KR20220094191A - 캡슐화 된 3d 세포 동시-배양에서 다수의 생물학적 과정을 독립적으로 분석하는 방법 - Google Patents

캡슐화 된 3d 세포 동시-배양에서 다수의 생물학적 과정을 독립적으로 분석하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중화 (multiplexed) 및 캡슐화된 (encapsulated) 3D 세포 동시-배양 (co-culture) 약물 테스트 또는 스크리닝 방법에 관련된다. 본 발명은 관심있는 하나 또는 그 이상의 약물이 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정에 대한 효과를 테스트하기에 적절한 시험관 내 약물 테스트 키트를 또한 공개한다.

Description

캡슐화 된 3D 세포 동시-배양에서 다수의 생물학적 과정을 독립적으로 분석하는 방법
본 발명은 다중 및 캡슐화 된3D 세포 동시-배양 약물 테스트 또는 스크리닝 방법에 관련된다. 본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정에 대한 하나 또는 그 이상의 관심있는 약물의 효과를 테스트하는데 적절한 시험관 내 약물 테스트 키트를 공개한다.
생물학적 세포에 대한 분자 본체 (molecular entities)의 시험관 내 스크리닝 또는 테스트는 새로운 약학적 물질의 발견, 및 또한 좀 더 최근에는, 환자를 치료하기 위한 최적의 약물(들)을 정의하기 위한 '정밀 의학 (precision medicine)' 테스트 동안에 사용되는 필수적인 과정을 구성한다. 시험관 내 분자 스크리닝은 약물 발견의 초기 단계에서 '히트 (hit)' 분자를 동정하기 위하여, 또는 이어지는 다음 단계에서, 다수의 선호적인 특성을 지닌 히트로서 정의된, 이 히트로부터 일련의 '리드(lead)' 항목을 정의하는데 둘 다 사용될 수 있다. 스크린 되는 많은 수의 화학물질 본체 (entity) 때문에, 시험관 내 약물 테스트는 시간 및 자원(resources)의 측면에서 매우 비쌀 수 있다. 이러한 커다란 투자에도 불구하고, 시험관 내 약물 스크리닝은, 여러 이유 때문에, 주로 사용되는 세포 배양의 임상적 상관성이 낮기 때문에, 바람직한 생물학적 효과를 가진 좋은 후보물질을 정의하는데 항상 성공적인 것은 아니다. 약물 스크리닝에서 사용되는 전형적인 단일 층(monolayer) 세포 배양은 3D 조직 생리, 세포 서부세트 (subset) 다양성, 또는 생체 내에서 일어나는 다-기관 상호작용을 반영하지 않는다. 추가로, 약물 스크리닝은 보통 테스트 당 단일 실험적 결과 (single experimental readout), 또는 최대로 두 번의 결과를 사용하여 수행된다. 그러므로,가장 좋은 전반적인 약물 개발 프로파일을 가진 약물을 동정하기 위하여 그 분자의 여러 다른 성질에 초점을 둔 여러 차례의 스크리닝이 요구된다. 예를 들어, 약물 스크리닝은 보통 타겟 세포에 대한 생물학적 활성의 평가로 시작하고 및 그 후, 간 세포 존재 하에서만 만들어지는 대사물질을 포함하는, 간 독성 또는 신경 독성을 동정하기 위한 추가의 스크리닝 라운드(round)가 이어진다. 더 나아가, 생체 내에서는 중요한 생리적 상호작용이 존재한다, 예를 들어, 타목시펜 (tamoxifen) 과 같은 전구 약물이 다른 조직에서, 유방에서 타목시펜, 활성화를 위해 간에 의해 대사된다. 주목할 만하게, 간세포는 흔히 원래의 약물 스크린에는 없으며, 또는 만약 있다면, 이는 생체내 세포 생물학을 반영하지 않는, 다른 세포 타입과 직접 접촉일 수 있다. 세포 사이에 이 중요한 생리적인 상호 작용을 포함하지 않는 것은 생체 내에서 효과적일 수 있는 치료제를 놓치게 할 수 있다. 그러므로, 잠재적인 약물 후보자의 여러 다른 특성 및 효과를 평가하기 위한 다수의 테스트가 필요하게 되는 결과가 되는, 현재의 약물 스크리닝 영역 (landscape) 에서의 문제는, 테스트 동안에 상기 언급된 세포 배양의 모든 현상을 동시에 해결할 수(address) 있는 방법이 부족하다는 것이다. 특히, 개선된 약물 스크리닝 또는 테스트 방법들은 평가 과정을 다수화 하고 및 좀 더 생리적으로 상관성이 있는 세포 배양 시스템을 사용할 수 있는 능력을 가질 수 있을 것이다.
타겟-기반한 약물 스크리닝 및 표현형적 약물 스크리닝 사이에 차이가 만들어 질 수 있다. 타겟-기반한 약물 스크리닝 접근 방법은 이전에 동정된 특별하고 및 자주 유일한 분자 경로(molecular pathway), 수용체, 또는 관심있는 세포에 대해 바람직한 생물학적 효과를 달성할 수 있는 타겟이 될 수 있는 다른 생물분자에 의존한다. 예를 들어, 유방-유래한-세포에서 (종양성) 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor)는 내분비 치료에 대한 실용적인 타겟인 것으로 나타났다. 에스트로겐 수용체에 대한 약물의 효과에 대한 시험관 내에서 검출 또는 연구를 쉽게 만들기 위하여 에스트로겐-의존성 수용체를 발현하도록 실험적인 세포주가 유전적으로 조작될 수 있다. 이에 반하여, 표현형 스크리닝은 정확한 분자 경로나 관심있는 세포에 대해 약물이 바람직한 생물학적 효과를 달성하기 위하여 작용해야 하는 세포 타겟에 대한 이전의 지식에 의존하지 않는다. 표현형적 스크리닝에서는, 세포 죽음, 세포 증식, 세포 독성, 및 면역 세포 활성화와 같은 일반적인 생물학적 과정을 잘-확립된 유전적 또는 단백질 마커를 사용하여 이들의 일반적인 표현형의 변화에 대해 검출될 수 있다. 표현형적 스크리닝을 사용하여 동정된 약물에 의하여 타겟이 되는 정확한 분자 파트너는, 이 특허의 범위를 벗어 난, 추가의 테스트가 수행될 때가지 알려지지 않고 남아있다.
시험관 내 약물 스크리닝 및 테스트를 증가시키기 위한 이전의 시도는 상기 언급된 문제를 부분적으로 해결하였을 뿐이고, 및 출원자가 아는 한, 상기 언급된 모든 문제가 동시에 다루어진 적이 없다. 예를 들어, EP 1 235 935 B1 (Rosetta Inpharmatics LLC)는, 세포의 적응(fitness)과 관련된 타겟 유전자의 기능을 억제하는 약물을 동정하기 위하여, 즉 타겟-기반한 (target-based) 약물 스크리닝을 위하여, '다중화된 (multiplexed)' (한 세포 당 다수) 유전자 리포터 세포 배양 시스템 (gene reporter cell culture systems)의 사용에 대해 서술하고 있다. 다른 타입의 세포를 동시-배양 (co-culture) 한 후에 다수의 유전자가 검출될 수 있으나, 그러나 이 서류에서의 가르침은 3D 구 세포 배양(3D spheroid cell cultures)에까지 연장되지는 않으며, 및 동시-배양된 세포의 다른 타입을 독립적으로 분석하는 능력은 가능하지 않다.
세포 상등액에서 많은 패널의 단백질들의 약물-유도된 조절을 조사하는 가능성을 보여주는, 다중화된 표현형 약물 테스트 (multiplexed phenotypic drug testing )가 이전에 또한 발행되었다 (PMID 20116850 참조). 다시한번, 이 약물 테스트 방법은 시스템의 생리학적 상관성을 증가시키기 위한 구 (spheroid)와 같은 3D 세포 배양의 사용을 포함하지 않는다. 추가로, 에세이 판독 (readout)이 용해성 단백질(들)로 구성되기 때문에 세포 내에서 생물학적 과정이 조절된 것을 검출하는 것은 가능하지 않다.
개선된 생리적인 상관성을 가진 세포 배양 시스템, 주목할 만하게, 3D 구 배양과 관련된 이전 기술 및 학술적인 발행물이 증가하고 있다. 예를 들어, EP 2 491 386 B1 (Plasticell Ltd)는, 캡슐 재료 내에 직접적으로 또는 캡슐 내부의 안에 각각 두 개 또는 그 이상의 라벨로 라벨 된, 다수의 마이크로캡슐 (microcapsules)에서 세포 배양을 서술하고 있다. 이 문서는 같은 타입이지만, 다양한 분화 상태에 있는 세포가 어떻게 서로 다른 표현형 또는 유전형 특성을, 예를 들어, 다른 증식 능력, 또는 특정한 유전자나 단백질의 발현을, 가질 수 있는지를 정의하는 것이 주 목적인 '스플릿-풀 세포 (split-pool cell)' 또는 '조합된 세포(combinatorial cell)' 배양을 또한 포함한다. 비슷하게, KR 101726063 B1 (UNIV SUNGKYUNKWAN RES & BUS [KR])는, 3D 종양 세포 배양을 캡슐화하기 위하여 사용되는, 다양한 형광 색소 (fluorochromes) 로, 리포좀 (liposomes) (캡슐과 같은 지질 이중 층)의 라벨링을 서술한다. 이 문서들은 캡슐을 라벨하기 위하여 다른 형광색소 ((양자 점 (quantum dots))를 사용할 수 있다는 점에서 현재의 기술과 비슷한 반면에, 리포좀은 종양의 유전적인 진단에 주로 사용되기 때문에 이들 중 아무것도 테스트 당 다수의 생물학적 과정을 검출하는 어떤 수단, 또는 현미경에 의해 여러 다양한 캡슐을 쉽게 구별하는 방법을 공개하지 않는다.
발명의 간단한 설명
본 발명은 시험관 내 약물 테스트를 개선하는 것을 목표로, 즉, 적어도 두 타입의 타겟 세포에서 바람직한 활성을 가지고, 최소의 유해한 부작용을 지닌 의료상 처치를 동정하기 위하여 새로운 또는 이전에 허가된 화학적 또는 생물학적 본체 (entity)를 스크리닝 하는 것을 목표로 한다. 이 개선에는 (1) 다-조직 개체 (multi-tissue organism)를 좀 더 잘 대표하는 다수의 세포 타입 동시-배양의 사용을 통하여, 중계 타당성 (translational relevance)을 증가시키는 것, (2) 생물학적 과정 또는 판독 (readout)의 수를 증가시키는 것은 물론 테스트에서 독립적으로 분석될 수 있는 다른 세포 타입의 수를 증가시켜, 테스트로부터 얻을 수 있는 정보의 양 및 질을 증가시키는 것, 및 (3) 더 좋은 약물 후보의 후보명단을 작성하는 동안에 모두 해당하는 특성인 생체 내 (in vivo)에서 수행되는데 요구되는 테스트 시간, 비용, 및 양을 감소시켜, 약물 테스트 효력을 증가시키는 것을 포함한다. 본 발명은 (1) 및 (2) 포인트에서 서술된 특성의 결과로 후속 생체 내 테스트 단계에서 좀 더 나은 신뢰성을 가지고 진행하도록, 후보 약물에 대해 개선된 선택을 하도록 한다.
본 발명의 목적 중의 하나는 하나 또는 그 이상의 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정을 분석할 수 있는 약물 테스트에 적합한 시험관 내 (in vitro) 방법을 제공하는 것이며, 그 방법에는:
a) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 상기 하나 또는 그 이상의 각 세포 타입에서, 분석될 각 생물학적 과정을 위한 적어도 하나의 형광 (fluorescent) 또는 생물발광 (bioluminescent) 리포터 유전자 발현;
b) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 언급된 하나 또는 그 이상의 각 세포 타입을 알기네이트 (alginate) 바이오폴리머로 캡슐화하고, 여기서 하나 이상의 세포 타입이 있는 경우, 해당하는 캡슐 모두, 또는 하나를 제외한 모두가, 각각 다른 타입의 형광물질로 라벨되고;
c) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 단계 b)의 캡슐화 된 모든 세포 타입은, 라벨 된 또는 라벨 되지 않은 알기네이트의 바이오폴리머로 선택적으로 캡슐화된 하나 또는 그 이상의 추가의 라벨 되지 않은 세포 타입과 함께, 동시-배양되고;
d) 선택적으로 상기 동시-배양액을 하나 또는 그 이상의 약물에 노출시키고;
e) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 단계 c)의 각 세포 타입에서 상기 다수의 생물학적 과정의 활성을,
상기 선택적인 하나 또는 그 이상의 테스트될 약물에 노출시키기 전 및/또는 후에 광학적 이미징을 통해 발광 또는 생물발광 리포터 유전자의 형광 또는 생물 발광 강도를 각각 분석하여, 측정하는 것을;
포함하고,
여기서 하나 이상의 세포 타입이 동시-배양될 때, 분석될 각 세포 타입은 분석될 상기 세포 타입을 함유하는 알기네이트 캡슐과 연관된 형광 라벨링의 타입에 기반을 두어 광학적 이미징을 통해 동정된다.
본 발명의 다른 목적은 관심 있는 하나 또는 그 이상의 약물의 효과를 하나 또는 그 이상 타겟 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정을 테스트하기에 적절한 시험관 내 약물 테스트 키트를 제공하는 것이며, 그 키트는:
상기 언급된 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입에서 분석될 생물학적 과정을 위한 형광 또는 생물발광 리포터 유전자를 발현하는 하나 또는 그 이상의 알기네이트-캡슐화된 타겟 세포 타입 (alginate-encapsulated target cell types)을 함유하는 적어도 하나의 사용 하기에 준비된(ready-to-use) 마이크로 웰 플레이트를 포함하며, 여기서 하나 이상의 세포 타입이 있는 경우에는, 해당하는 캡슐 모두, 또는 하나를 제외한 모두가 라벨 되며, 각각은 다른 타입의 형광물질로 라벨 된다.
본 발명의 다른 목적 및 유리한 점은, 다음의 예시적인 도면, 및 수반되는 청구항과 함께 참조하여 진행되는, 이어지는 상세한 설명의 검토로부터 이 분야 전문가에게는 분명해질 것이다
도 1: 간암세포 ((liver cancer (LC) cells)) ((간세포(hepatocyte))와 동시-배양된 (co-cultured) 유방암 세포 ((breast cancer (BC) cells))에서 타목시펜 (tamoxifen, Tam) 대비 타목시펜 대사물 ((4-하이드록시타목시펜 (4-hydroxytamoxifen; 4OHT))에 의한 에스트로겐 수용체 알파 (Estrogen Receptor alpha, ERα)의 약리학적 억제. 에스트로겐 수용체 알파 (ERα)의 조절 하에서 루시페라아제 (luciferase)를 안정적으로 발현하는 BC 세포를 LC 세포와 함께 또는 LC없이 배양시켰으며 및 이들을 증가되는 농도의 Tam 또는 이의 대사체 중 하나인, 4-OHT로 48시간 동안 처치하였다. BC 세포는 용해시키고 및 ERα 활성을 결정하기 위하여 생물발광 (bioluminescence)을 측정하였으며, 이는 BC 세포에서 친-암 활성(pro-cancer activity)의 판독으로서 간주될 수 있다. 그래프는 로그[억제제 농도]의 함수로서, 억제제 없는 ERα의 활성을 100%로 간주하고, ERα의 활성 퍼센트를 보여준다. 데이터는 3번의 독립적인 반복을 대표한다.
도 2: 동시-배양에서 두 개의 다른 세포 타입 (BC 및 LC)에서 두 세포 증식 상태의 정량. 이중 형광 리포터 유전자 FUCCI를 발현하기 위해 유전적으로 조작된3D 캡슐화된 BC 세포 및 LC 세포의 동시-배양의 증식. FUCCI 리포터를 안정적으로 발현하는 BC 세포 및 LC 세포 (증식하는 세포는 초록색, 증식하지 않는 세포는 적색)를 원-적색-라벨 된 알기네이트 캡슐 (far-red-labeled alginate capsules) (BC) 또는 라벨 되지 않은 알키네이트 캡슐 (LC)로 캡슐화 하였다. BC 동시-배양을 제조하기 위하여 BC캡슐을 LC 캡슐과 섞었으며 및 이들을 다른 농도의 태아 소 혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS)과 함께 96시간 동안 배양시켰다. 세포 및 캡슐의 형광 강도는 그 후 이미지엑스프레스 마이크로 공초점 현미경 (ImageXpress Micro Confocal microscope) (Molecular Devices)으로 측정되었으며, 및 메타엑스프레스 ((MetaXpress (Molecular Devices)) 소프트웨어로 가공되고 및 분석되었다. 그래프는 BC 세포 또는 LC 세포에 해당하는 리포터 유전자의 형광 강도(임의의 유닛)를 보여준다. 데이터는 3 번의 독립적인 반복 실험을 대표한다.
도 3: 캡슐화 된 LC 세포의 이중 리포터 유전자 FUCCI를 발현하는 캡슐화 된 BC 세포, 및 zipGFP-Casp3 리포터 유전자를 발현하는 zipGFP-Casp3와의 다중-배양 (multi-culture). LC 세포는 초록색-라벨된 알기네이트 캡슐로 캡슐화시키고, 이중 리포터 유전자 FUCCI ((활성적으로 증식하는 세포는 초록색, 증식하지 않는 세포 (잠복기) 세포)는 적색))를 발현하는 안정적인BC 세포는 라벨 되지 않은 알기네이트 캡슐에 캡슐화시키고, 및 zipGFP-Casp3 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 BC 세포 ((모든 세포는 적색(리포터 발현 대조군) 이며 및 세포사멸 유도시에는 초록색으로 된다))는 원-적색-라벨 된 알기네이트 캡슐에 캡슐화시켰다. 캡슐화된 세포는 밑에 커버 글라스 (cover glass)가 있는 96-웰 세포에서 함께 섞고 및 37°C에서 96시간 동안 배양시켰다. 이미지는 자동화된 공초점 현미경으로 수행하여 취득하였으며 및 이미지는 직접적으로 분석되었다.
도 4: BC 세포 단일 배양 (monoculture) 또는 LC 세포와 함께 다수 배양 (multi-culture) 에서 및 증가되는 농도의 타목시펜으로 처치된 BC 세포의 세포 사멸의 정량. LC 세포는 초록색-라벨 된 알기네이트 캡슐에 캡슐화시켰고, 이중 리포터 유전자 FUCCI ((활성적으로 증식하는 세포는 초록색이고, 증식하지 않는 세포 (잠복기 세포)는 적색이다))를 안정적으로 발현하는 BC 세포는 라벨 되지 않은 알기네이트 캡슐에 캡슐화시키고, 및 zipGFP-Casp3 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 BC 세포 ((모든 세포는 적색(리포터 발현 대조군) 이며 및 세포사멸 유도시에는 세포는 초록색으로 된다))는 원-적색-라벨 된 알기네이트 캡슐에 캡슐화시켰다. 캡슐화 된 세포는 밑에 커버 글라스가 있는 96-웰 플레이트에서 LC 세포와 함께 섞거나 (다수-배양) 또는 LC 세포 없이 (단일 배양) 섞고, 마이크로 몰 범위 (micromolar range) 의 증가하는 농도의 타목시펜 (Tamoxifen)으로 처치하거나 또는 처치하지 않고, 및 37°C에서 96시간 동안 배양시켰다. 이미지는 자동화된 공초점 현미경으로 수행하여 취득하였다. 세포 분할 및 세포 형광 강도의 정량은 메타엑스프레스 ((MetaXpress (Molecular Devices)) 소프트웨어로 수행되었다. 세포사멸의 정량을 위하여, 원-적색-라벨된 캡슐로부터의 세포 형광 강도가 측정되었으며 및 초록색 형광은 적색 형광으로 표준화하였다. 그래프는 증가되는 농도의 타목시펜으로 처치시 zipGFP-Casp3 리포터 유전자의 표준화된 형광 강도를 보여준다. 데이터는 3번의 독립적인 반복 실험을 대표한다.
도 5: 단일 배양 또는 LC 세포와 함께 다수-배양에서 및 증가하는 농도의 타목시펜으로 처치된 BC 세포 증식의 정량. LC 세포는 초록색-라벨된 알기네이트 캡슐에 캡슐화시켰고, 이중 리포터 유전자 FUCCI ((활성적으로 증식하는 세포는 초록색이고, 증식하지 않는 세포 (잠복기 세포)는 적색이다))를 안정적으로 발현하는 BC 세포는 라벨 되지 않은 알기네이트 캡슐에 캡슐화시키고, 및 zipGFP-Casp3 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 BC 세포 ((모든 세포는 적색 (리포터 발현 대조군) 이며 및 세포사멸 유도시에는 세포는 초록색으로 된다))는 원-적색-라벨 된 알기네이트 캡슐에 캡슐화시켰다. 캡슐화된 세포는 밑에 커버 글라스가 있는 96-웰 플레이트에서 LC 세포와 함께 섞거나 (다수-배양) 또는 LC 세포 없이 (단일 배양) 섞고, 마이크로 몰 범위 (micromolar range) 의 증가하는 농도의 타목시펜 (Tamoxifen)으로 처치하거나 또는 처치하지 않고, 및 37°C에서 96시간 동안 배양시켰다. 이미지는 자동화된 공초점 현미경으로 수행하여 취득하였다. 세포 분할 및 세포 형광 강도의 정량은 메타엑스프레스 ((MetaXpress (Molecular Devices)) 소프트웨어로 수행되었다. 세포 증식의 정량을 위하여, 라벨되지 않은 캡슐로부터의 세포 형광 강도가 측정되었다. 그래프는 증가하는 농도의 타목시펜으로 처치시 FUCCI 이중-리포터 유전자의 형광 강도(임의의 유닛)를 보여준다. 데이터는 3번의 독립적인 반복 실험을 대표한다.
출원인이 아는 한, 다중 약물 테스트 방법 (multiplexed drug testing methods) 은 확실한 생체 내 조직 구조를 모의하는 (simulate) 3D 구 배양 (3D spheroid cultures)과는 조합되지는 않았으며, 인간 신체와 같은 생물학적 시스템의 다중-기관 성질을 모사 할 목적인 동시-배양과도 조합하지 않았다. 뜻밖에도, 다양한 세포 배양 약물 테스트 방법을 조합하는 것은, 현재의 세포 배양 약물 테스트의 주요 한계 하나 또는 두 개만을 단지 다루는 어느 방법에서도 존재하지 않은, 유일한 장점을 제공하고, 그 상세한 것은 하기에 있다.
생물학적 과정의 다중 검출, 및 다른 세포 타입의 물리적 분리를 조합하는 약물 테스트 방법 술의 장점에는 실험 비용, 노동력, 및 시간에 대해 분명한 단순한 경제적인 측정이 포함한다. 이는 추가로 현재의 기술에 고유한 명확하지 않은 과학적인 개념적 발전을 포함한다. 여기에는 뚜렷한 인간 기관으로부터의 세포에 대한 잠재적으로 다른 효과를 가진 약물을 동정하는 능력을 포함한다. 예를 들어, 간세포-대사되는 약물은 극도로 강력한 항-암성 증식 효과를 가질 수 있으며 및 그럼에도 아주 낮은 농도에서 폐 세포에 높은 독성을 보이는 것은 물론, 면역 세포로부터 예상하지 않은 염증 반응을 유도한다. 그러므로 다른 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정의 조절을 동시에 검출하는 능력은 약물 활성에 대한 비할데 없는 고-함량 스크리닝(high-content screening of drug activity) 을 하도록 한다. 그러므로 본 발명은 생물학적 과정의 동시 평가 없이 달리 다음의 개발 과정으로 진행될 약물 후보자를 적게 선택하는 것이 가능하기 때문에 이전의 기술에 비해 특유한 장점을 제공한다. 현재 기술의 추가의 호의적인 특징은, 관심 있는 타겟 세포에서 강력한 생물학적 활성, 및 필수 기관으로부터의 세포에는 낮은 독성 또는 낮은 염증과 같은 다수의 바람직한 특성이 있는 약물을 동정하는 것이, 좀 더 효과적으로, 가능하다는 것이다.
박테리아 또는 간세포가 대부분의 다른 세포 타입과의 직접적인 접촉하는 것을 방지하기 위하여 세포를 캡슐화하는 것은 또한 유리하다 왜냐하면 이 세포들은 정상적으로 생체 내에서 대부분의 다른 세포와 직접적인 접촉을 하지 않기 때문이다. 예를 들어, 간세포는 자주 순환하는 약물을 대사한다. 그러나 이 세포들은 신경 세포(뉴론) 또는 폐 세포 등과 직접적인 접촉을 하지 않는다. 이전에 서술한 대로, 대부분의 다른 세포 배양 시스템은 다른 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정을 별도로 분석하는 수단을 포함하지 않으며, 및 현 기술은 그러므로 약물 스크린에서 테스트 된, 화학적 본체 (chemical entities)의, 전체 생물학적 시스템을 좀 더 잘 개괄할 목적의 다양한 조직으로부터의 세포에 대한, 효과를 검출하기 위한 특유의 위치를 차지한다.
여기서 서술된 것과 비슷하거나 또는 같은 방법 및 재료가 본 발명을 실행하거나 또는 테스트하는 데 사용될 수 있다하더라도, 적절한 방법 또는 재료가 아래에 서술된다. 여기서 언급된 모든 발행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고 문헌은 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합되었다. 여기서 논의된 발행물 및 출원은 본 출원의 출원 날짜 이전에 이들의 공개를 위해서만 제공된다. 본 발명이 이전의 발명에 의해 그러한 발행물보다 선행된다고 하지는 않는 것으로 여기서 간주하지 않는다. 추가로, 재료, 방법, 및 실시 예들은 단지 예시적이며 및 제한하려는 것은 아니다.
상충 되는 경우, 정의를 포함한 본 설명은 조절될 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 여기 주제에 속하는 기술 분야의 전문가에 의해 보통 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 여기서 사용된 대로, 하기의 정의는 본 발명의 이해를 촉진하기 위하여 제공된다.
설명서 및 청구항에서 사용된 대로, 단수형 "a", "an" 및 "the 는 문맥에서 달리 명확하게 구술하지 않는 한 복수 대상도 포함한다,
"포함하다(comprise)" 라는 용어는 일반적으로 포함(include)이라는 의미에서 사용된다, 즉, 하나 또는 그 이상의 특징 또는 성분의 존재를 허락하는 것을 말한다.
여기서 사용된 대로 "개체 (subject)" 또는 "환자(patient)" 라는 용어는 이 분야 기술에서 잘-인식되어 있으며, 및 여기서 개, 고양아, 쥐, 생쥐, 원숭이, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 낙타 및 가장 바람직하게, 사람을 포함하는 포유류를 언급하기 위하여 서로 교환적으로 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 개체는 치료를 필요로 하는 개체이거나 또는 질병 또는 장애를 가진 개체이다. 그러나, 다른 실시 예에서, 개체는 정상 개체가 될 수 있다. 이 용어는 특별한 나이 또는 성 (sex) 을 의미하지 않는다. 그러므로, 성인 및 신생아 개체, 남성이든 또는 여성이든, 를 포함하려는 의도이다.
"다중화 (Multiplexed)" 라는 용어는 관련된 화학적 또는 생물학적 표지 (tags)를 통한 것에 기반을 둔 다수의 생물학적 과정을 동시에 검출할 수 있는 약물 테스트하는 것을 의미한다.
"구 (spheroid)" 이라는 용어는 대략 구(sphere) 모양의 세포의 3D 집합체를 의미한다.
"간세포 (hepatocyte)" 란 용어는 임의의 어느 일차 간세포 (primary hepatocytes) 또는 건강한 또는 형질전환 된 간세포로부터 유래한 임의의 어느 세포주를 의미하며 및 예를 들어 간암 (liver cancer, LC) 세포주를 포함한다.
"캡슐 (Capsule)" 은 미세유체공학 장치 (microfluidics device) 를 통해 생산되는 폴리머 시트 (polymeric sheet) 또는 층(layer)의 의미하며, 전형적으로 본 발명에서 세포를 캡슐로 싸거나 또는 감싸기 위하여 사용되는 알기네이트를 포함한다. 이 분야 기술에서 캡슐은 세포 유닛을 에워싸는 보호적인 장벽이다. 이 용어는 이 분야 기술에서 반-투과성 또는 투과 불가능한 구조를 의미하기 위하여 보통 사용된다; 본 발명의 문맥에서, 마이크로캡슐 (microcapsule)은 반-투과성이고 및 성장 배지 성분 및 다른 시약의 통과는 허용하나, 세포 유닛의 동정을 하도록 하기 위하여 라벨 및 태그(tag) 는 유지한다.
미세 캡슐화 (Microencapsulation), 또는 캡슐화 (encapsulation) 는 세포 유닛을 마이크로캡슐에 에워싸는 것을 의미한다.
여기서 사용된 대로, "배양 조건 (culture conditions)" 이란 용어는 언급된 세포의 성장 또는 분화를 촉진하기 위하여 세포가 놓인 또는 노출된 환경을 의미한다. 그러므로 이 용어는 세포의 성장 및/또는 분화에 영향을 줄 수 있는 배지, 온도, 대기 조건, 기질, 교반 조건 및 이외 유사한 것을 의미한다. 좀 더 특별하게, 이 용어는 배양 배지에 병합될 수 있고 및 세포의 성장 및/또는 분화에 영향을 줄 수 있는 특별한 제제를 의미한다. 여기에는 일차 세포, 세포주, 또는 미생물의 배양 후 상등액 또는 용해액, 또는 살아있는 개체로부터 유래한 생물학적 액체 또는 추출물을 포함한다.
여기서 언급된 대로 "세포 (cell)" 는 독립적인 기능을 할 수 있는 개체의 가장 작은 구조적인 유닛, 또는 모두 반-투과성 세포막 또는 세포벽에 의해 둘러싸인 하나 또는 그 이상의 핵, 세포질, 및 다양한 소기관으로 구성된, 단일-세포 개체로 정의한다. 세포는 비진핵 세포, 진핵 세포, 동물 또는 식물, 또는 원시세균 (archaebacterial) 이 될 수 있다. 예를 들어, 세포는 진핵 세포일 수 있다. 세포는 자연적이거나 또는, 바람직한 성질을 달성하기 위하여 유전적으로 조작되거나 또는 계대 배양에 의한 것과 같은, 수정된 세포 일 수 있다. 줄기세포는 하기에 좀 더 상세하게 정의 되었으며, 및 하나 이상의 분화된 세포 타입을 생산할 수 있는 능력이 있는 전분화 (totipotent), 다분화능 (pluripotent) 또는 다능성 (multipotent) 세포로 정의된다. 줄기세포는 시험관 내에서 분화되어 분화된 세포를 생산할 수 있으며, 이는 그 자체가 다분화능이 있거나, 또는 최종적으로 분화될 수 있다. 시험관 내에서 분화된 세포는 세포 분화를 촉진하는 하나 또는 그 이상의 제제에 줄기세포를 노출시켜 인공적으로 창조된 세포이다.
"세포 (cell)" 라는 용어는 일반적이고 및 넓은 문맥상에서 사용되고 및 세포는 세포주이거나, 개체 또는 인간, 또는 빅테리아, 곰팡이, 또는 식물 세포로부터의 일차 세포로서 정의한다. 캡슐화된 세포에 가해지는 특별한 압력의 힘 또는 3D조직 같은 구조의 형성과 같은, 캡슐화된 세포 배양의 성질은 달리 시험관 내에서는 달성하기에 도전적인 세포 분화 또는 성장에 호의적일 수 있다. 예를 들어, 캡슐화는 다기능 신경 줄기세포 또는 연골세포 (chondrocytes) 의 확장을 강화하게 하며, 및 간세포의 장기간 유지를 촉진하고, 그러므로 제안된 약물 테스트 방법에 추가의 중계 상관성(translational relevance)을 제공한다.
세포 유닛 (또는 세포)의 "그룹(group)"은 서로 연결되어 있지 않은 그러한 유닛의 복수이다. 예를 들어, 한 세포 유닛은 세포의 그룹이 아니고, 하나의 단일 유닛 (single unit)에 함께 클러스터 되어 있는 하나 또는 그 이상의 세포이다. 단일 세포 (single cell), 및 개별 세포 유닛 (individualcell unit)은 세포 그룹 또는 세포 유닛 (cell unit)을 형성하기 위하여 함께 모을 (pool) 수 있다. 그룹들은, 그룹을 두 개 또는 그 이상의 그룹의 세포 또는 세포 유닛으로 나누어, 쪼개질 수 있다.
"약물 테스트 (drug testing)" 란 용어는 약물 스크리닝을 포함하는 포괄적인 용어이다. 본 발명에 따르면, 약물 테스트는 바람직한 생물학적 효과를 가진 새로운 화학적 개체 (chemical entities) 를 동정하기 위하여 분자 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다, 그러나 어느 약물 또는 약물의 조합이 환자에게 가장 적합한가를 동정하기 위하여, 또는 새로운 또는 이전에 동정 된 약물의 기전 또는 타겟-이외의 효과를 규명하기 위하여 알려진 또는 이전에 허가된 약물을 시험관 내에서 테스트하는 것을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 목적 중의 하나는 다른 생물학적 과정, 예를 들어, 세포 증식, 세포 독성, 종양 성장 또는 억제, 면역 세포 활성, 염증성 반응, 항생제 저항성, 약물 협동작용, 을 약물 테스트를 위한 테스트 화합물을 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 3D 세포 동시-배양에서 하나 또는 그 이상 타입의 세포에서 검출하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은 앞서 언급된 생물학적 과정에 해당하는 형광 리포터 유전자를 함유하도록 유전적으로 조작된 캡슐화된 세포주를 사용하며, 및 각 리포터 유전자에 대하여 다른 형광색을 사용하기 때문에 이들 생물학적 과정의 크기의 결과는 개별적으로 분석될 수 있다. 생물학적 활성은 다른 세포 타입을 다른 형광 화합물에 커플 된 알기네이트에 캡슐화시킴으로써 다른 세포 타입 사이에서 또한 구별될 수 있다. 그 방법은, (1) 다른 세포 주를 병합시킴으로써, 예를 들어, 약물을 대사시킬 수 있는 간세포를 유방암 세포와 함께 세포 약물 타겟으로서 사용함으로써, (2) 단일-테스트에서 다수의 생물학적 결과에 대한 동시 정보를 제공함으로써- 주목할만하게, 간 또는 다른 세포에 대한 독성, 및/또는 항-종양 활성 또는 약물 효력의 다른 계량에 대한 정보, 및 (3) 약물의 효력에 대하여 테스트할 때 추가의 생리적 상관성을 제공할, 타겟 세포의 3D 세포 배양을 사용함으로써, 약물 스크리닝 에세이를 개선하는 것을 목표로 한다.
"라벨 (label)" 또는 "태그(tag)"는, 여기서 사용된 대로, 세포 유닛을 동정하기 위한 및/또는 세포 유닛이 노출된, 배양 조건, 또는 일련의 배양 조건을 결정하기 위한 한 수단이다. 그러므로 라벨은, 각각 특정한 배양 단계에서 첨가되는 한 그룹의 라벨일 수 있거나; 또는 세포 유닛이 노출되는 배양 단계에 따라 추적되거나 또는 수정되는 실험 또는 시작시 첨가되는 라벨; 또는 사용된 배양 단계를 추론하게 하는, 단순히 위치적인 참조일수 있다. 라벨 또는 태그는 어느 한 시점에서 세포 유닛의 위치 또는 정체를 보고하거나 또는 기록하거나, 또는 세포 유닛에 유일한 식별자로 지정하는 장치일 수도 또한 있다. 라벨 또는 태그의 예는, 유일한 서열, 구조 또는 질량의 분자; 또는 형광 분자 (fluorescent molecules) 또는 비드 (bead)와 같은 물체; 또는 라디오주파수 (radiofrequency) 및 다른 응답기 (transponders); 또는 유일한 표시 또는 모양을 가진 물체이다. 서로 다른 형광 색소들 (fluorochromes) 은 이들의 광 방출 스펙트럼 (light emission spectra) 이 겹칠 수 있기 때문에, 서로 다른 태그의 선택은 다른 형광 색소 사이에 형광 겹침이 최소가 되도록 또는 없도록 수행되어야 하거나, 또는 염색 대조군 샘플을 사용하여 측정이 보완되도록 수행되어, 이미징 결과의 해석이 절충되지 않도록 수행되어야 한다.
"동정하는 라벨 (identifying label)" 은 이것이 부착되는 세포 유닛의 성질이 결정되도록 하는 라벨이다. 이는 각 노출에 동정하는 라벨을 첨가함으로써, 기록될 다른 배양 조건에 세포 유닛을 노출하게 하고, 및 이어서 라벨의 분석에 의해 여러 피크로 분리된다.
세포가 배지와 접촉되게 놓이거나, 또는 세포의 성장, 분화 또는 대사 상태와 같은 하나 또는 그 이상의 세포 과정 (들) 에 영향을 주는 컨디션 하에서 자랐을 때 세포는 "배양 컨디션에 노출되었다 (exposed to culture conditions)".
그러므로 만약 배양 컨디션이 배지에서 세포의 배양을 포함하면, 그 세포는 한 효과를 갖기 위한 충분한 시간 기간 동안 배지에 놓인다. 그와 비슷하게, 만약 컨디션이 온도 컨디션이면, 세포는 바람직한 온도에서 배양된다. 세포유닛 하나 또는 그 이상 그룹의 "풀링 (poolimg)" 은 단일 그룹 (single group)을 형성하기 위하여 그룹들의 혼합이 관련되거나 또는 하나 이상의 백그라운드를 가진, 즉, 하나 이상의 다른 세트의 배양 컨디션에 노출된 세포 유닛을 포함하는 풀 (pool) 이다. 풀(pool) 은 추가로, 무작위로 또는 무작위가 아니게, 그룹으로 세분화될 수 있다; 그러한 그룹은 그 자체는 본 목적에서는 "풀"이 아니나 , 그러나 그 자체는 조합, 예를 들어 다른 세트의 배양 컨디션에 노출된 후에, "풀"이 될 수 있다.
"세포 성장 (Cell growth)" 및 "세포 증식(cell proliferation)"은 여기서는 다른 세포 타입 또는 계통으로 분화됨이 없이 세포의 수가 증식하는 것을 표시하기 위하여 서로 교환적으로 사용된다. 다른 말로, 이 용어는 살아 있는 세포 수의 증가를 나타낸다. 바람직하게 증식은 인식할 만한 표현형 또는 유전자형의 변화를 수반하지 않는다.
"세포 분화 (Cell differentiation)" 는, 한 세포 타입으로부터, 다른 세포 타입으로의 발달이다. 예를 들어, 이능성(bipotent), 다분화능성(pluripotent) 또는 전능성(totipotent) 세포는 신경세포로 분화될 수 있다. 분화는 증식을 수반할 수 있거나, 또는 이와는 독립적일 수 있다. '분화 (differentiation)' 라는 용어는 일반적으로 발생적으로 덜 정의된 세포 타입, 예를 들어, 신경 세포 또는 림프구, 으로부터 성숙된 세포 타입으로의 표현형을 획득하는 것을 의미하며, 그러나 전환-분화 (trans-differentiation)를 배제하지 않으며, 여기서는 하나의 성숙된 세포 타입은 다른 성숙된 세포 타입, 예를 들어, 신경세포에서 림프구로, 또는 단핵구에서 대식세포로, 전환될 수 있다.
"복수(plurality)"라는 용어는 하나 이상을 의미한다. 라벨의 문맥에서, 각 캡슐화는 적어도 하나 더의 라벨이 첨가되도록 하여, 다수적으로-캡슐화된 세포 유닛은 캡슐화 당 적어도 하나의 라벨로 라벨 되게 할 수 있다는 사실을 서술한다. 마이크로캡슐 내의 세포 유닛의 문맥에서, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개 또는 그 이상의 세포 유닛은 단일 마이크로-캡슐 (single micro-capsule) 에 포함될 수 있다.
"표현형 스크리닝 (phenotypic screening)" 이라는 용어는 세포 또는 개체의 표현형을 바람직한 방식으로 바꾸는 소 분자, 펩티드, 항체 또는 RNAi　와 같은 물질을 동정하기 위하여 생물학적 연구 및 약물 발견에서 사용되는 타입의 스크리닝을 의미한다.
생물학적 과정의 활성을 측정하기 위하여 형광 시약이 보통 생명 과학 연구실에서 사용된다. 예를 들어, 형광 시약 DiOC6 및 프로피듐 아이오다이드 (propidium iodide)의 조합은 세포 집단에서 살아 있는 세포 (초록 형광) 및 죽은 세포 (적색 형광)의 검출 및 정량을 하도록 한다. 디하이드로에티디움(Dihydroethidium) 은 세포에서 활성 산소 종의 생산을 측정하기 위한 형광 탐침 (probe)으로, 산화된 후에 세포에서 적색이 되어 세포 스트레스의 표시자이다. 쿠마린 보로네이트 (Coumarin boronate) 또는 풀루오레신 보로네이트 (fluorescein-boronate)는, 각각 파란색 및 초록색 형광을 방출하여, 염증을 비롯한 많은 생리적 과정에 관련되는, 세포로의 산화 질소 (nitric oxides)의 생산을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. Fura-2는 신호전달 경로를 자극할 때 변동되는 세포 내 칼슘의 농도를 측정하기 위한 형광 탐침이다.
본 발명에서 그러한 시약의 병합은 분석될 수 있는 생물학적 활성의 스펙트럼을 확장하는 것을 도와준다. 그러나, 리포터 유전자 대신에, 형광 시약은 한 세포 집단의 모든 세포에서 생물학적 활성을 차별 없이 보고한다. 정말로, 형광 시약은 세포 배양 배지에 첨가된 후에 자유롭게 확산 되는 용해성 분자이고, 그러므로 모든 세포를 염색한다. 형광 시약은, 때로는 리포터 유전자가 존재하지 않을 수 있는, 추가의 생물학적 활성을 측정하기 위하여 형광 (fluorescent) 또는 생물 발광 (bioluminescent) 리포터 유전자와 조합으로 사용될 수 있다. 그렇게 하기 위하여, 형광 리포터 유전자 활성은 첫 번째로 측정되어야 한다 왜냐하면 이들이 발현되는 세포 타입에서 생물학적 활성을 특별히 보고하기 때문이다. 형광 시약의 첨가는 그 후 모든 세포를 염색하기 위하여 수행될 수 있다. 캡슐의 색은 시약의 형광을 별도로 측정하기 위하여 그래도 사용될 수 있으며, 및 그러므로 세포 동시-배양에서 특이한 캡슐화된 세포 타입에서, 관련된 생물학적 활성을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 형광 스펙트럼이 겹치지 않을 때까지 몇 개의 형광 시약이 동시에 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 목적 중의 하나는 하나 또는 그 이상의 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정을 분석할 수 있는 약물 테스트를 위한 시험관 내 (in vitro) 방법을 제공하는 것이며, 그 방법에는:
a) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 상기 하나 또는 그 이상의 각 세포 타입에서, 분석될 각 생물학적 과정을 위한 적어도 하나의 형광 (fluorescent) 또는 생물발광 (bioluminescent) 리포터 유전자 발현;
b) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 언급된 하나 또는 그 이상의 각 세포 타입을 알기네이트 (alginate) 바이오폴리머로 캡슐화하고, 여기서 하나 이상의 세포 타입이 있는 경우, 해당하는 캡슐모두, 또는 하나를 제외한 모두가, 각각 다른 타입의 형광물질로 라벨되고;
c) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 단계 b)의 캡슐화 된 모든 세포 타입은, 라벨 된 또는 라벨 되지 않은 알기네이트의 바이오폴리머로 선택적으로 캡슐화 된 하나 또는 그 이상의 추가의 라벨 되지 않은 세포 타입과 선택적으로 함께, 동시-배양되고;
d) 선택적으로 상기 동시-배양액을 하나 또는 그 이상의 약물에 노출시키고;
e) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 단계 c)의 각 세포 타입에서 상기 다수의 생물학적 과정의 활성을, 상기 선택적인 하나 또는 그 이상의 테스트될 약물에 노출시키기 전 및/또는 후에, 광학적 이미징을 통해, 발광 또는 생물발광 리포터 유전자의 형광 또는 생물 발광 강도를 각각 분석하여, 측정하는 것을;
포함하고,
여기서 하나 이상의 세포 타입이 동시-배양될 때, 분석될 각 세포 타입은 분석될 상기 세포 타입을 함유하는 알기네이트 캡슐과 연관된 형광 라벨링의 타입에 기반하여 광학적 이미징을 통해 동정된다.
약물의 테스트에 추가하여, 본 발명의 시험관 내 방법은 세포 또는 조직으로부터의 상등액, 또는 세포로부터의 용해액 또는 미생물 브로스(broth) 를 포함하는 생물학적 액체를 테스트하도록 또한 적응된다.
유리하게도, 본 발명은 또한 약물 테스트를 의도하지만, 그러나 인간 건강에 대하여 기대되는 또는 확인된 효과를 가진 다른 부류의 분자들도 테스트 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 알려지지 않은 화합물의 인간 건강에의 효과를 예측하기 위하여 및/또는 테스트 될 상응하는 생물학적 과정 또는 세포 타입을 선택하여 알려진 화합물에 대한 지식을 확장하기 위하여 사용될 수 있다. 영양분, 화장품, 오염물질 및 외부 유래 활성 물질과 같은 다른 화학물질은 이들이 세포 배양 배지에 용해 형태로 첨가될 수 있을 때까지 테스트 될 수 있다. 본 발명은 결정되지 않고 및/또는 오염된 액체 (예를 들어, 화학공장 또는 병원 등의 아래쪽 물) 또는 생리적 액체 (예를 들어, 소변, 혈청 등)와 같은 복잡한 조성물을, 이들이 함유하고 있는 및 측정되는 효과에 관련이 있는 하나 또는 몇 가지 분자를 동정할 필요없이, 특정한 생물학적 활성 및 세포 타입에 대한 효과를 측정하기 위하여 액체를 테스트하는 데 또한 사용될 수 있다. 그러한 적용으로, 본 발명은 화합물 및/또는 액체의 인간 건강에 대한 잠재적인 유해한 및/또는 유익한 효과를 기대하는 예측 도구로서 세계적으로 사용될 수 있다.
다수의 생물학적 과정으로서 또한 정의된 생물학적 활성은 형광 리포터 유전자 (fluorescent reporter genes) 또는 생물발광 리포터 유전자 (bioluminescent reporter genes) 둘 다에 의해 보고될 수 있다. 루시페라아제 (luciferases) 라고 불리는 몇 가지 생물발광 단백질 (bioluminescent proteins)이, 리포터 유전자로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 반딧불 루시페라아제 (firefly luciferase), 레닐라 루시페라아제 (Renilla luciferase), 및 가우시아 루시페라아제 (Gaussia luciferase)가 보통 생물발광 리포터 유전자로서 사용된다. 생물발광은 생물발광측정기 (bioluminometers)로 측정되며 및 이는 자주 형광보다 더 민감하다. 이들은 형광 리포터 유전자로는 달리 저조하게 검출되는 약한 생물학적 활성을 보고하기 때문에 몇 가지 리포터 유전자만 단지 생물발광 리포터 유전자로 가능하다. 그러므로 생물발광 리포터 유전자는 저조하게 검출될 수 있는 생물학적 활성의 측정을 위하여 형광 리포터 유전자를 대신하는 좋은 대체에 해당한다. 가능한 생물발광 색소의 제한적인 세트 때문에, 몇 가지의 생물발광 리포터 유전자들로 다중화하는 것 (multiplexing)은 어려우며 및 형광 리포터 유전자가 자주 선호적이다. 그러나 이중-리포터 시스템은 반딧불 루시페라아제 (firefly luciferase) 및 레닐라 (renilla) 로 디자인될 수 있으며 여기서 이 두 생물발광 리포터 단백질의 생물발광은 같은 샘플에서 순차적으로 측정될 수 있다. 형광 리포터 유전자들을 생물발광 리포터 유전자들과 조합하는 것은 가능하다 그러나 생물발광을 측정하기 전에 형광이 먼저 측정되어야 한다. 정말로, 생물발광 신호는 매우 강하고 및 형광의 검출을 손상시킨다. 생물발광은 기질을 필요로 하기 때문에 쉽게 조절될 수있으며 및 그러므로 세포 동시-배양에서 형광을 취득한 바로 직후에 첨가 될 수 있다. 다른 가능성은 동시-배양에서 보고된 특정한 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있는 그러한 세포 타입들 사이에 가능한 생물학적 교류를 고려하면서, 특정한 생물학적 활성을 측정하기 위하여 한 세포 타입에서 단일 생물발광 리포터 유전자를 다른 세포 타입과 함께 사용하는 것이다. (실시 예 1 참조).
본 발명은 캡슐당 몇 가지 세포 타입을 캡슐화하는 가능성을 포함한다. 예를 들어, 시험관 내 간 기능을 좀 더 잘 개괄하고, 및 그럼으로써 생체내 생물학을 좀 더 반영하는 방법에서 약물을 대사하고 또는 간독성을 조사하기 위하여, 간에서 정상적으로 발견되는 다른 세포와 함께 간 세포로 간 캡슐을 제조하는 것이 가능하다. 다른 한편으로, 단일 캡슐 내에서 비-종양적인 종양-연관된 세포가 종양 퇴화 호의적으로 되도록 재프로그램 할 수 있는, 예를 들어, 종양-연관된 면역 세포가 좀 더 염증성이 되도록 하거나 또는 종양에 대항하여 세포독성 면역 반응을 시작하게 하거나, 또는 종양 내피세포가 혈관생성 인자의 분비를 감소하도록 하는, 약물을 테스트하기 위하여 암세포 (종양 세포주 또는 환자 유래 종양 세포) 를 면역세포 또는 간질 세포 (stromal cell) ((예를 들어 단핵구 (monocytes), T 림프구 (T lymphocytes), 또는 내피세포 (endothelial cells) 의 세포주, 또는 다른 한편으로 환자 유래한 일차 세포))와 함께 함유하는 구 (spheroid)를 만드는 것이 가능하다.
그러므로 다른 세포가 인식 가능할 때 (즉, 둘 다 같은 캡슐에서, 한 세포 타입은 초록색, 다른 세포 타입은 적색, 또는 한 생물학적 활성은 초록색으로 판독되고 및 두 번째 생물학적 활성은 적색으로 판독되고), 캡슐당 몇 가지 타입의 세포를 사용하는 가능성은 특히 흥미롭다.
바람직하게도 형광소 (fluorophore) 는 아민-알기네이트 바이오폴리머 (amine-alginate biopolymer)에 커플된다, 그러나, 단순한 공유 화학을 가진 널리 다양한 형광 염료가 알려졌으며, 및 이들이 만약 좀 더 바람직한 물리화학적 또는 에세이-의존성 성질을 가지거나, 또는 같은 테스트에서 좀 더 높은 수의 형광소와 조합하였을 때 (예를 들어, 4개의 다른 형광 캡슐 라벨, 플러스 하나의 라벨 되지 않은 캡슐, 및 4개의 다른 리포터 유전자 형광 라벨), 이미징 현미경의 주어진 필터 및 레이저 구조를 통해 서로 정확하게 모두 구별될 수 있는, 다른 형광 라벨과 좀 더 좋은 교차 호환성을 가진다면, 이들은 형광 아민-기반한 염료를 대체할 수 있다.
본 발명에 따르면, 다수의 생물학적 과정은: 세포 증식, 염증, 종양 성장 및 억제, 약물 독성, 혈관신생, 면역 활성화, 해독 반응, 호르몬 반응, 외래물질 반응 (xenobiotic response), 유전독성 스트레스 반응 (genotoxic stress response) 및 사멸을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시 예에 따라, 상기 하나 또는 그 이상의 세포 타입은 상기 세포 타입 사이에 기대되는 또는 확인된 생리적인 상호작용에 기반을 두어, 및/또는 테스트 될 하나 또는 그 이상의 약물에 대하여 상기 하나 또는 그 이상의 세포 타입의 기대되는 또는 확인된 효과에 기반하여, 동시-배양을 위해 선택된다.
예를 들어, 하나 또는 그 이상의 세포 타입 사이에서 기대되는 또는 이전에 서술된 생리적 상호작용은, 약물이 간세포에 의해 대사될 수 있어, 타겟하는 암세포 타입을 향한 반응성을 변경한다는 기대에 기반을두어 간 세포를 한 암세포 타입과 동시-배양하는 것, 또는 난소암 세포가 유방암 세포의 증식을 유도하는 에스트로겐 (estrogen)을 생산한다는 지식에 기반을 두어 난소암 세포를 유방암 세포와 동시-배양하는 것, 또는 다른 한편으로 유방암 세포에서 항에스트로겐 (antiestrogen)인 약물은 자궁내막 (endometrium)에서는, 항에스트로겐 약물의 기대되는 나쁜 부작용 효과가 될 수 있는, 친-에스트로겐 (pro-estrogenic)이 될수 있다는 지식에 기반을 두어 항에스트로겐 약물을 테스트하기 위하여 간 세포를 자궁내막 암세포 및 유방암 세포와 함께 동시-배양하는 것을, 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 예에 따라, 시험관 내 약물 테스트하는 방법에는 상기-동시-배양이 하나 또는 그 이상의 약물에 노출되는 단계 d)를 포함한다.
특히, 하나 또는 그 이상의 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정을 분석할 수 있는 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법은, 하기의 단계를 포함한다:
a) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 상기 하나 또는 그 이상의 각 세포 타입에서, 분석될 각 생물학적 과정을 위한 적어도 하나의 형광 (fluorescent) 또는 생물발광 (bioluminescent) 리포터 유전자를 발현하고;
b) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 언급된 하나 또는 그 이상의 각 세포 타입을 알기네이트 (alginate) 바이오폴리머로 캡슐화하고, 여기서 하나 이상의 세포 타입이 있는 경우, 해당하는 캡슐 모두, 또는 하나를 제외한 모두가, 각각 다른 타입의 형광물질로 라벨되고;
c) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 단계 b)의 캡슐화 된 모든 세포 타입은, 라벨 된 또는 라벨 되지 않은 알기네이트의 바이오폴리머로 선택적으로 캡슐화 된 하나 또는 그 이상의 추가의 라벨 되지 않은 세포 타입과 함께, 동시-배양되고;
d) 상기 동시-배양을 하나 또는 그 이상의 약물에 노출시키고;
e) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 단계 c)의 각 세포 타입에서 상기 다수의 생물학적 과정의 활성을, 상기 하나 또는 그 이상의 테스트될 약물에 노출시키기 전 및/또는 후에, 광학적 이미징을 통해, 발광 또는 생물발광 리포터 유전자의 형광 또는 생물 발광 강도를 각각 분석하여, 측정하는 것;
여기서 하나 이상의 세포 타입이 동시-배양될 때, 분석될 각 세포 타입은 분석될 상기 세포 타입을 함유하는 알기네이트 캡슐과 연관된 형광 라벨링의 타입에 기반하여 광학적 이미징을 통해 동정된다.
바람직한 실시 예에서, 약물 테스트를 하기 위한 시험관 내 방법은 더 나아가 추가의 단계 f)를 포함하며 여기서 상기 동시-배양은 하나 또는 그이상의 추가의 생물학적 과정을 측정하기 위하여 하나 또는 그 이상의 형광 시약에 노출시킨다.
바람직하게, 현미경 및/또는 광도계에 의해 광학적 이미징이 수행된다. 광학적 이미징은 적절한 기구 분사구 (nozzle)가 사용되고 및 세포 캡슐이 충분히 작다면 유동 세포 분석 (flow cytometry)에 의해 수행될 수 있다. 유동세포 분석의 사용은 증가하는 에세이의 다중화를 되게할 수 있다 왜냐하면 표준 이미징 현미경에 비교하여 더 많은 형광 계수 (fluorescence parameters) 들이 쉽게 분석될 수 있기 때문이며, 및 이미지 분석 소프트웨어 사용 없이 분석될 수 있기 때문이다, 그러나 플레이트 웰 당 낮은 수의 캡슐은 이미지 기반한 현미경 분석에 좀 더 적절하다.
다른 실시 예에 따라, 상기 적어도 하나 또는 그 이상의 세포 타입은 세포주 또는 일차 조직 세포 (primary tissue cell) 의 서브세트 (subsets) : 간 세포, 종양 세포, 뇌 세포, 표피 세포 (epithelial cells), 내피세포 (endothelial cells), 면역시스템 세포 ( immune system cells), 다분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 폐 세포, 신장 세포, 동맥 세포(artery cells), 뼈 세포, 연골 세포 (cartilage cells), 근육 세포, 췌장 세포, 장 세포 (intestinal cells), 피부 세포, 섬유아 세포(fibroblasts), 곰팡이 세포 (fungal cells) 또는 박테리아를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석될 상기 하나 또는 그 이상의 세포 타입 중 적어도 하나 또는 단계 c)의 선택적으로 첨가되는 라벨 되지 않는 세포 타입 중 하나는 간 세포이다.
본 발명의 실시 예에 따라, 상기 하나 또는 그 이상의 캡슐화 된 세포 타입 중 적어도 하나는 환자의 암 샘플에서 유래한다.
본 발명의 실시 예에 따라, 상기 하나 또는 그 이상의 세포 타입 중 적어도 하나는 박테리아 또는 곰팡이 세포이다. 후자에서, 테스트 될 약물은 항생제 또는 살진균제이다. 이 실시 예에 따라, 분석될 다수의 생물학적 과정은: 항-미생물 저항성 또는 감수성 (anti-microbial resistance or susceptibility), 박테리아 증식(bacterial proliferation), 항균력 또는 정균력 (bactericidal or bacteriostatic activity)을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
다른 실시 예에서, 본 발명의 시험관 내 방법은 약물 스크리닝 또는 테스트를 위하여 디자인되며, 여기서 상기 다수의 형광 리포터 유전자는 표현형 약물 발견 과정 동안에 조사되는 생물학적 과정을 위하여 선택된다.
예를 들어, 유전자 리포터가 선택된다 왜냐하면 이는 기전적인 생물학적 연구를 통해 이전에 동정된 특정한 타겟, 즉, 특정한 암 또는 다른 특정한 질병의 병리에서 중요한 역할을 하는 수용체, 이기 때문이다.
바람직하게도, 유전자 리포터 또는 조절 요소는 CTCF 절연 서열 (insulator sequences)에 의해 인접되어 있다.
형광 색소 (fluorochromes) 의 선택은 검출 장치 (현미경 또는 세포측정기) 를 구성할 때 적절한 조절을 사용하여 알기네이트 형광소 (fluorophores) 및 형광 리포터 유전자 (fluorescent reporter gene) 구조 사이 및 이들 중 스펙트럼의 중첩이 최소화되거나 또는 없도록 한다.
다른 말로, 본 발명의 목적은 형광적으로-라벨 된 알기네이트 캡슐에 캡슐화된 형광 리포터 유전자를-발현하는 진핵세포 (예를 들어, 포유류 세포) 또는 비 진핵 세포 (예를 들어, 박테리아) 로 구성된다. 이 두 다른 타입의 형광 라벨링 (세포 내 리포터 유전자 및 알기네이트 캡슐 라벨링) 의 조합은 하나 또는 그 이상의 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정을 동시에 모니터링 (monitoring) 하게 한다.
특히, 세포는 알기네이트의 바이오폴리머로 캡슐화 된다. 캡슐은 정성적인 생리적 압력과 같은 물리적인 제약을 세포에 가한다. 이 압력은 세포를 통해 산소 및 영양소가 확산되는 것과 비교할 만한 300 μm 이하의 크기로 캡슐 내에 다세포 응집체 (multicellular aggregate)가 머물도록 하여, 이 세포 배양 모델 (증가되는 생물학적 상관성의 예가 상기에 목록화되어 있고, 신경 줄기세포 및 연골 세포)의 생리적인 상관성을 증가하게 한다.
각 세포 타입은 하나의 특별한 형광소 (fluorophore)로 화학적으로 수정된 알기네이트 껍질(shell)에 캡슐화된다. 그러므로 각 형광소는 시험관 내 약물 테스트의 분석 동안에 하나의 특정한 세포 타입을 함유하는 캡슐을 동정하게 한다.
캡슐화된 세포는 전형적으로 다른 형광 리포터 분자, 또는 다른 리포터 분자를 발현하도록 유전적으로 제작된 세포 주로 구성될 것이며, 이는 테스트 되는 "생물학적 과정 (biological processes)"에 관련되는 주요 활성을 모니터링하게 한다.
동시에 모니터 될 수 있는 유전자 패널에는, 약물 테스트에서 검출될 수 있는, 흔히 조사되는 특징, 즉, 생물학적 과정, 의 주요 조절자 또는 바이오마커가 포함된다. 이들 특징에는 세포 독성 (cell toxicity), 세포 증식 (cell proliferation), 염증 (inflammation), 호르몬 반응 (hormone response), 외래물질반응 (xenobiotic response), 유전독성 스트레스 반응 (genotoxic stress response), 및 항생제 저항성 (antibiotic resistance)이 포함된다.
특히, 본 발명은 다 세포 타입에서 다수의 세포 과정에 대한 약물의 효과를, 같은 테스트 내에서 동시에 규명하는 방법을 포함한다. 이를 달성하기 위하여, 그 방법은 유전적으로 조작된 캡슐화된 세포를 적용하여 하나 또는 그 이상의 세포 과정은 이의 형광 활성이 생물학적 과정을 의미하는 형광 리포터 유전자에 융합된 조절 요소 (regulatory element)를 통해 모니터 될 수 있도록 한다. 동시-배양에서 사용되는 세포 주는 생물학적 과정: 이것에만 국한하지 않으나, 세포 증식, 외래물질 스트레스 반응 (xenobiotic stress response), 염증, 종양 성장 또는 억제, 및 약물 독성 또는 해독 반응 (detoxification responses), 에 관련되는 하나 또는 그 이상의 리포터 유전자를 발현하도록 제작될 수 있다.
같은 세포 타입은 다른 생물학적 과정에 대한 리포터 유전자를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 다수의 리포터 유전자를 다중으로(multiplex) 분석하기 위하여, 세포는 필요로 하는 수의 별도의 배치 (separate batches) 의 세포로 나눌 수 있으며, 각 배치 (batch)는 단일 생물학적 과정에 해당하는 단일 리포터 유전자를 함유하도록 제작된다. 별도의 배치 (separate batches) 의 세포는 같은 캡슐에 캡슐화되도록 함께 모여지거나 (pooled), 또는 이들은 각각 별도로 캡슐화되어, 다수의 생물학적 과정의 활성이 혼합된 동시-배양, 또는 물리적으로 분리된 동시-배양에서 각각 측정된다. 다른 세포 과정에 해당하는 유전자들의 다중 분석 (multiplexed analysis) 은 최적의 약물 후보자를 예측하기 위한 증가 된 능력 및 약물 후보의 심도있는 성질 규명을 수행하는 데 필요한 시약, 소모품, 및 시간의 경제성을 포함하는 많은 유익한 점을 제공하고자 하는 의도이다.
각 타입의 캡슐은 단일 인간 기관 또는 종양과 같은 뚜렷한 생리적 부위에서 정상적으로 발견되는 하나 또는 그 이상의 세포 타입을 함유한다. 세포의 캡슐화는 다른 세포 타입의 별도의 단일 세포 현탁액의 제조가 관여 된다. 이 현탁액은 그 후 현미경으로 캡슐 내용물을 동정하도록 하는 많은 형광 마커 중 하나로 미리 라벨된 알기네이트의 얇은 층에 캡슐화된다.
캡슐화된 세포는 그 후 배양되어 구 (sheroids) 라고 불리는 3D 조직-유사 구조의 형성을 촉진한다. 다른 캡슐화된 세포 구 (cell spheroids)는 그 후 다른 세포 서브타입의 동시-배양을 생성하기 위하여 혼합될 수 있으며, 이는 이것에만 국한하지 않으나, 종양 세포 주, 환자 유래 일차 종양 세포, 및 세포 주-특히 약물을 대사할 수 있는 간 세포를 포함할 수 있다.
캡슐화된 3D 세포 배양의 사용은 (1) 같은 인간 기관에서는 전형적으로 발견되지 않는 다른 세포 타입의 세포 대 세포 접촉을 예방하고, 및 (2) 같은 웰 내에서 다른 세포 타입의 동시 분석을 가능하게 한다, 예를 들어, 같은 동시-배양 내에서 간 세포 및 암 세포에 대하여 약물의 독성이 별도로 평가될 수 있다.
같은 웰 내에서 다수의 세포 타입의 동시-배양의 목표는 이 약물 테스트 접근 방법의 임상적 상관성을 증가하기 위하여, 다세포 미세환경, 조직, 또는 인간 신체에서 일어나는 기관-간 시스템 (inter-organ systems) 을 개괄하기 위한 것이다. 예를 들어, 분리된 캡슐에서 암세포 및 간 세포의 동시-배양은 약물을 투여한 후 생체 내에서 공통의 과정을 모사 하기 위한 목표이며, 여기서 간은 먼저 약물을 대사하고 및 그 후 약물 대사물이 해부학적으로 먼 부위에서 항-암 반응의 주요 효능제가 된다.
본 발명은 다수의 효과가, 예를 들어 항-암 효과는 물론 간 독성이, 동시에 조사 될 수 있기 때문에 또한 시간과 재료의 절약이다. 이는 약물-유도된 간 손상 (drug-induced liver injury, DILI)이 많은 약물 후보가 개발 과정 (development process)으로 진행되지 않는 주요 이유 중에 하나이기 때문에 중요하다.
본 발명의 한 고유한 장점은 다수의 생물학적 과정을 혼합된 세포 타입의 동시-배양에서 측정하는 능력에 있다는 것이고, 이는 약물 테스트의 효력 및 정확도(생체 내 모델에 좀 더 전통적인 상관성)를 증가시킨다.
현재의 발명이 다른 3D 동시-배양 또는 캡슐화된 세포-기반한 약물 테스트 방법술과의 공통되는 장점은, 기존의 기술에 공통인, 하기의 특징을 통해 약물 테스트의 임상적 상관성을 증가시키는 것이다:
-알기네이트 캡슐은 생체 내에서 정상적으로는 서로 접촉하지 않는 다른 세포 타입의 물리적인 분리로서 작용한다
-3D 구 세포 배양 (spheroid cell cultures) 은 단일층 세포 배양에 비교하여 생체 내 조직과 좀 더 비슷한 행동을 한다.
추가로, 본 발명은 동시에 조사될 수 있는 생물학적 과정의 수를 증가하게 하는 것을 물론, 생물학적 과정의 레퍼토리를 (repertoire), 즉, 제약회사에 의해 흔히 조사되는 생물학적 과정의 많은 부분을 정량하기 위한 리포터 유전자 라이브러리의 생성을, 증가하게 한다.
본 발명은 세포 생물학 분야 및 응용 약물 발견 분야에서 현재 알려진 많은 현존하는 개별적인 요소 또는 과정은 물론 완전히 새로운 요소들을 조합한다. 이러한 기술적인 요소 또는 과정들이 하기에 서술된다:
a. 조직-유사한 성질을 가진 3D 세포 구 (cell spheroids) 를 형성하기 위한 세포의 캡슐화. 바람직하게, 알기네이트-기반한 세포의 캡슐화 방법이 미세유체공학 장치 (microfluidics device)로 수행된다. 미세유체공학 장치는 아레산드리 등에서 서술된다 (Alessandri K, Feyeux M, Gurchenkov B, Delgado C, Trushko A, Krause KH, Vignjeviζ D, Nassoy P, Roux A. Lab Chip. 2016 Apr 26;16(9):1593-1604. doi: 10.1039/c6lc00133e).
b. 약물 스크리닝에서 좀 더 임상적으로 상관성이 있는 결과의 달성을 도와주는, 생체 내-유사한 세포 상호작용을 생산하기 위하여 다른 세포 타입의 동시-배양. 바람직하게 본 발명은 세포 동시-배양에서 약물을 대사하기 위하여 간 세포를 사용한다.
c. 세포 캡슐을 형광 탐침으로 라벨링. 보통 형광 분자로 알기네이트를 라벨하는 데 사용되는 기술은 이 분야 기술에서 널리 알려졌다.
d. 유전자 조작 및 주요 세포 과정과 관련되는 다수의 조절 활성의 검출. 본 발명은 같은 세포 내에서 다른 형광 리포터 유전자의 형광 강도를 다수로 동시에 (다중) 분석하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, 특이한 분자 약물 타겟의 정체를 아는 것에 의존하지 않는, '표현형 약물 스크리닝 (phenotypic drug screening)'의 수행, 또는 다른한편으로, 세포에서 특정한 단백질의 조절 활성이 측정되는, '타겟-기반한 (target-based)' 약물 스크리닝의 수행을 목표로 한다. 이 요소는 본 발명의 고유한 특징을 나타낸다.
본 발명의 다른 목적은 하나 또는 그 이상의 관심있는 약물의 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정에의 효과를 테스트 하기에 적절한 시험관 내 약물 테스트 키트를 제공하는 것이고, 이 키트는:
- 적어도 하나의 바로-사용할 수 있는 (ready-to-use) 상기 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입에서 분석될 각 생물학적 과정을 위한 형광 또는 생물 발광 리포터 유전자를 발현하는 하나 또는 그 이상의 알기네이트-캡슐화된 타겟 세포 타입을 함유하는 마이크로웰 플레이트를 포함하고, 여기서 하나 이상의 세포 타입이 있는 경우, 해당하는 캡슐 모두, 또는 하나를 제외한 모두가, 각각 다른 타입의 형광 물질로 라벨된다.
바람직하게, 적어도 상기 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입 중 하나는 간 세포이다.
본 발명의 실시 예에 따라, 상기 형광소-라벨된 알기네이트-캡슐화된 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입은 하나 또는 그 이상의 환자-유래한 세포 타입과 함께 동시-배양된다. 바람직하게, 하나 또는 그 이상의 환자-유래한 세포 타입은 분석될 각 다수의 생물학적 과정을 위한 적어도 하나의 형광 리포터 유전자를 함유하도록 유전적으로 조작된다. 좀 더 바람직하게, 하나 또는 그 이상의 환자-유래한 세포 타입은 형광소로 라벨 된 알기네이트의 바이오폴리머로 각 캡슐화 된다.
시험관 내 약물 테스트 키트의 한 장점은 표현형 (거의 모든 세포에 대한 보통의 리포터로 일반적인 생물학적 과정에 영향을준다) 또는 타겟-기반한 (예를 들어, 에스트로겐 수용체인, 어떤 세포에서만 단지 존재할 수 있는 특별한 경로를 조절, 및 이상적인 치료적 타겟으로서 이전에 동정 된) 약물 발견에 사용될 수 있다는 것이다.
본 발명의 다른 실시 예에 따라, 분석될 다수의 생물학적 과정은: 세포 증식, 염증, 종양 성장 및 억제, 약물 독성, 혈관신생, 면역 활성화, 해독 반응, 호르몬 반응, 외래물질 반응 (xenobiotic response), 유전독성 스트레스 반응 (genotoxic stress response) 및 사멸을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 실시 예에 따라, 하나 또는 그 이상의 환자-유래한 세포 타입은:
간 세포, 종양 세포, 뇌 세포, 표피 세포 (epithelial cells), 내피세포 (endothelial cells), 면역시스템 세포 ( immune system cells), 다분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 폐 세포, 신장 세포, 동맥 세포(artery cells), 뼈 세포, 연골 세포 (cartilage cells), 근육 세포, 췌장 세포, 장 세포 (intestinal cells), 섬유아세포(fibroblasts), 또는 피부 세포를 포함하는 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 실시 예에 따라, 상기 캡슐화된 타겟 세포 타입 내에서 상기 하나 또는 그 이상의 약물의 생물학적 과정에서의 효과를 동정하기 위하여 상기 적어도 하나의 바로-사용 가능한 마이크로웰 플레이트의 한 웰 당 하나 또는 그 이상의 약물이 테스트 된다.
본 발명의 하나의 다른 실시 예에 따라, 상기 약물 사이에 상호작용을 동정하기 위하여 상기 적어도 하나의 바로-사용 가능한 마이크로웰 플레이트의 한 웰 당 하나 이상의 약물이 테스트 된다.
특히, 관심있는 캡슐화된 세포 내에서 생물학적 과정에 대한 약물의 효과를 동정하기 위하여, 또는 다른 한편으로 다수의 약물 사이의 상호작용, 예를 들어, 이것에만 국한하지 않으나, 세포 세포독성 또는 증식을 포함하는 생물학적 과정 조절의 시너지 (synergy) 또는 디서지 (dysergy), 를 동정하기 위하여, 웰 당 하나 또는 그 이상의 약물이 테스트된다.
이 분야 기술에 전문가는 여기서 서술된 본 발명이 특별하게 서술된 것 이외에는 변화 및 수정이 될 수 있다는 것을 알 것이다. 본 발명은 이의 정신 또는 필수적인 특성으로부터 이탈됨이 없이 모든 그러한 변화 및 수정을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 본 발명은 또한 이 설명서에서 언급되거나 또는 제시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 개별적으로 또는 집합적으로, 및 어느 및 모든 조합으로 또는 어느 두 개 또는 그 이상의 상기 단계 또는 특징을 포함한다. 본 공개는 그러므로 제시된 모든 관점에서 고려되고 및 제한적이지 않으며, 본 발명의 범위는 동반되는 청구항에 의해 제시되고, 및 동등한 의미 및 범위 내에 오는 모든 변화는 거기에 수용하려는 의도이다.
다양한 참고 문헌이 이 설명서 내내 인용되고, 이의 각각은 그 전문이 참고 문헌으로서 여기에 병합된다.
앞선 서술은 하기의 실시 예들을 참고로 좀 더 전적으로 이해될 것이다. 그러한 실시 예들은, 그러나, 본 발명을 실천하는 예시적인 방법이며 및 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시 예
실시 예 1:
설명:
에스트로겐 반응 요소 (Estrogen Response Element)의 조절하에 있는 루시페라아제 리포터 유전자 (luciferase reporter gene) 를 안정적으로 발현하는 유방암 세포((Breast Cancer (BC) cells)) 단일 층 (MELN 세포, 표 1 및 2)이 동시-배양되거나 또는 캡슐화된 간암 세포 ((Liver Cancer (LC) cells)) 없이 배양되고 및 증가되는 농도의 타목시펜(Tamoxifen) 또는 4-하이드록시타목시펜 (4-hydroxytamoxifen)으로 48시간 동안 처치되었다. BC 세포에서 에스트로겐 수용체 알파 (Estrogen Receptor α)의 활성은 루시페라아제의 활성을 측정하여((생물발광 강도 (bioluminescence intensity)) 결정된다.
재료 및 방법:
BC 세포를 위한 세포 접종
MELN 세포에 배양 배지를 빨아낸다 (aspirate) (표 1 참조)
PBS로 한번 세척하고 및 PBS를 빨아낸다
세포에 트립신 (trypsin) 을 첨가하고 및 과량의 트립신은 빨아낸다
37°C에서 5분 동안 배양한다
세포를 떼어내기 위하여 흰 세포 배양 배지(white cell culture medium) ((페놀 레드 (phenol red) 가 없는 DMEM 10% 숯으로-벗긴 소태아 혈청 (charcoal-stripped foetal bovine serum))를 세포 위로 반복 적으로 피펫트 (pipette) 하고 및 그 후 이들을 튜브에 모은다
세포를 96-웰 플레이트에 흰 세포 배양 배지에 10000 세포 / 웰로 접종한다.
세포를 37°C에서 배양한다.
실험 개념을 증명하기 위한 캡슐화 된 3D 동시-배양에서 사용된 세포 주의 특성
세포주 이름 장기 조직 출처(tissue origin) 공급자(supplier) 세포 배양 배지
MELN 가슴 젖관암종 (buctal carcinoma) Gift (Patrick Balaguer) DMEM 10% 소태아혈청
MDA-MB-134 가슴 젖관암종 (buctal carcinoma) ATCC DMEM 10% 소태아혈청
HepG2 간 간세포암종(hepatocellular carcinoma) ATCC DMEM 10% 소태아혈청
　LC 세포의 캡슐화를 위한 프로토콜:
-캡슐화를 위한 세포 제조:
합류 접시 (confluent dish)로 부터의 LC 세포(표 1 참조) 를 PBS로 세척하고, 트립신 처치를 통해 떼어 내고 및 세포 배양 배지로 이들을 모은다
세포의 수를 세고 및 1 ml 당 5백만 세포의 세포로 세포 현탁액을 제조한다.
세포 현탁액을40μm 코닝 필터(Corning filter)를 통해 50ml 펠콘 튜브 (Falcon tube)에 붓는다.
1ml의 세포 현탁액을(즉 5백만세포) 1.5mL 원심분리 튜브에 넣는다
세포를 1000 rpm 에서 5 분 동안 원심 분리하여 이들을 펠렛 (pellet) 으로 하고 및 이들을 소르비톨 (Sorbitol) 300μM (90μl)에 재현탁한다. 세포를 얼음에 유지한다.
-캡슐화:
캡슐화는 아레산드리 등에서 (Alessandri K, Feyeux M, Gurchenkov B, Delgado C, Trushko A, Krause KH, Vignjeviζ D, Nassoy P, Roux A. Lab Chip. 2016 Apr 26;16(9):1593-1604. doi: 10.1039/c6lc00133e) 서술된 대로 특허 된 기구 (WO/2013/113855) 로 수행되었다.
캡슐을 칼슘 용액을 함유하는10cm 페트리 접시 (petri dish)에 모으고, 30분 동안 배양한다.
칼슘 용액을 세포 배양 배지로 대체한다.
캡슐이 접시의 바닥에 정착하도록 기다린다.
접시 바닥에 있는 캡슐은 피하고, 18-게이지 (gauge) 바늘을 사용하여, 90%의 칼슘 용액을 빨아낸다(aspirate).
10cm 캡슐 접시 (dish) 를 세포 배양 배지로 가득 (40mL) 채운다.
캡슐이 정착되도록하고, 빨아내고 및 배양 배지로 다시 채운다. 두 번 반복하고, 마지막 차례에 15ml의 세포 배양 배지를 남겨둔다.
배양 캡슐(Incubate Capsule)을 37°C에서 배양한다.
플레이트에 LC 캡슐 로딩(loading) 및 처치
캡슐의 배지를 빨아내고, 대략 5ml의 배지는 남겨둔다.
캡슐이 통과되도록 하는 팁(tip)으로 장치된 1ml 피펫으로, 접시 표면을 남아 있는 배지로 세척한다
15ml 튜브에 가능한 많은 캡슐을 모은다.
나머지 캡슐을 모으기 위하여 1ml 피펫으로 5ml의 배지를 첨가한다.
□ 캡슐을 300 rpm에서 1분 동안 원심분리하고, 배지를 빨아내고 및 이 캡슐은 10ml의 페놀 레드 (phenol red) 가 없는 세포 배양 배지 ((페놀 레드가 없는 DMEM 10% 숯-벗겨낸 소태아 혈청 (charcoal-stripped foetal bovine serum))에 다시 현탁한다. 이를 한 번 더 반복한다.
□ 캡슐을 300 rpm에서 1분 동안 원심분리하고, 배지를 빨아내고 및 대략 200 μl 의 배지를 캡슐의 꼭대기에 남겨둔다.
적절한 부피를 웰로 이전하기 전에 캡슐을 현탁액으로 유지하기 위하여 계속적으로 아래 위로 피펫팅하면서 96-웰 플레이트에 BC 세포 단일 층 위에 캡슐을 분배한다.
웰의 반은 캡슐로 채우지 않는다 (BC 세포 로만의 컨디션)
모든 웰은 10pM 의 17β-에스트라디올 (17β-Estradiol) (E2) 로 처치하고, 및 그 후 다른 농도의 타목시펜 (Tamoxifen) 또는 4-하이드록시타목시펜 (4-hydroxytamoxifen)을 30pM 내지 1μM 범위에서 첨가한다.
플레이트를 37°C 에서 48시간 동안 배양한다.
루시페라아제 (Luciferas) 활성 측정
캡슐을 빨아내고, PBS로 한 번 세척하고 및 캡슐을 완전히 제거하기 위하여 빨아낸다
20μl 의 패시브 라이시스 버퍼 (Passive Lysis Buffer)(Promega)를 BC 세포 위에 첨가하고 및 실온에서 100rpm으로 플레이트 진탕기(plate shaker) 위에서 15분 동안 배양한다
10μl 의 용해액 (lysates) 을 광도계에 적응시킨 흰색 96-웰 플레이트에 옮기고 및 10μl 의 루시페라아제 기질(Luciferase substrate)) (Promega) 를 첨가한다.
광도계로 생물발광 강도를 읽는다.
결과:
도 1에서, 우리는 단일 층으로 자라는 BC 세포와 함께 시험관 내 동시-배양에서 캡슐화된 LC 세포의 포함은 타목시펜 (Tamoxifen) (ERα 활성의 억제, IC50 는LC 세포가 포함되었을 때 더 낮다) 의 항-암 활성을 증가시키는 것을 관찰하였다. 이는 캡슐화된 LC 세포와 BC 세포의 동시-배양은 LC 세포에 의한 2차 활성 약물 대사물 (엔독시펜) (endoxifen) 의 생리적인 생산을 개괄(recapitulate) 할 수 있음을 제시하며 , 이는 단지 전-약물 (pro-drug) (타목시펜) 과 BC 타겟 세포 주 만 포함한 단일-배양 시스템 (mono-culture system) 에서는 달리 간과할 수 있었던 것이다.
실시 예2:
설명:
원-적색-라벨 된 캡슐 (far-red-labeled capsules)에서 이중-리포터 FUCCI (표2 참조)를 안정적으로 발현하는 캡슐화된 BC 세포와 라벨 되지 않은 캡슐에서 이중-리포터 FUCCI (표2 참조)를 안정적으로 발현하는 캡슐화된LC 세포의 동시-배양은 다른 혈청 농도로 배양시켰다.활성적으로 증식하는 세포 및 증식하지 않는 세포 (잠복기)의 양은 같은 동시-배양 웰에서 LC 세포 및 BC 세포 둘 다에서 동시에 적색 (G1 기) 및 초록색(G2/S 기)핵의 비율을 정량하여 측정하였다.
재료 및 방법:
안정적인 리포터 세포주를 확립하는 프로토콜
HEK293 세포를 10cm-접시에 4 백만 세포/접시로 접종한다.
37°C에서 24시간 배양한다.
세포는 폴리에틸렌이민 형질 감염 방법 (PolyEthyleneImine transfection method)을 사용하여 플라스미드 pMD2G, psPAX2 및 관심 있는 렌티바이러스 리포터 플라스미드 (lentiviral reporter plasmid) ((pBOB-EF1-fastFUCCI-puro) 의 혼합으로 형질감염시킨다.
형질감염 용액을 세포에 첨가하고, 및 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
완전 배지 (complete medium) 교환을 수행한다.
세포를37°C에서 8 시간 동안 배양한다.
렌티바이러스를 함유하는, 배지를 튜브에 모은다.
완전 배지를 세포에 첨가하고 및 세포를 37°C 에서 16시간 동안 배양한다.
8 내지 16-시간 간격으로 배지로 수집을 두 번 더 반복한다.
안정적인 리포터 세포 주 ((MDA-MB134 및 HepG2, 표 1) 를 생성하기 위하여 사용된 세포를 직접적으로 렌티바이러스-함유하는 배지 (Lentiviruses-containing medium) 에, 정상 세포 배양과 같은 밀도로, 37°C 에서 96 시간 동안 접종한다.
렌티바이러스-함유하는 배지를 빨아 내고 및 완전 세포 배양 배지로 대체한다.
퓨로마이신 (puromycin) 을 최종 농도 2μg/mL으로 배양 배지에 24시간 동안 직접 첨가하고, 항생제 저항 (리포터 +) 세포를 선택한다.
죽은 세포를 함유하는 퓨로마이신 배양 배지를 제거하고 및 퓨로마이신 1μg/mL을 가진 완전 세포 배양 배지로 대체한다.
안정적인 리포터 세포 주는 1μg/mL 의 퓨로마이신을 가진 배지에서 유지시킨다.
생물학적 활성 및 이들의 관련된 리포터 유전자 특징
생물학적 과정 리포터 시스템
(reporter system)		 판독 (readout) 소스(source)
증식 형광 유비키티네이션-기반한 세포주기 제시자 (FUCCI; Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator). 증식하지 않는 세포는 적색이고 증식하는 세포는 초록색이다. 초록색 (
Figure pct00001
Ex/Em: 492/505) 및 적색 (
Figure pct00002
Ex/Em: 551/565) 형광 강도		 애드젠 (Addgene):
플라스미드#86849
사멸(apoptosis) 집 초록 형광 단백질-캐스페이즈3 (zipGFP-Casp3; zip Green Fluorescent Protein-Caspase3,). 리포터를 발현하는 세포는 적색이고, 캐스페이즈-의존성 사멸이 진행된 세포는 초록색이다. 초록(
Figure pct00003
Ex/Em: 485/510) 및 적색 (
Figure pct00004
Ex/Em: 587/610) 형광 강도		 애드젠(Addgene): 플라스미드#81241
에스트로겐 반응 에스트로겐 수용체 요소-루세페라아제. 생물발광 강도는 에스트로겐 반응의 활성에 연결된다 생물발광(Bioluminescence) 부논 등(Bunone et al., 1996)
아민 그룹을 함유하는 형광소로 알기네이트의 염색 (표 3 참조)
0.1M MES pH 6.0에 1% (w/v) 알기네이트 용액 (Alginate solution) 25mL을 제조하고 및 실온(RT) 에서 회전기 (rotator) 에 하룻밤 동안 혼합한다.
200μl DMSO에 용해된 1mg의 염료를 첨가하고 및 이 알기네이트를 RT에서 회전기 (rotator) 에 10-30분 동안 혼합되게 한다.
200ul 0.1 M MES pH 6.0에 용해된 설포-NHS (sulfo-NHS)를 알기네이트 용액에 최종 농도 2 mM이되게 첨가하고 및 RT에서 회전기 (rotator) 에 30분 동안 혼합 한다.
200ul 0.1 M MES pH 6.0에 용해된 EDC를 알기네이트 용액에 최종 농도 5 mM이되도록 첨가하고 및 RT에서 회전기 (rotator) 에서 1-2시간 동안 혼합되고 및 반응하게 한다.
1L의 증류수에서 슬라이드-A-레이져 카세트(Slide-A-Lyser cassette) (10K)에서 30분 동안 투석한다. 그 후, 물을교환하고, 카세트를 5L 증류수에 넣고 및 4°C 에서 살살 교반하면서 하룻밤 동안 놓아둔다.
염색된 알기네이트를 카세트로부터 모으고 및 이를 플라스틱 튜브에 옮기고, 4°C에 저장한다.
캡슐화 하기 전에, 염색된 알기네이트를 염색되지 않은 알기네이트 (단계 1 만 수행하여 제조한다) 와 염색된: 비염색된 비율이 1:10이 되도록 혼합한다 .
알기네이트 캡슐을 라벨하기 위하여 사용된 형광색소의 특징
형광색소
(fluorochrome)		 화합물 명 색 λ Ex/Em (nm) 참조 제품 공급자
ATTO 647N Amine Protected by license Far-red 646/664 95349 Sigma-Aldrich
Fluoresceinamine, Isomer 1 5- aminofluorescein Green 496/51 201626 Sigma-Aldrich
안정적인 리포터 세포의 캡슐화를 위한 프로토콜
-캡슐화를 위한 세포 제조:
실시 예 1에서의 "캡슐화를 위한 세포 제조" 와 같은 프로토콜
-캡슐화:
출원자이 BC 세포 캡슐화를 위해 원-적색-라벨된 (far-red-labelled) 알기네이트를 사용하고 및 LC 세포 캡슐화를 위해 라벨 되지 않은 알기네이트를사용한다는 것을 제외하고는 실시 예 1에서의 "캡슐화" 와 같은 프로토콜.
동시-배양을 만들기 위한 플레이트에 BC 및 LC 캡슐 로딩
캡슐의 배지를 빨아내고, 대략 5ml의 배지를 남겨둔다.
캡슐이 통과되도록 하는 팁(tip)으로 장치된 1ml 피펫으로, 접시 표면을 남아있는 배지로 세척한다.
15ml 튜브에 가능한 많은 캡슐을 모은다.
나머지 캡슐을 모으기 위하여 1ml 피펫으로 5ml의 배지를 첨가한다.
□ 캡슐을 300 rpm에서 1분 동안 원심분리하고, 배지를 빨아내고 및 이 캡슐은 10ml의 세포 배양에 다시 현탁 한다.
□ 캡슐을 300 rpm에서 1분 동안 원심분리하고, 배지를 빨아내고 및 대략 200 μl 의 배지를 캡슐의 꼭대기에 남겨둔다.
적절한 부피를 웰로 이전하기 전에 캡슐을 현탁액으로 유지하기 위하여 계속적으로 아래 위로 피펫팅하면서 캡슐을 이미징 급의 질을가진 96-웰 플레이트의 웰에 나누어 넣는다.
태아 소 혈청을 웰에 첨가하거나 또는 안하고 및 이 동시-배양은 37°C에서 96시간 동안 배양시킨다.
동시-배양에서 BC 및 LC 세포의 형광 강도의 측정
캡슐화된 3D 세포 동시-배양을 함유하는 96-웰 플레이트의 이미지 획득은 자동화된 공초점 현미경 (automated confocal microscope) (IXM-C, Molecular Devices??) 으로 수행된다. 4X 대물렌즈 (objective) 가 사용되고 및 10 z-단계가 각 형광 첸넬에 대해 웰 당 12개의 다른 면적에서 수행된다.
여기서 사용된 방법은 그 후 전형적으로 고 함량 스크리닝 과정 (High Content Screening (HCS) procedure) 이며, 이는 약물 발견을 위한 약학산업에서 현재 선택되는 최선의 방법이다. 이미지 획득 이후, 이미지 분석은 두 단계로 전개된다: 첫 번째, 상관되는 물체 마스크 (object masks) 를 생산하는 일련의 분할 과정을 적용하여 이미지에서 다른 세포 리포터 및 캡슐을 동정하고; 두 번째, 마스크가 적용된 원래의 이미지로부터 몇 가지 계수 (예를 들어, 형광 강도, 크기 및 모양 등)가 추출된다. 이 이미지 분석 과정은 동시-배양되는 두 세포 타입에서 증식 상태 (FUCCI 리포터에 의해 보고되는)를 동시에 정확하게 정량하게 한다.
결과:
도 2는 두 개의 다른 형광 리포터에 의해 보고되는(증식하는 세포는 초록색 형광 리포터 유전자; 증식하지 않는 세포는 적색 형광 유전자, 이 둘 다는 FUCCI 리포터에 포함되어 있다) 두 개의 다른 세포의 상태가 두 개의 다른 알기네이트 캡슐에서 캡슐화된 (BC 세포는 원-적색-라벨된 알기네이트 캡슐; LC 세포는 라벨 되지 않는 알기네이트 캡슐) 두 개의 다른 세포 타입의 3D 동시-배양에서 동시에 정량될 수 있다는 것을 보여준다. 도 2로부터의 결과는 또한 리포터의 형광은, HCS 과정: 자동화된 현미경관찰 획득에 이어서 이미지 처리 과정 및 소프트웨어 메타엑스프레스 (software MetaXpress) (Molecular Devices)로 분석하여, 이들 사이에서 및 라벨된 알기네이트 캡슐의 형광으로 구별될 수 있다는 것을 보여준다.
실시 예 3:
설명:
라벨 되지 않은 캡슐에서 이중-리포터 FUCCI (표2 참조)를 안정적으로 발현하는 캡슐화된 BC 세포, 및 원-적색-라벨된 캡슐 (far-red-labeled capsules)에서 리포터 zipGFP-Casp3 (표 2)를 안정적으로 발현하는 캡슐화된 LC 세포의 동시-배양은 초록색-라벨 된 캡슐에 캡슐화된 LC 세포와 함께 또는 없이 동시-배양되고 및
증가하는 농도의 타목시펜으로 96시간 동안 처치하였다. 사멸의 유도는 zipGFP-Casp3 리포터를 안정적으로 발현하는 BC 세포에서 자동화된 공초점 현미경 (automated confocal microscopy) (HCS) 으로 측정되었으며 및 증식은 이중-리포터 FUCCI 를 안정적으로 발현하는 BC 세포에서 동시에 측정된다.
재료 및 방법
두 개의 BC 안정적인 리포터 세포 주를 설립하는 프로토콜:
이중-리포터 FUCCI 를 안정적으로 발현하는BC 세포주를 만드는 것에 추가하여 출원자들이 pHAGE렌티바이러스 벡터에 병합된 리포터를 함유하는 직접-만든(home-made) 렌티바이러스 구조체 (pHAGE-fEF1-zipGFP-Casp3) 로 리포터 zipGFP-Casp3 (표2) 를 안정적으로 발현하는 BC 세포 주를 또한 만든 것을 제외하고, 실시 예 2의 "안정적인 리포터 세포주를 확립하는 프로토콜"에서와 같은 프로토콜.
아민 그룹을 함유하는 형광소로 알기네이트의 염색 (표3 참조)
실시 예 2의 "아민 그룹을 함유하는 형광소로 알기네이트의 염색 (표 3 참조)" 에서와 같은 프로토콜.
안정적인 리포터 세포의 캡슐화 프로토콜
-캡슐화를 위한 세포 제조:
실시 예 1의 "캡슐화를 위한 세포 제조"와 같은 프로토콜
-캡슐화:
우리가 이중-리포터 FUCCI를 안정적으로 발현하는 BC 세포를 캡슐화하기 위하여 라벨 되지 않은 알기네이트를 사용하고, zipGFP-Casp3 리포터를 안정적으로 발현하는 BC 세포를 캡슐화하기 위하여 원-적색- 라벨된 (far-red-labelled) 알기네이트를 사용하고, 및 LC 세포를 캡슐화하기 위하여 초록색-라벨 된 알기네이트를 사용한 것을 제외하고는 실시 예 1의 "캡슐화"와 같은 프로토콜.
동시-배양 (co-cultures)을 만들기 위한 플레이트에 캡슐 로딩(loading) 및 처치
하기를 제외하고는 실시 예 1의 "플레이트에 LC 캡슐 로딩 및 처치"와 같은 프로토콜:
적절한 부피를 웰로 이전하기 전에 캡슐을 현탁액으로 유지하기 위하여 계속하여 아래 위로 피펫팅하면서 이미징급 질의 96-웰 플레이트에 캡슐을 분배한다.
웰의 반은 캡슐로 채우지 않는다 (BC 세포 로만의 컨디션)
모든 웰은 10pM 의 17β-에스트라디올 (17β-Estradiol) (E2) 로 처치하고, 및 그 후 다른 농도의 타목시펜 (Tamoxifen) 또는 4-하이드록시타목시펜 (4-hydroxytamoxifen)을 1 μM 내지10μM 범위에서 첨가한다.
플레이트를 37°C 에서 96시간 동안 배양한다.
동시-배양에서 BC세포의 형광 강도의 측정
이미지 분석 과정에서 각 증식 상태 (FUCCI 리포터에 의한 보고) 및 FUCCI 리포터를 발현하는 BC 세포 및 zipGFP-Casp3 리포터를 발현하는 BC 세포에서 각각 사멸 유도 (zipGFP-Casp3 리포터에 의해 보고) 의 정량을 동시에 및 정확하게 하는 것을 제외하고는 실시예 2의 "동시-배양에서 BC 및 LC 세포의 형광 강도의 측정" 과 같은 프로토콜.
결과:
도 3은 세 개의 다른 타입의 캡슐화된 세포의 다수-배양을 보여준다: LC 세포, 리포터 유전자 zipGFP-Casp3를 안정적으로 발현하는 BC 세포, 및 이중-리포터 유전자 FUCCI를 안정적으로 발현하는 BC 세포. 캡슐색은 각 타입의 세포를 동정하게 하며 및 세포의 형광 강도는 각 캡슐 타입에서 특정한 생물학적 활성을 정량하기 위하여 측정될 수 있다 (여기서 라벨 되지 않은 캡슐에서 BC 세포의 증식 또는 원-적색 캡슐에서 BC 세포의 사멸). 이 특별한 실험에서, 출원자들은 같은 형광 색을 가진 두 개의 다른 리포터를 구별하기 위하여, 두 번째 세포 타입 (LC 세포)을 동정하기 위하여, 추가의 캡슐색을 가진, 다른 색의 캡슐을 사용하였다.
도 4 및 도 5는 출원자들이 두 개의 다른 생물학적 활성 (세포 증식 및 사멸) 을 위한 리포터로 두 개의 다른 생물학적 활성을 다수-배양 (multi-culture) ((동시-배양(co-culture)) 웰에서 동시에 측정할 수 있음을 보여준다. 이 실험에서, 출원자들은 마이크로 몰 (micromolar) 범위의 농도의 타목시펜 (Tamoxifen) 을 사용하였다. 이 농도의 타목시펜에서, 세포 증식의 억제는 포화하나, 사멸은 용량-의존적인 방식으로 유도된다. 출원자들은 도 4에서BC 세포에서 사멸의 유도는 LC-세포로 동시-배양에서만 용량-의존적인 방식으로 타목시펜에 의해 증가된다는 것을 관찰하였다. 도 5에서는, 세포 증식 억제는 1μM에서 이미 최대이고 및 더 높은 농도의 타목시펜으로 추가로 증가될 수 없다. 이 실험은 이 발명의 방법으로 출원자들이 다수-배양 (multi-culture) 에서 두 개의 다른 생물학적 활성을 독립적으로 및 동시에 측정할 수 있음을 보여준다. 출원자들은 LC 세포의 존재는 BC 세포에 대한 타목시펜의 효능이 증가함을 다시 한번 보여준다. 중요하게는, 이 실험은 같은 배양 웰에서 같은 분자의 두 개의 다른 약리학적 효과를 (세포 증식 억제 및 사멸 유도) 신뢰할 만하게 구별하게 한다.

Claims (21)

  1. 하나 또는 그 이상의 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정을 분석할 수 있는 약물 테스트를 위한 시험관 내 (in vitro) 방법으로, 상기 방법은 하기를 포함하고:
    a) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석되는 상기 하나 또는 그 이상의 각 세포 타입에서 발현되고, 분석되는 각 생물학적 과정을 위한 적어도 하나의 형광 (fluorescent) 또는 생물발광 (bioluminescent) 리포터 유전자;
    b) 알기네이트 (alginate)의 바이오폴리머와 함께 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석되는 상기 하나 또는 그 이상의 각 세포 타입을 캡슐화하고, 여기서 하나 이상의 세포 타입이 있는 경우, 해당하는 캡슐 모두, 또는 하나를 제외한 모두가, 각각 다른 타입의 형광소로 라벨되는 것;
    c) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 단계 b)의 분석된 캡슐화된 모든 세포 타입을 동시-배양하고, 선택적으로 알기네이트의 라벨되거나 라벨되지 않은 바이오폴리머로 선택적으로 캡슐화된 하나 또는 그 이상의 추가적인 라벨되지 않은 세포 타입과 선택적으로 함께하는;
    d) 선택적으로 하나 또는 그 이상의 약물에 상기 동시-배양을 노출;
    e) 같은 시험관 내 약물 테스트 에세이에서 분석되는 단계 c)의 각 세포 타입에서 상기 다수의 생물학적 과정의 활성을 측정하고, 테스트되는 상기 선택적인 하나 또는 그 이상의 약물에 노출시키기 전 및/또는 후에, 광학적 이미징을 통해, 각각의 발광 또는 생물발광 리포터 유전자의 형광 또는 생물 발광 강도를 개별적으로 분석하고,
    여기서 하나 이상의 세포 타입이 동시-배양될 때, 분석되는 각 세포 타입은 분석되는 상기 세포 타입을 함유하는 알기네이트 캡슐과 연관된 형광 라벨링의 타입에 기반응두어 광학적 이미징을 통해 동정 되는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    여기서 다수의 생물학적 과정은 하기를 포함하는 목록으로부터 선택되는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법: 세포 증식, 염증, 종양 성장 및 억제, 약물 독성, 혈관신생, 면역 활성화, 해독 반응, 호르몬 반응, 외래물질 반응 (xenobiotic response), 유전독성 스트레스 반응 (genotoxic stress response) 및 사멸.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 상기 하나 또는 그 이상의 세포 타입은 상기 세포 타입 사이에 기대되는 또는 확인된 생리적인 상호작용에 기반을 두고 및/또는 테스트 될 하나 또는 그 이상의 약물에 대한 하나 또는 그 이상의 상기 세포 타입의 기대되는 또는 확인된 효과에 기반하여 동시-배양을 위하여 선택되는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    여기서 시험관 내 방법은 상기 동시-배양이 하나 또는 그 이상의 약물에 노출되는 단계 d)를 포함하는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 시험관 내 방법은, 상기 동시-배양은 하나 또는 그 이상의 추가적인 생물학적 과정을 측정하기 위하여 하나 또는 그 이상의 형광 시약에 노출시키는, 단계 f)를 추가로 포함하는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    광학적 이미징 (optical imaging)은 현미경술 및/또는 광도계로 수행되는 것을 특징으로 하는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나 또는 그 이상의 세포 타입은 세포 주 또는 하기의 일차 조직 세포 서브세트(primary tissue cell subsets)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법: 간 세포, 종양 세포, 뇌 세포, 표피 세포 (epithelial cells), 내피세포 (endothelial cells), 면역시스템 세포 ( immune system cells), 다분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 배아 줄기세포 (embryonic stem cells), 폐 세포, 신장 세포, 동맥 세포(artery cells), 뼈 세포, 연골 세포 (cartilage cells), 근육 세포, 췌장 세포, 장 세포 (intestinal cells), 피부 세포, 섬유아세포(fibroblasts), 곰팡이 세포 (fungal cells) 또는 박테리아.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험관 내 약물 테스트 어세이에서 분석되는 상기 하나 또는 그 이상의 세포 타입 중 적어도 하나 또는 단계 c)의 선택적으로 첨가된 라벨 되지 않은 세포 타입 중 적어도 하나는 간 세포인 것을 특징으로 하는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 캡슐화된 세포의 하나 또는 그 이상 타입 중 적어도 하나는 환자 암 샘플로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 세포 타입 중 적어도 하나는 박테리아 또는 곰팡이 세포인 것을 특징으로 하는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    여기서 분석되는 약물은 항생제 또는 진균제인, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    여기서 분석되는 상기 다수의 생물학적 과정 중 적어도 하나는 하기를 포함하는 목록으로부터 선택되는, 약물 테스트를 위한 시험관 내 방법: 항-미생물 저항성 또는 감수성 (anti-microbial resistance or susceptibility), 박테리아 증식(bacterial proliferation), 항균력 또는 정균력 (bactericidal or bacteriostatic activity).
  13. 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입에서 다수의 생물학적 과정으로 하나 또는 그 이상의 관심있는 약물의 효과를 테스트 하기에 적절한 시험관 내 약물 테스트 키트로서, 상기 키트는 하기를 포함하는, 시험관 내 약물 테스트 키트:
    - 상기 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입에서 분석되는 각 생물학적 과정을 위한 형광 또는 생물 발광 리포터 유전자를 발현하는 하나 또는 그 이상의 알기네이트-캡슐화된 타겟 세포 타입을 함유하는 적어도 하나의 바로-사용할 수 있는 (ready-to-use) 마이크로웰 플레이트, 여기서 하나 이상의 세포 타입이 있는 경우, 해당하는 캡슐 모두, 또는 하나를 제외한 모두가, 각각 다른 타입의 형광물질로 라벨되는 것을 특징으로 한다.
  14. 제13항에 있어서,
    여기서 상기 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입 중 적어도 하나는 간 세포인, 시험관 내 약물 테스트 키트.
  15. 제13항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 상기 형광소 (fluorophore) -라벨 된 알기네이트-캡슐화된 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입은 하나 또는 그 이상의 환자-유래한 세포 타입과 동시-배양되는, 시험관 내 약물 테스트 키트.
  16. 제15항에 있어서,
    여기서 하나 또는 그 이상의 환자-유래 세포 타입은 분석되는 각 다수의 생물학적 과정을 위한 적어도 하나의 형광 리포터 유전자를 함유하기 위하여 유전적으로 조작되는, 시험관 내 약물 테스트 키트.
  17. 제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 하나 또는 그 이상의 환자-유래 세포 타입은 형광소로 라벨 된 알기네이트 바이오폴리머로 각 캡슐화 되는, 시험관 내 약물 테스트 키트.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 분석되는 다수의 생물학적 과정은 하기를 포함하는 목록으로부터 선택되는, 시험관 내 약물 테스트 키트:
    세포 증식, 염증, 종양 성장 및 억제, 약물 독성, 혈관신생, 면역 활성화, 해독 반응, 호르몬 반응, 외래물질 반응 (xenobiotic response), 유전독성 스트레스 반응 (genotoxic stress response) 및 사멸.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 하나 또는 그 이상의 타겟 세포 타입은 하기를 포함하는 목록으로부터 선택되는, 시험관 내 약물 테스트 키트:
    간 세포, 종양 세포, 뇌 세포, 표피 세포 (epithelial cells), 내피세포 (endothelial cells), 면역 시스템 세포 ( immune system cells), 다분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 폐 세포, 신장 세포, 동맥 세포(artery cells), 뼈 세포, 연골 세포 (cartilage cells), 근육 세포, 췌장 세포, 장 세포 (intestinal cells), 섬유아세포(fibroblasts), 또는 피부 세포.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 상기 하나 또는 그 이상의 약물은 상기의 캡슐화된 타겟 세포 타입 내에서 생물학적 과정에 대한 상기 하나 또는 그 이상의 약물의 효과를 동정하기 위하여 상기 적어도 하나의 바로-사용 가능한 마이크로웰 플레이트의 웰 당 테스트되는, 시험관 내 약물 테스트 키트.
  21. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 하나 이상의 약물은 상기 약물 사이의 상호작용을 동정하기 위하여 상기의 적어도 하나의 바로-사용-가능한 마이크로웰 플레이트의 웰 당 테스트 되는, 시험관 내 약물 테스트 키트.
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