KR20220092523A - 변이체 인터루킨-2 (vIL-2) 폴리펩타이드를 코딩하는 종양용해성 바이러스 벡터 - Google Patents

변이체 인터루킨-2 (vIL-2) 폴리펩타이드를 코딩하는 종양용해성 바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변이체 인터루킨 2(vIL-2) 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 이식유전자로서 포함하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 종양용해성 벡터 및 생리학적으로 허용되는 담체, 완충제, 부형제, 보조제, 첨가제, 방부제, 보존제, 충전제, 안정화제 및/또는 증점제 중 하나 이상을 포함하는 의약 조성물도 제공한다. 본 발명의 특정 목적은 암 또는 종양, 좋기로는 고형 종양의 치료에 사용하기 위해 상기 종양용해성 바이러스 벡터 또는 의약 조성물을 제공하는 것이다.

Description

변이체 인터루킨-2 (vIL-2) 폴리펩타이드를 코딩하는 종양용해성 바이러스 벡터
본 발명은 생명과학 및 의학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간의 암 치료법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 변이체 인터루킨-2(vIL-2) 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 종양용해성 바이러스 벡터에 관한 것이다.
면역자극성 사이토카인 인터루킨-2(IL-2)는 γ-사슬 사이토카인 계열에 속한다. 이것은 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 백혈구의 성장 인자이다. IL-2는 주로 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 림프구에 의해 생성되며 T 세포 증식 및 활성화 유도, B 세포 성장 강화, 단핵구 및 자연 살해 세포 활성화와 같은 다양한 면역학적 효과를 갖는다. IL-2는 광범위한 면역 장애의 치료제로 연구되어 왔지만 고용량의 IL-2 전신 투여와 관련된 부작용으로 인해 임상 적용이 제한되었다. IL-2는 IL-2Rγ(또는 CD132), IL-2Rβ(또는 CD122) 및 IL-2Rα(또는 CD25)의 세 가지 서브유닛으로 구성된 그의 수용체에 결합하여 신호를 보낸다. 조절 T 세포(CD4+Foxp3+; Treg)를 포함한 CD8+ 및 CD4+ T 세포는 양자 모두 삼량체 형태를 구성적으로 발현한다. IL-2Rγ 및 IL-2Rβ 서브유닛으로 구성된 IL-2 수용체의 이량체 중간체 형태는 NK 세포 및 휴지 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 발현된다.
CD8+ 이펙터 세포를 확장하고 활성화하는 IL-2의 능력으로 인해 신장 세포 암종 및 흑색종의 치료에 대한 IL-2의 적용이 장려되었다. 단점으로 IL-2는 면역 억제 조절 세포, 주로 Treg의 확장 및 유지에도 중심 역할을 한다는 것이다. IL-2 요법이 일부 환자에서 오래 지속되는 반응을 나타내긴 했지만, 전신 전달은 여러 임상 시험에서 한계를 입증하였다. 고용량 IL-2가 효과적인 치료를 위해 필요하면서도, 간, 심장 및 폐 문제를 유발하는 반면 Treg 유도를 통해 항종양 효능이 손상된다.
선행 기술에서 Levin et al., 2012는 IL-2Rβ에 대한 결합 친화도가 증가된 IL-2 '슈퍼카인'(super-2라고도 함)을 조작하여 CD25 발현을 위한 IL-2의 기능적 요구 사항을 제거하였다. IL-2와 비교하여 IL-2 슈퍼카인은 세포독성 T 세포의 우수한 확장을 유도하여 생체내 항종양 반응을 개선하고 그에 비례하여 T 조절 세포의 더 적은 확장을 유도하고 폐부종을 감소시켰다.
US9428567은 야생형 인간 IL-2보다 작은 IL-2Rβ 서브유닛에 대한 평형 해리 상수를 갖는 인간 인터루킨-2(hIL-2) 변이체를 개시하고 있다. 이 변이체는 또한 야생형 IL-2에 비해 IL-2Rα 또는 IL-2Rγ 서브유닛에 대한 감소된 결합을 나타낼 수 있다.
T 세포를 자극하는 IL-2의 능력을 감안할 때, IL-2를 코딩하는 바이러스는 T 세포 요법을 향상시킬 가능성이 있다(Itzhaki et al., 2013; Schwartz et al., 2002). T 세포 요법에는 종양-침윤 림프구(TIL), 수용체-변형 T 세포(TCR) 및 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T)가 포함된다. T 세포는 환자의 혈액이나 종양에서 추출되어 실험실에서 활성화 및/또는 변형되고 확장되어 치료 요법으로 환자에게 다시 제공된다(Tahtinen et al., 2016). 그러나 고도로 면역억제적인 종양 미세 환경은 입양 전달된 T 세포를 기능저하로 만들기 때문에, T 세포 주입은 각각 화학요법 및 고용량 전신 IL-2를 사용한 사전 및 사후 조절이 필요하며, 둘 다 심각한 독성을 유발한다(Schwartz, Stover et al. 2002). , Itzhaki, Levy et al. 2013).
수년간의 개발 끝에 종양용해성 바이러스가 현재 암 치료제로 사용되기 시작하였다. 작용 기전 및 바이러스의 효능에 영향을 미치는 요인과 관련된 몇 가지 발견이 있었지만, 여전히 바이러스 요법에 대한 전반적인 반응을 결정하는 경로를 식별할 필요가 있다. 임상 시험에서 종양용해성 바이러스는 유리한 안전성 프로파일과 유망한 효능을 입증하였다.
WO2014170389는 종양용해성 아데노바이러스 벡터 단독으로 또는 암에 대한 치료 용도 및 치료 방법을 위한 치료 조성물과 함께 사용하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 입양 세포 치료 조성물 및 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 개별 투여가 개시되어 있다. 입양 세포 요법(ACT: adoptive cell therapies)은 암을 치료하기 위한 강력한 접근 방식이지만 감염 및 이식편대숙주병과 같은 다른 질병도 치료할 수 있다. 입양 세포 전달은 이식의 면역학적 기능 및 특성을 전달하는 것을 목표로 생체외 성장 세포, 가장 일반적으로 면역-유래 세포를 숙주로 수동 전달하는 것이다. WO2014170389는 또한 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 핵산 서열을 개시하고 있다.
WO2016146894는 이중특이 모노클로날 항체를 인코딩하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터를 개시하고 있다.
US2019062395는 IL-2 변이체를 인코딩하는 이식유전자(transgene)를 포함하는 변형된 종양용해성 백시니아 바이러스 벡터를 개시한다.
특히 상당한 전이 부담이 있는 환자에서 종양용해성 바이러스 치료에 대한 반응은 여전히 개선될 여지가 있다. 종양용해성 바이러스의 활성과 관련된 경로의 추가 특성화는 바이러스 요법의 효능을 개선하기 위한 잠재적인 표적을 밝힐 수 있다. 따라서 단독으로든 다른 요법과 함께 조합하여서든, 종양용해성 바이러스 벡터의 효능은 여전히 개선될 수 있다. 본 발명은 특정 바이러스 벡터, 예를 들어, 입양 세포 요법을 이용함으로써 암 치료를 위한 효과적인 도구 및 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 주로 면역억제성 Treg의 자극인 IL-2 요법의 사용에서 나타나는 한계를 극복하는 것이다. 본 발명자들은 이식유전자로서 변이체 IL-2(vIL-2) 폴리펩타이드를 발현하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터를 설계하였다. vIL-2 유전자는 천연 IL-2 유전자에 점 돌연변이가 있어 CD25(수용체 소단위 α)에 대한 결합을 제거한다. 따라서 발현된 vIL2는 Treg 세포를 자극할 수 없고, 결과적으로 세포독성 T 세포의 바람직한 확장을 초래한다. 이 구성에서 바이러스 복제는 암세포로 제한되고 이식유전자(vIL-2) 발현은 바이러스 복제와 연결된다. 따라서 vIL-2는 종양 미세환경에서 필요한 경우에만 발현된다: 종양 미세환경에서 암세포 내 바이러스 복제는 종양-관련 항원의 위험 신호 및 확산을 유발하여, 세포를 죽이기 위해 면역 체계에 의한 암세포 인식을 촉진한다. 더욱이, 면역자극성 사이토카인의 발현은 이 효과를 더욱 부스팅한다.
따라서, 본 발명의 한 가지 목적은 비효율적이고, 안전하지 않고, 예측할 수 없는 암 치료법의 문제를 극복하기 위한 간단한 방법 및 도구를 제공하는 것이다. 일 구체예에서, 본 발명은 세포 요법을 위한 신규 방법 및 수단을 제공한다. 본 발명의 목적은 독립항에 기재된 것을 특징으로 하는 특정 바이러스 벡터, 방법 및 배열에 의해 달성된다. 본 발명의 특정 실시예는 종속항에 개시되어 있다.
구체적으로, 본 발명은 변이체 인터루킨 2(vIL-2) 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 이식유전자로서 포함하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 종양용해성 벡터 다음 중 적어도 1종, 즉: 생리학적으로 허용되는 담체, 완충제, 부형제, 보조제, 첨가제, 방부제, 보존제, 충전제, 안정화제 및/또는 증점제을 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 특정 목적은 암 또는 종양, 좋기로는 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 상기 종양용해성 바이러스 벡터 또는 의약 조성물을 제공하는 것이다.
도 1. 변이체 IL-2(vIL-2)는 기존의 IL-2보다 면역 세포 집단 증식에 더 유익한 효과를 나타낸다. 재조합 인간(rh) vIL-2는 기존의 rhIL-2와 비교하여 A) CD3+ CD8+T 세포 및 B) CD3-T CD56+ NK 세포 집단의 상당한 증가를 유도한다. C) rhIL-2는 (rh)vIL-2보다 더 많은 CD3+T CD4+T 세포 집단의 증식을 유도한다. 3일 후, (rh)vIL-2는 rhIL-2보다 CD8+ 이펙터 T 세포 및 NK 세포의 증식을 유도하는 데 더 강력했던 반면, CD4+ T 세포(Treg 포함)의 수준은 변이체에서 더 낮게 유지되었다. 데이터는 평균 + 평균 표준 오차(SEM)로 표시된다. **p<0.01.
도 2. 이펙터 및 소진된(exhausted) T 세포에 대한 vIL-2의 효과. A) 사전 활성화되고 rhIL-2, (rh)vIL-2 또는 배지만으로 배양된 CD3+ T 세포 모 집단의 CD8/CD4+ T 세포 비율. 대안적으로, 사전 활성화된 T 세포를 비감염(B) 또는 감염된(C) 암세포의 존재 하에 배지와 함께, 또는 rhIL-2, (rh)vIL-2와 함께 배양하였다. rhIL-2 및 (rh)vIL-2는 암세포의 존재 및 부재(A 및 B)에서 CD8/CD4 세포 비율에 유사한 효과를 나타냈다. 그러나 암세포가 종양용해성 바이러스에 감염되었을 때 rhvIL-2는 CD4+ 세포보다 CD8+CD27-CD62L-CD45RO+ 세포가 우세한 경향을 유도하였다(C). 평균을 표시하였다. 바이러스: Ad5/3-E2F-d24; CC: 암세포.
도 3. 중앙 기억 T 세포에 대한 vIL-2의 효과. A) CD3+ T 세포 모 집단의 CD8/CD4+ T 세포 비율을 사전-활성화하고 rhIL-2, (rh)vIL-2와 함께 또는 배지만으로 배양하였다. 대안적으로, 사전-활성화된 T 세포를 비감염(B) 또는 감염된(C) 암세포의 존재 하에 배지와 함께 또는 rhIL-2, (rh)vIL-2와 함께 배양하였다. 본 발명자들은 암세포가 없는 상태에서 rhIL-2와 (rh)vIL-2 사이의 CD8/CD4 Tcm 비율에서 어떤 차이도 발견하지 못하였다(A). 종양 세포의 존재 하에서 본 발명자들은 먼저 2일째에 비율의 감소를 관찰한 후 4일째에 증가하는 것을 관찰하였다. 다시 한번, (rh)vIL-2는 기존의 rhIL보다 Tcm 집단에서 더 높은 CD8 대 CD4 비율을 유도하였다(B). 백본 바이러스의 존재하에서 CD8/CD4 Tcm 세포는 제2일에 (rh)vIL-2가 있는 그룹에서 더 높았고 4일까지 일정하게 유지되었으며, 다른 그룹 중 이들 세포의 비율은 (rh)vIL-2 그룹에 비해 증가되었다(C). 이것은 (rh)vIL-2가 rhIL-2와 유사한 방식으로 Tcm 구획에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 평균을 나타내었다. 바이러스: Ad5/3-E2F-d24, CC: 암세포.
도 4. 이펙터 기억 T 세포에 대한 vIL-2의 효과. A) CD3+ T 세포 모 집단의 CD8/CD4+ T 세포 비율을 사전-활성화하고 rhIL-2, (rh)vIL-2와 함께 또는 배지만으로 배양하였다. 대안적으로, 사전-활성화된 T 세포를 비감염(B) 또는 감염된(C) 암세포의 존재 하에 배지와 함께, 또는 rhIL-2, (rh)vIL-2와 함께 배양하였다. 암세포가 존재하지 않는 경우(A), rhIL-2와 (rh)vIL-2 사이의 CD8/CD4 Tem 비율의 차이를 관찰하지 못하였다. 암세포가 존재하는 경우, rhIL-2 및 (rh)vIL-2는 4일째까지 높은 비율의 CD8/CD4 Tem을 유도한다(B). 암세포가 감염되었을 때, 본 발명자들은 4일째(C)에 (rh)vIL-2 그룹에서 높은 CD8/CD4 Tem 비율을 향한 경향을 관찰하였다. 평균을 나타내었다. 바이러스: Ad5/3-E2F-d24, CC: 암세포.
도 5. 작제된 바이러스는 종양용해성이고 일반적인 감기 바이러스인 아데노바이러스 혈청형 5의 백본을 갖는다. A) E2F 프로모터가 있는 키메라 5/3 종양용해성 아데노바이러스를 도식적으로 나타낸 도면; E1A에서 24개 염기쌍 결실; E1B 결실 비활성화; E3 영역에 삽입된 인간 vIL-2 이식유전자; 및 Ad5 섬유의 Ad3 혈청형 노브(knob). B) 바이러스는 생체외에서 종양용해 효능이 있다. BB는 이식유전자가 없는 백본 바이러스를 나타낸다. C) 바이러스에 감염된 세포는 이식유전자 산물을 성장 배지로 분비한다. Ad5/3-E2F-d24-IL-2와 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 간에는 바이러스의 세포 살해 능력에는 큰 차이가 없었으며, 따라서 이는 vIL-2 이식유전자의 존재가 바이러스의 종양용해 효능을 감소시키지 않는다는 것을 나타낸다(B). 또한, Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 감염된 세포는 사이토카인을 분비할 수 있었다(C).
도 6. A) 종양용해성 아데노바이러스 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2는 CD8+ 이펙터 세포 우성(dominance)을 유도하고 Treg 분화를 유도하지 않는다. A) 기존의 IL-2를 코딩하는 바이러스와 달리 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2는 활성화된 CD4+ T 세포보다 활성화된 이펙터 T 세포(CD3+ CD8+ CD25+ CD69+)의 존재를 유도한다. B) 기존의 IL-2를 코딩하는 바이러스는 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2와 달리, 면역억제성 Treg의 분화를 자극한다. CD25+ CD69+ 활성화된 이펙터 T 세포의 CD8/CD4 비율은 제3일과 제6일에 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 처리한 그룹이 기존 IL-2를 발현하는 바이러스로 처리한 그룹보다 유의하게 더 높았다(A). Ad5/3-E2F-d24-vIL-2는 Ad5/3-E2F-d24-IL-2(B)와 같이 Treg 분화를 유도하지 않았다. 데이터는 평균 + SEM으로 표시된다. ****p<0.0001; **p=0.01. Ad5/3-vIL-2: Ad5/3-E2F-d24-vIL2; Ad5/3-IL-2: Ad5/3-E2F-d24-IL2; Ad5/3: Ad5/3-E2F-d24; PBMC: 인간 말초 혈액 단핵 세포.
도 7. 햄스터에서 Ad5/3-E2F-d24-vIL2 강화된 항종양 효능 및 전체 생존: 2*106 HapT1 종양이 시리아 햄스터에 피하 이식되었다. (A-D) 제1일, 4일, 8일 및 13일에 1*109 VP의 Ad5/3-E2F-d24-IL-2, Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 또는 비무장(unarmed) 대조군 바이러스 Ad5/3-E2F로 처리된 햄스터, 또는 PBS가 투여된 모크(mock)에서의 제16일까지의 개별 종양 성장. Ad5/3-E2F-d24-vIL-2는 다른 그룹과 비교하여 더 나은 종양 조절을 보여주었다. (E) HapT1 종양이 확립된 햄스터를 제1, 4, 8, 13일에 다른 아데노바이러스로 치료하였다. 제18일부터 이들 그룹은 5일마다 6회의 추가 치료를 받았다. Ad5/3-E2F-d24-vIL2는 Ad5/3-E2F-d24-IL-2를 비롯한 다른 그룹과 비교하여 종양 성장을 유의하게 감소시켰다. 햄스터는 종양이 더 이상 보이지 않을 때 완치된 것으로 간주되었다. 정규화된 중앙 종양 부피 및 SEM. ***, P < 0.001; *, P < 0.05. (F) 제30일까지 치료된 종양의 백분율. (G) 전체 생존 및 통계적 유의성.
도 8: 사이토카인으로 무장된(armed) 아데노바이러스 처리 후의, 종양-특이적 면역학적 기억 유도: HapT1 종양이 치유된 모든 햄스터에 (A) HapT1(동일한 종양) 및 (B) DDT1-MF2(다른 종양)을, 햄스터의 등 상부에 이식하여 다시 챌린지하였다. 사이토카인 무장된 아데노바이러스를 사용한 이전 치료는 재챌린지 후 HapT1 세포의 성장을 감소시키는 것으로 나타났다. 가장 중요하게는, vIL-2 무장 아데노바이러스는 HapT1 재챌린지 후 동물의 40%(5마리 중 2마리)에서 완전한 종양 거부를 유도할 수 있었다.
도 9. 변이체 IL-2 바이러스 치료는 종양 미세환경에서 상당한 종양 감소 및 CD4+ 및 CD8+의 적당한 침투 수준을 달성한다. HapT1-보유 햄스터는 PBS(모크), Ad5/3-E2F-d24, 또는 Ad5/3-E2F-d24-IL-2, 또는 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 4회 종양내 주사로 처리하였다. 유세포 분석을 통한 면역 세포의 검출을 위해 제16일째(4회 처리 후)에 햄스터로부터 종양을 수집하였다. (A) 제0일 및 제16일의 종양 부피. (B) CD4+ 세포의 빈도, (C) CD8+ 세포의 빈도. 데이터는 평균 + SEM으로 표시된다. *p<0.05
도 10. 변이체 IL-2 바이러스 치료는 종양 미세환경에서 높은 수준의 IL-2를 달성한다. RT-qPCR을 통한 상대적 mRNA 정량화를 위해 16일째(4회 처리 후)에 햄스터로부터 종양을 수집하였다. 햄스터 IL-2(하단 막대), 인간 IL-2 및 IL-2 변이체(상단 막대)의 종양내 상대적인 mRNA 발현 수준. 데이터는 평균 + SEM으로 표시된다. *p<0.05,****p<0.0001
도 11. 바이러스-처리 동물의 전체적인 mRNA 발현 프로파일. 제16일째에 햄스터로부터 종양을 수집하고 Nanostring을 통해 mRNA 발현 프로파일을 결정하였다. (A) Ad5/3-E2F-d24의 mRNA 발현 프로파일, (B) Ad5/3-E2F-d24-IL-2의 mRNA 발현 프로파일 (C) Ad5/3-E2F-d24-IL-2 변이체의의 mRNA 발현 프로파일. 레퍼런스 그룹(-1 > log2 배수 변화 > 1)과 비교하여 통계적으로 유의하게 다른(조정된 p 값 < 0.05) 발현인 유전자에 대한 이름이 표시된다.
도 12. 야생형 인간 IL-2 또는 변이체 IL-2를 코딩하는 종양용해성 아데노바이러스로 치료된 종양에서 T-세포 수용체 신호전달 및 세포독성 화합물의 mRNA 발현 수준. 제16일에 햄스터로부터 종양을 수집하고 Nanostring을 통해 mRNA 발현 수준을 결정하였다. (A) T-세포 수용체(TCR)-복합체 및 신호전달과 관련된 유전자에 대한 mRNA 수, (B) 세포독성 화합물과 관련된 유전자에 대한 mRNA 수, (C) 변이체 IL-2 mRNA 상대 발현과 GZMK 또는 SAP1 mRNA 수 간의 피어슨 상관관계, 또는 두 후자의 유전자 사이의 피어슨 상관관계. 데이터는 레퍼런스 그룹(모크)과 통계적으로 다른 유전자의 평균 + SEM으로 표시된다. ns - 유의하지 않음
도 13. 인간 IL-2 또는 변이체 IL-2를 코딩하는 종양용해성 아데노바이러스로 치료된 종양에서 항염증 및 전염증 신호 유전자의 mRNA 발현 수준. 제16일에 햄스터로부터 종양을 수집하고 Nanostring을 통해 mRNA 발현 수준을 결정하였다. (A) 공동 자극 및 공동 억제 분자와 관련된 유전자에 대한 mRNA 수. (B) 항원 제시 세포 및 억제 골수 세포와 관련된 유전자에 대한 mRNA 수. (C) 항염증 및 전염증 신호와 관련된 신호와 관련된 유전자에 대한 mRNA 수. 데이터는 레퍼런스(모크)와 통계적으로 다른 유전자의 평균 + SEM으로 표시된다. *p<0.05,**p<0.01
인터루킨 2 (IL-2) 및 이의 변이체
본원에서, "IL-2"는 천연이든 재조합이든 야생형 IL-2를 의미한다. 성숙한 인간 IL-2는 133개 아미노산 서열로서 발생한다(신호 펩타이드 없이 추가 20개 N-말단 아미노산으로 구성됨). 인간 IL-2의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1)은 Genbank에서 수탁 번호 NP000577.2로 발견된다. 성숙한 인간 IL-2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 나타나 있다.
본원에 사용된 "IL-2 변이체", "변이체 IL-2", "vIL2" 또는 "vIL-2"는, 인터루킨-2 폴리펩타이드에 대해 특이적인 치환이 만들어진 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산(즉, 유전자)을 의미한다. 본원에서 용어 "폴리펩타이드"는 길이 또는 번역후 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 인산화)에 관계없이 아미노산 잔기의 임의의 사슬을 지칭한다. 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 또한 천연 IL-2 폴리펩타이드 사슬 내의 또는 다른 잔기에서의 하나 이상의 부위에서의 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 변형을 특징으로 할 수 있다. 본 개시내용에 따르면, 임의의 이러한 삽입, 결실, 치환 및 변형은 좋기로는 수용체 서브유닛 IL-2α에 대한 감소된 결합을 나타내지만 IL-2Rβ 결합 활성은 유지하거나 개선하는 변이체 IL-2를 생성한다. 예시적인 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 변이체는 또한 IL-2의 다른 위치(즉, 변이체의 활성 또는 2차 또는 3차 구조에 최소한의 영향을 미치는 것)에서 보존적 변형 및 치환을 포함할 수 있다.
예시적인 변이체 IL-2 폴리펩타이드는, SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리펩타이드가 IL-2Rα에 결합하는 친화도보다 낮은 친화도로 IL-2Rα에 결합하고 SEQ ID NO:2와 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 야생형 IL-2에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 87%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일할 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 아미노산 잔기의 수 또는 함량의 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 IL-2는 야생형 IL-2보다 더 많거나 더 적은 수의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 예시적인 변이체 폴리펩타이드는 야생형 IL-2에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 함유할 수 있다. 다양일 구체예에서, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 단일 아미노산 잔기, 예를 들어 SEQ ID NO: 2의 위치 80의 잔기의 부가, 결실 또는 치환에 의해 야생형 IL-2와 상이할 수 있다. 마찬가지로, 예시적인 변이체 폴리펩타이드는 2개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 SEQ ID NO:2의 위치 24, 45, 65, 72, 74, 80, 81, 85, 86, 89, 92, 93, 109 및 117의 잔기에서의 2개 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 야생형과 상이할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 I24V, Y45A P65H, L72G, Q74R, Q74H, Q74N, Q74S, L80F, L80V, R81I, R81T, R81D, L85V, I86V, I89V, I92F, V93I, D109L, F117A로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 좋기로는, 변이체 폴리펩타이드는 치환 L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 또한 변이체 IL-2 폴리펩타이드 및 또 다른 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 또는 키메라 폴리펩타이드로서 제조될 수 있다. 변이체 IL-2 및 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 키메라 폴리펩타이드가 생성될 수 있다. 키메라 단백질의 항체 또는 항원 결합 성분은 표적화 모이어티로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질을 세포 또는 표적 분자의 특정 서브셋에 국소화하는 데 사용할 수 있다.
본 발명은 특히 이식유전자로서 임의의 상기 언급된 변이체 IL-2 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 종양용해성 바이러스 벡터의 설계에 관한 것이다.
바이러스 벡터
종양용해성 바이러스 벡터는 암세포를 선택적으로 감염시키고 파괴할 수 있는 치료학적으로 유용한 항암 바이러스이다. 대부분의 현재 종양용해성 바이러스는 종양 선택성을 위해 적응되거나 조작되지만, 레오바이러스 및 볼거리 바이러스와 같이 암세포에 대한 자연적 선호를 갖는 바이러스가 있다. 많은 조작된 종양용해 바이러스 벡터는 종양 특이적 프로모터 요소를 이용하여 암세포에서만 복제가 가능한다. 암세포에 의해 선택적으로 발현되는 표면 마커는 또한 이들을 바이러스 진입 수용체로 사용함으로써 표적화될 수 있다. 아데노바이러스, 레오바이러스, 홍역, 단순 포진, 뉴캐슬병 바이러스 및 백시니아를 포함한 많은 바이러스가 현재 임상적으로 종양용해제로 테스트되었다.
좋기로는, 본 발명에서 사용되는 종양용해 벡터는 인간 또는 동물의 치료에 적합한 아데노바이러스 벡터이다. 본원에 사용된 "종양용해성 아데노바이러스 벡터"는 종양 대 정상 세포에서 선택적인 복제에 의해 암세포를 감염시키고 사멸시킬 수 있는 아데노바이러스 벡터를 지칭한다.
본 발명의 일 구체예에서, 아데노바이러스 벡터는 인간 바이러스의 벡터이다. 일 구체예에서, 아데노바이러스 벡터는 Ad5, Ad3 및 Ad5/3 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에 사용된 표현 "아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 핵산 백본"은 Ad5의 게놈을 지칭한다. 마찬가지로, "아데노바이러스 혈청형 3(Ad3) 핵산 백본"은 Ad3의 게놈을 지칭한다. "Ad5/3 벡터"는 Ad5 및 Ad3 벡터 모두를 포함하거나 이들의 일부를 갖는 키메라 벡터를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터의 백본은 특이적 돌연변이를 갖는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 또는 혈이청형 3(Ad3) 핵산 백본이다. 예를 들어 벡터의 섬유 영역이 변형될 수 있다. 일 구체예에서 골격은 Ad3 섬유 노브를 추가로 포함하는 Ad5 핵산 골격이다. 다시 말해서, 작제물은 Ad3로부터의 섬유 노브를 갖는 반면, 게놈의 나머지 또는 게놈의 나머지의 대부분은 Ad5로부터 유래된다(예를 들어, WO2014170389 참조).
아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 예컨대 바이러스 영역을 결실, 삽입, 돌연변이 또는 변형시킴으로써 변형될 수 있다. 벡터는 복제와 관련하여 종양 특이적으로 만들어진다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 종양 특이적 프로모터의 삽입(예컨대 E1을 구동하기 위한), 영역의 결실(예컨대 "Δ24"에 사용된 E1의 불변 영역 2, E3/gp19k, E3/6.7k) 및 이식유전자 또는 이식유전자들의 삽입과 같은 E1, E3 및/또는 E4에서의 변형을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 일반적으로 아데노바이러스 벡터의 복제를 지원하는 것으로 알려진 E1B 19K 유전자(SEQ ID NO: 3)는 본 벡터에서 무력화 결실 dE1B 19K(SEQ ID NO: 4)를 갖는다. E1B 19K의 결실은 암세포를 TNF알파에 민감하게 하여 세포자멸사를 촉진하는 것으로 알려져 있다(White et al., 1992).
야생형 E1B 19K 유전자의 서열은 다음과 같다(결실 가능한 영역은 밑줄):
Figure pct00001
따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 바이러스 벡터에서 dE1B 19K에 대한 서열은 다음과 같다:
Figure pct00002
종양 특이적 종양용해성 아데노바이러스 생성을 위한 한 가지 접근법은 E1의 불변 영역 2(CR2)에 영향을 미치는 24개 염기쌍(bp) 결실("Δ24" 또는 "d24")을 조작하는 것이다. 야생형 아데노바이러스에서 CR2는 합성(S) 단계, 즉 DNA 합성 또는 복제 단계의 유도를 위해 세포 Rb 종양 억제인자/세포 주기 조절 단백질에 결합하는 역할을 한다. pRb와 E1A 사이의 상호작용은 E1A 단백질 보존 영역의 아미노산 121에서 127을 필요로 한다. 벡터는 Heise C. et al.에 따른 벡터의 아미노산 122-129에 해당하는 뉴클레오타이드의 결실을 포함할 수 있다[(2000, Nature Med 6, 1134-1139) 및 Fueyo J. et al. (2000, Oncogene 19(1):2-12) 참조]. Δ24를 갖는 바이러스는 G1-S 체크포인트를 극복하며, 이러한 상호작용이 필요하지 않은 세포, 예컨대 전부는 아니어도 대부분의 인간 종양을 포함하는 Rb-p16 경로에 결함이 있는 종양 세포에서만 효율적으로 복제하는 능력이 감소된 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 벡터는 아데노바이러스 E1의 Rb 결합 불변 영역 2에 24bp 결실"Δ24" 또는 "d24")을 포함한다(도 5 참조).
E1A 내인성 바이러스 프로모터를 예를 들어 종양 특이적 프로모터로 대체하는 것도 가능하다. 예를 들어, E2F1(예컨대 Ad5 기반 벡터 내) 또는 hTERT(예컨대 Ad3 기반 벡터 내) 프로모터는 E1A 내인성 바이러스 프로모터 대신에 사용될 수 있다. 벡터는 E1A의 종양 특이적 발현을 위한 E2F1 프로모터를 포함할 수 있다.
E3 영역은 생체외 바이러스 복제에 필수적이지 않지만 E3 단백질은 숙주 면역 반응의 조절, 즉 선천적 및 특정 면역 반응의 억제에서 중요한 역할을 한다. 본 발명의 일 구체예에서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 E3 영역에서 핵산 서열의 결실은 바이러스 gp19k 및 6.7k 리딩 프레임의 결실이다. E3에서 gp19k/6.7K 결실은 아데노바이러스 E3A 영역에서 965개 염기쌍의 결실을 의미한다. 생성된 아데노바이러스 작제물에서, gp19k 및 6.7K 유전자가 모두 결실된다(Kanerva A et al. 2005, Gene Therapy 12, 87-94). gp19k 유전자 산물은 소포체의 주요 조직적합성 복합체 I(MHC1, 인간에서 HLA1으로 알려짐) 분자에 결합하여 이를 격리하고, 세포독성 T-림프구에 의한 감염된 세포의 인식을 방지하는 것으로 알려져 있다. 많은 종양이 HLA1/MHC1이 결핍되어 있기 때문에 gp19k의 결실은 바이러스의 종양 선택성을 증가시킨다(바이러스는 정상 세포에서 야생형 바이러스보다 더 빨리 제거되지만 종양 세포에서는 차이가 없다). 6.7K 단백질은 세포 표면에서 발현되며 TNF-관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL) 수용체 2를 하향 조절하는 데 참여한다.
본 발명의 일 구체예에서, 이식유전자, 즉 변이체 인터루킨 2(vIL2)를 인코딩하는 유전자는, E3 프로모터 하에 gp19k/6.7k 결실된 E3 영역에 배치된다. 이것은 바이러스의 복제와 E3 프로모터의 후속 활성화를 허용하는 종양 세포에 대한 이식유전자 발현을 제한한다. 특정 구현예에서 변이체 인터루킨 2를 인코딩하는 핵산 서열은 바이러스 gp19k 및 6.7k 리딩 프레임의 결실된 핵산 서열의 위치에 삽입된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 E3 gp19k/6.7k는 벡터에 유지되지만 하나 이상의 다른 E3 영역이 결실되었다(예를 들어, E3 9-kDa, E3 10.2 kDa, E3 15.2 kDa 및/또는 E3 15.3 kDa).
E3 프로모터는 임의의 외인성(예를 들어, CMV 또는 E2F 프로모터) 또는 당업계에 공지된 내인성 프로모터, 구체적으로 내인성 E3 프로모터일 수 있다. E3 프로모터는 주로 복제에 의해 활성화되지만 일부 발현은 E1이 발현될 때 발생한다. Δ24형 바이러스의 선택성은 E1 발현 후에 발생하기 때문에(E1이 Rb에 결합할 수 없을 때), 이들 바이러스는 형질도입된 정상 세포에서도 E1을 발현한다. 따라서, E3 프로모터 매개된 이식유전자 발현을 종양 세포로 제한하기 위해서는 E1 발현도 조절하는 것이 매우 중요한다.
본 발명의 특정 구현예는 이중 선택성 장치에 의해 복제가 p16/Rb 경로로 제한되는 종양용해성 아데노바이러스 벡터(예컨대 Ad5 또는 Ad3 벡터)를 포함한다; 결과적인 E1A 단백질이 세포의 Rb에 결합할 수 없도록 불변 영역 2에서 돌연변이된 아데노바이러스 E1A 유전자 앞에 위치한 E2F (예컨대 E2F1) 종양 특이적 프로모터. 또한, 섬유는 5/3 키메라에 의해 수정되어 종양 세포에 효율적으로 진입할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터는 다음을 포함한다:
1) 아데노바이러스 E1의 Rb 결합 불변 영역 2에서 24bp 결실(Δ24);
2) 바이러스 gp19k 및 6.7k 판독 프레임의 핵산 서열 결실; 및
3) 항목 2)에 정의된 바와 같은 결실된 핵산 서열 대신에 변이체 인터류킨 2(vIL2) 이식유전자를 인코딩하는 핵산 서열.
아래 실험 섹션에서 본 발명자들은 Ad5/3-E2F-d24 백본을 기반으로 하는 종양용해성 아데노바이러스를 구성하고 특성화했으며 이를 vIL2로 무장하였다. 이 바이러스는 E2F 프로모터와 E1A 불변 영역 2에 24개 염기쌍 결실("D24")을 가지고 있어, 모든 암세포의 공통 특징 중 하나인 망막모세포종/p16 경로-결함 세포에서만 복제가 가능한다. E1B 영역이 삭제되어 암세포의 세포자멸사를 유도한다(dE1B 19K). 더욱이, 암세포를 형질도입하는 능력을 개선하고 항종양 효능을 향상시키기 위해 이 바이러스는 혈청형 3에서 유래한 섬유 노브를 특징으로 하는 반면, 나머지 게놈은 혈청형 5에서 유래한다. 가장 중요한 것은 Ad5/3 바이러스는 인간에서 우수한 안전성 프로파일을 가지고 있다는 것이다. 좋기로는, vIL-2로 무장한 종양용해성 바이러스는 현재 치료할 수 없는 고형 종양을 안전하고 효과적으로 치료할 수 있는 잠재적 플랫폼으로서 T-세포 요법 또는 체크포인트 억제제와 함께 사용된다. 특히, Treg가 중요한 역할을 하는 종양 유형이 바람직하게 치료된다.
일 구체예에서, 본 발명은 변이체 인터루킨 2(vIL2) 이식유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 종양용해성 바이러스 벡터, 좋기로는 종양용해성 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다.
바람직한 일 구체예에서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 골격은 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 또는 혈청형 3(Ad3) 핵산 골격이다.
보다 바람직일 구체예에서, 변이체 인터루킨 2(vIL2) 이식유전자를 인코딩하는 상기 핵산 서열은 상기 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 E3 영역에서 결실된 핵산 서열을 대신한다. 가장 좋기로는, E3 영역에서 핵산 서열의 결실은 바이러스 gp19k 및 6.7k 리딩 프레임의 결실이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 벡터는 또한 상기 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 E1 서열에 24 bp 결실(Δ24)을 포함한다.
또 다른 바람직일 구체예에서, 벡터는 또한 -E1B의 무력화 결실((dE1B 19K)을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 벡터눈 Ad5/3 섬유 노브도 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 벡터는 추가의 이식유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 더욱 좋기로는, 추가의 이식유전자는 사이토카인을 인코딩한다. 일 구체예에서, 사이토카인은: TNF알파, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 보체 C5a, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (=RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 및 XCL2로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
더욱 바람직한 구체예에서, 사이토카인은 TNF알파이다.
본 발명에서 사용되는 바이러스 벡터는 또한 상기 기술된 것 이외의 다른 변형을 포함할 수 있다. 임의의 추가 구성요소 또는 변형이 선택적으로 사용될 수 있지만 본 발명에서 필수적인 것은 아니다.
외인성 요소의 삽입은 표적 세포에서 벡터의 효과를 향상시킬 수 있다. 외인성 조직 또는 종양-특이적 프로모터의 사용은 재조합 벡터에서 일반적이며 본 발명에서도 사용될 수 있다.
입양 세포 요법(Adoptive cell therapy)
본 발명의 한 가지 접근법은 암에 반응하고 암을 파괴할 수 있는 면역 림프구의 전달을 사용하여 암 환자를 위한 치료법을 개발하는 것이다. 분리된 종양-침윤 림프구는 배양액에서 대량으로 성장된 후 환자에게 주입된다. 본 발명에서 변이체 인터루킨 2(vIL2) 이식유전자를 인코딩하는 종양용해 벡터는 림프구의 효과를 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 "입양 세포 요법의 효능 증가"라 함은 본 발명의 종양용해 벡터가 입양 세포 치료 조성물과 함께 사용될 경우, 입양 세포 치료 조성물 단독의 치료 효과에 비해 대상체에서 더 강한 치료 효과를 유발할 수 있는 상황을 지칭한다. 본 발명의 특정 구체예는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 대상체에게 본 발명의 종양용해 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 상기 방법은 대상체에 입양 세포 치료 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 입양 세포 치료 조성물 및 벡터는 별도로 투여된다. 입양 세포 치료 조성물 및 아데노바이러스 벡터의 개별 투여는 골수절제 또는 비골수절제 전처리 화학요법 및/또는 방사선에 의해 선행될 수 있다. 입양 세포 요법 치료는 환자에서 암을 줄이거나 없애기 위한 것이다.
본 발명의 특정 구체예는 아데노바이러스 벡터 및 입양 세포 치료 조성물, 예컨대 종양 침윤 림프구, TCR 변형 림프구 또는 CAR 변형 림프구를 사용한 요법에 관한 것이다. 특히 T-세포 요법, 뿐만 아니라 NK 세포 요법 또는 기타 세포 요법과 같은 임의의 다른 입양 요법이 본 발명에서 이용될 수 있다. 실제로, 본 발명에 따르면 입양 세포 치료 조성물은 TIL 요법에서와 같이 변형되지 않은 세포 또는 유전적으로 변형된 세포를 포함할 수 있다. 종양 특이적 표적에 대한 T 세포의 유전적 표적화를 달성하는 두 가지 일반적인 방법이 있다. 하나는 알려진 특이성과 일치하는 인간 백혈구 항원(HLA, 설치류에서 주요 조직적합성 복합체로 알려짐) 유형을 가진 T-세포 수용체(TCR)의 전달이다. 다른 하나는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 인공 분자를 이용하여 세포를 변형시키는 것이다. 이 접근 방식은 HLA에 의존하지 않으며 표적 분자와 관련하여 더 유연한다. 예를 들어, 단일 사슬 항체가 사용될 수 있고 CAR은 또한 공동자극 도메인을 통합할 수 있다. 그러나 CAR 세포의 표적은 표적 세포의 막에 있어야 하는 반면, TCR 변형은 세포내 표적을 활용할 수 있다.
본원에 사용된 "입양 세포 치료 조성물"은 입양 세포 전달에 적합한 세포를 포함하는 임의의 조성물을 지칭한다. 본 발명의 일 구체예에서, 입양 세포 치료 조성물은 종양-침윤성 림프구(TIL), TCR(즉, 이종 T-세포 수용체) 변형된 림프구 및 CAR(즉, 키메라 항원 수용체) 변형된 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 유형을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 입양 세포 치료 조성물은 T-세포, CD8+ 세포, CD4+ 세포, NK-세포, 수지상 세포, 델타-감마 T-세포, 조절 T-세포 및 말초 혈액 단핵 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 유형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, TIL, T-세포, CD8+ 세포, CD4+ 세포, NK-세포, 델타-감마 T-세포, 조절 T-세포 또는 말초 혈액 단핵 세포는 입양 세포 치료 조성물을 형성한다. 본 발명의 한 특정 구체예에서 입양 세포 치료 조성물은 T 세포를 포함한다. 본원에 사용된 "종양 침윤 림프구" 또는 TIL은 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구를 지칭한다. 림프구는 B 세포, T 세포 및 자연 살해 세포의 세 그룹으로 나눌 수 있다. 본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, 입양 세포 치료 조성물은 표적-특이적 키메라 항원 수용체 또는 구체적으로 선택된 T-세포 수용체로 변형된 T-세포를 포함한다. 본원에 사용된 "T-세포"는 CD4+ 헬퍼 세포, CD8+ 세포독성 T-세포 및 γδ T 세포를 포함하는 CD3+ 세포를 지칭한다.
적합한 세포에 더하여, 본 발명에 사용되는 입양 세포 치료 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 완충제, 부형제, 보조제, 첨가제, 방부제, 충전제, 안정화제 및/또는 증점제, 및/또는 대응하는 제품에서 일반적으로 발견되는 임의의 성분과 같은 임의의 다른 제제를 포함할 수 있다. 조성물을 제형화하기 위한 적절한 성분 및 적절한 제조 방법의 선택은 당업자의 일반적인 지식에 속한다.
입양 세포 치료 조성물은 투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태와 같은 임의의 형태일 수 있다. 제형은 용액, 에멀젼, 현탁액, 정제, 펠렛 및 캡슐로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 조성물은 특정 제형으로 제한되지 않으며; 대신에 조성물은 임의의 공지된 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화될 수 있다. 의약 조성물은 당업계에 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 입양 세포 치료 조성물의 조합은 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 입양 세포 치료 조성물을 함께 그러나 별개의 조성물로서 사용하는 것을 지칭한다. 본 발명의 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 입양 세포 치료 조성물이 하나의 조성물로 사용되지 않음은 당업자에게 명백하다. 실제로, 아데노바이러스 벡터는 입양 세포를 변형하는 것이 아니라 표적 종양을 변형시켜, 종양이 세포 이식의 원하는 효과에 더 잘 적응하도록 사용된다. 특히, 본 발명은 종양에 대한 입양 이식의 동원을 향상시키고 그 활성을 증가시킨다. 본 발명의 특정 구체예에서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 조합의 입양 세포 치료 조성물은 임의의 순서로 대상에 동시 또는 순차적 투여를 위한 것이다.
체크포인트 억제제
면역 체크포인트 단백질은 T 세포 기능을 억제하는 신호를 T 세포로 보내는 특정 리간드와 상호작용한다. 암세포는 그의 표면에서 높은 수준의 체크포인트 단백질 발현을 유도하여 항암 면역 반응을 억제함으로써 이를 악용한다.
본원에 기재된 바와 같은 체크포인트 억제제(CPI로도 지칭됨)는 면역 체크포인트 단백질의 기능을 억제할 수 있는 임의의 화합물이다. 억제에는 기능의 감소와 완전한 차단이 포함된다. 특히 면역 체크포인트단백질은 인간 체크포인트 단백질이다. 따라서, 면역 체크포인트 억제제는 좋기로는 인간 면역 체크포인트의 억제제이다.
체크포인트 단백질에는 CTLA-4, PD-1(및 그의 리간드 PD-L1 및 PD-L2), B7-H3, B7-H4, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, BTLA, TIGIT 및/또는 IDO가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. LAG3, BTLA, B7-H3, B7-H4, TIM3 및 KIR을 포함하는 경로는 CTLA-4 및 PD-1 의존성 경로와 유사한 면역 체크포인트 경로를 구성하는 것으로 당업계에서 인지된다. 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PD-1(및 그의 리간드 PD-L1 및 PD-L2), B7-H3, B7- H4, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, BTLA, TIGIT 및/또는 IDO의 억제제일 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-L1의 억제제이다. 좋기로는, 면역 체크포인트 억제제는 PD-L1에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체이고, 더욱 좋기로는 BMS-936559, LY3300054, 아테졸리주맙, 더발루맙 및 아벨루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 조합물의 체크포인트 억제제는 항체이다. 본원에서 "항체"라 함은, 예컨대 표적 면역 체크포인트 또는 에피토프(예컨대 항원 결합 부분 유지)에 결합할 수 있는, 자연 발생 및 조작된 항체 뿐만 아니라 전장 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유사체를 포괄한다. 본원에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 항체는 인간, 인간화, 동물 또는 키메라를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 기원으로부터 유래할 수 있고 IgG1 또는 IgG4 이소형을 선호하는 임의의 이소형일 수 있으며 추가로 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있다. 용어 항체는 또한 항체(들)가 본원에 기재된 결합 특이성을 나타내는 한 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 포함한다.
암
본 발명의 재조합 벡터는 종양 세포에서 복제 가능하다. 본 발명의 일 구체예에서 벡터는 Rb-경로, 구체적으로 Rb-p16 경로에 결함이 있는 세포에서 복제 가능하다. 이러한 결함 세포에는 동물과 인간의 모든 종양 세포가 포함된다. 본원에서0"Rb-경로의 결함"이라 함은 경로의 임의의 유전자 또는 단백질에서의 돌연변이 및/또는 후성유전학적 변화를 지칭한다. 이러한 결함으로 인해 종양 세포는 E2F를 과발현하므로 일반적으로 효과적인 복제에 필요한 E1A CR2에 의한 Rb의 결합이 필요하지 않는다. 추가 선택성은 E2F 프로모터에 의해 매개되며, 이는 Rb/p16 경로 결함 세포에서 볼 수 있는 바와 같이 유리 E2F가 있을 때만 활성화된다. 유리 E2F가 없으면 E1A의 전사가 발생하지 않고 바이러스가 복제되지 않는다. E2F 프로모터의 포함은 정상 조직에서 E1A의 발현을 방지하는 데 중요하며, 이는 E3 프로모터로부터 이식유전자 발현을 허용함으로써 직간접적으로 독성을 유발할 수 있다.
본 발명은 대상에서 암을 치료하기 위한 접근법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 대상체는 인간 또는 포유동물, 구체적으로 포유동물 또는 인간 환자, 보다 구체적으로 인간 또는 암을 앓고 있는 포유동물이다.
이 접근법은 악성 및 양성 종양을 포함하여 모든 암 또는 종양을 치료하는 데 사용할 수 있으며, 원발성 종양과 전이 모두 접근법의 표적이 될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 암은 종양-침윤성 림프구를 특징으로 한다. 본 발명의 도구는 종양-침윤성 림프구를 특징으로 하는 전이성 고형 종양의 치료에 특히 매력적이다. 또 다른 구체예에서, T-세포 이식편은 키메라 항원 수용체의 종양 또는 조직 특이적 T-세포 수용체에 의해 변형되었다.
본원에 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 대상체, 좋기로는 포유동물 또는 인간 대상체에 적어도 종양용해성 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것을 의미하며, 이는 암이나 종양과 관련된 장애 또는 증상의 완전한 치유 뿐만 아니라 예방, 개선 또는 완화를 목적으로 한다. 치료 효과는 환자의 증상, 혈액 내 종양 표지자, 또는 예를 들어 종양의 크기 또는 환자의 생존 기간을 모니터링하여 평가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 암 또는 종양은 비인두암, 활막암, 간세포암, 신장암, 결합 조직 암, 흑색종, 폐암, 대장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모막암, 가스트린종, 갈색세포종, 프로락틴종, T세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰 히펠-린다우병, 졸링거-엘리슨 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 뇌암, 희소돌기아교종, 신경모세포종, 수막종, 척수종양, 뼈암, 골연골종, 연골육종, 유잉육종, 원발부위불명암, 카르시노이드, 위장관의 카르시노이드, 섬유육종 , 유방암, 파제트병, 자궁경부암, 식도암, 담낭암, 두경부암, 안암, 신장암, 윌름스종양, 카포시암 육종, 전립선암, 고환암, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 구강암, 피부암, 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 내분비 췌장암, 글루카곤종, 부갑상선암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직 육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 융모막암, 포상기태(hydatidiform mole), 자궁암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 청각신경종, 식육종, 인슐린종, 카르시노이드 증후군, 체세포종, 잇몸암, 심장암, 입술암, 수막암, 구강암, 신경암, 구개암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 침샘암, 혀암 및 편도암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 좋기로는, 치료되는 암 또는 종양은 신장암, 난소암, 방광암, 전립선암, 유방암, 결장직장암, 폐암(예컨대:소세포 폐암종, 비소세포 폐암종 및 편평 비소세포 폐암종), 위암, 고전적 호지킨 림프종, 중피종 및 간암을 포함한다. 보다 바람직일 구체예에서, 암 또는 종양 유형은 두경부암, 가장 좋기로는 인간 두경부암이다.
인간 또는 동물 환자를 본 발명의 요법에 적합한 것으로 분류하기 전에 임상의는 환자를 검사할 수 있다. 정상에서 벗어나 종양 또는 암을 나타내는 결과에 기초하여, 임상의는 환자에게 본 발명의 치료를 제안할 수 있다.
의약 조성물
본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 바이러스 벡터의 적어도 하나의 유형을 포함한다. 좋기로는, 본 발명은 (a) 종양용해성 바이러스를 그 자체로 또는 (b) 입양 세포 조성물 또는 (c) 체크포인트 억제제와 조합하여 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 암 치료에 사용하기 위한 상기 약제학적 조합물을 제공한다. 또한, 조성물은 적어도 2개, 3개 또는 4개의 상이한 벡터를 포함할 수 있다. 벡터 및 입양 세포 조성물 또는 체크포인트 억제제에 더하여, 의약 조성물은 또한 다른 치료학적 유효 제제, 임의의 기타 제제, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 담체, 완충제, 부형제, 보조제, 첨가제, 보존제, 방부제, 충전제, 안정화제 및/또는 또는 증점제 및/또는 해당 제품에서 일반적으로 발견되는 모든 성분을 포함한다. 조성물을 제형화하기 위한 적절한 성분 및 적절한 제조 방법의 선택은 당업자의 일반적인 지식에 속한다.
의약 조성물은 투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태와 같은 임의의 형태일 수 있다. 제형은 용액, 에멀젼, 현탁액, 정제, 펠렛 및 캡슐로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 조성물은 특정 제형으로 제한되지 않으며, 대신에 조성물은 임의의 공지된 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화될 수 있다. 의약 조성물은 당업계에 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 키트는 이식유전자로서 변이체 IL-2를 인코딩하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제를 포함한다. 이식유전자로서 변이체 IL-2를 인코딩하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터는 제1 포뮬레이션으로 제형화되고 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제는 제2 포뮬레이션으로 제형화된다. 별법으로, 본 발명의 약제학적 키트는 제1 포뮬레이션에서 이식유전자로서 변이체 IL-2를 인코딩하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 제2 포뮬레이션에서 입양 세포 조성물을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 제1 및 제2 포뮬레이션은 임의의 순서로 대상에 동시 또는 순차적 투여를 위한 것이다. 또 다른 구체예에서, 상기 키트는 암 또는 종양의 치료에 사용하기 위한 것이다.
투여
본 발명의 벡터 또는 의약 조성물은 임의의 포유동물 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 대상은 인간이다. 포유동물은 애완동물, 가축 및 생산 동물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
벡터 또는 조성물을 대상체에 투여하기 위해 임의의 통상적인 방법이 사용될 수 있다. 투여 경로는 조성물의 포뮬레이션 또는 형태, 질병, 종양의 위치, 환자, 동반 질환 및 기타 요인에 따라 다르다. 따라서, 조합에서 각 치료제의 투여량 및 투여 빈도는 특정 치료제, 치료되는 암의 중증도 및 환자 특성에 부분적으로 의존한다. 좋기로는, 투여 요법은 허용 가능한 수준의 부작용과 일치되게 환자에게 전달되는 각 치료제의 양을 최대화한다.
벡터의 유효 용량(effective dose)은 적어도 치료가 필요한 대상, 종양 유형 및 종양의 위치 및 종양의 단계에 따라 다르다. 용량은 예를 들어 약 1x108 바이러스 입자(VP) 내지 약 1x1014 VP VP, 구체적으로 약 약 5x109 VP 내지 약 1x1013 VP, 더욱 좋기로는 약 3x109 VP 내지 약 2x1012 VP로 다양할 수 있다. 일 구체예에서 변이체 IL-2를 코딩하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터는 1x1010- 1x1014 바이러스 입자의 양으로 투여된다. 본 발명의 다른 실시예에서, 도즈는 약 약 5x1010 - 5x1011 VP의 범위에 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 종양용해성 바이러스의 투여는 종양내, 동맥내, 정맥내, 흉막내, 방광내, 강내, 결절내 또는 복막 주사, 또는 경구 투여를 통해 수행된다. 임의의 관리 조합도 가능한다. 이 접근법은 국소 주사에도 불구하고 전신 효능을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 이식유전자로서 변이체 IL-2를 인코딩하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 (b) 대상체에 대한 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제의 개별 투여(들)는 동시에 수행되거나 또는 순서에 상관없이 연속적으로 수행된다. 이는 (a) 및 (b)가 함께 복용하기 위한 단일 단위 투여 형태로 제공되거나 또는 동시에 또는 특정 시간 차이를 두고 투여되는 별도의 실체(예컨대 별도의 용기에)로 제공될 수 있음을 의미한다. 이 시간 차이는 1시간 내지 2주, 좋기로는 12시간 내지 3일, 더 좋기로는 최대 24시간 또는 48시간일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 아데노바이러스 벡터의 1차 투여는 체크포인트 억제제의 1차 투여 전에 수행된다. 또한, 체크포인트 억제제 이외의 다른 투여 방식을 통해 바이러스를 투여하는 것도 가능하다. 이와 관련하여, 바이러스 또는 체크포인트 억제제는 종양내 투여하고 다른 하나는 전신 또는 경구 투여하는 것이 유리할 수 있다. 특히 바람직일 구체예에서, 바이러스는 종양내로 투여되고 체크포인트 억제제는 정맥내로 투여된다. 좋기로는, 바이러스 및 체크포인트 억제제는 별도의 화합물로 투여된다. 두 제제의 병용 처리도 가능한다.
바람직한 일 구체예에서, 체크포인트 억제제는 약 2 mg/kg 내지 50 mg/kg, 더욱 좋기로는 약 2 mg/kg 내지 25 mg/kg의 양으로 투여된다.
본원에서 "별도의 투여" 또는 "별도의"라 함은 (a) 이식유전자로서 변이 IL-2를 인코딩하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 (b) 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제가 서로 다른 2개의 상이한 생성물 또는 조성물인 상황을 지칭한다.
본 발명의 치료법에 추가하여 임의의 다른 치료법 또는 치료법의 조합이 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법 또는 용도는 동시 또는 순차적인 방사선 요법, 화학요법, 항혈관신생제 또는 표적 요법, 예컨대 알킬화제, 뉴클레오시드 유사체, 세포골격 변형제, 세포증식억제제, 모노클로날 항체, 키나제 억제제 또는 기타 항암 약물 또는 개재요법(외과수술을 포함한다)을 대상체에 투여하는 것을 더 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "증가하다", 뿐만 아니라 그로부터 유래하는 단어가 반드시 100% 또는 완전한 치료 또는 증가를 의미하는 것은 아니다. 오히려, 당업자가 인식하는 잠재적인 이점 또는 치료 효과는 그 정도가 다양하다.
기술이 발전함에 따라 본 발명의 개념이 다양한 방식으로 구현될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명 및 그 실시예는 위에서 설명된 예들에 제한되지 않고 청구범위의 범위 내에서 변할 수 있다.
실험 섹션
재료 및 방법
세포주
인간 폐 선암종 A549, 인간 흑색종 SK-MEL-28 및 햄스터 평활근육종 DDT1-MF2 세포주를 DMEM에서 유지하고 햄스터 췌장암 HapT1은 RPMI에서 유지시켰다. DMEM 또는 RPMI 양자 모두에 10% 소 태아 혈청(FBS), 100U/mL 페니실린, 100mg/mL 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민(모두 Sigma-Aldrich에서 제공)을 보충하였다. 두 세포주 모두 +37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다.
재조합 인간 사이토카인
재조합 인간(rh) IL-2(Peprotech) 및 rh vIL-2(Adipogen) 사이토카인을 0.1-100 U/mL 농도의 생체외 실험에서 양성 대조군으로 사용하였다.
바이러스 및 vIL-2 이식유전자 작제
이 연구에 사용된 모든 바이러스는 Ad5/3-E2F-d24의 백본을 가지고 있다. 이것과 Ad5/3-E2F-d24-IL-2의 구성은 앞서 설명한 바 있다(Havunen et al., 2017).
vIL-2 이식유전자는 위치 80 L->F, 81 R->D, 85 L->V, 86 I->V 및 92 I->F에서 IL-2 서열의 5개 점 돌연변이를 만들어 작제하였다. Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 바이러스는 galk 선택을 사용한 박테리아 인공 염색체(BAC)-재조합 전략으로 생성되었다(Warming et al., 2005; Muck-Hausl et al., 2015). 이식유전자 vIL-2는 상동 재조합에 의해 E3 영역에 삽입되었다. PCR-증폭된 vIL-2를 BAC-Ad5/3-E2F-Δ24-GalK/amp를 함유하는 SW102 박테리아에 전기천공하고 vIL-2 이식유전자를 갖는 양성 클론을 데옥시글루코스 선택으로 확인하였다. 제한효소 분석으로 서열을 확인하였다. 바이러스 게놈은 PacI 제한 효소(Thermo Scientific)를 사용하여 BAC에서 방출되었고 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)으로 A549 세포에 형질감염되었다. vIL-2-무장된 Ad5/3 바이러스를 염화세슘 구배 원심분리로 2회 정제하였다. 광학 밀도 및 조직 배양 감염 용량(TCID50) 분석을 사용하여 각각 바이러스 입자(VP) 농도 및 감염 단위를 결정하였다.
생체외 바이러스에 의한 사이토카인 발현
A549 세포를 Ad5/3-E2F-d24-IL-2, Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 감염시키거나 48시간 동안 감염시키지 않은 상태로 방치하였다. 상등액을 채취하여 여과(Amicon ultra 100K)한 후 제조사의 지침에 따라 IL-2 인간 ELISA 키트(Abcam)로 분석하여 바이러스에 의해 생성된 사이토카인의 양을 측정하였다.
용해력(Lytic potency) 분석
10,000 A549 세포/웰을 100ul의 2% DMEM 분석 배지에서 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 3중으로 0-1000 VP/세포로, Ad5/3-E2F-d24, Ad5/3-E2F-d24-IL-2, 또는 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 감염시켰다. 3일 후, 제조사의 지침(세포 역가 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI)에 따라 MTS 세포독성 분석으로 세포 생존력을 측정하였다.
세포 증식 분석
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 기증자로부터 얻어 Lymphoprep(StemCell 기술)을 사용하여 밀도 구배 원심분리를 통해 분리하였다. PBMC를 3일 동안 서로 다른 농도(0.1U, 1U, 10U 및 100U)에서 rh vIL-2 및 rh IL-2와 함께 인큐베이션하고 유세포 분석을 통해 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에 대해 분석하였다. 상대적인 세포 확장을 측정하기 위해 제3일의 양성 세포 비율을 제0일의 해당 숫자와 비교하였다.
T-세포 분리, 및 자극
T 세포를 CD3+ T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 통해 새로 분리된 PBMC에서 농축하였다. 분류된 T 림프구를 1:5 비드/T-세포 비율의 CD3/CD28 비드(Invitrogen)로 활성화한 다음, (1) 100U/mL의 rh IL-2; (2) 100U/mL의 rh vIL-2, 또는 (3) 대조군으로서 사이토카인은 없지만 완전한 배지와 함께 배양하였다. 이 세 가지 조건을 세 그룹에서 연구하였다: 그룹 1에서는 활성화된 T 세포 단독; 그룹 2에서는 활성화된 T 세포 외에 종양 세포; 및 그룹 3에서는 비무장 바이러스 Ad5/3-E2F-d24를 사용하여 활성화된 T 세포 및 종양 세포. 사이토카인 및 검정 배지의 절반은 제2일에 교체하였다. 세포는 0일, 2일 및 4일에 Sony SH800Z(Sony, Tokyo, Japan)를 사용하여 유세포 분석에 의해 분석되었다.
생체외 바이러스 감염 후 면역 서브세트 분석
종양 세포를 100VP/세포로 비무장 Ad5/3-E2F-d24, Ad5/3-E2F-d24-IL-2 또는 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 바이러스로 감염시키거나 또는 감염되지 않은 채로 두었다. 건강한 기증자로부터 분리된 PBMC를 감염 24시간 후 감염된 암세포 위에 추가하였다. PBMC만을 모크 대조군으로 사용하였다. 세포를 항-CD3, 항-CD8, 항-CD4, 항-CD25, 항-CD69, 항-CD127, 항-CD56으로 면역형광 염색하고 제0, 3, 6일에 BD Accuri C6 유세포분석기를 통해 분석하였다. 다음으로, 특이 면역 세포 집단, 즉 T 세포와 NK 세포의 효과를, 유사한 설정에서 더 자세히 연구하였다.
동물 실험
종양의 치료 유발 변화를 연구하기 위해 동물 당 2*106 HapT1 세포를 5주령의 면역 능력이 있는 시리아 햄스터의 허리에 피하 이식하였다. 평균 종양 직경이 0.5 cm에 도달했을 때 동물을 4개의 그룹(n=13)으로 무작위화하였다. 바이러스 Ad5/3-E2F-d24, Ad5/3-E2F-d24-IL-2, 및 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2를 1*109 VP로 종양내 투여하고 모크에는 PBS만 투여하였다. 바이러스는 제1일, 4일, 8일 및 13일에 주입되었다.
제16일에 각 그룹에서 5마리의 동물을 안락사시키고 종양 및 선택된 장기를 수집하여 존재하는 조직병리학적 특성 및 존재하는 면역 세포 서브세트를 평가하였다. 나머지 동물은 생존에 대해 모니터링되었다. 이들 동물은 제18일부터 5일마다 6회의 추가 바이러스 처리를 받았다. 종양은 제30일까지 모든 짝수일에 디지털 캘리퍼스로 측정하였다. 종점 기준은 20.0 mm 종양 크기 한계 및 피부 궤양을 포함하였다.
160일의 관찰 기간 후에 동일한 HapT1 종양(2*106 세포/종양) 또는 다른 종양 DDT-MF2(1.5*105 세포/종양)로 치료된 동물의 등 상부를 다시 챌린지하였다. 이전에 어떤 암세포나 치료에도 노출된 적이 없는 나이브 동물(n=3)을 모크 그룹으로서 포함시켰다. DDT1-MF2 종양이 최대 허용 직경에 도달할 때까지 종양 성장을 21일 동안 추적하였다. 특기할 것은 3마리의 Ad5/3-E2F-d24 치료 동물 중 2마리는 눈에 보이는 종양의 존재 때문에 재챌린지하지 않았다는 것이다. 즉, 종양은 비무장 바이러스로는 치료되지 않았다.
조직병리학
병리학적 평가를 위해 각 그룹의 5마리의 햄스터로부터 제16일에 간, 비장, 폐, 신장, 심장 및 종양과 같은 햄스터의 장기 샘플을 수집하였다. 수집된 샘플을 먼저 10% 포르말린에 고정하고 48시간 후 70% 에탄올로 옮기고 파라핀에 포매하였다. 현미경 평가를 위해 5μm 두께의 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 염색된 조직 샘플의 조직학적 변화를 병리학자가 평가하였다.
통계 분석
종양 성장의 평가는 SPSS 버전 25 통계(IBM)를 사용하여 로그 변환된 종양 부피를 갖는 선형 혼합 모델로 수행되었다. Two-way ANOVA 및 Log-rank(Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 각각 재시험 및 생존 곡선의 그룹 변동을 분석하였다. GraphPad Prism(버전 8.0.0.)을 이용하여 개별 및 그룹화된 종양 성장 데이터를 표시하고 생존 곡선을 그렸다. P값은 p<0.05일 때 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1. 이펙터 세포는 생체외에서 기존의 IL-2보다 vIL-2의 존재 하에서 더 많이 증식한다.
본 발명자들은 CD8+ T 세포, NK 세포 및 CD4+ T 세포와 같은 면역 세포를 자극하는 능력과 관련하여 rh vIL-2와 rh IL-2를 비교하였다. 본 발명자들은 다른 농도(0.1 - 100 U/ml)에서 재조합 인간(rh) vIL-2 또는 rh IL-2의 존재 또는 부재 하에 PBMC를 배양하였다. 3일 후, rh vIL-2는 IL-2보다 CD8+ 이펙터 T 세포 및 NK 세포의 증식을 유도하는 데 더 강력했던 반면, CD4+ T 세포(Treg 포함)의 수준은 변이체에서 더 낮게 유지되었다(도 1). 이러한 결과는 T 세포 및 NK 세포에 대해 vIL-2가 기존의 IL-2보다 선호되는 효과가 있음을 나타낸다. 활성화된 T-세포가 IL-2를 생성함에 따라 vIL-2 그룹에서도 배양물에 IL-2가 존재할 것이라는 점에 유의해야 한다. 이것은 예를 들어 Tregs에 대한 vIL-2의 효과를 희석시킬 것으로 예상된다.
실시예 2. 상이한 T 세포 서브세트에 대한 rh vIL-2의 효과는 사이토카인을 코딩하는 바이러스를 작제하기 위한 근거를 제공한다
아데노바이러스의 존재하에서 T 세포에 대한 rh vIL-2의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 CD3/CD28 비드로 T 세포를 분리하고 이들을 100 U/ml의 rh vIL-2 또는 rh IL-2 및 감염된/비감염된 암세포로 4일간 활성화시켰다. IL-2 및 vIL-2는 암세포의 존재 및 부재 하에서 CD8/CD4 세포 비에 유사한 효과를 나타냈다(도 2A 및 B). 그러나 암세포가 종양용해성 바이러스에 감염되었을 때 vIL-2는 CD4+ 세포보다 CD8+CD27-CD62L-CD45RO+ 세포 우세를 향한 경향을 유도하였다(도 2C).
후천 면역의 특징은 기억 반응이며, 이는 항원 특이적 림프구의 클론 확장 및 분화의 결과로 평생 지속된다(Sallusto et al., 2004). 본 발명자들은 감염되거나 감염되지 않은 암세포가 있는 상태에서 rh IL-2 또는 rh vIL-2의 존재하에 중심 기억 T 세포(Tcm; CD45RO+, CD62L+, CD27+)의 백분율 변화를 평가하였다. Tcm은 반응성 기억 반응을 매개하고 항원 자극 시 이펙터 세포로 분화한다. 본 발명자들은 암세포가 없는 상태에서 IL-2와 vIL-2 사이의 CD8/CD4 Tcm 비(ratio)의 차이를 찾지 못하였다(도 3A). 본 발명자들은 이 비율이 종양 세포 존재 하에서 제2일에 감소한 다음 제4일에 증가하는 것을 관찰하였다. 이번에도 vIL-2는 기존 IL-2보다 Tcm 집단에서 더 높은 CD8 대 CD4 비를 유도하였다(도 3B).
Tcm에 더해, 본 발명자들은 Tcm 세포와 동일한 조건에서 이펙터 기억 T 세포(Tem; CD45RO+, CD62L-, CD27+)도 평가하였다. Tem은 보호 기억을 제공하고 즉각적인 이펙터 기능을 특징으로 한다. 본 발명자들은, 암세포가 없는 경우 IL-2와 vIL-2 사이의 CD8/CD4 Tem 비의 차이를 관찰하지 못하였다(도 4A). 암세포가 있는 경우 IL-2 및 vIL-2는 제4일까지 높은 비의 CD8/CD4 Tem을 유도한다(도 4B). 암세포가 감염되었을 때, 본 발명자들은 제4일에 rh vIL-2 그룹에서 높은 CD8/CD4 Tem 비를 향한 경향을 관찰하였다(도 4C). 결론적으로, 본 발명자들은 전염증성 T 세포 구획에 대한 효과와 관련하여 rh IL-2와 rh vIL-2 사이에 유의미한 차이를 발견하지 못하였다. 이러한 결과는 vIL-2 무장된 종양용해성 아데노바이러스를 작제할 수 있는 견고한 근거를 제공하였다.
실시예 3. Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 바이러스는 vIL-2를 발현하고 생체외에서 효율적으로 종양 세포를 사멸시킨다
아데노바이러스 5/3은 아데노바이러스 혈청형 5의 백본과 아데노바이러스 혈청형 3의 섬유 노브를 특징으로 하며, 그 수용체가 진행된 종양에서 고도로 발현됨에 따라 종양 형질도입을 향상시킨다(Wang et al., 2011). 종양 세포에 대한 바이러스 복제를 제한하기 위해 E1A 유전자의 불변 영역 2에서의 돌연변이 및 이종 종양 특이적 E2F 프로모터의 도입을 수행하였다. 세포자멸사를 향상시키기 위해 E1B 19K 유전자 영역의 활성화(enabling)결실을 만들었다. 발현을 바이러스 복제에 연결하기 위해, 변이체 IL-2 이식유전자를 E3 프로모터 하에 E3 영역에 배치하였다(도 5A). 이식유전자 카세트는 오픈 리딩 프레임을 gp19k 및 6.7k로 대체한다.
작제된 바이러스의 종양용해 효능을 조사하기 위해, 인간 폐암 A549 세포를 사용하여 세포독성 검정을 수행하였다. Ad5/3-E2F-d24-IL-2와 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 사이에 바이러스의 세포 사멸 능력에는 큰 차이가 없었으며, 따라서 이는 vIL-2 이식유전자의 존재가 바이러스의 종양용해 효능을 감소시키지 않는다는 것을 나타낸다(도 5B). 또한, Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 감염된 세포는 사이토카인을 분비할 수 있었다(도 5C).
실시예 4. Ad5/3-E2F-d24-vIL-2는 이펙터 세포를 자극하지만 Tregs는 생체외에서 자극하지 않는다
인간 암 세포 A549를 Ad5/3-E2F-d24, Ad5/3-E2F-d24-IL-2 또는 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 감염시키거나 감염시키지 않은 채로 방치하였다. 24시간 후, 암세포를 PBMC와 함께 인큐베이션하였다. CD25+CD69+ 활성화 이펙터 T 세포의 CD8/CD4 비는 제3일 및 제6일에, Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 처리한 그룹에서 기존 IL-2를 발현하는 바이러스로 처리한 그룹보다 유의하게 더 높았다(도 6A). 실제로, 본 발명자들은 대조군 바이러스들 사이에서 활성화된 이펙터 T 세포의 CD8/CD4 비에서 어떤 유의미한 차이를 보지 못하였다. 따라서 vIL-2-무장된 Ad5/3 바이러스는 이펙터 세포에 대한 강력한 자극제이다.
Treg에 대한 효과를 조사하기 위해 본 발명자들은 CD4+ CD3+ 모집단의 CD25+CD127low 발현 세포를 분석하였다. Ad5/3-E2F-d24-vIL-2는 Ad5/3-E2F-d24-IL-2와 같은 Treg 분화를 유도하지 않았다(도 6B). 따라서, 바이러스에 의해 생성된 vIL-2는 Treg보다 이펙터 세포를 우선적으로 자극한다는 재조합 vIL-2의 주요 매력 특징을 유지하는 것으로 보이다.
실시예 5. 변이체 IL-2 무장된 종양용해성 아데노바이러스는 햄스터에서 항종양 효능 및 생존을 유의하게 향상시킨다
유망한 생체외 결과에 따라, 변이체 IL-2 무장 아데노바이러스를 면역능력이 있는 시리아 햄스터에서 연구하였다. 인간 아데노바이러스는 (마우스와 달리) 햄스터에서 복제할 수 있고 인간 IL-2와 같은 일부 인간 사이토카인은 햄스터에서 생리활성을 나타내기 때문에(Havunen et al., 2017; Gowen et al., 2008), 이것은 무장된 종양용해성 아데노바이러스를 연구하는데 최적의 모델이다(Havunen et al., 2017).
백본 Ad5/3-E2F-d24 또는 IL-2 무장 바이러스(Ad5/3-E2F-d24-IL-2)로 처리된 동물은 모크와 비교하여 종양 조절 경향을 나타냈다(차이가 유의하지는 않음). 인상적으로, 본 발명자들은 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 처리된 그룹에서 최고의 종양 제어를 얻었고 이 결과는 제30일까지 다른 모든 그룹과 비교하여 통계적으로 유의하였다. 이는 vIL-2가 Treg에 대한 원치 않는 면역억제 효과가 없이, 항종양 이펙터 T 세포의 자극제로서 유용함을 강조하는 것이다. 따라서, Ad5/3-E2F-d24-vIL-2는 완전한 종양 근절과 양립할 수 있는 방향으로 종양 미세환경의 강력한 조절자인 것으로 보인다.
요법의 작용 기전을 조사하기 위해 본 발명자들은 제1일, 4일, 8일 및 13일에 햄스터를 골격 Ad5/3-E2F-d24, Ad5/3-E2F-d24-IL-2, Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 또는 PBS로 처리하였다. 제16일에 햄스터를 안락사시키고 종양을 수집하여 유세포 분석 및 나노스트링 평가를 통해 종양 미세환경을 심층 분석하였다. 치료 관련 변화를 연구하기 위해 종양 및 선택된 장기를 조직병리학적 평가용으로 수집하였다. 병리학적 결과 모크 처리군과 종양용해성 아데노바이러스 처리군 사이에 차이가 없었으므로, 본 발명의 바이러스는 전신 독성 영향을 일으키지 않았다.
생존 데이터에 따르면 백본 바이러스로 처리된 그룹은 한 마리의 햄스터를 치료할 수 있었다. 또한 안정적인 종양을 가진 두 마리의 햄스터가 실험이 끝날 때까지 생존하였다. Ad5/3-E2F-d24-IL-2는 3마리의 햄스터를 치료하였다. Ad5/3-E2F-d24-vIL-2는 처리된 햄스터의 60%를 치료할 수 있었고 이 차이는 모크 실험에 비해 현저하였다(도 7).
실시예 6. 사이토카인 무장된 아데노바이러스에 의한 치료는 종양-특이적 면역학적 기억을 유도한다
종양용해성 바이러스 치료가 종양-특이적 면역학적 기억을 유도했는지 연구하기 위해, 치료된 모든 햄스터를 동일한 HapT1 암세포와 다른 DDT1-MF2 암세포로 재차 챌린지하였다. 두 암세포 유형 모두 치료된 햄스터의 등 상부에 이식되었다. 이 재-챌린지 실험에서는, 상이한 바이러스들이 상이한 수의 햄스터를 치료했기 때문에, 그룹당 동물의 수가 달랐다. 나이브한 동물 또는 비무장 바이러스로 처리된 동물에서 HapT1(도 8A) 또는 DDT1-MF2(도 8B) 종양 재-챌린지의 방해는 없었다. 이와 대조적으로, Ad5/3-E2F-d24-IL-2 또는 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2를 사용한 HapT1의 이전의 치유는 HapT1 재-챌린지에 대한 보호를 제공하는 것으로 나타났다. 참고로, Ad5/3-E2F-d24-vIL-2로 처리된 동물의 40%는 재차 챌린지된 후에도 HapT1 종양이 없는 상태로 남아 있었다. 그러나 DDT-MF2 종양은 무장된 바이러스에 의해 유도된 에피토프 특이적 면역학적 기억을 강조하는 이러한 동물에서 정상적으로 성장하였다. 이러한 발견은 전신 및 종양 특이적 항종양 면역을 확립하는 데 IL-2와 같은 사이토카인의 중요성을 나타내는 이전 데이터와도 일치한다(Havunen et al., 2017).
본 발명자들은 변이체 IL-2 무장 아데노바이러스 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2가 면역 능력이 있는 시리아 햄스터에서 안전하고 효과적임을 입증하였다. Ad5/3-E2F-d24-vIL-2는 종양 미세환경 내에서 강력한 항종양 효능 및 변이체 IL-2의 발현을 나타냈다. 인간 림프구에 대한 연구는 항종양 면역학적 효과의 유도를 나타냈다. 구체적으로, vIL-2는 억제성 Treg보다 이펙터 T 세포를 우선적으로 활성화시키는 것으로 보였다.
실시예 7. 종양용해성 아데노바이러스를 코딩하는 변이체 IL-2는 면역 세포의 중간 정도의 침윤 및 IL-2의 가장 높은 종양내 발현으로 실질적인 종양 감소를 유도한다
세포주
햄스터 췌장암 HapT1을 10% 소 태아 혈청(FBS), 100U/mL 페니실린, 100mg/mL 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민(모두 Sigma-Aldrich 제품)이 보충된 RPMI에서 유지시켰다. 두 세포주 모두 +37C℃ 및 5% CO2에서 배양되었다.
바이러스 및 vIL-2 이식유전자 작제
이 연구에 사용된 모든 바이러스는 Ad5/3-E2F-d24의 백본을 가지고 있다. 후자와 Ad5/3-E2F-d24-IL-2의 구성은 이전에 Havunen et al., 2017에서 설명된 바 있다. vIL-2 이식유전자를 위치 80 L->F, 81 R->D, 85 L->V, 86 I->V 및 92 I->F의 IL-2 서열에서 5개 점 돌연변이를 만들어 작제하였다. Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 바이러스는 galk 선택을 이용한 박테리아 인공 염색체(BAC)-재조합 전략으로 생성되었다(Warming et al., 2005; Muck-Hausl et al., 2015). 이식유전자 vIL-2는 상동 재조합에 의해 E3 영역에 삽입되었다. PCR-증폭된 vIL-2를 BAC-Ad5/3-E2F-Δ24-GalK/amp를 함유하는 SW102 박테리아에 전기천공하고 vIL-2 이식유전자를 갖는 양성 클론을 데옥시글루코스 선택으로 확인하였다. 제한효소 분석으로 서열을 확인하였다. 바이러스 게놈을 PacI 제한 효소(Thermo Scientific)를 사용하여 BAC에서 방출하고 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)으로 A549 세포에 형질감염시켰다. 이어서 vIL-2-무장된 Ad5/3 바이러스를 염화세슘 구배 원심분리로 2회 정제하였다. 광학 밀도 및 조직 배양 감염 용량(TCID50) 분석을 사용하여 각각 바이러스 입자(VP) 농도와 감염 단위를 결정하였다.
동물 실험
종양의 치료-유도 변화를 연구하기 위해 동물당 2x106 HapT1 세포를 5주령의 면역 능력이 있는 시리아 햄스터의 허리에 피하 이식하였다. 평균 종양 직경이 0.5 cm에 도달했을 때 동물을 4개의 그룹(n=13)으로 무작위화하였다. 바이러스 Ad5/3-E2F-d24, Ad5/3-E2F-d24-IL-2 및 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2를 1x109 VP로 종양내 투여하고 모크 그룹에는 PBS만 투여하였다. 바이러스는 제1일, 4일, 8일 및 13일에 주입되었다.
제16일에 각 그룹에서 5마리의 동물을 안락사시키고 종양을 수집하여 면역학적 변화 및 mRNA 발현 수준을 평가하였다.
유세포 분석
제16일에 수집된 햄스터 종양 샘플을 단일 세포 현탁액으로 가공하고 앞서 설정된 프로토콜에 따라 추가로 분석하였다(Havunen et al., 2017; Siurala et al., 2016). 그런 다음 이 샘플들을 CD8+(PE, 12-0080-82), CD4+(PE-Cyanine 7, 25-0041-82), 및 MHC II+ 세포(FITC, 11-5980-82) 세포에 대해 항체 염색하였다. NK+ 세포는 폴리클로날 항체 항-Asialo-GM1(Alexa Fluor-488, 53-6507-80)으로 표지하고, 대식세포+ 세포는 항-갈렉틴(PE, 12-5301-82)으로 이전에 설명한 대로(Havunen et al. , 2017) 표지하였다. 샘플당 100.000개의 이벤트 획득시 세포 형광이 Sony SH800Z 세포측정기(Sony, Tokyo, Japan)를 사용하여 검출되었다. 세포 데이터 처리 및 게이팅은 FlowJo v.10.6.1(BD®, New Jersey, USA)을 사용하여 수행되었다.
유전자-발현 분석
제16일에 채취한 동물 종양 샘플의 단편을 RNAlater(R0901; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)에 보존하고 추가 처리가 있을 때까지 -20℃에서 보관하였다. 그런 다음 이 샘플의 RNA를 제조업체의 지침에 따라 RNAeasy Mini Kit(74104; QIAGEN, Hilden, Germany)로 정제하였다. 최종 RNA 수율을 Thermo Scientific NanoDrop™ 1000 Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)로 측정하고 샘플의 RNA 농도를 20ng/μl로 조정하였다.
역전사효소(RT)-정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)
제16일에 종양으로부터 정제한 RNA를 이용, Quantitect Reverse Transcription Kit(205313, QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 cDNA를 합성하여 햄스터 IL-2 상대 발현 및 바이러스 이식유전자 발현의 상대 정량화에 사용하였다. 역전사 실시간 PCR(RT-qPCR)은 Santos et al., 2017에 의해 이전에 설명된 대로 수행되었다. 야생형 IL-2 바이러스 이식유전자는 인간 IL-2용으로 설계된 프라이머 및 프로브로 검출되었다. IL-2 변이체 바이러스 이식유전자의 경우, 인간IL-2v용으로 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하였다. 햄스터 IL-2 및 바이러스 이식유전자의 정규화는 햄스터 GAPDH 유전자를 사용하여 수행되었다(Siurala et al., 2015).
통계 분석
GraphPad Prism(버전 8.0.0.)을 사용하여 종양 부피 데이터, 상대 및 절대 mRNA 발현 수준을 표시하였다. 다른 치료 그룹 간의 차이를 평가하기 위해 Welch 보정이 있는 독립표본 t-검정(unpaired t-test)을 수행하였다. 그랜자임 생산과 SAP 유전자 또는 변이체 IL-2 도입유전자 생산 간의 상관관계를 확인하기 위해 피어슨 상관계수를 계산하였다. P값은 p<0.05일 때 유의한 것으로 간주하였다.
결과
종양용해성 아데노바이러스 치료에 의해 유도된 생물학적 사건에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 실험이 시작된 지 16일 후에 종양을 수집하였다. 제0일과 제16일의 종양 부피의 비교 결과 Ad5/3-E2F-D24를 사용한 치료가 햄스터 종양의 성장을 제어하는 데 있어 최소 효과를 갖는 것으로 나타났다(도 9A). 한편, 인간 IL-2 및 변이체 IL-2-코딩 종양용해성 아데노바이러스 치료는 햄스터 췌장 종양의 종양 성장을 실질적으로 지연시켰다. 제16일까지 이 그룹이 종양 부담이 가장 낮은 경향을 보였다는 점을 고려할 때, 이러한 효과는 변이체 IL-2 코딩 종양용해성 아데노바이러스로 치료한 햄스터에서 더욱 두드러진 것이었다(도 9A).
면역학적 구획의 추가 분석 결과 종양 내 CD4+ 및 CD8+ 세포의 빈도는 야생형 인간 IL-2 종양용해성 아데노바이러스 처리된 햄스터에서 가장 높은 것으로 밝혀졌다(도 9B-C). 이와 대조적으로, 변이체 IL-2-바이러스 요법을 받는 햄스터의 종양은 놀랍게도 중간 수준의 이러한 세포 침윤을 보였다(도 9B-C). 제16일에 종양 부피의 유의미한 차이가 사이토카인 무장 바이러스들 간에 관찰되지 않았다는 것을 고려하면, 이는 바이러스-발현 변이체 IL-2가 야생형 대응물에 비해 질적으로 우수한 항종양 반응을 유도함을 시사한다.
또한, 야생형 인간 IL-2의 주요 한계는 약동학(짧은 반감기) 및 결과적으로 표적 병변에서의 최소 축적이다(Arenas-Ramirez et al., 2015). 도 10의 결과는 위에서 언급한 문제가 Ad5/3-E2F-D24-vIL-2 종양용해성 아데노바이러스로 제거될 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 야생형 IL-2 또는 변이체 IL-2 종양용해성 아데노바이러스로 처리된 햄스터의 종양들 간에는 IL-2 생성 측면에서 상당한 차이가 관찰될 수 있다(도 10). 사실, Ad5/3-E2F-D24-vIL-2 처리군은 다른 모든 그룹과 비교하여 가장 높은 전체적 사이토카인 발현(숙주 IL-2 및 IL-2 변이체 이식유전자)을 나타냈다. 또한, 마지막 바이러스 처리 3일 후에도 IL-2 변이체의 수준이 높았다(도 10). 재조합 변이체 IL-2 단백질을 개발하려는 노력이 안전성 향상과 종양내적으로 관련이 있는 높은 수준의 변이체 IL-2 단백질에 초점을 맞추고 있다는 점을 고려할 때, 이러한 결과가 유사한 성질의 단백질에 대해서는 예측할 수 없다는 점은 매우 중요하고 또한 특히 주목할 만한다 (Arenas-Ramirez et al., 2015).
실시예 8. 변이체 IL-2 코딩 종양용해성 아데노바이러스 요법은 증가된 이펙터 T-세포 기능 및 낮은 면역억제를 위한 면역 재구성을 야기한다
세포주
햄스터 췌장암 HapT1을 10% 소 태아 혈청(FBS), 100U/mL 페니실린, 100mg/mL 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민(모두 Sigma-Aldrich 제품)이 보충된 RPMI에서 유지하였다. 두 세포주 모두 +37℃ 및 5% CO2에서 배양되었다.
바이러스 및 vIL-2 이식유전자 작제
이 연구에 사용된 모든 바이러스는 Ad5/3-E2F-d24의 백본을 가지고 있다. 후자와 Ad5/3-E2F-d24-IL-2의 구성은 이전에 Havunen et al., 2017에서 설명된 바 있다. vIL-2 이식유전자를 위치 80 L->F, 81 R->D, 85 L->V, 86 I->V 및 92 I->F의 IL-2 서열에서 5개 점 돌연변이를 만들어 작제하였다. Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 바이러스는 galk 선택을 이용한 박테리아 인공 염색체(BAC)-재조합 전략으로 생성되었다(Warming et al., 2005; Muck-Hausl et al., 2015). 이식유전자 vIL-2는 상동 재조합에 의해 E3 영역에 삽입되었다. PCR-증폭된 vIL-2를 BAC-Ad5/3-E2F-Δ24-GalK/amp를 함유하는 SW102 박테리아에 전기천공하고 vIL-2 이식유전자를 갖는 양성 클론을 데옥시글루코스 선택으로 확인하였다. 제한효소 분석으로 서열을 확인하였다. 바이러스 게놈을 PacI 제한 효소(Thermo Scientific)를 사용하여 BAC에서 방출하고 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)으로 A549 세포에 형질감염시켰다. 이어서 vIL-2-무장된 Ad5/3 바이러스를 염화세슘 구배 원심분리로 2회 정제하였다. 광학 밀도 및 조직 배양 감염 용량(TCID50) 분석을 사용하여 각각 바이러스 입자(VP) 농도와 감염 단위를 결정하였다.
동물 실험
종양의 치료-유도 변화를 연구하기 위해 동물당 2x106 HapT1 세포를 5주령의 면역 능력이 있는 시리아 햄스터의 허리에 피하 이식하였다. 평균 종양 직경이 0.5 cm에 도달했을 때 동물을 4개의 그룹(n=13)으로 무작위화하였다. 바이러스 Ad5/3-E2F-d24, Ad5/3-E2F-d24-IL-2 및 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2를 1x109 VP로 종양내 투여하고 모크 그룹에는 PBS만 투여하였다. 바이러스는 제1일, 4일, 8일 및 13일에 주입되었다.
제16일에 각 그룹에서 5마리의 동물을 안락사시키고 종양을 수집하여 면역학적 변화 및 mRNA 발현 수준을 평가하였다.
유전자-발현 분석
제16일에 채취한 동물 종양 샘플의 단편을 RNAlater(R0901; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)에 보존하고 추가 처리가 있을 때까지 -20℃에서 보관하였다. 그런 다음 이 샘플의 RNA를 제조업체의 지침에 따라 RNAeasy Mini Kit(74104; QIAGEN, Hilden, Germany)로 정제하였다. 최종 RNA 수율을 Thermo Scientific NanoDrop™ 1000 Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)로 측정하고 샘플의 RNA 농도를 20ng/μl로 조정하였다.
Counter® Digital Analyzer(NanoString Technologies, Seattle, USA)를 사용하여 모든 햄스터 종양의 RNA 샘플에 대해 NanoString nCounter® 유전자 발현 분석을 수행하였다. 유전자 발현은 nSolver 소프트웨어 4.0(NanoString Technologies, Seattle, USA)으로 분석된 101개 유전자를 포함하는 햄스터 세포용으로 설계된 맞춤형 패널을 이용하여 평가하였다. 볼케이노 플롯에서 각 유전자의 -log10(p-값) 및 log2 배수 변화에 대한 값으로 차등 발현을 나타내었다. 마찬가지로, RNA 수(Log2)로서의 차등 발현을 막대 그래프로 나타내었다. 처리 그룹의 각 유전자의 발현 수준울 대조군(모크) 그룹의 해당 유전자로 정규화하였다.
통계 분석
GraphPad Prism(버전 8.0.0.)을 사용하여 종양 부피 데이터, 상대 및 절대 mRNA 발현 수준을 표시하였다. 다른 치료 그룹 간의 차이를 평가하기 위해 Welch 보정이 있는 독립표본 t-검정(unpaired t-test)을 수행하였다. 그랜자임 생산과 SAP 유전자 또는 변이체 IL-2 도입유전자 생산 간의 상관관계를 확인하기 위해 피어슨 상관계수를 계산하였다. P값은 p<0.05일 때 유의한 것으로 간주하였다.
결과
바이러스 치료를 받는 종양의 전사체를 평가하여 추가 특성화를 수행하였다. Ad5/3-E2F-D24 바이러스 치료와 비교하여, 야생형 IL-2 또는 변이체 IL-2를 인코딩하는 종양용해성 바이러스로 치료된 종양은 겉보기에 유사한 수의 상향 조절된 유전자를 입증하였다. 두 그룹의 하향조절 프로파일을 평가할 때 야생형 IL-2는 변이체 IL-2 그룹보다 약 34.5% 더 많은 유전자가 하향 조절되었다(도 11). 야생형 IL-2 그룹이 IL-2 변이체에 비해 상향조절되거나 하향조절되는 거의 모든 유전자에 대해 더 높은 값을 나타냈다는 점에 유의하는 것이 중요한데, 이는 이전에 문헌에서 관련된 IL-2 강력한 생물학적 효과와 양립가능하다 (도 11) (Jiang et al., 2016). 그러나 높은 값이 반드시 더 나은 전체 반응으로 해석된 것은 아닌데, 이는Ad5/3-E2F-D24-vIL-2 바이러스가 종양 수축 및 전체 생존을 촉진하는 데 가장 성공적인 그룹이었기 때문이다.
그러나 차등 발현 분석을 상세히 살피면, Ad5/3-E2F-D24-vIL-2 바이러스가 면역억제 관련 유전자보다 T-세포 수용체 복합체 및 하류 신호전달 유전자와 관련된 공지의 유전자의 발현을 우선적으로 자극하는 것으로 입증되었다(도 12 및 13). 중요하게는, 변이체 IL-2 코딩 종양용해성 아데노바이러스를 사용한 치료는 TCR-복합 유전자(CD3E, CD3D)의 가장 높은 발현을 유도하며(도 12A), 이는 MHC 결합 시 TCR을 보유하고 인간에서 TCR 유도 신호전달을 개시하는 역할을 한다(Ngoenkam et al., 2018). 추가로, 변이체 IL-2-코딩 종양용해성 아데노바이러스 치료는 야생형 IL-2를 코딩하는 바이러스에 비해, 공지의 주요 하류 신호전달 유전자(LCK, ITK, ZAP70)를 상향조절하였다(도 12A). 놀랍게도, IL-2 변이체-코딩 바이러스를 사용한 치료는 TCR 발현, 고정 및 신호전달(CD3G, SAP)에 있어서 일부 중요한 유전자의 상향조절을 자극한 반면, 야생형 IL-2 바이러스 그룹에 대한 이들의 수준은 변경되지 않은 채로 유지되었다(도 12A). 통계적으로 유의하지는 않지만, 이들 데이터는 변이체 IL-2 코딩 종양용해성 아데노바이러스로 처리시 T-세포의 TCR 기능의 예상치 못한 증가된 활성을 시사하며, 이는 본 발명자들이 아는 한 현재 기술에서 문서화된 바 없다. 사실, 변이체 IL-2 바이러스만이 그랜자임 및 퍼포린(GZMK, GZMM, PRF1)의 높은 발현을 유도할 수 있었다(도 12B). 이펙터 세포독성 세포(T 세포 및 자연 살해 세포)에 의해 분비될 때, 그랜자임과 퍼포린은 종양 세포의 세포자멸사를 유도한다(Voskoboinik et al., 2015). 실상, 변이체 IL-2 이식유전자 mRNA 상대 발현과 GZMK 또는 SAP1 유전자 mRNA 카운트 양자 모두 사이의 상관관계 정도는 높고 포지티브한 반면, GZMK와 SAP1 유전자 사이에는 추가적인 포지티브한 상관관계를 볼 수 있다(도 12C). 특히, 현행 당업계에서는, Granzyme K 및 Granzime M의 발현은 종양용해성 아데노바이러스나 변이체 IL-2 단백질에 의해 유도되지 않는 것으로 알려져 있지 않다.
TIM-3 및 CTLA-4 유전자의 가장 높은 발현은 야생형 IL-2-코딩 바이러스로 처리된 종양에서 관찰되었다(도 13A). 이러한 유전자는 일반적으로 인간의 T 세포 기능을 억제하는 것으로 알려져 있으므로(Ngoenkam et al., 2018), 잠재적으로 증가된 면역억제 환경과 관련될 수 있다. 또 다른 유전자인 PD-L1은 변이체 IL-2 바이러스로 처리할 때 변경되지 않은 채로 남아 있었다(도 13A). 이것은 쥐와 인간의 면역억제에 있어서 PD-L1의 역할을 고려할 때, 변이체 IL-2 바이러스-처리된 동물에 속하는 종양에서의 가능한 낮은 면역억제에 기여했을 수 있다. CD137(인간 종양-반응성 TIL의 활성화 마커)의 최고 발현 수준이 야생형 IL-2-코딩 바이러스로 처리된 동물의 종양에서 관찰되었지만(도 13A), 이들 종양에서 면역억제에 대응하기에는 불충분했을 수 있다. 이와 대조적으로, CD27(공동-자극 마커)의 발현은 변이체-IL-2-바이러스 그룹에서 증가된 반면 야생형 대응물에서는 변경되지 않았다(도 13A). 더 긴 텔로미어가 CD27을 발현하는 TIL에서 이전에 보고되었으며, 이는 따라서 변이체 IL-2가 말단에서 덜 분화된 TIL의 존재를 잠재적으로 증가시킨다는 것을 시사한다. 한편, CD27은 기억 T-세포에서 고도로 발현되는 것으로 알려져 있으며, 이는 다기능 반응을 일으키는 것으로 여겨진다. 이것은 변이체 IL-2 종양용해성 바이러스가 종양에서 탁월한 품질의 반응을 가능하게 함을 시사한다.
다른 한편으로, 야생형 IL-2의 바이러스-유래 분비는 인간 및 마우스(CD80, CD86, CD40)에서 공지의 항원-제시 세포의 가장 높은 발현을 야기하였다(도 13B). 그러나 놀랍게도 야생형 IL-2-코딩 바이러스 처리는 햄스터에서 그의 변이체 대응물에 비해 열등한 항종양 효능을 나타내었다. 골수 세포와 같은 면역 억제 세포의 존재 및 활성(CD11b, CD206, Arg1) 역시도 야생형 IL-2 바이러스와 비교하여 변이체 IL-2 코딩 바이러스에서 변경되지 않거나 감소되었다(도 13B). 일반적인 기술과 달리, 이러한 효과는 변이체 IL-2 단백질의 특정 돌연변이가 다른 면역억제 세포 대신 조절 T-세포의 원치 않는 표적화를 방지하는 것을 주요 목표로 한다는 점을 고려하면 예상치 못한 것이다.
추가 분석 결과 야생형 IL-2 또는 변이체 IL-2-바이러스 요법으로 처리된 햄스터의 종양에서 IL-6, TGFb, IL-10(도 13C)의 유전자 발현이 전반적으로 감소된 것으로 나타났다(도 13C). 흥미롭게도, 전자는 CCL3, TNF, IL-1b(도 13C)(인간과 마우스에서 전염증성 사이토카인을 인코딩하는 유전자)의 발현을 증가시킨 반면, 야생형 IL-2 바이러스로 처리된 종양은 변이체 IL-2로 처리된 종양보다 더 큰 상태로 남아 있었다. 이에 대한 가능한 설명은 만성 수준에서 인간의 종양 진행에 기여할 수 있는 항종양 면역에서의 TNF의 알려진 모호한 역할이다.
요약하면, 변이체 IL-2-바이러스는 TCR을 보유하는 T 세포의 능력, 신호전달, 골수 세포 구획으로부터의 낮은 T 세포 억제 및 면역 억제를 촉진한다. 이러한 효과는 이펙터 세포의 개선된 세포독성 기능에 기여했을 수 있으며, 이는 변이형 IL-2-코딩 종양용해성 아데노바이러스 요법이 다른 치료군과 비교하여 최상의 생존 및 항종양 효능을 제공할 수 있게 해준다.
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Claims (26)

  1. 이식유전자로서 변이체 인터루킨 2 (vIL-2) 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 종양용해성 아데노바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이체 IL-2는 수용체 서브유닛 IL-2Rα에 대해 감소된 결합을 나타내지만 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ 결합 활성은 유지하거나 또는 개선된 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ 결합 활성을 나타내는 것인 종양용해성 바이러스 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 백본은 아데노바이러스 혈청형 3(Ad3)의 섬유 노브와 함께 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 또는 혈청형 3(Ad3) 핵산 골격 또는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 골격인 종양용해성 벡터.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 변이체 인터루킨 2(vIL-2) 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 핵산 서열은 상기 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 E3 영역에서 결실된 핵산 서열의 위치에 있는 것인 종양용해성 벡터.
  5. 제4항에 있어서, E3 영역에서의 핵산 서열의 결실은 바이러스 gp19k 및 6.7k 리딩 프레임의 결실인 종양용해성 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 벡터는 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 E1 서열의 24 bp 결실(Δ24)을 포함하는 것인 종양용해성 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 벡터는 Ad5/3 섬유 노브를 포함하는 것인 종양용해성 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 벡터는 Ad5/3-E2F-d24 백본을 포함하는 것인 종양용해성 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 벡터는 Ad5/3-E2F-d24-vIL-2 구조를 갖는 것인 종양용해성 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 SEQ ID NO:2에 정의된 위치를 참조로, 치환 L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F를 포함하는 변이체 IL-2 폴리펩타이드를 인코딩하는 것인 종양용해성 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 벡터는 추가의 이식유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 종양용해성 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 추가의 이식유전자는 사이토카인을 인코딩하는 것인 종양용해성 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 사이토카인은: TNF알파, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 보체 C5a, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (=RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 및 XCL2로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인 종양용해성 벡터.
  14. 제12항에 있어서, 사이토카인은 TNF알파인 것인 종양용해성 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 생리학적으로 허용되는 담체, 완충제, 부형제, 보조제, 첨가제, 방부제, 보존제, 충전제, 안정화제 및/또는 증점제 중 하나 이상을 포함하는 의약 조성물.
  16. 암 또는 종양, 좋기로는 고형 종양의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 종양용해성 아데노바이러스 벡터 또는 제15항에 따른 의약 조성물.
  17. 종양용해성 벡터 또는 제16항에 있어서, 암 또는 종양은 비인두암, 활막암, 간세포암, 신장암, 결합조직암, 흑색종, 폐암, 대장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모막암, 가스트린종, 갈색세포종, 프로락틴종, T세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰 히펠-린다우병, 졸링거-엘리슨 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 뇌암, 희소돌기아교종, 신경모세포종, 수막종, 척수종양, 뼈암, 골연골종, 연골육종 , 유잉육종, 원발부위불명암, 카르시노이드, 위장관의 카르시노이드, 섬유육종, 유방암, 파제트병, 자궁경부암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안암, 목암, 신장암, 윌름스종양, 카포시육종, 전립선암, 고환암, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 구강암, 피부암, 중피종, 다발성 골수종, 난소암 , 내분비췌장암, 글루카곤종, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 융모성암, 포상기태(hydatidiform mole), 자궁암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 청신경종, 균상식육종, 인슐린종, 카르시노이드 증후군, 체세포종, 잇몸암, 심장암, 입술암, 수막암, 구강암, 신경암, 구개암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 침샘암, 혀암 및 편도암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 종양용해성 벡터 또는 의약 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 입양 세포 치료 조성물과 함께 사용되기 위한 것인 종양용해성 벡터 또는 의약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 대상체에서 입양 세포 요법의 효능을 증가시키기 위해 암 치료에 사용하기 위한 것인 종양용해성 벡터 또는 의약 조성물.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선요법, 모노클로날 항체, 화학요법, 소분자 억제제, 호르몬 요법 또는 기타 항암 약물 또는 대상체에 대한 개재와 함께 암 치료에 사용하기 위한 것인 종양용해성 벡터 또는 의약 조성물.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 종양용해성 아데노바이러스 벡터 또는 제15항에 따른 의약 조성물의 약학적 유효량을 대상체에게 투여하는, 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 암 또는 종양은 비인두암, 활막암, 간세포암, 신장암, 결합조직암, 흑색종, 폐암, 대장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모막암, 가스트린종, 갈색세포종, 프로락틴종, T세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰 히펠-린다우병, 졸링거-엘리슨 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 뇌암, 희소돌기아교종, 신경모세포종, 수막종, 척수종양, 뼈암, 골연골종, 연골육종 , 유잉육종, 원발부위불명암, 카르시노이드, 위장관의 카르시노이드, 섬유육종, 유방암, 파제트병, 자궁경부암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안암, 목암, 신장암, 윌름스종양, 카포시육종, 전립선암, 폐암, 고환암, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 구강암, 피부암, 중피종, 다발성 골수종, 난소암 , 내분비췌장암, 글루카곤종, 부갑상선암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 융모성암, 포상기태(hydatidiform mole), 자궁암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 청신경종, 균상식육종, 인슐린종, 카르시노이드 증후군, 체세포종, 잇몸암, 심장암, 입술암, 수막암, 구강암, 신경암, 구개암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 침샘암, 혀암 및 편도암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 벡터는 입양 세포 치료 조성물과 함께 투여되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 대상체에 대한 입양 세포 치료 조성물 및 종양용해성 바이러스 벡터의 투여(들)는 동시에 또는, 임의 순서로 연속적으로 수행되는 것인 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 동시 또는 순차적 방사선요법, 모노클로날 항체, 화학요법, 소분자 억제제, 호르몬 요법, 입양 세포 요법 또는 기타 항암 약물 또는 개재를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 암 또는 종양 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 종양용해성 벡터의 용도.

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