KR20220061503A - Antibacterial Stapled Peptides Targeting Toxin-antitoxin System of Mycobacterium tuberculosis and Use Thereof - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to antibacterial staple peptides targeting a toxin-antitoxin system of Mycobacterium tuberculosis VapBC30, or uses thereof. The present invention inhibits the binding of a toxin-antitoxin complex and consequently induces the death of Mycobacterium tuberculosis by the RNase activity of the isolated toxin. The antibacterial staple peptides of the present invention can be used as an antibiotic composition that can provide a novel antibacterial strategy against Mycobacterium tuberculosis.

Description

결핵균 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 스테이플 펩타이드 및 이의 용도 {Antibacterial Stapled Peptides Targeting Toxin-antitoxin System of Mycobacterium tuberculosis and Use Thereof}Antibacterial Stapled Peptides Targeting Toxin-antitoxin System of Mycobacterium tuberculosis and Use Thereof

본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 스테이플 펩타이드에 관한 것이다. The present invention relates to an antibacterial staple peptide targeting the toxin-antitoxin system of Mycobacterium tuberculosis .

박테리아 독소-항독소 (TA) 시스템은 박테리아 생존에 필수적인 요소로 간주되고 있다. 박테리아 독소-항독소 시스템은 결합 조절자로서 세포 생존에 필수적인 역할을 한다. 전형적으로 독소는 음성 조절자 역할을 하고 RNA 절단, 아세틸화, 인산화, 및 ATP 합성 억제와 같은 다양한 기능에 관여한다. 이러한 제어 작용 전반에 걸쳐 독소는 성장을 억제하고 궁극적으로 박테리아 세포를 사멸시킨다. 독소와 달리 항독소는 단백질 또는 유전자 수준에서 동족 독소에 결합함으로써 RNase (리보뉴클레아제) 활성의 중화를 통해 세포 생존에서 양성 조절자 역할을 한다. 영양 부족이나 항생제 치료와 같은 다양한 스트레스 조건하에서 박테리아는 항상성을 유지하기 위해 독소와 항독소 발현 수준 간의 균형과 관련된 메커니즘을 이용한다. 독소-항독소 시스템은 박테리아 생존과 밀접한 관련이 있기 때문에, 독소-항독소 시스템이 신규 항균제 개발을 위한 유망한 항균 표적으로 인식되고 있다.Bacterial toxin-antitoxin (TA) systems are considered essential for bacterial survival. The bacterial toxin-antitoxin system plays an essential role in cell survival as binding regulators. Toxins typically act as negative regulators and are involved in various functions such as RNA cleavage, acetylation, phosphorylation, and inhibition of ATP synthesis. Throughout this control action, toxins inhibit growth and ultimately kill bacterial cells. Unlike toxins, antitoxins act as positive regulators in cell survival through neutralization of RNase (ribonuclease) activity by binding to cognate toxins at the protein or gene level. Under various stressful conditions, such as malnutrition or antibiotic treatment, bacteria exploit mechanisms related to the balance between toxin and antitoxin expression levels to maintain homeostasis. Since the toxin-antitoxin system is closely related to bacterial survival, the toxin-antitoxin system is recognized as a promising antibacterial target for the development of novel antibacterial agents.

결핵균(M. tuberculosis)의 전체 게놈에는 풍부한 독소-항독소 시스템이 있다. 놀랍게도 독소-항독소 시스템에 속하는 단백질은 H37Rv 균주에 있는 모든 단백질의 5% 초과를 차지한다. 결핵균 감염의 치료는 여전히 오랜 기간의 병용 요법이 요구되기 때문에, 특히 다중약물 내성 결핵 (MDR-TB) 및 광범위한 약물 내성 결핵 (XDR-TB)의 경우에는 전형적인 항생제와는 다른 새로운 작용 기작이 필요하다. 계속되는 연구에 따르면 독소-항독소 시스템은 박테리아의 감염 및 병원성과 관련이 있을 가능성이 크므로, 이들의 박테리아 생존에서의 독소-항독소 시스템의 기능 및 규제 역할이 지난 10년 동안 광범위하게 논의되고 있다.The entire genome of M. tuberculosis has an abundant toxin-antitoxin system. Surprisingly, proteins belonging to the toxin-antitoxin system account for more than 5% of all proteins in the H37Rv strain. Because treatment of Mycobacterium tuberculosis infection still requires long-term combination therapy, a novel mechanism of action different from typical antibiotics is needed, especially for multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) and widespread drug-resistant tuberculosis (XDR-TB). . As ongoing research indicates that the toxin-antitoxin system is likely to be associated with bacterial infection and pathogenicity, the function and regulatory role of the toxin-antitoxin system in their bacterial survival has been widely discussed over the past decade.

구체적으로, 결핵균으로부터의 독소-항독소 시스템의 구조-기능 관계 연구는 독소와 항독소 사이의 단백질-단백질 상호 작용 (PPI)에 대한 정보를 제공하고, 이는 신규 항균제 개발에서 유망한 치료 표적이 될 수 있다. 특히 독소-항독소 시스템은 박테리아 병원체에서 자주 만연함에도 불구하고 진핵 세포에 존재하지 않는다는 사실 때문에 더욱 매력적인 표적이 된다. 이에 본 발명자들은 소분자에 의한 독소와 항독소 간의 상호 작용 방해를 구상하였고, 이는 항독소 단백질을 분리함으로써 독소 단백질의 RNase 활성을 유도할 수 있는 것이다.Specifically, the study of the structure-function relationship of the toxin-antitoxin system from Mycobacterium tuberculosis provides information on the protein-protein interaction (PPI) between toxin and antitoxin, which may be a promising therapeutic target in the development of novel antibacterial agents. In particular, toxin-antitoxin systems are more attractive targets due to the fact that they are not present in eukaryotic cells despite their frequent prevalence in bacterial pathogens. Accordingly, the present inventors devised a small molecule to interfere with the interaction between the toxin and the antitoxin, which can induce the RNase activity of the toxin protein by isolating the antitoxin protein.

이전 연구에 따르면, 결핵균 VapBC30 복합체 (Rv0623 - Rv0624, PDB ID: 4XGQ)의 결정 구조를 활용하여 설계된 3개의 나선형 펩타이드 세그먼트가 VapC30과 VapB30 사이의 결합 인터페이스를 모방하고 시험관 내에서 해당 독소-항독소 복합체에 대해 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 그러나 일반적으로 선형 펩타이드는 세포 투과성 및 단백질 분해 안정성이 불량하다는 단점을 갖는다. 또한, 높은 입체구조적 유연성은 표적 단백질에 대한 낮은 결합력에 기여하여 생체 활성 저하를 초래한다.According to a previous study, three helical peptide segments designed utilizing the crystal structure of the Mycobacterium tuberculosis VapBC30 complex ( Rv0623 - Rv0624 , PDB ID: 4XGQ) mimic the binding interface between VapC30 and VapB30 and bind to the corresponding toxin-antitoxin complex in vitro. It was confirmed that it exhibits inhibitory activity against However, in general, linear peptides have disadvantages of poor cell permeability and proteolytic stability. In addition, the high conformational flexibility contributes to the low binding force to the target protein, resulting in reduced bioactivity.

Schafmeister, C. E., Po, J., and Verdine, G. L. (2000), J. Am. Chem. Soc. 122, 5891-5892.Schafmeister, C. E., Po, J., and Verdine, G. L. (2000), J. Am. Chem. Soc. 122, 5891-5892.

본 발명의 목적은 결핵균 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 스테이플 펩타이드를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an antibacterial staple peptide targeting the Mycobacterium tuberculosis toxin-antitoxin system.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 독소-항독소 결합체 VapBC30 내의 결합을 억제하는 항균 스테이플 펩타이드를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 결핵균의 독소-항독소 결합체 VapBC30 내의 VapB30 및 VapC30의 결합을 억제하며, 펩타이드를 구성하는 2개 이상의 아미노산이 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 항균 스테이플 펩타이드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an antibacterial staple peptide that inhibits the binding of Mycobacterium tuberculosis toxin-antitoxin conjugate VapBC30. Specifically, the present invention provides an antibacterial staple peptide that inhibits the binding of VapB30 and VapC30 in the Mycobacterium tuberculosis toxin-antitoxin conjugate VapBC30, and that two or more amino acids constituting the peptide are linked to each other.

또한, 본 발명은 상기 항균 스테이플 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 결핵균에 대한 항균 조성물, 특히 결핵 치료용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides an antibacterial composition for Mycobacterium tuberculosis, in particular a composition for treating tuberculosis, containing the antibacterial staple peptide as an active ingredient.

본 발명의 항균 스테이플 펩타이드는 결핵균의 독소-항독소 복합체 VapBC30의 결합을 모방하지만 독소의 활성에는 영향을 미치지 않으면서, 독소-항독소 복합체의 결합을 방해하고, 결과적으로 분리된 독소의 RNase 활성에 의해 결핵균의 사멸을 유도한다. 따라서 본 발명의 항균 스테이플 펩타이드는 결핵균에 대해 신규한 항균 전략을 제공할 수 있는 항생 조성물로서 사용될 수 있다.The antibacterial staple peptide of the present invention mimics the binding of the toxin-antitoxin complex VapBC30 of Mycobacterium tuberculosis, but does not affect the activity of the toxin, and interferes with the binding of the toxin-antitoxin complex. lead to the death of Therefore, the antibacterial staple peptide of the present invention can be used as an antibiotic composition that can provide a novel antibacterial strategy against Mycobacterium tuberculosis.

도 1은 알라닌 스캐닝을 기반으로 한 스테이플 펩타이드의 설계를 나타낸다. (a) 3개의 VapBC30 유래 선형 펩타이드의 알라닌 스캔 결과 (VapB30 α152 -59, VapC30 α214 -30, 및 VapC30 α448 -56). 활성은 원래 펩타이드의 활성을 100%로 하여 나타내었다. (b) 펩타이드 스테이플화에 사용되는 올레핀 보유 비천연 아미노산. (c) 스테이플화 잔기의 위치 결정. (d) 합성 펩타이드.
도 2는 정제된 펩타이드의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 모든 스펙트럼은 애질런트 HP 1260 시스템 (Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)에서 측정되었다. Zorbax C18 컬럼 (2.7μm, 120Å, 4.6 Х 50 mm)을 정지상으로 사용하였다. 이동상의 경우 용매 A (0.1% v/v 트리플루오로 아세트산 (TFA)을 포함하는 물) 및 용매 B (아세토니트릴)를 구배로 사용하였다. 구배는 다음과 같이 주어졌다: i) 5 내지 50%의 B의 선형 구배 (0 내지 5분); ii) 50 내지 100%의 B의 선형 구배 (5 내지 7분); iii) 등용매 유지 (B, 100%) (7 내지 15분); 및 iv) 100 내지 5%의 B의 선형 구배 (15 내지 17분). 유속은 1.0 mL/분으로 설정하였다.
도 3은 펩타이드의 고분해능 (HR) 질량 스펙트럼을 나타낸다. 모든 스펙트럼은 초고해상도 ESI Q-TOF 질량 분석기 (Bruker, 미국) (V30-SP-1 내지 V30-SP-11) 및 고분해능 LC/MSMS 분광계 (AB Sciex, 미국) (V30-SP-8-FITC 내지 V30-SP-9- FITC)를 사용하여 획득하였다.
도 4는 스테이플 펩타이드에 대한 시험관 내 분석 데이터를 나타낸다. (a) 시험관 내 RNase (리보뉴클레아제) 활성 분석의 개략도. (b) 합성 스테이플 펩타이드의 시험관 내 RNase 활성 분석 결과. (c) V30-SP-8 (좌) 및 V30-SP-9 (우)의 농도 의존적 RNase 활성. (d) V30-SP-8 및 V30-SP-9의 CD 스펙트럼.
도 5는 TFE의 연속적인 증가에 따른 선형 펩타이드의 CD 분광 분석을 나타낸다.
도 6은 플루오레스세인 이소티오시아네이트 (FITC) 표지된 펩타이드 (10 μM)로 처리한 스메그마균의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지 (좌), 스메그마균의 명시야(bright-field) 이미지 (가운데) 및 병합된 이미지 (우)를 나타낸다. (a) 빈 대조군. (b) 선형 펩타이드. (c) V30-SP-8. d) V30-SP-9.
도 7은 FITC-표지 펩타이드 (10 μM)로 처리된 스메그마균의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지 (좌), 스메그마균의 명시야 이미지 (중간) 및 병합된 이미지 (우)를 나타낸다. (a) V30-SP-8. (b) V30-SP-9.
도 8은 유세포 분석 데이터를 나타낸다. (a) 미처리 (음성 대조군) 그룹에서 얻은 스메그마균 세포의 유세포 분석 결과 및 FITC-표지 펩타이드 (선형 형태, V30-SP-8 및 V30-SP-9)의 첨가시의 결과. (b) 각 펩타이드의 세포 흡수량을 나타내는 막대 그래프. 활성은 V30-SP-9의 활성을 기준으로 정규화되었다.
도 9는 V30-SP-8 및 V30-SP-9의 항균 활성을 나타낸다 (a) 스메그마균을 다양한 농도의 V30-SP-8 및 V30-SP-9로 처리하였다. 세포를 LIVE/DEAD BacLight 염색 (Syto 9; 프로피듐 요오드화물 (PI))으로 표지하고, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)로 분석하였다. 70% 이소프로필 알코올의 항균 활성은 양성 대조군을 나타낸다. 이 대조군을 사용하여 LIVE cell/DEAD cell 영역을 설정하였다. (b) FACS 데이터에 대한 막대 그래프. 히스토그램은 세 세트의 독립적인 실험을 나타낸다.1 shows the design of staple peptides based on alanine scanning. (a) Alanine scan results of three VapBC30-derived linear peptides (VapB30 α1 52 -59 , VapC30 α2 14 -30 , and VapC30 α4 48 -56 ). Activity was expressed as 100% of the original peptide activity. (b) Non-natural amino acids with olefins used for peptide stapling. (c) Positioning of stapling residues. (d) synthetic peptides.
Figure 2 shows the HPLC chromatogram of the purified peptide. All spectra were measured on an Agilent HP 1260 system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). A Zorbax C18 column (2.7 μm, 120 Å, 4.6 Х 50 mm) was used as the stationary phase. For the mobile phase solvent A (water with 0.1% v/v trifluoro acetic acid (TFA)) and solvent B (acetonitrile) were used as gradients. Gradients were given as follows: i) a linear gradient of B from 5 to 50% (0 to 5 min); ii) a linear gradient of B from 50 to 100% (5 to 7 minutes); iii) isocratic holding (B, 100%) (7-15 min); and iv) a linear gradient of B from 100 to 5% (15 to 17 minutes). The flow rate was set at 1.0 mL/min.
3 shows the high resolution (HR) mass spectrum of the peptide. All spectra were analyzed by ultra-high resolution ESI Q-TOF mass spectrometer (Bruker, USA) (V30-SP-1 to V30-SP-11) and high resolution LC/MSMS spectrometer (AB Sciex, USA) (V30-SP-8-FITC to V30-SP-9-FITC) was used.
4 shows in vitro assay data for staple peptides. (A) Schematic of an in vitro RNase (ribonuclease) activity assay. (b) In vitro RNase activity assay of synthetic staple peptides. (c) Concentration-dependent RNase activity of V30-SP-8 (left) and V30-SP-9 (right). (d) CD spectra of V30-SP-8 and V30-SP-9.
Figure 5 shows the CD spectroscopic analysis of the linear peptide according to the continuous increase in TFE.
6 is a confocal laser scanning microscope image of Smegma treated with fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled peptide (10 μM) (left), bright-field image of Smegma bacteria ( middle) and the merged image (right). (a) Blank control. (b) a linear peptide. (c) V30-SP-8. d) V30-SP-9.
7 shows a confocal laser scanning microscope image of Smegma treated with FITC-labeled peptide (10 μM) (left), a bright field image of Smegma (middle), and a merged image (right). (a) V30-SP-8. (b) V30-SP-9.
8 shows flow cytometry data. (a) Flow cytometry results of Smegma cells obtained from the untreated (negative control) group and the results upon addition of FITC-labeled peptides (linear forms, V30-SP-8 and V30-SP-9). (b) A bar graph showing the amount of cellular uptake of each peptide. Activity was normalized based on the activity of V30-SP-9.
9 shows the antibacterial activity of V30-SP-8 and V30-SP-9 (a) Smegma was treated with various concentrations of V30-SP-8 and V30-SP-9. Cells were labeled with LIVE/DEAD BacLight staining (Syto 9; propidium iodide (PI)) and analyzed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The antibacterial activity of 70% isopropyl alcohol represents a positive control. LIVE cell/DEAD cell area was established using this control. (b) Bar graphs for FACS data. Histograms represent three sets of independent experiments.

본 발명은 결핵균의 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 스테이플 펩타이드를 제공한다.The present invention provides an antibacterial staple peptide targeting the toxin-antitoxin system of Mycobacterium tuberculosis.

일 실시태양에서, 본 발명의 항균 스테이플 펩타이드는 결핵균의 독소-항독소 결합체 VapBC30 내의 VapB30 및 VapC30의 결합을 억제하며, 펩타이드를 구성하는 2개 이상의 아미노산이 서로 연결될 수 있다. 이 때 항균 스테이플 펩타이드는 5 내지 20개, 바람직하게는 8 내지 17개, 특히 8개, 9개, 13개, 15개, 또는 17개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. In one embodiment, the antibacterial staple peptide of the present invention inhibits the binding of VapB30 and VapC30 in the toxin-antitoxin conjugate VapBC30 of Mycobacterium tuberculosis, and two or more amino acids constituting the peptide may be linked to each other. In this case, the antimicrobial staple peptide may consist of 5 to 20 amino acids, preferably 8 to 17 amino acids, particularly 8, 9, 13, 15, or 17 amino acids.

스테이플 펩타이드는, 예를 들어, 2개의 아미노산이 서로 연결(스테이플링)되어 형성될 수 있고, 또는 3개의 아미노산이 서로 연결(스티칭)되어 형성될 수도 있다. 3개의 아미노산이 서로 연결된 스테이플 펩타이드는 스티치 펩타이드로 지칭되기도 한다. The staple peptide, for example, may be formed by connecting (stapling) two amino acids to each other, or may be formed by connecting (stitching) three amino acids to each other. A staple peptide in which three amino acids are linked together is also referred to as a stitch peptide.

본원에 사용된 용어 "스테이플링(stapling)"이란, 펩타이드에 탄화수소의 교차-결합 등을 도입하여 펩타이드의 α-헬릭스 구조를 안정화시킬 수 있는 기술을 말한다. "펩타이드 스테이플링"은 예컨대 폴리펩타이드 내에 존재하는 두 개의 올레핀-함유 측쇄가 가교를 형성하기 위해 고리-폐쇄 복분해(ring-closing metathesis, RCM) 반응을 사용하여 공유적으로 연결되는("스테이플드") 합성 방법을 지칭한다. 예를 들어, 펩타이드의 스테이플링을 위하여, 펩타이드 서열 중 임의의 위치(i)와 그로부터 C 말단 쪽으로 4번째 위치(i+4)에 탄화수소(예를 들어, 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 화합물)로 작용기화된 임의의 아미노산을 도입한 다음, 이 두 개의 아미노산의 잔기를 Grubbs 촉매를 이용한 복분해 반응으로 교차-결합시킨다.As used herein, the term “stapling” refers to a technique capable of stabilizing the α-helix structure of a peptide by introducing cross-linking of hydrocarbons, etc. to the peptide. “Peptide stapling” refers to, for example, two olefin-containing side chains present in a polypeptide are covalently linked (“stapled”) using a ring-closing metathesis (RCM) reaction to form a crosslink. ) refers to the synthesis method. For example, for stapling of peptides, hydrocarbons (e.g., compounds comprising a carbon-carbon double bond) at any position (i) in the peptide sequence and at the fourth position (i+4) towards the C-terminus therefrom After introducing any amino acids functionalized with

본원에 사용된 용어 "아미노산"은 아미노기 및 카르복실기를 포함하는 분자를 의미한다. 아미노산은 알파-아미노산 및 베타-아미노산을 포함한다. 아미노산은 비천연 아미노산 또는 천연 아미노산일 수 있다. 예시적인 아미노산은 펩타이드에서 발견되는 20개의 일반적인 자연 발생 알파 아미노산의 D- 및L-이성질체와 같은 천연 알파-아미노산, 비천연 알파-아미노산, 천연 베타-아미노산 (예를 들어, 베타-알라닌), 및 비천연 베타-아미노산을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 펩타이드의 구성에 사용되는 아미노산은 유기 합성에 의해 제조되거나, 다른 경로, 예컨대, 천연 공급원으로부터 단리 또는 분해에 의해 수득될 수 있다. 아미노산은 상업적으로 입수가능하거나 합성될 수 있다.As used herein, the term “amino acid” refers to a molecule comprising an amino group and a carboxyl group. Amino acids include alpha-amino acids and beta-amino acids. The amino acid may be an unnatural amino acid or a natural amino acid. Exemplary amino acids include natural alpha-amino acids such as the D- and L-isomers of the 20 common naturally occurring alpha amino acids found in peptides, unnatural alpha-amino acids, natural beta-amino acids (eg, beta-alanine), and Non-natural beta-amino acids include, but are not limited to. The amino acids used in the construction of the peptides of the present invention may be prepared by organic synthesis or obtained by other routes, such as isolation or digestion from natural sources. Amino acids are commercially available or can be synthesized.

본원에서 사용된 용어 "펩타이드"는 펩타이드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 포함하며, 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩타이드, 및 펩타이드를 의미한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 개별적인 단백질, 또는 단백질의 집합을 의미할 수 있다. As used herein, the term “peptide” includes polymers of amino acid residues linked together by peptide (amide) bonds and refers to proteins, polypeptides, and peptides of any size, structure or function. A peptide or polypeptide may refer to an individual protein or a collection of proteins.

스테이플 펩타이드의 2개 이상의 아미노산이 서로 연결될 때 해당 아미노산은 가교(cross link) 또는 브릿지(bridge) 형성을 통해 연결될 수 있다. 예컨대, 상기 브릿지는 탄화수소 브릿지일 수 있고, 구체적으로, 이중 탄화수소 결합 또는 단일 탄화수소 결합으로 이루어진 것일 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 서로 연결되는 아미노산은 이황화 결합, 탄소-탄소 이중결합, 또는 아미드 결합을 통해 연결되는 것일 수 있다.When two or more amino acids of the staple peptide are linked to each other, the corresponding amino acids may be linked through cross link or bridge formation. For example, the bridge may be a hydrocarbon bridge, and specifically, may be formed of a double hydrocarbon bond or a single hydrocarbon bond. In another example, the amino acids linked to each other may be linked through a disulfide bond, a carbon-carbon double bond, or an amide bond.

일 실시태양에서, 본 발명의 항균 스테이플 펩타이드는 2개 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드에서 서로 연결되는 아미노산이 비천연 아미노산을 포함하며, 아래 표 1은 이의 예를 나타낸다. 바람직하게는, 비천연 아미노산은 알켄기 보유 비천연 아미노산이며, 예컨대 상기 알켄기는 펜테닐기, 헥세닐기, 헵테닐기, 옥테닐기, 노네닐기, 데세닐기, 운데세닐기, 도데세닐기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 가장 바람직한 비천연 아미노산은 (S)-2-(4'-펜테닐)-알라닌 (S5), (S)-2-(7'-옥테닐)-알라닌 (S8), (R)-2-(4'-펜테닐)-알라닌 (R5), (R)-2-(7'-옥테닐)-알라닌 (R8), 2,2-bis-(4'-펜테닐)-글리신 (B5) 및 2,2-bis-(7'-옥테닐)-글리신 (B8)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다. In one embodiment, the antimicrobial staple peptide of the present invention may comprise two or more unnatural amino acids. Preferably, the amino acids linked to each other in the peptide of the present invention include non-natural amino acids, and Table 1 below shows examples thereof. Preferably, the non-natural amino acid is a non-natural amino acid having an alkene group, for example, the alkene group is selected from the group consisting of a pentenyl group, a hexenyl group, a heptenyl group, an octenyl group, a nonenyl group, a decenyl group, an undecenyl group, and a dodecenyl group. It may be one or more selected. The most preferred unnatural amino acids are (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine (S 5 ), (S)-2-(7'-octenyl)-alanine (S 8 ), (R)- 2-(4'-pentenyl)-alanine (R 5 ), (R)-2-(7'-octenyl)-alanine (R 8 ), 2,2-bis-(4'-pentenyl)- It may be at least one selected from the group consisting of glycine (B 5 ) and 2,2-bis-(7′-octenyl)-glycine (B 8 ).

Figure pat00001
Figure pat00001

VapBC30 복합체의 구조를 보면 독소-항독소의 복합체간의 결합에는 항독소 VapB30의 α1-나선 (VapB30의 아미노산 잔기 52-59, 서열번호 23), 독소 VapC30의 α2-나선 (아미노산 잔기 14-30, 서열번호 24) 및 독소 VapC30의 α4-나선 (아미노산 잔기 48-56, 서열번호 25)이 관여한다. 이에 따라 본 발명자들은 해당 부분의 펩타이드를 모방하면서도 스테이플된 신규 펩타이드를 제조하고자 하였다. Looking at the structure of the VapBC30 complex, the binding between the toxin-antitoxin complex includes the α1-helix of the antitoxin VapB30 (amino acid residues 52-59 of VapB30, SEQ ID NO: 23) and the α2-helix of the toxin VapC30 (amino acid residues 14-30, SEQ ID NO: 24) ) and the α4-helix of the toxin VapC30 (amino acid residues 48-56, SEQ ID NO: 25) are involved. Accordingly, the present inventors attempted to prepare a novel peptide that was stapled while mimicking the peptide of the corresponding portion.

Figure pat00002
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이에 따른 본 발명의 항균 스테이플 펩타이드는 하기 서열번호 1 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. Accordingly, the antibacterial staple peptide of the present invention may have an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 11 below.

EXAAXRHR (서열번호 1);EXAAXRHR (SEQ ID NO: 1);

EXAAIXHR (서열번호 2);EXAAIXHR (SEQ ID NO: 2);

ELAAXRHX (서열번호 3);ELAAXRHX (SEQ ID NO: 3);

RXGEXGGRE (서열번호 4);RXGEXGGRE (SEQ ID NO: 4);

RXGEPGGRX (서열번호 5);RXGEPGGRX (SEQ ID NO: 5);

AERFXAAVEADXI (서열번호 6);AERFXAAVEADXI (SEQ ID NO: 6);

DEPDAERFXAAVEADXI (서열번호 7);DEPDAERFXAAVEADXI (SEQ ID NO: 7);

XLAAXRHX (서열번호 8);XLAAXRHX (SEQ ID NO: 8);

XLAAIRHX (서열번호 9);XLAAIRHX (SEQ ID NO: 9);

RXGEXGGRX (서열번호 10); 및RXGEXGGRX (SEQ ID NO: 10); and

XPDAERFXAAVEADX (서열번호 11);XPDAERFXAAVEADX (SEQ ID NO: 11);

상기 식에서, X는 (S)-2-(4'-펜테닐)-알라닌 (S5), (S)-2-(7'-옥테닐)-알라닌 (S8), (R)-2-(4'-펜테닐)-알라닌 (R5), (R)-2-(7'-옥테닐)-알라닌 (R8), 2,2-bis-(4'-펜테닐)-글리신 (B5) 또는 2,2-bis-(7'-옥테닐)-글리신 (B8)이다.wherein X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine (S 5 ), (S)-2-(7'-octenyl)-alanine (S 8 ), (R)-2 -(4'-pentenyl)-alanine (R 5 ), (R)-2-(7'-octenyl)-alanine (R 8 ), 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine (B 5 ) or 2,2-bis-(7′-octenyl)-glycine (B 8 ).

본 발명의 또 다른 바람직한 항균 스테이플 펩타이드는 하기 서열번호 12 내지 22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. Another preferred antibacterial staple peptide of the present invention may have an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12 to 22 below.

ER5AAS5RHR (서열번호 12);ER 5 AAS 5 RHR (SEQ ID NO: 12);

ES5AAIS5HR (서열번호 13);ES 5 AAIS 5 HR (SEQ ID NO: 13);

ELAAR5RHS5 (서열번호 14);ELAAR 5 RHS 5 (SEQ ID NO: 14);

RR5GES5GGRE (서열번호 15);RR 5 GES 5 GGRE (SEQ ID NO: 15);

RR8GEPGGRS5 (서열번호 16);RR 8 GEPGGRS 5 (SEQ ID NO: 16);

AERFR8AAVEADS5I (서열번호 17);AERFR 8 AAVEADS 5 I (SEQ ID NO: 17);

DEPDAERFR8AAVEADS5I (서열번호 18);DEPDAERFR 8 AAVEADS 5 I (SEQ ID NO: 18);

S5LAAB5RHS5 (서열번호 19);S 5 LAAB 5 RHS 5 (SEQ ID NO: 19);

R8LAAIRHS5 (서열번호 20);R 8 LAAIRHS 5 (SEQ ID NO: 20);

RR5GEB5GGRR5 (서열번호 21); 및RR 5 GEB 5 GGRR 5 (SEQ ID NO: 21); and

R8PDAERFB5AAVEADS8 (서열번호 22).R 8 PDAERFB 5 AAVEADS 8 (SEQ ID NO: 22).

본 발명의 가장 바람직한 항균 스테이플 펩타이드는 하기 서열번호 19 또는 20의 아미노산 서열을 가질 수 있다.The most preferred antibacterial staple peptide of the present invention may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or 20 below.

S5LAAB5RHS5 (서열번호 19); 또는S 5 LAAB 5 RHS 5 (SEQ ID NO: 19); or

R8LAAIRHS5 (서열번호 20).R 8 LAAIRHS 5 (SEQ ID NO: 20).

상기 펩타이드는 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 치환 또는 결실된 아미노산도 사용 가능하다.In the peptide, amino acids in which one or several amino acids have been added, substituted or deleted may also be used.

본 발명자들은 결핵 (TB)을 겨냥한 약물 개발 프로그램에서, VapBC30 복합체의 결합을 모방하지만 박테리아 세포 성장을 저지하고 결과적으로 세포 사멸을 초래하는 특정 펩타이드를 발견하였다. 본 발명에서는 탄화수소 스테이플화 (stapling) 전략을 기반으로 하는 후보 펩타이드를 최적화했고 시험관 내 (in vitro) RNA 활성 평가를 수행하였다. 본 발명의 VapB30 α152 -59 펩타이드로부터 변형된 스테이플 펩타이드 중 서열번호 19의 스테이플 펩타이드 (V30-SP-8)가 스메그마균 (Mycobacterium smegmatis) 세포막에 성공적으로 침투하여 분리물의 50%를 억제하는 최소억제농도 (MIC50) < 6.25 μM에서 항균 활성을 발휘하는 것을 확인하였다.In a drug development program targeting tuberculosis (TB), the present inventors have discovered a specific peptide that mimics the binding of the VapBC30 complex but inhibits bacterial cell growth and consequently leads to apoptosis. In the present invention, candidate peptides based on a hydrocarbon stapling strategy were optimized and RNA activity was evaluated in vitro . Among the staple peptides modified from the VapB30 α1 52-59 peptide of the present invention, the staple peptide (V30-SP-8) of SEQ ID NO: 19 successfully penetrates the Mycobacterium smegmatis cell membrane and inhibits 50% of the isolate Inhibitory concentration (MIC 50 ) It was confirmed that the antimicrobial activity was exhibited at <6.25 μM.

이에 따라 본 발명은 6.25 μM 미만의 MIC50을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 스테이플 펩타이드를 제공한다.Accordingly, the present invention provides an antimicrobial staple peptide, characterized in that it has a MIC50 of less than 6.25 μM.

따라서, 본 발명에 따른 스테이플 펩타이드는 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 예컨대 병원성 세균, 바이러스, 효모 또는 진균에 의한 감염성 질환의 예방, 억제, 개선 또는 치료용 조성물, 동물 사료용 조성물, 동물 사료용 첨가물, 기능성 식품 조성물, 식품 첨가제, 식품 보존제, 소독제, 살균 세정제 등의 용도로 사용될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.Therefore, the staple peptide according to the present invention can be used for various purposes and uses requiring antibacterial activity, such as a composition for preventing, inhibiting, improving or treating infectious diseases caused by pathogenic bacteria, viruses, yeast or fungi, and compositions for animal feed , an additive for animal feed, a functional food composition, a food additive, a food preservative, a disinfectant, a disinfectant, and the like, but is not limited thereto.

이에, 본 발명은 상기 스테이플 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 결핵 예방 또는 치료용 약학 조성물이다.Accordingly, the present invention provides an antibacterial composition comprising the staple peptide. Preferably, the composition is a pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis.

본 발명에서 사용되는 용어 "결핵(tuberculosis)"은 결핵균 감염 환자로부터 호흡기를 통해 나온 미세한 침방울 혹은 비말에 의해 직접 감염되며 그 정의상 결핵균에 의한 감염 때문에 발생하는 질환이다. 현재, 결핵균은 공기를 통해서 감염되기 때문에 폐 조직에서 결핵이 잘 생긴다. 따라서 보통 결핵이라고 하면 폐결핵을 의미하지만 결핵균은 폐 외에도 흉막, 림프선, 척추, 뇌, 신경, 신장, 위장관, 뼈 등 대부분의 조직이나 장기에도 침입해 증상을 일으킬 수 있다. [0026] 결핵균에 감염된 장기에 따라 고관절결핵, 골결핵, 골반결핵 같은 골관절 결핵과 고환결핵, 방광결핵, 신장결핵 같은 비뇨 생식계 결핵, 장결핵 같은 소화기계 결핵과 결핵성 뇌막염 같은 중추신경계 결핵 등의 다양한 감염질환으로 나뉠 수 있다. 결핵균은 숙주의 몸속 영양분을 이용해 천천히 증식하며 결핵에 걸리면 기운이 없고 쉽게 피로를 느끼며 체중이 감소하는 등의 증상이 주로 나타난다. 또한, 결핵균에 감염된 장기에 따라서 증상이 다르게 나타나는데 폐결핵의 경우에는 기침과 가래, 흉통 등의 증상이 생기며 비뇨 생식계 결핵에서는 빈뇨, 배뇨곤란, 혈뇨 등이 나타나고 골관절 결핵에서는 해당 부위 뼈에 통증이 유발되며 림프선 결핵이면 전신, 특히 목 위 나 겨드랑이의 림프절이 커지면서 통증과 압박감이 유발된다. 또한, 척추 결핵의 경우 허리통증을, 중추신경계 결핵에서는 두통과 구토 등의 증상이 나타난다. 사람의 몸이 결핵균에 감염되면 면역세포와의 염증반응에 의해 아주 느린 속도로 몸의 정상조직을 파괴하며 치즈 같은 형태의 고름이 형성되고 그 주위에 육아종(Granuloma, 덩어리로 된 혹)이 발생하게 된다.As used herein, the term "tuberculosis (tuberculosis)" is a disease caused by infection with Mycobacterium tuberculosis, which by definition is directly infected by microscopic saliva or droplets discharged through the respiratory tract from a Mycobacterium tuberculosis-infected patient. Currently, because Mycobacterium tuberculosis is transmitted through the air, tuberculosis is more likely to occur in the lung tissue. Therefore, tuberculosis usually means pulmonary tuberculosis, but Mycobacterium tuberculosis can invade most tissues or organs, such as the pleura, lymph glands, spine, brain, nerves, kidneys, gastrointestinal tract, and bones, in addition to the lungs, causing symptoms. Depending on the organ infected with Mycobacterium tuberculosis, osteoarticular tuberculosis such as hip tuberculosis, bone tuberculosis, and pelvic tuberculosis, urogenital tuberculosis such as testicular tuberculosis, bladder tuberculosis, kidney tuberculosis, digestive system tuberculosis such as intestinal tuberculosis and tuberculosis meningitis, such as tuberculosis of the central nervous system. can be divided Mycobacterium tuberculosis proliferates slowly using the nutrients in the host's body, and symptoms such as lack of energy, easily fatigued, and weight loss appear mainly when contracted tuberculosis. In addition, symptoms appear differently depending on the organ infected with Mycobacterium tuberculosis. In the case of pulmonary tuberculosis, symptoms such as cough, sputum, and chest pain occur; in urogenital tuberculosis, frequent urination, difficulty in urination, and hematuria; Lymphatic tuberculosis causes enlarged lymph nodes throughout the body, especially in the neck or armpits, causing pain and pressure. In addition, symptoms such as back pain in the case of spinal tuberculosis, and headache and vomiting in the central nervous system tuberculosis appear. When a person's body is infected with Mycobacterium tuberculosis, it destroys the normal tissues of the body at a very slow rate due to the inflammatory reaction with immune cells, and cheese-like pus is formed, and granulomas are formed around it. do.

본 발명의 약학적 조성물로 예방 또는 치료가 가능한 결핵은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 폐결핵일 수 있으며, 보다 바람직하게는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 발생하는 감염성 결핵일 수 있다.Tuberculosis that can be prevented or treated with the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but may preferably be pulmonary tuberculosis, and more preferably may be infectious tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis.

본 발명에서 사용되는 용어 "결핵균(Mycobacterium tuberculosis)"는 다제내성 결핵균(Multi drug resistance tuberculosis, MDR-TB) 또는 광범위내성 결핵균(extensively drug resistant tuberculosis, XDR-TB)일 수 있다.As used herein, the term " Mycobacterium tuberculosis " may be multi-drug-resistant tuberculosis (MDR-TB) or extensively drug-resistant tuberculosis (XDR-TB).

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 조성물의 섭취 또는 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며 "치료"는 상기 조성물의 섭취 또는 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다. As used herein, the term "prevention" refers to any action that inhibits or delays the onset of the disease by ingestion or administration of the composition, and "treatment" means that the symptoms of the disease are improved by ingestion or administration of the composition or It means any action that is beneficial.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 상기 조성물을 섭취 또는 투여함으로써 상기 질환의 발병 또는 증상을 완화하거나 결핵균의 성장 및 분열증식을 억제 또는 감소시키는 효과를 의미한다.As used herein, the term "improvement" refers to an effect of alleviating the onset or symptoms of the disease or inhibiting or reducing the growth and division proliferation of Mycobacterium tuberculosis by ingesting or administering the composition.

본 발명의 약학 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 이 때, 제약상 허용되는 부형제는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable excipient. In this case, pharmaceutically acceptable excipients are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose , polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.

또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.In addition, a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. may be additionally included in addition to the above components.

본 발명의 제약 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to a desired method, and the dosage may vary depending on the condition and weight of the patient, and the degree of disease. , depending on the drug form, administration route and time, but may be appropriately selected by those skilled in the art.

본 발명의 제약 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , can be determined according to factors including sensitivity to drug, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, concurrent drugs, and other factors well known in the medical field. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

구체적으로, 본 발명의 제약 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.Specifically, the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate and excretion rate, disease type, and drugs used in combination. 0.001 to 150 mg per 1 kg of body weight, preferably 0.01 to 100 mg, may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times a day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

<실험 방법><Experiment method>

본 발명은 하기와 같은 실험 방법에 의해 수행될 수 있다. The present invention can be carried out by the following experimental method.

1. 단백질 제조 1. Protein Preparation

독소-항독소 복합체 단백질 VapBC30 및 VapC30 단백질 단독을 E. coli 세포에서 과발현시켰고 문헌 (Lee et al., Nucleic Acids Res. Volume 43, Issue 15, 3 September 2015, 7624-7637)에 따라 정제시켰다.Toxin-antitoxin complex proteins VapBC30 and VapC30 proteins alone were overexpressed in E. coli cells and purified according to the literature (Lee et al., Nucleic Acids Res. Volume 43, Issue 15, 3 September 2015, 7624-7637).

2. 2. 펩타이드peptide 합성 synthesis

펩타이드는 0.41 mmol/g의 로딩 용량으로 링크 아미드 MBHA 수지(Rink Amide MBHA Resin) (BeadTech)에서 Fmoc 화학법을 사용하여 제조하였다. 모든 합성은 82 μmol 스케일 상에서 수행되었다. 건조 수지를 사용하기 전에 2시간 동안 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)로 팽윤시켰다. Fmoc 보호기는 DMF 중 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다 (2 Х 10분). Fmoc 탈보호 후, 레진을 DMF (Х3), MeOH (Х3), 디클로로메탄 (DCM, Х3) 및 N-메틸피롤리돈 (NMP, Х3)으로 세척하였다. 천연 및 비천연 아미노산 모두 활성화제로서 1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트 (COMU) 4 당량 (eq), Fmoc 보호 아미노산 4 당량 및 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 8 당량을 사용하여 NMP에서 2시간 동안 커플링시켰다. DMF (Х9)로 완전히 세척한 후 카이저 테스트(Kaiser test)로 커플링 반응의 완결을 확인하였다.Peptides were prepared using Fmoc chemistry on Rink Amide MBHA Resin (BeadTech) with a loading capacity of 0.41 mmol/g. All syntheses were performed on an 82 μmol scale. The dry resin was swollen with N,N -dimethylformamide (DMF) for 2 hours before use. The Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF (2 Х 10 min). After Fmoc deprotection, the resin was washed with DMF (Х3), MeOH (Х3), dichloromethane (DCM, Х3) and N -methylpyrrolidone (NMP, Х3). 4 equivalents (eq) of 1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy)dimethylamino-morpholino-carbenium hexafluorophosphate (COMU) as activator for both natural and unnatural amino acids, Coupling was performed in NMP for 2 hours using 4 equivalents of Fmoc protected amino acid and 8 equivalents of diisopropylethylamine (DIPEA). After complete washing with DMF (Х9), completion of the coupling reaction was confirmed by Kaiser test.

3. 복분해 및 정제3. Metathesis and purification

수지-결합 N-Fmoc, 측쇄-보호 펩타이드의 고리-폐쇄 복분해는 Ar 분위기 하에서 실온에서 2시간 동안 1,2-디클로로에탄 (DCE)에서 20 몰% Grubbs 촉매를 사용하여 수행되었다. DCM (Х2), MeOH (Х2) 및 DCM (Х2)으로 세척한 후, 반응을 추가로 2회 반복하였다. 반응은 수지 분취액에서 펩타이드를 절단한 후 애질런트 HP 1260 시스템 (Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)을 사용하여 모니터링하였다. Fmoc 제거 후, 아세틸기 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)를 사용한 펩타이드의 N-말단 변형은 다음 조건에 따라 수행되었다. i) 아세틸화: 실온에서 45분 동안 NMP에서 아세트산 무수물 (30 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (60 당량); ii) FITC 라벨링: 실온에서 하룻밤 동안 피리딘/DMF/DCM (v/v/v = 12/7/5)에서 FITC (1.5 당량). 수지를 DMF (Х3), MeOH (Х3) 및 DCM (Х3)으로 세척하고 밤새 진공 건조시켰다. 펩타이드는 트리플루오로 아세트산/트리이소프로필실란/물 (v/v/v = 95/2.5/2.5)의 혼합물로 2시간 동안 처리하여 수지로부터 탈 보호되고 절단되었다. 그런 다음 휘발성 성분을 감압 하에서 제거하였다. 조 혼합물을 아세토니트릴과 물의 1:1 혼합물에 용해시키고 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과시켰다. 목적 생성물을 Zorbax C18 컬럼 (Agilent, 5 μm, 80 Å, 21.2 X 150 mm)을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 정제하고, 액체 크로마토그래피-질량분석 (LC-MS) 분석법 및 초 고해상도 전기 분무 이온화 사중 극자 비행 시간 (ESI Q-TOF) 질량 분석기 (미국 브루커)로 특성화하였다.Ring-closed metathesis of the resin-bound N -Fmoc, side chain-protecting peptide was performed using 20 mol% Grubbs catalyst in 1,2-dichloroethane (DCE) for 2 hours at room temperature under Ar atmosphere. After washing with DCM (Х2), MeOH (Х2) and DCM (Х2), the reaction was repeated two more times. The reaction was monitored using an Agilent HP 1260 system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) after cleavage of the peptide from the resin aliquot. After Fmoc removal, N-terminal modification of the peptide with an acetyl group or fluorescein isothiocyanate (FITC) was performed according to the following conditions. i) Acetylation: acetic anhydride (30 eq) and diisopropylethylamine (60 eq) in NMP for 45 min at room temperature; ii) FITC labeling: FITC (1.5 eq) in pyridine/DMF/DCM (v/v/v = 12/7/5) overnight at room temperature. The resin was washed with DMF (Х3), MeOH (Х3) and DCM (Х3) and dried in vacuo overnight. The peptide was deprotected from the resin and cleaved by treatment with a mixture of trifluoroacetic acid/triisopropylsilane/water (v/v/v = 95/2.5/2.5) for 2 hours. The volatile components were then removed under reduced pressure. The crude mixture was dissolved in a 1:1 mixture of acetonitrile and water and filtered through a 0.45 μm syringe filter. The desired product was purified by reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) using a Zorbax C18 column (Agilent, 5 μm, 80 Å, 21.2 X 150 mm), followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis and ultra-high resolution Electrospray ionization quadrupole time-of-flight (ESI Q-TOF) mass spectrometer (Bruker, USA).

4. 시험관 내 리보뉴클레아제 분석 4. In vitro ribonuclease assay

펩타이드에 의해 VapBC30에서 방출된 VapC30의 리보뉴클레아제 활성은 RNase 얼러트 키트 (IDT, 미국 아이오와주 코럴빌 소재)를 사용하여 확인하였다. 이 분석에서 형광단은 합성 RNA 가닥의 한쪽 끝에 공유 결합되어 합성 RNA의 다른 쪽 끝에 있는 ??처 그룹에 의해 ??칭되었다. 형광단-??처 쌍을 포함하는 합성 RNA가 리보뉴클레아제와 상호 작용하면, 상기 합성 RNA가 소화되고 형광이 검출된다. 방출된 형광단은 490 nm에서 여기(excitation)시 520 nm에서 형광을 방출하였다. 생성된 형광 (상대 형광 단위, RFU)은 스펙트라맥스 제미니 XPS 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)에서 관찰하였다. 다양한 농도의 펩타이드 (1.25, 2.5, 5 및 10 μM), 10 μM VapC30 독소, 및 10 μM VapBC30 복합체가 사용되었다.The ribonuclease activity of VapC30 released from VapBC30 by the peptide was confirmed using the RNase Alert Kit (IDT, Coralville, Iowa, USA). In this assay, the fluorophore was covalently attached to one end of the synthetic RNA strand and termed by an anchor group at the other end of the synthetic RNA. When a synthetic RNA comprising a fluorophore-acting pair interacts with a ribonuclease, the synthetic RNA is digested and fluorescence is detected. The emitted fluorophore emitted fluorescence at 520 nm upon excitation at 490 nm. The resulting fluorescence (relative fluorescence unit, RFU) was observed on a Spectramax Gemini XPS microplate reader (Molecular Devices, San Jose, CA). Various concentrations of peptide (1.25, 2.5, 5 and 10 μM), 10 μM VapC30 toxin, and 10 μM VapBC30 complex were used.

5. CD 분광법 5. CD Spectroscopy

CD 측정은 1 mm 광 경로를 갖는 셀에서 20 ℃에서 Chirascan-Plus 분광 편광계 (Applied Photophysics, 영국 레더헤드 소재)를 사용하여 수행하였다. 펩타이드 샘플은 물과 아세토니트릴 (9:1, v/v)의 혼합물에서 50 μM의 농도로 제 조하였다. 선형 펩타이드만을 분석하기 위해 TFE를 용매에 연속적으로 첨가하였다 (1, 10, 20, 50, 100%). CD 스캔은 1 nm 대역폭과 100 nm/분의 스캔 속도로 180 내지 260 nm에서 수행하였다. 세 번의 스캔을 평균하고 용매 배경을 평균 스캔에서 뺐다. 각 펩타이드의 나선도는 CDNN 소프트웨어로 계산하였다.CD measurements were performed using a Chirascan-Plus spectropolarimeter (Applied Photophysics, Leatherhead, UK) at 20 °C in a cell with a 1 mm optical path. Peptide samples were prepared at a concentration of 50 μM in a mixture of water and acetonitrile (9:1, v/v). To analyze only linear peptides, TFE was added sequentially to the solvent (1, 10, 20, 50, 100%). CD scans were performed from 180 to 260 nm with a 1 nm bandwidth and a scan rate of 100 nm/min. Three scans were averaged and the solvent background subtracted from the average scan. The helix of each peptide was calculated with CDNN software.

6. 스메그마균(M. smegmatis)의 클로닝 및 발현 6. Cloning and expression of M. smegmatis

결핵균 (균주 H37Rv) VapB30 (rv0623) 및 VapC30 (rv0624)을 코딩하는 유전자를 프라이머 Rv0623-BHI_F, Rv0623-Hid_rN, Rv0624-Ndel_F 및 Rv0624-ERV-R을 사용하여 증폭하고(표 1) 발현 벡터 pYUBDuet (Addgene, 미국 매사츠세츠주 워터타운 소재) 내로 클로닝하여 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 VapB30 및 VapC30의 제조하였다. rv0623 및 rv0624를 보유하는 벡터를 E. coli Top10 컴피턴트 세포 (Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월썸 소재)로 형질 전환시켰다. 형질 전환된 Top10 세포에서 추출한 플라스미드를 스메그마균 mc2155로 전기 천공하였다. 스메그마균 컴피턴트 세포의 제조 및 전기 천공을 보고된 프로토콜 (Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재, www.Bio-Rad.com)에 따라 수행하였다. rv0623 및 rv0624를 보유하는 스메그마균 mc2155 균주를 37 ℃ 및 100 rpm에서 10% 알부민-덱스트로스-식염수 (ADS), 0.5% 글리세롤, 및 0.1% 트윈 80이 보충된 Middlebrook 7H9 액체 배양 배지에서 성장시켰다. 하이그로마이신 (Hyg, 50 μg/mL)을 스메그마균 배양에 사용하였다. 배양물의 OD600이 0.5에 도달했을 때, 0.5 mM 이소프로필 1-티오-D-갈락토피라노사이드를 첨가하여 발현을 유도하고 배양물을 37 ℃에서 24시간 동안 성장시켰다.Mycobacterium tuberculosis (strain H37Rv) VapB30 ( rv0623 ) and VapC30 ( rv0624 ) encoding genes were amplified using primers Rv0623-BHI_F, Rv0623-Hid_rN, Rv0624-Ndel_F and Rv0624-ERV-R (Table 1) and the expression vector pYUBDuet ( Addgene, Watertown, Mass.) to prepare VapB30 and VapC30 with N-terminal hexa-histidine tags. Vectors carrying rv0623 and rv0624 were transformed into E. coli Top10 competent cells (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass.). The plasmid extracted from the transformed Top10 cells was electroporated with Smegma mc 2 155. Preparation and electroporation of Smegma competent cells was performed according to the reported protocol (Bio-Rad, Hercules, CA, USA, www.Bio-Rad.com). Smegma mc 2 155 strains carrying rv0623 and rv0624 were cultured in Middlebrook 7H9 liquid culture medium supplemented with 10% albumin-dextrose-saline (ADS), 0.5% glycerol, and 0.1% Tween 80 at 37 °C and 100 rpm. grown up Hygromycin (Hyg, 50 μg/mL) was used for culturing Smegma bacteria. When the OD 600 of the culture reached 0.5, 0.5 mM isopropyl 1-thio-D-galactopyranoside was added to induce expression and the culture was grown at 37° C. for 24 hours.

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7. 공 초점 현미경 7. Confocal Microscopy

공 초점 현미경 (Leica Micro-systems, 독일 베츨라어 소재)을 사용하여 FITC 표지된 펩타이드를 사용하여 스메그마균에 대한 펩타이드의 투과성을 평가하였다. 완전한 7H9 배지에서 중간 로그 단계 (OD600 0.3-0.5)로 성장한 스메그마균의 배양물을 Mueller-Hinton broth (BD Bioscience)에서 5배 희석으로 희석하였다. 에펜도르프 튜브에 분취된 희석된 세포 현탁액을 10 μM에서 항균성 펩타이드 제제로 처리하였다. 37 ℃ 및 100 rpm에서 1시간 동안 배양한 후, 세포 현탁액을 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하였다. 63x 오일 침지 대물 렌즈를 갖는 TCS8 공초점 현미경 (Leica Microsystems)에서 이미지를 획득하였다.Using a confocal microscope (Leica Micro-systems, Wetzlar, Germany), the FITC-labeled peptide was used to evaluate the permeability of the peptide to Smegma bacteria. A culture of smegma grown to a medium log stage (OD 600 0.3-0.5) in complete 7H9 medium was diluted with a 5-fold dilution in Mueller-Hinton broth (BD Bioscience). The diluted cell suspensions aliquoted into Eppendorf tubes were treated with antimicrobial peptide preparations at 10 μM. After incubation at 37° C. and 100 rpm for 1 hour, the cell suspension was washed with phosphate buffered saline (PBS). Images were acquired on a TCS8 confocal microscope (Leica Microsystems) with a 63x oil immersion objective.

8. 항균 활성 테스트 (8. Antibacterial activity test ( MICMIC 테스트) Test)

VapBC30을 보유하는 스메그마균에 대한 몇 가지 항균 펩타이드 제제의 최소 억제 농도 (MIC)는 7H9 배지에서 2배 연속 희석 방법으로 결정되었다. 스메그마균의 대수기(Log-phase) 배양물을 OD600 값 0.01로 희석하였다. 200 μL의 희석된 배양물을 96-웰 플레이트 (폴리스티렌 둥근 사각형 웰, SPL, 대한민국 소재)에 접종하고 100 μM 내지 3.125 μM 농도의 펩타이드 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하였다. 가시적 성장은 37 ℃에서 1일 배양 후 점수를 매겼다. 세균 펠렛을 함유하는 웰은 양성 웰로 표시하고 투명한 브로스를 함유하는 웰은 음성 웰로 표시하였다. MIC는 박테리아 성장을 완전히 억제한 최저 펩타이드 농도로 정의되었다. 각 테스트는 중복으로 수행되었다.The minimum inhibitory concentration (MIC) of several antimicrobial peptide formulations against VapBC30-bearing Smegma was determined by 2-fold serial dilution method in 7H9 medium. A log-phase culture of Smegma was diluted to an OD 600 value of 0.01. 200 μL of the diluted culture was inoculated into a 96-well plate (polystyrene rounded square wells, SPL, Korea) and 100 μL of a peptide solution with a concentration of 100 μM to 3.125 μM was added to each well. Visible growth was scored after 1 day incubation at 37 °C. Wells containing the bacterial pellet were marked as positive wells and wells containing clear broth were marked as negative wells. The MIC was defined as the lowest peptide concentration that completely inhibited bacterial growth. Each test was performed in duplicate.

9. 9. 유세포flow cell 분석 analysis

유세포 분석을 사용하여 스메그마균에 대한 펩타이드의 투과성과 생존력을 모두 평가하였다. 투과성 평가를 위한 샘플 제조는 공초점 이미지에 대한 샘플 제조와 동일한 프로토콜을 따랐다. 생존력 분석을 위해, VapBC30을 보유하는 스메그마균을 완전한 7H9 배지에서 중간 대수기 (OD600 0.3-0.5)까지 성장시키고 10 μM에서 항균성 펩타이드 제제로 처리하였다. 37 ℃ 및 100 rpm에서 24시간 동안 배양한 후, PI-피코에리트린 (PE) 및 Syto 9-FITC를 포함하는 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen)로 세포를 염색하였다. FACSLyric (BD Bioscience, 미국 소재)에서 두 유세포 분석을 수행했으며 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (TreeStar)를 사용하여 데이터를 분석하였다.Both the permeability and viability of the peptide to Smegma were evaluated using flow cytometry. Sample preparation for permeability evaluation followed the same protocol as sample preparation for confocal images. For viability assays, VapBC30-bearing smegma were grown in complete 7H9 medium to mid-log phase (OD 600 0.3-0.5) and treated with antimicrobial peptide preparations at 10 μM. After incubation at 37° C. and 100 rpm for 24 hours, cells were stained with LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen) containing PI-phycoerythrin (PE) and Syto 9-FITC. Both flow cytometry analyzes were performed on a FACSLyric (BD Bioscience, USA) and data were analyzed using FlowJo software (TreeStar).

실시예Example 1 : 선형 1: linear 펩타이드의of peptide 알라닌 스캐닝 및 alanine scanning and 스테이플staple 펩타이드의of peptide 설계 design

VapC30 또는 VapB30의 결합 인터페이스에서 나선형 단편은 해당 독소와 항독소 사이의 단백질-단백질 상호 작용의 억제제 역할을 한다. 상기 억제 활성에 대한 각 잔기의 기여도를 결정하고 펩타이드 스테이플화를 위한 비천연 아미노산의 적절한 위치를 밝히기 위해 알라닌 스캐닝을 수행하였다(도 1a). The helical fragment at the binding interface of VapC30 or VapB30 acts as an inhibitor of the protein-protein interaction between the corresponding toxin and antitoxin. Alanine scanning was performed to determine the contribution of each residue to the inhibitory activity and to reveal the appropriate position of the non-natural amino acid for peptide stapling (Fig. 1a).

알라닌 치환이 있는 각 펩타이드를 VapBC30 복합체에 첨가하여 시험관 내 RNase 분석을 통해 VapC30의 RNase 활성 발현 여부를 평가하였다. Each peptide having alanine substitution was added to the VapBC30 complex to evaluate the expression of VapC30's RNase activity through an in vitro RNase assay.

VapB30 α152 -59 펩타이드의 경우, 돌연변이 펩타이드 중 어느 것도 억제 활성이 현저히 눈에 띄게 변화를 나타내지 않았다 (야생형 펩타이드에 비해 10% 미만 감소). 따라서, 하기 기준에 따라 올레핀 함유 잔기의 위치를 선택하였다 (도 1b): (i) 알라닌 치환되었을 때 억제 활성 변화 5% 미만 및 (ii) 동일한 나선형 면에서 잔기를 정렬하기 위해 i 및 i+3, 4, 또는 7에서 두 위치를 선택. 이중 스테이플 (스티치) 펩타이드의 경우, B5 잔기는 i 및 i+7에서의 두 개의 비천연 아미노산 중간에 통합되었다 (도 1c). In the case of the VapB30 α1 52 -59 peptide, none of the mutant peptides exhibited a significant, appreciable change in inhibitory activity (less than 10% reduction compared to the wild-type peptide). Therefore, the positions of the olefin-containing residues were selected according to the following criteria ( FIG. 1B ): (i) less than 5% change in inhibitory activity when substituted with alanine and (ii) i and i+3 to align the residues on the same helical plane Choose two locations from , 4, or 7. For the double staple (stitch) peptide, the B 5 residue was integrated between the two unnatural amino acids at i and i+7 ( FIG. 1C ).

다른 두 개의 선형 펩타이드 (VapC30 α214 -30 및 VapC30 α448 - 56)의 경우, 일부 돌연변이 (전자의 경우 E6A, R7A, F8A, E9A, V12A 및 E13A, 후자의 경우 R1A, E4A, G7A, R8A 및 E9)는 상응하는 원래 펩타이드에 비해서 독소-항독소 복합체에 대한 억제 활성이 10% 초과 억제되었다 (도 1a). For the other two linear peptides (VapC30 α2 14 -30 and VapC30 α4 48 - 56 ), some mutations (E6A, R7A, F8A, E9A, V12A and E13A in the former case, R1A, E4A, G7A, R8A and E9) inhibited the inhibitory activity against the toxin-antitoxin complex by more than 10% compared to the corresponding native peptide (Fig. 1a).

이러한 결과를 기반으로 적절한 합성 표적을 생성하기 위해 잔기를 스테이플화 하기에 적합한 위치를 결정하였다(도 1d). 도 1d의 Entry 1 내지 11은 각각 서열번호 12 내지 22에 상응한다. 일부 VapC30 α214 -30 유도체의 경우, 억제 활성에 기여하지 않은 것들은 절단되었다 (도 1d의 Entry 6 및 11).Based on these results, suitable positions for stapling residues were determined to generate appropriate synthetic targets (Fig. 1d). Entry 1 to 11 in FIG. 1D correspond to SEQ ID NOs: 12 to 22, respectively. For some VapC30 α2 14 -30 derivatives, those that did not contribute to the inhibitory activity were cleaved (Entry 6 and 11 in Fig. 1d).

실시예Example 2: 2: 스테이플staple 펩타이드에on peptides 대한 시험관 내 in vitro for RNaseRNase 분석 analysis

알라닌 스캐닝 결과를 기반으로, 순도 95% 초과 고체상 펩타이드 합성을 통해 도 1d에 나타낸 총 11개의 스테이플 펩타이드를 제조하였다(실험 방법 "2. 펩타이드 합성" 및 "3. 복분해 및 정제" 항목 참조). HPLC로 정제하고 LC-MS 분석을 통해 목적 펩타이드가 제조되었음을 확인하였다(도 2, 표 4). 추가로 고분해능 질량 분광법에 의해 목적 펩타이드를 특징지었다(도 3).Based on the alanine scanning results, a total of 11 staple peptides shown in FIG. 1D were prepared through solid phase peptide synthesis with a purity greater than 95% (refer to experimental methods “2. Peptide Synthesis” and “3. Metathesis and Purification”). Purification by HPLC and LC-MS analysis confirmed that the target peptide was prepared (FIG. 2, Table 4). The target peptide was further characterized by high-resolution mass spectrometry (FIG. 3).

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VapBC30 복합체 내 상호 작용을 방해하는 능력을 시험하기 위해 시험관 내 RNase 분석을 수행하였다(실험 방법 "4. 시험관 내 리보뉴클레아제 분석" 항목 참조). 그 결과 본 발명의 억제제 펩타이드는 VapB30 항독소 단백질로부터 VapC30 독소 단백질을 방출하여 VapC30 RNase 활성의 회복을 유도함을 확인하였다. 이어서, 형광단 및 ??처 사이의 링커 역할을 하는 기질 RNA가 절단됨에 따라 자유 VapC30 독소 단백질의 수에 비례하여 형광 강도가 증가하였다(도 4a).In order to test the ability to interfere with the interaction within the VapBC30 complex, an in vitro RNase assay was performed (refer to Experimental Method "4. In vitro Ribonuclease Assay"). As a result, it was confirmed that the inhibitor peptide of the present invention induces recovery of VapC30 RNase activity by releasing VapC30 toxin protein from VapB30 antitoxin protein. Subsequently, the fluorescence intensity increased in proportion to the number of free VapC30 toxin protein as the substrate RNA serving as a linker between the fluorophore and the anchor was cleaved (Fig. 4a).

초기 평가에서는 동일한 양의 펩타이드(10μM)를 독소-항독소 복합체와 기질 RNA의 혼합물로 처리하여 스테이플 펩타이드 간의 비교를 수행하였다. 그 결과, VapB30 α152 -59 펩타이드의 첨가에 따라 변형된 5개의 스테이플 펩타이드는 파괴 활성 측면에서 다른 스테이플 펩타이드보다 우수한 것으로 나타났다 (도 1d의 Entry 1 내지 3, 8, 및 9). 그 중에서 V30-SP-8 및 V30-SP-9가 가장 효과적인 펩타이드인 것으로 나타났다(도 4b). 이러한 펩타이드는 VapB30의 독소 결합 영역을 모방하고 VapC30의 비활성 부위에 결합하도록 설계되었다. 위 실험을 통해 본 발명의 스테이플 펩타이드, 특히 V30-SP-8 및 V30-SP-9는 VapC30에 대한 결합시 VapB30과 경쟁하여 결과적으로 VapC30의 활성 부위를 발현시키고 박테리아 RNA의 소화를 유도함이 확인되었다. 이로부터 본 발명의 스테이플 펩타이드는 결핵균과 같은 VapBC30 발현 병원체에 대한 항균제로서 역할을 할 수 있음을 알 수 있다. In the initial evaluation, comparison between staple peptides was performed by treating the same amount of peptide (10 μM) with a mixture of toxin-antitoxin complex and substrate RNA. As a result, it was shown that the five staple peptides modified by the addition of the VapB30 α1 52 -59 peptide were superior to other staple peptides in terms of destructive activity (Entry 1 to 3, 8, and 9 in FIG. 1d ). Among them, V30-SP-8 and V30-SP-9 were found to be the most effective peptides (Fig. 4b). This peptide was designed to mimic the toxin binding region of VapB30 and bind to the inactive site of VapC30. Through the above experiment, it was confirmed that the staple peptides of the present invention, particularly V30-SP-8 and V30-SP-9, competed with VapB30 upon binding to VapC30 to express the active site of VapC30 and induce the digestion of bacterial RNA. . From this, it can be seen that the staple peptide of the present invention can serve as an antibacterial agent against VapBC30-expressing pathogens such as Mycobacterium tuberculosis.

추가로 본 발명의 펩타이드의 농도 의존성을 확인하였다(도 4c). V30-SP-8 및 V30-SP-9을 각각 1.25, 2.5, 5, 10 μM의 농도로 처리한 결과, 10 μM 미만에서도 활성을 나타내는 것으로 나타났다. V30-SP-8 및 V30-SP-9는 동일한 선형 펩타이드로부터 변형되었지만 이들의 합성에 사용되는 스테이플화 링커는 상이하였다. 세포 억제 특성은 펩타이드 나선성과 세포 투과성을 기반으로 복합 효과를 가지며, 이는 VapBC30으로부터의 VapC의 해리에 기여한다. 따라서 유사한 시험관 내 RNase 활성이 관찰되어도 두 개의 스테이플 펩타이드는 나선성 및 해당 세포막 투과성에 차이가 있을 수 있을 것이다.In addition, the concentration dependence of the peptide of the present invention was confirmed (Fig. 4c). As a result of treatment with V30-SP-8 and V30-SP-9 at concentrations of 1.25, 2.5, 5, and 10 μM, respectively, it was shown that activity was shown even at less than 10 μM. V30-SP-8 and V30-SP-9 were modified from the same linear peptide but the stapling linker used for their synthesis was different. The cytostatic properties have a combined effect based on peptide helix and cell permeability, which contributes to the dissociation of VapC from VapBC30. Therefore, even if similar in vitro RNase activity is observed, it is likely that the two staple peptides have differences in helix and permeability to the corresponding cell membrane.

실시예Example 3 : 선형 3: Linear 펩타이드peptide 및 and 스테이플staple 펩타이드의of peptide CD 분광법 CD spectroscopy

두 개의 스테이플 펩타이드, V30-SP-8 및 V30-SP-9의 나선 성향과 이들의 선형 대응물을 원형 이색성 (CD) 분광법을 통해 분석하였다(실험 방법 "5. CD 분광법" 항목 참조).The helical nature of two staple peptides, V30-SP-8 and V30-SP-9, and their linear counterparts were analyzed by circular dichroism (CD) spectroscopy (see "Experimental Methods" section "5. CD Spectroscopy").

선형 펩타이드의 경우 약 195 nm에서 강한 음성 피크가 나타났는데, 이는 전형적인 무작위 코일 패턴을 나타내는 반면, 스테이플 펩타이드는 208 및 222 nm에서 두 개의 음성 피크를 보였으며, 이는 수성 매체에서의 나선형 구조를 나타낸다(도 4d). 놀랍게도 스티치 펩타이드 V30-SP-8이 단일 스테이플 펩타이드 V30-SP-9보다 더 나선형일 것이라는 기대와는 반대로, 단일 스테이플화 전략이 나선성 유도에 더 효과적이었다(나선도: V30-SP-8의 경우 26.1% 및 V30-SP-9의 경우 및 33.8%). 이 결과는 스티치 펩타이드의 구조적 최적화를 위한 추가 여지가 있음을 나타낼 수 있다. The linear peptide showed a strong negative peak at about 195 nm, indicating a typical random coil pattern, whereas the staple peptide showed two negative peaks at 208 and 222 nm, indicating a helical structure in the aqueous medium ( Fig. 4d). Surprisingly, contrary to the expectation that the stitch peptide V30-SP-8 would be more helical than the single staple peptide V30-SP-9, the single stapling strategy was more effective in inducing helix (helix: for V30-SP-8). 26.1% and for V30-SP-9 and 33.8%). This result may indicate that there is further room for structural optimization of stitched peptides.

선형 펩타이드의 경우 2,2,2-트리플루오로에탄올 (TFE)을 용매에 첨가하여 나선형 구조를 유도하였다. 용매가 TFE와 완전히 교환되었음에도 TFE가 없는 용매에서 스테이플 펩타이드와 동일한 수준까지 나선도를 증가시키지 못하였다(도 5). 이러한 결과는 펩타이드 스테이플화가 효율적임을 나타내는 것이다.For linear peptides, 2,2,2-trifluoroethanol (TFE) was added to the solvent to induce a helical structure. Although the solvent was completely exchanged with TFE, the helix did not increase to the same level as the staple peptide in the solvent without TFE (Fig. 5). These results indicate that peptide stapling is efficient.

실시예Example 4 : 세포 투과성 평가 4: Assess cell permeability

스테이플 펩타이드 및 선형 펩타이드가 스메그마균 세포막을 통과하는지를 확인하기 위해, 플루오레스세인 이소티오시아네이트 (FITC) 표지된 V30-SP-8과 V30-SP-9 및 이 두 가지 스테이플 펩타이드의 선형 형태를 사용한 공초점 현미경 연구를 VapBC30-보유 스메그마균에서 수행하였다(실험 방법 "7. 공 초점 현미경" 항목 참조). In order to confirm that the staple peptide and the linear peptide pass through the Smegma cell membrane, fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled V30-SP-8 and V30-SP-9 and the linear form of these two staple peptides were analyzed. Confocal microscopy studies used were performed on VapBC30-bearing smegma (refer to "7. Confocal Microscopy" section of the experimental method).

그 결과를 도 6a 내지 6d에 나타내었다.The results are shown in Figs. 6a to 6d.

선형 펩타이드의 경우 세포 내에서 형광 신호가 거의 관찰되지 않고 이는 세균 막을 통과하는 능력이 좋지 않음을 의미한다(도 6b). 이는 CD 분광 분석에 따를 때 선형 펩타이드는 세포 투과성이 낮아 수성 배지에서 α-나선 구조를 형성하지 않기 때문으로 생각된다. 이와는 대조적으로, V30-SP-8-FITC 및 FITC-V30-SP-9-FITC는 스메그마균에 흡수(uptake)되었고 (도 6c 및 6d, 도 7), 이는 나선 성향과 관련이 있다. In the case of the linear peptide, almost no fluorescence signal was observed in the cell, which means that the ability to pass through the bacterial membrane was poor (Fig. 6b). This is thought to be because, according to CD spectroscopy, the linear peptide does not form an α-helical structure in an aqueous medium due to low cell permeability. In contrast, V30-SP-8-FITC and FITC-V30-SP-9-FITC were uptaken by Smegma ( FIGS. 6c and 6d , FIG. 7 ), which is related to the helical tendency.

스테이플 펩타이드의 세포 흡수는 선형 펩타이드 세포 흡수보다 약 2배 더 높았다(도 8). 따라서, 스테이플화 기술은 세포막 침투와 세포 내 펩타이드의 국소화를 향상시킴을 알 수 있다.Cellular uptake of staple peptides was approximately 2-fold higher than that of linear peptides ( FIG. 8 ). Therefore, it can be seen that the stapling technique improves cell membrane penetration and intracellular peptide localization.

실시예Example 5 : 항균 활성 측정 5: Measurement of antibacterial activity

이전 연구에서 VapB30 없이 VapC30 단독 발현이 박테리아 세포 사멸을 초래하는 것이 확인되었다. 본 발명자들은 상기 결과를 바탕으로 VapB30과 VapC30을 분리하는 화학적 도구가 항균 활성을 나타낼 것이라고 가정하였다. 이 가설을 뒷받침하기 위해 스메그마균 mc2155 세포를 스테이플 펩타이드와 이의 선형 대응물로 처리하여 항균 활성 테스트를 수행하였다(실험 방법 "8. 항균 활성 테스트 (MIC 테스트)" 항목 참조). 그 결과 6.25 μM V30-SP-8 및 V30-SP-9에서 세포 성장이 억제되는 것으로 나타났다. In a previous study, it was confirmed that expression of VapC30 alone without VapB30 resulted in bacterial cell death. The present inventors hypothesized that a chemical tool to separate VapB30 and VapC30 would exhibit antibacterial activity based on the above results. In order to support this hypothesis, antibacterial activity test was performed by treating Smegma mc 2 155 cells with staple peptide and its linear counterpart (see "8. Antimicrobial activity test (MIC test)" section of the experimental method). As a result, cell growth was inhibited at 6.25 μM V30-SP-8 and V30-SP-9.

추가적으로, 6.25 μM, 12.5 μM, 25 μM 및 50 μM (6.25 μM 초과) 농도에서의 억제는 정도를 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 평가하였다. 스메그마균 mc2155 세포에 V30-SP-8 및 V30-SP-9를 첨가한 효과를 LIVE/DEAD BacLight 염색으로 표지된 세포의 유세포 분석에 의해 테스트하였다(실험 방법 "9. 유세포 분석" 항목 참조). 그 결과를 도 9에 나타내었다.Additionally, the extent of inhibition at concentrations of 6.25 μM, 12.5 μM, 25 μM and 50 μM (greater than 6.25 μM) was assessed via flow cytometry. The effect of adding V30-SP-8 and V30-SP-9 to Smegma mc 2 155 cells was tested by flow cytometry analysis of cells labeled with LIVE/DEAD BacLight staining (Experimental method "9. Flow cytometry" section) reference). The results are shown in FIG. 9 .

70% 이소프로필 알코올과 DMSO로 처리된 스메그마균 mc2155 세포는 각각 96% 및 25% 사멸 세포를 나타내었다 (세포는 프로피듐 요오드화물 (PI)에 투과성임). 스메그마균 mc2155 세포를 본 발명의 스테이플 펩타이드로 처리했을 때 PI 투과성 세포의 비율이 펩타이드 농도에 따라 증가했고, 이는 본 발명의 펩타이드의 살균 활성을 나타낸다.Smegma mc 2 155 cells treated with 70% isopropyl alcohol and DMSO showed 96% and 25% apoptosis, respectively (cells are permeable to propidium iodide (PI)). When Smegma mc 2 155 cells were treated with the staple peptide of the present invention, the proportion of PI-permeable cells increased according to the peptide concentration, indicating the bactericidal activity of the peptide of the present invention.

V30-SP-8의 성공적인 내재화가 공초점 이미지(도 6b 및 6c)에 의해 입증되었기 때문에, 상기 결과는 실제로 박테리아 세포 내부에서 항균 효과가 발휘되었음을 나타낸다. 70% 이소프로필 알코올 및 DMSO의 항균 활성을 각각 100% 및 0%로 하여 V30-SP-8 및 V30-SP-9의 항균 활성을 표준화했을 때, 분리물의 50%를 억제하는 V30-SP-8의 최소 억제 농도 (MIC50) 값은 12.5 μM 내지 25.0 μM였다(도 9b). 이는 이미 항균 활성을 갖는 것으로 알려진 반코마이신 (스메그마균에 대한 MIC50 = 20 μM)과 유사한 효능을 나타낸다. As the successful internalization of V30-SP-8 was demonstrated by the confocal images (Figs. 6b and 6c), these results indicate that the antibacterial effect was indeed exerted inside the bacterial cells. When the antibacterial activity of V30-SP-8 and V30-SP-9 was standardized with the antibacterial activity of 70% isopropyl alcohol and DMSO of 100% and 0%, respectively, V30-SP-8 inhibiting 50% of the isolates The minimum inhibitory concentration (MIC 50 ) values of were between 12.5 μM and 25.0 μM ( FIG. 9b ). This shows efficacy similar to vancomycin (MIC 50 = 20 μM against Smegma), which is already known to have antibacterial activity.

나선성은 세포 투과성에 영향을 미치는 중요한 요소 중 하나이기 때문에, 테스트된 펩타이드 간의 나선성 차이는 6.25 μM에서의 스테이플 펩타이드의 효과와 비교하여 50 μM에서의 선형 펩타이드의 낮은 효과를 설명할 수 있다. 본 발명의 이러한 결과는 항균 약물 발견 분야의 응용 분야에서 V30-SP-8에 대한 상당한 잠재력을 나타내는 것이다.Since helix is one of the important factors influencing cell permeability, the difference in helix between the tested peptides may explain the lower effect of the linear peptide at 50 μM compared to the effect of the staple peptide at 6.25 μM. These results of the present invention indicate a significant potential for V30-SP-8 in the field of application in the field of antibacterial drug discovery.

결론conclusion

위 실시예로부터 VapBC30 독소-항독소 단백질 복합체를 표적으로 하는 신규 스테이플화 펩타이드 11개를 동정하였다. 그 중 알라닌 스캐닝 및 시험관 내 RNase 분석을 통한 후속 스크리닝에 의한 펩타이드 서열의 설계는 펩타이드 히트로서 V30-SP-8 및 V30-SP-9가 효과적일 수 있음을 보여주었다. CD 분광법 분석과 공초점 레이저 스캐닝 현미경은 α-나선성과 세포 투과성 사이의 상관 관계를 보여줌으로써 본 발명의 접근법의 효율성을 입증한다. 스테이플 펩타이드를 스메그마균으로 처리한 결과 V30-SP-8이 6.25 μM 미만의 MIC50을 갖는 항균 활성을 나타냈고, 이는 반코마이신보다 우수하였다.From the above example, 11 novel stapled peptides targeting the VapBC30 toxin-antitoxin protein complex were identified. Among them, design of peptide sequences by alanine scanning and subsequent screening through in vitro RNase analysis showed that V30-SP-8 and V30-SP-9 could be effective as peptide hits. CD spectroscopy analysis and confocal laser scanning microscopy demonstrate the effectiveness of our approach by showing a correlation between α-helix and cell permeability. As a result of treating the staple peptide with Smegma bacteria, V30-SP-8 exhibited antibacterial activity with a MIC50 of less than 6.25 μM, which was superior to vancomycin.

종합하면, 이러한 결과는 본 발명의 신규 스테이플 펩타이드, 특히 V30-SP-8은 VapBC30 단백질 복합체 내의 상호 작용을 방해함으로써 큰 항균 활성을 발휘함을 나타낸다. 본 발명의 신규 스테이플 펩타이드의 작용 기작은 일반적으로 DNA, RNA, 단백질 또는 세포벽 합성을 차단하는 전형적인 항균제와 구별된다. 이 특징은 본 발명의 신규 스테이플 펩타이드가 약물 내성을 해결하기 위한 유망한 후보물질이 될 수 있음을 나타낸다.Taken together, these results indicate that the novel staple peptide of the present invention, particularly V30-SP-8, exerts great antibacterial activity by interfering with the interaction within the VapBC30 protein complex. The mechanism of action of the novel staple peptide of the present invention is generally distinguished from typical antibacterial agents that block DNA, RNA, protein or cell wall synthesis. This feature indicates that the novel staple peptide of the present invention can be a promising candidate for solving drug resistance.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Antibacterial Stapled Peptides Targeting Toxin-antitoxin System of Mycobacterium tuberculosis and Use Thereof <130> S20P-0021-KR <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 1 Glu Xaa Ala Ala Xaa Arg His Arg 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 2 Glu Xaa Ala Ala Ile Xaa His Arg 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> 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MISC_FEATURE <222> (5) <223> X is 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X is (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 21 Arg Xaa Gly Glu Xaa Gly Gly Arg Gly 1 5 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X is (R)-2-(7'-octenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15) <223> X is (S)-2-(7'-octenyl)-alanine <400> 22 Xaa Pro Asp Ala Glu Arg Phe Xaa Ala Ala Val Glu Ala Asp Xaa 1 5 10 15 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 23 Glu Leu Ala Ala Ile Arg His Arg 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 24 Asp Glu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Glu Ala Ala Val Glu Ala Asp His 1 5 10 15 Ile <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 25 Arg Phe Gly Glu Pro Gly Gly Arg Glu 1 5 <110> SNU R&DB Foundation <120> Antibacterial Stapled Peptides Targeting Toxin-antitoxin System of Mycobacterium tuberculosis and Use Thereof <130> S20P-0021-KR <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 1 Glu Xaa Ala Ala Xaa Arg His Arg 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 2 Glu Xaa Ala Ala Ile Xaa His Arg 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 3 Glu Leu Ala Ala Xaa Arg His Xaa 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 4 Arg Xaa Gly Glu Xaa Gly Gly Arg Glu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 5 Arg Xaa Gly Glu Pro Gly Gly Arg Xaa 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(13) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 6 Ala Glu Arg Phe Xaa Ala Ala Val Glu Ala Asp Xaa Ile 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 7 Asp Glu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Xaa Ala Ala Val Glu Ala Asp Xaa 1 5 10 15 Ile <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 8 Xaa Leu Ala Ala Xaa Arg His Xaa 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 9 Xaa Leu Ala Ala Ile Arg His Xaa 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 10 Arg Xaa Gly Glu Xaa Gly Gly Arg Xaa 1 5 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (S)-2-(7'-octenyl)-alanine, (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine, (R)-2-(7'-octenyl)-alanine, 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine or 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine <400> 11 Xaa Pro Asp Ala Glu Arg Phe Xaa Ala Ala Val Glu Ala Asp Xaa 1 5 10 15 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X is (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 12 Glu Xaa Ala Ala Xaa Arg His Arg 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(6) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 13 Glu Xaa Ala Ala Ile Xaa His Arg 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X is (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 14 Glu Leu Ala Ala Xaa Arg His Xaa 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X is (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 15 Arg Xaa Gly Glu Xaa Gly Gly Arg Glu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X is (R)-2-(7'-octenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 16 Arg Xaa Gly Glu Pro Gly Gly Arg Xaa 1 5 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X is (R)-2-(7'-octenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 17 Ala Glu Arg Phe Xaa Ala Ala Val Glu Ala Asp Xaa Ile 1 5 10 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X is (R)-2-(7'-octenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 18 Asp Glu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Xaa Ala Ala Val Glu Ala Asp Xaa 1 5 10 15 Ile <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X is 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 19 Xaa Leu Ala Ala Xaa Arg His Xaa 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X is (R)-2-(7'-octenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 20 Xaa Leu Ala Ala Ile Arg His Xaa 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X is (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X is 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X is (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine <400> 21 Arg Xaa Gly Glu Xaa Gly Gly Arg Gly 1 5 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthsized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X is (R)-2-(7'-octenyl)-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15) <223> X is (S)-2-(7'-octenyl)-alanine <400> 22 Xaa Pro Asp Ala Glu Arg Phe Xaa Ala Ala Val Glu Ala Asp Xaa 1 5 10 15 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 23 Glu Leu Ala Ala Ile Arg His Arg 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 24 Asp Glu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Glu Ala Ala Val Glu Ala Asp His 1 5 10 15 Ile <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 25 Arg Phe Gly Glu Pro Gly Gly Arg Glu 1 5

Claims (13)

결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 독소-항독소 결합체 VapBC30 내의 VapB30 및 VapC30의 결합을 억제하며, 펩타이드를 구성하는 2개 이상의 아미노산이 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 항균 스테이플 펩타이드.
Mycobacterium tuberculosis ( Mycobacterium tuberculosis ) Toxin-antitoxin conjugate VapBC30 inhibits the binding of VapB30 and VapC30, and two or more amino acids constituting the peptide are linked to each other antibacterial staple peptide.
 제1항에 있어서, 5 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항균 스테이플 펩타이드.
The antibacterial staple peptide according to claim 1, characterized in that it consists of 5 to 20 amino acids.
 제1항에 있어서, 2개 또는 3개의 아미노산이 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 항균 스테이플 펩타이드.
The antibacterial staple peptide according to claim 1, wherein 2 or 3 amino acids are linked to each other.
 제1항에 있어서, 상기 서로 연결되는 아미노산은 이황화 결합, 탄소-탄소 이중결합, 또는 아미드 결합을 통해 연결되는 것을 특징으로 하는, 항균 스테이플 펩타이드.
The antibacterial staple peptide according to claim 1, wherein the amino acids linked to each other are linked via a disulfide bond, a carbon-carbon double bond, or an amide bond.
 제1항에 있어서, 상기 서로 연결되는 아미노산은 알켄기 보유 비천연 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항균 스테이플 펩타이드.
The antibacterial staple peptide according to claim 1, wherein the amino acids linked to each other include non-natural amino acids having an alkene group.
 제5항에 있어서, 상기 알켄기 보유 비천연 아미노산은 (S)-2-(4'-펜테닐)-알라닌 (S5), (S)-2-(7'-옥테닐)-알라닌 (S8), (R)-2-(4'-펜테닐)-알라닌 (R5), (R)-2-(7'-옥테닐)-알라닌 (R8), 2,2-bis-(4'-펜테닐)-글리신 (B5) 및 2,2-bis-(7'-옥테닐)-글리신 (B8)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것을 특징으로 하는, 항균 스테이플 펩타이드.
The method of claim 5, wherein the alkene group-bearing unnatural amino acid is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine (S 5 ), (S)-2-(7'-octenyl)-alanine ( S 8 ), (R)-2-(4'-pentenyl)-alanine (R 5 ), (R)-2-(7'-octenyl)-alanine (R 8 ), 2,2-bis- (4'-pentenyl)-glycine (B 5 ) and 2,2-bis-(7'-octenyl)-glycine (B 8 ), characterized in that at least one selected from the group consisting of, antibacterial staple peptide .
 제1항에 있어서, 상기 서로 연결되는 아미노산은 고리-폐쇄 복분해를 통해 생성된 고리를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는, 항균 스테이플 펩타이드.
The antibacterial staple peptide according to claim 1, wherein the amino acids linked to each other are linked through a ring generated through loop-closed metathesis.
 제1항에 있어서, 하기 서열번호 1 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 특징으로 하는, 항균 스테이플 펩타이드:
EXAAXRHR (서열번호 1);
EXAAIXHR (서열번호 2);
ELAAXRHX (서열번호 3);
RXGEXGGRE (서열번호 4);
RXGEPGGRX (서열번호 5);
AERFXAAVEADXI (서열번호 6);
DEPDAERFXAAVEADXI (서열번호 7);
XLAAXRHX (서열번호 8);
XLAAIRHX (서열번호 9);
RXGEXGGRX (서열번호 10); 및
XPDAERFXAAVEADX (서열번호 11);
상기식에서, X는 (S)-2-(4'-펜테닐)-알라닌 (S5), (S)-2-(7'-옥테닐)-알라닌 (S8), (R)-2-(4'-펜테닐)-알라닌 (R5), (R)-2-(7'-옥테닐)알라닌 (R8), 2,2-bis-(4'-펜테닐)-글리신 (B5) 또는 2,2-bis-(7'-옥테닐)-글리신 (B8)이다.
The antibacterial staple peptide according to claim 1, characterized in that it has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 11:
EXAAXRHR (SEQ ID NO: 1);
EXAAIXHR (SEQ ID NO: 2);
ELAAXRHX (SEQ ID NO: 3);
RXGEXGGRE (SEQ ID NO: 4);
RXGEPGGRX (SEQ ID NO: 5);
AERFXAAVEADXI (SEQ ID NO: 6);
DEPDAERFXAAVEADXI (SEQ ID NO: 7);
XLAAXRHX (SEQ ID NO: 8);
XLAAIRHX (SEQ ID NO: 9);
RXGEXGGRX (SEQ ID NO: 10); and
XPDAERFXAAVEADX (SEQ ID NO: 11);
wherein X is (S)-2-(4'-pentenyl)-alanine (S 5 ), (S)-2-(7'-octenyl)-alanine (S 8 ), (R)-2 -(4'-pentenyl)-alanine (R 5 ), (R)-2-(7'-octenyl) alanine (R 8 ), 2,2-bis-(4'-pentenyl)-glycine ( B 5 ) or 2,2-bis-(7′-octenyl)-glycine (B 8 ).
 제1항에 있어서, 하기 서열번호 12 내지 22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 항균 스테이플 펩타이드:
ER5AAS5RHR (서열번호 12);
ES5AAIS5HR (서열번호 13);
ELAAR5RHS5 (서열번호 14);
RR5GES5GGRE (서열번호 15);
RR8GEPGGRS5 (서열번호 16);
AERFR8AAVEADS5I (서열번호 17);
DEPDAERFR8AAVEADS5I (서열번호 18);
S5LAAB5RHS5 (서열번호 19);
R8LAAIRHS5 (서열번호 20);
RR5GEB5GGRR5 (서열번호 21); 및
R8PDAERFB5AAVEADS8 (서열번호 22).
The antibacterial staple peptide according to claim 1, characterized in that it has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12 to 22:
ER 5 AAS 5 RHR (SEQ ID NO: 12);
ES 5 AAIS 5 HR (SEQ ID NO: 13);
ELAAR 5 RHS 5 (SEQ ID NO: 14);
RR 5 GES 5 GGRE (SEQ ID NO: 15);
RR 8 GEPGGRS 5 (SEQ ID NO: 16);
AERFR 8 AAVEADS 5 I (SEQ ID NO: 17);
DEPDAERFR 8 AAVEADS 5 I (SEQ ID NO: 18);
S 5 LAAB 5 RHS 5 (SEQ ID NO: 19);
R 8 LAAIRHS 5 (SEQ ID NO: 20);
RR 5 GEB 5 GGRR 5 (SEQ ID NO: 21); and
R 8 PDAERFB 5 AAVEADS 8 (SEQ ID NO: 22).
 제1항에 있어서, 하기 서열번호 19 또는 20의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 항균 스테이플 펩타이드:
S5LAAB5RHS5 (서열번호 19); 또는
R8LAAIRHS5 (서열번호 20).
The antibacterial staple peptide according to claim 1, characterized in that it has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or 20:
S 5 LAAB 5 RHS 5 (SEQ ID NO: 19); or
R 8 LAAIRHS 5 (SEQ ID NO: 20).
 제1항에 있어서, 6.25 μM 미만의 MIC50을 갖는 것을 특징으로 하는, 항균 스테이플 펩타이드.
The antimicrobial staple peptide according to claim 1, characterized in that it has a MIC50 of less than 6.25 μM.
 제1항에 내지 제11항 중 어느 한 항의 항균 스테이플 펩타이드를 포함하는, 결핵 예방 또는 치료용 조성물.
A composition for preventing or treating tuberculosis, comprising the antimicrobial staple peptide of any one of claims 1 to 11.
 제12항에 있어서, 상기 항균 스테이플 펩타이드는 하기 서열번호 19 또는 20의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방 또는 치료용 조성물:
S5LAAB5RHS5 (서열번호 19); 또는
R8LAAIRHS5 (서열번호 20).


The composition for preventing or treating tuberculosis according to claim 12, wherein the antibacterial staple peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or 20:
S 5 LAAB 5 RHS 5 (SEQ ID NO: 19); or
R 8 LAAIRHS 5 (SEQ ID NO: 20).
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101746160B1 (en) * 2015-05-29 2017-06-12 서울대학교산학협력단 Antibiotic peptides targeting toxin-antitoxin system of Mycobacterium tuberculosis and use thereof
KR20180091920A (en) * 2015-12-21 2018-08-16 수트라 테라퓨틱스 엘티디 Biologically active compounds conjugated to stapled or stitched peptides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101746160B1 (en) * 2015-05-29 2017-06-12 서울대학교산학협력단 Antibiotic peptides targeting toxin-antitoxin system of Mycobacterium tuberculosis and use thereof
KR20180091920A (en) * 2015-12-21 2018-08-16 수트라 테라퓨틱스 엘티디 Biologically active compounds conjugated to stapled or stitched peptides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Schafmeister, C. E., Po, J., and Verdine, G. L. (2000), J. Am. Chem. Soc. 122, 5891-5892.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116178506A (en) * 2023-02-07 2023-05-30 湖南中晟全肽生化有限公司 Stapler peptide and application thereof
CN116178506B (en) * 2023-02-07 2023-09-19 湖南中晟全肽生化有限公司 Stapler peptide and application thereof

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