KR20220088372A - HBV 발현을 억제하는 RNAi 제제 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 B형 간염 바이러스의 발현을 억제하는 RNAi 제제 및 이의 용도에 관한 것으로, B형 간염 바이러스의 발현을 억제하는 RNAi 제제 및 상기 RNAi 제제를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

HBV 발현을 억제하는 RNAi 제제 및 이의 용도 {RNA interference agent for inhibiting Hepatitis B virus expression and use thereof}
본 출원은 HBV (Hepatitis B virus) 발현을 억제하는 RNAi 제제 및 이의 용도에 관한 것이다.
B형 간염 (Hepatitis B)은 B형 간염 바이러스 (Hepatitis　B　virus, HBV)의 감염에 의한 전염성 질병으로, 잠복기에는 권태감, 식욕 부진, 피로, 오심, 구토, 우측 상복부 불편감이 나타나며, 증상이 심한 경우에는 황달, 및 소양증을 유발한다. 전 세계적으로 매년 200 만명 이상이 HBV에 감염되는 것으로 알려져 있으며, HBV 백신이 개발됨에 따라 HBV 보유율이 3 % 정도로 감소하였으나, 여전히 국내 보균자수는 약 125 만명에 달하고 있다. B형 간염 환자 치료의 가장 큰 걸림돌로는 HBV 치료제에 대한 빈번한 약제 내성의 출현이며, 이에 따라 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
B형 간염 바이러스는 3,200bp 크기의 불완전한 이중가닥으로 이루어진 DNA 바이러스로서, 완전한 원형의 음성 가닥 DNA 안쪽에 불완전한 상보적 구조의 양성 가닥 DNA가 위치한다. B형 간염 바이러스 게놈은 4개의 ORF (open reading frame)가 둘러싸여져 있는데, 이 중에서 가장 길이가 긴 것은 중합효소를 encoding하는 polymerase ORF이고, 그 다음은 바이러스 표면 단백을 encoding하는 surface ORF이며, 이는 polymerase ORF 내에 겹쳐서 존재한다. 한편, precore/core ORF와 core promoter/X ORF는 polymerase ORF와 일부 겹쳐진 상태로 존재한다.
이러한 구조를 갖는 B형 간염 바이러스의 증식은 바이러스가 간세포의 표면에 붙어서 세포질 내로 침투하는 것부터 시작된다. 세포질 내로 침투한 B형 간염 바이러스의 뉴클레오캡시드는 핵막에서 외피를 제거하는 과정을 거친 후에 간세포 핵 내로 이동한다. 핵 내에서 B형 간염 바이러스 게놈은 인체 내의 효소를 이용하여 불완전한 이중 가닥인 RC (relaxed circular) DNA 형태에서 완전한 이중구조를 가지는 cccDNA (covalently closed circular DNA) 형태로 전환된다. 이 형태는 모든 B형 간염 바이러스 mRNA를 전사하는데 있어 가장 중요한 주형으로 작용한다. 이후, cccDNA 형태의 바이러스 소염색체부터 5개의 RNA를 전사하는 과정이 진행된다. 상기 전사 과정은 두 개의 enhancer에 의해 조절을 받는데, enhancer I은 S와 X 단백 사이에, enhancer II는 core promoter 바로 상부에 위치하며, 상기 Enhancer I, II는 프로모터를 상향 조절시켜 바이러스 증식을 촉진한다. 4개의 프로모터에 의해 만들어진 전사체들은 3.5 kb인 pregenomic RNA와 3.5 kb보다 약간 큰 크기의 precore RNA, 그리고 2.4 kb, 2.1 kb, 0.7 kb의 subgenomic RNA들이다. 일련의 프로모터들은 전사체의 활성도를 조절하며 RNA 전사체들은 번역 과정을 통하여 단백질을 생성한다. 2.4 kb의 RNA 전사체는 preS1 단백질을, 2.1 kb의 RNA 전사체는 preS2와 S 단백질을, 0.7 kb의 전사체는 X 단백질을 생성한다. 이후, Precore RNA는 HBeAg을 생성하고, pregenomic RNA는 바이러스의 뉴클레오캡시드(core 단백, HBcAg)와 중합효소를 만들고 또한 역전사의 주형 역할까지 한다. 이후, 세포질 내에서 pregenomic RNA의 핵산외각생성신호(encapsidation signal or epsilon, ε)와 중합효소가 반응하여 함께 뉴클레오캡시드 안으로 싸여지고(encapsidation) 그 내부에서 역전사 과정에 의해서 음성가닥 DNA를 생성한다. 이 때 11개의 뉴클레오티드로 구성된 DR1(direct repeat 1)이 음성가닥 DNA를 만드는 시발체의 역할을 한다. 상기와 같이 음성가닥 DNA가 만들어지면 DR1과 거의 같은 서열의 DR2가 반대편 양성가닥의 5’ 말단 부위에서 다시 시발이 되어 양성 가닥 DNA가 만들어지기 시작하고 불완전하지만 이중 가닥이 되면서 RC DNA가 형성되고, 뉴클레오캡시드는 점차 완숙해진다. 이후 뉴클레오캡시드는 다시 간세포핵 안으로 들어가 간내 cccDNA 양을 점차 늘려 나가거나 세포질세망에서 외피막을 형성한 후 골지체를 거쳐 새로운 virion의 형태로 간세포 밖으로 방출된다.
한편, RNA 간섭 (RNA interference) 현상을 이용한 질병의 치료는 mRNA를 타겟으로 하여, 유전자의 발현을 translational level에서 조절하는 siRNA를 이용하기 때문에 보다 안전하게 질병을 치료할 수 있다. 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)는 표적 mRNA와 같은 시퀀스를 가진 sense strand와 그와 상보적인 시퀀스를 가진 antisense strand로 구성된다. conventional siRNA는 19-21bp의 짧은 duplex를 가지며 양쪽 strand 3'에 2개의 뉴클레오티드가 돌출되어 있다. siRNA는 세포 내로 들어가 표적 mRNA에 붙어 표적 mRNA를 분해시키며 표적 유전자의 발현을 억제한다. oligo의 시퀀스를 바꿈으로써 모든 mRNA를 표적으로 하는 것이 가능하기 때문에 구조가 복잡한 단백질의 발현도 억제할 수 있으며, 따라서 현재 치료가 어려운 암, 바이러스 감염, 유전병과 같은 질병의 치료를 가능하게 할 수 있다. 그러나 세포 내로 유입된 siRNA는 면역반응 유발, 비표적 유전자의 억제와 같은 부작용을 일으킬 수 있는데, 그 중에서도 siRNA를 세포 내로 도입하는 delivery system이 siRNA를 이용한 치료제 개발에서 가장 큰 문제가 되고 있다.
siRNA는 phosphate backbone 때문에 음전하를 띄게 되는데, 음전하를 갖는 세포막과 반발력을 갖게 되어 세포 내로 siRNA를 도입하려면 delivery system을 필요로 한다. delivery system의 한 예로는 양전하를 갖는 리포좀이나 폴리머로 siRNA를 감싸서 음전하를 상쇄시켜 세포 내로 도입하는 방법이 많이 사용되고 있다. 그러나 양전하를 갖는 전달체는 음전하를 갖는 세포막에 붙어 원하지 않는 독성을 나타내거나 세포 내의 여러 종류의 단백질과 상호작용을 통해 원하지 않는 복합체를 형성하는 등 다양한 부작용을 일으킬 수 있다. 또한 siRNA는 혈액 내의 핵산가수분해효소(nuclease)에 의해 빠르게 분해되기 때문에 표적으로 하는 세포에 도달되는 siRNA의 양이 표적 유전자의 발현을 상당히 감소시킬 만큼 충분하지 않을 수 있다. 따라서 siRNA가 안전하고 효과적으로 타겟 세포 내로 전달될 수 있는 방법이 필요하다.
이에 본 발명자들은 HBV를 표적으로 하는, 전달체의 도움 없이 세포 내로 전달되며 핵산가수분해효소에 대한 저항성이 높은 siRNA를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, B형 간염 바이러스 게놈 중 중합효소(Polymerase), S 단백질 (표면 항원 S) 또는 HBx (X 단백질)영역의 ORF에 대한 전사체를 억제함으로써, HBV의 증식을 억제할 수 있는 siRNA들을 디자인하였으며, 더 나아가, 효능 스크리닝을 통해 가장 효율적인 siRNA를 선별하고, 변형(modification)을 통해 세포 내 전달 문제를 극복할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 HBV (Hepatitis B virus) 발현을 억제하는 RNAi 제제를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 RNAi 제제를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 개선 또는 치료용 약학 조성물, 또는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 개선 또는 치료방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 B형 간염 바이러스 게놈 중 HBV S 또는 HBV X 유전자의 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것을 특징으로 하는 RNAi 제제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi 제제를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi 제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 개선 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, HBV (Hepatitis B virus)의 증식을 효율적으로 억제시킬 수 있는 비대칭 siRNA를 제공할 수 있다. 또한, 상기 siRNA가 전달체 도움 없이 세포 내로 도입되고 핵산가수분해효소에 대한 저항성을 갖도록 화학적으로 변형시킨 siRNA를 통해 in vivo에서 보다 효율적으로 HBV를 억제함으로써, B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 비대칭 HBV asiRNA의 구조를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 HBV asiRNA를 Hela 세포에 처리한 후, 이에 따른 HBV 증식 억제능을 확인한 결과이다.
도 3은 HBV asiRNA 4종을 마우스 간 세포에 처리한 후, 이에 따른 HBV 증식 억제능을 확인한 결과이다.
도 4는 HBV cp-asiRNA 8종을 마우스 간 세포에 처리한 후, 이에 따른 HBV 증식 억제능을 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 HBV cp-asiRNA의 효능을 평가하기 위한 마우스 모델 실험 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 6은 HBV cp-asiRNA 2종을 마우스에 투여한 후, 이에 따른 HBV 증식 억제능을 확인한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 HBV cp-asiRNA의 효능을 평가하기 위한 마우스 모델에서의 Efficacy assay 및 Duration assay 실험 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 8은 HBV cp-asiRNA 21종의 Efficacy assay 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 HBV cp-asiRNA 21종의 Duration assay 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 일 실시예에 따른 HBV cp-asiRNA의 효능을 평가하기 위한 세포 모델에서의 실험 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 11은 HBV asiRNA 및 이의 cp-asiRNA의 HBV 증식 억제능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 일 실시예에 따른 HBV cp-asiRNA의 효능을 평가하기 위한 AAV-HBV 마우스 모델에서의 실험 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 13은 AAV-HBV 마우스 모델에서 HBV cp-asiRNA의 HBV 증식 억제능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 AAV-HBV 마우스 모델에서 HBV cp-asiRNA의 HBV 증식 억제능을 면역조직화학법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 HBV cp-asiRNA 20종을 마우스 간 세포에 처리한 후, 이에 따른 HBV 증식 억제능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 은 일 실시예에 따른 HBV cp-asiRNA의 효능을 평가하기 위한 마우스 모델에서의 Efficacy assay 및 Duration assay 실험 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 17은 HBV cp-asiRNA 7종의 Efficacy assay 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 HBV cp-asiRNA 4종의 Duration assay 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 HBV cp-asiRNA 3종의 IC50 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 E-VP 변형이 도입된 HBV cp-asiRNA 3종의 HBV 증식 억제능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"RNAi(RNA interference; RNA 간섭)"란, 목적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)를 세포 등에 도입하여 목적 유전자 mRNA의 분해를 유도함으로써 목적 유전자의 발현을 억제하는 메카니즘을 의미한다.
“RNAi 유도용 핵산 분자 (nucleic acid molecules inducing RNAi), RNAi 제제, 또는 RNAi 유도용 제제"란 서열-특이적 방식으로 상기 RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제 또는 하향 조절할 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 개별 핵산 분자, 복수의 상기 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자의 풀 (pool) 모두를 지칭할 수 있다. 일 구체예에 있어서 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 siRNA일 수 있다.
"siRNA(small interfering RNA; 짧은 간섭 RNA)"란, 서열 특이적으로 효율적인 유전자 발현 억제(gene silencing)를 매개하는 짧은 이중 가닥의 RNA(dsRNA)를 의미한다.
"안티센스 가닥(antisense strand)"이란 관심 있는 목적 핵산(target nucleic acid)에 실질적으로 또는 100% 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 예를 들어 mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g.,microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 상보적일 수 있다.
"센스 가닥(sense strand)"이란 목적 핵산과 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.
"유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 목적 유전자는 바이러스 게놈에 내재된 것으로, 동물 유전자로 통합되거나 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다. 예컨대, 목적 유전자는 HBV 게놈상의 유전자일 수 있다. 이 경우, siRNA 분자는 포유동물 세포 내 HBV 유전자의 번역을 불활성화시키는데 유용하다.
"B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus, HBV)"는 헤파드나바이러스 (Hepadnaviridae) 패밀리에 속하는 바이러스로서, 간 세포에 침투하여 급성 및 만성 간염 등을 유발한다. 상기 HBV는 간세포 표면에 달라붙어 세포 내로 침투하는 과정, 세포질에서 외피를 벗겨내고 세포핵 안으로 침입해 DNA 복제를 하는 증식 과정, 세포질에서 껍질을 쌓아 완전한 바이러스 형태로 재조합하는 조립 과정, 및 간세포 밖으로 빠져나가는 배출 과정, 그리고 또 다시 다른 간세포에 달라붙어 반복해서 증식하는 과정을 거치게 된다. 이 중에서도, cccDNA(covalently closed circular DNA)는 HBV에 감염된 간세포 핵 내에 존재하며 HBV 전사의 주형 역할을 하는 바, 이를 매개로 하는 유전자의 전사, 번역 과정을 억제하는 것은 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환을 치료하는데 효과적일 수 있다.
특히, HBV 게놈의 전사가 다시스트론성 중첩 RNA를 초래하기 때문에, 단일 HBV 유전자를 표적으로 하는 일 양상에 따른 RNAi 제제는 대부분의 또는 모든 HBV 전사물 발현의 유의미한 억제를 초래할 수 있다. 예를 들어, HBV 게놈 중 S 유전자를 표적으로 하는 RNAi 제제는 S 유전자 발현뿐 아니라 "하류" 유전자의 발현의 억제를 함께 초래할 수 있고, HBV 게놈 중 X 유전자를 표적으로 하는 RNAi 제제 역시, X 유전자 발현 뿐 아니라 "하류" 유전자의 발현의 억제를 초래할 수 있다. 따라서, HBV 게놈 중 HBV S 또는 HBV X 유전자의 발현을 억제함으로써, B형 간염 바이러스의 복제 또는 증식을 억제할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 B형 간염 바이러스 게놈 중 S 단백질 (표면 항원 S) 또는 HBx (X 단백질)영역의 ORF에 대한 전사체의 억제는, B형 간염 바이러스 게놈 중 중합효소(Polymerase) 영역의 ORF와 중첩된 영역에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 목적은 크게 두 가지로 나타낼 수 있는데, 첫째는 HBV 유전자를 타겟으로 하는 siRNA들을 디자인하고, 스크리닝을 통해 가장 효율적으로 HBV의 복제 또는 증식을 억제시키는 siRNA를 선별하는 것이며, 둘째는 siRNA를 별다른 전달체 없이 세포 내로 전달시키고 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 높이기 위해 화학적인 변형을 도입하는 것이다. 인지질로 구성된 세포막을 통과하려면 크기가 작거나 혹은 소수성이어야 한다. 그러나 siRNA는 phosphate backbone에 의해 음전하를 띄며 그로 인해 세포막을 투과하는데 어려움이 있다. 또한 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 높여 serum에서의 긴 lifetime을 가지게 하여 표적으로 도달되는 양이 효과적인 RNAi를 일으키기에 충분하도록 만들어야 한다. 따라서 변형(modification)을 도입하여, siRNA의 delivery 문제를 극복하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 먼저 HBV 게놈 중 S 또는 X 유전자를 타겟으로 하는 asiRNA를 디자인하고, HBV plasmid로 형질감염된 세포에서 HBV 증식 억제능이 우수한 asiRNA를 선별하였다. 이후, 상기 선별된 siRNA에 다음 4가지의 modification을 도입하여 asiRNA가 세포 관통능을 가지고 핵산가수분해효소에 저항성을 가지도록 변형시켰다. 첫째는 sense strand의 3' 말단에 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc) 유도체를 결합시켜 간 조직으로의 전달을 가능하게 해준다. 두 번째는 sense strand 또는 antisense strand의 5' 말단 또는 3' 말단 가까이의 phosphate backbone을 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하여 핵산외부가수분해 효소에 대한 저항성을 가지며, 세포로의 흡수와 in vivo에서 siRNA의 생물학적 이용을 가능하게 해준다. 세 번째는 당의 2'을 OMethyl로 modification하여 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 부여하며 siRNA immunogenicity를 낮추어 주며 off-target 효과를 감소시켜준다. 네 번째는 당의 2'을 fluoro로 modification하여 double strand duplex에 안정성을 부여하며, serum에서의 안정성을 높이고 in vitro와 in vivo에서 효율적인 silencing이 가능하게 한다. siRNA에 위와 같은 modification을 가함으로써 siRNA는 세포 관통능을 갖게 되고, serum에 더욱 오래 머물러 표적 세포로 충분한 양의 siRNA가 전달됨에 따라 보다 효율적인 유전자 억제를 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, B형 간염 바이러스 (Hepatitis　B　virus, HBV)의 발현을 억제하는, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 제제로서, 상기 안티센스 가닥은 19 내지 23nt의 길이를 가지며; 상기 센스 가닥은 15 내지 17nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하고, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하고, 다가의 갈락토스 또는 N-아세틸-갈락토사민 유도체를 포함하며; 및 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것인 RNAi 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 일 관점에서, B형 간염 바이러스 (Hepatitis　B　virus, HBV)의 발현을 억제하는, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 제제로서,상기 안티센스 가닥은 19 내지 23nt의 길이를 가지며; 상기 센스 가닥은 15 내지 17nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하고, 서열번호 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 및 75로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하고, 다가의 갈락토스 또는 N-아세틸-갈락토사민 유도체를 포함하며; 및 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것인 RNAi 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 일 관점에서, HBV의 중합효소와 표면 항원 S을 암호화하는 오버래핑 오픈 리딩 프레임 또는 HBV의 중합효소와 X 단백질 (HBx)을 암호화하는 오버래핑 오픈 리딩 프레임과 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하는 RNAi 제제, 및 상기 RNAi 제제를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서의 siRNA는 일반적인 RNAi(RNA interference) 작용을 가지는 모든 물질을 포함하는 개념이다. RNAi는 1998년 Caenorthabditis elegans에서 최초로 발견된 세포 내 유전자 조절 기작으로 작용기전은 세포 내로 투입된 RNA 이중 가닥 중 안티센스 가닥이 표적 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 유전자 분해를 유도한다고 알려져 있다. 그 중 siRNA는 "in vitro"에서 유전자의 발현을 억제하는 방법 중에 하나다. 19-21bp의 siRNA는 이론적으로 거의 모든 유전자에 대한 선택적 억제가 가능하여 암, 바이러스성 감염 등의 다양한 유전자 관련 질환 치료제로 개발이 가능하며, 최근 가장 각광받는 신약 개발 후보 기술이다. 포유동물에서 siRNA를 사용한 생체 내 치료를 첫 시도한 경우는 2003년 중반이었으며, 그 이후로 응용 연구에 대한 많은 시도로 생체 내 치료에 관하여 다수 보고되었다.
다만, 가능성과 반대로 siRNA의 부작용 및 단점이 계속적으로 보고되어 있다. RNAi 기반 치료제의 개발이 이루어지기 위해서는 1) 효과적인 전달시스템의 부재, 2) 오프타겟 효과, 3) 면역반응 유도, 4) 세포 내 RNAi 기구 포화와 같은 장벽을 극복해야 할 필요성이 있다. siRNA가 표적 유전자의 발현을 직접적으로 조절할 수 있는 효과적인 방법임에도 불구하고 이와 같은 문제들로 인해 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다. 이와 관련하여, 비대칭 siRNA(asymmetric shorter duplex siRNA, asiRNA)는 종래의 siRNA가 가지는 19+2 구조에 비해 짧은 이중나선 길이를 갖는 비대칭 RNAi 유도 구조이다. 기존 siRNA 구조 기술에서 확인되는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화, TLR3에 의한 면역반응 등의 문제점들을 극복한 기술이며, 이에 따라 부작용이 낮은 RNAi 신약 개발이 가능하다.
이를 바탕으로, 일 실시예에서는 센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 비대칭 siRNA를 제시하며, 일 실시예에 따른 siRNA는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화 등의 문제를 일으키지 않아 안정적으로 높은 전달 효율을 유지하면서, 목적하는 정도로 유효하게 HBV 표적 유전자에 대한 발현을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNAi 제제는 상기 센스 가닥은 15 내지 17nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥은 18nt 이상의 길이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 안티센스 가닥은 18 내지 31nt의 길이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 18 내지 23nt의 길이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 센스 가닥의 길이는 16nt 또는 17nt, 이와 상보적인 안티센스 가닥의 길이는 19nt, 20nt, 21nt 또는 22nt인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성한다. 안티센스 가닥의 3' 말단은 예를 들어 1 내지 16nt의 오버행(overhang)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, HBV 게놈 중 S 또는 X 유전자를 타겟으로 하는 HBV asiRNA를 디자인하였고, HBV가 형질감염된 세포 또는 일시적으로 발현하는 transient cell에서 감염된 HBV의 억제 효능을 확인하였다.
본 발명에 따른 RNAi 제제에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는, 서열번호 7, 13, 29, 33, 65 또는 67일 수 있다.
본 발명에 따른 RNAi 제제에 있어서, 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 8, 14, 30, 34 또는 66일 수 있다
본 발명에 따른 다른 RNAi 제제에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 및 75로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 29, 33, 65, 67, 73 또는 75일 수 있다.
본 발명에 따른 다른 RNAi 제제에 있어서, 안티센스 가닥은 서열번호 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 및 76으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 30, 34, 66, 68, 74 또는 76일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
일반적인 siRNA는 포스페이트 백본 구조에 의한 높은 음전하 및 높은 분자량 등의 이유로 세포막을 통과할 수 없고 혈액에서의 빠른 분해 및 제거되어 실제 표적 부위에 RNAi 유도를 위한 충분한 양을 전달하는데 어려움이 있다. 현재 in vitro 전달의 경우 cationic lipids와 cationic polymers들을 이용한 높은 효율의 delivery 방법이 많이 개발되어 있지만, in vivo의 경우에는 in vitro만큼의 높은 효율로 siRNA를 전달하기 어렵고, 생체 내에 존재하는 다양한 단백질들과 상호작용에 의하여 siRNA 전달 효율이 감소하는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 비대칭 siRNA 구조에 화학적 변형을 도입하여 별도의 전달체 없이 효과적이고 세포 내 전달을 할 수 있는 자가 전달능을 가진 asiRNA 구조체(cp-asiRNA)를 개발하였다.
본 발명에 있어서, 상기 센스 가닥은 가닥은 3가의 N-아세틸-갈락토사민 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에서 화학적 변형은 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다: 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, 또는 -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 산소가 황으로 치환; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및 인산기(phosphate group), E-비닐포스포네이트(E-Vinylphosphonate) 또는 세포 침투 펩타이드와의 결합.
일 구체예에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 하기로부터 선택된 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다: 3'말단 또는 5'말단으로부터 인접한 3 내지 5개의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; 2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 및 5' 말단에 인산기(phosphate group), E-비닐포스포네이트(E-Vinylphosphonate) 또는 세포 침투 펩타이드의 결합.
일 구체예에 있어서, 상기 센스 가닥은 하기로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다: 5'말단으로부터 인접한 2 내지 4개의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; 2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 및 3' 말단에 세포 침투 펩타이드의 결합.
다른 구체예에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 중 2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -OCH3(methoxy) 또는 -F(불소)로 치환되는 변형; 센스 또는 안티센스 가닥에서 10% 이상의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 변형; 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 인산기(phosphate group) 결합 또는 E-비닐포스포네이트(E-Vinylphosphonate) 결합;으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 RNAi 제제에 있어서, 안티센스 가닥은 하기 표 1의 (a) 내지 (d)로 구성된 군에서 선택되고, 센스 가닥은 하기 표 1의 (e) 내지 (h)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 안티센스 가닥은 하기 표 1의 (a) 또는 (c) 중 어느 하나 일 수 있고, 상기 센스 가닥은 하기 표 1의 (e) 또는 (g) 중 어느 하나일 수 있다
　 서열 (5' > 3')
(a) P-mU*fA*mCfGmAfAmCfCmAfCmUmGmAfAmC*fA*mA*fA*mU
(b) P-mU*fA*mCmGmAfAmCfCfAmCmUmGmAfAmC*fA*mA*mA*mU
(c) P-mU*fA*mGfAmUfGmAfGmAfAmGmGmCfAmC*fA*mG*fA*mC
(d) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC
(e) mU*fG*mUfUfCfAmGfUmGfGmUfUmCfGmUfA-GalNAc
(f) mU*fG*mUfUfCfAmGmUmGmGmUmUmCmGmUmA-GalNAc
(g) mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc
(h) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCmAmUmCmUmA-GalNAc
상기 서열에서 *는 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated bond), m은 2'-O-메틸(Methyl), 2'-F-는 2'-플루오로(Fluoro), P는 5'-인산기(Phosphate group)를 의미하며, GalNAc는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc) 유도체가 결합되어 있는 것이다.
본 발명에 따른 다른 RNAi 제제에 있어서, 안티센스 가닥은 하기 표 2의 (a1) 내지 (u1)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이고, 센스 가닥은 하기 표 2의 (a2) 내지 (u2)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 상기 안티센스 가닥은 하기 표 2의 (a1), (b1), (j1), (q1), (s1), (t1) 또는 (u1) 중 어느 하나 일 수 있고, 상기 센스 가닥은 하기 표 2의 (a2), (b2), (j2), (q2), (s2), (t2) 또는 (u2) 중 어느 하나일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 안티센스 가닥은 하기 표 2의 (a1), (j1), (s1), (t1) 또는 (u1) 중 어느 하나 일 수 있고, 상기 센스 가닥은 하기 표 2의 (a2), (j2), (s2), (t2) 또는 (u2) 중 어느 하나일 수 있다.
No. 서열 (5' > 3') 서열이름
(a1) P-mU*fA*mGfAmGfGmAfCmAfAmAmCmGfGmG*fC*mA*fA*mC OLX703A-020-1_antisense
(b1) P-mU*fA*mGfAmGfGmAfCmAfAmAmCmGfGmG*fC*mA*fA*mC OLX703A-020-3_antisense
(c1) P-mU*fA*mGmAmGfGmAmCmAmAmAmCmGfGmG*fC*mA*mA*mC OLX703A-020-5_antisense
(d1) EVP-mU*fA*mGfAmGfGmAfCmAfAmAmCmGfGmG*fC*mA*fA*mC OLX703A-020-17_antisense
(e1) P-mU*fA*mCmGmAfAmCmCmAmCmUmGmAfAmC*fA*mA*mA*mU OLX703A-032-5_antisense
(f1) P-mU*fA*mCfGmAfAmCfCmAfCmUmGmAfAmC*fA*mA*fA*mU OLX703A-032-9_antisense
(g1) P-mU*fG*mAmGmAfAmGfGfCmAmCmAmGfAmC*fG*mG*mG*mG OLX703A-044-2_antisense
(h1) P-mU*fG*mAfGmAfAmGfGmCfAmCmAmGfAmC*fG*mG*fG*mG OLX703A-044-3_antisense
(i1) P-mU*fG*mAfGmAfAmGfGmCfAmCmAmGfAmC*fG*mG*fG*mG OLX703A-044-13_antisense
(j1) P-mU*fC*mAfGmAfUmGfAmGfAmAmGmGfCmA*fC*mA*fG*mA OLX703A-046-3_antisense
(k1) P-mU*fC*mAmGmAmUfGmAfGmAmAmGmGfCmA*fC*mA*mG*mA OLX703A-046-8_antisense
(l1) P-mU*fC*mAfGmAfUmGfAmGfAmAmGmGfCmA*fC*mA*fG*mA OLX703A-046-13_antisense
(m1) EVP-mU*fC*mAfGmAfUmGfAmGfAmAmGmGfCmA*fC*mA*fG*mA OLX703A-046-17_antisense
(n1) P-mU*fA*mUmGmAmGfAmAfGmGmCmAmCfAmG*fA*mC*mG*mG OLX703A-080-6_antisense
(o1) P-mU*fA*mUmGmAmGfAmAfGmGmCmAmCfAmG*fA*mC*mG*mG OLX703A-080-16_antisense
(p1) P-mU*fA*mGfAmUfGmAfGmAfAmGmGmCfAmC*fA*mG*fA*mC OLX703A-082-1_antisense
(q1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC OLX703A-082-2_antisense
(r1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC OLX703A-082-5_antisense
(s1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC OLX703A-082-12_antisense
(t1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC OLX703A-082-16_antisense
(u1) EVP-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC OLX703A-082-17_antisense
(a2) mG*fC*mCfCfGfUmUfUmGfUmCfCmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-020-1_sense
(b2) mG*fC*mCfCfGfUmUmUmGmUmCmCmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-020-3_sense
(c2) mG*fC*mCfCfGfUmUfUmGfUmCfCmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-020-5_sense
(d2) mG*fC*mCfCfGfUmUfUmGfUmCfCmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-020-17_sense
(e2) mU*fG*mUfUfCfAmGfUmGfGmUfUmCfGmUfA-GalNAc OLX703A-032-5_sense
(f2) mU*fG*mUfUfCfAmGmUmGmGfUfUmCmGmUmA-GalNAc OLX703A-032-9_sense
(g2) mC*fG*mUfCfUfGmUfGmCfCmUfUmCfUmCfA-GalNAc OLX703A-044-2_sense
(h2) mC*fG*mUfCfUfGmUmGmCmCmUmUmCmUmCmA-GalNAc OLX703A-044-3_sense
(i2) mC*fG*mUfCfUfGmUmGmCmCmUmUmCfUmCfA-GalNAc OLX703A-044-13_sense
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(p2) mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-082-1_sense
(q2) mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-082-2_sense
(r2) mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-082-5_sense
(s2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-082-12_sense
(t2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCmAmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-082-16_sense
(u2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-082-17_sense
상기 서열에서 *는 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated bond), m은 2'-O-메틸(Methyl), 2'-F-는 2'-플루오로(Fluoro), P는 5'-인산기(Phosphate group), EVP는 5' E-비닐포스포네이트(E-Vinylphosphonate)를 의미하며, GalNAc는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc) 유도체가 결합되어 있는 것이다.
본 발명에 따른 또 다른 RNAi 제제에 있어서, 안티센스 가닥은 하기 표 3의 (a1) 내지 (u1)로 구성된 군에서 선택되고, 센스 가닥은 하기 표 3의 (a2) 내지 (u2)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 안티센스 가닥은 하기 표 3의 (e1), (k1), (l1), (n1) 또는 (vl)이고, 상기 센스 가닥은 하기 표 3의 (e2), (k2), (l2), (n2) 또는 (v2)이다. 보다 바람직하게는 상기 안티센스 가닥은 하기 표 3의 (k1), (l1), (n1) 또는 (vl)이고, 상기 센스 가닥은 하기 표 3의 (k2), (l2), (n2) 또는 (v2)이다.
No. 서열 (5' > 3') 서열 이름
(a1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmA*mC*fG*mG OLX703A-103-16_antisense
(b1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*mG*mG OLX703A-103-24_antisense
(c1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*fG*mG OLX703A-103-30_antisense
(d1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*mG*mG OLX703A-103-47_antisense
(e1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*fG*mG OLX703A-103-49_antisense
(f1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*mG*mG OLX703A-103-67_antisense
(g1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*fG*mG OLX703A-103-71_antisense
(h1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*fA*mC*mG*mG OLX703A-103-82_antisense
(i1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmCfA*mG*mA*mC*fG*mG OLX703A-103-85_antisense
(j1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmCfA*mG*fA*mC*fG*mG OLX703A-103-89_antisense
(k1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*mG*mG OLX703A-103-91_antisense
(l1) EVP-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*mG*mG OLX703A-103-101_antisense
(m1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmCfA*mG*mA*mC*mG*Mg OLX703A-107-2_antisense
(n1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*fG*mG OLX703A-107-19_antisense
(o1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmCfA*mG*mA*mC*fG*mG OLX703A-107-27_antisense
(p1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*fA*mC*fG*mG OLX703A-107-29_antisense
(q1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*fG*mG OLX703A-107-35_antisense
(r1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*mG*mG OLX703A-107-39_antisense
(s1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmCfA*mG*mA*mC*fG*mG OLX703A-107-45_antisense
(t1) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmCfA*mG*fA*mC*fG*mG OLX703A-107-48_antisense
(u1) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*fG*mG OLX703A-107-53_antisense
(v1) EVP-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*fG*mG OLX703A-107-55_antisense
(a2) mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-103-16_sense
(b2) mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-103-24_sense
(c2) mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc OLX703A-103-30_sense
(d2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-103-47_sense
(e2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-103-49_sense
(f2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCmAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-103-67_sense
(g2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCmAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-103-71_sense
(h2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-103-82_sense
(i2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-103-85_sense
(j2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-103-89_sense
(k2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-103-91_sense
(l2) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-103-101_sense
(m2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-2_sense
(n2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-19_sense
(o2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCmAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-27_sense
(p2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCmAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-29_sense
(q2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCmAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-35_sense
(r2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-39_sense
(s2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-45_sense
(t2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-48_sense
(u2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-53_sense
(v2) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc OLX703A-107-55_sense
본 발명은 다른 관점에서, 상기 RNAi 제제를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환은 HBV 감염 및/또는 복제에 의해 야기되거나, 그와 관련된 질환 또는 장애를 지칭하는 것으로서, HBV 유전자 발현 및/또는 복제의 감소에 의해 이익을 얻을 질환, 장애 또는 병증을 포함할 수 있다. 상기 질환은 예를 들어, D형 간염 바이러스 감염, 델타 간염, 급성 B형 간염, 급성 전격 B형 간염, 만성 B형 간염, 간 섬유증, 간 경화, 간 부전, 또는 간암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 유효성분인 RNAi 제제 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다.
상기 약학 조성물의 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 RNAi 제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 개선 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 개선 또는 치료방법에 포함되는 구성은 앞서 설명한 발명에 포함되는 구성과 동일하므로, 위 설명은 개선 또는 치료방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: HBV를 표적으로 하는 RNAi 유도 이중가닥 핵산 분자의 스크리닝
(1) HBV 증식 억제능 평가에 따른 HBV asiRNA 도출
본 실시예에서는 스크리닝을 위한 HBV asymmetric siRNA (asiRNA)인 16mer (sense strand)-19mer (antisense strand)의 비대칭 asiRNA로 디자인하였다(도 1). 또한, 상기 HBV asiRNA는 B형 간염 바이러스 게놈 중 HBV S 또는 HBV X 영역의 ORF에 대한 전사체, 즉, 3.5 Kb pregenomic RNA, 3.5 Kb precore mRNA, 2.4 Kb preS1 mRNA, 및/또는 2.1 Kb pre S2/S mRNA, 0.7kb Hbx mRNA를 저해하도록 디자인하였다.
이후, Hela 세포에 HBV plasmid와 HBV asiRNA를 형질감염(transfection)시킨 뒤, 이에 따른 HBV 억제능을 확인하였다. 구체적으로, HBV asiRNA (1 nM) 및 HBV plasmid (25 ng/well)를 Hela 세포 내로 전달하기 위해 lipofectamine 2000 (ThermoFisher, Cat.11668019, 0.25 ul/well)를 사용하였고, 세포 내 전달을 실시한 시점으로부터 24시간 후, Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960)을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity를 측정하고 HBV plasmid 만을 전달한 군 (plasmid only)의 intensity와 비교하여 asiRNA의 HBV 증식 억제 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, HBV 증식을 유의적으로 억제할 수 있는 HBV asiRNA를 확인하였으며, 구체적인 서열 정보는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
No. Name Sequence (5' → 3') 서열번호
12 asiHBV-012 sense GAUGUGUCUGCGGCGU 1
antisense ACGCCGCAGACACAUCCAG 2
14 asiHBV-014 sense UGUGUCUGCGGCGUUU 3
antisense AAACGCCGCAGACACAUCC 4
18 asiHBV-018 sense GGUAUGUUGCCCGUUU 5
antisense AAACGGGCAACAUACCUUG 6
20 asiHBV-020 sense GCCCGUUUGUCCUCUA 7
antisense UAGAGGACAAACGGGCAAC 8
23 asiHBV-023 sense AGUUUACUAGUGCCAU 9
antisense AUGGCACUAGUAAACUGAG 10
27 asiHBV-027 sense ACUAGUGCCAUUUGUU 11
antisense AACAAAUGGCACUAGUAAA 12
32 asiHBV-032 sense UGUUCAGUGGUUCGUA 13
antisense UACGAACCACUGAACAAAU 14
33 asiHBV-033 sense AGUGGUUCGUAGGGCU 15
antisense AGCCCUACGAACCACUGAA 16
34 asiHBV-034 sense GUGGUUCGUAGGGCUU 17
antisense AAGCCCUACGAACCACUGA 18
35 asiHBV-035 sense UCAGUUAUAUGGAUGA 19
antisense UCAUCCAUAUAACUGAAAG 20
39 asiHBV-039 sense GCACCUCUCUUUACGA 21
antisense UCGUAAAGAGAGGUGCGCC 22
40 asiHBV-040 sense CACCUCUCUUUACGCA 23
antisense UGCGUAAAGAGAGGUGCGC 24
41 asiHBV-041 sense ACCUCUCUUUACGCGA 25
antisense UCGCGUAAAGAGAGGUGCG 26
43 asiHBV-043 sense CCGUCUGUGCCUUCUA 27
antisense UAGAAGGCACAGACGGGGA 28
44 asiHBV-044 sense CGUCUGUGCCUUCUCA 29
antisense UGAGAAGGCACAGACGGGG 30
45 asiHBV-045 sense GUCUGUGCCUUCUCAU 31
antisense AUGAGAAGGCACAGACGGG 32
46 asiHBV-046 sense GUGCCUUCUCAUCUGA 33
antisense UCAGAUGAGAAGGCACAGA 34
49 asiHBV-049 sense CCUUCUCAUCUGCCGA 35
antisense UCGGCAGAUGAGAAGGCAC 36
56 asiHBV-056 sense UGGUGGACUUCUCUCA 37
antisense UGAGAGAAGUCCACCACGA 38
58 asiHBV-058 sense GUCUGCGGCGUUUUAU 39
antisense AUAAAACGCCGCAGACACA 40
59 asiHBV-059 sense CUGCGGCGUUUUAUCA 41
antisense UGAUAAAACGCCGCAGACA 42
60 asiHBV-060 sense UGCGGCGUUUUAUCAU 43
antisense AUGAUAAAACGCCGCAGAC 44
61 asiHBV-061 sense CUGCUGCUAUGCCUCA 45
antisense UGAGGCAUAGCAGCAGGAU 46
62 asiHBV-062 sense UGCUGCUAUGCCUCAU 47
antisense AUGAGGCAUAGCAGCAGGA 48
63 asiHBV-063 sense CUAUGCCUCAUCUUCU 49
antisense AGAAGAUGAGGCAUAGCAG 50
68 asiHBV-068 sense UAGUGCCAUUUGUUCA 51
antisense UGAACAAAUGGCACUAGUA 52
69 asiHBV-069 sense UGGUUCGUAGGGCUUU 53
antisense AAAGCCCUACGAACCACUG 54
72 asiHBV-072 sense CCACGGGGCGCACCUA 55
antisense UAGGUGCGCCCCGUGGUCG 56
73 asiHBV-073 sense CACGGGGCGCACCUCU 57
antisense AGAGGUGCGCCCCGUGGUC 58
74 asiHBV-074 sense ACGGGGCGCACCUCUA 59
antisense UAGAGGUGCGCCCCGUGGU 60
75 asiHBV-075 sense CGGGGCGCACCUCUCU 61
antisense AGAGAGGUGCGCCCCGUGG 62
76 asiHBV-076 sense GGGGCGCACCUCUCUU 63
antisense AAGAGAGGUGCGCCCCGUG 64
80 asiHBV-080 sense UCUGUGCCUUCUCAUA 65
antisense UAUGAGAAGGCACAGACGG 66
82 asiHBV-082 sense UGUGCCUUCUCAUCUA 67
antisense UAGAUGAGAAGGCACAGAC 68
85 asiHBV-085 sense UGCCAACUGGAUCCUA 69
antisense UAGGAUCCAGUUGGCAGCA 70
86 asiHBV-086 sense UGCUGCCAACUGGAUA 71
antisense UAUCCAGUUGGCAGCACAG 72
(2) HBV asiRNA의 증식 억제능 평가
본 실시예에서는 상기에서 도출된 HBV asiRNA들 중 4종 (asiHBV-020, asiHBV-032, asiHBV-044, asiHBV-082)을 대상으로, 마우스 간 세포에서의 HBV 억제능을 평가하였다. 구체적으로, 마우스에 HBV plasmid (20 ug/mouse)를 유체 역학적 주입 (Hydrodynamic injection)을 통해 투여하고, 이로부터 6시간 후, 상기 마우스로부터 간세포를 분리하였다. 이후, 4종의 HBV asiRNA를 각각 1nM, 10nM씩 lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher, Cat.13778150, 0.1ul/100ul)을 이용하여 세포 내로 전달하였다. 세포 내 전달을 실시한 시점으로부터 24시간 후, Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960)을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity를 측정하고 lipofectamine RNAiMAX만을 처리한 군 (Mock)의 intensity와 비교하여 HBV asiRNA의 HBV 증식 억제 수준을 확인하였다. 한편, 대조군으로는 HBV plasmid 만을 전달한 군 (HDI only)을 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, HBV asiRNA(asiHBV-020, asiHBV-032, asiHBV-044, asiHBV-082)의 처리에 따른 HBV 증식 억제 효과를 확인하였다. 이러한 효과는 HBV plasmid 만을 전달한 군 (HDI only) 및 lipofectamine RNAiMAX만을 처리한 군 (Mock)에 비해 현저한 것이었으며, 농도 의존적인 경향성을 보여주었다.
실시예 2: 화학적 변형이 도입된 HBV asiRNA의 디자인 및 제작
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 증식 억제 효과를 확인한 HBV asiRNA들 중 2 (asiHBV-032, asiHBV-082)을 대상으로, 화학적 변형이 도입된 비대칭 siRNA (cell penetrating-asymmetric siRNA: cp-asiRNA)를 디자인하였다. 본 실시예에서 디자인된 cp-asiRNA는 상기 asiRNA에 비해, 다양한 화학적 변형(2'OMe, PS, Fluoro)이 된 것으로서, 간 세포 내부로의 전달이 향상된 비대칭 siRNA이다.
본 실시예에서 제작한 총 8종의 cp-asiRNA의 서열정보는 하기 표 5와 같다.
No. Name Sequence (5' → 3')
1 OLX703A-032-1 sense mU*fG*mUfUfCfAmGfUmGfGmUfUmCfGmUfA-GalNAc
antisense P-mU*fA*mCfGmAfAmCfCmAfCmUmGmAfAmC*fA*mA*fA*mU
2 OLX703A-032-2 sense mU*fG*mUfUfCfAmGfUmGfGmUfUmCfGmUfA-GalNAc
antisense P-mU*fA*mCmGmAfAmCfCfAmCmUmGmAfAmC*fA*mA*mA*mU
3 OLX703A-032-3 sense mU*fG*mUfUfCfAmGmUmGmGmUmUmCmGmUmA-GalNAc
antisense P-mU*fA*mCfGmAfAmCfCmAfCmUmGmAfAmC*fA*mA*fA*mU
4 OLX703A-032-4 sense mU*fG*mUfUfCfAmGmUmGmGmUmUmCmGmUmA-GalNAc
antisense P-mU*fA*mCmGmAfAmCfCfAmCmUmGmAfAmC*fA*mA*mA*mU
5 OLX703A-082-1 sense mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc
antisense P-mU*fA*mGfAmUfGmAfGmAfAmGmGmCfAmC*fA*mG*fA*mC
6 OLX703A-082-2 sense mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc
antisense P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC
7 OLX703A-082-3 sense mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCmAmUmCmUmA-GalNAc
antisense P-mU*fA*mGfAmUfGmAfGmAfAmGmGmCfAmC*fA*mG*fA*mC
8 OLX703A-082-4 sense mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCmAmUmCmUmA-GalNAc
antisense P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC
* 상기 GalNAc는 trivalent GalNAc 유도체임.
한편, 상기 표 5에서, 센스 가닥 3' 말단과 결합된 "trivalent GalNAc"로 표기된 유도체의 구조는 하기 화학식 1에 나타낸 바와 같다.
Figure pat00001
또한, 상기 표 5에 "*", "m", "f", "P", "EVP"로 표기된 화학적 변형은 하기 표 6에 나타낸 바와 같다.
표기법 화학적 변형
* 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate bond)
m 2'-O-메틸(Methyl)
f 2'-플루오로(Fluoro)
P 5'-인산기(Phosphate group)
EVP 5' E-비닐포스포네이트 (E-Vinylphosphonate)
구체적으로, 상기 표 6에서, "*"은 기존의 포스포다이에스터 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 형태를 의미하는 것이며, "m"은 기존의 2'-OH가 2'-O-메틸로 치환된 형태를 의미하는 것이다. 또한, "f"는 예를 들어, fG의 경우, 기존의 G(구아닌)의 2'-OH가 플루오르로 치환된 형태를 의미하는 것이고, "P"는 5'-말단에 인산기가 결합된 형태를 의미하는 것이며, "EVP"는 5'-말단에 (E) 비닐포스포네이트가 결합된 형태를 의미하는 것이다. 예를 들어, EVP-mU의 경우 기존의 U(구아닌)의 2'-OH가 2'-O-메틸로 치환된 형태에서 5'-말단에 (E) 비닐포스포네이트가 결합된 형태를 의미하는 것이다.
실시예 3: 화학적 변형이 도입된 HBV asiRNA의 증식 억제능 평가
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 화학적 변형이 도입된 HBV cp-asiRNA 8종을 대상으로, 마우스 간 세포에서의 HBV 억제능을 평가하였다. 구체적으로, 마우스에 HBV plasmid (20 ug/mouse)를 유체 역학적 주입을 통해 투여하고, 이로부터 6시간 후 상기 마우스로부터 간세포를 분리하였다. 이후, 8종의 HBV cp-asiRNA를 각각 1nM, 20nM, 또는 200nM씩 lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher, Cat.13778150, 0.1ul/100 ul)을 이용하여 세포 내로 전달하였다. 세포 내 전달을 실시한 시점으로부터 24시간 후, Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960)을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity를 측정하고 HBV plasmid 만을 전달한 군 (HDI only)의 intensity와 비교하여 HBV cp-asiRNA의 HBV 증식 억제 수준을 확인하였다. 한편, 1nM 트랜스펙션 그룹에 대한 음성 대조군으로는 lipofectamine RNAiMAX만을 처리한 군 (Mock)을 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, HBV cp-asiRNA 8종의 처리에 따른 HBV 증식 억제 효과를 확인하였다.
다음으로, 상기에서 화학적 변형이 도입된 HBV cp-asiRNA들 중 2종 (OLX703A-032-1, OLX703A-082-1)을 대상으로, 마우스 모델을 이용하여 HBV 억제능을 평가하였다. 구체적으로, 도 5에 도시한 바와 같이, 마우스에 HBV Plasmid (10 ug/mouse)를 유체 역학적 주입을 통해 투여하여 HBV Plasmid HDI 마우스 모델을 구축하였다. 이와 동시에, HBV cp-asiRNA 2종을 각각 3 mg/kg, 또는 9 mg/kg씩 상기 마우스 모델에 피하 주사하였다. 상기 피하 주사를 실시한 시점으로부터 48시간 후, Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960)을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity를 측정하고, HBV plasmid 만을 전달한 군 (Mock control)과 비교하여 HBV cp-asiRNA의 HBV 증식 억제 수준을 확인하였다. 각 그룹 당 3마리의 마우스를 사용하였고, 각 마우스 당 간 조직 내 2 영역을 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, HBV cp-asiRNA 2종의 처리에 따른 HBV 증식 억제 효과를 in vivo 상에서 확인하였다. 상기 실험 결과는 일 실시예에 따른 HBV asiRNA/HBV cp-asiRNA는 B형 간염 바이러스 감염과 연관된 질병의 치료를 위하여 활용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 4: 화학적 변형이 도입된 HBV asiRNA의 추가 디자인 및 제작
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 증식 억제 효과를 확인한 HBV asiRNA들 중 6종 (asiHBV-020, asiHBV-032, asiHBV-044, asiHBV-046, asiHBV-080, asiHBV-082)을 대상으로, 화학적 변형이 도입된 비대칭 siRNA (cell penetrating-asymmetric siRNA: cp-asiRNA)를 추가로 디자인하였다. 본 실시예에서 디자인된 cp-asiRNA는 상기 asiRNA에 비해, 다양한 화학적 변형이 된 것으로서, 간 세포 내부로의 전달이 향상된 비대칭 siRNA이다.
또한, 본 발명의 HBV asiRNA 및 cp-asiRNA의 효과를 확인하기 위한 하기의 실시예에서는 음성대조군(negative control, NC)으로서 Factor 9 유전자를 표적으로 하는 cp-asiRNA (OLX700A-001-8)을 이용하였다.
본 실시예에서 제작한 총 19종의 cp-asiRNA의 서열정보는 하기 표 7에 기재하였으며, 상기 NC의 서열정보는 표 8에 기재하였다. (* 상기 GalNAc는 trivalent GalNAc 유도체임).
Figure pat00002
Name Sequence (5' → 3')
OLX700A-001-8 (NC) sense mG*fC*mAfGfUfAmUfGmUfUmGfAmUfGmGfA-GalNAc
antisense P-mU*fC*mCfAmUfCmAfAmCfAmUmAmCfUmG*fC*mU*fU*mC
한편, 상기 표 7 및 표 8에서, 센스 가닥 3' 말단과 결합된 GalNAc의 구조는 상기 화학식 1에 나타낸 바와 같다. 또한, 상기 표 7 및 표 8에 "*", "m", "f", "P" 및 "EVP"로 표기된 화학적 변형은 상기 표 6에 나타낸 바와 같다.
실시예 5: 화학적 변형이 도입된 HBV asiRNA의 증식 억제능 평가
(1) In vivo 수준의 HBV 증식 억제능 평가
본 실시예에서는 상기 실시예 2 및 4에서 화학적 변형이 도입된 HBV cp-asiRNA들을 대상으로, Efficacy assay 및 Duration assay를 이용하여 HBV 억제능을 평가하였다 (도 7).
먼저, Efficacy assay를 위해, BALB/c 마우스의 꼬리 정맥으로 HBV plasmid (20 ug/mouse)를 유체역학적 주입을 통해 투여하였다. 각 GalNAc-asiRNA를 3 mg/kg 의 농도로 견갑골 사이에 피하 주사하였다. 3일 후 마우스의 간 조직 두 영역(left lobe, caudate lobe)을 얻어 1X 단백질 용해 완충액(protein lysis buffer) 1 ml에 넣고 조직분쇄기(homogenizer)로 파쇄하였다. 13,000 rpm, 4℃, 15분 원심분리하여 상층액만 새로운 튜브에 옮겨 담아 준비하였다. Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960)을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity 를 측정하였다. HBV plasmid 만을 전달한 군(대조군)의 intensity와 비교하여 GalNAc-asiRNA 의 HBV 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, HBV cp-asiRNA 18종의 처리에 따른 HBV 증식 억제 효과를 확인하였다.
다음으로, Duration assay를 위해, 각 GalNAc-asiRNA를 3 mg/kg 의 농도로 견갑골 사이에 피하 주사하였으며, 14일 후 꼬리 정맥으로 HBV plasmid (20 ug/mouse)를 유체역학적 주입을 통해 투여하였다. 3일 후 마우스의 간 조직 두 영역(left lobe, caudate lobe) 을 얻어 1X 단백질 용해 완충액(protein lysis buffer) 1 ml에 넣고 조직분쇄기(homogenizer)로 파쇄하였다. 13,000 rpm, 4℃, 15분 원심분리하여 상층액만 새로운 튜브에 옮겨 담아 준비하였다. Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960)을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity 를 측정하였다. HBV plasmid 만을 전달한 군(대조군)의 intensity와 비교하여 GalNAc-asiRNA 의 HBV 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, HBV cp-asiRNA 6종의 처리에 따른 HBV 증식 억제 효과를 확인하였으며, 상기 HBV cp-asiRNA는 생체 내에서 장시간동안 안정적으로 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
(2) In vitro 수준의 HBV 증식 억제능 평가
본 실시예에서는 상기 실시예 2 및 4에서 화학적 변형이 도입된 HBV cp-asiRNA들 중 6종을 대상으로, 세포 수준(In vitro)에서 HBV 억제능을 평가하였다.
구체적으로, HBV를 발현하는 HepG2.2.15 세포주를 이용하여 실험을 수행하였으며 (도 10), 3종의 asiRNA(asiHBV-020, asiHBV-046, asiHBV-082) 및 이들의 GalNAc-asiRNA를 이용하였다. 상기 siRNA들을 lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher, Cat.13778150, 4 ml/well)을 이용하여 10 nM 농도로 세포 내 전달하였다. 3일간 배양한 후 ELISA를 이용하여 상층액에서 HBsAg, HBeAg의 수준을 확인하였고, 세포에서는 qPCR을 이용하여 HBV DNA의 발현수준을 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, P/S 와 P/S/X를 타겟팅하는 상기 HBV asiRNA 및 이들의 GalNAc-asiRNA 모두 HBV를 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
(3) AAV-HBV 마우스 모델을 이용한 HBV 증식 억제능 평가
본 실시예에서는 상기 실시예 4에서 화학적 변형이 도입된 HBV cp-asiRNA들 중 3종을 대상으로, AAV-HBV 마우스 모델에서 Efficacy assay를 이용하여 HBV 억제능을 평가하였다 (도 12).
구체적으로, AAV-HBV 마우스 모델에서의 efficacy assay는 WuXi AppTec Co., Ltd.에서 수행되었다. 물질 투여 30일 전 C57B/L6 마우스에 AAV-HBV 1.0X1011 viral titer를 정맥 주입(i.v injection)하여 AAV-HBV 마우스 모델을 셋업 하였다. 물질 투여일(Day 0)에 GalNAc-asiRNA 9 mg/kg를 상기 마우스모델에 피하 주사로 투여하였다. 총 28일 동안 2회/주 혈액을 채취하여 혈중 HBsAg, HBeAg의 수준은 ELISA로, HBV DNA의 발현수준은 qPCR로 측정하였다. 물질 투여 30일 후 마우스 간 조직을 얻어 IHC로 HBsAg을 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 처리한 3종의 HBV cp-asiRNA는 장시간동안 효과적으로 HBV 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다. 또한, 마우스 간 조직을 얻어 IHC을 수행한 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 HBsAg가 Saline 그룹에서 세포질이나 세포막에 발현되어 있으나 HBV cp-asiRNA를 투여한 조직에서는 발현이 현저히 감소됨을 확인하였다.
실시예 6: HBV를 표적으로 하는 RNAi 유도 이중가닥 핵산 분자의 개량
본 실시예에서는 상기 실시예 5에서 우수한 HBV 증식 억제능을 나타낸 asiHBV-082의 sense 또는 antisense 서열의 길이를 변형시킨 HBV asiRNA를 제작하였으며, 구체적인 서열 정보는 하기 표 9에 나타낸 바와 같다.
No. Name Sequence (5' → 3') 서열번호
82 asiHBV-082 sense UGUGCCUUCUCAUCUA 67
antisense UAGAUGAGAAGGCACAGAC 68
103 asiHBV-103 sense UGUGCCUUCUCAUCUA 73
antisense UAGAUGAGAAGGCACAGACGG 74
107 asiHBV-107 sense CUGUGCCUUCUCAUCUA 75
antisense UAGAUGAGAAGGCACAGACGG 76
다음으로, 상기 HBV asiRNA들을 대상으로, 화학적 변형이 도입된 비대칭 siRNA (cell penetrating-asymmetric siRNA: cp-asiRNA)를 디자인하였다. 본 실시예에서 디자인된 cp-asiRNA는 상기 asiRNA에 비해, 다양한 화학적 변형이 된 것으로서, 간 세포 내부로의 전달이 향상된 비대칭 siRNA이다.
본 실시예에서 제작한 총 22종의 cp-asiRNA의 서열정보는 하기 표 10과 같다 (* 상기 GalNAc는 trivalent GalNAc 유도체임).
Figure pat00003
한편, 상기 표 10에서, 센스 가닥 3' 말단과 결합된 GalNAc의 구조는 상기 화학식 1에 나타낸 바와 같다. 또한, 상기 표 9에 "*", "m", "f", "P" 및 "EVP"로 표기된 화학적 변형은 상기 표 6에 나타낸 바와 같다.
실시예 7: 화학적 변형이 도입된 HBV asiRNA의 증식 억제능 평가
(1) In vitro 수준의 HBV 증식 억제능 평가
본 실시예에서는 상기 실시예 6에서 화학적 변형이 도입된 HBV cp-asiRNA들 중 20종을 대상으로, 세포 수준(In vitro)에서 HBV 억제능을 평가하였다.
구체적으로, C57B/L6 마우스에서 간세포(hepatocyte)를 분리하여 1X104 cell/well로 시딩한 후, 16/21 (asiHBV-103) 및 17/21 (asiHBV-107) 형태의 GalNAc-asiRNA를 두가지 농도(200 nM, 20 nM)로 처리하였다. 24시간 후, HBV plasmid 50 ng 을 lipofectamine 2000 (ThermoFisher, Cat.11668019, 0.2 ul/well) 이용하여 세포 내 전달하였다. 24시간 후 유지 배지(maintenance media)로 교체하고 다시 24시간 배양 후, Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960) 을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity를 측정하였다. NC를 처리한대조군의 intensity와 비교하여 GalNAc-asiRNA 의 HBV 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, HBV cp-asiRNA 20종의 처리에 따른 HBV 증식 억제 효과를 확인하였다.
(2) In vivo 수준의 HBV 증식 억제능 평가
본 실시예에서는 상기 실시예 6에서 화학적 변형이 도입된 HBV cp-asiRNA들 중 6종 또는 3종을 대상으로, Efficacy assay 및 Duration assay를 이용하여 HBV 억제능을 평가하였다 (도 16).
먼저, Efficacy assay를 위해, BALB/c 마우스의 꼬리 정맥으로 HBV plasmid (10 ug/mouse)를 유체역학적 주입을 통해 투여하였다. 각 GalNAc-asiRNA를 0.5 mg/kg 의 농도로 견갑골 사이에 피하 주사하였다. 3일 후 마우스의 간 조직 두 영역(left lobe, caudate lobe)을 얻어 1X 단백질 용해 완충액(protein lysis buffer) 0.5 ml에 넣고 조직분쇄기(homogenizer)로 파쇄하였다. 13,000 rpm, 4℃, 15분 원심분리하여 상층액만 새로운 튜브에 옮겨 담아 준비하였다. Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960)을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity 를 측정하였다. HBV plasmid 만을 전달한 군(대조군)의 intensity와 비교하여 GalNAc-asiRNA 의 HBV 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 7종의 HBV cp-asiRNA는 HBV 증식 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
다음으로, Duration assay를 위해, 각 GalNAc-asiRNA를 1 mg/kg 의 농도로 견갑골 사이에 피하 주사하였으며, 14일 후 꼬리 정맥으로 HBV plasmid (10 ug/mouse)를 유체역학적 주입을 통해 투여하였다. 3일 후 마우스의 간 조직 두 영역(left lobe, caudate lobe) 을 얻어 1X 단백질 용해 완충액(protein lysis buffer) 0.5 ml에 넣고 조직분쇄기(homogenizer)로 파쇄하였다. 13,000 rpm, 4℃, 15분 원심분리하여 상층액만 새로운 튜브에 옮겨 담아 준비하였다. Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960)을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity 를 측정하였다. HBV plasmid 만을 전달한 군(대조군)의 intensity와 비교하여 GalNAc-asiRNA 의 HBV 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 4종의 HBV cp-asiRNA는 생체 내에서 장시간동안 우수한 HBV 증식 억제 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
(3) IC50 평가
본 실시예에서는 3종의 HBV asiRNA(OLX703A-83, OLX703A-103 및 OLX703A-107)의 IC50을 비교 평가하였다.
구체적으로, Hela 세포주 8X103/well을 96-웰 플레이트에 시딩하고, 다음날 lipofectamine 2000 (0.2 ul/100 ml)을 이용하여 HBV plasmid 25 ng과 각 물질을 0.001nM~3nM 농도로 공동-형질전환(co-transfection)하였다. 24시간 배양 후, 새로운 배지로 교체하고 다시 24시간 배양하였다. Renilla 및 Firefly luciferase intensity는 Dual luciferase report assay system(Promega, Cat.E1960)을 이용하여 측정하였고, HBV plasmid 만을 전달한 군(대조군)의 intensity와 비교하여 확인하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 3종의 HBV cp-asiRNA는 현저히 낮은 IC50을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 8: E-VP 변형이 도입된 HBV asiRNA의 증식 억제능 평가
본 실시예에서는 화학적 변형이 도입된 HBV cp-asiRNA의 antisense 서열의 5'에 E-VP(E-Vinylphosphonate)를 추가 도입한 변형체의 HBV 억제능을 평가하였다.
구체적으로, OLX703A-082-12, OLX703A-103-91 및 OLX703A-107-19의 antisense 서열의 5'에 E-VP 변형을 도입하였으며, 각각 OLX703A-082-17, OLX703A-103-101 및 OLX703A-107-55로 명명하였다. 다음으로, BALB/c 마우스의 꼬리 정맥으로 HBV plasmid (20 ug/mouse)를 유체역학적 주입을 통해 투여하였다. 각 GalNAc-asiRNA를 농도 별로(3 mg/kg, 9 mg/kg) 의 농도로 견갑골 사이에 피하 주사하였다. 3일 후 마우스의 간 조직 두 영역(left lobe, caudate lobe)을 얻어 1X 단백질 용해 완충액(protein lysis buffer) 0.5 ml에 넣고 조직분쇄기(homogenizer)로 파쇄하였다. Dual luciferase reporter assay system (Promega, Cat.E1960)을 이용하여 Renilla와 Firefly luciferase intensity 를 측정하였다. NC의 intensity와 비교하여 GalNAc-asiRNA 의 HBV 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, EVP가 도입된 3종의 HBV cp-asiRNA는 HBV 증식 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> OliX Pharmaceuticals, Inc. <120> RNA interference agent for inhibiting Hepatitis B virus expression and use thereof <130> PN142714KR <150> KR 10-2020-0178838 <151> 2020-12-18 <160> 76 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-012 sense <400> 1 gaugugucug cggcgu 16 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-012 antisense <400> 2 acgccgcaga cacauccag 19 <210> 3 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-014 sense <400> 3 ugugucugcg gcguuu 16 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-014 antisense <400> 4 aaacgccgca gacacaucc 19 <210> 5 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-018 sense <400> 5 gguauguugc ccguuu 16 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-018 antisense <400> 6 aaacgggcaa cauaccuug 19 <210> 7 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-020 sense <400> 7 gcccguuugu ccucua 16 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-020 antisense <400> 8 uagaggacaa acgggcaac 19 <210> 9 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-023 sense <400> 9 aguuuacuag ugccau 16 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-023 antisense <400> 10 auggcacuag uaaacugag 19 <210> 11 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-027 sense <400> 11 acuagugcca uuuguu 16 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-027 antisense <400> 12 aacaaauggc acuaguaaa 19 <210> 13 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-032 sense <400> 13 uguucagugg uucgua 16 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-032 antisense <400> 14 uacgaaccac ugaacaaau 19 <210> 15 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-033 sense <400> 15 agugguucgu agggcu 16 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-033 antisense <400> 16 agcccuacga accacugaa 19 <210> 17 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-034 sense <400> 17 gugguucgua gggcuu 16 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-034 antisense <400> 18 aagcccuacg aaccacuga 19 <210> 19 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-035 sense <400> 19 ucaguuauau ggauga 16 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-035 antisense <400> 20 ucauccauau aacugaaag 19 <210> 21 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-039 sense <400> 21 gcaccucucu uuacga 16 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-039 antisense <400> 22 ucguaaagag aggugcgcc 19 <210> 23 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-040 sense <400> 23 caccucucuu uacgca 16 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-040 antisense <400> 24 ugcguaaaga gaggugcgc 19 <210> 25 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-041 sense <400> 25 accucucuuu acgcga 16 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-041 antisense <400> 26 ucgcguaaag agaggugcg 19 <210> 27 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-043 sense <400> 27 ccgucugugc cuucua 16 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-043 antisense <400> 28 uagaaggcac agacgggga 19 <210> 29 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-044 sense <400> 29 cgucugugcc uucuca 16 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-044 antisense <400> 30 ugagaaggca cagacgggg 19 <210> 31 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-045 sense <400> 31 gucugugccu ucucau 16 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-045 antisense <400> 32 augagaaggc acagacggg 19 <210> 33 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-046 sense <400> 33 gugccuucuc aucuga 16 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-046 antisense <400> 34 ucagaugaga aggcacaga 19 <210> 35 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-049 sense <400> 35 ccuucucauc ugccga 16 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-049 antisense <400> 36 ucggcagaug agaaggcac 19 <210> 37 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-056 sense <400> 37 ugguggacuu cucuca 16 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-056 antisense <400> 38 ugagagaagu ccaccacga 19 <210> 39 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-058 sense <400> 39 gucugcggcg uuuuau 16 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-058 antisense <400> 40 auaaaacgcc gcagacaca 19 <210> 41 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-059 sense <400> 41 cugcggcguu uuauca 16 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-059 antisense <400> 42 ugauaaaacg ccgcagaca 19 <210> 43 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-060 sense <400> 43 ugcggcguuu uaucau 16 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-060 antisense <400> 44 augauaaaac gccgcagac 19 <210> 45 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-061 sense <400> 45 cugcugcuau gccuca 16 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-061 antisense <400> 46 ugaggcauag cagcaggau 19 <210> 47 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-062 sense <400> 47 ugcugcuaug ccucau 16 <210> 48 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-062 antisense <400> 48 augaggcaua gcagcagga 19 <210> 49 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-063 sense <400> 49 cuaugccuca ucuucu 16 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-063 antisense <400> 50 agaagaugag gcauagcag 19 <210> 51 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-068 sense <400> 51 uagugccauu uguuca 16 <210> 52 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-068 antisense <400> 52 ugaacaaaug gcacuagua 19 <210> 53 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-069 sense <400> 53 ugguucguag ggcuuu 16 <210> 54 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-069 antisense <400> 54 aaagcccuac gaaccacug 19 <210> 55 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-072 sense <400> 55 ccacggggcg caccua 16 <210> 56 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-072 antisense <400> 56 uaggugcgcc ccguggucg 19 <210> 57 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-073 sense <400> 57 cacggggcgc accucu 16 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-073 antisense <400> 58 agaggugcgc cccgugguc 19 <210> 59 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-074 sense <400> 59 acggggcgca ccucua 16 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-074 antisense <400> 60 uagaggugcg ccccguggu 19 <210> 61 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-075 sense <400> 61 cggggcgcac cucucu 16 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-075 antisense <400> 62 agagaggugc gccccgugg 19 <210> 63 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-076 sense <400> 63 ggggcgcacc ucucuu 16 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-076 antisense <400> 64 aagagaggug cgccccgug 19 <210> 65 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-080 sense <400> 65 ucugugccuu cucaua 16 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-080 antisense <400> 66 uaugagaagg cacagacgg 19 <210> 67 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-082 sense <400> 67 ugugccuucu caucua 16 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-082 antisense <400> 68 uagaugagaa ggcacagac 19 <210> 69 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-085 sense <400> 69 ugccaacugg auccua 16 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-085 antisense <400> 70 uaggauccag uuggcagca 19 <210> 71 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-086 sense <400> 71 ugcugccaac uggaua 16 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-086 antisense <400> 72 uauccaguug gcagcacag 19 <210> 73 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-103 sense <400> 73 ugugccuucu caucua 16 <210> 74 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-103 antisense <400> 74 uagaugagaa ggcacagacg g 21 <210> 75 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-107 sense <400> 75 cugugccuuc ucaucua 17 <210> 76 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiHBV-107 antisense <400> 76 uagaugagaa ggcacagacg g 21

Claims (11)

  1. B형 간염 바이러스 (Hepatitis　B　virus, HBV)의 발현을 억제하는, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 제제로서,
    상기 안티센스 가닥은 19 내지 23nt의 길이를 가지며;
    상기 센스 가닥은 15 내지 17nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하고, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하고, 다가의 갈락토스 또는 N-아세틸-갈락토사민 유도체를 포함하며; 및
    상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것인 RNAi 제제.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 RNAi 제제.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 센스 가닥은 3가의 N-아세틸-갈락토사민 유도체를 포함하는 RNAi 제제.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하기로부터 선택된 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것인 RNAi 제제:
    뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(플루오로), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, 또는 -O-3-디메틸아미노프로필로 치환;
    뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 산소가 황으로 치환;
    뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형;
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및
    인산기(phosphate group), E-비닐포스포네이트(E-Vinylphosphonate) 또는 세포 침투 펩타이드와의 결합.
  5. B형 간염 바이러스 (Hepatitis　B　virus, HBV)의 발현을 억제하는, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 제제로서,
    상기 안티센스 가닥은 19 내지 23nt의 길이를 가지며;
    상기 센스 가닥은 15 내지 17nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하고, 서열번호 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 및 75로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하고, 다가의 갈락토스 또는 N-아세틸-갈락토사민 유도체를 포함하며; 및
    상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것인 RNAi 제제.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 및 76으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 RNAi 제제.
  7. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서, 상기 센스 가닥은 3가의 N-아세틸-갈락토사민 유도체를 포함하는 RNAi 제제.
  8. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서, 상기 RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하기로부터 선택된 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것인 RNAi 제제:
    뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(플루오로), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, 또는 -O-3-디메틸아미노프로필로 치환;
    뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 산소가 황으로 치환;
    뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형;
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및
    인산기(phosphate group), E-비닐포스포네이트(E-Vinylphosphonate) 또는 세포 침투 펩타이드와의 결합.
  9. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 B형 간염 바이러스를 억제하기 위한 RNAi 제제로서, 하기 (a) 내지 (m)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 안티센스 가닥을 포함하며,
    (a) P-mU*fA*mCfGmAfAmCfCmAfCmUmGmAfAmC*fA*mA*fA*mU;
    (b) P-mU*fA*mCmGmAfAmCfCfAmCmUmGmAfAmC*fA*mA*mA*mU;
    (c) P-mU*fA*mGfAmUfGmAfGmAfAmGmGmCfAmC*fA*mG*fA*mC;
    (d) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC;
    (e) P-mU*fA*mGfAmGfGmAfCmAfAmAmCmGfGmG*fC*mA*fA*mC;
    (f) P-mU*fC*mAfGmAfUmGfAmGfAmAmGmGfCmA*fC*mA*fG*mA;
    (g) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC;
    (h) P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC;
    (i) EVP-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC;
    (j) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*mG*mG;
    (k) EVP-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*mG*mG;
    (l) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*fG*mG; 및
    (m) EVP-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*fG*mG;
    상기에서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-OCH3로의 치환, f는 2'-F의 치환, P는 5'-인산기의 결합, EVP는 5'-E-비닐포스포네이트(E-Vinylphosphonate)의 결합을 의미하는 것인 RNAi 제제.
  10. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 B형 간염 바이러스를 억제하기 위한 RNAi 제제로서, 하기 (A) 내지 (M)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 센스 가닥을 포함하며,
    (A) mU*fG*mUfUfCfAmGfUmGfGmUfUmCfGmUfA-GalNAc;
    (B) mU*fG*mUfUfCfAmGmUmGmGmUmUmCmGmUmA-GalNAc;
    (C) mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc;
    (D) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCmAmUmCmUmA-GalNAc;
    (E) mG*fC*mCfCfGfUmUfUmGfUmCfCmUfCmUfA-GalNAc;
    (F) mG*fU*mGfCfCfUmUmCmUmCmAmUmCmUmGmA-GalNAc;
    (G) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc;
    (H) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCmAmUfCmUfA-GalNAc;
    (I) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc;
    (J) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc;
    (K) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc;
    (L) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc; 및
    (M) mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc;
    상기에서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-OCH3로의 치환, f는 2'-F의 치환, GalNAc은 3'-말단에 결합된 3가의 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc) 유도체를 의미하는 것인 RNAi 제제.
  11. 청구항 1, 청구항 2, 청구항 5, 청구항 6, 청구항 9, 및 청구항 10 중 어느 한 항에 따른 RNAi 제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 질환의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
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