KR20220062577A - Tfeb의 활성화에 의해 망막 색소 상피 세포의 리소좀 기능을 회복시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

대상체에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 리소좀 기능을 회복시키는 방법, 및 연령-관련 황반 변성 (AMD), Stargardt 황반 망막 변성, 신경변성 질환 또는 당뇨병성 망막병증을 예방 및/또는 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (i) 전사 인자 EB (TFEB)의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 관련된 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 및 이들의 조성물이 또한 제공된다.

Description

TFEB의 활성화에 의해 망막 색소 상피 세포의 리소좀 기능을 회복시키는 방법
관련 출원에 대한 상호-참조
본 특허 출원은 2019년 9월 9일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/897,800호의 우선권을 주장하며, 이는 참조로 통합된다.
서열 목록
본원과 동시에 제출된 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
연령-관련 황반 변성 (Age-related macular degeneration: AMD)은 세계적으로 노인들 실명의 주요 원인이다. 전 세계적으로 AMD를 가진 사람의 수는 2020년에 1억 9,600만 명에서 2040년에는 2억 8,800만 명으로 증가할 것으로 예상된다. 1,500만 명 이상의 미국인이 AMD의 영향을 받고 있으며, 치료 비용은 3,500억 달러를 초과한다. 최신 데이터에 따르면 2020년까지 미국에서 300만 명 이상의 사람들이 이 질병으로 추가로 진단받을 것이라고 시사하였다.
대다수의 환자는 위축성 (건성) AMD를 앓고 있다. 그러나 질병의 끝없는 진행으로 인해, 10년 이내에 이들은 진행성 질병으로 발전할 것이다. 건성 AMD의 부담은 "베이비 붐 세대 (baby boomers)"가 나이들어감에 따라 증가하고 있다. 이러한 질병에 걸린 개인들의 인구가 증가함에도 불구하고, 건성 AMD에 대한 현재 이용 가능한 명확한 치료법 (중간 AMD에 대한 AREDS II 제제 제외) 또는 예방법이 없다. AMD의 건성 타입은 이 질병에 걸린 개인의 약 80-90%에 영향을 미친다. 그 원인은 알려져 있지 않으며, 통상 습성 타입 (wet type)보다 더 천천히 진행된다.
현재 습성 AMD (wet AMD)를 앓고 있는 환자는 항-VEGF 요법 예컨대 AVASTINTM (베바시주맙), LUCENTISTM (라니비주맙 주사제), 및 EYLEATM (아플리버셉트)를 이용할 수 있다. 그러나 치료 요법 (매월 주사가 필요함)이 매우 고가이고, 장기간 효과가 없으며, 모든 환자에게 도움이 되는 것은 아니다.
위축성 AMD 환자가 많기 때문에, 시력을 잃기 전 단계에서 초기 질병을 표적으로 하는 새로운 치료법이 요구되고 있다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 망막 색소 상피 (retinal pigment epithelial: RPE) 세포의 리소좀 기능을 회복시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 전사 인자 EB (transcription factor EB: TFEB)의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 대상체 (예: 인간)는 연령-관련 황반 변성 (AMD)을 갖거나 또는 AMD가 발병할 위험이 있을 수 있으며, 여기서 AMD는 습성 AMD 또는 위축성 (건성) AMD일 수 있고, 이는 지도모양 위축 (geographic atrophy)을 포함할 수 있다. 상기 대상체는 Stargardt 황반 망막 변성을 갖거나, 또는 Stargardt 황반 망막 변성이 발병할 위험이 있을 수 있다. 상기 대상체는 신경변성 질환을 갖거나, 또는 신경변성 질환 예컨대 알츠하이머병 또는 파킨슨병이 발병할 위험이 있을 수 있다. 대안으로서 또는 추가적으로, 상기 대상체는 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy: DR)을 갖거나, 또는 DR이 발병할 위험이 있을 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 대상체에서 AMD, Stargardt 황반 망막 변성, 신경변성 질환 또는 당뇨병성 망막병증을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 전사 인자 EB (TFEB)의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 핵산은 벡터 (예: AAV 벡터)에 포함될 수 있다.
상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 138, 142, 211, 455, 462, 463, 466, 467, 및 469 중 하나 이상의 위치에 있는 세린이 독립적으로 다른 하나의 아미노산으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로,
(i) 서열번호: 1의 위치 138에 있는 세린이 알라닌으로 치환될 수 있고, 및/또는
(ii) 서열번호: 1의 위치 142에 있는 세린이 알라닌으로 치환될 수 있고, 및/또는
(iii) 서열번호: 1의 위치 211에 있는 세린이 알라닌으로 치환될 수 있고, 및/또는
(iv) 서열번호: 1의 위치 455에 있는 세린이 알라닌으로 치환될 수 있고, 및/또는
(v) 서열번호: 1의 위치 462에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환될 수 있고, 및/또는
(vi) 서열번호: 1의 위치 463에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환될 수 있고, 및/또는
(vii) 서열번호: 1의 위치 466에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되고, 및/또는
(viii) 서열번호: 1의 위치 467에 있는 세린이 알라닌으로 치환되고, 및/또는
(ix) 서열번호: 1의 위치 469에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환된다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 138, 142 및 211의 각 위치에 있는 세린이 알라닌으로 각각 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 455에 있는 세린이 알라닌으로 치환되고, 선택적으로 서열번호: 1의 위치 211에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
추가적 일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 462, 463, 466 및 469의 각 위치에 있는 세린이 아스파르트산으로 각각 치환되고, 서열번호: 1의 위치 467에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 약학적으로 허용 가능한 담체 및 (b) 상기 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 그 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 추가로 AMD (예: 위축성 AMD 또는 습성 AMD), Stargardt 황반 망막 변성, 신경변성 질환 (예: 알츠하이머병 또는 파킨슨병), 또는 당뇨병성 망막병증을 예방 및/또는 치료하기 위한, (i) TFEB의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 AMD (예: 위축성 AMD 또는 습성 AMD), Stargardt 황반 망막 변성, 신경변성 질환 (예: 알츠하이머병 또는 파킨슨병), 또는 당뇨병성 망막병증을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, (i) TFEB의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 AMD (예: 위축성 AMD 또는 습성 AMD), Stargardt 황반 망막 변성, 신경변성 질환 (예: 알츠하이머병 또는 파킨슨병), 또는 당뇨병성 망막병증을 예방 및/또는 치료하기 위한, (i) TFEB의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 AMD (예: 위축성 AMD 또는 습성 AMD), Stargardt 황반 망막 변성, 신경변성 질환 (예: 알츠하이머병 또는 파킨슨병), 또는 당뇨병성 망막병증을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, (i) TFEB의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드에 관한 것이다.
도 1A-1C는 78세 남성 대조군 (도 1A) 및 위축성 AMD를 가진 84세 남성 (도 1B)의 RPE/맥락막에서 TFEB 면역표지 (immunolabeling)를 보여준다. 대조군 안구에서, 강한 TFEB 면역반응성이 RPE 핵 (화살표)에서 현저하지만, (도 1B)에서 AMD 안구의 RPE 핵 (별표)에는 부재하고, 이는 그래프 (도 1C)에 도시된 바와 같다. 참고: (B)에서 다층 RPE. 막대 = 20 μm; *P<0.05.
도 2A-2B는 세포내이입 경로에서 단백질의 발현이 Cryba1 조건부 녹아웃 (cKO) 마우스의 RPE 세포에서 감소된다는 것을 입증하였다 (Cryba1은 Valapala et al., Nat. Commun., 4: 1629 (2013)에 기재된 바와 같은 RPE 세포로부터 특이적으로 결실되었다). 도 2A는 웨스턴 블롯 (WB)으로 나타낸 바와 같이 초기 엔도솜 마커 (early endosome marker)인 Rab5가 5-개월령 Cryba1 cKO RPE 세포에서 연령-일치 floxed 대조군 (Valapala et al., Sci. Rep., 5: 8755 (2015)에 기재된 바와 같은 Cryba1 fl/fl) RPE 세포와 비교하여 감소되는 것을 보여주었다. 액틴은 내부 대조군으로 사용되었다. 그래프는 평균 ± SD를 나타내고, *P<0.05 (two-tail t test), n=5. 도 2B는 WB로 나타낸 바와 같이 초기 및 후기 엔도솜의 융합 및 초기 엔도솜 수준에서의 분류에 필요한 단백질인 EEA1, 및 소포 트래피킹 및 엔도솜 신호전달을 조절하는 APPL1이 5개월령 Cryba1 cKO RPE 세포에서 Cryba1 fl/fl RPE 세포와 비교하여 감소되는 것을 보여주었다. 액틴은 내부 대조군으로 사용되었다.
도 3A-3C는 Cryba1 cKO 마우스가 RPE 세포 이질성을 보여주는 것을 입증하였다. 도 3A는 1개월령 및 9개월령 cKO 마우스의 망막 단면에서 EBP50의 면역염색을 보여주며, 이는 대조군과 비교하여 RPE 세포에서 감소된 EBP50 및 미세융모 (microvilli) 길이를 나타낸다. 도 3B는 3개월령 마우스의 RPE 추출물이 cKO RPE 세포에서 정점 측 단백질 (ERM 및 EBP50)의 발현이 감소되었음을 보여준다. 도 3C는 팔로이딘 (Phalloidin) (F-액틴) 및 EBP50 (미세융모) 항체를 사용하여 시각화된 바와 같이, RPE 이질성을 보여주는 4개월령 Cryba1 cKO 마우스의 RPE 플랫 마운트 (flat mounts)이다. F-액틴 및 EBP50 염색 모두는 cKO RPE에서 정점 측 (화살표)에서 세포 손실 면적을 보여준다. 세포 손실의 포켓은 마우스가 나이들어감에 따라 심각하다 (표시되지 않음). 직교 이미지 (병합/직교)는 RPE 미세융모 (화살표)의 탈락 (dropout)을 보여준다. 막대 = 20 mm. 그래프는 평균 ± S.D를 나타내고, *P<0.05, **P<0.01 (two-tail t test), n=5.
도 4는 Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 변경된 클라트린 (clathrin) 매개 세포내이입을 보여준다. floxed 대조군 및 cKO RPE 세포의 정점 측으로부터 클라트린 매개 세포내이입의 라이브 세포 이미징 (Live cell imaging)을 TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경으로 수행하였다. RPE-맥락막-공막 복합체를 유리 바닥 접시에서 배양하고, rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 및 Ad-CMV-FAP-mClta로 감염시켜서, 액틴 및 클라트린을 각각 시각화하였다. 플랫 마운트의 TIRF 이미지 및/또는 비디오를 Plan Apo TIRF 1.49 NA 100x 오일 대물렌즈 및 Prime 95b 카메라 (Photometrics)를 구비한 도립 Nikon Ti로 촬영하였다. 12초에 걸쳐서, 클라트린 소포는 정점 원형질막 (화살표)에 진입하지 못하는 반면에, floxed 대조군에서 삽입이 발생하였다.
도 5는 실시예에 기재된 WT-TFEB 및 항시적으로 활성인 TFEB-S210A 제제에 대한 개략도이다.
도 6A-6C는 AAV2-TFEB 벡터가 RPE 세포에서 형질감염에 적합한 것을 입증하였다. 비-감염된 마우스의 RPE/맥락막 (A) 및 AAV2-TFEB-GFP의 망막하 주사 후 RPE/맥락막 (B)은 단일 망막하 감염 후 RPE 세포의 85-90% 이상이 효과적으로 감염되었음을 입증하였다. 신경감각 망막 또는 맥락막에서 GFP-발현 세포는 발견되지 않았다 (도시되지 않음). (C) 7일 후에 피크 발현이 관찰되었다. 다시, 감염 후 2주 동안 신경감각 망막 또는 맥락막에서 GFP-발현 세포는 발견되지 않았다 (도시되지 않음).
도 7A-7C는 회복된 TFEB 기능이 Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포에서 자가포식 및 리소좀 기능의 변경을 완화하는 것을 입증하는 그래프이다. 도 7A는 항시적으로 활성인 마우스 TFEB (TFEBS210A)를 발현하는 AAV 벡터를 Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포에 투여하여 TFEBS210A가 RPE 세포의 핵으로 전위되는 것을 자세히 개시한다. 도 7B는 야생형 마우스 (1), 벡터가 없는 Cryba1 KO 마우스 (2), 및 야생형 TFEB를 발현하는 AAV 벡터가 투여된 Cryba1 KO 마우스 (3)와 비교하여, TFEBS210A를 발현하는 AAV 벡터로 감염된 Cryba1 KO 마우스(4)의 RPE 세포에서 CTSB, LAMP2, ATP6VOA1, 및 CTSD의 상대 발현을 보여주는 그래프이다. 도 7C는 야생형 TFEB를 발현하는 AAV 벡터로 감염된 Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포에서의 발현과 비교하여, TFEBS210A를 발현하는 AAV 벡터로 감염된 Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포에서 p62/SQSTM1의 상대 발현을 나타낸다. 빈 (Empty) AAV는 효과가 없었다. 평균 ± S.D., n=3. P-값은 one-way AVOVA 및 Tukey's post-hoc test에 의해 평가되었으며, 적어도 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. *P<0.05 및 **P<0.01.
도 8A-8C는 노화된 Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 철 축적 및 인플라마좀 (inflammasome) 활성화를 나타낸다. 도 8A는 RPE 세포의 리소좀 이상으로 인한 철 과부하가 인플라마좀 활성화 및 세포 사멸을 유발할 수 있음을 보여준다. 도 8B는 급식 (fed) 및 결핍 (starved) 조건하에 4개월령 (1, 2) 또는 10개월령 (5, 6) Cryba1 fl/fl 마우스 (대조군)와 비교하여, 4개월령 (3, 4) 또는 10개월령 (7, 8) Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 산화환원 민감성 제1철 이온 수준 (redox sensitive ferrous ion levels) 증가를 보여주었다. 도 8C는 연령-일치 대조군에 비해 노화된 Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 인플라마좀 마커 NLRP3 및 절단된 카스파제-1의 상승된 수준을 나타낸다.
도 9A-9C는 TFEB 활성화가 인 비트로 Cryba1 KO RPE 세포에서 철 축적 및 인플라마좀 활성화를 억제하는 것을 입증하였다. 도 9A는 철 킬레이터 리포칼린-2 (LCN-2) 및 철 공급원 시트르산 제2철 암모늄 (ferric ammonium citrate: FAC)의 존재하에 Cryba1 KO RPE 세포에 항시적으로 활성인 마우스 TFEB (TFEBS210A)를 발현하는 AAV 벡터의 투여를 보여준다. 도 9B-9C는 TFEBS210A를 발현하는 AAV 벡터로 감염된 Cryba1 KO RPE 세포가 야생형 TFEB를 발현하는 AAV 벡터로 감염된 Cryba1 KO RPE 세포와 비교하여 철 축적 및 인플라마좀 활성화 (NLRP3 및 IL-β 발현 증가)를 역전시킬 수 있음을 보여준다. *P<0.05 및 **P<0.01.
도 10A-10B는 회복된 TFEB 기능이 Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 자가포식 및 리소좀 기능의 변경을 완화시키는 것을 입증하였다. 9개월령 Cryba1 cKO 마우스에게 WT TFEB를 발현하는 AAV 벡터 (WT TFEB 벡터) 또는 항시적으로 활성인 마우스 TFEB (TFEBS210A)를 발현하는 AAV 벡터 (돌연변이체 TFEB 벡터)를 망막하 주사하였다. 도 10A는 돌연변이체 벡터를 Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에 투여하여 qPCR에 의해 CLEAR (조정된 리소좀 발현 및 조절) 네트워크 유전자가 회복되는 것을 보여준다. 도 10B는 Cryba1 cKO 마우스에 돌연변이체 벡터를 투여하여 RPE 세포에서 세포 p62/SQSTM1 수준 감소와 함께 자가포식소체 (autophagosome) 제거가 개선되는 것을 나타내었다. 2개월 후에 동물을 희생시키고, RPE-맥락막 복합체를 수확하였다. *P<0.05, **P<0.01 (n=4).
도 11A-11B는 Cryba1 fl/fl 대조군에 비해, Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 CLEAR 네트워크 유전자의 감소 (도 11B)와 동시에, 금식 및 급식된 Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포에서 TFEB의 세포질 격리 (cytosolic sequestration) (도 11A)를 주로 보여준다.
도 12A-12B는 Cryba1 fl/fl 대조군에 비해, Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 리소좀 pH를 나타낸다. 도 12A는 대조군에 비해 Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 리소좀 pH의 유의미한 증가를 보여주는 그래프이다. 도 12B는 cKO RPE 세포에서 Cryba1의 과발현 (pCDNA-Cryba1의 투여에 의해)이 pH 이상을 인 비트로 구조하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 13A-13B는 Cryba1 fl/fl 대조군에 비해, Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 카텝신 D 효소 활성을 나타낸다. 도 13A는 Cryba1 fl/fl 대조군에 비해, Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 카텝신 D 효소 활성의 유의미한 감소를 보여주는 그래프이다. 도 13B는 cKO RPE 세포에서 Cryba1의 과발현 (pCDNA-Cryba1의 투여에 의해)이 카텝신 D 효소 활성을 인 비트로 구조하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 14A-14C는 Cryba1 녹아웃 마우스의 이상을 나타낸다. 도 14A는 리소좀 내강 분획 (분획 1)에서 βA3/A1-크리스탈린의 국재화를 나타내며, 리소좀 막 분획 (분획 2)에서의 발현은 최소화된다. 도 14B는 Cryba1 (βA3/A1-크리스탈린에 대한 코딩) 조건부 (RPE에서 구체적으로 결실됨) 및 녹아웃 마우스 (Cryba1 cKO)를 나타낸다. 도 14C는 2-3주령부터 최대 9개월령의 Cryba1 cKO 마우스에서 RPE 이상 및 AMD-유사 표현형의 발달을 개략도로 보여준다.
도 15A-15B는 Cryba1 cKO RPE 세포에서 자가포식소체 (autophagosome) 및 자가포식용해소체 (autophagolysosome) 형성을 보여준다. 도 15A는 WT 또는 cKO 마우스로부터 단리되고 pH-민감성 리포터 (mCherry-GFP-LC3)로 형질감염된 RPE 세포의 살아있는 세포 이미징을 나타내며, 이는 대조군에 비해 Cryba1 cKO RPE 세포에서 자가포식용해소체 형성의 감소를 보여주며, 이는 Cryba1 과발현 시에 구조된다. 도 17B는 상이한 조건하에 자가포식소체 및 자가포식용해소체 반점의 수의 정량분석을 나타낸다.
도 16A-16B는 WT 및 Cryba1 KO RPE 세포에서 카텝신 D 수준을 나타낸다. 면역형광 (도 16A) 및 웨스턴 블롯 (도 16B)은 연령-일치 대조군과 비교하여, Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포에서 카텝신 D 수준의 감소를 보여준다.
도 17A-17B는 Cryba1 KO 마우스가 연령-관련 황반 변성-유사 표현형을 보여주는 것을 나타내었다. 도 17A는 RPE65 (RPE 세포의 알려진 마커) 발현의 현저한 감소와 함께, RPE 세포의 조약돌 (cobblestone)-유사 구조 (화살표)의 손실을 보여주는 RPE 플랫 마운트의 면역형광 이미지이다. 도 17B는 나이가 증가함에 따라 Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포에서 큰 액포 (화살표) 및 기저 라미나 침착물 (별표 및 삽입)의 축적을 보여주는 전자 현미경 이미지이다.
도 18A-C는 Cryba1 cKO 마우스의 RPE가 (자가) 포식세포를 보유하는 것을 보여주었다. 전자 현미경 이미지는 큰 자가포식소체 (도 18A-B에서 화살표)의 축적을 보여주며, 이는 광수용기 외부 세그먼트 (photoreceptor outer segments)가 있고 분해되지 않았다 (도 18C에서 화살표).
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 TFEB의 활성 형태가 RPE 세포의 기능을 회복시키고 AMD-유사 표현형을 구조할 수 있음을 발견하였다. 이러한 개념은 AMD를 넘어서는 의미가 있으며, 리소좀 기능이상 및 세포 이질성이 중요한 병태생리학적 특징인 노화 및 노화-관련 및 신경변성 질환에 대한 고유한 통찰력을 제공한다.
본 발명은 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 리소좀 기능을 회복시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) TFEB의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 관련된 폴리펩티드, 핵산, 벡터 및 조성물을 제공한다.
상기 대상체는 인간 또는 기타 동물 (예: 포유동물 예컨대 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 고양이, 개, 토끼, 돼지, 소, 말 또는 영장류)을 지칭하며, 여기서 대상체는 질병의 예방 또는 치료가 필요한 동물 (예: 인간)을 지칭할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 대상체는 연령-관련 황반 변성 (AMD)을 갖거나, 또는 AMD가 발병할 위험이 있다. 상기 AMD는 습성 AMD 또는 위축성 (건성) AMD일 수 있다. 상기 대상체는 AMD에 이차적인 지도모양 위축을 가질 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 또한 대상체에서 AMD를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 대상체는 Stargardt 황반 망막 변성을 갖거나, 또는 Stargardt 황반 망막 변성이 발병할 위험이 있다. 이와 같이, 본 발명은 또한 Stargardt 황반 망막 변성을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 구체예에서, 상기 대상체는 신경변성 질환을 갖거나, 또는 신경변성 질환 예컨대 알츠하이머병 또는 파킨슨병이 발병할 위험이 있다. 이와 같이, 본 발명은 또한 대상체에서 신경변성 질환 예컨대 알츠하이머병 또는 파킨슨병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
추가적 구체예에서, 상기 대상체는 당뇨병성 망막병증 (DR)을 갖거나, 또는 DR이 발병할 위험이 있다. 상기 대상체는 또한 당뇨병성 황반 부종 (DME)을 가질 수 있거나, 또는 DME가 발병할 위험이 있을 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 또한 대상체에서 DR 또는 DME를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
이와 같이, 본 발명은 대상체에서 AMD, Stargardt 황반 망막 변성, 신경변성 질환 또는 당뇨병성 망막병증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) TFEB의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 138, 142, 211, 455, 462, 463, 466, 467, 및 469 중 하나 이상 (예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개)의 위치에 있는 세린이 독립적으로 다른 하나의 아미노산 (즉, 세린 이외의 자연 또는 비-자연 발생 아미노산)으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성될 수 있다. 예를 들어:
(i) 서열번호: 1의 위치 138에 있는 세린이 알라닌으로 치환될 수 있고, 및/또는
(ii) 서열번호: 1의 위치 142에 있는 세린이 알라닌으로 치환될 수 있고, 및/또는
(iii) 서열번호: 1의 위치 211에 있는 세린이 알라닌으로 치환될 수 있고, 및/또는
(iv) 서열번호: 1의 위치 455에 있는 세린이 알라닌으로 치환될 수 있고, 및/또는
(v) 서열번호: 1의 위치 462에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환될 수 있고, 및/또는
(vi) 서열번호: 1의 위치 463에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환될 수 있고, 및/또는
(vii) 서열번호: 1의 위치 466에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되고, 및/또는
(viii) 서열번호: 1의 위치 467에 있는 세린이 알라닌으로 치환되고, 및/또는
(ix) 서열번호: 1의 위치 469에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환된다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 138, 142 및 211의 각 위치에 있는 세린이 알라닌으로 각각 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 455에 있는 세린이 알라닌으로 치환되고, 선택적으로 서열번호: 1의 위치 211에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 따라서, 본 발명은 (i) 서열번호: 1의 위치 455에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 (ii) 서열번호: 1의 위치 211 및 455 각각에 있는 세린이 알라닌으로 각각 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 모두를 제공한다.
추가적 일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 462, 463, 466 및 469의 각 위치에 있는 세린이 아스파르트산으로 각각 치환되고, 서열번호: 1의 위치 467에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
폴리펩티드는 다수의 통상적인 기술들 중 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 서열은 합성, 재조합, 단리 및/또는 정제될 수 있다.
폴리펩티드는 재조합 공급원으로부터 단리 또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편은 잘 알려진 분자 유전학 기술을 사용하여 적절한 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 단편은 전사될 수 있고, 후속하여 폴리펩티드로 인 비트로 번역될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 키트가 또한 사용될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응은 선택적으로 핵산의 조작에 사용될 수 있다.
폴리펩티드는 또한 당해 분야에 알려진 방법에 따라 자동화 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 대안으로서, 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려진 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 구체적으로, 폴리펩티드는 고체상 합성 절차를 사용하여 합성될 수 있다. 원하는 경우, 자동화 펩티드 합성기를 사용하여 수행할 수 있다. t-부틸옥시카보닐 (t-BOC) 또는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc) 아미노산 차단기의 제거 및 수지로부터 폴리펩티드의 분리는 예를 들어, 감소된 온도에서 산 처리함으로써 달성될 수 있다. 그 다음에, 단백질-함유 혼합물은 비-펩티드 유기 화합물을 제거하기 위해, 예를 들어 디에틸 에테르로 추출될 수 있고, 합성된 폴리펩티드는 수지 분말로부터 (예를 들어, 약 25% w/v 아세트산을 사용하여) 추출될 수 있다. 폴리펩티드의 합성 후에, 임의의 불완전한 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 유리 아미노산을 제거하기 위해, 추가 정제 (예를 들어, HPLC 사용)가 선택적으로 수행될 수 있다. 아미노산 및/또는 HPLC 분석은 합성된 폴리펩티드에 대해 그 아이덴티티를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 다른 적용을 위해, 화학적 접합에 의해 또는 당업자에게 알려져 있는 유전적 수단을 통해, 보다 큰 융합 단백질의 일부로서 폴리펩티드를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 폴리펩티드, 및 융합 단백질의 단리, 정제, 분석 또는 안정성을 촉진하는 것과 같은 임의의 원하는 특성 또는 기능을 갖는 하나 이상의 다른 단백질(들)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본원에서 사용된 "핵산"은 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"를 포함하며, 일반적으로 DNA 또는 RNA의 폴리머를 의미하고, 단일가닥 또는 이중가닥, 합성 또는 천연 공급원으로부터 수득 (예: 단리 및/또는 정제)될 수 있으며, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 비변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드들 간에 발견되는 포스포디에스테르 대신에, 천연, 비-천연, 또는 변경된 뉴클레오티드간 연결 예컨대 포스포로아미데이트 연결 또는 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있다. 일반적으로 상기 핵산은 임의의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 본원에서 논의된 바와 같이 일부 경우에는 핵산이 하나 이상의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하는 것이 적합할 수 있다.
일 구체예에서, 핵산은 재조합체이다. 본원에서 사용된, 용어 "재조합체"는 (i) 천연 또는 합성 핵산 세그먼트들을 살아있는 세포에서 복제할 수 있는 핵산 분자에 연결함으로써 살아있는 세포 외부에서 제작된 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에 기재된 분자의 복제로부터 생성되는 분자를 지칭한다. 본원의 목적을 위해, 복제는 인 비트로 복제 또는 인 비보 복제일 수 있다.
핵산 (예: DNA, RNA, cDNA 등)은 재조합체 생성 및 상업적 합성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 물질로 생성될 수 있다. 이와 관련하여, 핵산 서열은 합성, 재조합, 단리 및/또는 정제될 수 있다.
핵산은 당해 분야에 알려진 절차를 사용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 결찰 반응에 기반하여 제작될 수 있다. 예를 들어, Green et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)을 참조한다. 예를 들어, 핵산은 자연 발생 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 혼성화 시에 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오티드 (예: 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드)를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산을 생성하는데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신 (wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신 (queosine), 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 대안으로서, 본 발명의 핵산들 중 하나 이상은 Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) 및 Synthegen (Houston, TX)과 같은 회사로부터 구입할 수 있다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 핵산, 및 핵산을 세포로 전달 및/또는 세포에서 핵산의 발현을 가능하게 하는 요소를 포함하는 구조체의 일부로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 발현 제어 서열과 양립 가능한 조건 하에 달성되도록 결찰된다. 발현 제어 서열은 적절한 프로모터, 인핸서 (예: CMV 인핸서), 전사 종결인자, 단백질-코딩 유전자 앞의 개시 코돈 (즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하기 위해 해당 유전자의 정확한 판독 프레임의 유지 및 종결 코돈을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 프로모터는 hVMD2 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 CMV 즉시 초기 I 프로모터, 폭스바이러스 프로모터, 30K 프로모터, I3 프로모터, sE/L 프로모터, 7.5K 프로모터, 40K 프로모터 및 C1 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 전사-기반 증폭 시스템 (TAS), 자가-지속 서열 복제 시스템 (3SR) 및 Qβ 복제효소 증폭 시스템 (QB)과 같은 인 비트로 방법에 의해 클로닝되거나 또는 증폭될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분자의 DNA 서열에 기반한 프라이머를 사용하여 cDNA의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 단리될 수 있다. 광범위하게 다양한 클로닝 및 인 비트로 증폭 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명은 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 핵산은 임의의 적절한 벡터에 삽입될 수 있다. 벡터의 선택 및 이를 제작하는 방법은 당해 분야에 통상 알려져 있으며, 일반적인 기술 참조에 설명되어 있다.
적합한 벡터는 증식 및 확장 또는 발현 또는 이들 모두를 위해 디자인된 벡터를 포함한다. 적합한 벡터의 예는 예를 들어 플라스미드, 플라스미드-리포솜 복합체, CELid 벡터 (예를 들어, Li et al., PLoS One, 8(8): e69879. doi: 10.1371/journal.pone.0069879 (2013) 참조) 및 바이러스 벡터 예컨대 파보바이러스-기반 벡터 (즉, AAV 벡터), 레트로바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)-기반 벡터, 아데노바이러스-기반 벡터 및 폭스바이러스 벡터를 포함한다. 이들 발현 구조체들 중 임의의 것은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 양상에서, 벡터는 바이러스 벡터 예컨대 AAV 벡터이다. 상기 AAV 벡터는 안구 세포 (예: RPE 세포)에 투여하기에 적합한 임의의 AAV 혈청형 또는 이의 변이체로 패키징하는데 적합할 수 있다. 적합한 AAV 혈청형의 예는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 이의 변이체, 및 조작되거나 또는 새롭게 합성된 AAV 바이러스 예컨대 AAV.7m8을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
AAV 벡터는 본원에 기재된 임의의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질, 또는 이의 단편에 패키징될 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 AAV2 캡시드에 패키징된다.
적합한 재조합 AAV는 본원에 정의된 AAV 혈청형 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 단편; 기능적 rep 유전자; 본원에 기재된 임의의 본 발명의 벡터; 및 본 발명의 벡터를 AAV 캡시드 단백질로 패키징하기에 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 패키징 세포 (packaging cell)를 배양함으로써 생성될 수 있다. AAV 캡시드에 본 발명의 AAV 벡터를 패키징하기 위해 패키징 세포에 의해 요구되는 성분들은 트란스 (trans)로 숙주 세포에 제공될 수 있다. 대안으로서, 임의의 하나 이상의 필수 성분들 (예: 본 발명의 벡터, rep 서열, 캡시드 서열 및/또는 헬퍼 기능)은 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 필수 성분들 중 하나 이상을 함유하도록 조작된 안정한 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, AAV 벡터는 자기-상보적 (self-complementary)이다. 자기-상보적 벡터는 유리하게는 제2 가닥 DNA 합성의 속도-제한 단계를 극복하고, 조기 개시 및 더 강한 유전자 발현을 부여할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 벡터는 재조합 발현 벡터이다. 본원의 목적을 위해, 용어 "재조합 발현 벡터"는 구조체가 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 숙주 세포에 의해 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 발현되도록 하는 유전자-변형된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구조체를 의미하며, 상기 벡터는 세포와, 세포내에서 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 발현되기에 충분한 조건하에 접촉된다. 본 발명의 벡터는 전체적으로 자연 발생하지 않는다. 그러나, 벡터의 일부는 자연적으로 발생할 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 DNA 및 RNA를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 타입의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 합성되거나 또는 천연 공급원으로부터 일부 수득될 수 있으며, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터는 자연-발생, 비-자연-발생 뉴클레오티드간 연결, 또는 이들 연결 타입을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 비-자연 발생 또는 변경된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 연결은 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.
벡터는 예를 들어, Green et al., supra.에 기재된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 원형 또는 선형인 발현 벡터의 구조체는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 기능하는 복제 시스템을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은 예를 들어 ColE1, 2μ 플라스미드, λ, SV40, 소 유두종 바이러스 (bovine papilloma virus) 등으로부터 유래될 수 있다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 추가하여, 벡터는 숙주 (예: 포유동물 예컨대 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 고양이, 개, 토끼, 돼지, 소, 말 또는 영장류 (예: 인간))에서 전달 및 발현을 위한 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
벡터는 형질전환 또는 형질감염된 숙주의 선택을 가능하게 하는, 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생물제 저항성, 예를 들어 항생제, 중금속 등에 대한 저항성, 원영양성 (prototrophy)을 제공하기 위한 영양요구성 숙주에서의 보완 등을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터에 적합한 마커 유전자는 예를 들어 네오마이신/G418 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 히스티디놀 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 및 암피실린 저항성 유전자를 포함한다.
벡터는 벡터로 형질감염되거나 또는 벡터를 포함하는 바이러스로 감염된 세포내 벡터에 포함된 핵산의 전사, 번역 및 발현 중 하나 이상을 허용하는 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된, "작동 가능하게 연결된" 서열은 항시적으로 활성인 TFEB 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 인접한 조절 서열, 및 항시적으로 활성인 TFEB 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제어하기 위해 트란스로 또는 거리를 두고 작용하는 조절 서열 모두를 포함한다.
조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; RNA 처리 신호 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (polyA) 신호 서열; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열 (즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 코딩된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. PolyA 신호 서열은 합성일 수 있거나, 또는 예를 들어 SV-40, 인간 및 소를 포함하는 많은 적합한 종으로부터 유래될 수 있다.
벡터가 숙주 (예: 인간)에게 투여하기 위한 것인 경우, 벡터 (예: AAV)는 바람직하게는 표적 세포에서 낮은 복제 효율을 갖는다 (예를 들어, 세포당 약 1개 이하의 자손 또는 더 바람직하게는 세포당 0.1개 이하의 자손이 생성됨). 복제 효율은 표적 세포의 감염 후 바이러스 역가를 결정함으로써 경험적으로 용이하게 결정될 수 있다.
폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터는 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터 및 담체 (예: 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체)를 포함하는 조성물 (예: 약학적 조성물)로서 제제화될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 조성물은 단독으로 또는 약학적 제제의 일부로서 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다.
조성물 (예: 약학적 조성물)은 본 발명의 하나 초과의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 또는 조성물을 포함할 수 있다. 대안으로서, 또는 추가로, 조성물은 하나 이상의 다른 약학적 활성제 또는 약물을 포함할 수 있다. 약학적 조성물에 사용하기에 적합할 수 있는 이러한 다른 약학적 활성제 또는 약물의 예는 AMD 속발성 지도모양 위축을 가진 환자의 경우 람팔리주맙 (lampalizumab) (항-보체 인자 D; Genentech); 습성 AMD의 경우 브롤리시주맙 (brolicizumab) (pan-isoform 항-VEGF-A; Novartis); 습성 AMD 및 당뇨병성 망막 부종 (DME)의 경우 OPT-302 (가용성 VEGF-C/D 수용체; Ophthea); 습성 AMD의 경우 PanOptica's 국소 VEGF 억제제; LUCENTISTM (라니비주맙 주사제)와 선택적으로 조합된 페그플레라닙 (pegpleranib) (PDGF 이소형에 결합된 DNA 압타머; Ophtotech/Novartis); EYLEATM (아플리버셉트 (aflibercept))와 선택적으로 공동-제제화된 리누쿠맙 (rinucumab) (항-PDGF 수용체; Regeneron); DE-120 (항-PDGF/VEGF 이중특이적; Santen); 보롤라닙 (vorolanib) (pDGF 및 VEGF에 대한 키나제 활성을 억제하는 경구용 RTK 억제제; Tyrogenex); EYLEATM (아플리버셉트)와 선택적으로 조합된 네바쿠맙 (nevacumab) (항-안지오포이에틴 2; Regeneron); RG-7716 (항-안지오포이에틴 2/VEGF 이중특이적; Chugai); ARP-1536 (항 VE PTP; Akebia/Aeripo); ICON-1 (조직 인자에 결합된 키메라 단백질; Iconic Therapeutic); 및 카로툭시맙 (carotuximab) (항-엔도긴; Tracon/Santen)을 포함한다.
담체는 통상적으로 사용되는 임의의 것일 수 있고, 물리화학적 고려사항 예컨대 용해도 및 활성 화합물(들)과의 반응성 결여, 및 투여 경로에 의해서만 제한된다. 본원에 기재된 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어 비히클, 아쥬반트, 부형제 및 희석제는 당업자에게 잘 알려져 있고, 용이하게 입수 가능하다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 활성제(들)에 대해 화학적으로 불활성이고, 사용 조건하에서 유해한 부작용 또는 독성이 없는 것이 바람직하다.
담체의 선택은 부분적으로 본 발명의 특정 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 이의 조성 및 사용된 기타 활성제 또는 약물뿐만 아니라, 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 또는 이의 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다.
폴리펩티드, 핵산, 벡터, 또는 이들의 조성물은 대상체에게 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 그 핵산을 포함하는 벡터는 세포 (예컨대 대상체내 세포)에, 임의의 다양한 기술에 의해 도입될 수 있으며, 예컨대 핵산을 전달 및 발현시킬 수 있는, 본원에 기재된 핵산 또는 구조체의 일부로서의 벡터와 세포를 접촉시킴으로써 도입될 수 있다. 세포에 핵산을 도입하고 발현시키기 위한 특정 프로토콜은 당해 분야에 알려져 있다.
폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 그의 조성물의 임의의 적절한 용량이 대상체에게 투여될 수 있다. 적절한 용량은 대상체의 연령, 체중, 키, 성별, 일반적인 건강 상태, 과거 병력 및 질병 진행과 같은 요인에 따라 달라지며, 임상의가 결정할 수 있다. 양 또는 용량은 임상적으로 합리적인 기간에 걸쳐 대상체에서 원하는 생물학적 반응, 예를 들어 치료 또는 예방 반응에 영향을 주기에 충분해야 한다.
예를 들어, 폴리펩티드는 숙주 (예: 포유동물 예컨대 인간)의 백신접종 (vaccination) 당 약 0.05 mg 내지 약 10 mg (예: 0.1 mg, 0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 및 이들의 범위), 바람직하게는 백신접종당 약 0.1 mg 내지 약 5 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 수회 용량 (예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 초과)이 (예컨대 수주 또는 수개월의 기간에 걸쳐서) 제공될 수 있다.
투여 기간은 치료 진행에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 구체예에서, 투여 기간은 1년 미만, 9개월 미만, 8개월 미만, 7개월 미만, 6개월 미만, 5개월 미만, 4개월 미만, 3개월 미만, 2개월 미만, 또는 1개월을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 투여 기간은 투여 기간의 길이 동안 1일 3회 용량, 1일 2회 용량, 또는 1일 1회 용량을 포함할 수 있다.
벡터가 바이러스 벡터인 경우, 적절한 용량은 약 1 x 105 내지 약 1 x 1012 (예: 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 및 이들의 범위)의 플라크 형성 유닛 (plaque forming units: pfus)을 포함할 수 있고, 상기 용량의 더 낮거나 또는 더 높은 용량이 숙주에게 투여될 수 있다.
폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 이의 조성물은 대상체에게 국소, 피하, 근육내, 피부내, 복강내, 척추강내, 정맥내, 망막하 주사, 및 유리체내 주사를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 또는 조성물은 망막하 또는 유리체내 주사에 의한 안구로의 직접 주사, 또는 국소 적용 (예: 점안제로서)에 의해 직접 투여 (예: 국소 투여)될 수 있다. 다중 투여가 제공되는 경우, 투여는 대상체의 하나 이상의 부위에서 수행될 수 있고, 단일 용량은 개인의 1, 2, 3, 4개 이상의 부위에 투여하기 위해 단일 용량을 동일한 부분으로 나누어 투여될 수 있다.
폴리펩티드, 핵산, 벡터, 또는 이의 조성물의 투여는 "예방적" 또는 "치료적"일 수 있다. 예방적으로 제공되는 경우, 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 이의 조성물은 AMD, 신경변성 질환, DR 및/또는 DME로 대상체가 진단되기 전에 제공된다. 예를 들어, AMD, 신경변성 질환, DR 및/또는 DME가 발병할 위험이 있는 대상체는 예방적으로 치료되는 바람직한 환자 그룹이다. 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 이의 조성물의 예방적 투여는 AMD, 신경변성 질환, DR 및/또는 DME를 예방, 개선 또는 지연시킨다. 치료적으로 제공되는 경우, 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 이의 조성물은 AMD, 신경변성 질환, DR 및/또는 DME의 진단 시에 또는 그 후에 제공된다.
대상체가 이미 AMD, 신경변성 질환, DR 또는 DME로 진단된 경우, 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 이들의 조성물은 다른 치료적 치료 예컨대 람팔리주맙 (항-보체 인자 D; Genentech); 브롤리시주맙 (pan-isoform 항-VEGF-A; Novartis); OPT-302 (가용성 VEGF-C/D 수용체; Opthea); PanOptica 국소 VEGF 억제제; 페그플레라닙 (PDGF 이소형에 결합된 DNA 압타머; Ophtotech/Novartis); LUCENTISTM (라니비주맙 주사); 리누쿠맙 (항-PDGF 수용체; Regeneron); EYLEATM (아플리버셉트); DE-120 (항-PDGF/VEGF 이중특이적; Santen); 보롤라닙 (pDGF 및 VEGF에 대한 키나제 활성을 억제하는 경구용 RTK 억제제; Tyrogenex); 네바쿠맙 (항-안지오포이에틴 2; Regeneron); RG-7716 (항-안지오포이에틴 2/VEGF 이중특이적; Chugai); ARP-1536 (항 VE PTP; Akebia/Aeripo); ICON-1 (조직 인자에 결합된 키메라 단백질; Iconic Therapeutic); 및/또는 카로툭시맙 (항-엔도긴; Tracon/Santen)과 함께 투여될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "치료하다" 및 "예방하다"는 반드시 100% 또는 완전한 치료 또는 예방을 의미하는 것은 아니다. 오히려, 당업자가 잠재적인 유익 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인정하는 치료 또는 예방의 정도는 다양하다.
본 발명의 방법을 위한 약학적 조성물의 다양한 적합한 제제가 존재한다. 임의의 적합한 담체가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있고, 이러한 담체는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 담체의 선택은 부분적으로 조성물이 투여되는 특정 부위 (예: 안구 세포, RPE 세포, 광수용기 세포, 간상체 및 원추체) 및 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 약학적 조성물은 선택적으로 멸균, 또는 하나 이상의 아데노-관련 바이러스 벡터를 제외하고 멸균될 수 있다.
약학적 조성물에 적합한 제제는 수성 및 비-수성 용액, 항산화제, 완충제 및 정균제를 함유할 수 있는 등장성 멸균 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제제는 앰플 및 바이알과 같은 단위-용량 또는 다중-용량 밀봉 용기에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 물을 부가하는 것이 요구되는 동결-건조 (냉동건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 담체는 완충된 식염수 용액이다. 더 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물은 투여 전에 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터를 손상으로부터 보호하기 위해 제제화된다. 예를 들어, 약학적 조성물은 유리 제품, 주사기 또는 바늘과 같은, 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터를 제조, 저장 또는 투여하는데 사용되는 장치에서 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터의 손실을 감소시키기 위해 제제화될 수 있다. 약학적 조성물은 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터의 광 민감도 및/또는 온도 민감도를 감소시키기 위해 제제화될 수 있다. 이를 위해, 약학적 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 액체 담체, 예를 들어, 상기 기재된 것들, 및 폴리소르베이트 80, L-아르기닌, 폴리비닐피롤리돈, 트레할로스, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 안정화제를 포함한다. 이러한 조성물의 사용으로 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터의 저장 수명을 연장하고, 투여를 용이하게 하며, 본 발명의 방법의 효율성을 증가시킬 수 있다.
약학적 조성물은 또한 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터의 형질도입/형질감염 효율을 향상시키기 위해 제제화될 수 있다. 또한, 당업자는 약학적 조성물이 다른 치료제 또는 생물학적 활성제를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
하기 구체예가 예시된다:
구체예 1. 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 리소좀 기능을 회복시키는 방법으로서,
(i) 전사 인자 EB (TFEB)의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 2. 구체예 1에 있어서, 상기 대상체는 연령-관련 황반 변성 (AMD)을 갖거나, 또는 AMD가 발병할 위험이 있는 것인 방법.
구체예 3. 구체예 2에 있어서, 상기 AMD는 위축성 AMD이고, 선택적으로 상기 위축성 AMD는 지도모양 위축을 포함하는 것인 방법.
구체예 4. 구체예 2에 있어서, 상기 AMD는 습성 AMD인 것인 방법.
구체예 5. 구체예 1에 있어서, 상기 대상체는 Stargardt 황반 망막 변성을 갖거나, 또는 Stargardt 황반 망막 변성이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
구체예 6. 구체예 1에 있어서, 상기 대상체는 신경변성 질환을 갖거나, 또는 신경변성 질환이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
구체예 7. 구체예 6에 있어서, 상기 신경변성 질환은 알츠하이머병 또는 파킨슨병인 것인 방법.
구체예 8. 구체예 1에 있어서, 상기 대상체는 당뇨병성 망막병증 (DR)을 갖거나, 또는 DR이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
구체예 9. 대상체에서 연령-관련 황반 변성 (AMD), Stargardt 황반 망막 변성, 신경변성 질환 또는 당뇨병성 망막병증을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서,
(i) 전사 인자 EB (TFEB)의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 10. 구체예 9에 있어서, 상기 AMD는 위축성 AMD이고, 선택적으로 상기 위축성 AMD는 지도모양 위축을 포함하는 것인 방법.
구체예 11. 구체예 9에 있어서, 상기 AMD는 습성 AMD인 것인 방법.
구체예 12. 구체예 9에 있어서, 상기 신경변성 질환은 알츠하이머병 또는 파킨슨병인 것인 방법.
구체예 13. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 hVMD2 프로모터를 추가로 포함하는 것인 방법.
구체예 14. 구체예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 벡터에 포함되는 것인 방법.
구체예 15. 구체예 14에 있어서, 상기 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터인 것인 방법.
구체예 16. 구체예 15에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2인 것인 방법.
구체예 17. 구체예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 138, 142, 211, 455, 462, 463, 466, 467, 및 469 중 하나 이상의 위치에 있는 세린이 독립적으로 다른 하나의 아미노산으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
구체예 18. 구체예 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 138에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
구체예 19. 구체예 17 또는 18에 있어서, 서열번호: 1의 위치 142에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
구체예 20. 구체예 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 1의 위치 211에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
구체예 21. 구체예 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 1의 위치 455에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
구체예 22. 구체예 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 1의 위치 462에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되는 것인 방법.
구체예 23. 구체예 17 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 1의 위치 463에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되는 것인 방법.
구체예 24. 구체예 17 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 1의 위치 466에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되는 것인 방법.
구체예 25. 구체예 17 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 1의 위치 467에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
구체예 26. 구체예 17 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 1의 위치 469에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되는 것인 방법.
구체예 27. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 인간인 것인 방법.
구체예 28. 구체예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산, 폴리펩티드, 또는 그 핵산을 포함하는 벡터가 망막하 주사, 유리체내 주사, 또는 국소 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
구체예 29. 서열번호: 1의 위치 138, 142, 211의 각 위치에 있는 세린이 알라닌으로 각각 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
구체예 30. 서열번호: 1의 위치 455에 있는 세린이 알라닌으로 치환되고, 선택적으로 서열번호: 1의 위치 211에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
구체예 31. 서열번호: 1의 위치 462, 463, 466, 및 469의 각 위치에 있는 세린이 아스파르트산으로 각각 치환되고, 서열번호: 1의 위치 467에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
구체예 32. 구체예 29 내지 31 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
구체예 33. 구체예 32의 핵산을 포함하는 벡터.
구체예 34. (a) 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 (b) 구체예 29 내지 31 중 어느 하나의 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 그 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
본 실시예는 항시적으로 활성인 TFEB의 투여로 RPE 세포에서 자가포식 및 리소좀 기능의 변경을 완화하여, AMD-유사 표현형을 억제하는 것을 입증하였다.
Cryba1 녹아웃 및 조건부 녹아웃 마우스 (도 11-18 참조)
Cryba1 (βA3/A1-크리스탈린 코딩) 녹아웃 마우스 (KO) 및 조건부 녹아웃 (cKO)은 AMD-유사 병리를 가진 마우스 모델이다. βA3/A1-크리스탈린 단백질은 리소좀 내강에 국재되어 있다. Cryba1 KO 또는 cKO 마우스에서, RPE 세포 이상이 하기와 같이 발생한다: 비정상 ERM 인산화 및 Rho-GTPase 발현 (2-3주); 미세융모 분열 (disorganization) (1개월); RPE 이질성, 미세융모 손실, 미스트래피킹, 및 EMT (3-4개월); 및 심각한 표현형 (9개월) (도 15C 참조).
Cryba1 cKO 마우스는 RPE 세포에서 세포내이입 경로에서 단백질 발현이 감소되었고 (예: Rab5, EEA1 및 AAPL1), RPE 세포에서 정점 측 단백질 (예: ERM 및 EBP50)의 발현이 감소되었으며, RPE 세포에서 클라트린-매개 세포내이입이 변경되었다 (도 2A-B, 3A-C 및 4 참조). Cryba1 cKO 마우스는 RPE 세포에서 철 축적 및 인플라마좀 활성화 증가를 보여주었다 (도 8A-C). 또한, Cryba1 cKO 마우스는 CLEAR (조정된 리소좀 발현 및 조절) 네트워크 유전자의 발현이 감소되었고, 리소좀 pH는 증가되었으며, 카텝신 D 효소 활성은 감소되었고, 조약돌-유사 구조가 손실되었으며, RPE 세포에서 RPE65의 발현은 감소되었다 (도 11A-B, 12A-B, 13A-B, 14A-B 및 17A 참조).
또한, TFEB 활성화는 인간 AMD 환자의 RPE 세포 및 Cryba1 KO 마우스에서 비정상적이다 (도 1A-1C 및 11A-11B 참조).
야생형 및 항시적으로 활성인 TFEB를 운반하는 AAV 벡터의 제조
Cryba1 cKO 마우스의 AMD-유사 표현형이 항시적으로 활성화된 TFEB에 의해 구조될 수 있는지를 결정하기 위해, 야생형 (WT) 및 항시적으로 활성인 TFEB-S210A를 운반하는 AAV 벡터를 도 5에 개시된 바와 같이 조작하였다.
WT TFEB를 먼저 pCR-Blunt 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 클로닝하였다. 간단히 말해서, RNA를 마우스 신장으로부터 추출한 다음에, 역전사하여 cDNA를 생성하였다. WT TFEB는 마우스 TFEB (CCDS 28856.1, TFEB_CDS_F: ATGGCGTCACGCATCGGG (서열번호: 2) 및 TFEB_CDS_R: TCACAGAACATCACCCTCCT (서열번호: 3))의 더 긴 주석을 위해 디자인된 프라이머 세트 및 High-Fidelity Phusion 폴리머라제 (Thermo Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 산물을 겔 정제하고, 제조자의 지침에 따라 pCR-Blunt 벡터에 결찰시켰다 (시퀀싱에 의해 확인됨).
인간 및 마우스 TFEB 단백질들의 정렬로, 마우스 TFEB의 더 짧은 주석 (CCDS 50133.1)에 상응하는 476개의 잔기 중첩에서 93.5%의 동일성을 나타내었다. 특히, 마우스에서, 위치 44에서 글루타민 잔기 하나가 결실되어, TFEB의 핵 국재화 조절에 중요한 세린의 위치가 인간에서 위치 211과 비교하여 마우스에서 위치 210으로 이동되었다.
TFEB-S210A 돌연변이체를 형성하기 위해, 제조자의 지침에 따라 QuikChange Lightning 부위-지정 돌연변이유발 키트 (Agilent, Santa Clara, CA)를 사용하여 pCR-Blunt의 WT TFEB에 점 T-＞G 돌연변이를 도입함으로써 TCC 코돈을 GCC로 돌연변이시켰다 (시퀀싱에 의해 확인).
Gibson 어셈블리 (Gibson assembly)를 위한 플라스미드를 제조하기 위해, Age1 (BshT1) 및 Sac1 제한 효소를 사용하여 eGFP를 절단하고, 생성된 선형화된 sc (자가 상보적)-hVMD2를 겔 정제하였다. TFEB (CCDS 50133.1)의 더 짧은 버전이 하기 프라이머를 사용하여 pCR-Blunt 벡터에서 WT 또는 돌연변이된 TFEB로부터 PCR-증폭되었다: sc-hVMD2_TFEB_F: accagcctagtcgccagaccaccggGCCACCATGGCGTCACGCATCGGG (서열번호: 4) 및 sc-hVMD2_TFEB_R: cacagtcgaggctgatcagcgagctTCACAGAACATCACCCTCCT (서열번호: 5). 프라이머들 모두는 선형화된 sc-hVMD2 전달 플라스미드 (소문자)와 중첩되는 서열을 함유하였고, 포워드 프라이머는 번역 효능을 개선하기 위해 KOZAK 서열 GCCACC를 함유하였다.
선형화된 sc-hVMD2 플라스미드 및 새롭게 PCR-증폭된 WT 또는 TFEB-S210A를 Gibson 어셈블리 키트 (New England Biolabs, Ipswich, MA)를 사용하여 결찰시켰다. ITR의 무결성은 SmaI 소화에 의해 확인하였다. sc-hVMD2-TFEB 및 sc-hVMD2-TFEB-S210A 구조체를 AAV-HEK-293 세포 (Agilent)에서 삼중 형질감염 방법을 사용하여 AAV2 및 AAV8-2YF 벡터에 패키징하였다. 바이러스를 요오딕사놀 구배 (iodixanol gradient)에서 정제하고, 버퍼를 DPBS로 교환하였다. 바이러스는 QPCR을 사용하여 적정하였고, 1.64x1012vg (벡터 게놈)/ml (WT) 및 1.72x1012vg/ml (돌연변이체)의 역가를 가졌다.
AAV-TFEB 벡터의 RPE 세포로의 형질감염
도 6A-C에 도시된 바와 같이, AAV2-TFEB-GFP의 망막하 주사로 단일 망막하 감염 후에 RPE 세포의 85-90% 초과의 효과적인 감염을 나타내었다. 그러므로, AAV-TFEB 벡터는 RPE 세포에서의 형질감염에 적합하다.
항시적으로 활성인 TFEB를 발현하는 AAV 벡터를 사용한 Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포 감염은 자가포식 및 리소좀 기능의 변경을 완화시킨다.
Cryba1 KO 마우스를 Valapala et al., Sci. Rep., 5: 8755 (2015)에 기재된 바와 같이 제조하였다. Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포를 항시적 활성 형태의 마우스 TFEB (TFEBS210A)를 발현하는 AAV2 벡터로 감염시켰다. 대조군으로서, Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포를 야생형 마우스 TFEB 또는 빈 벡터 (empty vector)를 발현하는 AAV 벡터로 감염시켰다.
도 7A-C 및 10A-B에 나타낸 바와 같이, 항시적으로 활성인 TFEB는 Cryba1 KO 및 cKO 마우스의 RPE 세포 핵에 국재되었고, 자가포식소체 축적 및 CLEAR 네트워크 유전자 발현의 변경을 각각 감소시켰다.
항시적으로 활성인 TFEB를 발현하는 AAV 벡터를 사용한 Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포 감염은 철 축적 및 인플라마좀 활성화를 감소시킨다.
도 8A-C에 나타낸 바와 같이, 나이든 Cryba1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 총 철 및 산화환원 민감성 제1철 이온 수준은 대조군과 비교하여 증가하였다. 또한, 인플라마좀 마커 NLRP3 및 IL-1β의 수준은 연령-일치 대조군에 비해 나이든 Cryb1 cKO 마우스의 RPE 세포에서 상승하였다. RPE 세포의 리소좀 이상으로 인한 철 과부하는 인플라마좀 활성화 및 세포 사멸을 유발할 수 있다.
항시적으로 활성인 TFEB가 이러한 표현형을 구조할 수 있는지를 확인하기 위해, Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포를, 철 킬레이터 LCN-2 및 철 공급원 FAC의 존재 하에 항시적으로 활성인 형태의 마우스 TFEB (TFEBS210A)를 발현하는 AAV 벡터로 감염시켰다. 대조군으로서, Cryba1 KO 마우스의 RPE 세포를, 철 킬레이터 LCN-2 및 철 공급원 FAC의 존재하에 야생형 마우스 TFEB를 발현하는 AAV 벡터로 감염시켰다.
철 축적 및 인플라마좀 활성화 (NKRP3 및 IL-1β 발현 증가)는 대조군 (WT) TFEB 벡터-감염된 세포와 비교하여, 돌연변이체 TFEB 벡터-감염된 Cryba1 KO RPE 세포에서 역전되었다 (도 9A-C 참조).
이와 같이, 항시적으로 활성인 TFEB의 투여로 RPE 세포의 자가포식 및 리소좀 기능의 변경을 완화시키고, 이는 AMD, 당뇨병성 망막병증, 및 당뇨병성 황반 부종, 및 신경변성 질환 예컨대 알츠하이머병 또는 파킨슨병과 같은 장애의 치료 또는 예방에서 항시적으로 활성인 TFEB의 사용을 뒷받침한다.
본원에서 인용된 공개 문헌, 특허 출원, 및 특허를 포함하는 모든 참조 문헌들은, 각각의 참조 문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조로서 통합된다고 표시된 것과 같이, 그리고 완전하게 본원에 개시된 것과 같이, 동일한 범위를 참조하는 것으로서 본원에 통합된다.
본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 하기의 청구항의 맥락에서), 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 "적어도 하나" 및 유사한 지시어의 사용은, 다르게 표시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "적어도 하나" 앞에 하나 이상의 항목 목록 (예를 들어, "A 및 B 중 적어도 하나")의 사용은, 다르게 표시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 나열된 항목으로부터 선택되는 하나의 항목 (A 또는 B) 또는 나열된 항목들 중 둘 이상의 임의의 조합 (A 및 B)을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포괄하는" 및 "함유하는"은, 다르게 표시되지 않는 한, 개방된 끝을 갖는 용어 (즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미)로 해석되어야 한다. 본원에서 수치의 범위의 인용은, 다르게 표시되지 않는 한, 단순히 그 범위 내의 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 축약적 방법으로서 역할하도록 의도하는 것이고, 각각의 별도의 값은 그들 각각이 본원에 언급된 것과 같이 본 명세서에 통합된다. 본원에 설명된 모든 방법은 본원에서 다르게 표시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의 및 모든 예시, 또는 예시적 언어 (예를 들면, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것으로 의도되며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서에서의 언어는 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 임의의 미-청구된 요소를 표시하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 바람직한 구체예가 본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최상의 형태를 포함하여 본원에 기재되어 있다. 이러한 바람직한 구체예의 변형들은 전술된 설명을 읽으면 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자들은 숙련된 기술자들이 이러한 변형들을 적절하게 이용하고, 본 발명자들은 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 본 발명이 실시될 것을 예상한다. 따라서 본 발명은 준거법에 의해 허용되는 바와 같이, 본원에 첨부된 청구항에 인용된 청구 사항의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 더욱이, 이들의 모든 가능한 변형에서 상기 기재된 요소들의 임의의 조합이 본원에 다르게 표시되거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함된다.
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Claims (34)

  1. 망막 색소 상피 (retinal pigment epithelial: RPE) 세포의 리소좀 기능을 회복시키는 방법으로서,
    (i) 전사 인자 EB (transcription factor EB: TFEB)의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 연령-관련 황반 변성 (age-related macular degeneration: AMD)을 갖거나, 또는 AMD가 발병할 위험이 있는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 AMD는 위축성 AMD이고, 선택적으로 상기 위축성 AMD는 지도모양 위축 (geographic atrophy)을 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 AMD는 습성 AMD (wet AMD)인 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 Stargardt 황반 망막 변성을 갖거나, 또는 Stargardt 황반 망막 변성이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 신경변성 질환을 갖거나, 또는 신경변성 질환이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 신경변성 질환은 알츠하이머병 또는 파킨슨병인 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy: DR)을 갖거나, 또는 DR이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
  9. 대상체에서 연령-관련 황반 변성 (AMD), Stargardt 황반 망막 변성, 신경변성 질환 또는 당뇨병성 망막병증을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서,
    (i) 전사 인자 EB (TFEB)의 항시적으로 활성인 형태를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 AMD는 위축성 AMD이고, 선택적으로 상기 위축성 AMD는 지도모양 위축을 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 AMD는 습성 AMD인 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 신경변성 질환은 알츠하이머병 또는 파킨슨병인 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 hVMD2 프로모터를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 벡터에 포함되는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 벡터는 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated viral: AAV) 벡터인 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2인 것인 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 1의 위치 138, 142, 211, 455, 462, 463, 466, 467, 및 469 중 하나 이상의 위치에 있는 세린이 독립적으로 다른 하나의 아미노산으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 138에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 142에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 211에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
  21. 청구항 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 455에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
  22. 청구항 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 462에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되는 것인 방법.
  23. 청구항 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 463에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되는 것인 방법.
  24. 청구항 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 466에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되는 것인 방법.
  25. 청구항 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 467에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것인 방법.
  26. 청구항 17에 있어서, 서열번호: 1의 위치 469에 있는 세린이 아스파르트산으로 치환되는 것인 방법.
  27. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 인간인 것인 방법.
  28. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산, 폴리펩티드, 또는 그 핵산을 포함하는 벡터가 망막하 주사, 유리체내 주사, 또는 국소 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  29. 서열번호: 1의 위치 138, 142, 및 211의 각 위치에 있는 세린이 알라닌으로 각각 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  30. 서열번호: 1의 위치 455에 있는 세린이 알라닌으로 치환되고, 선택적으로 서열번호: 1의 위치 211에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  31. 서열번호: 1의 위치 462, 463, 466, 및 469의 각 위치에 있는 세린이 아스파르트산으로 각각 치환되고, 서열번호: 1의 위치 467에 있는 세린이 알라닌으로 치환되는 것을 제외하고는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  32. 청구항 29의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  33. 청구항 32의 핵산을 포함하는 벡터.
  34. (a) 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 (b) 청구항 29의 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 그 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
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