KR20220121846A - 글루텐 분해를 위한 적어도 하나의 바실루스 및 락토바실루스 균주를 포함하는 박테리아 컨소시엄 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생존가능 세포 또는 그의 세포질 추출물로서의 바실루스 종, 락토바실루스 종, 및 임의적으로 또한 페디오코쿠스 종의 속에 속하는 프로바이오틱 균주 및 프로테아제를 포함하는 제제, 및 인간에서 및 식품 생산 동안 안전한 글루텐 분해를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생존가능 세포 또는 그의 세포질 추출물로서의 바실루스 종(Bacillus sp.), 락토바실루스 종(Lactobacillus sp.), 및 페디오코쿠스 종(Pediococcus sp.)의 속에 속하는 프로바이오틱 균주 및 프로테아제를 포함하는 제제, 및 인간에서 및 인간 및 동물용 식품의 생산 동안 안전한 글루텐 분해를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
글루텐은 밀, 호밀, 귀리, 및 보리와 같은 곡물의 주요 단백질 네트워크이다. 글루텐은 면역원성 및/또는 독성 잠재력이 있는 펩티드 서열을 갖는 단량체성 α-글리아딘, γ-글리아딘, Ω-글리아딘을 포함한다 (가장 현저한 예는 표 1에 나열됨).
표 1: 면역원성 글리아딘 펩티드
글리아딘의 불완전한 소화는 이들 펩티드를 방출하여 민감한 개체에게 유해 반응을 일으킬 수 있다. 문헌은 또한 글루텐을 구성하는 다른 단백질 분획인 글루테닌으로부터 면역원성 펩티드의 방출을 나타낸다. 글루텐-관련된 장애의 스펙트럼은 셀리악 질환 (CD), 밀 알레르기 (WA), 비-셀리악 글루텐 민감성 (NCGS), 및 글루텐-민감성 과민성 장 증후군을 포함한다 [1]. 이들 장애는 병원성 차이가 있기는 하지만 관련된 증상을 나타내며, 그들은 치료할 수 없기 때문에 글루텐 / 글루텐-함유 식품을 회피함으로써 치료된다. 또한, 다양한 다른 건강 병태 (예를 들어, 정신분열증, 아토피, 섬유근육통, 자궁내막증, 비만, 비-특이적 위장 증상)가 글루텐 회피로부터 이익을 얻는 것으로 제안되었다 [2]. 이들 사실은 글루텐-무함유 식이 (GFD)의 부상을 설명하며; 이러한 관행은 또한 많은 증가하는 수의 건강하고 증상이 없는 사람들에게까지 확대된다. 예를 들어, 보고에 따르면, 미국 인구의 33%가 글루텐을 회피하기를 원하고 운동선수 인구의 41%가 50% 초과의 시간 동안 GFD를 하고 있다고 보고하였다 [3].
그러나, GFD를 실행하는 것은, 특히 GFD를 유지하기 위한 명확한 징후가 없는 경우, 즉 글루텐 회피가 의학적 필요성보다 생활 방식 선택인 경우, 위험 및 이익 평가에서 고려되어야 할 문제 및 부작용과 관련이 있다. GFD는 종종 많은 글루텐-대체 식품에서 발견되는 과도한 칼로리 및 증가된 슈가 및 포화된 지방 함량과 나란히 미량 영양소 및 섬유질 결핍과 함께, 예를 들어 곡물 제품의 회피로 인해 불균형이 초래된다 [4-6]. 따라서, GFD의 잠재적인 위험은 어린이 및 청소년의 성장/발달 지연, 다양한 영양실조-관련된 장애, 고지혈증, 고혈당, 및 관상 동맥 질환을 포함한다 [6]. 또한, GFD를 장기간 준수하면 장내 마이크로바이옴 불균형을 일으켜 차후 건강에 부작용을 초래할 수 있다 [7].
GFD는 현재 CD, WA 및 NCGS 환자에 대한 유일한 효과적인 요법이다. 특히 CD의 경우, 글루텐 또는 유사한 단백질의 섭취가 질환의 발병 및 악화를 유발하므로 글루텐 섭취를 엄격히 회피하는 것이 매우 중요하다. 그러나, 글루텐-무함유인 것으로 간주되거나 주장되는 식품 제품조차도 글루텐 섭취의 안전한 한도 (전형적으로 CD 환자의 경우 < 20 ppm)를 초과하는 글루텐 양 (미량)을 함유한다. CD 환자에 대한 식품 안전성을 보장하기 위해 글루텐 회피 또는 해독을 지지하는 전략이 구상되었다. 글루텐의 장내 운명 및 이에 대한 생리학적 반응의 주요 결정인자는 장내 미생물총이며, 이는 차등적으로 집락화된 마우스로의 실험 [8] 및 CD 환자 대 건강한 개체로부터의 미생물총 비교 [9, 10]로부터 밝혀졌다. 이에 맞추어, 글루텐-관련된 장애를 개선시키기 위해 여러 미생물총-표적화된 기술이 개발되었다. 이들 기술은 하기로 분류될 수 있다: 1. GFD 또는 글루텐-관련된 장애와 관련된 장내 미생물 불균형을 교정하기 위해 락토바실루스 종 또는 비피도박테리움 종(Bifidobacterium spp.)의 경구 적용, 2. 정의되지 않은 메커니즘을 통한 글루텐-관련된 장애에 대한 비-특이적 지지로서 락토바실루스 종 또는 비피도박테리움 종의 경구 적용, 3. 글루텐의 분해를 지지하기 위해 락토바실루스 종 또는 비피도박테리움 종의 경구 적용, 4. 글루텐의 분해를 지지하기 위한 펩티드 히드롤라제 ("글루테나제")의 경구 적용. 독성/면역원성 글루텐 에피토프의 분해는 펩티다제 PepN, PepO, PepI, PepX, PepP의 조합된 활성을 필요로 한다 [11].
최근에, 문헌 (Zheng J, Wittouck S, Salvetti E, Cmap Franz HMB, Harris P, Mattarelli PW, O'Toole B, Pot P, Vandamme J, Walter K, Watanabe S, Wuyts GE, Felis MG, Ganzle A and Lebeer S, 2020. A taxonomic note on the genus lactobacillus: description of 23 novel genera, emended description of the genus lactobacillus Beijerinck 1901, and Union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.004107)에 따라 락토바실루스 속의 여러 종의 분류학적 분류가 업데이트되었다. 본 발명의 맥락에서 특히 관련이 있는 것은 하기의 종이다:
AU2015261774 AA는 CD를 예방 또는 치료하기 위해 락토바실루스 카세이 (락티카세이바실루스 카세이) IPLA12038의 사용을 청구한다. 이 균주는 12시간 이내에 특정 양의 33-mer를 분해하지만 임의의 다른 중요한 면역원성 펩티드는 분해하지 않으며 PepN 8.03 mEU/mg; PepQ 9.5 mEU/mg; Pepl 0.58 mEU/mg; PepX 3.19 mEU/mg의 효소 활성을 갖는 것으로 기재되었다. 이 균주는 산성 조건 (pH < 3.0)에서 살아남지 못하므로 글루텐-관련된 장애에 대한 기술적 솔루션을 제공하지 않는다.
WO2017139659 A1은 로티아(Rothia) 종으로부터의 서브틸리신에 의한 XPQ 모티프 및 단 2개의 면역원성 펩티드 (33-mer 및 26-mer)의 절단을 청구한다.
AU2008341708 AA는 글루텐-관련된 장애의 치료에서의 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum) CECT 7347의 용도를 청구하며; 글루텐 또는 그 내의 중요한 에피토프에 대한 이 균주의 임의의 펩티다제 또는 프로테아제 활성에 대한 언급은 없다.
WO17134240 A1은 CD 치료를 위한 파에칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii), 부티리시코쿠스 풀리카에코룸(Butyricicoccus pullicaecorum), 로세부리아 이눌리니보란스(Roseburia inulinivorans), 로세부리아 호미니스(Roseburia hominis), 악케르만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) 및 아나에로스티페스 카카에(Anaerostipes caccae) 종을 함유하는 조성물을 청구한다.
US2017000830 AA는 글루텐 민감성을 개선시키기 위한 락토코쿠스(Lactococcus) 종 및 효소를 함유하는 조성물을 청구한다. 프란카빌라(Francavilla) 등은 락토바실루스 및 비피도박테리움 속으로부터의 5가지 균주의 조합을 적용한 후 GFD에 대한 CD 환자의 과민성 장 증후군 (IBS)-유사 증상의 개선을 보고하였다 [12]. 이 치료는 장내 미생물총 조성의 변화와 관련이 있으나; 글루텐 소화에 대한 균주의 효과는 보고되지 않았다. 한편, 동일 그룹은 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이), 및 락토바실루스 카세이 (락티카세이바실루스 카세이) 종의 균주에 대해 PepN의 경우 최대 10 mU/mg, PepI의 경우 10 mU/mg, PEP의 경우 5 mU/mg, PepQ의 경우 25 mU/mg의 활성을 나타내는 락토바실루스 균주의 시험관내 펩티다제 활성을 평가하였다 [13]. 이들 균주 중 10가지를 조합하여 적용하면 24시간 인큐베이션 후 표 1에 나열된 글리아딘 에피토프가 가수분해되었다. 위 및 소장 조건 하에서 균주의 생존은 결정되지 않았으므로 인간의 위장관에서 글루텐 소화에 대한 이들 균주의 효능은 예측될 수 없다.
헤란(Herran) 등은 24시간의 매우 긴 인큐베이션 시간 후에만 33-mer에 대한 단백질분해 활성을 나타내었고 다른 펩티드에 대해서는 그렇지 않았던, 인간의 소장으로부터의 엘. 살리바리우스(L. salivarius), 엘. 람노수스(L. rhamnosus), 엘. 레우테리(L. reuteri) (리모시락토바실루스 레우테리), 엘. 카세이(L. casei) (락티카세이바실루스 카세이), 엘. 오리스(L. oris), 엘. 가세리(L. gasseri), 엘. 페르멘툼(L. fermentum), 엘. 크리스파투스(L. crispatus), 엘. 브레비스(L. brevis) (레비락토바실루스 브레비스), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) 종에 속하는 27가지의 박테리아 균주를 단리하였다 [14]. 유사하게, 이 에피토프에 대한 약한 활성은 다시 비. 서브틸리스, 비. 푸밀루스 및 비. 리케니포르미스 종을 포함하여 인간 소장 기원의 다른 균주에서 발견되었다 [15].
CA3069659A1은 진균 효소 및 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스), 락토바실루스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리), 및 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 종으로부터 선택된 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 조성물에 의해 글루텐-무함유 가루를 제조하는 방법을 개시한다. 위 및 소장 조건 하에서 이들 박테리아의 생존은 결정되지 않았으므로, 인간의 위장관에서 글루텐 소화에 대한 이들 균주의 효능은 예측될 수 없다. 또한, 이들 조성물에 의해 소화되는 글루텐의 운명이 개시되지 않았으며; 면역원성 펩티드의 출현 또는 소멸 뿐만 아니라 소화물의 면역원성도 평가되지 않았다.
식품 가공 동안 [16] 및 인간에서 [17] 글루텐을 해독하기 위해 펩티드 히드롤라제의 상업적 사용이 기재되었다. 그러나, 이들 효소를 함유하는 관련된 제품은 효능에 대한 증거가 거의 없다 [17].
결론적으로, 글루텐-관련된 장애의 문제는 상기에서 언급된 모든 적용이 몇몇 문제를 가지고 있고 임상으로 성공적으로 전환되지 않았기 때문에 해결되지 않은 상태로 남아 있다. 적용 1 및 2는 글루텐 독성의 근본적인 문제가 직접적으로 해결되지 않기 때문에 단지 간접적인 이익을 제공할 수 있다. 적용 3은 지금까지 글루텐의 생체외 소화, 단지 부분 소화로 이어지는 글루텐/글리아딘 단백질에 대한 단독 프로테아제 활성의 평가, 또는 12시간 또는 그 초과의 매우 긴 인큐베이션 시간 후 극히 소수의 면역원성 글루텐 펩티드의 소화 평가로 제한되었다.
성공적인 임상 전환의 결여는 위장관의 실제 조건 하에서 조합된 미생물 균주의 저조한 생존에 의해 및 식품 매트릭스의 글루텐 펩티드에 대한 제한된 활성에 기인하여 설명될 수 있다.
CD 환자를 위한 미생물 효소 치료 (적용 4)는 위장 통과 동안 효소 활성의 저조한 단백질분해 저항성, 범위 및 지속기간의 주요 제한을 갖는다 [18]. 또한, 이들은 글루텐을 부분적으로만 분해하여 잠재적으로 독성 에피토프를 방출할 수 있기 때문에 심지어 위험한 것으로 간주된다 [17].
하기 고려사항에 기초하여 창의적이고 효과적인 기술을 개발하여 이들 제한을 극복하는 것이 목표였다:
ㆍ 불완전한 분해는 독성 및/또는 면역원성 펩티드의 형성을 초래할 수 있기 때문에 인간의 소화 동안 글루텐/글리아딘/글루테닌 분해는 그 자체로 유익하지 않다.
ㆍ 생체내에서 글루텐 분해를 유발하기 위한 현재 이용가능한 수단의 안전성에 대한 우려가 표명되었으며, 이는 이들이 부분적으로만 그렇게 할 수 있어 글루텐 독성을 유발하거나 악화시킬 수 있기 때문이다.
ㆍ 생체내에서 글루텐 분해를 유발하기 위한 임의의 시도는 이러한 분해가 완전하고 안전한 분해 생성물로 이어지는지를 확인해야 한다.
ㆍ 면역원성 잠재력이 있는 글루텐-내재 펩티드 서열의 다양성을 감안할 때, 모든 펩티드의 완전한 분해를 보장하기 위해서는 상이한 미생물로부터의 펩티드 히드롤라제의 조합이 필요하다.
ㆍ 이러한 조합은 바람직하게는 대사적으로 활성이고 위장관의 관련된 부분 (즉, 위 및 십이지장)에서 서로 상승작용하는 프로바이오틱 미생물 컨소시엄에 의해 제공되어 관련된 식품 매트릭스로부터 비-독성의 비-면역원성인 작은 펩티드 또는 아미노산으로의 글루텐 단백질의 안전하고 신속하고 완전한 분해를 촉진한다.
ㆍ 본 발명자들은 산- 및 담즙-저항성 박테리아 균주를 적절한 단백질/펩티드 기질 특이성과 조합함으로써 이러한 상승작용이 달성될 수 있다고 생각하였고, 특정 생태학적 분야로부터의 특정 락토바실루스 종, 바실루스 종, 및 일부 경우에 또한 페디오코쿠스 종의 조합 (그들의 세포질 추출물 포함)이 이에 특히 유용하다는 것을 밝혀내었다.
본 발명에서 본 발명자들은 식품 생산 동안 뿐만 아니라 인간 및 동물의 위장관에서 글루텐 분해에 사용하기 위한 기술로서 페디오코쿠스 균주의 임의적 첨가와 함께 락토바실루스 및 바실루스 종에 의해 포함되는 컨소시엄의 적용을 개시한다.
이러한 기술이 예방 또는 다른 이유로 글루텐에 대한 노출을 최소화하려는 사람들 뿐만 아니라 이를 필요로 하는 사람들에게 이익을 줄 수 있는 방법은 하기와 같다:
(i) CD, WA 및 NCGS 환자에 대한 치료 또는 보완 요법으로 의도적으로 또는 우발적으로 섭취된 글루텐의 안전한 제거. 통상적인 글루텐-함유 식이로 돌아갈 가능성.
(ii) 섭취된 글루텐으로 인해 발생할 수 있는 비-특이적 장 또는 장외 증상을 갖는 사람들을 위한 치료 또는 보완 요법으로 의도적으로 또는 우발적으로 섭취된 글루텐의 안전한 제거. 통상적인 글루텐-함유 식이로 돌아갈 가능성.
(iii) GFD를 준수하는 대안으로 글루텐 노출을 최소화하려는 증상이 없는 사람들을 위한 솔루션 제공.
본 발명은 페디오코쿠스 균주의 임의적 첨가와 함께 락토바실루스 및 바실루스 종을 포함하는 제제에 관한 것이다. 이들 새로운 제제는 인간의 위장관에서 및 글루텐-함유 식료품의 생산 동안 글루텐의 비-독성 및 비-면역원성 펩티드/아미노산으로의 소화를 촉진한다.
따라서, 본 발명의 대상은 글루텐의 안전하고 완전한 분해에 사용하기 위한, 바실루스 속으로부터 선택된 적어도 하나의 프로바이오틱 균주 및 락토바실루스 속으로부터 선택된 적어도 하나의 프로바이오틱 균주의 컨소시엄을 포함하는 제제이다.
본 발명은 20 ppm 이하의 글루텐 함량으로의 글루텐의 분해에 사용하기 위한, 바실루스 속으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 균주 및 락토바실루스 속으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 균주의 컨소시엄을 포함하는 제제에 관한 것이며,
a) 상기 균주의 컨소시엄은 12-mer 펩티드 QLQPFPQPQLPY (서열식별번호(Seq-ID No): 1), 14-mer 펩티드 PQPQLPYPQPQSFP (서열식별번호: 2), 20-mer 펩티드 QQLPQPQQPQQSFPQQQRPF (서열식별번호: 3), 33-mer 펩티드 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열식별번호: 4)를 분해할 수 있다.
바람직한 구성에서, 균주의 컨소시엄은 12-mer 펩티드 QLQPFPQPQLPY (서열식별번호: 1), 14-mer 펩티드 PQPQLPYPQPQSFP (서열식별번호: 2), 20-mer 펩티드 QQLPQPQQPQQSFPQQQRPF (서열식별번호: 3), 33-mer 펩티드 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열식별번호: 4)를 적어도 1% 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20% 또는 적어도 30% 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 분해할 수 있다.
글루텐 함량은 ELISA 검정을 통해, 바람직하게는 AOAC (공립 농업화학자 협회) 국제 공식 분석법 (OMA) (방법 번호 AACCI 38-55.01)에 따라 R5 항체-기반 샌드위치 및 경쟁적 ELISA (R5-ELISA) [22]를 이용하여 가수분해된 글루텐을 결정하거나 ELISA 시스템 글루텐 잔기 검출 키트 (오스트레일리아 윈저)를 사용하여 잔류 글루텐을 결정함으로써 결정된다.
바람직한 구성에서, 제제는 잔류 글루텐을 6시간 후 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 또는 16시간 후 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 또는 48시간 후 적어도 99% 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 제제는 글루텐 단편을 6시간 후 적어도 90%, 또는 16시간 후 적어도 95%, 또는 48시간 후 적어도 97% 감소시킬 수 있다.
또 다른 바람직한 구성에서, 제제는 잔류 글루텐을 6시간 후 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 또는 16시간 후 적어도 99% 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 제제는 글루텐 단편을 6시간 후 적어도 94%, 또는 16시간 후 적어도 97%, 또는 48시간 후 100% 감소시킬 수 있다.
더욱 바람직한 구성은 사용하기 위한 제제이며,
b) 상기 균주의 컨소시엄은 글루텐-관련된 장애의 영향을 받는 대상체 또는 동물의 소장 또는 소장 외식편에서 면역원성 또는 독성 반응을 일으키지 않는 소화물로 글루텐을 분해할 수 있고/거나,
c) 컨소시엄의 모든 균주는 모의 위 (pH 1.0-4.0) 및 장 (pH 5.4-6.8; 0.05-0.6% 담즙산, 또는 생체내 조건 하에 인간에 존재하는 담즙산 농도) 조건에서 생존 (2 log 미만의 CFU 손실)하고/거나,
d) 컨소시엄의 구성원은 3 U/g (PepP), 5 U/g (PepO), 20 U/g (PepX), 17 U/g (PepI), 20 U/g (PepN) 이상의 적어도 하나의 펩티다제 활성을 갖는 상보적인 PepP, PepO, PepX, PepI 및 PepN 활성을 갖는다.
바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 및 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸), 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이), 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스), 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스), 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리)의 종, 및 일부 경우에서 또한 페디오코쿠스 종의 박테리아는 이 효과에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 바실루스 균주는 바실루스 푸밀루스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 메가테리움으로부터 선택되고, 바람직하게는 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, DSM 33301, 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, DSM 33298, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356으로부터 선택된다.
락토바실루스 균주는 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸), 락토바실루스 카세이 (락티카세이바실루스 카세이), 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이), 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스), 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스), 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리)로부터 선택되고, 바람직하게는 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33363, DSM 33364, DSM 33366, DSM 33367, DSM 33368, DSM 33369, DSM 33370, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, DSM 33375, DSM 33376, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, DSM 33379로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 사용을 위한 제제는 하기 균주 중 하나 이상을 포함한다:
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363, DSM 33364; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373; 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377; 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379; 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, DSM 33353, 또는
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, DSM 33369; 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376; 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DSM 33371; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378; 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 또는
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 또는
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301.
본 발명에 따른 사용을 위한 특히 바람직한 제제는 하기 균주를 포함한다:
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 또는
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 또는
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 푸밀루스 DSM 33355.
본 발명의 균주의 세포는 본 발명의 조성물에 포자 (휴면임)로서, 영양 세포 (성장 중임)로서, 전이 상태 세포 (영양 세포에서 포자로 전환되거나 그 역)로서, 또는 전체 세포 추출물로서 또는 풍부화된 효소 분획 또는 정제된 효소로서, 또는 이들 유형의 세포 또는 추출물/단리물 중 적어도 2개의 조합으로서 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 언급된 균주로부터 단리된 프로테아제 유전자가 유전자 클로닝 및 유전자 전달 절차에 의해 전달된 미생물 균주를 포함하는 조성물, 및 이러한 유전자 조작된 균주의 포자 (해당되는 경우)로서의, 영양 세포로서의, 전이 상태 세포로서의, 전체 세포 추출물로서의 또는 풍부화된 효소 분획 또는 정제된 효소로서의 또는 이러한 유형의 세포 또는 추출물/단리물 중 적어도 2개의 조합으로서의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 프로바이오틱 균주는 휴면 형태로 또는 영양 세포로서 존재한다. 대안적인 실시양태에서, 프로바이오틱 균주의 세포질 추출물 또는 세포-무함유 상청액 또는 열-사멸된 바이오매스가 사용된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 제제는 하나 이상의 프로바이오틱 균주, 바람직하게는 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종(Weissella sp.), 보다 바람직하게는 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371로부터 선택된 것을 추가로 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 제제는 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 바실루스 종, 락토바실루스 종, 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종, 로티아 무실라기노사(Rothia mucilaginosa), 로티아 아에리아(Rothia aeria)로부터 정제된 미생물 프로테아제, 서브틸리신, 나토키나제, 아라비녹실란, 보리 곡립 섬유, 귀리 곡립 섬유, 호밀 섬유, 밀기울 섬유, 이눌린, 프룩토올리고사카라이드 (FOS), 갈락토올리고사카라이드 (GOS), 저항성 전분, 베타-글루칸, 글루코만난, 갈락토글루코만난, 구아 검, 크실로올리고사카라이드, 알기네이트 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 글루텐-관련된 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체 또는 동물에서 바람직하게는 셀리악 질환, 비-셀리악 글루텐 민감성, 밀 알레르기, 및 글루텐-민감성 과민성 장 증후군으로부터 선택된 글루텐-관련된 장애를 치료 또는 예방하기 위한 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 20 ppm 미만의 글루텐을 함유하는, 글루텐-함유 곡물 밀, 보리, 호밀 및 귀리로부터, 글루텐-무함유 식품을 생산하기 위한 제제에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 제제는 바실루스 종, 락토바실루스 종, 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종의 구성원의 미생물 세포막의 투과제로서 작용하는 물질, 바람직하게는 알기네이트를 추가로 포함한다.
대안적인 실시양태에서, 바실루스 종, 락토바실루스 종, 페디오코쿠스 종 및 웨이셀라 종으로부터 선택된 프로바이오틱 균주 중 하나 이상은 개별적으로 또는 컨소시엄으로서 고정화된다. 고정화는 셀룰로스 및 키토산과 같은 고체 표면 상에 다공성 매트릭스, 예를 들어 알기네이트, k-카라기난, 한천, 키토산 및 폴리갈락투론산과 같은 폴리사카라이드 겔 또는 젤라틴, 콜라겐 및 폴리비닐 알콜과 같은 다른 중합체성 매트릭스 내에 포획으로서 또는 응집 및 마이크로캡슐화 또는 전기분무 기술에 의해 실현될 수 있다. 락토바실루스, 바실루스, 및 페디오코쿠스 속의 균주는 모의 위장 조건 하에서의 생존 및 PepN, PepO, PEP, PepX, PepQ 활성에 대해 스크리닝되었다. 하기 균주는 모의 위장 조건 하에서 생존하였으며 (2 log 미만의 CFU 감소) PepN, PepO, PEP, PepX, PepQ와 같은 예외적으로 높은 펩티다제 활성을 나타내었다:
락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33362, DSM 33363, DSM 33364, DSM 33367, DSM 33366, DSM 33369, DSM 33368
락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374
락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377
락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, DSM 33375, DSM 33376
락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, DSM 33379
바실루스 서브틸리스 DSM 33298, DSM 33353
바실루스 푸밀루스 DSM 33301, DSM 33297, DSM 33355
바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356
바실루스 리케니포르미스 DSM 33354
페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371
따라서, 바람직하게는 본 발명에 따른 제제에 사용되는 바실루스/락토바실루스/페디오코쿠스 균주는 하기 그룹으로부터 선택된다:
DSMZ에 DSM 33298, DSM 33353으로 기탁된 바실루스 서브틸리스 균주; DSMZ에 DSM 33301, DSM 33297, DSM 33355로 기탁된 바실루스 푸밀루스 균주; DSMZ에 DSM 33300, DSM 33356으로 기탁된 바실루스 메가테리움 균주; DSMZ에 DSM 33354로 기탁된 바실루스 리케니포르미스 균주; DSMZ에 DSM 33371로 기탁된 페디오코쿠스 펜토사세우스 균주; DSMZ에 DSM 33378, DSM 33379로 기탁된 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) 균주; DSMZ에 DSM 33370, DSM 33362, DSM 33363, DSM 33364, DSM 33367, DSM 33366, DSM 33369, DSM 33368로 기탁된 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) 균주; DSMZ에 DSM 33374로 기탁된 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) 균주; DSMZ에 DSM 33377로 기탁된 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) 균주; DSMZ에 DSM 33373, DSM 33375, DSM 33376으로 기탁된 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) 균주.
균주 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363, DSM 33364; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373; 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377; 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 바실루스 서브틸리스 DSM 33353이 조합되는 경우 (조합 1), 표 1에 나열된 4가지의 시험된 글루텐 에피토프 모두는 12시간 이내에 완전히 분해되었다.
마찬가지로, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379; 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, DSM 33353을 포함한 조합 2, 및 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366 및 DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376; 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378; 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298을 포함한 조합 3은 12시간 이내에 표 1에 나열된 글루텐 에피토프의 완전한 분해를 이끌었다.
또한, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300의 조합은 균주 조합 1-3과 유사하게 효과적이었다.
또한, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 DSM 33355, 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300의 조합은 균주 조합 1-3과 유사하게 효과적이었다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구성은 하기로부터 선택된 균주 조합을 포함하는 제제에 관한 것이다:
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363, DSM 33364; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373; 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377; 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379; 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298 및 DSM 33353, 또는
엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366 및 DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376; 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378; 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 또는
락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 또는
락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 DSM 33355, 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300.
상기에 나열된 바실루스 종, 락토바실루스 종, 및 페디오코쿠스 종의 균주 중 많은 다른 조합이 이미 표시된 것과 비슷한 성능을 나타내었다.
보다 구체적으로, 본 발명의 바람직한 구성은 종합적으로 높은 효소 PepI, PepN, PepX, PepO 및 PepP 활성을 제공하는 균주 조합을 포함하며; 결과적으로, 이러한 조합은 하기 그룹 1-5 각각의 적어도 하나의 균주를 함유하며, 여기서 그룹 구성원은 PepI (그룹 1), PepN (그룹 2), PepX (그룹 3), PepO (그룹 4), PepP (그룹 5)에 대해 특히 높은 효소 활성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 또 다른 대상은 하기 그룹 1-5 각각의 적어도 하나의 균주를 포함하는 제제이다:
그룹 1: 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375,
그룹 2: 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362,
그룹 3: 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373,
그룹 4: 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 바실루스 푸밀루스 DSM 33355, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301,
그룹 5: 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33368, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33364, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373.
바람직한 구성에서, 제제는 적어도 3가지의 상이한 균주, 바람직하게는 적어도 4가지의 상이한 균주, 보다 바람직하게는 적어도 5가지의 상이한 균주를 포함한다.
제제가 하기 균주를 포함하는 경우에 특히 바람직하다:
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363, DSM 33364; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373; 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377; 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379; 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298 및 DSM 33353, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366 및 DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376; 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378; 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 푸밀루스 DSM 33355.
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, DSM 33301, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362 및 DSM 33367, DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33369, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 또는
- 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, DSM 33368; 바실루스 푸밀루스 DSM 33355, 및 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33362, 및 DSM 33366, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 비. 리케니포르미스 DSM 33354, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, DSM 33364, DSM 33370, 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, DSM 33369, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 피. 펜토사세우스 DSM 33371, 비. 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 또는
- 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 피. 펜토사세우스 DSM 33371, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 비. 리케니포르미스 DSM 33354, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33366, DSM 33370, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, DSM 33379, 비. 리케니포르미스 DSM 33354, 비. 서브틸리스 DSM 33353.
추가의 바람직한 구성에서, 제제는 하기 균주를 포함한다:
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 푸밀루스 DSM 33355.
본 발명의 또 다른 바람직한 구성은, 예를 들어 발효 및 베이킹 공정에 의해 곡물로부터 식료품을 제조하는데 사용되는 제제이다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 제제를 포함하는, 식품 또는 애완동물 사료 보충제 또는 식품 또는 애완동물 사료 제품에 관한 것이다.
본 발명의 한 대상은 식품 보충제로서의 본 발명에 따른 제제의 용도 또는 식료품에서의 그의 용도이다. 본 발명에 따른 바람직한 식료품은 초콜릿 제품, 구미, 뮤즐리, 뮤즐리 바 및 유제품이다.
본 발명의 추가 대상은 또한 식품 또는 사료 제품에서 신바이오틱 성분으로서의 본 발명의 제제의 용도이다.
본 발명의 추가 대상은 본 발명에 따른 제제 및 바람직하게는 단백질, 탄수화물, 지방, 추가 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 효소, 비타민, 면역 조정제, 우유 대체제, 미네랄, 아미노산, 콕시디오스타트, 산-기반 제품, 약물 및 이들의 조합로부터 선택된 적어도 하나의 추가 식품 성분을 함유하는 식료품 조성물이다.
본 발명에 따른 식료품 또는 사료 조성물은 또한, 예를 들어 환제, 캡슐, 정제, 분말 또는 액체 형태의 식이 보충제를 포함한다.
본 발명의 추가 대상은 본 발명에 따른 제제 및 제약상 허용되는 담체를 함유하는 제약 조성물이다.
본 발명에 따른 제제는 인간 또는 동물에게 투여될 때 바람직하게는 인간의 건강 상태, 특히 장 건강, 심혈관 건강, 정신 건강 또는 면역 건강을 개선시킨다.
본 발명에 따른 유리한 구성은 하기 중 하나 이상에 의해 인간 또는 동물의 건강 상태를 개선시키기 위한 조성물이다:
- 독성 글루텐 에피토프, 바람직하게는 표 1에 나열된 것들의 양을 감소시킴.
- 초기 글루텐 양을 20 ppm 미만으로 감소시킴.
항목
1. 글루텐의 분해에 사용하기 위한, 바실루스 속으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 균주 및 락토바실루스 속으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 균주의 컨소시엄을 포함하는 제제.
2. 20 ppm 이하의 글루텐 함량으로의 글루텐의 분해에 사용하기 위한, 바실루스 속으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 균주 및 락토바실루스 속으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 균주의 컨소시엄을 포함하는 제제.
3. 항목 1 또는 2에 있어서,
a) 상기 균주의 컨소시엄이 12-mer 펩티드 QLQPFPQPQLPY (서열식별번호: 1), 14-mer 펩티드 PQPQLPYPQPQSFP (서열식별번호: 2), 20-mer 펩티드 QQLPQPQQPQQSFPQQQRPF (서열식별번호: 3), 33-mer 펩티드 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열식별번호: 4)를 분해할 수 있는 것인
제제.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 글루텐 함량이 ELISA 검정, 바람직하게는 항체-기반 샌드위치 또는 경쟁적 검정을 통해 결정되는 것인 제제.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 제제가 잔류 글루텐을 6시간 후 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 또는 16시간 후 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 또는 48시간 후 적어도 99% 감소시킬 수 있는 것인 제제.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 제제가 글루텐 단편을 6시간 후 적어도 90%, 또는 16시간 후 적어도 95%, 또는 48시간 후 적어도 97% 감소시킬 수 있는 것인 제제.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 제제가 잔류 글루텐을 6시간 후 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 또는 16시간 후 적어도 99% 감소시킬 수 있는 것인 제제.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 제제가 글루텐 단편을 6시간 후 적어도 94%, 또는 16시간 후 적어도 97%, 또는 48시간 후 100% 감소시킬 수 있는 것인 제제.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 있어서, 균주의 컨소시엄이 12-mer 펩티드 QLQPFPQPQLPY (서열식별번호: 1), 14-mer 펩티드 PQPQLPYPQPQSFP (서열식별번호: 2), 20-mer 펩티드 QQLPQPQQPQQSFPQQQRPF (서열식별번호: 3), 33-mer 펩티드 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열식별번호: 4)를 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 분해할 수 있는 것인 제제.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서,
b) 상기 균주의 컨소시엄이 글루텐-관련된 장애의 영향을 받는 대상체 또는 동물의 소장 또는 소장 외식편에서 면역원성 또는 독성 반응을 일으키지 않는 소화물로 글루텐을 분해할 수 있고/거나,
c) 컨소시엄의 모든 균주가 모의 위 (pH 1.0-4.0) 및 장 (pH 5.4-6.8; 0.05-0.6% 담즙산, 또는 생체내 조건 하에 인간에 존재하는 담즙산 농도) 조건에서 생존 (2 log 미만의 CFU 손실)하고/거나,
d) 컨소시엄의 구성원이 3 U/g (PepP), 5 U/g (PepO), 20 U/g (PepX), 17 U/g (PepI), 20 U/g (PepN) 이상의 적어도 하나의 펩티다제 활성을 갖는 상보적인 PepP, PepO, PepX, PepI 및 PepN 활성을 갖는 것인
제제.
11. 항목 1 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 바실루스 균주가 바실루스 푸밀루스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 메가테리움으로부터 선택되고, 바람직하게는 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, DSM 33301, 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, DSM 33298, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356으로부터 선택되는 것인 제제.
12. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 락토바실루스 균주가 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸), 락토바실루스 카세이 (락티카세이바실루스 카세이), 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이), 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스), 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스), 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리)로부터 선택되고, 바람직하게는 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33363, DSM 33364, DSM 33366, DSM 33367, DSM 33368, DSM 33369, DSM 33370, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, DSM 33375, DSM 33376, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, DSM 33379로부터 선택되는 것인 제제.
13. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, 프로바이오틱 균주가 휴면 형태로 또는 영양 세포로서 존재하는 것인 제제.
14. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 프로바이오틱 균주의 세포질 추출물 또는 세포-무함유 상청액 또는 열-사멸된 바이오매스가 사용되는 것인 제제.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 제제가 하나 이상의 프로바이오틱 균주, 바람직하게는 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종, 보다 바람직하게는 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371로부터 선택된 것을 추가로 포함하는 것인 제제.
16. 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목에 있어서, 제제가 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 바실루스 종, 락토바실루스 종, 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종, 로티아 무실라기노사, 로티아 아에리아로부터 정제된 미생물 프로테아제, 서브틸리신, 나토키나제, 아라비녹실란, 보리 곡립 섬유, 귀리 곡립 섬유, 호밀 섬유, 밀기울 섬유, 이눌린, 프룩토올리고사카라이드 (FOS), 갈락토올리고사카라이드 (GOS), 저항성 전분, 베타-글루칸, 글루코만난, 갈락토글루코만난, 구아 검, 크실로올리고사카라이드, 알기네이트 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 제제.
17. 항목 1 내지 16 중 어느 한 항목에 있어서, 글루텐-관련된 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체 또는 동물에서 바람직하게는 셀리악 질환, 비-셀리악 글루텐 민감성, 밀 알레르기, 및 글루텐-민감성 과민성 장 증후군으로부터 선택된 글루텐-관련된 장애를 치료 또는 예방하기 위한 제제.
18. 항목 1 내지 17 중 어느 한 항목에 있어서, 바람직하게는 20 ppm 미만의 글루텐을 함유하는, 글루텐-함유 곡물 밀, 보리, 호밀 및 귀리로부터, 글루텐-무함유 식품을 생산하기 위한 제제.
19. 항목 1 내지 18 중 어느 한 항목에 있어서, 바실루스 종, 락토바실루스 종, 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종의 구성원의 미생물 세포막의 투과제로서 작용하는 물질, 바람직하게는 알기네이트를 추가로 포함하는 제제.
20. 항목 1 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 바실루스 종, 락토바실루스 종, 페디오코쿠스 종 및 웨이셀라 종으로부터 선택된 프로바이오틱 균주 중 하나 이상이 개별적으로 또는 컨소시엄으로서 고정화되는 것인 제제.
21. 하기 그룹 1-5 각각의 적어도 하나의 균주를 포함하는 제제:
그룹 1: 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375,
그룹 2: 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362,
그룹 3: 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373,
그룹 4: 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 바실루스 푸밀루스 DSM 33355, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301,
그룹 5: 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33368, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33364, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373.
22. 항목 21에 있어서, 적어도 3가지의 상이한 균주, 바람직하게는 적어도 4가지의 상이한 균주, 보다 바람직하게는 적어도 5가지의 상이한 균주를 포함하는 제제.
23. 항목 21 또는 22에 있어서, 하기 균주를 포함하는 제제:
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363, DSM 33364; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373; 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377; 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379; 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298 및 DSM 33353, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366 및 DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376; 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378; 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 푸밀루스 DSM 33355, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, DSM 33301, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362 및 DSM 33367, DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33369, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 또는
- 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, DSM 33368; 바실루스 푸밀루스 DSM 33355, 및 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33362, 및 DSM 33366, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 비. 리케니포르미스 DSM 33354, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, DSM 33364, DSM 33370, 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, DSM 33369, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 피. 펜토사세우스 DSM 33371, 비. 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 또는
- 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 피. 펜토사세우스 DSM 33371, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 비. 리케니포르미스 DSM 33354, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33366, DSM 33370, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, DSM 33379, 비. 리케니포르미스 DSM 33354, 비. 서브틸리스 DSM 33353.
24. 항목 21 내지 23 중 어느 한 항목에 있어서, 하기 균주를 포함하는 제제:
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 푸밀루스 DSM 33355.
25. 항목 21 내지 24 중 어느 한 항목에 있어서, 프로바이오틱 균주가 휴면 형태로 또는 영양 세포로서 존재하는 것인 제제.
26. 항목 21 내지 25 중 어느 한 항목에 있어서, 프로바이오틱 균주의 세포질 추출물 또는 세포-무함유 상청액 또는 풍부화된 효소 분획 또는 정제된 효소 또는 열-사멸된 바이오매스가 사용되는 것인 제제.
27. 항목 21 내지 26 중 어느 한 항목에 있어서, 제제가 하나 이상의 프로바이오틱 균주, 바람직하게는 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종, 보다 바람직하게는 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371로부터 선택된 것을 추가로 포함하는 것인 제제.
28. 항목 21 내지 27 중 어느 한 항목에 있어서, 제제가 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 바실루스 종, 락토바실루스 종, 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종, 로티아 무실라기노사, 로티아 아에리아로부터 정제된 미생물 프로테아제, 서브틸리신, 나토키나제, 아라비녹실란, 보리 곡립 섬유, 귀리 곡립 섬유, 호밀 섬유, 밀기울 섬유, 이눌린, 프룩토올리고사카라이드 (FOS), 갈락토올리고사카라이드 (GOS), 저항성 전분, 베타-글루칸, 글루코만난, 갈락토글루코만난, 구아 검, 크실로올리고사카라이드, 알기네이트 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 제제.
29. 항목 21 내지 28 중 어느 한 항목에 따른 제제를 포함하는, 식품 또는 애완동물 사료 보충제 또는 식품 또는 애완동물 사료 제품 또는 제약 제품.
작업 실시예
실시예 1. 위장 조건에 저항성인 프로바이오틱 미생물
모의 위액 및 장액은 페르난데즈 등 [19]에 의해 기재된 바와 같이 사용되었다. 정지상-성장된 세포를 8000 g에서 10분 동안 수거하고, 생리적 용액으로 세척하고, NaCl (125 mM/l), KCl (7 mM/l), NaHCO3 (45 mM/l), 및 펩신 (3 g/l) (시그마-알드리치 캄파니(Sigma-Aldrich CO.), 미국 미주리주 세인트 루이스)을 함유한 50 ml의 모의 위액 (세포 밀도 10 log CFU/ml)에 현탁시켰다 [20]. 최종 pH를 2.0, 3.0 및 8.0으로 조정하였다. pH 8.0 값은 낮은 pH의 효과 이외에 모의 위액 성분의 영향을 조사하는데 사용되었다. 현탁액을 혐기성 조건 및 연동을 모의하기 위한 교반 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. 이 현탁액의 분취량을 0, 90 및 180분에 취하고, 생존 계수를 결정하였다. 위 소화의 효과는 또한 pH 2.0에서 모의 위액을 접종하기 전에 재구성된 탈지유 (RSM) (11% 고형분, w/v)에 세포를 현탁시켜 결정하였다. RSM 첨가 후의 최종 pH는 약 3.0이었다. 이 조건은 위 통과 동안 식품 매트릭스의 효과를 모의하기 위해 검정되었다 [20]. 위 소화 180분 후, 세포를 수거하고, pH 8.0에서 0.1% (w/v) 판크레아틴 및 0.15% (w/v) 옥스갈(Oxgall) 담즙염을 함유하는 모의 장액에 현탁시켰다. 현탁액을 교반 하에 37℃에서 인큐베이션하고, 분취량을 0, 90, 및 180분에 취하였다 [21]. < 400가지의 시험된 균주 중 119가지는 초기 초기 1x1010 CFU/ml의 2 log 미만의 감소를 나타내었고 모의 위장 조건에 대해 저항성인 것으로 특징지어졌다.
실시예 2. 위장 조건에 저항성인 단일 균주의 프로테아제 및 펩티다제 활성
모의 위장 조건에 대한 저항성을 나타내는 모든 119가지의 균주 (락토바실루스 종, 63가지 균주; 웨이셀라 종, 3가지 균주; 페디오코쿠스 종, 1가지 균주 및 바실루스 종, 51가지 균주)가 합성 기질에 대한 펩티다제 및 프로테이나제 활성에 대해 시험되었다. 펩티다제 활성을 검정하기 위해 후기 지수 성장기 (약 9.0 log CFU/ml)로부터의 각각의 균주의 배양물을 사용하였다. 세척된 세포 펠릿의 분취량 (0.3 g [건조 중량])을 50 mM 트리스-HCl (pH 7.0)에 재현탁시키고, 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 13,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포벽에 느슨하게 회합된 효소를 제거하였다. 세포질 추출물은 박테리아 현탁액을 60분 동안 37℃에서 교반 조건 (약 160 rpm) 하에 24% 수크로스를 함유하는 50 mM 트리스-HCl (pH 7.5) 버퍼에서 리소자임과 함께 인큐베이션하여 제조하였다. 스페로플라스트를 등장성 버퍼에 재현탁시키고, 16 A/s에서 40초 동안 초음파처리하였다 (소니 프렙(Sony Prep) 모델 150, 산요(Sanyo), 영국). 추출물을 동결-건조시켜 10배 농축시키고, 5 mM 트리스-HCl (pH 7.0)에 재현탁시키고, 4℃에서 24시간 동안 투석하였다. 락토바실루스의 세포질 추출물의 일반적 아미노펩티다제 N형 (PepN), 프롤린 이미노펩티다제 (PepI), X-프롤릴 디펩티딜 아미노펩티다제 (PepX) 엔도펩티다제 (PepO) 및 프롤릴 엔도펩티다제 (PepP) 활성을 각각 Leu-p-니트로아닐리드 (p-NA), Pro-p-NA, Gly-Pro-p-NA, Z-Gly-Gly-Leu-p-NA 및 Z-Gly-Pro-4-니트로아닐리드 기질 (시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co))을 사용하여 측정하였다. 검정 혼합물은 0.05 M 인산칼륨 버퍼, pH 7.0에 900 μl의 2.0 mM 기질 및 100 μl의 세포질 추출물을 함유하였다. 혼합물을 37℃에서 180분 동안 인큐베이션하고, 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 데이터는 p-니트로아닐린을 사용하여 설정된 표준 곡선과 비교되었다. 1 단위의 활성은 검정 조건 하에서 분당 1 μmol의 p-니트로아닐린을 유리시키는데 필요한 효소의 양으로 정의되었다. 상기 펩티다제 활성으로부터의 주성분 분석 (PCA) 데이터를 기반으로 하여, 일부 균주는 다른 균주와 명확하게 분리되었다 (도 1). 도 2는 매우 높은 펩티다제 활성 (적어도 하나의 펩티다제 활성에 대해)을 나타내는 균주를 보고한다. PepN 활성은 0.0 (U002-C04; U541-C05; U776-C02; DSM 33301; U021-C01; DSM32540; U567-C04) 내지 31.400 ± 0.09 U (DSM 33362) (중앙 값 3.08)의 범위였다. 펩티다제 활성이 낮은 균주 (내부 번호를 가짐 / 또는 DSMZ: U002-C04; U541-C05; U776-C02; DSM 33301; U021-C01; DSM32540; U567-C04로 기탁됨)는 더 이상 평가되지 않았다. 다른 가장 활성인 균주는 DSM 33367, DSM 33374, DSM 33370, DSM 33371, DSM 33377, DSM 33373, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, DSM 33376, DSM 33375, DSM 33363, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 및 바실루스 메가테리움 DSM 33356이었다 (도 1, 도 2). PepI의 중앙 값은 1.66이었다. 가장 활성인 균주 (PepI 활성 > 18 U)는 DSM 33375, DSM 33373이었다. PepX 활성은 0.0 내지 약 24 U 범위였다. 가장 활성인 균주는 DSM 33379, DSM 33371, DSM 33370, DSM 33369, DSM 33374, DSM 33373, 및 DSM 33363이었다 (도 1 및 도 2) (중앙 값 1.81). PepO의 중앙 값은 0.54였다. 가장 활성인 균주 (PepO 활성 > 5 U)는 DSM 33353, DSM 33355, 및 DSM 33301이었다. PepP 활성은 0.0 내지 6.23 U (DSM 33368) (중앙 값 0.22)였다. 다른 가장 활성인 균주 (PepP 활성 > 3 U)는 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33378, DSM 33371, DSM 33377, DSM 33367, DSM 33374, DSM 33366, DSM 33373, 및 DSM 33364였다.
도 1은 119가지의 바실루스, 락토바실루스, 페디오코쿠스, 및 웨이셀라 균주의 세포질 추출물의 일반적 아미노펩티다제 N형 (PepN), 프롤린 이미노펩티다제 (PepI), X-프롤릴 디펩티딜 아미노펩티다제 (PepX), 엔도펩티다제 (PepO) 및 프롤릴 엔도펩티다제 (PepP) 활성에 기초하여 주성분 분석 (PCA) 후 제1 및 제2 주성분의 점수 (A) 및 로딩 (B) 플롯을 나타낸다. PepN, PepI, PepX, PepP는 각각 Leu-p-니트로아닐리드 (p-NA), Pro-p-NA, Gly-Pro-p-NA, Z-Gly-Gly-Leu-p-NA 및 Z-Gly-Pro-4-니트로아닐리드 기질을 사용하여 측정되었다. 매우 높은 펩티다제 활성 (적어도 하나의 펩티다제에 대해)을 나타내는 균주는 적색으로 보고되었다.
도 2는 선별된 단일 바실루스 (비.(B.)), 락토바실루스 (엘.(L.)) 및 페디오코쿠스 (피.(P.)) 균주의 펩티다제 활성 (PepN, PepI, PepX, PepO 및 PepP)을 나타낸다. 1 단위 (U)의 활성은 검정 조건 하에서 분당 1 μmol의 p-니트로아닐리드를 유리시키는데 필요한 효소의 양으로 정의되었다.
실시예 3. 면역원성 에피토프에 대한 균주의 혼합물의 펩티다제 활성
매우 높은 펩티다제 활성 (적어도 하나의 펩티다제에 대해)을 나타내는 바실루스, 락토바실루스 및 페디오코쿠스 균주는 강력하고 상보적인 효소 활성을 조합하기 위해 혼합된 균주로 평가되었다. 다양한 혼합물을 사용하여 시험관내에서 글루텐 불내성에 책임이 있는 면역원성 에피토프를 분해하는 능력을 검정하였다.
펩티드의 가수분해는 이전에 선별된 박테리아 균주의 세포질 추출물의 조합을 사용하여 수행되었다. α9-글리아딘의 단편 57-68 (Q-L-Q-P-F-P-Q-P-Q-L-P-Y), A-글리아딘의 단편 62-75 (P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-S-F-P), γ-글리아딘의 단편 134-153 (Q-Q-L-P-Q-P-Q-Q-P-Q-Q-S-F-P-Q-Q-Q-R-P-F), 및 α2-글리아딘의 단편 57-89 (L-Q-L-Q-P-F-P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-P-F) (33-mer)에 상응하는 면역원성 에피토프는 화학적으로 합성되어 1 mM의 초기 농도로 사용되었다. 가수분해는 RP-HPLC로 모니터링되었다. RP-HPLC로부터의 단일 피크는 나노-ESI 탠덤 질량 분광측정 (나노-ESI-MS/MS)로 분석되었다. 합성 면역원성 에피토프의 최고의 가수분해를 나타내는 균주의 혼합물은 3, 4 및 5번 (도 3)으로 모든 독성 펩티드를 완전히 가수분해하였다 (90% 가수분해 또는 그 초과). 도 3은 면역원성 에피토프에 대한 균주 혼합물의 펩티다제 활성을 나타낸다.
균주 혼합물은 하기와 같았다:
1. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33363, DSM 33364, DSM 33366; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379; 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 바실루스 서브틸리스 DSM 33353.
2. 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, DSM 33376; 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33369, DSM 33368; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378; 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33301.
3. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363, DSM 33364; 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377; 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 바실루스 서브틸리스 DSM 33353.
4. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379; 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, DSM 33353.
5. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376; 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378; 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298.
6. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33367, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374; 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377; 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298.
실시예 4. 상이한 컨소시엄에 의한 모의 위장 조건 하에서의 글루텐 분해
모의 위장 소화 하에서 글루텐 분해가 평가되었다. 생체내에서 글루텐의 완전한 분해를 위한 실현가능한 기술적 솔루션을 개발하려는 의도로, 본 발명자들은 가능한 한 적은 수의 균주를 필요한 만큼 많이 함유하는 최소 조합을 검색하였다.
시작점으로 실시예 3의 혼합물 1-6을 사용하여, 총 22가지의 균주 (락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33362, DSM 33363, DSM 33364, DSM 33366, DSM 33368, DSM 33369 및 DSM 33367; 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374; 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, DSM 33375; 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371; 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, DSM 33301, DSM 33355, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, DSM 33353)로부터 선별된 하기 컨소시엄을 제조하였다:
1. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, DSM 33301
2. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362 및 DSM 33367, DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300;
3. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353;
4. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301;
5. 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33369, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300;
6. 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, DSM 33368; 바실루스 푸밀루스 DSM 33355, 및 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354;
7. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33362, 및 DSM 33366, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353.
8. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297;
9. 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 비. 리케니포르미스 DSM 33354;
10. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, DSM 33364, DSM 33370, 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 메가테리움 DSM 33356;
11. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 서브틸리스 DSM 33353;
12. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, DSM 33369, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 피. 펜토사세우스 DSM 33371, 비. 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355;
13. 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 피. 펜토사세우스 DSM 33371, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297;
14. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 비. 리케니포르미스 DSM 33354;
15. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33366, DSM 33370, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, DSM 33379, 비. 리케니포르미스 DSM 33354, 비. 서브틸리스 DSM 33353;
16. 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355.
5 g의 밀 빵 (30초 동안 씹고 10 mL의 NaK-포스페이트 0.05 M, pH 6.9가 포함된 비커에 수집) 또는 관련된 도우를 NaCl (125 mM), KCl (7 mM), NaHCO3 (45 mM), 및 펩신 (3 g/L) (시그마-알드리치 캄파니, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 함유하는 모의 위액에 현탁시켰다. 살아있는 박테리아 (대략 9.0 log CFU/mL의 최종 세포 밀도를 가짐) 및 용해된 박테리아 (9.0 log 세포/mL에 상응)로서 풀링된 선별된 균주의 현탁액을 첨가하였다. 반응 혼합물 중 글루텐의 계산된 초기 양은 7,000 ppm이었다. 박테리아 혼합물을 첨가하지 않은 대조군 도우도 모의 소화를 거쳤다. 현탁액을 연동을 모의하기 위해 교반 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. 위 소화 180분 후, 현탁액에 pH 8.0에서 0.1% (w/v) 판크레아틴 및 0.15% (w/v) 옥스갈 담즙염 (시그마-알드리치 캄파니)을 함유하는 모의 장액이 첨가되었다. 판크레아틴 및 담즙염 외에, 유체는 효소 제제 E1, E2 (각각 0.2 g/kg), 베론(Veron) HPP (10 g/100 kg 단백질) 및 베론 PS (25 g/100 kg 단백질) 효소를 함유하였다. 베이커리 적용에 통상적으로 사용되는 아스페르길루스 오리자에 (티로신 기준으로 500,000 헤모글로빈 단위/g, 효소 1 [E1]) 및 아스페르길루스 니거 (3,000 분광광도측정 산 프로테아제 단위/g, 효소 2 [E2])의 프로테아제는 BIO-CAT 인크.(BIO-CAT Inc.) (버지니아주 트로이)에 의해 공급되었다. 베론 HPP 및 베론 PS는 바실루스 서브틸리스로부터의 박테리아 프로테아제 (AB 엔자임즈(AB Enzymes))이다. 효소 혼합물 (E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP)은 대조군 도우에 첨가되지 않았다. 장 소화는 교반 조건 (약 200 rpm) 하에 37℃에서 48시간 동안 수행되었다. 소화 후, 샘플을 얼음 위에 놓고, 가수분해된 글루텐 농도를 R5 항체-기반 샌드위치 및 경쟁적 ELISA (R5-ELISA) [22]를 이용하여 AOAC (공립 농업화학자 협회) 국제 공식 분석법 (OMA) (방법 번호 AACCI 38-55.01)에 따라 결정하였다. R5-ELISA 분석은 제조업체 (알-바이오팜 아게(R-Biopharm AG), 독일)의 지침에 따라 리다스크린(RIDASCREEN)® 글리아딘 경쟁적 검출 키트를 사용하여 수행되었다. 또한, ELISA 시스템 글루텐 잔기 검출 키트 (오스트레일리아 윈저)를 사용하여 잔류 글루텐을 정량화하였다. 소화된 샘플에서 에피토프의 존재는 HPLC 분석을 통해 6, 16, 24, 36 및 48시간 인큐베이션 후에 모니터링되었다. 나노 전기분무 이온화-이온 트랩 탠덤 질량 분석측정 (나노-ESI-MS/MS)과 커플링된 액체 크로마토그래피를 이용하여 글루텐의 가수분해 및 독성 에피토프의 부재를 확인하였다.
R5-ELISA (AOAC 공식 분석법, 방법 번호 AACCI 38-55.01)에 의해 추정되는 바와 같이, 소화 6시간 후, 가수분해된 글루텐 농도는 대조군의 경우 810 ± 0.02 ppm, 혼합물 3의 경우 310 ± 0.06 ppm 범위였다 (표 2). 소화 16 및 24시간 후, 글루텐 함량은, 혼합물 16을 제외하고는, 대부분의 혼합물에서 ≥ 100 ppm이었다. 중요하게도, 글루텐 단편 수준은 혼합물 4 및 16을 사용한 소화 36시간 후 20 ppm 미만이었고; 글루텐 단편은 혼합물 4, 5, 6, 8 및 16에 대해 인큐베이션이 끝날 때 (48시간) 완전히 없었다.
잔류 글루텐과 관련하여, 대부분의 혼합물 (MC1-9, 16)은 소화 24시간 이내에 20 ppm의 임계 역치 미만으로 감소시켰다. 또한, 혼합물 4-9 및 16은 16시간 이내에 잔류 글루텐을 ≤ 20 ppm으로 감소시킬 수 있었다. 가장 중요하게도, 혼합물 4는 소화 16시간 후에 완전한 것으로 나타났다 (도 5). MC8 및 MC16은 소화 첫 6시간 이내에 이미 완전한 글루텐 분해를 초래하였다. 전체적으로, MC4, MC8 및 MC16은 온전한 글루텐 뿐만 아니라 단편화된 글루텐을 가장 효율적으로 제거하였다 (표 2).
표 2. 특정 ELISA 시험에 의해 추정된, 모의 위장 소화 6, 16, 24, 36 및 48시간 후 프롤라민의 잔류 글루텐 및 펩티드 단편의 농도 (ppm). 대조군: 박테리아 세포 및 상업용 효소 없이 소화된 도우; MC1-MC16: 선별된 락토바실루스 (엘.) 및 바실루스 (비.) 균주의 살아있는 세포 및 용해된 세포 및 E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP 상업용 효소를 사용하여 구축된 미생물 컨소시엄. 데이터는 3개의 독립적인 분석의 평균이다. 동일한 행에서 상이한 위 첨자 문자를 갖는 a-j값은 상당히 상이하다 (P < 0.05).
7,000 ppm의 반응 혼합물 중 글루텐의 계산된 초기 양에 기초하여, 잔류 글루텐과 관련하여, 모든 혼합물은 이를 6시간 후 적어도 94% (대조군의 경우 약 84% 감소와 비교), 16시간 후 적어도 98%, 및 48시간 후 최대 적어도 99.1% 감소시킬 수 있었다. 글루텐 단편과 관련하여, 이는 모든 혼합물에 의해 6시간 후 적어도 91% (대조군의 경우 약 88% 감소와 비교), 16시간 후 적어도 95%, 및 48시간 후 최대 적어도 97% 감소되었다.
잔류 글루텐과 관련하여, 가장 효율적인 균주 MC4, MC8, 및 MC16은 6시간 후 적어도 97%, 16시간 후 적어도 99.8%, 및 24시간 후 최대 100% 감소시킬 수 있었다. 글루텐 단편과 관련하여, 가장 효율적인 균주 MC4, MC8, 및 MC16에 의해 6시간 후 적어도 94%, 16시간 후 적어도 97%, 36시간 후 적어도 98%, 및 48시간 후 최대 100% 감소되었다. 도 4는 대조군 (패널 A), 혼합물 4 (패널 B) 및 혼합물 7 (패널 C) 소화된 밀 빵 샘플의 RP-HPLC 펩티드 프로파일을 나타낸다. M4 및 M7은 E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP 상업용 효소와 조합되었다. 혼합물 4는 모든 면역원성 펩티드의 완전한 (93%) 가수분해를 유도한 반면, 혼합물 7에 의해서는 단지 부분적인 (56%) 가수분해만 달성되었다. 결론적으로, 본 발명자들은 실시예 3에 개시된 보다 광범위한 혼합물과 비교하여 단지 4-7가지의 선별된 균주를 포함하는 완전히 기능적인 혼합물을 밝혀내었다.
예시적인 미생물 컨소시엄을 위해, 본 발명자들은 첨가된 상업용 효소와 함께 및 그 없이 실험을 수행하였다. 컨소시엄만으로도 잔류 뿐만 아니라 가수분해된 글루텐의 강력한 감소가 나타났으며, 이는 첨가된 효소에 의해 더욱 향상되었다.
실시예 5. 셀리악 질환 환자로부터의 십이지장 외식편을 사용한 글루텐 소화물의 면역원성 평가
소화물의 면역원성은 셀리악 질환 (CD)을 갖는 환자로부터의 십이지장 생검 시료에서 시토카인 발현을 시험함으로써 생체외에서 추정되었다. 모든 CD 환자는 HLA-DQ2 표현형을 나타내었다. CD는 유럽 소아 소화기병학, 간장학 및 영양 학회 기준 [23]에 따라 진단되었다. 절제 직후, 모든 생검 시료를 얼음-냉각된 배양 배지 (RPMI 1640; 깁코-인비트로젠(Gibco-Invitrogen), UK)에 넣고, 30분 이내에 실험실로 수송하였다. 십이지장 생검 시료는 원래 브라우닝(Browning) 및 트리어(Trier) [24]에 의해 기재된 기관 조직 배양 방법을 이용하여 4시간 동안 배양되었다. 간단히 말해서, 생검 시료는 스테인리스-스틸 메쉬에서 융모 측이 위로 향하게 하고, 기관 조직 배양 접시 (팔콘(Falcon), 미국)의 중앙 웰 위에 배치되었다. 웰은 15% 소 태아 혈청 (깁코-인비트로젠) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI를 함유하였다. 접시를 혐기성 병에 넣고, 37℃에서 인큐베이션하였다.
대조군 도우 (양성 대조군) (박테리아 세포 및 미생물 효소를 첨가하지 않고 소화된 밀 빵), 혼합물 4 (엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301의 살아있는 세포 및 용해된 세포 및 E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP 상업용 효소를 첨가하여 소화된 밀 빵) 및 혼합물 7 (엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, 및 DSM 33366, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353의 살아있는 세포 및 용해된 세포 및 E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP 상업용 효소를 첨가하여 소화된 밀 빵)의 소화된 샘플은 글리아딘 및 글루테닌 폴리펩티드 추출을 거쳐 CD 환자로부터의 십이지장 생검 시료에서 시토카인 발현을 유도하는 능력을 평가하는데 사용되었다. 각각의 CD 환자로부터의 4가지 생검 시료를 5가지 조건 하에서 배양 배지와 함께 배양하였다: (i) 48시간 동안 소화된 혼합물 4 (엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301의 살아있는 세포 및 용해된 세포 및 E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP 상업용 효소를 첨가하여 소화된 밀 빵)를 함유하는 도우 사용; (ii) 48시간 동안 소화된 혼합물 7 (엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33362, 및 DSM 33366, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353의 살아있는 세포 및 용해된 세포 및 E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP 상업용 효소를 첨가하여 소화된 밀 빵)를 함유하는 도우 사용; (iii) 48시간 동안 소화된 혼합물 16 (엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33330, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 DSM 33355의 살아있는 세포 및 용해된 세포 및 E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP 상업용 효소를 첨가하여 소화된 밀 빵)를 함유하는 도우 사용; (iv) 48시간 동안 소화된 대조군 도우 (대조군) 사용; 및 (v) 배양 배지 (RPMI 1640+위액 및 장액, 음성 대조군) 사용. 각각의 환자로부터의 생검 시료를 세정하고, RNA를 보존하기 위해 -80℃에서 RNA레이터(RNAlater) (퀴아젠 게엠베하(Qiagen GmbH), 독일)에 저장하였다. 제조업체의 지침에 따라 RNeasy 미니키트 (퀴아젠 게엠베하)을 사용하여 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. mRNA의 농도는 260 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 추정되었다. 총 RNA의 분취량 (500ng)은 랜덤 육량체, 택맨(TaqMan) 역전사 시약 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 이탈리아 몬자), 및 3.125 U/μl의 멀티스크라이브(MultiScribe) 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 50 μl의 최종 부피로 역전사되었다. cDNA 샘플은 -20℃에서 저장되었다. RT-PCR은 ABI 프리즘 7500HT 신속 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 96-웰 플레이트에서 수행되었다. 데이터 수집 및 분석은 기계 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 표적 유전자 (IFN-γ, IL-2, IL-10) 및 내인성 대조군 (글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 [GAPDH]를 코딩하는 유전자)에 대한 PCR 프라이머 및 형광발생 프로브는 각각 택맨 유전자 발현 검정물 및 사전-개발된 택맨 검정물 (어플라이드 바이오시스템즈)로 구입되었다. 검정물은 PCR 프라이머와 프로브의 3' 말단에 비-형광 소광제를 갖는 택맨 마이너 그루브 바인더(TaqMan Minor Groove Binder) 6-카르복시플루오레세인 염료-표지된 프로브의 20x 믹스로 제공되었다. 2단계 역전사-PCR은 1x 택맨 유전자 발현 검정 믹스 및 1x 택맨 범용 PCR 마스터 믹스의 최종 농도와 함께 제1-가닥 cDNA를 사용하여 수행되었다. 최종 반응 부피는 25 μl였다. 각각의 샘플을 3중으로 분석하고, 모든 실험을 2회 반복하였다. 비-템플릿 대조군 (RNase-무함유 물)은 모든 플레이트에 포함되었다. 하기 열 사이클러 조건이 이용되었다: 50℃에서 2분 (우라실 DNA 글리코실라제 활성화), 95℃에서 10분, 및 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분의 40 사이클. 초기에, 각각의 프라이머/프로브 세트에 대해 표준 곡선 및 검증 실험을 수행하였다. IFN-γ, IL-2 또는 IL-10 cDNA의 6가지 연속 희석액 (20 내지 0.1 ng/μl)을 각각의 프라이머/프로브 세트에 대한 템플릿으로 사용하였다. 입력 cDNA의 양의 로그에 대해 역치 사이클 (CT) 값을 플롯팅하여 표준 곡선을 생성하였다. CT 값은 기준선 수준 초과의 리포터 형광 증가가 처음 검출되는 PCR 사이클이다. 표적 유전자에 대한 평균 값은 내인성 참조 유전자 (GAPDH 유전자)를 사용하여 정규화되었다. 건강한 십이지장 생검 시료를 사용하여 모든 실험을 보정하였다. 상청액으로 분비된 IFN-γ, IL-2 및 IL-10 단백질의 수준은 제조업체의 권장에 따라 96-웰 둥근-바닥 플레이트 (테마 리세르카(Tema Ricerca), 이탈리아 밀란)에서 ELISA로 정량화되었다.
예상대로, 양성 대조군과 함께 인큐베이션된 십이지장 생검 시료는 음성 대조군 (RPMI 1640 + 위액 및 장액)보다 유의하게 (P <0.05) 더 높은 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 10 (IL-10) (B), 및 인터페론 감마 (IFN-γ) mRNA 발현을 생성하였다 (도 5). 음성 대조군과 비교하여, 혼합물 4 및 16으로 소화된 샘플은 IL-2, IL-10 및 IFN-γ의 동일한 (P > 0.05) 수준을 나타내었다. 혼합물 7은 양성 대조군보다 더 낮은 IL-2 합성을 특징으로 하지만 음성 대조군 뿐만 아니라 혼합물 4 및 16과 비교하여 더 높은 IL-2 합성을 특징으로 한다. IL-10 및 IFN-γ에 대해서도 유사한 경향이 발견되었다. 이들 결과는 도 4a-c에 나타난 바와 같이 각각 혼합물 4 및 7에 의한 면역원성 펩티드의 전체적 및 부분적 제거와 상당히 관련이 있다.
도 5a는 CD를 갖는 환자로부터의 십이지장 생검 시료에서 인터류킨 2 (IL-2)의 농도 (ng/μl)를 나타낸다. 대조군: 박테리아 세포 및 미생물 효소를 첨가하지 않고 소화된 밀 빵; RPMI+위액 및 장액: 음성 대조군; 미생물 컨소시엄 4: 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301의 살아있는 세포 및 용해된 세포 및 E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP 상업용 효소를 첨가하여 소화된 밀 빵; 미생물 컨소시엄 7: 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33366 및 DSM 33370, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353의 살아있는 세포 및 용해된 세포 및 E1, E2, 베론 PS, 베론 HPP 상업용 효소를 첨가하여 소화된 밀 빵; 및 미생물 컨소시엄 16: 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33330, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355의 살아있는 세포 및 용해된 세포를 첨가하여 소화된 밀 빵. CD1 내지 CD10, 셀리악 환자로부터의 십이지장 생검 시료.
도 5b는 CD를 갖는 환자로부터의 십이지장 생검 시료에서 인터류킨 10 (IL-10)의 농도 (ng/μl)를 나타낸다. 샘플 및 미생물 컨소시엄은 도 5a와 동일하다.
도 5c는 CD를 갖는 환자로부터의 십이지장 생검 시료에서 인터페론 감마 (IFN-γ)의 농도 (ng/μl)를 나타낸다. 샘플 및 미생물 컨소시엄은 도 5a와 동일하다.
본 발명의 발견은 프로바이오틱 박테리아 균주의 선별된 조합이 글루텐-민감성 환자에서 글루텐의 소화를 개선시키고 위장 소화 동안 면역원성 펩티드를 가수분해하여 일반적으로 글루텐-민감성 환자, 특히 CD 환자에 대한 글루텐 독성을 감소시킬 잠재력을 갖는다는 증거를 제공한다.
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Invention title: Preparation comprising probiotic strains for gluten degradation ( en )
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END
Claims (17)
- 20 ppm 이하의 글루텐 함량으로의 글루텐의 분해에 사용하기 위한, 바실루스(Bacillus) 속으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 균주 및 락토바실루스(Lactobacillus) 속으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 균주의 컨소시엄을 포함하는 제제로서,
a) 상기 균주의 컨소시엄은 12-mer 펩티드 QLQPFPQPQLPY (서열식별번호: 1), 14-mer 펩티드 PQPQLPYPQPQSFP (서열식별번호: 2), 20-mer 펩티드 QQLPQPQQPQQSFPQQQRPF (서열식별번호: 3), 33-mer 펩티드 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열식별번호: 4)를 분해할 수 있는 것인
제제. - 제1항에 있어서, 균주의 컨소시엄이 12-mer 펩티드 QLQPFPQPQLPY (서열식별번호: 1), 14-mer 펩티드 PQPQLPYPQPQSFP (서열식별번호: 2), 20-mer 펩티드 QQLPQPQQPQQSFPQQQRPF (서열식별번호: 3), 33-mer 펩티드 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열식별번호: 4)를 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 분해할 수 있는 것인 제제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
b) 상기 균주의 컨소시엄이 글루텐-관련된 장애의 영향을 받는 대상체 또는 동물의 소장 또는 소장 외식편에서 면역원성 또는 독성 반응을 일으키지 않는 소화물로 글루텐을 분해할 수 있고/거나,
c) 컨소시엄의 모든 균주가 모의 위 (pH 1.0-4.0) 및 장 (pH 5.4-6.8; 0.05-0.6% 담즙산, 또는 생체내 조건 하에 인간에 존재하는 담즙산 농도) 조건에서 생존 (2 log 미만의 CFU 손실)하고/거나,
d) 컨소시엄의 구성원이 3 U/g (PepP), 5 U/g (PepO), 20 U/g (PepX), 17 U/g (PepI), 20 U/g (PepN) 이상의 적어도 하나의 펩티다제 활성을 갖는 상보적인 PepP, PepO, PepX, PepI 및 PepN 활성을 갖는 것인
제제. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바실루스 균주가 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 선택되고, 바람직하게는 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, DSM 33301, 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, DSM 33298, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356으로부터 선택되는 것인 제제.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 락토바실루스 균주가 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) (락티플란티바실루스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum)), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei) (락티카세이바실루스 카세이(Lacticaseibacillus casei)), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) (락티카세이바실루스 파라카세이(Lacticaseibacillus paracasei)), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis) (레비락토바실루스 브레비스(Levilactobacillus brevis)), 락토바실루스 산프란시센시스(Lactobacillus sanfranciscensis) (프룩티락토바실루스 산프란시센시스(Fructilactobacillus sanfranciscensis)), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri) (리모시락토바실루스 레우테리(Limosilactobacillus reuteri))로부터 선택되고, 바람직하게는 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33363, DSM 33364, DSM 33366, DSM 33367, DSM 33368, DSM 33369, DSM 33370, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, DSM 33375, DSM 33376, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, DSM 33379로부터 선택되는 것인 제제.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로바이오틱 균주가 휴면 형태로 또는 영양 세포로서 존재하는 것인 제제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프로바이오틱 균주의 세포질 추출물 또는 세포-무함유 상청액 또는 열-사멸된 바이오매스가 사용되는 것인 제제.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 하나 이상의 프로바이오틱 균주, 바람직하게는 페디오코쿠스 종(Pediococcus sp .), 웨이셀라 종(Weissella sp.), 보다 바람직하게는 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DSM 33371로부터 선택된 것을 추가로 포함하는 것인 제제.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 바실루스 종(Bacillus sp.), 락토바실루스 종(Lactobacillus sp.), 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종, 로티아 무실라기노사(Rothia mucilaginosa), 로티아 아에리아(Rothia aeria)로부터 정제된 미생물 프로테아제, 서브틸리신, 나토키나제, 아라비녹실란, 보리 곡립 섬유, 귀리 곡립 섬유, 호밀 섬유, 밀기울 섬유, 이눌린, 프룩토올리고사카라이드 (FOS), 갈락토올리고사카라이드 (GOS), 저항성 전분, 베타-글루칸, 글루코만난, 갈락토글루코만난, 구아 검, 크실로올리고사카라이드, 알기네이트 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 제제.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 글루텐-관련된 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체 또는 동물에서 바람직하게는 셀리악 질환, 비-셀리악 글루텐 민감성, 밀 알레르기, 및 글루텐-민감성 과민성 장 증후군으로부터 선택된 글루텐-관련된 장애를 치료 또는 예방하기 위한 제제.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 20 ppm 미만의 글루텐을 함유하는, 글루텐-함유 곡물 밀, 보리, 호밀 및 귀리로부터, 글루텐-무함유 식품을 생산하기 위한 제제.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 바실루스 종, 락토바실루스 종, 페디오코쿠스 종, 웨이셀라 종의 구성원의 미생물 세포막의 투과제로서 작용하는 물질, 바람직하게는 알기네이트를 추가로 포함하는 제제.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 바실루스 종, 락토바실루스 종, 페디오코쿠스 종 및 웨이셀라 종으로부터 선택된 프로바이오틱 균주 중 하나 이상이 개별적으로 또는 컨소시엄으로서 고정화되는 것인 제제.
- 하기 그룹 1-5 각각의 적어도 하나의 균주를 포함하는 제제:
그룹 1: 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375,
그룹 2: 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362,
그룹 3: 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373,
그룹 4: 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 바실루스 푸밀루스 DSM 33355, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301,
그룹 5: 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 락토바실루스 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 락토바실루스 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33368, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, 락토바실루스 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33364, 락토바실루스 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373. - 제14항에 있어서, 적어도 3가지의 상이한 균주, 바람직하게는 적어도 4가지의 상이한 균주, 보다 바람직하게는 적어도 5가지의 상이한 균주를 포함하는 제제.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 하기 균주를 포함하는 제제:
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363, DSM 33364; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373; 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377; 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 메가테리움 DSM 33300 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362, DSM 33367, DSM 33368; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379; 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298 및 DSM 33353, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366 및 DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374; 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376; 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371; 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33378; 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, DSM 33356 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33301, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 및 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 푸밀루스 DSM 33355, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33363 및 DSM 33364, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33373 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297, DSM 33355, DSM 33301, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33362 및 DSM 33367, DSM 33368, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 바실루스 서브틸리스 DSM 33298, 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33366, DSM 33369, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33376, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 페디오코쿠스 펜토사세우스 DSM 33371, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33369, 바실루스 푸밀루스 DSM 33297 및 바실루스 메가테리움 DSM 33300, 또는
- 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, DSM 33368; 바실루스 푸밀루스 DSM 33355, 및 바실루스 리케니포르미스 DSM 33354, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33370, DSM 33362, 및 DSM 33366, 락토바실루스 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 및 바실루스 서브틸리스 DSM 33353, 또는
- 엘. 파라카세이 (락티카세이바실루스 파라카세이) DSM 33375, 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33367, 엘. 레우테리 (리모시락토바실루스 레우테리) DSM 33374, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 비. 리케니포르미스 DSM 33354, 또는
- 엘. 플란타룸 (락티플란티바실루스 플란타룸) DSM 33363, DSM 33364, DSM 33370, 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 바실루스 메가테리움 DSM 33356, 또는
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- 엘. 브레비스 (레비락토바실루스 브레비스) DSM 33377, 피. 펜토사세우스 DSM 33371, 엘. 산프란시센시스 (프룩티락토바실루스 산프란시센시스) DSM 33379, 비. 메가테리움 DSM 33300, 비. 푸밀루스 DSM 33297, 또는
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