KR20220057553A - 인간 재조합 저시알릴화된 에리트로포이에틴, 그것의 정제 방법 및 치료 용도 - Google Patents

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테레시타 데 제수스 로드리구에즈 오바야
다니엘 엔리크 아마로 곤자레즈
주데이 아이메드 갈시아 알타레조
리아나 마리아 소사 테스테
야나라 살미엔토 콘데
로울데스 헬난데즈 데 라 로사
다이리 디아즈 고이레
로페즈 에스텔라 기메네즈
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센트로 데 인뮤놀러지아 모레큘러
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Abstract

본 발명은 생명공학 및 의약 분야에 관한 것이며, 전체 글리칸의 40-60%인 일- 및 이-시알릴화된 시알산 잔기, 전체 글리칸의 40-43%인 삼-시알릴화된 시알산 잔기 및 전체 글리칸의 10-13%인 사-시알릴화된 시알산 잔기를 가진 2-, 3- 및 4-안테나 구조에 의해 형성된 푸코실화된 N-글리칸의 미세이질성을 가진 것을 특징으로 하는 재조합 인간 에리트로포이에틴의 제약학적 조성물을 제시한다. 이 글리코실화 패턴으로 인해 상기 조성물은 신경계의 장애에 사용될 수 있다. 본원에 설명된 제약학적 조성물을 얻는 방법이 또한 제시된다.

Description

인간 재조합 저시알릴화된 에리트로포이에틴, 그것의 정제 방법 및 치료 용도
본 발명은 생명공학 및 의약 분야에 관한 것이며, 특히 신경계 장애에 사용할 수 있는 특성을 부여하는 글리코실화 패턴을 가진 재조합 인간 에리트로포이에틴의 제약학적 조성물을 얻는 것에 관한 것이다.
에리트로포이에틴(EPO)은 30.4 kDa의 분자량을 가진 166개 아미노산에 의해 형성된 당단백질 호르몬이다(Lanfranco, F and Strasburger, C. J. (2016) Sports Endocrinology 47: 115-27). EPO는 태아 및 주산기에 간의 혈관주위 세포에서 자연적으로 생성되고, 성인기에는 주로 신장의 사이질 섬유아세포에서 생성된다. 이 호르몬은 골수에서 적혈구 생성을 자극하고 신경 손상에 대한 뇌의 반응에서 중요한 역할을 한다(Siren L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(7): 4044-9).
EPO는 고도로 글리코실화된 분자이며, 그것의 탄수화물 부분이 분자량의 40%를 구성한다. 이 단백질은 4개의 복잡한 올리고당 사슬을 함유하는 데, 그 중 3개는 N-타입 접합부에 의해 나머지 하나는 O-타입 접합부에 의해 폴리펩타이드 사슬에 연결되며, 이들의 위치는 여러 문헌들에 의해 잘 설명되었다(Elliott, S. et al. (2004) The Journal of Biological Chemistry, 279(16): 16854-16862; Watson et al. (1994) Glyco-biology 4(2): 227-237). N-타입 접합부를 가진 올리고당은 가변적 수의 시알산 말단 잔기를 함유할 수 있고, 이는 분비, 분자 안정성, 수용체 결합 및 생체내 활성에 중요하다(Egrie, J. and Browne, J. (2001) Br. J. Cancer, 84(l): 3-10; Goldwasser et al. (1974) J. Biol. Chem 249: 4202-4206).
90년대부터 현재에 이르기까지 재조합 인간 EPO(rhEPO)의 신경 보호 특성에 대한 수많은 증거가 축적되었다. 1998년에 Sakanara와 동료들은 게르빌루스쥐의 전뇌 허혈 모델에서 총경동맥 폐쇄 후 측심실을 통한 rhEPO 공급이 CA1 영역의 해마 뉴런에 대한 허혈성 손상을 감소시켰음을 증명했다(Sakanara, M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4635-4640).
중추신경계에 대한 EPO의 세포보호 효과는 2004년에 Maiese와 동료들에 의해, 이후 2005년에 Viviani와 동료들에 의해 증명되었다(Maiese, K. et al. (2004) Trends in Pharmacological Sciences 25(11): 577-83, Viviani, D. et al.(2005) Journal of Neurochemistry 93(2): 257-268). 조혈성 EPO에 대한 비임상 연구에서 축적된 모든 정보에도 불구하고, 달성된 결과는, 환자에 적용시 장기적인 사용과 관련하여 발생하는 부작용으로 인해 임상에서는 재현되지 못했다.
성인 신경계에서의 EPO 수용체의 발현은 주로 뉴런, 성상아교세포 및 미세아교세포에서 발견되며, 성상아교세포는 저시알릴화된 EPO를 생성한다(Nagai, A. et al. (2001) Journal of Neuropathology & Experimental Neurology , 60(4): 317-319).
상당수의 연구자들이 동일한 신경보호 특성을 갖지만 조혈 작용으로 인한 부작용은 없는 약물을 얻기 위해 rhEPO를 변형시키는 작업에 착수했다. rhEPO의 전체 효소 탈시알릴화에 의해 얻어진 AsialoEPO(US 2004/0122216)라고 하는 EPO가 상기 언급된 소망하는 특성을 가지며, 이러한 EPO는 rhEPO 수용체에 대해 높은 친화도를 갖지만, 극히 짧은 혈장 반감기로 인해 보호 작용은 제한된다. 에리트로포이에틴의 변형의 다른 예는 단백질의 카바밀화에 의한 리신의 호모시트룰린으로의 변형이며, 이로인해 카바밀화된 EPO(CEPO)가 생성된다(Leist, M., Ghezzi, P., Grasso, G., et al. (2004) 305 (5681): 239-242). 이러한 두 가지 EPO는 모두 조혈 효과를 나타내지 않았으며, CEPO를 가지고 수행된 임상 시험에서 부작용이 관찰되지는 않았지만 신경보호 효과도 증명되지 않았다.
특허출원 WO 2007/009404는 시알산 함량이 낮은 EPO의 상이한 비강 제제들을 제시하는데, 이 EPO는 저자의 추후 간행물에서 NeuroEPO라고 칭했다(Garcia, JC and Sosa, I. (2009), The Scientific World Journal, 9: 970-981). 이러한 rhEPO는 중공 섬유 막 발효 과정 및 가장 산성인 이소폼을 분리하기 위한 이온 교환 크로마토그래피 정제(시알산 함량이 적은 것들로부터 시알산 함량이 높은 것들)에 의해 얻어진다. 상기 NeuroEPO는 13개 이소폼의 프로파일을 가지며, 이중 9개는 EPOCIM®라고 하는 조혈성 rhEPO를 공유했다.
본 발명자는 추가의 화학적 및 유전적 변형 없이 rhEPO 저시알릴화 이소폼의 발현을 증가시킬 수 있는, 4차 암모늄 리간드 Q를 사용한 음이온 교환제로서 단일체 칼럼(monolithic column)을 사용하는 크로마토그래피에 의해 수행된 정제 단계와 조합된 교반 탱크(ST)에서의 생성 과정을 최초로 제시한다. 이들 이소폼은 4.25 내지 5.85의 pH 범위에서 등전점 프로파일을 가지고, NeuroEPO와 상이한 글리코실화와 관련된 3차 구조를 가지며, 이것은 시험관내 및 생체내 모두에서 신경보호 및 신경-회복 기전에 더 큰 유효성을 제공한다.
발명의 간단한 설명
한 구체예에서, 본 발명의 목적은 등전점이 4.25 내지 5.85의 범위 내인 이소폼 프로파일을 가진 rhEPO를 활성 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 rhEPO는 2, 3 및 4-안테나 구조에 의해 형성된 푸코실화된 N-글리칸의 미세이질성(microheterogeneity)을 가지며, 전체 글리칸의 40-60%인 일- 및 이-시알릴화된 시알산 잔기, 40-43%인 삼-시알화된 시알산 잔기 및 10-13%인 사-시알릴화된 시알산 잔기, 뿐만 아니라 제약학적으로 허용되는 부형제를 가진다.
특히, 세린 126의 O-글리코실화 부위는 0 내지 2개의 시알산 잔기를 가진 3개의 시알로폼을 가지며, 일시알릴화된 구조가 전체 글리칸의 78-82%로 가장 풍부하고, 시알릴화되지 않은 구조는 전체 글리칸의 6-10%이다.
아스파라긴 83의 N-글리코실화 부위는 하기 구조를 포함한다:
- 1 또는 2개 시알산 잔기를 갖는 전체 글리칸의 8-12%인 푸코실화된 2-안테나 구조,
- 1, 2 및 3개 시알산 잔기를 갖는 전체 글리칸의 17-21%인 푸코실화된 3-안테나 구조,
- 1 내지 4개 시알산 잔기를 갖는 전체 글리칸의 27-31%인 푸코실화된 4-안테나 구조, 및
- 1 내지 4개 시알산 잔기를 갖는 N-아세틸 락토사민 타입 1 및 2를 가진 전체 글리칸의 38-42%인 푸코실화된 4-안테나 구조.
본 발명에서 제시된 제약학적 조성물을 위한 제약학적으로 허용되는 부형제는 하이드록시프로필메틸셀룰로오스와 같은 생체접착성(bioadhesive) 중합체 및 L-트립토판, L-류신, L-아르기닌 염산염 및 L-히스티딘 염산염과 같은 단백질 안정제를 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다.
본 발명의 목적인 제약학적 조성물의 일부인 rhEPO 이소폼의 상기 설명된 구조는 시험관내 및 생체내 모두에서 신경보호 및 신경-회복 기전에 더 큰 유효성을 부여한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 목적은 34±2℃의 온도 범위에서 관류 모드의 ST에서 발효 과정이 일어나는 미변형 rhEPO를 얻기 위한 방법을 제공하는 것이며, 이때 배양 배지는 단백질을 함유하지 않고, pH 범위가 7.2 내지 7.3이며, 이 배지는 8-12 mmol/L의 최종 농도가 얻어질 때까지 글루타민으로 보충된다. 이 방법은 또한 크로마토그래피 단계를 이용한 정제 과정을 포함하며, 이때 단일체 칼럼이 Q 4차 암모늄 리간드를 사용한 음이온 교환제로서 사용되고, 평형 버퍼는 20 mmol/L Tris 10 mmol/L HCl 용액이며, 이 용액의 pH는 7.9 내지 8.10의 범위이고, 전도도는 1.35-1.65 mS/cm 범위이며, pH가 4.3 내지 4.5이고 전도도가 2 내지 3.5 mS/cm인 50 mmol/L 아세트산나트륨 용리 버퍼를 사용한다.
본 출원서에 설명된 방법에 의해, NeuroEPO와 상이한 글리코실화와 관련된 3차 구조를 가진 저 시알산 함량 이소폼의 수가 증가된 제약학적 조성물이 얻어지며, 이것은 시험관내 및 생체내 모두에서 신경보호 및 신경-회복 기전에 더 큰 유효성을 부여한다.
본 발명의 목적은 또한 치매, 뇌졸중, 파킨슨 질환, 운동실조증, 두개뇌 외상, 녹내장, 자폐증, 신생아 저산소증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증 및 외상, 중독 또는 방사선에 의해 유발된 신경학적 손상의 치료를 위한 본원에 설명된 제약학적 조성물의 용도를 제공하는 것이다. 특히, 이러한 치료가 필요한 대상체에 대해 상기 제약학적 조성물을 사용한 치료 방법이 제시되며, 상기 조성물의 투여는 1mL의 부피 중 0.1mg 내지 4mg의 투여 범위로 6 내지 12개월의 기간 동안 매주 1 내지 3회 수행된다.
발명의 상세한 설명
제약학적 조성물
본 발명의 목적인 rhEPO는 4.25 내지 5.85의 등전점 프로파일, 및 세린 126의 O-글리코실화 부위 및 아스파라긴 24, 38 및 83의 3개의 N-글리코실화 부위에 의한 글리코실화와 관련된 동일한 3차 구조를 유지하는 rhEPO와 유사한 글리코실화와 관련되지 않은 2차 및 3차 단백질 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 본원에 제시된 rhEPO의 탄수화물 조성은 다른 rhEPO와 구별된다. 푸코실화된 N-글리칸의 미세이질성은 전체 탄수화물의 40-60% 범위, 바람직하게 43-50% 범위의 일- 및 이-시알릴화된 시알산 잔기, 전체 탄수화물의 40-43% 범위의 삼-시알릴화된 시알산 잔기 및 전체 탄수화물의 10-13%의 사-시알릴화된 시알산 잔기를 갖는 2, 3 및 4-안테나 구조로 이루어진다.
특히, 세린 126의 O-글리코실화 부위는 0 내지 2개의 시알산 잔기를 갖는 3개의 시알로폼을 가지며, 일-시알릴화된 구조가 전체 글리칸의 78-82%로 가장 풍부하고, 시알릴화되지 않은 구조는 전체 글리칸의 6-10%이다.
아스파라긴 83의 N-글리코실화 부위는 하기 구조를 포함한다:
- 1 또는 2개 시알산 잔기를 갖는 전체 글리칸의 8-12%인 푸코실화된 2-안테나 구조,
- 1, 2 및 3개 시알산 잔기를 갖는 전체 글리칸의 17-21%인 푸코실화된 3-안테나 구조,
- 1 내지 4개 시알산 잔기를 갖는 전체 글리칸의 27-31%인 푸코실화된 4-안테나 구조, 및
- 1 내지 4개 시알산 잔기를 갖는 N-아세틸 락토사민 타입 1 및 2를 가진 전체 글리칸의 38-42%인 푸코실화된 4-안테나 구조.
용어 저시알릴화된 rhEPO, EPO, HS 또는 염기성 이소폼은 본 발명에서 상호 교환하여 사용되며, 상기 제시된 특징을 가진 제약학적 조성물을 말하고, 공통적으로 NeuroEPO plus라고도 언급된다.
본 발명의 목적인 제약학적 조성물은 활성 성분으로서 rhEPO의 저시알릴화된 이소폼들을 가진다. 이들 저시알릴화된 이소폼은 본 발명에 설명된 과정을 통해서 얻어지며, 상기 이소폼을 얻기 위한 rhEPO의 화학적 및/또는 유전적 변형은 수반하지 않는다.
상기 제약학적 조성물의 활성 성분의 일부인 rhEPO 이소폼은 NeuroEPO와 상이한 글리코실화와 관련된 3차 구조를 가지며, 시험관내 및 생체내 모두에서 신경보호 및 신경-회복 기전에 더 큰 유효성을 부여한다.
본 발명의 목적인 제약학적 조성물은 비강 또는 안과적 투여 경로에 의해 투여되며, 최종 제형이 점비제, 비강 스프레이 또는 점안제인 수용액 형태이다. 상기 제약학적 제제는 활성 성분으로서 저시알릴화된 rhEPO 및 선택적으로 제약학적으로 적합한 부형제 및/또는 안정제를 포함한다.
제약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 안정제는 사용된 용량 및 농도에서 대상체에게 비-독성이며, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스 및 메틸셀룰로오스와 같은 생체접착성 중합체; L-트립토판, L-류신, L-아르기닌 염산염 및/또는 L-히스티딘 염산염 및 그것의 염과 같은 단백질 안정제를 포함할 수 있다.
치료적 적용 및 치료 방법
본 발명은 뇌혈관 질환, 정신 질환 및 신경퇴행성 질환과 같은 신경계 장애의 치료에 유용한 제약학적 조성물을 제공한다. 특히, 상기 질환은 치매, 뇌졸중, 파킨슨 질환, 운동실조증, 두개뇌 외상, 녹내장, 자폐증, 신생아 저산소증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증 및 외상, 중독 또는 방사선에 의해 유발된 신경학적 손상일 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 저시알화된 rhEPO를 6 내지 12개월의 기간 동안 매주 1 내지 3회 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 투여는 점막에 약물을 점적주입함으로써 서서히 비강내(IN) 경로로 수행될 수 있다. 투여 용량은 0.1mg-4mg, 바람직하게 0.5mg-1mg의 범위이다. 용량 당 최대 투여 부피는 1mL이며, 콧구멍 당 0.5mL이고, 총 하루 용량은 3mL이다. 상기 부피는 각 적용 사이에 5-15분의 시간 간격으로, 바람직하게 15분마다 더 작은 부피로 나누어 적용될 수 있다.
rhEPO의 저시알릴화된 이소폼을 얻는 방법
본 발명에서 제시된 방법은 상이한 단계들로 이루어지며, 하기 설명된 셀라인을 이용한다.
셀라인
본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 셀라인은 rhEPO의 생성에 대해 보고된 것과 동일하다.
가장 많이 사용되는 계통은 CHO, COS, BHK, Namalwa, HeLa, Hep3B, HepG2이고, 본 발명의 경우 바람직하게 CHO 셀라인이 사용된다.
발효 과정
본 발명의 발효 과정은 ST 기술을 사용하여 수행된다. 이 과정은 다음과 같은 몇 단계로 구성된다. 제1 단계는 연구 세포 은행 앰풀을 실온(18-24℃)에 도달할 때까지 해동하는 것이다. 이어서 확장 단계가 수행되며, 이때 세포는 바이오매스를 증가시키려는 목적하에 시드 발효기의 적절한 접종을 보장하는 세포 농도 및 세포 생존율으로 규모가 조정된다. 일단 ≥1x106 세포/mL의 세포 밀도에 도달하면 상이한 작동 방식으로 발효가 시작된다. 이들 방식은 배치 배양, 바이오매스 보유 또는 미보유 연속 배양일 수 있다. 저시알릴화된 이소폼을 얻기 위해, 34±2℃ 범위의 온도 및 6.8±0.4 범위의 pH가 이 발효 단계에서 보장되어야 한다. 세포는 8-12 mmol/L 범위의 글루타민 최종 농도가 얻어질 때까지 단백질-무함유 배양 배지에서 성장해야 한다.
정제 과정
저시알릴화된 rhEPO의 정제 과정은 하기의 크로마토그래피 단계를 포함한다.
먼저, 착색된 리간드에서 위-친화성(pseudo-affinity) 크로마토그래피가 수행된다. 이 단계의 목적은 rhEPO를 포착하고 상청액(SN)에 존재하는 주요 오염물질을 부분적으로 제거하는 것이다. 이어서, 단백질의 버퍼를 다음번 크로마토그래피 단계를 위한 적용 용액의 버퍼로 교환하기 위해 겔 여과 크로마토그래피가 수행된다.
다음에, 금속킬레이트에 의한 위-친화성 크로마토그래피가 수행된다. 이 단계의 목표는 rhEPO를 포착하고 이 과정의 이전 단계에서 제거되지 않았던 오염물질 분획을 완전히 제거하는 것이다. 버퍼를 다음번 크로마토그래피 단계의 적용 용액의 버퍼로 교환하기 위해 겔 여과 크로마토그래피가 다시 수행된다.
제조 과정의 중요 단계로서, Q 4차 암모늄 리간드를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피가 수행된다. 이 크로마토그래피 단계에서 단일체 칼럼이 사용된다. 이 크로마토그래피의 목적은 산 이소폼으로부터 (생물학적으로 활성인) 저시알릴화된 이소폼의 분리, DNA의 보유 및 생성물의 농축이다. 이들은 모두 오염되거나 산성 이소폼과 혼합되지 않은 저시알릴화된 이소폼이 얻어지는 것을 보증한다.
마지막으로, 버퍼를 교환하고 단백질을 활성 원료 형태로 용리시킬 목적하에 겔 여과 크로마토그래피가 다시 수행된다.
도 1. 이소폼 프로파일: A) 절단된 이소폼; B) 평가된 온도 및 pH 조건하의 배양에서 생성된 SN
도 2. 평가된 온도 및 pH 조건하의 배양물 중 저시알릴화된 이소폼의 비율
도 3. 파일럿 규모에서 평가된 조건하의 각 배양물 중 저시알릴화된 이소폼의 비율
도 4. SN에서 저감된 산성 이소폼의 상대 강도
도 5. rhEPO 이소폼의 Q 4차 암모늄 리간드의 정적 흡수 용량에 대한 이동상 pH 및 전도도의 영향: (A) 저시알릴화된(염기성), (B) 산성
도 6. 돌파 곡선 A): 크로마토그래피 매트릭스 "Q SFF", B): 단일체 칼럼 "CIM QA"
도 7. 염기성 및 산성 이소폼의 성능에 대한 용리 버퍼 pH의 영향
도 8. 제조 규모에서 rhEPO의 저시알릴화된 이소폼의 분포
도 9. 질량분석법과 결합된 쯔위터이온성 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피에 의한 저시알릴화된 rhEPO의 N-글리칸의 연구
도 10. A) 트립신 및 뉴라미니다아제 및 B) 트립신에 의한 효소절단의 결과 관찰된 저시알릴화된 rhEPO 0126 글리코펩타이드 글리코폼의 추출된 이온 전기영동도(EIE)
도 11. 트립신 및 뉴라미니다아제 효소절단의 결과 관찰된 N83 글리코펩타이드 글리코폼의 EIE
도 12. A) 트립신 및 뉴라미니다아제 및 B) 트립신에 의한 효소절단의 결과 관찰된 저시알릴화된 rhEPO N83 글리코펩타이드 글리코폼의 EIE
도 13. 8% 디메틸설폭사이드(DMSO)에 의한 세포 손상 및 저시알릴화된 rhEPO에 의한 후속 처리 후 24h 및 48h에서의 성상아교세포 배양물의 세포 생존율 프로파일
도 14. 관찰 7일 동안의 생존율, Kaplan-Meier 차트
도 15. 경색 24시간 후 동물의 신경학적 상태
도 16. 정상세포 마우스 모델에서 망상적혈구의 수에 대한 상이한 rhEPO 이소폼의 적용 효과
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 더 상세히 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1
pH 및 온도는 실험실 규모에서 rhEPO 이소폼 프로파일에 영향을 미친다
인간 EPO 유전자로 형질감염된 CHO 셀라인으로부터 시드 세포 은행을 얻었고, 단백질-무함유 배지에서 현탁 상태로 성장하도록 적응시켰다. 이 배양 배지에 대한 완전한 적응은 배양 제25일째인 37 세대 후에 얻어졌다.
상이한 pH 및 온도 조건하에 셀라인의 성능을 평가하기 위해 두 변수를 조합하여 실험을 설계했다. 실험 조건을 표 1에 나타낸다. 0.5 mol/L 수산화나트륨을 첨가하여 배양물의 pH를 조절했다.
Figure pct00001
평가된 상이한 조건에서의 배양물에서 생성된 SN의 샘플에 상응하는 rhEPO의 이소폼 프로파일을 등전 포커싱에 의해 결정했다. 2 내지 5 및 3 내지 10의 pH 범위의 암폴린의 혼합물을 사용했고, 내부 EPOCIM® 기준 물질을 대조군으로 사용했다. 샘플에서 각 이소폼의 강도 퍼센트를 Gene Tools 프로그램을 사용하여 밀도측정법에 의해 분석했다. 2.80 내지 4.25 범위의 pH 값을 가진 이소폼은 산성 이소폼으로 정의되었고, 4.25 내지 6.55 범위의 pH 값을 가진 이소폼은 염기성 이소폼으로 정의되었다(도 1A). 도 1B는 이소폼 프로파일이 온도에 의한 영향을 강하게 받았음을 보여준다. pH와 무관하게, 각 조건에 상응하는 SN 샘플을 37℃의 온도에서 대조군과 비교했을 때는 7개의 산성 이소폼이 관찰된다. 한편, 35℃에서는 산성 이소폼의 소실이 관찰되었는데, 이것은 pH 7.2 및 7.3의 조건에서 보다 뚜렸했다.
도 2는 pH 7.2 및 7.3과 온도 35℃의 조건에서 얻어진 이소폼이 전부(100%) 염기성 이소폼이었음을 보여준다.
실시예 2
pH 및 온도는 파일럿 규모에서 rhEPO 이소폼 프로파일에 영향을 미친다
실험실 규모에서 얻어진 최상의 배양 조건(35℃, pH 7.2 및 7.3)의 효과를 세포 배양을 위한 보다 제어되고 유리한 환경에서 평가했다. 실시예 1에 설명된 시드 세포 은행으로부터, 3.5 L 유효 부피의 ST 타입 바이오반응기(Infors-AGCH 4103, Bottmingen)를 사용하여 4개의 발효 과정을 설계했다. 연구 조건을 표 2에 나타낸다. 초기 세포 생존율은 평가된 모든 조건에서 90%를 초과했다.
Figure pct00002
각 발효 종료시 샘플을 채취했고, 바이오반응기에서 평가된 조건에 대해 배양물에서 생성된 SN 샘플의 이소폼 프로파일을 등전 포커싱 기술에 의해 결정했다. 일단 이들 프로파일이 얻어지면 Gene Tools 프로그램을 사용했고, 등전 포커싱 겔에 상응하는 이미지로부터 시작해서, 겔에 존재하는 각 밴드의 강도를 결정하고, 각 조건에서 저시알릴화된 이소폼의 비율을 평가했다.
도 3에서 확인한 바와 같이, 배양 조건 2 및 3(35℃, pH 7.2-7.3)에서, 저시알릴화된 이소폼의 비율은 조건 1 및 4보다 더 높았다. 이 결과는 실험실 규모에서 얻어진 결과와 일치하는데, 즉 pH 7.2-7.3 및 온도 35℃로 연구 조건을 변경함으로써 pH 4.25-5.85의 연구 조건에 비해 rhEPO의 이소폼 프로파일을 더 큰 강도로 개선시켰다.
실시예 3
배양 배지에서 글루타민의 농도를 증가시킴으로써 rhEPO 염기성 이소폼의 발현이 선호된다
배양 배지에서 글루타민의 농도 증가가 저시알릴화된 이소폼의 증가에 영향을 미쳤는지의 여부를 평가하기 위해 rhEPO-생성 CHO 셀라인의 성능을 평가했다. 상이한 글루타민 농도의 배양 배지에 노출된 시드 세포 은행을 사용했고, 배양 배지에 대한 적응을 15일 동안 수행했다. 37℃ 인큐베이터에서 교반 속도가 600 rpm으로 유지된 회전 병을 사용하여, 최종 부피 300 mL의 배양 배지 중 0.5x106 세포/mL의 초기 세포 농도에서 평가를 시작했다. 배양 배지의 최종 글루타민 농도는 8, 12 및 16 mmol/L였고, 6 mmol/L의 글루타민을 가진 배양 배지를 대조군으로 사용했다.
상이한 글루타민 농도로 처리하고 7일 후 배양물의 SN에서 저시알릴화된 이소폼의 상대 강도를 밀도측정법에 의해 평가했다.
도 4는 평가된 3개의 변형 각각에서, 대조군에 비해 더 높은 비율의 저시알릴화된 이소폼이 얻어졌음을 보여주며, 따라서 배양 배지에서 글루타민 농도가 증가함에 따라 SN에서 저시알릴화된 이소폼의 획득에 유리하다는 것을 입증한다. 이들 이소폼의 최고 값은 8 mmol/L 글루타민에서 관찰되었다(87%).
실시예 4
pH 및 전도도는 실험실 규모에서 Q 강 4차 암모늄 음이온 교환제에서 산성 및 염기성 이소폼의 흡수에 영향을 미친다
Q 강 4차 암모늄 음이온 교환제에서 산성 이소폼의 최대 흡수에 유리한 pH 및 전도도 조건을 결정할 목적으로, 다음의 버퍼 용액들을 평가했다: 20 mmol/L 인산나트륨(무수 다이베이직 및 모노베이직 이수화물) 및 20 mmol/L Tris 10 mmol/L HCl. pH 6 내지 8 및 전도도 1.5 내지 5 mS/cm의 상이한 pH 및 전도도 값에서 버퍼 용액을 연구했다. 교환제로의 산성 이소폼의 최대 흡수는 pH 6 및 전도도 1.50 mS/cm의 조건에서 관찰되었다. 한편, 저시알릴화된 (염기성) 이소폼의 흡수는 pH 8 및 전도도 1.50 mS/cm에서 최대화된다. 이 결과가 도 5에 도시된다.
실시예 5
단일체 칼럼 기술을 사용한 Q 강 음이온성 매트릭스는 실험실 규모에서 종래의 크로마토그래피 겔 기술을 사용한 것과 비교하여 rhEPO 이소폼을 분리하는 능력 측면에서 보다 좋은 성능을 가진다
연구된 각 기술의 동적 흡수 용량(Q)을 2개의 돌파 곡선을 사용하여 계산했다. 각 기술의 제조자가 추천한 2개의 선형 유속을 사용하며, 크로마토그래피 겔 기술에 대해 100 cm/h 및 600 cm/h, 단일체 칼럼(CIM QA)에 대해 156 cm/h 및 624 cm/h이었다. 종래의 기술 및 단일체 칼럼 기술에 대해 실험에서 사용된 평형 용액은 실시예 4에서 얻어진 결과에 따라서 pH 8 및 전도도 1.5 mS/cm을 가진 Tris-HCl 버퍼였다.
rhEPO 샘플을 칼럼에 적용하고, 이들의 출구에서 상이한 시간에 샘플을 채취했다. 각 샘플에서 단백질의 농도(C)를 분광광도법에 의해 결정했다. 각 샘플에서 기지의 C 값을 사용하여 비-흡수된 단백질의 비율 C/CO를 계산했다. Q 매트릭스의 mL 당 rhEPO의 mg 단위로 주어진 겔의 단위 부피 당 칼럼에 적용된 단백질의 질량, 즉 적재량을 매번 계산했다.
도 6에서, C/CO 값 vs. 동적 흡수 용량이 돌파 곡선에 그래프로 표시되며, 이로써 특정된 유속에서 비-흡수된 단백질의 비율 C/CO = 0.1에 따른 겔의 Q를 알 수 있다.
도 6A는 종래의 크로마토그래피 겔 기술에서 얻어진 돌파 곡선을 도시하며, 최저 유속에서 최고 동적 용량을 가졌다. 도 6B는 단일체 칼럼이 시험된 두 선형 유속에서 매우 유사한 동적 흡수 용량을 가진다는 것을 보여주며, 따라서 매트릭스의 동적 흡수 용량의 변동 없이 더 높은 유속에서 작동될 수 있다.
표 3은 수행된 상이한 측정에서 얻어진 Q 값을 나타낸다.
Figure pct00003
충전층 및 단일체 칼럼 기술에서 강 음이온 교환제에서 수행된 Q 연구 결과를 비교했을 때, 두 기술 모두 연구된 최저 선형 속도에서 유사한 Q를 가진다는 것이 확인되었다. 그러나, 최고 선형 속도에서는 단일체 칼럼이 평가된 종래의 크로마토그래피 매트릭스보다 1.40배 더 큰 동적 흡수 용량을 가진다. 따라서, 단일체 칼럼은 정제될 rhEPO 질량을 처리하는 용량에 영향 없이 해당 과정의 작업 속도 증가를 허용한다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 6
실험실 규모에서 pH를 저하시킴으로써 단일체 칼럼에서 저시알릴화된 rhEPO 이소폼의 용리가 선호된다
Q SFF 및 CIM QA 칼럼을 사용하여 실험 테스트를 수행했다. 두 기술에서 사용된 평형 용액은 실시예 4에 따른 pH 8 및 전도도 1.5 mS/cm의 Tris-HCl 버퍼였다. Q SFF 칼럼의 연구 선형 속도는 600 cm/h였고, 단일체 칼럼의 연구 선형 속도는 624 cm/h였다. 실험에서 사용된 제품은 "Sephadex" G-25 분자 배제 크로마토그래피 칼럼이었고, 버퍼를 상기 언급된 평형 용액으로 교체했다. 염기성 이소폼의 용리를 위해, pH 값 4.41, 4.81, 5.06, 5.20인 0.01% 50 mmol/L Tween 20 아세트산나트륨 버퍼를 사용하여 단일체 음이온-교환 칼럼으로 몇 번의 과정을 수행했다.
각 과정에서 저시알릴화된(염기성) 이소폼 및 산성 이소폼의 용리시 얻어진 회수물이 도 7에 도시된다. 이들 결과의 분석으로부터, 염기성 이소폼의 용리 버퍼 용액의 pH가 증가함에 따라 이들의 성능이 감소한다는 것이 확인되었고, 따라서 pH 4.41에서 50 mmol/L 아세트산나트륨 버퍼가 용리를 위해 선택되었다.
실시예 7
제조 규모에서 저시알릴화된 rhEPO를 얻는 과정은 이소폼의 분리 및 순도의 측면에서 일정하다
실시예 1에 설명된 시드 세포 은행으로부터 발효 과정을 수행했고, 초기 세포 생존율은 90%를 초과한다. 8 mmol/L 글루타민의 최종 농도에 도달하도록 보충된 단백질-무함유 배양 배지에서 35℃의 온도로 발효 단계를 수행했고, 배지의 pH는 7.2 내지 7.3으로 유지했다.
일단 수거물이 4번 얻어지면 정제 단계를 수행했고, 이때 Q 4차 리간드를 사용한 음이온 교환제의 단일체 칼럼을 사용했다. pH 8 및 전도도 1.5 mS/cm의 Tris-HCl 용액을 평형 버퍼로 사용했고, pH 4.41인 50 mmol/L 아세트산나트륨 버퍼를 용리에 사용했다.
정제 과정 후 얻어진 활성 원료 4개 배치의 이소폼 프로파일을 등전 포커싱 기술에 의해 결정했다. 2 내지 5 및 3 내지 10의 pH 범위를 가진 암폴린의 혼합물을 사용했고, 내부 EPOCIM® 기준 물질을 대조군으로 사용했다. 도 8은 이소폼의 분리에 있어서 일관성을 보여주며, 6개의 주 이소폼으로 구성된 이소폼 프로파일이 관찰되고, 이중 단지 2개만 대조군과 공유된다.
또한, 정제된 이소폼의 시알산 함량을 Europe 8.0 약전(2014)에 설명된 과정에 따라서 결정했고, 역상 HPLC에 의해 순도를 결정했다. 표 4는 얻어진 시알산 함량 및 순도 결과를 나타낸다.
Figure pct00004
시알산 함량은 단백질 분자 당 시알산 10 mol 미만이었고, 순도는 4개의 배치에서 95%를 초과했으며, 이로부터 저시알릴화된 rhEPO를 얻기 위한 본 과정이 NeuroEPO에서 관찰된 것과 상이한 4.25 내지 5.85의 pH 범위에 있는 이소폼의 획득을 보증한다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 8
저시알릴화된 rhEPO의 글리코실화와 관련된 3차 구조는 특징적인 미세이질성을 나타낸다
글리칸 분석
N-글리칸 프로파일을 연구하기 위해 저시알릴화된 rhEPO에 펩타이드 N-글리코시다아제 F(PNGase F)를 사용하여 변성 및 효소 절단 과정을 행했다. 일단 N-글리칸이 방출되면 HyperSep Hypercab SPE 카트리지를 사용하여 고체상 추출에 의해 정제했다(Mancera-Arteu, M. et al. (2016) Anal. Chim. Acta 940: 92-103). 이어서, 이들을 Gimenez 등(2015, Gimenez, E et al. (2015) Anal. Chim. Acta, 866: 59-68)에 의해 제시된 과정에 따라서 유도체화했다.
질량분석법과 결합된 쯔위터이온성-친수성 상호작용 모세관 액체 크로마토그래피를 Mancera-Arteu, M. 등(2016, Anal. Chim. Acta, 940: 92-103)에 의해 제시된 방법에 따라서 수행했다.
도 9는 저시알릴화된 rhEPO에서 검출된 글리칸 중 3개의 질량 스펙트럼을 도시한다. 보이는 대로, 글리칸 3Ant2SiA1Fuc이 가장 풍부하고, 글리칸4Ant4SiA1Fuc은 감소된 양으로 발견된다.
표 5는 구조에 따른 글리칸의 상대 면적 퍼센트를 나타낸다.
구조에 따른 글리칸의 상대 면적 퍼센트
글리칸 면적 (%) **
2-안테나 구조 10.3
3-안테나 구조 17.2
4-안테나 구조 72.5
표 6은 검출된 글리칸을 상응하는 상대 면적, 단일동위원소 실험 분자 질량(Mexp) 및 질량 오차와 함께 나타낸다. 보이는 대로, 시알릴화 구조가 적은 글리칸이 상당수 존재한다.
Figure pct00005
표 6에서 보이는 대로, 시알릴화 구조가 더 많은 글리칸(4개 시알산 분자)은 낮은 비율로 발견된다. 대조적으로, 3Ant1SiA1Fuc, 4Ant1SiA1Fuc, 4Ant1LacNAc1SiA1Fuc 및 4Ant3LacNAc1SiA1Fuc와 같은 다른 rhEPO에서 발견되지 않은 시알산 분자를 가진 구조가 검출된다. 글리칸 4Ant3Sia1Fuc이 저시알릴화된 rhEPO에 풍부하다.
또한, 검출된 전체 글리칸에 대한 안테나에 의한 상대 면적의 퍼센트가 다른 rhEPO와 상이하다는 것과 1개 또는 2개의 시알산 잔기를 가진 구조는 안테나에 의한 상대 면적의 50%를 초과한다는 것을 알 수 있다.
글리코펩타이드 분석
0126 및 N83 글리코펩타이드에 존재하는 모든 글리코폼을 검출하기 위해, 트립신 및 뉴라미니다아제(rhEPO HS-TN)를 사용하여 rhEPO 및 rhEPO-CRS(약전 기준 제품)에 효소절단을 수행했다. 검출된 각 글리코폼에서의 모든 시알로폼을 트립신 효소절단 분석(rhEPO HS-T)으로부터 연구했다. 샘플은 Gimenez, E. et al.(2011, Rapid Commun Mass Spectrom. 25: 2307-2316)에 의해 제시된 과정에 따라서 질량분석법에 의해 분석했다.
도 10A 및 B는 rhEPO HS-TN 및 HS-T 효소절단물에서 검출된 0126 글리코펩타이드 글리코폼의 EIE를 도시한다. 도 10A에서, 0126/OsiA 글리코폼의 것에 상응하는 단일 피크가 관찰되며, 뉴라미니다아제가 글리코펩타이드의 완전한 탈시알릴화를 야기하므로, 모든 시알로폼이 단일 글리코폼으로 된다. 반면, 도 10B에서는 트립신만으로 효소절단되었을 때는 0, 1 및 2개의 시알산 분자를 가진 3개의 시알로폼이 관찰된다.
표 7은 검출된 0126 시알로폼을 상응하는 상대 면적, 단일동위원소 실험 분자 질량(Mexp) 및 질량 오차와 함께 나타낸다.
Figure pct00006
얻어진 결과는 가장 풍부한 시알로폼이 하나의 시알산 분자를 함유하는 것임을 보여준다. 시알릴화되지 않은 이소폼 및 단지 하나의 시알산만 가진 것들의 상대 면적 퍼센트는 다른 rhEPO에 비해 더 높다.
N83 글리코펩타이드의 경우, rhEPO HS-TN 효소절단물을 분석했을 때, 시알산이 없는 6개의 상이한 글리코폼에 상응하는 6개의 피크가 검출되었다. 얻어진 EIE가 도 11에 도시되고, 검출된 글리코폼은 표 8에 나타낸다. 얻어진 결과는 N83 부위에서 복잡한 탈시알릴화된 4-안테나 구조의 퍼센트가 더 높다는 것을 보여준다.
Figure pct00007
도 12A는 rhEPO HS-TN 효소절단물에서 상이한 4-안테나 구조들이 분리되지 않은 것을 보여준다. 반면, rhEPO HS-T 효소절단물의 시알릴화된 글리코폼이 분석되었을 때는 이들의 분명한 분리가 관찰되며, 3개의 시알산 잔기를 가진 것들이 더 큰 강도를 가진다(도 12B). 이들 결과는 글리칸 연구로부터의 발견과 일치한다.
표 9는 검출된 모든 시알로폼을 상응하는 상대 면적, 단일동위원소 실험 분자 질량(Mexp) 및 질량 오차와 함께 나타낸다.
Figure pct00008
상기 결과들은 저시알릴화된 rhEPO가 단백질이 트립신으로만 효소절단되었을 때 더 적은 시알릴화된 구조(예를 들어, 2Ant1SiA1Fuc 또는 3Ant1SiA1Fuc)를 갖는 것을 특징으로 한다는 것을 입증한다. 일- 및 이-시알릴화된 구조의 상대 면적은 대략 60%이다.
N83 글리코펩타이드에서는 4-안테나 구조가 다른 글리코폼들과 비교하여 최고 퍼센트로 발견되고, 여기서 2개의 시알산 잔기를 가진 구조가 최대 비율을 가지게 된다.
실시예 9
저시알릴화된 rhEPO는 DMSO의 세포독성에 대하여 성상아교세포에 대해 회복 효과를 가진다
PG4 성상아교세포 셀라인을 3.7g/L NaHCO3 및 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 글루코오스가 많은 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양했다. 세포를 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37℃의 온도로 24시간 동안 인큐베이션했다. 특정된 시간 후 SN을 추출했고, 8% DMSO로 세포에 손상을 야기했으며, 24h 동안 다시 인큐베이션했다. 이어서 SN을 제거하고, 상이한 농도의 저시알릴화된 rhEPO(1.25; 2.5; 5 및 10 ng/mL)를 가진 2% DMEM 배양 배지를 첨가했다. 24h 및 48h 후 알라마르 블루(Alamar Blue) 시약을 첨가한 다음 세포를 6h 동안 인큐베이션했고, 540/630 nm에서 판독했다. 모든 인큐베이션은 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37℃의 온도로 수행했다.
저시알릴화된 rhEPO의 상이한 농도 1.25, 2.5, 5 및 10 ng/mL에서 세포가 그들의 생존율을 어떻게 회복할 수 있었는지 도 13에서 확인할 수 있으며, 최상의 조건은 1.25 ng/mL의 저시알릴화된 rhEPO이고, 이것은 성상아교세포의 회복 능력을 증명한다.
실시예 10
저시알릴화된 rhEPO는 NeuroEPO보다 좋은 신경회복 활성을 가진다
몽골 게르빌루스쥐를 사용하여 영구적인 일측성 허혈 모델을 Kahn K(1972, Kahn K. (1972) Minneap 22: 510-515)에 의해 제시된 방법에 따라서 생성했다. 이어서 동물을 다음과 같이 5개의 실험 그룹으로 구분하였다.
그룹 1: 비히클 10 μL
그룹 2: 저시알릴화된 rhEPO 0.142 mg/kg로 치료
그룹 3: 저시알릴화된 rhEPO 0.0142 mg/kg로 치료
그룹 4: NeuroEPO 0.142 mg/kg로 치료
그룹 5: NeuroEPO 0.0142 mg/kg로 치료
각 치료는 4일 동안 하루 3회 IN 경로에 의해 투여했다. 동물은 치료 중 처음 4일 동안, 그리고 이후 3일의 회복기 동안 조사되었다.
결과는 비히클과 비교했을 때 0.142 및 0.0142 mg/kg의 용량의 저시알릴화된 rhEPO로 치료된 동물에서 유의하게 더 높은 생존율을 보여주며, NeuroEPO는 0.142 mg/kg의 용량에서만 사망률이 유의하게 감소했고 0.0142 mg/kg 용량에서는 그렇지 않았다(도 14).
신경학적 평가는 저시알릴화된 rhEPO(NeuroEPO plus)의 신경보호 효과를 나타냈다. 이에 따르면, 저시알릴화된 rhEPO로 치료된 그룹은 위약 그룹 및 NeuroEPO로 치료된 그룹과 비교하여, 사용된 용량으로 치료된 동물에서 신경학적 등급의 값을 유의하게 감소시켰고, NeuroEPO로 치료된 경우는 저시알릴화된 rhEPO로 치료된 그룹과 동일한 결과가 단지 0.142 mg/kg 용량에서만 달성될 수 있었다(도 15)(던컨 통계 테스트, 같은 문자 p>0.05; 다른 문자 p>0.05).
실시예 11
저시알릴화된 rhEPO는 정상세포 마우스 모델에서 망상적혈구 수를 증가시키지 않는다
B6D2F1 암컷 마우스를 각 6마리씩 6개의 실험 그룹으로 구분하고, 다음과 같이 단일 치료 용량을 제공했다.
그룹 1: 200μL 부피 중 rhEPO 연구 기준 물질 0.003 mg/mL, 피하 경로(SC)
그룹 2: 200μL 부피 중 저시알릴화된 rhEPO 0.006 mg/mL, SC 경로
그룹 3: 200μL 부피 중 저시알릴화된 rhEPO 0.5 mg/mL, IN 경로
그룹 4: 200μL 부피 중 저시알릴화된 rhEPO 1 mg/mL, IN 경로
그룹 5: 200μL 부피 중 저시알릴화된 rhEPO 2 mg/mL, IN 경로
그룹 6: 대조군, 200μL 부형제, SC 경로
망상적혈구 수의 결과가 도 16에 도시된다. 확인되 바와 같이, SC 및 IN 경로 모두에서 대조군 동물과 저시알릴화된 rhEPO로 치료된 그룹의 동물 간에 유의한 차이가 없었다. rhEPO 연구 기준 물질로 치료된 동물의 망상적혈구 수는 대조군 동물 및 저시알릴화된 rhEPO로 치료된 그룹의 동물보다 유의하게 더 높았다(던컨 테스트, 동일 문자 p> 0.05; 다른 문자 p <0.05).
상기 결과는 저시알릴화된 EPO가 이 시험을 위해 확립된 최고 용량에서도 망상적혈구 수를 증가시키지 않는다는 것을 증명했으며, 이것은 저시알릴화된 EPO가 조혈 효과를 갖지 않음을 보여준다.

Claims (13)

  1. 활성 성분으로서 등전점 프로파일이 4.25 내지 5.85 사이에 있는 재조합 인간 에리트로포이에틴(rhEPO)을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 푸코실화된 N-글리칸의 미세이질성이 2-, 3- 및 4-안테나 구조에 의해 형성되고, 전체 글리칸의 40-60% 범위의 일- 및 이-시알릴화된 시알산 잔기, 전체 글리칸의 40-43% 범위의 삼-시알릴화된 잔기 및 전체 글리칸의 10-13% 범위의 사-시알릴화된 잔기 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 세린 126에서 O-글리코실화 부위가 0 내지 2개의 시알산 잔기를 갖는 3개의 시알로폼을 가지고, 이때 일-시알릴화된 구조가 가장 풍부하며 전체 글리칸의 78-82%이고, 시알릴화되지 않은 구조는 전체 글리칸의 6-10%인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 아스파라긴 83의 N-글리코실화 부위가 하기 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
    - 전체 글리칸의 8-12%인, 1 및 2개의 시알산 잔기를 가진 푸코실화된 2-안테나 구조,
    - 전체 글리칸의 17-21%인, 1, 2 및 3개의 시알산 잔기를 가진 푸코실화된 3-안테나 구조,
    - 전체 글리칸의 27-31%인, 1 내지 4개의 시알산 잔기를 가진 푸코실화된 4-안테나 구조, 및
    - 전체 글리칸의 38-42%인, 1 내지 4개의 시알산 잔기가 존재하는 N-아세틸 락토사민 타입 1 및 2를 가진 푸코실화된 4-안테나 구조,
  5. 제 1 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 부형제는 생체접착성 중합체 및 단백질 안정제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 생체접착성 중합체는
    - 하이드록시메틸셀룰로오스,
    - 하이드록시프로필셀룰로오스, 및
    - 메틸셀룰로오스
    를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 단백질 안정제는
    - L-트립토판,
    - L-류신,
    - L-아르기닌 염산염, 및
    - L-히스티딘 염산염
    을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  8. 추가의 화학적 및 유전적 변형 없이 등전점 프로파일이 4.25 내지 5.85 사이에 있는 rhEPO를 얻는 방법으로서, 발효 과정이 교반 탱크에서 일어나고, 정제 과정에서 Q 4차 암모늄 리간드를 사용한 음이온 교환제로서 단일체 칼럼을 사용하는 크로마토그래피 단계가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, rhEPO의 발효 과정이, 8 내지 12 mmol/L의 최종 농도가 되도록 글루타민으로 보충된 단백질-무함유 배양 배지에서, 35℃의 온도 및 7.2-7.3의 pH 범위의 교반 탱크에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 정제 과정에서 pH 8 및 전도도 1.5 mS/cm를 가진 20 mmol/L Tris 10 mmol/L HCl이 평형 버퍼로 사용되고, pH 4.41을 가진 50 mmol/L 아세트산나트륨 용액이 용리 버퍼로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 저시알릴화된 rhEPO가 활성 성분인 제약학적 조성물.
  12. 치매, 뇌졸중, 파킨슨 질환, 운동실조증, 두개뇌 외상, 녹내장, 자폐증, 신생아 저산소증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증 및 외상, 중독 또는 방사선에 의해 유발된 신경학적 손상의 치료를 위한 제 1 항 내지 제 7 항 및 제 11 항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물의 용도.
  13. 제 1 항 내지 제 7 항 및 제 11 항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 1mL의 부피 중 0.1mg 내지 4mg의 투여 범위로 6 내지 12개월 동안 매주 1 내지 3회 투여하는 단계를 포함하는, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법.
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