KR20220079315A - 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 엑소좀은 기존 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀에 비하여 보다 개선된 치주 질환 예방 또는 치료 효과를 나타내는 바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating periodontal disease comprising exosomes derived from induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells}
본 발명은 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
미세소포체 (Extracellular Vesicles)는 마이크로베지클 (Microvesicles), 엑소좀 (Exosome) 등을 포함하는 30~1000 nm 크기의 구형 지질이중층 (lipid-bilayer)으로 구성된 소포체 (vesicle)이다.
엑소좀의 지질이중층은 기원 세포 (공여세포)와 같은 인지질 이중막 구조로 되어 있으며, 세포가 세포외로 분비하는 물질의 구성체로 세포-세포간의 커뮤니케이션 및 세포성 면역 중재 등의 기능적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
엑소좀은 기원 세포 특유의 생물학적 기능을 반영하는 세포특이적 구성 성분을 함유하며, 인지질, mRNA, miRNA 외에도 다양한 수용성 단백질, 외재성 단백질 및 막관통 단백질 성분 등을 포함한다.
이러한 엑소좀은 비만세포, 림프구, 성상세포, 혈소판, 신경세포, 내피세포, 상피세포 등 모든 동물 세포에서 배출되며 혈액, 소변, 점액, 타액, 담즙액, 복수액, 뇌척수액 등의 다양한 체액에서 발견된다. 엑소좀은 뇌혈관 장벽 (Blood-Brain Barrier; BBB)도 통과할 수 있으며, 표피 세포와 내피세포의 세포막 투과가 가능할 정도로 선택적 투과성이 높아 특정 약물의 나노캐리어 (nanocarrier)인 DDS (drug delivery system) 개발에도 활용되고 있다.
중간엽 줄기세포에서 분비하는 엑소좀 및 마이크로베지클 (microvesicle)은 세포-세포간 커뮤니케이션 (cell-to-cell communication)에 관여하며 줄기세포가 가지는 재생의학적인 치료 효능을 보인다고 알려져 있다.
줄기세포를 체내에 이식한 후에 장기간의 생존 없이 세포에서 분비되는 파라크린 인자 (paracrine factors)에 트로픽 효과 (trophic effect)를 가져오는 것이 알려져 있고, 이러한 인자에는 성장인자 (growth factor), 케모카인 (chemokine), 사이토카인 (cytokine) 등과 같은 저분자가 엑소좀과 같은 세포외 소포체 (extracellular vesicle)에 의하여 분비되며, 이러한 엑소좀은 줄기세포에서 유래한다. 따라서 엑소좀은 줄기세포의 특성을 규명하고 이의 치료적 효능을 평가하는데 활용되고 있다. 나아가, 최근에는 중간엽 줄기세포 자체를 사용하지 않고 중간엽 줄기세포가 분비하는 엑소좀을 이용하여 다양한 질환의 치료효과에 대한 연구가 활발하게 진행 중이며, 학계 및 산업계에서는 이를 통해 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 대안이 될 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명자들은 중간엽 줄기세포의 엑소좀을 이용한 치주 질환 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)에서 유래한 중간엽 줄기세포를 확립하고, 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀이 우수한 치주 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타냄을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC) 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환 (periodontal disease)의 예방, 억제, 완화 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC) 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환 (periodontal disease)의 예방, 억제, 완화 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 중간엽 줄기세포의 엑소좀을 이용한 치주 질환 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)에서 유래한 중간엽 줄기세포보다 미분화 단계에 있는 중간엽 줄기세포의 전구세포를 확립하고, 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀이 우수한 치주 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타냄을 규명하였다.
본 발명은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀 및 이를 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀 및 이를 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC) 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환 (periodontal disease)의 예방, 억제, 완화 또는 치료용 약제학적 조성물이다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)"는 체세포와 같은 이미 분화된 세포에 역분화 (dedifferentiation)를 유도하여 초기의 미분화된 상태로 돌아가, 전분화능 (pluripotency)을 가지게 된 세포를 의미한다.
상기 역분화는 특정 유전자 (예를 들어, Sox2, c-Myc, Klf4, Oct-4 등)를 도입하여 발현시키거나 상기 특정 유전자가 도입된 세포에서 만들어진 역분화 유도 단백질을 주입하여 유도될 수 있다.
상기 전분화능은 생체를 구성하는 3가지 배엽 (germ layer), 즉 내배엽 (endoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm) 기원의 조직 또는 기관으로 분화할 수 있는 능력을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포"는 다분화능을 가진 세포로서 조골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다. 상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 가장 흔히 사용되나, 골수 외에도 제대 또는 제대혈, 지방조직, 양수, 어금니의 치아 돌기 (tooth bud)로부터 유래할 수 있다. 중간엽 줄기세포는 기질세포 (stromal cell)이라는 용어로도 불린다.
본 발명에 따른 중간엽 줄기세포는 일반적인 중간엽 줄기세포가 아닌, [본 발명자들이 개발한] SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않거나, SSEA-4를 발현하는 세포 수가 10% 또는 5% 미만인 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 중간엽 줄기세포 (BxC)이다.
상기 "유도만능줄기세포"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화 줄기세포 라고도 한다.
상기 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 센다이바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다.
상기 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마 (teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다.
본 발명의 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 포유동물 유래의 유도만능줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능줄기세포이다.
또한, 본 발명의 상기 유도만능줄기세포가 역분화 되기 전의 체세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 양수 또는 태반 등으로부터 유래된 체세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로 상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast), 간세포 (hepatocyte), 지방세포 (adipose cell), 상피세포 (epithelial cell), 표피세포 (epidermal cell), 연골세포 (chondrocyte), 근세포 (muscle cell), 심근세포 (cardiac muscle cell), 멜라노사이트 (melaonocyte), 신경세포 (neural cell), 교세포 (glial cell), 성상교세포 (astroglial cell), 단핵구 (monocyte), 대식세포 (macrophage) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 동등한 수의 중간엽 줄기세포에 비하여 ANKRD1, CPE, NKAIN4, LCP1, CCDC3, MAMDC2, CLSTN2, SFTA1P, EPB41L3, PDE1C, EMILIN2, SULT1C4, TRIM58, DENND2A, CADM4, AIF1L, NTM, SHISA2, RASSF4, 및 ACKR3로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 유전자를 더 높은 수준으로 발현한다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 동등한 수의 중간엽 줄기세포에 비하여 DHRS3, BMPER, IFI6, PRSS12, RDH10, 및 KCNE4로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 유전자를 더 낮은 수준으로 발현한다.
본 발명의 유도만능줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포 (BxC)는 동일한 조직 유래(e.g. 제대 조직)의 중간엽 줄기세포 (MSC)와 비교하여 염색체 핵형에 있어서 이상이 없고, 증식능력이 우수하다.
구체적으로, 본 발명의 BxC는 계대를 9번 이상 거듭할 경우 동일 조직 유래의 중간엽 줄기세포(MSC)와 비교하여 10배 이상 증식능의 차이가 나타나며, 12 번 이상의 횟수로 계대를 하여도 증식능의 감소가 관찰되지 않는다. 또한, BxC는 MSC에 비하여 세포 증식능과 관련된 마커인 Ki67의 발현량도 2배 이상 높게 나타난다.
본 발명에 따른 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 (BxC)는 Endostatin, Endothelin-1, VEGF-A, Thrombospondin-2, PlGF, PDGF-AA, beta-NGF, 및 HB-EGF 등의 기능성 단백질을 동등한 수의 중간엽 줄기세포와 비교하여 다량 분비한다.
Endostatin은 자연적으로 생성되는 type XVIII 콜라겐에서 유래한 20 kDa C-터미널 단편으로, 항-신생혈관제제로 보고되어 있다.
endothelin-1은 preproendothelin-1 (PPET1)으로도 알려져 있으며, EDN1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서 혈관 내피세포에서 생산된다. endothelin-1은 강력한 혈관수축제로 알려져 있다.
VEGF-A (vascular endothelial growth factor A)는 VEGFA 유전자가 인코딩하는 단백질로서 혈관 내피세포의 VEGFR1 및 VEGFR2와 상호작용을 통해 혈관의 성장을 유도하는 것으로 알려져 있다.
Thrombospondin-2는 THBS2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서, 세포-세포 상호작용 또는 세포-기질 상호작용을 매개하는 것으로 알려져 있다. Thrombospondin-2의 암에 대한 역할은 논란의 여지가 있으나, 중간엽 줄기세포의 세포 표면 특성을 조절하는 것으로 보고되어 있으며 세포 부착 및 세포 이동에 관여한다고 알려져 있다.
PlGF (placental growth factor)는 PGF 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서 VEGF sub-family의 멤버로서 배아발생기에서 혈관신생에 주된 역할을 하는 단백질로 알려져 있다.
PDGF-AA (platelet-derived growth factor)는 세포의 성장 및 분열을 조절하는 성장인자로서 혈관의 생성 및 성장, 및 중간엽 줄기세포의 증식, 화학주성, 및 이동에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
NGF (Nerve growth factor)는 신경친화성 인자 및 뉴로펩타이드로서, 신경의 성장, 유지, 증식 및 생존에 주로 관여한다. NGF는 alpha-, beta-, 및 gamma-NGF가 약 2:1:2의 비율로 발현되는 세 가지 단백질의 복합체로서, 여기에서 gamma-NGF는 세린 프로테아제로 작용하고, beta-NGF의 N-터미널을 절단하여 NGF를 활성화시킨다고 알려져 있다.
HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor)는 HBEGF 유전자에 의해 인코딩되는 EGF family 단백질의 멤버이다. HB-EGF는 심장의 발달 및 혈관분포에 중요한 역할을 한다고 알려져 있고, 표피 창상의 치유에서 상피화 과정에 필수적인 단백질로 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "엑소좀 (exosome)"이란 세포가 세포 외로 분비하거나, 세포 내에 존재하는 지질-이중층으로 구성된 막 구조를 갖는 소낭 (membrane vesicle)으로, 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재한다. 엑소좀의 직경은 30-1000 nm 정도이며, 다중소포체 (multivesicular bodies)가 세포막과 융합될 때 세포로부터 방출되거나, 세포막으로부터 곧바로 방출된다. 엑소좀이 응고, 세포-세포간 커뮤니케이션 및 세포성 면역을 중재하는 기능적 역할을 수행하기 위해, 세포 내의 생체분자인 단백질, 생체활성 지질 및 RNA (miRNA)를 수송하는 역할을 하는 것은 잘 알려져 있다.
엑소좀은 미세소포체 (microvesicle)를 포괄하는 개념이다. 엑소좀의 마커 단백질로는 CD63, CD81 등이 알려져 있고, 그 외에는 EGFR과 같은 세포 표면의 수용체, 신호전달에 관련 분자, 세포 부착 관련 단백질, MSC 연관 항원, 열충격단백질 (heat shock protein), 소포 형성과 관련된 Alix 등의 단백질이 알려져 있다.
본 발명에 있어서 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀은 상술한 유도만능줄기세포-유래 중간엽줄기세포 (BxC) 내에 존재하거나, BxC로부터 분비된 엑소좀을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함하는"이란 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀이 치주 질환의 예방 또는 치료 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
치주질환은 구내염 (stomatitis), 설염 (glossitis), 치은염 (gingivitis), 치주염 (periodontal inflammation), 치조골파손 (alveolar bone breakage) 및 치조골형성장애 (alveolar bone osteodystrophy)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 치주 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 (a) 치주 질환의 발전의 억제; (b) 치주 질환의 경감; 및 (c) 치주 질환의 제거를 의미한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 잇몸, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치주 질환 치료방법에 관한 것이다.
상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스 (mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀의 치주 질환 치료 용도에 관한 것이다.
치주 질환 치료방법 및 치료용도는 상술한 본 발명의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 및 이를 포함하는 약제학적 조성물과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태는 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC) 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환 (periodontal disease)의 예방, 억제, 완화 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "전처리"란 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 배양 과정에서 전처리 물질이 첨가된 세포배양 배지를 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포에 접촉시키는 과정을 의미한다.
전처리는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 과정에서 전처리 물질을 포함하는 세포배양 배지를 이용하여 배양하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
세포배양 배지는 동물세포 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium), DMEM과 F12의 혼합물, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium), α-MEM, Iscove's MEM, 199 배지, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, Way-mouth's MB752/1, McCoy's 5A 및 MCDB 시리즈 등이 이용될 수 있다.
배양은 6 내지 48시간 동안 수행될 수 있다.
구체적으로, 배양은 6 내지 42시간, 6 내지 36시간, 6 내지 30시간, 6 내지 27시간, 12 내지 48시간, 12 내지 42시간, 12 내지 36시간, 12 내지 30시간, 12 내지 27시간, 18 내지 48시간, 18 내지 42시간, 18 내지 36시간, 18 내지 30시간, 18 내지 27시간, 21 내지 48시간, 21 내지 42시간, 21 내지 36시간, 21 내지 30시간 또는 21 내지 27시간 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 전처리 물질은 레스베라트롤 (Resveratrol), P 물질 (Substance P) 및 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산 (Phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 전처리 물질은 레스베라트롤일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포는 레스베라트롤이 세포배양 배지에 1 내지 100 nM의 농도로 포함되어 배양된 것일 수 있다.
구체적으로, 레스베라트롤은 0.01 내지 10000 nM, 0.1 내지 5000nM, 0.5 내지 1000nM, 1 내지 500nM, 1 내지 100nM, 5 내지 100nM 또는 5 내지 30nM 농도로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 전처리 물질은 P-물질일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포는 P-물질이 세포배양 배지에 50 내지 150 nM의 농도로 포함되어 배양된 것일 수 있다.
구체적으로, P-물질은 세포배양 배지 내 1 내지 90 nM, 1 내지 80 nM, 1 내지 70 nM, 1 내지 60 nM, 1 내지 50 nM, 1 내지 40 nM, 1 내지 30 nM, 50 내지 300 nM, 50 내지 250 nM, 50 내지 200 nM, 50 내지 150 nM, 50 내지 100 nM, 75 내지 125 nM, 10 내지 90 nM, 10 내지 80 nM, 10 내지 70 nM, 10 내지 60 nM, 10 내지 50 nM, 10 내지 40 nM 또는 20 내지 40 nM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 전처리 물질은 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포는 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산이 세포배양 배지에 1 내지 100 nM의 농도로 포함되어 배양된 것일 수 있다.
구체적으로, 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산은 세포배양 배지 내 1 내지 1000 nM, 5 내지 500 nM, 10 내지 250 nM, 10 내지 100 nM, 15 내지 80 nM 또는 20 내지 70 nM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양물로로부터 분리된 엑소좀에 관한 것이다.
본 발명의 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의부터 분리된 엑소좀은 종래의 엑소좀으로서의 특성을 가진 엑소좀이다.
본 발명의 또 다른 양태는 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치주 질환 치료방법에 관한 것이다.
"개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태는 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀의 치주 질환 치료 용도에 관한 것이다.
치주 질환 치료방법 및 치료용도는 상술한 본 발명의 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀 및 이를 포함하는 약제학적 조성물과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 전처리 물질로 전처리 하거나 또는 전처리 하지 않은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방, 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 엑소좀은 기존 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀에 비하여 보다 개선된 치주 질환 예방 또는 치료 효과를 나타내는 바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC)로부터 분리한 엑소좀(BxC-e) 및 전처리된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (BxC-R56e, BxC-R26e 및 BxC-I10e)의 치주세포 증식률 증가효과를 나타낸 도이다.
도 2a는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC) 및 전처리된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (BxC-R56e, BxC-R26e 및 BxC-I10e)의 치주세포의 골세포 분화능력 증가효과를 나타낸 사진이다.
도 2b는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC) 및 전처리된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (BxC-R56e, BxC-R26e 및 BxC-I10e)의 치주세포의 골세포 분화능력 증가효과를 나타낸 그래프이다.
도 3a 내지 3c는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC) 및 레스베라트롤, P 물질 또는 PMA가 전처리된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (BxC-R56e, BxC-R26e 및 BxC-I10e)의 치주세포의 골세포 분화관련 유전자 (OC, BMP2, RUNX2)의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 4a는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC) 및 레스베라트롤, P 물질 또는 PMA가 전처리된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (BxC-R56e, BxC-R26e 및 BxC-I10e)의 상처 치유 (Wound healing) 및 세포이동 효과 (cell migration)를 확인한 사진이다.
도 4b는 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 (BxC) 및 레스베라트롤, P 물질 또는 PMA가 전처리된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (BxC-R56e, BxC-R26e 및 BxC-I10e)의 상처 치유 (Wound healing) 및 세포이동 효과 (cell migration)를 확인한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 배양
유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)를 10%의 FBS (Fetal bovine Serum) 및 10 ng/ml의 bFGF를 첨가한 DMEM에서 7일간 배양하였다. 이 후, FACS 분석을 통하여 배양된 유도만능줄기세포 중 세포 표면에 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 SSEA-4(-) 세포를 분리하여 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포를 수득하였다. 이어서, 분리된 SSEA-4(-) 세포를 계대하여 10%의 FBS 및 10 ng/ml의 bFGF를 첨가한 DMEM 배지에서 7일간 추가 배양하여, 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 제작하였다 (이하, BxC).
이 후, BxC를 High glucose DMEM (Gibco, USA), 10% FBS (HyClone, USA), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X, Gibco, USA)를 포함하는 배양배지에서 추가 배양하였다.
실시예 2: 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 (BxC-e) 분리
실시예 1에서 배양된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 배양배지를 수거하여 300xg에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하였다. 원심분리 후 상층액을 수득해 0.22μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기 (high speed centrifuge)를 이용하여 10,000xg, 4℃에서 70분간 원심분리하였다.
이어서, 원심분리된 상층액을 다시 수득해 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000xg, 4℃에서 90분간 원심분리하였다. 이 후, 상층액을 제거하고, 하층에 남아있는 엑소좀을 PBS (phosphate bufferd salin)에 희석하여 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 (이하, BxC-e 엑소좀)을 분리하였고, 이를 이하의 실험에 사용하였다.
실시예 3: 전처리 물질 처리에 따른 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 분리
3-1. 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산 전처리 엑소좀 (BxC-I10e) 분리
10% Fetal bovine Serum, 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution 및 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산 (Phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA, Sigma, USA) 50nM이 포함된 High glucose DMEM 배양배지에 상기 실시예 1에서 제조된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 24시간 배양하였다.
배양을 완료한 후, 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산이 전처리 된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 세척하고 엑소좀이 제거된 FBS을 10% 첨가한 배양배지에서 추가적으로 72시간 배양하였다.
72시간 배양 후, 전처리 물질이 처리된 배양배지를 수거하여 300xg에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하였다. 이어서, 상층액을 취하여 0.22μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기 (high speed centrifuge)를 이용하여 10,000xg, 4℃에서 70분간 원심분리하였다. 그 다음, 원심분리된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000xg, 4℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 하층에 남아있는 엑소좀을 PBS에 희석하여 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산 전처리 엑소좀 (이하, BxC-I10e 엑소좀)을 분리하였으며, 이를 이하의 실험에 사용하였다.
3-2. 레스베라트롤 전처리 엑소좀 (BxC-R56e) 분리
10% Fetal bovine Serum, 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution 및 레스베라트롤 (Resveratrol, Sigma, USA) 10nM이 포함된 High glucose DMEM 배양배지에 상기 실시예 1에서 제조된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 24시간 배양하였다.
배양을 완료한 후, 레스베라트롤이 전처리 된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 세척하고 엑소좀이 제거된 FBS을 10% 첨가한 배양배지에서 추가적으로 72시간 배양하였다.
72시간 배양 후, 전처리 물질이 처리된 배양배지를 수거하여 300xg에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하였다. 이어서, 상층액을 취하여 0.22μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기 (high speed centrifuge)를 이용하여 10,000xg, 4℃에서 70분간 원심분리하였다. 그 다음, 원심분리된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000xg, 4℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 하층에 남아있는 엑소좀을 PBS에 희석하여 레스베라트롤 전처리 엑소좀 (이하, BxC-R56e 엑소좀)을 분리하였으며, 이를 이하의 실험에 사용하였다.
3-3. P 물질 (Substance P) 전처리 엑소좀 (BxC-R26e) 분리
10% Fetal bovine Serum, 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution 및 P 물질 100 nM이 포함된 High glucose DMEM 배양배지에 상기 실시예 1에서 제조된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 24시간 배양하였다.
배양을 완료한 후, 레스베라트롤이 전처리 된 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포를 세척하고 엑소좀이 제거된 FBS을 10% 첨가한 배양배지에서 추가적으로 72시간 배양하였다.
72시간 배양 후, 전처리 물질이 처리된 배양배지를 수거하여 300xg에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하였다. 이어서, 상층액을 취하여 0.22μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기 (high speed centrifuge)를 이용하여 10,000xg, 4℃에서 70분간 원심분리하였다. 그 다음, 원심분리된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000xg, 4℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 하층에 남아있는 엑소좀을 PBS에 희석하여 P 물질 전처리 엑소좀 (이하, BxC-R26e 엑소좀)을 분리하였으며, 이를 이하의 실험에 사용하였다.
실시예 4: 치주세포 증식률 증가 확인
상기 실시예 2에서 분리된 엑소좀(BxC-e) 및 상기 실시예 3에서 분리된 엑소좀 (BxC-R56e, BxC-R26e, BxC-I10e)에 대하여 치주인대 세포의 증식을 확인하였다.
인간유래 치주인대 섬유아세포인 HPdLF (human periodontal ligament fibroblasts, LONZA)를 5% FBS가 첨가된 SCGM 배지 (CC-3205, LONZA, Switzerland)를 이용하여 96웰 플레이트에 분주한 후, 37℃5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 엑소좀에 의한 치주인대 유래 섬유아세포의 증식을 확인하기 위해 배양액 제거 후 DPBS로 세척한 뒤, FBS를 제거한 DMEM (11995-065, Gibco, USA)배지에 엑소좀 (BxC-e, BxC-R56e, BxC-R26e, BxC-I10e)을 100㎍/ml 농도로 넣은 후, 배지 100㎕씩 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 2일간 배양을 하였다. 이 후, 10㎕의 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, ALX-850-039, Enzo) 용액을 배양액에 넣어 37℃5% CO2 배양기에서 2시간 배양 후 색이 변하는 것이 확인되면 450nm로 흡광도를 측정하여, 치주인대 세포의 증식을 확인하였으며, 그 결과를 도 1 및 표 1에 나타내었다.
PBS BxC-e BxC-R56e BxC-R26e BxC-I10e
평균
증식률		 1.0 1.5 1.3 1.4 1.3
실험결과, 도 1 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, BxC-e, BxC-R56e, BxC-R26e, BxC-I10e 엑소좀을 처리한 군 모두에서 치주세포의 증식률이 대조군에 비해 월등하게 향상된 것을 확인하였다.
실시예 5: 치주세포의 골세포 분화능력 증가 확인
인간유래 치주인대 섬유아세포인 HPdLF (human periodontal ligament fibroblasts, LONZA)를 5% FBS가 첨가된 SCGM 배지 (CC-3205, LONZA, Switzerland)를 이용하여 24웰 플레이트에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 골세포로의 분화를 확인하기 위해 배양액 제거 후 DPBS로 세척한 뒤, 골세포분화 배지(A1007201, Gibco)에 엑소좀 (BxC-e, BxC-R56e, BxC-R26e, BxC-I10e)을 100㎍/ml 농도로 넣은 후, 배지 500㎕씩를 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이때, 2-3일 간격으로 배지를 교환하여 주고 8일간 배양 후 골세포 분화 확인 염색을 하였다. 배지 제거 후, DPBS로 다시 세척하고 4% 파라포름알데하이드 용액 (163-20145, Wako)으로 10분간 고정하였다. 파라포름알데하이드 용액을 제거하고 DPBS로 세척한 후 Alizarin red S로 15분간 염색을 한 뒤 DPBS로 세척하였다. Cetylpyridinium chloride (C0732, Sigma)를 증류수에 녹여 10% CPC 용액을 만들어 각 웰에 200㎕씩 넣어 탈염색을 한 후, 탈염색한 용액을 10% CPC 용액으로 1/5 로 희석하여 96웰 플레이트에 옮겨 550nm로 흡광도를 측정하여 골세포의 분화능력을 측정하였으며, 그 결과를 도 2a, 2b 및 표 2에 나타내었다.
Undif
(미분화)		 PBS BxC-e BxC-R56e BxC-R26e BxC-I10e
평균 분화 비율 1 30.4 9.4 164.2 54.0 62.5
실험결과, 도 2a 내지 2b 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, 확인할 수 있듯이 레스베라트롤, P 물질, PMA 전처리 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포 유래 엑소좀 (BxC-R56e, BxC-R26e, BxC-I10e)은 치주유래 세포의 골세포로의 분화를 촉진시킴을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 치주세포의 골세포 분화관련 유전자 발현증가
인간유래 치주인대 섬유아세포인 HPdLF (human periodontal ligament fibroblasts, LONZA)를 5% FBS가 첨가된 SCGM 배지 (CC-3205, LONZA, Switzerland)를 이용하여 6웰 플레이트에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 골세포로의 분화를 확인하기 위해 배양액 제거 후 DPBS로 세척한 뒤, 엑소좀 (BxC-e, BxC-R56e, BxC-R26e, BxC-I10e)을 100㎍/ml 농도로 넣은 골세포분화 배지 (A1007201, Gibco)를 1.5mL씩 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이때 2-3일 간격으로 배지를 교환하여 주고 7일간 배양하였다.
배양이 끝난 뒤 골세포 분화 유전자의 정량적 발현 비교 실험을 진행한다. 각 웰에 트리졸 용액 (TRIZol reagent, 15596-018, Invitrogen) 1mL를 첨가하여 세포를 분해한 후, 1.5ml 튜브에 옮겨 담은 후 클로로포름 (Chloroform, C2432, Sigma) 200㎕를 첨가하고 볼텍스 (vortex)한 뒤, 4℃, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새 1.5ml 튜브로 옮긴 후 이소프로판올 (Isopropanol, 1096342511, Merck Millipore) 500㎕와 섞어주었다. 튜브를 50회 업&다운해준 뒤, 5분 동안 아이스에 방치한 후, 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 제거하였다. 남은 침전물에 70% 에탄올 1 mL를 가한 후, 12,000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 보이지 않을 동안 건조시키고, nuclease free water를 사용하여 RNA 펠렛을 용해시켰다. 나노드롭 (Nanodrop)을 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고 AccuPower CycleScript RT PreMix(dT20) (K-2044, Bioneer, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
이후, 합성한 cDNA와 하기 표 3의 제작한 프라이머 (코스모진텍)를 사용하여 Real time PCR (Real time-polymerase chain reaction)를 이용하여 OC, BMP-2 및 RUNX2의 mRNA 발현 변화를 확인하였으며, 측정한 결과를 도 3a 내지 3c 및 표 4 내지 6에 나타내었다.
순번 명명 서열 (5’-3’) 비고
1 OC_Foward CTCACACTCCTCGCCCTATTG
2 OC_Reverse GCTTGGACACAAAGGCTGCAC
3 BMP-2_Foward TGCGGTCTCCTAAAGGTCG
4 BMP-2_Reverse AACTCGAACTCGCTCAGGAC
5 RUNX2_Foward GCGGTGCAAACTTTCTCCAG
6 RUNX2_Reverse TGCTTGCAGCCTTAAATGACTC
PBS BxC-e BxC-R56e BxC-R26e BxC-I10e
OC 발현량 1.0 0.9 1.6 1.1 1.2
PBS BxC-e BxC-R56e BxC-R26e BxC-I10e
BMP2 발현량 1.0 1.0 2.6 1.7 2.1
PBS BxC-e BxC-R56e BxC-R26e BxC-I10e
RUNX2 발현량 1.0 1.4 2.3 1.6 2.1
실험결과, 도 3a 내지 3c 및 표 4 내지 6에서 확인할 수 있듯이, BxC-R56e, BxC-R26e 및 BxC-I10e 엑소좀을 처리한 군에서 치주세포의 골세포 분화관련 유전자인 OC, BMP2, RUNX2 모두 대조군에 비해서 발현량이 유의하게 상승한 것을 확인하였다.
실시예 7: 치주세포 상처 치유 (Wound healing) 및 세포 이동 (migration) 능력 확인
상기 실시예 2 및 3에서 분리된 엑소좀 (BxC-e, BxC-R56e, BxC-R26e, BxC-I10e)에 대하여 인간 치주인대 유래 섬유아세포의 스크래치 상처의 회복률 증가를 확인하였다.
인간유래 치주인대 섬유아세포인 HPdLF (human periodontal ligament fibroblasts, LONZA)를 5% FBS가 첨가된 SCGM 배지 (CC-3205, LONZA, Switzerland)를 이용하여 6웰 플레이트에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 16시간 (overnight) 동안 배양하였다. 세포 형광 염색을 위해 Cell Tracker (C2925, Invitrogen)를 넣은 배지로 교환 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 30분 동안 배양하였다. 200㎕ 팁을 이용하여 각 웰의 가운데를 일직선이 되도록 스크래치를 준 후 배양액 제거 후 DPBS로 세척한 뒤, 형광 이미지를 촬영하였다. 이후, 엑소좀의 스크래치 상처 회복능력을 확인하기 위해 배양액을 제거한 뒤 DPBS로 세척 후 엑소좀 (BxC-e, BxC-R56e, BxC-R26e, BxC-I10e)을 100㎍/ml 농도로 DMEM (11995-065, Gibco, USA)에 희석하여 1mL씩 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 16시간 배양하였다. 형광 이미지를 찍고 image J 프로그램을 이용하여 16시간 전 사진과 16시간 후 사진의 상처면적을 측정하여 면적의 감소 비율로 회복률을 측정하였으며, 측정한 결과를 도 4a 내지 4b 및 표 7에 나타내었다.
PBS BxC-e BxC-R56e BxC-R26e BxC-I10e
Closure 비율 1.00 1.84 3.39 3.15 2.59
실험결과, 도 4a 내지 4b 및 표 7에서 확인할 수 있듯이, BxC-e, BxC-R56e, BxC-R26e, BxC-I10e 엑소좀을 처리한 군 모두에서 치주세포의 상처 치유 및 세포 이동 촉진 능력이 월등하게 향상된 것을 확인하였다.
<110> Brexogen Inc. <120> Composition for preventing or treating periodontal disease comprising exosomes derived from induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells <130> PN200348 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC_Foward <400> 1 ctcacactcc tcgccctatt g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC_Reverse <400> 2 gcttggacac aaaggctgca c 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-2_Foward <400> 3 tgcggtctcc taaaggtcg 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-2_Reverse <400> 4 aactcgaact cgctcaggac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX2_Foward <400> 5 gcggtgcaaa ctttctccag 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX2_Reverse <400> 6 tgcttgcagc cttaaatgac tc 22

Claims (11)

  1. 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC) 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환 (periodontal disease)의 예방, 억제, 완화 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 치주질환은 구내염 (stomatitis), 설염 (glossitis), 치은염 (gingivitis), 치주염 (periodontal inflammation), 치조골파손 (alveolar bone breakage) 및 치조골형성장애 (alveolar bone osteodystrophy)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  4. 전처리 물질로 전처리된, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)-유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC) 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환 (periodontal disease)의 예방, 억제, 완화 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 것인, 약제학적 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 치주질환은 구내염 (stomatitis), 설염 (glossitis), 치은염 (gingivitis), 치주염 (periodontal inflammation), 치조골파손 (alveolar bone breakage) 및 치조골형성장애 (alveolar bone osteodystrophy)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 전처리 물질은 레스베라트롤 (Resveratrol), P 물질 (Substance P), 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산 (Phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 약제학적 조성물.
  8. 다음 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC) 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSC) 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 완화, 억제, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조 방법:
    유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양물로부터 엑소좀을 분리하는 분리 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포로부터 분화된 것인, 약제학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 방법은 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 전처리 물질로 전처리하는 전처리 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 전처리 물질은 레스베라트롤 (Resveratrol), P 물질 (Substance P), 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산 (Phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 방법.
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