KR20220104797A - 비수성 에멀전을 이용한 지속 방출 제형 - Google Patents
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Abstract
중합체 또는 중합체-코팅된 마이크로입자를 생성하기 위한 비수성 에멀전 방법이 제공된다. 한 방법은 단백질 분말 및 중합체를 탄화수소 용매에서 배합하여 비수성 제1 용액을 형성하고, 제1 용액을 탄화플루오린 액체 및 플루오린 계면활성제를 포함하는 제2 용액에 첨가하여 탄화플루오린 액체 중에 다중 에멀전 탄화수소 액적을 포함하는 비수성 에멀전을 형성함으로써 지속 방출 마이크로입자 조성물을 생성한다. 후속 마이크로입자 경화 공정은 형성된 에멀전 액적으로부터 탄화수소 용매를 제거하는 단계를 포함하고, 이것은 교반 하에 주위 조건에서 탄화수소의 증발을 통해 또는 진공을 통해 가속 경화, 또는 탄화플루오린에 공용매로서 히드로플루오로에스테르의 첨가를 통해 달성될 수 있다. 탄화플루오린 액체를 제거하고 여분의 탄화플루오린 액체로 세척하여 지속 방출 마이크로입자를 단리하며, 여기서 지속 방출 마이크로입자는 하나 이상의 단백질 코어 및 중합체 피질을 포함한다.
Description
발명의 기술 분야
본 발명의 측면은 일반적으로 약물 마이크로구(microsphere) 제형 및 비수성 에멀전 시스템을 사용하여 그를 제조하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
생물학적 관련 표적을 향한 치료용 단백질의 연장 방출 전달은 암, 심혈관 질환, 혈관 병태, 정형외과 장애, 치과 장애, 상처, 자가면역 질환, 위장 장애, 및 안과 질환과 같은 의학적 병태의 치료에 바람직하다. 약물의 제어 및 연장 전달을 위한 생체적합성 및 생분해성 중합체 및 다른 이식가능한 전달 장치가 수십 년 동안 사용되었다. 예를 들어, 일부 중합체-기반 전달 장치에서는, 중합체가 시간에 따라 분해됨에 따라, 치료용 약물이 서서히 방출된다.
연장 방출이 환자 순응을 위해 바람직할 수 있다. 특히, 주사 횟수를 감소시키는 것이 특히 의사가 주사를 놓는 것이 요구되는 경우에는 예컨대 안내(intraocular) 치료제의 경우에는 유익할 수 있다. 가능한 적은 수의 주사로 시간에 따라 효과적으로 약물을 전달하는 연장 방출 제형에 대한 충족되지 않은 의학적 필요가 있다. 다른 질환, 예를 들어 암 및 염증 질환의 경우, 안정하고 효과적인 단백질 치료제를 함유하는 개선된 이식가능한 연장 방출 제형이 필요하다.
치료용 거대분자, 예컨대 항체 및 수용체 Fc-융합 단백질은 분자를 환자에게 투여하기에 적합하게 할 뿐만 아니라, 저장 동안 및 투여 부위에 있는 동안 그의 안정성을 유지하는 방식으로 제형화되어야 한다. 예를 들어, 수용액 중의 치료용 단백질(예를 들어, 항체 및 융합 단백질)은 용액이 적절하게 제형화되지 않으면 분해, 응집 및/또는 요망되지 않는 화학적 변형이 일어나기 쉽다. 액체 제형에서 단백질 치료제의 안정성은 제형에 사용되는 부형제의 종류 및 그 부형제들의 서로에 대한 양 및 비율 뿐만 아니라 가용성 단백질의 농도에 의존한다. 치료용 단백질 제형을 제조할 때에는 안정성 외의 고려사항을 또한 고려해야 한다. 그러한 추가 고려사항의 예는 용액의 점도 및 주어진 제형에 의해 수용될 수 있는 치료용 단백질의 농도를 포함한다. 연장 방출을 위해 치료용 단백질을 제형화할 때, 시간에 따라 및 저장 및 생리학적 온도에서 계속 안정하고, 적절한 농도의 항체를 함유하고, 제형이 환자에게 편리하게 투여되는 것을 가능하게 하는 다른 특성을 가지는 제형에 도달하기 위해 많은 주의를 기울여야 한다.
일부 연장 방출 제형은 다음을 포함하는 다양한 봉입 방법을 사용하여 생성된다: 내부 상 분리, 계면 중합, 다중 에멀전의 형성, 고분자전해질의 층별 흡착 및 소프트 템플레이팅 기술. 수중유중수(Water-in-oil-in-water)(W/O/W) 다중 에멀전은 다중 에멀전의 가장 흔한 유형이며, 수성 현탁액에서 직접 수성/친수성 코어의 봉입을 가능하게 한다. 불행하게도, 수성 에멀전 시스템은 생물학적 활성제를 연장 방출 제형에 봉입하는 데 사용될 때 특정한 문제를 가진다. 예를 들어, 단백질의 침전이 수성 유기 계면에서 일어나고, 이에 수반하여 그들의 면역반응성 감소가 일어난다(Raghuvanshi, R., et al., Pharm Dev Technol, 3(2):269-76 (1998)). 일부 수성 에멀전 시스템에서는, 물이 유기상으로 확산되어 단백질을 가수분해할 수 있다. 가수분해 후, 단백질 액적이 합쳐지기 시작하고, 수성 환경 내로 빠져 나와 응집 또는 침전된다. 경화 후에, 공극 및 물 채널이 마이크로입자에 단백질이 이전에 있었지만 수성 환경으로 빠져나간 곳에 나타난다.
비수성 에멀전은 물의 존재가 바람직하지 않은 경우이면 언제나 정규 수성 에멀전을 대체할 수 있다. 그러나, 문헌 또는 종래 기술에서 비수성 에멀전에 관한 보고는 거의 없다. 탄화수소-기반 비수성 에멀전 시스템의 2가지 유형이 알려져 있다: (1). 공중합체(예를 들어, 헥산/디메틸포름아미드)를 차단시켜 안정화된 2종의 비혼화성 유기 용매; 및 (2.) 기존의 계면활성제를 사용하여 물을 대체하는 오일-비혼화성 극성 용매(예를 들어, 포름아미드, 아세토니트릴). 이전에, 퍼플루오린화 오일 중 물(W/F) 에멀전이 연구되었고, 단일 세포 또는 단일 분자 생물학적 검정을 위해 액적-기반 미세유체학에서 널리 응용되었다. 이들 연구에서, PFPE-PEG-PFPE는 탄화플루오린 용매에서 물 액적을 안정화시키기 위한 플루오린 계면활성제(FS)로서 사용되어 왔다.
많은 비혼화성-용매-쌍, 보통은 하나는 극성이고 하나는 비극성인 쌍이 입수가능하지만, 과제는 중합체 마이크로구의 합성에 적합한 쌍을 찾는 것이다. 대표적인 생분해성 중합체, 예를 들어 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 폴리락트산(PLA), 폴리(오르토 에스테르)(POE)는 중간 극성을 갖는 용매, 예컨대 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 등에 대부분 용해된다. 이것은 연속상의 선택을 제한한다. 추가로, 공정, 독성, 안전성 및 잔류 용매와의 상용성은 그들 유기 용매 사용의 관심사이고, 의약품으로서의 용도를 위해서는 고려할 필요가 있다.
탄화플루오린은 다음의 일반적인 특성 때문에 비수성 에멀전 시스템에서 연속상으로서 사용될 수 있다:
1. 탄화플루오린은 "소수성"도 아니고 "친수성"도 아니며, 그들은 그들을 탄화수소 액적 에멀전을 위한 연속상으로서 이상적이게 하는 대부분 유기 (탄화수소) 용매와 비혼화성이다.
2. 탄화플루오린은 단백질 및 다른 친수성 분자, 탄화수소-기반 중합체 및 유기 부형제에 대해 비용매이며, 즉 이러한 유형의 분자는 탄화플루오린에 용해되지 않을 것이다.
3. 탄화플루오린은 낮은 점도를 가진다.
4. 탄화플루오린은 화학적으로 불활성이고, 흔하게 사용되는 탄화수소 용매에 비해 상대적으로 덜 독성 또는 부식성일 수 있다.
5. 탄화플루오린은 휘발성이며 재활용할 수 있다.
이전 문헌은 탄화플루오린을 함유하는 다양한 종류의 에멀전 시스템이 미세유체학 방법, 예컨대 탄화플루오린 중 물(W/F), 물 중 탄화플루오린 중 물(W/F/W) 이중 에멀전, 물/탄화플루오린/오일/물(W/F/O/W) 삼중 에멀전, 탄화플루오린/탄화수소/물(F/H/W) 이중 에멀전, 및 탄화수소/탄화플루오린/물(H/F/W) 이중 에멀전을 통해 제작되었다고 보고하였다. 이들 에멀전 중 일부는 중합체성 마이크로구의 합성에 사용되어 왔다. 그러나, 그들 모두는 여전히 물을 분산상 또는 연속상으로서 사용하는 수성-기반 에멀전 시스템이다.
따라서, 본 발명의 목적은 약물 제형의 생성을 위한 비수성 에멀전 시스템 및 그의 사용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개선된 단백질 안정성 및 안정한 연장 방출을 갖는 연장 방출 제형을 제공하는 것이다.
발명의 개요
중합체 및 중합체-코팅된 마이크로입자를 생성하기 위한 비수성 에멀전 방법이 제공된다. 한 실시양태는 단백질 분말 및 생분해성 또는 생침식성 중합체를 탄화수소 용매에서 배합하여 비수성 제1 용액을 형성하는 단계 및 제1 용액을 탄화플루오린 액체 및 플루오린 계면활성제를 포함하는 제2 용액에 첨가하여 탄화플루오린 액체 내에 다중 에멀전 탄화수소 액적을 함유하는 비수성 에멀전을 형성하는 단계에 의해 지속 방출 또는 제어 방출 마이크로입자 조성물을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 에멀전은 벌크 에멀전에 의해 형성된다. 방법은 탄화수소 용매를 제거하는 단계 및 탄화플루오린 액체를 제거하여 지속 방출 또는 제어 방출 마이크로입자를 단리하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 지속 방출 마이크로입자는 하나 이상의 단백질 분말 코어 및 생분해성 또는 생침식성 중합체 피질(cortex)을 함유한다. 탄화플루오린 및 탄화수소 액체는 비수성 에멀전을 교반하고 주위 대기압 하에 또는 진공 하에 탄화플루오린 및 탄화수소 액체를 증발시키는 동안에 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 탄화플루오린 액체가 히드로플루오로에테르(HFE)를 함유하거나, 또는 에멀전화 후에 추가의 HFE를 비수성 에멀전에 첨가하여 탄화수소를 탄화플루오린 액체 내로 신속하게 추출하여 마이크로구 경화를 가속화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 분말은 미세화된 단백질 분말이다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자는 마이크로입자 상에 남아 있는 임의의 잔류 탄화수소 용매, 탄화플루오린 액체, 플루오린 계면활성제, 또는 그들의 배합을 제거하기 위해 세척된다. 전형적인 탄화플루오린 액체는 FC-40을 포함하지만 이에 제한되지 않는 퍼플루오로 C5-C18 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄화플루오린 액체는 HFE를 함유한다. 전형적인 탄화수소 용매는 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 그의 배합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적인 플루오린 계면활성제는 퍼플루오로폴리에테르-b-폴리에틸렌 글리콜-b-퍼플루오로폴리에테르(PFPE-PEG-PFPE) 삼블록 공중합체이다. 전형적인 생침식성 중합체는 폴리오르토에스테르(POE)이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 융합 단백질, 또는 재조합 단백질이다. 한 실시양태에서, 단백질은 분무 건조된 VEGF Trap 단백질이다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자는 1.0 내지 100 μm 또는 1.0 내지 200 μm의 직경을 가진다. 한 실시양태에서, 개시된 비수성 에멀전 방법에 의해 형성된 마이크로입자는 유동성 마이크로입자 조성물이다. 개시된 유동성 마이크로입자 조성물은 제약학상 허용되는 부형제, 예를 들어 pH 완충 식염수에 현탁되거나, 또는 유성 비히클 예컨대 중쇄 트리글리세라이드에 현탁될 수 있다. 유동성 마이크로입자 조성물은 비경구, 예를 들어 27G 바늘을 갖는 주사기를 사용하여 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태는 5.0 내지 40% w/v POE를 포함하는 탄화수소 용액 중에 현탁된 1.0 내지 30.0% w/v 분무 건조된 단백질을 포함하는 분산상을 0.1 내지 5.0% w/v 플루오린 계면활성제 및 임의로 HFE를 포함하는 탄화플루오린 용액을 포함하는 연속상에서 에멀전화하여 분산상의 에멀전 액적을 형성하는 단계에 의해 중합체-코팅된 마이크로구의 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 방법은 에멀전을 교반하면서 탄화수소 액체를 제거함으로써 에멀전 액적을 경화하여 중합체-코팅된 마이크로구의 집단을 형성하는 단계 및 임의로 마이크로입자를 세척하여 임의의 탄화수소 용액, 탄화플루오린 용액, 플루오린 계면활성제, 또는 그의 배합을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 탄화수소 및 탄화플루오린 용액은 주위 대기압 또는 진공 하에서 증발에 의해 제거된다.
또 다른 실시양태는 용해된 중합체를 함유하는 탄화수소 용액을 분무 건조된 단백질 분말과 배합하여 분산상을 생성하는 단계 및 분산상을 탄화플루오린 액체 및 0.2 내지 5.0% w/v의 FS 및 임의로 HFE를 포함하는 연속상과 배합하여 연속상 중의 분산상의 에멀전 액적을 생성하는 단계에 의해 중합체-코팅된 마이크로입자를 생성하는 방법을 제공한다. 방법은 진공 하에 있는 동안 에멀전을 교반함으로써 탄화수소 및 탄화플루오린 용액을 제거하여 마이크로입자를 경화하는 단계 및 그 다음에 중합체 코팅된 마이크로입자를 수확하는 단계를 포함한다. 방법은 또한 수확된 마이크로입자를 세척하는 임의적 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태는 탄화수소 용매에 중합체를 함유하는 제1 용액과 탄화플루오린 용매 및 플루오린 계면활성제를 함유하는 제2 용액을 배합하는 단계 및 배합된 용액을 휘저어서 에멀전을 생성하는 단계에 의해 마이크로입자를 생성하는 방법을 제공한다. 방법은 배합된 용액을 교반하면서 진공 하에서 탄화수소 용매를 제거하여 마이크로입자를 경화하는 단계 및 마이크로입자를 수확하는 단계를 포함한다. 방법은 임의적으로 마이크로입자를 세척하는 단계 및 마이크로입자를 건조시키는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태는 본원에 기재된 비수성 에멀전 방법에 의해 생성된 중합체-코팅된 마이크로입자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자는 마이크로입자의 중합체 표면 또는 내부 매트릭스에 기공 또는 채널을 거의 또는 전혀 가지지 않는다.
또 다른 실시양태는 본원에 개시된 비수성 에멀전 방법을 사용하여 생성된 중합체-코팅된 마이크로입자를 함유하는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 마이크로입자의 크기는 제형 조성물 및 공정 매개변수를 변화시킴으로써 요망되는 직경 또는 크기로 조정될 수 있다.
도 1a는 H/F 기반 벌크 에멀전을 통한 블랭크 POE 마이크로구 생성 공정을 나타낸 도해이다 - 도식 1. 도 1b는 FC-40의 화학 구조를 나타낸다. 도 1c는 퍼플루오로폴리에테르/폴리(에틸렌 글리콜) 삼블록 공중합체인, 플루오린 계면활성제 PFPE-PEG-PFPE (Pico-Surf™ 1)의 화학 구조를 나타낸다. Pico-Surf™ 1은 예를 들어 FC-40 중의 5%(w/w)로 상업적으로 입수가능하다.
도 2a는 H/F 에멀전을 통해 형성된 블랭크 POE 마이크로구의 현미경사진이다. 도 2b는 낮은 FS 함량으로 발견된 POE 응집을 보여주는 현미경 사진이다.
도 3a, 3b 및 3c는 낮은, 중간 및 높은 균질화 속도로 H/F 에멀전을 통해 형성된 블랭크 POE 마이크로구의 현미경 사진이다.
도 4 (도식 2)는 S/H/F 기반 벌크 에멀전을 통한 POE 마이크로구 내 SDP 봉입 공정을 나타내는 도해이다.
도 5 (도식 3)은 단백질 SDP의 봉입을 위한 탄화플루오린 중 탄화수소 에멀전 시스템을 보여주는 도해이다.
도 6a 및 6b는 FC-40에 분산된 POE 및 형광 표지된 분무 건조된 단백질(F-SDP)을 함유하는 에틸 아세테이트 액적의 형광 이미지이다. F-SDP가 액적 내에서 그의 원래의 크기 및 모르폴로지를 보유하였음을 주목한다.
도 7a는 VEGF Trap F-SDP-봉입된 마이크로구의 명시야 현미경 사진이다. 도 7b는 VEGF Trap F-SDP-봉입된 마이크로구의 형광 이미지이다 (막대 = 20 μm). 도 7c는 VEGF Trap F-SDP-봉입된 마이크로구의 형광 이미지이다 (막대 = 10 μm).
도 8a-8d는 수성 환경에 놓인 VEGF Trap F-SDP-봉입된 POE 마이크로구의 형광 이미지이다. F-SDP가 액적 내에서 그의 원래의 크기 및 모르폴로지를 보유하였음을 주목한다.
도 9는 비수성 에멀전 방법에서 디클로로메탄(DCM) 또는 에틸 아세테이트(EtAc)를 사용하여 생성된 마이크로입자의 부피 밀도(%) 대 크기(μm)의 선 그래프이다.
도 10a 및 10b는 각각 10% 및 30% w/w VEGF Trap SDP가 로딩된 마이크로입자의 현미경 사진이다.
도 11a 및 11b는 각각 10% 및 30% w/w SDP가 로딩된 VEGF Trap F-SDP-봉입된 POE 마이크로구의 대표적인 형광 이미지이다. F-SDP가 액적 내에서 그의 원래의 크기 및 형태를 보유하였음을 주목한다.
도 12a-12c는 5%, 10% 및 30% w/w SDP가 로딩된 마이크로입자의 주사전자현미경(SEM) 이미지이고, SDP 로딩이 증가함에 따라 마이크로입자의 표면에서 단백질 증가를 보여준다.
도 13a 및 도 13b는 Dv50이 2.18 μm 및 5.63 μm인 분무 건조 단백질의 SEM 이미지이다.
도 14a, 14b 및 14c는 PLA 마이크로구 내에 봉입된 VEGF-Trap F-SDP의 명시야, 형광 및 SEM 이미지이다.
도 15a 및 15b는 PLGA 마이크로구 내에 봉입된 VEGF-Trap F-SDP의 명시야 및 형광 이미지이다.
도 2a는 H/F 에멀전을 통해 형성된 블랭크 POE 마이크로구의 현미경사진이다. 도 2b는 낮은 FS 함량으로 발견된 POE 응집을 보여주는 현미경 사진이다.
도 3a, 3b 및 3c는 낮은, 중간 및 높은 균질화 속도로 H/F 에멀전을 통해 형성된 블랭크 POE 마이크로구의 현미경 사진이다.
도 4 (도식 2)는 S/H/F 기반 벌크 에멀전을 통한 POE 마이크로구 내 SDP 봉입 공정을 나타내는 도해이다.
도 5 (도식 3)은 단백질 SDP의 봉입을 위한 탄화플루오린 중 탄화수소 에멀전 시스템을 보여주는 도해이다.
도 6a 및 6b는 FC-40에 분산된 POE 및 형광 표지된 분무 건조된 단백질(F-SDP)을 함유하는 에틸 아세테이트 액적의 형광 이미지이다. F-SDP가 액적 내에서 그의 원래의 크기 및 모르폴로지를 보유하였음을 주목한다.
도 7a는 VEGF Trap F-SDP-봉입된 마이크로구의 명시야 현미경 사진이다. 도 7b는 VEGF Trap F-SDP-봉입된 마이크로구의 형광 이미지이다 (막대 = 20 μm). 도 7c는 VEGF Trap F-SDP-봉입된 마이크로구의 형광 이미지이다 (막대 = 10 μm).
도 8a-8d는 수성 환경에 놓인 VEGF Trap F-SDP-봉입된 POE 마이크로구의 형광 이미지이다. F-SDP가 액적 내에서 그의 원래의 크기 및 모르폴로지를 보유하였음을 주목한다.
도 9는 비수성 에멀전 방법에서 디클로로메탄(DCM) 또는 에틸 아세테이트(EtAc)를 사용하여 생성된 마이크로입자의 부피 밀도(%) 대 크기(μm)의 선 그래프이다.
도 10a 및 10b는 각각 10% 및 30% w/w VEGF Trap SDP가 로딩된 마이크로입자의 현미경 사진이다.
도 11a 및 11b는 각각 10% 및 30% w/w SDP가 로딩된 VEGF Trap F-SDP-봉입된 POE 마이크로구의 대표적인 형광 이미지이다. F-SDP가 액적 내에서 그의 원래의 크기 및 형태를 보유하였음을 주목한다.
도 12a-12c는 5%, 10% 및 30% w/w SDP가 로딩된 마이크로입자의 주사전자현미경(SEM) 이미지이고, SDP 로딩이 증가함에 따라 마이크로입자의 표면에서 단백질 증가를 보여준다.
도 13a 및 도 13b는 Dv50이 2.18 μm 및 5.63 μm인 분무 건조 단백질의 SEM 이미지이다.
도 14a, 14b 및 14c는 PLA 마이크로구 내에 봉입된 VEGF-Trap F-SDP의 명시야, 형광 및 SEM 이미지이다.
도 15a 및 15b는 PLGA 마이크로구 내에 봉입된 VEGF-Trap F-SDP의 명시야 및 형광 이미지이다.
I. 정의
본 개시물은 본원에 기재된 조성물 및 방법 뿐만 아니라 기재된 실험 조건에 제한되지 않으며 그 이유는 그러한 것이 변할 수 있기 때문이라는 것을 이해해야 한다. 또한 본 개시물의 범위가 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용되는 용어가 단지 일부 실시양태를 설명하기 위한 것일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다.
다르게 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시물이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자가 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 하지만 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 조성물, 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 언급된 모든 간행물은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
현재 청구된 발명을 기술하는 맥락에서(특히 청구범위의 맥락에서) 용어 "a", "an", "the" 및 유사한 지시대상의 사용은, 본원에서 다르게 지시되지 않거나 또는 문맥에 의해 명백히 모순되지 않으면, 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 값들의 범위들의 열거는 본원에서 다르게 지시되지 않으면, 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 것의 약기 방법으로서 기능하도록 의도되고, 각각의 개별 값은 마치 그것이 본원에서 개별적으로 열거된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
용어 "약"의 사용은 진술된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 10%의 범위의 값을 기술하는 것을 의도하고; 다른 실시양태에서, 값들은 진술된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 5%의 범위의 값의 범위일 수 있고; 다른 실시양태에서, 값들은 진술된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 2%의 범위의 값의 범위일 수 있고; 다른 실시양태에서, 값들은 진술된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 1%의 범위의 값의 범위일 수 있다. 상기 범위들이 문맥에 의해 명확해지는 것을 의도하고, 더 이상의 제한은 함축되지 않는다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 지시되지 않거나 또는 달리 명백하게 문맥에 의해 모순되지 않으면 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예들, 또는 전형적 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 분명히 하기 위한 것을 의도하고, 달리 주장되지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 두지 않는다. 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비청구된 요소를 지시하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
"단백질"은 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 단백질은 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하고, 또한 변형 예컨대 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 알킬화, 히드록실화 및 ADP-리보실화를 포함할 수 있다. 단백질-기반 약물을 포함해서, 단백질은 과학적 또는 상업적 관심을 끌 수 있고, 단백질은 무엇보다도 효소, 리간드, 수용체, 항체 및 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 단백질은 잘 알려진 세포 배양 방법을 사용하여 다양한 유형의 재조합 세포에 의해 생성되고, 일반적으로 유전 공학 기술(예를 들어, 예컨대 키메라 단백질을 코딩하는 서열, 또는 코돈-최적화된 서열, 인트론이 없는 서열 등)에 의해 세포 내로 도입되며, 여기서 그것은 에피솜(episome)으로서 거주할 수 있거나 또는 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
"항체"는 이황화 결합에 의해 상호연결된 4개의 폴리펩티드 사슬인 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 가진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 함유한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 가진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리는 더 보존되는 영역이 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 초변이성 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 다음 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 서브클래스의 글리코실화된 및 비글리코실화된 면역글로불린 둘 모두의 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현시키기 위해 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조된, 발현된, 생성된 또는 단리된 항체 분자를 포함한다. 용어, 항체는 또한 하나 초과의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 이종사량체 면역글로불린을 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 본 출원에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 8,586,713에 기재되어 있다.
"Fc 융합 단백질"은 하나가 면역글로불린 분자의 Fc 부분인 둘 이상의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하며, 이들은 그 외에 자연에서는 함께 발견되지 않는다. 항체-유래 폴리펩티드(Fc 도메인을 포함함)의 다양한 부분에 융합된 일부 이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는 예를 들어 Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; 및 Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19.11, 1992"에 의해서 기재되었다. "수용체 Fc 융합 단백질"은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하며, 이는 일부 실시양태에서는 힌지 영역, 이어서 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc-융합 단백질은 하나 이상의 리간드(들)에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 trap, 예컨대 예를 들어 IL-1 trap 또는 VEGF trap이다.
"미세화된 단백질 입자" 또는 "단백질 입자"는 낮은, 매우 낮은, 또는 0에 가까운 양의 물(예를 들어, < 3 중량% 물)과 함께 다수의 단백질 분자를 함유하는 입자를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 미세화된 단백질 입자는 일반적으로 구형 형상이고, 2 마이크론 내지 약 35 마이크론 범위의 ECD를 가진다. 미세화된 단백질 입자는 임의의 특정 단백질 개체에 제한되지 않고, 치료용 단백질의 제조 및 전달에 적합하다. 흔한 치료용 단백질은 특히 항원-결합 단백질, 예컨대 예를 들어 가용성 수용체 단편, 항체(IgG 포함) 및 항체의 유도체 또는 단편, Fc 융합 단백질을 포함하는 다른 Fc 함유 단백질, 및 트랩-유형 단백질(Huang, C., Curr. Opin. Biotechnol. 20: 692-99 (2009)) 예컨대 예를 들어 VEGF Trap을 포함해서 수용체-Fc 융합 단백질을 포함한다.
II. 탄화수소-탄화플루오린 에멀전을 이용한 마이크로구 제형 생성
무수 에멀전 시스템을 사용하여 제약 조성물을 제형화하는 시스템 및 방법이 제공된다. 개시된 무수 에멀전 방법은 기존의 수성 에멀전 시스템으로 인한 여러 문제점을 극복한다. 예를 들어, 개시된 무수 에멀전 시스템과 본원에 제공된 기존의 수성 에멀전 시스템 간의 비교 연구는 수성 에멀전 시스템을 사용하여 생성된 제형이 생성 동안에 약물, 예를 들어 단백질 약물을 에멀전 액적으로부터 수성 연속상으로 누출시킨다는 것을 보여준다. 에멀전 액적으로부터 약물의 이러한 누출은 낮은 봉입 효능을 초래한다. 본원에 기재된 개시된 비수성 기반 에멀전 방법은 친수성 약물 예컨대 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 약물 분자를 수성 에멀전 방법에 비해 상대적으로 증가된 봉입 효능, 원래 단백질 미립자 구조의 보유, 또는 그의 배합으로 봉입한다. 개시된 무수 에멀전 시스템 및 방법은 벌크 방법(즉, 휘젓기, 균질화, 초음파 처리) 및 다른 통상적인 방법에 의해 봉입된 약물 제형을 생성할 수 있다. 시스템 및 방법은 또한 광범위한 중합체 물질, 고체-상태 페이로드(payload), 및 에멀전화 방법에 응용될 수 있다. 표 1은 상이한 에멀전 수확물의 비교 결과를 보여주고, 비수성 에멀전 시스템이 수성 에멀전 시스템에 비해 마이크로입자 봉입에 있어서 상당한 개선이라는 것을 입증한다.
표 1:
A. 탄화플루오린 중 탄화수소 중 고체(S/H/F) 에멀전
전형적인 비수성 S/H/F 에멀전 방법은 건조 단백질 분말 및 생분해성 및 또는 생침식성 중합체를 탄화수소 용매에 배합하여 비수성 제1 용액을 형성하는 단계 및 제1 용액을 탄화플루오린 액체 및 플루오린 계면활성제로 제조된 제2 용액에 첨가하는 단계를 포함한다. 제1 및 제2 용액의 배합은 예를 들어 휘젓기, 초음파 처리, 캐비테이션(cavitation), 균질화 또는 볼텍싱(vortexing)에 의해 탄화플루오린 액체 내에 다중 에멀전 탄화수소 액적을 함유하는 비수성 에멀전을 형성하는 방식으로 수행된다. 본 방법은 탄화수소 용매를 제거하는 단계 및 탄화플루오린 액체를 제거하여 하나 이상의 미세화된 단백질 코어 및 생분해성 중합체 피질을 가지는 마이크로입자를 단리하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 에멀전은 교반되고, 탄화수소 및 탄화플루오린 액체는 진공 하에 증발된다. 결과적으로 얻은 마이크로입자는 임의로 세척되어 탄화수소 용매, 탄화플루오린 액체, 플루오린 계면활성제, 또는 그의 배합을 제거할 수 있다. 에멀전은 벌크 에멀전 기술을 사용하여 형성될 수 있다.
한 실시양태는 단백질 분말 및 생분해성 또는 생침식성 중합체를 탄화수소 용매에 배합하여 비수성 제1 용액을 형성하는 단계 및 제1 용액을 탄화플루오린 액체, 플루오린 계면활성제 및 임의로 HFE를 함유하는 제2 용액에 첨가하여 탄화플루오린 액체 중에 단백질 분말을 함유하는 다중 에멀전 탄화수소 액적을 함유하는 비수성 에멀전을 형성하는 단계에 의해 지속 방출 마이크로입자 조성물을 생성하는 방법을 제공한다. 에멀전은 균질화, 볼텍싱, 초음파 처리, 캐비테이션, 휘젓기, 또는 그의 배합을 사용하여 형성될 수 있다. 상기 방법은 에멀전을 교반하면서 탄화수소 용매 및 탄화플루오린 액체를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 탄화수소 및 탄화플루오린 액체는, 임의로 진공 하에 있는 동안, 증발에 의해 제거될 수 있다.다른 실시양태에서, 마이크로입자는 여과에 의해 수확될 수 있다. 탄화수소 및 탄화플루오린 액체의 제거는 마이크로입자를 경화하고, 그 다음에 마이크로 입자가 수확될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 더 빠른 경화 공정을 위해 분산상으로부터 탄화플루오린 연속상으로 탄화수소를 추출하는 것을 돕기 위해 탄화플루오린에 HPE가 첨가될 수 있다. HFE는 탄화플루오린 및 탄화수소 둘 모두와 혼화성이고, 따라서 탄화플루오린상에서 탄화수소의 용해도를 향상시키기 위한 공용매로서 작용할 수 있다. 비수성 에멀전 방법에 의해 생성된 지속 방출 마이크로입자는 생분해성 또는 생침식성 중합체의 매트릭스 내에 봉입된 단백질을 함유한다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자는 단일 코어-쉘 구조를 가진다. 다른 실시양태에서, 마이크로입자는 중합체 내에 분산된 다중 코어를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로입자의 집단은 중합체 피질에 의해 봉입된 단일 코어 구조를 가지는 마이크로입자 및 중합체 피질 내에 다중 코어 구조를 가지는 마이크로입자를 포함한다. 탄화플루오린 액체는 FC-40을 포함하지만 이에 제한되지 않는 퍼플루오로 C5-C18 화합물일 수 있고, 탄화수소 용액은 에틸 아세테이트, 클로로포름, 톨루엔, 에틸 아세테이트, 테트라히드로푸란 및 디클로로메탄 또는 그의 배합의 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 플루오린 계면활성제는 Pico-Surf™ 1로서 상업적으로 입수가능한 퍼플루오로폴리에테르-b-폴리에틸렌 글리콜-b-퍼플루오로폴리에테르이다. 일부 실시양태에서, 생침식성 중합체는 POE이다. 다른 실시양태에서, 중합체는 폴리락트산 및 폴리(락트-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일반적으로, 단백질은 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 융합 단백질, 재조합 단백질, 또는 그의 단편 또는 절단된 버전이다. 대표적으로, 단백질은 예를 들어 분무 건조, 전기분무 건조, 가역적 침전, 분무 동결, 마이크로템플레이팅(microtemplating), 또는 그의 배합에 의해 미세화된다. 한 실시양태에서, 단백질은 VEGF Trap 단백질 또는 그의 절단된 형태이다. 개시된 방법에 사용될 수 있는 다른 단백질은 아래에서 기재된다. 개시된 방법에 의해 생성된 마이크로입자는 기공 또는 채널이 없는 중합체 피질을 가진다. 중합체 피질은 천공되지 않는다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자는 1 내지 200 μm의 직경을 가진다.
또 다른 실시양태는 (1) 5.0 내지 30% w/v POE를 포함하는 탄화수소 용액에 현탁된 1.0 내지 30.0% w/v 분무 건조된 단백질을 가지는 분산상을 (2) 0.1 내지 5.0% w/v 플루오린 계면활성제를 포함하는 탄화플루오린 용액을 함유하는 연속상에 배합하여 분산상의 에멀전 액적을 형성하는 단계에 의해 중합체 코팅된 마이크로구를 생성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 탄화수소 용액을 제거함으로써 에멀전 액적을 경화하여 경화된 중합체 코팅된 마이크로구를 형성하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 탄화플루오린 용액은 FC-40을 포함하지만 이에 제한되지 않는 퍼플루오로 C5-C18 화합물일 수 있고, 탄화수소 용액은 에틸 아세테이트, 클로로포름, 톨루엔, 에틸 아세테이트, 테트라히드로푸란 및 디클로로메탄 또는 그의 배합의 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 플루오린 계면활성제는 Pico-Surf™ 1로서 상업적으로 입수가능한 퍼플루오로폴리에테르-b-폴리에틸렌 글리콜-b-퍼플루오로폴리에테르이다. 방법은 에멀전을 진공 하에 있는 동안에 교반하여 탄화수소 및 탄화플루오린 용액을 제거하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태는 용해된 중합체를 함유하는 탄화수소 용액 및 분무 건조된 단백질 분말을 배합하여 분산상을 생성하는 단계에 의해 중합체 코팅된 마이크로입자를 생성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 분산상을 탄화플루오린 액체 및 0.1 내지 5.0% w/v의 플루오린 계면활성제를 함유하는 연속상과 배합하여 연속상 내의 분산상의 에멀전 액적을 생성하는 단계 및 중합체 코팅된 마이크로입자를 수확하는 단계를 포함한다. 탄화수소 용액은 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름 및 그의 배합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 탄화플루오린 용액은 FC-40을 함유하고, 계면활성제는 Pico-Surf™ 1로서 상업적으로 입수가능한 퍼플루오로폴리에테르-b-폴리에틸렌 글리콜-b-퍼플루오로폴리에테르이다.
1. 탄화수소 용매
일부 실시양태에서, 탄화수소 용매(탄화수소 액체라고도 부름)는 중합체 물질, 예를 들어, 생분해성 또는 생침식성 중합체가 탄화수소에 가용성이도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 탄화수소 용매는 디클로로메탄, 클로로포름, 톨루엔, 에틸 아세테이트, 테트라히드로푸란, 또는 그의 배합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 탄화수소 용매는 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 펜탄, 프로판올, 헥산, 또는 그의 배합을 함유할 수 있다.
2. 플루오로액체
전형적인 플루오로액체는 Flourinert™ FC-40 (평균 MW = 650 g/mol) 1,1,2,2,3,3,4,4,4-노나플루오로-N,N-비스(1,1,2,2,3,3,4,4,4-노나플루오로부틸)부탄-1-아민(도 1b), Fluorinert™ FC-70 (평균 MW = 821 g/mol) 또는 그의 배합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 탄화플루오린 액체이다. 일부 실시양태에서, 탄화플루오린 액체는 히드로플루오로에테르(HFE)이거나 또는 그를 함유한다. 전형적인 HFE는 NOVEC™ 7000(1-메톡시헵타플루오로프로판), NOVEC™ 7100(메톡시-노나플루오로부탄), NOVEC™ 7200(에톡시-노나플루오로부탄), NOVEC™ 7500(2-(트리플루오로메틸)-3-에톡시도데카플루오로헥산 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 탄화플루오린 액체는 FC-40, FC-70, Novec™ 7500, Novec™ 7100, Novec™ 7000 또는 그의 배합을 함유한다. 일부 실시양태에서, 제2 용액은 플루오로액체 이외에 추가로 플루오린 계면활성제(FS)를 함유한다. 전형적인 FS는 Pico-Surf™ 1로서 상업적으로 입수가능한 퍼플루오로폴리에테르-b-폴리에틸렌 글리콜-b-퍼플루오로폴리에테르(PFPE-PEG-PFPE) 삼블록 공중합체이다. 한 실시양태에서, 탄화플루오린 액체 또는 제2 용액은 FC-40 및 Pico-Surf™ 1을 함유한다.
일부 실시양태에서, FS는
여기서 R1 = 
이며,
여기서 n ~ 37, x + z ~ 6.0, y ~ 12.5. 또는 여기서 n = 3.7, x + z ~ 3.6, y ~ 9.0. (Lee, M. et al., Lab Chip., 7:14(3): 509-13(2014))
한 실시양태에서, HFE는 하기 화학 구조를 가진다:
2-(트리플루오로메틸)-3-에톡시도데카플루오로헥산
공정에 사용하기에 적합한 다른 HFE는 모든 수소 원자가 플루오린 치환이 없는 탄소 상에 존재하고 에테르 산소, 즉 RfORh에 의해 플루오린화된 탄소로부터 분리되는 분자의 부류이다. HFE는 선형, 분지형 또는 고리형, 또는 그의 배합(예컨대 알킬지환족)일 수 있는 분자 구조를 가지며, 바람직하게는 에틸렌성 불포화가 없고 총 약 4 내지 약 20개의 탄소 원자를 가진다. 이러한 HFE는 알려져 있고, 본질적으로 순수한 화합물로서 또는 혼합물로서 용이하게 입수가능하다. HFE의 친유성 및 친플루오린성 때문에, 그것은 탄화플루오린 및 탄화수소 둘 모두와 혼화가능하다. 탄화수소/탄화플루오린 에멀전에 첨가될 때, 그것은 공용매로서 작용하여 탄화수소를 탄화플루오린상으로 추출하고 경화 공정을 가속할 수 있다.
일부 실시양태에서, 탄화수소 용매, 탄화플루오린, 또는 둘 모두는 에멀전이 교반되는 동안, 임의로 진공 하에서, 증발에 의해 제거된다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자는 여과, 임의로 진공 하에서의 여과에 의해 수확된다.
탄화플루오린상 중 HFE의 백분율은 0-20% v/v일 수 있고, 한편으로 HFE 백분율을 증가시키면 탄화수소 추출 속도가 증가한다. 그러나, HFE의 백분율은 너무 높을 수는 없는데, 그 이유는 마이크로구의 크기 및 모르폴로지가 제어하기 더 어려워질 수 있기 때문이다.
3. 침식성 또는 생분해성 중합체
한 실시양태에서, 중합체는 생분해성 또는 생침식성 중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 분지형 또는 선형 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락틱-폴리글리콜릭 공중합체(PLGA), 폴리-D,L-락티드-코-글리콜리드(PLGA), PLGA-에틸렌 옥시드 푸마레이트, 폴리에틸렌 글리콜 1000에 에스테르화된 PLGA-알파-토코페릴 숙시네이트(PLGA-TGPS), 폴리무수물 폴리[1,6-비스(p-카르복시페녹시)헥산](pCPH), 폴리(히드록시부티르산-코히드록시발레르산) (PHB-PVA), 폴리에틸렌 글리콜-폴리(락트산) 공중합체(PEG-PLA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리-알킬-시아노-아크릴레이트(PAC), 폴리(에틸)시아노아크릴레이트(PEC), 폴리이소부틸 시아노아크릴레이트, 폴리-N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드(폴리(HPMA)), 폴리-β-R-히드록시 부티레이트(PHB), 폴리-β-R-히드록시 알카노에이트(PHA), 폴리-β-R-말산, 인지질-콜레스테롤 중합체, 2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린/폴리에틸렌글리콜-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DOPC/PEG-DSPE)/콜레스테롤, 폴리사카라이드, 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 알기네이트, 덱스트란 및 덱스트란 히드로겔 중합체, 아밀로스, 이눌린, 펙틴 및 구아 검, 키토산, 키틴, 헤파린, 히알루론산, 시클로덱스트린 (CD)-기반 폴리로탁산 및 폴리슈도로탁산, 폴리아스파르테이트, 폴리글루타메이트, 폴리루신, 류신-글루타메이트 공중합체, 폴리부틸렌 숙시네이트, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 피브로인, 폴리오르토에스테르, 폴리오르토에스테르-폴리아미딘 공중합체, 폴리오르토에스테르-디아민 공중합체, 잠재산을 혼입한 폴리오르토에스테르, 폴리(에틸렌 글리콜)/폴리(부틸렌 테레프탈레이트) 공중합체, 및 그의 배합 및 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 중합체는 폴리-ε-카프로락톤(PCL) 또는 그의 유도체 또는 공중합체이다. 한 실시양태에서, 중합체는 PLGA 또는 그의 유도체 또는 공중합체이다. 한 실시양태에서, 중합체는 에틸 셀룰로스 또는 그의 유도체 또는 공중합체이다. 한 실시양태에서, 중합체는 폴리오르토에스테르 또는 그의 유도체 또는 공중합체이다. 한 실시양태에서, 중합체는 폴리에스테르아미드이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중합체"는 공유 화학 결합에 의해 연결된 반복 단량체를 포함하는 거대분자를 지칭한다. 중합체는 생체적합성 및 생분해성 침식성이다. 생체적합성 및 생분해성 중합체는 천연 또는 합성일 수 있다. 천연 중합체는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩티드, 예컨대 천연 발생 단백질, 재조합 단백질, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 피브로인, 폴리아스파르테이트, 폴리글루타메이트, 폴리리신, 류신-글루타메이트 공중합체; 및 폴리사카라이드, 예를 들면, 셀룰로스 알기네이트, 덱스트란 및 덱스트란 히드로겔 중합체, 아밀로스, 이눌린, 펙틴 및 구아 검, 키토산, 키틴, 헤파린 및 히알루론산을 포함한다. 합성 생체적합성 또는 생분해성 중합체는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락틱-폴리글리콜릭 공중합체(PLGA), 폴리-D,L-락티드-코-글리콜리드(PLGA), PLGA-에틸렌 옥시드 푸마레이트, 폴리에틸렌 글리콜 1000에 에스테르화된 PLGA-알파-토코페릴 숙시네이트(PLGA-TGPS), 폴리무수물 폴리[1,6-비스(p-카르복시페녹시)헥산](pCPH), 폴리(히드록시부티르산-코히드록시발레르산)(PHB-PVA), 폴리에틸렌 글리콜-폴리(락트산) 공중합체(PEG-PLA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리-알킬-시아노-아크릴레이트(PAC), 폴리(에틸)시아노아크릴레이트(PEC), 폴리이소부틸 시아노아크릴레이트, 폴리-N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드(폴리(HPMA)), 폴리-β-R-히드록시 부티레이트(PHB), 폴리-β-R-히드록시 알카노에이트(PHA), 폴리-β-R-말산, 인지질-콜레스테롤 중합체, 2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린/폴리에틸렌글리콜-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DOPC/PEG-DSPE)/콜레스테롤, 에틸 셀룰로스, 시클로덱스트린(CD) 기반 폴리로탁산 및 폴리슈도로탁산, 폴리부틸렌 숙시네이트(PBS), 폴리오르토에스테르, 폴리오르토에스테르-폴리아미딘 공중합체, 폴리오르토에스테르-디아민 공중합체, 분해 속도를 제어하는 잠재성 산을 혼입하는 폴리오르토에스테르, 및 특히 폴리(에틸렌 글리콜)/폴리(부틸렌 테레프탈레이트) 공중합체를 포함한다.
에틸 셀룰로스(EC)는 제약 및 식품 과학에서 사용되는 잘 알려져 있고 쉽게 입수가능한 생체재료이다. 그것은 글루코스 히드록실기의 일부가 에틸 에테르로 대체된 셀룰로스 유도체이다. Martinac et al., J. Microencapsulation, 22(5): 549-561 (2005) 및 이 문헌의 참고문헌을 참조하고, 이것은 마이크로구 제조에서 생체적합성 중합체로서 에틸 셀룰로스를 사용하는 방법을 기재한다. 또한, 에틸 셀룰로스 및 에틸 셀룰로스의 유도체의 제조 방법의 상세한 설명은 미국 4,210,529 (1980) 및 이 문헌의 참고문헌을 참조한다.
폴리-D,L-락티드-코-글리콜리드(PLGA)는 또한 조직 공학 및 제약 전달 시스템에 사용되는 잘 알려진 미국 식품의약국(FDA) 승인 생체적합성 및 생분해성 중합체이다. PLGA는 글리콜산 및 락트산 단량체를 포함하는 폴리에스테르이다. PLGA의 합성 및 PLGA 나노입자의 제조에 대한 설명은 Astete and Sabliov, Biomater. Sci. Polym. Ed., 17(3): 247-89(2006) 및 그의 참고문헌을 참조한다.
폴리-ε-카프로락톤(PCL)은 사람에게 약물 전달 장치로 사용하기 위해 FDA에서 승인한 또 다른 생체적합성 및 생분해성 중합체이다. PCL은 ε-카프로락톤의 폴리에스테르이고, 이것은 체내에서 빠르게 가수분해하여 무독성 또는 저독성 히드록시카르복실산을 형성한다. PCL의 제조에 대한 설명은 Labet and Thielemans, Chemical Society Reviews 38: 3484-3504(2009) 및 그의 참고문헌을 참조한다. 전달 시스템으로서 PCL-기반 마이크로구 및 나노스피어의 제조 및 사용에 대한 설명은 Sinha et al., Int. J. Pharm., 278(1): 1-23(2004) 및 그의 참고문헌을 참조한다.
폴리오르토에스테르(POE)는 약물 전달을 위해 설계된 생침식성 중합체이다. 그것은 일반적으로, 글리콜 축합을 통해 중합되어 오르토에스테르 결합을 형성하는 케텐 아세탈, 바람직하게는 시클릭 디케텐 아세탈, 예컨대 예를 들어 3,9-디메틸렌-2,4,8,10-테트라옥사 스피로[5.5]-운데칸의 중합체이다. 폴리오르토에스테르 합성 및 다양한 유형의 설명이 예를 들어 미국 4,304,767에서 발견될 수 있다. 폴리오르토에스테르는 다양한 소수성 디올 및 폴리올을 교환해넣거나 또는 교환해냄으로써, 예컨대 예를 들어 헥산트리올을 데칸트리올로 대체함으로써; 뿐만 아니라 잠재성 산, 예컨대 예를 들어 글리콜리드, 옥탄디산 등을 골격에 첨가하여 pH 민감도를 증가시킴으로써 그의 약물 방출 프로파일 및 분해 속도를 제어하도록 변형될 수 있다. POE의 맞춤 형태는 질량 손실 및 약물 방출을 조정하기 위해 POE 골격에 글리콜산을 포함할 수 있다. 폴리오르토에스테르에 대한 다른 변형은 작용성을 증가시키기 위한 아민의 통합을 포함한다. 폴리오르토에스테르의 형성, 설명 및 사용은 미국 5,968,543; 미국 4,764,364; Heller and Barr, Biomacromolecules, 5(5): 1625-32(2004); 및 Heller, Adv. Drug. Deliv. Rev., 57: 2053-62 (2005)에 기재되어 있다.
4. 단백질 약물
일부 실시양태에서, 개시된 무수 에멀전 방법 및 시스템에 의해 생성된 마이크로입자 제형은 약물을 포함한다. 전형적인 약물은 단백질, 융합 단백질 및 그의 단편, 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 단백질은 VEGF Trap 단백질이고(예를 들어, Aflibercept이며, 이것은 예를 들어 미국 특허 번호 7,087,411, 7,279,159 및 8144840에 기재된 바와 같이 hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 함유하고, 이 문헌들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, VEGF Trap 단백질은 미국 특허 번호 7,396,664에 기재된 바와 같은 VEGF Trap의 절단된 형태이고, 이 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 마이크로입자 제형 중의 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 또는 테트라바디(tetrabody), 이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-IG)이라고 명명되는 이중-특이적 4가 면역글로불린 G-유사 분자, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 키메라 힌지를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 키메라 Fc를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 항-프로그래밍된 세포 사멸 1 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,987,500에 기재된 바와 같은 항-PD1 항체, 항-프로그래밍된 세포 사멸 리간드-1(예를 들어,미국 특허 번호 9,938,345에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-안지오포에틴-2 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 9,402,898에 기재된 바와 같은 항-ANG2 항체), 항-안지오포에틴-유사 3 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,018,356에 기재된 바와 같은 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 9,265,827에 기재된 바와 같은 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,302,015에 기재된 바와 같은 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,795,121에 기재된 바와 같은 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 9,132,192에 기재된 바와 같은 항-EGFR 항체. 또는 미국 특허 번호 9,475,875에 기재된 바와 같은 항-EGFRvIII 항체), 항-프로프로테인 전환효소 서브틸리신 켁신-9 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,062,640 또는 미국 특허 번호 9,540,449에 기재된 바와 같은 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,871,209 또는 9,260,515에 기재된 바와 같이 또한 항-미오스타틴 항체로도 알려져 있는 항-GDF8 항체), 항-글루카곤 수용체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,587,029 또는 9,657,099에 기재된 바와 같은 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터루킨 4 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0271681A1(포기됨) 또는 미국 특허 번호 8,735,095 또는 8,945,559에 기재된 바와 같은 항-IL 4R 항체), 항-인터루킨 6 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,582,298, 8,043,617 또는 9,173,880에 기재된 바와 같은 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터루킨 33(예를 들어, 미국 특허 번호 9,453,072 또는 9,637,535에 기재된 바와 같은 항-IL33 항체), 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,447,173 및 10,125,188, 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2019/0031741A1에 기재된 바와 같은 항-RSV 항체), 항-분화 클러스터 3(예를 들어, 미국 특허 번호 9,657,102에 기재된 바와 같은 항-CD3 항체), 항-분화 클러스터 20 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,657,102 및 US20150266966A1, 및 미국 특허 번호 7,879,984에 기재된 바와 같은 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-분화 클러스터- 48(예를 들어, 미국 특허 번호 9,228,014에 기재된 바와 같은 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,079,948에 기재된 바와 같음), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,718,872에 기재된 바와 같은 항-MERS 항체), 항-에볼라 바이러스 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,771,414에 기재된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체, 항-림프구 활성화 유전자 3 항체 (예를 들어, 항-LAG3 항체, 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2016/0017029(포기됨) 및 미국 특허 번호 8,309,088 및 9,353,176에 기재된 바와 같은 항-NGF 항체) 및 항-단백질 Y 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 항-CD3 x 항-CD20 이중특이적 항체 (미국 특허 번호 9,657,102 및 US20150266966A1에 기재된 바와 같음), 항-CD3 x 항-뮤신 16 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-CD3 x 항-Muc 16 이중특이적 항체), 및 항-CD3 x 항-전립선-특이적 막 항원 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-CD3 x 항-PSMA 이중특이적 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 앱식시맙, 아달리무맙, 아달리무맙-아토, 아도트라스투주맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아텔리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 카나키누맙, 카프로맙 펜데티드, 세르톨리주맙 페골, 세미플리맙, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두필루맙, 두르발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에미시주맙-kxwh, 엠탄시네알리로쿠맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 파시누맙, 골리무맙, 구셀쿠맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루시주맙, 인플릭시맙, 인플릭시맙-abda, 인플릭시맙-dyyb, 이필리무맙, 익세키주맙, 메폴리주맙, 네시투무맙, 네스바쿠맙, 니볼루맙, 오빌톡삭시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레슬리주맙, 리누쿠맙, 리툭시맙, 사릴루맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 토실리주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 트레보그루맙, 우스테키누맙 및 베돌리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 복합체 내의 단백질은 Fc 모이어티 및 또 다른 도메인 (예를 들어, Fc-융합 단백질)을 함유하는 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 함유하는 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 힌지 영역, 이어서 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다중 리간드에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 함유한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 TRAP 단백질, 예컨대 예를 들어 IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 Il-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유하는 릴로나셉트)이고; 미국 특허 번호 6,927,004를 참조하고, 이 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), 또는 VEGF Trap (예를 들어, hIgG10의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함하는 아플리베르셉트 또는 ziv-아플리베르셉트)이다. 다른 실시양태에서, Fc-융합 단백질은 ScFv-Fc-융합 단백질이고, 이것은 Fc 모이어티에 커플링된 항체의 하나 이상의 항원-결합 도메인(들), 예컨대 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편 중 하나 이상을 함유한다.
일부 실시양태에서, 초기 단백질은 건조 분말, 예를 들어 미세화된 건조 분말의 형태이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 분무 건조된 분말(SDP)이다. 단백질 용액 대신 분무 건조된 단백질 사용은 마이크로 입자 내 더 높은 단백질 로딩 및 봉입 공정 동안 더 좋은 단백질 안정성이라는 이점을 가진다. 일부 실시양태에서, 건조 단백질 분자는 전체 봉입 공정 및 저장 조건 동안에 고체 상태로 남아 있고 안정화제에 의해 둘러싸여 있다. 일부 실시양태에서, 봉입된 분무 건조된 단백질은 높은 회수 및 낮은 응집체를 나타내는데, 이는 아마도 표면 단백질의 작은 부분만 계면에 노출됨으로 인해서 최소화된 표면 상호작용 때문일 것이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 봉입 전에 미세화된다.
B. 마이크로입자
한 실시양태는 개시된 비수성 에멀전 시스템을 사용하여 생성되는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 중합체 피질 및 미세화된 단백질 코어를 가지는 마이크로입자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자의 형상은 대략 구형이다. 일부 마이크로입자 및 단백질 코어는 구형과 비슷할 것이고, 반면에 일부는 형상이 더 불규칙할 것이다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "직경"은 다음 중 각각 및 임의의 것을 의미한다: (a) 마이크로입자 또는 단백질 코어를 외접하여 둘러싸는 구체의 직경, (b) 마이크로입자 또는 단백질 코어의 경계 내에 꼭 맞는 가장 큰 구체의 직경, (c) (a)의 외접된 구체와 (b)의 경계 내에 갇힌 구체 사이에 있는, 그 둘 사이의 평균을 포함하는 임의의 치수, (d) 마이크로입자 또는 단백질 코어의 최장축의 길이, (e) 마이크로입자 또는 단백질 코어의 최단축의 길이, (f) 장축의 길이 (d)와 단축의 길이 (e) 사이에 있는, 그 둘 사이의 평균을 포함하는 임의의 치수, 및/또는 (g) 마이크로플로우 영상화(MFI), 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해, 또는 광 산란 방법 예컨대 정적 광 산란(SLS), 동적 광 산란(DLS) 또는 레이저 회절 분석에 의한 부피 또는 수 평균 직경으로서 결정되는 등가 원 직경("ECD"). 직경은 일반적으로 마이크로미터(μm 또는 마이크론)로 표현된다. 직경은 광학적 측정 또는 주사 전자 현미경 측정에 의해 결정될 수 있다.
개시된 비수성 에멀전 방법에 의해 생성된 마이크로입자는 낮은, 매우 낮은, 또는 0에 가까운 양의 물(예를 들어, < 3 중량% 물)을 갖는 다수의 단백질 분자. 본원에서 사용된 바와 같이, 미세화된 단백질 입자는 2 마이크론 내지 약 35 마이크론, 또는 2.0 내지 50 μm, 또는 5.0 내지 15.0 μm, 또는 약 10 μm 범위의 ECD를 가진다. 미세화된 단백질 입자는 임의의 특정 단백질 개체에 제한되지 않고, 위에서 기재된 단백질을 포함하는 치료용 단백질의 제조 및 전달에 적합하다.
예를 들어, 단백질 입자는 분무 건조, 동결건조 및 밀링(milling), 제트 밀링, 비-용매에서의 가역적 침전, 과립화, 점진적 침전 (미국 7,998,477 (2011)), 초임계 유체 침전 (미국 6,063,910 (2000)), 또는 고압 이산화탄소 유도 입자 형성 (Bustami et al., Pharma. Res. 17: 1360-66(2000))에 의해 미세화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "분무 건조"는 분무 건조기를 사용하여 슬러리 또는 현탁액으로부터 마이크론 크기의 입자를 포함하는 건조 분말을 생성하는 방법을 의미한다. 분무 건조기는 어토마이저(atomizer) 또는 분무 노즐을 이용하여 현탁액 또는 슬러리를 제어된 액적 크기 분무로 분산시킨다. 분무 건조에 의해 10 내지 500 μm의 액적 크기가 생성될 수 있다. 용매(물 또는 유기 용매)가 건조됨에 따라, 단백질 물질이 마이크론 크기의 입자로 건조되어 분말-유사 물질을 형성하거나; 또는 단백질-중합체 현탁액의 경우, 건조 동안에 중합체가 단백질 로드(load) 주위에 쉘을 경화시켰다.
일부 실시양태에서, 미세화된 단백질은 VEGF Trap 단백질이다. 미세화된 VEGF Trap 단백질 입자의 형성을 위한 제약 제형은 약 10 mg/mL 내지 약 100 mg/mL VEGF Trap 단백질, 약 1.0 내지 약 50 mg/mL 단백질, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 35 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 55 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 65 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 75 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 85 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 95 mg/mL, 또는 약 100 mg/mL VEGF Trap 단백질을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 비수성 에멀전 시스템을 사용하여 생성된 마이크로입자는 중합체 피질 내에 단백질 입자 코어를 함유하고, 약 2 μm 내지 약 70 μm, 약 5 μm 내지 약 65 μm, 약 10 μm 내지 약 60 μm, 약 15 μm 내지 약 55 μm, 약 10 μm 내지 약 50 μm, 약 1.0 내지 15 μm, 약 20 μm, 약 25 μm, 또는 약 30 μm의 직경 범위를 가진다. 크기 변화는 중합체 피질의 두께를 아주 많이 반영하지만, 단백질 코어의 직경이 크기 변화에 어느 정도 기여할 수 있을 것이다.
한 실시양태에서, 개시된 비수성 에멀전 방법에 의해 형성된 마이크로입자는 유동성 마이크로입자 조성물이다. 개시된 유동성 마이크로입자 조성물은 제약학상 허용되는 부형제, 예를 들어, pH 완충 식염수에 현탁될 수 있다. 유동성 마이크로입자 조성물은 비경구, 예를 들어 주사기 예컨대 27G 바늘을 갖는 주사기를 사용하여 투여될 수 있다.
마이크로입자는 단백질 치료제의 시한 방출 또는 연장 방출에 유용하다. 일부 실시양태에서, 마이크로구 제형은 유리체내로, 맥락막위로, 또는 피하로 주사된다. 예를 들어, VEGF Trap 마이크로입자는 예를 들어 혈관 눈 장애의 치료를 위해 유리체에서 VEGF Trap 치료용 단백질의 연장 방출, 또는 다른 장애를 치료하기 위해 VEGF Trap의 연장 방출을 위한 피하 이식에 유용할 것으로 생각된다.
본 발명의 마이크로입자는 단백질을 생리학적 수성 환경에서 약 37 ℃에서 적어도 60, 90, 120, 또는 150 일까지 연장된 기간 동안 상대적으로 일정한 속도로 방출한다.
한 실시양태는 본원에 개시된 비수성 에멀전 방법을 사용하여 생성된 마이크로구의 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 > 100 mg의 분무 건조된 단백질을 함유한다. 한 실시양태에서, 비수성 에멀전 방법은 > 90% 수율을 가지고, > 99% 순도를 갖는 마이크로입자를 생성하고, 그것은 > 10% w/w 로딩, 및 50-100 μL 주사 부피의 경우에 < 10% 버스트(burst)를 가진다.
실시예
실시예 1: H/F 기반 벌크 에멀전을 통한 블랭크(blank) 마이크로구 합성
물질 및 방법
오일 및 수성-기반 에멀전 시스템은 중합체 마이크로입자 또는 나노입자 합성에 빈번하게 사용되며, 여기서 소수성 중합체 물질은 유기상에 용해되고 수성 연속상에 분산된다. 그러나, 수용성 중합체, 예를 들어 PEG, 카르복시메틸 셀룰로스(CMC), 및 물 존재 하에서 쉽게 가수분해되는, 폴리무수물, 폴리락트산과 같은 짧은 중간-블록을 갖는 지방족 폴리에스테르 및 폴리(글루탐산)과 같은 일부 폴리(아미노산)을 포함하는 중합체의 경우에는, 통상적인 수성-기반 에멀전 시스템이 이상적이지 않다. 다음 실시예는 위에서 언급된 수용성 또는 수분해성 중합체 마이크로입자를 생성하기 위한 개시된 H/F 에멀전 시스템의 유용성을 입증한다. 일부 실시양태에서, 그들 중합체는 먼저 극성 용매, 예를 들어 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 및 덜-극성 용매, 예를 들어 DCM, 클로로포름을 포함하는 탄화수소 용매에 용해된다. 이어서, 이 중합체 용액을 FS, 예를 들어 Picosurf 1을 갖는 탄화플루오린 액체, 예를 들어 FC-40인 연속상에 첨가한다. 에멀전은 휘젓기, 볼텍싱 또는 다른 에멀전화 방법을 통해 제조된다. 에멀전 액적은 최종적으로 탄화수소 용매를 증발 또는 추출함으로써 중합체 구로 경화된다.
특정 실시양태에서는, H/F 벌크 에멀전을 통한 블랭크 POE 마이크로구 합성을 위해, 도식 1 (도 1a)에 도시된 바와 같이, DCM 중 약 10%, 20%, 30% 및 40% w/v POE 200 μL를 0.5% w/w FS Pico-Surf™ 1(Sphere Fluidics)을 함유하는 FC-40 2 mL에 첨가하였다. 에멀전화는 볼텍싱을 통해 달성되었다. 에멀전 액적은 FC-40보다 가볍고, 용액의 상부에 부유되었다. 분액을 채취하고 현미경 영상화를 위해 유리 슬라이드 위에 떨어뜨렸다. 마이크로구는 진공 하에서 3시간 동안의 교반에 의해 경화되었다. FC-40 중의 경화된 중합체 구를 먼저 0.22 마이크론 PES 막을 통해 진공 여과하였다. FC-40은 필터를 통과하였고 마이크로구는 보유되었다. 이어서, 마이크로구를 추가의 FC-40으로 세척하고, 진공 하에서 완전히 건조시켰다. 동일한 공정을 갖는 다른 예에서는, DCM 중의 약 30% w/v POE를 탄화수소상에 사용하고, FC40 중의 약 0.01%, 0.1% 및 0.5% FS를 탄화플루오린상에 사용하여 FS 농도의 효과를 평가하였다.
결과
FS의 존재로, 탄화수소 및 탄화플루오린 혼합물은 H/F 에멀전을 형성할 수 있었다. 한 예에서는, DCM을 FC-40(도 1b의 FC-40의 구조 참조)에 H/F 에멀전으로서 분산시키고, PFPE-PEG-PFPE를 FS(도 1c의 FS의 구조 참조)로서 사용하였다. 증가하는 농도의 FS를 FC-40 탄화플루오린상에 첨가하였다. 시험은 DCM 액적의 유착을 방지하기 위해 0.1-5 % w/w FS가 필요함을 보여주었다 (도 2a). 0.1% w/w 미만 SF를 첨가한 경우, 더 넓은 크기 분포가 관찰되었다. SF가 사용되지 않으면, DCM 액적은 안정하지 않았다. 분산된 DCM 액적은 빠르게 함께 병합될 것이고, 두 상은 곧 분리될 것이다. 결과는 중합체 마이크로구를 성공적으로 생성하기 위해 안정한 H/F 에멀전을 생성하기 위한 충분한 양의 FS의 사용 및 경화 공정 동안의 연속적 교반의 필요성을 보여주었다. (도 2b).
DCM 중의 POE의 첨가 및 FC-40에서의 볼텍싱은 POE를 함유하는 액적의 형성을 초래하였다. 주위 조건에서 개방 용기 내에서 또는 진공 하에서 DCM의 증발은 액적이 POE 마이크로구로 경화되는 것을 초래하였다(도 2a 및 2b). 마이크로구의 크기는 액적 크기 및 유기상의 POE 함량과 관련되었다. 더 높은 POE 농도는 더 큰 마이크로구 크기를 초래한다(표 1).
표 1.
실시예 2: 균질화 속도의 효과
물질 및 방법
DCM 중의 30% 또는 40% w/v POE 일(1) mL를 0.5% (w/w) FS FC-40을 갖는 FC-40 9 mL에 첨가하고, VWR 7mm x 95mm 톱니 발전기 프로브를 갖는 VWR 핸드헬드 균질화기 200으로 낮은(최대 전력의 약 50%), 중간(최대 전력의 약 60%), 및 높은(최대 전력의 약 70%) 세 균질화 속도 중 하나로 에멀전화시켰다. 형성된 에멀전을 진공 하에서 교반하였다. 형성된 마이크로구를 세척하고 진공 하에서 건조시켰다.
결과
도 3에 도시된 바와 같이, 30% POE의 경우, 낮은 균질화 속도는 더 큰 마이크로구 크기를 제공하였고, 반면에 높은 균질화 속도는 더 작은 크기를 제공하였다(표 2). 40% POE는 동일한 경향을 보여주었다. 이들 결과는 균질화 속도를 조정하는 것이 마이크로구 크기를 제어할 수 있음을 보여준다.
표 2.
실시예 3: S/H/F 기반 벌크 에멀전 방법을 통한 POE 마이크로구 내에 단백질 SDP 봉입의 일반적인 절차
물질 및 방법
도 4에 도시된 바와 같이, 벌크 에멀전 합성은 3 단계인 제형화, 에멀전화, 경화로 나눌 수 있다. 이들 3 단계에서 상이한 매개 변수가 사용되기 때문에 생성물의 특성은 상이할 것이다. 일반적인 절차는 아래와 같이 기재된다:
제형화를 위해, 총 고형물 중량의 10%-30% w/w의 VEGF Trap SDP(또는 형광 영상화를 위한 형광-표지된 SDP(F-SDP))를 10-35% w/v POE를 함유하는 에틸 아세테이트 500 μL에 5분 동안 볼텍싱 및 후속 초음파 처리에 의해 분산시켰다. 이어서, 이들 현탁액을 0.1 - 0.5% w/w FS를 갖는 FC-40 9.5 mL에 첨가하였다. 에멀전화는 휘젓기, 볼텍싱 또는 벤치-톱(bench-top) 균질화기를 사용한 균질화를 통해 달성될 수 있다. 에멀전의 구조를 도 5에 도시한다. 에멀전화 직후, 공정중 분액을 채취하여 현미경 영상화를 위해 유리 슬라이드 위에 떨어뜨렸다. 액적들은 슬라이드 위에서 주위 조건 하에서 증발을 통해 경화되었다. 마이크로구의 경화를 위해, 세 가지 방법 중 하나를 적용하였다: (a) 개방 용기 내에서 밤새 주위 조건에서 용액을 교반하고 에틸 아세테이트의 증발을 허용함; (b) 더 빠른 용매 증발을 위해 용액을 진공 하에서 적어도 2 시간 동안 교반함; (c) NOVEC 7500, 또는 FC-40 및 NOVEC7500의 혼합물을 교반 하에 에멀전에 첨가함. HFE는 탄화수소상으로부터 탄화플루오린상으로 에틸 아세테이트를 추출하는 것을 돕고 신속한 경화 공정(대표적으로 수분 이내)을 가능하게 하는 공용매로서 작용한다.
결국, FC-40 중의 경화된 중합체 구를 먼저 0.22 μm PES 막을 통해 진공 여과하였다. FC-40은 필터를 통과하였고, 마이크로구는 보유되었다. 이어서, 마이크로구를 추가의 FC-40으로 세척하고, 진공 하에서 완전히 건조시켰다.
마이크로구의 크기는 생성물 분말을 0.01% w/v PVA 용액에 분산시킴으로써 액체 샘플링과 함께 Malvern Mastersizer 3000을 사용하여 레이저 회절 분석에 의해 측정되었다. 생성물의 모르폴로지는 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 측정되었다.
마이크로구의 단백질 함량을 측정하기 위해, 먼저, 미리 결정된 양의 마이크로구를 에틸 아세테이트 200 μL에 용해시킨 후, 1 순수로 추출하였고, 수성상을 수집하고 원심분리하여 혼탁한 현탁액을 제거하였다. 단백질 순도 및 농도를 SEC-UPLC로 측정하였다.
버스트 방출을 측정하기 위해, 미리 결정된 양의 마이크로구를 37 ℃의 PBS 1 mL에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 원심분리하고, 상층액의 단백질 농도를 SEC-UPLC로 측정하였다.
결과
상기 결과는 충분한 SF의 존재로 안정한 H/F 에멀전의 생성을 보여주었다. 이러한 비수성 에멀전은 블랭크 POE 구를 성공적으로 생성할 수 있다. 이러한 무수 방법을 다시 사용하여 SDP를 POE 마이크로구에 혼입시켰다. 한 예에서, 총 고체 중량의 10% w/w의 VEGF Trap F-SDP를 에틸 아세테이트 (20% w/v POE 포함)에 현탁액으로서 도입하였고, FC-40 (0.5% w/w FS 함유) 중의 이 현탁액을 휘젓기 및 볼텍싱을 통해 에멀전화시켰다. 에멀전화 직후, 현미경 영상화를 위해 분액을 유리 슬라이드 위에 옮겼다. 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, 에틸 아세테이트는 FC-40 내의 액적으로 분산되었고, SDP 입자는 에틸 아세테이트 액적 내부에 명확하게 갇혔다. S/O/W 시스템(데이터는 나타내지 않음)과 달리, 탄화플루오린 연속상으로 단백질이 누출되는 징후는 없었다. 중요하게는 이 H/F 시스템에서, 액적 내의 SDP 입자는 분말 상태에서 그의 원래의 딤플(dimple) 형상을 보유하였다. SDP를 재구성하는 H/F 시스템에 물이 없었기 때문에, 따라서 SDP는 그의 원래의 고체 미립자 형태로 남아 있었다. 경화 후에, 단일 또는 다수의 SDP 입자를 함유하는 POE 마이크로구는 명시야 및 형광 현미경 이미지를 통해 명확하게 관찰될 수 있다(도 7a, 7b 및 7c). 유리 슬라이드 위의 탄화수소 및 탄화플루오린 용매의 증발 후, 물을 첨가하여 버스트 방출 및 봉입 품질을 시험하였다. 도 8a-d에 나타낸 바와 같이, 마이크로구 생성물을 물에 넣은 후, SDP-봉입된 POE 마이크로구는 이들의 완전성을 보유하였다. 단백질의 즉시 방출은 관찰되지 않았고, SDP 입자의 형상은 동일하게 남아 있었고, 이는 SDP 입자가 중합체 매트릭스에 의해 잘 보호되고 수성 환경으로부터 차폐됨을 지시하였다. 이들 결과는 H/F 에멀전이 단백질 및 다른 친수성 약물을 중합체 매트릭스 내로 봉입하기 위한 효과적인 용액이며, 높은 봉입 효율, 높은 수율을 달성하고 한편으로 버스트 방출을 최소화하는 잠재력을 가진다는 것을 시사하고 - 이러한 모든 것이 수성 기반 W/O/W 또는 S/O/W 방법을 사용할 때의 주요한 과제이다.
여기에 개시된 절차는 POE 마이크로구 내에 단백질 SDP 봉입을 위해 S/H/F 비수성 기반 벌크 에멀전 방법을 사용하는 예이다. 이 방법은 재현가능하고 확장가능하며 조정가능하다. 제형 및 공정의 매개변수를 변화시킴으로써, 생성물 특성을 조정하고 제어할 수 있다. 그들 매개변수 중 일부의 효과는 실시예 4에서 개시된다.
실시예 4: 탄화수소 용매의 효과
물질 및 방법
탄화수소로서 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 마이크로입자를 생성하였다. DCM 중의 35% w/v POE 및 에틸 아세테이트 중의 35% w/v POE를 제조하였다. 총 고체 중량의 십 퍼센트(10%) w/w의 단백질 분말을 DCM 또는 에틸 아세테이트 중의 POE 용액 0.5 mL에 현탁시켰다. 이들 현탁액을 20 mL 섬광 바이알 내의 0.5% w/w FS를 함유하는 FC-40 9.5 mL에 옮겼다. 이들 혼합물을 균질화하여 에멀전을 생성하고 1.5 시간 동안 하우스 진공 하에서 교반하였다. 형성된 마이크로구를 여과에 의해 단리하고, FC-40으로 세척하고, 진공 하에서 건조시켰다.
결과
도 9는 탄화수소 용매의 종류가 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트인 것을 제외하고는 동일한 제형 및 공정 조건을 사용하여 생성된 마이크로입자의 크기 분포를 나타낸다. 어느 탄화수소든 사용하여 생성된 마이크로입자는 분무 건조된 단백질의 봉입을 보여준다. 디클로로메탄을 사용하면 더 큰 마이크로입자가 생성된다. 아래의 표 2를 참조한다. 결과는 동일한 제형 및 공정 조건 하에서, 상이한 탄화수소 용매를 사용하는 것이 상이한 크기의 마이크로구를 초래한다는 것을 시사하였다. DCM은 에틸 아세테이트보다 더 큰 마이크로구 크기를 생성하였다. 따라서, 탄화수소 용매는 마이크로구 크기를 제어하기 위해 의도적으로 선택될 수 있다.
표 3.
실시예 5: 단백질 로딩 양의 효과
물질 및 방법
단백질 로딩 양만을 변화시켜서 실시예 2에 기재된 바와 같이 마이크로입자를 생성하였다. DCM 중의 삽십오 퍼센트(35%) w/v POE를 제조하였다. 총 고체 중량의 5%, 10% 및 30% w/w의 단백질 분말을 DCM 중의 POE 용액 0.5 mL에 현탁시켰다. 이들 현탁액을 20 mL 섬광 바이알 내의 0.5% w/w FS를 함유하는 FC-40 9.5 mL에 옮겼다. 이들 혼합물을 약 1 분 동안 균질화하여 에멀전을 생성한 다음, Novec7500 및 FC-40의 1:1 v:v 혼합물 6 mL를 1 분 이내에 에멀전에 첨가하였다. 이어서, 1 분 동안 교반한 후, 형성된 마이크로구를 여과에 의해 단리하고, FC-40으로 세척하고, 진공 하에서 건조시켰다.
결과
표 3에 나타낸 바와 같이, 제형 중의 단백질 분말의 양의 증가는 레이저 회절 분석에 의해 측정된 더 큰 POE 마이크로입자 크기를 야기하였고, 또한 단백질 추출 실험, 명시야 및 공초점 형광 현미경을 통해 관찰된 최종 POE 마이크로구 생성물에서 증가된 단백질 로딩을 야기하였다. 30% w/w 단백질 분말 로딩의 명시야 이미지는 10% w/w 단백질 분말보다 더 어둡고 덜 투명한 마이크로구를 보여주었고, 더 많은 약물이 마이크로구 생성물에 봉입되었음을 지시한다(도 10a 및 10b). 대표적인 공초점 이미지는 마이크로구의 단면도로부터 SDP가 그의 원래 형태로 POE 매트릭스에 봉입되었음을 확인하였다(도 11a 및 11b). 더 많은 SDP 입자가 30% w/w 로딩 마이크로구에서 관찰되었다. 다시, 봉입된 SDP는 그들의 딤플 형상을 보유하였고, 그들이 전체 제작 공정 동안 원상태였음을 지시한다. 추가로, SEM 이미지는 증가하는 단백질 분말 로딩이 더 많은 단백질 입자가 POE 마이크로입자의 표면에 흡착되는 것을 야기한다는 것을 입증하였다(도 12a-12c). 따라서, 결과들은 최대 30% w/w의 단백질 분말이 마이크로구 내에 효율적으로 봉입될 수 있음을 입증하였다. 이 제형에서 마이크로구 내의 물리적 공간의 잠재적 결여로 인해 > 30% w/w 단백질 분말 로딩의 경우에는 마이크로구의 표면에 단백질 입자가 흡착될 수 있다. 표면 흡착된 단백질은 버스트 방출 효과가 치료 효능을 위해 요망되는 경우에 물과 접촉시 약물의 버스트 방출을 발생할 수 있다. 단백질은 수성-기반 에멀전 시스템에서 예상되는 바와 같이 연속상으로 손실되지 않는다.
표 4.
실시예 6: H/F 벌크 에멀전화를 사용하여 POE 마이크로구 내에 SDP 봉입에 대한 실험의 설계(DOE)
물질 및 방법
설계된 공간에서의 합성의 중요한 인자가 최종 생성물의 특성에 미치는 영향을 평가하기 위해 DOE 연구를 수행하였다. 설계된 실험에서 10 회 시행을 실시예 2에 기재된 일반적인 절차에 따라 수행하였다. 단백질 분말 로딩, 단백질 분말 입자 크기(Dv(50) 크기 크기는 2.2 um 및 5.6 um이고, 도 13의 SEM 이미지 참조), 중합체 농도, 및 HFE 농도를 변화시켰고, 반면에 다음 제형 및 공정 조건, 예를 들어 탄화수소 및 탄화플루오린상의 부피, 균질화 속도, FS 농도는 일정하게 유지하였다(표 4). 측정된 반응은 마이크로구 크기(Dv50, 레이저 회절에 의한 스팬(Span)), 봉입 효율, 37 ℃에서 1 시간 버스트 방출, SEM 이미지를 포함하였다.
결과
DOE의 결과를 표 5에 요약한다.
표 5.
(R2 = 0.76을 갖는) 마이크로구 크기에서 맞춤 설계 DOE 피팅(fitting)은 단백질 분말 로딩 및 POE 농도의 주요 효과를 나타내었다(p-값 < 0.05, 표 6의 상관관계 결과 참조). 추가로, 버스트 방출에서 피팅(R2 = 0.92)은 단백질 분말 로딩만이 버스트 방출에 유의하게 영향을 미친다(p-값 < 0.05, 표 7의 상관관계 결과 참조)는 것을 보여준다. 결과는 제형에서 단백질 분말 양을 증가시키는 것이 최종 생성물에서 더 높은 페이로드를 초래할 것이지만, 또한 그것은 버스트 방출 백분율을 증가시킬 것임을 시사한다. 버스트 방출은 표면 흡착된 단백질 입자에 의해 야기될 가능성이 있다. 중합체 마이크로구에 내재화된 단백질 분말의 최대량은 주어진 마이크로구 크기에 대해서 물리적 공간에 의해 결정된다. 단지 제형 현탁액 중의 단백질 분말 농도를 증가시키는 것만으로는 이 실시예에서 약 30% w/w였던 어느 일정 문턱 이상에서는 약물 봉입을 증가시키지 않을 것이다.
표 6.
표 7.
실시예 7. 상이한 단백질에 S/H/F 에멀전-기반 봉입 방법의 적용
개시된 H/F 기반 에멀전 시스템 및 공정은 상이한 중합체 및 치료용 단백질에 적용가능한 플랫폼 기술일 수 있다. 본 발명의 한 특정한 예에서, 재조합 IgG4(MW ~145 kDa)의 단백질 분말, 재조합 IgG1(MW ~146 kDa)의 단백질 분말, 또는 재조합 융합 단백질(MW ~64 kDa)의 단백질 분말은 각각 실시예 2와 동일한 공정을 통해 POE 마이크로구 내에 봉입되었다. 결과를 표 7에 요약한다. 마이크로구 생성물 중의 봉입된 단백질 분말의 양은 추출 검정을 통해 결정되었고, 표적 값과 일치하였다. 단백질 순도가 봉입 공정 후에 재조합 융합 단백질 IgG1의 경우에는 보유되었거나 또는 IgG4의 경우에는 약간 감소되었다(2 % 미만)는 것은 양호한 공정적합성을 지시한다.
표 7.
다른 생분해성 중합체, 예를 들어 PLGA 및 PLA가 또한 H/F 기반 에멀전에 사용된다. 본 발명의 한 특정한 예에서, 실시예 2에 개시된 유사한 공정을 통해, 형광-표지된 VEGF Trap F-SDP를 PLGA (락티드:글리콜리드 50:50, Mw 42-65 kDa, Sigma Aldrich) 및 PLA(알킬 에테르 종결됨, Mw 18,000-28,000, Sigma Aldrich) 마이크로구 각각에 봉입하였다. 명시야 및 형광 현미경 이미지는 단백질 분말이 중합체 마이크로구의 내부에 성공적으로 봉입되었음을 지시한다(PLA의 경우 도 14a-c 및 PLGA의 경우 도 15a-b).
전술한 명세서에서 본 발명이 그의 일부 실시양태와 관련하여 기재되었고 많은 세부사항들이 예시 목적으로 제시되었지만, 본 발명이 추가적인 실시양태를 허용할 수 있고, 본원에 기재된 세부사항들 중 일부는 본 발명의 기본 원리에서 벗어남이 없이 상당히 변화될 수 있다는 것이 관련 분야의 숙련자에게는 명백할 것이다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 본 발명은 그의 정신 또는 본질적 속성으로부터 벗어남이 없이 다른 특정한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 본 발명의 범위를 지시하는 것으로서는 상기 명세서보다 첨부된 청구범위를 참고해야 한다.
Claims (52)
- 중합체 또는 중합체-코팅된 마이크로입자를 생성하는 방법으로서,
단백질 분말 및 중합체를 탄화수소 용매에서 배합하여 비수성 제1 용액을 형성하는 단계;
제1 용액을 탄화플루오린 액체 및 플루오린 계면활성제를 포함하는 제2 용액에 첨가하는 단계;
배합된 용액을 휘저어서 탄화플루오린 액체 내에 다중 에멀전 탄화수소 액적을 포함하는 비수성 에멀전을 형성하는 단계;
탄화수소 용매를 제거하는 단계; 및
탄화플루오린 액체를 제거하여 중합체 매트릭스 내에 봉입된 단백질을 포함하는 마이크로입자를 단리하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자가 단일 코어-쉘 구조를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 마이크로입자가 상기 중합체 내에 분산된 다중 코어를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로입자가 중합체에 의해 봉입된 단일 코어-구조의 배합을 포함하는 마이크로입자 및 중합체에 의해 봉입된 다중 코어 구조를 포함하는 마이크로입자를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄화플루오린 액체가 퍼플루오로 C5-C18 화합물을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄화수소 용액이 디클로로메탄, 클로로포름, 톨루엔, 에틸 아세테이트, 테트라히드로푸란 또는 그의 배합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄화플루오린 용액이 Flourinert™ FC-40 (평균 MW = 650 g/mol) 1,1,2,2,3,3,4,4,4-노나플루오로-N,N-비스(1,1,2,2,3,3,4,4,4-노나플루오로부틸)부탄-1-아민을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 탄화수소 용매가 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 또는 그의 배합을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄화플루오린 용액이 히드로플루오로에테르를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플루오린 계면활성제가 퍼플루오로폴리에테르-b-폴리에틸렌 글리콜-b-퍼플루오로폴리에테르를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 폴리오르토에스테르(POE)를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 폴리락트산 및 폴리(락트-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 융합 단백질, 재조합 단백질, 또는 그의 단편 또는 절단된 버전인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 단백질이 VEGF Trap 단백질인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 단백질이 VEGF Trap 단백질의 절단된 형태인, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로입자가 1 내지 200 μm의 직경을 가지는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분말이 직경 0.5 내지 20 μm의 미세화된 단백질을 포함하는 입자를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분말이 분무 건조, 전기분무 건조, 가역적 침전, 분무 동결, 마이크로템플레이팅(microtemplating) 또는 그의 배합에 의해 미세화되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에멀전이 균질화, 볼텍싱(vortexing), 초음파 처리, 캐비테이션(cavitation), 휘젓기, 또는 그의 배합을 사용하여 형성되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배합된 용액을 교반하면서 탄화수소 용매를 제거하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 탄화수소 용매가 진공 하에서 제거되어 마이크로입자를 경화하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄화수소 용매가 증발에 의해 제거되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄화플루오린 액체가 여과에 의해 임의로 진공 하에서 제거되는 것인, 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 히드로플루오로에테르가 상기 탄화수소를 추출하기 위해 공용매로서 사용되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되면서, 지속 방출 마이크로입자인 마이크로입자.
- 제25항의 마이크로입자를 포함하는 지속 방출 조성물.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로입자가 중합체 피질(cortex)에 기공 또는 채널을 거의 또는 전혀 가지지 않는 것인, 마이크로입자.
- 중합체 또는 중합체-코팅된 마이크로구를 생성하는 방법으로서,
(1) 5.0 내지 35% w/v POE를 포함하는 탄화수소 용액에 현탁된 1.0 내지 30.0% w/w 총 고체 분무 건조된 단백질을 포함하는 분산상을
(2) 0.1 내지 5.0% w/v 플루오린 계면활성제를 포함하는 탄화플루오린 용액을 포함하는 연속상에 배합하여 분산상의 에멀전 액적을 형성하는 단계;
탄화수소 액체를 제거함으로써 에멀전 액적을 경화하여 경화된 중합체 또는 중합체-코팅된 마이크로구를 형성하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제28항에 있어서, 상기 비수성 에멀전이 교반되고, 상기 탄화수소 용액이 교반되는 동안 주위 대기압 하에서 또는 진공 하에서 증발에 의해 제거되는 것인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 경화된 중합체 또는 중합체-코팅된 마이크로구가 진공 여과에 의해 수확되는 것인, 방법.
- 중합체 또는 중합체-코팅된 마이크로입자를 생성하는 방법으로서,
용해된 중합체를 포함하는 탄화수소 용액 및 분무 건조된 단백질 분말을 배합하여 분산상을 생성하는 단계;
분산상을 탄화플루오린 액체 및 0.1 내지 5.0% w/v의 플루오린 계면활성제를 포함하는 연속상과 배합하여 연속상 중의 분산상의 에멀전 액적을 생성하는 단계; 및
중합체-코팅된 마이크로입자를 수확하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제31항에 있어서, 상기 분무 건조된 단백질이 항체, 재조합 단백질, 융합 단백질 또는 그의 단편인, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 단백질이 VEGF Trap 단백질 또는 절단된 VEGF Trap 단백질인, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 탄화수소 용액이 디클로로메탄, 클로로포름, 톨루엔, 에틸 아세테이트, 테트라히드로푸란 또는 그의 배합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄화플루오린 액체가 트리플루오로메틸)비스(1,1,2,2,3,3,4,4,4-노나플루오로부틸)아민을 포함하는 것인, 방법.
- 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로입자가 교반하는 동안에 증발에 의해 또는 진공 하에서 탄화수소 용액을 제거함으로써 경화되는 것인, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 경화된 마이크로입자를 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제31항 내지 제37항의 방법 중 어느 하나에 의해 생성된 마이크로입자.
- 제38항의 마이크로입자를 포함하는 제약 조성물.
- 제39항에 있어서, 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제40항에 있어서, 상기 제약 조성물이 지속 방출 조성물인, 제약 조성물.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제약 조성물이 비경구 투여용으로 제형화된 것인, 제약 조성물.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제약 조성물이 100 mg 초과의 분무 건조된 단백질을 포함하는 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 히드로플루오로에테르가 4-에톡시-1,1,1,2,2,3,3,4,5,6,6,6-디데카플루오로-5-(트리플루오로메틸)헥산을 포함하는 것인, 방법.
- 마이크로 입자를 생성하는 방법으로서,
탄화수소 용매에 중합체를 포함하는 제1 용액과 탄화플루오린 용매 및 플루오린 계면활성제를 포함하는 제2 용액을 배합하는 단계;
배합된 용액을 휘저어서 에멀전을 생성하는 단계;
배합된 용액을 교반하면서 진공 하에서 탄화수소 용매를 제거하여 마이크로입자를 경화하는 단계;
마이크로입자를 수확하는 단계;
임의로, 마이크로입자를 세척하는 단계;
및 마이크로입자를 건조시키는 단계
를 포함하는, 방법. - 제45항에 있어서, 상기 탄화수소 용매가 디클로로메탄, 클로로포름, 톨루엔, 에틸 아세테이트, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 또는 그의 배합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 탄화플루오린 용매가 트리플루오로메틸)비스(1,1,2,2,3,3,4,4,4-노나플루오로부틸)아민을 포함하는 것인, 방법.
- 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 POE, 폴리락트산, 폴리(락트-코-글리콜산), 또는 그의 배합을 포함하는 것인, 방법.
- 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로입자가 중합체 피질 및 중공 코어를 포함하는 것인, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 마이크로입자가 중합체 피질에 기공 또는 채널을 거의 또는 전혀 가지지 않는, 방법.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 마이크로입자의 직경이 탄화수소 용매, 휘젓기 속도, 중합체 농도, 또는 그의 배합을 변화시킴으로써 요망되는 직경으로 조정되는 것인, 방법.
- 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항의 마이크로입자.
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