KR20220056665A - Marker composition and primer set for Microsatellite Instability (MSI) Diagnosis - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 현미부수체 불안정성 진단용 마커 조성물 및 프라이머 세트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 BAT26 및 CAT25을 포함하는 마커 조성물 또는 이의 프라이머 세트를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a marker composition and a primer set for diagnosing microsatellite instability, and more particularly, to a use for diagnosing microsatellite instability using a marker composition comprising BAT26 and CAT25 or a primer set thereof.
현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI)은 암세포에서 DNA mismatch repair system (MMR)에 관련된 유전자의 메틸화, 변이로 인해 DNA 복구시스템에 결함이 발생하여 mono-, di-, tri-, tetra-nucleotide 등의 현미부수체 반복 횟수가 일정하게 유지되지 못하는 상태를 의미한다. MSI는 NIH/NCI에서 권고하는 NCI 패널를 통해 유전성 비용종성 대장암을 진단, 치료 반응, 생존율을 예측하는데 활용 되어왔다. 또한 최근 MSI는 여러 종양에서 확인되었고, 2014년부터 면역항암제의 표적으로 사용되고 있으며, 면역항암제의 반응을 예측하는 바이오마커로 MSI 검사가 널리 사용되고 있다.Microsatellite instability (MSI) is caused by defects in the DNA repair system due to methylation or mutation of genes involved in the DNA mismatch repair system (MMR) in cancer cells, such as mono-, di-, tri-, tetra-nucleotide, etc. It means the state in which the number of microsatellite repetitions is not kept constant. MSI has been used to diagnose hereditary non-polyposis colorectal cancer, predict treatment response, and survival rate through the NCI panel recommended by the NIH/NCI. In addition, MSI has recently been identified in several tumors, has been used as a target for immunotherapy since 2014, and the MSI test has been widely used as a biomarker to predict the response of immunotherapy.
현재 MSI를 확인하는 가장 유용한 방법은 중합효소연쇄반응법 (Polymerase chain reaction, PCR)으로 알려져 있으며, 현미부수체 불안정성 검사에는 2개의 단 염기 (mononucleotide) 현미부수체인 BAT25, BAT26과 3개의 쌍 염기 (dinucleotide) 현미부수체인 D5S346, D2S123, D17S250으로 구성된 베데스다 패널이 주로 사용되어 왔다. 그러나, 최근에는 단 염기 현미부수체인 BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27로 구성된 새로운 패널을 제시하여 기존의 베데스다 패널보다 민감도와 특이도를 높이는 연구가 진행되고 있다. 특히, 이 패널 중 두 개 이상의 현미부수체가 불안정성을 보이는 경우를 MSI-H (high)로 정의하며, 하나의 현미부수체에서만 불안정성을 보이는 경우를 MSI-L (low), 불안정성을 보이는 현미부수체가 하나도 없는 경우를 MSS (stable) 라고 정의하며, MSI-H인 경우를 현미부수체 불안정성이 있다고 평가하며 산발성 대장암의 경우 10-15%가 MSI-H인 반면, 유전성 비용종성 대장암의 경우에는 거의 대부분의 환자가 MSI-H이기 때문에 현미부수체 불안정성 검사는 추가적인 유전자 검사가 필요한 대상 군을 선별하는 데 사용될 수 있다. 또한 면역항암제의 반응에서도 MSI-H 여부가 매우 중요한 면역치료 고려 대상으로 대두되고 있어 이에 대한 활발한 연구가 진행중이다 (미국 등록특허 10/699802).Currently, the most useful method for confirming MSI is known as the polymerase chain reaction (PCR), and for microsatellite instability testing, two mononucleotide microsatellites BAT25 and BAT26 and three pair bases ( dinucleotide) The Bethesda panel composed of microsatellites D5S346, D2S123, and D17S250 has been mainly used. However, recently, a new panel composed of BAT25, BAT26, NR21, NR24, and NR27, which are single base microsatellites, has been proposed, and research is underway to increase the sensitivity and specificity compared to the existing Bethesda panel. In particular, a case in which two or more microsatellites in this panel show instability is defined as MSI-H (high), a case in which only one microsatellite shows instability is defined as MSI-L (low), and a microsatellite showing instability is defined as MSI-L (low). The absence of one is defined as MSS (stable), and the case of MSI-H is evaluated as microsatellite instability. Because the majority of patients are MSI-H, microsatellite instability testing can be used to select subjects for additional genetic testing. In addition, MSI-H is also emerging as a very important consideration for immunotherapy in the response of immuno-cancer drugs, and active research is ongoing on this (US Patent 10/699802).
현재 MSI-PCR검사법은 2 bp 미만의 allele size 차이가 나타나는 quasi-monomorphic marker인 BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27을 사용한 pentaplex PCR이 gold-standard로 알려져 있고, 이 검사법은 기존의 dinucleotide marker와는 달리 paired-normal을 같이 PCR해서 결과를 비교 하지 않고, 종양 조직만 사용하여 MSI 현상을 진단할 수 있는 장점이 있다. 하지만, 최근 늘어나는 MSI 검사량과 필요 검체 양이 충분치 않은 경우, formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) 조직의 경우 DNA 퀄리티가 좋지 못해 PCR 실패율이 높은 경우가 많이나타나고 있다. 따라서, 임상 진단 검사에서 좀 더 효과적인 PCR 마커 세트를 발굴하여 민감도와 특이도가 높은 결과를 얻고 저비용 고효율의 검사법의 개발이 필요한 실정이다.Currently, MSI-PCR test method is known as gold-standard pentaplex PCR using BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27, which are quasi-monomorphic markers showing an allele size difference of less than 2 bp. It has the advantage of diagnosing the MSI phenomenon using only the tumor tissue without comparing the results of paired-normal PCR together. However, when the MSI test amount and the required sample amount are not sufficient, the DNA quality of formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue is not good and the PCR failure rate is high. Therefore, it is necessary to discover a more effective PCR marker set in a clinical diagnostic test to obtain a result with high sensitivity and specificity and to develop a low-cost and high-efficiency test method.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 민감도와 특이도를 높일 수 있는 현미부수체 불안정성 진단 마커를 연구한 결과, BAT26 및 CAT25를 사용하는 경우 DNA 퀄리티가 떨어지는 FFPE 검체에서도 PCR 실패없이 빠르고 정확하게 현미부수체 불안정성 진단 결과를 도출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.In order to solve the above problems, the present inventors studied microsatellite instability diagnostic markers that can increase sensitivity and specificity. The present invention was completed by confirming that microsatellite instability diagnostic results could be derived.
이에, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a marker composition for diagnosing microsatellite instability (MSI) comprising a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide having a sequence complementary thereto.
또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.In addition, the present invention provides a primer set for diagnosing microsatellite instability (MSI), comprising a pair of primers represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and a pair of primers represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6. It is another object to provide a composition comprising the composition, a kit comprising the composition.
또한, 본 발명은 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing microsatellite instability (MSI).
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
이에, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단용 마커 조성물을 제공한다.Accordingly, in order to achieve the above object, the present invention provides a marker composition for diagnosing microsatellite instability (MSI) comprising a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide having a complementary sequence thereto do.
또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention provides a primer set for diagnosing microsatellite instability (MSI), comprising a primer pair represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and a primer pair represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 do.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단용 조성물 및 이를 포함하는 현미부수체 불안정성 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a composition for diagnosing microsatellite instability (MSI) comprising the primer set and a kit for diagnosing microsatellite instability comprising the same.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.In addition, the present invention provides an information providing method for diagnosing microsatellite instability (MSI) comprising the following steps.
(a) 생물학적 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;(a) isolating DNA from the biological sample;
(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하는 단계; 및(b) using the isolated DNA as a template, and performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer set; and
(c) 상기 (b)단계에서 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계.(c) confirming the PCR product amplified in step (b) by electrophoresis.
본 발명에 일 구현예에서, 상기 현미부수체 불안정성을 진단하는 것은 암의 예후를 예측하기 위한 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, diagnosing the microsatellite instability may be for predicting the prognosis of cancer.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 예후는 재발, 생존, 또는 무병생존일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the prognosis may be recurrence, survival, or disease-free survival.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 콧물, 타액, 뇨, 객담, 및 림프액로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the biological sample may be any one or more selected from the group consisting of tissue, blood, plasma, serum, runny nose, saliva, urine, sputum, and lymph.
본 발명자들은 현미부수체 불안정성을 진단하기 위해 인종, 성별, 집단간의 polymorphism이 가장 적은 PCR 마커를 선별하고 (BAT26 및 CAT25), 상기 마커를 이용하는 경우 기존의 검사법인 pentaplex PCR와 NGS 검사 결과와 비교하여 민감도와 특이도가 100%임을 확인함으로써, MSI-high 여부를 정확히 판단할 수 있는 검사법으로 간단하고, 저비용 및 고효율의 duplex 현미부수체 불안정성 PCR 프라이머 세트를 개발하였다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 5개의 마커를 사용하는 PCR 검사에 비해 효율이 뛰어나고, DNA 퀄리티가 떨어지는 FFPE 검체에서도 PCR 실패없이 빠르고 정확하게 현미부수체 불안정성 진단 결과를 도출할 수 있을 것으로 기대된다.In order to diagnose microsatellite instability, the present inventors select a PCR marker with the least polymorphism between race, gender, and group (BAT26 and CAT25), and when using the marker, compared with the results of the existing pentaplex PCR and NGS test, By confirming that the sensitivity and specificity are 100%, a simple, low-cost and high-efficiency duplex microsatellite instability PCR primer set was developed as a test method that can accurately determine whether MSI-high or not. The primer set according to the present invention is more efficient than a PCR test using five markers, and it is expected that it will be possible to quickly and accurately derive microsatellite instability diagnostic results without PCR failure even in FFPE samples with poor DNA quality.
도 1은 pentaplex 프라이머 세트 (NR27, NR21, BAT26, BAT25, NR24) 프라이머를 이용하여 PCR을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 현미부수체 불안정성이 있는 경우에 pentaplex 프라이머 세트 (NR27, NR21, BAT26, BAT25, NR24) 또는 Duplex 프라이머 세트 (BAT26, CAT25)를 이용하여 PCR-genotyping을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 현미부수체가 안정한 경우에 pentaplex 프라이머 세트 (NR27, NR21, BAT26, BAT25, NR24) 또는 Duplex 프라이머 세트 (BAT26, CAT25)를 이용하여 PCR-genotyping을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 정상 대조군 및 MSI-high 샘플환자에서 본 발명에 따른 BAT26 프라이머 세트를 이용하여 PCR-genotyping을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정상 대조군 및 MSI-high 샘플환자에서 본 발명에 따른 CAT25 프라이머 세트를 이용하여 PCR-genotyping을 확인한 결과를 나타낸 것이다.1 shows the results of confirming PCR using a pentaplex primer set (NR27, NR21, BAT26, BAT25, NR24) primers.
Figure 2a shows the results of confirming PCR-genotyping using a pentaplex primer set (NR27, NR21, BAT26, BAT25, NR24) or a duplex primer set (BAT26, CAT25) in the case of microsatellite instability.
Figure 2b shows the results of confirming PCR-genotyping using a pentaplex primer set (NR27, NR21, BAT26, BAT25, NR24) or a duplex primer set (BAT26, CAT25) when the microsatellite is stable.
3 shows the results of confirming PCR-genotyping using the BAT26 primer set according to the present invention in normal control and MSI-high sample patients.
4 shows the results of confirming PCR-genotyping using the CAT25 primer set according to the present invention in normal control and MSI-high sample patients.
본 발명자들은 민감도와 특이도를 높일 수 있는 현미부수체 불안정성 진단 마커를 연구한 결과, BAT26 및 CAT25를 사용하는 경우 DNA 퀄리티가 떨어지는 FFPE 검체에서도 PCR 실패없이 빠르고 정확하게 현미부수체 불안정성 진단 결과를 도출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.As a result of studying microsatellite instability diagnostic markers that can increase sensitivity and specificity, the present inventors found that when BAT26 and CAT25 are used, microsatellite instability diagnostic results can be derived quickly and accurately without PCR failure even in FFPE samples with poor DNA quality. By confirming that it is possible, the present invention was completed.
이에, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단용 마커 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a marker composition for diagnosing microsatellite instability (MSI) comprising a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide having a sequence complementary thereto.
본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 마커 조성물은 CASP2 (caspase 2) 유전자의 3’UTR 서열인 CAT25 마커를 의미하며, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 마커 조성물은 MSH2 유전자의 intron 5 서열인 BAT26 마커를 의미한다. 이때, 상기 마커 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.The marker composition represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention means a CAT25 marker, which is the 3'UTR sequence of the CASP2 (caspase 2) gene, and the marker composition represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is the MSH2 gene intron 5 refers to the BAT26 marker sequence. At this time, the marker composition is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 It may include a nucleotide sequence having homology.
또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention provides a primer set for diagnosing microsatellite instability (MSI), comprising a primer pair represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and a primer pair represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 do.
본 발명에 따른 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머는 CASP2 gene 의 3’UTR에 위치한 T25 영역을 타겟으로 한 정방향 및 역방향의 프라이머 세트이고, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머는 MSH2 gene의 intron5 에 위치한 A25 영역을 타겟으로 한 프라이머 세트이다. 이때, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 내지 서열번호 6으로 표시되는 염기서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.The primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 according to the present invention are forward and reverse primer sets targeting the T25 region located at 3'UTR of the CASP2 gene, and the bases of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 The primer indicated by the sequence is a primer set targeting the A25 region located in intron5 of the MSH2 gene. In this case, the primer set contains 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 6 or more. It may include a nucleotide sequence having homology.
본 발명에 사용되는 용어, “프라이머”는 상보적인 템플레이트와 염기세트 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복제를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.As used herein, the term “primer” refers to a short nucleic acid sequence capable of forming a base pair with a complementary template and serving as a starting point for template strand replication.
본 발명에서 사용되는 용어 “현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI)”이란 세포 내 유전자들이 쉽게 돌연변이를 일으키는 상태로 암세포에서 DNA mismatch repair system (MMR) 에 관련된 유전자의 메틸화, 변이로 인해 DNA 복구시스템에 결함이 발생하여 mono-, di-, tri-, tetra-nucleotide 등의 현미부수체 반복 횟수가 일정하게 유지되지 못하는 상태를 의미하며, 종양 돌연변이를 만들어낼 가능성이 더 높아지는 상태가 되는 것을 의미하며, MSH-H는 MSS 또는 MSI-L에 비해 암의 예후가 좋게 나타나는 것으로 알려져 있는 바, 본 발명에 따른 현미부수체 불안정성을 진단하는 것은 암의 예후를 예측하기 위한 것일 수 있다.As used herein, the term “microsatellite instability (MSI)” refers to a state in which intracellular genes are easily mutated. In cancer cells, DNA mismatch repair system (MMR)-related genes are methylated and mutated. It means a state in which the number of microsatellite repeats such as mono-, di-, tri-, tetra-nucleotide cannot be kept constant due to a defect in the , MSH-H is known to have a better prognosis of cancer compared to MSS or MSI-L, so diagnosing microsatellite instability according to the present invention may be for predicting the prognosis of cancer.
본 발명에서 사용되는 용어, “예후 (prognosis)”란, 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 암의 재발, 생존 (overall survival), 또는 무병생존 (disease-free survival)을 의미하는 것이나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.As used herein, the term “prognosis” refers to prediction of disease progression and recovery, and refers to a prospect or a preliminary evaluation. In the present invention, prognosis means cancer recurrence, overall survival, or disease-free survival, but is not limited thereto.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 사용된 신규 프라이머 세트가 종래 기술인 pentaplex 프라이머 세트를 이용한 PCR에 비해 민감도 및 특이도가 우수함을 확인하였다.The present inventors confirmed that the novel primer set used in the present invention through specific examples has superior sensitivity and specificity compared to PCR using the conventional pentaplex primer set.
본 발명의 일 실시예에 의하면, Pentaplex PCR과 비교하여 본 발명의 Duplex PCR을 수행한 경우에 집단 간의 polymorphism이 가장 낮게 나타나며 PCR 성공 효율이 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 각 프라이머 세트의 PCR-genotyping을 확인한 결과, BAT26 또는 CAT25를 단독으로 확인하는 경우 정상 대조군과 MSI-high 샘플환자인 #1 및 #2는 현저히 다른 deletion 현상을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).According to an embodiment of the present invention, it was confirmed that the polymorphism between the groups was the lowest and the PCR success efficiency was high when the duplex PCR of the present invention was performed compared to the pentaplex PCR, and PCR-genotyping of each primer set was confirmed. As a result, when checking BAT26 or CAT25 alone, it was confirmed that the normal control group and MSI-high
따라서, MSI-high 환자를 선별하는데 있어, Duplex PCR 프라이머 세트를 사용하는 것이 pentaplex PCR 프라이머 세트를 사용한 검사법보다 훨씬 더 고효율, 저비용의 민감도와 특이도가 높은 방법임을 유추할 수 있다.Therefore, in screening MSI-high patients, it can be inferred that the use of the duplex PCR primer set is a much more efficient, low-cost, sensitive and specific method than the test method using the pentaplex PCR primer set.
이에 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.Accordingly, as another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for diagnosing microsatellite instability (MSI) comprising the primer set and a kit comprising the composition.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응 (예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 상기 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트 (compartment)로 제작될 수 있다.The kit of the present invention may optionally include reagents necessary for performing a target amplification PCR reaction (eg, PCR reaction), such as a buffer, a DNA polymerase cofactor, and deoxyribonucleotide-5-triphosphate. In addition, the kit may include various polynucleotide molecules, reverse transcriptase, buffers and reagents, and antibodies that inhibit DNA polymerase activity. In addition, in the kit, the optimal amount of reagent used in a specific reaction can be easily determined by a person skilled in the art having the disclosure herein. Typically, the kit may be manufactured as a separate package or compartment comprising the aforementioned components.
상기 키트를 이용하면 손쉽게 PCR을 수행하고 소량의 FFPE 조직에서도 실패율을 줄이고 특이성을 높여 현미부수체 불안정성을 진단할 수 있다.Using the kit, PCR can be easily performed, and microsatellite instability can be diagnosed by reducing the failure rate and increasing specificity even in a small amount of FFPE tissue.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI) 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.As another aspect of the present invention, the present invention provides an information providing method for diagnosing microsatellite instability (MSI) comprising the following steps.
(a) 생물학적 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;(a) isolating DNA from the biological sample;
(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하는 단계; 및(b) using the isolated DNA as a template, and performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer set; and
(c) 상기 (b)단계에서 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계.(c) confirming the PCR product amplified in step (b) by electrophoresis.
본 발명에 따른 상기 생물학적 시료는 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 콧물, 타액, 뇨, 객담, 및 림프액로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The biological sample according to the present invention may be any one or more selected from the group consisting of tissue, blood, plasma, serum, runny nose, saliva, urine, sputum, and lymph, but is not limited thereto.
상기 생물학적 시료로부터 DNA를 추출하는 것은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 반응 완충용액(2X), 본 발명에 따른 프라이머 세트, 3차 증류수 및 개체에서 추출한 게놈 DNA를 혼합하여 PCR 반응액을 제조할 수 있으며, DNA 중합효소 및 dNTP를 함께 이용하여 PCR을 수행할 수 있다.Extracting DNA from the biological sample may be performed according to a method commonly used in the art, and may be performed using a commercially available DNA extraction kit. Specifically, a PCR reaction solution can be prepared by mixing the reaction buffer (2X), the primer set according to the present invention, tertiary distilled water, and genomic DNA extracted from the individual, and PCR can be performed using a DNA polymerase and dNTP together. can
상기 단계 (c)에서 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 방법은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 (agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔 (polyacrylamide gel) 전기영동을 이용할 수 있다.The method of confirming the PCR product by electrophoresis in step (c) may use agarose gel or polyacrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product.
본 발명에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 PCR-genotyping을 확인하였으며, 패널 중 한 개 이상의 현미부수체가 불안정성을 보이는 경우를 MSI-H (high)로 정의하고, 현미부수체 불안정성이 없는 경우를 MSS (microsatellite stable)로 정의하였다.In the present invention, PCR-genotyping was confirmed using a primer set including a primer pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and a primer set including a primer pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, one of the panels The case where the microsatellite showed instability was defined as MSI-H (high), and the case where there was no microsatellite instability was defined as MSS (microsatellite stable).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples and the like will be described in detail to help the understanding of the present invention. However, the embodiments according to the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those of ordinary skill in the art.
[실시예][Example]
실시예 1. 신규 프라이머 세트 제조Example 1. Preparation of a new primer set
1-1. CAT25 프라이머 세트 제조1-1. CAT25 Primer Set Manufacturing
CASP2 gene의 3’ UTR에 위치한 T25 영역을 타겟으로 한 프라이머 세트(CAT25F: 5’-CCCTGCTTATCTGAAACTTCCC-3’ (서열번호 3), CAT25R: 5’-GGAGTTGGAGCTTGCAGTGA-3’ (서열번호 4))를 제조하였다.A primer set targeting the T25 region located in the 3' UTR of the CASP2 gene (CAT25F: 5'-CCCTGCTTATCTGAAACTTCCC-3' (SEQ ID NO: 3), CAT25R: 5'-GGAGTTGGAGCTTGCAGTGA-3' (SEQ ID NO: 4)) was prepared .
1-2. BAT26 프라이머 세트 제조1-2. BAT26 Primer Set Manufacturing
MSH2 gene의 intron5 에 위치한 A25 영역을 타겟으로 한 프라이머 세트(BAT26F: 5’-ACTGACTACTTTTGACTTCAGCC-3’ (서열번호 5), BAT26R: 5’-TTTTAACCATTCAACATTTTTAACCCT-3’ (서열번호 6))를 제조하였다.A primer set targeting the A25 region located in intron5 of the MSH2 gene (BAT26F: 5'-ACTGACTACTTTTGACTTCAGCC-3' (SEQ ID NO: 5), BAT26R: 5'-TTTTAACCATTCAACATTTTTAACCCT-3' (SEQ ID NO: 6)) was prepared.
1-3. 신규 프라이머 세트 PCR 조건1-3. New primer set PCR conditions
1 tube-multiplex PCR시 동일한 PCR 조건에서 반응시키기 위해 프라이머의 Tm값을 58℃로 맞춰 디자인함으로써, PCR 효율을 높여주었다.In the case of 1 tube-multiplex PCR, the PCR efficiency was increased by designing the Tm value of the primer to 58° C. to react under the same PCR conditions.
또한, 고농도의 template DNA와 다량의 프라이머 세트를 한 tube에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머간 간섭현상 및 inhibition으로 PCR 증폭 효율 저하와 비특이적 증폭 산물 형성 등의 문제점이 발생할 수 있는 바, Solgent사의 2X multiplex PCR enzyme을 사용하여 hot-start PCR로 multiplex PCR 수행하여, DNA 퀄리티가 좋지 않은 소량의 FFPE 조직에서도 특이성 높은 증폭이 가능하게 하였다.In addition, since a high concentration of template DNA and a large amount of primer set are put in one tube and reacted, problems such as a decrease in PCR amplification efficiency and formation of non-specific amplification products due to interference between primers and inhibition may occur. Solgent's 2X multiplex PCR By performing multiplex PCR with hot-start PCR using enzyme, it was possible to amplify with high specificity even in a small amount of FFPE tissue with poor DNA quality.
실시예 2. 신규 프라이머 세트의 PCR 민감도 및 특이도 확인Example 2. Confirmation of PCR sensitivity and specificity of a novel primer set
도 1에 도시한 바와 같이 pentaplex PCR 경우 5개의 프라이머를 이용하여 PCR을 하는데 이 경우 프라이머간의 간섭반응이 일어나 poor DNA인 경우, PCR fail이 매우 높은 것이 일반적이기 때문에 민감도와 특이도가 높은 2개의 마커를 선별하여 duplex PCR을 진행하는 경우 PCR 성공률이 매우 높아지고, pentaplex PCR (NR27, NR21, BAT26, BAT25, NR24)에 비해 집단 간의 polymorphism이 가장 낮게 나타나며 PCR 성공 효율이 높게 나타나는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 1, in the case of pentaplex PCR, PCR is performed using 5 primers. In this case, interference reaction occurs between primers and, in the case of poor DNA, PCR fail is generally very high, so two markers with high sensitivity and specificity It was confirmed that the PCR success rate was very high when duplex PCR was performed by selecting
보다 구체적으로 BAT26 및 CAT25를 이용한 duplex MSI PCR 마커를 개발하였으며, 상기 PCR 마커와 종래 기술인 pentaplex PCR (NR27, NR21, BAT26, BAT25, NR24) 및 NGS 검사와의 민감도 및 특이도를 비교하였다.More specifically, a duplex MSI PCR marker was developed using BAT26 and CAT25, and the sensitivity and specificity of the PCR marker and the conventional pentaplex PCR (NR27, NR21, BAT26, BAT25, NR24) and NGS tests were compared.
그 결과, BAT26 및 CAT25를 이용하여 Duplex PCR을 수행한 경우에 도 2a에 나타낸 바와 같이 MSI-H의 결과물로 민감도가 높은 BAT26과 CAT25 두 마커 모두에서 deletion이 관찰되었으며, 도 2b에 나타낸 바와 같이 MSS의 결과물로 BAT26과 CAT25 두 마커 모두 정상 peak로 관찰되었다. As a result, when duplex PCR was performed using BAT26 and CAT25, deletion was observed in both markers of high sensitivity BAT26 and CAT25 as a result of MSI-H as shown in FIG. 2a, and MSS as shown in FIG. 2b As a result of , both BAT26 and CAT25 markers were observed as normal peaks.
나아가, 각 프라이머 세트의 PCR-genotyping을 확인한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 BAT26의 경우 정상 대조군에서는 약 125 값에서 높은 peak를 나타냈으나, MSI-high 샘플환자인 #1 및 #2는 약 110 내지 115 부근에서 높은 peak를 나타내 정상 대조군과 현저히 다른 deletion현상을 확인하였다.Furthermore, as a result of confirming PCR-genotyping of each primer set, as shown in FIG. 3 , in the case of BAT26, a high peak was shown at a value of about 125 in the normal control group, but
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이 CAT25의 경우 정상 대조군에서는 139 내지 142 값에서 높은 peak를 나타냈으나, MSI-high 샘플환자인 #1 및 #2는 각각 131 내지 133의 값 또는 128과 140에서 높은 peak를 나타내 정상 대조군과 현저히 다른 deletion현상을 확인하였다.In addition, as shown in FIG. 4 , in the case of CAT25, the normal control showed a high peak at values of 139 to 142, but MSI-high
상기 결과로부터, 면역치료의 바이오마커로 알려진 MSI-high 환자를 선별하는데 있어, Duplex PCR 프라이머를 사용하는 것이 pentaplex PCR 프라이머를 사용한 검사법보다 훨씬 더 고효율, 저비용의 진단이 가능하며 민감도 및 특이도가 높은 진단이 가능함을 유추할 수 있다.From the above results, in screening MSI-high patients known as biomarkers of immunotherapy, the use of duplex PCR primers enables much more efficient and low-cost diagnosis than the test method using pentaplex PCR primers, and has high sensitivity and specificity. Diagnosis can be inferred.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The description of the present invention stated above is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. There will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Marker composition and primer set for Microsatellite Instability (MSI) Diagnosis <130> PD20-213 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1124 <212> DNA <213> CASP2 3' UTR <400> 1 gagaaggcca ggaagaatgg tgtgtttccc tagactctgt aaccacctct ctgtcttttt 60 ccttcctgag aaacgtccat ctctctccct tactattccc actttcattc aatcaacctg 120 cacttcatat ctagatttct agaaaagctt cctagcttat ctccctgctt catatctctc 180 ccttctttac cttcatttca tcctgttggc tgctgccacc aaatctgtct agaatcctgc 240 tttacaggat catgtaaatg ctcaaagatg taatgtagtt ctttgttcct gctttctctt 300 tcagtattaa actctccttt gatattatgt ggcttttatt tcagtgccat acatgttatt 360 gttttcaacc tagaaacctt tatccctgct tatctgaaac ttcccaactt ccctgttctt 420 taagactttt tttttttttt tttttttttt tgagacagag tctcgctctg tcgcccaggc 480 tggagggcag tggcacgatc tcagctcact gcaagctcca actcccgggt tcacgccatt 540 ctcctgcctc agccttccaa gtagctggga ctacaggtgc ccgccaccgt gcccggctaa 600 tttttttgta tttttagtag agacagggtt tcaccatgtt agccgggatg gtcttgatct 660 cctgacctca tgatccaccc acctcagcct cccaaagtgt tgggattaca ggcgtgagcc 720 actgcgcccg ggcaagacct ttttttaaaa aaaaaaaaaa aaaaacttcc attctttctt 780 cctccagtct gttctcacat aacagagtag ttttggtttt taattttttt tggttgtttg 840 ctgttttttg ttttttaagg tgagttctca ctatgtttct cagactggtc tcgaactcct 900 ggcctcaagc catcttcccg cctcagcctc tcaaatagct gggcttacag gcatgagcca 960 ccacacctgg ccaggatttg gttgtttaaa tataaatctg atcacccccc tgcttagaac 1020 ccttctgctt tctattaccc ctcatttaaa atgtaaactc ttcaccttgg tttatgagaa 1080 ctggttcttg ccttcccctt gaacctcatt aaatggtgat ttct 1124 <210> 2 <211> 450 <212> DNA <213> MSH2 intron5 <400> 2 gttgcagttt catcactgtc tgcggtaatc aagtttttag aactcttatc agatgattcc 60 aactttggac agtttgaact gactactttt gacttcagcc agtatatgaa attggatatt 120 gcagcagtca gagcccttaa cctttttcag gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag 180 ggttaaaaat gttgaatggt taaaaaatgt tttcattgac atatactgaa gaagcttata 240 aaggagctaa aatattttga aatattatta tacttggatt agataactag ctttaaatgg 300 ctgtattttt ctctcccctc ctccactcca ctttttaact tttttttttt taagtcagag 360 tctcacttgt tccctaggcc agagtgcagt ggcacaatct cagcccactc taacctccac 420 ctcccaagta gttgggatta cagttgcctg 450 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT25 F primer <400> 3 ccctgcttat ctgaaacttc cc 22 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT25 R primer <400> 4 ggagttggag cttgcagtga 20 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAT26 F primer <400> 5 actgactact tttgacttca gcc 23 <210> 6 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAT26 R primer <400> 6 ttttaaccat tcaacatttt taaccct 27 <110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Marker composition and primer set for Microsatellite Instability (MSI) Diagnosis <130> PD20-213 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1124 <212> DNA <213> CASP2 3' UTR <400> 1 gagaaggcca ggaagaatgg tgtgtttccc tagactctgt aaccacctct ctgtcttttt 60 ccttcctgag aaacgtccat ctctctccct tactattccc actttcattc aatcaacctg 120 cacttcatat ctagatttct 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tataaatctg atcacccccc tgcttagaac 1020 ccttctgctt tctattaccc ctcatttaaa atgtaaactc ttcaccttgg tttatgagaa 1080 ctggttcttg ccttcccctt gaacctcatt aaatggtgat ttct 1124 <210> 2 <211> 450 <212> DNA <213> MSH2 intron5 <400> 2 gttgcagttt catcactgtc tgcggtaatc aagtttttag aactcttatc agatgattcc 60 aactttggac agtttgaact gactactttt gacttcagcc agtatatgaa attggatatt 120 gcagcagtca gagcccttaa cctttttcag gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag 180 ggttaaaaat gttgaatggt taaaaaatgt tttcattgac atatactgaa gaagcttata 240 aaggagctaa aatattttga aatattatta tacttggatt agataactag ctttaaatgg 300 ctgtattttt ctctcccctc ctccactcca ctttttaact tttttttttt taagtcagag 360 tctcacttgt tccctaggcc agagtgcagt ggcacaatct cagcccactc taacctccac 420 ctcccaagta gttgggatta cagttgcctg 450 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT25 F primer <400> 3 ccctgcttat ctgaaacttc cc 22 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT25 R primer <400> 4 ggagttggag cttgcagtga 20 <210> 5 <211> 23 <212> RNA 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Claims (12)
상기 현미부수체 불안정성을 진단하는 것은 암의 예후를 예측하기 위한 용도인 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.The method of claim 1,
Diagnosing the microsatellite instability is characterized in that the use for predicting the prognosis of cancer, a marker composition.
상기 예후는 재발, 생존, 또는 무병생존인 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.3. The method of claim 2,
The prognosis is characterized in that recurrence, survival, or disease-free survival, a marker composition.
상기 현미부수체 불안정성을 진단하는 것은 암의 예후를 예측하기 위한 용도인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.5. The method of claim 4,
Diagnosing the microsatellite instability is characterized in that the use for predicting the prognosis of cancer, a primer set.
상기 예후는 재발, 생존, 또는 무병생존인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.6. The method of claim 5,
The prognosis is characterized in that recurrence, survival, or disease-free survival, the primer set.
(a) 생물학적 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계.A method for providing information for diagnosing microsatellite instability (MSI), comprising the steps of:
(a) isolating DNA from the biological sample;
(b) using the isolated DNA as a template, and performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer set of any one of claims 4 to 6; and
(c) confirming the PCR product amplified in step (b) by electrophoresis.
상기 현미부수체 불안정성을 진단하는 것은 암의 예후를 예측하기 위한 용도인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.10. The method of claim 9,
Diagnosing the microsatellite instability is characterized in that the use for predicting the prognosis of cancer, information providing method.
상기 예후는 재발, 생존, 또는 무병생존인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.11. The method of claim 10,
The prognosis is recurrence, survival, or disease-free survival, characterized in that, information providing method.
상기 생물학적 시료는 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 콧물, 타액, 뇨, 객담, 및 림프액로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
10. The method of claim 9,
The biological sample is an information providing method, characterized in that at least one selected from the group consisting of tissue, blood, plasma, serum, runny nose, saliva, urine, sputum, and lymph.
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