KR20220076684A - Self-healing protein hydrogel and manufacturing method of the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자기치유 기능성 단백질 나노케이지 하이드로겔에 관한 것으로, 보다 자세하게는 특정한 구조를 가지지 않으며 탄성력 있는 IDP 단백질을 구조적 안정성이 탁월한 단백질 나노케이지에 유전공학적으로 연결한 빌딩 블럭(building block)을 제작한 후, di- 또는 tri- 티로신 가교결합을 형성하여 제작한 하이드로겔 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 자가치유 기능성 단백질 나노케이지 하이드로겔은 균일한 공극 분포를 보이고 높은 수분 함량 및 구조적 안정성이 우수한 탄성 중합체 성질을 보이고, 열 에너지를 가하여 가역적 회복이 가능하며, 생체 적합성과 생분해성이 우수하여 바이오 메디컬 분야에 활용이 가능하다.The present invention relates to a self-healing functional protein nanocage hydrogel, and more specifically, a building block that does not have a specific structure and genetically connects an elastic IDP protein to a protein nanocage with excellent structural stability. Then, it relates to a hydrogel produced by forming a di- or tri- tyrosine cross-link and a method for preparing the same.
The self-healing functional protein nanocage hydrogel of the present invention exhibits a uniform pore distribution, high moisture content and excellent elastomeric properties with structural stability, reversible recovery by applying thermal energy, and excellent biocompatibility and biodegradability. It can be used in the biomedical field.
Description
본 발명은 자기치유 기능성 단백질 나노케이지 하이드로겔에 관한 것으로, 보다 자세하게는 특정한 구조를 가지지 않으며 탄성력 있는 IDP 단백질을 구조적 안정성이 탁월한 단백질 나노케이지에 유전공학적으로 연결한 빌딩 블럭(building block)을 제작한 후, di- 또는 tri- 티로신 가교결합을 형성하여 제작한 하이드로겔 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a self-healing functional protein nanocage hydrogel, and more specifically, a building block that does not have a specific structure and genetically connects an elastic IDP protein to a protein nanocage with excellent structural stability. Then, it relates to a hydrogel produced by forming a di- or tri- tyrosine cross-link and a method for preparing the same.
하이드로겔은 물리적 또는 화학적으로 가교결합된 친수성의 고분자 매트릭스로, 높은 수분함량, 유연성, 탄력성 등 살아있는 조직과 유사한 성질을 지닌다는 면에서 바이오의약 분야의 조직공학 및 약물전달의 소재로 다양하게 응용되고 있다. 현재 널리 사용되고 고분자 하이드로젤로 polyacrylamide(PA) hydrogel, polyethylene glycol(PEG) hydrogel, Polyvinyl Chloride(PVC), Polypropylene(PP), Polystyrene(PS), Polyethylene(PE) 등이 응용되고 있으며 대부분이 인공적 합성 고분자를 기반으로 하고 있는 소재이다. Hydrogel is a physically or chemically cross-linked hydrophilic polymer matrix, and in that it has properties similar to living tissue such as high water content, flexibility, and elasticity, it is widely applied as a material for tissue engineering and drug delivery in the biomedical field. have. Polyacrylamide (PA) hydrogel, polyethylene glycol (PEG) hydrogel, Polyvinyl Chloride (PVC), Polypropylene (PP), Polystyrene (PS), Polyethylene (PE), etc. are currently widely used polymer hydrogels, and most of them are artificial synthetic polymers. It is a material based on
하지만 주로 사용되는 소재인 Polyacrylamide(PA)의 경우, 독성을 지니고 있어 3D 구조에서의 cell encapsulation이 불가능하고 Polyethylene glycol(PEG) 또한 인체에서의 세포 섭취 방해 작용, 면역반응을 일으킬 수 있다는 한계가 존재한다. 이와 같이 인공적 합성 나노소재가 인체와 환경에 미치는 심각한 악영향과 그 안전성/독성/유해성 문제가 본격적으로 대두되고 있는 와중에, 단백질 하이드로겔은 뛰어난 생체적합성과 생분해성, ECM(세포외기질, Extracellcular materix)을 모방할 수 있는 능력, 겔에 유전공학적, 화학적 기법을 이용하여 생물학적 기능을 부여 수 있다는 점으로 인해 많은 관심을 받고 있다. 하지만 상대적으로 낮은 안정성과 물성조절의 어려움, 낮은 기계적 성질로 인해 활용에 제한이 있다. However, in the case of polyacrylamide (PA), a material mainly used, because it is toxic, cell encapsulation in 3D structure is impossible, and polyethylene glycol (PEG) also has limitations in that it can interfere with cell uptake in the human body and cause an immune response. . In the midst of the serious adverse effects of artificial synthetic nanomaterials on the human body and the environment and the safety/toxicity/hazard issues thereof, protein hydrogels have excellent biocompatibility, biodegradability, and extracellular matrix (ECM). It is receiving a lot of attention due to its ability to mimic the gel and its ability to impart biological functions to gels using genetic engineering and chemical techniques. However, its use is limited due to relatively low stability, difficulty in controlling physical properties, and low mechanical properties.
이에 단백질 하이드로겔의 단점을 보완하기 위해, (i)엘라스틴, 레질린, 실크파이브로인 등의 천연 단백질 고분자에 PA, PEG등의 합성고분자를 화학적으로 결합하는 시도 또는 (ii)탄성력을 지닌 단백질의 반복서열을 활용하는 연구들, 대한민국 공개특허 제10-2014-7018751호와 같이 단백질 입자 분말 주위에 유기젤을 형성하는 조성물 형성 방법 등이 시도되고 있으나, 단백질만으로 이루어진 하이드로겔로 자연조직과 유사하면서 안정성이 높은 하이드로겔을 제작하는 것은 여전히 과제로 남아있다.In order to compensate for the shortcomings of the protein hydrogel, (i) an attempt to chemically bind synthetic polymers such as PA and PEG to natural protein polymers such as elastin, regiline, silk fibroin, or (ii) a protein with elasticity Studies utilizing the repetitive sequence of However, it remains a challenge to fabricate a hydrogel with high stability.
자연에서 발생하는 많은 물질들은(근육, ECM) 모두 계층적인 구조를 가지고 있고, 이는 구조적, 비구조적인 단백질로 결합되어 있다. ECM의 경우에는, 접히지 않은 단백질 도메인과 접힌 단백질 도메인의 균형으로 인해 기계적 특성이 결정된다. 또한, 이러한 기계적 특성은 단순히 기계적인 형태를 제공하는 것뿐만이 아니라, 세포 성숙, 분화, 운동성과 같은 생리학적 반응을 자극한다. Many substances that occur in nature (muscle, ECM) all have a hierarchical structure, which is combined with structural and non-structural proteins. In the case of ECM, mechanical properties are determined by the balance of unfolded and folded protein domains. In addition, these mechanical properties not only provide mechanical morphology, but also stimulate physiological responses such as cell maturation, differentiation, and motility.
따라서, 특정한 구조를 가지지 않으며 탄성력 있는 IDP 단백질을 구조적 안정성이 탁월한 단백질 나노케이지에 유전공학적으로 연결한 하나의 구조로 통합하여 자연적으로 발생하는 물질의 특성과 구조를 모방할 수 있는 단백질 하이드로겔을 제작할 필요가 있다.Therefore, it is possible to manufacture a protein hydrogel that can mimic the properties and structure of naturally occurring materials by integrating the elastic IDP protein without a specific structure into a single structure genetically linked to a protein nanocage with excellent structural stability. There is a need.
본 발명은 상기와 같은 필요를 해결하기 위하여 자기치유 기능성 단백질 하이드로겔 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a self-healing functional protein hydrogel and a method for preparing the same in order to solve the above needs.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,In order to achieve the above object, the present invention
자가조립 나노 케이지와 탄성 단백질이 결합된 일체형 빌딩 블록 단백질을 포함하고, 상기 탄성 단백질은 상기 자가조립 나노 케이지 표면에 계층적으로 구조화된, 단백질 하이드로겔을 제공한다.It includes an integral building block protein in which the self-assembled nano-cage and the elastic protein are combined, and the elastic protein is hierarchically structured on the surface of the self-assembled nano-cage, and provides a protein hydrogel.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,In order to achieve the above other object, the present invention
페리틴 나노 케이지 단백질과 탄성 단백질의 유전자를 결합하여 일체형 빌딩 블록 단백질을 생합성하는 제1단계;a first step of synthesizing an integral building block protein by combining the genes of the ferritin nanocage protein and the elastic protein;
상기 생합성된 단백질을 동결 건조하는 제2단계;a second step of freeze-drying the biosynthesized protein;
상기 동결 건조된 단백질을 증류수로 희석한 후 초음파 처리하는 제3단계; 및a third step of sonicating the freeze-dried protein after diluting it with distilled water; and
상기 초음파 처리된 단백질을 열 처리하여 하이드로겔을 형성하는 제4단계;를 포함하고, 상기 열 처리를 통해 단백질간 가교를 형성하는, 단백질 하이드로겔 제조방법을 제공한다.A fourth step of heat-treating the sonicated protein to form a hydrogel; and providing a method for producing a protein hydrogel comprising, forming a cross-link between proteins through the heat treatment.
본 발명의 자가치유 기능성 단백질 하이드로겔은 균일한(homogenous) 공극 분포를 보이고 높은 수분 함량 및 구조적 안정성이 우수한 탄성 중합체 성질을 보이고, 열 에너지를 가하여 가역적 회복이 가능하며, 생체 적합성과 생분해성이 우수하여 바이오 메디컬 분야에 활용이 가능하다.The self-healing functional protein hydrogel of the present invention shows a uniform (homogenous) pore distribution, high moisture content and excellent elastomeric properties with structural stability, reversible recovery is possible by applying thermal energy, and excellent biocompatibility and biodegradability Therefore, it can be used in the biomedical field.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 빌딩 블록 단백질의 제조방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 빌딩 블록 단백질의 유전자를 나타낸 개략도, 나노 규모의 투과 전자 현미경 사진, 동적 광 산란(DLS) 결과, 및 크로마토그래피 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 또는 비교예에 따른 고체 겔 생성 결과를 나타낸 모식도 및 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 또는 비교예의 di- 또는 tri-티로신 가교결합에 따른 자외선 조명 하(under UV ilumination) 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 하이드로겔의 SEM 이미지이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 열처리 전후 NC-IDP 용액(1wt%)의 AFM 이미지이다.
도 7은 본 발명의 단백질 하이드로겔의 진동 유변학적 특성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 단백질 하이드로겔의 팽윤 비율과 수분 함유량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 하이드로겔의 자가 치유를 확인한 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 하이드로겔의 37℃에서 자가 치유를 확인한 사진이다.1 is a schematic diagram showing a method for producing a building block protein according to an embodiment of the present invention.
2 is a schematic diagram showing a gene of a building block protein prepared according to an embodiment of the present invention, a nano-scale transmission electron micrograph, a dynamic light scattering (DLS) result, and a chromatography result.
3 is a schematic diagram and a photograph showing the results of solid gel formation according to Examples or Comparative Examples of the present invention.
4 shows the results of under UV illumination according to di- or tri-tyrosine crosslinking of Examples or Comparative Examples of the present invention.
5 is an SEM image of a hydrogel according to an embodiment of the present invention.
6 is an AFM image of an NC-IDP solution (1wt%) before and after heat treatment according to an embodiment of the present invention.
7 is a graph showing the vibrational rheological properties of the protein hydrogel of the present invention.
8 is a graph showing the swelling ratio and moisture content of the protein hydrogel according to an embodiment of the present invention.
9 is a photograph confirming self-healing of the protein hydrogel according to an embodiment of the present invention.
10 is a photograph confirming self-healing at 37° C. of a protein hydrogel according to an embodiment of the present invention.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일측면에 따르면 자가조립 나노 케이지와 탄성 단백질이 결합된 일체형 빌딩 블록 단백질을 포함하고, 상기 탄성 단백질은 상기 자가조립 나노 케이지 표면에 계층적으로 구조화된, 단백질 하이드로겔을 제공한다.According to one aspect of the present invention, it provides a protein hydrogel, comprising an integral building block protein in which a self-assembled nano-cage and an elastic protein are combined, wherein the elastic protein is hierarchically structured on the surface of the self-assembled nano-cage.
본 발명의 단백질 하이드로겔은 구조적 단백질과 구조화되지 않은 단백질의 계층적 구조 복합물로, 반고체 네트워크 재료이다. 구조적으로 정렬된 영역과 유연한 영역이 균형을 이룬다. 구체적으로 단백질 나노 케이지 결정을 IDP(Intrinsically disordered protein)와 유전자적(유전공학)으로 결합하여 일체형이면서 계층적인 반고체 하이드로겔을 제시한다. 본 발명의 빌딩 블록 단백질은 보다 바람직하게는, 구조화되지 않은 엘라스토머 rec1 resilin 단백질을 고도로 조직화된 결정 페리틴 나노케이지에 통합하여 제공될 수 있다. The protein hydrogel of the present invention is a semi-solid network material, which is a hierarchical structural complex of structural and unstructured proteins. Structurally aligned and flexible areas are balanced. Specifically, we present an integral and hierarchical semi-solid hydrogel by combining protein nanocage crystals with IDP (Intrinsically disordered protein) genetically (genetic engineering). More preferably, the building block protein of the present invention can be provided by integrating the unstructured elastomeric rec1 resilin protein into a highly organized crystalline ferritin nanocage.
자가조립 나노 케이지와 탄성 단백질은 유전공학적으로 융합되어 일체형 단백질을 형성하고, 자가조립 나노 케이지는 폴딩(folding)되고, 탄성 단백질은 언폴딩(unfolding)됨에 따라 폴딩된 자가조립 나노 케이지가 내부 공간을 차지하고, 언폴딩된 탄성 단백질이 자가조립 나노 케이지가 차지한 공간 바깥쪽을 둘러싸 계층적 구조를 형성하여 코어쉘과 유사한 형태를 형성한다.The self-assembled nano-cage and the elastic protein are genetically fused to form an integral protein, and the self-assembled nano-cage is folded and the elastic protein is unfolded. Occupying, the unfolded elastic protein surrounds the outside of the space occupied by the self-assembled nanocage to form a hierarchical structure, forming a shape similar to a core shell.
본 발명에서 자가조립 나노 케이지는 특별한 유도물질의 도움이 없이 발현과 동시에 규칙적인 배열에 의해 다량체(multimer)를 형성함으로써 나노입자를 형성할 수 있는 단백질을 의미하며, 페리틴, sHsp(small heat shock protein), vault, P6HRC1-SAPN, M2e-SAPN, MPER, SAPN, 및 다양한 바이러스 또는 박테리오파지 캡시드 단백질 일 수 있다. In the present invention, the self-assembled nanocage refers to a protein that can form nanoparticles by forming multimers by regular arrangement at the same time as expression without the help of a special inducer, ferritin, small heat shock (sHsp) protein), vault, P6HRC1-SAPN, M2e-SAPN, MPER, SAPN, and various viral or bacteriophage capsid proteins.
또한 탄성 단백질로는 resilin, rec1 resilin, elastin, elastin-like peptides, β-hairpin peptides, α-helical coiled coil peptides, silk fibroin, 또는 silk-like peptides을 이용할 수 있다. In addition, as the elastic protein, resilin, rec1 resilin, elastin, elastin-like peptides, β-hairpin peptides, α-helical coiled coil peptides, silk fibroin, or silk-like peptides may be used.
자가조립 나노케이지 단백질과 탄성 단백질은 유전공학 기법을 통하여 융합단백질 형태로 빌딩 블록 단백질을 형성한다. 각각의 빌딩 블록 단백질은 di- 또는 tri- 티로신(tyrosine) 결합을 형성하며, 별도의 가교제를 부가함 없이 열을 가하여 가교 결합을 형성할 수 있다. 열 처리는 30 ~ 60℃로 진행함이 바람직하다. di- 또는 tri- 티로신(tyrosine) 결합은 열처리를 이용한 방법, peroxidase-mediated crosslinking, THPP- or THP- mediated Mannichtype crosslinking, Ru(bpy)3 2+-mediated photochemical crosslinking, Photo-Fenton type crosslinking 이용하여 형성할 수 있다. Self-assembled nanocage proteins and elastic proteins form building block proteins in the form of fusion proteins through genetic engineering techniques. Each of the building block proteins forms di- or tri-tyrosine bonds, and cross-links can be formed by applying heat without adding a separate cross-linking agent. The heat treatment is preferably performed at 30 to 60°C. Di- or tri- tyrosine bond is formed using heat treatment method, peroxidase-mediated crosslinking, THPP- or THP- mediated Mannichtype crosslinking, Ru(bpy) 3 2+ -mediated photochemical crosslinking, Photo-Fenton type crosslinking can do.
자가조립 나노케이지 단백질과 탄성 단백질은 열 처리를 통해 빌딩 블록 단백질을 형성한다. 별도의 가교제를 부가함 없이 열을 가하여 가교 결합을 형성할 수 있다. 열 처리는 30 ~ 60℃로 진행함이 바람직하다.Self-assembled nanocage proteins and elastic proteins form building block proteins through heat treatment. Cross-linking may be formed by applying heat without adding a separate cross-linking agent. The heat treatment is preferably performed at 30 to 60°C.
나노 케이지들이 연결된 네트워크 구조를 형성하여 제작된 하이드로겔은 균질(homogenous)한 공극 분포를 보이고 높은 수분 함량 및 구조적 안정성이 우수하다. 또한 본 발명의 하이드로겔은 물리적으로 부서진 경우 열을 다시 가하게 되면 가교결합이 회복되며 자가 치유할 수 있음에 특징이 있다. The hydrogel produced by forming a network structure in which nanocages are connected shows a homogenous pore distribution and has excellent moisture content and structural stability. In addition, the hydrogel of the present invention is characterized in that when it is physically broken, crosslinking is restored and self-healing when heat is applied again.
본 발명의 단백질 하이드로겔은 순수 단백질만으로 이루어져 생체 적합성과 생분해성이 우수하다. 단백질 나노 케이지의 조직화된 특성이 resilin 단백질에 결정 구조 틀을 제공하므로 구조적 안정성이 우수하며, 계층적 구조적 특성과 초탄성 및 에너지 전환 메커니즘의 상관관계를 이용하여 생체 모방 물질로 이용할 수도 있다. 나노 케이지의 표면에 부착된 분자를 화학 또는 생물학적으로 변형하거나, 내부 공동에 특정 물질을 삽입하여 캡슐화하는 등 구조체로 활용도 가능하다.The protein hydrogel of the present invention is made of pure protein and has excellent biocompatibility and biodegradability. Since the organized nature of the protein nanocage provides a crystal structure framework for the resilin protein, it has excellent structural stability, and can also be used as a biomimetic material by using the correlation between the hierarchical structural properties and the hyperelasticity and energy conversion mechanism. It can also be used as a structure, such as chemically or biologically modifying molecules attached to the surface of the nanocage, or inserting a specific material into an internal cavity to encapsulate it.
본 발명의 다른 일측면에 따르면 페리틴 나노 케이지 단백질과 탄성 단백질의 유전자를 결합하여 일체형 빌딩 블록 단백질을 생합성하는 제1단계; 상기 생합성된 단백질을 동결 건조하는 제2단계; 상기 동결 건조된 단백질을 증류수로 희석한 후 초음파 처리하는 제3단계; 및 상기 초음파 처리된 단백질을 열 처리하여 하이드로겔을 형성하는 제4단계;를 포함하고, 상기 열 처리를 통해 단백질간 가교를 형성하는, 단백질 하이드로겔 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a first step of biosynthesizing an integral building block protein by combining the genes of the ferritin nanocage protein and the elastic protein; a second step of freeze-drying the biosynthesized protein; a third step of sonicating the freeze-dried protein after diluting it with distilled water; and a fourth step of heat-treating the sonicated protein to form a hydrogel.
일체형 빌딩 블록 단백질을 생합성하는 단계는 페리틴 나노 케이지 단백질과 탄성 단백질의 유전자를 유전공학적으로 결합하는 것을 포함한다. 구조적 단백질과 구조화되지 않은 단백질의 계층적 구조 복합물을 형성하기 위하여 반고체 네트워크 재료를 합성한다. 구조적으로 정렬된 영역과 유연한 영역이 균형을 이룬다. 구체적으로 단백질 나노 케이지 결정을 IDP(Intrinsically disordered protein)와 유전자적으로 결합하여 일체형이면서 계층적인 구조를 형성할 수 있다. 즉, 일체형 빌딩 블록 단백질은 구조화되지 않은 엘라스토머 rec1 resilin 단백질(유연한 단백질)을 고도로 조직화된 결정 페리틴 나노케이지에 통합하여 제공될 수 있다.The step of biosynthesizing the integral building block protein includes genetically engineering the gene of the ferritin nanocage protein and the elastic protein. A semi-solid network material is synthesized to form a hierarchical structural complex of structural and unstructured proteins. Structurally aligned and flexible areas are balanced. Specifically, an integral and hierarchical structure can be formed by genetically combining protein nanocage crystals with an intrinsically disordered protein (IDP). That is, an integral building block protein can be provided by integrating unstructured elastomeric rec1 resilin protein (flexible protein) into highly organized crystalline ferritin nanocages.
생합성된 단백질은 동결 건조, 증류수 희석, 초음파 처리를 거친 후 하이드로겔 형성 공정단계에 투입된다.The biosynthesized protein is subjected to freeze-drying, dilution with distilled water, and sonication, and then added to the hydrogel formation process step.
본 발명의 하이드로겔 형성단계는 별도의 가교제를 투입하지 않고 열 처리를 통해 하이드로겔을 형성할 수 있다. 열 처리는 30 ~ 60℃로 진행함이 바람직하다. 열 처리에 따라 형성되는 가교 결합은 di- 또는 tri- 티로신(tyrosine) 결합일 수 있다.The hydrogel forming step of the present invention can form a hydrogel through heat treatment without adding a separate crosslinking agent. The heat treatment is preferably performed at 30 to 60°C. The crosslinks formed by heat treatment may be di- or tri-tyrosine bonds.
본 발명의 단백질 하이드로겔 제조방법은 유전공학적 결합으로 일체형 빌딩 블록 단백질을 형성하고, 열 처리를 통해 하이드로겔을 형성함에 따라 구조적 안정성을 향상하면서 자가 치유 기능성을 가지는 단백질 하이드로겔을 제조할 수 있는 점에서 우수하다.The protein hydrogel production method of the present invention can produce a protein hydrogel having self-healing functionality while improving structural stability by forming an integral building block protein through genetic engineering and forming a hydrogel through heat treatment excellent in
이하, 첨부된 도면들을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 상세히 설명하기로 한다. 한편, 해당 기술분야의 통상적인 지식을 가진 자로부터 용이하게 알 수 있는 구성과 그에 대한 작용 및 효과에 대한 도시 및 상세한 설명은 간략히 하거나 생략하고 본 발명과 관련된 부분들을 중심으로 상세히 설명하도록 한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. On the other hand, the illustration and detailed description of the configuration and the action and effect thereof, which can be easily known from those of ordinary skill in the art, will be simplified or omitted, and the parts related to the present invention will be mainly described in detail.
<실시예 및 실험><Examples and Experiments>
IDP(NC-ICP) 빌딩 블록 단백질을 표시하는 나노 케이지 결정의 생합성Biosynthesis of Nanocage Crystals Marking IDP (NC-ICP) Building Block Proteins
재조합 rec1-resilin과 인간 페리틴 중쇄(hFTN-H)유전자는 유전자 합성 서비스(CosmoGenetect Co., Korea)를 이용하여 얻었다. 연장 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 및 유전자 클론 6·히스티딘 :: hFTN-H :: 링커 :: Rec1-resilin, 6·히스티딘 :: hFTN-H 및 6·히스티딘 :: Rec1- resilin을 pT7-7 플라스미드 벡터에 넣어 각각 발현 벡터 pT7-NC-IDP, pT7-NC 및 pT7-IDP를 생성한다. Recombinant rec1-resilin and human ferritin heavy chain (hFTN-H) genes were obtained using a gene synthesis service (CosmoGenetect Co., Korea). Prolonged polymerase chain reaction (PCR) and
i)N-NdeI-6x Histidine tag-(hFH)-XhoI-C; i)N- Nde I-6x Histidine tag-(hFH) -Xho I-C;
ⅱ)N-XhoI-l-6x Histidine tag-Rec1 Resilin-HindⅢ-C; ii)N- Xho I-1-6x Histidine tag-Rec1 Resilin- Hind III-C;
ⅲ)N-NdeI-6x Histidine tag-(hFH)-linker-XhoI-Rec1 Resilin-HindⅢ-C; iii)N- Nde I-6x Histidine tag-(hFH)-linker- XhoI -Rec1 Resilin- Hind III-C;
구축된 벡터는 이후 재조합 단백질 발현을 위한 암피실린 내성 선별을 통해 E.coli(BL21(DE3))로 형질 전환하였다.The constructed vector was then transformed into E. coli (BL21 (DE3)) through ampicillin resistance selection for recombinant protein expression.
재조합 단백질의 발현 및 정제Expression and purification of recombinant proteins
상기 재조합 단백질이 형질전환된 세포를 37℃에서 암피실린(ampicillin)을 포함하는 LB 배양액에서 OD600이 1.1이 될 때까지 배양하였고 1 mM IPTG를 첨가 후 37℃에서 6시간동안 단백질 발현을 유도하였다. 상기 유도 후 원심분리하여 세포를 수득하였고 펠렛을 용해 완충액(1M Tris/HCL, 10mM Imidazole, 0.1% Triton-X, 5mM 2-mercaptoethanol, pH 7.4)에 재부유하였고 초음파 프로세서(ultrasonic processor)로 균질화하였다. 그 다음, 발현된 NC-IDP, NC 및 IDP는 Ni-NTA 크로마토그래피 단계를 통해 정제하였고 완충액을 Distilled water(DW) 로 교환해 준 후 -45℃에서 동결건조 하였다.The recombinant protein-transformed cells were cultured in LB culture medium containing ampicillin at 37°C until OD600 reached 1.1, and after addition of 1 mM IPTG, protein expression was induced at 37°C for 6 hours. After the induction, cells were obtained by centrifugation, and the pellet was resuspended in lysis buffer (1M Tris/HCL, 10 mM Imidazole, 0.1% Triton-X, 5 mM 2-mercaptoethanol, pH 7.4) and homogenized with an ultrasonic processor. . Then, the expressed NC-IDP, NC and IDP were purified through Ni-NTA chromatography step, and the buffer was exchanged with distilled water (DW) and then lyophilized at -45°C.
물리 화학적 특성화Physicochemical characterization
정제된 NC-IDP 단백질 샘플을 탄소 필름 200 구리 그리드(Electron Microscopy Science, USA)에 한 방울을 놓고 2% 암모늄 몰리브데이트 용액 또는 우라닐 아세테이트 용액 한 방울을 사용하여 음성으로 염색했다. NC-IDP의 형태는 생체 투과 전자 현미경(bio-TEM, Hitachi)으로 분석되었다. NC-IDP의 다량체 형태는 Superdex 컬럼(Superdex 200 10/300 GL 칼럼)을 사용하여 크기 배제 크로마토 그래피(SEC; Atka Purifier 100)로 분석했다. NC-IDP의 유체역학적 크기는 Zetasizer Nano ZS 시스템(Malvern Instruments, Ltd, UK)을 사용하여 동적 광 산란(DLS)에 의해 분석되었다.Purified NC-IDP protein samples were negatively stained by placing a drop on a
단백질 하이드로겔 형성Protein hydrogel formation
동결 건조된 단백질 분말 샘플을 증류수(DW)로 희석한 후 초음파 처리했다. 이 후 샘플을 고정 온도에서 20분 동안 가열하여 최종 하이드로겔을 형성했다.The freeze-dried protein powder sample was diluted with distilled water (DW) and then sonicated. The sample was then heated at a fixed temperature for 20 minutes to form the final hydrogel.
NC-IDP의 시스테인 잔기 돌연변이 유발Cysteine residue mutagenesis of NC-IDP
ferritin 중쇄의 ferroxidase 활성과 산화를 제거하기 위해 위치 90, 102, 130에서 3개의 시스테인을 암호화하는 인간 ferritin 중쇄 유전자를 각각 아르기닌, 알라닌 및 알라닌으로 돌연변이 시켰다. 돌연변이 C90R NC-IDP 및 삼중 돌연변이 C90R/C102A/C130A는 적절한 프라이머를 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발 키트(Intron, Korea)를 사용하여 생성되었다.To eliminate ferroxidase activity and oxidation of ferritin heavy chain, the human ferritin heavy chain gene encoding three cysteines at positions 90, 102, and 130 was mutated to arginine, alanine and alanine, respectively. Mutant C90R NC-IDP and triple mutant C90R/C102A/C130A were generated using a site-directed mutagenesis kit (Intron, Korea) using appropriate primers.
주사 전자 현미경 분석Scanning electron microscopy analysis
단백질 하이드로겔을 동결 건조하고 백금(Pt)으로 코팅한 다음 5kV의 가속 전압에서 10mA에서 60초 동안 작동하는 전계 방출 주사 전자현미경(FE-SEM, Hitachi SU8220)을 사용하여 시각화했다.The protein hydrogels were lyophilized, coated with platinum (Pt), and then visualized using a field emission scanning electron microscope (FE-SEM, Hitachi SU8220) operated at 10 mA for 60 s at an accelerating voltage of 5 kV.
원자힘 현미경 분석Atomic Force Microscopy Analysis
원자힘 현미경(AFM, XE7, Park system)을 이용하여 1 wt% NC-DIP 용액의 졸과 겔 상태의 형태학적 차이를 관찰하였다. AFM 이미지는 비접촉 모드에서 PPP-NCHR(Park system) 캔틸레버로 얻었다. 샘플 준비를 위해 용해 또는 겔화(55℃에서 1시간 동안) NC-IDP를 4000rpm의 스핀 속도로 실리콘 웨이퍼에 스핀 코팅했다.Morphological differences between the sol and gel states of 1 wt% NC-DIP solution were observed using an atomic force microscope (AFM, XE7, Park system). AFM images were acquired with a PPP-NCHR (Park system) cantilever in non-contact mode. For sample preparation, dissolving or gelling (at 55° C. for 1 hour) NC-IDP was spin coated onto a silicon wafer at a spin speed of 4000 rpm.
진동 유변학 분석Vibration Rheological Analysis
하이드로겔 샘플을 직경 25mm 평행판 형상의 진동 레오미터(MARS III, Thermo Scientific Inc., USA)의 평판 위에 놓고 25℃에서 33~35mm 간격 거리 조건에서 측정했다. 스트레인 스윕은 일정한 주파수(6 rad s-1)에서 0.1~1000% 스트레인으로 수행되었다. 응력 완화를 위해 전단 응력은 15% 및 45% 고정 변형에서 10분 동안 모니터링되었다.The hydrogel sample was placed on a flat plate of a 25 mm diameter parallel plate-shaped vibrating rheometer (MARS III, Thermo Scientific Inc., USA) and measured at 25° C. at a distance of 33 to 35 mm. Strain sweeps were performed with 0.1~1000% strain at a constant frequency (6 rad s −1 ). For stress relaxation, shear stress was monitored for 10 min at 15% and 45% fixed strain.
팽윤 분석swelling analysis
하이드로겔 샘플을 액체 N2에서 동결시키고 건조 중량을 측정하기 전에 동결 건조하였다. 하이드로겔의 건조 중량을 측정한 후, 건조된 하이드로겔 샘플을 인산염 완충 식염수(PBS)에 1일과 10일 동안 37℃에서 담근 후 여과지로 과량의 물을 블로팅한 후 하이드로겔의 습윤 중량을 측정하였다. 이러한 하이드로겔의 수분 함량은 평형에서 수분 함량(WC) 및 팽윤 비율(q)의 관점에서 평가되었다(WC=(Ws-Wd) / Ws×100, q=Ws/Wd.).The hydrogel samples were frozen in liquid N 2 and lyophilized prior to determining the dry weight. After measuring the dry weight of the hydrogel, the dried hydrogel sample was immersed in phosphate buffered saline (PBS) at 37° C. for 1 and 10 days, and then the wet weight of the hydrogel was measured after blotting excess water with a filter paper. did. The water content of these hydrogels was evaluated in terms of water content (WC) and swelling ratio (q) at equilibrium (WC=(Ws-Wd)/Ws×100, q=Ws/Wd.).
자가 치유 분석self-healing assay
55℃의 조건에서 20분 동안 가열하여 유발된 계층적 단백질 하이드로겔을 형성한 후 주사기 바늘을 사용하여 물리적으로 분쇄하였다. 분쇄된 물질은 단백질이 하이드로겔 상태를 재형성하는 능력을 테스트하기 위해 열 블록을 사용하여 12시간 동안 추가 열처리(55 또는 37℃)를 거쳤다.After forming a hierarchical protein hydrogel induced by heating at 55° C. for 20 minutes, it was physically pulverized using a syringe needle. The pulverized material was subjected to an additional heat treatment (55 or 37° C.) for 12 h using a heat block to test the ability of the protein to re-form the hydrogel state.
<결과 및 평가><Results and evaluation>
빌딩 블록 단백질의 설계, 생합성 및 물리 화학적 특성화Design, biosynthesis and physicochemical characterization of building block proteins
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 빌딩 블록 단백질의 제조방법을 나타낸 개략도이다. 도 1을 참고하여 설명하면, 계층적 하이드로겔을 위한 빌딩 블록 단백질을 설계했다. 날개, 힌지 및 힘줄과 같은 특수한 해부학적 구조에서 발견되는 탄성 IDP인 Resilin(>92%)은 구조화되지 않은 특성과 고무와 같은 유연성과 탄력성이 나타나는 특징을 가짐에 따라, 구조적 유연성을 제공하기 위해 선택되었다. 1 is a schematic diagram showing a method for producing a building block protein according to an embodiment of the present invention. Referring to FIG. 1 , a building block protein for a hierarchical hydrogel was designed. Resilin (>92%), an elastic IDP found in specialized anatomical structures such as wings, hinges, and tendons, was chosen to provide structural flexibility, as it possesses unstructured properties and rubber-like flexibility and resilient properties. became
특히, Drosophila melanogaster의 resilin의 exon I에 의해 암호화된 재조합 resilin 유사 단백질인 rec1은 천연 resilin과 물리적 특성이 유사하기 때문에 본 연구에 사용되었다. 또한, 우리는 충분한 기계적 안정성을 제공하고 자연적인 계층 구조적 접힌 단백질 도메인을 모방하기 위해 균일한 크기 분포를 가진 단백질 나노 케이지를 사용했다. 다양한 단백질 나노 케이지 중에서 인간 페리틴 중쇄(hFTN-H)는 결정 구조적 특성과 광범위한 pH 및 온도 값, 다양한 물리 화학적 조건에서 뛰어난 구조적 안정성으로 인해 선택되었다. In particular, rec1, a recombinant resilin-like protein encoded by exon I of resilin from Drosophila melanogaster, was used in this study because its physical properties are similar to those of natural resilin. Furthermore, we used protein nanocages with uniform size distribution to provide sufficient mechanical stability and mimic the natural hierarchical folded protein domains. Among the various protein nanocages, human ferritin heavy chain (hFTN-H) was selected because of its crystalline structural properties, a wide range of pH and temperature values, and excellent structural stability under various physicochemical conditions.
이러한 인공 구조 및 구조화되지 않은 단백질을 사용하여 그림 2a와 같이 계층적 하이드로 게을 위한 빌딩 블록 단백질의 플라스미드 벡터를 구축했다. hFTN-H에 대한 유전자는 유연한 글리신이 풍부한 링커 서열(GGGGS)3에 대한 유전자와 함께 rec1-IDP에 대한 유전자와 융합되었으며, 이 구조의 발현은 페리틴 기반 나노 케이지가 표면에 높은 rec1-IDP 밀도를 표시하는 결과를 가져왔다. Using these artificial structures and unstructured proteins, we constructed a plasmid vector of the building block protein for the hierarchical hydrogease as shown in Figure 2a. The gene for hFTN-H was fused with the gene for rec1-IDP along with the gene for flexible glycine-rich linker sequence (GGGGS) 3 , and expression of this construct showed that the ferritin-based nanocage exhibited high rec1-IDP density on the surface. resulted in display.
재조합 단백질, 즉 IDP(NC-IDP)를 표시하는 나노 케이지 결정은 65.8% 용해도로 대장균에서 성공적으로 발현되고, Ni 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. 재조합 빌딩 블록 NC-IDP의 다량체화, 나노 규모 및 형태는 투과 전자 현미경(TEM), 동적 광 산란(DLS) 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 관찰되었다. 도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 빌딩 블록 단백질의 유전자를 나타낸 개략도(a), 나노 규모의 투과 전자 현미경 사진(b), 동적 광 산란(DLS) 결과(c), 크로마토그래피 결과(d)이다. 도 2를 참고하여 설명하면, 야생형 페리틴 나노 케이지의 구형 형태와 유사하게 NC-IDP는 직경이 약 18~20nm인 구형 입자를 형성했다. 또한, NC-IDP의 평균 직경은 19.39±1.23 nm로 야생형 페리틴 나노 케이지의 약 10~12nm 값보다 큰 것으로 확인되었다. Nanocage crystals displaying the recombinant protein, namely IDP (NC-IDP), were successfully expressed in E. coli with 65.8% solubility and purified using Ni affinity chromatography. Multimerization, nanoscale and morphology of the recombinant building block NC-IDP was observed using transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering (DLS) and size exclusion chromatography. 2 is a schematic diagram showing the gene of the building block protein prepared according to an embodiment of the present invention (a), a nano-scale transmission electron micrograph (b), dynamic light scattering (DLS) result (c), chromatography result ( d). Referring to FIG. 2 , similar to the spherical shape of the wild-type ferritin nanocage, NC-IDP formed spherical particles with a diameter of about 18-20 nm. In addition, it was confirmed that the average diameter of NC-IDP was 19.39±1.23 nm, which was larger than the value of about 10-12 nm of the wild-type ferritin nanocage.
종합적으로 자기 조립 결정 구조 나노 케이지에 IDP를 제시하는 빌딩 블록 단백질(NC-IDP)을 설계하고 생성하였다. 그리고 처음 합성되었을 때, 이 NC-IDP는 불용성이며 친수성 고분자 매트릭스로 바뀌는 가교되지 않은 수용성 종이며 다음에 설명되는 바와 같이 열적으로 변형되어 가교될 수 있음을 확인하였다.We designed and generated a building block protein (NC-IDP) that comprehensively presents IDPs in self-assembled crystal structure nanocages. And when first synthesized, it was confirmed that this NC-IDP is an insoluble, non-crosslinked water-soluble species that transforms into a hydrophilic polymer matrix, and can be thermally deformed and cross-linked as described below.
열적으로 유도된 NC-DIP의 하이드로겔로의 변환Transformation of Thermally Induced NC-DIPs into Hydrogels
종래의 resilin 기반 하이드로겔은 di 또는 tri-티로신 결합의 생화학적으로 가교된 네트워크로 만들어지며, (i)퍼옥시다제(peroxidase), (ii)Mannich-유형 반응, (iii)감광제[Ru (bpy) 32+] 매개 광 화학적 가교 및 (iii)광-펜톤 반응과 같은 여러 전략을 사용하여 생산된다. Conventional resilin-based hydrogels are made of biochemically cross-linked networks of di- or tri-tyrosine bonds, (i) peroxidase, (ii) Mannich-type reaction, (iii) photosensitizer [Ru (bpy) ) 32+] mediated photochemical crosslinking and (iii) photo-Fenton reactions.
그러나 본 발명은 먼저 rec1의 열 전이를 사용하여 가교된 고체 고분자 매트릭스를 생성하였다. 수용액의 rec1 단백질은 이전 연구에서 온도, pH, 이온 및 빛에 대한 다중 자극 반응을 나타내는 것으로 확인되었다. 특히, rec1 단백질은 조직화된 원 섬유 구조를 형성하는 것으로 나타났으며, 가열로 인해 결합된 물이 손실되면 보다 단단하고 더 응측 되며 정렬된 소구체(globules)를 형성하였다. 이 소구체는 티로신의 페놀 방향족 그룹 사이의 소수성 상호 작용의 형성을 촉진하고 인접 단백질 사슬을 형성하여 di 또는 tri-티로신 가교를 형성한다. rec1의 열전이가 약 50℃에서 발생하는 것으로 측정되었기 때문에 현재 작업에서는 하이드로겔화를 위해 55℃의 열처리 온도를 선택하였다.However, the present invention first used the thermal transfer of rec1 to generate a cross-linked solid polymer matrix. The rec1 protein in aqueous solution was identified in previous studies to exhibit multi-stimulatory responses to temperature, pH, ions and light. In particular, the rec1 protein was shown to form an organized fibrillar structure, and when the bound water was lost due to heating, it formed harder, more coagulated and ordered globules. These globules promote the formation of hydrophobic interactions between the phenolic aromatic groups of tyrosine and form adjacent protein chains to form di- or tri-tyrosine bridges. Since the thermal transition of rec1 was measured to occur at about 50 °C, in the present work, a heat treatment temperature of 55 °C was selected for hydrogelation.
도 3은 본 발명의 실시예 또는 비교예에 따른 고체 겔 생성 결과를 나타낸 모식도 및 사진이다. 도 3을 참고하여 설명하면, 20 wt% NC-IDP 용액(200mg/ml)은 열처리를 거쳐 고체 고분자 물질로 성공적으로 변형되었다(a). 반면에 동일한 20 wt% rec1 단백질 용액은 고체 겔을 생성하지 못했으며(e), 가열을 통한 겔화, 즉 di- 또는 tri-티로신 결합을 형성하기 위해서는 rec1 단백질만으로는 부족함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 탄성체 IDP를 나노 케이지 단백질에 통합하여 하이드로겔 구조를 위한 충분한 기계적 안정성을 확보할 수 있음을 확인하였다. 3 is a schematic diagram and a photograph showing the results of solid gel generation according to Examples or Comparative Examples of the present invention. Referring to FIG. 3 , a 20 wt% NC-IDP solution (200 mg/ml) was successfully transformed into a solid polymer material through heat treatment (a). On the other hand, the same 20 wt% rec1 protein solution did not produce a solid gel (e), and it was confirmed that rec1 protein alone was insufficient to form a di- or tri-tyrosine bond through heating. Through these results, it was confirmed that sufficient mechanical stability for the hydrogel structure could be secured by integrating the elastomer IDP into the nanocage protein.
도 4는 본 발명의 실시예 또는 비교예의 di- 또는 tri-티로신 가교결합에 따른 자외선 조명 하(under UV ilumination) 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 (b)를 참고하여 설명하면, 자외선(UV) 조명을 받은 NC-IDP 하이드로겔 샘플은 청색 형광을 나타냈으며, 하이드로겔에서 di- 또는 tri-티로신 가교의 존재를 확인할 수 있었다. 반면 di-또는 tri-티로신 결합이 없는 대조 합성 아크릴 아미드겔은 이러한 형광은 보이지 않았다.4 shows the results of under UV illumination according to di- or tri-tyrosine crosslinking of Examples or Comparative Examples of the present invention. Referring to FIG. 4 (b), the NC-IDP hydrogel sample irradiated with ultraviolet (UV) light exhibited blue fluorescence, confirming the presence of di- or tri-tyrosine bridges in the hydrogel. On the other hand, the control synthetic acrylamide gel without di- or tri-tyrosine bond did not show such fluorescence.
rec1을 페리틴 나노 케이지에 통합하는 겔 변환에 대한 효과를 더 이해하기 위해, 야생형 페리틴 나노 케이지와 rec1 단백질을 개별적으로 합성했다. 개별 야생형 페리틴 나노 케이지와 rec1 단백질로 구성된 용액의 열처리는 겔화를 유발하지 않았다(도 3의 b). 특히 페리틴은 철의 생리학적 저장에 중요한 역할을 하기 때문에 'ferroxidase 반응'을 이용하여 스스로 산화(·OH생성)한다. Ferroxidase 활성은 90번 위치에서 시스테인에 의한 페리틴 나노 케이지들의 산화와 함께 인간 페리틴 중쇄에 의해서도 나타나는 것으로 관찰되었다. To further understand the effect on gel transformation of integrating rec1 into ferritin nanocages, wild-type ferritin nanocages and rec1 protein were synthesized separately. Heat treatment of individual wild-type ferritin nanocages and solutions composed of rec1 protein did not induce gelation (Fig. 3b). In particular, since ferritin plays an important role in the physiological storage of iron, it oxidizes (·OH generation) by itself using the 'ferroxidase reaction'. Ferroxidase activity was observed to be expressed by human ferritin heavy chain as well as oxidation of ferritin nanocages by cysteine at position 90.
겔화를 일으킨 페리틴의 ferroxidase 활성으로 인한 촉매 반응인지 확인하기 위해 먼저 NC-IDP의 시스테인 잔기 90이 아르기닌으로 대체된 돌연변이 형태를 테스트했다. 도 3의 (c)에서 볼 수 있듯이, 이러한 C90R NC-IDP 용액은 하이드로겔을 성공적으로 형성하여 페리틴 나노 케이지의 시스테인 잔기가 하이드로겔화 동안 NP-IDP의 가교에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 또한, 페리틴에서 ferroxidase 반응성 NP-IDP도 고체 겔로 변형되었다(도 3의 d). 이러한 결과는 NP-IDP 용액이 페리틴의 ferroxidase 활성의 결과가 아니라 결정 구조 나노 케이지에 포함된 rec1의 열 전이의 결과로 고체 고분자 네트워크로 변형되었음을 나타낸다.To confirm whether the gelation was catalyzed by ferroxidase activity of ferritin, we first tested a mutant form in which cysteine residue 90 of NC-IDP was replaced with arginine. As shown in Fig. 3(c), this C90R NC-IDP solution successfully formed a hydrogel, indicating that the cysteine residue of the ferritin nanocage did not affect the crosslinking of the NP-IDP during hydrogelation. In addition, ferroxidase-reactive NP-IDP in ferritin was also transformed into a solid gel (Fig. 3d). These results indicate that the NP-IDP solution was transformed into a solid polymer network not as a result of ferroxidase activity of ferritin, but as a result of thermal transfer of rec1 contained in the crystal structure nanocage.
종래 고체 겔을 생산하기 위한 rec1-resilin 단백질 용액의 최적 농도는 20 wt%인 것으로 나타났으며, 단백질 농도가 10 wt% 미만이면 고체 형태의 하이드로겔이 생성되지 않았다. 그러나 본 발명의 경우 20-, 10- 및 5- wt% NC-IDP 솔루션이 모두 열처리 후 고체 겔로 성공적으로 변환되는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 a). 또한, di- 또는 tri-티로신 가교의 양과 단백질 농도 사이의 긍정적인 연관성으로 인해 이러한 NC-IDP 겔은 NC-IDP 농도가 증가함에 따라 UV 조명하에서 청색 형광의 증가를 나타냈다(도 4의 b, c).The optimal concentration of the rec1-resilin protein solution for producing a conventional solid gel was found to be 20 wt%, and when the protein concentration was less than 10 wt%, a solid hydrogel was not produced. However, in the case of the present invention, it was confirmed that all of the 20-, 10-, and 5-wt% NC-IDP solutions were successfully converted into solid gels after heat treatment (FIG. 4a). In addition, due to the positive association between the amount of di- or tri-tyrosine crosslinking and the protein concentration, these NC-IDP gels showed an increase in blue fluorescence under UV illumination as the NC-IDP concentration increased (Fig. 4b,c). ).
또한, 55℃ 미만의 열처리 온도(37℃)에서도 NC-IDP 용액이 겔로 변하는 것을 관찰하여 NC-IDP가 세포 캡슐화 또는 주사 가능한 하이드로겔과 같은 생물 의학 응용 분야에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 열처리의 결과로 NC-IDP의 티로신 잔기 사이에 분자간 가교가 형성되고, NC-IDP 용액이 고체 물질로 성공적으로 변환되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 나노 케이지 단백질에 엘라스토머 IDP를 통합하는 것이 구조적 안정성을 제공하고 하이드로겔 스캐폴드의 기계적 안정성에 중요한 것으로 밝혀져 매우 낮은 단백질 농도의 용액에서도 하이드로겔을 생성할 수 있음을 의미한다. 열 유도 된 겔 형성은 종래 resilin 기반 하이드로겔화 방법(peroxidase-mediated crosslinking, THPP- or THP- mediated Mannichtype crosslinking, Ru(bpy)3 2+-mediated photochemical crosslinking, Photo-Fenton type crosslinking)에 비해 생체적합성이 높고 편리한 가교 전략인 점에서 우수하다.In addition, it was observed that the NC-IDP solution turned into a gel even at a heat treatment temperature of less than 55 ° C (37 ° C), confirming that NC-IDP can be effectively used in biomedical applications such as cell encapsulation or injectable hydrogels. As a result of the heat treatment, it was confirmed that an intermolecular bridge was formed between the tyrosine residues of NC-IDP, and the NC-IDP solution was successfully converted into a solid material. These results suggest that the incorporation of elastomeric IDPs into nanocage proteins has been shown to provide structural stability and is important for the mechanical stability of hydrogel scaffolds, suggesting that hydrogels can be generated even in solutions with very low protein concentrations. Heat-induced gel formation has lower biocompatibility compared to conventional resilin-based hydrogelation methods (peroxidase-mediated crosslinking, THPP- or THP- mediated Mannichtype crosslinking, Ru(bpy) 3 2+ -mediated photochemical crosslinking, Photo-Fenton type crosslinking). It is excellent in that it is a high and convenient crosslinking strategy.
계층적 단백질 하이드로겔의 마이크로 및 나노 구조Micro and nanostructure of hierarchical protein hydrogels
단백질 하이드로겔의 마이크로 및 나노 구조를 조사하기 위해 우리는 주사 전자 현미경(SEM) 및 원자힘 현미경(AFM) 분석을 수행했다. 균질한 다공성 형태는 자연 세포 행동에 유리하고 균일한 환경을 제공하기 때문에 효과적인 조직 재생을 실현하는 역할을 한다. To investigate the micro and nanostructure of protein hydrogels, we performed scanning electron microscopy (SEM) and atomic force microscopy (AFM) analysis. The homogeneous porous morphology serves to realize effective tissue regeneration as it provides a favorable and uniform environment for natural cell behavior.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 하이드로겔의 SEM 이미지이다. (a)는 20wt%, (b)는 10wt%, (c)는 5 wt% NC-IDP 용액에 따른 결과이다. 도 5를 참고하여 설명하면, 본 발명에 따른 하이드로겔은 매우 균일한 기공 크기를 가진 다공성 3차원 스캐폴드로 구성됨을 관찰했으며, 이 형태는 분자간 가교를 사용하여 만들어진 좋은 연결에 기인함을 확인하였다. 20 wt%, 10 wt% 및 5 wt% NC-IDP 용액으로 만든 하이드로겔은 각각 1.047μm, 1.288μm 및 6.064μm의 평균 기공 치수를 나타냈다. 더 작은 크기의 기공으로 이어지는 더 높은 농도의 단백질 사용은 하이드로겔에서 관련된 증가 된 양의 di-티로신 및 tri-티로신 가교로부터 예상된다. 5 is an SEM image of a hydrogel according to an embodiment of the present invention. (a) is 20wt%, (b) is 10wt%, (c) is the result according to the 5 wt% NC-IDP solution. 5, it was observed that the hydrogel according to the present invention was composed of a porous three-dimensional scaffold with a very uniform pore size, and it was confirmed that this morphology was due to the good connection made using intermolecular crosslinking. . Hydrogels made with 20 wt%, 10 wt% and 5 wt% NC-IDP solutions exhibited mean pore dimensions of 1.047 μm, 1.288 μm and 6.064 μm, respectively. The use of higher concentrations of protein leading to smaller sized pores is expected from the associated increased amounts of di-tyrosine and tri-tyrosine crosslinking in the hydrogel.
특히, SEM 분석을 위해 준비된 동결 건조된 하이드로겔 샘플에서 생성된 균열이 배열에서 선형으로 배향되고 분쇄되지 않음을 관찰했고, 이는 분자 수준에서의 하이드로겔의 구조가 분자간 구조적 계층을 보여주는 NC-IDP의 교차연결에 기반을 두고 있다는 것을 보여준다. In particular, we observed that the cracks generated in the lyophilized hydrogel sample prepared for SEM analysis were linearly oriented in the arrangement and not crushed, which was the result of the hydrogel structure at the molecular level showing the intermolecular structural hierarchy of NC-IDP. It shows that it is based on cross-linking.
분자 수준에서 하이드로겔의 구조를 더 이해하기 위해 AFM을 사용하여 NC-IDP의 분자간 가교의 정도를 평가하였다. 도 6은 본 발명의 실시예에 따른 열처리 전후 NC-IDP 용액(1wt%)의 AFM 이미지이다. (a)는 열처리 전, (b)는 열처리 후의 결과이다. 도 6을 참고하여 설명하면, 아직 열처리되지 않은 NC-IDP는 일반적인 표면 형태 패턴을 나타내지 않았다. 구체적으로, 도 6의 (a)에서 볼 수 있듯이, 이러한 NC-IDP는 20nm에서 150nm까지 다양한 직경의 몇 개의 고립된 섬으로 불규칙한 표면 형태 패턴을 형성했다. 그러나 열처리 직후, 표면에 네트워크를 형성하기 위해 서로 연결되어 있는 것으로 보이는 나노 크기 입자의 균일한 패턴을 관찰할 수 있었다(도 6의 b). 입자의 측면 치수는 DLS 및 TEM 분석에 의해 표시된 NC-IDP의 직경과 유사한 18.76±1.65 nm로 측정되었다. 이러한 관찰은 개별 입자가 단일 NC-IDP 일 가능성이 가장 높고, 분자 수준에서 하이드로겔의 구조가 구조적 계층을 나타내는 NC-IDP의 분자간 가교를 기반으로 한다는 것을 의미한다.To further understand the structure of the hydrogel at the molecular level, we evaluated the degree of intermolecular crosslinking of NC-IDPs using AFM. 6 is an AFM image of an NC-IDP solution (1 wt%) before and after heat treatment according to an embodiment of the present invention. (a) is the result before heat treatment, (b) is the result after heat treatment. Referring to FIG. 6 , the NC-IDP, which has not yet been heat treated, did not show a general surface morphology pattern. Specifically, as shown in Fig. 6(a), these NC-IDPs formed an irregular surface morphology pattern with several isolated islands of various diameters from 20 nm to 150 nm. However, immediately after the heat treatment, a uniform pattern of nano-sized particles that seemed to be connected to each other to form a network on the surface could be observed (Fig. 6b). The lateral dimension of the particles was determined to be 18.76±1.65 nm, similar to the diameter of the indicated NC-IDP by DLS and TEM analysis. These observations imply that individual particles are most likely a single NC-IDP, and that the structure of the hydrogel at the molecular level is based on intermolecular cross-linking of NC-IDPs representing a structural hierarchy.
NC-IDP의 이러한 구조는 이전에 AFM을 사용하여 연구된 천연 전체 길이의 resilin 구조와 유사한 것으로 밝혀졌다. 천연 resilin의 구조는 AFM 연구와 다른 연구에서 3개의 도메인으로 구성되는 것으로 나타났다. 첫 번째 도메인은 엑손 I에서 파생되었으며 엘라스토머 기능에 유익한 고도로 무질서한 형태를 나타낸다. 두 번째 도메인은 엑손 II에서 유래하고 상대적으로 짧으며(62개 아미노산 잔기) 키틴 결합 도메인으로 기능하고, 엑손 III에서 파생된 도메인이며 엑손 I에서 파생된 도메인보다 더 구조화되고 단단한 도메인이며, 수중에서 소수성 미셀 구조를 나타낸다. 전체 길이 resilin의 전체 구조 즉, 이 세 도메인이 함께 생성된 결과로 직경이 20 ~ 30nm인 꽉 채워진 구형 및 나노 크기의 미셀 입자를 형성하고 섬 모양의 네트워크를 가진 나노 다공성 스캐폴드를 형성하는 것으로 나타났다. 특히 이 구조는 탄성과 같은 기능에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 관찰된 NC-IDP의 나노 구조는 미셀 구조를 닮은 페리틴 나노 케이지가 엑손 III에서 파생된 도메인을 대체할 수 있음을 시사했다. 따라서 이 rec1(exon I)-접합 나노 케이지는 스캐폴드로 사용되어 천연 resilin의 생체 모방으로 사용될 수 있으며 resilin 기반 하이드로겔의 특성 조절을 미세 조정할 수 있다.This structure of NC-IDP was found to be similar to the native full-length resilin structure previously studied using AFM. The structure of native resilin has been shown to consist of three domains in AFM studies and other studies. The first domain is derived from exon I and exhibits a highly disordered conformation beneficial to elastomeric function. The second domain is derived from exon II, is relatively short (62 amino acid residues), functions as a chitin binding domain, is derived from exon III, is a more structured and rigid domain than that derived from exon I, and is hydrophobic in water. The micellar structure is shown. The overall structure of the full-length resilin, i.e., as a result of the co-creation of these three domains, it was shown to form tightly packed spherical and nano-sized micellar particles with a diameter of 20 to 30 nm and to form a nanoporous scaffold with an island-like network. . In particular, this structure has been shown to play an important role in functions such as elasticity. The observed nanostructures of NC-IDPs suggested that ferritin nanocages resembling micellar structures could replace the domains derived from exon III. Therefore, this rec1(exon I)-conjugated nanocage can be used as a scaffold and used as a biomimetic of natural resilin, and can fine-tune the property control of resilin-based hydrogels.
계층적 단백질 하이드로겔의 진동 유변학 및 팽창 동역학Vibratory Rheology and Expansion Kinetics of Hierarchical Protein Hydrogels
NC-IDP 하이드로겔의 구조적 안정성과 관련된 점탄성 기계적 특성을 모니터링 하기 위해 평행판 형상을 사용하는 동적 진동 전단 유변학이 사용되었다. 세 가지 NC-IDP 농도에서 생성된 하이드로겔은 6rad/s에서 1~1000%의 진동 전단 변형 스윕 테스트를 하였다. Dynamic oscillatory shear rheology using parallel plate geometry was used to monitor the viscoelastic mechanical properties related to the structural stability of NC-IDP hydrogels. Hydrogels generated at three different NC-IDP concentrations were subjected to oscillatory shear strain sweep tests of 1-1000% at 6 rad/s.
도 7은 본 발명의 단백질 하이드로겔의 진동 유변학적 특성을 나타낸 그래프이다. 도 7의 (a)를 참고하여 설명하면, 세 가지 하이드로겔 모두에 대해 변형률이 증가함에 따라 임계 변형 값에 도달할 때까지 응력이 점차 증가했다. 정량적으로, 파단 시 진동 전단 변형의 값은 각각 20, 10 및 5 wt% NC-IDP 용액에서 생성된 하이드로겔의 경우 105.5%, 99.8% 및 199.1%였다. 이 관계는 낮은 단백질 농도로 만든 하이드로겔이 제대로 연결되지 않은 네트워크를 형성하여 연질 하이드로겔을 생성함을 나타낸다. 또한, 세 가지 하이드로겔 모두에 대해 응력-변형 그래프에 급격한 감소 또는 파단 곡선이 없음("스냅" 없음)은 각 경우의 하이드로겔이 최대 응력에 접근할 때 즉시 분해되지 않고 천천히 분해됨을 나타낸다.7 is a graph showing the vibrational rheological properties of the protein hydrogel of the present invention. Referring to Figure 7 (a), as the strain increased for all three hydrogels, the stress gradually increased until the critical strain value was reached. Quantitatively, the values of oscillatory shear strain at break were 105.5%, 99.8% and 199.1% for hydrogels produced in 20, 10 and 5 wt% NC-IDP solutions, respectively. This relationship indicates that hydrogels made with low protein concentration form poorly connected networks, resulting in soft hydrogels. In addition, the absence of abrupt reduction or fracture curves in the stress-strain graph for all three hydrogels (no “snap”) indicates that the hydrogel in each case does not disintegrate immediately but slowly disintegrates when approaching the maximum stress.
탄성 반응과 시간에 따른 하이드로겔의 기계적 특성의 의존성 수준을 결정하기 위해 전단 응력 완화 실험이 수행되었다. 여기에서 20, 10 및 5 wt% NC-IDP 용액에서 생성된 하이드로겔 샘플은 10분 동안 15% 및 45% 고정 변형 수준에 적용되었다(도 7의 b, c).도 7의 (b, c)를 참고하여 설명하면, 세 가지 하이드로겔 각각은 변형이 없고 일정한 저장 및 손실 계수를 유지하는 응력 완화 거동을 보였으며, 이는 이전에 PEG, 다당류 및 ELP 기반 하이드로겔에서 관찰된 것과는 상이하게 관찰되었다. 특히, 동일한 실험 조건에서 종래 PEG 하이드로겔과 resilin 유사 펩타이드(RLP) 기반 하이드로겔의 초기 전단 응력 수준의 거의 ~90% 및 ~35%가 손실된 것으로 보고되나 본 발명에 따른 NC-IDP 하이드로겔은 응력 완화가 감지되지 않은 상태에서 상당한 탄성을 나타냈다.A shear stress relaxation experiment was performed to determine the level of dependence of the elastic response and the mechanical properties of the hydrogel over time. Here, hydrogel samples generated in 20, 10 and 5 wt% NC-IDP solutions were subjected to 15% and 45% fixed strain levels for 10 min (Fig. 7b,c). Fig.7(b,c) ), each of the three hydrogels exhibited a stress relaxation behavior that was free from deformation and maintained a constant storage and loss modulus, which was different from that previously observed for PEG, polysaccharide, and ELP-based hydrogels. . In particular, it is reported that almost ~90% and ~35% of the initial shear stress level of the conventional PEG hydrogel and the resilin-like peptide (RLP)-based hydrogel are lost under the same experimental conditions, but the NC-IDP hydrogel according to the present invention is Significant elasticity was exhibited in the state where no stress relaxation was detected.
다음으로, 10일 동안 PBS 버퍼에 담근 동결건조된 NC-IDP 겔에 의한 수분 흡수를 모니터링 하여 생리적 조건에서 NC-IDP 하이드로겔의 팽창 역학을 평가했다. 도 8은 본 발명의 실시예에 따른 단백질 하이드로겔의 팽윤 비율과 수분 함유량을 나타낸 그래프이다. 도 8의 (a)를 참고하여 설명하면, 빠르게 팽창하여 배양 24시간 이내에 거의 평형에 도달했다. NC-IDP의 10 wt% 농도에서 생성된 하이드로겔의 평형 팽윤 비율에 비해 20 wt% 농도에서 생성된 하이드로겔의 팽윤비는 상대적으로 낮았다. 이 하이드로겔의 낮은 팽윤 비율은 위에서 설명한 바와 같이 더 뻣뻣한 성질과 더 조밀한 di-또는 tri-티로신 가교 네트워크에 기인한다. Next, we evaluated the swelling kinetics of NC-IDP hydrogels under physiological conditions by monitoring water absorption by lyophilized NC-IDP gels soaked in PBS buffer for 10 days. 8 is a graph showing the swelling ratio and moisture content of the protein hydrogel according to an embodiment of the present invention. Referring to Fig. 8 (a), it rapidly expanded and almost reached equilibrium within 24 hours of incubation. Compared to the equilibrium swelling ratio of the hydrogel generated at the 10 wt% concentration of NC-IDP, the swelling ratio of the hydrogel generated at the 20 wt% concentration was relatively low. The low swelling rate of this hydrogel is due to its stiffer nature and denser di- or tri-tyrosine cross-linked network, as described above.
도 8의 (b)를 참고하여 설명하면, 두 하이드로겔의 경우 수분 함량은 팽윤 비율과 유사한 경향을 보였으며 매우 높은 팽윤 등급을 나타냈다. 일반적으로 하이드로겔은 수분 함량에 따라 저팽윤 등급 하이드로겔(수분 함량 20~50%), 중팽윤 등급 하이드로겔(50~90%), 고팽윤 등급 하이드로겔(90~99.5 %), 초흡수성 하이드로겔(> 99.5)로 분류할 수 있다. Referring to FIG. 8 (b), in the case of the two hydrogels, the moisture content showed a similar tendency to the swelling ratio and showed a very high swelling grade. In general, hydrogels are low-swelling grade hydrogels (water content 20-50%), medium-swelling grade hydrogels (50-90%), high-swelling grade hydrogels (90-99.5%), superabsorbent hydrogels, depending on the moisture content. (> 99.5).
Rec1은 다른 엘라스토머 단백질(예:아미노산 잔기의 5%만이 극성인 엘라스틴)과 달리 주로 극성 아미노산 잔기(46%)로 구성되며 단백질 나노 케이지는 일반적으로 다공성이며 최대 90% 용매로 구성될 수 있다. 따라서 NC-IDP겔에 물을 흡수하면 거시적 팽창(최대 93.56 %)이 발생했으며 NC-IDP의 이러한 높은 팽창 특성은 높은 투과성과 다양한 세포 기능을 위한 향상된 물질 이동을 제공함으로써 특히 의료 분야에 활용도가 높은 점에서 우수하다. Rec1 is mainly composed of polar amino acid residues (46%), unlike other elastomeric proteins (eg elastin, where only 5% of the amino acid residues are polar), and protein nanocages are usually porous and can consist of up to 90% solvent. Therefore, absorption of water into the NC-IDP gel caused macroscopic swelling (up to 93.56%), and this high swelling property of NC-IDP provides high permeability and improved mass transport for various cellular functions, making it particularly useful in the medical field. excellent in that
계층적 단백질 하이드로겔의 자기 치유 특성Self-healing properties of hierarchical protein hydrogels
다음으로 NC-IDP 하이드로겔의 자가 치유 또는 재형성 특성을 조사했다. 재료의 수명과 신뢰성을 연장하는 것이 중요한 다양한 응용 분야에서 외부 자극 또는 재료 자체의 자율적 상호 작용의 결과로 기계적으로 유발된 손상이 발생한 후 재료를 원래 상태로 복구할 수 있는 능력이 추구되어왔다. 이러한 이유와 세포의 증식 및 이동에 대한 적합성으로 인해 자가 치유 하이드로겔은 조직 공학 및 수리와 같은 생의학 응용 분야에 효과적으로 사용될 수 있다. 이에 본 발명에 따른 하이드로겔의 자가 치유 특성을 테스트하였다. 특히, 20 wt% 및 10 wt% NC-IDP 용액으로 만든 하이드로겔을 매우 작은 조각으로 쪼갠 다음 열처리를 통해 테스트했다. Next, the self-healing or remodeling properties of NC-IDP hydrogels were investigated. In a variety of applications where extending the life and reliability of materials is important, the ability to restore materials to their original state has been sought after mechanically induced damage as a result of external stimuli or autonomous interactions of the materials themselves. For these reasons and their suitability for cell proliferation and migration, self-healing hydrogels can be effectively used for biomedical applications such as tissue engineering and repair. Accordingly, the self-healing properties of the hydrogel according to the present invention were tested. In particular, hydrogels made with 20 wt% and 10 wt% NC-IDP solutions were broken down into very small pieces and then tested through heat treatment.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 하이드로겔의 자가 치유를 확인한 사진이다. 도 9의 (a)는 20wt%, (b)는 10wt% NC-IDP 용액의 결과이고, (i)는 NC-IDP 용액, (ii)는 열처리로 생성된 하이드로겔, (iii)는 손상된 하이드로겔, (iv)는 자가 치유된 하이드로겔을 나타낸다. 도 9를 참고하여 설명하면, 각 하이드로겔은 성공적으로 단일 하이드로겔 조각으로 재형성되었다. 이 결과는 이러한 NC-IDP 하이드로겔에 대한 높은 자가 치유 효율을 나타냈다. NC-IDP 하이드로겔의 이러한 자가 치유 특성은 수소 결합과 티로신 잔류물의 π-π 상호 작용 때문이다. resilin의 단일 티로신 잔류물은 단백질을 교차 β- 유사 섬유로 자기 조립하는 데 결정적인 역할을 하는 것으로 보고되었으며, 이 역할은 수소 결합 및 잔류물이 만든 π-π 상호 작용으로 인한 것으로 나타났다. 이러한 다중 비공유 상호 작용은 열역학적 제어 방식으로 다중 분자 빌딩 블록을 폴리머 네트워크로 조립하는 것을 용이하게 하며, 이러한 폴리머 네트워크에서 자가 치유 거동은 이러한 결합의 형성 및 파괴의 가역적 특성으로 인해 발생하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 단백질 하이드로겔에서 높은 자가 치유 능력을 발견했고, 이 높은 능력은 많은 티로신을 포함하는 빌딩 블록 단백질과 그에 따라 많은 수소 결합 및 π-π 상호 작용에 기인함을 확인할 수 있었다.9 is a photograph confirming self-healing of a protein hydrogel according to an embodiment of the present invention. 9 (a) is a result of 20 wt%, (b) is a 10 wt% NC-IDP solution, (i) is an NC-IDP solution, (ii) is a hydrogel produced by heat treatment, (iii) is a damaged hydrogel Gel, (iv) represents a self-healing hydrogel. Referring to FIG. 9 , each hydrogel was successfully reformed into a single hydrogel piece. These results indicated a high self-healing efficiency for these NC-IDP hydrogels. This self-healing property of the NC-IDP hydrogel is due to the π–π interaction of hydrogen bonds and tyrosine residues. A single tyrosine residue in resilin has been reported to play a critical role in self-assembly of proteins into crossed β-like fibers, and this role has been shown to be due to hydrogen bonding and the π-π interactions made by the residues. These multiple non-covalent interactions facilitate the assembly of multi-molecular building blocks into polymer networks in a thermodynamically controlled manner, and it was confirmed that self-healing behavior in these polymer networks occurs due to the reversible nature of the formation and destruction of these bonds. That is, a high self-healing ability was found in the protein hydrogel according to the present invention, and it could be confirmed that this high ability was due to a large number of hydrogen bonds and π-π interactions with the building block protein containing a lot of tyrosine.
또한 NC-IDP 하이드로겔이 생리학적으로 발견되는 온도 조건에 가까운 온도 조건에서 자가 치유 능력이 있는지 확인하기 위해 37℃에서 자가 치유 특성을 테스트했다. 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 하이드로겔의 37℃에서 자가 치유를 확인한 사진이다. 도 10을 참고하여 설명하면, 55℃에서 37℃로 온도를 낮추면 하이드로겔의 재형성 속도가 감소했지만, 하이드로겔은 여전히 원래의 상태로 완전히 회복되어 상기 데이터(도 9)와 일치함을 확인하였다.In addition, the self-healing properties were tested at 37 °C to confirm that the NC-IDP hydrogel has the ability to self-heal under temperature conditions close to those found physiologically. 10 is a photograph confirming self-healing at 37° C. of a protein hydrogel according to an embodiment of the present invention. Referring to FIG. 10, when the temperature was lowered from 55° C. to 37° C., the reformation rate of the hydrogel decreased, but the hydrogel was still completely restored to its original state, confirming that it was consistent with the data (FIG. 9). .
본 발명의 하이드로겔은 새로운 유형의 계층적 반고체 하이드로겔로, 단백질 나노 케이지 결정을 본질적으로 무질서한 단백질(IDP) 분자와 통합하여 개발하였다. 빌딩 블록 단백질은 발현될 때 구조화되지 않은 엘라스토머 resilin 단백질이 고도로 조직화된 페리틴 나노 케이지에 통합되는 유전자 구조를 생성함으로써 설계된다. 유전자 변형 E. coli 박테리아는 수용성 형태의 NC-IDP 빌딩 블록 단백질을 성공적으로 발현시켰으며, 여기서 페리틴 나노 케이지의 표면이 IDP로 장식되었다. The hydrogel of the present invention is a new type of hierarchical semi-solid hydrogel, developed by integrating protein nanocage crystals with intrinsically disordered protein (IDP) molecules. The building block proteins are designed by creating a genetic construct in which, when expressed, the unstructured elastomeric resilin protein is incorporated into highly organized ferritin nanocages. The transgenic E. coli bacteria successfully expressed the NC-IDP building block protein in a water-soluble form, where the surface of ferritin nanocages was decorated with IDP.
단백질 나노 케이지의 고도로 조직화된 초분자 특성은 3차원적으로 무질서한 IDP에 결정 구조를 제공하여 물리적 가교와 구조적 안정성을 개선하였다. 결과적으로 NC-IDP 용액은 저농도에서도 열 유도되어 고체 고분자 겔로 변형될 수 있었다. 높은 생체 적합성과 편리한 방법을 포함한 몇 가지 장점을 보여주었으며 생물 의학 응용에 효과적으로 사용될 수 있었다.The highly organized supramolecular nature of the protein nanocage provided a crystalline structure to the three-dimensionally disordered IDP, improving physical cross-linking and structural stability. As a result, the NC-IDP solution was thermally induced even at a low concentration and could be transformed into a solid polymer gel. It showed several advantages, including high biocompatibility and convenient method, and could be effectively used in biomedical applications.
하이드로겔의 미세 구조와 나노 구조를 시각화한 결과, 하이드로겔의 나노 구조는 분자간 가교된 NC-IDP로 인해 매우 균질한 다공성 네트워크로 구성되며 구조적 계층 구조를 확인할 수 있었다. 가교된 NC-IDP의 분자간 연결된 나노 입자 형 네트워크는 천연 전체 길이 resilin의 나노 다공성 섬 모양의 네트워크와 유사했다. resilin의 초탄성 및 에너지 변환 메커니즘이 구조적 특성과 높은 상관관계가 있다는 점을 감안할 때, 생체 모방 접근 방식에 대한 추가 평가는 이 재료의 다양한 특성을 조정하고 그 기능을 미세하게 제어할 수 있는 기회를 제공한다. As a result of visualizing the microstructure and nanostructure of the hydrogel, the nanostructure of the hydrogel is composed of a very homogeneous porous network due to the intermolecular cross-linked NC-IDP, and the structural hierarchical structure can be confirmed. The intermolecularly linked nanoparticle-like network of cross-linked NC-IDPs resembled the nanoporous island-like network of native full-length resilin. Given that the hyperelasticity and energy conversion mechanisms of resilin are highly correlated with structural properties, further evaluation of biomimetic approaches opens up opportunities to tune the various properties of this material and finely control its function. to provide.
본 발명의 하이드로겔은 3차원 네트워크 구조, 응력 완화가 없는 엘라스토머 특성, 높은 수분 함량, 우수한 자가 치유 특성, 고유한 생체적합성 및 생분해성 등 다양한 특성을 가지며, 모든 특성은 ECM과 같은 자연 발생 물질을 효과적으로 모방한다. 체온에 반응할 수 있는 열 자극에 대한 반응성과 자가 치유 능력은 생체적합성이 높은 3D 프린팅용 바이오 잉크와 세포 캡슐화 및 조직 재생을 위한 주사 가능한 하이드로겔로의 사용을 촉진할 수 있다. The hydrogel of the present invention has various properties such as three-dimensional network structure, elastomeric properties without stress relaxation, high water content, excellent self-healing properties, unique biocompatibility and biodegradability, and all properties are naturally occurring materials such as ECM. effectively imitate Responsiveness to thermal stimuli that can respond to body temperature and the ability to self-heal could facilitate the use of highly biocompatible 3D printing bioinks and injectable hydrogels for cell encapsulation and tissue regeneration.
페리틴 나노 케이지의 여러 특성을 조정할 수 있는 뛰어난 능력으로 인해 본 발명의 계층적 단백질 하이드로겔은 나노 케이지의 표면을 장식하는 종을 화학적 또는 생물학적으로 변형하거나, 작은 분자를 내부 공동으로 캡슐화하거나, 생체 광물화를 수행하는 등 다양한 방식으로 기능화할 수 있는 점에서 우수하다.Due to the excellent ability to tune the various properties of ferritin nanocages, the hierarchical protein hydrogels of the present invention can chemically or biologically modify the species adorning the surface of the nanocages, encapsulate small molecules into internal cavities, or biominerals. It is excellent in that it can be functionalized in a variety of ways, such as carrying out the transformation.
전술한 내용은 후술할 발명의 청구범위를 더욱 잘 이해할 수 있도록 본 발명의 특징과 기술적 장점을 다소 폭넓게 상술하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The foregoing has outlined rather broadly the features and technical advantages of the present invention so that the following claims may be better understood. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing the technical spirit or essential features thereof. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention is indicated by the following claims rather than the above detailed description, and all changes or modifications derived from the claims and their equivalents should be construed as being included in the scope of the present invention.
Claims (6)
상기 자가조립 나노 케이지는 sHsp(small heat shock protein), 페리틴, vault, P6HRC1-SAPN, M2e-SAPN, MPER-SAPN, 및 박테리오파지 캡시드 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 단백질 하이드로겔. The method of claim 1,
The self-assembled nanocage is one selected from the group consisting of sHsp (small heat shock protein), ferritin, vault, P6HRC1-SAPN, M2e-SAPN, MPER-SAPN, and bacteriophage capsid protein, a protein hydrogel.
상기 탄성 단백질은 resilin, rec1 resilin, elastin, elastin-like peptides, β-hairpin peptides, α-helical coiled coil peptides, silk fibroin, 및 silk-like peptides로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 단백질 하이드로겔.The method of claim 1,
The elastic protein is one selected from the group consisting of resilin, rec1 resilin, elastin, elastin-like peptides, β-hairpin peptides, α-helical coiled coil peptides, silk fibroin, and silk-like peptides, a protein hydrogel.
상기 빌딩 블록 단백질은 di- 또는 tri- 티로신(tyrosine) 가교 결합된, 단백질 하이드로겔.The method of claim 1,
The building block protein is di- or tri- tyrosine (tyrosine) cross-linked, protein hydrogel.
상기 생합성된 단백질을 동결 건조하는 제2단계;
상기 동결 건조된 단백질을 증류수로 희석한 후 초음파 처리하는 제3단계; 및
상기 초음파 처리된 단백질을 열 처리하여 하이드로겔을 형성하는 제4단계;를 포함하고, 상기 열 처리를 통해 단백질간 가교를 형성하는, 단백질 하이드로겔 제조방법.a first step of synthesizing an integral building block protein by combining the genes of the ferritin nanocage protein and the elastic protein;
a second step of freeze-drying the biosynthesized protein;
a third step of diluting the freeze-dried protein with distilled water and then sonicating; and
A fourth step of heat-treating the sonicated protein to form a hydrogel; and, forming a cross-link between proteins through the heat treatment, a protein hydrogel production method.
상기 가교는 di- 또는 tri- 티로신(tyrosine) 가교 결합인, 단백질 하이드로겔 제조방법.6. The method of claim 5,
The cross-linking is a di- or tri- tyrosine (tyrosine) cross-linking, protein hydrogel production method.
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