KR20220071214A - 항-tnfr2 항체 및 사용 방법 - Google Patents

항-tnfr2 항체 및 사용 방법 Download PDF

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KR20220071214A
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에린 엘. 필버트
수쉬마 크리쉬난
크리스틴 탄
레나 바잣
시아오동 양
라이언 알바라도
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아펙시젠, 인코포레이티드
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Abstract

종양학적 질환, 염증성 및/또는 자가면역 질환 등을 치료 또는 진단하는 것을 포함하여 다양한 치료 또는 진단 방법 중 어느 하나에 사용될 수 있는 항종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2) 항체 및 관련 조성물이 제공된다.

Description

항-TNFR2 항체 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 의거하여 2019년 9월 17일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/901,364호; 2020년 3월 5일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/985,509호; 2020년 7월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/047,824호; 및 2020년 7월 29일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/058,016호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록에 관한 언급
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 이는 참조로서 본 명세서에 통합된다. 서열 목록이 포함된 텍스트 파일의 명칭은 APEX-025/04WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 약 265 KB로, 2020년 9월 11일에 생성되었으며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.
기술 분야
본 개시는 종양학적 질환, 염증성 및/또는 자가면역 질환 등을 치료 또는 진단하는 것을 포함하여 다양한 치료 또는 진단 방법 중 어느 하나에 사용될 수 있는 항종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2) 항체 및 관련 조성물에 관한 것이다.
TNF-α는 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 중요한 역할을 하는 필수 염증 매개체이다. TNF-α는 주로 대식세포와 단핵구에 의해 생성되며, 26 kDa의 막-결합 삼량체(mTNF-α) 및 17 kDa의 가용성 삼량체(sTNF-α) 모두로서 존재할 수 있다. TNF-α는, 4개의 반복된 시스테인-풍부 모티프를 함유하는 유사한 세포외 도메인을 갖지만, 구별되는 신호전달 경로를 활성화하는 분화된 세포 내 도메인을 또한 갖는 2개의 수용체, TNFR1(TNFRSF1A; 55 kDa) 및 TNFR2(TNFRSF1B; 75 kDa)를 통해 그 효과를 발휘한다.
TNFR1은 도처에서 발현되는 단백질이며, mTNF-α 및 sTNF-α 둘 다에 의해 결합되어, 맥락에 따라 세포 생존/염증 또는 세포자멸사 신호를 전달할 수 있다. 대조적으로, TNFR2 발현은 활성화 상태에 의해 조절되고, 주로 T 세포 및 면역억제 골수 세포로 제한되는데, 골수 유래 면역억제 세포(MDSC)로도 알려진 면역억제 골수 세포는 단핵 세포 및 과립구 골수 세포를 포함한다. 단핵 골수 세포는 단핵구뿐만 아니라 말단 분화된 대식세포 및 수지상 세포(DC)를 포함하는데, 단핵구는 염증 조건 하에 조직 내에서 대식세포 및 DC로 분화한다. 과립구 골수 세포는 말단 분화된 다형핵 호중구, 호산구, 호염기구, 및 비만 세포의 집단을 포함한다. TNFR2는 mTNF-α를 통해서만 완전히 결합할 수 있다. TNFR1과는 달리, TNFR2는 세포질 내에 사멸 도메인을 함유하지 않으며; 대신에, TRAF 및 NFkB 경로를 통해 신호를 전달하여 세포 생존 및 면역 억제를 조절할 수 있다. 또한, mTNF는 수용체 결합 시 mTNF가 발현되는 세포에서 역방향 신호전달을 나타낸다. 2가지 TNFR 모두는 TACE 효소에 의해 절단되어 가용성 형태로 전환될 수 있으며, 여기서 가용성 형태는 세포에서 수용체를 제거하거나 sTNF-α를 유인함으로써 TNF-α에 대 세포를 탈감각화하도록 작용할 수 있다.
TNFR2는 높은 수준의 TNFR2를 발현하는 조절 T 세포(Treg)에 미치는 영향을 통해 면역 체계의 조절에 중요한 역할을 한다. 마우스에서, TNFR2의 결실은 Treg의 기능을 감소시킴으로써 자가면역 질환 및 대장염을 악화시킨다. 인간에서, TNFRSF1B의 알려진 다형성은 TNFR2 발현을 감소시키거나 TNFα에 대한 결합을 감소시키고, 조절 T 세포에서 TNFR2-매개 신호전달을 방해한다. 이러한 다형성은 전신성 홍반루푸스(SLE), 크론병, 및 궤양성 대장염을 포함하는 자가면역 질환과 강한 상관관계가 있다. 마우스 및 인간 모두에서, TNFR2는 종양에서 발견되는 Treg를 포함하여, 고도로 억제성인 Treg 상에서 발현되지만, 효과기 T 세포에서는 강하게 발현되지 않는다. TNFR2 발현은 다수의 종양 유형에서 억제성 종양 미세환경과 강력하게 상관된다. 또한, TNFR2+ Treg가 TME(Govindaraj C) 내에서 T 효과기 반응을 손상시킬 수 있다는 것이 난소 세포에서 입증되었다. 마우스 모델은 암에 대한 면역 반응을 방해하는 데 있어서 TNFR2의 역할에 대한 추가적인 증거를 제공하였다. 또한, TNFR2는 신장암, 결장암, 및 난소암을 포함하여 25개가 넘는 종양 유형에서 식별되었다. 기능 획득 TNFR2 돌연변이는 치료에 불응성인 희귀한 형태의 CTCL을 가진 세자리 증후군(Sezary syndrome) 환자에서 발생한다.
따라서, TNFR2를 효과적으로 억제하거나 달리 길항시키는 치료 항체, 및 암과 염증성 질환을 치료하는 관련 방법에 대한 필요성이 당업계에 남아 있다.
본 개시는 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 일 양태는 인간 TNFR2를 포함하여, TNFR2에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
서열번호 1~3에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 서열번호 4~6에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역;
서열번호 7~9에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 10~12에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 13~15에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 16~18에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 19~21에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 22~24에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 25~27에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 28~30에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 31~33에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 34~36에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 37~39에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 40~42에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 43~45에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 46~48에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 49~51에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 52~54에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 55~57에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 58~60에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 61~63에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 64~66에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 67~69에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 70~72에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 73~75에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 76~78에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 79~81에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 82~84에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 85~87에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 88~90에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 91~93에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 94~96에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역; 또는
서열번호 97~99에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 100~102에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
또는 상기 CDR 영역에 걸쳐 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 총 아미노산 치환을 제외하고, (i) 및 (ii)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 항체의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 영역은 서열번호 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 및 135로부터 선택된 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 서열번호 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 및 136으로부터 선택된 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
서열번호 103에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 104에 제시된 VL 영역;
서열번호 105에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 106에 제시된 VL 영역;
서열번호 107에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 108에 제시된 VL 영역;
서열번호 109에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 110에 제시된 VL 영역;
서열번호 111에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 112에 제시된 VL 영역;
서열번호 113에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 114에 제시된 VL 영역;
서열번호 115에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 116에 제시된 VL 영역;
서열번호 117에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 118에 제시된 VL 영역;
서열번호 119에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 120에 제시된 VL 영역;
서열번호 121에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 122에 제시된 VL 영역;
서열번호 123에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 124에 제시된 VL 영역;
서열번호 125에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 126에 제시된 VL 영역;
서열번호 127에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 128에 제시된 VL 영역;
서열번호 129에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 130에 제시된 VL 영역;
서열번호 131에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 132에 제시된 VL 영역;
서열번호 133에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 134에 제시된 VL 영역; 또는
서열번호 135에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 136에 제시된 VL 영역.
일부 구현예는, 서열번호 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 및 135로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역, 및 서열번호 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 및 136으로부터 선택된 서열에 대해 각각 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 결합하고, 표 R1에서 밑줄이 그어진 서열로부터 선택된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 표 R2에서 밑줄이 그어진 서열로부터 선택된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3을 각각 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다.
일부 구현예는, 표 R1로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 각각 표 R2로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 제6항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예는, 성숙한 인간 TNFR2 서열(FL 인간 TNFR2의 잔기 23~461)에 의해 결정했을 때, R21, Y23, T27, S33, K34, T51, 및 S55로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지는 에피토프에서 인간 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하여, 예를 들어 여기서, 에피토프는 REY, TAQMCCSK (서열번호 328), 및 TVCDS (서열번호 329)로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 37~39에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 서열번호 40~42에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 서열번호 115에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 서열번호 116에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 115에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 116에 제시된 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TNFR2, 예를 들어 가용성 및/또는 세포 발현된 인간 TNFR2에 결합한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 T1로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 인간 TNFR2 펩티드 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서, 항체는 단쇄 항체, scFv, 힌지 영역이 결여된 1가 항체, 미니바디, 및 프로바디로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항체는 Fab 또는 Fab’ 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 F(ab’)2 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 전체 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 인간 IgG 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IgG 불변 도메인은 IgG1 CH1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, IgG 불변 도메인은 IgG1 Fc 영역, 임의로 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 임의로 변형된 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TNFR2, 예를 들어, 표 T1로부터의 적어도 하나의 펩티드 에피토프에 약 2 nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.7 nM 이하의 KD로 인간 TNFR2에 결합하거나, 약 50 pm 이하의 KD로 일차 T 세포, 임의로 Treg 상의 인간 TNFR2에 결합한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(a) TNFR2에 대한 TNF-α 결합을 억제함;
(b) TNFR2 신호 전달을 억제함;
(c) TNFR2 신호 전달을 활성화함;
(d) TNFR2 삼량체화를 억제함;
(e) 인간 TNFR2 및 시노몰구스 원숭이 TNFR2에 교차 반응성으로 결합함;
(f) 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)에 의해 종양 세포, Treg, 및/또는 억제성 골수 세포(임의로, 대식세포, 호중구, 및 골수 유래 억제 세포(MDSC))의 세포 살해/고갈을 증가/유도함;
(g) 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP)에 의해 종양 세포, Treg, 및/또는 억제성 골수 세포(임의로, 대식세포, 호중구, 및 MDSC)의 세포 살해/고갈을 증가/유도함;
(h) 골수 세포(임의로, 대식세포, 호중구, 및 MDSC)에 의한 면역 억제를 감소시킴;
(i) MDSC 및/또는 M2 대식세포를 전염증성 M1 대식세포로 전환시킴;
(j) Treg를 효과기 T 세포로 전환시킴;
(k) 차가운 종양(cold tumor)을 뜨거운 종양(hot tumor)으로 전환시킴;
(l) Treg 매개 면역 억제를 감소시킴; 또는
(m) (a) 내지 (k) 중 하나 이상의 조합.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR1, 헤르페스바이러스 세포내 침투 매개체(HVEM), CD40, 사멸 수용체 6(DR6), 및/또는 오스테오프로테게린(OPG)에 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2 길항제이다. 일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2 작용제이다. 일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체이다.
소정의 구현예는 본원에 기술된 것과 같은 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화화는 단리된 폴리뉴클레오티드, 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 포함한다.
또한, 생리학적으로 허용 가능한 담체, 및 본원에 기술된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 조성물이 포함된다.
또한, 암을 가진 환자, 예를 들어 비정상적인 TNFR2 발현과 관련된 암을 가진 환자를 치료하는 방법이 포함되며, 상기 방법은 본원에 기술된 조성물을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 단계를 포함한다.
또한, 암환자, 예를 들어 TNFR2 길항제 매게 면역 억제와 관련된 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이 포함되며, 상기 방법은 본원에 기술된 조성물을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2 길항제이다.
또한, 염증성 및/또는 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이 포함되며, 상기 방법은 본원에 기술된 조성물을 환자에게 투여하여 염증을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 염증성 및/또는 자가면역 질환은, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 TNFR2 작용제인, 비정상적인 TNFR2 발현과 연관된다. 일부 구현예에서, 염증성 및/또는 자가면역 질환은 TNFR2 작용제 매개 면역 활성화와 연관된다.
도 1은 암 면역요법에서 항-TNFR2 항체의 활성에 대해 제안된 메커니즘을 도시한다.
도 2는 본원에 기술된 항체 면역화 및 스크리닝 계획을 도시한다.
도 3a~3d는 인간 키메라 항체 특성 분석 제1 세트의 결과를 보여준다. 도 3a~3b에서, 인간(3a) 또는 시노몰구스(3b) TNFR2-His 태그된 단백질을 96-웰 ELISA 플레이트 상에 1 μg/mL로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 1% BSA를 사용하여 차단하였다. 항체를 실온(RT)에서 1시간 동안 첨가하고, 세척하고, 항-인간 HRP를 사용하여 검출하였다. TMB 기질을 사용하여 3~5분 동안 검정을 개발하였다. 도 3c에서, FACS 결합은 인간 TNFR2를 발현하도록 조작된 CHO 세포를 이용해 수행하였다. 간략하게, MACS 완충액에서 200,000개의 세포와 함께 1시간 동안 항체를 인큐베이션한 다음 세척하고, 항-인간 IgG BV421을 사용하여 20분 동안 검출하였다. 샘플은 Cytoflex 또는 MACSQuant 유세포 계측기를 사용하여 분석하였다. 도 3d에서, 리간드 차단 ELISA는 4℃에서 밤새 1 ug/mL TNFR-Fc로 플레이트를 코팅하여 수행하였다. 플레이트를 세척하고, 차단하고, 항체를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항체를 세척하고, 100 ng/mL TNF-α를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마우스 항-인간 TNF-α 및 항-마우스 IgG HRP로 세척한 후 TNF-α를 검출하였다. TMB 기질을 사용하여 5~7분 동안 검정을 개발하였다.
도 4a~4d는 가용성(4a) 및 세포 기반 인간 TNFR2(4c), Cyno TNFR2(4b), 및 ELISA 기반 TNF-α 차단(4d)에 결합하는 항체를 포함하여, 인간 키메라 항체의 특성분석 제2 세트의 결과를 보여준다. 상기 도 3a~3d에 기술된 바와 같이 수행함.
도 5는 NFkB HEK 리포터 라인 상에서 인간 키메라 항체에 의한 TNFR 신호전달을 보여준다. Promega 유래의 HEK TNFR 리포터 세포를 바닥이 편평한 플레이트에 웰 당 50,000개의 세포로 도말하였다. 10 μg/mL의 표시된 항체 또는 0.2 ng/mL의 TNF-α를 첨가하고, 37℃에서 20시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. QuantiBlue 시약을 상청액과 4:1 비율로 사용하여 10분 동안 리포터 활성을 검출하였다. 플레이트를 SpectroMax로 655 nm에서 판독하였다. 데이터는 신호 수준이 낮을 때, 55F6이 약간의 작용제 활성을 갖는 반면, 다른 항체는 유의한 활성을 갖지 않음을 나타낸다.
도 6a~6d는 가용성(6a) 및 세포 기반 인간 TNFR2(6c), Cyno TNFR2(6b)에 결합하는 인간화 항체, 및 ELISA 기반 TNF-α 차단(6d)을 보여준다.
도 7은 인간화 후보물질을 이용한 세포 기반 TNFα 차단 검정을 보여준다. TNFR2-과발현 CHO 세포를 웰 당 100,000개의 세포로 도말하였다. 세포를 표시된 항체와 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 14 ng/mL 비오티닐화-TNFα를 30분 동안 첨가하였다. TNFα를 세척하고 15분 동안 SA-PE로 검출하였다. 세포를 Cytoflex 또는 MACSQuant 유세포 계측기를 사용하여 분석하였다. 검정을 2회 반복하였다.
도 8은 가용성 TNFR1 결합 검정을 보여준다. TNFR1-His 태그된 단백질을 4℃에서 밤새 1 μg/mL로 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 차단하고, RT에서 1시간 동안 항체를 표시된 농도로 첨가하였다. 항체를 세척하고 항-인간 IgG HRP로 1시간 동안 검출하였다. TMB 기질을 사용하여 10분 동안 검정을 개발하였다.
도 9a~9b는 리포터 검정에 의한 TNFR2-CHO 세포의 ADCC를 보여준다. Promega의 ADCC Reporter Bioassay Core 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다. 간략하게, 25,000개의 TNFR2-CHO 세포를 검정 완충액 중에서 플랫-웰 플레이트에 첨가하였다. 항체를 표시된 농도로 첨가하였다. 웰 당 75,000개의 효과기 세포를 첨가하였다(E:T = 3:1). 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 6시간 후, 플레이트를 실온으로 평형화시키고, SpectroMAX 플레이트 판독기 상에서 5분 후 측정한 Bio-Glo 루시퍼라제 기질을 사용하여 리포터 활성을 검출하였다. 도 9a는 이소형 대비 배수 변화를 도시한 것으로서, RLU(유도된 것 - 배경)/RLU (이소형 대조군 - 배경)으로서 계산한 것이다. 도 9b는 배수 변화보다는 RLU를 도시한다.
도 10a~10f는 TNFR2에 대한 시험 항체의 고 친화도 1가 결합[인간화 클론 25~71 (a; Kon=3.58E+05 1/Ms; Koff=5.53E-04 1/s) 및 25~108 (b; Kon=3.76E+05 1/Ms; Koff=2.33E-04 1/s)]을 Octet에 의해 도시한 것 및 인간 TNFR2 단백질에 대한 시험 항체의 고 친화도 1가 결합을 ELISA에 의해 도시한 것(10c), 시노몰구스 TNFR2 단백질에 대한 시험 항체의 고 친화도 1가 결합을 ELISA에 의해 도시한 것(10d), 세포 발현 인간 TNFR2에 대한 시험 항체의 고 친화도 1가 결합을 도시한 것(10e), 활성화된 인간 Treg에 대한 시험 항체의 고 친화도 1가 결합을 도시한 것(10f)이다.
도 11a~11e는 TNFR1 (11a), 헤르페스바이러스 세포내 침투 매개체(HVEM; 11b), CD40(11c), 사멸 수용체 6(DR6; 11d), 및 오스테오프로테게린(OPG; 11e)에 대한 결합 결여에 의해 나타난 바와 같이, 25~71 및 25~108이 TNFR2에 특이적임을 보여준다.
도 12a~12b는 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 통한 25~71 및 25~108에 의한 TNFR2-발현 세포(12a, 형질감염체) 및 TNFR2-발현 종양 세포(12b, K562, 인간 AML 세포주)의 세포 살해/고갈을 보여준다.
도 13a~13b는 ADCC를 통한 시험 항체에 의한 TNFR2-발현 인간 Treg의 세포 살해/고갈을 입증한다.
도 14a~14b는 대식세포 매개 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP)을 통한, 5~71 및 25~108에 의한 TNFR2-발현 종양 세포의 세포 살해를 보여준다.
도 15a~15c는 25~71 및 25~108이 골수 유래 억제 세포(MDSC) 매개 면역 억제를 2개의 상이한 공여자(15b 및 15c)로부터 역전시킬 수 있음을 보여준다. 억제율(%) = T 단독 - [(T+MDSC)/T 단독] X 100.
도 16은 에피토프가 전장 TNFR2의 잔기 43, 45, 49, 55, 56, 73, 및 77을 포함하는, 항체 클론 25~71과 전장 인간 TNFR2(서열번호 327)의 영역 사이의 에피토프 부위를 보여준다.
도 17a~17j는 항체 클론 25~71과 인간 TNFR2 사이의 상호작용을 보여준다. 전장 인간 TNFR2 서열의 잔기 43~45(REY); 잔기 49~56(TAQMCCSK; 서열번호 328); 및 잔기 73~77(TVCDS; 서열번호 329)에 상응하는, 에피토프 상의 TNFR2 PDB 구조 3ALQ는 회색으로 표시되어 있다. 도시된 것은 리본/표면 형태의 정면도(a), 배면도(b), 측면도 1(c), 측면도 2(d), 및 상면도(e); 및 리본 형태의 정면도(f), 배면도(g), 측면도 1(h), 측면도 2(i), 및 상면도(j)이다.
도 18a~18e는 클론 25~71이 효과기 T 세포의 Treg 억제를 역전시킨다는 것을 보여준다. 18a에서, 정제된 Treg는 억제 검정에 첨가될 때 TNFR2를 발현한다. 18b~18c에서, 데이터는 T 반응 세포의 증식율(b) 또는 Treg 억제율(c)로서 도표화되어 있다. 도 18d~18e는 Tresp:Treg 비율이 1:2일 때(d) 및 IgG1 대조군(e)의 예시적인 증식 히스토그램을 보여준다.
도 19a~19c는 Colo205 세포를 주사한 암컷 누드 마우스에서 클론 25~71의 항종양 효과(48% TGI)를 보여준다. 19a는 치료 프로토콜을 개략적으로 기술한 것이고, 19b는 시험 제제가 종양 부피에 미치는 효과를 나타내고, 19c는 체중에 미치는 효과를 보여준다.
본 개시는 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것으로서, 특히 특정 에피토프 특이성 및 기능적 특성을 갖는 항체에 관한 것이다. 일부 구현예는, TNFR2에 결합할 수 있고, TNFR2가 이의 리간드 종양 괴사 인자-α(TNF-α)와 결합하는 것을 차단할 수 있고, 유도된 하류 세포 신호전달 및 생물학적 효과를 억제할 수 있는 특이적 인간화 항체 및 이의 단편을 포함한다. 소정의 구현예에서, 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2 길항제 또는 억제제이다. 일부 경우에, TNFR2의 길항제는, 예를 들어 종양 미세환경에서 TNFR2의 면역억제 작용을 차단함으로써 면역 반응을 강화한다. 본원에 기술된 TNFR2 길항제 항체는, 예를 들어 TNFR2-발현 암을 포함하여, 암의 치료와 예방에 유용하다.
일부 구현예는 TNFR2 활성 또는 이의 비정상적인 발현과 연관된 질환 또는 장애 진단, 평가, 및 치료를 위한 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도에 관한 것이다. 대상 항체는 다른 질환 가운데 암의 치료 또는 예방에 사용된다.
구체적으로 반대로 지시되지 않는 한, 본 개시를 실시하는 데에는 당업계의 종래 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학, 및 재조합 DNA 기술로 이루어진 방법이 사용될 것이며, 이 중 많은 부분은 예시의 목적으로 후술된다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology 또는 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009); Ausubel 등의 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995]; Sambrook과 Russell의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001)]; Maniatis 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.)]; Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal의 문헌[A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)] 및 기타 유사한 문헌을 참조한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 “a”, “an” 및 “the”는 그 내용이 명백하게 달리 언급하지 않는 한 복수의 대상체를 포함한다.
“약”은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이에 대해 많게는 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1%만큼 가변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이를 의미한다.
“길항제”는 다른 제제 또는 분자의 생리학적 작용을 방해하거나 달리 감소시키는 제제(예: 항체)를 지칭한다. 일부 경우에, 길항제는 다른 제제 또는 분자에 특이적으로 결합한다. 전체 길항제 및 부분 길항제가 포함된다.
“작용제”는 다른 제제 또는 분자의 생리학적 작용을 증가시키거나 강화하는 제제(예: 항체)를 지칭한다. 일부 경우에, 작용제는 다른 제제 또는 분자에 특이적으로 결합한다. 전체 작용제 및 부분 작용제가 포함된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 “포함하다(comprise)” 또는 “포함하는(comprises 또는 comprising)”과 같은 변형은, 언급된 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 군을 포함하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 군을 배제하지는 않는 것으로 이해해야 한다.
“이루어지는(consisting of)”이란 “이루어지는”이라는 문구와 연결된 모든 것을 포함하고, 이들로 한정되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 “다음으로 이루어지는”은 열거된 요소가 요구되거나 필수적이라는 것, 및 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. “본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)”은 이 문구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 본 개시에서 명시된 활동 또는 작용을 방해하지 않거나 이에 기여하지 않는 다른 요소에 대해 제한됨을 의미한다. 따라서, 문구 “본질적으로 이루어지는”은 열거된 요소가 필요하거나 필수적이지만, 다른 요소는 임의적인 것이고, 다른 요소가 열거된 요소의 활동 또는 작용에 중요한 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
본 명세서의 각 구현예는 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 모든 다른 구현예에 준용된다(mutatis mutandis).
용어 “조절(modulating)” 및 “변경(altering)”하는 것은, 일반적으로 대조군 대비 통계적으로 유의하거나 생리학적으로 유의한 양 또는 정도로 “증가(increasing)”, “강화(enhancing)” 또는 “자극(stimulating)”하는 것 뿐만 아니라 “감소(decreasing 또는 reducing)”, 또는 “억제(inhibiting)”하는 것을 포함한다. “증가된(increased)”, “자극된(stimulated)” 또는 “강화된(enhanced)” 양은 일반적으로 “통계적으로 유의한” 양이며, 조성물이 없을 때(예를 들어 제제의 부재시) 또는 대조군 조성물에 의해 생산된 양의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100배 또는 그 이상인(예를 들어, 500, 1000배인)(예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8과 같이 개재된 모든 정수 및 범위를 포함함) 증가를 포함할 수 있다. “감소된(decreased 또는 reduced)” 또는 “억제된(inhibited)” 양은 일반적으로 “통계적으로 유의한” 양이며, 부의 조성물(no composition)(예를 들어, 제제의 부재시) 또는 대조군에 의해 생산된 양에 있어서 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% , 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 감소(개재된 모든 정수 및 범위를 포함함)를 포함할 수 있다. 비교 및 “통계적으로 유의한” 양의 예가 본원에 기술되어 있다.
“실질적으로” 또는 “본질적으로”는 임의의 주어진 양의 거의 완전히 또는 완전히, 예를 들어, 임의의 주어진 양의 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 의미한다.
“통계적으로 유의미한”이란 결과가 우연히 발생했을 가능성이 낮다는 것을 의미한다. 통계적 유의성은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 사용되는 유의성 척도는 p-값을 포함하며, 이는 귀무 가설이 참인 경우, 관찰된 이벤트가 발생할 빈도 또는 확률이다. 수득된 p-값이 유의 수준보다 작은 경우, 귀무 가설이 기각된다. 간단한 경우에, 유의 수준은 p-값 0.05 이하로 정의된다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환에 표준 기술(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)이 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 이들 및 관련 기술 및 절차는 당업계에 잘 알려진 종래의 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조 문헌에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행될 수 있다. 구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기술된 분자 생물학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여, 및 이들 분야의 실험실 절차 및 기술과 관련하여 사용되는 명명법은 당업계에 잘 알려져 있고 흔히 사용되는 것이다. 재조합 기술, 분자 생물학, 미생물학, 화학적 합성, 화학적 분석, 약학적 제제, 제형, 및 전달, 및 환자의 치료에 표준 기술이 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상보성 결정 영역 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 서열, 및 상보성 결정 영역 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 서열을 특징으로 하거나 이를 포함한다. 예시적인 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열은 아래 표 H1에 제공되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
따라서, 소정의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2에 결합하며,
표 H1로부터 선택된 상보성 결정 영역 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 서열; 및
표 H1로부터 선택된 상보성 결정 영역 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 서열을 포함하고,
적어도 하나의 TNFR2 폴리펩티드 또는 에피토프(예를 들어, 표 T1로부터 선택됨)에 특이적으로 결합하는 이의 변이체를 포함한다.
소정의 구현예에서, CDR 서열은 다음과 같다:
서열번호 1~3에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 서열번호 4~6에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역;
서열번호 7~9에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 10~12에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 13~15에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 16~18에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 19~21에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 22~24에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 25~27에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 28~30에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 31~33에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 34~36에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 37~39에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 40~42에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 43~45에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 46~48에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 49~51에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 52~54에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 55~57에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 58~60에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 61~63에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 64~66에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 67~69에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 70~72에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 73~75에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 76~78에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 79~81에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 82~84에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 85~87에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 88~90에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
서열번호 91~93에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 94~96에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역; 또는
서열번호 97~99에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 100~102에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역.
또한, TNFR2에 결합하는 친화도 성숙 변이체, 예를 들어, CDR 영역에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 총 변경을 갖는 변이체, 예를 들어, 본원에 기술된 하나 이상의 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및/또는 VLCDR3 서열이 변경된 변이체를 포함하는, 이의 변이체가 포함된다. 예시적인 “변경(alteration)” 아미노산 치환, 추가, 및 결실을 포함한다.
소정의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 서열, 및 경쇄 가변 영역(VL) 서열을 특징으로 하거나 이를 포함한다. 예시적인 인간화 VH 및 VL 서열이 아래 표 H2에 제공되어 있고, 예시적인 토끼 VH 서열이 아래 표 R1에 제공되어 있고(VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역에는 밑줄이 그어져 있음), 예시적인 토끼 VL 서열이 아래 표 R2에 제공되어 있다(VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역에는 밑줄이 그어져 있음).
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따라서, 소정의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2에 결합하고, 표 H2로부터 선택된 VH 및 상응하는 VL 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, VH 영역은 서열번호 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 및 135로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 서열번호 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 및 136으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
서열번호 103에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 104에 제시된 VL 영역;
서열번호 105에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 106에 제시된 VL 영역;
서열번호 107에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 108에 제시된 VL 영역;
서열번호 109에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 110에 제시된 VL 영역;
서열번호 111에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 112에 제시된 VL 영역;
서열번호 113에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 114에 제시된 VL 영역;
서열번호 115에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 116에 제시된 VL 영역;
서열번호 117에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 118에 제시된 VL 영역;
서열번호 119에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 120에 제시된 VL 영역;
서열번호 121에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 122에 제시된 VL 영역;
서열번호 123에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 124에 제시된 VL 영역;
서열번호 125에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 126에 제시된 VL 영역;
서열번호 127에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 128에 제시된 VL 영역;
서열번호 129에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 130에 제시된 VL 영역;
서열번호 131에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 132에 제시된 VL 영역;
서열번호 133에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 134에 제시된 VL 영역; 또는
서열번호 135에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 136에 제시된 VL 영역.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 결합하고, 표 R1에서 밑줄이 그어진 서열로부터 선택된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 표 R2에서 밑줄이 그어진 서열로부터 선택된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3을 포함하는 (클론명 기준으로) 상응하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 표 R1로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 표 R2로부터 선택된 (클론명 기준으로) 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 전술한 바와 같이, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2), 예를 들어, 가용성 또는 세포 발현 TNFR2에 결합한다. 특정 구현예에서, TNFR2는 인간 TNFR2, 또는 이의 펩티드 에피토프이다. 인간 TNFR2의 예시적인 펩티드 에피토프가 아래 표 T1에 제공되어 있다.
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소정의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TNFR2, 예를 들어, 표 T1로부터 선택된 적어도 하나의 인간 TNFR2 펩티드 에피토프, 예를 들어 표 T1로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 펩티드 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 성숙한 인간 TNFR2 서열(FL 인간 TNFR2의 잔기 23~461)에 의해 정의했을 때 R21, Y23, T27, S33, K34, T51, 및 S55로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지는 펩티드 에피토프에서 인간 TNFR2에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, REY, TAQMCCSK(서열번호 328), 및 TVCDS(서열번호 329)로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지는 펩티드 에피토프에서 인간 TNFR2에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 2 nM 이하의 KD, 또는 약 0.7 nM 이하의 KD로 인간 TNFR2에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시노몰구스 TNFR2에 결합하며, 예를 들어, 인간 TNFR2 및 시노몰구스 TNFR2에 교차 반응성으로 결합한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2 길항제이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2에 대한 TNF-α 결합을 억제하거나 달리 감소시킨다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2 다량체화 또는 삼량체화를 억제하거나 달리 감소시킨다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, T 조절 세포(Treg)의 TNFR2-매개 활성화를, 예를 들어 전신에서 또는 종양 미세환경에서 억제하거나 달리 감소시킨다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2에 결합하고, TNFR2 길항제이며, 종양 괴사 인자 수용체 1(TNFR1), 예를 들어 인간 TNFR1에 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 헤르페스바이러스 세포내 침투 매개체(HVEM), CD40, 사멸 수용체 6(DR6), 및/또는 오스테오프로테게린(OPG)에 실질적으로 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내에서, 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)에 의해 종양 세포(예를 들어, TNFR2-발현 종양 세포), Treg, 및/또는 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 세포 살해/고갈을 대조군 또는 기준에 비해, 예를 들어 약 또는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% 또는 그 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 대식세포 매개 항체 의존적 세포 식균작용(ADCC)에 의해 종양 세포(예를 들어, TNFR2-발현 종양 세포), Treg, 및/또는 MDSC의 세포 살해/고갈을 대조군 또는 기준에 비해, 예를 들어 약 또는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% 또는 그 이상 증가시킨다. 일부 구현예에서, 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MDSC 매개 면역 억제를 대조군 또는 기준 대비, 예를 들어 약 또는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% 또는 그 이상만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MDSC 및/또는 M2 대식세포를 전염증성 M1 대식세포로 전환시키고/시키거나, 상기 전환을 대조군 또는 기준 대비, 예를 들어 약 또는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% 또는 그 이상만큼 증가시킴으로써, Treg를 효과기 T 세포로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 “차가운” 종양을 “뜨거운” 종양으로 전환시킨다. “차가운” 종양은 면역 체계에 의해 인식되지 않았거나 강한 반응을 야기하지 않은 종양이다. 예를 들어, 차가운 종양의 미세환경은 일반적으로 낮거나 유의하지 않은 수준의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 갖는 대신에; 종종 상대적으로 높은 수준의 골수 유래 억제 세포 및/또는 Treg를 갖는데, 이들은 면역억제 사이토카인을 분비하여 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 종양 미세환경 내로 이동하는 것을 방해한다. 대조적으로, “뜨거운” 종양은 높은 수준의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 가짐으로써, 염증 종양 미세환경을 생성하는 종양이다. 특정 구현예에서, 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전술한 특성 중 임의의 하나 이상의 조합을 갖는다.
단지 설명을 위해, 항체 또는 이의 항원 결합단편과 TNFR2 폴리펩티드 간의 결합 상호작용은, biacore 검정(예를 들어, 센서 칩에 결합된 적절히 태그된 가용성 시약을 이용함), (천연 또는 재조합) 세포 표면에서 TNFR2 폴리펩티드를 발현하는 세포를 이용하는 FACS 분석, 면역검정, 형광 염색 검정, ELISA 검정, 및 ITC(Isothermal Titration Calorimetry, 등온 적정 열량측정)와 같은 미세열량측정 접근법과 같은 다양한 일상적인 방법에 의해 검출되고 정량화될 수 있다.
당업계에 잘 알려진 바와 같이, 항체는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 에피토프 인식 부위를 통해, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 온전한 다클론 또는 단클론 항체 뿐만 아니라, 이의 단편(예: dAb, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), 단쇄(scFv), 이의 합성 변이체, 자연 발생 변이체, 필요한 특이성을 가진 항원 결합 단편을 갖는 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 필요한 특이성을 가진 항원 결합 부위 또는 단편(에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성도 포함한다. 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편인 “디아바디”(WO94/13804; P. Holliger 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993])도 본원에서 고려되는 항체의 특정 형태이다. CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디도 본원에 포함된다(S. Hu 등의 문헌[Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996] 참조). 예를 들어, Ward, E. S. 등의 문헌[Nature 341, 544-546 (1989)]; Bird 등의 문헌[Science, 242, 423-426, 1988]; Huston 등의 문헌[PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988]; PCT/US92/09965; WO94/13804; P. Holliger 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993]; Y. Reiter 등의 문헌[Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]; S. Hu 등의 문헌[Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 “항원 결합 단편”은 관심 항원, 특히 TNFR2에 결합하는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 하나의 CDR을 함유하는 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 이와 관련하여, 본원에 기술된 항체의 항원 결합 단편은 TNFR2에 결합하는 항체에서 유래된, 본원에 제시된 VH 및 VL 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR 모두를 포함할 수 있다.
용어 “항원”은 항체와 같은 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있고, 추가적으로 동물에서 사용되어 해당 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산할 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 “에피토프”는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자, 바람직하게는 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 소정의 구현예에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 군을 포함하고, 소정의 구현예에서는 특정 3차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 소정의 구현예에서, 항체는 단백질 및/또는 거대 분자의 복합 혼합물에서 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 항체는 평형 해리 상수가 10-7 또는 10-8 M 이하일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 일부 구현예에서, 평형 해리 상수는 10-9 M 또는 ≤10-10 M 이하일 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편은 중쇄와 경쇄 프레임워크 영역(FR) 세트 사이에 개재되어 CDR을 지지하고, CDR 각각에 대한 공간 관계를 정의하는 중쇄 및 경쇄 CDR 세트를 각각 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “CDR 세트”는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 초가변 영역을 지칭한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터, 이들 영역은 각각 “CDR1,” “CDR2,” 및 “CDR3”으로 표시된다. 따라서, 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하여 6개의 CDR을 포함한다. 단일 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩티드는 본원에서 “분자 인식 단위”로서 지칭된다. 다수의 항원-항체 복합체의 결정학적 분석을 통해, CDR의 아미노산 잔기가 결합된 항원과의 광범위한 접촉을 형성하는 것을 입증하였는데, 여기서 가장 광범위한 항원 접촉은 중쇄 CDR3과의 접촉이다. 따라서, 분자 인식 단위는 항원 결합 부위의 특이성을 주로 담당한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “FR 세트”는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세트의 CDR을 프레이밍하는 4개의 측면 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 FR 잔기는 결합된 항원과 접촉할 수 있지만, FR은 V 영역이 항원 결합 부위, 특히 CDR에 직접 인접한 FR 잔기로 접히게 하는 것을 주로 담당한다. FR 내에서, 소정의 아미노 잔기 및 소정의 구조적 특징은 매우 고도로 보존된다. 이와 관련하여, 모든 V 영역 서열은 약 90개의 아미노산 잔기로 이루어진 내부 이황화 루프를 함유한다. V 영역이 결합 부위로 접힐 때, CDR은 항원 결합 표면을 형성하는 돌출 루프 모티프로서 디스플레이된다. 이는, 정확한 CDR 아미노산 서열에 관계없이 CDR 루프가 소정의 “정준형” 구조로 접히는 형상에 영향을 미치는 보존된 FR 구조 영역이 존재한다는 것으로 일반적으로 인식된다. 또한, 소정의 FR 잔기는 항체 중쇄 및 경쇄의 상호작용을 안정화하는 비공유 도메인 간 접촉에 참여하는 것으로 알려져 있다.
면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 Kabat, E. A. 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987] 및 갱신판을 참조하여 결정될 수 있으며, 상기 문헌은 인터넷 상에서 이용할 수 있다 (immuno.bme.nwu.edu).
“단클론 항체”는 단클론 항체의 동종 항체 집단을 지칭하며, 여기서 단클론 항체는 에피토프의 선택적 결합에 관여하는 아미노산(자연 발생 및 비-자연 발생)으로 구성된다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 에피토프에 대해 유도된다. 용어 “단클론 항체”는 온전한 단클론 항체 및 전장 단클론 항체를 포함할 뿐만 아니라, 이의 단편(예컨대, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), 단쇄 (scFv), 이들의 변이체, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 단클론 항체, 키메라 단클론 항체, 및 에피토프에 결합하는 데 필요한 특이성 및 능력을 갖는 항원 결합 단편(에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성도 포함한다. 이는 항체의 공급원 또는 항체의 제조 방식(예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자 이식 동물 등)과 관련하여 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 상기 용어는 “항체”의 정의 하에 본원에 기술된 전체 면역글로불린 및 단편 등을 포함한다.
단백질분해 효소 파파인은 IgG 분자를 우선적으로 절단하여 여러 단편을 제공하는데, 이들(F(ab) 단편) 중 2개는 온전한 항원 결합 부위를 포함하는 공유 이종이량체를 각각 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 절단하여 여러 단편을 제공할 수 있는데, 2개의 항원 결합 부위 모두를 포함하는 F(ab’)2 단편이 여기에 포함된다. 본 개시의 특정 구현예에 따라 사용하기 위한 Fv 단편은 IgM, 및 드물게는 IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자의 우선적 단백질 절단에 의해 생성될 수 있다. 그러나, Fv 단편은 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 보다 일반적으로 유도된다. Fv 단편은 천연 항체 분자의 항원 인식 및 결합 능력의 대부분을 보유하는 항원 결합 부위를 포함하는 비공유 VH::VL 이종이량체를 포함한다. Inbar 등의 문헌[(1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662]; Hochman 등의 문헌[(1976) Biochem 15:2706-2710]; 및 Ehrlich 등의 문헌[(1980) Biochem 19:4091-4096].
소정의 구현예에서, 단쇄 Fv 또는 scFv 항체가 고려된다. 예를 들어, 카파 바디(Ill 등의 문헌[Prot. Eng. 10: 949-57 (1997)]; 미니바디(Martin 등의 문헌[EMBO J 13: 5305-9 (1994)]; 디아바디(Holliger 등의 문헌[PNAS 90: 6444-8 (1993)]; 또는 야누신(Janusin)(Traunecker 등의 문헌[EMBO J 10: 3655-59 (1991)] 및 Traunecker 등의 문헌[Int. J. Cancer Suppl. 7: 51-52 (1992)]은 원하는 특이성을 갖는 항체를 선택하는 것과 관련하여 본원의 교지에 따라 표준 분자 생물학 기술을 사용해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 리간드를 포함하는 이중특이적 항체 또는 키메라 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 상이한 항체 유래의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함할 수 있는 반면, 이중특이적 항체는 하나의 결합 도메인을 통해 TNFR2에 특이적으로 결합하고 제2 결합 도메인을 통해 제2 분자에 특이적으로 결합하도록 생성할 수 있다. 이들 항체는 재조합 분자 생물학적 기술을 통해 생산되거나 물리적으로 함께 접합될 수 있다.
단쇄 Fv(scFv) 폴리펩티드는 공유 결합된 VH::V L이종이량체이며, 이는 펩티드 암호화 링커에 의해 연결된 VH-암호화 유전자 및 VL-암호화 유전자를 포함하는 유전자 융합체로부터 발현된다. Huston 등의 문헌[(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883]. 항체 V 영역으로부터 자연적으로 응집되지만 화학적으로 분리되는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드 사슬을, 항원 결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 접히게 되는 scFv 분자로 전환하기 위해 화학 구조를 구별하기 위한 다수의 방법이 기술되어 왔다. 예를 들어, Huston 등의 미국 특허 제5,091,513호 및 제5,132,405호; 및 Ladner 등의 미국 특허 제4,946,778호를 참조한다.
소정의 구현예는, 표적 또는 질환 조직에서 결합 부위(들)가 활성화될 때까지 마스킹되거나 단백질 분해 절단에 의해 달리 불활화되는 항체 또는 “프로바디”를 포함한다. 이들 및 관련 구현예 중 일부는, 항체의 항원 결합 부위(들)를 입체적으로 방해하고, 하나 이상의 단백질분해 절단성 링커를 통해 항체에 융합되는 하나 이상의 마스킹 모이어티를 포함한다(예를 들어, Polu 및 Lowman의 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 14:1049-1053, 2014] 참조).
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 TNFR2 결합 항체는 디아바디의 형태이다. 디아바디는 폴리펩티드의 다량체이며, 각각의 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인 및 면역글로불린 중쇄의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인을 포함하고, 2개의 도메인은 (예를 들어 펩티드 링커에 의해) 연결되어 있지만 서로 결합되어 항원 결합 부위를 형성할 수 없고; 항원 결합 부위는 다량체 내의 하나의 폴리펩티드의 제1 도메인과 다량체 내의 또 다른 폴리펩티드의 제2 도메인의 결합에 의해 형성된다(WO94/13804).
항체의 dAb 단편은 VH 도메인으로 이루어진다(Ward, E. S. 등의 문헌[Nature 341, 544-546 (1989)]).
이중특이적 또는 다중특이적 항체가 사용되는 경우, 이들은 다양한 방식으로 제조될 수 있는(Holliger, P. 및 Winter G.의 문헌[Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), 예를 들어 화학적으로 또는 하이브리도마로부터 제조되는 종래 이중특이적 항체이거나, 전술한 이중 특이적 항체 단편 중 어느 하나일 수 있다. 디아바디 및 scFv는 가변 도메인만을 사용하여 Fc 영역 없이 작제되어 항유전자형 반응(anti-idiotypic reaction)의 효과를 잠재적으로 감소시킬 수 있다.
이중특이적 전체 항체와 대조적으로, 이중특이적 디아바디는 대장균에서 쉽게 작제되고 발현될 수 있기 때문에 특히 유용할 수도 있다. 적절한 결합 특이성을 가진 디아바디(및 항체 단편과 같은 많은 다른 폴리펩티드)는 파지 디스플레이를 사용해 라이브러리로부터 쉽게 선택할 수 있다(WO94/13804). 예를 들어, 디아바디의 하나의 아암이 항원 X에 대해 특이성이 유도된 상태로 일정하게 유지되는 경우, 다른 하나의 아암을 가변시켜 적절한 특이성을 갖는 항체가 선택되게 하는 라이브러러리를 만들 수 있다. 이중특이적 전체 항체는 노브-인투-홀 조작에 의해 제조될 수 있다(J. B. Ridgeway 등의 문헌[Protein Eng., 9, 616-621, 1996] 참조).
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 UniBody®의 형태로 제공될 수 있다. UniBody®는 힌지 영역이 제거된 IgG4 항체이다(GenMab Utrecht, The Netherlands; 또한 US20090226421도 참조). 이러한 독점적 항체 기술은 현재의 작은 항체 포맷보다 예상되는 더 긴 치료 윈도우를 갖는 안정적이고 작은 항체 포맷을 생성한다. IgG4 항체는 불활성으로 간주되므로 면역 체계와 상호작용하지 않는다. 완전한 인간 IgG4 항체는, 항체의 힌지 영역을 제거하여 상응하는 온전한 IgG4(GenMab, Utreecht)에 대해 구별되는 안정성 특성을 갖는 반분자 단편을 수득함으로써 변형될 수 있다. IgG4 분자를 절반으로 만들면 UniBody® 상에서 동족 항원(예: 질환 표적)에 결합할 수 있는 하나의 영역만 남게 되고, 따라서 UniBody®는 표적 세포 상의 하나의 부위에만 1가 결합하게 된다. 소정의 암 세포 표면 항원의 경우, 이러한 1가 결합은, 동일한 항원 특이성을 갖는 2가 항체를 사용했을 때 나타날 수 있는 것과 같이, 암 세포가 성장하도록 자극하지 않을 수 있으므로, UniBody® 기술은 종래의 항체를 이용한 치료에 불응성일 수 있는 일부 유형의 암에 대한 치료 옵션을 제공할 수 있다. UniBody®의 작은 크기는 일부 형태의 암을 치료할 때 큰 이점이 될 수 있으며, 더 큰 고형 종양에 대한 분자의 더 나은 분포를 가능하게 하고 잠재적으로 효능을 증가시킬 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 개시의 항체는 Nanobody®의 형태를 취할 수 있다. Nanobody®는 단일 유전자에 의해 암호화되고, 거의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예를 들어, 대장균에(예를 들어, 미국 특허 제6,765,087호), 곰팡이류(예를 들어, 아스페르길루스 또는 트리코더마), 및 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이버마이세스(Kluyvermyces), 한세눌라(Hansenula), 또는 피키아(Pichia)(예를 들어, 미국 특허 제6,838,254호)에서 효율적으로 생산될 수 있다. 생산 공정은 확장 가능하며, 수 킬로그램의 Nanobodys®가 생산된 적이 있다. 나노바디는 사용 기간이 긴 바로 사용 가능한 용액으로 제형화될 수 있다. Nanoclone® 방법(예를 들어, WO 06/079372 참조)은 B-세포의 자동화된 고처리량 선택에 기초하여 원하는 표적에 맞는 나노바디를 생성하는 독점적인 방법이다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화된다. 이는, 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조된 키메라 분자를 지칭하며, 상기 키메라 분자는 비인간 종의 면역글로불린으로부터 유래된 항원 결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 갖는다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역 상에 이식된 CDR만을 포함할 수 있다. 에피토프 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이는 인간 개체에서 면역원으로서의 불변 영역을 제거하지만, 외래 가변 영역에 대한 면역 반응이 남아 있을 가능성이 있다(LoBuglio, A. F. 등의 문헌[(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4220-4224]; Queen 등의 문헌[PNAS (1988) 86:10029-10033]; Riechmann 등의 문헌[Nature (1988) 332:323-327)]. 본원에 개시된 항-TNFR2 항체의 인간화를 위한 예시적인 방법은 미국 특허 제7,462,697호에 기술된 방법을 포함한다. 소정의 구현예에 따른 예시적인 인간화 항체는 표 H1 및 표 H2에 제공된 인간화 서열을 포함한다.
또 다른 접근법은 인간 유래 불변 영역을 제공하는 것뿐만 아니라, 가변 영역을 변형시켜 이들의 형상을 인간 형태에 가능한 한 가깝게 재형성하는 것에 초점을 맞춘다. 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역은, 대상 에피토프에 반응하여 변화하고, 결합 가능성을 결정하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하는 것으로 알려져 있으며, CDR은 주어진 종에서 상대적으로 보존되고 CDR에 대한 스캐폴딩을 추정적으로 제공하는 4개의 프레임워크 영역(FR)이 측면에 위치한다. 특정 에피토프에 대한 비인간 항체를 제조하는 경우, 가변 영역은 변형될 인간 항체에 존재하는 FR 상에 비인간 항체로부터 유래된 CDR을 접목시킴으로써 “재성형”되거나 “인간화”될 수 있다. 다양한 항체에 대한 이러한 접근법의 적용은 Sato, K. 등의 문헌[(1993) Cancer Res 53:851-856]; Riechmann, L. 등의 문헌[(1988) Nature 332:323-327]; Verhoeyen, M. 등의 문헌[(1988) Science 239:1534-1536]; Kettleborough, C. A. 등의 문헌[(1991) Protein Engineering 4:773-3783]; Maeda, H. 등의 문헌[(1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134]; Gorman, S. D. 등의 문헌[(1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185]; Tempest, P. R. 등의 문헌[(1991) Bio/Technology 9:266-271]; Co, M. S. 등의 문헌[(1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873]; Carter, P. 등의 문헌[(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289]; 및 Co, M. S. 등의 문헌[(1992) J Immunol 148:1149-1154]에 보고되어 있다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다(예: 토끼 항체 유래의 6개의 CDR 모두를 함유하는 인간화 토끼 항체). 일부 구현예에서, 인간화 항체는 원래 항체에 대해 변경된 하나 이상의 (하나, 2, 3, 4, 5, 6개의) CDR을 가지며, 이는 원래 항체의 하나 이상의 CDR로부터 “유래된” 것으로도 지칭된다.
소정의 구현예에서, 본 개시의 항체는 키메라 항체일 수 있다. 이와 관련하여, 키메라 항체는 상이한 항체의 이종 Fc 부분에 작동 가능하게 연결되거나 달리 융합된 항-TNFR2 항체의 항원 결합 단편으로 구성된다. 소정의 구현예에서, 이종 Fc 도메인은 인간 기원이다. 일부 구현예에서, 이종 Fc 도메인은 IgA(하위 부류 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG(하위 부류 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 포함), 및 IgM을 포함하여, 부모 항체와 상이한 Ig 부류로부터 유래될 수 있다. 추가의 구현예에서, 이종 Fc 도메인은 상이한 Ig 부류 중 하나 이상의 CH2 및 CH3 도메인으로 구성될 수 있다. 인간화 항체와 관련하여 전술한 바와 같이, 인간화 항체의 항-TNFR2 항원 결합 단편은 본원에 기술된 항체의 CDR 중 하나 이상(예를 들어, 본원에 기술된 항체의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 CDR)만을 포함하거나, 전체 가변 도메인(VL, VH 또는 둘 다)을 포함할 수 있다.
소정의 구현예에서, TNFR2-결합 항체는 본원에 기술된 항체의 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 이와 관련하여, 일부 경우에, 원하는 특이적 결합을 유지하면서 항체의 VHCDR3만을 전달할 수 있는 것으로 나타났다(Barbas 등의 문헌[PNAS (1995) 92: 2529-2533]). McLane 등의 문헌[PNAS (1995) 92:5214-5218], Barbas 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:2161-2162]을 또한 참조한다.
Marks 등은 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인의 레파토리를 제공하기 위해 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 영역에 대한 컨센서스 프라이머와 함께 가변 도메인 영역의 5’ 말단에 대해 유도되거나 이에 이에 인접한 컨센서스 프라이머가 사용되는 항체 가변 도메인의 레파토리를 생산하는 방법을 기술한다(Bio/Technology, 1992, 10:779-783). Marks 등은 이러한 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3과 어떻게 조합될 수 있는지를 추가로 기술한다. 유사한 기술을 사용하여, 현재 기술된 항체의 CDR3-유래 서열은 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레파토리와 함께 셔플링될 수 있고, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동족 VL 또는 VH 도메인과 합쳐져 TNFR2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공할 수 있다. 그런 다음, 적절한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 선택될 수 있도록, 레파토리는 WO 92/01047의 파지 디스플레이 시스템과 같은 적절한 호스트 시스템에서 표시될 수 있다. 레퍼토리는 적게는 104개의 개별 구성원에서부터, 위로는 이의 수천 내지 수십만배만큼, 예를 들어 106 내지 108 또는 1010배만큼 더 많은 개별 구성원으로 이루어질 수 있다. 유사한 셔플링 또는 조합 기술도 Stemmer(Nature, 1994, 370:389-391)에 의해 개시되었는데, Stemmer는 β-락타마제 유전자와 관련하여 이 기술을 기술하지만, 이러한 접근법이 항체 생성에 사용될 수 있음을 관찰하였다.
추가의 대안은, 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자를 대상으로 전체 가변 도메인 내에서 돌연변이를 생성하는 무작위 돌연변이 유발을 사용해 본원에 기술된 하나 이상의 CDR-유래 서열을 갖는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성하는 것이다. 이러한 기술은 오류 유발 PCR을 사용한 Gram 등에 의해 기술되었다(1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580). 사용될 수 있는 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 돌연변이 유발을 유도하는 것이다. 이러한 기술은 Barbas 등(1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) 및 Schier 등(1996, J. Mol. Biol. 263:551-567)에 의해 개시되었다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항체의 특이적 VH 및/또는 VL은 TNFR2에 대한 친화도 증가와 같은 바람직한 특성을 갖는 항체를 식별하기 위해 상보적 가변 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 Portolano 등의 문헌[J. Immunol. (1993) 150:880-887]; Clarkson 등의 문헌[Nature (1991) 352:624-628]에 기술되어 있다.
원하는 결합 활성, 예컨대 TNFR2에 대한 결합 활성을 갖는 항체를 식별하기 위해 CDR을 혼합하고 일치시키는 다른 방법이 사용될 수도 있다. 예를 들어: Klimka 등의 문헌[British Journal of Cancer (2000) 83: 252-260]은 마우스 VL 및 인간 VH 라이브러리를 마우스 VH에서 유지된 CDR3 및 FR4와 함께 사용하는 스크리닝 방법을 기술한다. 항체를 수득한 후, 인간 VL 라이브러리에 대해 VH를 스크리닝하여 항원에 결합된 항체를 수득하였다. Beiboer 등의 문헌[J. Mol. Biol. (2000) 296:833-849]는 전체 마우스 중쇄 및 인간 경쇄 라이브러리를 사용하는 스크리닝 방법을 기술한다. 항체를 수득한 후, 하나의 VL을 마우스의 CDR3이 유지된 인간 VH 라이브러리와 조합하였다. 항원에 결합할 수 있는 항체를 수득하였다. Rader 등의 문헌[PNAS (1998) 95:8910-8915]은 전술한 Beiboer 등의 방법과 유사한 방법을 기술한다.
지금 기술된 이들 기술은 당업계에 공지된 기술에 포함되거나 그 자체로서 당업계에 알려져 있다. 그러나, 당업자는 당업계에서 통상적인 방법을 사용하여 본원에 기술된 여러 구현예에 따라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하기 위해 이러한 기술을 사용할 수 있다.
TNFR2 항원에 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 수득하기 위한 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은, 본원에 제시된 VH 도메인의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 추가, 결실, 치환, 또는 삽입함으로써 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계; 임의로, 이렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계; 및 VH 도메인 또는 VH/VL 조합(들)을 시험하여 TNFR2에 특이적이고 임의로 하나 이상의 원하는 특성을 갖는 특이적 결합 구성원 또는 항체 항원 결합 도메인을 식별하는 단계를 포함한다. VL 도메인은 본원에서 제시된 것과 실질적으로 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체가 하나 이상의 VH 도메인과 조합되는, 유사한 방법이 사용될 수 있다.
항체 또는 폴리펩티드에 “특이적으로 결합”하거나 “우선적으로 결합”하는 (본원에서 상호 교환적으로 사용됨) 에피토프는 당업계에서 잘 이해되는 용어이며, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 분자가 대안적인 세포 또는 물질과 반응하거나 결합하는 것보다 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 오랫동안, 및/또는 더 큰 친화도로 특정 세포 또는 물질과 반응하거나 결합하는 경우, 이 분자는 “특이적 결합” 또는 “우선적 결합”을 나타내는 것으로 지칭된다. 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로, 결합력으로, 더 쉽게, 및/또는 더 오랫동안 표적에 결합하는 경우, 항체는 표적에 “특이적으로 결합”하거나 “우선적으로 결합”한다. 예를 들어, TNFR2 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는, 다른 TNFR2 에피토프 또는 비-TNFR2 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로, 결합력으로, 더 쉽게, 및/또는 더 오랫동안 하나의 TNFR2에 결합하는 항체이다. 이러한 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있다는 것도 이해할 것이다. 이와 같이, “특이적 결합” 또는 “우선적 결합”은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하는 것은 아니다. 일반적으로, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미하지만, 반드시 그런 것은 아니다.
면역학적 결합은, 예를 들어 (비제한적인 예시이며 제한하는 것은 아님) 정전기, 이온성, 친수성 및/또는 소수성 인력 또는 반발력, 입체력, 수소 결합, 반데르 발스 힘, 및 기타 상호작용의 결과로서, 면역글로불린 분자와 면역글로불린 분자가 특이성을 갖는 항원 간에 발생하는 일종의 비공유 상호작용을 지칭한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(Kd)의 관점에서 표현될 수 있으며, 여기서 Kd가 작을수록 친화도가 더 큰 친화도를 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 하나의 이러한 방법은 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 이들 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화도, 및 양 방향으로 속도에 균등하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 따라 달라진다. 따라서, “결합 속도 상수”(Kon) 및 “해리 속도 상수”(Koff) 둘 다는 농도 및 실제 결합 및 해리 속도를 계산함으로써 결정될 수 있다. Koff/Kon의 비율은 친화도와 관련되지 않은 모든 파라미터를 취소할 수 있게 하므로, 해리 상수 Kd와 동등하다. Davies 등의 문헌[(1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473]을 전반적으로 참조한다.
에피토프 그 자체 또는 “면역학적으로 활성인 상태로 남아 있는”는" 에피토프를 지칭할 때의 용어 “면역학적으로 활성”은, 상이한 조건 하에, 예를 들어 에피토프가 환원 및 변성 조건을 거친 후에, 에피토프에 결합하는 항-TNFR2 항체의 능력을 지칭한다.
일부 구현예에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, TNFR2에 결합하기 위해, (i) 항원에 특이적으로 결합할 뿐 아니라 (ii) 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하거나, 본원에 개시된 VH CDR3 또는 이들 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 본원에 기술된 임의의 항체와 경쟁하는 것일 수 있다. 항체들 간의 경쟁은, 예를 들어 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 특이적 항체의 식별을 가능하게 하는 ELISA를 사용함으로써 및/또는 태그되지 않은 항체가 존재할 때 검출될 수 있는 특이적 리포터 분자를 하나의 항체에 태그함으로써 시험관 내에서 쉽게 검정될 수 있다. 따라서, TNFR2에 결합하는 본원에 기술된 항체와 경쟁하는 인간 항체 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
이와 관련하여, 본원에서 사용되는 바와 같이, (예를 들어, TNFR2에 대한 리간드(예: TNF-α) 및/또는 역수용체의 결합을 억제/차단하는 것을 지칭할 때, 또는 TNFR2에 대한 항-TNFR2 항체의 결합을 억제/차단하는 것을 지칭할 때의) 용어 “경쟁하는”, “결합을 억제하는” 및 “결합을 차단하는”은 상호 교환적으로 사용되고, 부분적 억제/차단 및 완전한 억제/차단 둘 다를 포함한다. TNFR2에 대한 리간드 및/또는 역수용체의 억제/차단은, 리간드 및/또는 역수용체가 억제 또는 차단 없이 TNFR2에 결합할 때 발생하는 정상적인 수준 또는 유형의 세포 신호전달을 바람직하게 감소시키거나 변경시킨다. 억제 및 차단은, 리간드가 항-TNFR2 항체와 접촉하지 않는 경우와 비교해 본원에 개시된 것과 같은 항-TNFR2 항체와 접촉할 때, TNFR2에 대한 리간드 및/또는 역수용체의 결합이 측정 가능하게 감소하는 것, 예를 들어, TNFR2에 대한 리간드(예: TNF-α) 및/또는 역수용체의 결합이 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 감소하는 것을 또한 포함하도록 의도된다.
면역글로불린의 불변 영역은 가변 영역보다 적은 서열 다양성을 나타내며, 다수의 천연 단백질에 결합하여 중요한 생화학적 이벤트를 유도하는 역할을 담당한다. 인간에는 IgA(하위 부류 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG(하위 부류 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 포함), 및 IgM을 포함하는 5개의 상이한 부류의 항체가 있다. 이들 항체 부류 간의 구별되는 특징은 이들의 불변 영역이며, V 영역에는 미묘한 차이가 존재할 수 있다.
항체의 Fc 영역은 다수의 Fc 수용체 및 리간드와 상호 작용하여, 효과기 기능으로서 지칭되는 일련의 중요한 기능적 능력을 부여한다. 일 구현예에서, 항-TNFR2 항체는 Fc 영역을 포함한다. IgG의 경우, Fc 영역은 Ig 도메인 CH2 및 CH3, 및 CH2로 이어지는 N-말단 힌지를 포함한다. IgG 부류에 대한 Fc 수용체의 중요한 패밀리는 Fc 감마 수용체(FcγR)이다. 이들 수용체는 항체와 면역 체계의 세포 아암 사이의 전달을 매개한다(Raghavan 등의 문헌[1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220]; Ravetch 등의 문헌[2001, Annu Rev Immunol 19:275-290]). 인간에서, 이러한 단백질 패밀리는 이소형 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI (CD64); 이소형 FcγRIIa (동형 H131 및 R131 포함), FcγRIIb (FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함), 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII (CD32); 및 이소형 FcγRIIIa (동형 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb (동형 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2 포함)를 포함하는 FcγRIII (CD16)을 포함한다(Jefferis 등의 문헌[2002, Immunol Lett 82:57-65]). 이들 수용체는 일반적으로, Fc에 대한 결합을 매개하는 세포외 도메인, 막 걸침 영역, 및 세포 내에서 일부 신호전달 이벤트를 매개할 수 있는 세포내 도메인을 갖는다. 이들 수용체는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 큰 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 T 세포를 포함하는 다양한 면역 세포에서 발현된다. Fc/FcγR 복합체의 형성에는 결합된 항원 부위에 이들 효과기 세포가 동원되어, 일반적으로 세포 내의 신호 전달 이벤트 및 후속하는 중요한 면역 반응, 예컨대 염증 매개체의 방출, B 세포 활성화, 세포내 섭취, 식균작용, 및 세포독성 공격을 유발한다.
세포독성 및 식세포 효과기 기능을 매개하는 능력은 항체가 표적 세포를 파괴하는 강력한 메커니즘이다. FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 용해를 유발하는 세포 매개 반응은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)으로서 지칭된다(Raghavan 등의 문헌[1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220]; Ghetie 등의 문헌[2000, Annu Rev Immunol 18:739-766]; Ravetch 등의 문헌[2001, Annu Rev Immunol 19:275-290]). FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 식균작용을 유발하는 세포 매개 반응은 항체 의존적 세포 매개 식균작용(ADCP)으로서 지칭된다. 모든 FcγR은 Cg2(CH2) 도메인의 N-말단 단부 및 선행 힌지에서 Fc 상의 동일한 영역에 결합한다. 이러한 상호작용은 구조적으로 잘 특성화되어 있고(Sondermann 등의 문헌[2001, J Mol Biol 309:737-749]), 인간 FcγRIIIb의 세포외 도메인에 결합된 인간 Fc의 여러 구조가 해석되었다(pdb 수탁 코드 1E4K) (Sondermann 등의 문헌[2000, Nature 406:267-273]) (pdb 수탁 번호 1IIS 및 1IIX) (Radaev 등의 문헌[2001, J Biol Chem 276:16469-16477])
상이한 IgG 하위 부류는 FcγR에 대해 상이한 친화도를 가지며, IgG1 및 IgG3은 일반적으로 IgG2 및 IgG4보다 수용체에 더 양호하게 결합한다(Jefferis 등의 문헌[2002, Immunol Lett 82:57-65]). 모든 FcγR은 상이한 친화도로 IgG Fc 상의 동일한 영역에 결합하며: 고친화도 결합제인 FcγRI는 IgG1에 대해 10-8 M-1의 Kd를 갖는 반면, 저친화 수용체인 FcγRII 및 FcγRIII는 일반적으로 각각 10-6 및 10-5로 결합한다. FcγRIIIa 및 FcγRIIIb의 세포외 도메인은 96% 동일하지만; FcγRIIIb는 세포내 신호전달 도메인을 갖지 않는다. 또한, FcγRI, FcγRIIa/c, 및 FcγRIIIa는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 갖는 세포내 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 면역 복합체-유발 활성화의 양성 조절자인 반면, FcγRIIb는 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 가지며 따라서 억제성이다. 따라서, 전자는 활성화 수용체로서 지칭되고, FcγRIIb는 억제 수용체로서 지칭된다. 수용체는 상이한 면역 세포 상에서의 발현 패턴 및 수준에 있어서도 상이하다. 또 다른 수준의 복잡성은 인간 단백질체에서 다수의 FcγR 다형성의 존재이다. 임상적으로 유의한 특히 관련된 다형성은 V158/F158 FcγRIIIa이다. 인간 IgG1은 F158 이소형보다는 더 큰 친화도로 V158 동형에 결합한다. 이러한 친화도의 차이, 및 어쩌면 ADCC 및/또는 ADCP에 미치는 그 효과가 항-CD20 항체 리툭시맙(Rituxan®은 IDEC Pharmaceuticals Corporation의 등록 상표임)의 효능에 대한 유의한 결정인자인 것으로 나타났다. V158 동형을 가진 환자는 리툭시맙 치료에 호의적으로 반응하지만; 낮은 친화도의 F158 동형을 가진 환자는 잘 반응하지 않는다(Cartron 등의 문헌[2002, Blood 99:754-758]). 인간 중 약 10~20%는 V158/V158 동형접합성이고, 45%는 V158/F158 이형접합성이며, 인간 중 35~45%는 F158/F158 동형접합성이다(Lehrnbecher 등의 문헌[1999, Blood 94:4220-4232]; Cartron 등의 문헌[2002, Blood 99:754-758]). 따라서, 인간 중 80~90%는 잘 반응하지 않으며, FF158 FcγRIIIa의 적어도 하나의 대립유전자를 갖는다.
Fc 영역은 보체 캐스케이드의 활성화에도 관여한다. 고전적인 보체 경로에서, C1은 그의 C1q 서브유닛과 함께, 항원(들)과 복합체를 형성한 IgG 또는 IgM의 Fc 단편에 결합한다. 소정의 구현예에서, Fc 영역에 대한 변형은, 보체 시스템을 활성화하는 본원에 기술된 TNFR2-특이적 항체의 능력을 변경(강화 또는 감소)하는 변형을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제7,740,847호 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, 보체 의존적 세포독성(CDC) 검정을 수행할 수 있다(예를 들어, Gazzzano-Santoro 등의 문헌[J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)] 참조).
따라서, 소정의 구현예에서, 본 개시는 기능적 특성이 변경된, 예컨대 CDC, ADCC, 또는 ADCP 활성이 감소 또는 강화되었거나, 특이적 FcγR에 대한 결합 친화도가 강화되었거나, 혈청 반감기가 증가된, 변형된 Fc 영역을 갖는 항-TNFR2 항체를 제공한다. 본원에서 고려된 다른 변형된 Fc 영역은, 예를 들어, 발행된 미국 특허 제7,317,091호; 제7,657,380호; 제7,662,925호; 제6,538,124호; 제6,528,624호; 제7,297,775호; 제7,364,731호; 공개된 미국 특허 출원 US2009092599; US20080131435; US20080138344; 및 공개된 국제 특허 출원 WO2006/105338; WO2004/063351; WO2006/088494; WO2007/024249에 기술되어 있다.
따라서, 소정의 구현예에서, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 소정의 구현예에서, 융합은 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 일부 경우에, 경쇄 결합을 위한 필수 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)이 융합물 중 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 세포 내로 공동 형질감염된다. 이는, 작제에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 원하는 이중특이적 항체의 최적의 수율을 제공할 때, 구현예에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는 데 있어서 더 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 동일한 비율로 발현이 높은 수율을 초래하는 경우 또는 비율이 원하는 사슬 조합의 수율에 유의한 영향을 미치지 않는 경우, 2개 또는 3개의 폴리펩티드 사슬 모두에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터 내에 삽입하는 것이 가능하다.
본 개시의 항체(및 이의 항원 결합 단편 및 변이체)는, 예를 들어 정제 또는 진단 용도에 사용하기 위한 에피토프 태그 또는 표지를 포함하도록 변형될 수도 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호 또는 유럽 특허 제0 425 235 B1호, 및 Chari 등의 문헌[Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에 개시된 것들을 포함하여, 항체 접합체를 만들기 위한 많은 연결기가 당업계에 알려져 있다. 연결기는 상기 식별된 특허에 개시된 것과 같은 이황화기, 티오에테르기, 산 불안정기, 광불안정기, 펩티다아제 불안정기, 또는 에스테라아제 불안정기를 포함하며, 이황화기 및 티오에테르기가 바람직하다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 TNFR2-특이적 항체는 본원에서 접합체로서 지칭되는 다른 제제 또는 치료 화합물에 접합되거나 작동 가능하게 연결될 수 있다. 제제 또는 치료 화합물은 폴리펩티드 제제, 폴리뉴클레오티드 제제, 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인, 항-혈관신생제, 티로신 키나아제 억제제, 독소, 방사성 동위원소, 또는 다른 치료적 활성제일 수 있다. 화학치료제, 사이토카인, 항-혈관신생제, 티로신 키나아제 억제제, 및 다른 치료제가 본원에 기술되어 있고, 전술한 치료제 모두가 항체 접합체로서 사용될 수 있다. 이러한 접합체는 TNFR2의 발현을 특징으로 하는 종양 또는 종양 미세환경과 같은 작용 부위에 대해 제제 또는 화합물을 표적화하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체(이의 단편 및/또는 변이체 포함)는 소분자 독소, 폴리펩티드, 핵산, 및 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소를 포함하되 이에 한정되지 않는 독소에 접합되거나 작동 가능하게 연결된다. 소분자 독소는 사포린(Kuroda K, 등의 문헌[The Prostate 70:1286-1294 (2010)]; Lip, WL. 등의 문헌[2007 Molecular Pharmaceutics 4:241-251]; Quadros EV. 등의 문헌[2010 Mol Cancer Ther; 9(11); 3033-40]; Polito L. 등의 문헌[2009 British Journal of Haematology, 147, 710-718]), 칼리키마이신(calicheamicin), 메이탄신(maytansine) (미국 특허 제5,208,020호), 트리코테신(trichothene), 및 CC1065를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 독소는 RNase, 젤로닌(gelonin), 엔디인(enediynes), 리신(ricin), 아브린(abrin), 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 젤로닌, 슈도모나스 외독소(PE40), 시겔라(Shigella) 독소, 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 독소, 및 미국자리공 항바이러스 단백질(pokeweed antifiral protein)을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된다. 메이탄시노이드는 튜불린 중합화를 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 메이테누스 세레타 관목(shrub Maytenus serrata)으로부터 처음 단리되었다(미국 특허 제3,896,111호). 소정의 미생물도 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시놀을 생산한다는 것이 이어서 발견되었다(미국 특허 제4,151,042호). 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체는, 예를 들어 미국 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호에 개시되어 있다. 메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체 및 이의 치료적 용도는, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호, 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 기술되어 있다. Liu 등은 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에서 인간 결장직장암에 대해 유도된 단클론 항체 C242에 연결된, 메이탄시노이드로 지정된 DM1을 포함하는 면역접합체를 기술하였다. 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌으며, 생체 내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타냈다.
항체-메이탄시노이드 접합체는 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결함으로써 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 상당히 감소시키지 않으면서 제조된다. 항체 분자 당 평균 3~4개씩 접합된 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 향상시키는 데 효능을 나타냈는데, 하나의 독소/항체 분자로도 네이키드 항체를 사용하는 것에 비해 세포독성을 향상시킬 것으로 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 잘 알려져 있고, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는, 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 및 본원에서 전술한 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀; 및 메이탄시놀의 방향족 고리 또는 다른 위치가 변경된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
또 다른 관심 접합체는 하나 이상의 칼리키마이신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리키마이신 계열의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 칼리키마이신의 구조적 유사체가 사용될 수도 있다(Hinman 등의 문헌[1993, Cancer Research 53:3336-3342]; Lode 등의 문헌[1998, Cancer Research 58:2925-2928]) (미국 특허 제5,714,586호; 미국 특허 제5,712,374호; 미국 특허 제5,264,586호; 미국 특허 제5,773,001호). 아우리스타틴 E(AE) 및 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE)와 같은 돌라스타틴 10 유사체 현재 개시된 항체 또는 이들의 변이체에 대한 접합체로서 사용될 수 있다(Doronina 등의 문헌[2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84]; Francisco 등의 문헌[2003, Blood 102(4):1458-65]). 유용한 효소 활성 독소는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사신(alpha-sarcin), 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질(dianthin protein), 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 억제제, 커신(cursin), 크로틴(crotin), 비누풀(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 리스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 및 트리코테신(tricothecene)을 포함한다. 예를 들어, PCT WO 93/21232를 참조한다. 추가로, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 TNFR2-특이적 항체와 핵용해 활성을 갖는 화합물, 예를 들어 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 사이에서 접합 또는 융합이 형성되는 구현예를 고려한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 방사성 동위원소에 접합되거나 작동 가능하게 연결되어 방사성 접합체(radioconjugate)를 형성할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 접합체 항체를 생산하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At, 및 212Bi가 이에 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
본원에 기술된 항체는 소정의 구현예에서 세포독소(예를 들어, 세포증식억제제 또는 세포살해제), 치료제, 또는 방사성 원소(예를 들어, 알파-방출 원소, 감마-방출 원소 등)와 같은 치료 모이어티에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 예로는 파클리탁셀/파클리탁솔(paclitaxel/paclitaxol), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 브리민화 에티듐(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜키친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트락신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-데하이드로테스트스테론, 글루코코티코이드(glucocorticoid), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로파놀론(propranolol), 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체 등이 있다. 하나의 예시적인 세포독소는 사포린(Advanced Targing Systems, San Diego, CA로부터 입수 가능함)이다. 치료제는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 항대사물질(예: 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예: 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스디클로로디아민 백금(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예: 다우노루비신(구 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예: 닥티노마이신(구 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항유사분열제(예: 빈크리스틴 및 빈블라스틴).
또한, TNFR2-특이적 항체(본원에서 제공된 이의 기능적 단편, 예를 들어 항원 결합 단편을 포함함)는 소정의 구현예에서 치료 모이어티, 예컨대 방사성 금속 이온을 접합하는 데 유용한 방사성 물질 또는 거대고리 킬레이터에 접합될 수 있다. 소정의 구현예에서, 거대고리 킬레이터는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N’,N’’,N’’’-테트라아세트산(DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 당업계에 일반적으로 알려져 있고, Denardo 등의 문헌[1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90]; Peterson 등의 문헌[1999, Bioconjug. Chem. 10:553]; 및 Zimmerman 등의 문헌[1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 항체는 종양 사전 표적화에 사용하기 위해 “수용체”(예컨대, 스트렙트아비딘)에 접합될 수 있으며, 여기서 항체-수용체 접합체는 환자에게 투여되고, 이어서 미결합 접합체는 제거제를 사용하여 순환으로부터 제거된 다음, 세포독성제(예컨대, 방사성 뉴클레오티드)에 접합되는 “리간드”(예컨대, 아비딘)이 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 의존적 효소 매개 전구약물 요법(ADEPT)을 사용하기 위해 효소에 접합되거나 작동 가능하게 연결된다. ADEPT는 전구약물(예를 들어, 펩티딜 화학요법제, PCT WO 81/01145 참조)을 활성 항암제로 전환시키는 전구약물 활성화 효소에 항체를 접합시키거나 작동 가능하게 연결함으로써 사용될 수 있다. 예를 들어, PCT WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호를 참조한다. ADEPT에 유용한 면역 접합체의 효소 성분은, 전구약물을 보다 활성인 세포독성 형태로 변환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 이들 및 관련 구현예의 방법에 유용한 효소는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 인산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 알칼라인 포스파타아제; 황산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 아릴설파타아제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암제 5-플루오로우라실로 전환하는 데 유용한 시토신 탈아미노효소; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 프로테아제, 예컨대 세레티아 프로테아제, 써몰리신, 서브틸리신, 카복시펩티다아제, 및 카텝신(예: 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환하는 데 유용한 D-알라닐카복시펩티다아제; 당화된 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 탄수화물 절단 효소, 예컨대 베타-갈락토시다아제 및 뉴라미니다아제; 베타-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 베타-락타마아제; 및 아민 질소가 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 각각 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 페니실린 아미다아제, 예컨대 페니실린 V 아미다아제 또는 페니실린 G 아미다아제. 대안적으로, 효소 활성을 갖고, 당업계에서 “항체효소(abzyme)”로도 알려진 항체를 사용해 전구약물을 유리 활성 약물로 전환할 수 있다(예를 들어, Massey의 문헌[1987, Nature 328: 457-458] 참조). 항체-항체효소 접합체는 종양 세포 집단에 항체효소를 전달하기 위해 제조될 수 있다.
면역접합체는 다음과 같은 다양한 이기능성 단백질 결합제를 사용해 제조할 수 있다: N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예: 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 툴루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠). 특정 커플링제는 이황화 결합을 가능하게 하는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson 등의 문헌[Biochem. J. 173:723-737 [1978]) 및 N-숙신아미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다. 링커는 하나 이상의 절단 가능한 성분의 방출을 용이하게 하는 “절단 가능한 링커”일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커가 사용될 수 있다(Cancer Research 52: 127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호).
본 개시의 항체(및 폴리펩티드)의 다른 변형도 본원에서 고려된다. 예를 들어, 항체는 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 연결될 수 있다. 항체는 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구체, 마이크로 유화액, 나노입자, 및 나노캡슐) 또는 매크로 유화액 중에서, 예를 들어, 공진 기법에 의해 제조되거나 계면간 중합화(예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트)마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “담체”는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출될 때 세포 또는 포유동물에게 비독성인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종 생리학적으로 허용 가능한 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용 가능한 담체의 예는 인산염, 구연산염, 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 포도당, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염 형성 반대이온; 및/또는 폴리소르베이트 20(TWEEN™) 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 폴록사머(PLURONICS™)과 같은 비이온성 계면활성제, 등을 포함한다.
항-TNFR2 항체의 원하는 기능적 특성은 당업자에게 공지된 다양한 방법, 친화도/결합 검정(예를 들어, 표면 플라스몬 공명, 경쟁적 억제 검정); 세포독성 검정, 세포 생존력 검정, 세포 증식 또는 분화 검정, 시험관 내 또는 생체 내 모델을 사용하는 암 세포 및/또는 종양 성장 억제를 사용하여 평가할 수 있다. 다른 검정은 본원에 기술된 항체가 정상적인 TNFR2-매개 반응을 차단하는 능력을 시험할 수 있다. 본원에 기술된 항체는 시험관 내 및 생체 내 효능에 대해서도 시험될 수 있다. 이러한 검정은 당업자에게 알려진 잘 확립된 프로토콜(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); 또는 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용해 수행될 수 있다.
본 개시는 소정의 구현예에서 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인을 암호화하는 핵산을 추가로 제공한다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 이들 및 관련 구현예는 본원에 기술된 바와 같은 TNFR2에 결합하는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “단리된 폴리뉴클레오티드”는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 일부 조합을 의미하며, 단리된 폴리뉴클레오티드는 그 기원으로 인해 (1) 단리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견되는, 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 결합되지 않고, (2) 자연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는다.
용어 “작동 가능하게 연결된”은, 이 용어가 적용되는 성분이 적절한 조건 하에서 성분 고유의 기능을 수행할 수 있게 하는 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 단백질 코딩 서열에 “작동 가능하게 연결된” 전사 조절 서열은, 단백질 코딩 서열의 발현이 조절 서열의 전사 활성과 비슷한 조건 하에서 달성되도록 단백질 코딩 서열에 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “조절 서열(control sequence)”은 이들이 연결되거나 작동 가능하게 연결되는 코딩 서열의 발현, 가공, 또는 세포 내 국소화에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 달라질 수 있다. 특정 구현예에서, 원핵생물에 대한 전사 조절 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 진핵생물에 대한 전사 조절 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 서열, 전사 종결 서열, 및 폴리아데닐화 서열에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터를 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, “조절 서열”은 리더 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 지칭되는 용어 “폴리뉴클레오티드”는 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 중합체를 의미한다. 소정의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 두 유형 중 하나의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 브로모우리딘과 같은 염기 변형; 아라비노시드 및 2’,3’-디데옥시리보오스와 같은 리보오스 변형; 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐아데이트, 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오티드간 연결 변형을 포함한다. 용어 “폴리뉴클레오티드”는 DNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 구체적으로 포함한다.
용어 “자연 발생 뉴클레오티드”는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 “변형된 뉴클레오티드”는 변형되거나 치환된 당기(sugar group) 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 “올리고뉴클레오티드 연결”은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐아데이트, 포스포로아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오티드 연결을 포함한다. 예를 들어 LaPlanche 등의 문헌[1986, Nucl. Acids Res., 14:9081]; Stec 등의 문헌[1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077]; Stein 등의 문헌[1988, Nucl. Acids Res., 16:3209]; Zon 등의 문헌[1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539]; Zon 등의 문헌[1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England]; Stec 등의 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann과 Peyman의 문헌[1990, Chemical Reviews, 90:543]을 참조하고, 이들의 개시 내용은 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 혼성화를 검출할 수 있게 하는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
용어 “벡터”는 코딩 정보를 숙주 세포에게 전달하는 데 사용되는 임의의 분자(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 또는 바이러스)를 지칭하도록 사용된다. 용어 “발현 벡터”는, 숙주 세포를 형질전환하는 데 적합하고 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 유도 및/또는 조절하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 발현은, 인트론이 존재하는 경우, 전사, 번역, 및 RNA 스플라이싱과 같은 공정을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 게놈 서열, 게놈외 서열 및 플라스미드-암호화된 서열, 및 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 등을 발현하거나 발현하도록 구성될 수 있는 더 작은 조작된 유전자 절편을 포함할 수 있다. 이러한 절편은 자연적으로 단리되거나, 당업자에 의해 합성적으로 변형될 수 있다.
또한, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA, 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는, 인트론을 함유하고 일대일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 추가의 코딩 서열 또는 비-코딩 서열 본 개시에 따른 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그렇지는 않으며, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있지만 반드시 그렇지는 않다. 폴리뉴클레오티드는 천연 서열을 포함할 수 있거나, 이러한 서열의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 이들 및 관련 구현예에 따르면, 본 개시는 본원에 기술된 항-TNFR2 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 또한 제공한다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부 및 이러한 폴리뉴클레오티드의 보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
다른 관련 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 본원에 기술된 항-TNFR2 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적인 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 방법(예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이, 표준 파라미터를 사용하는 BLAST 분석)을 사용했을 때, 본원에 기술된 항체를 암호화하는 서열과 같은 기준 폴리뉴클레오티드 서열과 비교해 적어도 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 당업자는 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일성을 결정하기 위해, 코돈 퇴화, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치 설정 등을 고려하여 이들 값을 적절히 조정할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일반적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 바람직하게는 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 항체의 결합 친화도가 본원에 특이적으로 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 항체에 비해 실질적으로 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 것이다.
소정의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 단편은 본원에 기술된 바와 같은 항체를 암호화하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상보적인 서열의 다양한 길이의 연속 신장을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 서열의 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 또는 1000개 또는 그 이상의 (이들 사이의 모든 중간 길이도 포함함) 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이러한 맥락에서, “중간 길이”는 인용된 값들 사이의 임의의 길이, 예컨대 50, 51, 52, 53, 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등; 200 내지 500 사이의 모든 정수; 500 내지 1,000 사이의 모든 정수 등을 의미한다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 서열에서 발견되지 않은 추가 뉴클레오티드에 의해 일 말단 또는 양 말단에서 연장될 수 있다. 이러한 추가 서열은 본원에 기술된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 말단 중 하나 또는 본원에 기술된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 양 말단에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 단편 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 서열에 중간 내지 높은 엄중도의 조건 하에서 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 혼성화 기술은 분자 생물학 분야에 잘 알려져 있다. 예시의 목적으로, 본원에서 제공된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 다른 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 시험하기 위한 적절한 중간 정도의 엄중도 조건은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 사전 세척하는 것; 50℃~60℃, 5 X SSC에서 밤새 혼성화하는 것; 이어서 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X, 및 0.2X SSC로 각각 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다. 당업자는 예를 들어 혼성화 용액의 염 함량 및/또는 혼성화가 수행되는 온도를 변경함으로써 혼성화의 엄중도가 쉽게 조작될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 적절한 높은 엄중도의 혼성화 조건은, 혼성화 온도가 예를 들어, 60℃~65℃ 또는 65℃~70℃로 증가된다는 것을 제외하고는, 전술한 것들을 포함한다.
소정의 구현예에서, 전술한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 변이체, 단편, 및 혼성화 서열은 TNFR2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화한다. 소정의 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 TNFR2에 적어도 약 50%, 적어도 약 70%로 결합하는(소정의 구현예에서는 적어도 약 90% 결합하는) 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 CDR을 비롯하여 본원에 구체적으로 제시된 항체 서열을 암호화한다. 추가의 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 본원에 제시된 항체를 비롯하여 본원에 구체적으로 제시된 항체 서열보다 더 큰 친화도로 TNFR2에 결합하는, 예를 들어 정량적으로 적어도 약 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 또는 110%로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 CDR을 암호화한다.
본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 대표적인 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 제공된 변이체 TNFR2-특이적 항체, 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 항원 결합 단편을 갖는 항체 단백질)의 3차원 구조를 결정하는 것은 일상적인 방법을 통해 이뤄질 수 있어서, 하나 이상의 아미노산의 추가, 결실, 첨가, 또는 선택된 천연 또는 비-천연 아미노산과의 치환이, 이렇게 유래된 구조적 변이체가 현재 개시된 종의 공간-충만 특성을 보유하는지 여부를 결정하기 위한 목적으로 가상으로 모델링될 수 있다. 항체 내에서 적절한 아미노산 치환(또는 아미노산 서열을 암호화하는 적절한 폴리뉴클레오티드)을 결정하여, 예를 들어 친화도를 유지하거나 더 양호한 친화도가 달성되도록 하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램이 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은 코딩 서열 자체의 길이에 관계없이 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 분절 등과 같은 다른 DNA 서열과 조합될 수 있어서, 이들의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있으며, 전체 길이는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해 유리하게 제한되는 것으로 고려된다. 예를 들어, 총 길이가 약 10,000, 약 5000, 약 3000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 염기쌍 길이 등(모든 중간 길이를 포함함)인 예시적인 폴리뉴클레오티드 분절이 유용한 것으로 고려된다.
폴리뉴클레오티드 서열을 비교할 때, 2개의 서열 내의 뉴클레오티드의 서열을 후술하는 바와 같이 최대로 상응하도록 정렬했을 때, 동일하다면, 이 2개의 서열을 “동일한” 것이라 한다. 2개의 서열 간의 비교는 일반적으로 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 식별하고 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “비교 윈도우”는 하나의 서열을 동일한 수의 연속 위치를 갖는 기준 서열과 최적으로 정렬한 후 이 2개의 서열을 비교할 수 있는, 적어도 20개의 연속 위치, 일반적으로는 30 내지 75개, 40 내지 50개의 연속 위치로 이루어진 세그먼트를 지칭한다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬은 Lasergene® 생물정보학 소프트웨어 패키지(DNASTAR, Inc., Madison, WI) 내의 Megalign™ 소프트웨어를 사용하여, 기본 파라미터를 사용해 수행할 수 있다. 이러한 프로그램은 다음 참조 문헌에 기술된 여러 가지 정렬 방식을 구현한다: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. 및 Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. 및 Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor 11:105 (1971); Santou, N. Nes, M., Mol. Biol. Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. 및 Sokal, R.R., Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. 및 Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730 (1983).
대안적으로, 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 Smith와 Waterman의 국소 동일성 알고리즘(Add. APL. Math 2:482 (1981)), Needleman과 Wunsch의 동일성 정렬 알고리즘[J. Mol. Biol. 48:443 (1970)], Pearson과 Lipman의 유사성 탐색 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)), 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 검사(inspection)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 유사성 백분율을 결정하는 데 적합한 하나의 예시적인 알고리즘은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, Altschul 등이 문헌[Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)], 및 Altschul 등의 문헌[J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 각각 기술되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은, 예를 들어 본원에 기술된 파라미터와 함께, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 간의 서열 동일성 백분율을 결정하는 데 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용할 수 있다. 예시적인 일 예에서, 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M(한 쌍의 일치하는 잔기에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 누적 점수를 계산할 수 있다. 누적 정렬 점수가 달성된 최대 값으로부터 X의 양만큼 이격되거나; 하나 이상의 음으로 채점된 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 점수가 0 또는 그 이하가 되거나; 어느 하나의 서열의 끝에 도달한 경우, 각 방향으로의 단어 일치(word hit)의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 11의 단어 길이(W) 및 10의 기대값(E)을 기본값으로 사용하고, BLOSUM62 매트릭스 정렬 점수(Henikoff와 Henikoff의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조)는 50의 (B), 10 기대값(E), M=5, N=-4, 및 양가닥 비교를 사용한다.
소정의 구현예에서, “서열 동일성의 백분율”은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 최적의 2개의 정렬을 위한 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교했을 때 20% 이하, 일반적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 일치하는 동일한 핵산 염기가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 얻고, 일치하는 위치의 수를 기준 서열 내의 총 위치의 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
유전자 코드의 축퇴의 결과로서, 본원에 기술된 바와 같은 항체를 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 TNFR2에 결합하는 항체를 암호화하는 천연 또는 원래 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 최소한의 서열 동일성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드는 본 개시에 의해 명백히 고려된다. 소정의 구현예에서, 포유류 발현에 대해 코돈 최적화된 서열이 구체적으로 고려된다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 돌연변이 유발과 같은 돌연변이 유발 접근법이 본원에 기술된 항체의 변이체 및/또는 유도체의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 접근법에 의해, 폴리펩티드 서열에서의 특이적 변형은 항체를 암호화하는 기저 폴리뉴클레오티드의 돌연변이 유발을 통해 이루어질 수 있다. 이들 기술은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 폴리뉴클레오티드에 도입함으로써, 예를 들어 전술한 고려 사항 중 하나 이상을 통합하여 서열 변이체를 제조하고 시험하는 간단한 접근법을 제공한다.
부위 특이적 돌연변이 유발은, 원하는 돌연변이를 갖는 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 충분한 수의 인접 뉴클레오티드를 사용해 돌연변이체를 생산하여, 결실 접합부의 가로 양측에 안정한 이중체를 형성하기에 충분한 크기와 서열 복잡도를 갖는 일차 서열을 제공할 수 있게 한다. 폴리뉴클레오티드 자체의 특성을 개선, 변경, 감소, 변형, 또는 달리 변화시키고/시키거나 암호화된 폴리펩티드의 특성, 활성, 조성, 안정성, 또는 일차 서열을 변경시키기 위해, 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이가 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명자들은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 친화도, 또는 특정 Fc 영역의 기능, 또는 특정 FcγR에 대한 Fc 영역의 친화도와 같은, 암호화된 폴리펩티드의 하나 이상의 특성을 변경시키기 위해, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발을 고려한다. 부위 특이적 돌연변이 유발의 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 모두의 변이체를 생성하는 데 널리 사용된다. 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유발은 DNA 분자의 특이적 부분을 변경하는데 흔히 사용된다. 이러한 구현예에서, 일반적으로 약 14 내지 약 25개 뉴클레오티드 등의 길이를 포함하는 프라이머가 사용되며, 서열의 접합부의 양측에 약 5 내지 약 10개의 잔기가 변경된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 부위 특이적 돌연변이 유발 기술은 단일 가닥 및 이중 가닥 형태 둘 다로 존재하는 파지 벡터를 종종 사용해왔다. 부위 지향성 돌연변이 유발에 유용한 일반적인 벡터는 M13 파지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파지는 쉽게 상업적으로 이용 가능하며, 이들의 용도는 일반적으로 당업자에게 잘 알려져 있다. 이중 가닥 플라스미드도 관심 유전자를 플라스미드로부터 파지에 전달하는 단계를 제거하는 부위 지향성 돌연변이 유발에 일상적으로 사용된다.
일반적으로, 본원에 따른 부위 지향성 돌연변이 유발은 먼저 단일 가닥 벡터를 수득하거나, 원하는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 그 서열 내에 포함하는 이중 가닥 벡터의 2개의 가닥을 용융시켜 수행된다. 원하는 돌연변이된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 합성으로 제조된다. 그런 다음, 이러한 프라이머를 단일 가닥 벡터로 어닐링하고, 돌연변이 보유 가닥의 합성을 완료하기 위해, 대장균 중합효소 I Klenow 단편과 같은 DNA 중합 효소로 중합화한다. 따라서, 하나의 가닥이 원래의 돌연변이되지 않은 서열을 암호화하고 다른 하나의 가닥이 원하는 돌연변이를 지니는 이종이중체가 형성된다. 그런 다음, 이러한 이종이중체 벡터를 사용하여 적절한 세포, 예컨대 대장균 세포를 형질전환시키고, 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선택한다.
부위 지향성 돌연변이 유발을 사용하여 선택된 펩티드-암호화 DNA 분절의 서열 변이체를 제조하는 것은 잠재적으로 유용한 종을 생산하는 수단을 제공하는 것이며, 펩티드의 서열 변이체 및 이를 암호화하는 DNA 서열이 수득될 수 있는 다른 방법이 있기 때문에, 제한하려는 의미는 아니다. 예를 들어, 원하는 펩티드 서열을 암호화하는 재조합 벡터를 하이드록실아민과 같은 돌연변이 유발제로 처리하여 서열 변이체를 수득할 수 있다. 이들 방법 및 프로토콜에 관한 구체적인 세부 사항은 Maloy 등의 1994 문헌; Segal의 1976 문헌; Prokop과 Bajpai의 1991 문헌; Kuby의 1994 문헌; 및 Maniatis 등의 1982 문헌의 교지를 통해 확인할 수 있고, 이들 문헌 각각은 해당 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “올리고뉴클레오티드 유도성 돌연변이 유발 절차”는 템플릿 의존적 공정 및 벡터-매개 전파를 지칭하며, 이는 특정 핵산 분자의 농도를 초기 농도에 비해 증가시키거나, 증폭과 같은 검출 가능한 신호의 농도를 증가시킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “올리고뉴클레오티드 유도성 돌연변이 유발 절차”는 프라이머 분자의 템플릿 의존적 연장을 포함하는 공정을 지칭하도록 의도된다. 용어 템플릿 의존적 공정은 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성을 지칭하며, 여기서 새로 합성된 핵산 가닥의 서열은 상보적 염기 페어링의 잘 알려진 규칙에 의해 좌우된다(예를 들어, Watson의 1987 문헌 참조). 일반적으로, 벡터 매개 방법론은 핵산 단편을 DNA 또는 RNA 벡터 내로 도입하고, 벡터의 클론을 증폭시키고, 증폭된 핵산 단편을 회수하는 것을 포함한다. 이러한 방법론의 예는 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합된 미국 특허 제4,237,224호에 의해 제공된다.
폴리펩티드 변이체의 생산을 위한 다른 접근법에서, 미국 특허 제5,837,458호에 기술된 바와 같은 반복 서열 재조합이 사용될 수 있다. 이러한 접근법에서, 재조합 및 스크리닝 또는 선택의 반복 사이클을 수행하여, 예를 들어, 증가된 결합 친화도를 갖는 개별 폴리뉴클레오티드 변이체를 “진화”시킨다. 소정의 구현예는 또한 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태로 작제물을 제공한다.
많은 구현예에서, 대상 단클론 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포 내로 직접 도입되고, 세포는 암호화된 항체의 발현을 유도하기에 충분한 조건 하에서 배양된다. 본 개시의 항체는 본원에 제공된 폴리펩티드 및 핵산 서열과 함께 당업자에게 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 제조된다. 폴리펩티드 서열은 본원에 개시된 특정 항체를 암호화하는 적절한 핵산 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다. 핵산 서열은 당업자에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 다양한 발현 시스템에 대한 특정 코돈 “선호도”를 반영하도록 최적화될 수 있다.
소정의 관련 구현예에 따르면, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 작제물; 임의의 항체, CDR, VH, 또는 VL 도메인 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포; 및 암호화된 생성물의 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은 핵산을 암호화하는 단계로부터의 발현을 포함한다. 발현은 적절한 조건 하에서 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 생산 후, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 임의의 적절한 기술을 사용하여 단리되고/되거나 정제된 다음, 원하는 대로 사용될 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 암호화 핵산 분자 및 벡터는, 예를 들어 이들의 자연 환경으로부터 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로 단리되고/되거나 정제될 수 있고, 핵산의 경우, 원하는 기능을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열이 아닌 기원의 핵산 또는 유전자가 없거나 실질적으로 없는 상태로 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 명시된 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하며, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, U가 T로 치환되는 명시된 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다.
다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 클로닝하고 발현하는 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적절한 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 효모, 및 바큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용 가능한 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포, 및 기타 많은 것들을 포함한다. 흔한 바람직한 박테리아 숙주는 대장균(E. coli)이다.
대장균과 같은 원핵 세포에서 항체 및 항원 결합 단편을 발현시키는 것은 당업계에서 잘 확립되어 있다. 예를 들어, Pluckthun의 문헌[Bio/Technology 9: 545-551, 1991]을 참조한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기 위한 옵션으로서, 배양물 중의 진핵세포에서 발현시키는 것도 당업자가 이용할 수 있으면, 이에 대해서는 최근의 검토, 예를 들어 Ref, M. E.의 문헌[(1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576]; Trill J. J. 등의 문헌[(1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560]을 참조한다.
프로모터 서열, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자, 및 경우에 따라 다른 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하는 적절한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 벡터는 경우에 따라 플라스미드, 바이러스(예: 파지), 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 세부 사항은, 예를 들어, Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들어 핵산 작제물의 제조, 돌연변이 유발, 시퀀싱, 세포 내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석 등에 있어서, 핵산의 조작을 위한 많은 공지된 기술 및 프로토콜은 Ausubel (eds.) 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, John Wiley & Sons, 1992] 또는 이의 후속 개정판에 상세하 기술되어 있다.
용어 “숙주 세포”는 본원에 기술된 항체 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열이 도입되었거나 이를 도입할 수 있는 세포로서, 선택된 관심 유전자, 예컨대 본원에 기술된 임의의 항체를 암호화하는 유전자를 추가로 발현하거나 발현할 수 있는 세포를 지칭하도록 사용된다. 상기 용어는 부모 세포의 자손을 포함하며, 선택된 유전자가 존재하는 한, 자손이 원래 부모와 형태 또는 유전자 구성이 동일한지 여부는 상관없다. 따라서, 이러한 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법도 고려된다. 도입하는 단계는 임의의 이용 가능한 기술을 사용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀 매개 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스(예: 우두), 또는 곤충 세포의 경우 바큘로바이러스를 사용하는 형질도입을 포함할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공, 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다. 도입하는 단계 후에, 예를 들어, 유전자의 발현을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터 발현을 유발하거나 발현시키는 단계가 이어질 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체)에 통합된다. 통합은, 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함함으로써촉진될 수 있다.
또한, 소정의 구현예에서, 본 개시는 특정 폴리펩티드, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 TNFR2-특이적 항체를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 전술한 바와 같은 작제물을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 용어 “형질도입”은 일반적으로 파지에 의해 하나의 박테리아로부터 다른 박테리아로 유전자를 전달하는 것을 지칭하도록 사용된다. “형질도입”은 또한 레트로바이러스에 의한 진핵 세포 서열의 획득 및 전달을 지칭한다. 용어 “형질감염”은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 지칭하도록 사용되며, 외인성 DNA가 세포 막 내부에 도입되었을 때 세포는 “형질감염”된 것이다. 다수의 형질감염 기술이 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 개시되어 있다. 예를 들어 Graham 등의 문헌[1973, Virology 52:456]; Sambrook 등의 문헌[2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories]; Davis 등의 문헌[1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier]; 및 Chu 등의 문헌[1981, Gene 13:197]을 참조한다. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적절한 숙주 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “형질전환”은 세포의 유전적 특성의 변화를 지칭하며, 세포가 DNA를 함유하도록 변형되었을 때 세포는 형질전환된 것이다. 예를 들어, 세포가 그의 고유 상태로부터 유전적으로 변형될 때 세포는 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 후, 형질전환 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합됨으로써 세포와 재조합되거나, 복제되지 않은 상태로 에피솜 성분으로서 일시적으로 유지되거나, 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. DNA가 세포 분열과 함께 복제될 때, 세포는 안정적으로 형질전환된 것으로 간주된다. 핵산 분자, 폴리펩티드, 숙주 세포 등과 같은 생물학적 물질과 관련하여 사용될 때의 용어 “자연 발생” 또는 “천연”은 자연에서 발견되고 인간에 의해 조작되지 않은 물질을 지칭한다. 유사하게, 본원에서 사용되는 바와 같이, “비-자연 발생” 또는 “비-천연”은 자연에서 발견되지 않거나 인간에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 물질을 지칭한다.
용어 “폴리펩티드” “단백질” 및 “펩티드” 및 “당단백질”은 상호 교환적으로 사용되고, 임의의 특정 길이에 한정되지 않는 아미노산의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 미리스토일화, 황산화, 당질화, 인산화, 및 신호 서열의 추가 또는 결실과 같은 변형을 배제하지 않는다. 용어 “폴리펩티드” 또는 “단백질”은 아미노산의 하나 이상의 사슬을 의미하며, 여기서 각각의 사슬은 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산을 포함하고; 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 단백질, 즉 자연 발생 단백질 및 구체적으로 비-재조합 세포, 또는 유전적으로 조작된 세포 또는 재조합 세포의 서열을 갖는, 펩티드 결합에 의해 함께 공유 결합되고/되거나 비공유 결합된 복수의 사슬을 포함할 수 있고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열이 결실, 추가, 및/또는 치환된 분자를 포함한다. 용어 “폴리펩티드” 및 “단백질”은 본 개시의 TNFR2에 결합하는 항체, 또는 항-TNFR2 항체의 하나 이상의 아미노산이 결실, 추가, 및/또는 치환된 서열을 구체적으로 포함한다. 따라서, “폴리펩티드” 또는 “단백질”은 하나의 아미노산 사슬(“단량체”로 지칭됨) 또는 복수의 아미노산 사슬(“다량체”로 지칭됨)을 포함할 수 있다.
본원에서 지칭되는 용어 “단리된 단백질”은 대상 단백질이 (1) 자연에서 일반적으로 발견되는 적어도 일부 다른 단백질을 갖지 않음; (2) 동일한 공급원, 예를 들어 동일한 종 유래의 다른 단백질을 실질적으로 갖지 않음; (3) 상이한 종의 세포에 의해 발현됨; (4) 자연 상태에서 결합된 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리되었음; (5) “단리된 단백질”이 자연 상태에서 결합된 단백질의 일부분과 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 결합되지 않음; (6) 자연 상태에서 결합되지 않는 폴리펩티드와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동 가능하게 결합됨; 또는 (7) 자연 상태에서 발생하지 않음을 의미한다. 이러한 단리된 단백질은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 또는 다른 RNA에 의해 암호화될 수 있고, 합성 기원의 단백질이거나, 이들의 임의의 조합일 수 있다. 소정의 구현예에서, 단리된 단백질은 이의 (치료적, 진단적, 예방적, 연구적, 또는 기타) 사용을 방해하게 되는, 자연 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 오염물을 실질적으로 갖지 않는다.
용어 “폴리펩티드 단편”은 단량체 또는 다량체일 수 있고, 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실, 및/또는 자연 발생 폴리펩티드 또는 재조합적으로 생산된 폴리펩티드의 내부 결실 또는 치환을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 소정의 구현예에서, 폴리펩티드 단편은 적어도 5 내지 약 500개 아미노산 길이의 아미노산 사슬을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개 아미노산의 길이임을 이해할 것이다. 특히 유용한 폴리펩티드 단편은 항원 결합 도메인 또는 항체의 단편을 포함하는 기능적 도메인을 포함한다. 항-TNFR2 항체의 경우, 유용한 단편은 CDR 영역, 특히 중쇄 또는 경쇄의 CDR3 영역; 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역; 항체 사슬의 일부 또는 2개의 CDR을 포함하는 이의 가변 영역; 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
폴리펩티드는 단백질의 N-말단 단부에서 신호(또는 리더) 서열을 포함할 수 있으며, 이는 단백질의 전달을 번역과 함께 또는 번역 후에 유도한다. 신호 펩티드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 폴리펩티드 아미노산 서열은 이러한 신호 또는 리더 펩티드 없이도 본원에 기술된 임의의 용도에 대해 고려된다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 신호 펩티드는 일반적으로 가공 도중에 절단되어 활성 항체 단백질에는 포함되지 않는다. 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드(예: 폴리-His)의 합성, 정제, 또는 식별을 용이하게 하기 위해, 또는 고형 지지체에 대한 폴리펩티드의 결합을 강화하기 위해 프레임 내 융합되거나 링커 또는 다른 서열에 접합될 수 있다.
펩티드 링커/스페이서 서열은, 필요에 따라 각각의 폴리펩티드가 이차 및/또는 삼차 구조로 접히는 것을 보장하기에 충분한 거리만큼 다수의 폴리펩티드 성분을 분리하는데 사용될 수도 있다. 이러한 펩티드 링커 서열은 당업계에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 융합 폴리펩티드에 통합될 수 있다.
소정의 펩티드 스페이서 서열은, 예를 들어 다음에 기초하여 선택될 수 있다: (1) 이들이 가요성의 연장된 형태를 채택할 수 있음; (2) 이들이 제1 및 제2 폴리펩티드 상의 기능적 에피토프와 상호작용할 수 있는 이차 구조를 채택할 수 없음; 및/또는 (3) 폴리펩티드의 기능적 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기가 결여됨.
하나의 예시적인 구현예에서, 펩티드 스페이서 서열은, 예를 들어, Gly, Asn, 및 Ser 잔기를 함유한다. Thr 및 Ala와 같은 다른 거의 중성인 아미노산도 스페이서 서열에 포함될 수 있다.
스페이서로서 유용하게 사용될 수 있는 다른 아미노산 서열은 Maratea 등의 문헌[Gene 40:39 46 (1985)]; Murphy 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986)]; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호에 개시돈 것들을 포함한다.
다른 예시적인 스페이서는, 예를 들어 Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp (서열번호 324) (Chaudhary 등의 문헌[1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070]) 및 Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (서열번호 325) (Bird 등의 문헌[1988, Science 242:423-426])을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드가 기능적 도메인을 분리하고 입체 간섭을 방지하는 데 사용될 수 있는 비-필수 N-말단 아미노산 영역을 갖는 경우, 스페이서 서열은 요구되지 않는다. 2개의 코딩 서열은 임의의 스페이서 없이 직접 융합되거나, 예를 들어, 1 내지 3회 반복되는 5량체 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 326)의 가요성 폴리링커를 사용하여 융합될 수 있다. 이러한 스페이서는 VH와 VL 사이에 삽입됨으로써 단쇄 항체(scFv)를 작제하는데 사용되어 왔다(Bird 등의 문헌[1988, Science 242:423-426]; Huston 등의 문헌[1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5979-5883]).
펩티드 스페이서는, 소정의 구현예에서, 단쇄 항체의 가변 영역을 형성하는 2개의 베타-시트 간의 정확한 상호작용을 가능하게 하도록 설계된다.
소정의 구현예에서, 펩티드 스페이서는 1 내지 5개 아미노산, 5 내지 10개 아미노산, 5 내지 25개 아미노산, 5 내지 50개 아미노산, 10 내지 25개 아미노산, 10 내지 50개 아미노산, 10 내지 100개 아미노산, 또는 그 사이의 임의의 아미노산의 범위이다. 일부 구현예에서, 펩티드 스페이서는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 길이의 아미노산을 포함한다.
본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 또는 이의 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실 및/또는 잔기의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특성(예: TNFR2에 대한 높은 친화도 결합)을 갖는다면, 최종 항체에 도달하도록 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변화는 당질화 부위의 수 또는 위치를 변경하는 것과 같이 항체의 번역 후 공정을 변경할 수도 있다. 본 개시의 폴리펩티드에 대해 전술한 임의의 변이 및 변형이 본 개시의 항체에 포함될 수 있다.
본 개시는 본원에 개시된 항체의 변이체를 제공한다. 소정의 구현예에서, 이러한 변이체 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 CDR은 TNFR2을 비롯하여 본원에 구체적으로 제시된 항체 서열에 적어도 약 50%, 적어도 약 70%로, 소정의 구현예에서는 적어도 약 90% 결합한다. 추가의 구현예에서, 이러한 변이체 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 CDR은 본원에 제시된 항체보다 더 큰 친화도로 TNFR2을 비롯하여 본원에 구체적으로 제시된 항체 서열에 결합하며, 예를 들어 정량적으로 적어도 약 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 또는 110%로 결합한다.
대표적 폴리펩티드(예: 본원에 제공된 것과 같은 변이체 TNFR2-특이적 항체, 예를 들어 본원에 제공된 것과 같은 항원 결합 단편을 갖는 항체)는 일상적인 방법에 의해 제작되어, 하나 이상의 아미노산의 선택된 천연 또는 비천연 아미노산과의 치환, 추가, 결실, 또는 삽입이 그렇게 유래된 구조 변이체가 본원에 개시된 종의 구체 충만 특성을 유지하는 여부를 결정하도록 가상적으로 모델링될 수 있다. 예를 들어, Donate 등의 문헌[1994 Prot. Sci. 3:2378]; Bradley 등의 문헌[Science 309: 1868-1871 (2005)]; Schueler-Furman 등의 문헌[Science 310:638 (2005)]; Dietz 등의 문헌[Proc. Nat. Acad. Sci. USA] 103:1244 (2006); Dodson 등의 문헌[Nature 450:176 (2007)]; Qian 등의 문헌[Nature 450:259 (2007)]; Raman 등의 문헌[Science 327:1014-1018 (2010)]을 참조한다. 본원에 제공된 것과 같은 이의 TNFR2-특이적 항체 항원 결합 도메인의 합리적인 설계와 같은 이들 및 관련 구현예에 사용될 수 있는 컴퓨터 알고리즘의 일부 추가적인 비제한적인 예는, 3-D 그래픽과 내장 스크립팅을 사용하여 대규모 생체분자 시스템을 표시하고, 애니메이션화하고, 분석하기 위한 분자 시각화 프로그램인 VMD를 포함한다(Urbana-Champagne 소재 University of Illinois의 Theoretical and Computational Biophysics Group의 웹사이트 ks.uiuc.edu/Research/vmd/를 참조한다). 에너지가 최소화된 형태의 공간 충진 모델(반데르발스 반지름)로부터 원자 치수를 결정할 수 있게 하는 많은 다른 컴퓨터 프로그램이 당업계에 공지되어 있고 당업자에게 이용 가능하다; 상이한 화학군에 대한 높은 친화도 영역을 탐색하여 결정함으로써, 결합을 강화시키는 GRID; 탐색을 통해 수학적 정렬을 계산하는 Monte Carlo; 및 힘 필드 계산 및 분석을 평가하는 CHARMM(Brooks 등의 문헌[(1983) J. Comput. Chem. 4:187-217]) 및 AMBER(Weiner 등의 문헌[(1981) J. Comput. Chem. 106: 765])는 (Eisenfield 등의 문헌[(1991) Am. J. Physiol. 261:C376-386]; Lybrand의 문헌[(1991) J. Pharm. Belg. 46:49-54]; Froimowitz의 문헌[(1990) Biotechniques 8:640-644]; Burbam 등의 문헌[(1990) Proteins 7:99-111]; Pedersen의 문헌[(1985) Environ. Health Perspect. 61:185-190]; 및 Kini 등의 문헌[(1991) J. Biomol. Struct. Dyn. 9:475-488]도 참조함). Schrodinger(Munich, Germany)의 프로그램과 같은 같는 다양한 적절한 컴퓨터 프로그램을 상업적으로 이용할 수도 있다..
일부 구현예에서, 항-TNFR2 항체 및 이의 인간화 버전은 토끼 단클론 항체로부터 유래되며, 특히 APXiMAB™ 기술을 사용하여 생성된다. 이들 항체는 최소한의 서열 변형을 요구함으로써 돌연변이 계통 유도(MLG) 인간화 기술을 사용하여 인간화 후 기능적 성질의 유지를 용이하게 하기 때문에 유리하다(예를 들어, 미국 특허 제7,462,697호 참조). 따라서, 본 개시의 항-TNFR2 항체를 제조하는 예시적인 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,675,063호 및 제7,429,487호에 기술된 APXiMAB™ 토끼 단클론 항체 기술을 포함한다. 이와 관련하여, 소정의 구현예에서, 본 개시의 항-TNFR2 항체는 토끼에서 생산된다. 특정 구현예에서, 토끼 비장세포 또는 말초 B 림프구와 융합될 수 있는 토끼 유래의 불멸 B 림프구가 항체를 생산하는 하이브리드 세포를 생산하는 데 사용된다. 불멸 B-림프구는 내인성 면역글로불린 중쇄를 검출 가능하게 발현하지 않으며, 소정의 구현예에서 변경된 면역글로불린 중쇄 암호화 유전자를 함유할 수 있다.
조성물 및 사용 방법
본 개시는 TNFR2-특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물, 및 암, 염증성 및 자가면역 질환, 및 기타 질환의 치료를 포함하는 다양한 치료 환경에서 이러한 조성물의 투여를 제공한다.
본원에 기술된 TNFR2-특이적 항체를 순수 형태 또는 적절한 약학적 조성물로 투여하는 것은 유사한 효능을 제공하기 위한 제제의 허용된 투여 모드 중 어느 하나를 통해 수행될 수 있다. 약학적 조성물은 항체 또는 항체 함유 조성물을 적절한 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제와 조합함으로써 제조될 수 있고, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔, 미소구체, 및 에어로졸과 같은 고형분, 반고형분, 액체, 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 또한, 다른 약학적 활성 성분(본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 다른 항암제를 포함함) 및/또는 염, 완충제, 및 안정화제와 같은 적절한 부형제가 조성물 내에 존재할 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 투여는 경구, 비경구, 비강, 정맥내, 피내, 피하, 또는 국소 투여를 포함하는 다양한 상이한 경로에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 투여 모드는 치료 또는 예방될 병태의 성질에 따라 달라진다. 투여 후, 암의 진행 및/또는 전이를 감소, 억제, 예방, 또는 지연시키는 양은 효과적인 것으로 간주된다.
소정의 구현예에서, 투여된 양은 생존 종양의 양에 있어서 통계적으로 유의한 감소, 예를 들어, 종양 덩어리의 적어도 50% 감소, 또는 변경된(예를 들어, 통계적으로 유의하게 감소된) 스캔 치수에 의해 표시되는 바와 같이, 종양 퇴행을 초래하기에 충분하다.
정확한 투여량 및 치료 기간은 치료 중인 질환의 함수이며, 공지된 시험 프로토콜을 사용하거나, 당업계에 공지된 모델 시스템에서 조성물을 시험하고 이로부터 외삽하여 경험적으로 결정될 수 있다. 조절된 임상 시험이 수행될 수도 있다. 투여량은 완화될 병태의 중증도에 따라 달라질 수도 있다. 약학적 조성물은 일반적으로 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서 치료적으로 유용한 효과를 발휘하도록 제형화되고 투여된다. 조성물은 1회 투여되거나, 일정 시간 간격으로 투여되도록 다수의 보다 적은 투여량으로 분할될 수 있다. 임의의 특정 대상체의 경우, 특정 투여량 요법은 개별적인 필요에 따라 시간 경과에 따라 조정될 수 있다.
TNFR2-특이적 항체 함유 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 알려진 암치료제, 예컨대 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광역학적 요법 등과 병용 투여될 수 있다. 조성물은 항생제와 병용 투여될 수도 있다.
따라서, 이들 및 관련 약학적 조성물을 투여하는 일반적인 경로는 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 구강, 직장, 질, 유리체 내, 및 비강을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 소정의 구현예에 따른 약학적 조성물은, 조성물이 환자에게 투여될 때, 그 안에 담긴 활성 성분이 생체 이용 가능하도록 제형화된다. 대상체 또는 환자에게 투여될 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 취할 수 있으며, 여기서, 예를 들어, 정제는 단일 투여 단위일 수 있고, 본원에 기술된 TNFR2-특이적 항체를 에어로졸 형태로 포함하는 용기는 복수의 투여 단위를 담을 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이며; 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)을 참조한다. 임의의 경우에, 투여될 조성물은 본원의 교시에 따른 관심 질환 또는 병태를 치료하기 위한, 본 개시의 항체의 치료적 유효량을 함유할 것이다.
약학적 조성물은 고형분 또는 액체의 형태일 수 있다. 일 구현예에서, 담체(들)는 미립자이므로, 조성물은 예를 들어, 정제 또는 분말 형태이다. 담체(들)는 액체이고, 조성물은 예를 들어 경구 오일, 주사식 액체, 또는 에어로졸일 수 있고, 이는 예를 들어 흡입 투여에 유용하다. 경구 투여용으로 의도되는 경우, 약학적 조성물은 바람직하게는 고형분 또는 액체의 형태이며, 여기서 반고형분, 반액체, 현탁액, 및 겔 형태는 본원에서 고형분 또는 액체 중 어느 하나로 간주되는 형태 내에 포함된다.
경구 투여용 고형 조성물로서의 약학적 조성물은 분말, 과립, 압축된 정제, 알약, 캡슐, 츄잉 검, 웨이퍼 등으로 제형화될 수 있다. 이러한 고형 조성물은 일반적으로 하나 이상의 불활성 희석제 또는 식용 담체를 함유할 것이다. 또한, 다음 중 하나 이상이 존재할 수 있다: 카복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 껌 트라가칸스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 락토오스 또는 덱스트린, 알긴산과 같은 붕해제, 알긴산나트륨, 프리모겔(Primogel), 옥수수 전분 등과 같은 부형제; 스테아린산 마그네슘 또는 스테로텍스(Sterotex)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제; 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향료와 같은 향미제; 및 착색제. 약학적 조성물이 젤라틴 캡슐과 같은 캡슐의 형태인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 액체, 예를 들어 엘릭서, 시럽, 용액, 유화액, 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 2개의 실시예로서, 경구 투여용 또는 주사에 의한 전달을 위한 것일 수 있다. 경구 투여용으로 의도되는 경우, 소정의 조성물은 본 화합물에 더하여 감미제, 보존제, 염료/착색제, 및 향미제 중 하나 이상을 함유한다. 주사에 의해 투여되도록 의도된 조성물의 경우, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충액, 안정화제, 및 등장제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
액체 약학적 조성물은, 이들이 용액, 현탁액, 또는 다른 유사 형태인지와 상관없이, 다음 보조제 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수, 식염수(바람직하게는 생리 식염수), 링거 용액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노글리세드 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 완충제, 아세테이트, 구연산염, 또는 인산염과 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조절제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 투여 바이알에 봉입될 수 있다. 생리 식염수는 예시적인 보조제이다. 주사식 약학적 조성물은 멸균 상태인 것이 바람직하다.
비경구 또는 경구 투여용으로 의도된 액체 약학적 조성물은 적절한 투여량이 수득될 수 있도록 본원에 개시된 바와 같은 일정량의 TNFR2-특이적 항체를 함유해야 한다. 일반적으로, 이러한 양은 조성물 중 적어도 0.01%의 항체이다. 경구 투여용으로 의도되는 경우, 이러한 양은 조성물 중량의 0.1 내지 약 70%가 되도록 변화될 수 있다. 소정의 경구 약학적 조성물은 약 4% 내지 약 75%의 항체를 함유한다. 소정의 구현예에서, 약학적 조성물 및 제제는 비경구 투여 단위가 희석 전에 0.01 내지 10 중량%의 항체를 함유하도록 제조된다.
약학적 조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있으며, 이 경우 담체는 용액, 유화액, 연고 또는 겔 염기를 적절히 포함할 수 있다. 염기는, 예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 꿀벌 왁스, 광유, 물과 알코올과 같은 희석제, 및 유화제와 안정화제. 증점제는 국소 투여용 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여용으로 의도되는 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온토포레시스 장치(iontophoresis device)를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은, 예를 들어 직장 내에서 용융되어 약물을 방출하게 되는 직장 투여용 좌제의 형태로 의도될 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적절한 비자극성 부형제로서 유성 염기를 함유할 수 있다. 이러한 염기는 라놀린, 코코아 버터, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
약학적 조성물은 고형분 또는 액체 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분 주위에 코팅 쉘을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 쉘을 형성하는 물질은 일반적으로 불활성이며, 예를 들어, 설탕, 셸락, 및 다른 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 젤라틴 캡슐에 담겨질 수 있다. 고형분 또는 액체 형태의 약학적 조성물은 항체에 결합하여 화합물의 전달을 돕는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 능력으로 작용할 수 있는 적절한 제제는 다른 단클론 또는 다클론 항체, 하나 이상의 단백질 또는 리포좀을 포함한다. 약학적 조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 투여량 단위로 본질적으로 이루어질 수 있다. 용어 에어로졸은 콜로이드 성질의 시스템부터 가압 패키지로 이루어진 시스템까지 다양한 시스템을 지칭하도록 데 사용된다. 전달은 액화 또는 압축 가스에 의하거나 활성 성분을 분배하는 적절한 펌프 시스템에 의할 수 있다. 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위해 단상성, 이상성, 또는, 삼상성 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸의 전달은, 함께 키트를 형성할 수 있는 필수 용기, 활성화제, 밸브, 내부 용기 등을 포함한다. 당업자는 과도한 실험 없이 바람직한 에어로졸을 결정할 수 있다.
약학적 조성물은 약학 분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의해 투여되도록 의도된 약학적 조성물은, 용액을 형성하도록, 본원에 기술된 바와 같은 TNFR2-특이적 항체를 포함하는 조성물, 및 임의로 염, 완충액, 및/또는 안정화제 중 하나 이상을 멸균 증류수와 조합함으로써 제조될 수 있다. 계면활성제는 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 용이하게 하기 위해 첨가될 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에서 항체의 용해 또는 균질한 현탁을 용이하게 하도록 항체 조성물과 비공유적으로 상호작용하는 화합물이다.
조성물은 치료적 유효량으로 투여될 수 있는데, 이는 다음을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라지게 된다: 사용된 특정 화합물(예를 들어, TNFR2-특이적 항체)의 활성; 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간; 환자의 나이, 체중, 전반적인 건강, 성별, 및 식단; 투여 모드 및 투여 기간; 배설 속도; 약물 병용; 특정 장애 또는 병태의 중증도; 치료를 받고 있는 대상체. 일반적으로, 치료적으로 유효한 일일 투여량은 (70 kg 포유동물 기준) 약 0.001 mg/kg(즉, 0.07 mg) 내지 약 100 mg/kg(즉, 7.0 g)이고; 바람직하게는 치료적으로 유효한 투여량은 (70 kg의 포유동물 기준) 약 0.01 mg/kg(즉, 0.7 mg) 내지 약 50 mg/kg(즉, 3.5g); 더 바람직하게는 치료적으로 유효한 투여량은 (70 kg 포유동물 기준) 약 1 mg/kg(즉, 70 mg) 내지 약 25 mg/kg(즉, 1.75 g)이다.
본 개시의 TNFR2-특이적 항체를 포함하는 조성물은 하나 이상의 다른 치료제와 동시에, 투여 전에, 또는 투여 후에 투여될 수도 있다. 이러한 병용 요법은 항체 및 하나 이상의 추가 활성제를 함유하는 단일 약학적 투여 제형을 투여하는 것뿐만 아니라, 본 개시의 항체 및 각각의 활성제를 포함하는 조성물을 별도의 약학적 투여 제형으로 투여하는 것도 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 항체 및 다른 활성제는 정제 또는 캡슐과 같은 단일 경구 투여 조성물로 환자에게 함께 투여되거나, 각각의 제제가 별도의 경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 유사하게, 본원에 기술된 바와 같은 항체 및 다른 활성제는 함께 단일 비경구 투여 조성물로, 예컨대 염수 용액 또는 다른 생리학적으로 허용 가능한 용액으로 환자에게 투여되거나, 각각의 제제가 별도의 비경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 별도의 투여 제형이 사용되는 경우, 항체 및 하나 이상의 추가 활성제를 포함하는 조성물은 본질적으로 같은 시간에, 즉 동시에 투여되거나, 시차를 두고 별도로, 즉 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있으며; 병용 요법은 모든 이들 요법을 포함하는 것으로 이해된다.
따라서, 소정의 구현예에서, 본 개시의 항-TNFR2 항체 조성물을 하나 이상의 다른 치료제와 병용으로 투여하는 것도 고려된다. 이러한 치료제는 본원에 기술된 것과 같은 특정 병태, 예컨대 류마티스 관절염, 염증, 또는 암에 대한 표준 치료제로서 당업계에서 허용될 수 있다. 고려되는 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항염증제, 화학요법제, 방사선치료제, 또는 다른 활성제 및 보조제를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항-TNFR2 항체는 하나 이상의 암 면역요법제와 병용 투여된다. 소정의 경우에, 면역요법제는 대상체의 면역 반응을 조절하여, 예를 들어, 암 관련 또는 암 특이적 면역 반응을 증가시키거나 유지시켜 면역 세포에 의한 암세포 억제를 증가시키거나 암세포를 감소시킨다. 예시적인 면역요법제는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 및 이의 항원 결합 단편, 리간드, 및 작은 펩티드, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 또한, 소분자, 세포(예를 들어, T-세포와 같은 면역 세포), 다양한 암 백신, 유전자 요법, 또는 다른 폴리뉴클레오티드 기반 제제(종양용해 바이러스와 같은 바이러스 제제 및 기타 당업계에 알려진 다른 것들을 포함함)가 면역요법제로서 포함된다. 따라서, 소정의 구현예에서, 암 면역 요법제는 면역 관문 조절제, 암 백신, 종양용해 바이러스(oncolytic virus), 사이토카인, 및 세포 기반 면역요법 중 하나 이상으로부터 선택된다.
소정의 구현예에서, 암 면역 요법제는 면역 관문 조절제이다. 특정 예는 하나 이상의 억제성 면역 관문 분자의 “길항제”, 및 하나 이상의 자극성 면역 관문 분자의 “길항제”를 포함한다. 일반적으로, 면역 관문 분자는 신호를 증가시키거나(공자극 분자) 신호를 감소시키는 면역 체계의 성분이며, 암세포는 면역 관역 분자의 자연 기능을 교란할 수 있기 때문에 이들을 표적으로 하면 암을 치료할 가능성이 있다(예를 들어, Sharma와 Allison의 문헌[Science. 348:56-61, 2015]; Topalian 등의 문헌[Cancer Cell. 27:450-461, 2015]; Pardoll의 문헌[Nature Reviews Cancer. 12:252-264, 2012] 참조). 일부 구현예에서, 면역 관문 조절제(예: 길항제, 작용제)는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 면역 관문 분자에 “결합”하거나 “특이적으로 결합”한다.
일부 구현예에서, 면역 관문 조절제는 하나 이상의 억제성 면역 관문 분자의 길항제 또는 억제제이다. 예시적인 억제성 면역 관문 분자는 예정 사멸-리간드 1(PD-L1), 예정 사멸-리간드 2(PD-L2), 예정 사멸 1(PD-1), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA), 세포독성 T-림프구 연관 단백질 4(CTLA-4), 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO), 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3), 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3), B 및 T 림프구 감쇄제(BTLA), CD160, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), 및 신호 조절 단백질 α(SIRPα)를 포함한다.
소정의 구현예에서, 제제는 PD-1(수용체) 길항제 또는 억제제이며, 이들을 표적화하면 종양 환경에서 면역 기능이 복원되는 것으로 나타났다(예를 들어, Phillips 등의 문헌[Int Immunol. 27:39-46, 2015] 참조). PD-1은 면역글로불린 상과에 속하는 세포 표면 수용체로서, T 세포 및 pro-B 세포에서 발현된다. PD-1은 2개의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2와 상호작용한다. PD-1은, 예를 들어, T 세포의 활성화를 감소시키거나 방지함으로써 억제성 면역 관문 분자로서 기능하며, 이는 결국 자가면역을 감소시키고 자기 내성을 촉진한다. PD-1의 억제 효과는 적어도 부분적으로는 림프절의 항원 특이적 T 세포에서 세포자멸사를 촉진하는 동시에 조절 T 세포(억제 T 세포)에서 세포자멸사를 감소시키는 이중 메커니즘을 통해 적어도 부분적으로 달성된다. PD-1 길항제 또는 억제제의 일부 예는, PD-1에 특이적으로 결합하여 이의 면역 억제 활성 중 하나 이상, 예를 들어, 이의 하류 신호전달 또는 PD-L1과 이의 상호작용을 감소시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다. PD-1 길항제 또는 억제제의 특정 예는 항체 니볼루맙, 펨브롤리주맙, PDR001, MK-3475, AMP-224, AMP-514, 및 피딜리주맙, 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제8,008,449호; 제8,993,731호; 제9,073,994호; 제9,084,776호; 제9,102,727호; 제9,102,728호; 제9,181,342호; 제9,217,034호; 제9,387,247호; 제9,492,539호; 제9,492,540호; 및 미국 특허 출원 제2012/0039906호; 제2015/0203579호 참조).
일부 구현예에서, 제제는 PD-L1 길항제 또는 억제제이다. 전술한 바와 같이, PD-L1은 PD-1 수용체에 대한 천연 리간드 중 하나이다. PD-L1 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는, PD-L1에 특이적으로 결합하여 이의 면역 억제 활성, 예를 들어 PD-1 수용체에 대한 결합을 감소시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다. PD-L1 길항제의 특정 예는 항체 아테졸리주맙(MPDL3280A), 아벨루맙(MSB0010718C), 및 더발루맙(MEDI4736), 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제9,102,725호; 제9,393,301호; 제9,402,899호; 제9,439,962호 참조).
일부 구현예에서, 제제는 PD-L2 길항제 또는 억제제이다. 전술한 바와 같이, PD-L2는 PD-1 수용체에 대한 천연 리간드 중 하나이다. PD-L2 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는, PD-L2에 특이적으로 결합하여 이의 면역 억제 활성, 예를 들어 PD-1 수용체에 대한 이의 결합을 감소시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다.
소정의 구현예에서, 제제는 VISTA 길항제 또는 억제제이다. VISTA는 크기가 약 50 kDa이며, 면역글로불린 상과(하나의 IgV 도메인을 가짐) 및 B7 계열에 속한다. 이는 주로 백혈구 세포에서 발현되고, 이의 전사는 p53에 의해 부분적으로 조절된다. VISTA가 T 세포에 대한 리간드 및 수용체 둘 다로서 작용하여 T 세포 효과기 기능을 억제하고 말초 내성을 유지할 수 있다는 증거가 있다. VISTA는 골수 유래 억제 세포 및 조절 T 세포와 같은 종양 침윤 림프구에서 높은 수준으로 생산되며, 항체로 이를 차단하면 흑색종 및 편평 세포 암종의 마우스 모델에서 종양 성장이 지연된다. 예시적인 항-VISTA 길항제 항체는, 예를 들어 WO 2018/237287에 기술된 항체를 포함하며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 통합된다.
일부 구현예에서, 제제는 CTLA-4 길항제 또는 억제제이다. CD152(분화 클러스터 152)로도 알려진 CTLA4 또는 CTLA-4(세포독성 T-림프구-연관 단백질 4)는, 예를 들어 항원 제시 세포의 표면에서 CD80 또는 CD86에 결합될 때 T 세포에 억제 신호를 전달함으로써 기능하는 단백질 수용체이다. CTLA-4 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다. 특정 예는 항체 이필리무맙 및 트레멜리무맙, 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. 이필리무맙의 활성 중 적어도 일부는 CTLA-4를 발현하는 억제인자 Treg의 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 사멸에 의해 매개되는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 제제는 IDO 길항제 또는 억제제, 또는 TDO 길항제 또는 억제제이다. IDO 및 TDO는 면역 억제 특성을 갖는 트립토판 이화 효소이다. 예를 들어, IDO는 T 세포 및 NK 세포를 억제하고, Treg 및 골수 유래 억제 세포를 생성 및 활성화하고, 종양 혈관 신생을 촉진하는 것으로 알려져 있다. IDO 및 TDO 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는, IDO 또는 TDO에 특이적으로 결합하고(예를 들어, Platten 등의 문헌[Front Immunol. 5: 673, 2014] 참조), 하나 이상의 면역 억제 활성을 감소시키거나 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다. IDO 길항제 또는 억제제의 특정 예는 인독시모드(NLG-8189), 1-메틸-트립토판(1MT), β-카볼린(노르하만; 9H-피리도[3,4-b]인돌), 로스마린산, 및 에파카도스타트(예를 들어, Sheridan의 문헌[Nature Biotechnology. 33:321,-322, 2015] 참조)를 포함한다. TDO 길항제 또는 억제제의 특정 예는 680C91 및 LM10을 포함한다(예를 들어, Pilote 등의 문헌[PNAS USA. 109:2497-2502, 2012] 참조).
일부 구현예에서, 제제는 TIM-3 길항제 또는 억제제이다. T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3)은 활성화된 인간 CD4+ T 세포에서 발현되고 Th1 및 Th17 사이토카인을 조절한다. TIM-3은 또한 이의 리간드인 갈렉틴-9와의 상호작용 시 세포사멸을 유발함으로써 Th1/Tc1 기능의 음성 조절자로서 작용한다. TIM-3은 억제성 종양 미세환경에 기여하며, 이의 과발현은 다양한 암에서 불량한 예후와 관련이 있다(예를 들어, Li 등의 문헌[Acta Oncol. 54:1706-13, 2015] 참조). TIM-3 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는, TIM-3에 특이적으로 결합하여 이의 면역 억제 활성 중 하나 이상을 감소시키거나 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 LAG-3 길항제 또는 억제제이다. 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)은 활성화된 T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 및 형질세포양 수지상 세포 상에서 발현된다. 이는 CTLA-4 및 PD-1과 유사한 방식으로 T 세포의 세포 증식, 활성화, 및 항상성을 음성으로 조절하고(예를 들어, Workman 및 Vignali의 문헌[European Journal of Immun. 33: 970-9, 2003]; 및 Workman 등의 문헌[Journal of Immun. 172: 5450-5, 2004] 참조), Treg 억제 기능에서 역할을 하는 것으로 보고되었다(예를 들어, Huang 등의 문헌[Immunity. 21: 503-13, 2004] 참조). LAG3은 또한 CD8+ T 세포를 관용원성 상태(tolerogenic state)로 유지하고 PD-1과 결합하여 CD8 T 세포 고갈을 유지한다. LAG-3 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는, LAG-3에 특이적으로 결합하여 이의 면역 억제 활성 중 하나 이상을 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다. 특정 예는 항체 BMS-986016, 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 BTLA 길항제 또는 억제제이다. B- 및 T-림프구 약독화제(BTLA; CD272)의 발현은 T 세포의 활성화 중에 유도되며, 이는 종양 괴사 패밀리 수용체(TNF-R) 및 세포 표면 수용체의 B7 패밀리와의 상호작용을 통해 T 세포를 억제한다. BTLA는 헤르페스 바이러스 세포내 침투 매개체(HVEM)로도 알려진 종양 괴사 인자(수용체) 상과, 구성원 14(TNFRSF14)에 대한 리간드이다. BTLA-HVEM 복합체는, 예를 들어 인간 CD8+ 암-특이적 T 세포의 기능을 억제함으로써 T 세포 면역 반응을 음성적으로 조절한다(예를 들어, Derre 등의 문헌[J Clin Invest 120:157-67, 2009] 참조). BTLA 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는, BTLA-4에 특이적으로 결합하여 이의 면역 억제 활성 중 하나 이상을 감소시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 HVEM 길항제 또는 억제제, 예를 들어 HVEM에 특이적으로 결합하여 BTLA 또는 CD160과의 상호 작용을 방해하는 길항제 또는 억제제이다. HVEM 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는, HVEM에 특이적으로 결합하고, 임의로 HVEM/BTLA 및/또는 HVEM/CD160 상호작용을 감소시켜, HVEM의 면역 억제 활성 중 하나 이상을 감소시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 CD160 길항제 또는 억제제, 예를 들어 CD160에 특이적으로 결합하여 HVEM과의 상호 작용을 방해하는 길항제 또는 억제제이다. CD160 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는, CD160에 특이적으로 결합하고, 임의로 CD160/HVEM 상호작용을 감소시켜, 이의 면역 억제 활성 중 하나 이상을 감소시키거나 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 TIGIT 길항제 또는 억제제이다. T 세포 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT)은 다양한 림프 세포의 표면에서 발견되고, 예를 들어 Treg를 통해 항종양 면역을 억제하는 공동 억제 수용체이다(Kurtulus 등의 문헌[J Clin Invest. 125:4053-4062, 2015] 참조). TIGIT 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는, TIGIT에 특이적으로 결합하여 이의 면역 억제 활성 중 하나 이상을 감소시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다(예를 들어, Johnston 등의 문헌[Cancer Cell. 26:923-37, 2014] 참조).
소정의 구현예에서, 제제는 SIRPα 길항제 또는 억제제이다. SIRPα는 주로 골수 세포에 의해 발현되는 조절 막 당단백질로서, 광범위하게 발현되는 막관통 단백질 CD47과 상호작용하여 선천 면역 세포의 효과기 기능, 예컨대 숙주 세포 식균작용을 음성적으로 조절한다. 소정의 암세포는, 예를 들어 CD47을 과발현함으로써 억제성 SIRPα-CD47 신호 전달 경로를 활성화여 대식세포 매개 식균작용을 억제한다. SIRPα 억제제는 단독으로 및 다른 암치료제와의 상승 효과를 통해 암 성장 및 전이를 감소시키는 것으로 나타났다(예를 들어, Yanagita의 문헌[JCI Insight. 2017 Jan 12; 2(1): e89140] 참조). SIRPα 길항제 또는 억제제의 일반적인 예는 SIRPα에 특이적으로 결합하여 SIRPα-CD47 신호전달을 방해하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자를 포함한다(상기 문헌 참조).
일부 구현예에서, 면역 관문 조절제는 하나 이상의 자극성 면역 관문 분자의 작용제이다. 예시적인 자극성 면역 관문 분자는 CD40, OX40, 글루코코티코이드-유도 TNFR 계열 관련 유전자(GITR), CD137(4-1BB), CD27, CD28, CD226, 및 헤르페스 바이러스 세포내 침투 매개체(HVEM)를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 CD40 작용제이다. CD40은 항원 제시 세포(APC) 및 일부 악성 종양에서 발현된다. 이의 리간드는 CD40L(CD154)이다. APC 상에서의 결합은 공자극 분자를 상향조절하여, 항종양 면역 반응에서 T 세포의 지원에 대한 필요성을 잠재적으로 우회한다. CD40 작용제 요법은 APC 성숙 및 종양에서 림프절로의 이동에 있어서 중요한 역할을 하여, 항원 제시 및 T 세포 활성화를 증가시킨다. 항-CD40 작용제 항체는 동물 모델에서 실질적인 반응 및 지속적인 항암 면역을 생성하는데, 이는 세포독성 T 세포에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 효과이다(예를 들어, Johnson 등의 문헌[Clin Cancer Res. 21: 1321-1328, 2015]; 및 Vonderheide와 Glennie의 문헌[Clin Cancer Res. 19:1035-43, 2013] 참조). CD40 작용제의 일반적인 예는, CD40에 특이적으로 결합하여 이의 면역 자극 활성 중 하나 이상을 증가시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자 또는 리간드를 포함한다. 특정 예는 CP-870,893, 다세투주맙, Chi Lob 7/4, ADC-1013, CD40L, rhCD40L, 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. CD40 작용제의 특정 예는 APX005(예를 들어, US 2012/0301488 참조) 및 APX005M(예를 들어, US 2014/0120103 참조)을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 제제는 OX40 작용제이다. OX40(CD134)은 효과기 및 기억 T 세포의 증식을 촉진하고, T 조절 세포의 분화 및 활성을 억제한다(예를 들어, Croft 등의 문헌[Immunol Rev. 229:173-91, 2009] 참조). 리간드는 OX40L(CD252)이다. OX40 신호전달은 T 세포 활성화 및 생존 모두에 영향을 미치기 때문에, 림프절에서 항종양 면역 반응을 개시하고 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. OX40 작용제의 일반적인 예는, OX40에 특이적으로 결합하여 이의 면역 자극 활성 중 하나 이상을 증가시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자 또는 리간드를 포함한다. 구체적인 예는 OX86, OX-40L, Fc-OX40L, GSK3174998, MEDI0562(인간화 OX40 작용제), MEDI6469(쥣과 OX40 작용제), 및 MEDI6383(OX40 작용제), 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 GITR 작용제이다. 글루코코르티코이드-유도 TNFR 패밀리 관련 유전자(GITR)는 T 세포 증식을 증가시키고, Treg의 억제 활성을 억제하며, T-효과기 세포의 생존을 연장시킨다. GITR 작용제는 Treg 계통 안정성의 상실을 통해 항종양 반응을 촉진하는 것으로 나타났다(예를 들어, Schaer 등의 문헌[Cancer Immunol Res. 1:320-31, 2013] 참조). 이들 다양한 메커니즘은 GITR이 림프절에서 면역 반응을 개시하고 종양 조직에서 면역 반응을 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 이의 리간드는 GITRL이다. GITR 작용제의 일반적인 예는, GITR에 특이적으로 결합하여 이의 면역 자극 활성 중 하나 이상을 증가시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자 또는 리간드를 포함한다. 특정 예는 GITRL, INCAGN01876, DTA-1, MEDI1873, 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 CD137 작용제이다. CD137(4-1BB)은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 계열의 구성원이며, CD137의 가교 결합은 T 세포 증식, IL-2 분비, 생존, 및 세포 용해 활성을 향상시킨다. CD137-매개 신호 전달은 또한 CD8+ T 세포와 같은 T 세포를 활성화 유도 세포 사멸로부터 보호한다. CD137 작용제의 일반적인 예는, CD137에 특이적으로 결합하여 이의 면역 자극 활성 중 하나 이상을 증가시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자또는 리간드를 포함한다. 특정 예는 CD137(또는 4-1BB) 리간드(예를 들어, Shao와 Schwarz의 문헌[J Leukoc Biol. 89:21-9, 2011] 참조) 및 항체 항체 유토밀루맙을 포함하며, 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 CD27 작용제이다. CD27의 자극은 미노출 T 세포의 항원 특이적 확장을 증가시키고, T 세포 기억 및 T 세포 면역을 장기간 유지하는 데 기여한다. 이의 리간드는 CD70이다. 작용제 항체로 인간 CD27을 표적화하면 T 세포 활성화 및 항종양 면역이 자극된다(예를 들어, Thomas 등의 문헌[Oncoimmunology. 2014;3:e27255], 및 doi:10.4161/onci.27255; 및 He 등의 문헌[J Immunol. 191:4174-83, 2013] 참조). CD27 작용제의 일반적인 예는, CD27에 특이적으로 결합하여 이의 면역 자극 활성 중 하나 이상을 증가시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자 또는 리간드를 포함한다. 특정 예는 CD70 및 항체 바릴리무맙 및 CDX-1127(1F5)을 포함하며, 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 CD28 작용제이다. CD28은 구성적으로 발현되는 CD4+ T 세포 및 일부 CD8+ T 세포이다. 이의 리간드는 CD80 및 CD86을 포함하고, 이의 자극은 T 세포 증식을 증가시킨다. CD28 작용제의 일반적인 예는, CD28에 특이적으로 결합하여 이의 면역 자극 활성 중 하나 이상을 증가시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자 또는 리간드를 포함한다. 특정 예는 항체 CD80, CD86, 항체 TAB08, 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 CD226 작용제이다. CD226은 TIGIT와 리간드를 공유하는 자극 수용체이며, TIGIT와 반대로, CD226의 결합은 T 세포 활성화를 강화시킨다(예를 들어, Kurtulus 등의 문헌[J Clin Invest. 125:4053-4062, 2015[; Bottino 등의 문헌[J Exp Med. 1984:557-567, 2003]; 및 Tahara-Hanaoka 등의 문헌[Int Immunol. 16:533-538, 2004] 참조). CD226 작용제의 일반적인 예는, CD226에 특이적으로 결합하여 이의 면역 자극 활성 중 하나 이상을 증가시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자 또는 리간드(예: CD115, CD115)를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 HVEM 작용제이다. 종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원 14(TNFRSF14)로도 알려진 헤르페스 바이러스 세포내 침투 매개체(HVEM)는 TNF 수용체 상과의 인간 세포 표면 수용체이다. HVEM은 T 세포, APC, 및 기타 면역 세포를 포함하는 다양한 세포에서 발견된다. 다른 수용체와 달리, HVEM은 휴지 T 세포에서 높은 수준으로 발현되고 활성화 시 하향 조절된다. HVEM 신호전달은 T 세포 활성화의 초기 단계 및 림프절에서 종양 특이적 림프구 집단이 증식하는 동안 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. HVEM 작용제의 일반적인 예는, HVEM에 특이적으로 결합하여 이의 면역 자극 활성 중 하나 이상을 증가시키는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 소분자 또는 리간드를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항-TNFR2 항체는 하나 이상의 이중특이적 또는 다중특이적 항체와 병용 투여된다. 예를 들어, 소정의 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 (i) 하나 이상의 억제성 면역 관문 분자에 결합하여 이를 억제할 수 있고, (ii) 또한 하나 이상의 자극성 면역 관문 분자에 결합하여 작용시킬 수 있다. 소정의 구현예에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 (i) PD-L1, PD-L2, PD-1, CTLA-4, IDO, TDO, TIM-3, LAG-3, BTLA, CD160, 및/또는 TIGIT 중 하나 이상에 결합하여 이를 억제하고, 또한 (ii) CD40, OX40 글루티코르티코이드-유도 TNFR 계열 관련 유전자(GITR), CD137 (4-1BB), CD27, CD28, CD226, 및/또는 헤르페스 바이러스 세포내 침투 매개체(HVEM) 중 하나 이상에 결합하여 이를 작용화(agonize)한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항-TNFR2 항체는 하나 이상의 암 백신과 병용 투여된다. 소정의 구현예에서, 암 백신은 온코파지(Oncophage), 인간 유두종바이러스 HPV 백신 (임의로 가다실(Gardasil) 또는 서바릭스(Cervarix), B형 간염 백신(임의로 엔제릭스-B(Engerix-B), 리콤비락스 HB(Recombivax HB), 또는 트윈릭스(Twinrix)), 및 시푸류셀-T(Provenge) 중 하나 이상으로부터 선택되거나; 인간 Her2/neu, Her1/EGF 수용체(EGFR), Her3, A33 항원, B7H3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23 (IgE 수용체), MAGE-3, C242 항원, 5T4, IL-6, IL-13, 혈관 내피 성장 인자 VEGF (예: VEGF-A), VEGFR-1, VEGFR-2, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CD152, CD200, CD221, CCR4, HLA-DR, CTLA-4, NPC-1C, 테나신(tenascin), 비멘틴(vimentin), 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1R), 알파-태아단백질, 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 탄산탈수효소 9(CA-IX), 암배아 항원(CEA), 구아닐리 시클라아제 C, NY-ESO-1, p53, 서바이빈, 인테그린 αvβ3, 인테그린 α5β1, 엽산 수용체 1, 막관통 당단백질 NMB, 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 당단백질 75, TAG-72, MUC1, MUC16 (또는 CA-125), 포스파티딜세린, 전립선 특이적 막 항원(PMSA), NR-LU-13 항원, TRAIL-R1, 종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원 10b (TNFRSF10B 또는 TRAIL-R2), SLAM 계열 구성원 7 (SLAMF7), EGP40 범암종 항원, B-세포 활성화 인자(BAFF), 혈소판 유래 성장 인자 수용체, 당단백질 EpCAM (17-1A), 예정 사멸-1, 이황화 단백질 이성질화효소(PDI), 간 재성 포스파타아제 3 (PRL-3), 전립선 산 포스파타아제, 루이스-Y 항원, GD2 (신경외배엽 기원의 종양에서 발현되는 디시알로강글리오시드), 글리피칸-3 (GPC3), 및 메소텔린 중 하나 이상으로부터 선택된 암 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항-TNFR2 항체는 하나 이상의 종용용해 바이러스와 병용 투여된다. 일부 구현예에서, 종양용해 바이러스(oncolytic virus)는 탈리모겐 라헤르파렙벡(T-VEC), 콕사키바이러스 A21(CAVATAK™), 온코린(H101), 펠라레오렙(REOLYSIN®), 세네카 밸리 바이러스(NTX-010), 세네카바이러스(Senecavirus) SVV-001, ColoAd1, SEPREHVIR (HSV-1716), CGTG-102 (Ad5/3-D24-GMCSF), GL-ONC1, MV-NIS, 및 DNX-2401 중 하나 이상으로부터 선택된다.
소정의 구현예에서, 암 면역요법제는 사이토카인이다. 예시적인 사이토카인은 인터페론(IFN)-α, IL-2, IL-12, IL-7, IL-21, 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 포함한다.
소정의 구현예에서, 암 면역요법제는 세포 기반 면역요법, 예를 들어 T 세포 기반 입양 면역요법이다. 일부 구현예에서, 세포 기반 면역 요법은 암 항원-특이적 T 세포, 임의로 생체외-유래 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 암 항원-특이적 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)-변형 T 세포, 및 T-세포 수용체(TCR)-변형 T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 및 펩티드-유도 T 세포 중 하나 이상으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, CAR-변형 T 세포는 CD-19에 대해 표적화된다(예를 들어, Maude 등의 문헌[Blood. 125:4017-4023, 2015] 참조).
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항-TNFR2 항체는 입양 면역 요법, 예를 들어, 자가 면역 요법의 일부로서 사용된다. 따라서, 소정의 구현예는 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은:
(a) 본원에 기술된 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 생체외-유래 면역 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
(b) 자가 면역 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 생체외-유래 면역 세포는 자가 세포이며, 이는 치료 대상 환자로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 자가 면역 세포는 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 및/또는 수지상 세포(DC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 림프구는 T-세포, 임의로 세포독성 T-림프구(CTL)를 포함한다. 입양 T-세포 및 NK 세포 면역요법에 대한 설명은 예를 들어, June의 문헌[J Clin Invest. 117: 1466-1476, 2007]; Rosenberg와 Restifo의 문헌[Science. 348:62-68, 2015]; Cooley 등의 문헌[Biol. of Blood and Marrow Transplant. 13:33-42, 2007]; 및 Li와 Sun, Chin의 문헌[J Cancer Res. 30:173-196, 2018]을 참조한다. 일부 구현예에서, T 세포는 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 “암 항원”에 대해 유도되는 암 항원-특이적 T 세포를 포함한다. 소정의 구현예에서, 항-TNFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 입양으로 전달된 면역 세포의 효능을 강화시킨다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항-TNFR2 항체는 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예는 티오테파 및 시클로포스파미드(CYTOXAN™)와 같은 알킬화제; 부설파, 임프로설판, 및 피포설판과 같은 알킬설폰산염; 벤조도파, 카보큐온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라머스틴, 이포파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜스테린, 프레드니머스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카머스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴, 라디머스틴과 같은 니트로스우레아; 알라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리키마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 프트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메트트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 클라우스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피토스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-부신제; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지큐온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질화갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피아루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테뉴아존산; 트리지큐온; 2, 2’,2”-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노머스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드(“Ara-C”); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로미틴 (DMFO); Targretin™ (벡사로텐), Panretin™ (알리트레티노인)과 같은 레티노산 유도체; ONTAK™ (데닐류킨 디피톡스); 에스페라마이신; 카페시타빈; 및 전술한 것들 중 어느 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체를 포함한다. 또한, 본 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항호르몬제, 예컨대 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타아제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston)과 같은 항에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 바이칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린과 같은 항안드로겐; 및 전술한 것들 중 어느 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체가 포함된다.
다양한 다른 치료제가 본원에 기술된 항-TNFR2 항체와 함께 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 항염증제와 함께 투여된다. 항염증제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론 포함), 비스테로이드성 항염증제(NSAIDS)(아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 설파살라진, 류플루노미드, 항-TNF 의약, 시클로포스파미드, 및 마이코페놀레이트 포함)를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cox-2 억제제(예: VIOXX®(로페콕시브) 및 CELEBREX®(셀레콕시브)), 및 시알레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 진통제는 아세트아미노펜, 옥시코돈, 프로포르옥시펜 염산염의 트라마돌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 또는 프레드니손으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 생물학적 반응 조절제는 세포 표면 마커에 대해 유도되는 분자(예를 들어, CD4, CD5 등), 사이토카인 억제제, 예컨대 TNF 길항제(예를 들어, 에타너셉트(ENBREL®), 아달리무맙(HUMIRA®), 및 인플릭시맙(REMICADE®)), 케모카인 억제제, 및 접착 분자 억제제를 포함한다. 생물학적 반응 조절제는 단클론 항체뿐만 아니라 분자의 재조합 형태도 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 레플루노미드, 설파살라진, 하이드록시클로로퀸, 금(경구(아우라노핀) 및 근육내), 및 미노시클린을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 사이토카인과 함께 투여된다. 본원에서 사용되는 “사이토카인(cytokine)”은 다른 세포에 대해 작용하는 하나의 세포 모집단에 의해 세포간 매개체로서 방출되는 단백질에 대한 일반적인 용어를 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인에는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 프로렐락신; 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮐러관-억제 물질; 마우스 성선 자극 호르몬-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-베타와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론-알파, 베타, 및 감마와 같은 인터페론; 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15와 같은 인터류킨(IL); TNF-알파 또는 TNF-베타와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양에서 유래된 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 TNFR2-특이적 항체를 포함하는 조성물은 암, 염증성 질환, 및 자가면역 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본원에 기술된 것과 같은 질환을 앓고 있는 개체에게 투여된다. 암은 특히 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, 췌장, 결장, 위장, 전립선, 방광, 신장, 난소, 자궁경부, 유방, 폐, 비인두의 암종, 및 악성 흑색종을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 따라서, 소정의 구현예는 암환자를 치료하기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에 기술된 조성물을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 비정상적인 TNFR2 발현 및/또는 TNFR2 길항제 매개 면역 억제와 연관이 있다. 소정의 구현예에서, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 항체는 TNFR2 길항제이다.
일부 구현예에서, 염증성 또는 자가면역 질환은 비정상적인 TNFR2 발현과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 염증성 또는 자가면역 질환은 TNFR2 작용제 매개 면역 활성화와 연관된다. 예시적인 자가면역 질환은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 관절염(류머티스성 관절염 및 반응성 관절염 포함), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 건선 및 염증성 장 질환(IBD), 뇌척수막염, 포도막염, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 당뇨병, 애디슨 병, 소아 지방변증, 만성 피로 증후군, 자가면역 간염, 자가면역 탈모증, 강직성 척추염, 궤양성 대장염, 크론병, 섬유근통, 심상성 천포창, 쇼그렌 증후군, 카와사키병, 갑상성기능항진증/그레이브스병, 갑성선기능저하증/하시모토병, 자궁내막증, 피부경화증, 악성 빈혈, 굿파쳐스 증후군, 길랑-바레 증후군, 베게너병, 사구체 신염, 재생불량성 빈혈(수혈성 재생불량성 빈혈 환자 포함), 발작성 야간 혈색소뇨증, 골수이형성 증후군, 특발성 혈소판감소성 자반등, 자가면역 용혈성 빈혈, 에반 증후군, 인자 VIII 억제제 증후군, 전신 혈관염, 피부근염, 다발근육염 및 류머티스 열, 자가면역 림프구증식 증후군(ALPS), 자가면역 수포성 유사천포창, 파킨슨병, 유육종증, 백반증, 원발성 담즙성 간경화증, 및 자가면역 심근염.
예시적인 염증성 질환은 크론병, 대장염, 피부염, 건선, 게실염, 간염, 과민성 장 증후군(IBS), 홍반성 루푸스, 신염, 파킨슨병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머병, 관절염, 류마티스 관절염, 천식, 및 죽상경화증 및 혈관염과 같은 다양한 심혈관 질환을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 염증성 질환은 류마티스 관절염, 당뇨병, 통풍, 크리오피린 관련 주기적 증후군, 및 만성 폐쇄성 폐 장애로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 항체는 TNFR2 작용제이다.
예를 들어, 소정의 구현예는 작용제 항-TNFR2 항체를 포함하는 본원에 개시된 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 염증성 질환을 치료하거나 이의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예는 작용제 항-TNFR2 항체를 포함하는 본원에 개시된 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 이식 환자에게 투여함으로써, 이식편-대-숙주 질환을 치료하거나, 예방하거나, 이의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예는 작용제 항-TNFR2 항체를 포함하는 본원에 개시된 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 이식 환자에게 투여함으로써, 이식 거부를 치료하거나, 예방하거나, 이의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다.
소정의 구현예는 작용제 항-TNFR2 항체를 포함하는 본원에 개시된 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 감염성 질환을 치료하거나, 예방하거나, 이의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 감염성 질환은 바이러스, 박테리아, 진균(임의로 효모), 및 원생동물 감염증을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
인간 질환의 치료를 위한 생체 내 사용을 위해, 본원에 기술된 항체는 일반적으로 투여 전에 약학적 조성물에 통합된다. 약학적 조성물은 본원에 기술된 항체 중 하나 이상을 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같은 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함한다. 약학적 조성물을 제조하기 위해, 화합물 중 하나 이상의 유효량이 특정 투여 방식에 적합한 것으로 당업자에게 알려진 임의의 약학적 담체(들) 또는 부형제와 혼합된다. 약학적 담체는 액체, 반-액체, 또는 고형분일 수 있다. 비경구, 피내, 피하, 또는 국소 도포에 사용되는 용액 또는 현탁액은 예를 들어 다음을 포함할 수 있다: 멸균 희석제(예: 물), 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제(예를 들어, 벤질 알코올 및 메틸 파라벤); 항산화제(예컨대, 아스코르브산 및 중아황산나트륨) 및 킬레이트제(예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)); 완충제(예컨대 아세테이트, 구연산염, 및 인산염). 정맥 내 투여되는 경우, 적절한 담체는 생리식염수 또는 인산염 완충 식염수(PBS), 및 증점제 및 가용화제를 포함하는 용액, 예컨대 포도당, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 TNFR2-특이적 항체를 포함하는 조성물은 항체가 신체로부터 신속하게 제거되는 것을 보호하는 담체, 예컨대 서방성 제형 또는 코팅과 함께 제조될 수 있다. 이러한 담체는 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템(이들로 한정되지 않음)과 같은 조절 방출식 제형, 및 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산, 및 당업자에게 공지된 다른 것들(이들로 한정되지 않음)과 같은 생분해성 생체적합성 중합체를 포함한다.
TNFR2에 결합하는 항체를 사용하는 치료 방법이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 본 개시의 항체는 TNFR2의 부적절한 발현을 수반하는 질환을 가진 환자에게 투여되며, 상기 질환은 본 개시의 맥락에서, 예를 들어 존재하는 단백질의 양 또는 돌연변이체 단백질의 존재에 있어서의 변화(예를 들어, 통계적으로 유의한 증가 또는 감소)로 인한 비정상적인 TNFR2의 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질환 및 장애를 포함하는 것을 의미한다. 과잉(overabundance)는 분자 수준에서의 과발현, 작용 부위에서의 장기간 또는 축적된 출현, 또는 정상적으로 검출 가능한 활성에 비해 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로) 증가된 TNFR2의 활성을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 임의의 원인으로 인한 것일 수 있다. 이러한 TNFR2의 과잉은 TNFR2 신호전달 이벤트의 정상적인 발현, 출현, 또는 활성에 대해 측정될 수 있고, 상기 측정은 본원에 기술된 항체의 개발 및/또는 임상 시험에서 중요한 역할을 할 수 있다.
특히, 본 항체는 TNFR2의 발현 또는 과발현과 관련된 암을 포함하여, 다양한 암의 치료에 유용하다. 예를 들어, 소정의 구현예는 본원에 개시된 TNFR2-특이적 항체의 치료적 유효량을 암환자에게 투여함으로써, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 모양성 세포 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, 췌장, 결장, 위장, 전립선, 방광, 신장, 난소, 자궁경부, 유방, 폐, 비인두의 암종, 및 악성 흑색종을 포함하되 이들로 한정되지 않는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 투여 후, 암의 진행 및/또는 전이를 (당업자가 알 수 있는 적절한 대조군에 비해) 통계적으로 유의한 방식으로 억제, 예방, 또는 지연시키는 양은 효과적인 것으로 간주된다.
일부 구현예는 본원에 개시된 TNFR2-특이적 항체의 치료적 유효량(예를 들어, 투여 후 당업자가 알 수 있는 적절한 대조군에 비해 통계적으로 유의한 방식으로 암의 전이를 엊게, 예방, 또는 지연하는 양)을 암환자에게 투여함으로써, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, 췌장, 결장, 위장, 전립선, 방광, 신장, 난소, 자궁경부, 유방, 폐, 비인두의 암종, 및 악성 흑색종을 포함하되 이들로 한정되지 않는 암의 전이를 감소시키거나 예방하는 방법을 제공한다.
일부 구현예는 본원에 개시된 TNFR2-특이적 항체의 치료적 유효량을 암환자에게 투여함으로써, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 모양성 세포 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, 췌장, 결장, 위장, 전립선, 방광, 신장, 난소, 자궁경부, 유방, 폐, 비인두의 암종, 및 악성 흑색종을 포함하되 이들로 한정되지 않는 암을 예방하는 방법을 제공한다.
일부 구현예는 본원에 개시된 TNFR2-특이적 항체의 치료적 유효량을 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 모양성 세포 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, 췌장, 결장, 위장, 전립선, 방광, 신장, 난소, 자궁경부, 유방, 폐, 비인두의 암종, 또는 악성 흑색종 중 하나 이상에 걸린 환자에게 투여함으로써, 이러한 질환을 치료, 예방, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 항-TNFR2 항체는 결합된 항원의 구조, 예를 들어 입체 에피토프를 결정하는 데 사용되며, 그런 다음 이 구조는 예를 들어 화학 모델링 및 SAR 방법을 통해 이러한 구조를 갖거나 이를 모방하는 화합물을 개발하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예는 TNFR2를 발현하는 세포 또는 조직의 존재를 검출하기 위한 진단 응용에 부분적으로 관한 것이다. 따라서, 본 개시는 샘플에서 TNFR2를 검출하는 방법, 예컨대 TNFR2를 발현하는 세포 또는 조직을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 다음을 포함하되 이들로 한정되지 않는 다양한 알려진 검출 포맷으로 적용될 수 있다: 면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC), 인시튜(in situ) 혼성화(ISH), 전체-양 인시튜 혼성화(WISH), 형광 DNA 인시튜 혼성화(FISH), 유세포 계측법, 효소 면역 검정(EIA), 및 효소 결합 면역 검정(ELISA).
ISH는 표지된 상보적 DNA 또는 RNA 가닥(즉, 일차 결합제)을 사용하여 세포 또는 조직의 일부 또는 절편에서, 또는 조직이 충분히 작은 경우 전체 조직(전체 마운트 ISH)에서 특이적 DNA 또는 RNA 서열을 국소화(인시튜)하는 일종의 혼성화이다. 당업자는 ISH가 항체를 일차 결합제로서 사용하여 단백질을 조직 절편에서 국소화하는 면역조직화학과 구별되는 것을 이해할 것이다. DNA ISH는 염색체의 구조를 결정하기 위해 게놈 DNA에 사용될 수 있다. 형광 DNA ISH(FISH)는, 예를 들어, 염색체 무결성을 평가하기 위한 의학적 진단에 사용될 수 있다. RNA ISH(혼성화 조직화학)는 조직 절편 또는 전체 마운트 내에서 mRNA 및 다른 전사물을 측정하고 국소화하는데 사용된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있는 검출 가능한 표지에 접합된다. 이와 관련하여, 항체 “접합체”는 검출 가능한 표지에 공유 결합되는 항-TNFR2 항체를 지칭한다. 본 개시에서, DNA 프로브, RNA 프로브, 단클론 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 항체 유도체, 예컨대 단쇄-가변-단편 항체 또는 에피토프 태그된 항체는 모두 검출 가능한 표지에 공유 결합될 수 있다. “직접 검출”에서, 단 하나의 검출 가능한 항체, 즉 일차 검출 가능한 항체가 사용된다. 따라서, 직접 검출은 검출 가능한 표지에 접합된 항체가 제2 항체(이차 항체)를 첨가할 필요 없이 그 자체로 검출될 수 있음을 의미한다.
“검출 가능한 표지”는 샘플에서 표지의 존재 및/또는 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 (예컨대, 시각적으로, 전자적으로, 또는 달리) 생성할 수 있는 분자 또는 물질이다. 항체에 접합될 때, 검출 가능한 표지는 특이적 항체가 유도되는 표적을 찾고/찾거나 정량화하는 데 사용될 수 있다. 이에 의해, 검출 가능한 표지에 의해 생성된 신호를 검출함으로써 샘플 내 표적의 존재 및/또는 농도를 검출할 수 있다. 검출 가능한 표지는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있고, 상이한 특이적 항체에 접합된 몇몇 상이한 검출 가능한 표지가 하나 이상의 표적을 검출하기 위해 조합하여 사용될 수 있다.
직접적으로 검출될 수 있는 검출 가능한 표지의 예는 형광 염료 및 방사성 물질 및 금속 입자를 포함한다. 대조적으로, 간접 검출은 일차 항체의 적용 후에 하나 이상의 추가 항체, 즉 이차 항체의 적용을 필요로 한다. 따라서, 검출은 이차 항체의 결합 또는 일차 검출 가능 항체에 대한 결합제의 결합을 검출함으로써 수행된다. 추가의 또는 이차 결합제 또는 항체의 첨가를 필요로 하는 일차 검출 가능한 결합제 또는 항체의 예는 효소 검출 가능한 결합제 및 합텐 검출 가능한 결합제 또는 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 검출 가능한 표지는 제1 결합제(예를 들어, ISH, WISH, 또는 FISH 공정)를 포함하는 핵산 중합체에 접합된다. 소정의 구현예에서, 검출 가능한 표지는 (예를 들어, IHC 공정에서) 제1 결합제를 포함하는 항체에 접합된다.
본 개시의 방법에 사용되는 항체에 접합될 수 있는 검출 가능한 표지의 예는 형광 표지, 효소 표지, 방사성 동위원소, 화학발광 표지, 전기화학발광 표지, 생물발광 표지, 중합체, 중합체 입자, 금속 입자, 합텐, 및 염료를 포함한다.
형광 표지의 예는 다음을 포함한다: 5-(및 6)-카복시플루오레세인, 5- 또는 6-카복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-(및 6)-카복스아미도 헥사논산, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 테트라메틸로다민, 및 Cy2, Cy3, 및 Cy5와 같은 염료, AMCA를 포함하는 임의 치환된 쿠마린, PerCP, R-피코에리트린(RPE) 및 알로피코에리트린(APC)을 포함하는 피코빌리단백질, 텍사스 레드, 프린스턴 레드, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 이의 유사체, 및 R-피코에리트린 또는 알로피코에리트린의 접합체, 코팅된 CdSe 나노결정자와 같은 반도체 물질에 기초한 입자와 같은 무기 형광 표지.
중합체 입자 표지의 예는 형광 염료와 함께 포매될 수 있는 폴리스티렌의 마이크로 입자 또는 라텍스 입자, PMMA, 또는 실리카; 또는 염료, 효소, 또는 기질을 함유하는 중합체 미셀 또는 캡슐을 포함한다.
금속 입자 표지의 예는 금 입자 및 코팅된 금 입자를 포함하며, 이는 은 얼룩으로 변환될 수 있다. 합텐의 예는 DNP, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 비오틴, 및 디곡시게닌을 포함한다. 효소 표지의 예는 서양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리 인산분해효소(ALP 또는 AP), β-갈락토시다아제(GAL), 포도당-6-인산 탈수소효소, β-N-아세틸글루코사미미다아제, β-글루쿠로니다아제, 인버타아제, 크산틴 옥시다아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 및 포도당 옥시다아제(GO)를 포함한다. 서양고추냉이 과산화효소에 일반적으로 사용되는 기질의 예는 다음을 포함한다: 3,3’-디아미노벤지딘(DAB), 니켈이 강화된 디아미노벤지딘, 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC), 벤지딘 디하이드로클로라이드(BDHC), 행커-예이츠 시약(HYR), 인도판 블루(IB), 테트라메틸벤지딘(TMB), 4-클로로-1-나프톨(CN), 알파-나프톨 피로닌(.알파.-NP), o-디아니시딘(OD), 5-브로모-4-클로로-3-인도릴포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸륨(NBT), 2-(p-요오드페닐)-3-p-니트로페닐-l-5-페닐 테트라졸륨 클로라이드(INT), 테트라니트로 블루 테트라졸륨(TNBT), 5-브로모-4-클로로-3-인독실-베타-D-갈락토시다아제/페로-페리시아니드(BCIG/FF).
알칼리 포스파타아제에 일반적으로 사용되는 기질의 예는 다음을 포함한다: 나프톨-AS-B 1-포스페이트/패스트 레드 TR (NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR (NAMP/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/-패스트 레드 TR (NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR (NAMP/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/뉴 푹신 (NABP/NF), 브로모클로로인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨(BCIP/NBT), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-- d-갈락토피라노시드(BCIG).
발광 표지의 예는 루미놀, 이소루미놀, 아크리디늄 에스테르, 1,2-디옥세탄, 및 피리도피리다진을 포함한다. 전기화학발광 표지의 예는 루테늄 유도체를 포함한다. 방사성 표지의 예는 요오드화물, 코발트, 셀레늄, 트리튬, 탄소, 황, 및 인의 방사성 동위원소를 포함한다.
검출 가능한 표지는 본원에 기술된 항체에 연결되거나, 항체, 핵산 프로브, 또는 중합체와 같은 관심 생물학적 마커에 특이적으로 결합하는 임의의 다른 분자에 연결될 수 있다. 또한, 당업자는 검출 가능한 표지가 또한 제2 및/또는 제3, 및/또는 제4, 및/또는 제5 결합제 또는 항체 등에도 접합될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 관심 생물학적 마커를 특성화하는 데 사용되는 각각의 추가 결합제 또는 항체가 신호 증폭 단계의 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 생물학적 마커는, 예를 들어, 광학 현미경, 형광 현미경을 사용하거나, 검출 가능한 물질이 예를 들어 염료, 콜로이드성 금 입자, 발광 시약인 경우 전자 현미경을 사용하여 시각적으로 검출될 수 있다. 생물학적 마커에 결합된 시각적으로 검출 가능한 물질은 분광광도계를 사용하여 검출할 수도 있다. 검출 가능한 물질이 방사성 동위원소인 경우, 검출은 자가 방사선 촬영에 의해 가시적으로 이루어지거나, 섬광 계수기를 사용하여 비시각적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, Larsson의 문헌[1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.)]; John D. Pound (ed.)의 문헌[Methods in Molecular Biology, vol. 80 1998, Humana Press, Totowa, N.J.]을 참조한다.
본 개시는, 샘플에서 TNFR2 또는 TNFR2를 발현하는 세포 또는 조직을 검출하기 위한 키트를 추가로 제공하며, 여기서 키트는 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유한다. 소정의 구현예에서, 키트는 본 개시의 항체가 부착되는 완충제, 효소, 표지, 기질, 비드, 또는 기타 표면, 및 사용 지침을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1
면역화 및 일차 스크리닝
스크리닝을 위한 항체를 제조하기 위해, 4마리의 뉴질랜드 흰토끼를 면역화하고, 이어서 인간 293-TNFR2 과발현 세포 또는 인간 TNFR2-Fc 융합 단백질로 부스팅하였다. 모든 토끼는 인간 TNFR2에 특이적인 혈청 역가를 가졌으며, 이들은 APXiMAB™ 기술을 사용해 하이브리도마를 생성하고, B 세포 배양 방법(RevMAb)에 의한 항체를 생성하는 데 사용하였다. 일차 스크리닝 시, CHO-TNFR2 과발현 세포에 결합된 460개의 항체를 식별하였다. 잠재적 리드 후보를 식별하기 위한 스크리닝 방법은 도 2에 도시되어 있다.
그런 다음, 하이브리도마와 B 세포 배양물로부터의 상청액을 사용하여, ELISA-기반 수용체-리간드 결합 검정에서 TNF-α가 가용성 TNFR2-His(Sino Biological; 10417-H08H)에 결합하는 것을 차단할 수 있는 항체를 스크리닝하였다. 식별된 460개의 항체 가운데, 173개는 최대 결합의 75%를 초과하는 수준에서 TNFR2에 대한 TNF-α 결합의 억제를 나타냈다.
110개의 항체를 선택하여 인간 IgG 키메라 단계로 이동하였다. B 세포 클로닝으로부터 진행된 110개의 항체 중, 28개의 클론은 증폭시키지 못했다. 82개의 나머지 클론의 중쇄 및 경쇄를 증폭시키고 인간 IgG1 백본 상에 직접 클로닝하였다. 82개의 키메라 항체를 발현시키고, 세포 기반 TNFR2에 대한 결합에서 양성으로 시험된 상청액을 시퀀싱하였다. 초기 스크리닝 깔때기를 통과한 하이브리도마로부터 식별된 10개의 모든 항체를 키메라화하고, 시퀀싱하고, 계속 진행하였다.
서열 분석(고유성 및 제한된 잠재적 발달 가능성, 예컨대 글리코실화, 탈아민화 등; 및 CDR3 길이)을 사용하여 추가 연구를 위한 25개의 항체를 B 세포 배양물로부터 선택하였다. 모든 10개의 하이브리도마 클론을 서열 분석과는 독립적으로 진행시켰다. 하이브리도마 유래의 2세트의 클론은 요약 표(표 E1)에서 별표와 해시태그로 표시된 것과 같이 동일한 서열을 가졌다(8G11.5 = 37D1.4 및 28B7.3 = 37H4.1). 재조합 키메라 항체를 발현시키기 위해, 중쇄(H) 및 경쇄(L) 플라스미드를 293개의 세포 내로 공동 형질감염시키고, 7~10일 후에 상청액을 수확하였다. 항체를 단백질 A 컬럼을 통해 정제하고 PBS에 대해 투석하였다.
인간 키메라 항체의 시험관 내 특성 분석. 키메라 항체를 가용성 및 세포 발현 인간 TNFR2, 가용성 시노몰구스 및 마우스 TNFR2에 대한 결합, 및 ELISA-기반 TNF-α 차단에 대해 스크리닝하였다. 도 3a~3d의 데이터 세트는 제1 항체 세트를 도시하고, 도 4a~4d의 데이터 세트는 제2 항체 세트를 도시한다. 또한, PLAD 또는 CRD1 도메인 유래의 펩티드(aa 17-54; TCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCD), CRD2 도메인 유래의 펩티드(aa 58~93; DSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQN), CRD3 도메인 유래의 펩티드(aa 106~133; LSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTE 및 aa 114~133; LCAPLRKCRPGFGVARPGTE), 및 CRD4 도메인 유래의 펩티드(펩티드 5; aa 146~174; 및 TFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNAS)를 사용하는 예비 에피토프 비닝을 위해, 펩티드-결합 ELISA에서 항체를 스크리닝하였다 (데이터 요약은 아래 표 E1 참조).
Figure pct00019
결합 친화도, cyno 교차 반응성, 차단 능력, 및 (표 E1에서 굵은 글씨체로 강조된) 다양한 에피토프 빈을 포착하는 능력에 기초하여 인간화하기 위해 35개의 항체 중 15개를 선택하였다. 인간화된 15개의 클론 중, 3개의 클론은, ELISA에 의하면 TNF-α 결합을 차단하지 않았지만 펩티드 5에 결합하였으며, 이는 TNFR2 삼량체화를 차단함으로써 세포 표면 상에서 TNF-α를 차단하는 것으로 가정하였다. 서열이 동일하고, 시노몰구스 또는 인간 TNFR2에 강력하게 결합하지 않거나 TNF-α 결합을 차단하지 않은 클론은 선택에서 해제하였다.
독점적인 돌연변이 계통 안내(Mutational Lineage Guided, MLG) 기술을 사용하여 인간 IgG1 프레임워크 상에서 항체를 인간화하였다. ELISA에 의하면 15개의 항체 중 하나는 항원에 대한 결합을 상실하였고 복구할 수 없었다. 다른 14개의 항체를 가용성 인간 TNFR1 및 TNFR2 결합, 세포 기반 TNFR2 결합, cyno TNFR2 결합, 및 ELISA 및 FACS 둘 다에 의한 TNF-α 차단에 대해 스크리닝하였다(도 5 내지 8 참조). 키메라 단계에서 펩티드 5에 결합하고 TNF-α를 차단하지 않은 항체는 세포 기반 ELISA에 의하면 TNF-α 결합을 차단하지 않았으므로, 이를 선택에서 해제하였다. 강한 세포 기반 TNFR2 결합을 유지하는 항체를 Promega ADCC Jurkat NFAT 리포터 키트를 사용하여 TNFR2 과발현 CHO 세포주의 ADCC에 대해 시험하였다(도 9a~9b). 인간화 후보물질의 특성은 아래 표 E2에 나타나 있다. (굵은 글씨체로 강조 표시한) 5개의 리드 후보는 원하는 기준을 충족시켰다.
Figure pct00020
리드 후보 및 백업의 선택 CLD에 앞서, 2개의 리드 후보를 선택하는 데 도움을 주기 위해 TNFR 계열 구성원 특이성, 사이토카인 방출 검정, 및 개발 가능성 분석과 함께 과발현 세포주에 대한 ADCC 검정을 완료하였다. 아래 표 E3은 인간화율 분석을 보여준다.
실시예 2
클론 h600-25-71 및 h600-25-108의 결합 및 활성 특성
인간화 클론 h600-25-71 및 h600-25-108을 결합 및 활성 특성에 대해 시험하였다. TNFR 계열 구성원에 대한 결합을 시험하기 위해, 표적 단백질을 4℃에서 1 μg/mL로 밤새 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 차단하고, RT에서 1시간 동안 항체를 표시된 농도로 첨가하였다. 각각의 단백질에 대한 양성 대조군 항체를 약 1 ug/mL로 사용하였다. 항체를 세척하고 항-인간 IgG HRP로 1시간 동안 검출하였다. TMB 기질을 사용하여 10분 동안 검정을 개발하였다. 세포 결합을 위해, 연막(buffy coat)로부터 정제한 인간 CD4+ T 세포를 항-CD3/CD28과 함께 평평한 바닥 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하고 생존력, CD4, CD25, 및 FOXP3에 대해 염색하였다. 항-인간 IgG APC를 사용하여 시험 항체 염색을 검출하였다. CD4+CD25hiFOXP3+ 조절 T 세포를 이용해 시험 항체의 결합 적정을 평가하고 결합 백분율로서 도표화하였다.
도 10a~10f의 결과는, 25~71 및 25~108이 인간 TNFR2 단백질(10c), 시노몰구스 TNFR2 단백질(10d), 세포 발현 인간 TNFR2(10e), 및 활성화된 인간 Tregs(10f)를 포함하여 TNFR2에 높은 친화도로 결합함을 보여준다. 도 11a~11e의 결과는 25~71 및 25~108이 TNFR2에 특이적이고, TNFR1, HVEM, CD40, DR6, 또는 OPG에 결합하지 않음을 보여준다. IgG 이소형 대조군은 삼각형으로 표시되어 있고, 양성 대조군은 별표로 표시되어 있다.
항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)을 통해 TNFR2-발현 세포에 대한 항체의 효과를 시험하기 위해, ADCC 검정을 전술한 바와 같이 수행하였다. 도 12a~12b에 도시된 바와 같이, 25~71 및 25~108은 종양 세포(12b)를 포함하여 TNFR2-발현 세포에 대해 ADCC를 유도하였다.
Treg에 대한 항체의 효과를 시험하기 위해, PBMC를 백혈구 환원 챔버로부터 단리하였다. 37℃의 가습된 5% CO2 인큐베이터 내의 96-웰 평평한 바닥 플레이트에서, 2x105개의 PBMC를 0.1 μg/mL 항-CD3(클론: OKT3)으로 자극하고, 16~24시간 동안 항-TNFR2 항체로 처리하였다. 세포를 완전한 RPMI(10% 열불활성화 FBS, 1X 페니실린-스트렙토마이신, 1 mM 피루브산나트륨, 1X MEM 비필수 아미노산, 50mM β-메르캅토에탄올)에서 배양하였다. 세포를 수확하고, 유세포 계측에 의해 CD4 Treg를 CD4+ CD25hi FoxP3+로서 식별하였다. 도 13a~13b에 도시된 바와 같이, 25~71 및 25~108은 인간 PBMC로부터 Treg를 고갈시켰다. 두 그래프 모두 5개의 공여자의 평균을 나타내며, 여기서 각각의 조건을 2회 수행하였다. 고갈율(%) = 100 * (결실 없음*- 실험)/(결실 없음) 여기서 고갈 없음은 항-CD3만으로 자극된 PBMC를 지칭한다.
TNFR2-발현 종양 세포의 대식세포-매개 항체-의존적 세포 식균작용(ADCP)에 항체가 미치는 효과를 시험하기 위해(도 14a 참조), 5% CO2가 포함된 37℃ 인큐베이터에서 6일 동안 인간 CD14+ 단핵구를 10 μg/mL M-CSF와 함께 배양하여 대식세포를 생산하였다. 생성된 대식세포를 TNFR2-과발현 CHO 세포(표적)와 함께 CellTrace CFSE 및 Violet으로 각각 표지하였다. 표적 세포를 항-TNFR2 항체 또는 이소형 대조군과 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 표지된 세포를 낮은 인간 IgG 혈청가 포함된 RPMI에서 100,000개의 대식세포 대 50,000개의 표적 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 세포를 Cytoflex LX 유세포 계측기를 사용하여 분석하였다. 도 14b에 도시된 바와 같이, 25~71 및 25~108은 TNFR2+ 세포의 대식세포 매개 ADCP를 유도하였다. 식균작용 백분율을 다음과 같이 계산하였다: ((이중 양성 세포(%))/(총 표적 세포(%))*100).
CD8 T 세포의 골수 유래 억제 세포(MDSC) 억제에 항체가 미치는 효과를 시험하기 위해, 7일 동안 786-O 종양 세포주와 인간 PBMC를 공동 배양하여 MDSC를 생성하였다. CD33+ MDSC를 마이크로비드(Miltenyi)를 사용하여 양성 선별에 의해 단리하였다. 자가 CD8 T 세포를 세포 트레이스 바이올렛(cell trace violet)으로 표지하고, CD3/CD28로 자극하면서 MDSC와 4:1의 비율로 3일 동안 공동 배양하였다. 3일 후, 생존력 염료로 세포를 표지하고, 바이올렛 염료 희석을 사용하여 CD8 T 세포 증식을 측정하였다. 도 15a의 실험 개요를 참조한다.
도 15b~15c에 도시된 바와 같이, 25~71 및 25~108은 CD8 T 세포의 MDSC 억제를 유의하게 감소시켰다. 억제 백분율은 다음과 같이 계산하였다: [T 세포 단독 - (T + MDSC)]/T 단독 X 100. 데이터는 평균 +/- SEM으로서 도표화되어 있다. IgG1 이소형은 검은색 막대, 25~71은 회색 막대, 25~108은 흰색 막대를 사용해 도표화되어 있다. 통계는 ANOVA 및 * = P<0.01 및 **=P<0.001을 사용하여 생성하였다.
조절 T 세포에 항체가 미치는 효과를 추가로 시험하기 위해, 자기 비드(Miltenyi)를 사용하는 음성 선택에 의해 건강한 인간 연막 유래의 PBMC로부터 CD4 T 세포를 단리하였다. CD25+ Treg를 제조자 프로토콜(Miltenyi)에 따라 CD25 자성 비드를 사용하여 고갈시키고, 생성된 CD4 세포(T 반응 세포)를 검정 설정 시까지 동결 보존하였다. 자가 공여자 유래의 Treg를 제조자 프로토콜에 따라 Treg 익스팬더 비드(DynaBeads) 및 100nM 라파마이신을 사용하여 단리하고 15일 동안 증식시켰다. 검정 설정 전날에, T 반응 세포를 해동하고 밤새 방치시켰다. 다음 날, T 반응 세포를 세포 트레이스 바이올렛으로 표지하고, 둥근 바닥 플레이트에서 10 ug/mL의 25~71 또는 이소형 대조군과 함께 표시된 비율로 Treg에 첨가하였다. Treg 검사 비드(Miltenyi)를 첨가하고, 검정물을 5일 동안 인큐베이션하였다. 세포를 5일차에 수확하고, 생존력 염료로 염색하고, MACSQuant 분석기를 이용해 분석하였다. T 세포 억제 백분율을 다음과 같이 계산하였다: (자극된 T 반응 세포 단독의 증식 - 시험 값의 증식)/(자극된 T 반응 세포 단독). 실험은 적어도 4개의 공여자를 대상으로 수행하였다. 도 18a~18e에 도시된 바와 같이, 클론 25~71은 효과기 T 세포의 Treg 억제를 역전시킨다.
전술한 실험으로부터의 결합 친화도(KD) 및 EC50 값은 아래 표 E4에 요약되어 있다.
Figure pct00021
마우스에서 항체의 효과를 시험하기 위해, 암컷 누드 마우스에게 Colo205 종양 세포를 SQ로 주사하였다. 100 mm3의 종양 부피에서, 도 19a에 표시된 바와 같이 마우스를 치료하였다. 대조군 대비 항체 25~71에서 유의한 항종양 효과(48% TGI)가 관찰되었다(도 19b 참조). 대조군 대비 치료군에서 체중의 변화는 관찰되지 않았다(도 19c 참조).
실시예 3
클론 25~71에 대한 에피토프 부위의 식별
TNFR2/25~71 복합체의 에피토프를 고 해상도로 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
먼저, TNFR2 단독 및 클론 25~71 단독의 샘플에 대해 고 질량 MALDI 분석을 수행하여 무결성 및 응집 수준을 확인하였다. 측정은, 나노-몰의 민감도로 최대 2Mda까지 검출을 최적화하도록 설계된 검출 시스템이 포함된 HM4 상호작용 모듈(CovalX)이 구비된 Autoflex II MALDI ToF 질량 분광계(Bruker)를 사용하여 수행하였다. TNFR2 샘플 분말을 1 mg/ml의 농도에 도달하도록 증류수로 용해시키고, TNFR2 및 클론 25~71의 각 단백질 샘플 20 μl를 피펫팅하여 최종 부피가 10 μl인 8개의 희석액을 제조하였다. 그런 다음, 각각의 희석물 1 μl를 아세토니트릴/물(1:1, v/v), TFA 0.1%(K200 MALDI 키트) 중 재결정화된 시나핀산 매트릭스(10 mg/ml)로 구성된 1 μl의 매트릭스와 혼합하였다. 혼합 후, 각각의 샘플 1 μl를 MALDI 플레이트(SCOUT 384) 상에 점적하였다. 실온에서 결정화한 후, 플레이트를 MALDI 질량 분광계에 도입하고, 고 질량 MALDI 모드에서 즉시 분석하였다.
가교 결합 실험 가교 결합 실험은 고 질량 MALDI 질량 분광분석에 의해 비공유 상호작용의 직접 분석을 가능하게 한다. 비공유 상호작용을 함유하는 단백질 샘플을 가교 결합 혼합물(Bich 등의 문헌[Anal. Chem. 82 (1), pp 172-179, 2010])과 혼합함으로써, 고 민감도로 비공유 복합체를 특이적으로 검출하는 것이 가능하다. 생성된 공유 결합은 상호작용 종이 샘플 제조 공정 및 MALDI 이온화에서 생존할 수 있게 한다. 고 질량 검출 시스템은 고 질량 범위에서 상호작용을 특성화할 수 있게 한다.
대조군 실험을 위해 제조된 각각의 혼합물(좌측 9 μl)을 K200 MALDI MS 분석 키트(CovalX)를 사용하는 가교 결합에 투입하였다. 9 μl의 혼합물(1에서 1/128까지)을 1 μl의 K200 안정화제 시약(2 mg/ml)과 혼합하고 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간(180분) 후, MALDI 분석을 위해 대조군 실험에서와 같이 샘플을 제작하였다. 결정화 직후, 표준 질소 레이저가 구비된 HM4 상호작용 모듈(CovalX)을 사용하여, 0 내지 1500 kDa의 상이한 질량 범위에 초점을 맞추어 고 질량 MALDI 분석에 의해 샘플을 분석하였다.
결과. 고 질량 MALDI 질량 분광분석 및 화학적 가교 분석은 클론 25~71의 비공유 응집체 또는 TNFR2의 다량체를 검출하지 않았다.
그런 다음, HM4 상호작용 모듈(CovalX)이 구비된 Autoflex II MALDI ToF 질량 분광계(Bruker)를 사용하여 TNFR2/25~71의 복합체를 특성화하였다. TNFR2/25~71의 10 μl 혼합물을 1.25 μM/0.5 μM의 각각의 농도로 제조하였다. 혼합물 1 μl를 아세토니트릴/물(1:1, v/v), TFA 0.1%(K200 MALDI 키트) 중 재결정화된 시나핀산 매트릭스(10 mg/ml)로 구성된 1 μl의 매트릭스와 혼합하였다. 혼합 후, 각각의 샘플 1 μl를 MALDI 플레이트(SCOUT 384) 상에 점적하였다. 실온에서 결정화한 후, 플레이트를 MALDI 질량 분광계에 도입하고, 즉시 분석하였다.
가교 결합 실험. 대조군 실험을 위해 제조된 혼합물(좌측 9 μl)을 K200 MALDI MS 분석 키트(CovalX)를 사용하는 가교 결합에 투입하였다. 9 μl의 혼합물을 1 μl의 K200 안정화제 시약(2 mg/ml)과 혼합하고 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간(180분) 후, MALDI 분석을 위해 대조군 실험에서와 같이 샘플을 제작하였다. 샘플은 결정화 직후 고 질량 MALDI 분석에 의해 분석하였다.
MALDI ToF MS 분석은 표준 질소 레이저가 구비된 HM4 상호작용 모듈(CovalX)을 사용하여 0 내지 1500 kDa의 상이한 질량 범위에 초점을 맞추어 수행하였다.
결과. 대조군 실험을 위해, TNFR2 및 클론 25~71을 MH+=37.179 kDa 및 MH+=147.708 kDa로 검출하였다. 가교 결합 후, 2개의 추가 피크를 MH+=189.401 kDa 및 MH+=228.341 kDa로 검출하였다. Complex Tracker 소프트웨어를 사용하여 대조군 및 가교 결합 스펙트럼을 중첩시켰는데, 이를 통해 2개의 비공유 단백질 복합체를 MH+=186.113 kDa 및 MH+=224.384 kDa로 검출하였다.
에피토프 결정을 위해, 먼저 TNFR2를 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타아제, 및 써모리신으로 단백질 분해하고, 이어서 nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 분석을 수행하였다. 조합된 펩티드 맵핑을 통해 TNFR2 서열의 약 94.57%의 커버리지를 확인하였다(데이터 미도시).
TNFR2/25~71 복합체의 에피토프를 고 해상도로 결정하기 위해, 복합체를 중수소화된 가교제와 함께 인큐베이션하고, 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타아제, 및 써모리신에 의해 다효소 절단하였다. 가교 결합된 펩티드를 농축시킨 후, 고해상도 질량 분광분석법(nLC-LTQ-Orbitrap MS)에 의해 샘플을 분석하고, 생성된 데이터를 XQuest 및 Stavrox 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
환원 알킬화. 20 μL의 TNFR2/클론 25~71 혼합물을 실온에서 180분 인큐베이션 시간 동안 2 μL의 DSS d0/d12(2 mg/mL; DMF)와 혼합하였다. 인큐베이션 후, 1 μL의 중탄산암모늄(20 mM 최종 농도)을 첨가하여 반응을 중단시킨 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 그런 다음, Speedvac을 사용하여 용액을 건조시킨 후, H2O 8M 우레아 현탁액(20 μL)에 현탁하였다. 혼합 후, 2 μl의 DTT(500 mM)를 용액에 첨가하였다. 그런 다음, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 2 μl의 요오드아세트아미드(1 M)를 첨가한 후, 실온의 암실에서 1시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 80 μl의 단백질 분해 완충액을 첨가하였다. 트립신 완충액은 50mM Ambic pH 8.5, 5% 아세토니트릴을 함유하였고, 키모트립신 완충액은 트리스 HCl 100mM, CaCl2 10mM pH 7.8을 함유하였고, ASP-N 완충액은 인산염 완충액 50MM pH 7.8을 함유하였고, 엘라스타아제 완충액은 트리스 HCl 50mM pH 8.0을 함유하였으며, 써모리신 완충액은 트리스 HCl 50mM, CaCl2 0.5 mM pH 9.0 mM을 함유하였다.
트립신 단백질 분해의 경우, 100 μl의 환원/알킬화된 TNFR2/25~71 혼합물을 0.5 μl의 트립신(Promega)과 1/100의 비율로 혼합하고, 단백질 분해 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 키모트립신 단백질 분해의 경우, 100 μl의 환원/알킬화된 TNFR2/25~71 혼합물을 0.25 μl의 키모트립신(Promega)과 1/200의 비율로 혼합하고, 단백질 분해 혼합물을 25℃에서 밤새 인큐베이션하였다. ASP-N 단백질 분해의 경우, 100 μl의 환원/알킬화된 TNFR2/25~71 혼합물을 0.25 μl의 ASP-N(Promega)과 1/200의 비율로 혼합하고, 단백질 분해 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 엘라스타아제 단백질 분해의 경우, 100 μl의 환원/알킬화된 TNFR2/25~71 혼합물을 0.5 μl의 엘라스타아제(Promega)와 1/100의 비율로 혼합하고, 단백질 분해 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 써모리신 단백질 분해의 경우, 100 μl의 환원/알킬화된 TNFR2/25~71 혼합물을 1 μl의 써모리신(Promega)과 1/50의 비율로 혼합하고, 단백질 분해 혼합물을 70℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 분해 후, 포름산 1% 최종을 용액에 첨가하였다. 가교 결합된 펩티드를 Xquest 버전 2.0 및 Stavrox 3.6 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
결과. 중수소화된 d0d12와 TNFR2/25~71 복합체의 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타아제, 및 써모리신 단백질분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석을 통해 TNFR2와 클론 25~71 사이에서 12개의 가교 결합된 펩티드를 검출하였다. 화학적 가교 결합, 고 질량 MALDI 질량 분광분석, 및 nLC-Orbitrap 질량 분광분석을 사용하여, TNFR2와 항체 25~71 사이의 분자 계면을 특성화하였다. 이러한 분석의 결과는 도 16 및 도 17a~17j에 도시되어 있으며, TNFR2/25~71 상호작용이 전장 인간 TNFR2의 다음 잔기; R43, Y45, T49, S55, K56, T73, 및 S77를 포함하거나; 성숙한 인간 TNFR2의 다음 잔기; R21, Y23, T27, S33, K34, T51, 및 S55를 포함함을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Apexigen, Inc. Filbert, Erin L. Krishnan, Sushma Tan, Christine Bahjat, Rena Dong, Xiaodong Alvarado, Ryan <120> ANTI-TNFR2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> APEX-025/04WO <150> US 62/901,364 <151> 2019-09-17 <150> US 62/985,509 <151> 2020-03-05 <150> US 63/047,824 <151> 2020-07-02 <150> US 63/058,016 <151> 2020-07-29 <160> 329 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Heavy CDR1 <400> 1 Ser Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Heavy CDR2 <400> 2 Phe Ile Ser Ser Ser Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Heavy CDR3 <400> 3 Glu Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Asp Tyr Thr Gly Ile Phe Asn Leu 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light CDR1 <400> 4 Gln Ala Thr Glu Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - 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heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 142 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala 20 25 30 Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Asp Thr Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val His Leu Lys Ile Ala 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Asn Val Gly 85 90 95 Val Arg Met Tyr Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 143 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 143 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Phe Ile Asp Thr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ala 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Asn Val Gly 85 90 95 Ala Arg Met Tyr Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 144 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 144 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Trp Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Gly Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg 85 90 95 Tyr Val Gly Ser Ser Tyr Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 145 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 145 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Asp Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ala Ser Pro Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Asn Val 85 90 95 Gly Ala Arg Met Tyr Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 146 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 146 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Asp Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Pro 85 90 95 Asp Tyr Asp Gly Tyr Ala Gly Tyr Gly Tyr Gly Asp Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 147 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 147 Gln Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Leu Val Lys 1 5 10 15 Pro Gly Gly Ser Leu Glu Leu Cys Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser His Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Phe Ala Gly Ser Ala Gly Ser Thr Tyr 50 55 60 Tyr Ala Thr Trp Val Ser Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Ile Asp 65 70 75 80 Gln Asn Thr Gly Cys Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr 85 90 95 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Thr Asn Thr Ala Tyr Asp Pro 100 105 110 Phe Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 148 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 148 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Asn Gly 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Gly Ile Asn Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Met Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Lys Thr Ser 85 90 95 Gly Ile Asn Val Tyr Asn Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 149 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 149 Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Glu Ala Gly Asp Ser Glu Ser Asn Tyr Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Gln Met Thr Thr Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Thr Tyr Asp Thr Phe Gly Tyr Gly Asp Tyr Val Tyr 100 105 110 Thr Thr Pro Ala Ser Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser 130 <210> 150 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 150 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Phe Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser His Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asp Ala Gly Tyr Asp Gly Tyr Gly Tyr Gly Thr Asp 100 105 110 Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 151 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 151 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Val Asn Val Asn Ser 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Asp Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Gly Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ser Thr Asn Leu Asn Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Arg Asn Thr Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Val Tyr Gly 100 105 110 Gly Ala Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 152 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 152 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser His Tyr 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Ser Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Arg Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys Ala Arg Tyr 85 90 95 Asn Tyr Asp Asp Asp Gly Glu Leu Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 153 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 153 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Asn Gly 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Gly Ile Asn Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Met Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Lys Thr Ser 85 90 95 Gly Ile Asn Val Tyr Asn Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 154 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 154 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser His Tyr 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Val Ile Thr Ser Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Arg Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr 85 90 95 Asn Tyr Asp Asp Asp Gly Glu Leu Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 155 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 155 Gln Gln Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Thr Val Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Asn Asn 20 25 30 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Cys Ile Tyr Pro Ser Ile Val Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Glu Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Val Arg Asp Arg Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asn Leu Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 156 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 156 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Thr 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Phe Ile Ser Ser Ser Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp 85 90 95 Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Asp Tyr Thr Gly Ile Phe Asn Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 157 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 157 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly 20 25 30 Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Thr Ser Trp Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Val Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Ser 85 90 95 Tyr Tyr His Ser Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 158 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 158 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile His Ser Asp Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Leu Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ala 65 70 75 80 Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly 85 90 95 Tyr Pro Gly Tyr Tyr Thr Ser Thr Phe Asn Arg Leu Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 159 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 159 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Gly Ser Gly Tyr Tyr Pro Asp Val Phe Asn Phe Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 160 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 160 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Glu Leu Cys Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Ser 20 25 30 His Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Cys Ile His Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Ile Asp Gln Ser Thr 65 70 75 80 Gly Cys Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Thr Ala Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Thr Ala Thr Thr Tyr Asp Pro Tyr Tyr Leu 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 161 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 161 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Tyr Gly 20 25 30 Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Gly Ile Asn Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ala Met Val Asp Leu Lys Val Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Val Cys Ala Arg Thr Ser 85 90 95 Gly Asn Asn Val Tyr Asn Tyr Phe Thr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 162 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 162 Gln Ser Val Glu Val Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Tyr 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Ser Val Asp Leu Lys Val Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Thr 85 90 95 Tyr Asp Asp Asp Gly Glu Leu Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 163 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 163 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr 20 25 30 Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile Ala 35 40 45 Cys Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Asn Leu Arg His Ala Gly Tyr Gly Gln Pro Phe Asn Leu Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 164 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - 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heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 168 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser His 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Val Phe Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser His Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Tyr Gly Tyr Gly Thr Asp 100 105 110 Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 169 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 169 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Gly Asn Gly Asp Asp Asp Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Thr Asp Ile His Gly Gly Asn Ser Leu Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 170 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 170 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Gly Asp Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Pro 85 90 95 Asp Tyr Gly Gly Tyr Ala Gly Tyr Gly Tyr Gly Asp Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 171 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 171 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser His Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Val Phe Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser His Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Tyr Gly Tyr Gly Thr Asp 100 105 110 Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 172 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 172 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Tyr Tyr 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr 85 90 95 Ser Tyr Asp Asp Asp Gly Glu Leu Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 173 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 173 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Asp Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Tyr Tyr Thr Tyr Gly Tyr Asn Val Asp Ala Asp Ala Ala Leu 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 174 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 174 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Glu Thr Gly Gly Asn Leu Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Ser Leu Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Tyr 85 90 95 Pro Gly Tyr Tyr Thr His Thr Phe Asn Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 175 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 175 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Asp His Tyr Ala Tyr Gly Tyr Ala Gly Val Ala Tyr Gly 100 105 110 Thr Glu Tyr Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 176 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 176 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr Trp 20 25 30 Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile Ala 35 40 45 Cys Ile Ala Ala Gly Ser Ser Asp Thr Pro Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ile Ala Tyr Ser Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Gly Tyr Gly Ala Phe 100 105 110 Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 177 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 177 Gln Glu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Leu Val 1 5 10 15 Lys Pro Gly Gly Ser Leu Glu Leu Cys Cys Asn Ala Ser Gly Phe Thr 20 25 30 Leu Ser Asn Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Phe Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala 50 55 60 Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Ile 65 70 75 80 Asp Gln Ser Thr Gly Cys Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp 85 90 95 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Ser Ser Thr Ala Tyr Asp 100 105 110 Pro Phe Tyr Phe Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 178 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 178 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Asp 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Trp Ser Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Val Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Val 85 90 95 Gly Tyr Ala Gly Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 179 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 179 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Val Gly Ser Ile Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Tyr Thr Tyr Asp Tyr Gly Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr 100 105 110 Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 180 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 180 Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Phe Asp Ala Ala Ser Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Gln Ala Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Thr Ile Gly Tyr Asp Ala Ala Gly Asp Trp Lys Tyr Ala Phe 100 105 110 Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 181 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 181 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Asn Thr Tyr Asp Asn Thr Ala Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Ser Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Ala Thr Lys Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Val 85 90 95 His Asn Asn Val Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 182 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 182 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Asn Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Tyr Thr Ser Tyr Gly Tyr Asn Val Asp Ala Asp Ala Ala Leu 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 183 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 183 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Ser Tyr Asn 20 25 30 Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Pro Ala Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 His Phe Thr Leu Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Ile Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Arg Asp Ala 85 90 95 Thr Ile Glu Gly Met Ser Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 184 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 184 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Gly His 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Asp Pro Ile Phe His Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser His Ser Ala Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asn Ala Gly Tyr Asp Gly Tyr Gly Tyr Gly Thr Asp 100 105 110 Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 185 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 185 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr Val 65 70 75 80 Ala Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ile Tyr Val Gly Tyr Gly Gly Asn Gly Tyr Ala Asp 100 105 110 Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 186 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 186 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ile Gly Ser Asp Tyr Tyr Ala Phe Phe Asn Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 187 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 187 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Val Asn 20 25 30 Ala Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Asn Ala Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ser Thr Ser Leu Asn Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Arg Leu Thr Val Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Tyr Ala Gly Tyr Thr Gly Tyr Gly Tyr Leu Asn Leu 100 105 110 Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 188 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 188 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Asp Ala Gly Ser Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Tyr Ala Thr Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Ile Ala Thr 100 105 110 Ala Pro Gln Phe Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 189 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 189 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ile Asp 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Gly Gly Asp Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Ser Arg Tyr Thr Gly Tyr Pro Asn Tyr Asp Asp Val 100 105 110 Pro Glu His Phe Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 190 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 190 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Gly Gly Ser Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Pro Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Gly Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ile Gly Val Gly Tyr Gly Gly Asn Gly Tyr Ala Asp Leu 100 105 110 Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 191 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 191 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr Tyr 20 25 30 Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu 65 70 75 80 Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Gly Tyr Gly Tyr Tyr Phe Ser Leu Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 192 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - 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heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 194 Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Thr Ile Asp Pro Asp Tyr Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ile Ser Phe Ala Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Pro Tyr Phe 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 195 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 195 Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Pro Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Ser Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Asp Val Gly Tyr Ala Gly Tyr Ala Tyr Asp Arg Gly Tyr Tyr 100 105 110 Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 196 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 196 Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Pro Asp Tyr Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Asp His Tyr Thr Tyr Gly Asp Ala Gly Tyr Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Ser Ala Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 197 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 197 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Ser Gly Gly Ser Ser Val Tyr Met Asn Phe Phe Thr 100 105 110 Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 198 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 198 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ile Gly Ser Asp Tyr Tyr Ala Phe Phe Asn Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 199 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 199 Leu Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Tyr Ser Gly Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Asn Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Ser Ser Thr Ala Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Tyr Thr Thr Asp Gly Ala Gly Tyr Ala Tyr Gly Thr 100 105 110 Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 200 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 200 Gln Gln Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Pro Asp Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Leu Tyr Thr Ser Gly Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Gly Ala Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 201 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 201 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ile Gly Ser Asp Tyr Tyr Ala Phe Phe Asn Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 202 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 202 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ala Gly Phe Thr Ile Ser Thr Thr 20 25 30 Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Tyr Gly Asn Gly Gly Gly Thr Trp Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Leu Asn Ser Tyr Val Asp Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 203 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 203 Gln Ser Leu Glu Asp Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Tyr 20 25 30 Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala 35 40 45 Cys Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Ala Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln 65 70 75 80 Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg 85 90 95 Asp Arg Asp Gly Gly Ser Met Ser Tyr Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 204 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 204 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Asp 20 25 30 Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Tyr Thr Gly Gly Ile Thr Asn Phe Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ala 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly 85 90 95 Tyr Asp Ser Asp Gly Tyr Val Tyr Pro Asp Ala Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 205 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 205 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ser Ala Ala Tyr Asp Gly Gly Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Gly Tyr Asn Asp Ala Leu Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 206 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 206 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ser Met Arg Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Glu Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Asp Val 85 90 95 Gly Gly Asp Gly Gly Trp Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 207 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 207 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Ile Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ser Arg Arg Thr Asp Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Glu Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Glu Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Asp Val 85 90 95 Gly Gly Asp Gly Gly Trp Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 208 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 208 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asn 20 25 30 Met Gln Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Met Thr Ile Asp Ala Gly Pro Tyr Tyr Ala Ala Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Gly Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Phe Phe Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 209 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 209 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Tyr Ala 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Phe Ile Arg Pro Gly Gly Ser Ala Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Arg Glu Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Tyr Asp 85 90 95 Thr Tyr Gly Tyr Gly Asp Thr Arg Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 210 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 210 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Trp Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Gly Leu Lys 65 70 75 80 Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 85 90 95 Arg Tyr Val Gly Ser Ser Tyr Val Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 211 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 211 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Pro 20 25 30 Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Asn 65 70 75 80 Ser Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Gly Ser 85 90 95 Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 <210> 212 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 212 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Tyr Asn Asp Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp 85 90 95 Asp Ser Tyr Gly Tyr Gly Asp Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 213 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 213 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Val Lys Gly Leu Lys Trp Ile Gly 35 40 45 Phe Ile Asp Val Asp Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Trp Thr Arg Tyr Asp 85 90 95 Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 214 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 214 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Trp Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Gly Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ala Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg 85 90 95 Phe Val Gly Ser Ser Tyr Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 215 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 215 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Trp Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Gly Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg 85 90 95 Phe Val Gly Ser Ser Tyr Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 216 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 216 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Pro Thr Val Asp Leu Glu Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Trp 85 90 95 Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Tyr Arg Ser Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 217 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 217 Gln Ser Val Glu Glu Ser Glu Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Asp Ile Ser Thr Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Ala 65 70 75 80 Ser Leu Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Asp 85 90 95 Tyr Gly Gly Glu Thr Tyr Ala Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 218 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 218 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Pro 20 25 30 Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Asn 65 70 75 80 Ser Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Gly Ser 85 90 95 Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 <210> 219 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 219 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Gly Tyr Asp Ser Asp Ala Tyr Val Tyr Pro Asp Val Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 220 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 220 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Trp Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Gly Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg 85 90 95 Phe Val Gly Ser Ser Tyr Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 221 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 221 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp Glu Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His His 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Gly Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Asp Ala Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ala Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Gly Leu Thr Glu Ser Leu Gly Thr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 222 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 222 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Phe Leu Ser Ser Tyr Glu 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Tyr Thr Asp Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Val Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly His 85 90 95 Pro Asp Tyr Ser Ser Gly Met Val Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 223 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 223 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp Glu Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Arg Ile Asp Ala Asn Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Asp 85 90 95 Phe Glu Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 224 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 224 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ser Met Arg Thr Asp Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Glu Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Asp Val 85 90 95 Gly Gly Asp Gly Gly Trp Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 225 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 225 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Phe 20 25 30 Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Asn Thr Gly Gly Asp Ser Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Thr 85 90 95 Gly Tyr Gly Gly Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Phe Asp Pro Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 226 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 226 Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Asn Thr Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Thr 85 90 95 Gly Tyr Gly Gly Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Phe Asp Pro Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 227 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 227 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser His Val 20 25 30 Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Leu Thr Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly 85 90 95 Tyr Asp Tyr Asp Asp Ser Gly Asp Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asn Ile Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 228 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - heavy chain sequence from rabbit hybridoma <400> 228 Gln Ser Val Ala Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Gly Ser Arg Asp Asn Thr His Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ala 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ile 85 90 95 Tyr Gly Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Tyr Asp Trp Leu Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 229 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 229 Asp Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Gly Gln Ser Ile Asp Ser 20 25 30 Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Ser Phe Tyr Val Thr Ile 85 90 95 Ser Ala Met Val Asp Tyr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys <210> 230 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 230 Ile Glu Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Glu Asp Ile Asp Ser Tyr Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 His Ala Ser Tyr Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Tyr Tyr Ser Ser Ser Ala 85 90 95 Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 <210> 231 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 231 Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Asp Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Tyr Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Phe Tyr Ser Asn Asn 85 90 95 Thr Glu Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 232 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 232 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Tyr Tyr Thr Ser 85 90 95 Ser Asp Asn Tyr Asn Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys <210> 233 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 233 Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Val Lys Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Arg Cys Asp 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Phe Tyr Thr Ser Arg Ser 85 90 95 Asp Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 <210> 234 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 234 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Gly Tyr Tyr Gly Gly Ser 85 90 95 Tyr Ile Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 235 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 235 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Val 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser 85 90 95 Tyr Ile Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 236 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 236 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asp Tyr Asp Asn Asp 85 90 95 Ile Asp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 237 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 237 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Leu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser 85 90 95 Tyr Ile Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 238 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <220> <221> misc_feature <222> (97)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 238 Leu Asp Ile Lys Val Thr Gln Thr Pro Ala Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Ser Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Lys Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Tyr Thr Ser Gly 85 90 95 Xaa Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 239 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 239 Ile Glu Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Ala 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Asp 85 90 95 Asp Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 <210> 240 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 240 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Thr 20 25 30 Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Tyr Tyr Gly Asp 85 90 95 Asn Thr Tyr Asn Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 241 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 241 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn 20 25 30 Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Ser Arg Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Glu Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Tyr Tyr Ser Ser 85 90 95 Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys <210> 242 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 242 Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Glu Pro Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Gly Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Val 35 40 45 Ser Ala Phe Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Val Thr 85 90 95 Tyr Phe Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 243 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 243 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Phe Ser 85 90 95 Asp Asn Gly Cys Tyr Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys <210> 244 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 244 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Asp Ala Asn Asn 20 25 30 Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Leu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp 85 90 95 Ala Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 245 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 245 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Thr 20 25 30 Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Tyr Tyr Gly Asp 85 90 95 Asn Thr Tyr Asn Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 246 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 246 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Asp Ala Asn Asn 20 25 30 Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Tyr Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp 85 90 95 Ala Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 247 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 247 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Val Pro Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asn 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Ser Gly Val Asn 85 90 95 Gly Asn Arg Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Lys <210> 248 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 248 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Thr Glu Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ile Tyr Thr 85 90 95 Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 249 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 249 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn Glu 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Thr Asn Asn 85 90 95 Val Asp Asn Leu Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 250 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 250 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Arg Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Asn 20 25 30 Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Asp Ala Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Val Ser 85 90 95 Ser Tyr Gly Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 251 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 251 Ile Glu Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Ser Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Ala 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Tyr Thr Ser Ser Asn Thr 85 90 95 Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 <210> 252 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 252 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Tyr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Pro Ser 20 25 30 Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Pro Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Ala Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Tyr Gly Asp 85 90 95 Asn Thr Tyr Asn Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 253 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 253 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Asp Val Asp Lys Asn Asn 20 25 30 Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp 85 90 95 Ala Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 254 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 254 Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Val Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Leu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ala Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asp Arg Ser Ser 85 90 95 Thr Asp Met Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 255 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 255 Ile Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Gly Val Gly Asp 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Phe Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Asp 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Tyr Ser Asp Ala 85 90 95 Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 <210> 256 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 256 Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Arg Asn Asn 20 25 30 Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ser 85 90 95 Ser Gly Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 257 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 257 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Glu Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Leu Lys Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Cys Thr Tyr Ile Gly Ser Gly 85 90 95 Tyr Val Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 258 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - 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Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 262 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Asn Asn Asn Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp Ala 85 90 95 Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 <210> 263 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 263 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Leu Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Val Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 264 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - 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Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 278 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Ile Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Asn Tyr Tyr Arg Ser 85 90 95 Ser Ser Ser Thr Tyr Glu Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val 100 105 110 Val Lys <210> 279 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 279 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Leu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn 85 90 95 Val Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 280 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 280 Ala Phe Glu Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser 85 90 95 Ile Gly Phe Trp Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 281 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 281 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Glu Pro Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Asp Ile Thr 85 90 95 Thr Asp Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 282 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 282 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Tyr Tyr Thr Asp 85 90 95 Ser Asn Asp Tyr Gly Ala Asn Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val 100 105 110 Val Val Lys 115 <210> 283 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 283 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Ala Thr Ile 85 90 95 Tyr Ala Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 284 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 284 Gln Gly Pro Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Glu Ser Val Asn Ser Asn Asn 20 25 30 Ile Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Val Tyr Asp Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Ala Ser Ser 85 90 95 Gly Trp Tyr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 285 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 285 Gln Gly Pro Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Glu Ser Phe Gly Gly Gly Asn 20 25 30 Ile Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ser Ser Thr Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Asp His Ser Gly 85 90 95 Ala Trp Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 286 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 286 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Val Val Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser Gln Thr Ile Tyr Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Trp Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp Ala 85 90 95 Asp Pro Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 287 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 287 Ala Gln Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg 85 90 95 Ser Ala Asp Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 288 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - 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Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 290 Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Glu Pro Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Trp Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ala Tyr Gly Tyr Thr Ser Asp 85 90 95 Asp Ala Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 291 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 291 Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly Asp 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Gly Asn Asn 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Val 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Trp Lys Asp Glu Ile 85 90 95 Asp Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 292 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 292 Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asp Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Trp Tyr Val Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Leu Tyr Gly Asp 85 90 95 Asp Ser Phe Thr Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 293 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 293 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Asn Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asp Tyr Ser Asp 85 90 95 Val Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 294 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - 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Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 304 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Asn 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Glu Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asp Tyr Asp Asn Asp 85 90 95 Val Asp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 305 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 305 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asp Tyr Asp Asn Asp 85 90 95 Val Asp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 306 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 306 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Asp Ser Asn Asn 20 25 30 Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp 85 90 95 Ala Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 307 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 307 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Asp Ser 85 90 95 Asn Ile Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 308 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 308 Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Asn 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Arg Asp Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asn Tyr Asp Cys Gly 85 90 95 Ser Ala Asp Cys Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 309 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 309 Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Leu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ala Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln His Gly Tyr Thr Gly Ser Asn 85 90 95 Val His Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 310 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 310 Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Ile Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asp Tyr Asp Asn Asp 85 90 95 Val Asp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 311 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 311 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asp Ser 20 25 30 Gly Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ser Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Tyr Asp Thr Gly 85 90 95 Ser Ser Val Tyr Asp Trp Gly Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val 100 105 110 Val Lys <210> 312 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 312 Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Leu Tyr Asn Lys Asp 20 25 30 Ala Cys Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Ala Phe Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Phe Ile Ser Ser 85 90 95 Ser Asp Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 313 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 313 Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Arg Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Pro Gly Gly 85 90 95 Ser Asp Val His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 314 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 314 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Val Thr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Asn Asn Ile Ala 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 <210> 315 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 315 Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Asn Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ile Tyr Ile Asp 85 90 95 Val Gly Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 316 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 316 Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ile Tyr Ile Asp 85 90 95 Val Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 317 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 317 Ala Ala Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Asp Asn Asn Asn 20 25 30 Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Pro Pro Met Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp 85 90 95 Ala Glu Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 318 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - Light chain sequence from rabbit hybridoma <400> 318 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Gly Ser Ser 85 90 95 Tyr Val Glu Ser Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 319 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 319 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 1 5 10 15 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 20 25 30 Ser Asp Thr Val Cys Asp 35 <210> 320 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 320 Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser 1 5 10 15 Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr 20 25 30 Arg Glu Gln Asn 35 <210> 321 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 321 Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys 1 5 10 15 Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu 20 25 <210> 322 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 322 Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg 1 5 10 15 Pro Gly Thr Glu 20 <210> 323 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 323 Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His Gln 1 5 10 15 Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser 20 25 <210> 324 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - spacer sequence <400> 324 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp 1 5 10 <210> 325 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - spacer sequence <400> 325 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 326 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - linker sequence <400> 326 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 327 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 327 Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser 1 5 10 15 Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser 20 25 30 Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 35 40 <210> 328 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 328 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys 1 5 <210> 329 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 329 Thr Val Cys Asp Ser 1 5

Claims (37)

  1. 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    서열번호 1~3에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 서열번호 4~6에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역;
    서열번호 7~9에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 10~12에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 13~15에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 16~18에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 19~21에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 22~24에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 25~27에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 28~30에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 31~33에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 34~36에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 37~39에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 40~42에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 43~45에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 46~48에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 49~51에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 52~54에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 55~57에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 58~60에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 61~63에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 64~66에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 67~69에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 70~72에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 73~75에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 76~78에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 79~81에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 82~84에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 85~87에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 88~90에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    서열번호 91~93에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 94~96에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역; 또는
    서열번호 97~99에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 VH 영역; 및 서열번호 100~102에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 VL 영역;
    또는 상기 CDR 영역에 걸쳐 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 총 아미노산 치환을 제외하고, (i) 및 (ii)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 항체의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, VH 영역은 서열번호 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 및 135로부터 선택된 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, VL 영역은 서열번호 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 및 136으로부터 선택된 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    서열번호 103에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 104에 제시된 VL 영역;
    서열번호 105에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 106에 제시된 VL 영역;
    서열번호 107에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 108에 제시된 VL 영역;
    서열번호 109에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 110에 제시된 VL 영역;
    서열번호 111에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 112에 제시된 VL 영역;
    서열번호 113에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 114에 제시된 VL 영역;
    서열번호 115에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 116에 제시된 VL 영역;
    서열번호 117에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 118에 제시된 VL 영역;
    서열번호 119에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 120에 제시된 VL 영역;
    서열번호 121에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 122에 제시된 VL 영역;
    서열번호 123에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 124에 제시된 VL 영역;
    서열번호 125에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 126에 제시된 VL 영역;
    서열번호 127에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 128에 제시된 VL 영역;
    서열번호 129에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 130에 제시된 VL 영역;
    서열번호 131에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 132에 제시된 VL 영역;
    서열번호 133에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 134에 제시된 VL 영역; 또는
    서열번호 135에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 136에 제시된 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 서열번호 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 및 135로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역, 및 서열번호 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 및 136으로부터 선택된 서열에 대해 각각 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 R1에서 밑줄이 그어진 서열로부터 선택된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 표 R2에서 밑줄이 그어진 서열로부터 선택된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3을 각각 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 표 R1로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 각각 표 R2로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 성숙한 인간 TNFR2 서열(FL 인간 TNFR2의 잔기 23~461)에 의해 결정했을 때, R21, Y23, T27, S33, K34, T51, 및 S55로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지는 에피토프에서 인간 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)에 결합하되, 임의로 에피토프는 REY, TAQMCCSK (서열번호 328), 및 TVCDS (서열번호 329)로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 서열번호 37~39에 각각 제시된 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 서열번호 40~42에 각각 제시된 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, VH 영역은 서열번호 115의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, VL 영역은 서열번호 116의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열번호 115에 제시된 VH 영역, 및 서열번호 116에 제시된 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TNFR2, 임의로 가용성 및 세포 발현된 인간 TNFR2에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 표 T1로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 인간 TNFR2 펩티드 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간화된 것인, 단리된 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단쇄 항체, scFv, 힌지 영역이 결여된 1가 항체, 미니바디, 및 프로바디로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 항체.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fab 또는 Fab’ 단편인, 단리된 항체.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 F(ab’)2 단편인, 단리된 항체.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 전체 항체인, 단리된 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG 불변 도메인을 포함하는, 단리된 항체.
  21. 제20항에 있어서, IgG 불변 도메인은 IgG1 CH1 도메인을 포함하는, 단리된 항체.
  22. 제20항에 있어서, IgG 불변 도메인은 IgG1 Fc 영역을 포함하고, 임의로 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 임의로 변형된 Fc 영역을 임의로 포함하는, 단리된 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TNFR2, 예를 들어, 표 T1의 적어도 하나의 펩티드 에피토프에 약 2 nM 이하의 KD로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.7 nM 이하의 KD로 인간 TNFR2에 결합하거나, 약 50 pm 이하의 KD로 일차 T 세포, 임의로 Treg 상의 인간 TNFR2에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) TNFR2에 대한 TNF-α 결합을 억제하고;
    (b) TNFR2 신호 전달을 억제하고;
    (c) TNFR2 신호 전달을 활성화하고;
    (d) TNFR2 이량체화/삼량체화를 억제하고;
    (e) 인간 TNFR2 및 시노몰구스 원숭이 TNFR2에 교차 반응성으로 결합하고;
    (f) 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)에 의해 종양 세포, Treg, 및/또는 억제성 골수 세포(임의로, 대식세포, 호중구, 및 골수 유래 억제 세포(MDSC))의 세포 살해/고갈을 증가/유도하고;
    (g) 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP)에 의해 종양 세포, Treg, 및/또는 억제성 골수 세포(임의로, 대식세포, 호중구, 및 MDSC)의 세포 살해/고갈을 증가/유도하고;
    (h) 골수 세포(임의로, 대식세포, 호중구, 및 MDSC)에 의한 면역 억제를 감소시키고;
    (i) MDSC 및/또는 M2 대식세포를 전염증성 M1 대식세포로 전환시키고;
    (j) Treg를 효과기 T 세포로 전환시키고;
    (k) 차가운 종양(cold tumor)을 뜨거운 종양(hot tumor)으로 전환시키고;
    (l) Treg 매개 면역 억제를 감소시키거나;
    (m) (a) 내지 (k) 중 하나 이상의 조합을 수행하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, TNFR1, 헤르페스바이러스 세포내 침투 매개체(HVEM), CD40, 사멸 수용체 6(DR6), 및/또는 오스테오프로테게린(OPG)에 실질적으로 결합하지 않는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, TNFR2 길항제인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, TNFR2 작용제인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화화는 단리된 폴리뉴클레오티드, 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 또는 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  31. 생리학적으로 허용 가능한 담체, 및 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 조성물.
  32. 암을 가진 환자, 임의로 비정상적인 TNFR2 발현과 관련된 암을 가진 환자를 치료하는 방법으로서, 제31항의 조성물을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 암을 가진 환자, 임의로 TNFR2 길항제 매개 면역 억제와 관련된 암을 가진 환자를 치료하는 방법으로서, 제31항의 조성물을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2 길항제인, 방법.
  35. 염증성 및/또는 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 제231항의 조성물을 환자에게 투여하여 염증을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 질환은 비정상적인 TNFR2 발현 이상과 연관이 있고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNFR2 작용제인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 질환은 TNFR2 작용제 매개 면역 활성화와 연관이 있는, 방법.
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