KR20220087454A - 힌지 도메인을 갖는 노치 수용체 - Google Patents

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콜 티. 로이발
레이먼드 리우
아이오위스 주
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 개시는 일반적으로, 특히, 리간드-의존적 방식으로 전사 조절을 조절하도록 조작된 신규한 부류의 수용체에 관한 것이다. 특히, 신규한 수용체는 노치로부터 유래되었음에도 불구하고, 이전에 수용체의 기능에 필수적이라고 여겨지는 노치 네가티브 조절 영역을 요구하지 않는다. 추가로, 본원에 기재된 신규한 수용체는 세포외 올리고머화 도메인을 포함하여 키메라 수용체의 올리고머 형성을 촉진한다. 본 개시는 또한, 그러한 수용체들을 생성하는 데 유용한 조성물 및 방법, 이를 인코딩하는 핵산, 핵산으로 유전적으로 변형된 숙주 세포뿐만 아니라, 세포의 활성을 조절하기 위한 및/또는 다양한 건강 상태, 예컨대, 암의 치료를 위한 방법을 제공한다.

Description

힌지 도메인을 갖는 노치 수용체
연방 정부 지원 R&D에 관한 진술
[0001] 본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 OD025751 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 상호 참조
[0002] 본 출원은 둘 모두 2019년 9월 24일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/905,251호 및 제62/905,263호의 우선권을 주장하며, 임의의 도면을 포함하여 상기 출원들의 개시 내용은 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함된다.
서열 목록 포함
[0003] 본 출원은 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함되는 서열 목록을 포함한다. "048536_654001WO_Sequence_Listing_ST25.txt,"라는 명칭의 첨부된 서열 목록 텍스트 파일은 2020년 9월 23일에 생성되었고, 144 KB이다.
분야
[0004] 본 개시는 일반적으로, 세포-표면 리간드에 결합하고 선택 가능한 특이성 및 활성을 갖는 신규한 합성 세포 수용체에 관한 것이다. 본 개시는 또한 그러한 수용체들을 생성하는 데 유용한 조성물 및 방법, 이를 인코딩하는 핵산, 핵산으로 유전적으로 변형된 숙주 세포뿐만 아니라, 세포의 활성을 조절하기 위한 및/또는 다양한 건강 상태 또는 질환, 예컨대, 암의 치료를 위한 방법을 제공한다.
[0005] 인간에서의 조작된 세포 요법들의 개발을 제한하는 중요한 문제는, 예를 들어, 표적-외 활성, 표적-내, 종양-외 활성(즉, 여기서 CAR-T 표적은 또한 종양 외부에서 정상 세포에서 확인됨)과 같은 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T)의 투여에 중대한 부작용을 일으키는 상호 작용을 감소시키거나 없애는 치료적 유전자 발현의 조절, 및 필요 시 CAR-T 활성을 조절하거나 끄지 못한다는 것이다. 이들 문제들에 대한 가능한 해결책은 유전자 발현 및/또는 세포 거동을 변형시킬 수 있는 합성 수용체를 사용하는 것이다.
[0006] 노치(Notch) 수용체는 세포-세포 접촉 신호전달을 매개하고, 세포-대-세포 소통, 예를 들어, 2 개의 접촉 세포들(여기서, 접촉하는 하나의 세포는 "수신기(receiver)" 세포이고 접촉하는 다른 세포는 "송신기(sender)" 세포임) 사이의 소통에서 발달 및 다른 양상에 중심적인 역할을하는 막관통 단백질이다. 수신기 세포에서 발현된 노치 수용체는 송신 세포에서 발현되는 이들의 리간드(예를 들어, 델타/세레이트/래그, 또는 "DSL" 패밀리의 단백질)을 인식한다. 이들 접촉하는 세포 상의 노치 및 델타의 맞물림은 노치 수용체의 2-단계 단백질분해를 초래하며, 이는 궁극적으로 막으로부터 세포질 내로의 수용체의 세포내 부분의 방출을 야기한다. 노치는 일반적으로, 3 개의 LIN-12-노치 반복부(LNR) 모듈 및 노치 세포외 서브유닛(NEC)의 이종이량체화 도메인(HD)으로 이루어진진 도메인인, 노치 네가티브 조절 영역(NRR)에 의해 절단으로부터 보호되는 메탈로프로테아제 절단 부위("S2"로 표시됨)를 갖는다. 이러한 단백질분해는, 송신 세포에 의해 가해지는 힘에 의해 조절되는 것으로 여겨진다: DSL 리간드는 노치 수용체를 끌어 당기고, 네가티브 조절 영역의 입체구조를 변화시켜, 메탈로프로테아제 부위를 노출시킨다. 이후, 그러한 부위는 구성적으로 활성인 프로테아제에 의해 절단되어, 수용체의 세포외 결합 부분 및 네가티브 조절 영역(NRR)을 방출한다. 결국, 수용체의 세포외 결합 부분의 방출은 또 다른 막내 절단 부위(들)("S3"로 표시됨)를 노출시키며, 이는/이들은 세포 막 내에서 감마 세크레타제에 의해 절단되어, 세포 막으로부터 핵 귀환 세포내 도메인을 방출한다(W.R. Gordon et al., Dev Cell (2015) 33:729-36). 이러한 방출된 도메인은 전사 조절기로서 기능함으로써 수신기 세포 거동을 변경한다. 노치 수용체는 발달 동안 다양한 세포 기능들에 관여하고 이를 위해 요구되며, 종에 걸친 방대한 수의 세포-타입들의 기능에 중요하다.
[0007] 흔히 "SynNotch 수용체"로 지칭되는 노치 수용체의 기존의 1 세대 합성 유도체의 예는, 야생형 노치에서 다수의 EGF-유사 반복부를 함유하는 세포외 리간드-결합 도메인을 항체 유도체로 대체하고, 노치 NRR의 기능에 여전히 의존하면서 세포질 도메인을 선택된 전사 활성자로 대체함으로써 이러한 간단한 신호전달 거동을 이용한다(L. Morsut et al., Cell (2016) 164:780-91). 일반적으로, SynNotch 신호전달은 리간드 결합과 상관 관계가 있지만, 수용체의 감도 및 응답을 조절하는 것은 어렵다. 추가적으로, NRR은 대략 160 개의 아미노산 범위라서, 이러한 단독의 도메인을 일부 성숙한 단백질, 예컨대, 인슐린 또는 표피 성장 인자(EGF)의 크기로 만든다. 이는 키메라 수용체의 발현을 덜 효율적으로 만들고, 벡터 용량-관련 크기 제약으로 인해, 생성된 키메라 수용체는 일부 클로닝 및 트랜스펙션 벡터의 능력을 넘어설 수 있다.
개요
[0008] 본 개시는 일반적으로, 세포 활성을 조절하는 데 또는 다양한 건강 상태 또는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 키메라 폴리펩티드와 같은 면역-치료제에 관한 것이다. 특히, 놀랍게도, 네가티브 조절 영역(NRR)을 포함하는 노치 세포외 서브유닛(NEC)의 완전한 부재에도 불구하고 리간드 결합에 대한 응답으로 신호를 전달하는 능력을 보유하는 올리고머화 가능한 키메라 수용체가 본원에 제공된다. 보다 구체적으로, 이들 수용체는 세포외 올리고머화 도메인을 포함하여 키메라 수용체의 올리고머 형태, 예를 들어, 이량체 또는 삼량체 형태의 형성을 촉진한다. 임의의 특정 이론으로 국한되지 않으면서, 이러한 설계는 세포외 도메인(ECD)의 올리고머화 또는 클러스터링을 용이하게 하고, 이어서, 세포내 도메인(ICD)을 함께 가져와서 세포 신호전달, 예를 들어, T-세포 신호전달을 활성화시킨다. 또한, 이들 수용체는 다양한 감도를 제공한다. 추가적으로, 네이티브 노치 NEC를 완전히 생략함으로써, 본 개시의 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SynNotch-인코딩 폴리뉴클레오티드보다 더 작아질 수 있고, 이는 더 제한된 용량을 갖는 벡터들의 사용을 가능하게 하거나 달리 벡터 용량-관련 크기 제약에 의해 배제될 추가 요소들의 포함을 용이하게 한다.
[0009] 일 양태에서, N-말단에서부터 C-말단으로, (a) 선택된 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 세포외 리간드-결합 도메인; (b) 분자간 이황화 결합을 통해 키메라 폴리펩티드의 올리고머 형성을 촉진할 수 있는 힌지 도메인; (c) 하나 이상의 리간드-유도성 단백질분해성 절단 부위를 포함하는 막관통 도메인; 및 (d) 전사 조절제를 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 키메라 폴리뉴클레오티드로서, 선택된 리간드의 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 결합이 전사 조절자와 힌지 도메인 사이에 배치된 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위에서 절단을 유도하며, 키메라 폴리펩티드가 LIN-12-노치 반복부(LNP) 및/또는 노치 수용체의 이종이량체화 도메인(HD)을 포함하지 않는, 키메라 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
[00010] 본 개시에 따른 키메라 폴리펩티드의 비-제한적 예시적인 구현예는 다음 특징들 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 이동 정지 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 세포의 표면 상에서 리간드에 결합할 수 있는 항원-결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 병원체이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 인간 세포는 종양 세포이다. 일부 구현예에서, 인간 세포는 말단 분화 세포이다. 일부 구현예에서, 리간드는 단백질 또는 탄수화물을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드는 분화 클러스터 (CD) 마커이다. 일부 구현예에서, CD 마커는 CD1, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8b, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD34, CD40, CD45, CD48, CD52, CD59, CD66, CD70, CD71, CD72, CD73, CD79A, CD79B, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD94, CD95, CD134, CD140 (PDGFR4), CD152, CD154, CD158, CD178, CD181 (CXCR1), CD182 (CXCR2), CD183 (CXCR3), CD210, CD246, CD252, CD253, CD261, CD262, CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD276 (B7H3), CD279, CD295, CD339 (JAG1), CD340 (HER2), EGFR, FGFR2, CEA, AFP, CA125, MUC-1, MAGE, 알칼리성 포스파타제, 태반-유사 2(ALPPL2), B-세포 성숙 항원(BCMA), 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 및 신호 조절 단백질 α(SIRPα)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0011] 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 발현 카세트 또는 발현 벡터에 도입된다.
[0012] 일부 구현예에서, (a) 본원에 개시된 바와 같은 키메라 폴리펩티드; 및/또는 (b) 본원에 개시된 바와 같은 재조합 핵산을 포함하는 재조합 세포가 본원에 제공된다. 또한, 관련된 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 제공된다.
[0013] 또 다른 양태에서, 약학적으로 허용되는 담체 및 다음 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다: (a) 본원에 개시된 바와 같은 재조합 핵산; 및 (b) 본원에 개시된 바와 같은 재조합 세포. 일부 구현예에서, 개시된 약학적 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 재조합 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화된다.
[0014] 또 다른 양태에서, 세포의 활성을 조절하기 위한 방법으로서, (a) 본 개시의 재조합 세포를 제공하는 단계, 및 (b) 선택된 리간드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 키메라 폴리펩티드의 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 선택된 리간드의 결합이 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위의 절단을 유도하고, 전사 조절자를 방출하며, 방출된 전사 조절자가 재조합 세포의 활성을 조절하는, 방법이 본원에 제공된다. 또 다른 양태는 개체에서 표적 세포의 활성을 조절하기 위한 방법으로서, 유효수의 본 개시의 재조합 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 재조합 세포가 개체에서 표적 세포의 활성을 억제하는, 방법에 관한 것이다.
[0015] 또 다른 양태는 개체에서 건강 상태(예를 들어, 질환)를 치료하기 위한 방법으로서, 유효수의 본 개시의 재조합 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 재조합 세포가 개체에서 건강 상태를 치료하는, 방법에 관한 것이다.
[0016] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예들은, 세포의 활성을 조절하거나, 표적 암 세포를 억제하거나, 이를 필요로 하는 개체에서 건강 상태(예컨대, 질환)를 치료하기 위한 시스템으로서, 시스템이 본 개시의 키메라 폴리펩티드; 본 개시의 폴리뉴클레오티드; 본 개시의 재조합 세포; 또는 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는, 시스템에 관한 것이다.
[0017] 본 개시의 또 다른 양태는 본 개시의 재조합 세포를 제조하기 위한 방법으로서, (a) 단백질 발현이 가능한 세포를 제공하는 단계, 및 (b) 제공된 세포를 본 개시의 재조합 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 얻어진 샘플에 대해 수행되는 백혈구성분채집술에 의해 얻어지고, 세포는 생체 외에서 접촉된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화된다.
[0018] 본 개시의 추가의 또 다른 양태는 건강 상태의 치료를 위한 본 개시의 키메라 폴리펩티드; 본 개시의 폴리뉴클레오티드; 본 개시의 재조합 세포; 또는 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상의 용도이다. 일부 구현예에서, 건강 상태는 암과 같은 질환이다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변이다.
[0019] 본 개시의 또 다른 양태는 건강 상태, 예를 들어, 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 본 개시의 키메라 폴리펩티드; 본 개시의 폴리뉴클레오티드; 본 개시의 재조합 세포; 또는 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상의 용도이다.
[0020] 전술한 요약은 단지 예시적인 것이며, 어떤 식으로도 제한하고자 의도된 것이 아니다. 본원에 기재된 예시적인 구현예 및 특징 이외에, 본 개시의 추가 양태, 구현예, 목적 및 특징은 도면 및 상세한 설명 및 청구항들로부터 완전히 명백해질 것이다.
도 1a 및 도 1b는 본 개시의 키메라 폴리펩티드와 SynNotch 수용체 간의 차이를 개략적으로 예시한 것이다. 도 1a는 리간드 인식 도메인(예를 들어, 항-CD19 scFv), 노치 네가티브 조절 영역(NRR)을 포함하는 막곁 도메인(JMD), 단일 통과 막관통 도메인(TMD), 이동 정지 서열(STS), 및 전사 조절자(예를 들어, Gal4VP64)를 갖는, 기존의 합성 노치 수용체(SynNotch)의 개략적 구조를 도시한 것이다. 도 1b는 본원에 개시되는 바와 같은 예시적인 2 세대 합성 노치 수용체(힌지-노치 수용체)의 개략적인 구조를 도시한 것이며, 여기서 NRR을 포함하여 야생형 노치 폴리펩티드의 전체 NEC가 결실되었다. CD8 힌지 도메인으로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열은 TMD에 N-말단으로 삽입된다. CD8 힌지 서열은 분자간 이황화 결합을 통한 키메라 폴리펩티드의 이량체 형성을 촉진하는 폴리펩티드 모티프를 함유한다.
[0022] 도 2A 내지 도 2C는 힌지-노치 수용체 구성, 이들의 발현 및 일차 T CD4+ T 세포에서의 활성화를 개략적으로 요약한 것이다. 도 2A에서, 인간 노치 1 단백질들에 기반하여 설계된 예시적인 SynNotch1 수용체(좌측 패널)가 개략적으로 도시된다. 중간 패널은 예시적인 CD8 힌지-노치1 수용체를 개략적으로 도시한다. 좌측 패널의 SynNotch1 수용체와 비교하여, CD8 힌지-노치1 수용체는 전체 JMD를 이황화 결합을 형성하는 것으로 알려진 시스테인 잔기를 함유하는 CD8A 힌지 도메인으로 대체한다. 우측 패널은 개략적으로 예시적인 절두된 CD8 힌지-노치1 수용체(truncCD8 힌지-노치1)이다. CD8 힌지-노치1 수용체와 비교하여, truncCD8 힌지-노치1 수용체는 CD8A 힌지 서열의 C-말단 결실을 함유하여, 단일 시스테인 잔기 및 더 짧은 세포외 영역을 남긴다. 도 2B는 수용체 발현의 유세포 분석 데이터의 요약이다. 이들 실험에서, 일차 인간 T-세포는 수용체 또는 전사 리포터 플라스미드를 발현하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었고, 항-CD3/항-CD28 다이나비드(Gibco)로 활성화되었다. 수용체 신호전달은 AlexaFluor647-태그 항-myc 항체(Cell Signaling)를 사용하여 측정되었다. 리포터 발현은 리포터 플라스미드에서 발견되는 구성적 mCitrine 유전자를 통해 측정되었다. 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 이중 양성 세포들이 분류되었고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 도 2C는 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정된, 수용체 활성화 시험의 결과를 요약한 것이다.
[0023] 도 3은 동시 T-세포 활성화에 의한 수용체 활성화를 입증하기 위해 수행된 실험의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 이들 실험에서, T-세포 활성화를 시뮬레이션하기 위해, 항-MCAM, 항-CD3 이중특이성 T-세포 인게이저(MCAM BiTE®)이 사용되었고, 이들은 K562 세포의 존재 하에 T-세포 수용체를 활성화시킨다. 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포는 24 시간 동안 다음과 공동배양되었다: MCAM BiTE®(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포 + MCAM BiTE®(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 CD19+ K562 세포 + MCAM BiTE®(하부 트레이스). 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화는 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었고, 도 2의 비-활성화된 T-세포들로부터 얻어진 신호와 비교하여 증가된 리포터 신호를 나타냈다.
[0024] 도 4A 내지 도 4D는 키메라 노치 수용체의 맥락에서 힌지 도메인을 최적화도록 수행된 실험들의 결과를 요약한 것이다. 도 4A는 "a", "b", "c", 및 "d"로 표시된 하나 이상의 힌지 구성요소들을 포함하는 다양한 CD8 힌지-노치 절두 변이체를 개략적으로 예시한 것이다. 구성요소 "a"는 제1 시스테인 잔기의 N-말단 영역을 나타낸다. 구성요소 "b"는 제1 시스테인 잔기를 나타낸다. 구성요소 "c"는 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기 사이의 영역을 나타낸다. 구성요소 "d"는 제2 시스테인 잔기, 및 제2 시스테인 잔기에서부터 수용체 막관통 도메인까지의 영역을 나타낸다. 시험된 4 개의 변이체들의 힌지 구성요소가 열거된다. 도 4B는 Jurkat T-세포에서 시험한 수용체 활성화의 결과를 요약한 것이다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다. 도 4C는 도 4B의 데이터로부터의 %BFP 양성 세포의 정량화를 나타낸 것이다. 도 4D는 도 4B의 데이터로부터의 신호:잡음비의 플롯이다.
[0025] 도 5는 동시적 PKC(단백질 키나제 C) 신호전달을 이용한 truncCD8힌지2 수용체 활성화를 시험하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 이들 실험에서, PKC 신호 전달을 시뮬레이션하기 위해, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)가 첨가되었다. 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포는 24 시간 동안 PMA의 존재 및 부재에서 다음과 공동배양되었다: 추가 세포 없음(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 CD19+ K562 세포(하부 트레이스). 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다.
[0026] 도 6A 내지 도 6B는 다른 공급원으로부터 유래된 대안적인 힌지 도메인을 함유하는 힌지-노치 수용체로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 도 6A에서 입증되는 바와 같이, CD8A 이외에, CD28, OX40, 및 IgG4가 사용 가능한 힌지 도메인을 지니는 것으로 밝혀졌다. 이들 실험에서, 4 개의 예시적인 힌지-노치 수용체가 있다: pIZ343(절두된 CD8힌지-노치), pIZ358(CD28힌지-노치), pIZ360(OX40힌지-노치), pIZ359(IgG4힌지-노치). 힌지-노치 수용체 각각에 대한 간략한 설명이 표 2에 제공된다. 도 6B는 도 6A의 시험로부터의 %BFP 양성 세포의 정량화를 도시한 것이다.
[0027] 도 7A 내지 도 7B는 다른 리간드 인식 도메인들을 함유하는 힌지-노치 수용체를 시험하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 도 7A에서 입증된 바와 같이, 항-CD19 scFv 이외에, 항-ALPPL2 scFv 및 eGFP가 리간드 인식 도메인으로서 사용될 수 있다. 도 7B에 도시된 바와 같이, 이전에 생성된 리포터 양성 Jurkat T-세포주가 수용체 작제물로 형질도입되었다. 수용체 발현은 AlexaFluor647-태그 항-myc 항체(Cell Signaling)를 사용하여 측정되었다. 수용체 활성화 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 Jurkat T-세포들은 24 시간 동안 다음과 공동배양되었다: 비첨가(상부 트레이스) 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 ALPPL2+ K562 세포/세포 표면 상에서 항-GFP 나노바디를 발현하는 1 x 105 개 K562(하부 트레이스). 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다.
[0028] 도 8A 내지 도 8B는 다른 이동 정지 서열(STS)을 갖는 힌지-노치 수용체를 시험하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 도 8A에 예시된 바와 같이, 노치1 STS 이외에, 또 다른 STS(예를 들어, 노치2 STS, 노치4 STS, DAG1 STS, PTPRF STS, 및 KL STS)가 수용체 거동에 영향을 미치는 데 사용될 수 있다. 이들 실험에서, 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이나비드(Gibco)로 활성화되었고, 수용체 또는 전사 리포터 작제물을 발현하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 수용체/리포터 양성 세포들이 분류되었고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개의 이중 양성 T-세포들이 다음과 24 시간 동안 공동배양되었다: 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 CD19 + K562 세포(하부 트레이스). 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다. 도 8B는 도 8A에서 활성화 데이터의 정량화를 도시한 것이다.
[0029] 도 9A 내지 도 9C는 힌지-노치 수용체를 최적화하기 위해, 힌지-노치1 작제물에 의해 예시된 바와 같은, 다양한 힌지-노치 절두 변이체의 기능을 평가하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 도 9A는 작제물 pIZ341의 N-JMD 도메인의 전장 또는 절두된 형태를 포함하는 변이체에 대한 작제물 설계를 예시한 것이다. 검은 색 막대는 각각의 변이체를 구성하는 아미노산들을 나타낸다. "Full"은 SEQ ID NO: 12를 포함하는 전장 변이체를 지칭한다. "Trunc 1"은 SEQ ID NO: 39를 포함하는 절두 변이체 No. 1을 나타낸다. "Trunc 2"는 SEQ ID NO: 13을 포함하는 절두 변이체 No. 2를 나타낸다. "Trunc 3"은 SEQ ID NO: 40을 포함하는 절두 변이체 No. 3을 나타낸다. "Trunc 4"는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 절두 변이체 No. 4를 나타낸다. 이들 CD8 힌지 변이체들의 발현의 비교는 도 9B에 나타나 있다. 구체적으로, 일차 인간 CD4+ T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이나비드를 사용하여 활성화되었고, 하나는 힌지 절단 변이체 수용체를 발현하고 다른 하나는 BFP 전사 리포터 + 항-알칼리성 포스파타제, 태반-유사 2(ALPPL2) CAR을 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포는 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류되고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장된다. 도 9B의 좌측 5 개의 패널들은 GFP에 의해 측정된 수용체 작제물 발현 수준(x-축) 대비 항-myc-태그 염색(y-축)에 의해 측정된 각 수용체의 상대 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 9B의 최우측 패널은 이중-양성 세포에서 CD8 힌지 변이체의 수용체 발현의 MFI 정량화를 나타낸 것이다. 도 9C는 좌측에서 우측으로 Full 변이체 및 절두 변이체 1 내지 4를 나타내는 5 개의 패널을 나타낸 것이다. 각각의 변이체에 대해, 항-CD19 수용체를 발현하는 T-세포는, 상부에서 하부로, 비첨가(상부 트레이스), ALPPL2 + K562 세포(상부에서부터 두 번째 트레이스), CD19 + K562 세포(상부에서부터 세 번째 트레이스) 또는 ALPPL2+ CD19+(하부 트레이스)과 공동배양되었다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다.
[0030] 도 10은 상이한 결합 도메인을 갖는 힌지-노치 변이체 및 단백질분해 활성에 대한 이들의 의존성들을 시험하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 일차 인간 CD4+ T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이나비드를 사용하여 활성화되었고, 하나는 표시된 결합 헤드 절두 변이체 수용체가 있는 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 전사 리포터를 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포가 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류되고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 시험을 위해, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체가 1 x 105 개 K562 세포(상부 트레이스), 1 x 105 개 리간드 + K562 세포(상부에서 두 번째 트레이스), 1 x 105 개 리간드 + K562 세포와 ADAM10 억제제(상부에서 세 번째 트레이스), 또는 1 x 105 개 리간드 + K562 세포와 감마-세크레타제 억제제, DAPT(하부 트레이스)와 공동배양되었다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다.
[0031] 도 11A 내지 도 11C는 상이한 결합 도메인 및 노치2 STS 도메인으로의 힌지-노치 변이체를 시험하기 위해 수행된 실험로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 일차 CD4+ 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드를 사용하여 활성화되었고, 하나는 표시된 헤드 힌지노치 수용체가 있는 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 전사 리포터를 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포가 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류되고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 시험을 위해, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체가 2 일 동안 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 BCMA+ K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양되었다(도 11A). 도 11A에서 좌측 패널은 항-BCMA scFv 결합 헤드를 갖는 작제물을 지칭하고, 중간 패널은 항-BCMA 완전 인간화 VH 결합 헤드를 갖는 작제물을 지칭하고, 우측 패널은 결합 도메인에 최적화된 힌지 도메인이 있는 항-BCMA 완전 인간화 VH 결합 헤드를 작제물을 지칭한다(힌지 5). SIRPα 결합 헤드가 유사하게 시험되었다. 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체는 2 일 동안 비첨가(상부 트레이스), 또는 1 x 105 개 K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양되었다(도 11B). 도 11c에서, HER2 항원에 대한 상이한 scFv이 시험되었고, 유사한 방법을 이용하여 비교되었다. 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체는 2 일 동안 비첨가(상부 트레이스), 부착성 HEK 293T 세포(상부에서부터 두 번째 트레이스), 부착성 MBMDA-468 세포(상부에서부터 세 번째 트레이스), 부착성 MCF7 세포(상부에서부터 네 번째 트레이스), 또는 부착성 SKBR3 세포(하부 트레이스)와 공동배양되었다(도 11C). 좌측 패널은 항-HER2 4D5-7 scFv 결합 헤드를 나타내고, 반면에 우측 패널은 항-HER2 4D5-8 scFv 결합 헤드를 나타낸다. 도 11A 내지 도 11C에서, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화는 후속적으로 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다.
[0032] 도 12는 상이한 프로모터 및 STS 도메인을 갖는 힌지-노치 변이체의 활성화를 비교하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포는 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 ALPPL2+ K562 세포(상부에서 두 번째 트레이스), 1 x 105 개 CD19+ K562 세포(상부에서 세 번째 트레이스), 또는 1 x 105 개 ALPPL2+ CD19+ K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양되었다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다. 뮤린 및 인간 기원 SynNotch 작제물을 사용한 활성화가 비교를 위해 포함되었다.
[0033] 도 13A 내지 도 13B는 힌지-노치 작제물에서 노치1 막관통 도메인(TMD)의 돌연변이 분석에 대한 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 힌지-노치 작제물의 TMD 도메인에서 상이한 알라닌 돌연변이를 갖는 변이체가 제조되었다. 힌지-노치의 TMD에서 위치 301(F)에서부터 위치 322(S)까지의 각각의 아미노산 잔기가 알라닌으로 개별적으로 돌연변이되었다. 일차 CD4+ 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드를 사용하여 활성화되었고, 하나는 TMD 돌연변이체 변이체를 발현하고 다른 하나는 BFP 전사 리포터를 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포가 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류되고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 도 13A에서, 좌측 패널은 리포터 작제물 마커 발현(x-축) 대비 항-myc-태그 염색(y-축)에 의해 측정된, 상이한 수용체의 상대 발현을 나타내고, 우측 패널은 이중-양성 세포에서의 TMD 돌연변이 변이체의 수용체 발현의 MFI 정량화를 나타낸다. 도 13B에서, 항-CD19 수용체를 발현하는 T-세포는 대조 CD19(-) 또는 CD19(+) K562 세포와 1:1 비로 공동배양되었다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다. 좌측 패널은 활성화 프로파일의 유동 패널들을 나타낸다. 우측 패널은 선 그래프로서 플롯팅된 BFP%를 나타낸다.
[0034] 도 14는 힌지-노치 작제물에서 막관통 도메인(TMD) 및 STS 도메인의 돌연변이 분석에 대한 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 이 실시예에서 네 가지 유형의 예시적인 힌지 노치 수용체가 이용되었고, 이들 모두는 항-CD19 scFv 도메인, 절두된 CD8 힌지 도메인, 및 Gal4VP64 도메인 + 상이한 TMD 도메인(CLSTN1 TMD 또는 CLSTN2 TMD) 및 상이한 STS 도메인(CLSTN1 STS, CLSTN2 STS, 또는 노치1 STS)을 포함하였다. 일차 인간 CD4+ T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)로 활성화되고, 하나는 나타낸 바와 같이 TMD/STS 조합을 갖는 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 구성적으로 발현된 항-ALPPL2 CAR을 갖는 전사 리포터를 발현하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포가 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류되고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 시험을 위해, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체가 1 x 105 개 K562 세포("-CAR" 패널, 청색), 또는 1 x 105 개 CD19+ K562 세포("-CAR" 패널, 적색)와 공동배양되었다. 마찬가지로, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체가 CAR 활성의 존재에서 1 x 105 개ALPPL2+ K562 세포("+CAR" 패널, 청색), 또는 1 x 105 개 ALPPL2+ CD19+ K562 세포("+CAR" 패널, 적색)와 공동배양에 의해 시험되었다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화가 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다.
[0035] 도 15A 내지 도 15B는 조작된 사이토카인의 힌지-노치-제어된 발현을 이용하여 T 세포의 조정 가능한 리간드-의존적 확장에 대한 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 도 15A는 T 세포의 자가분비 및 측분비 확장을 위해 조작된 사이토카인의 리간드-촉발 분비를 제공하도록 힌지-노치 STS 변이체로 조작된 T 세포의 다이어그램을 나타낸 것이다. 표시된 STS 변형을 갖는 항-CD19 힌지-노치 수용체의 발현 프로파일은 도 15B에 나타나 있다. 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드를 사용하여 활성화되었고, 하나는 MCAM 항원에 대하여 CAR을 발현하고 다른 하나는 Gal4-UAS 제어 하에 유도성 수퍼-IL2를 갖는 힌지-노치 수용체를 발현하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포가 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류되고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 항-myc-태그 염색(y- 축)에 의해 수용체 발현이 결정되었다.
[0036] 도 16은, 수퍼-IL2의 리간드-촉발 발현이 CAR-T 세포의 세포 생존력을 개선한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 항-CD19 힌지노치 노치1 STS 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포는 IL-2가 없는 배지에서, K562 세포 부재(상부 좌측), 힌지-노치를 촉발시키는 CD19+ K562의 존재(상부 우측), CAR 활성화를 촉발시키는 MCAM+ K562 세포의 존재(하부 좌측) 또는 둘 모두의 수용체의 활성화를 촉발시키는 MCAM+ 및 CD19+ K562 세포의 존재(하부 우측)와 공동배양되었다. 9 일 후에, Fortessa X-50을 사용한 순방향 및 측면-산란 측정들에 의한 생존 T 세포의 비율이 평가되었다.
[0037] 도 17은 힌지-노치의 STS-변이체에 의한 T 세포의 조정 가능한 증식을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드를 사용하여 활성화되었고, 하나는 MCAM 항원에 대하여 CAR을 발현하고 다른 하나는 Gal4-UAS 제어 하에 유도성 수퍼-IL2를 갖는 힌지-노치 수용체를 발현하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다(우측 네 개 패널). 3 개의 상이한 STS 변이체(NRG1, 노치1, 노치2)를 함유하는 힌지-노치 수용체가 힌지-노치가 없는 대조에 대해 시험되었다. 마찬가지로, 일차 인간 T-세포는 CAR 발현 없이 생성되었다(좌측 패널). T 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 CellTrace Violet으로 염색되었고, IL-2가 없는 배지에서 CD19+ K562 표적 세포와 공동배양되었고, CTV 신호 붕괴에 의해 증식을 평가하기 위해 표시된 시점에 Fortessa X-50을 사용하여 측정되었다.
[0038] 도 18A 내지 18B는 힌지-노치의 STS-변이체에 의한 수퍼-IL2의 조정 가능한 분비를 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드를 사용하여 활성화되었고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 수퍼-IL2를 갖는 힌지-노치 수용체를 발현하는 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다(도 18A). 3 개의 상이한 STS 변이체(NRG1, 노치1, 노치2)를 함유하는 힌지-노치 수용체가 힌지-노치가 없는 대조에 대해 시험되었다. T 세포는 IL-2가 결여된 배지에서 MCAM+ CD19+ K562 세포와 공동인큐베이션되었고, 표시된 시점에, 상청액 IL-2는 마이크로플레이트 리더로 제조업체의 프로토콜에 따라 Instant ELISA 키트를 사용하여 측정되었다. 적색 점선은 T 세포를 배양하는 데 사용되는 IL-2의 표준 농도를 나타낸다. 수퍼-IL2의 등급화된 분비는 STS-조정된 힌지-노치 수용체의 활성화에 의해 달성되었다. 도 18B에서, 일차 인간 T-세포는 MCAM에 대해 CAR을 발현하는 추가의 렌티바이러스 벡터로 생성되었다.
[0039] 도 19는 힌지-노치의 STS-변이체에 의한 수퍼-IL2의 조정 가능한 분비가 방관자 T 세포의 증식을 향상시킨다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드를 사용하여 활성화되었고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 수퍼-IL2를 갖는 힌지-노치 수용체를 포함하는 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다(우측 패널). 3 개의 상이한 STS 변이체(NRG1, 노치1, 노치2)를 함유하는 힌지노치 수용체가 힌지-노치가 없는 대조에 대해 시험되었다. 힌지-노치 T 세포는 MCAM에 대해 CAR을 발현하는 CellTrace Far Red(좌측 패널)로 또는 CAR 부재(우측 패널)로 염색된 "방관자" T 세포와 공동인큐베이션되었다. T 세포는 IL-2가 결여된 배지에서 MCAM+ CD19+ K562 세포와 공동인큐베이션되었고, Fortessa X-50에서 신호 붕괴를 측정함으로써 방관자 T 세포의 증식이 평가되었다.
[0040] 도 20은 힌지-노치 수용체 CAR 회로를 함유하는 단일 렌티바이러스 벡터 작제물을 시험하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드를 사용하여 활성화되었고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 항-MCAM CAR 카세트로 구성적으로 발현된 힌지-노치 수용체를 함유하는 단일 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 세포가 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 myc-태그를 통해 힌지-노치 수용체 발현에 대하여 분류되고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 3 개의 STS-변이체는 표시된 바와 같이 대조로서 사용되는 구성적으로 발현된 CAR과 함께 시험되었다. 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 T 세포가 비첨가(상부 트레이스), 5 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 5 x 104 개 CD19 + K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양되었다. 후속적으로, 유도성 CAR의 전사 활성화는 Fortessa X-50을 사용하여 GFP 태그에 의해 측정되었다.
[0041] 도 21은 힌지노치 CAR 회로를 함유하는 단일 렌티벡터로 조작된 T 세포에 의한 특이적 이중 항원 표적 세포 사멸을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드를 사용하여 활성화되었고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 항-MCAM CAR 카세트로 구성적으로 발현된 힌지-노치 수용체를 함유하는 단일 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 세포가 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 myc-태그를 통해 힌지-노치 수용체 발현에 대하여 분류되고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 3 개의 STS-변이체는 표시된 바와 같이 대조로서 사용된 구성적으로 발현된 CAR과 함께 시험되었다. 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 T 세포가 5 x 105 개 MCAM+ K562 세포 또는 5 x 104 개 MCAM+ CD19+ K562 세포와 공동배양되었다. 표적 세포 사멸은 Fortessa X-50을 사용하여 K562 집단의 순방향/측면-산란에 의해 평가되었다.
[0042] 도 22는 T 세포 활성화 및 고갈의 제어에 대하여 힌지-노치 수용체를 함유하는 단일 렌티바이러스 벡터 작제물을 시험하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드를 사용하여 활성화되었고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 항-MCAM CAR 카세트로 구성적으로 발현된 힌지-노치 수용체를 함유하는 단일 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 세포가 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 myc-태그를 통해 힌지-노치 수용체 발현에 대하여 분류되고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장되었다. 3 개의 STS-변이체는 표시된 바와 같이 대조로서 사용되는 구성적으로 발현된 CAR과 함께 시험되었다. 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 T 세포를 5 x 104 개 CD19+ K562 세포와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 CAR의 전사 활성화는 Fortessa X-50을 사용하여 GFP 태그에 의해 측정되었다(최좌측의 패널). T 세포 활성화 및 고갈은 각각 CD25(좌측에서부터의 두 번째 패널) 및 CD39(좌측에서부터의 세 번째 및 네 번째 패널)의 발현에 의해 측정되었다.
[0043] 도 23은 힌지-노치-대-CAR 회로의 생체 내 시험을 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한 것이다. 일측성 종양의 경우, NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG) 마우스는 왼쪽 옆구리에 1 x 106 개 K562-BCMA/CD19 종양 세포가 피하 이식되었다. 대측성 종양의 경우, NSG 마우스는 왼쪽 옆구리에 1 x 106 개 K562-BCMA/CD19 종양 세포가, 오른쪽 옆구리에 1 x 106 개 K562-CD19 종양 세포가 이식되었다. 종양 이식 4 일 후, 2.5 x 106 개의 조작된 일차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포(총 5 x 106 개 T 세포)가 꼬리 정맥 주사를 통해 i.v. 주입되었다. 주 2 회 내지 3 회 캘리퍼를 통해 종양 크기가 모니터링되고, 종양이 ≥20 mm로 측정되었을 때 마우스가 종점에 도달한 것으로 결정되었다. 면역 표현형 분석을 위해, T 세포 이식 10 일 후에 종양 및 비장이 수거되었다. 종양은 37℃에서 30 분 동안 4 mg/ml의 콜라게나제 IV 및 0.1 mg/ml의 DNase I으로 RPMI-1640에서 수동으로 잘게 잘리고 분해되었고, 비장은 수동으로 해리되고 적혈구 용해에 주어졌다. 다음 항체들이 사용되었다: 항-CD45, 항-CD3, 항-CD4, 및 항-CD8. 죽은 세포는 Draq7로 배제되었다. 샘플들은 FACSymphony X50 SORP를 사용하여 분석되었고, 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
본 개시의 상세한 설명
본 개시는 일반적으로, 특히, 리간드-의존적 방식으로 전사 조절을 조절하도록 조작된 신규한 부류의 올리고머화 가능한 키메라 폴리펩티드 수용체에 관한 것이다. 특히, 신규한 수용체("힌지-노치"로 칭해짐)는 노치로부터 유래되었음에도 불구하고, 노치 NEC 서브 유닛, 특히, 이전에 수용체의 기능에 필수적이라고 여겨지는 NRR을 요구하지 않는다. 이러한 신규한 부류의 수용체는 합성 및 재조합이며, 천연으로 발생하지 않는다. 후술되는 바와 같이, 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드는 합성 폴리펩티드일 수 있거나, 요망되는 및/또는 개선된 성질, 예컨대, 전사 조절을 제공하도록 조작, 설계, 또는 변형될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 신규한 힌지-노치 수용체가 기능적일뿐만 아니라 향상된 생물학적 활성을 나타낸다는 입증은 놀랍고, 그 분야의 교시들과 완전히 상반되는 것이다. 추가로, 본원에 기재된 신규한 키메라 수용체는 세포외 올리고머화 도메인을 도입하여 키메라 수용체의 올리고머 형태, 예를 들어, 이량체 또는 삼량체 형태의 형성을 촉진한다. 이러한 설계는 세포외 도메인(ECD)의 올리고머화/클러스터링을 용이하게 하고, 이어서, 세포내 도메인(ICD)을 함께 가져와서 세포 신호전달, 예를 들어, T-세포 신호전달을 활성화시키는 것으로 사료된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 수용체는 표적 세포-표면 리간드에 결합하며, 이는 키메라 수용체의 단백질분해 절단을 촉발시키고, 세포에서 맞춤형 전사 프로그램을 조절하는 전사 조절자의 방출을 촉발시킨다. 본 개시는 또한, 그러한 수용체들을 생성하는 데 유용한 조성물 및 방법, 이를 인코딩하는 핵산, 핵산으로 유전적으로 변형된 숙주 세포뿐만 아니라, 세포의 활성을 조절하기 위한 및/또는 다양한 건강 상태, 예컨대, 질환(예를 들어, 암)의 치료를 위한 방법을 제공한다.
[0045] 하기 상세한 설명에서, 이의 일부를 형성하는 첨부된 도면이 참조된다. 도면에서, 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 유사한 기호들은 일반적으로 유사한 구성요소로 확인된다. 상세한 설명, 도면, 및 청구항에서 기술되는 예시적인 대안은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본원에 제시되는 요지의 범위 또는 사상으로부터 벗어남 없이 다른 대안들이 사용될 수 있고, 다른 변화들이 이루어질 수 있다. 본원에서 일반적으로 기술되고 도면들에 예시된 바와 같은 양태들이 매우 다양한 상이한 구성들로 배열, 치환, 조합 및 설계될 수 있으며, 이들 모두는 명시적으로 고려되고, 본 출원의 일부를 구성한다는 것이 용이하게 이해될 것이다.
정의
[0046] 단수 형태인 부정관사 및 정관사는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 하나 이상의 세포(이들의 혼합물 포함)를 포함한다. "A 및/또는 B"는 본원에서 다음의 대안들: "A", "B", "A 또는 B", 및 "A 및 B" 모두를 포함하기 위해 사용된다.
[0047] 본원에서 사용되는 용어 "투여"및 "투여하는"은 정맥내, 동맥내, 두개내, 근내, 복강내, 피하, 근육내, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는 투여 경로에 의한 본원에 개시되는 바와 같은 조성물 또는 제형의 전달을 지칭한다. 이 용어는 의료 전문가에 의한 투여 및 자기-투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[0048] "암"은 암-유발 세포에 전형적인 특징, 예컨대, 제어되지 않는 증식, 불멸, 전이 가능성, 급속한 성장 및 증식률, 및 특정한 특유의 형태적 특징들을 갖는 세포의 존재를 지칭한다. 일부 유형의 암 세포는 종양과 같이 덩어리와 같은 덩어리로 응집될 수 있지만, 일부 암 세포는 대상체내에서 단독으로 존재할 수 있다. 종양은 고형 종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 또한 다른 유형의 비-종양 암을 포함한다. 비-제한적인 예들은, 혈액암 또는 혈액 악성종양, 예컨대, 백혈병, 림프종, 및 골수종을 포함한다. 암은 전암뿐만 아니라 악성 암을 포함할 수 있다.
[0049] 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 그러한 용어들뿐만 아니라 "세포", "세포 배양", "세포주"는 특정 대상 세포 또는 세포주뿐만 아니라, 배양물에서 전달 또는 계대의 수에 관계없이 그러한 세포 또는 세포주의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 모든 자손이 모 세포와 정확히 동일하지는 않다는 것이 이해되어야 한다. 이는 특정 변형이 돌연변이(예를 들어, 고의적인 또는 의도하지 않은 돌연변이) 또는 환경적 영향(예컨대, 메틸화 또는 다른 후성유전적 변형)으로 인해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문이며, 그에 따라, 자손이 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 자손이 원래의 세포 또는 세포주와 동일한 기능을 보유하는 한, 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.
[0050] 본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2 개 이상의 요소들, 예를 들어, 그들이 의도된 방식으로 동작할 수 있게 하는 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 물리적 또는 기능적 연결을 나타낸다.
[0051] 2 개 이상의 핵산 또는 단백질의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "동일성 퍼센트"는 후술되는 디폴트 파라미터들을 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘들을 사용하여, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정하는 경우 동일하거나, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 특정 백분율(비교 범위 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 일치성을 위해 비교되고 정렬될 때 약 60% 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일성)을 갖는 둘 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. 예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 NCBI 웹 사이트(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 참조한다. 이후, 그러한 서열은 "실질적으로 동일한"이라고 한다. 이러한 정의는 또한, 서열의 보체(complement)를 지칭하거나 이에 적용될 수 있다. 이러한 정의는 또한 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열뿐만 아니라 치환들을 갖는 서열을 포함한다. 서열 동일성은 적어도 약 20 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐, 또는 10 내지 100 개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐, 또는 주어진 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산될 수 있다. 서열 동일성은 공개된 기법들 및 널리 이용 가능한 컴퓨터 프로그램, 예컨대, GCS 프로그램 패키지(Devereux et al, Nucleic Acids Res. 12:387, 1984), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990)를 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성은, 위스콘신 대학교 생명공학 센터(1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)의 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지와 같은 서열 분석 소프트웨어를 이의 디폴트 파라미터와 사용하여 측정될 수 있다.
[0052] 본원에서 사용되는 바와 같이, 그리고 달리 특정되지 않는 한, 제제의 "치료적 유효량"은 건강 상태, 예컨대, 질환(예를 들어, 암)의 치료 또는 관리에서 치료적 이익을 제공하거나 질환과 연관된 하나 이상의 증상들을 지연시키거나 최소화시키기에 충분한 양이다. 치료적 유효량의 화합물은, 질환의 치료 또는 관리에서 치료적 이익을 제공하는, 단독으로 또는 다른 치료제와 조합된 치료제의 양을 의미한다. 용어 "치료 유효량"은, 질환의 전체적인 치료를 개선하거나, 질병의 증상 또는 원인을 감소시키거나 회피하거나, 또 다른 치료제의 치료적 효능을 향상시키는 양을 포괄할 수 있다. "유효량"의 예는 "치료적 유효량"으로 또한 지칭될 수 있는, 질환의 증상 또는 증상들의 치료, 예방, 또는 감소에 기여하기에 충분한 양이다. 증상의 "감소"는 증상(들)의 중증도 또는 빈도의 감소, 또는 증상(들)의 제거를 의미한다. "치료적 유효량"을 포함하는 조성물의 정확한 양은 치료의 목적에 따라 좌우될 것이며, 공지된 기법들을 사용하여 당업자에 의해 확인 가능할 것이다(예를 들어, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 2010); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (2016); Pickar, Dosage Calculations (2012); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조).
[0053] 본원에서 사용되는 "대상체" 또는 "개체"는 동물, 예컨대, 인간(예를 들어, 인간 개체) 및 비-인간 동물을 포함한다. 일부 구현예에서, "대상체" 또는 "개체"는 의사의 관리를 받는 환자이다. 따라서, 대상체는 인간 환자, 또는 관심 질환(예를 들어, 암) 및/또는 질환의 하나 이상의 증상을 갖거나, 가질 위험이 있거나, 갖는 것으로 의심되는 인간 환자 또는 개체일 수 있다. 대상체는 또한 진단 시점 또는 그 이후에 관심 질병의 위험이 있는 것으로 진단된 개체일 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 및 비-포유동물, 예컨대, 비-인간 영장류, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
[0054] 값들의 범위가 제공되는 경우, 그러한 범위의 상한과 하한, 그리고 명시된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값 사이에서, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 하한의 단위의 10 분의 1까지의 각각의 개재 값은 본 개시 내에 포함된다는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한, 명시된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 제한을 조건으로 하여 본 개시 내에 포함된다. 명시된 범위가 한계들 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계들 중 하나 또는 둘 모두를 배제하는 범위들이 또한 본 개시에 포함된다.
[0055] 본원에 개시된 모든 범위들은 또한, 임의의 그리고 모든 가능한 하위-범위 및 이들의 하위-범위의 조합을 포함한다. 임의의 열거된 범위는, 동일한 범위가 적어도 동등한 절반, 3 분의 1, 4 분의 1, 5 분의 1, 10 분의 1 등으로 세분화되는 것을 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 인식될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 본원에서 논의되는 각각의 범위는 하위 세 번째, 중간 세 번째 및 상위 세 번째 등으로 용이하게 세분될 수 있다. 당업자에 의해 또한 이해될 바와 같이, "~까지", "적어도", "초과", 및" 미만" 등과 같은 모든 언어는 인용된 수를 포함하고, 후속하여 상기 논의된 바와 같이 하위 범위로 세분될 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 범위는 각각의 개별 부재를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1 내지 3 개의 항목을 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3 개의 항목들을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1 내지 5 개의 항목을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 항목 등을 갖는 그룹을 지칭한다.
[0056] 명확성을 위해, 별개의 구현예의 문맥에서 기재된 본 개시의 조성물 및 방법의 특정 특징이 또한 단일 구현예에서 조합되어 제공될 수 있다는 것이 인지된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 문맥에서 기재된 본 개시의 다양한 특징이 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 개시에 관한 구현예들의 모든 조합들은 본 개시에 의해 구체적으로 포괄되며, 각각의 그리고 모든 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 개시되는 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 구현예 및 이들 요소의 모든 하위-조합은 또한 본 개시에 의해 구체적으로 포괄되며, 각각의 그리고 모든 조합이 본원에 개별적으로 그리고 명시적으로 개시되는 것처럼 본원에 개시된다.
노치 수용체
[0057] 노치 수용체는 인접 세포에서 발현된 표면-결합 리간드에 결합 시 신호를 정상적으로 전달하는 막관통 단백질이다. 노치 신호는 세포-세포 접촉에 의존한다. 척추동물 및 무척추 동물들의 진화 발산은 노치 수용체가 수반하는 적어도 2 회의 라운드의 유전자 복제를 동반하였다: 초파리는 단일 노치 유전자, 벌레 2 개(GLP-1 및 LIN-12), 및 포유동물 4 개(노치1 내지 4). 노치 신호의 변환은 세 가지 주요 사건에 의존한다: (i) 리간드 인식, (ii) 리간드-의존적 절단 부위의 입체형태 노출, 및 (iii) 핵 전사 활성화 복합체의 조립.
[0058] 전형적 노치 신호는 조절된 막내 단백질분해라 불리는 공정에 변환된다. 노치 수용체는 일반적으로 세포 표면에 나머지 단백질분해 저항성 입체형태로 유지되지만, 리간드 결합은 막으로부터 수용체의 세포내 부위(세포내 노치(ICN) 또는 노치 세포내 도메인(NICD)으로도 알려짐)를 방출하는 단백질분해 캐스케이드를 개시한다. 중요하고 조절된 절단 단계는 ADAM 메탈로프로테아제에 의해 영향을 받으며, 원형질막 바로 외부에 있는 S2라고 불리는 부위에서 발생한다. 이러한 절두된 수용체, dubbed NEXT(노치 세포외 절두의 경우)는 감마 세크레타제, 다단백질 효소 복합체에 의해 부위 S3에서 처리될 때까지 테터링된 막을 유지한다.
[0059] 감마 세크레타제-매개 절단 후, ICN은 궁극적으로 핵으로 들어가고, 여기서 CSL로 칭해지는 DNA-결합 전사 인자(포유동물의 C-프로모터-결합 인자, RBP-J라고도 함)/드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster)에서 헤어리스 또는 카에노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에서 Lag1의 저해자 및 Mastermind/Lag-3 패밀리의 전사 보조활성자를 함유하는 전사 활성자 복합체를 조립한다. 이러한 복합체는 이어서 p300과 같은 추가 보조활성 단백질과 결합하여 기저 전사 기구를 모집하고 다운스트림 표적 유전자의 발현을 활성화시킨다.
[0060] 노치 수용체는 모듈러 도메인 조직화를 갖는다. 노치 수용체의 노치 세포외 서브유닛(NEC)은 리간드 결합을 담당하는 일련의 N-말단 표피 성장 인자 수용체(EGFR)-유사 반복부로 이루어진다. O-푸코스, Fringe 및 Rumi 글리코실트랜스페라제에 의한 변형을 포함하여 이들 EGFR 반복부의 O-연결된 글리코실화는 또한 초파리와 포유동물의 상이한 리간드 하위유형에 대한 반응으로 노치 수용체의 활성을 조절한다.
[0061] EGFR 반복부에는 노치 수용체에 고유한 3 개의 LIN-12/노치 반복부( L IN-12/ N otch r epeat; LNR) 모듈이 이어지고, 조기 수용체 활성화를 예방하는 데 참여하는 것으로 광범위하게 보고되어 있다. 노치1의 이종이량체화( h etero d imerization; HD) 도메인은 푸린 절단에 의해 분리되고, 따라서 이의 N-말단 부분은 노치 세포외 서브유닛(NEC)을 종결하고, 이의 C-말단 절반은 노치 막관통(NTM) 서브유닛의 시작을 구성한다. NEC의 세포외 HD-C 영역 다음에는 막관통 세그먼트 및 전사 활성자를 포함하는 세포내 영역(ICN)이 있다. 노치 수용체 및 노치-매개 세포 신호전달에 관한 추가 정보는, 예를 들어, 둘 모두가 본원에 참조로 포함되는 문헌[W.R. Gordon et al., Dev Cell (2015) 33:729-36 및 W.R. Gordon et al., J. Cell Sci. (2008) 121:3109-19]에서 찾아볼 수 있다.
본 개시의 조성물
[0062] 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 본 개시는 기존의 합성 노치 수용체에 비해 다양한 이점을 갖고, 리간드-의존적 방식으로 전사 조절을 조절하도록 조작된 신규한 부류의 올리고머화 가능한 키메라 폴리펩티드 수용체를 제공한다. 예를 들어, 천연 노치 수용체는 노치 조절 영역, 또는 심지어 NEC 서브유닛 전체를 생략함으로써 여러 수십 개의 탠덤 EGFR-유사 반복부를 함유하는 NEC 서브유닛으로 크기 때문에, 본 개시의 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연 노치 수용체 및 기존의 SynNotch-인코딩 폴리뉴클레오티드보다 작을 수 있고, 이는 더 제한된 용량을 갖는 벡터의 사용을 가능하게 하거나 달리 벡터 용량과 관련된 크기 제약에 의해 배제될 추가 요소의 포함을 가능하게 한다.
[0063] 당업자는 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 수용체가 특정 세포 및 환경적 맥락에서 증폭된 활성화를 촉진한다는 것을 이해할 것이다. 수용체 활성에 대한 이러한 유형의 피드백은 조작된 세포에 의한 치료적 페이로드의 생산을 향상시키고 조절하는 데 사용될 수 있는 새로운 특징이다. 또한, 하기에서 추가로 상세하게 기술되는 바와 같이, 본원에 개시된 다수의 수용체 변이체는 더 높은 효율로 형질도입될 수 있고 인간 일차 T 세포의 세포 표면에서 더 높은 수준으로 발현될 수 있기 때문에 기존의 SynNotch 수용체보다 발현이 용이하다.
[0064] 또한, 하기에서 보다 상세히 기술되는 바와 같이, 본원에 개시된 특정 키메라 폴리펩티드 수용체는, 예를 들어, 요망되는 전사 출력의 리간드-유도 신호 수준에 의해 결정하는 경우 기존의 SynNotch 수용체보다 더 나은 활성을 갖는다. 예를 들어, 힌지-노치 및 trunc힌지-노치는 해당하는 SynNotch보다 더 높은 리간드-유도 신호율을 제공하고, 리간드-유도가 아닐 때 더 낮은 신호율을 제공한다. 또한, 본원에 개시된 특정 키메라 폴리펩티드 수용체는 추가적인 노치 수용체를 조작하기 위한 더 모듈형인 플랫폼을 제공한다. 이러한 모듈형 플랫폼은 별개의 기능을 갖는 도메인으로 하여금, 예를 들어, 다른 종으로부터의 해당 도메인으로 쉽게 교체할 수 있도록 하여 수용체 활성화 프로파일의 사용자 지정을 가능하게 한다. 실시예에서 보다 상세하게 기술되는 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 특정 힌지-노치 및 절두된 힌지-노치 수용체는, 기존 SynNotch 수용체보다 작고 잘 발현될 뿐만 아니라, 맞춤화에 이용 가능한 수용체 세포외, 막관통, 및 세포내 도메인의 모든 요소로 광대한 정도로 맞춤화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 다양한 CD8 힌지노치 수용체의 시험은 다양한 세포외 도메인이 가능하다는 것을 입증하였다. 확실히 대조적으로, 기존의 SynNotch1 조절 도메인에서 수행되는 유사한 과정은 발현 상실 또는 스위치-유사 기능 상실로 이어진다.
[0065] 임의의 특정 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 본원에 기재된 힌지노치 수용체는 뮤린 또는 인간 버전의 SynNotch1과 비교할 때 더 높은 수준의 리간드-유도 신호를 제공할 수 있는 것으로 사료된다. 또한, 본원에 기재된 힌지노치 수용체는 뮤린 버전의 SynNotch1과 비교할 때 리간드의 부재에서 더 낮은 수준의 신호(예를 들어, 더 낮은 잡음 신호)를 제공할 수 있는 것으로 사료된다. 예를 들어, 기존 SynNotch 수용체는 scFvs 및 나노바디와 같은 리간드-결합 도메인으로 조작될 수 있지만, SynNotch 수용체에서는 수용체/리간드로부터 천연 세포외 도메인을 사용하는 것이 어려웠다. 대조적으로, 본원에 제공된 2 세대 노치 수용체는 다른 유형의 리간드 결합 도메인, 예를 들어, scFv 이외의 결합 도메인의 사용에 적합하므로 표적화 가능한 질환 및 조직의 범위가 확장된다. 예를 들어, 하기 실시예 섹션에 제시된 실험은 표적 세포의 표면에서 발현된 항-GFP 나노바디 LaG17에 결합할 수 있는 리간드-결합 도메인으로서 eGFP를 사용하는 능력을 입증하였다. 이에 반해, 뮤린과 인간 SynNotch와 같은 기존의 합성 노치 수용체는 리간드-결합 도메인으로서 eGFP1과 상용 가능하지 않았다.
[0066] 실시예에서 기술되는 바와 같이, 특정 키메라 폴리펩티드 수용체는 일차 인간 T 세포에서 시험되고 검증되었다. 이들 신규한 수용체는 마우스 모델에서도 유사한 성능을 보일 것으로 예상된다. 본원에 개시된 수용체는 향상된 식별 및 종양 제거를 위해 다양한 면역 세포 유형으로 조작되거나 자가면역 및 조직 재생의 제어를 위해 조작된 세포에 있을 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 키메라 수용체 중 하나 이상을 발현하도록 조작된 면역 세포와 같은 조작된 세포는 또한 본 개시의 범위 내에 있다.
키메라 폴리펩티드
[0067] 상기 개략된 바와 같이, 본 개시의 일부 구현예는 리간드-의존적 방식으로 전사 조절을 조절하도록 조작된 신규한 비-자연 발생 키메라 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 신규한 수용체는 노치로부터 유래되었음에도 불구하고, 이전에 수용체의 기능에 필수적이라고 여겨지는 노치 조절 영역(NRR)을 요구하지 않는다. 또한, 본원에 기재된 신규한 조작된 수용체는 올리고머화를 촉진하도록 세포외 올리고머화 도메인(예를 들어, 힌지 도메인)을 도입하여 더 고차의 올리고머, 예를 들어, 이량체 또는 삼량체 형태의 키메라 수용체를 형성한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 분자간 이황화 결합을 통한 키메라 폴리펩티드의 올리고머 형성을 촉진할 수 있는 폴리펩티드 모티프를 포함한다. 세포외 올리고머화 도메인은 노치 세포외 도메인의 일부 또는 전부를 대체할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 수용체는 표적 세포-표면 리간드에 결합하며, 이는 수용체의 단백질분해 절단을 촉발시키고, 세포에서 맞춤형 전사 프로그램을 조절하는 전사 조절자의 방출을 촉발시킨다.
[0068] 일부 구현예에서, N-말단에서부터 C-말단으로: (a) 선택된 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 세포외 리간드-결합 도메인(ECD); (b) 분자간 이황화 결합을 통해 키메라 폴리펩티드의 올리고머 형성을 촉진할 수 있는 힌지 도메인; (c) 하나 이상의 리간드-유도성 단백질분해성 절단 부위를 포함하는 막관통 도메인(TMD); 및 (d) 전사 조절자를 포함하는 세포내 도메인(ICD)을 포함하는 키메라 폴리펩티드로서, 선택된 리간드의 ECD에 대한 결합은 전사 조절자와 힌지 도메인 사이에 배치된 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위(들)에서 절단을 유도하며, 키메라 폴리펩티드는 LIN-12-노치 반복부(LNP) 및/또는 노치 수용체의 이종이량체화 도메인(HD)을 포함하지 않는, 키메라 폴리펩티드가 본원에 제공된다.
세포외 도메인(ECD)
[0069] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 수용체(예를 들어, 힌지-노치 수용체)의 ECD는 하나 이상의 표적 리간드에 결합 친화성을 갖는다. 표적 리간드는 세포 표면에서 발현되거나, 달리 키메라 수용체에 기계적 힘을 가할 수 있도록 정착, 고정 또는 결속된다. 이와 같이, 임의의 특정 이론으로 국한되지 않으면서, 세포-표면 리간드에 대한 본원에 제공된 키메라 수용체의 ECD의 결합은 반드시 표적 세포 표면으로부터 표적 리간드를 제거하는 것이 아니고, 키메라 수용체에 기계적 견인력을 작용시킨다. 예를 들어, 달리 가용성인 리간드는 표면, 또는 세포외 기질의 분자에 결합되어 있는 경우 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 리간드는 세포-표면 리간드이다. 적합한 리간드 유형들의 비-제한적 예는 세포 표면 수용체; 부착성 단백질; 표면-결합된 탄수화물, 지질, 당지질, 지단백질, 및 지다당류; 인테그린; 뮤신; 및 렉틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드는 단백질이다. 일부 구현예에서, 리간드는 탄수화물이다.
[0070] 일부 구현예에서, 리간드는 분화 클러스터 (CD) 마커이다. 일부 구현예에서, CD 마커는 CD1, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8b, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD34, CD40, CD45, CD48, CD52, CD59, CD66, CD70, CD71, CD72, CD73, CD79A, CD79B, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD94, CD95, CD134, CD140 (PDGFR4), CD152, CD154, CD158, CD178, CD181 (CXCR1), CD182 (CXCR2), CD183 (CXCR3), CD210, CD246, CD252, CD253, CD261, CD262, CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD276(B7H3), CD279, CD295, CD339 (JAG1), CD340 (HER2), EGFR, FGFR2, CEA, AFP, CA125, MUC-1, 및 MAGE로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0071] 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 수용체의 리간드-결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 하나 이상의 표적 항원에 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 항체 또는 이의 기능적 항원-결합 단편의 하나 이상의 항원-결합 결정자를 포함한다. 본 개시을 읽었을 때 당업자는 "이의 기능적 단편" 또는 "이의 기능적 변이체"라는 용어가 단편 또는 변이체가 유래된 야생형 분자와 공통되는 정량적 및/또는 정성적 생물학적 활성을 갖는 분자를 지칭한다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어, 항체의 기능적 단편 또는 기능적 변이체는 기능적 단편 또는 기능적 변이체가 유래된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 동일한 능력을 본질적으로 보유하는 것이다. 예를 들어, 세포 표면 수용체의 에피토프에 결합할 수 있는 항체는 N-말단 및/또는 C-말단에서 절두될 수 있고, 이의 에피토프 결합 활성의 보유는 당업자에게 공지된 검정을 이용하여 평가되었다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 항체, 나노바디, 디아바디, 트리아바디, 또는 미니바디, F(ab')2 단편, F(ab) 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 및 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 이의 기능적 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 scFv를 포함한다.
[0072] 항원-결합 모이어티는 자연-발생 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 예를 들어, 결합 친화성과 같은 요망된 및/또는 개선된 성질을 제공하도록 조작, 설계, 또는 변형될 수 있다. 일반적으로, 표적 항원(예를 들어, CD19 항원)에 대한 항원-결합 모이어티, 예를 들어, 항체의 결합 친화성은 문헌[Frankel et al., Mol. Immunol, 16:101-06, 1979]에 기재된 Scatchard 방법에 의해 계산될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 친화성은 항원/항체 해리 속도에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 결합 친화성은 경쟁 방사선면역검정에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 결합 친화성은 ELISA에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 항체 친화성은 유세포분석에 의해서 측정된다. 항원(예컨대, CD19)을 "선택적으로 결합하는" 항체는 다른 항원을 현저히 결합하지 않지만 높은 친화성, 예를 들어, 100 nM 이하, 예컨대, 60 nM 이하, 예를 들어, 30 nM 이하, 예컨대, 15 nM 이하, 또는 10 nM 이하, 또는 5 nM 이하, 또는 1 nM 이하, 또는 500 pM 이하, 또는 400 pM 이하, 또는 300 pM 이하, 또는 200 pM 이하, 또는 100 pM 이하의 평형 상수 (KD)로 항원을 결합하는 항원-결합 모이어티이다.
[0073] 당업자는 본 개시의 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 요망되는 국재화 또는 기능에 기초하여 ECD를 선택할 수 있다. 예를 들어, HER2 항원에 특이적인 항체를 포함하는 ECD를 갖는 키메라 폴리펩티드 또는 미니노치 수용체는 HER2-발현 유방암 세포로 세포를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 폴리펩티드 힌지-노치 수용체의 ECD는 종양-관련 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)을 결합할 수 있다. 당업자는 TAA가, 예를 들어, 종양 세포 상에 그리고 정상 세포 상에 존재하고 많은 정상 세포 상에 존재하지만, 종양 세포 상에는 훨씬 더 낮은 농도로 존재하는 단백질과 같은 분자를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 대조적으로, TSA는 일반적으로, 예를 들어, 종양 세포에는 존재하지만 정상 세포에서는 부재인 단백질과 같은 분자를 포함한다.
[0074] 일부 경우에서, 항원-결합 모이어티는, 종양 세포에 의해 발현되는 항원, 즉, 종양-관련 항원에 의해 발현되는 에피토프에 특이적이다. 종양-관련 항원은, 예를 들어, 유방암 세포, B 세포 림프종, 췌장암, 호지킨 림프종 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종, 폐암 세포, 비-호지킨 B-세포 림프종(B-NHL) 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종 세포, 흑색종 세포, 만성 림프구성 백혈병 세포, 급성 림프구성 백혈병 세포, 신경모세포종 세포, 신경교종, 교모세포종, 결장직장암 세포 등과 관련된 항원일 수 있다. 또한, 종양-관련 항원이 또한 비-암성 세포에 의해 발현될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 도메인은 조직-특이적 항원에 존재하는 에피토프에 특이적이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 도메인은 질환-관련 항원에 존재하는 에피토프에 특이적이다.
[0075] 적합한 표적 항원의 비-제한적 예는 CD19, B7H3(CD276), BCMA(CD269), 알칼리성 포스파타제, 태반-유사 2(ALPPL2), 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 신호 조절 단백질 α(SIRPα), CD123, CD171, CD179α, CD20, CD213A2, CD22, CD24, CD246, CD272, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD46, CD71, CD97, CEA, CLDN6, CLECL1, CS-1, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EpCAM, EphA2, Ephrin B2, FAP, FLT3, GD2, GD3, GM3, GPRC5D, HER2 (ERBB2/neu), IGLL1, IL-11Rα, KIT(CD 117), MUC1, NCAM, PAP, PDGFR-β, PRSS21, PSCA, PSMA, ROR1, SSEA-4, TAG72, TEM1/CD248, TEM7R, TSHR, VEGFR2, ALPI, 시트룰린화 비멘틴, cMet, 및 Axl을 포함한다.
[0076] 일부 구현예에서, 표적 항원은 CD19, B7H3(CD276), BCMA(CD269), ALPPL2, CD123, CD171, CD179α, CD20, CD213A2, CD22, CD24, CD246, CD272, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD46, CD71, CD97, CEA, CLDN6, CLECL1, CS-1, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EpCAM, EphA2, Ephrin B2, FAP, FLT3, GD2, GD3, GM3, GPRC5D, HER2 (ERBB2/neu), IGLL1, IL-11Ra, KIT(CD117), MUC1, NCAM, PAP, PDGFR-β, PRSS21, PSCA, PSMA, ROR1, SSEA-4, TAG72, TEM1/CD248, TEM7R, TSHR, VEGFR2, ALPI, 시트룰린화된 비멘틴, cMet, Axl, GPC2, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2/neu), CD276(B7H3), IL-13Rα1, IL-13Rα2, α-페토프로테인(AFP), 암배아 항원(CEA), 암 항원-125(CA-125), CA19-9, 칼레티닌, MUC-1, 상피막 단백질(EMA), 상피 종양 항원(ETA), 티로시나제, 흑색종-관련 항원(MAGE), CD34, CD45, CD123, CD93, CD99, CD117, 크로모그라닌, 사이토케라틴, 데스민, 아교 섬유성 산성 단백질(GFAP), 총 낭성 질환 유체 단백질(GCDFP-15), ALK, DLK1, FAP, NY-ESO, WT1, HMB-45 항원, 단백질 멜란-A (T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), myo-D1, 근육-특이적 액틴 (MSA), 뉴로필라멘트, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 태반 알칼리성 포스파타제, 시냅토피신, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, AOC3(VAP-1), CAM-3001, CCL11(에오탁신-1), CD125, CD147(바시긴), CD154(CD40L), CD2, CD20, CD23(IgE 수용체), CD25(이종이량체 IL-2 수용체의 서브유닛), CD3, CD4, CD5, IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc 영역, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-6 수용체, 인테그린 α4, 인테그린 α4β7, LFA-1(CD11α), 마이오스타틴, OX-40, 스클레로신, SOST, TGFβ1, TNF-α, VEGF-A, 피루베이트 키나제 동형효소 M2형(종양 M2-PK), CD20, CD5, CD7, CD3, TRBC1, TRBC2, BCMA, CD38, CD123, CD93, CD34, CD1α, SLAMF7/CS1, FLT3, CD33, CD123, TALLA-1, CSPG4, DLL3, 카파 경쇄, 람다 경쇄, CD16/ FcγRIII, CD64, FITC, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2(강글리오시드 G2), GD3, EGFRvIII(표피 성장 인자 변이체 III), EGFR 및 이의 이소변이체, TEM-8, 정자 단백질 17(Sp17), 메소텔린로부터 선택된다.
[0077] 적합한 항원의 추가의 비-제한적 예는 PAP(전립선 산 포스파타제), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 프로스테인, NKG2D, TARP(T 세포 수용체 감마 대체 판독 프레임 단백질), Trp-p8, STEAP1(프로스테이트 1의 6-막관통 상피 항원), 비정상적 라스 단백질, 비정상적 p53 단백질, 인테그린 β3(CD61), 갈락틴, K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten 랫트 육종 바이러스 발암유전자), Ral-B, GPC2, CD276(B7H3), 또는 IL-13Rα를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 Her2이다. 일부 구현예에서, 항원은 ALPPL2이다. 일부 구현예에서, 항원은 BCMA이다. 일부 구현예에서, ECD의 항원-결합 모이어티는 리포터 단백질, 예컨대, GFP 및 eGFP에 특이적이다. 이러한 항원 결합 모이어티의 비-제한적 예는 LaG17 항-GFP 나노바디를 포함한다. 일부 구현예에서, ECD의 항원-결합 모이어티는 항-BCMA 완전-인간화 VH 도메인(FHVH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 신호 조절 단백질 α(SIRPα)이다.
[0078] 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 수용체에 의한 표적화에 적합한 추가 항원은 GPC2, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2/neu), CD276(B7H3), IL-13Rα1, IL-13Rα2, α-페토프로테인(AFP), 암배아 항원(CEA), 암 항원-125(CA-125), CA19-9, 칼레티닌, MUC-1, 상피 막 단백질(EMA), 상피 종양 항원(ETA)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 다른 적합한 표적 항원은 티로시나제, 흑색 종-연관 항원(MAGE), CD34, CD45, CD123, CD93, CD99, CD117, 크로모그라닌, 시토케라틴, 데스민, 신경교섬유성 산성 단백질(GFAP), 총낭성 질환 유체 단백질(GCDFP-15), ALK, DLK1, FAP, NY-ESO, WT1, HMB-45 항원, 단백질 멜란-A(T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), myo-D1, 근-특이적 액틴(MSA), 신경필라멘트, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 태반 알칼리성 포스파타제, 시냅토피신, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[0079] 본원에 개시된 키메라에 의한 표적화에 적합한 추가 항원은 AOC3(VAP-1), CAM-3001, CCL11(에오탁신-1), CD125, CD147(바시긴), CD154(CD40L), CD2, CD20, CD23(IgE 수용체), CD25(IL-2 수용체의 이형화학의 서브유닛), CD3, CD4, CD5, IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc 영역, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-6 수용체, 인테그린 α4, 인테그린 α4β7, LFA-1(CD11α), 마이오스타틴, OX-40, 스클레로신, SOST, TGFβ1, TNF-α, 및 VEGF-A와 같은 염증성 질환과 관련된 것들을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[0080] 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 및 힌지-노치 수용체에 의한 표적화에 적합한 추가 항원은 피루베이트 키나제 동종효소 M2형(종양 M2-PK), CD20, CD5, CD7, CD3, TRBC1, TRBC2, BCMA, CD38, CD123, CD93, CD34, CD1α, SLAMF7/CS1, FLT3, CD33, CD123, TALLA-1, CSPG4, DLL3, 카파 경쇄, 람다 경쇄, CD16/ FcγRIII, CD64, FITC, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2(강글리오시드 G2), GD3, EGFRvIII(표피 성장 인자 변이체 III), EGFR 및 이의 이소변이체, TEM-8, 정자 단백질 17(Sp17), 메소텔린을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 적합한 항원의 추가의 비-제한적 예는 PAP(전립선 산 포스파타제), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 프로스테인, NKG2D, TARP(T 세포 수용체 감마 대체 판독 프레임 단백질), Trp-p8, STEAP1(프로스테이트 1의 6-막관통 상피 항원), 비정상적 라스 단백질, 비정상적 p53 단백질, 인테그린(3(CD61), 갈락틴, K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten 랫트 육종 바이러스 발암유전자), 및 Ral-B를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 GPC2, CD19, Her2/neu, CD276(B7H3), IL-13Rα1, 또는 IL-13Rα2이다. 일부 구현예에서, 항원은 Her2이다. 일부 구현예에서, 항원은 ALPPL2이다. 일부 구현예에서, 항원은 BCMA이다. 일부 구현예에서, ECD의 항원-결합 모이어티는 리포터 단백질, 예컨대, GFP 및 eGFP에 특이적이다. 이러한 항원 결합 모이어티의 비-제한적 예는 LaG17 항-GFP 나노바디를 포함한다. 일부 구현예에서, ECD의 항원-결합 모이어티는 항-BCMA 완전-인간화 VH 도메인(FHVH)을 포함한다.
[0081] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 및 힌지-노치 수용체에 의한 표적화에 적합한 항원은 병원체로부터 유래된 리간드를 포함한다. 예를 들어, 항원은 HER2-양성 유방암 세포에 의해 생성된 HER2일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 B-세포 백혈병에서 발현되는 CD19일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 다형 교모세포종(GBM)에서 발현되지만 건강한 CNS 조직에서는 훨씬 덜 발현되는 EGFR일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 성인의 암, 예를 들어 결장암과 관련된 CEA일 수 있다.
[0082] 일부 구현예에서, ECD의 항원-결합 모이어티는 세포 표면 표적에 특이적이고, 여기서 세포 표면의 비-제한적 예는 CD19, CD30, Her2, CD22, ENPP3, EGFR, CD20, CD52, CD11α, 및 α-인테그린을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 및 힌지-노치 수용체는 CD19, CEA, HER2, MUC1, CD20, ALPPL2, BCMA, 또는 EGFR을 결합하는 항원-결합 모이어티를 갖는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 키메라 폴리펩티드(예를 들어, 힌지-노치 수용체)는 CD19를 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 키메라 폴리펩티드(예를 들어, 힌지-노치 수용체)는 ALPPL2를 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 키메라 폴리펩티드(예를 들어, 힌지-노치 수용체)는 BCMA를 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 키메라 폴리펩티드(예를 들어, 힌지-노치 수용체)는 Her2를 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
[0083] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 및 힌지-노치 수용체는 CD19, ALPPL2, BCMA, 또는 Her2를 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 9-11, 36-38, 및 72 중 하나 이상에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 SEQ ID NO: 9-11, 36-38, 및 72로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 SEQ ID NO: 9-11, 36-38, 및 72로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 SEQ ID NO: 9-11, 36-38, 및 72 중 하나 이상에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 SEQ ID NO: 9-11, 36-38, 및 72로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 9-11, 36-38, 및 72 중 어느 하나에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 아미노산 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다.
힌지 도메인
[0084] 상기 개략된 바와 같이, 본 개시의 키메라의 TMD에 N-말단으로 위치하는 노치 세포외 도메인은 분자간 이황화 결합을 통해 키메라 폴리펩티드의 올리고머 형성을 촉진하는 하나 이상의 폴리펩티드 모티프를 함유하는 올리고머화 도메인(예를 들어, 힌지 도메인)을 포함한다. 이들 경우에, 본원에 개시된 키메라 노치 수용체 내에서, 일반적으로 힌지 도메인은 ECD와 TMD 사이에 배치된 유연성 올리고 또는 폴리펩티드 커넥터 영역을 포함한다. 따라서, 힌지 도메인은 ECD와 TMD 사이에 유연성을 제공하고, 또한 올리고머 복합체를 형성하기 위해 둘 이상의 키메라 폴리펩티드 단량체 사이의 분자간 이황화 결합 부위를 제공한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드의 이량체 형성을 촉진하는 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드의 삼량체 형성을 촉진하는 모티프를 포함한다(예를 들어, OX40으로부터 유래된 힌지 도메인).
[0085] 본 개시의 조성물 및 방법에 적합한 힌지 폴리펩티드 서열은 자연-발생 힌지 폴리펩티드 서열(예를 들어, 자연-발생 면역글로불린으로부터의 것들)일 수 있다. 대안적으로, 힌지 폴리펩티드 서열은 자연-발생 힌지 폴리펩티드 서열에 해당하는 합성 서열일 수 있거나, 완전 합성 힌지 서열일 수 있거나, 요망되는 및/또는 개선된 성질을 제공하기 위해, 예를 들어, 전사 조절을 위해 조작, 설계 또는 변형될 수 있다. 적합한 힌지 폴리펩티드 서열은 IgA, IgD, 및 IgG 서브클래스로부터 유래된 것들, 예컨대, IgG1 힌지 도메인, IgG2 힌지 도메인, IgG3 힌지 도메인, 및 IgG4 힌지 도메인, 또는 이들의 기능적 변이체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 힌지 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 CXXC 모티프를 함유한다. 일부 구현예에서, 힌지 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 CPPC 모티프를 함유한다. 이와 관련하여 추가 정보는, 예를 들어, 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함되는 문헌[Vidarsson G. et al., Frontiers Immunol. October 20, 2014]에 의한 최신 보고에서 찾아볼 수 있다.
[0086] 이에 따라, 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 IgG1 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 IgG2 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 IgG3 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 IgA 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 IgD 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다.
[0087] 본원에 개시된 조성물 및 방법에 적합한 추가 힌지 폴리펩티드 서열은 CD8α 힌지 도메인, CD28 힌지 도메인, CD152 힌지 도메인, PD-1 힌지 도메인, CTLA4 힌지 도메인, OX40 힌지 도메인, FcγRIIIα 힌지 도메인, 및 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 OX40 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 힌지 폴리펩티드 서열을 포함한다.
[0088] 원칙적으로, 유연성과 올리고머화 능력을 부여하는 것 이외에, 힌지 도메인의 길이 및/또는 아미노산 조성에는 특별한 제한이 없다. 그러나, 당업자는 본 개시의 키메라 폴리펩티드의 요망되는 활성을 달성하도록 ECD와 TMD의 상호, 뿐만 아니라 키메라 폴리펩티드 단량체의 상호 배향 및/또는 근접성을 변화시키기 위해 힌지 폴리펩티드 서열의 길이 및 조성을 최적화할 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 일부 구현예에서, 약 1 내지 100 개 아미노산 잔기(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 아미노산 잔기)를 포함한 임의의 어느 단쇄 펩티드가 힌지 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 약 5 내지 50, 약 10 내지 60, 약 20 내지 70, 약 30 내지 80, 약 40 내지 90, 약 50 내지 100, 약 60 내지 80, 약 70 내지 100, 약 30 내지 60, 약 20 내지 80, 약 30 내지 90 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 약 1 내지 10, 약 5 내지 15, 약 10 내지 20, 약 15 내지 25, 약 20 내지 40, 약 30 내지50, 약 40 내지 60, 약 50 내지 70 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 약 40 내지 70, 약 50 내지 80, 약 60 내지 80, 약 70 내지 90, 또는 약 80 내지 100 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 약 1 내지 10, 약 5 내지 15, 약 10 내지 20, 약 15 내지 25 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 약 100 % 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42 중 어느 하나에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 아미노산 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다.
막관통 도메인(TMD)
[0089] 상기 개략된 바와 같이, 본 개시의 키메라 폴리펩티드는 하나 이상의 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위를 포함하는 막관통 도메인을 포함한다.
[0090] 노치 수용체에서 단백질분해 절단 부위(예를 들어, S2 또는 S3)의 예는 상술된 바와 같다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 적합한 추가의 단백질분해 절단 부위는 콜라게나제-1, -2 및 -3(MMP-1, -8 및 -13), 젤라티나제 A 및 B(MMP-2 및 -9), 스트로멜리신 1, 2 및 3(MMP-3, -10 및 -11), 마트릴리신(MMP-7) 및 멤브레인 메탈로프로테이나제(MT1-MMP 및 MT2-MMP)로부터 선택된 MMP에 대한 메탈로프로테이나제 절단 부위를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, MMP-9의 절단 서열은 Pro-X-X-Hy(여기서, X는 임의의 잔기; Hy는 소수성 잔기, 예컨대, Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Tyr, Val, Met, 및 Pro를 나타냄) (SEQ ID NO: 64), 예를 들어, Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr) (SEQ ID NO: 65), 예를 들어, Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser (SEQ ID NO: 66) 또는 Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr (SEQ ID NO: 67)이다. 적합한 프로테아제 절단 부위의 또 다른 예는 플라스미노겐 활성자 절단 부위, 예를 들어, 유로키나제형 플라스미노겐 활성자(uPA) 또는 조직 플라스미노겐 활성자(tPA) 절단 부위이다. 적합한 프로테아제 절단 부위의 또 다른 예는 프로락틴 절단 부위이다. uPA 및 tPA의 절단 서열의 구체적인 예는 Val-Gly-Arg (SEQ ID NO: 68)를 포함하는 서열을 포함한다. 단백질분해적으로 절단 가능한 링커에 포함될 수 있는 또 다른 예시적인 프로테아제 절단 부위는 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, 예를 들어, Glu-Asn-Leu-Tyr-Thr-Gln-Ser (SEQ ID NO: 69)이며, 여기서 프로테아제는 글루타민과 세린 사이를 절단한다. 단백질분해적으로 절단 가능한 링커에 포함될 수 있는 프로테아제 절단 부위의 또 다른 예는 엔테로키나제 절단 부위, 예를 들어, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 70)를 포함하고, 여기서 절단은 리신 잔기 후에 발생한다. 단백질분해적으로 절단 가능한 링커에 포함될 수 있는 프로테아제 절단 부위의 또 다른 예는 트롬빈 절단 부위, 예를 들어, Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 71)이다. 프로테아제 절단 부위를 포함하는 추가의 적합한 링커는 다음 프로테아제에 의해 절단 가능한 서열을 포함한다: PreScission™ 프로테아제(인간 리노바이러스 3C 프로테아제 및 글루타티온-S-트랜스페라제를 포함하는 융합 단백질), 트롬빈, 캅테신 B, 엡스타인-바 바이러스 프로테아제, MMP-3(스트로멜리신), MMP-7(마트릴리신), MMP-9; 서모리신-유사 MMP, 기질 메탈로프로테이나제 2(MMP-2), 캅테신 L; 캅테신 D, 기질 메탈로프로테이나제 l(MMP-l), 유로키나제형 플라스미노겐 활성자(uPA), 멤브레인형 1 기질메탈로프로테이나제(MT-MMP), 스트로멜리신 3(또는 MMP-11), 서몰리신, 섬유아세포 콜라게나제 및 스트로멜리신-1, 기질 메탈로프로테이나제 13(콜라게나제-3), 조직형 플라스미노겐 활성자(tPA), 인간 전립선-특이적 항원, 칼리크레인(hK3), 호중구 엘라스타제, 및 칼페인(칼슘 활성화 중성 프로테아제). 수용체가 발현되는 숙주 세포에 고유하지 않은 프로테아제(예를 들어, TEV)는 추가 조절 메카니즘으로 사용될 수 있으며, 이러한 메카니즘에서는 프로테아제가 발현되거나 달리 제공될 때까지 힌지-노치의 활성화가 가능하지 않다. 추가적으로, 프로테아제는 종양-관련 또는 질환-관련(정상 조직에서보다 훨씬 더 높은 정도로 발현됨)일 수 있고, 독립적인 조절 메카니즘의 역할을 한다. 예를 들어, 일부 기질 메탈로프로테아제는 특정 암 유형에서 고도로 발현된다.
[0091] 일반적으로, 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 및 힌지-노치 수용체에 적합한 TMD는 적어도 하나의 γ-세크레타제 절단 부위를 포함하는 1형 막관통 수용체의 임의의 막관통 도메인일 수 있다. γ-세크레타제 복합체뿐만 아니라 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 및 노치를 포함하는 이의 기질 단백질의 구조 및 기능에 대한 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌[Zhang et al., Frontiers Cell Neurosci (2014)]의 최근 보고에서 찾아볼 수 있다. 1형 막관통 수용체로부터의 비-제한적인 적합한 TMD는 CLSTN1, CLSTN2, APLP1, APLP2, LRP8, APP, BTC, TGBR3, SPN, CD44, CSF1R, CXCL16, CX3CL1, DCC, DLL1, DSG2, DAG1, CDH1, EPCAM, EPHA4, EPHB2, EFNB1, EFNB2, ErbB4, GHR, HLA-A, 및 IFNAR2로부터의 것들을 포함하고, 여기서 TMD는 적어도 하나의 γ-세크레타제 절단 부위를 포함한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 적합한 추가의 TMD는 1형 막관통 수용체 IL1R1, IL1R2, IL6R, INSR, ERN1, ERN2, JAG2, KCNE1, KCNE2, KCNE3, KCNE4, KL, CHL1, PTPRF, SCN1B, SCN3B, NPR3, NGFR, PLXDC2, PAM, AGER, ROBO1, SORCS3, SORCS1, SORL1, SDC1, SDC2, SPN, TYR, TYRP1, DCT, VASN, FLT1, CDH5, PKHD1, NECTIN1, PCDHGC3, NRG1, LRP1B, CDH2, NRG2, PTPRK, SCN2B, Nradd, 및 PTPRM으로부터의 막관통 도메인을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 또는 노치 수용체의 TMD는 알카데인 알파 및 알카데인 감마와 같은 칼신테닌 계열의 구성원의 TMD로부터 유래된 TMD이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 또는 노치 수용체의 TMD는 노치 수용체로 공지된 TMD이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 또는 노치 수용체의 TMD는 상이한 노치 수용체로부터 유래된 TMD이다. 예를 들어, 인간 노치1에 기반한 힌지-노치 수용체에서, 노치1 TMD는 노치2 TMD, 노치3 TMD, 노치4 TMD, 또는 비-인간 동물, 예컨대, 다니오 레리오(Danio rerio), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster), 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis), 또는 갈루스 갈루스(Gallus gallus)로부터의 노치 TMD로 치환될 수 있다.
[0092] 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 17, 77, 및 78 중 하나 이상에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 17, 77, 및 78로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 17, 77, 및 78로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 17, 77, 및 78 중 하나 이상에 대해 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 17, 77, 및 78로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 17, 77, 및 78 중 어느 하나에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 아미노산 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, TMD 내의 아미노산 치환(들)은 TMD의 "GV" 모티프 내에 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 그러한 치환(들) 중 적어도 하나는 알라닌에 대한 치환이다. 예를 들어, 서열 FMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (SEQ ID NO: 17)뿐만 아니라 SEQ ID NO: 77 또는 78에 기재된 서열의 아미노산 잔기 중 1, 2, 3, 4, 5 개 이상의 아미노산 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 17 내의 "GV" 모티프의 위치 18 및/또는 19에서 아미노산 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 17의 위치 18에서 글리신 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 17의 위치 19에서 발린 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 17의 위치 18에 상응하는 위치에 돌연변이, 예컨대, G18A 돌연변이로 SEQ ID NO: 17에 상응하는 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 17의 위치 19에 상응하는 위치에 돌연변이, 예컨대, V19A 돌연변이로 SEQ ID NO: 17에 상응하는 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
이동 정지 서열
[0093] 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 및 힌지-노치 수용체는 TMD에 C-말단으로 위치한 고전하 도메인을 구성하는 이동 정지 서열(STS)을 포함한다. 임의의 특정 이론으로 국한되지 않으면서, TMD와 ICD 사이에 배치된 이러한 고전하 도메인은 ICD가 막에 진입하는 것을 방지한다. STS는 TMD 및 ICD에, N-말단으로부터 C-말단으로, TMD-STS-ICD의 순서로 연결된다. 원칙적으로, STS의 길이 및/또는 아미노산 조성에는 특별한 제한이 없다. 일부 구현예에서, 약 4 내지 약 40 개 아미노산 잔기(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 등 아미노산 잔기)를 포함한 임의의 어느 단쇄 펩티드가 STS로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, STS는 약 4 내지 15, 약 6 내지 20, 약 8 내지 25, 약 10 내지 30, 약 12 내지 35, 약 14 내지 40, 약 5 내지 40, 약 10 내지 35, 약 15 내지 30, 약 20 내지 25, 약 20 내지 40, 약 10 내지 30, 약 4 내지 20, 또는 약 5 내지 25 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 약 4 내지 10, 약 5 내지 12, 약 6 내지 14, 약 7 내지 18, 약 8 내지 20, 약 9 내지 22, 약 10 내지 24, 또는 약 11 내지 26 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 약 4 내지 10 개의 잔기, 예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
[0094] 일부 구현예에서, STS는 노치1, 노치2, 노치3, 노치4, CLSTN1, CLSTN2, CSF1R, CXCL16, DAG1, GHR, PTPRF, AGER, KL, NRG1, LRP1B, Jag2, EPCAM, KCNE3, CDH2, NRG2, PTPRK, BTC, EPHA3, IL1R2, 또는 PTPRM으로부터 STS 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 처음 4 개의 잔기에 Lys (K) 또는 Arg (R)만을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 1, 2, 3, 4, 5 개 이상의 염기성 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 5, 4, 3, 2, 1, 0 개의 방향족 잔기 또는 소수성 및/또는 벌키한 측쇄를 갖는 잔기를 포함한다.
[0095] 일부 구현예에서, STS는 서열 목록에 SEQ ID NO: 18 내지 19, 43-63, 79, 및 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 SEQ ID NO: 18 내지 19, 43 내지 63, 79, 및 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 SEQ ID NO: 18 내지 19, 43 내지 63, 79, 및 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 SEQ ID NO: 18 내지 19, 43 내지 63, 79, 및 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 SEQ ID NO: 18 내지 19, 43-63, 79, 및 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 18 내지 19, 43-63, 79, 및 80 중 어느 하나에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 아미노산 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, STS는 노치1, 노치2, 노치3, 노치4, CLSTN1, CLSTN2, JAG2, PTPRF, LRP1B, NRG2, KCNE2, KCNE3, KCNE4, AGER, PKHD1, GHR, PTPRM, DAG1, NRG1, EPCAM, KL, PTPRK, CXCL16, 또는 표 3 및 4에 열거된 어느 하나로부터의 STS 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예컨대, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 처음 4 개의 잔기에 Lys (K) 또는 Arg (R)만을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 1, 2, 3, 4, 5 개 이상의 염기성 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, STS는 5, 4, 3, 2,1, 0 개의 방향족 잔기 또는 소수성 및/또는 벌키한 측쇄를 갖는 잔기를 포함한다.
세포내 도메인
[0096] 본 개시의 키메라 폴리펩티드 및 힌지-노치 수용체는 전사 조절자를 포함한다. 본 개시의 전사 조절자는 프로모터-구동 DNA 서열의 전사를 활성화하거나 억제하는 작용을 하는 폴리펩티드 요소이다. 본 개시의 조성물 및 방법에 적합한 전사 조절자는 자연-발생 전사 조절자일 수 있거나, 요망되는 및/또는 개선된 성질, 예컨대, 전사 조절을 제공하도록 조작, 설계, 또는 변형될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 본 개시의 조작된 수용체는 이들이 조작된 세포에서 맞춤형 전사 프로그램을 촉발시키는 능력을 제공할 수 있다는 점에서 유리하다. 일부 구현예에서, 본 개시의 전사 조절자는 조작된 세포에서 한 번만 나타나는 특정 서열의 전사를 유도하는 맞춤형 전사 조절자이다.
[0097] 일부 구현예에서, 전사 조절자는 세포의 분화를 직접적으로 조절한다. 일부 구현예에서, 전사 조절자는 두 번째 전사 인자의 발현을 조절함으로써 세포의 분화를 간접적으로 조정(예를 들어, 조절)한다. 전사 조절자가 전사 활성자 또는 전사 억제제가 될 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 전사 조절자는 전사 억제자이다. 일부 구현예에서, 전사 조절자는 전사 활성자이다. 일부 구현예에서, 전사 조절자는 핵 국재화 신호를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 조절자는 Gal4-VP16, Gal4-VP64, tetR-VP64, ZFHD1-VP64, Gal4-KRAB, 및 HAP1-VP16으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전사 조절자는 Gal4-VP64이다.
[0098] 본 개시의 키메라 폴리펩티드 및 힌지-노치 수용체는, 일반적으로 약 100 아미노산 (aa) 내지 약 1000 aa, 예를 들어, 약 100 aa 내지 약 200 aa, 약 150 aa 내지 약 250 aa, 약 200 aa 내지 약 300 aa, 약 250 aa 내지 약 350 aa, 약 300 aa 내지 약 400 aa, 약 350 aa 내지 약 450 aa, 약 400 aa 내지 약 500 aa 길이인 키메라 폴리펩티드를 포함하여, 임의의 길이의 키메라 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 키메라 폴리펩티드는 일반적으로 약 400 aa 내지 약 450 aa, 약 450 aa 내지 약 500 aa, 약 500 aa 내지 약 550 aa, 약 550 aa 내지 약 600 aa, 약 600 aa 내지 약 650 aa, 약 650 aa 내지 약 700 aa, 약 700 aa 내지 약 750 aa, 약 750 aa 내지 약 800 aa, 약 800 aa 내지 약 850 aa, 약 850 aa 내지 약 900 aa, 약 900 aa 내지 약 950 aa, 또는 약 950 aa 내지 약 1000 aa 길이이다. 일부 경우에, 본 개시의 키메라 폴리펩티드는 약 300 aa 내지 약 400 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 개시의 키메라 폴리펩티드는 약 300 aa 내지 약 350 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 개시의 키메라 폴리펩티드는 약 300 aa 내지 약 325 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 개시의 키메라 폴리펩티드는 약 350 aa 내지 약 400 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 개시의 키메라 폴리펩티드는 약 750 aa 내지 약 850 aa의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드는 약 525 aa, 약 538 aa, 약 539 aa, 약 542 aa, 약 550 aa, 약 556 aa, 또는 약 697 aa의 길이를 갖는다.
추가 도메인
[0099] 일부 구현예에서, TMD에 N-말단으로 위치된 노치 세포외 도메인은 추가 도메인, 예를 들어, 막 국재화 신호, 예컨대, CD8A 신호, 검출 가능한 마커, 예컨대, myc 태그 또는 his 태그 등을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 특정 이론으로 국한되지 않으면서, 힌지 도메인에 N-말단으로 추가 도메인을 도입하는 것이 유익할 수 있다. 이는, 벌크 특징(예컨대, NRR)을 TMD에 인접하게 도입하는 것이, 충분히 멀리 이격되어 있지 않으면, 활성에 영향을 미칠 것이기 때문이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 폴리펩티드 및 힌지노치 수용체는 하나 이상의 추가 특징, 예컨대, 예컨대, 신호 서열, 검출 가능한 표지, 종양-특이적 절단 부위, 질환-특이적 절단 부위, 또는 이들의 조합을 포함하도록 추가로 조작될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 몇몇 프로테아제(예컨대, 기질 메탈로프로테아제)는 암에서 상향조절되어, 특정 절단 부위를 통해서가 아니라 더 높은 수준의 특정 프로테아제를 통해서 종양-특이적 절단 특이성을 가능하게 한다. 이와 관련하여 추가 정보는, 예를 들어, 인용에 의해 본원에 포함되는 문헌[J.S. Dudani et al., Annu. Rev. Cancer Biol. (2018), 2:353-76]에서 찾아볼 수 있다.
[0100] 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체는 (a) SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 힌지 도메인; (b) SEQ ID NO: 17, 77, 및 78 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인; 및 (c) SEQ ID NO: 18 내지 19, 43 내지 63, 79, 및 80 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이동 정지 서열 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체는 (a) SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 힌지 도메인; (b) SEQ ID NO: 17, 77, 및 78 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인; 및 (c) SEQ ID NO: 18 내지 19, 43 내지 63, 79, 및 80 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이동 정지 서열 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체는 (a) SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 힌지 도메인; (b) SEQ ID NO: 17, 77, 및 78 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인; 및 (c) SEQ ID NO: 18 내지 19, 43 내지 63, 79, 및 80 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이동 정지 서열 도메인을 포함한다.
[0101] 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드는 본원에 개시된 키메라 수용체에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 목록에서 확인되는 SEQ ID NO: 1 내지 8, 24 내지 35, 및 73 내지 76 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 6에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 8에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 24에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 25에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 26에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 27에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 28에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 31에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 32에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 33에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 73에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 74에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 75에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 76에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
핵산 분자
[0102] 또 다른 양태에서, 발현 카세트들을 포함하는, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 및 힌지-노치 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다양한 핵산 분자, 및 예를 들어, 숙주 세포에서 수용체의 생체내 발현을 가능하게 하는 조절 서열과 같이 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 이들 핵산 분자들을 함유하는 발현 벡터가 본원에 제공된다.
[0103] 본 개시의 핵산 분자는, 예를 들어, 약 1.5 Kb 내지 약 50 Kb, 약 5 Kb 내지 약 40 Kb, 약 5 Kb 내지 약 30 Kb, 약 5 Kb 내지 약 20 Kb, 또는 약 10 Kb 내지 약 50 Kb, 예를 들어, 약 15 Kb 내지 30 Kb, 약 20 Kb 내지 약 50 Kb, 약 20 Kb 내지 약 40 Kb, 약 5 Kb 내지 약 25 Kb, 또는 약 30 Kb 내지 약 50 Kb를 포함하는 임의의 길이일 수 있다.
[0104] 일부 구현예에서, N-말단에서부터 C-말단으로, (a) 선택된 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 세포외 리간드-결합 도메인; (b) 분자간 이황화 결합을 통해 키메라 폴리펩티드의 올리고머 형성을 촉진할 수 있는 힌지 도메인; (c) 하나 이상의 리간드-유도성 단백질분해성 절단 부위를 포함하는 막관통 도메인; 및 (d) 전사 조절자를 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 선택된 리간드에 대한 결합은 전사 조절자와 힌지 도메인 사이에 배치된 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위에서 절단을 유도하며, 키메라 폴리펩티드는 LIN-12-노치 반복부(LNP) 및/또는 노치 수용체의 이종이량체화 도메인(HD)을 포함하지 않는, 핵산 분자가 본원에 제공된다.
[0105] 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 발현 카세트 또는 발현 벡터에 도입된다. 일반적으로, 발현 카세트는, 수용 세포에서, 생체 내에서 및/또는 생체 외에서 코딩 서열의 적절한 전사 및/또는 번역을 지시하기에 충분한 조절 정보 및 코딩 서열을 포함하는 유전 재료의 작제물을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 일반적으로, 발현 카세트는 요망되는 숙주 세포 및/또는 개체를 표적화하기 위한 벡터에 삽입될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시의 발현 카세트는, 본원에 개시된 바와 같은 키메라 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하고, 이는 발현 제어 요소, 예컨대, 프로모터, 및 임의로 코딩 서열의 전사 또는 번역에 영향을 주는 다른 핵산 서열 중 어느 것 또는 이의 조합에 작동 가능하게 연결된다.
[0106] 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 도입된다. 용어 "벡터"는 일반적으로 숙주 세포들 사이의 전달을 위해 설계된 재조합 폴리뉴클레오티드 작제물을 지칭하고, 이는 형질전환 목적, 예를 들어, 숙주 세포로의 이종성 DNA의 도입을 위해 사용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 벡터는 또 다른 DNA 세그먼트가 삽입된 세그먼트의 복제를 야기하기 위해 삽입될 수 있는 레플리콘, 예컨대, 플라스미드, 파지, 또는 코스미드일 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 통합 벡터일 수 있다.
[0107] 일부 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 당업자에 의해 인지될 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 일반적으로 핵산 분자로의 전달, 또는 세포의 게놈으로의 통합을 용이하게 하는 바이러스-유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 전달 플라스미드) 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자를 지칭하기 위해 광범위하게 사용된다. 바이러스 입자는 일반적으로 다양한 바이러스 구성요소를 포함할 것이고, 때로는 또한 핵산(들) 이외에 숙주 세포 구성요소를 포함할 것이다. 용어 바이러스 벡터는 핵산을 세포 내로 또는 전달된 핵산 자체로 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전 요소를 함유한다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능적 유전 요소 또는 이의 부분을 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 레트로바이러스 속인 레트로바이러스로부터 주로 유래된 LTR을 포함하는 구조적 및 기능적 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다.
[0108] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 수용체에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 서열 목록에서 확인되는 SEQ ID NO: 1 내지 8, 24 내지 35, 및 73 내지 76 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 5에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 6에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 7에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 8에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 24에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 25에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 26에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 27에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 28에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 29에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 31에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 32에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 33에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 35에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 73에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 74에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 75에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 76에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다.
[0109] 키메라 수용체를 인코딩하는 핵산 서열은 관심 있는 숙주 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다. 예를 들어, 서열의 G-C 함량은 숙주 세포에서 발현된 공지된 유전자에 대한 참조에 의해 계산하는 경우 주어진 세포 숙주에 대해 평균 수준으로 조절될 수 있다. 코돈 사용 최적화를 위한 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 본원에 개시된 키메라 수용체의 코딩 서열 내 코돈 사용량은 코딩 서열 내 코돈의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 최대 100%가 특정 숙주 세포에서의 발현에 최적화되도록 숙주 세포에서의 발현을 향상시키도록 최적화될 수 있다.
[0110] 본원에 개시되는 일부 구현예는 본원에 개시된 키메라 수용체를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 발현 카세트에 관한 것이다. 일반적으로, 발현 카세트는, 수용 세포에서, 생체 내에서 및/또는 생체 외에서 코딩 서열의 적절한 전사 및/또는 번역을 지시하기에 충분한 조절 정보 및 코딩 서열을 함유한다. 발현 카세트는 요망되는 숙주 세포를 표적화하기 위한 벡터 및/또는 개체로 삽입될 수 있다. 발현 카세트는, 하나 이상의 핵산 서열이 기능적으로 작동하는 방식으로 연결되는, 즉, 작동 가능하게 연결되는 핵산 분자를 포함하는 게놈 통합 또는 자가 복제가 가능한 임의의 공급원으로부터 유래된 선형 또는 원형, 단일-가닥 또는 이중-가닥, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 분자로서, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자가 복제 폴리뉴클레오티드 분자, 파지로 삽입될 수 있다.
[0111] 본원에 개시된 임의의 키메라 수용체 또는 힌지-노치 수용체를 인코딩하는 핵산 분자 중 하나 이상을 함유하는 벡터, 플라스미드, 또는 바이러스가 또한 본원에 제공된다. 핵산 분자는, 예를 들어, 벡터로 형질전환/형질도입된 세포에서 이들의 발현을 지시할 수 있는 벡터 내에 함유될 수 있다. 진핵 세포 및 원핵 세포에서 사용하기에 적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 상업적으로 입수 가능하거나 또는 당업자에 의해 용이하게 제조된다. 예를 들어, 개시 내용이 인용에 의해 본원에 포함되는 문헌[Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory (jointly referred to herein as "Sambrook"); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (including supplements through 2014); Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss; Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego: Academic Press; Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA: Academic Press; Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K. B., Ferr
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, F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E. A.　(2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley, (including supplements through 2014); 및 Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.]을 참조한다.
[0112] DNA 벡터는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법들을 통해 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키기에 적합한 방법은 문헌[Sambrook et al. (2012, 상기)]에서 찾아볼 수 있고, 다른 표준 분자 생물학 실험실 매뉴얼, 예컨대, 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 형질감염, 미세주입, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크레이프 로딩, 탄도 도입, 뉴클레오포레이션, 유체 역학적 충격 및 감염이 있다.
[0113] 본 개시에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40), 및 소 유두종 바이러스 벡터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조). 예를 들어, 본원에 개시되는 바와 같은 키메라 수용체는 진핵생물 숙주, 예컨대, 포유동물 세포(예를 들어, COS 세포, NIH 3T3 세포, 또는 HeLa 세포)에서 생성될 수 있다. 이들 세포는 미국형 배양물 보관소(Manassas, VA)를 포함하여 다수의 공급업체로부터 입수 가능하다. 발현 시스템을 선택할 때, 구성요소들이 서로 호환 가능하다는 것을 보장하기 위해 주의를 기울여야 한다. 당업자는 그러한 결정을 할 수 있다. 또한, 발현 시스템을 선택할 때 지침이 필요한 경우, 당업자는 문헌[P. Jones, "Vectors: Cloning Applications" John Wiley and Sons, New York, N.Y., 2009)]을 참조할 수 있다.
[0114] 제공된 핵산 분자는 자연 발생 서열 또는 자연 발생하는 것들과는 상이하지만 유전 코드의 축퇴성으로 인해 동일한 폴리펩티드, 예를 들어, 항체를 인코딩할 수 있는 것들과 상이한 서열을 함유할 수 있다. 이들 핵산 분자는 RNA 또는 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, 또는 합성 DNA, 예컨대, 포스포라미다이트-기반 합성에 의해 생성된 것), 또는 이들 유형의 핵산 내 뉴클레오티드의 조합 또는 변형으로 이루어질 수 있다. 또한, 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥(예를 들어, 센스 또는 안티센스 가닥)일 수 있다.
[0115] 핵산 분자는 폴리펩티드(예를 들어, 항체)를 인코딩하는 서열로 제한되지 않으며; 코딩 서열의 상류 또는 하류에 있는 비-코딩 서열의 일부 또는 전부(예를 들어, 키메라 수용체의 코딩 서열)가 또한 포함될 수 있다. 분자 생물학 분야의 당업자는 핵산 분자들을 단리하기 위한 일상적인 절차들에 익숙하다. 이들은, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제로의 게놈 DNA의 처리에 의해, 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 성능에 의해 생성될 수 있다. 핵산 분자가 리보핵산(RNA)인 경우, 분자들은, 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다.
재조합 세포 및 세포 배양
[0116] 본 개시의 핵산은, 핵산 분자를 함유하는 재조합 세포를 생성하기 위해, 예를 들어, 인간 T 림프구와 같은 숙주 세포로 도입될 수 있다. 따라서, 본 개시의 일부 구현예는 재조합 세포를 제조하기 위한 방법으로서, (a) 단백질 발현이 가능한 세포를 제공하는 단계, 및 (b) 제공된 세포를 본 개시의 재조합 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
[0117] 본 개시의 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 것은, 예를 들어, 바이러스 감염, 형질감염, 접합, 프로토플라스트 융합, 리포펙션, 전기천공법, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포좀-매개 형질감염, 입자총 기법, 인산칼슘 침전, 직접 미량주사법, 나노입자-매개 핵산 전달 등과 같은 당업자에게 공지된 방법들에 의해 달성될 수 있다.
[0118] 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 분자는 당업계에 공지된 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 숙주 게놈에 안정적으로 통합될 수 있거나, 일시적 발현을 위한 미니-서클 발현 벡터로서 재조합 숙주 세포를 에피솜으로 복제하거나 또는 재조합 숙주 세포에 존재할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 분자는 재조합 숙주 세포에서 에피솜 단위로서 유지되고 복제된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 재조합 세포의 게놈 내에 안정적으로 통합된다. 안정적인 통합은 고전적인 랜덤 게놈 재조합 기법들을 사용하거나, 보다 정확한 기법들, 예컨대, 가이드 RNA-지정 CRISPR/Cas9 게놈 편집, 또는 NgAgo(Natronobacterium gregoryi Argonaute; 나트로노박테리움 그레고리 아르고노테)를 이용한 DNA-가이드 엔도뉴클레아제 게놈 편집, 또는 TALEN 게놈 편집( t ranscription a ctivator- l ike e ffector n uclease; 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제)을 이용하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 일시적 발현을 위한 미니-서클 발현 벡터로서 재조합 숙주 세포에 존재한다.
[0119] 핵산 분자는 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자로 캡슐화될 수 있거나, 전기천공과 같은 당업계에 공지된 바이러스 또는 비-바이러스 전달 수단 및 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 세포 내로의 핵산의 도입은 바이러스 형질도입에 의해 달성될 수 있다. 비-제한적 예에서, 아데노-관련 바이러스(AAV)는 바이러스 형질도입을 통해 표적 세포로 핵산을 전달하도록 조작된다. 여러 AAV 혈청형들이 기재되었고, 공지된 모든 혈청형들이 다수의 다양한 조직형들로부터 세포를 감염시킬 수 있다. AAV는 독성의 증거없이, 생체 내에서 광범위한 종 및 조직을 형질도입할 수 있고, 이는 비교적 온화한 선천성 및 적응성 면역 반응들을 생성한다.
[0120] 렌티바이러스-유래 벡터 시스템은 또한 핵산 전달 및 바이러스 형질도입을 통한 유전자 요법에 유용하다. 렌티바이러스 벡터는 (i) 숙주 게놈 내로의 안정적인 벡터 통합을 통한 지속된 유전자 전달; (ii) 분열 및 비-분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력; (iii) 중요한 유전자- 및 세포-요법-표적 세포형들을 포함하는 넓은 조직 트로피즘; (iv) 벡터 형질도입 이후의 바이러스 단백질의 발현 없음; (v) 복합적 유전 요소, 예컨대, 폴리시스트로닉 또는 인트론-함유 서열을 전달하는 능력; (vi) 잠재적으로 더 안전한 통합 부위 프로파일; 및 (vii) 벡터 조작 및 생성을 위한 비교적 용이한 시스템을 포함하여, 유전자-전달 비히클로서 여러 매력적인 성질들을 제공한다.
[0121] 일부 구현예에서, 숙주 세포는, 예를 들어, 바이러스 벡터 또는 숙주 세포의 게놈의 일부에 상동성인 핵산 서열을 포함하는 상동성 재조합을 위한 벡터일 수 있는 본 출원의 벡터 작제물로 유전적으로 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)될 수 있거나, 관심 있는 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 벡터일 수 있다. 숙주 세포는 비변형 세포일 수 있거나 적어도 하나의 핵산 분자로 이미 형질감염된 세포일 수 있다.
[0122] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체 내에 있다. 일부 구현예에서, 세포는 생체 외에 있다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관 내에 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-인간 영장류 세포이다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 면역 세포, 뉴런, 상피 세포, 및 내피 세포, 또는 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 면역계 세포, 예를 들어, 림프구(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포), 또는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 B 세포, 단핵구, 자연 살해(NK) 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 수지상 세포, 대식세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포(TH), 세포독성 T 세포(TCTL), 또는 다른 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역계 세포는 T 림프구이다.
[0123] 일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 조혈 줄기 세포이다. 세포의 일부 구현예에서, 세포는 림프구이다. 일부 구현예에서, 세포는 전구체 T 세포 또는 T 조절(Treg) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD34+, CD8+, 또는 CD4+ 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중앙 메모리 CD8+ T 세포, 이펙터 메모리 CD8+ T 세포, 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 세포의 일부 구현예에서, 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중앙 메모리 CD4+ T 세포, 이펙터 메모리 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 얻어진 샘플에 대해 수행되는 백혈구형성증에 의해 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 환자이다.
[0124] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 본원에 개시된 바와 같은 제1 및 제2 핵산 분자를 추가로 포함하며, 여기서 제1 핵산 분자와 제2 핵산 분자는 동일한 서열을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 본원에 개시된 바와 같은 제1 및 제2 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체를 추가로 포함하며, 여기서 제1 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체 및 제2 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체는 동일한 서열을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체는 제2 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체의 발현 및/또는 활성을 조절한다.
[0125] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 관심 있는 단백질을 인코딩하는 발현 카세트를 추가로 포함하며, 여기서 관심 있는 단백질의 발현은 키메라 수용체 전사 조절자에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 관심 있는 단백질은 재조합 세포에 대해 이종성이다. 이종성 단백질은 세포에서 정상적으로 발견되지 않는, 예를 들어, 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않는 것이다. 원칙적으로, 발현이 키메라 수용체 전사 조절자에 의해 조절될 수 있는 적합한 단백질에 대해서는 특별한 제한이 없다. 본원에 개시된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 예시적인 유형의 단백질은 사이토카인, 세포독소, 케모카인, 면역조절제, 친-아폽토시스 인자, 항-아폽토시스 인자, 호르몬, 분화 인자, 탈분화 인자, 면역 세포 수용체, 또는 리포터를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포 수용체는 T-세포 수용체(TCR)이다. 일부 구현예에서, 면역 세포 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 관심 있는 단백질을 인코딩하는 발현 카세트는 본 개시의 키메라 수용체를 인코딩하는 것과 동일한 핵산 분자에 도입된다. 일부 구현예에서, 관심 있는 단백질을 인코딩하는 발현 카세트는 본 개시의 키메라 수용체를 인코딩하는 핵산 분자로부터 분리된 제2 발현 벡터로 도입된다. 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포, 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 본원에 제공된다. 일반적으로, 배양 배지는 본원에 기재된 세포를 배양하기 위한 임의의 적합한 배양 배지일 수 있다. 매우 다양한 싱기 언급된 숙주 세포 및 종을 형질전환시키기 위한 기법들이 당업계에 공지되어 있으며, 기술 및 과학 문헌에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포를 포함하는 세포 배양물이 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 세포 배양물을 생성하고 유지하기에 적합한 방법 및 시스템이 당업계에 공지되어 있다.
약학적 조성물
[0126] 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 및 재조합 세포는 약학적 조성물을 포함하는 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 핵산 및/또는 재조합 세포, 및 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 담체를 포함한다.
[0127] 주사용으로 적합한 약학적 조성물은 멸균 주사가능 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산물 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, 크레모포어 (Cremophor) EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균성이어야 하며, 용이한 주사기주입가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하며, 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는 용매 또는 분산매일 수 있고, 이것은, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 적당한 이의 혼합물을 함유한다. 적절한 유체성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우에 요구된 입도의 유지에 의해 및 계면활성제, 예를 들어, 소듐 도데실 설페이트의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에서 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 일반적일 것이다. 주사가능 조성물의 장기적인 흡수는 흡수를 지연하는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함하여 일어날 수 있다.
[0128] 멸균 주사가능한 용액은 활성 화합물을 요구되는 양으로 적절한 용매에서 상기 열거된 성분 중 1종 또는 조합으로 혼입시킨 후, 필요에 따라, 여과 멸균에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다.
[0129] 일부 구현예에서, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 및 노치 수용체는 또한 문헌[McCaffrey et al. (Nature 418:6893, 2002), Xia et al. (Nature Biotechnol. 20:1006-10, 2002), 또는 Putnam (Am. J. Health Syst. Pharm. 53:151-60, 1996, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53:325, 1996)]에 기재된 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법들을 이용하여 형질감염 또는 감염에 의해 투여될 수 있다.
본 개시의 방법
[0130] 본원에 기재된 치료적 조성물 중 어느 하나, 예를 들어, 핵산, 재조합 세포, 및 약학적 조성물의 투여는 관련된 건강 상태 또는 질환, 예컨대, 암 및 만성 감염에 대하여 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산, 재조합 세포, 및 약학적 조성물은 체크포인트 억제와 관련된 하나 이상의 자가면역 장애 또는 질환을 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 이를 발병할 위험이 높을 수 있는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 치료제에 혼입될 수 있다. 예시적인 자가면역 장애 및 질환은, 제한 없이, 셀리악병, 1형 당뇨병, 그레이브스 병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 및 전신 홍반 루푸스를 포함할 수 있다.
[0131] 따라서, 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 개체에서 표적 세포의 활성을 억제하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법이 본원에 개시된 바와 같은 핵산, 재조합 세포, 및 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 제1 요법제를 개체에 투여하는 것을 포함하고, 상기 제1 요법제는 표적 세포를 억제하는, 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 표적 세포는 이의 증식이 감소되는 경우, 이의 병리학적 또는 병원성 거동이 감소되는 경우, 파괴되거나 사멸되는 경우 등에 억제될 수 있다. 억제는 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 측정된 병리학적 또는 병원성 거동의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 개시된 유효수의 재조합 세포를 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 재조합 세포는 개체에서 표적 세포의 활성을 억제한다. 일반적으로, 개시된 방법의 표적 세포는 개체에서 임의의 세포 유형일 수 있으며, 예를 들어, 급성 골수종 백혈병 세포, 역형성 림프종 세포, 성상세포종 세포, B-세포 암 세포, 유방암 세포, 결장암 세포, 뇌실막 세포, 식도암 세포, 교모세포종 세포, 신경교종 세포, 평활근육종 세포, 지방육종 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 외투 세포 림프종 세포, 흑색종 세포, 신경모세포종 세포, 비-소세포성 폐암 세포, 희소돌기아교종 세포, 난소암 세포, 췌장 암세포, 말초 T-세포 림프종 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 위암 세포, 암종 세포, 중피종 세포, 또는 육종 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 병원성 세포이다.
[0132] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 건강 상태(예를 들어, 질환)의 치료를 필요로 하는 개체에서 건강 상태(예를 들어, 질환)를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 본원에 개시된 바와 같은 키메라 폴리펩티드 또는 힌지 노치 수용체 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약학적 조성물을 포함하는 재조합 세포 중 하나 이상을 포함하는 제1 요법제를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 제1 요법제가 개체에서 건강 질환을 치료하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 개시된 바와 같은 유효량의 재조합 세포를 포함하는 제1 요법제를 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 재조합 세포는 건강 질환을 치료한다.
[0133] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 건강 상태(예를 들어, 질환)의 치료를 보조하는 것을 필요로 하는 개체에서 건강 상태(예를 들어, 질환)의 치료를 보조하는 방법으로서, 상기 방법이 본원에 개시된 바와 같은 키메라 폴리펩티드, 힌지 노치 수용체, 핵산, 재조합 세포, 및 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 제1 요법제, 및 제2 요법제를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 제1 및 제2 요법제가 함께 개체에서 질환을 치료하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 개시된 바와 같은 유효량의 재조합 세포를 포함하는 제1 요법제를 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 재조합 세포는 건강 질환을 치료한다.
개체에게 대한 재조합 세포 투여
[0134] 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 유효량의 본 개시의 재조합 세포를 그러한 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 이러한 투여 단계는 당업계에서 임의의 이식 전달 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 재조합 세포는 개체의 혈류에 직접 주입될 수 있거나, 달리 개체에 투여될 수 있다.
[0135] 일부 구현예에서, 본원에 개시되는 방법은 요망되는 효과(들)가 야기되는 요망되는 부위에서 도입된 세포의 적어도 부분적 국소화를 일으키는 방법 또는 경로에 의해 개체에 재조합 세포를 "도입", "임플란팅", 및 "이식"이라는 용어와 상호 교환 가능하게 사용되는 용어인 투여하는 것을 포함한다. 재조합 세포 또는 이들의 분화된 자손은 투여되는 세포의 적어도 일부 또는 세포의 구성요소가 생존 가능한 상태로 유지되는 개체에서 요망되는 위치로의 전달을 야기하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체에 투여한 후 세포의 생존 기간은 수시간, 예를 들어, 24 시간만큼 짧게부터 수일까지, 수년 또는 심지어 개체의 일생, 즉, 장기간 생착만큼 길 수 있다.
[0136] 예방적으로 제공될 때, 본원에 기재된 재조합 세포는 치료될 질환 또는 질병의 임의의 증상에 앞서 개체에 투여될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서 재조합 세포 집단의 예방적 투여는 질병 또는 질환의 증상들의 발생을 예방한다.
[0137] 치료적으로 제공될 때, 일부 구현예에서, 재조합 세포는, 예를 들어, 질환 또는 질병의 증상 또는 징후 발병 시(또는 그 후에), 예를 들어, 또는 질환 또는 질병의 발병 시에 제공된다.
[0138] 본원에 기재된 다양한 구현예에 사용하기 위해, 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 재조합 세포는 적어도 102 개 세포, 적어도 5 × 102 개 세포, 적어도 103 개 세포, 적어도 5 × 103 개 세포, 적어도 104 개 세포, 적어도 5 × 104 개 세포, 적어도 105 개 세포, 적어도 2 × 105 개 세포, 적어도 3 × 105 개 세포, 적어도 4 × 105 개 세포, 적어도 5 × 105 개 세포, 적어도 6 × 105 개 세포, 적어도 7 × 105 개 세포, 적어도 8 × 105 개 세포, 적어도 9 × 105 개 세포, 적어도 1 × 106 개 세포, 적어도 2 × 106 개 세포, 적어도 3 × 106 개 세포, 적어도 4 × 106 개 세포, 적어도 5 × 106 개 세포, 적어도 6 × 106 개 세포, 적어도 7 × 106 개 세포, 적어도 8 × 106 개 세포, 적어도 9 × 106 개 세포, 또는 이의 배수일 수 있다. 재조합 세포는 하나 이상의 공여체들로부터 유래될 수 있거나, 자가 공급원으로부터 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 이를 필요로 하는 개체에 투여 전에 배양물에서 확장된다.
[0139] 일부 구현예에서, 방법 또는 경로에 의해 재조합 세포 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 세포에 따른 복수의 재조합 세포를 포함하는 조성물)을 개체로 전달하는 것은 요망되는 부위에 세포 조성물의 적어도 부분적 국소화를 야기한다. 재조합 세포를 포함하는 조성물은 개체에 효과적인 치료를 야기하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있는데, 예를 들어, 투여는 전달되는 조성물의 일부, 예를 들어, 적어도 1 × 104 개 세포가 소정 기간 동안 요망되는 부위로 전달되는 개체에서 요망되는 위치로의 전달을 야기한다. 투여 방식은 주사, 주입, 설치를 포함한다. "주사"는, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 심실내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 내척수내, 및 흉골내 주사와 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 경로는 정맥내이다. 세포의 전달을 위해, 주사 또는 주입에 의한 전달이 바람직한 투여 방식이다.
[0140] 일부 구현예에서, 재조합 세포는, 예를 들어, 주입 또는 주사를 통해, 전신 투여된다. 예를 들어, 재조합 세포의 집단은 표적 부위, 조직, 또는 기관으로의 직접 투여 이외로 투여되며, 따라서 개체의 순환계에 들어감에 따라 대사 및 기타 유사한 과정을 거친다.
[0141] 질환 또는 질병의 치료를 위해 본원에 제공된 임의의 조성물들을 포함하는 치료의 효능은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 당업자는, 질환의 징후 또는 증상 또는 마커 중 어느 하나 또는 전부가 호전되거나 개선될 경우, 치료가 효과적인 것으로 여겨진다는 것을 인지할 것이다. 효능은 또한, 개체가 입원 감소에 의해 평가되는 바와 같이 악화되지 않거나 질환의 의료 개입을 필요로 하지 않음(예를 들어, 질환의 진행이 중단되거나 적어도 느려짐)에 의해 측정될 수 있다. 이들 적응증을 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 치료는 개체 또는 동물(일부 비-제한적 예는 인간 또는 포유동물을 포함함)에서 질환의 임의의 치료를 포함하고, (1) 질환 억제, 예를 들어, 증상의 진행을 정지시키거나 늦춤; 또는 (2) 질환 완화, 예를 들어 증상의 퇴행을 유발함; 및 (3) 증상의 발생 가능성을 예방하거나 낮춤을 포함한다.
[0142] 상기 논의된 바와 같이, 치료적 유효량은 개체에게, 예컨대, 질환을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 이에 대한 위험이 있는 개체에 투여될 때 특정의 유익한 효과를 촉진시키기에 충분한 치료적 조성물의 양을 포함한다. 일부 구현예에서, 유효량은 질환의 증상의 진행을 예방 또는 지연시키기에 충분한 양을 포함하거나, 질환의 증상의 진행 과정을 변경하거나(이로 제한되지는 않지만, 예를 들어, 질환의 증상의 진행을 늦춤), 질환의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 경우에 대해, 적절한 유효량은 일상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다는 것이 이해된다.
[0143] 개시된 방법의 일부 구현예에서, 개체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 일부 구현예에서, 개체는 세포 표면 리간드 또는 항원에 의해 매개되는 세포 신호전달의 억제와 관련된 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 본 개시의 조성물 및 방법에 의해 치료될 적합한 질환은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 및 감염성 질환을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 질환은 암 또는 만성 감염이다.
추가 요법
[0144] 상기 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 재조합 세포, 및 약학적 조성물들은 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대, 화학요법제 또는 항암제 또는 항암 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가 치료제와 "조합"한 투여는 임의의 순서로 동시적인(동시발생) 및 순차적인 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제, 화학요법제, 항암제, 또는 항암 요법제는 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택된다. "화학요법제" 및 "항암제"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 다양한 부류의 항암제가 사용될 수 있다. 비-제한적 예는 알킬화제, 항대사물질, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 포도필로톡신, 항체(예를 들어, 단클론성 또는 다클론성), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 이마티닙 메실레이트(Gleevec® 또는 Glivec®)), 호르몬 처리제, 가용성 수용체 및 다른 항종양제를 포함한다.
세포 활성 조절 방법
[0145] 또 다른 양태에서, 세포의 활동을 조절하기 위한 다양한 방법들이 본원에 제공된다. 방법은 (a) 유효량의 본원에 제공된 임의의 재조합 세포를 제공하는 단계, 및 (b) 이를 선택된 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 선택된 리간드의 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 결합은 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위의 절단을 유도하고, 전사 조절자를 방출하며, 여기서 방출된 전사 조절자는 재조합 세포의 활성을 조절한다. 본 개시을 읽을 때 당업자는 개시된 방법이 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 수행될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
[0146] 본원에 제공된 방법을 이용하여 조절될 수 있는 비-제한적인 예시적 세포 활성은 유전자 발현, 증식, 아폽토시스, 비-아폽토시스 사멸, 분화, 탈분화, 이동, 유전자 산물 분비, 세포 부착, 및 세포용해 활성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[0147] 일부 구현예에서, 방출된 전사 조절자는 세포의 유전자 산물의 발현을 조절한다. 일부 구현예에서, 방출된 전사 조절자는 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 조절한다. 이종성 유전자 산물은 네이티브 세포에서 정상적으로 발견되지 않는, 예컨대, 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않는 것이다. 예를 들어, 세포는 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형될 수 있다.
[0148] 일부 구현예에서, 이종성 유전자 산물은 분비된 유전자 산물이다. 일부 구현예에서, 이종성 유전자 산물은 세포 표면 유전자 산물이다. 일부 경우에, 이종성 유전자 산물은 세포내 유전자 산물이다. 일부 구현예에서, 방출된 전사 조절자는 세포에서 둘 이상의 이종성 유전자 산물의 발현을 동시에 조절한다.
[0149] 일부 구현예에서, 세포 내 이종성 유전자 산물은 케모카인, 케모카인 수용체, 키메라 항원 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 대사 효소, 병원체-유래 단백질, 증식 유도제, 수용체, RNA 가이드 뉴클레아제, 부위-지정 뉴클레아제, T-세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 독소, 독소-유래 단백질, 전사 조절자, 전사 활성자, 전사 억제자, 번역 조절자, 번역 활성자, 번역 억제자, 활성화 면역-수용체, 항체, 아폽토시스 억제제, 아폽토시스 유도제, 조작된 T 세포 수용체, 면역-활성제, 면역-억제제, 및 억제 면역-수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0150] 일부 구현예에서, 방출된 전사 조절자는 세포의 분화를 조절하며, 여기서 세포는 면역 세포, 줄기 세포, 간세포, 또는 전구체 세포이다.
[0151] 본 개시의 키메라 수용체는 동일한 결합 도메인 및 ICD를 사용할 때 표준 SynNotch 수용체보다 높은 정도의 발현을 제공한다. 리간드/결합 도메인 쌍 및 이의 친화성에 좌우하여, 본 개시의 키메라 폴리펩티드 또는 힌지-노치 수용체는 상응하는 SynNotch 수용체보다 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% 더 높은 발현 증진을 제공할 수 있다.
[0152] 추가로, 본 개시의 키메라 수용체는 리간드 결합과 독립적으로, T 세포 활성화의 정도에 반응하는 전사 조절을 제공할 수 있다. 예를 들어, T 세포에서 발현되는 경우, 본 개시의 일부 수용체는 T-세포가 활성화되지 않은 경우의 리간드-유도 신호와 비교하여 T-세포가 활성화되는 경우에 더 강한 리간드-유도 신호를 제공한다. 이는, 예를 들어, 키메라 수용체 리간드의 부재에도 불구하고, 활성화될 때 T 세포 반응을 향상시키거나 억제하는 것이 요구되는 경우에, 사용 시 추가 유연성을 가능하게 한다.
시스템 및 키트
[0153] 또한, 본원에 제공되고 기재된 키메라 폴리펩티드, 힌지-노치 수용체, 재조합 핵산, 재조합 세포, 또는 약학적 조성물뿐만 아니라 이를 제조하고 사용하기 위한 서면 지침서를 포함하는 시스템 및 키트가 본원에 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 힌지-노치 수용체, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 핵산, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 세포, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 시스템 및/또는 키트가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 시스템 및/또는 키트는 제공된 키메라 폴리펩티드, 힌지-노치 수용체, 재조합 핵산, 재조합 세포, 또는 약학적 조성물 중 어느 하나를 개체에 투여하기 위해 사용되는 하나 이상의 시린지(프리-필드 시린지 포함) 및/또는 카테터(프리-필드 시린지 포함)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 이를 필요로 하는 개체에서 요망되는 목적, 예를 들어, 세포 활성 조절, 표적 암 세포 억제, 또는 건강 질환(예를 들어, 질병) 치료를 위한 다른 키트 구성요소와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 하나 이상의 추가 치료제를 가질 수 있다.
[0154] 상술된 임의의 시스템 및 키트는 하나 이상의 추가 시약을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 이러한 추가 시약은 다음으로부터 선택될 수 있다: 희석 완충액; 재구성 용액; 세척 완충액; 조절 시약; 조절 발현 벡터; 음성 대조 폴리펩티드, 양성 대조 폴리펩티드, 키메라 수용체 폴리펩티드의 시험관내 생산을 위한 시약.
[0155] 일부 구현예에서, 시스템 또는 키트의 구성요소는 별도의 컨테이너에 있을 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 시스템 또는 키트의 구성요소는 단일 컨테이터에서 조합될 수 있다.
[0156] 일부 구현예에서, 시스템 또는 키트는 방법을 수행하기 위해 키트의 구성요소를 사용하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법을 수행하기 위한 지침서는 일반적으로 적합한 판독 매체 상에 기록된다. 예를 들어, 지침서는 기재, 예컨대, 종이 또는 플라스틱 등 상에 인쇄될 수 있다. 상기 지침서는 키트 또는 이의 구성요소 등의 컨테이너의 라벨링 (즉, 패키지 또는 서브패키지와 관련된)에서 패키지 삽입물로서 키트에 존재할 수 있다. 지침서는 적합한 컴퓨터 판독 저장 매체, 예를 들어, CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브 등 상에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 일부 예에서, 실제 지침서는 키트에 존재하지 않지만, 원거리 공급원으로부터의 지침서를 수득하기 위한 수단(예를 들어, 인터넷을 통해)이 제공될 수 있다. 이러한 구현예의 일례는 지침서가 검토될 수 있고/있거나 지침서가 다운로드될 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 지침서에 관하여, 지침서를 수득하기 위한 상기 수단은 적합한 기재 상에 기록될 수 있다.
[0157] 본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 간행물, 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 인용에 의해 포함되어 있는 것으로 지시된 것처럼 동일한 정도로 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함되어 있다.
[0158] 본원에 인용된 임의의 참조가 종래 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것은 아니다. 참고 문헌들의 논의는 이들의 저자들이 주장하는 것을 진술하며, 본 발명자들은 인용된 문서들의 정확성 및 적절성에 이의를 제기할 권리를 보유한다. 과학적인 일지 기사, 특허 문서, 및 교과서들을 포함하는 다수의 정보 공급처들이 본원에서 언급되지만; 이러한 참고 문헌은 이들 문서들 중 임의의 것이 당업계에서 공통된 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정을 구성하는 것이 아님이 확실히 이해될 것이다.
[0159] 본원에 주어진 일반적인 방법들의 논의는 단지 예시적인 목적을 위한 것으로 의도된다. 다른 대안적인 방법 및 대안이 본 개시의 검토 시 당업자에게 명백할 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함될 것이다.
[0160] 본 명세서 전반에 걸쳐, 다양한 특허, 특허 출원 및 다른 유형의 간행물(예를 들어, 저널 기사, 전자 데이터베이스 항목 등)이 참조된다. 본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 다른 간행물의 개시는 모든 목적 상 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함된다.
[0161] 본원에 인용된 임의의 참조가 종래 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것은 아니다. 참고 문헌들의 논의는 이들의 저자들이 주장하는 것을 진술하며, 본 발명자들은 인용된 문서들의 정확성 및 적절성에 이의를 제기할 권리를 보유한다. 과학적인 일지 기사, 특허 문서, 및 교과서들을 포함하는 다수의 정보 공급처들이 본원에서 언급되지만; 이러한 참고 문헌은 이들 문서들 중 임의의 것이 당업계에서 공통된 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정을 구성하는 것이 아님이 확실히 이해될 것이다.
실시예
[0162] 본 개시의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법들은 상기 인용된 문헌들에서 충분히 설명된다.
[0163] 추가 구현예가 다음의 실시예들에서 더 상세히 개시되며, 이들은 하기의 예시들로 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 개시 또는 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도된 것이 아니다.
실시예 1
키메라 수용체 및 반응 요소 작제물의 설계 및 구성
[0164] 본 실시예는 키메라 노치 수용체의 패밀리의 설계 및 구성을 기술한다. 본 개시의 다양한 예시적인 수용체에 대한 상세한 정보는 하기 표 1 및 2에서 확인될 수 있다.
표 1. 이 표는 키메라 노치 수용체의 각각에 대한 간단한 설명, 이들의 해당 구성요소뿐만 아니라, 서열 목록에 기재된 해당 서열 식별자를 제공한다. ECD: 세포외 도메인; N-JMD: N-말단 막곁 도메인(즉, 힌지 도메인); TMD: 막관통 도메인; STS: 이동 정지 서열; TF: 전사 인자.
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표 2. 이 표는 키메라 노치 수용체와 각각의 구성요소(콤마로 분리된 구성요소) 각각에 대한 간략한 설명을 제공한다. 달리 언급되지 않는 한, 항목은 인간 기원의 단백질을 지칭한다. 예를 들어, "노치1, 노치1"은 이러한 단백질 모듈을 생성하기 위해 노치1로부터의 2 개의 서열이 융합되었음을 지시한다.
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[0165] 상기 표 1 내지 2에 기재된 키메라 수용체는 CD19를 인식하는 단쇄 항원-결합 단편(scFv)(문헌[Porter DL et al., 2011]), ALPPL2(FYIA), BCMA, Her2, 또는 항-BCMA 완전 인간화 VH 도메인을, 상응하는 수용체 스캐폴드 및 합성 전사 조절자 GAL4-VP64에 융합함으로써 형성되었다. 이들 수용체의 구성을 위해, 표 1 및 서열 목록에 제공된 아미노산 서열에 대해 코딩하는 DNA 단편은 표시된 단백질에 대한 DNA 서열을 함유하는 합성된 유전자 단편 또는 플라스미드들로부터 PCR 증폭되었고, 렌티바이러스 발현 벡터 pHR-SIN-pGK의 BamHI 클로닝 부위로 측접한 번역 개시 및 정지 서열로 표준 클로닝 기법(예를 들어, 오버행 PCR, 융합 PCR, 및 융합 내 클로닝)을 사용하여 조립되었다(L. Morsut et al., Cell (2016) 164:780-91; Addgene plasmid #76120).
[0166] 이들 실험에서 사용된 전사 조절자 GAL4-VP64는 단순 포진 단백질 VP16의 최소 활성화 도메인(아미노산 437-447)의 사량체 반복부로 이루어진 활성화 도메인 VCP64에 융합된 효모 GAL4 전사 인자로부터의 DNA 도메인을 함유하였다. 표 2에 예시된 바와 같이, 대부분의 예시적인 수용체는 막 표적화를 위한 N-말단 CD8α 신호 펩티드(MALPVTALLLPLALLLHAARP) (SEQ ID NO: 21)를 함유하는 반면, 하나의 예시적인 알킬(pIZ343eGFP)은 마우스 IgKVIII 신호 펩티드를 함유하였다. 추가로, 대부분의 예시적인 수용체는 형광 염료(α-myc A647®, Cell Signaling Technology, Cat #2233)에 접합된 항체로 표면 발현의 적합한 결정을 위한 myc-tag (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 22)을 함유하였다. 하기 실시예 3 내지 4에 기재된 모든 일차 T 세포 실험에 대해 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터를 함유하는 변형된 렌티바이러스 pHR'SIN:CSW 벡터(KT Roybal et al., Cell 2016 Oct 6; 167(2):419-32)로 각각 수용체를 클로닝하였다.
[0167] pHR'SIN:CSW 벡터를 또한 반응 요소 플라스미드를 생성하도록 변형시켰다. 이러한 목적 상 GAL4 DBD 도메인의 결합을 위한 표적 서열(GGAGCACTGTCCTCCGAACG) (SEQ ID NO: 23)의 5 개 카피를 최소 pybTATA 프로모터에 5′로 클로닝하였다. 또한, 성공적으로 형질도입된 T 세포를 적절하게 식별하기 위해 황색 형광 리포터 단백질(mCitrine)의 발현을 구성적으로 구동하는 PGK 프로모터를 반응 요소 플라스미드에 포함시켰다.
[0168] 모든 유도성 BFP 벡터들의 구성을 위해, 청색 형광 리포터 단백질(BFP)에 대한 코딩 서열을 GAL4 반응 요소에 3'로 위치된 다중 클로닝 부위의 BamHI 부위를 통해 클로닝하였다. 모든 유도성 CAR 벡터의 구성을 위해, CAR을 녹색 형광 리포터 단백질(GFP)로 C-말단에 태깅하고, GAL4 반응 요소에 3'로 위치된 다중 클로닝 부위에서 BamHI 부위를 통해 클로닝하였다. 모든 작제물들을 제조업체의 지시에 따라 클로닝 키트(In-Fusion® 클로닝, Clontech #ST0345)를 통해 클로닝하였다.
실시예 2
일차 인간 T-세포 단리 및 배양
[0169] 본 실시예는 하기 실시예 3에 기술된 다양한 세포 형질도입 실험에 후속적으로 사용된 일차 인간 T 세포의 단리 및 배양을 기술한다.
[0170] 이들 실험에서, 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 성분채집술 후에 혈액으로부터 단리하고, 인간 T-세포 단리 키트(인간 CD4+ 또는 CD8+ 풍부 칵테일; STEMCELL Technologies Cat #15062 및 15063)를 사용하여 음성 선별에 의해 농축하였다. 혈액을 University Institutional Review Board에 의해 승인된 바와 같이 퍼시픽 혈액 센터(샌프란시스코, CA)로부터 입수하였다. T 세포를 20% 인간 AB 혈청(Valley Biomedical Inc., #HP1022) 및 10% DMSO로 성장 배지(RPMI-1640, UCSF 세포 배양 코어)에서 저온보존하였다. 해동 후, T 세포를 모든 실험에 대하여 30 단위/mL IL-2(NCI BRB 전임상 저장소)가 보충된 X-VIVOTM 15(Lonza # 04-418Q), 5% 인간 AB 혈청 및 10 mM 중화 N-아세틸 L-시스테인(Sigma-Aldrich #A9165)을 함유하는 인간 T 세포 배지에서 배양하였다.
실시예 3
인간 T 세포는 렌티바이러스 벡터로 안정적으로 형질도입되었다
[0171] 본 실시예는 본 명세서에 달리 특정되지 않는 한 인간 T 세포의 렌티바이러스 형질도입에 사용되는 일반적인 프로토콜을 기술한다.
[0172] 일반적으로, pHR'SIN:CSW 트랜스진 발현 벡터 및 Mirus TransIT®-Lenti(Mirus, #MIR 6606)를 이용한 바이러스 패키징 플라스미드 pCMVdR8.91 및 pMD2.G로 Lenti-X™ 293T 세포(Clontech #11131D)의 형질감염을 통해, 수포성 구내염 바이러스 외피 G 단백질(VSV-G)(판트로픽 벡터)로 위형인 렌티바이러스 벡터를 생산하였다. 일반적으로, 일차 T 세포를 동일한 날에 해동하고, 배양에서 24 시간 후에, 1:3 세포:비드 비로 표면에 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 갖는 비드로 자극하였다(인간 T-활성자 CD3/CD28 다이아비드®, Life Technologies #11131D). 48 시간에, 바이러스 상청액을 수집하고, 일차 T 세포를 24 시간 동안 바이러스에 노출시켰다. T-세포 자극 후 5 일째에, 비드를 제거하고, T 세포를 이들이 휴식기일 때 14 일째까지 확장하고, 검정에 사용할 수 있었다. T 세포를 Beckton Dickinson (BD Biosciences) FACSAriaTM II 유세포 분석기로 검정에 대해 분류하였다. 기저 CAR 발현을 나타내는 AND-게이트 T 세포는 분류 동안 게이트 아웃되었다.
실시예 4
시험관 내에서 일차 T 세포의 자극
[0173] 본 실시예는 본 명세서에 달리 특정되지 않는 한, 본원에 기재된 키메라 힌지-노치 폴리펩티드에 의해 시험관 내에서 일차 T 세포의 자극을 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0174] 모든 시험관 내 T-세포 자극에 대해, 평저형 96-웰 조직 배양 플레이트에서 1:1 비로 수신 세포와 1 x 105 개 T 세포를 공동-배양하였다. 배양을 24 시간째에 BD FortessaTM X-50으로 리포터 활성화에 대하여 분석하였다. 모든 유세포 분석을 FlowJoTM 소프트웨어(TreeStar, Inc.)에서 수행하였다.
실시예 5
일차 T CD4+ T 세포에서의 CD8힌지-노치 수용체 설계, 발현, 및 활성화
[0175] 본 실시예는 CD8힌지-노치 수용체의 설계, 및 일차 T CD4+ T 세포에서의 이들의 발현 및 활성화를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 기술한다. CD8힌지-노치 수용체의 2 개의 변이체를 구축하였다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 인간 노치1 단백질에 기반하여 설계된, 예시적인 SynNotch1 수용체가 좌측 패널에 나타나 있다. 중간 패널은 예시적인 CD8 힌지-노치1 수용체를 개략적으로 도시한다. 좌측 패널의 SynNotch1 수용체와 비교하여, CD8 힌지-노치1 수용체는 이황화 결합을 형성하는 것으로 알려진 시스테인 잔기를 함유하는 CD8 힌지 도메인으로 NRR을 대체한다. 우측 패널은 예시적인 절두된 CD8 힌지-노치1 수용체(truncCD8 힌지-노치1)를 개략적으로 나타낸다. CD8 힌지-노치1 수용체와 비교하여, truncCD8 힌지-노치1 수용체는 CD8 힌지 서열의 C-말단 결실을 함유하여, 단일 시스테인 잔기 및 더 짧은 세포외 영역을 남긴다. 도 2b는 수용체 발현의 유세포 분석 데이터의 요약이다. 이들 실험에서, 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이나비드(Gibco)로 활성화되었고, 수용체 또는 전사 리포터 작제물을 발현하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 수용체 발현을 AlexaFluor647-태그 항-myc 항체(Cell Signaling)를 사용하여 측정하였다. 리포터 발현을 리포터 플라스미드에서 발견되는 구성적 mCitrine 유전자를 통해 측정하였다. 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 이중 양성 세포를 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장하였다. 도 2c는 수용체 활성화의 결과를 요약한 것이다. 이들 실험에서, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포를 24 시간 동안 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 CD19+ K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 본 실시예에 기술된 결과는 CD8힌지-노치 수용체와 truncCD8 힌지-노치1 둘 모두가 일차 T CD4+ T 세포에서 배양되었다는 것을 입증해 준다.
실시예 6
T-세포 자극에 의한 CD8힌지 수용체 활성화
[0176] 본 실시예는 동시 T-세포 활성화로 본원에 기재된 CD8힌지-노치 수용체에 의해 매개된 유전자 활성화를 입증하기 위해 수행된 실험의 결과를 기술한다. 이들 실험은 실시예 5에서 상술된 동일한 CD8힌지-노치 수용체 변이체를 사용하여 실시하였다. 동시 T-세포 활성화에 의한 수용체 활성화 시험의 결과는 도 3b에 나타나 있다. 이들 실험에서, T-세포 활성화를 시뮬레이션하기 위해, 항-MCAM, 항-CD3 이중특이성 T-세포 인게이저(MCAM BiTE)를 사용하였고, 이들은 K562 세포의 존재 하에 T-세포 수용체를 활성화시킨다. 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포를 24 시간 동안 MCAM BiTE(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포 + MCAM BiTE(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 CD19+ K562 세포 + MCAM BiTE(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 본 실시예에 기술된 결과는 CD8힌지-노치 수용체와 truncCD8 힌지-노치1 둘 모두가 동시 T-세포 활성화의 존재 또는 부재에서 전사를 활성화시킬 수 있다는 것을 입증해 준다.
실시예 7
CD8힌지 최적화
[0177] 본 실시예는 키메라 노치 수용체의 맥락에서 CD8 힌지 도메인을 최적화도록 수행된 실험들의 결과를 기술한다. CD8 힌지 도메인의 4 개의 변이체를 시험하였다: truncCD8 힌지1, truncCD8 힌지2, truncCD8 힌지3, 및 truncCD8 힌지4. 이들 CD8 힌지 도메인 변이체들 사이의 구조적 차이는 도 4A에 나타나 있으며, 여기서 힌지 구성요소는 "a", "b", "c", 및 "d"로 표기되어 있다. 구성요소 "a"는 제1 시스테인 잔기의 N-말단 영역을 나타낸다. 구성요소 "b"는 제1 시스테인 잔기를 나타낸다. 구성요소 "c"는 제1 시스테인 잔기와 제2 시스테인 잔기 사이의 영역을 나타낸다. 구성요소 "d"는 제2 시스테인 잔기, 및 제2 시스테인 잔기에서부터 수용체 막관통 도메인까지의 영역을 나타낸다. 도 4B는 Jurkat T-세포에서 시험한 수용체 활성화의 결과를 요약한 것이다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 도 4C는 도 4B의 데이터로부터의 %BFP 양성 세포의 정량화를 나타낸 것이다. 본 실시예에 기술된 결과는, BFP 발현 수준에 의해 측정하는 경우, CD8 힌지 도메인의 4 개의 모든 변이체가 전사를 활성화시킬 수 있다는 것을 입증해 준다. 그러나, truncCD8 힌지1 및 2-노치1 수용체는 이들이 리간드를 이용하여 높은 수준으로의 전사를 활성화시키고 최소의 리간드-독립적 전사 조절을 나타낸다는 점에서 최적이다(도 4B).
실시예 8
동시 PKC 신호전달로 시험한 TruncCD8힌지2 수용체 활성화
[0178] 본 실시예는 동시 PKC 신호전달로 상기 실시예 7에 기술된 truncCD8힌지2 수용체에 의해 매개되는 유전자 활성화를 시험하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 기술한다. 이들 실험에서, PKC 신호 전달을 시뮬레이션하기 위해, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), DAG 유사체를 첨가하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포를 PMA의 존재 및 부재에서 24 시간 동안 추가 세포 없음(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 CD19+ K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 본 실시예에 기술된 결과는 truncCD8 힌지2-노치1이 동시 PKC 신호전달의 존재 또는 부재에서 전사를 활성화시킬 수 있다는 것을 입증해 준다.
실시예 9
대안적인 공급원으로부터의 힌지 도메인 시험
[0179] 본 실시예는 다른 공급원으로부터 유래된 대안적인 힌지 도메인을 함유하는 힌지-노치 수용체로 수행된 실험으로부터의 결과를 기술한다. 이들 실험에서, CD28, OX40, 및 IgG4로부터 유래된 힌지 도메인으로 힌지-노치 수용체를 구축하였다(예를 들어, 도 6A 참조). 4 개의 예시적인 힌지-노치 수용체: pIZ343(절두 CD8힌지2-노치), pIZ358(CD28힌지-노치), pIZ360(OX40힌지-노치), pIZ359(IgG4힌지-노치)를 시험하였다. 힌지-노치 수용체 각각에 대한 간략한 설명이 또한 표 2에 제공된다. 도 6B에 나타낸 바와 같이, 각각의 힌지-노치 작제물 pIZ343(절두 CD8힌지-노치), pIZ358(CD28힌지-노치), pIZ360(OX40힌지-노치), pIZ359(IgG4힌지-노치)는 BFP 리포터 유전자의 발현에 의해 결정하는 경우 일차 T-세포를 자극할 수 있었다. 이전에 생성된 리포터 양성 Jurkat T-세포주를 수용체 작제물로 형질도입하였다. 수용체 발현을 AlexaFluor647-태그 항-myc 항체(Cell Signaling)를 사용하여 측정하였다. 수용체 활성화 시험을 위해 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 Jurkat T-세포를 24 시간 동안 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 CD19+ K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 도 6B는 도 6A의 시험 결과로부터의 %BFP 양성 세포의 정량화를 도시한 것이다. 본 실시예에 기재된 실험은, CD8A 이외에, 다른 사용 가능한 힌지 도메인이 대안적인 공급원, 예컨대, CD28, OX40, 및 IgG4로부터 유래될 수 있음을 입증해 준다.
실시예 10
대안적인 리간드 인식 도메인을 함유하는 힌지-노치 수용체의 시험
[0180] 본 실시예는 대안적인 리간드 인식 도메인을 함유하는 힌지-노치 수용체를 시험하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 기술한다.
[0181] 도 7A에서 입증된 바와 같이, 항-CD19 scFv 이외에, 항-ALPPL2 scFv 및 eGFP가 또한 리간드 인식 도메인으로서 사용될 수 있었다. 도 7B에 도시된 바와 같이, 이전에 생성된 리포터 양성 Jurkat T-세포주를 수용체 작제물로 형질도입하였다. 수용체 발현을 AlexaFluor647-태그 항-myc 항체(Cell Signaling)를 사용하여 측정하였다. 수용체 활성화 시험을 위해 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 Jurkat T-세포를 24 시간 동안 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 ALPPL2+ K562 세포/세포 표면 상에서 항-GFP 나노바디를 발현하는 1 x 105 개 K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 본 실시예에서 기재된 실험은, CD19 이외에, 다른 사용 가능한 힌지 도메인이 대안적인 공급원으로부터 유래될 수 있음을 입증해 준다.
실시예 11
대안적인 이동 정지 서열(STS)을 함유하는 힌지-노치 수용체의 시험.
[0182] 본 실시예는 대안적인 STS를 함유하는 힌지-노치 수용체를 시험하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 기술한다.
[0183] 도 8A에 예시된 바와 같이, 노치1 STS 이외에, 또 다른 STS(예를 들어, 노치2 STS, 노치4 STS, DAG STS, PTPRF STS, 및 KL STS)가 수용체 거동에 영향을 미치는 데 사용될 수 있다. 이들 실험에서, 일차 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이나비드(Gibco)로 활성화하고, 수용체 또는 전사 리포터 작제물을 발현하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 수용체/리포터 양성 세포들을 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포를 24 시간 동안 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 CD19+ K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 도 8B는 도 8A에서 활성화 데이터의 정량화를 도시한 것이다. 본 실시예에서 기재된 실험은, 노치1 STS 이외에, 다른 사용 가능한 이동 정지 서열이 대안적인 공급원으로부터 유래될 수 있음을 입증해 준다.
실시예 12
리포터 Jurkat T 세포의 생성
[0184] 본 실시예는 본원에 기재된 다양한 힌지-노치 수용체의 시험에 후속적으로 사용된 리포터 Jurkat T 세포의 생성을 기술한다.
[0185] 이들 실험에서, 앞서 기재된 바와 같이, 유도성 BFP 리포터 유전자 및 구성적 mCitrine 리포터 유전자를 운반하는 리포터 플라스미드를 사용하여 E6-1 Jurkat T 세포(ATCC# TIB-152)를 렌티바이러스로 형질도입하였다(K.T. Roybal et al., Cell, 164:1-10, 2016). 리포터-양성 Jurkat 세포를 Beckton Dickinson (BD Biosciences) FACSAriaTM II 유세포 분석기를 사용하여 mCitrine 발현에 대하여 분류하고, 확장시켰다.
[0186] 앞서 기재된 바와 같이 수용체 트랜스진 발현 벡터로 렌티바이러스 입자를 생산하였다(L. Morsut et al., Cell (2016) 164:780-91). 리포터-양성 Jurkat 세포를 개별 수용체로 형질도입하고, 96 웰 플레이트에서 실험을 위해 확장시켰다.
실시예 13
[0187] 본 실시예는 본원에 기재된 키메라 힌지-노치 폴리펩티드에 의해 시험관 내에서 Jurkat T 세포의 자극을 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0188] 4 개의 CD8 힌지-노치 변이체를 시험하였다. 도 4A는 하나 이상의 힌지 구성요소들을 포함하는 4 개의 CD8 힌지-노치 절두 변이체를 개략적으로 예시한 것이다. 도 4B는 Jurkat T-세포에서 수용체 활성화를 시험하기 위해 수행된 실험의 결과를 요약한 것이다. 이들 실험에서, 이전에 생성된 리포터 양성 Jurkat T-세포주를 각각의 CD8 힌지-노치 변이체로 형질도입하였다. 수용체 발현을 AlexaFluor647-태그 항-myc 항체(Cell Signaling)를 사용하여 측정하였다. 수용체 활성화 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 Jurkat T-세포를 24 시간 동안 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 CD19+ K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 이 시험으로부터, truncCD8 힌지2는 최적의 구성인 것으로 결정되었고, 후속 연구에 사용되었다. 도 4C는 도 4B에서의 데이터로부터 %BFP 양성 세포의 정량화를 나타낸 것이다(비첨가, K562 존재, CD19+ K562 세포 존재). 도 4D는 도 4B의 데이터로부터의 신호:잡음비의 플롯이다. CD19+ K562로 자극된 Jurkat T-세포로부터의 값을 K562 세포로 자극된 Jurkat T-세포로부터의 값으로 나누었다.
실시예 14
[0189] 본 실시예는 본원에 기재된 키메라 CD8 힌지-노치 폴리펩티드를 최적화하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0190] 다수의 예시적인 CD8 Hing 절두 변이체를 제조하였다. 도 9A에 나타낸 바와 같이, 예시적인 변이체는 작제물 pIZ341의 N-JMD 도메인에 상응하는 전장 또는 절두된 형태의 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 12)를 포함한다. 검은 색 막대는 각각의 변이체를 구성하는 아미노산들을 나타낸다. 결과로서, 도 9A 내지 도 9C에서 비교를 위한 변이체는 다음과 같다: SEQ ID NO: 12를 포함하는 "Full" 변이체; SEQ ID NO: 39를 포함하는 "Trunc 1" 변이체; SEQ ID NO: 13을 포함하는 "Trunc 2" 변이체; SEQ ID NO: 40을 포함하는 "Trunc 3" 변이체; 및 SEQ ID NO: 41을 포함하는 "Trunc 4" 변이체. 이들 CD8 힌지 변이체들의 발현의 비교는 도 9B에 나타나 있다. 구체적으로, 일차 인간 CD4+ T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)로 활성화시키고, 하나는 힌지 절두 변이체 수용체를 발현하고 다른 하나는 BFP 전사 리포터 + 항-ALPPL2 CAR을 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 도 9B의 좌측 5 개의 패널들은 GFP에 의해 측정된 수용체 작제물 발현 수준(x-축) 대비 항-myc-태그 염색(y-축)에 의해 측정된 각 수용체의 상대 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 9B의 최우측 패널은 이중-양성 세포에서 CD8 힌지 변이체의 수용체 발현의 MFI 정량화를 나타낸 것이다. 도 9C의 각각의 패널에서 상부에서 하부로 나타낸 바와 같이, 항-CD19 수용체를 발현하는 T-세포를 비첨가(상부 트레이스), ALPPL2+ K562 세포(상부에서 두 번째 트레이스), CD19+ K562 세포(상부에서 세 번째 트레이스), 또는 ALPPL2+ CD19+(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다.
실시예 15
[0191] 본 실시예는 상이한 리간드-결합 도메인으로 힌지-노치 작제물의 활성화 및 ADAM 프로테아제 및 감마-세크레타제의 단백질분해 활성에 대한 이들의 의존성을 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0192] 리간드 인식 도메인 및 노치2 STS 도메인으로서 항-CD19 scFv를 갖는 하나의 작제물, 리간드 인식 도메인 및 노치2 STS 도메인으로서 항-LaG17 나노바디를 갖는 또 다른 작제물, 및 eGFP 세포외 도메인 및 노치1 STS 도메인을 갖는 제3 작제물을 포함하여 세 개의 예시적인 힌지-노치 작제물을 제조하였다. 일차 인간 CD4+ T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)로 활성화시키고, 하나는 나타낸 결합 헤드 절두 변이체 수용체를 갖는 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 전사 리포터를 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다(도 10). 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 시험을 위해, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체를 1 x 105 개 K562 세포(상부 트레이스), 1 x 105 개 리간드 + K562 세포(상부에서 두 번째 트레이스), 1 x 105 개 리간드 + K562 세포와 ADAM10 억제제(상부에서 세 번째 트레이스), 또는 1 x 105 개 리간드 + K562 세포와 감마-세크레타제 억제제, DAPT(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다.
실시예 16
[0193] 본 실시예는 리간드-결합 도메인의 확장된 세트를 갖는 예시적인 노치2 STS 힌지-노치 작제물의 활성화 특징을 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0194] BCMA 항원에 대해 상이한 결합 헤드로 시험을 수행하였다. 일차 CD4+ 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, 하나는 표시된 헤드를 갖는 힌지노치 수용체가 있는 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 전사 리포터를 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 시험을 위해, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체를 2 일 동안 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 1 x 105 개 BCMA+ K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다(도 11A). 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 도 11A에서 좌측 패널은 항-BCMA scFv 결합 헤드를 갖는 작제물을 지칭하고, 중간 패널은 항-BCMA 완전 인간화 VH 결합 헤드를 갖는 작제물을 지칭하고, 우측 패널은 결합 도메인에 최적화된 힌지 도메인과 항-BCMA 완전 인간화 VH 결합 헤드를 갖는 작제물을 지칭한다(힌지 5).
[0195] SIRPα 결합 헤드를 유사하게 시험하였다. 일차 CD8+ 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, 하나는 표시된 헤드 힌지노치 수용체가 있는 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 전사 리포터를 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 시험을 위해, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체를 2 일 동안 비첨가(청색), 또는 지시된 바와 같은(적색) 1 x 105 개 K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다(도 11B). 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다.
[0196] HER2 항원에 대한 상이한 scFv를 시험하고, 비교하였다. 일차 CD4+ 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, 하나는 표시된 헤드 힌지노치 수용체가 있는 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 전사 리포터를 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 시험을 위해, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체를 2 일 동안 비첨가(상부 트레이스), 부착성 HEK 293T 세포(상부에서부터 두 번째 트레이스), 부착성 MBMDA-468 세포(상부에서 세 번째 트레이스), 부착성 MCF7 세포(상부에서부터 네 번째 트레이스), 또는 부착성 SKBR3 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다(도 11C). 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 도 11C에서, 좌측 패널은 항-HER2 4D5-7 scFv 결합 헤드를 나타내고, 반면에 우측 패널은 항-HER2 4D5-8 scFv 결합 헤드를 나타낸다.
실시예 17
[0197] 본 실시예는 상이한 프로모터 및 STS 도메인을 갖는 힌지-노치 변이체의 활성화를 비교하기 위해 수행된 실험을 기술한다. 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포를 비첨가(상부 트레이스), 1 x 105 개 ALPPL2+ K562 세포(상부에서 두 번째 트레이스), 1 x 105 개 CD19+ K562 세포(상부에서 세 번째 트레이스), 또는 1 x 105 개 ALPPL2+ CD19+ K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다(도 12). 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 뮤린 및 인간 기원 SynNotch 작제물을 사용한 활성화가 비교를 위해 포함되었다.
실시예 18
[0198] 본 실시예는 힌지-노치 작제물에서의 노치1 막관통 도메인(TMD)의 돌연변이 분석을 기술한다.
[0199] 힌지-노치 작제물의 TMD 도메인에서 상이한 알라닌 돌연변이를 갖는 변이체를 제조하였다. 힌지-노치의 TMD에서 위치 301(F)에서부터 위치 322(S)까지의 각각의 아미노산 잔기를 알라닌으로 개별적으로 돌연변이시켰다. 일차 인간 CD4+ T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, 하나는 TMD 돌연변이체 변이체를 발현하고 다른 하나는 BFP 전사 리포터를 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 도 13A에서, 좌측 패널은 리포터 작제물 마커 발현(x-축) 대비 항-myc-태그 염색에 의해 측정된, 상이한 수용체의 상대 발현(y-축)을 나타내고, 우측 패널은 이중-양성 세포에서의 TMD 돌연변이 변이체의 수용체 발현의 MFI 정량화를 나타낸다.
[0200] 도 13B에 나타낸 바와 같이, 항-CD19 수용체를 발현하는 T-세포를 대조 CD19(-) 또는 CD19(+) K562 세포와 1:1 비로 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 좌측 패널은 활성화 프로파일의 유동 패널을 나타낸다. 우측 패널은 선 그래프로서 플롯팅된 BFP%를 나타낸다. 결과는 TMD의 C-말단에서 글리신(G) 및 발린(V) 잔기의 중요성을 나타낸다.
실시예 19
[0201] 본 실시예는 힌지-노치 작제물에서 막관통 도메인(TMD) 및 STS 도메인에 대한 돌연변이 분석을 기술한다.
[0202] 네 가지 유형의 예시적인 힌지 노치 수용체(SEQ ID NO: 73 내지 76)를 본 실시예에 사용하였고, 이들 모두 항-CD19 scFv 도메인, 절두된 CD8 힌지 도메인, 및 Gal4VP64 도메인을 포함하였다. STS 및 TMD 도메인의 선택을 위해, 네 가지 작제물은 다음을 포함하였다: CLSTN1 TMD 및 CLSTN1 STS (SEQ ID NO: 73), CLSTN2 TMD 및 CLSTN2 STS (SEQ ID NO: 74), CLSTN1 TMD 및 노치1 STS (SEQ ID NO: 75), CLSTN2 TMD 및 노치1 STS (SEQ ID NO: 76). 일차 인간 CD4+ T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)로 활성화시키고, 하나는 나타낸 바와 같이 TMD/STS 조합을 갖는 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 구성적으로 발현된 항-ALPPL2 CAR을 갖는 전사 리포터를 함유하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체를 1 x 105 개 K562 세포("-CAR" 패널, 청색), 또는 1 x 105 개 CD19+K562 세포("-CAR" 패널, 적색)와 공동배양하였다. 마찬가지로, 1 x 105 개 이중 양성 T-세포 발현 수용체를 CAR 활성의 존재에서 1 x 105 개 ALPPL2+ K562 세포("+CAR" 패널, 청색), 또는 1 x 105 개 ALPPL2+ CD19+ K562 세포("+CAR" 패널, 적색)와 공동배양에 의해 시험하였다. 후속적으로, 유도성 BFP 리포터 유전자의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다.
실시예 20
[0203] 본 실시예는 추가 T 세포 자극 없이 힌지노치 STS 변이체의 활성화 특징의 표 3을 기술한다.
[0204] 일차 인간 CD4+ T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)로 활성화시키고, 하나는 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 구성적 eGFP-태그 항-ALPPL2 CAR 발현으로 전사 리포터인 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 시험을 위해, T-세포 발현 수용체를 K562 세포 또는 CD19+ K562 세포와 공동배양하였다. BFP 리포터 유전자를 후속적으로 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 하기 표 3에서와 같이, CD19+ K562 대 K562 조건 하에 BFP+ 세포의 MFI로부터의 신호대잡음비를 2 개의 조건에서 MFI에서 델타 변화에 대하여 플롯팅하였다.
[0205] 표 3. 이 표는 ALPPL2+ K562와 공동발현된 항-ALPPL2 CAR의 자극이 없는 데이터를 제공한 것이다. "리포터 단독"은 리포터 플라스미드를 나타내고 모든 샘플들에서 발현되었다.
Figure pct00008
실시예 21
[0206] 본 실시예는 T 세포 자극과 함께 힌지노치 STS 변이체의 활성화 특징의 표 4를 기술한다.
[0207] 일차 인간 CD4+ T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)로 활성화시키고, 하나는 나타낸 바와 같이 힌지 수용체를 발현하고 다른 하나는 구성적 eGFP+ 항-ALPPL2 CAR 발현으로 전사 리포터인 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 시험을 위해, T-세포 발현 수용체를 K562 세포 또는 CD19+ K562 세포와 공동배양하였다. BFP 리포터 유전자를 후속적으로 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. CD19+ K562 대 K562 조건 하에 BFP+ 세포의 MFI로부터의 신호대잡음비를 2 개의 조건에서 MFI에서 델타 변화에 대하여 플롯팅하였다. 실시예 19에서와 같이, 그러나 CAR 활성화를 위해 추가의 ALPPL2 + K562 공동-인큐베이션으로 활성화를 조사하였다.
[0208] 표 4. 이 표는 ALPPL2+ K562와 공동발현된 항-ALPPL2 CAR의 자극이 있는 데이터를 제공한 것이다. "리포터 단독"은 리포터 플라스미드를 나타내고 모든 샘플들에서 발현되었다.
Figure pct00009
실시예 22
[0209] 본 실시예는 T 세포 조작된 힌지-노치 STS 변이체에 의한 제어된 IL-2 생산을 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0210] 도 15A는 T 세포의 자가분비 및 측분비 확장을 위해 조작된 사이토카인의 리간드-촉발 분비를 제공하도록 힌지-노치 STS 변이체로 조작된 T 세포의 다이어그램을 나타낸 것이다. 표시된 STS 변형을 갖는 항-CD19 힌지-노치 수용체의 발현 프로파일은 도 15B에 나타나 있다. 일차 인간 T-세포는 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화되었고, 하나는 MCAM 항원에 대하여 CAR을 발현하고 다른 하나는 Gal4-UAS 제어 하에 유도성 수퍼-IL2를 갖는 힌지-노치 수용체를 발현하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입되었다. 두 작제물 모두를 함유하는 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 항-myc-태그 염색(y- 축)에 의해 발현을 결정하였다.
실시예 23
[0211] 본 실시예는 수퍼-IL2의 리간드-촉발 발현이 CAR-T 세포의 세포 생존력을 개선한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0212] 항-CD19 힌지-노치 노치1 STS 수용체를 발현하는 1 x 105 개 이중 양성 T-세포를 IL-2가 없는 배지에서, K562 세포의 부재(상부 좌측), 힌지-노치를 촉발시키는 CD19+ K562(상부 우측), CAR 활성화를 촉발시키는 MCAM+ K562 세포(하부 좌측) 또는 둘 모두의 수용체의 활성화를 촉발시키는 MCAM+ 및 CD19+ K562 세포(하부 우측)와 공동배양하였다(도 16). 9 일 후에, Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용한 순방향 및 측면-산란 측정에 의한 생존 T 세포의 비율을 평가하였다. 둘 모두의 수용체의 공동-활성화는 대부분의 생존 세포에서 야기되었고, 그 후에 힌지-노치 활성화(및 후속하는 수퍼-IL2 유도), CAR 활성화 단독, 및 어느 하나의 비활성화였다.
실시예 24
[0213] 본 실시예는 힌지-노치의 STS-변이체에 의한 T 세포의 조정 가능한 증식을 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0214] 일차 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, 하나는 MCAM 항원에 대하여 CAR을 발현하고 다른 하나는 Gal4-UAS 제어 하에 유도성 수퍼-IL2를 갖는 힌지-노치 수용체를 발현하는 2 개의 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다(도 17의 우측 4 개 패널). 3 개의 상이한 STS 변이체(NRG1, 노치1, 노치2)를 함유하는 힌지-노치 수용체를 힌지-노치가 없는 대조에 대해 시험하였다. 마찬가지로, 일차 인간 T-세포는 CAR 발현 없이 생성되었다(도 17의 좌측 패널). T 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 CellTrace Violet(Invitrogen)으로 염색되었고, IL-2가 없는 배지에서 CD19+ K562 표적 세포와 공동배양되었고, CTV 신호 붕괴에 의해 증식을 평가하기 위해 표시된 시점에 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 측정되었다.
실시예 25
[0215] 본 실시예는 힌지-노치의 STS-변이체에 의한 수퍼-IL2의 조정 가능한 분비를 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0216] 일차 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 수퍼-IL2를 갖는 힌지-노치 수용체를 발현하는 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다(도 18A). 3 개의 상이한 STS 변이체(NRG1, 노치1, 노치2)를 함유하는 힌지-노치 수용체를 힌지-노치가 없는 대조에 대해 시험하였다. T 세포를 IL-2가 결여된 배지에서 MCAM+ CD19+ K562 세포와 공동인큐베이션하였고, 표시된 시점에, 상청액 IL-2를 마이크로플레이트 리더(Tecan)로 제조업체의 프로토콜에 따라 Instant ELISA 키트(Invitrogen)를 사용하여 측정하였다. 적색 점선은 T 세포를 배양하는 데 사용되는 IL-2의 표준 농도를 나타낸다. 수퍼-IL2의 등급화된 분비는 STS-조정된 힌지-노치 수용체의 활성화에 의해 달성되었다.
[0217] 도 18B에서, 일차 인간 T-세포는 MCAM에 대해 CAR을 발현하는 추가의 렌티바이러스 벡터로 생성되었다. CAR-발현 세포에 의한 IL-2의 향상된 흡수는 CAR-단독 및 NRG1-STS 힌지-노치 T 세포에서 상청액 IL2의 손실을 초래하였다. 대조적으로, 노치1 및 노치2-STS 기반 수용체에 의한 수퍼-IL2의 더 큰 유도는 초기에 이러한 흡수를 증식 전에 능가하고, K562 제거는 상청액 수준을 감소시켰다.
실시예 26
[0218] 본 실시예는 힌지-노치의 STS-변이체에 의한 수퍼-IL2의 조정 가능한 분비가 방관자 T 세포의 증식을 향상시킨다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0219] 일차 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 수퍼-IL2를 갖는 힌지-노치 수용체를 포함하는 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다(도 19의 우측 패널). 3 개의 상이한 STS 변이체(NRG1, 노치1, 노치2)를 함유하는 힌지노치 수용체를 힌지노치가 없는 대조에 대해 시험하였다. 힌지노치 T 세포를 MCAM에 대해 CAR을 발현하는 CellTrace Far Red(Invitrogen)(도 19의 좌측 패널)로 또는 CAR 부재(도 19의 우측 패널)로 염색된 "방관자" T 세포와 공동인큐베이션하였다. T 세포를 IL-2가 결여된 배지에서 MCAM+ CD19+ K562 세포와 공동인큐베이션하였고, Fortessa X-50(BD Biosciences)에 대하여 신호 붕괴를 측정함으로써 방관자 T 세포의 증식을 평가하였다. CAR 발현의 존재 및 부재에서 방관자 T 세포의 경우, 힌지-노치-활성화 T 세포의 STS 변이체에 의해 등급화된 방식으로 증식이 향상되었다.
실시예 27
[0220] 본 실시예는 힌지-노치 수용체 CAR 회로를 함유하는 단일 렌티바이러스 벡터 작제물을 시험하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0221] 일차 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 항-MCAM CAR 카세트로 구성적으로 발현된 힌지-노치 수용체를 함유하는 단일 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 myc-태그를 통해 힌지-노치 수용체 발현에 대하여 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 3 개의 STS-변이체를 표시된 바와 같이 대조로서 사용되는 구성적으로 발현된 CAR과 함께 시험하였다(도 20). 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 T 세포를 비첨가(상부 트레이스), 5 x 105 개 K562 세포(중간 트레이스), 또는 5 x 104 개 CD19 + K562 세포(하부 트레이스)와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 CAR의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 GFP 태그에 의해 측정하였다.
실시예 28
[0222] 본 실시예는 힌지노치 CAR 회로를 함유하는 단일 렌티벡터로 조작된 T 세포에 의한 특이적 이중 항원 표적 세포 사멸을 입증하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0223] 일차 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 항-MCAM CAR 카세트로 구성적으로 발현된 힌지노치-수용체를 함유하는 단일 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 myc-태그를 통해 힌지-노치 수용체 발현에 대하여 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 3 개의 STS-변이체를 표시된 바와 같이 대조로서 사용되는 구성적으로 발현된 CAR과 함께 시험하였다. 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 T 세포를 5 x 105 개 MCAM+ K562 세포 또는 5 x 104 개 MCAM+ CD19+ K562 세포와 공동배양하였다. 표적 세포 사멸을 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 K562 집단의 순방향/측면-산란에 의해 평가하였다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 힌지-노치 회로는 MCAM+ 및 CD19+ 항원 둘 모두를 함유하는 효과적이고 특이적으로 표적 세포를 제거하였다.
실시예 29
[0224] 본 실시예는 T 세포 활성화 및 고갈의 제어에 대하여 힌지-노치 수용체를 함유하는 단일 렌티바이러스 벡터 작제물을 시험하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0225] 일차 인간 T-세포를 항-CD3/항-CD28 다이아비드(Gibco)를 사용하여 활성화시키고, Gal4-UAS 제어 하에 유도성 항-MCAM CAR 카세트로 구성적으로 발현된 힌지-노치 수용체를 함유하는 단일 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 세포를 초기 T-세포 자극 후 5 일째에 myc-태그를 통해 힌지-노치 수용체 발현에 대하여 분류하고, 활성화 시험을 위해 추가로 확장시켰다. 3 개의 STS-변이체는 표시된 바와 같이 대조로서 사용되는 구성적으로 발현된 CAR과 함께 시험하였다. 시험을 위해, 항-CD19 수용체를 발현하는 1 x 105 개 T 세포를 5 x 104 개 CD19+ K562 세포와 공동배양하였다. 후속적으로, 유도성 CAR의 전사 활성화를 Fortessa X-50(BD Biosciences)을 사용하여 GFP 태그에 의해 측정하였다(도 22의 최좌측 패널). T 세포 활성화 및 고갈을 각각 CD25 및 CD39의 발현에 의해 측정하였다(도 22).
실시예 30
[0226] 본 실시예는 힌지-노치-대-CAR 회로의 생체내 시험을 위해 수행된 실험을 기술한다.
[0227] 도 23에 나타낸 바와 같이, 일측성 종양의 경우, NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG) 마우스의 왼쪽 옆구리에 1 x 106 개 K562-BCMA/CD19 종양 세포를 피하 이식하였다. 대측성 종양의 경우, NSG 마우스의 왼쪽 옆구리에 1 x 106 개 K562-BCMA/CD19 종양 세포를, 오른쪽 옆구리에 1 x 106 개 K562-CD19 종양 세포를 이식하였다. 종양 이식 4 일 후, 2.5 x 106 개의 조작된 일차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포(총 5 x 106 개 T 세포)를 i.v.로 주입하였다. 주 2 회 내지 3 회 캘리퍼를 통해 종양 크기를 모니터링하고, 종양이 ≥20 mm로 측정되었을 때 마우스가 종점에 도달한 것으로 결정하였다. 면역 표현형 분석을 위해, T 세포 이식 10 일 후에 종양 및 비장을 수거하였다. 종양을 37℃에서 30 분 동안 4 mg/ml의 콜라게나제 IV(Worthington Biochemical Corporation) 및 0.1 mg/ml의 DNase I (MilliporeSigma)으로 RPMI-1640에서 종양을 수동으로 잘게 자르고 분해하고, 비장을 수동으로 해리하고, 적혈구 용해(ACK; KD medical)에 주어지게 하였다. 다음 항체를 사용하였다: 항-CD45 (2D1, 368516, Biolegend), 항-CD3(UCHT1, 300464, Biolegend), 항-CD4 (SK3, 563552, BD biosciences), 및 항-CD8(RPA-T8, 563823, BD Biosciences). 죽은 세포를 Draq7 (Abcam)로 배제하였다. 샘플을 FACSymphony X50 SORP (BD Biosciences)를 사용하여 분석되었고, 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
실시예 31
[0228] 본 실시예는 표 1에 기재된 노치 수용체에 대해 본원에 제공되고 논의된 바와 같은 실험 결과를 요약한다.
표 5
Figure pct00010
Figure pct00011
[0229] 본 개시의 특정 대안들이 개시되었지만, 다양한 수정들 및 조합들이 가능하고, 첨부된 청구항들의 실제 사상 및 범위 내에서 고려된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 제시된 정확한 초록 및 개시에 대한 제한의 의도가 아니다.
참고문헌
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California <120> Notch Receptors With Hinge Domain <130> 048536-654001WO <140> Herewith <141> Herewith <150> US 62/905,251 <151> 2019-09-24 <150> US 62/905,263 <151> 2019-09-24 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 556 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30 Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45 Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110 Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175 Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190 Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205 Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220 Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240 Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255 Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270 Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 290 295 300 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Met 305 310 315 320 Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly 325 330 335 Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys 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Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp 370 375 380 Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 385 390 395 400 Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 405 410 415 <210> 35 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 35 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Val Gln 20 25 30 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 35 40 45 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 50 55 60 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 90 95 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 100 105 110 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu 115 120 125 Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr 130 135 140 Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro 145 150 155 160 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 165 170 175 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Phe Met Tyr Val Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu 195 200 205 Ser Lys Arg Lys Arg Lys His Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln 210 215 220 Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys 225 230 235 240 Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser 245 250 255 Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val 260 265 270 Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro 275 280 285 Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile 290 295 300 Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp 305 310 315 320 Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr 325 330 335 Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser 340 345 350 Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser 355 360 365 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 370 375 380 Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 385 390 395 400 Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu 405 410 415 Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 420 425 <210> 36 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 36 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 35 40 45 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr 50 55 60 Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 65 70 75 80 Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr 85 90 95 Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met 100 105 110 Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 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<211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> X can be any amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X represents a hydrophobic residue such as Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Tyr, Val, Met, and Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is either Ser or Thr <400> 65 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is either Leu or Gln <400> 66 Pro Xaa Gly Met Thr Ser 1 5 <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is either Leu or Gln <400> 67 Pro Xaa Gly Met Thr 1 5 <210> 68 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 68 Val Gly Arg 1 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 69 Glu Asn Leu Tyr Thr Gln Ser 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Thr 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175 Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190 Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205 Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220 Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240 Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255 Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270 Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ile Ala Thr Val 290 295 300 Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val Val Ala Met Gly 305 310 315 320 Val Tyr Arg Val Arg Ile Ala His Gln His Met Lys Leu Leu Ser Ser 325 330 335 Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser 340 345 350 Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys 355 360 365 Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu 370 375 380 Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu 385 390 395 400 Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu 405 410 415 Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val 420 425 430 Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met 435 440 445 Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu 450 455 460 Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala 465 470 475 480 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp 485 490 495 Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 500 505 510 Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 515 520 525 Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 540 <210> 75 <211> 537 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 75 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30 Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45 Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110 Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175 Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190 Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205 Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220 Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240 Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255 Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270 Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ala Thr Val Val 290 295 300 Ile Val Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile Ile Leu Gly Val 305 310 315 320 Phe Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala 325 330 335 Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro 340 345 350 Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro 355 360 365 Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu 370 375 380 Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg 385 390 395 400 Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys 405 410 415 Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala 420 425 430 Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu 435 440 445 Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn 450 455 460 Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly 465 470 475 480 Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 485 490 495 Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp 500 505 510 Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp 515 520 525 Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 <210> 76 <211> 538 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 76 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30 Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45 Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110 Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175 Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190 Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205 Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220 Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240 Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255 Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270 Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ile Ala Thr Val 290 295 300 Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val Val Ala Met Gly 305 310 315 320 Val Tyr Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln 325 330 335 Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys 340 345 350 Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser 355 360 365 Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val 370 375 380 Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro 385 390 395 400 Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile 405 410 415 Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp 420 425 430 Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr 435 440 445 Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser 450 455 460 Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser 465 470 475 480 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 485 490 495 Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 500 505 510 Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu 515 520 525 Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 <210> 77 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 77 Ala Thr Val Val Ile Val Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile 1 5 10 15 Ile Leu Gly Val Phe 20 <210> 78 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 78 Ile Ala Thr Val Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val 1 5 10 15 Val Ala Met Gly Val Tyr 20 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 79 Arg Ile Arg Ala Ala His Arg Arg Thr Met Arg 1 5 10 <210> 80 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 80 Arg Val Arg Ile Ala His Gln His 1 5

Claims (78)

  1. N-말단에서부터 C-말단으로,
    a) 선택된 리간드에 대해 결합 친화성을 갖는 세포외 리간드-결합 도메인;
    b) 분자내 이황화 결합을 통해 키메라 폴리펩티드의 올리고머 형성을 촉진할 수 있는 힌지 도메인;
    c) 하나 이상의 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위를 포함하는 막관통 도메인; 및
    d) 전사 조절자를 포함하는 세포내 도메인
    을 포함하는, 키메라 폴리펩티드로서,
    상기 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 상기 선택된 리간드의 결합이 상기 전사 조절자와 상기 힌지 도메인 사이에 배치된 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위에서 절단을 유도하고,
    상기 키메라 폴리펩티드가 LIN-12-노치 반복부(LNR) 및/또는 노치 수용체의 이종이량체화 도메인(HD)을 포함하지 않는, 키메라 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 막관통 도메인이 이동 정지 서열을 추가로 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포외 도메인이 세포의 표면 상에서 리간드에 결합할 수 있는 항원-결합 모이어티를 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 세포가 병원체인, 키메라 폴리펩티드.
  5. 제3항에 있어서, 세포가 인간 세포인, 키메라 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 인간 세포가 종양 세포인, 키메라 폴리펩티드.
  7. 제5항에 있어서, 인간 세포가 말단 분화된 세포인, 키메라 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 단백질 또는 탄수화물을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 CD1, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8b, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD34, CD40, CD45, CD48, CD52, CD59, CD66, CD70, CD71, CD72, CD73, CD79A, CD79B, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD94, CD95, CD134, CD140 (PDGFR4), CD152, CD154, CD158, CD178, CD181 (CXCR1), CD182 (CXCR2), CD183 (CXCR3), CD210, CD246, CD252, CD253, CD261, CD262, CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD276 (B7H3), CD279, CD295, CD339 (JAG1), CD340 (HER2), EGFR, FGFR2, CEA, AFP, CA125, MUC-1, MAGE, 알칼리성 포스파타제, 태반-유사 2(ALPPL2), B-세포 성숙 항원(BCMA), 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 및 신호 조절 단백질 α(SIRPα)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 세포 표면 수용체, 부착성 단백질, 인테그린, 뮤신, 렉틴, 종양 관련 항원, 및 종양-특이적 항원으로부터 선택되는, 키메라 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원인, 키메라 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 리간드-결합 도메인이 수용체의 리간드-결합 부분을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  13. 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 모이어티가 항체, 나노바디, 디아바디, 트리아바디, 미니바디, F(ab')2 단편, F(ab)v 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), 및 이의 기능적 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 항원-결합 모이어티가 scFv를 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  15. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 모이어티가 CD19, B7H3(CD276), BCMA(CD269), ALPPL2, CD123, CD171, CD179a, CD20, CD213A2, CD22, CD24, CD246, CD272, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD46, CD71, CD97, CEA, CLDN6, CLECL1, CS-1, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EpCAM, EphA2, Ephrin B2, FAP, FLT3, GD2, GD3, GM3, GPRC5D, HER2 (ERBB2/neu), IGLL1, IL-11Rα, KIT(CD117), MUC1, NCAM, PAP, PDGFR-β, PRSS21, PSCA, PSMA, ROR1, SIRPα, SSEA-4, TAG72, TEM1/CD248, TEM7R, TSHR, VEGFR2, ALPI, 시트룰린화된 비멘틴, cMet, 및 Axl로 이루어진 군으로부터 선택된 종양-관련 항원에 특이적으로 결합하는, 키메라 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 종양-관련 항원이 CD19, BCMA, CEA, HER2, MUC1, CD20, ALPPL2, SIRPα, 또는 EGFR인, 키메라 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 종양-관련 항원이 CD19, BCMA, HER2, 또는 ALPPL2인, 키메라 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위가 감마 세크레타제 절단 부위를 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 조절자가 전사 활성자, 또는 전사 억제자를 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 도메인이 Gal4-VP16, Gal4-VP64, tetR-VP64, ZFHD1-VP64, Gal4-KRAB, 및 HAP1-VP16으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵 국재화 서열 및 전사 조절자 서열을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 단백질분해 절단 부위, 신호 서열, 검출 가능한 표지, 종양-특이적 절단 부위, 질환-특이적 절단 부위, 및 이들의 조합을 추가로 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 CD8α 힌지 도메인, CD28 힌지 도메인, CD152 힌지 도메인, PD-1 힌지 도메인, CTLA4 힌지 도메인, OX40 힌지 도메인, IgG1 힌지 도메인, IgG2 힌지 도메인, IgG3 힌지 도메인, 및 IgG4 힌지 도메인, 또는 이들의 임의의 기능적 변이체로부터 유래되는, 키메라 폴리펩티드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 CD8α 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래되는, 키메라 폴리펩티드.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 CD28 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래되는, 키메라 폴리펩티드.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 OX40 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래되는, 키메라 폴리펩티드.
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 IgG4 힌지 도메인 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래되는, 키메라 폴리펩티드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이동 정지 서열이 SEQ ID NO: 18 내지 19, 43 내지 63, 79, 및 80 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인이 SEQ ID NO: 17, 77, 및 78 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 힌지 도메인이 SEQ ID NO: 12 내지 16 및 39 내지 42 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 막관통 도메인이 SEQ ID NO: 17, 77, 및 78 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    c) 이동 정지 서열 도메인이 SEQ ID NO: 18 내지 19, 43 내지 63, 79, 및 80 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 내지 8, 24 내지 35, 및 73 내지 76 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  33. 제32항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 발현 카세트 또는 발현 벡터에 도입되는, 재조합 핵산.
  34. 제33항에 있어서, 발현 벡터가 바이러스 벡터인, 재조합 핵산.
  35. 제34항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터인, 재조합 핵산.
  36. a) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 키메라 폴리펩티드; 및/또는
    b) 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산
    을 포함하는, 재조합 세포.
  37. 제36항에 있어서, 재조합 세포가 진핵 세포인, 재조합 세포.
  38. 제37항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인, 재조합 세포.
  39. 제38항에 있어서, 포유동물 세포가 면역 세포, 뉴런, 상피 세포, 및 내피 세포, 또는 줄기 세포인, 재조합 세포.
  40. 제39항에 있어서, 면역 세포가 B 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 수지상 세포, 대식세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 또는 다른 T 세포인, 재조합 세포.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 제1 키메라 폴리펩티드 및 제2 키메라 폴리펩티드; 및/또는
    b) 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함하고,
    상기 제1 키메라 폴리펩티드 및 상기 제2 키메라 폴리펩티드가 동일한 서열을 갖지 않고/않거나 상기 제1 핵산 또는 상기 제2 핵산이 동일한 서열을 갖지 않는, 재조합 세포.
  42. 제41항에 있어서, 제1 키메라 폴리펩티드가 제2 키메라 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 조절하는, 재조합 세포.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 단백질을 인코딩하는 발현 카세트를 추가로 포함하고, 상기 단백질의 발현이 전사 조절자에 의해 조절되는, 재조합 세포.
  44. 제43항에 있어서, 단백질이 세포에 대해 이종성인, 재조합 세포.
  45. 제44항에 있어서, 프로모터가 효모 GAL4 프로모터인, 재조합 세포.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 사이토카인, 세포독소, 케모카인, 면역조절제, 친-아폽토시스 인자, 항-아폽토시스 인자, 호르몬, 분화 인자, 탈분화 인자, 면역 세포 수용체(예를 들어, TCR 또는 CAR), 또는 리포터인, 재조합 세포.
  47. 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 재조합 세포, 및 배양 배지를 포함하는, 세포 배양물.
  48. 약학적으로 허용되는 담체, 및 하기 중 하나 이상을 포함하는, 약학적 조성물:
    a) 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산; 및
    b) 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포.
  49. 제48항에 있어서, 조성물이 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 재조합 핵산이 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화되는, 약학적 조성물.
  51. 세포의 활성을 조절하기 위한 방법으로서, 상기 방법이
    a) 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포를 제공하는 단계; 및
    b) 상기 재조합 세포를 선택된 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 선택된 리간드의 상기 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 결합이 리간드-유도성 단백질분해 절단 부위의 절단을 유도하고, 전사 조절자를 방출하며, 상기 방출된 전사 조절자가 상기 재조합 세포의 활성을 조절하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 접촉이 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 수행되는, 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 조절하고자 하는 세포의 활성이 선택된 유전자의 발현, 증식, 아폽토시스, 비-아폽토시스 사멸, 분화, 탈분화, 이동, 분자의 분비, 세포 부착, 및 세포용해 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 방출된 전사 조절자가 세포의 유전자 산물의 발현을 조절하는, 방법.
  55. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 방출된 전사 조절자가 이종성 유전자 산물의 발현을 조절하는, 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 세포의 유전자 산물이 케모카인, 케모카인 수용체, 키메라 항원 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 대사 효소, 병원체-유래 단백질, 증식 유도제, 수용체, RNA 가이드 뉴클레아제, 부위-지정 뉴클레아제, T 세포 수용체, 독소, 독소-유래 단백질, 전사 조절자, 전사 활성자, 전사 억제자, 번역 조절자, 번역 활성자, 번역 억제자, 활성화 면역-수용체, 항체, 아폽토시스 억제제, 아폽토시스 유도제, 조작된 T 세포 수용체, 면역-활성제, 면역-억제제, 및 억제 면역-수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 방출된 전사 조절자가 세포의 분화를 조절하며, 상기 세포가 면역 세포, 줄기 세포, 간세포, 또는 전구체 세포인, 방법.
  58. 개체에서 표적 세포의 활성을 억제하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 재조합 세포가 상기 개체에서 상기 표적 세포의 활성을 억제하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 표적 세포가 병원성 세포인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 병원성 세포가 암 세포인, 방법.
  61. 제57항에 있어서, 표적 암 세포가 급성 골수종 백혈병 세포, 역형성 림프종 세포, 성상세포종 세포, B-세포 암 세포, 유방암 세포, 결장암 세포, 식도종 세포, 식도 암 세포, 교모세포종 세포, 신경교종 세포, 평활근육종 세포, 지방육종 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 외투 세포 림프종 세포, 흑색종 세포, 신경모세포종 세포, 비소세포성 폐암 세포, 희돌기교종 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포, 말초 T-세포 림프종 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 위암 세포, 암종 세포, 중피종 세포, 또는 육종 세포인, 방법.
  62. 건강 상태의 치료를 필요로 하는 개체에서 건강 상태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포를 포함하는 제1 요법제를 상기 개체에 투여하는 것을 포함하고, 상기 재조합 세포가 상기 개체에서 상기 건강 상태를 치료하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 제2 요법제를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 제2 요법제가 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 및 독소 요법으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 제1 요법제 및 제2 요법제가 동일한 조성물 또는 별개의 조성물에서 함께 투여되는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 제1 요법제 및 제2 요법제가 동시에 투여되는, 방법.
  67. 제63항 또는 제64항에 있어서, 제1 요법제 및 제2 요법제가 순차적으로 투여되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 제1 요법제가 제2 요법제 전에 투여되는, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 제1 요법제가 제2 요법제 후에 투여되는, 방법.
  70. 제67항에 있어서, 제1 요법제 및 제2 요법제가 차례로 투여되는, 방법.
  71. 세포의 활성을 조절하거나, 표적 암 세포를 억제하거나, 이를 필요로 하는 개체에서 건강 상태를 치료하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템이
    a) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 키메라 폴리펩티드;
    b) 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산;
    c) 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포; 및
    d) 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
  72. 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포를 제조하기 위한 방법으로서,
    a) 단백질 발현이 가능한 세포를 제공하고;
    b) 상기 제공된 세포를 상기 제공된 세포 내에서 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산과 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 세포가 대상체로부터 얻어진 샘플에 대해 수행되는 백혈구형성증에 의해 얻어지고, 상기 세포가 생체 외에서 접촉되는, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 재조합 핵산이 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화되는, 방법.
  75. 건강 상태의 치료를 위한
    a) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 키메라 폴리펩티드;
    b) 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산;
    c) 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포; 및
    d) 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 조성물
    중 하나 이상의 용도.
  76. 제75항에 있어서, 건강 상태가 암인, 용도.
  77. 제76항에 있어서, 암은 고형 종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변인, 용도.
  78. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 건강 상태의 치료용 의약의 제조를 위한, 용도.
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