KR20220097858A - 시험관내 조류 식품 - Google Patents

Abstract

본원은 조류 섬유아세포로부터 시험관내에서 제조된 식품 및 상기 조류 섬유아세포의 수확 방법을 제공한다. 특히, 시험관내에서 생산된 닭고기 제품을 생산한다. 또한 본원은 그의 생산 방법을 제공한다.

Description

시험관내 조류 식품

본 개시내용은 시험관내에서 생산된 조류 세포로부터 유래된 식품 및 저혈청 또는 무혈청하에서의 조류 세포의 배양 방법에 관한 것이다.

닭고기는 수천 년 동안 인간 식단의 일부였다. 현대 국내 닭(Gallus domesticus)은 동남 아시아가 원산지인 붉은 정글새(Gallus gallus)의 후손이지만 일부 관련 종은 국내 닭의 진화 과정에서 이종교배되었을 수도 있다(Lawler et al.). 기원전 2000년경에 인도에서 처음으로 사육된 것으로 여겨진다(USDA Fact Sheet). 현재, 세계에는 약 20억 마리의 닭이 있는 것으로 여겨지며, 인간의 식단에서 가장 흔한 동물성 단백질 공급원으로서 돼지를 제치고 추월할 태세이다(Gorman et al.). 닭고기는 단백질 함량이 높고 지방 함량이 낮기 때문에 매우 바람직한 식품 성분이다.

닭고기는 다양한 문화적 경계를 쉽게 넘나드는 우리 시대의 유비쿼터스 식품이다. 부드러운 맛과 균일한 질감(texture)으로 닭고기는 거의 모든 요리의 풍미 팔레트에 대해 흥미로운 빈 캔버스를 제공한다.

닭고기는 종종 붉은 고기에 대한 건강한 대안으로 권장된다. 닭고기 소비는 붉은 육류나 가공육보다 대장암 발병 위험이 낮고(English et al.) 흰살코기(닭고기, 칠면조 고기 및 생선) 소비는 모든 원인으로 인한 사망률, 암 발병 위험, 및 심혈관 질환의 낮은 위험성과 연관된다(Sinha et al.). 또한 닭고기는 심혈관 질환의 위험인자인 포화지방과 콜레스테롤 함량이 붉은 육류보다 적다(국제암연구소).

추가로, 닭고기 소비와 관련하여 안전 문제가 발생한 경우, 이는 전형적으로 닭에 있을 수 있는 모든 미생물을 죽이지 않는 덜 익힌 조리와 함께, 축산, 도축 또는 가공 실행의 결함과 관련된 미생물 오염이 포함된다. 도축 및 가공 과정에서 대변으로 고기가 오염되는 것은 흔한 일이다. 2012년 미국 전역의 닭고기 제품에 대한 무작위 조사에서 책임 있는 의학을 위한 의사 위원회(Physicians Committee for Responsible Medicine)는 샘플의 48%에 대변이 포함되어 있음을 발견했으며 2009년 USDA 연구에 따르면 닭 시체의 87%가 포장 직전에 분변 오염 징후인 이. 콜라이(E. coli)에 대해 양성 반응을 보였다. 철저히 조리하면 오염된 미생물을 죽일 수 있지만 조리가 철저하지 않으면 일부 미생물이 생존하여 식인성 질병을 일으킬 수 있다.

배양육 제품은 (1) 식용을 위해 도축된 동물에 대한 의존도를 실질적으로 감소시키고, (2) 식량 공급을 위해 동물을 기르는 환경적 부담을 줄이며, (3) 안전하고 일관된 품질을 갖는 신뢰할 만한 단백질 공급원을 제공할 잠재력이 있다.

본 개시내용은 시험관내에서 조류 섬유아세포(avian fibroblast cell)를 배양하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 조류 식품용 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 제품의 제조 및 사용 공정을 제시한다.

일부 구현예에서, 시험관내에서 배양된 조류 섬유아세포를 포함하는 식품의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 조류 섬유아세포를 유지할 수 있는 증식 배지(growth medium)에서 시험관내에서 조류 섬유아세포의 집단(population)을 배양하고, 상기 조류 섬유아세포를 회수하고, 상기 회수된 조류 섬유아세포를 식용 식품으로 제형화함을 포함한다. 일부 구현예에서, 조류 섬유아세포는 1차 조류 섬유아세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조류 섬유아세포는 2차 조류 섬유아세포를 포함한다.

일부 구현예에서, 시험관내에서 증식된 조류 섬유아세포로부터 제조된 식품의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 수(water)를 포스페이트로 컨디셔닝하여 컨디셔닝된 수(conditioned water)를 제조하는 단계, 식물 단백질 단리물(isolate) 또는 식물 단백질 농축물을 상기 컨디셔닝된 물로 수화하여 수화된 식물 단백질을 생산하는 단계, 세포 페이스트를 상기 수화된 식물 단백질과 접촉시켜 세포 및 콩류(pulse) 단백질 혼합물을 생산하는 단계, 상기 세포 및 식물 단백질 혼합물을 수 개의 단계로 가열하는 단계(여기에서 상기 가열 단계는 하기 중 적어도 하나를 포함한다:

상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 40 내지 65℃의 온도로 상승시키고, 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 40 내지 65℃의 온도에서 1 내지 30분 동안 유지시키고, 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 60 내지 85℃의 온도로 상승시킨다), 상기 세포 및 단백질 혼합물을 -1 내지 25℃의 온도로 냉각시키는 단계, 및 상기 세포 및 단백질 혼합물을 지방과 혼합하여 사전-조리(pre-cooking) 제품을 생산하는 단계를 포함한다. 상기 사전-조리 제품은 추가 조리 없이 소비할 수 있다. 대안적으로, 상기 사전-조리 제품은 조리되어 식용 식품을 생산한다. 임의로, 상기 사전-조리 제품을 실온, 냉장 온도 또는 냉동 상태에서 보관할 수 있다.

일부 구현예에서, 세포 페이스트(상기 세포 페이스트 함량은 적어도 5 중량%이고, 상기 세포 페이스트는 시험관내에서 증식된 조류 섬유아세포로부터 제조된다); 식물 단백질 단리물 또는 식물 단백질 농축물(상기 식물 단백질 함량은 적어도 5 중량%이다); 지방(상기 지방 함량은 적어도 5 중량%이다); 및 수(상기 수 함량은 적어도 5 중량%이다)를 포함하는, 조류 섬유아세포로부터 생산된 식품을 제공한다.

일부 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 약 1 내지 100 중량%의 습윤 세포 페이스트를 포함한다.

일부 구현예에서, 식물 단백질 단리물 또는 식물 단백질 농축물은 마른 콩, 렌틸콩, 녹두(mung bean), 파바콩, 마른 완두콩, 병아리콩, 동완두, 밤바라콩, 비둘기 완두콩, 루핀, 갈퀴덩굴, 팥, 일반 콩, 호로파, 긴콩, 리마콩, 러너콩, 또는 테파리콩, 대두, 또는 무쿠나콩으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 콩류로부터 수득된다. 다양한 구현예에서, 본원에 제공된 콩류 단백질 단리물 또는 식물 단백질 농축물은 비그나 안굴라리스(Vigna angularis), 비시아 파바(Vicia faba), 시세르 아리에티눔(Cicer arietinum), 렌즈 쿨리나리스(Lens culinaris), 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris), 비그나 운구이쿨라타(Vigna unguiculata), 비그나 서브테라네아(Vigna subterranea), 카자누스 카잔(Cajanus cajan), 루피누스 스페시즈(Lupinus sp.), 벳치 스페시즈(Vetch sp.), 트리고넬라 포에눔-그라에쿰(Trigonella foenum-graecum), 파세올루스 루나투스(Phaseolus lunatus), 파세올루스 콕시네우스(Phaseolus coccineus) 또는 파세올루스 아쿠티폴리우스(Phaseolus acutifolius)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 콩류 단백질 단리물은 녹두로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 녹두는 비그나 라디아타(Vigna radiata)이다.

일부 구현예에서, 동물 단백질 단리물 및 동물 단백질 농축물은 동물 또는 동물 생산물로부터 수득된다. 동물 단백질 단리물 또는 동물 단백질 농축물의 예는 유청, 카제인 및 계란 단백질을 포함한다.

일부 구현예에서, 식물 단백질 단리물은 밀, 쌀, 테프, 귀리, 옥수수, 보리, 수수, 호밀, 기장, 삼백초, 아마란스, 메밀, 퀴노아, 아몬드, 캐슈, 피칸, 땅콩, 호두, 마카다미아, 개암, 피스타치오, 브라질넛, 밤, 콜라넛, 해바라기씨, 호박씨, 아마씨, 카카오, 잣, 은행 및 기타 견과류로부터 수득된다.

도 1은 조류 섬유아세포의 배양에 대한 공정 흐름도를 묘사한다.
도 2는 배양된 조류 섬유아세포의 수확을 위한 공정 흐름도를 묘사한다.
도 3은 배양된 닭고기 제품(JUST7, JUST8, JUST9)의 제조에 사용된 닭 세포 풀의 3개의 생물학적 복제물(JUST1, JUST2, JUST3)의 전사체 분석의 계층적 군집화를 묘사한다.
도 4a는 배양 시간의 함수로서 세포 생육력을 나타내는 저혈청 배지에서의 닭 섬유아세포 적응을 묘사한다. 도 4b는 계대수의 함수로서 집단 배가 시간을 나타내는 저혈청 배지에서의 닭 섬유아세포 적응을 묘사한다.
도 5a는 배양 시간의 함수로서 지방산 및 성장인자가 보충된 기본 배지에서의 닭 섬유아세포 적응을 묘사한다. 도 5b는 배양 시간의 함수로서 성장인자가 없는 기본 배지에서의 닭 섬유아세포 적응을 묘사한다. 도 5c는 배양 시간의 함수로서 성장인자가 보충된 무혈청 기본 배지에서의 닭 섬유아세포 적응을 묘사한다. 성장인자는 인슐린-유사, 표피-유사, 및 섬유아세포-유사 성장인자를 포함한다.
도 6A는 배양 시간의 함수로서, 본원에 정의된 바와 같은 ITSEEF의 존재하에서 감소하는 농도의 FBS를 갖는 배지에서의 C1F 닭 세포의 적응을 묘사한다. 도 6B는 계대수의 함수로서 집단 배가시간을 나타내는 무-혈청 배지에의 닭 섬유아세포 적응을 묘사한다. 도 6C는 도 6A 및 6B에 나타낸 배양물에 대한 시간의 함수로서 세포 생육력을 묘사한다.

하기의 설명은 당업자가 개시된 발명의 요지를 만들어 사용하고, 적용의 상황에 이를 통합시킬 수 있도록 제공된다. 다양한 변형(modification)뿐만 아니라 다양한 적용에서의 다양한 용도는 당업자에게 쉽게 명백할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리를 광범위한 구현예에 적용할 수 있다. 따라서, 본 개시내용을 제시된 구현예로 제한하고자 하지 않고, 본원에 개시된 원리 및 신규의 특징과 일치하는 가장 넓은 범위를 부여하고자 한다.

정의

본원에 사용되는 바와 같이, "배치(batch) 배양"이란 용어는 영양소, 온도, 압력, 통기, 및 성장을 최적화하기 위한 다른 환경 조건을 갖는 폐쇄된 배양 시스템을 지칭한다. 배양 중에 영양소가 추가되지 않고 폐기물이 제거되지 않기 때문에, 배치 배양은 영양소가 고갈되고 성장이 멈추기 전에 유한한 수명 주기를 완료할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "식용 식품"이란 용어는 인간 소비에 안전한 식품을 지칭한다. 예를 들어, 여기에는 비제한적으로, 정부 또는 규제 기관(예를 들어 미국 식품의약국)에 따라 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 식품이 포함된다. 몇몇 구현예에서, 식품은 숙련가에 의해, 소비하기에 안전한 것으로 간주된다. 인간 소비에 적합한 임의의 식용 식품은 또한 다른 동물이 소비하기에도 적합해야 하며 이러한 구현예를 본원의 범위 내에 포함시키고자 한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "효소" 또는 "효소적으로"란 용어는 생물학적 촉매를 지칭한다. 효소는 화학 반응을 가속화하거나 촉매화한다. 효소는 활성화 에너지를 낮추어 반응 속도를 증가시킨다.

본원에 사용되는 바와 같이, "발현"이란 용어는 유전자로부터의 정보가 기능성 유전자 산물의 합성에 사용되는 과정이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "유가(fed-batch) 배양"이라는 용어는 기질과 같은 하나 이상의 영양소가 배양 동안 연속 또는 주기적 모드로 생물 반응기에 공급되고 생산물(들)이 실행이 끝날 때까지 생물 반응기에 남아 있는 작동 기법을 지칭한다. 대안의 설명은 기본 배지가 초기 세포 배양을 지원하고, 영양 고갈을 방지하기 위해 공급물 배지가 추가되는 배양에 대한 것이다. 유가 배양에서 배양액의 공급된-기질 농도를 원하는 수준으로 조절하여 지속적인 성장을 지원할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "유전자 산물"은 유전자의 발현으로 인한 생화학적 물질, RNA 또는 단백질이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "증식 배지"는 미생물 또는 세포 또는 작은 식물의 성장을 지지하는 배지 또는 배양 배지를 지칭한다. 증식 배지는 제한 없이 고체 또는 액체 또는 반고체일 수 있다. 증식 배지는 또한 "증식 배지들"과 동의어이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "기본 배지"는 임의의 특별한 영양 보충제를 필요로 하지 않는 다수 유형의 미생물 및/또는 세포의 성장을 촉진하는 비-보충 배지를 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "시험관내"는 시험관, 배양 접시, 생물반응기, 또는 살아있는 유기체 외부의 다른 어떤 곳에서 수행되거나 일어나는 과정을 지칭한다. 본 개시내용의 본문에서, 생산물은 시험관내 생산물로도 지칭될 수 있으며, 이 경우 시험관내는 형용사가 되며, 이는 생산물이 살아있는 유기체의 밖에 있는 방법 또는 공정으로 생산되었음을 의미할 것이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "현탁 배양"은 단일 세포 또는 세포의 작은 응집체가 교반된 액체 배지에 현탁된 상태에서 번식하는 유형의 배양을 지칭한다. 또한 세포 배양 또는 세포 현탁 배양을 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "섬유아세포"는 세포외 기질, 상피 분화, 및 염증 및 상처 치유의 조절을 담당하는 중간엽 유래 세포를 지칭한다. 또한, 섬유아세포는 성장인자의 분비를 담당하며 다른 세포 유형에 대한 스캐폴드(scaffold)로서 작용한다. 섬유아세포는 통상적인 육류에서 발견되는 세포 유형 중 하나이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "세포 페이스트"는 수를 함유하는 세포 배양물로부터 수확되는 세포의 페이스트를 지칭한다. 세포 페이스트의 건조 세포 중량은 1%-5%,5%-10%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 또는 그 이상일 수 있다. 숙련가는 목적하는 수 함량을 갖는 세포 페이스트를 제조할 수 있다. 전형적으로, 세포 페이스트는 약 5 내지 15 건조 세포 중량%의 세포를 포함한다. 임의의 다른 목적하는 건조 세포 중량 백분율을 포함하는 세포 페이스트를 포함하여, 배양된 세포의 목적하는 건조 세포 중량을 포함하는 세포 페이스트를 제조하는 것은 숙련가의 영역내에 있다. 숙련가는 원심분리, 동결건조, 가열 또는 임의의 다른 주지된 건조 기법에 의해 수분을 제거할 수 있다. 미국 농무부에 따르면, 가금류를 포함한 동물 육류의 천연 수분 함량은 약 75%의 수이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "습윤 세포 페이스트"는 약 25%-90%의 수, 25%-85%의 수, 25%-80%의 수, 25%-75%의 수, 25%-70%의 수, 25%-65%의 수, 25%-60%의 수, 25%-55%의 수, 25%-50%의 수, 30%-90%의 수, 30%-85%의 수, 30%-80%의 수, 30%-75%의 수, 30%-70%의 수, 30%-65%의 수, 30%-60%의 수, 30%-55%의 수, 30%-50%의 수, 35%-90%의 수, 35%-85%의 수, 35%-80%의 수, 35%-75%의 수, 35%-70%의 수, 35%-65%의 수, 35%-60%의 수, 35%-55%의 수, 35%-50%의 수, 40%-90%의 수, 40%-85%의 수, 40%-80%의 수, 40%-75%의 수, 40%-70%의 수, 40%-65%의 수, 40%-60%의 수, 40%-60%의 수, 40%-55%의 수, 40%-50%의 수, 45%-90%의 수, 45%-85%의 수, 45%-80%의 수, 45%-75%의 수, 45%-70%의 수, 45%-75%의 수, 45%-70%의 수, 45%-65%의 수, 45%-60%의 수, 45%-55%의 수, 45%-50%의 수, 50%-90%의 수, 50%-85%의 수, 50%-80%의 수, 50%-75%의 수, 50%-70%의 수, 50%-65%의 수, 50%-60%의 수, 50%-55%의 수를 포함한다. 세포 페이스트는 배양된 세포육의 또 다른 용어이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 적어도 80 건조 중량%의 세포인 세포를 지칭한다. 실질적으로 순수한 세포는 80 내지 85 건조 중량%의 세포, 85 내지 90 건조 중량%의 세포, 90 내지 92 건조 중량%의 세포, 92 내지 94 건조 중량%의 세포, 94 내지 96 건조 중량%의 세포, 96 내지 98 건조 중량%의 세포, 98 내지 99 건조 중량%의 세포이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "시즈닝(seasoning)"은 고체 및 액체 형태의 하나 이상의 허브와 양념을 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "1차 조류 섬유아세포"는 적합한 증식 배지에서, 예를 들어 조절된 환경 조건하에서 성장을 유지하는 모 동물로부터의 세포를 지칭한다. 1차 배양물 중의 세포는 원래 조직 중의 세포와 동일한 핵형(진핵생물 세포 핵 중의 염색체의 수 및 외관)을 갖는다.

본원에 사용되는 바와 같이, "2차 조류 섬유아세포"는 유전자 형질전환을 겪고 불멸화되어 무한 증식을 허용하는 1차 세포를 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "증식"은 세포수의 증가를 생성시키는 과정을 지칭한다. 상기는 세포사 또는 분화를 통한 세포 분열과 세포상실간의 균형을 특징으로 한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "부정성(adventitious)"은 비제한적으로, 바이러스, 세균, 마이코플라스마 및 진균과 같은 하나 이상의 오염물질을 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "펩티드 가교결합 효소" 또는 "가교결합 효소"는 하나 이상의 폴리펩티드간의 공유 결합의 형성을 촉매화하는 효소이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "트랜스글루타미나제" 또는 "TG"는 γ-카복시아미드기와 다양한 1차 아민간의 펩티드(아미드) 결합의 형성을 촉매화하는 효소(R-글루타밀-펩티드 아민 글루타밀 트랜스퍼라제)(EC 2.3.2.13으로서 분류됨)를 지칭한다. 트랜스글루타미나제는 폴리펩티드간의 공유 결합의 형성을 촉매화함으로써 폴리펩티드를 가교결합시킨다. 트랜스글루타미나제와 같은 가교결합 효소는 식품 산업에서 낙농, 육류 및 시리얼 제품과 같은 일부 식품의 질감을 개선시키기 위해 사용된다. 상기는 세균 공급원, 진균, 곰팡이, 어류, 포유동물 또는 식물로부터 단리될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "단백질 농축물"은 식물 공급원 또는 동물 공급원으로부터 수득된 하나 이상의 상이한 폴리펩티드의 집합체이다. 단백질 농축물의 단백질 건조 중량 퍼센트는 25 건조 중량% 초과의 단백질이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "단백질 단리물"은 식물 공급원 또는 동물 공급원으로부터 수득된 하나 이상의 상이한 폴리펩티드의 집합체이다. 단백질 농축물의 단백질 건조 중량 퍼센트는 50 건조 중량% 초과의 단백질이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 백분율(%)은 달리 나타내지 않는 한 전형적으로 건조 중량 기준의 총 중량%를 지칭한다.

"약"이란 용어는 지시된 값 및 상기 값 초과 및 미만의 범위를 가리키고 포함한다. 몇몇 구현에에서, "약"이란 용어는 지정된 값±10%, ±5% 또는 ±1%를 가리킨다. 몇몇 구현예에서, "약"이란 용어는 지정된 값±상기 값의 1 표준 편차를 가리킨다.

본 개시내용에서, 시험관내에서 조류 유래된 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본원의 방법은 세포 배양물을 증식시키고, 회수하고, 그의 순도를 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 세포를 예를 들어 하나 이상의 식품에 사용할 수 있다.

본원의 개시내용은 시험관내에서 증식된 조류 유래된 세포를 포함하는 조류 식품 조성물에 대한 구현예를 제시한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 식물 단백질, 세포 페이스트, 지방, 수 및 펩티드 가교결합 효소를 포함한다.

본원의 개시내용은 시험관내에서 증식된 조류 유래된 세포로부터 제조된 조류 식품의 제조 방법에 대한 구현예를 제시한다. 상기 조류 식품은 식용 식품이다.

세포

본원은 세포를 포함하는 식품 또는 공정을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 조류 세포이다. 일부 구현예에서, 조류 세포는 비제한적으로 닭, 꿩, 거위, 백조, 비둘기, 칠면조 및 오리 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 조류 섬유아세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 2차 조류 섬유아세포를 포함한다.

일부 구현예에서, 세포는 UMNSAH/DF1(C1F) 세포이다. 몇몇 구현예에서, 세포는 1996년 10월 11일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재)에 기탁된 상업적으로 입수할 수 있는 닭 세포주이다. 일부 구현예에서, 사용된 세포는 ATCC 기탁 번호 CRL12203으로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 조류 세포주는 자발적으로 불멸화된 섬유아세포 표현형을 갖는다. 일부 구현예에서, 조류 세포주는 높은 증식률을 갖는다. 몇몇 구현예에서, 세포는 불멸화된 섬유아세포 표현형과 높은 증식률을 모두 갖는다.

일부 구현예에서, 세포는 어떠한 방식으로도 재조합되거나 조작되지 않는다(즉 비-GMO). 일부 구현예에서, 세포는 어떠한 바이러스 및/또는 바이러스 DNA에도 노출되지 않았다. 몇몇 구현예에서, 세포는 재조합체도 아니고 어떠한 바이러스 및/또는 바이러스 DNA 및/또는 RNA에도 노출되지 않았다.

배양 배지 및 성장

일부 구현예에서, 증식은 현탁 또는 접착 조건에서, 피더-세포의 존재 및/또는 부재하에서 및/또는 혈청-함유 또는 무혈청 배지 조건에서 일어난다. 일부 구현에에서, 증식용 배지는 아미노산, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 필수 금속, 무기질, 비타민, 완충제, 항균제, 성장인자, 및/또는 추가적인 성분 중 하나 이상을 함유한다.

일부 구현예에서, 증식을 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정한다. 일부 구현예에서, 증식을 직접적인 세포 카운트를 통해 측정한다. 몇몇 구현예에서, 증식을 혈구계에 의해 측정한다. 일부 구현예에서, 증식을 자동 세포 영상화에 의해 측정한다. 몇몇 구현예에서, 증식을 쿨터(Coulter) 계수기에 의해 측정한다.

일부 구현예에서, 증식을 생육력 착색제를 사용하여 측정한다. 몇몇 구현예에서, 사용된 착색제는 트립판 블루를 포함한다.

일부 구현예에서, 증식을 전체 DNA에 의해 측정한다. 일부 구현예에서, 증식을 BrdU 표지화에 의해 측정한다. 일부 구현예에서, 증식을 대사 측정에 의해 측정한다. 몇몇 구현예에서, 증식을 테트라졸륨 염을 사용하여 측정한다. 몇몇 구현예에서, 증식을 ATP-결합된 발광에 의해 측정한다.

일부 구현예에서, 배양 배지는 기본 배지이다. 몇몇 구현예에서, 기본 배지는 DMEM, DMEM/F12, MEM, HAMS's F10, HAM's F12, IMDM, 맥코이 배지(McCoy's Media) 및 RPMI이다.

일부 구현예에서, 기본 배지는 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 비오틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 콜린 클로라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 D-칼슘 판토테네이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 폴산을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 니아신아미드를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 피리독신 하이드로클로라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 리보플라빈을 포함한다. 일부 구현예에서, 티아민 하이드로클로라이드는 기본 배지(DMEM/F12)의 일부이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 비타민 B12(또한 시아노코발아민으로서 공지됨)를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 i-이노시톨(미오-이노시톨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 염화 칼슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 황산 구리를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 질산 제2철을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 염화 마그네슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 황산 마그네슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 염화 칼륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 나트륨 비카보네이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 염화 나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 이염기성 인산 나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 일염기성 인산 나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 황산 아연을 포함한다. 일부 구현예에서, 증식 배지는 당을 포함한다. 일부 구현예에서, 당은 비제한적으로 D-글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 만노스, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 하나의 구현예에서, 당은 D-글루코스와 만노스를 모두 포함한다. 글루코스 및 만노스가 둘 다 세포를 배양하기 위한 증식 배지에 사용되는 구현예에서, 상기 증식 배지(배양 배지) 중의 글루코스의 양은 0.1-10 g/L, 0.1-9 g/L, 0.1-8 g/L, 0.1-7 g/L, 0.1-6 g/L, 0.1-5 g/L, 0.1-4 g/L, 0.1-3 g/L, 0.1-2 g/L, 0.1-1g/L, 0.5-10 g/L, 0.5-9 g/L, 0.5-8 g/L, 0.5-7 g/L, 0.5-6 g/L, 0.5-5 g/L, 0.5-4 g/L, 0.5-3 g/L, 0.5-2 g/L, 0.5-1 g/L, 1-10 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-7 g/L, 1-6 g/L, 1-5 g/L, 1-4 g/L, 1-3 g/L, 1-2 g/L, 2-10 g/L, 2-9 g/L, 2-8 g/L, 2-9 g/L, 2-8 g/L, 2-7 g/L, 2-6 g/L, 2-5 g/L, 2-4 g/L, 2-3 g/L, 3-10 g/L, 3-9 g/L, 3-8 g/L, 3-9 g/L, 3-8 g/L, 3-7 g/L, 3-6 g/L, 3-5 g/L, 3-4 g/L, 4-10 g/L, 4-9 g/L, 4-8 g/L, 4-9 g/L, 4-8 g/L, 4-7 g/L, 4-6 g/L, 4-5 g/L, 5-10 g/L, 5-9 g/L, 5-8 g/L, 5-9 g/L, 5-8 g/L, 5-7 g/L, 또는 5-6 g/L이고, 상기 증식 배지 중의 만노스의 양은 0.1-10 g/L, 0.1-9 g/L, 0.1-8 g/L, 0.1-7 g/L, 0.1-6 g/L, 0.1-5 g/L, 0.1-4 g/L, 0.1-3 g/L, 0.1-2 g/L, 0.1-1g/L, 0.5-10 g/L, 0.5-9 g/L, 0.5-8 g/L, 0.5-7 g/L, 0.5-6 g/L, 0.5-5 g/L, 0.5-4 g/L, 0.5-3 g/L, 0.5-2 g/L, 0.5-1 g/L, 1-10 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-7 g/L, 1-6 g/L, 1-5 g/L, 1-4 g/L, 1-3 g/L, 1-2 g/L, 2-10 g/L, 2-9 g/L, 2-8 g/L, 2-9 g/L, 2-8 g/L, 2-7 g/L, 2-6 g/L, 2-5 g/L, 2-4 g/L, 2-3 g/L, 3-10 g/L, 3-9 g/L, 3-8 g/L, 3-9 g/L, 3-8 g/L, 3-7 g/L, 3-6 g/L, 3-5 g/L, 3-4 g/L, 4-10 g/L, 4-9 g/L, 4-8 g/L, 4-9 g/L, 4-8 g/L, 4-7 g/L, 4-6 g/L, 4-5 g/L, 5-10 g/L, 5-9 g/L, 5-8 g/L, 5-9 g/L, 5-8 g/L, 5-7 g/L, 또는 5-6 g/L이다. 당업자는 이들 글루코스와 만노스의 양의 조합, 예를 들어 2 내지 5 그램의 글루코스와 1 내지 4 그램의 만노스를 사용할 수 있음을 알 것이다.

일부 구현예에서, 기본 배지는 리놀레산을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 리포산을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 푸트레신-2HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 1,4 부탄디아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 플루로닉 F-68을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 본 단락 중의 각 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 DMEM/F12이다.

일부 구현예에서, 증식 배지는 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈청은 송아지 태아 혈청, 닭 혈청, 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택된다.

일부 구현예에서, 증식 배지는 적어도 10%의 소 태아 혈청을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 조류 섬유아세포의 집단을, 상기 세포의 회수에 앞서, 적어도 10%의 소 태아 혈청이 있는 배지에 이어서, 2% 미만으로 감소된 소 태아 혈청이 있는 배지에서 증식시킨다.

또 다른 구현예에서, 배양 배지는 소 태아 혈청, 송아지 태아 혈청, 또는 임의의 동물 유래된 혈청을 포함하는 혈청을 함유하지 않는다.

몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 1.9% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 1.7% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 1.5% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 1.3% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 1.1% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 0.9% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 0.7% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 0.5% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 0.3% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 0.1% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 0.05% 이하의 소 태아 혈청으로 감소시킨다. 몇몇 구현예에서, 소 태아 혈청을 세포의 회수에 앞서 약 0%의 소 태아 혈청으로 감소시킨다.

일부 구현예에서, 기본 배지는 DMEM/F12이고 3:1; 2:1; 또는 1:1의 비로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 기본 배지는 DMEM/F12이고 약 3:1의 비로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 기본 배지는 DMEM/F12이고 약 2:1의 비로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 기본 배지는 DMEM/F12이고 약 1:1의 비로 존재한다.

일부 구현예에서, 증식 배지는 프로테아솜, 스테로이드 생합성, 아미노산 분해, 아미노산 생합성, 약물 대사, 국소 접착(focal adhesion), 세포 주기, MAPK 신호전달(signaling), 글루타치온 대사, TGF-베타, 파고솜(phagosome), 테르페노이드 생합성, DNA 복제, 해당, 글루코스신생합성, 단백질 외수송(protein export), 부타노에이트 대사, 및 케톤체의 합성 및 분해로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포 신호전달 경로로부터의 적어도 하나의 유전자의 발현을 최적화하기 위해 변형된다.

일부 구현예에서, 조류 섬유아세포의 생산 단계를 하나 이상의 세포 신호전달 경로의 유전자 발현에 대해 모니터링한다. 몇몇 구현예에서, 증식 배지를 유전자 발현의 모니터링으로부터 획득된 데이터에 따라 각 세포 생산 단계에서 조절한다.

일부 구현예에서, 조류 섬유아세포를, 하나 이상의 지질의 축적을 유도하기에 충분한 양으로 하나 이상의 화합물을 증식 배지에 가하거나 상기 배지로부터 제거함으로써 지질을 축적하도록 유도한다.

일부 구현예에서, 임의의 배양 조건에서 조류 섬유아세포의 유지, 증식, 분화, 지질 축적, 지질 함량, 정제 및/또는 수확 효율, 증식률, 세포 밀도, 세포 중량, 내오염성, 조류 섬유아세포-특이적 유전자 발현 및/또는 단백질 분비, 전단 감도(shear sensitivity), 풍미, 질감, 색상, 냄새, 향, 미각 품질, 영양 품질, 성장 억제 부산물 분비 최소화 및/또는 배지 요구 최소화 중 하나 이상이 성장인자, 단백질, 펩티드, 지방산, 원소, 소분자, 식물 하이드로실레이트, 유도 진화, 유전 공학, 배지 조성, 생물반응기 설계 및/또는 스캐폴드 설계 중 하나 이상에 의해 개선된다. 몇몇 구현예에서, 지방산은 스테아리돈산(SDA)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 지방산은 리놀레산을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 성장인자는 인슐린 또는 인슐린 유사 성장인자를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 성장인자는 섬유아세포 성장인자 등을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 성장인자는 표피 성장인자 등을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 단백질은 트랜스페린을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 원소는 셀레늄을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 소분자는 에탄올아민을 포함한다. 배양에 사용되는 에탄올아민의 양은 0.05-10 ㎎/L, 0.05-10 ㎎/L, 0.1-10 ㎎/L, 0.1-9.5 ㎎/L, 0.1-9 ㎎/L, 0.1-8.5 ㎎/L, 0.1-8.0 ㎎/L, 0.1-7.5 ㎎/L, 0.1-7.0 ㎎/L, 0.1-6.5 ㎎/L, 0.1-6.0 ㎎/L, 0.1-5.5 ㎎/L, 0.1-5.0 ㎎/L, 0.1-4.5 ㎎/L, 0.1-4.0 ㎎/L, 0.1-3.5 ㎎/L, 0.1-3.0 ㎎/L, 0.1-2.5 ㎎/L, 0.1-2.0 ㎎/L, 0.1-1.5 ㎎/L, 및 0.1-1.0 ㎎/L이다.

몇몇 구현예에서, 배지는 식물 가수분해산물이 보충될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 가수분해산물은 효모 추출물, 밀 펩톤, 쌀 펩톤, 피톤 펩톤, 이스톨레이트, 완두 펩톤, 대두 펩톤, 완두 펩톤, 감자 펩톤, 녹두 단백질 가수분해산물 또는 셰프톤을 포함한다. 배양에 사용되는 가수분해산물의 양은 0.1 g/L 내지 5 g/L, 0.1 g/L 내지 4.5 g/L, 0.1 g/L 내지 4 g/L, 0.1 g/L 내지 3.5 g/L, 0.1 g/L 내지 3 g/L, 0.1 g/L 내지 2.5 g/L, 0.1 g/L 내지 2 g/L, 0.1 g/L 내지 1.5 g/L, 0.1 g/L 내지 1 g/L, 또는 0.1 g/L 내지 0.5 g/L이다.

일부 구현예에서, 소분자는 락테이트 데하이드로게나제 억제제를 포함한다. 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 락테이트 데하이드로게나제는 락테이트의 형성을 억제한다. 조류 세포에 의한 락테이트의 생산은 세포의 성장을 억제한다. 예시적인 락테이트 데하이드로게나제 억제제는 옥사메이트, 갈로플라빈, 고시폴(gossypol), 퀴놀린 3-설폰아미드, N-하이드록시인돌-계 억제제, 및 FX11로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 발효 배지 중 락테이트 데하이드로게나제 억제제의 양은 1-500mM, 1-400mM, 1-300mM, 1-250mM, 1-200mM, 1-175mM, 1-150mM, 1-100mM, 1-50mM, 1-25mM, 25-500mM, 25-400mM, 25-300mM, 25-250mM, 25-200mM, 25-175mM, 25-125M, 25-100mM, 25-75mM, 25-50mM, 50-500mM, 50-400mM, 50-300mM, 50-250mM, 50-200mM, 50-175mM, 50-150mM, 50-125mM, 50-100mM, 50-75mM, 75-500mM, 75-400mM, 75-300mM, 75-250mM, 75-200mM, 75-175mM, 75-150mM, 75-125mM, 75-100mM, 100-500mM, 100-400mM, 100-300mM, 100-250mM, 100-200mM, 100-150mM, 100-125mM, 및 100-500mM이다.

일부 구현예에서, 조류 섬유아세포를 현탁 배양 시스템에서 증식시킨다. 일부 구현예에서, 조류 섬유아세포를 배치, 유가, 반연속(충전 및 회수) 또는 관류 배양 시스템 또는 이들 중 일부의 조합에서 증식시킨다. 현탁 배양으로 증식시키는 경우, 상기 현탁 배양을 목적하는 크기의 용기(vessel)(발효 탱크, 생물반응기)에서 수행할 수 있다. 용기는 조류 세포의 허용가능하지 않은 붕괴 없이 상기 세포의 증식에 적합한 크기이다. 일부 구현예에서, 현탁 배양 시스템을 적어도 25 리터(L), 50 L, 100 L, 200 L, 250 L, 350 L, 500 리터(L), 1000 L, 2,500 L, 5,000 L, 10,000 L, 25,000 L, 50,000 L, 100,000 L, 200,000 L, 250,000 L, 또는 500,000 L의 용기에서 수행할 수 있다. 보다 작은 현탁 배양의 경우, 세포의 배양을 적어도 125 ㎖, 250 ㎖, 500 ㎖, 1 L, 1.5 L, 2 L, 2.5 L, 3 L, 5 L, 10 L, 또는 그 이상의 플라스크에서 수행할 수 있다.

일부 구현예에서, 현탁 배양의 세포 밀도는 0.25x 10⁶ 세포.㎖, 0.5x10⁶ 세포/㎖ 및 1.0x 10⁶ 세포/㎖, 1.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 2.0x 10⁶ 세포/㎖, 2.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 3.0x 10⁶ 세포/㎖, 3.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 4.0x 10⁶ 세포/㎖, 4.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 5.0x 10⁶ 세포/㎖, 5.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 6.0x 10⁶ 세포/㎖, 6.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 7.0x 10⁶ 세포/㎖, 7.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 8.0x 10⁶ 세포/㎖, 8.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 9.0 X 10⁶ 세포/㎖, 9.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 10x 10⁶ 세포/㎖, 10x 10⁶ 세포/㎖ 내지 15.0x X 10⁶ 세포/㎖, 15x X 10⁶ 세포/㎖ 내지 20x X 10⁶ 세포/㎖, 20x X 10⁶ 세포/㎖ 내지 25x10⁶ 세포/㎖, 25x 10⁶ 세포/㎖ 내지 30x 10⁶ 세포/㎖, 30 X 10⁶ 세포/㎖ 내지 35x 10⁶ 세포/㎖, 35x 10⁶ 세포/㎖ 내지 40x 10⁶ 세포/㎖, 40x 10⁶ 세포/㎖ 내지 45 x10⁶ 세포/㎖, 45x 10⁶ 세포/㎖ 내지 50x 10⁶ 세포/㎖, 50x 10⁶ 세포/㎖ 내지 55x 10⁶ 세포/㎖, 55x 10⁶ 세포/㎖ 내지 60x 10⁶ 세포/㎖, 60x 10⁶ 세포/㎖ 내지 65x 10⁶ 세포/㎖, 70x 10⁶ 세포/㎖ 내지 75x 10⁶ 세포/㎖, 75x 10⁶ 세포/㎖ 내지 80x 10⁶ 세포/㎖, 85x 10⁶ 세포/㎖ 내지 90x 10⁶ 세포/㎖, 90x 10⁶ 세포/㎖ 내지 95x 10⁶ 세포/㎖, 95x 10⁶ 세포/㎖ 내지 100x 10⁶ 세포/㎖, 100x 10⁶ 세포/㎖ 내지 125x 10⁶ 세포/㎖, 또는 125x 10⁶ 세포/㎖ 내지 150x 10⁶ 세포/㎖이다.

일부 구현예에서, 조류 섬유아세포를 스캐폴드 중에 포매하거나 스캐폴딩 물질에 부착된 채로 증식시킨다. 일부 구현예에서, 조류 섬유아세포를 생물반응기에서 및/또는 스캐폴드상에서 분화시키거나 증식시킨다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 미세담체, 오가노이드 및/또는 맥관화된 배양물, 자기-조립 공-배양물, 단층, 하이드로젤 스캐폴드, 세포제거된 조류 섬유아세포 및/또는 식용 기질 중 적어도 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 플라스틱 및/또는 유리 또는 다른 물질 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 천연(생물학적) 중합체 키틴, 알기네이트, 콘드로이친 설페이트, 카라기난, 젤란검, 히알루론산, 셀룰로스, 콜라겐, 젤라틴 및/또는 엘라스틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 개질된 단백질 또는 개질된 폴리펩티드를 포함한다. 개질되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드 또는 개질된 단백질 또는 폴리펩티드는 식물 또는 다른 유기체로부터 단리된 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 식물 단백질 단리물 또는 식물 단백질 농축물은 콩류 단백질, 갈퀴덩굴 단백질, 곡물 단백질, 견과류 단백질, 거대조류 단백질, 미세조류 단백질, 및 기타 식물 단백질을 포함한다. 콩류 단백질은 마른 콩, 렌틸콩, 녹두, 파바콩, 마른 완두콩, 병아리콩, 동완두, 밤바라콩, 비둘기 완두콩, 루핀, 갈퀴덩굴, 팥, 일반 콩, 호로파, 긴콩, 리마콩, 러너콩, 또는 테파리콩, 대두, 또는 무쿠나콩으로부터 수득될 수 있다. 갈퀴덩굴 단백질은 살갈퀴 속에서 수득할 수 있다. 곡물 단백질은 밀, 쌀, 테프, 귀리, 옥수수, 보리, 수수, 호밀, 기장, 삼백초, 아마란스, 메밀, 퀴노아 및 기타 곡물에서 수득할 수 있다. 견과류 단백질은 아몬드, 캐슈, 피칸, 땅콩, 호두, 마카다미아, 헤이즐넛, 피스타치오, 브라질콩, 밤, 콜라넛, 해바라기씨, 호박씨, 아마씨, 카카오, 잣, 은행 및 기타 견과류에서 얻을 수 있다. 동물성 원료에서 수득된 단백질을 또한 우유 단백질, 유청, 카제인, 계란 단백질 및 기타 동물성 단백질을 포함하여, 스캐폴드로서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 자가-조립 공-배양물은 회전 타원체 및/또는 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 단층은 세포외 기질이 있거나 없는 것이다. 일부 구현예에서, 하이드로젤 스캐폴드는 히알루론산, 알기네이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 식용 기질은 세포제거된 식물 조직을 포함한다.

일부 구현예에서, 1차 또는 2차 조류 섬유아세포는 선행 단락 중 어느 하나에서와 같이 변형되거나 증식된다.

세포의 회수

세포를 당업자에게 명백한 임의의 기법에 의해 회수할 수 있다. 일부 구현예에서 조류 섬유아세포를 증식 배지로부터 분리하거나 생물반응기 또는 스캐폴드로부터 제거한다. 몇몇 구현예에서, 조류 섬유아세포를 원심분리, 기계/필터 프레스, 여과, 응집 또는 응고 또는 중력 침전 또는 건조 또는 이들의 임의의 조합에 의해 분리한다. 몇몇 구현예에서, 여과 방법은 접선유동 여과, 진공 여과, 회전진공 여과 및 유사한 방법을 포함한다. 몇몇 구현예에서 건조를 플래시 건조, 침상 건조, 선반 건조 및/또는 유도층 건조 및 유사한 방법에 의해 수행할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 조류 섬유아세포를 효소적으로 분리한다. 몇몇 구현예에서, 조류 섬유아세포를 기계적으로 분류한다.

세포 안전성

일부 구현예에서, 조류 섬유아세포의 집단은 실질적으로 순수하다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 배양 단계에서 조류 섬유아세포가 실질적으로 순수한지의 여부를 측정하기 위해 시험을 실행한다.

일부 구현예에서, 조류 섬유아세포를 세균의 존재 또는 부재에 대해 시험한다. 몇몇 구현예에서, 시험된 세균의 유형은 비제한적으로 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 캄필로박터 제주니움(Campylobacter jejunim), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 페칼 스트렙토코커스(Fecal streptococcus), 마이코플라스마 게누스(Mycoplasma genus), 마이코플라스마 풀모니스(Mycoplasma pulmonis), 대장균(Coliform) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 포함한다.

일부 구현예에서, 세포 배지의 성분, 예를 들어 소 태아 혈청을 바이러스의 존재 또는 부재에 대해 시험한다. 몇몇 구현예에서, 바이러스는 비제한적으로 블루텅, 소 아데노바이러스, 소 파르보바이러스, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 광견병, 레오바이러스, 아데노 관련 바이러스, BK 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 1형, 단순 헤르페스 2형, 헤르페스 바이러스 6형, 헤르페스 바이러스 7형, 헤르페스 바이러스 8형, HIV1, HIV-2, HPV-16, HPV 18, 인간 거대 세포 바이러스, 인간 거품 바이러스, 인간 T-림프성 바이러스, 존 커닝햄 바이러스, 및 파르보바이러스 B19를 포함한다.

일부 구현예에서, 시험을 효모 및/또는 곰팡이의 존재 또는 부재에 대해서 수행한다.

일부 구현예에서, 시험은 질량 분광분석, 예를 들어 유도 결합된 플라스마 질량 분광분석(ICP-MS)에 의한 금속 농도에 대한 것이다. 몇몇 구현예에서, 시험된 금속은 비제한적으로 비소, 납, 수은, 카드뮴 및 크로뮴을 포함한다.

일부 구현예에서, 시험은 배양물 중에 생산된 호르몬에 대한 것이다. 몇몇 구현예에서, 호르몬은 비제한적으로 17β-에스트라디올, 테스토스테론, 프로제스테론, 제라놀, 멜렌제스테롤 아세테이트, 트렌볼론 아세테이트, 메제스트롤 아세테이트, 멜렌제스테롤 아세테이트, 클로르마디논 아세테이트, 다이엔에스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 헥세스트롤, 텔레라놀, 제아르알라논, 및 제라놀을 포함한다.

일부 구현예에서, 시험은 미국 식품의약국에서 자세히 설명한 바와 같은 현행의 양호한 제조 공정을 준수한다.

표현형, 공정 모니터링 및 데이터 분석

일부 구현예에서, 세포를 당업자에게 공지된 임의의 기법에 의해 모니터링한다. 일부 구현예에서, 분화를, RT-qPCR을 사용하여 전체 RNA 추출 후에 분화의 전사 마커를 사용하고 이어서 전사된 관심 유전자의 수준을 참조, 예를 들어 하우스키핑 유전자와 비교하여 측정 및/또는 확인한다.

식품 조성물

몇몇 구현예에서 본원은 조류 섬유아세포를 포함하는 식품 조성물 또는 식품을 제공한다. 일부 구현예에서, 조류 섬유아세포를 다른 물질 또는 성분과 합하여 조류 식품 조성물인 조성물을 제조한다. 몇몇 구현예에서, 섬유아세포를 단독으로 사용하여 조류 식품 조성물인 조성물을 제조한다. 몇몇 구현예에서, 조류 식품 조성물은 조류 너겟(nugget), 조류 텐더(tender), 조류 가슴살, 조류 굴, 조류 발, 조류 날개, 조류 소시지, 조류 공급원료 또는 조류 껍질과 유사한 제품이다. 몇몇 구현예에서, 조류 제품은 닭고기 제품과 유사하다.

일부 구현예에서, 회수된 조류 섬유아세포를 다른 성분과 함께 조성물로 제조한다. 몇몇 구현예에서, 조성물은 세포 페이스트, 녹두, 지방 및 수를 포함한다.

몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 중량 기준으로 적어도 100%, 90%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 50%, 40%, 30%, 35%, 25%, 15%, 10%, 5% 또는 1%의 습윤 세포 페이스트 함량을 갖는다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 중량 기준으로 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%- 50%, 60%-70%, 80%-90%, 또는 90%-100%의 습윤 세포 페이스트 함량을 갖는다. 몇몇 구현예에서, 조성물은 중량 기준으로 적어도 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 또는 15%의 콩류 단백질 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 중량 기준으로 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%- 50%, 60%-70%, 80%-90%, 또는 90%-95%의 콩류 단백질 함량을 갖는다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 중량 기준으로 적어도 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 중량 기준으로 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%- 50%, 60%-70%, 80%-90%, 또는 90%-95%의 지방 함량을 갖는다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 중량 기준으로 적어도 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 중량 기준으로 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%- 50%, 60%-70%, 80%-90%, 또는 90-95%의 수 함량을 갖는다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 2%-5%, 5%-10%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 50%-55%, 55%-60%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 또는 90%-95%의 습윤 세포 페이스트 함량을 포함한다.

일부 구현예에서, 조성물은 0.0001-0.0125%의 펩티드 가교결합 효소, 예를 들어 트랜스글루타미나제 함량을 포함한다.

몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 1 중량%의 건조 세포 중량 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 5 중량%의 건조 세포 중량 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 10 중량%의 건조 세포 중량 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 15 중량%의 건조 세포 중량 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 20 중량%의 건조 세포 중량 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 25 중량%의 건조 세포 중량 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 30 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 35 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 40 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 45 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 50 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 55 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 60 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 65 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 70 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 75 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 80 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 85 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 90 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 95 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 97 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 98 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 99 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 100 중량%의 건조 세포 중량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 2%-5%, 5%-10%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 50%-55%, 55%-60%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 또는 90%-95%의 건조 세포 중량 함량을 포함한다.

몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 중량 기준으로 적어도 2%, 5%, 10 %, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 콩류 단백질 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 2%-5%, 5%-10%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 50%-55%, 55%-60%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 또는 90%-95%의 콩류 단백질 함량을 포함한다. 일부 구현예에서, 콩류 단백질은 녹두 단백질이다.

몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 1 중량%의 지방 함량, 적어도 2 중량%의 지방 함량, 적어도 5 중량%의 지방 함량, 적어도 7.5 중량%의 지방 함량, 또는 적어도 10 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 15 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 20 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 25 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 27 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 30 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 35 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 40 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 45 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 50 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 55 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 60 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 65 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 70 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 75 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 80 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 85 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 90 중량%의 지방 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 1%-5%, 5%-10%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 45%-50%, 50%-55%, 55%-60%, 60%-65%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 또는 90%-95%의 지방 함량을 포함한다.

몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 5 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 10 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 15 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 20 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 25 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 30 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 35 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 40 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 45 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 50 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 55 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 60 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 65 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 70 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 75 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 80 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 85 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 적어도 90 중량%의 수 함량을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 95 중량%의 수 함량을 포함한다.

몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 25-75 중량%의 습윤 세포 페이스트 함량, 15 내지 45 중량%의 녹두 단백질 함량, 10-30 중량%의 지방 함량, 및 20 내지 50 중량%의 수 함량을 포함한다.

몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 펩티드 가교결합 효소를 포함한다. 예시적인 펩티드 가교결합 효소는 트랜스글루타미나제, 솔타제(sortase), 서브틸리신, 티로시나제, 락카제, 퍼옥시다제 및 라이실 옥시다제로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 몇몇 구현예에서, 조성물은 중량 기준으로 0.0001%-0.025%, 0.0001%-0.020%, 0.0001%-0.0175%, 0.0001%-0.0150%, 0.0001%-0.0125%, 0.0001%-0.01%, 0.0001%-0.0075%, 0.0001%-0.005%, 0.0001%-0.0025%, 0.0001%-0.002%, 0.0001%-0.0015%, 0.0001%-0.001%, 0.0001%-0.00015%의 가교결합 효소를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 중량 기준으로 0.0001%-0.025%, 0.0001%-0.020%, 0.0001%-0.0175%, 0.0001%-0.0150%, 0.0001%-0.0125%, 0.0001%-0.01%, 0.0001%-0.0075%, 0.0001%-0.005%, 0.0001%-0.0025%, 0.0001%-0.002%, 0.0001%-0.0015%, 0.0001%-0.001%, 0.0001%-0.00015%의 트랜스글루타미나제 함량을 포함한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 펩티드 가교결합 효소는 콩류 또는 갈퀴덩굴 단백질을 가교결합시키는 것으로 여겨지며 펩티드 가교결합 효소는 콩류 또는 갈퀴덩굴 단백질을 조류 세포에 가교결합시키는 것으로 여겨진다.

하나의 구현예에서, 식품 조성물 또는 식품은 0.0001% 내지 0.0125%의 트랜스글루타미나제를 포함하며, 상기 트랜스글루타미나제 부재하의 세포 페이스트에 비해 부피 기준으로 표현시 감소되거나 또는 현저하게 감소된 리폭시게나제 활성 또는 지질을 산화시키는 다른 효소 활성을 나타낸다. 보다 바람직하게, 식품 조성물 또는 식품은 리폭시게나제 또는 지질을 산화시킬 수 있는 효소가 본질적으로 없다. 일부 구현예에서, 조성물에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 산화적 효소 활성의 감소가 관찰된다. 리폭시게나제는 조성물에 바람직하지 못한 풍미를 부여하는 화합물의 형성에 원인이 되는 지질의 산화를 촉매화한다.

일부 구현예에서, 녹두 단백질을 병아리콩, 파바콩, 노란 완두콩, 현미, 호밀, 황금 렌틸콩, 차나달, 대두, 팥, 수수, 싹튼 녹색 렌틸콩, 두풍식 렌틸콩, 및/또는 흰색 리마콩으로부터의 단백질을 포함하는 식물계 단백질로 교체한다.

일부 구현예에서, 추가적인 식용 성분의 첨가를 사용하여 식품의 식품 조성물을 제조할 수 있다. 식용 식품 성분은 전분, 개질된 전분, 검 및 다른 하이드로콜로이드와 같은 질감 개질 성분을 포함한다. 다른 식품 성분은 pH 조절제, 고화방지제, 착색제, 유화제, 풍미제, 풍미 향상제, 발포제, 소포제, 습윤제, 감미제 및 다른 식용 성분을 포함한다.

몇몇 구현예에서, 방법 및 식품 조성물 또는 식품은 식품 조합과 함께 유효량의 첨가된 보존제를 포함한다.

보존제는 세균, 곰팡이, 진균 또는 효모로부터 식품 부패를 방지하고(항균); 색상, 풍미 또는 질감의 변화를 늦추거나 방지하고 산패를 지연시키며(산화방지); 신선함을 유지한다. 몇몇 구현예에서, 보존제는 하기 중 하나 이상이다: 아스코르브산, 시트르산, 나트륨 벤조에이트, 칼슘 프로피오네이트, 나트륨 에리쏘르베이트, 나트륨 나이트라이트, 칼슘 소르베이트, 칼륨 소르베이트, BHA, BHT, EDTA, 토코페롤(비타민 E), 및 지방 및 오일 및 이를 함유하는 식품이 산패되거나 이취를 발생시키는 것을 방지하는 산화방지제.

식품 가공

일부 구현예에서, 본원은 콩류 단백질, 세포 페이스트 및 포스페이트를 수에 합하고 상기 혼합물을 3 단계로 가열함을 포함하는 조류 식품의 제조 공정을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 공정은 포스페이트를 수에 첨가하여 상기 수를 컨디셔닝하여 컨디셔닝된 수를 제조함을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 콩류 단백질을 수화시켜 수화된 식물 단백질을 제조하기 위해 콩류 단백질을 컨디셔닝된 수에 첨가한다. 일부 구현예에서, 세포 페이스트를 수화된 식물 단백질(식물 단백질이 첨가된 컨디셔닝된 수)에 첨가하여 세포 단백질 혼합물을 생산한다. 일부 구현예에서, 식물 단백질은 콩류 단백질이다. 일부 구현예에서, 콩류 단백질은 녹두 단백질이다.

일부 구현예에서, 포스페이트는 이나트륨 포스페이트(DSP), 나트륨 헥사메타포스페이트(SHMP), 사나트륨 피로포스페이트(TSPP)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 하나의 특정한 구현예에서, 수에 첨가되는 포스페이트는 DSP이다. 일부 구현예에서, 수에 첨가되는 DSP의 양은 적어도 또는 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.11%, 0.12%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 또는 0.15% 초과이다.

일부 구현예에서, 공정은 3개의 가열 단계를 겪는다. 일부 구현예에서, 제1 가열 단계는 세포 및 단백질 혼합물을 40-65℃의 온도로 가열함을 포함하며, 여기에서 시즈닝을 첨가한다. 일부 구현예에서, 제2 단계는 세포 및 단백질 혼합물을 적어도 10분간 40-65℃의 온도에서 유지시킴을 포함하며, 여기에서 펩티드 가교결합 효소, 예를 들어 트랜스글루타미나제를 첨가한다. 일부 구현예에서, 제3 가열 단계는 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 60-85℃의 온도로 상승시킴을 포함하며, 이때 수에 오일을 첨가한다. 일부 구현예에서, 공정은 상기 온도를 5-15℃로 낮추어 사전-조리 제품을 제조하는 제4의 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 시즈닝을 제1 단계, 제2 단계, 제3 단계 또는 제4 단계에 첨가한다. 일부 구현예에서, 시즈닝은 비제한적으로 소금, 설탕, 파프리카, 양파 분말, 마늘 분말, 흑후추, 백후추, 및 천연 닭고기 향(비건)을 포함한다.

일부 구현예에서, 오일(지방)을 제1 단계, 제2 단계, 제3 단계 또는 제4 단계에 첨가하여 사전-조리 제품을 제조한다. 오일은 식물성 오일, 땅콩 오일, 카놀라 오일, 코코넛 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일, 대두 오일, 해바라기 오일, 마가린, 식물성 쇼트닝, 동물성 오일, 버터, 수지, 라드, 마가린 또는 식용 오일을 포함하는 그룹 중에서 선택된다.

일부 구현예에서, 사전-조리 제품을 추가적인 준비나 조리 없이 소비하거나, 또는 사전-조리 세품을 주지된 조리 기법을 사용하여 추가로 조리할 수 있다.

일부 구현예에서, 공정은 조류 식품을 조리 금형에 놓아 준비함을 포함한다. 일부 구현예에서, 공정은 조리 금형에 진공을 적용시켜 조류 식품의 밀도 및 질감을 유효하게 변화시킴을 포함한다.

일부 구현예에서, 조류 식품에 빵가루를 입힌다.

일부 구현예에서, 조류 식품을 찌거나, 끓이거나, 지지거나, 튀기거나, 굽거나, 그릴링(grilling)하거나, 브로일링하거나, 전자레인지에 돌리거나, 탈수하거나, 수비드 조리하거나, 압력 조리하거나 또는 냉동시키거나 또는 이들의 임의의 조합으로 조리한다.

식물 단백질 단리

본원은 미국 공보 WO2013/067453, US 2017/0238590 A1, WO2017/143298, WO2017/143301, 및 US 62/981,890의 식물 단백질 농축물의 제조를 위한 식물 단백질의 가공 방법 및/또는 식물 단백질 농축물을 전체적으로 참조하거나 인용한다.

본원은 광범위한 식품 적용을 위한 고도의 기능성을 갖는 식물 단백질 단리물 또는 식물 단백질 농축물의 생산 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단리물의 생산 방법은 하기 중에서 선택된 하나 이상의 단계를 포함한다:

(a) 수용액 중의 식물 단백질 공급원으로부터 하나 이상의 식물 단백질을 추출한다. 일부 구현예에서, 추출을 약 5.0-10.0의 pH에서 수행한다.

(b) 상기 추출물로부터 단백질을 하기 2개의 방법 중 적어도 하나를 사용하여 정제한다:

(i) 상기 추출물로부터 단백질을 글로불린-풍부 분획의 등전점 부근의 pH, 예를 들어 약 5.0-6.0의 pH에서 침전시키고; 및/또는

(ii) 미세여과, 한외여과 또는 크로마토그래피와 같은 여과 방법을 사용하여 상기 추출물로부터 단백질을 분별하고 농축시킨다.

(c) 정제된 단백질 단리물을 회수한다.

특정한 구현예에서, 식물 단백질 단리물은 일련의 기계적 공정을 사용하여 생산되며, 이때 사용되는 유일한 화학물질은 pH 조절제, 예를 들어 수산화 나트륨 및 시트르산이며, 임의로 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 가하여 상기 단리물의 풍미에 영향을 미치는 지질 산화 활성을 방지한다.

본원에서 제공되는 식물 단백질 또는 식물 단백질 농축물을 임의의 적합한 식물 단백질 공급원으로부터 제조할 수 있지만, 출발 물질이 전체 식물 물질, 예를 들어 전체 녹두, 전체 팥, 완두콩 또는 다른 식물 물질인 경우, 본원에서 제공되는 방법의 제1 단계는 전형적으로 원료 공급원 물질을 탈부함(dehulling)을 포함한다. 일부 상기와 같은 구현예에서, 원료 콩을 종자 코트(껍질) 및 과피(겨)를 제거하기 위해 구멍을 뚫고, 액침하고 건조시키는 하나 이상의 단계로 탈부한다. 이어서 상기 탈부된 녹두를 분쇄하여 잘 한정된 입자 분포 크기를 갖는 가루를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 상기 평균 입자 분포 크기는 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 또는 100 ㎛이다. 특정한 구현예에서, 상기 입자 분포 크기는 추출 단계 동안 단백질의 비율 및 수율을 증가시키기 위해 300 ㎛ 미만이다. 사용되는 분쇄기의 유형은 비제한적으로 해머, 핀, 나이프, 버, 및 공기 분류 분쇄기 중 하나 또는 이들의 조합을 포함한다.

가능한 경우, 생산된 가루의 공기 분류는 단백질 추출 공정을 촉진하고 공정 전체의 효율성을 향상시킬 수 있다. 사용된 방법은 공기 분류 분쇄기와 같은 미세 분쇄 분쇄기 사용하여 콩이 전형적으로 45 ㎛ 미만의 입자 크기로 분쇄되도록 하는 것이다. 생산된 가루를 공기 분류기를 통과시켜 굵은 부분과 미세한 부분으로 분리한다. 가루를 공기 분류기를 통해 통과시키는 행위는 가루 중의 사용 가능한 단백질의 대부분을 가루의 전체 질량 중 더 작은 부분으로 농축시키기 위한 것이다. 전형적인 미세 분획(고-단백질) 수율은 5-50%이다. 미세 분획은 입자 크기가 20 ㎛ 미만인 경향이 있으나; 이는 원두의 재배 시기와 지역에 따라 영향을 받을 수 있다. 고-단백질 분획은 전형적으로 원래 샘플 중 단백질의 150-220%를 차지한다. 결과적으로 생산된 전분-풍부 부산물 스트림은 또한 가치가 가중되고, 실행 가능하며, 또한 판매 가능한 관심 대상이 된다.

바람직한 구현예에서, 식물 단백질 단리물 또는 식물 단백질 농축물의 정제 방법은 추출 단계를 포함한다. 추출 단계의 일부 구현예에서, 중간 출발 물질, 예를 들어 콩가루를 수용액과 혼합하여 슬러리를 형성시킨다. 일부 구현예에서, 수용액은 수, 예를 들어 연수이다. 수성 추출은 1 부의 식물 단백질의 공급원(예를 들어 가루) 대 약 2 내지 15부의 수성 추출 용액을 포함하는 수용액을 만드는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 1부의 식물 단백질 공급원당 5 내지 10 부피의 수성 추출 용액을 사용한다. 수성 추출 용액 대 가루의 추가로 유용한 비는 1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1 또는 대안으로 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15를 포함한다.

바람직하게, 수성 추출을 목적하는 온도, 예를 들어 약 2-50℃에서, 냉각된 혼합 탱크에서 수행하여 슬러리를 형성시킨다. 일부 구현예에서, 혼합을 보통 내지 높은 전단하에서 수행한다. 일부 구현예에서, 식품 등급의 소포제(예를 들어 KFO 402 폴리글리콜)를 슬러리에 가하여 혼합 공정 동안 발포를 감소시킨다. 다른 구현예에서, 소포제를 추출 중에 사용하지 않는다.

일부 구현예에서, 여러 단계의 순차적인 추출을 수행하여 추출을 개선시킨다.

일부 구현예에서, 순차적인 추출을 배치 모드로 또는 연속 모드로 수행한다.

일부 구현예에서, 순차적인 추출을 동류 또는 역류 모드로 수행한다.

슬러리의 pH를, 표적 단백질의 수용액으로의 용해를 위해 목적하는 pH에 도달하도록 식품 등급의 50% 수산화 나트륨 용액으로 조절한다. 일부 구현예에서, 추출을 약 5-10.0의 pH에서 수행한다. 다른 구현예에서, 추출을 중성 또는 중성 부근의 pH에서 수행한다. 일부 구현예에서, 추출을 약 pH 5.0-pH 9, pH 6.0-pH 8.5 또는 보다 바람직하게는 pH 6.5-pH 8의 pH에서 수행한다. 특정한 구현예에서, 추출을 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 10.0의 pH에서 수행한다. 특정한 구현예에서, 추출을 약 7.0의 pH에서 수행한다.

추출에 이어서, 용해된 단백질 추출물을, 예를 들어 경사분리기 및 디스크-스택 원심분리기로 이루어진 고체/액체 분리 유닛에서 슬러리로부터 분리시킨다. 추출물을 저온, 바람직하게는 3-10℃에서 원심분리시킨다. 추출물을 수집하고, 펠릿을, 바람직하게는 3:1의 수 대 가루로 재현탁시킨다. pH를 다시 조절하고 원심분리시킨다. 두 추출물을 합하고 나일론 메쉬를 사용하여 여과한다.

임의로, 단백질 추출물에 탄소 흡착 단계를 가하여 비-단백질, 이취 성분, 및 추가적인 섬유성 고체를 단백질 추출로부터 제거한다. 상기 탄소 흡착 단계는 등명화된 단백질 추출물로 이어진다. 이어서 탄소 흡착 단계의 하나의 구현예에서, 단백질 추출물을 4 내지 8℃에서 식품 등급 과립 목탄-충전된 환상 바스켓 컬럼(<5% w/w의 목탄 대 단백질 추출물 비)으로 보낸다.

일부 구현예에서, 추출 및 임의로 탄소 흡착에 이어서, 등명화된 단백질 추출물을 냉각된 조건(예를 들어 2 내지 8℃)하에서 식품-안전 산성 용액으로 산성화하여 그의 등전점에 도달하게 한다. 이러한 조건하에서, 표적 단백질이 침전하며 수용액으로부터 분리가능하게 된다. 일부 구현예에서, 수용액의 pH를 대략적으로, 단백질-풍부 분획 중의 하나 이상의 글로불린-유형 단백질 중 적어도 하나, 예를 들어 녹두 8S/베타 콩글리시닌의 등전점으로 조절한다. 일부 구현예에서, pH를 조절 단계에 앞서 약 5.0-10.0의 초기 pH를 갖는 단백질 추출물을 포함하는 수용액으로부터 조절한다. 일부 구현예에서, pH를 약 5.0 내지 6.5로 조절한다. 일부 구현예에서, pH를 약 5.2-6.5, 5.3 내지 6.5, 5.4 내지 6.5, 5.5 내지 6.5, 또는 5.6 내지 6.5로 조절한다. 일부 구현예에서, pH를 약 5.2-6.0, 5.3 내지 6.0, 5.4 내지 6.0, 5.5 내지 6.0, 또는 5.6 내지 6.0으로 조절한다. 몇몇 구현에에서, pH를 약 5.4-5.8로 조절한다. 일부 구현예에서, pH를 약 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 또는 6.2로 조절한다.

본원에 제공된 방법의 바람직한 구현예에서, 녹두 단백질 정제를 위해, pH를 약 pH 5.6 내지 pH 6.0의 범위로 조절하고 목적하는 녹두 단백질의 침전을 달성한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 약 pH 5.6 내지 pH 6.0 범위의 등전점 침전은 단백질 수율, 단백질 순도, 소분자 중량 비-단백질 종(모노 및 디사카라이드 포함)의 감소된 체류, 오일 및 지질의 감소된 체류, 구조 구성 성질, 예를 들어 높은 젤 강도 및 젤 탄성, 우수한 감각 성질, 및 고도로 기능성인 8S 글로불린/베타 콩글리시닌 단백질의 선택적인 농축 중에서 선택된 하나 이상의 품질에 관하여, 우수한 녹두 단백질 단리물을 생성하는 것으로 여겨진다. 이러한 본원에 제공된 방법에 의해 제조된 녹두 단백질 단리물 또는 녹두 단백질 농축물의 뜻밖의 우수한 특징은 예를 들어 미국 공보 US 2017/0238590 A1의 실시예 6 및 8에 기재되어 있다. US 2017/0238590 A1의 실시예 6에 기재된 결과에 의해 입증되는 바와 같이, 약 pH 5.6 내지 pH 6.0의 pH 범위에서 산 침전을 겪은 녹두 단백질 단리물은 pH 5.6 미만의 pH에서 산 침전을 겪은 녹두 단백질 단리물에 비해, 단백질 회수(소분자의 회수와 비교하여), 젤화 개시 온도, 젤 강도, 젤 탄성, 및 감각 성질에 관하여 우수한 품질을 나타내었다. 약 pH 5.2 내지 pH 5.8의 pH 범위에서 산 침전을 겪은 녹두 단백질 단리물은 또한 상기 범위 밖의 산 침전을 겪은 녹두 단백질 단리물에 비해 실질적으로 더 낮은 지질 체류를 나타내었다.

단백질 침전을 유도하기에 적합한 식품 등급 산은 비제한적으로 말산, 락트산, 염산, 및 시트르산을 포함한다. 특정한 구현예에서, 침전을 20%의 식품 등급 시트르산 용액으로 수행한다. 다른 구현예에서, 침전을 40%의 식품 등급 시트르산 용액으로 수행한다.

일부 구현예에서, pH 조절 외에, EDTA, 예를 들어 2 mM의 식품 등급 EDTA를, 이취 화합물을 생산하는 지질 산화를 억제하기 위해 침전 용액에 가한다.

대안의 구현예에서, 침전 단계는 극저온-침전(1-4℃에서)과 함께 pH 5.6에서의 등전점 침전을 포함하며, 여기에서 pH를 5.4-5.8로 조절한다.

또 다른 대안의 구현예에서, 높은 유량의 낮은 이온 강도 침전을 극저온 침전(1-4℃에서)과 병행한다. 일부 상기와 같은 구현예에서, 여액의 빠른 희석을, 1 부피의 상등액 대 3 부피의 저온 0.3% NaCl의 비로 저온(1-4℃) 0.3% NaCl 중에서 수행한다. 추가적인 재현탁 및 균질화 단계는 목적하는 단백질 단리물의 생산을 보장한다.

이어서 일부 구현예에서, 침전된 단백질 슬러리를 pH-조절된 수용액으로부터 제거하여 고체/액체 분리 유닛(예를 들어 하나의 디스크-스택 원심분리기)으로 보낸다. 방법의 일부 구현예에서, 분리는 0.3%(w/w)의 식품 등급 염화 나트륨의 첨가로 발생하며, 무거운 상에서 단백질 커드가 회수된다. 바람직한 구현예에서, 단백질 커드를 4 부피의 연수로 냉각된 조건(2 내지 8℃)하에서 세척하여, 최종의 잔류 불순물, 예를 들어 섬유성 고체, 염 및 탄수화물을 제거한다.

방법의 일부 구현예에서, 여과를 대안으로서 또는 산 침전 외에 사용한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 단백질의 산 침전으로 소분자의 제거를 돕는 반면, 대안의 방법, 예를 들어 한외여과(UF)를 사용하여 침전/단백질 응집 사건을 피하는 것으로 여겨진다. 따라서, 일부 구현예에서, 녹두 단백질 단리물 또는 녹두 단백질 농축물을 수득하기 위해 단백질-풍부 분획을 정제하는 것은 적어도 하나의 선택성 멤브레인을 사용하는 여과, 미세여과 또는 한외여과 과정을 수행함을 포함한다.

한외여과 공정은 체류물 분획(멤브레인을 통과하지 않는 물질 함유)을 투과물 분획(멤브레인을 통과하는 물질 함유)으로부터 분리시키는 적어도 하나의 반-투과성 선택성 멤브레인을 사용한다. 반-투과성 멤브레인은 분자 크기에 기반하여 물질(예를 들어 단백질 및 다른 성분)을 분리시킨다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 한외여과 공정에 사용되는 반-투과성 멤브레인은 10 kDa 이상의 분자 크기를 갖는 분자를 제외시킬 수 있다(즉 이들 분자는 체류물 분획 중에 남아있는다). 일부 구현예에서, 반-투과성 멤브레인은 25 kDa 이상의 분자 크기를 갖는 분자(예를 들어 콩류 단백질)를 제외시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 반-투과성 멤브레인은 50 kDa 이상의 분자 크기를 갖는 분자를 제외시킨다. 다양한 구현예에서, 본원에 논의된 방법의 한외여과 공정에 사용되는 반-투과성 멤브레인은 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa, 35 kDa, 40, kDa, 45 kDa, 50 kDa, 55 kDa, 60 kDa, 65 kDa, 70 kDa, 75 kDa, 80 kDa, 85 kDa, 90 kDa, 또는 95 kDa 초과의 분자 크기를 갖는 분자(예를 들어 콩류 단백질)를 제외시킨다. 예를 들어, 10 kDa 멤브레인은 10 kDa 미만 크기의 콩류 단백질을 포함한 분자가 상기 멤브레인을 통해 투과물 분획으로 통과하도록 하는 반면, 10 kD 이상의 콩류 단백질을 포함하는 분자는 체류물 분획 중에 남아있는다.

일부 구현예에서, 산 침전 및 분리로부터 생성되는 세척된 단백질 커드 용액을 고온/단시간 저온살균 단계에서 저온살균하여 용액 중에 존재하는 임의의 병원성 세균을 사멸시킨다. 특정한 구현예에서, 저온살균을 74℃에서 20 내지 23초간 수행한다. 건조한 단리물을 목적으로 하는 특정한 구현예에서, 저온살균된 용액을 분무 건조기에 통과시켜 임의의 잔류 수 함량을 제거한다. 전형적인 분무 건조 조건은 170℃의 유입 온도, 및 70℃의 유출 온도를 포함한다. 최종의 건조된 단백질 단리물 분말은 전형적으로 5% 미만의 수분 함량을 갖는다. 본원에 기재된 방법의 일부 구현에에서, 저온살균을 생략하여, 단백질 단리물의 보다 넓은 기능성을 유지시킨다.

본원에 개시된 발명의 구현예를 추가로 예시하기 위해 하기의 비제한적인 방법을 제공한다. 당업자는 하기의 실시예에 개시된 기법이, 본 발명의 다수의 구현예의 실시에서 잘 기능하는 것으로 밝혀졌고 따라서 그의 실시 방식의 실시예를 구성하는 것으로 간주됨을 알아야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어, 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 개시된 특정한 구현예에서 다수의 변화를 수행하여, 동일하거나 유사한 결과를 여전히 획득할 수 있음을 알아야 한다.

실시예

실시예 1: 세포 배양

세포는 1996년 10월 11일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재)에 기탁된, 상업적으로 입수할 수 있는 닭 세포주 UMNSAH/DF1(C1F는 상기 세포의 출원인의 내부 명칭이다)으로부터 유래된 딸 세포주이다.

배지 제형은 FBS 또는 BCS(송아지 태아 혈청)가 보충된, 아미노산, 비타민, 무기염 및 다른 성분을 포함하는 기본 배지(DMEM/F12)이다.

마스터 작업 세포 은행(MCWB)의 생성

세포의 단일 바이알을 C1F 마스터 세포 은행(MCB)으로부터 회수하여 C1F MWCB를 확립시켰다. 간단히, C1F MCB 극저온 바이알을 액체 질소 보관으로부터 제거하여 37℃ 수욕에 즉시 넣었다. 바이알을 서서히 저어 세포 현탁액을 급속히 해동시켰다. C1F 세포 현탁액을 층류 후드에서 10 ㎖의 예온된 배양 배지를 함유하는 15 ㎖ 원추 튜브로 점차적으로 옮겼다. 생성된 희석된 C1F 세포 현탁액을 300xg에서 5분간 원심분리시켰다. 상등액을 세포 펠릿을 방해하지 않고 무균 흡출하였다. C1F 세포를 배양 배지에 서서히 재현탁하고 50 ㎖의 최종 작업 부피를 갖는 250 ㎖ 회전 배양 플라스크로 옮겼다. 해동-후 세포 밀도 및 생육력을 측정하여 C1F 건강 및 확립된 MCB의 품질 조절에 대해 모니터링하였다.

C1F 세포를 총 9일간 125 rpm에서 교반하에 배양하고 4 단계로 규모 확대하였다. 첫 번째, 세포를 5% CO₂를 갖는 가습 배양기에서 37℃에서 2일간 배양하였다. 이어서 배양물을 300xg에서 5분간 원심분리시켰다. 배양 상등액을 경사분리하고 C1F 세포 펠릿을 신선한 배지에 재현탁하고 500 ㎖ 진탕 플라스크에서 130 ㎖의 최종 부피로 시딩하였다. 두 번째, C1F 세포를 5% CO₂를 갖는 가습 배양기에서 37℃에서 추가로 2일간 125 rpm에서 교반하에 배양하였다. 이어서 배양물을 300xg에서 5분간 다시 원심분리하고; 세포 펠릿을 1 L 진탕 플라스크에서 신선한 배지에 340 ㎖의 최종 부피의 배지로 재현탁하였다. 최종적으로, 2일 배양 후에, 세포 배양물을 수집하고 300xg에서 5분간 원심분리시키고; C1F 세포 펠릿을 2 L 진탕 플라스크에서 880 ㎖의 최종 작업 부피를 위해 신선한 배지에 재현탁하였다. C1F 세포를 동일한 조건하에서 2일간 배양하고, 300xg에서 5분간 원심분리시키고; 세포 펠릿을 5 L 진탕 플라스크에서 신선한 배지에 2.3 L의 최종 부피로 재현탁하였다. C1F 세포 배양물을 5% CO₂를 갖는 가습 배양기에서 교반하에 추가로 1일간 두었다가 MWCB의 생성을 위해 수확하였다.

최종 확대 배양물 중의 C1F 세포를 수집하고 5분간 300xg에서 원심분리시켰다. 세포를 보다 낮은 부피의 배양 배지에 재현탁하고 농축된 C1F 세포를 샘플링하고 반-자동 세포 카운팅 시스템(Vi-Cell)을 사용하여 카운트하였다. C1F 세포에 300xg에서 5분간 또 다른 원심분리를 진행하고 이를 20 내지 25x10⁶ 세포/㎖ 범위로 극저온보존 배지(10% DMSO가 있는)에 재현탁시켰다. 세포를 이소프로판올 챔버에서 16 내지 24-시간의 기간 동안 4℃에서부터 -80℃까지 -1℃/분의 속도로 바-코딩된 극저온바이알에서 동결시켰다. 이어서 세포를 기상 액체 질소 보관 시스템(Taylor Wharton(<-175 ℃))으로 옮겨 보관하였다. 바이알 내용물 및 은행 보관 위치는 통제된 데이터베이스에 기록되었다.

세포 은행 방출 시험 및 배양육 생산에 적합한 바이알(들)이 MWCB로부터 회수되는 것을 보장하기 위해 CGMP 보관 연쇄 문서(바이알 식별 확인)를 사용하였다.

실시예 2: 배양된 닭고기 생산

예시적인 제조 공정에서 시드 확대 및 세포 생육을 위해 단일-사용 일회용 시스템이 사용된다. 배양 배지와의 접촉 시간이 긴 처리 시스템에는 쉐이크 플라스크, 웨이브 백, 배지 보관 백, 및 대규모 500 L 생물 반응기용 교반 탱크 생물 반응기 백이 포함된다. 도 1은 조류 섬유아세포를 세포 배양하기 위한 공정 흐름도를 묘사한다. 도 2는 세포를 수확하기 위한 공정 흐름도를 묘사한다.

시드 확대를, MWCB로부터의 세포의 바이알을 해동함으로써 시작하고 100 ㎖의 작업 부피를 갖는 500 ㎖ 진탕 플라스크에서 배양한다. 5% FBS를 갖는 DMEM/F12를 시드 확대에 사용한다. 이어서 배양액을 1:3 내지 1:6으로 분할하고 작업 부피가 300 ㎖인 1 L 진탕 플라스크에 시딩한다.

대형 진탕 플라스크에서 C1F 세포의 규모 확대 배양을 3 L 플라스크에서 900 ㎖까지 1:3 내지 1:6 분할 비로 진행한 다음 900 ㎖ 배양물을 5 L 플라스크에서 2.7 L로 분할하였다. 최종적으로, 5 L 플라스크 중의 2.7 L 배양물을 웨이브 백으로의 전달을 위해 1:3 분할 비를 사용하여 3개의 2.7 L 플라스크로 추가 분할한다.

웨이브 백에서 세포 배양

3개의 5 L 진탕 플라스크의 배양물(2.7 L 배양물)을 사용하여 무균 조건하에서 상기 진탕 플라스크 배양에 대해 앞서 나타낸 1:3 분할 비(8.1 L의 세포 현탁액 + 15.9 L의 신선한 배지)에 따라 웨이브 백(25 L의 최대 작업 부피로 총 50 L의 부피)에 접종한다. 저 혈청 함유 배지(DMEM/F12 + 1.25% FBS)를 생산 시스템(웨이브 백 또는 500 L 생물반응기)에서 세포 증식에 사용한다. 5% 혈청이 500 L 생물반응기에 대한 시드로서 사용되는 경우 이를 웨이브 백에서의 세포 증식에 사용한다.

웨이브 백 중의 C1F 배양물을 생산을 위해 수확하거나 또는 500 L 생물반응기 접종에 사용한다.

500 L 생물반응기에서 배양

웨이브 백(25 L)의 내용물을 100 L의 초기 배양 배지(총 125 L 부피에 대해 1:3 내지 1:6 분할 비)가 있는 대규모 생물반응기(500 L의 최대 작업 부피로 총 700 L 부피)로 무균적으로 옮긴다.

3일(+/- 0.5일) 배양 후에, 배지 부피를 375 L의 새로운 배양 배지를 가하여 500 L로 증가시키고 추가로 3일(+/- 0.5일)간 계속한다. 배양물을 규칙적으로 샘플링하여 세포수 및 생육력을 측정한다. 생물반응기 배양물을 pH, 락테이트, 글루코스, 글루타민 및 글루타메이트 수준에 대해 오프-라인으로 모니터링한다.

농축 및 회수

세포 배양 브로쓰를 수직축 통과 경사분리 원심분리기를 사용하여 농축시킨다(25-100배). 세포 분리 방법은 원심분리, 여과, 응집 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 원심분리기의 속도는 0.4-1.2 분^-1의 볼 크기당 유량으로 500-1000 rcf이다. 농축된 세포 배양 슬러리를 수집하고 다음의 세척 공정 단계로 이동시킨다.

세포 세척

원심분리 후 세포 펠릿을 효율적으로 세척함으로써 배양육 내의 배지 성분의 캐리오버를 완화시킨다. 구체적으로, 세포 배양 종료 시 소모된 배지의 원심분리 후에 수득된 세포 펠렛을 5배(w/v)의 0.45% NaCl 용액을 사용하는 재현탁 및 원심분리 과정을 통해 순차적으로 2회 세척한다. 세척에 의해, 배양육 중의 배지 성분 캐리오버의 유효 감소는 적어도 25배이다. 글루코스, 글루타민 및 나트륨을 제외하고, 배지 성분의 캐리오버는 세척 종료 시에 25배 희석을 기준으로 10ppm 미만으로 매우 낮은 것으로 실험적으로 추정된다. 글루코스 및 글루타민은 세포 배양 동안 탄소/질소 공급원으로 소비된다.

세척 효율을, 두 번째 세척액 중의 플루로닉 F-68의 유지된 양을 측정함으로써 추적한다. 증식 배지 중의 플루로닉 F-68의 초기 농도는 0.1% w/v(1000 ㎎/L)이다. 두 번째 세척액 중의 플루로닉 F-68 농도는 검출할 수 없었으며(<<0.01% w/v), 이는 다른 용해성 배지 성분의 제거에서 세척의 효율을 입증한다.

세척액 중의 알부민을, 소 혈청 알부민에 대해 높은 감도 및 특이성을 갖는 소 알부민 ELISA 키트(Lifespan Bioscience)를 사용하여 검출하고 정량분석한다. 최종 세척액에서, 알부민 농도는 10 ㎎/L 미만인 것으로 측정되었으며 이는 0-100 ppm(㎎/L)의 범위에 있을 수 있다.

세척된 세포(배양된 닭고기)를 최종 제품 제형에 사용하기에 앞서 -20℃ 이하에서 밀봉된 식품-안전 용기에서 보관한다.

실시예 3: 세균 및 바이러스에 대한 세포의 안전성 시험

세포의 안전성 및 효능을 세포의 모든 증식 및 수확 단계에서 검사한다. 배양된 C1F 세포를 바이러스, 효모 및 세균 부정 인자(adventitious agent)의 존재에 대해 평가한다.

닭고기 제품을 FDA의 세균학적 분석 매뉴얼(BAM)의 프로토콜을 사용하여 세균의 존재에 대해 분석한다.

총 플레이트 카운트(TPC)는 호기성 플레이트 카운트(APC)와 동의어이다. 미국 FDA의 세균학적 분석 매뉴얼(BAM) 3장에 명시된 바와 같이 이 분석은 제품의 미생물 수준을 나타내기 위한 것이다. 간단히 말해서, 이 방법은 샘플의 적절한 십진법 희석 및 아가 플레이트의 비선택적 배지상의 도말을 수반한다. 약 48시간 동안 배양 후에 콜로니 형성 단위(CFU)를 계산하고 총 플레이트 수로 보고한다.

효모 및 곰팡이를 미국 FDA 세균학적 분석 매뉴얼(BAM), 18장에 요약된 방법론에 따라 분석한다. 간략하게 설명하면, 이 방법은 0.1% 펩톤 수에서 샘플을 연속적으로 희석하고, 미생물 증식을 억제하지만 효모 및 곰팡이 계수를 용이하게 하는 항생제와 함께 영양소를 함유하는 페트리 플레이트에 분배하는 것을 수반한다. 플레이트를 25℃에서 배양하고 5일 후에 카운팅한다. 대안으로, 0.1% 펩톤 수에서 샘플을 10배 연속 희석하고 효모 및 곰팡이 계수를 용이하게 하는 항생제와 함께 영양소를 포함하는 페트리필름(Petrifilm)상에 1 ㎖을 분배하여 분석한다. 페트리필름을 25 또는 28℃에서 48시간 동안 배양하고 결과를 CFU로서 보고한다.

에스케리키아 콜라이 및 대장균을 미국 FDA 세균학적 분석 매뉴얼(BAM), 4장에 개략된 방법론에 따라 분석한다. 이 방법은 라우릴 설페이트 트립톤 브로쓰에서 연속해서 십진법 희석하고 35℃에서 배양하고 기체 형성을 확인함을 수반한다. 다음 단계는 기체 주입 튜브(3 ㎜ 루프 사용)에서 BGLB 브로쓰로 옮기고 35℃에서 48±2시간 동안 배양하는 것을 수반한다. 결과를 MPN(가장 있음직한 수) 대장균/g으로 보고한다.

스트렙토코커스를 BAM의 9장에 기재된 바와 같은 CMMEF 방법을 사용하여 분석한다. 분석 원리는 스트렙토코커스에 의한 산 형성의 검출에 기반하며 보라색에서 노란색으로의 색상 변화에 의해 지시된다. KF 스트렙토코커스 아가 배지를 선택적인 단리 및 계수를 위해 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)와 함께 사용한다. 배양 반응을 35+/-2℃에서 46-48시간 동안 호기적으로 배양한 후에 CFU로서 기록한다.

살모넬라를 미국 FDA 세균학적 분석 매뉴얼(BAM), 5장에 개략된 방법에 따라 분석한다. 간단히, 분석물을 살모넬라의 단리를 위해 제조하고 이어서 선택적인 농축 배지로 옮겨 단리하고, 비스무스 설파이트(BS) 아가, 자일로스 리신 데옥시콜레이트(XLD) 아가, 및 Hektoen 장(HE) 아가상에 도말한다. 이 단계를 RV 배지상으로의 전달과 함께 반복한다. 플레이트를 35℃에서 24+/-2시간 동안 배양하고 살모넬라일 수 있는 콜로니의 존재에 대해 검사한다. 추정상 살모넬라를, 사용되는 시험/기질 및 생성된 결과에 따라 살모넬라의 생화학적 및 혈청학적 반응을 관찰하는 다양한 방법을 통해 추가로 시험한다. 25 L 웨이브 백에서 생산된 소량의 육류로 인해 단지 5 그램만이 살모넬라에 대해서 시험된다. 500 L 수확물로부터 시험된 양은 FDA BAM - 5장과 일치할 것이다.

배양된 닭고기를 상기 실시예와 동일한 방법에 의해 제조하였다.

표 1은 세균 오염이 미국 FDA 지침과 비교시 무시할만하였음을 나타낸다.

배양된 닭고기의 미생물학적 분석

매개변수	기본 방법	사양	대표적인 예
미생물학적 분석
호기성 플레이트 수	FDA BAM - 3장	<10,000 cfu/g	<10 cfu/g
대장균	FDA BAM - 4장	<3 MPN/g	<3 MPN/g
이. 콜라이	FDA BAM - 4장	<3 MPN/g	<3 MPN/g
분원성 스트렙토코커스	CMMEF - 9장	<10 cfu/g	<10 cfu/g
살모넬라	FDA BAM - 5장	검출 안 됨	검출 안 됨

마이코플라스마 오염

배양된 C1F 세포는, 각 은행에서 무작위로 선택되고 시험된 세포 바이알의 최소 3%가 해동되고 그의 배양 상등액이 MycoAlert^TM 마이코플라스마 검출 키트를 사용하여 음성 결과를 제공하는 경우 마이코플라스마 검출에 타당한 것으로 간주된다. 키트 지침에 따라, 시험된 샘플을 발광 판독 B 및 발광 판독 A간의 비에 따라 분류한다: 마이코플라스마의 경우 비<0.9 음성; 0.9<비<1.2 경계선(24시간 후에 세포의 재시험이 요구됨); 비>1.2 마이코플라스마 오염.

바이러스 평가

바이러스 평가를, 제3자( Charles River Research Animal Diagnostic Services) - 인간 필수 CLEAR 패널; 조류 바이러스 및 세균 패널에 의해 수행된 감염성 질병 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 통해 부정성 인간 및 조류 바이러스 및 세균 인자를 분석함으로써 수행하였다.

세포 은행으로부터의 C1F는, 시험된 은행의 독립적인 세포 바이알의 최소 3%가 해동되고 그의 세포 펠릿이 부정성 인자의 전체 패널에 대해 음성 결과를 제공하는 경우 바이러스 평가에 타당한 것으로 간주된다.

배양된 C1F 세포는 각각의 세포 은행으로부터의 독립적인 세포 펠릿이 전체 인간 및 조류 패널에 대해 음성이므로 부정성 조류 및 인간 바이러스 및 세균인자의 부재에 대해 입증된 것으로 간주된다.

실시예 4: 배양된 닭고기 분석

배양된 닭고기의 영양 프로파일을 통상적인 닭고기와 비교하였다.

배양된 닭고기의 화학적 분석을 수분, 단백질 함량, 지방 함량, 회분 함량, 탄수화물을 사용하여 수행하였다. 수분 함량을 대류 오븐에서 ≥24시간 동안 105℃에서 건조된 배양된 닭고기의 10-그램 시험 부분을 사용하여 중량 오븐 건조 방법을 사용하여 분석하였다. 전체 조 단백질을 LECO FP 628 질소/단백질 분석기를 사용하는 Dumas 연소 방법에 의해 측정된 총 질소에 기반하여 분석하였다. 지방 함량을 출발 시험 부분의 질량에 대한 누적 지방산 메틸 에스테르(FAME)의 비로서 측정하였다. 30 ㎎의 세포의 건조된 시험 부분에 메탄올성 염산에 의한 직접적인 트랜스에스테르화를 가하고, FAME를 헵탄내로의 액체-액체 추출에 의해 GC-FID에 의한 분석을 위해 분리한다. 시험 샘플에 부가된 내부 표준 및 교정 표준으로서 메틸-10-헵타데세노에이트의 첨가에 의해 정량분석을 달성하였다. 이 방법에서 확인된 FAME는 Nuchek Prep Inc.에서 구매한 GLC-74X 분석 표준의 구성성분으로, 메틸 옥타노에이트 내지 메틸 도코사노에이트의 15개의 통상적인 포화 및 불포화 FAME의 혼합물이다. GC 크로마토그램 중의 모든 다른 유의미한 피크를 그들의 가장 가까운 용출 이웃의 교정 곡선에 기반하여 정량분석하였다. 전체 회분 함량을 Milestone Pyro 260 전자레인지를 사용하여 중량측정 방법에 기반하여 분석하였다. 샘플을 50분 넘게 900℃로 가열하고 이어서 1시간 동안 900℃에서 유지시켰다. 탄수화물 함량을 전체 수분, 단백질, 회분 및 지방 함량과의 차이에 의해 계산한다.

표 2는 통상적인 뼈없는 닭가슴살과 비교된 배양된 닭고기의 회분, 탄수화물, 단백질 및 지방 퍼센트를 요약한다.

통상적인 뼈없는 닭가슴살과 비교된 배양된 닭고기의 영양 분석

영양소 패키지	참조 방법	건조한 생 닭가슴살	건조한 배양된 생 닭고기		건조한 막 배양된 생 닭고기 (0% 회분으로 정규화됨)
회분	AOAC 930.30	0		12	0
탄수화물	계산	0		3	3.4
단백질	AOAC 992.23	87.1		77.8	88.3
총 지방	AOAC 996.06	8.2		8.1	9.2

표 3은 통상적인 뼈없는 닭가슴살과 비교된 배양된 닭고기의 포화된, 일불포화된 및 다중불포화된 지방 퍼센트를 요약한다. 지방 값을 샘플 중 총 지방에 대한 비(specific) 지방의 %로서 나타낸다.

배양된 닭고기의 불포화된, 일불포화된 및 다중불포화된 지방 퍼센트의 요약

영양소 패키지	참조 방법	건조한 생 닭가슴살	건조한 막 배양된 생 닭고기
지방-포화된	AOAC 996.06	26.1	36.8
지방-일불포화된	AOAC 996.06	34.1	50
지방-다중불포화된	AOAC 996.06	17.5	7.4
칼로리	계산	437	436

배양된 닭고기는 건조한 생 닭고기에 대해 건조 세포 페이스트 100 그램당 그램으로 비교시 통상적인 닭고기의 경우와 유사하다. 통상적인 닭가슴살과 배양된 닭고기의 전체적인 칼로리값은 유사하다. 일불포화된 지방(통상적으로 건강한 유형의 지방으로 지칭된다)은 통상적인 및 배양된 닭고기(각각 34.1% 및 50%) 모두에서 보다 높은 백분율의 지방 유형을 나타내며, 다음으로 포화된 지방 및 다중불포화된 지방 순이다. 흥미롭게도, 배양된 닭고기 중의 높은 회분 함량은 주로 물질의 제조에 사용된 0.45% NaCl 세척액과 닭 세포 증식에 사용된 배양 배지로부터의 잔류 염에 기인한다. 이는 또한 배양된 닭고기에서의 나트륨 수준(3.6%)에 의해 입증되었다. 회분을 분석에서 제거하는 경우, 단백질, 지방 및 탄수화물 수준은 배양된 닭고기와 통상적인 닭간에 상당히 일치한다.

실시예 5: 조류 식품 조성

전형적인 조류 식품 조성을 하기 표 4에 기재한다(중량 기준 백분율).

예시적인 조류 식품 조성

성분	중량%
수	20-40
세포 페이스트	25-50
녹두	10-20
지방	5-20
트랜스글루타미나제	0.0001-0.0125

실시예 6: 닭고기 너겟 제조 레시피

하나의 비제한적인 레시피를 하기에 기재한다.

먼저, 수를 이나트륨 포스페이트로 0.03 내지 16%의 농도로 컨디셔닝하였다. 수 컨디셔닝 후에, 녹두 단백질 단리물을 컨디셔닝된 수에 가하여 수화된 콩류 단백질을 제조하였다. 이어서, 25 내지 65%의 농도로 C1F 세포로부터 제조된 세포 페이스트를 수화된 콩류 단백질과 접촉시켜 세포 및 단백질 혼합물을 제조하였다.

일련의 가열 단계를 세포 및 단백질 혼합물에 적용하였다. 첫 번째 단계에서, 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 45-60℃의 온도로 상승시켰다. 이 단계에서 시즈닝을 첨가하였다. 두 번째 단계 동안, 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 45-60℃에서 유지시키고 트랜스글루타미나제를 첨가하였다. 트랜스글루타미나제 효소 반응을 45-60℃의 온도에서 10-20분간 실행시켰다. 세 번째 단계 동안, 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 70℃로 증가시켜 효소를 불활성화시킴으로써 트랜스글루타미나제 효소 반응을 정지시킨다. 본원에서 논의된 바와 같이, 트랜스글루타미나제는 단백질 단리물 중의 펩티드 및 배양된 세포상에 존재하는 펩티드를 공유적으로 연결시키는 것으로 여겨진다. 세 번째 단계 동안, 오일을 5-20%(v/v)의 농도로 첨가하였다.

이어서 세 번째 단계의 처리 후에 세포 및 단백질 혼합물을 5-15℃의 온도로 냉각시켰다.

이어서 세 번째 단계 후의 세포 및 단백질 혼합물을 5-25% 지방으로 유화시켜 유화된 혼합물을 생성시키고 이를 금형으로 옮긴다. 유화된 혼합물의 밀도 및 질감을, 금형에 진공을 적용시킴으로써 변화시켰다. 이어서 유화된 혼합물을 실리콘 금형/선반에 배분하였다. 이어서 실리콘 금형/선반을 200-275℃에서 5 내지 19분간, 35-75% 증기를 주입하면서 구웠다.

이어서 구워진 재료를 백에 넣거나, 급속 냉동하거나, 냉장보관하였다. 이어서 구워진 재료에 빵가루를 입히고 튀겨 배양된 조류 닭고기 바이트를 생산하였다.

배양된 조류 닭고기 바이트를 시식 패널에 의해 시험하였으며 패널은 배양된 조류 세포 닭고기 바이트가 농장 동물로부터 제조된 닭고기 바이트와 맛, 질감 및 식감이 필적할만하다고 결정하였다.

실시예 7: 제조에 사용된 닭 세포에 대한 서열분석

제조에 사용된 닭 세포에 대한 서열분석을 모 세포에 비교하여 배양 조건에 의해 유발된 잠재적인 유전자 이동을 평가하였다.

간단히, 참조 간행물에 기반하여 R 프로그램 DESeq2_1.20.0을 사용하여 차별적인 유전자 발현 분석을 수행하였다. 그 후에, ClusterProfiler: cluster_2.0.7-1을 사용하여 샘플의 계층적 군집화를 수행하였다.

도 3은 모 닭 세포 풀의 3개의 생물학적 복제물과, 배양된 닭고기 제조에 사용된 닭 세포 풀의 3개의 생물학적 복제물간에 수행된 군집화 분석을 묘사한다.

10,400개 초과의 유전자를 도 3에 플롯팅하며, 통계적으로 다르게 발현된 유전자는 p<0.01에 대해 선택되고, 상기 다르게 발현된 유전자의 규모는 히트맵으로 제시된다.

샘플 JUST1-JUST3를 고(10% v/v) 혈청 농도로 보충된 배지와 함께 접착 조건하에서 배양된 모 닭 세포로부터 수득하였다.

샘플 JUST7-JUST9를 저(1.25% v/v) 혈청 농도로 보충된 배지와 함께 현탁액 중에서 배양하였다. 도 3에서 관찰된 바와 같이, 샘플을 각 그룹내에서 함께 군집화하였으며, 이는 각각의 배양 조건내에서 생물학적 복제물들간에 균일성을 나타내었다.

Gallus gallus 데이터베이스(GenomeInfoDbData_1.1.0 및 2018년 4월 9일 업데이트된 Org.Gg.eg.db(Gallus 데이터베이스) v2.1)에 대한 주석을 기반으로 하는enrichKEGG를 사용하여 경로 농축을 수행하여, 상이하게 발현된 유전자가 특정 경로로 분류되는지를 확인하였다.

영향을 받은 경로는 DNA 복제, 프로테아솜, 리보솜, 세포자멸사 및 스테로이드 생합성의 기전과 연관 것들을 포함한다. 상향- 및 하향-조절된 유전자 중 어느 것도 인간 소비에 유해한 대사산물, 단백질 또는 다른 독소와 연관되지 않았다.

실시예 8: 혈청 함량 감소의 효과

세포 생육력(도 4a) 및 집단 배가 시간(도 4b)에 대한 저 혈청 배지의 영향을 분석하였다. 세포를 처음에 0.5%(v/v) 혈청 농도 및 이어서 0%(v/v)-무혈청으로 낮추어 증식시켰다.

지방산 및 성장인자가 보충된 무혈청 기본 배지(도 5a) 및 지방산 및 성장인자가 보충된 무혈청 기본 배지(도 5c)에서의 C1F 세포 증식의 효과를 연구하고 혈청이 없고 성장인자가 없는 기본 배지에서 증식된 C1F 세포와 비교하였다(도 5b). 사용된 성장인자는 5 내지 200 마이크로그램/㎖ 농도의 인슐린-유사, 표피-유사, 및 섬유아세포-유사 성장인자였다. 도 5a 및 5c는 발효 동안 100 마이크로그램/㎖의 성장인자를 사용하였다. 50 마이크로그램/㎖의 성장인자의 경우 유사한 효과가 관찰되었다. 결과는 성장인자가 보충된 무혈청 배지가 성장인자가 보충된 혈청이 있는 기본 배지와 유사한 생육성 세포 밀도를 달성함을 입증한다.

실시예 9: 무혈청 조건에의 적응

선행 단계에서 성공적인 세포 적응을 확인한 후, 각 단계에서 혈청 백분율의 순차적 감소를 기반으로 점진적 적응 방법론을 구현하였다. 낮은 혈청 농도에 대한 세포 적응은 즉각적인 과정이 아니며 새로운 미세 환경에 적응하고 혈청 감소의 각 단계에서 건강한 외관과 분명한 성장을 획득하도록 조정하는데 일정 기간이 필요하다. 첫 번째, 우리는 현탁액 중의 세포가 현저한 증식 정지를 나타내는 FBS의 임계값 농도를 결정하였다. 5% FBS 함유 배지에서 유지된 C1F 세포를 2%, 1% 및 0.5% FBS로 옮겼다. FBS 농도가 1%(v/v) 미만으로 감소되었을 때, 세포는 감소된 증식을 나타내었다. 세포를 저혈청 농도에 적응시키기 위해 1% v/v 및 0.5%(v/v) FBS를 함유하는 배지에 인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민(ITSE)(ThermoFisher) 및 성장인자(표피 성장인자(EGF) 및 기본 섬유아세포 성장인자(FGF), Peprotech)를 보충하였다. ITSE, EGF 및 기본 FGF를 함께 사용하는 것을 ITSEEF라고 한다. 도 6은 무혈청 배지에서 증식하도록 적응된 세포의 생육력, 집단 배가 시간 및 집단 배가 수준을 개시한다. 도 6a는 혈청 이유(weaning) 과정 동안의 생육성 세포 밀도를 나타낸다. 도 6b는 혈청 이유 과정 동안의 집단 배가 시간을 나타낸다. 도 6c는 세포가 0.5% FBS를 함유하는 배지에서 0% FBS로 이행될 때 C1F 세포의 생육력을 나타낸다.

무혈청 배지에서 보다 높은 세포 밀도를 달성하기 위해, 추가적인 화학적으로 한정된 보충물을 시험하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 비타민, 지질 및 미량 원소를 성장인자 및 ITSE의 이유와 함께 선별하였다. 본 실시예에서, DMEM/F12 배지의 분말(ThermoFisher, Cat#A42914EK) 및 액체(플루로닉-F68 및 ITSEEF가 보충된 기본 배지(DMEM/F-12, Cat#11320-033), 따라서 이후에 JUST 기본(JB) 배지라 칭한다) 버전이 모두 사용되었다. 액체 DMEM/F12가 적응 연구의 대부분에 사용되었다. 표준 오스몰농도(대략 330 mOsm/㎏)를 갖는 SFM(SFC-2)을, DMEM/F12의 상업적으로 입수할 수 있는 분말 형태를 사용하여 제조하는 반면, 저-오스몰농도(대략 280 mOsm/㎏)를 갖는 SFM(SFC-4)은, 글루코스, HEPES 완충제, L-글루타민, 나트륨 비카보네이트, 및 염화 나트륨을 함유하지 않는 분말 DMEM/F12의 주문제작 변체를 사용하여 제조되었다. SFC-4의 누락 성분을 별도로 첨가하였으며 오스몰농도를 상이한 염화 나트륨 첨가 값에 기반하여 조절하였다. 사내 RO/DI 수를 사용하여 분말 제형으로부터 DMEM/F12 기본 배지를 제조하였다.

무혈청 조건에의 상이한 적응 단계에서 최적화된 다양한 SFM의 조성

성분		SFM 유형
		JB	JB-VLA	SFC-2	SFC-4
기본 배지	DMEM/F12	X	X	X	X
단백질-기반	ITSE	X	X	X	X
성장 인자	EGF	X	X
	기본 FGF	X	X
비타민	4Vit 믹스		X	X	X
지질	CDL 믹스		X	X	X
미량 원소	상업적인 미량원소 믹스		X	X	X
계면활성제	플루로닉	X	X	X	X

무혈청 C1F(SF-C1F) 세포 확대 및 극저온보존

생육성 세포 밀도를 기반으로, C1F 세포의 확대를 위한 분할 비를 결정하였으며, 이는 전형적으로 1:3(v/v)이다. 무혈청 배지(SFM)에서 배양된 C1F 세포를 50 ㎖ 작업 배양물이 있는 125 ㎖ 플라스크로부터 2.5 L 작업 부피를 갖는 5 L 플라스크에서 다중 증분 계대배양 단계를 통해 최종 단계로 확대시켰다: 250 ㎖ 플라스크에서 100 ㎖, 500 ㎖ 플라스크에서 300 ㎖, 2.8 L 플라스크에서 900 ㎖. 각각의 세포 계대배양 후에, 세포 밀도 및 생육력의 새로운 측정을 앞서 기재한 바와 동일한 프로토콜에 따라 수행하였다.

SF-C1F 세포 은행을 5 L 진탕 플라스크에서 활발하게 증식하는 배양물로부터 제조하였다. 뱅킹에 바람직한 세포수를 유지하는 부피의 C1F 세포 현탁액을 300xg에서 원심분리시켰다. 상등액을 무균 경사분리하거나 또는 C1F 세포 펠릿을 방해 없이 흡출하였다. 세포 펠릿을 극저온보존 배지에 서서히 재현탁시켰다. 다양한 사내 및 상업적으로 입수할 수 있는 동결 배지를 선별하여 최고의 수행자를 결정하였다(표 6). 사내 동결 배지는 FBS 및/또는 DMSO를 SFM(SFC-2) 배지에 가하여 제조되었다. 상업적인 극저온보존 배지를 BioLife Solutions(CryoStor CS2, CS5, CS10) 및 PromoCell(Cryo-SFM)로부터 구입하였다. SF-C1F 세포 은행을 액체 질소 냉동기의 증기상에서 -185℃에서 20 내지 30x10⁶ 세포 분액으로서 보관하였다. 사내 극저온보존 배지용으로 1 ㎖ 분액 및 상업적인 동결 배지용으로 2 ㎖ 분액을 극저온 보관 바이알에 분배하였다. 세포를 이소프로판올 챔버에서 16 내지 24-시간 기간 동안 4℃에서 -80℃까지 -1℃/분의 속도로 바-코딩된 극저온바이알에서 동결시켰다. 이어서 C1F 세포를 증기상 액체 질소 보관 시스템(Taylor Wharton(<-175℃))으로 옮겨 보관하였다. 바이알 내용물 및 은행 보관 위치를 통제된 데이터베이스에 기록하였다. 적합한 바이알(들)이 세포 은행으로부터 회수되는 것을 보장하기 위해 GMP 보관 연쇄 문서(바이알 식별 확인)를 사용한다.

SF-C1F 세포 은행의 2개 바이알을 37℃ 수욕에서 2분 미만으로 해동시키고 SFM(SFC-2)을 사용하여 10-배 희석에 이어서 재현탁시켰다. 300xg에서 원심분리 후에, 상등액을 제거하고, 세포를 다시 신선한 SFM에 0.3-0.6x10⁶ 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. 회전 계대배양을, 세포가 1.2x10⁶ 세포/㎖ 이상에서 생육성 세포 밀도(VCD)로 증식함으로써 회복을 나타낼 때까지 수행하였다. 회복시, 세포를 1:3 비에 따라 분할 계대배양하였다. 회전 계대배양을 300xg에서 5분간 세포를 원심분리시키고 상등액을 버려 수행하였다. 이어서 세포 펠릿을 신선한 배지에 재현탁시켰다. 분할 계대배양 방법에서, 세포 배양물의 일부를 예정된 양의 신선한 배지를 함유하는 새로운 플라스크로 옮겼다. 1:3의 세포 분할 비를 위해서, 원래 C1F 현탁액의 전체 부피의 1/3을 신선한 배양 배지의 전체 부피의 2/3를 함유하는 플라스크로 옮긴다. VCD를 실시예 13에 개시된 방법에 따라 측정하였다.

SF-C1F 세포에 대해 시험된 극저온보존 배지

배지 유형	명칭/성분	판매사	유형
극저온 배지	10% FBS+10%DMSO+80% SFM	사내	혈청 함유
	90% FBS+10%DMSO	사내	혈청 함유
	10% DMSO+90%SFM	사내	무혈청
	CryoStor CS2	BioLife Solutions	무혈청
	CryoStor CS2	BioLife Solutions	무혈청
	CryoStor CS10	BioLife Solutions	무혈청
	Cyro-SFM	PromoCell	무혈청

생육성 세포 밀도 및 생육력의 정량분석을 위해서, 1 ㎖의 C1F 현탁액을 에펜도르프 튜브에 수집하고 300xg에서 5분간 원심분리하였다. 상등액은 버리거나 대사산물 농도 측정에 사용하였다. C1F 세포 펠릿을 500 ㎕의 TrypLE Express(Gibco)에 재현탁시키고 진탕 플랫폼상에서 37℃에서 5-8분간 배양한 다음, 500 ㎕의 배양 배지를 가하여 효소 활성을 불활성화시켰다. 전체 부피(샘플당 550 ㎖의 최소 부피)를 Vi-Cell^tm XR 세포 생육력 분석기(Beckman Coulter)의 샘플링 컵으로 옮겼다. 세포 밀도 및 생육력을 Vi-Cell 분석기를 사용하여 정량분석하였다. Nova Flex 생물분석기(Nova Biomedical, USA)를 사용하여 pH, 글루코스, 글루타민, 글루타메이트, 락테이트, 암모늄, 칼륨 및 나트륨의 값을 평가하였다. 1 ㎖의 샘플(소모된 또는 신선한 배지)을 배지 성분 및 대사산물 분석에 사용하였다. 신선한 및 소모된 배지의 오스몰농도를 20 ㎕의 샘플을 사용하여 OsmoPro 삼투압계(Advanced Instruments)를 사용하여 측정하였다. 집단 배가 시간(PDT) 및 집단 배가 수준(PDL)을 하기 식에 따라 계산하였다:

PDT = t*log10(2)/((log10(n/n0)) 이고,

여기에서, t = 배양 시간, n = 최종 세포수 및 n0 = 시딩된 세포수.

PDL = 3.32[log10(n/n0)] 이고,

여기에서, n = 최종 세포수 및 n0 = 시딩된 세포수.

C1F 세포를 0.5% FBS에 성공적으로 적응시킨 후에, FBS를 0.25%, 0.1%, 0.05% 및 0% FBS로 단계적으로 추가로 감소시켰다. C1F 세포는 ITSEEF의 존재하에서 FBS 없이 성공적으로 증식되었으나, 세포 밀도 및 증식률은 5% FBS 함유 배지에서 증식된 세포보다 약간 낮았다.

실시예 10: 추가적인 배지 성분

본 실시예는 세포 밀도 및 증식률을 개선시키기 위해 무혈청 배지에 영양 성분을 첨가함을 개시한다. 표 5에 개시된 배지를 JUST 기본(JB) 배지라 칭한다. ThermoFisher로부터 구입한 지질 용액(CD-지질)은 세포 배양 배지에서 FBS의 이유를 지원하는 것으로 앞서 보고되었다. 지질, 특히 필수 지방산 및 에탄올아민이 섬유아세포를 포함한 세포의 증가된 증식을 지지하는 것으로 나타났다. 이들은 에너지를 저장하고 세포막의 구성성분으로서 작용하며; 또한 신호전달 및 수송을 지원한다. 화학적으로 한정된 비타민 및 지질의 보충은 무혈청 C1F 세포의 VCD를 약 0.8-1.0x10⁶ 세포/㎖에서 1.5x10⁶ 세포/㎖로 개선시켰다. VCD를 실시예 13에 개시된 방법에 따라 측정하였다.

이어서, 우리는 VCD 및 증식률을 증가시키기 위해 미량원소를 가하였다. 예를 들어, 셀레늄은 글루타치온(GSH) 합성효소에 대한 보조인자로서 유리 라디칼의 해독을 돕는 것으로 알려져 있다. 구리, 아연 및 트리카복실산과 같은 다른 미량원소는 세포 성장 및 증식에 소량일지라도 필요하다. 미세영양소는 또한 몇몇 효소의 기능 및 유지에 필수적이다. Corning으로부터 구입한 미량원소 A, B 및 C를 시험하였다. Trace A 혼합물은 한정된 농도의 CuSO4, ZnSO4, Na-셀레나이트, 및 시트르산 제2철을 함유한다. Trace A(JB-VLA)에서 배양시, C1F 세포는 시간이 지남에 따라 ∼2x10⁶ 세포/㎖의 VCD를 달성할 수 있었다. 흥미롭게 Trace B 및 C는 SFM 중에서 C1F 닭 세포에 대해 관찰할 수 있는 효과가 없었다. VCD를 실시예 13에 개시된 방법에 따라 측정하였다.

실시예 11: 성장인자의 감소

본 실시예는 SFM 중의 성장인자의 감소를 개시한다. C1F 세포를 실시예 10에 개시된 바와 같이 배양하였으나, 배지에 첨가되는 성장인자의 양을 서서히 줄임으로써 성장인자의 첨가를 최소화하도록 조정하였다. 시간이 지남에 따라, C1F 세포는 EGF 및 FGF를 함유하지 않는 배지에서 실시예 10에 개시된 바와 유사한 VCD 및 증식률로 성공적으로 증식하였다.

ITSE를 감소시키는 실험은 SFM 중의 닭 세포의 성장 및 증식을 손상시키지 않으면서 10배까지 ITSE 보충량을 감소시키는데 성공하였다. VCD를 실시예 13에 개시된 방법에 따라 측정하였다.

실시예 12: 조류 세포의 대규모 제조

일회용의 스테인레스-강 생물반응기에서 무혈청(C1F-SFM) 및 혈청-함유 배지(C1F-SCM)을 사용하여 최대 1,000 L의 규모로 C1F 세포의 대규모 제조를 수행하였다. 무혈청 및 혈청-함유 배지는 본원에 기재되어 있다.

발효 용기의 크기가 증가함에 따라, 높은 압력, 혼합시간, 영양소 흐름, 보다 낮은 O₂ 수준 및 CO₂의 형성, 및 전단은 세포의 성장 또는 세포의 용해를 억제하거나 방지하는 작용을 한다. 발효 용기의 크기가 높이가 증가함에 따라, 용기 기부의 압력이 대단히 높아져 세포의 용해를 초래할 수 있다. 조류 세포를 큰 발효기에서 배양할 수 있음은 놀랍고도 뜻밖의 결과이다. 조류 세포는 세포를 높은 압력으로부터 보호하는 보호성 세포벽을 갖고 있지 않다.

일회용 웨이브백 생물반응기가 배치 세포 배양 모드 또는 관류 모드로 사용되었다.

배치 세포 배양 모드의 경우, 5 L 진탕 플라스크로부터의 배양물을 사용하여 무균 조건하에서 50 L 진동 움직임 웨이브백을 접종하여 목적하는 분할 비를 획득하였다. 목적하는 세포 밀도가 달성된 후에, 추가적인 배지를 웨이브백에 가하여 목적하는 분할 비를 달성하였다. 이 시점에서 전체 배양 부피는 50 L였다. 50 L 웨이브백의 배양 완료 시, 2개의 웨이브백 배치 배양물의 전체 내용물을 사용하여 200 L 스테인레스 강 생물반응기를 접종하였다.

500 L 생물반응기의 접종물을 생성시키는데 사용된 관류 웨이브백 배양물의 경우, 단일 50 L 웨이브백 생물반응기를 5 L 진탕 플라스크로부터의 배양물로 접종하고 신선한 배지를 가하여 목적하는 분할 비를 달성하였다. 접종에 이어서, 세포 배양물을 1일간 증식되게 한 후 1일째에 관류 공정을 개시시켰다. 관류를 예정된 양의 시간 동안 계속하고, 최종 관류일에, 세포 배양물을 목적하는 분할 비에 따라 옮겨 500 L 일회용 생물반응기 접종에 사용하였다.

수회의 200 L 및 1,000 L 스테인레스 강 생물반응기 배양을 수행하여 배양된 닭 세포를 제조하였다. 상기에 논의된 웨이브백 배양물의 내용물을 200 L 생물반응기로 옮기고 배양 배지를 생물반응기에 가하여 목적하는 분할 비를 달성하였다. 배양 동안, 생물반응기 배양물을 pH, 용존 산소, 글루코스, 글루타민, 락테이트, 암모늄 및 오스몰농도 수준에 대해 오프라인으로 모니터링하였다. 배양 동안, 샘플을 수집하여 미생물의 부재를 확인하였다.

1,000 L 스테인레스 강 및 500 L 일회용 생물반응기를 또한 회수 및 충전 방법으로 실행할 수 있다. 상기 공정에 의해, 목적하는 양의 생물반응기 배양물, 예를 들어 1,000 L 생물반응기 중 750 L 또는 500 L 생물반응기 중 375 L의 배양물을 임시 보관 용기(일회용 BioBag)내에 수확하고 신선한 배지를 남은 배양물에 즉시 가하여, 전체 부피를 1,000 L 또는 500 L로 복구한다. 상기 재충전 작업과 동반하여, 수집된 세포 배양물을 수확을 위해 농축시킨다. 일단 생물반응기가 목적하는 부피로 재충전되었으면, 배양을 계속하여 목적하는 세포 밀도를 달성하였다. 상기 회수 및 충전 과정을 수회 수행하여 전체 배양 부피를 수집하는 최종 수확으로 마친다.

세포 수확은 증식 배지/액체로부터 세포의 분리 및 수집으로서 정의된다. 전형적으로, 수확을 원심분리 및 잔류 배지 성분의 세척에 의해 수행한다. 세포를 임의의 세척액, 전형적으로 0.45%(w/v) NaCl을 함유하는 수로 세척할 수 있다. 수확 생산물인 배양된 닭을 또한 "세포 페이스트"라 칭하며, 이는 원심분리 및 세척 후에 생성된 습윤 세포 펠릿을 의미한다.

2백만 세포/㎖를 훨씬 초과하는 세포 밀도가 통상적으로 획득되었다.

실시예 13: 락테이트 생산의 감소

세포 증식 동안, 대사산물(예를 들어 락테이트, 암모니아, 아미노산 중간체)의 축적은 특정 농도에서 세포 증식 및 생산성에 유해한 것으로 나타났다(Claudia Altamirano et al., 2006; Freund & Croughan, 2018; Lao & Toth, 1997; Pereira et al., 2018). 유가 공정에서 락테이트의 축적은 배양 pH의 감소를 야기하며 이는 pH를 설정값 또는 생리학적 범위에서 유지시키기 위해 알칼리의 첨가를 요한다. 부정적으로, 알칼리의 첨가는 배지의 오스몰농도의 증가를 야기하며 보다 높은 오스몰농도 수준은 대부분의 세포주의 증식 및 단백질 생산을 강하게 억제하는 것으로 나타났다(Christoph Kuper et al., 2007; Kiehl et al., 2011; McNeil et al., 1999).

락테이트 축적의 주요 경로는 피루베이트의 락테이트로의 상호전환이며, 이는 락테이트 데하이드로게나제(LDH)에 의해 촉매화된다. 포유동물 세포에서, 연구는 각각 LDHA 또는 LDHB에 의해 암호화되는 서브유닛 A 또는 B와 동종- 또는 이종-사량체로서 존재함을 보였다(Urbanska & Orzechowski, 2019). 더욱이, LDHA는 순방향 반응(피루베이트에서 락테이트로)을 촉매화하고 LDHB는 역방향 반응(락테이트에서 피루베이트로)을 촉매화하는 것으로 나타났다. LDHA는, 산소의 존재하에서조차 피루베이트로부터 락테이트를 생산하는 시트르산 주기를 통해 피루베이트의 붕괴를 구동하지 않는 세포주에서 발생하는 바르부르크(Warburg) 효과에서 핵심적인 역할을 한다.

피루베이트의 유사체인 옥사메이트는 강한 경쟁적 LDHA 억제제로, 트리카복실산(TCA) 주기(훨씬 더 에너지 효율적인 공정)를 통해 글루코스의 무수한 붕괴를 채널링함으로써 바르부르크 효과를 중단시킨다(Wang et al., 2019). 그러나, 상기 분자의 사용은 대부분의 산업적인 포유동물 세포주의 보다 이른 생산 단계에서 핵심적인 인자인 세포 증식을 억제한다(Kim et al., 2019; Wang et al., 2019).

C1F 세포를 1.25% 소 혈청이 보충된 현탁 배양물에서 배양하였다. 다양한 농도의 나트륨 옥사메이트를 시험하였으며: 1, 3, 5, 10, 30, 60, 100, 및 200 mM, 락테이트의 생산, 글루코스 소비, 세포 증식률 및 세포 밀도를 측정하였다.

비속도를 1일 생육성 세포 농도 및 세포 배양 지속기간 동안의 대사산물 농도를 사용하여 계산하였다. 특정한 순 증식률(μN)을 하기 수학식 1을 사용하여 시간 구간 t₁ 내지 t₂에 걸쳐 VCD의 변화로서 계산하였다:

[수학식 1]

비 글루코스 소비율(qGluc) 또는 비 락테이트 생산율(qLac)을 하기 수학식 2를 사용하여 측정하였으며, 이때 P는 글루코스 또는 락테이트 농도이다:

[수학식 2]

생육성 세포 밀도(VCD) 및 생육력을 진탕 플라스크 세포 배양물로부터 취한 1 ㎖의 1일 샘플로부터 Vi-cell^TM(Beckman Coulter)을 사용하여 트립판 블루 배제 방법에 의해 측정한다. 대사산물(글루코스, 락테이트 글루타민, 글루타메이트, 암모늄) 농도를 포함하여 기체 및 pH 값을 Bioprofile Flex 분석기(Nova Biomedical)를 사용하여 측정하였다. 오스몰농도를 어는점 기술을 사용하는 OsmoPro 다중-샘플 미세-삼투압계(Advanced Instruments)를 사용하여 측정하였다.

처리되지 않은 대조용 세포를 포함하여, 다양한 농도의 나트륨 옥사메이트(1, 3, 5 및 10 mM)로 처리된 C1F-SCM 세포를 3일간 중복 진탕 플라스크를 사용하여 배치 모드로 배양하였다. 우리는 대조용 조건과 비교하여, 10 mM 옥사메이트-처리된 세포의 경우 락테이트 생산의 28%(p<0.05) 감소, 및 2일째에 시험된 다른 농도의 옥사메이트로 처리된 세포에서 락테이트 생산의 감지할정도의 감소를 관찰하였다. 또한, 우리는 옥사메이트-처리된 세포에서 2일까지 락테이트 생산 및 글루코스 소비에 대한 옥사메이트의 농도-의존적인 효과를 관찰하였으며, 이때 옥사메이트 농도의 증가는 감소된 락테이트 생산으로 이어졌다. 다른 대조용 매개변수는 허용가능한 생리학적 범위내에 있었다.

실험을 3-일 배치 세포 배양물 중의 나트륨 옥사메이트의 보다 높은 농도의 나트륨 옥사메이트(10, 15, 20 및 30 mM)를 사용하여 반복한 경우, 락테이트 생산이 농도-의존적인 방식으로 감소되었으며 락테이트 생산이 약 52%까지 감소되었다.

우리는 3-일 배치 배양물에 대해서 옥사메이트 농도의 추가적인 증가(30, 60, 100 및 200 mM)를 진행하였다. 예상된 바와 같이, 옥사메이트로 처리된 세포에서 락테이트 생산의 농도-의존적인 감소가 관찰되었다.

옥사메이트의 영향이 대사 부산물이 이미 존재하는 세포 배양물에서 유사하게 남아있는 지를 추가로 검사하기 위해서, 우리는 신선한 배지(소모된 배지의 부피의 1/3 및 신선한 배지의 2/3)로 1:3(v/v) 분할을 사용하여 30 mM 옥사메이트로 처리된 세포를 계대배양하였다. 수일간 배양에 사용된 이월 배지에는 항상 세포 소비로 인한 대사산물의 잔류량(이월량)이 포함되어 있다.

30 mM의 옥사메이트로 처리된 C1F 세포는 최대 배양 5일까지 연속적인 선형 증식을 나타내었으며, 2.79x10⁶ 세포/㎖에서 피크였다. 대조용 배양물은 배양 3일째에 1.64x10⁶ 세포/㎖에서 피크였으며 그 후에 떨어졌다. 따라서, 옥사메이트-처리된 배양물은 ∼44%의 최대 생육성 세포 밀도에서 현저한 증가를 나타내었다. 옥사메이트-처리된 세포가 5일까지 보다 높은 세포 밀도를 나타내었다 하더라도, 이들 C1F-SCM 세포는 여전히 대조군에 비해 누적 락테이트 생산이 ∼23% 감소하였다. 또한, 옥사메이트-처리된 C1F 세포는 감소된 비 글루코스 소비(qGluc)를 나타내었다. 세포 생육력 및 배지의 오스몰농도는 옥사메이트 보충에 의해 손상되지 않았다. 옥사메이트 처리되지 않은 대조군에 비해, 배양 3 내지 5일 옥사메이트-처리된 배양물에 대해 암모늄 축적이 급증하였다. 배지의 pH는 대조용 배양물의 경우 약 7.0, 및 옥사메이트-처리된 C1F-SCM 세포의 경우 7.2였다.

옥사메이트 처리된 세포의 세포 밀도의 증가는 놀랍고도 예상밖이다. 암세포상에서 옥사메이트를 사용하여 수행한 연구는 세포 증식의 억제를 보인다. 세포 증식에 대한 옥사메이트의 억제 효과는 TCA 주기를 통한 것보다 ATP 생성을 위한 더 빠른 경로를 나타내기 때문에 에너지원으로서 해당 경로에 대한 암세포의 의존성 때문일 수 있다(Kim et al., 2019; Lu et al., 2014).

실시예 13: 대체 당

우리는 1.25% FBS를 함유하는 현탁 배양물에서 증식된 사내 C1F 닭 세포의 증식 및 대사에 대한 대체 당(만노스, 프럭토스 및 갈락토스)의 영향을 평가하였다. 특정 순 증식률(μN) 및 비 글루코스 소비율(qGluc) 또는 비 락테이트 생산율(qLac)을 실시예 12에 개시된 바와 같이 수학식 1 또는 2에 따라 계산하였다.

본원에 기재된 바와 같은 현탁 배양물을, 0일째부터 첨가되고 최대 3일까지 배치 모드로 배양된 3 g/L의 각 당을 사용하여 배양하였다. 샘플링 후 3일째에, 추가로 3 g/L의 각 당을 각각의 플라스크에 가하였다. 3일까지, 피크 세포 밀도에서, 탄소원으로서 글루코스를 사용한 플라스크는 최고의 생육성 세포 밀도(∼2.805x10⁶ 세포/㎖)를 가졌고, 이어서 만노스(∼2.40x10⁶ 세포/㎖), 이어서 프럭토스(1.935x10⁶ 세포/㎖) 및 마지막으로 갈락토스(0.915x10⁶ 세포/㎖)를 갖는 플라스크 순이었다.

만노스-공급된 플라스크가 2일까지 보다 낮은 전체 락테이트 생산을 가졌지만, 3일 VCD에 대해 정규화시, 생산된 락테이트는 글루코스와 함께 배양된 세포에 비해 1.7%까지의 약간의 증가를 보였다.

우리는 C1F 세포가 탄소원으로서 프럭토스를 사용할 수 있음을 관찰하였기 때문에, 상이한 출발 농도의 프럭토스의 영향을 평가하였다. 하나의 실험에서, 0일부터 6 g/L의 프럭토스를 한 세트의 중복 플라스크에 첨가하고, 3 g/L의 프럭토스를 0일부터 또 다른 세트의 중복 플라스크에 첨가하였다. 3 g/L의 프럭토스로 시작하는 플라스크에서, 추가로 3 g/L의 프럭토스를 복제물 중 하나의 1일째, 및 다른 복제물의 2일째에 첨가하였다. 전반적으로, 플라스크는 2일까지 유사한 세포 밀도 및 증식률 프로파일을 나타내었지만, 0일부터 6 g/L의 프럭토스로 배양된 플라스크는 1일부터 3일까지 36% 더 높은 락테이트 축적의 약간의 증가를 나타내었다.

이어서 우리는 증식 및 락테이트 생산에 대한 글루코스, 만노스 및 프럭토스의 병용 효과를 평가하였다. 실험 설계(DOE) 접근법을 사용하여, 17개의 배치 진탕 플라스크 실행을 수행하여 현탁 닭 C1F 세포에 대한 에너지원으로서 글루코스, 만노스 및 프럭토스의 다양한 농도 조합을 평가하였다. 사용된 실험 설계는 3개의 인자(글루코스, 만노스 및 프럭토스) 및 4개의 수준(0, 0.5, 1.5 및 3.0 g/L)을 포함하였다. 3일까지, 기본 탄소원 3.0 글루코스/0.5 프럭토스/0.5 만노스를 갖는 세포가 3.8x10⁶ 세포/㎖의 최고 생육성 세포 밀도(VCD)를 가졌고, 이어서 3.0 글루코스/0.0 프럭토스/3.0 만노스 및 3.0 글루코스/3.0 프럭토스/3.0 만노스 순이었다. 또한, 3.0 글루코스/3.0 프럭토스/3.0 만노스 플라스크의 VCD는 4일까지 3.54x10⁶ 세포/㎖에서 3.78x10⁶ 세포/㎖로 증가하였다. 흥미롭게도, 상기에서 언급된 플라스크는 대조용 플라스크와 유사한 락테이트 프로파일을 나타내었다.

VCD를 최대화하기 위해서, DOE 분석은 글루코스의 존재가 매우 유의미함(p 값 = 0.001)을 보였다. 이어서 만노스의 존재가 이어졌다. 또한, DOE 분석은 최소의 락테이트로 VCD를 최대화하기 위해서는 글루코스 및 만노스의 조합이 최적화되어야함을 보였다. 더욱이, 프럭토스 조합은 최저의 락테이트 축적 수준 및 보다 낮은 VCD를 보였다. 최저량의 글루코스(또는 글루코스 부재 또는 저 만노스/만노스 부재)를 갖는 배양물은 보다 많은 글루코스 및 특정량의 만노스를 갖는 경우에 비해 불량하게 수행되었다. 한편으로, 3.0 g/L의 글루코스 및 적어도 ≥1.5 g/L 만노스를 갖는 3개의 플라스크(3 글루코스/1.5 프럭토스/3 만노스, 3.0 글루코스/0.0 프럭토스/3.0 만노스 및 3.0 글루코스/3.0 프럭토스/3.0 만노스)는 글루코스의 느린 소비를 나타내었다.

우리는 배양물 중의 글루코스의 존재의 중요성 및 세포 배양 수명에서 만노스의 추가적인 이득을 발견하였기 때문에, DOE를 사용하여 상이한 글루코스/만노스 비를 선별하였다. 사용된 DOE 설계는 2개의 인자(글루코스 및 만노스) 및 4개의 수준(0.5, 1.5, 3.0 및 4.0 g/L)을 포함하였다. 세포 배양 4일까지, 우리는 추가로 1.5-3.0 g/L의 만노스와 함께 3.0 g/L의 글루코스를 갖는 플라스크가 대조용(단지 3.0 g/L 글루코스)에 비해 최고의 VCD(∼10-25% 증가 대 대조용) 및 연장된 세포 배양 수명을 나타냄을 관찰하였다. 3.0 g/L 글루코스 및 1.5 g/L 만노스를 갖는 플라스크는 약 3x10⁶ 세포/㎖의 VCD를 가졌으며, 이때 3.0 g/L 글루코스를 갖고 만노스는 없는 대조용 플라스크는 약 2.5x10⁶ 세포/㎖의 VCD를 가졌다.

실시예 14: 배양된 조류 세포로부터 제조된 닭껍질

본원의 교시에 따라 제조된 배양된 조류 세포를 사용하여 세포-배양 기반 닭껍질 제품을 제조하였다. 닭껍질 제품은 10%-60% 습윤 세포 페이스트, 80%-40% 수, 및 0.1.%-25% 전분, 변성 전분 또는 하이드로콜로이드를 혼합하여 제조되었다. 성분을 함께 혼합하고 65℃로 가열하여 전분을 경화시켰다. 이어서, 혼합물을 시트 상에 얇게 펴고 혼합물이 젤화될 때까지, 전형적으로 약 20분 동안 160℃-220℉에서 스티밍하였다. 젤화된 생산물을 회수하여 실온으로 냉각되도록 하였다. 냉각되고 젤화된 생산물을 조각으로 부수고 건조될 때까지 120℃-160℉에서 갈색화하여 세포-배양 기반 닭껍질 제품을 제조하였다. 전형적으로, 건조 시간은 4-12시간이었다.

세포-배양 기반 닭껍질 제품은 깊은 감칠맛 프로파일 및 농장 동물의 닭껍질의 식감을 가졌다. 맛 테스트에서, 일부 피실험자는 농장 닭의 껍질보다 세포 배양-기반 닭껍질 제품의 맛을 선호하였다.

상술한 구현예 및 실시예는 단지 예시적이며 비제한적인 것으로 의도된다. 당업자는 일상적인 실험을 사용하여, 특정 화합물, 물질 및 과정의 수많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 모든 균등물은 범위 내에 있는 것으로 간주되며 첨부된 청구범위에 포함된다.

참고문헌

Claims (60)

1. 시험관내에서 조류 섬유아세포 식품(avian fibroblast cell food)의 생산 방법으로서,
   a. 조류 섬유아세포를 유지할 수 있는 증식 배지(growth medium)에서 상기 조류 섬유아세포의 집단(population)을 시험관내에서 배양하는 단계;
   b. 상기 조류 섬유아세포를 회수하는 단계; 및
   c. 상기 회수된 조류 섬유아세포를 식용 식품으로 제형화하는
   단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   증식 배지가 적어도 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서,
   적어도 10% 소 태아 혈청을 갖는 배지에서 조류 섬유아세포의 집단을 증식시킨 다음, 상기 세포를 회수하기 전에 상기 배지를 2% 미만의 소 태아 혈청으로 감소시킴을 포함하는 방법.
4. 제3항에 있어서,
   소 태아 혈청을 세포 회수 전에 0%로 감소시키는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   프로테아솜, 스테로이드 생합성, 아미노산 분해, 아미노산 생합성, 약물 대사, 국소 접착(focal adhesion), 세포 주기, MAPK 신호전달(signaling), 글루타치온 대사, TGF-베타, 파고솜(phagosome), 테르페노이드 생합성, DNA 복제, 해당, 글루코스신생합성, 단백질 외수송(protein export), 부타노에이트 대사, 및 케톤체의 합성 및 분해로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포 신호전달 경로로부터의 적어도 하나의 유전자의 발현을 최적화하기 위해 증식 배지를 변형(modifying)시킴을 추가로 포함하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   세포 신호전달 경로의 유전자 발현을 위해 조류 섬유아세포를 생산하는 단계를 모니터링함을 추가로 포함하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   유전자 발현의 모니터링으로부터 획득된 데이터에 따라 각각의 세포 생산 단계에서 배지를 조절함을 추가로 포함하는 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   조류 섬유아세포의 집단이 실질적으로 순수한 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   하나 이상의 지질의 축적을 유도하기에 충분한 양으로 하나 이상의 화합물을 증식 배지에 가하거나 또는 증식 배지로부터 제거함으로써 조류 섬유아세포가 지질을 축적하도록 유도함을 추가로 포함하는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    증식 배지로부터 조류 섬유아세포를 분리시키거나 또는 생물반응기 또는 스캐폴드(scaffold)로부터 상기 세포를 제거함을 추가로 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서,
    조류 섬유아세포를 원심분리, 여과, 응집, 응고, 프레스, 및/또는 중력 또는 이들의 조합에 의해 분리시키는 방법.
12. 제10항에 있어서,
    여과 유형이 미세 또는 한외-여과 또는 이들의 조합인 방법.
13. 제10항에 있어서,
    조류 섬유아세포를 효소적으로 또는 기계적으로 분리시킴을 추가로 포함하는 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    배치(batch), 유가(fed-batch), 반연속(충전 및 회수), 연속, 또는 관류 배양 또는 이들의 일부 조합의 현탁 배양 시스템으로 발생하는 방법.
15. 제14항에 있어서,
    현탁 배양이 0.25x 10⁶ 세포.㎖, 0.5x10⁶ 세포/㎖ 및 1.0x 10⁶ 세포/㎖, 1.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 2.0x 10⁶ 세포/㎖, 2.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 3.0x 10⁶ 세포/㎖, 3.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 4.0x 10⁶ 세포/㎖, 4.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 5.0x 10⁶ 세포/㎖, 5.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 6.0x 10⁶ 세포/㎖, 6.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 7.0x 10⁶ 세포/㎖, 7.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 8.0x 10⁶ 세포/㎖, 8.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 9.0 X 10⁶ 세포/㎖, 9.0x 10⁶ 세포/㎖ 내지 10x 10⁶ 세포/㎖, 10x 10⁶ 세포/㎖ 내지 15.0x X 10⁶ 세포/㎖, 15x X 10⁶ 세포/㎖ 내지 20x X 10⁶ 세포/㎖, 20x X 10⁶ 세포/㎖ 내지 25x10⁶ 세포/㎖, 25x 10⁶ 세포/㎖ 내지 30x 10⁶ 세포/㎖, 30 X 10⁶ 세포/㎖ 내지 35x 10⁶ 세포/㎖, 35x 10⁶ 세포/㎖ 내지 40x 10⁶ 세포/㎖, 40x 10⁶ 세포/㎖ 내지 45 x10⁶ 세포/㎖, 45x 10⁶ 세포/㎖ 내지 50x 10⁶ 세포/㎖, 50x 10⁶ 세포/㎖ 내지 55x 10⁶ 세포/㎖, 55x 10⁶ 세포/㎖ 내지 60x 10⁶ 세포/㎖, 60x 10⁶ 세포/㎖ 내지 65x 10⁶ 세포/㎖, 70x 10⁶ 세포/㎖ 내지 75x 10⁶ 세포/㎖, 75x 10⁶ 세포/㎖ 내지 80x 10⁶ 세포/㎖, 85x 10⁶ 세포/㎖ 내지 90x 10⁶ 세포/㎖, 90x 10⁶ 세포/㎖ 내지 95x 10⁶ 세포/㎖, 95x 10⁶ 세포/㎖ 내지 100x 10⁶ 세포/㎖, 100x 10⁶ 세포/㎖ 내지 125x 10⁶ 세포/㎖, 또는 125x 10⁶ 세포/㎖ 내지 150x 10⁶ 세포/㎖의 세포 밀도를 달성하는 방법.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    현탁 배양 시스템을 적어도 500 리터(L), 1,000 L, 2,000 L, 2,500 L, 5,000 L, 10,000 L, 25,000 L, 50,000 L, 100,000 L, 200,000 L, 또는 500,000 L인 용기(vessel)에서 수행할 수 있는 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    임의의 배양 조건에서, 조류 섬유아세포의 유지, 증식, 분화, 지질 축적, 지질 함량, 정제 및/또는 수확 효율, 증식률, 세포 밀도, 세포 중량, 내오염성, 조류 섬유아세포-특이적 유전자 발현 및/또는 단백질 분비, 전단 감도(shear sensitivity), 풍미, 질감(texture), 색상, 냄새, 향, 미각 품질, 영양 품질, 성장 억제 부산물 분비 최소화, 및/또는 배지 요구 최소화 중 하나 이상을 성장인자, 지방산, 단백질, 원소, 소분자, 유도 진화, 유전 공학, 배지 조성, 생물반응기 설계, 및/또는 스캐폴드 설계 중 하나 이상에 의해 개선시킴을 추가로 포함하는 방법.
18. 제17항에 있어서,
    지방산이 스테아리돈산 및 리놀렌산을 포함하는 방법.
19. 제17항에 있어서,
    성장인자가 인슐린 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 및 표피 성장인자를 포함하는 방법.
20. 제17항에 있어서,
    단백질이 트랜스페린을 포함하는 방법.
21. 제17항에 있어서,
    원소가 셀레늄을 포함하는 방법.
22. 제17항에 있어서,
    소분자가 에탄올아민을 포함하는 방법.
23. 제17항에 있어서,
    소분자가 락테이트 데하이드로게나제 억제제인 방법.
24. 제23항에 있어서,
    락테이트 데하이드로게나제 억제제가 옥사메이트, 갈로플라빈, 고시폴(gossypol), 퀴놀린 3-둘폰아미드, N-하이드록시인돌-계 억제제, 및 FX11로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
25. 제24항에 있어서,
    락테이트 데하이드로게나제 억제제가 옥사메이트인 방법.
26. 제25항에 있어서,
    증식 배지 중의 옥사메이트의 농도가 1-500mM, 1-400mM, 1-300mM, 1-250mM, 1-200mM, 1-175mM, 1-150mM, 1-100mM, 1-50mM, 및 1-25mM로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    증식 배지가 글루코스 및 만노스로 이루어진 그룹 중에서 선택된 당을 포함하는 방법.
28. 제27항에 있어서,
    증식 배지가 글루코스 또는 만노스를 포함하는 방법.
29. 제27항에 있어서,
    증식 배지 중의 글루코스 및/또는 만노스의 양이 1-10 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-7 g/L, 1-6 g/L, 1-5 g/L, 1-4 g/L, 1-3 g/L, 1-2 g/L인 방법.
30. 제27항에 있어서,
    증식 배지 중의 글루코스의 양이 1-10 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-7 g/L, 1-6 g/L, 1-5 g/L, 1-4 g/L, 1-3 g/L, 1-2 g/L이고, 증식 배지 중의 만노스의 양이 1-10 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-9 g/L, 1-8 g/L, 1-7 g/L, 1-6 g/L, 1-5 g/L, 1-4 g/L, 1-3 g/L, 1-2 g/L인 방법.
31. 제1항에 있어서,
    식용 식품이 세포 페이스트를 포함하고, 상기 세포 페이스트 함량이 중량 기준으로 적어도 90%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 50%, 또는 25%의 양이며, 상기 세포 페이스트 내용물이 시험관내에서 증식된 조류 섬유아세포로부터 제조되는 방법.
32. 제31항에 있어서,
    식용 식품이 녹두 단백질(mung bean protein)을 추가로 포함하고, 상기 녹두 단백질 함량이 적어도 5 중량%의 양인 방법.
33. 제31항에 있어서,
    식용 식품이 지방을 추가로 포함하고, 상기 지방 함량이 적어도 5 중량%의 양인 방법.
34. 제31항에 있어서,
    식용 식품이 수(water)를 추가로 포함하고, 상기 수 함량이 적어도 20 중량%인 방법.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    식품이 조류 너겟(nugget), 조류 텐더(tender), 조류 가슴살, 조류 굴, 조류 발, 조류 날개, 조류 소시지, 조류 공급원료, 및 조류 껍질과 유사한 방법.
36. 제1항에 있어서,
    회수된 조류 섬유아세포를 식용 식품으로 제형화하는 단계가 식물 단백질 단리물(isolate)을 컨디셔닝된 수(conditioned water)에서 수화시켜 수화된 식물 단백질을 생산함을 추가로 포함하는 방법.
37. 제36항에 있어서,
    회수된 조류 섬유아세포를 식용 식품으로 제형화하는 단계가 세포 페이스트를 수화된 식물 단백질에 첨가함을 추가로 포함하는 방법.
38. 제1항에 있어서,
    회수된 조류 섬유아세포를 식용 식품으로 제형화하는 단계가
    a. 포스페이트로 수를 컨디셔닝하여 컨디셔닝된 수를 제조하고;
    b. 식물 단백질 단리물을 상기 컨디셔닝된 수로 수화시켜 수화된 식물 단백질을 생산하고;
    c. 세포 페이스트 및 수화된 식물 단백질을 접촉시켜 세포 및 단백질 혼합물을 생산하고;
    d. 상기 세포 및 단백질 혼합물을 수 개의 단계로 가열하고, 상기 단계가 하기 중 적어도 하나를 포함하며:
    i. 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 40-65℃의 온도로 상승시키고;
    ii. 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 적어도 15분간 40-65℃의 온도 에서 유지시키고;
    iii. 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 60-85℃의 온도로 상승시켜 사 전-조리 제품을 제조하고;
    iv. 임의로, 상기 세포 및 단백질 혼합물을 5-15℃의 온도로 냉각시켜 사 전-조리 제품을 제조함;
    e. 임의로, 상기 단계 (i), (ii), (iii), (iv)에서, 또는 사전-조리 제품에 오일을 첨가하고;
    f. 임의로, 상기 사전-조리 제품을 조리하여 조류 식품을 제조함
    을 추가로 포함하는 방법.
39. 제38항에 있어서,
    식물 단백질 단리물이 콩류(pulse) 단백질 단리물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
40. 제39항에 있어서,
    콩류 단백질 단리물이 녹두 단백질 단리물인 방법.
41. 제40항에 있어서,
    회수된 조류 섬유아세포를 식용 식품으로 제형화하는 단계가 세포 및 단백질 혼합물을 수 개의 단계로 가열함을 추가로 포함하고, 상기 단계가 하기 중 적어도 하나를 포함하는 방법:
    a. 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 40-65℃의 온도로 상승시키고;
    b. 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 적어도 15분간 유지시키고;
    c. 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 60-85℃의 온도로 상승시킴.
42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (i)이 세포 및 단백질 혼합물에 시즈닝(seasoning)을 첨가함을 추가로 포함하는 방법.
43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)가 펩티드 가교결합 효소를 첨가함을 추가로 포함하는 방법.
44. 제43항에 있어서,
    가교결합 효소가 트랜스글루타미나제, 솔타제(sortase), 서브틸리신, 티로시나제, 락카제, 퍼옥시다제 및 라이실 옥시다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
45. 제44항에 있어서,
    트랜스글루타미나제를 중량 기준으로 0.0001%-0.025%, 0.0001%-0.020%, 0.0001%-0.0175%, 0.0001%-0.0150%, 0.0001%-0.0125%, 0.0001%-0.01%, 0.0001%-0.0075%, 0.0001%-0.005%, 0.0001%-0.0025%, 0.0001%-0.002%, 0.0001%-0.0015%, 0.0001%-0.001%, 0.0001%-0.00015%의 농도로 첨가하는 방법.
46. 제38항에 있어서,
    단계 (iii)이 오일을 첨가함을 추가로 포함하는 방법.
47. 제1항에 있어서,
    회수된 조류 섬유아세포를 식용 식품으로 제형화하는 단계가 세포 및 단백질 혼합물을 5-10℃의 온도로 냉각시킴을 추가로 포함하는 방법.
48. 제1항에 있어서,
    회수된 조류 섬유아세포를 식용 식품으로 제형화하는 단계가 단계 (i), (ii), (iii) 또는 (iv)에서 오일을 첨가하여 사전-조리 제품을 생산함을 추가로 포함하는 방법.
49. 제48항에 있어서,
    하기 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 방법:
    a. 사전-조리 제품을 튀기고;
    b. 사전-조리 제품을 굽고;
    c. 사전-조리 제품을 그릴링(grilling)하고;
    d. 사전-조리 제품을 냉동시킴.
50. 시험관내에서 증식된 조류 섬유아세포로부터 제조된 소비용 조류 제품의 제조 방법으로서,
    a. 포스페이트로 수를 컨디셔닝하고;
    b. 콩류 단백질 단리물을 상기 컨디셔닝된 수로 수화시켜 수화된 콩류 단백질을 생산하고;
    c. 세포 페이스트를 상기 수화된 콩류 단백질에 첨가하여 세포 및 단백질 혼합물을 생산하고;
    d. 상기 세포 및 단백질 혼합물을 수 개의 단계로 가열하고, 상기 단계가 하기 중 적어도 하나를 포함하며:
    i. 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 40-65℃의 온도로 상승시키고;
    ii. 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 적어도 15분간 유지시키고;
    iii. 상기 세포 및 단백질 혼합물의 온도를 60-85℃의 온도로 상승시킴;
    e. 상기 세포 및 단백질 혼합물을 5-15℃의 온도로 냉각시키고;
    f. 상기 세포 및 단백질 혼합물에 오일을 첨가하여 사전-조리 제품을 생산하고;
    g. 상기 사전-조리 제품을 조리하여 식용 식품을 제조함
    을 포함하는 방법.
51. 제50항에 있어서,
    하기 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 방법:
    a. 사전-조리 제품을 튀기고;
    b. 사전-조리 제품을 굽고;
    c. 사전-조리 제품을 그릴링하고;
    d. 사전-조리 제품을 냉동시킴.
52. 제50항에 있어서,
    단계 (i)가 수에 시즈닝을 첨가함을 추가로 포함하는 방법.
53. 제50항에 있어서,
    단계 (ii)가 펩티드 가교결합 효소를 첨가함을 추가로 포함하는 방법.
54. 제53항에 있어서,
    펩티드 가교결합 효소가 트랜스글루타미나제, 솔타제, 서브틸리신, 티로시나제, 락카제, 퍼옥시다제 및 라이실 옥시다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
55. 제53항에 있어서,
    펩티드 가교결합 효소가 트랜스글루타미나제인 방법.
56. 제50항에 있어서,
    단계 (iii)이 오일을 첨가함을 추가로 포함하는 방법.
57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 1차 조류 섬유아세포를 포함하는 방법.
58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 2차 조류 섬유아세포를 포함하는 방법.
59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 식품.
60. a. 함량이 적어도 25 중량%의 양이고, 시험관내에서 증식된 조류 섬유아세포로부터 제조된 세포 페이스트;
    b. 함량이 적어도 15 중량의 양인 녹두 단백질;
    c. 함량이 적어도 1 중량%의 양인 지방; 및
    d. 함량이 적어도 20 중량%의 양인 수
    를 포함하는, 조류 섬유아세포로부터 생산된 식품.

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