KR20220050127A - Asic1 채널 안타고니스트 항체 - Google Patents

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KR20220050127A
KR20220050127A KR1020227002538A KR20227002538A KR20220050127A KR 20220050127 A KR20220050127 A KR 20220050127A KR 1020227002538 A KR1020227002538 A KR 1020227002538A KR 20227002538 A KR20227002538 A KR 20227002538A KR 20220050127 A KR20220050127 A KR 20220050127A
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asic1a
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구앙 양
민 치앙
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상하이테크 유니버시티
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Abstract

본 기술은 일반적으로 허혈성 뇌졸중을 예방하거나 치료하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 기술은 또한, 항-ASIC1a 항체를 유효량으로 투여하여 허혈성 뇌졸중을 앓고 있거나, 이에 걸리기 쉬운 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다.

Description

ASIC1 채널 안타고니스트 항체
본 기술은 일반적으로, ASIC1a 활성 및/또는 신호전달과 관련된 질환을 예방하거나 치료하는 조성물 또는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 기술은, 항-ASIC1a 항체를 유효량으로 대상체에게 투여하여, ASIC1a 활성 및/또는 신호전달에 의해 야기되거나 이에 관련된 허혈성 뇌졸중 및 관련 병태를 앓고 있거나, 이에 걸리기 쉬운 대상체를 치료하는 것을 제공한다.
독자의 이해를 돕기 위해 이하의 설명이 제공된다. 제공된 정보 또는 인용된 참조 문헌 중 어느 것도 선행 기술로 인정되지 않는다.
산 감지 이온 채널(Acid-Sensing Ion Channel, ASIC)은 세포외 양성자에 의해 게이팅된다. ASIC는 세포외 산증에 의해 활성화되는 양이온 채널이다. ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 및 ASIC4의 6가지 ASIC 서브유닛을 암호화하는 적어도 4개 이상의 유전자가 확인되었으며, 그 중 "a" 및 "b" 지정은, 각각 ACCN2 및 ACCN1인 ASIC1 및 ASIC2 유전자의 대안적으로 스플라이싱된 변이체를 나타낸다. 아밀로라이드에 의한 차단에 대해 민감한 기능적 ASIC 채널은 동종 또는 이종 형태로 조립된 3개의 서브유닛으로 구성된다. ASIC1a는 뇌에서 고도로 발현되며, 다른 ASIC 동위체(isoform)와 기능적 동종 또는 이종 채널을 형성한다. pH 7.0에 가까운 활성화 임계값으로, ASIC1a는 뇌에서 산증의 주요 감지자 역할을 하며 정상상태뿐만 아니라 병리-생리학에 연루된다.
하나의 양태에서, 본 기술은 허혈성 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, VH는 서열번호 3, 13, 23, 33, 43 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34, 44 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35, 45 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고; VL은 서열번호 8, 18, 28, 38, 48 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 서열번호 10, 20, 30, 40, 50 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, VH는 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, VL은 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2 및 서열번호 7(ASC01); 서열번호 12 및 서열번호 17(ASC02); 서열번호 22 및 서열번호 27(ASC03); 서열번호 32 및 서열번호 37(ASC04); 서열번호 42 및 서열번호 47(ASC05); 및 서열번호 52 및 서열번호 57(ASC06)로 각각 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 아미노산 서열 및 VL 아미노산 서열을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASC06이다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 동종형의 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체이다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2 및 서열번호 7(ASC01); 서열번호 12 및 서열번호 17(ASC02); 서열번호 22 및 서열번호 27(ASC03); 서열번호 32 및 서열번호 37(ASC04); 서열번호 42 및 서열번호 47(ASC05); 및 서열번호 52 및 서열번호 57(ASC06)로 각각 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 아미노산 서열 및 VL 아미노산 서열을 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a 단백질에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 ASIC1a 단백질 또는 ASIC1a 단백질의 세포외 도메인에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결하는 에피토프에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 양성자-유도된 ASIC1a 전류를 억제한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상의 완화를 필요로 하는 대상체에서, 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 완화시키는 방법을 제공하고, 방법은 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, VH는 서열번호 3, 13, 23, 33, 43 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34, 44 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35, 45 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고; VL은 서열번호 8, 18, 28, 38, 48 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 서열번호 10, 20, 30, 40, 50 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 동종형의 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체이다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a 단백질에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 ASIC1a 단백질 또는 ASIC1a 단백질의 세포외 도메인에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결하는 에피토프에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a를 억제한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a 전류를 억제한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 양성자-유도된 ASIC1a 전류를 억제한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상은 갑작스러운 쇠약, 얼굴, 팔 또는 다리의 마비 또는 무감각, 얼굴 한쪽의 처짐, 착란, 말하기의 어려움, 말을 이해하기 어려움, 한쪽 또는 양쪽 눈의 불편한 시력, 흐릿한 시야, 검은 시야, 이중 시야, 호흡 곤란, 현기증, 보행의 어려움, 균형 상실, 협응능력 상실, 이유 없는 넘어짐, 의식 상실, 갑작스러운 두통 또는 심한 두통이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상은 갑자기 발병한 안면 마비, 얼굴 한쪽의 처짐, 팔의 표류 또는 비정상적인 말투이다.
하나의 양태에서, 본 기술은 허혈성 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서, 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57 중 어느 하나의 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열(VL); 및/또는 (b) 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 또는 52 중 어느 하나에 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열(VH)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, VH는 서열번호 3, 13, 23, 33 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34 및 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고; VL은 서열번호 8, 18, 28, 38 및 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39 및 49로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 서열번호 10, 20, 30, 40 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 동종형의 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a 단백질에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 ASIC1a 단백질 또는 ASIC1a 단백질의 세포외 도메인에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결하는 에피토프에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a 전류를 억제한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 양성자-유도된 ASIC1a 전류를 억제한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 본 기술은 본원에 개시된 임의의 핵산을 발현하는 숙주 세포 또는 벡터를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 사용 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 방사성 표지, 형광성 표지 및 색소생산성 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출가능한 표지에 커플링된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 2차 항체를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 본 기술은, 검출가능한 표지에 접합된, 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 및 생물학적 샘플에서 검출가능한 표지의 존재 및 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 ASIC1a 단백질을 검출하기 위한 방법을 제공한다.
도 1은, ELISA에 의해 측정하였을 때, 절단된 hASIC1a(아미노산 13-464; 이하 "ΔhASIC1a")를 함유하는 나노디스크에 대한 정제된 scFv 항체 ASC01-ASC06의 결합을 도시한다. 빈(empty) 나노디스크를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 2는 표면에서 hASIC1a를 발현하는 세포 및 6가지 scFv 항체의 상호작용을 나타내는 공초점 현미경 이미지를 도시한다. CHO-K1 세포를, hASIC1a-eYFP(초록색)를 암호화하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키고, ASC01-ASC06(빨간색)으로 염색하고, 핵을 DAPI(파란색)에 의해 표지하였으며, 이때 막대=10 μm이다.
도 3a는 ASC06 scFv 및 ASC06-IgG1 항체로 염색된 CHO-K1/hASIC1a 세포를 도시한다. CHO-K1 세포를, hASIC1a-eYFP(초록색)를 암호화하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키고, ASC06 scFv 및 ASC06-IgG1 항체(빨간색)로 염색하고, 핵을 DAPI(파란색)에 의해 표지하였으며, 이때 막대=10 μm이다.
도 3b는 단일 주기 동역학(SCK) 모델로 비아코어(Biacore) SPR(표면 플라즈몬 공명) 시스템을 사용하여 결정하였을 때, ΔhASIC1a에 대한 ASC06-IgG1의 결합 친화도를 도시한다. 선 그래프는 공명 단위(RU, 이는 표면의 분석물 결합 능력의 변화를 반영함)를 시간의 함수로서 나타낸다. ΔhASIC1a에 대한 ASC06-IgG1의 결합 친화도는 7.9 nM인 것으로 결정되었다.
도 4a는 ASC06-IgG1의 종 특이성을 나타내는 공초점 현미경 이미지를 도시한다. CHO-K1 세포를, hASIC1a-eYFP, mASIC1a-eYFP 또는 rASIC1a-eYFP(초록색) 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키고, ASC06-IgG1(빨간색)으로 염색하였다. DAPI(파란색)을 사용하여 세포의 핵을 염색하였다. 막대는 10 μm 스케일을 나타낸다.
도 4b는 FACS 분류에 의해 결정하였을 때, ASC06-IgG1의 종- 및 ASIC1 서브타입-특이성을 도시한다. CHO-K1 세포를, hASIC1a-eYFP, mASIC1a-eYFP, rASIC1a-eYFP, hASIC1b-eYFP, hASIC2a-eYFP, hASIC2a/2b-eYFP 및 hASIC3a-eYFP 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키고, Alexa555-접합된 ASC06-IgG1으로 염색하였다. 10,000개의 세포를 분류하였다. FACS 프로파일의 오른쪽 상단 사분면에 표시되는 Alexa555- 및 eYFP-이중 양성 세포는 주어진 ASIC1 서브타입 또는 동족체(homolog)에 대한 ASC06-IgG1의 결합을 나타낸다.
도 5a는 상이한 투여량의 ASC06-IgG1(100 nM, 300 nM)의 부재 또는 존재 하에서 단일 hASIC1a 안정 CHO-K1 세포로부터의 대표적인 전류 트레이스를 도시한다. 전류 트레이스 위의 회색 선은 세포외 pH 값이 pH 7.4에서 pH 6.0으로 감소되었고 기록을 수행했던 시간을 보여준다. 전류 트레이스 위의 검정색 선은 표시된 작용제를 이용한 처리를 나타낸다. pH 6으로 처리된 세포를 음성 대조군으로 사용하였고, 독 펩티드 프살모톡신-1(Psalmotoxin-1, PcTx1)을 양성 대조군으로 사용하였다. "세척"은 300 nM의 ASC06-IgG1의 처리에 이어서 세척 용액을 15분 주입한 후의 전류의 회복을 나타낸다.
도 5b는 ASC06-IgG1에 의한 산-유도된 hASIC1a 전류의 투여량-의존적 억제를 도시한다. 겉보기 IC50 값은 85 ± 6 nM으로 측정된다(N=3-5). 데이터는 5회 반복의 평균 ± 표준 편차로 도시된다.
도 5c는 ASC06-IgG1 또는 PcTx1로 처리한 후 악효세척(washout) 시간 동안 hASIC1a 전류를 나타내는 약효세척 실험을 도시한다. 선 그래프는 약효세척 시간(분)의 함수로 상대 전류를 보여준다(N=4).
도 6a는 ASC06-IgG1에 의한 산 유도된 ASIC1a-매개 칼슘 유입의 억제를 도시한다. 다양한 농도의 ASC06-IgG1(1:3 연속 희석에서 30 내지 0.12 nM)의 존재 하에 hASIC1a-mCherry(4C12)를 안정적으로 과발현하는 CHO-K1 세포에 산-유도된 칼슘 유입의 대표적인 진행 곡선이 도시된다.
도 6b는 산 유도된 칼슘 유입에 대한 ASC06-IgG1의 투여량-의존적 억제를 도시한다(N=6).
도 7a는 세포질 데하이드로게나제 활성에 의해 측정하였을 때, pH(pH = 5.5, 6.0 및 7.4)가 hASIC1a-eYFP의 막 발현이 있거나 없는 CHO-K1 세포의 생존력에 미치는 효과를 도시한다(N=5-6).
도 7b는 pH(pH = 5.5, 6.0 및 7.4)가 hASIC1a-eYFP의 막 발현이 있거나 없는 CHO-K1 세포에 미치는 효과를 도시한다. 막대 그래프는 방출된 LDH 함량을 보여준다(N=5-6).
도 7c는 증가하는 농도의 ASC06-IgG1의 존재 하에 hASIC1a-eYFP 안정 세포의 생존력에 의해 측정하였을 때, ASC06-IgG1에 의한 산증-유도된 세포 죽음으로부터의 투여량-의존적 보호를 도시한다. 데이터는 4회 반복의 평균 ± 표준 편차로 도시된다(N=3-5).
도 7d는 증가하는 농도의 ASC06-IgG1의 존재 하에 hASIC1a-eYFP 안정 세포에 의한 LDH 방출에 의해 측정하였을 때, ASC06-IgG1에 의한 산증-유도된 세포 죽음의 투여량-의존적 보호를 도시한다. 데이터는 3 내지 5회 반복의 평균 ± 표준 편차로 도시된다(N=3-5).
도 8a는 마우스 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO)-유도된 허혈성 뇌졸중 모델에서 생체내 연구를 위한 실험 디자인을 나타내는 모식적 다이어그램을 도시한다.
도 8b(상단 패널)는 MCAO-유도된 허혈성 뇌졸중 모델 마우스에 PBS(허위-대조군, N=6), 동종형 대조군(N=6), ASC06-IgG1(N=6) 및 PcTx1(N=6)으로 처리한 후, 생체 염료 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 하이드로클로라이드(TTC)로 염색함으로써 검출하였을 때, 경색 영역을 나타내는 뇌의 단면의 이미지를 도시한다. 도 8b(하단 패널)는 도 8b(상단 패널)에서와 같이 처리된 마우스의 뇌에서 경색 영역의 부피를 나타내는 막대 그래프를 도시한다. *는 p 값 < 0.05를 나타내고, **는 허위-대조군과 비교하여 p 값 <0.01을 나타낸다. NS = 중요하지 않음.
도 9a-9c는 ASC06-Fab 복합물과 hASIC1a(hASIC1a-ECD)의 엑토도메인 복합물의 음성-염색 전자 현미경 이미지를 도시한다. 도 9a는 미처리 이미지의 하위 영역을 도시한다. 스케일 바 = 50 nm. 도 9b는 도 9a로부터 선택된 대표적인 단일 입자를 도시한다. 스케일 바 = 10 nm. 도 9c는 단일 입자(N=5,064)에 기반한 해당하는 대표적인 클래스 평균을 도시한다. 스케일 바 = 10 nm.
도 9d는 분자 동역학 모의실험에 의해 검출하였을 때, ASC06-IgG1의 형태학적 에피토프를 도시한다. 제1 서브유닛은 이미지의 왼쪽에 표시되고, 제2 서브유닛은 오른쪽에 도시된다. 이미지의 하단 근처의 베타 시트를 포함하여, 제1 서브유닛의 일부는 제2 서브유닛 뒤에 위치된다. 점(제1 서브유닛에 짙은 회색 점, 제2 서브유닛에 밝은 회색 점)을 사용하여 도시된, ASC06-IgG1의 결합 부위는 2개의 ASIC1a 서브유닛에 의해 형성된다.
도 9e는 ASC06-IgG1에 결합하는 데 역할을 갖는 hASIC1a 단백질의 아미노산 잔기의 식별을 도시한다. 나타낸 알라닌 치환 돌연변이체 hASIC1a-eYFP 단백질로 일시적으로 형질감염된 CHO-K1 세포를 FACS-기반 검정을 이용하여 ASC06-IgG1에 대한 결합을 검정하였다. 상단 패널은 1차 항체 없이 2차 항체만 포함된 음성 대조군(NC)을 도시한다. 하단 패널은 ASC06-IgG1이 세포와 함께 항온처리된 실험을 도시한다. 세포가 야생형 hASIC1a 단백질을 발현하는 양성 대조군이 도시된다. CHO-K1 세포가 hASIC1a를 발현하지 않는 또 다른 음성 대조군도 왼쪽에 도시된다.
도 10a는 hASIC1a-eYFP 융합 단백질을 발현하는 안정한 세포주인 6H7 세포주에 대한 ASC06-IgG1의 투여량-의존적 결합을 도시한다. 데이터는 2.06 ± 0.01 nM의 겉보기 결합 친화도를 보여준다(n = 3).
도 10b(상단 패널)는 hASIC1a-mCherry(빨간색)로 성기게 형질감염된 mASIC1a KO 마우스의 피질에서 ASC06-IgG1-염색된 1차 뉴런(초록색)의 공초점 현미경 이미지를 도시한다. 미분 간섭 대비(DIC) 사진은 뉴런의 형광 사진와 병합된 명시 야상(bright field image)을 보여준다. 도 10b(하부 패널)는 ASC06-IgG1 결합이 시냅스후 수상돌기에서 발생함을 나타내는 신경돌기의 증폭된 현장을 도시한다.
도 11a는 hASIC1a의 정상 상태 탈감작(steady-state desensitization, SSD) 프로파일에 대한 ASC06-IgG1의 효과를 도시한다(n = 6-8).
도 11b는 hASIC1a의 양성자 활성화 프로파일에 대한 ASC06-IgG1의 효과를 도시한다(n = 5).
도 12a는 ΔhASIC1a-나노디스크의 조성의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. ΔhASIC1a-나노디스크는, 오른쪽에 도시되며, 계산 모델링(computation modeling)을 사용하여, 상단의 파란색, 노란색, 보라색 리본이 추정상의 ΔhASIC1a 삼합체 구성을 나타내고, 디스크 측면의 빨간색 리본은 MSP1을 나타내며, 하얀색 볼 클러스터는 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)을 나타낸다. 빈 나노디스크는 ΔhASIC1a 대신 아세틸콜린을 사용한 나노디스크 조립체를 지칭한다.
도 12b는 나노디스크 조립체의 크기를 나타내는 동적 광 산란(DLS) 측정 결과를 도시한다. 삽입된 이미지는 계산된 직경으로 표지된 모델링된 입자를 보여준다.
도 12c는 "차등 농축" 패닝(panning)에서 양성 파지미드의 산출을 도시한다.
도 12d는 정제된 단일 쇄(ASC06) 및 전장(ASC06-IgG1) 항체의 SDS-PAGE 분석을 도시한다.
도 13a는 상업용 염소 다클론성 항-ASIC1a 항체 또는 ASC06-IgG1을 사용하여 CHO-K1 세포("-") 또는 hASIC1a-eYFP를 발현하는 CHO-K1 안정 세포주("+")로부터의 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 13b는 CHO-K1 세포("-") 또는 ASC06-IgG1로 면역침전되고 상업용 항-eYFP 항체로 분석된 hASIC1a-eYFP를 발현하는 CHO-K1 안정 세포주("+")의 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 14는 hASIC1a-ECD 및 ASC06-Fab에 의해 조립된 복합물의 겔 여과 프로파일을 도시한다. hASIC1a-ECD 단독, ASC06-Fab 단독 및 복합물의 겔 여과 프로파일이 도시된다. 슈퍼덱스(Superdex) 200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 사용하였다(24 mL 부피).
도 15는 PcTx1-Fc의 SPR 센서그램을 도시한다. ΔhASIC1a에 대한 PcTx1-Fc의 결합 친화도는 단일 사이클 동역학 방법에 기초하여, 1.0 nM으로 결정되었다.
도 16은 ASC06-IgG1이 SSD나 ASIC1a의 활성화를 방해하지 않음을 도시한다. 도 16a는 다양한 조건형성 pH 값에서 pH 6.0 자극에 의해 유발되는 ASIC1a 전류의 대표적인 트레이스를 도시한다. 상단 패널의 트레이스는 ASC06-IgG1의 부재 하의 전류를 보여주고, 하단 패널의 트레이스는 300 nM ASC06-IgG1의 존재 하의 전류를 나보여준다. 도 16b는 조건형성한 pH 7.4와 함께 6.8 내지 6.0 범위의 pH에 의해 유발된 대표적인 전류 트레이스를 도시한다. 상단, ASC06-IgG1 없음; 하단, ASC06-IgG1(300 nM) 포함. pH 7.2 및 pH 7.0 활성화의 트레이스는 이러한 조건에서 유발되는 전류가 없었기 때문에 도시되지 않았다.
도 17a는 CHO-K1 세포 또는 안정한 CHO-K1 세포를 과발현하는 hASIC1a-mCherry(4C12)에서 산 유도 후 세포질에서 칼슘 유입의 최대 형광 강도를 도시한다. 표시된 경우, 4C12 세포를 아밀로라이드, PcTx1, ASC06-IgG1 또는 동종형 대조군 항체와 함께 사전-항온처리하였다.
도 17b는 아밀로라이드, PcTx1, ASC06-IgG1 또는 동종형 대조군 항체의 존재 하에 4C12에서 산 유도된 칼슘 유입의 대표적인 진행 곡선을 도시한다. 관련 없는 항체는 동종형 대조군으로 간주하였다.
도 18은 ASC06-IgG1의 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 분석을 도시한다. ASC06-IgG1(0.5 mg/mL)을 상이한 pH의 세포외액과 함께 37℃에서 6시간 동안 항온처리한 후 SEC-HPLC 분석을 하였다.
도 19a는 ASC01의 VH 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)을 도시한다.
도 19b는 ASC01의 VH 도메인의 아미노산 서열(서열번호 2)을 도시한다. VH CDR1(서열번호 3), VH CDR2(서열번호 4) 및 VH CDR3(서열번호 5)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 20a는 ASC01의 VL 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 6)을 도시한다.
도 20b는 ASC01의 VL 도메인의 아미노산 서열(서열번호 7)을 도시한다. VL CDR1(서열번호 8), VL CDR2(서열번호 9) 및 VL CDR3(서열번호 10)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 21a는 ASC02의 VH 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 11)을 도시한다.
도 21b는 ASC02의 VH 도메인의 아미노산 서열(서열번호 12)을 도시한다. VH CDR1(서열번호 13), VH CDR2(서열번호 14) 및 VH CDR3(서열번호 15)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 22a는 ASC02의 VL 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 16)을 도시한다.
도 22b는 ASC02의 VL 도메인의 아미노산 서열(서열번호 17)을 도시한다. VL CDR1(서열번호 18), VL CDR2(서열번호 19) 및 VL CDR3(서열번호 20)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 23a는 ASC03의 VH 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 21)을 도시한다.
도 23b는 ASC03의 VH 도메인의 아미노산 서열(서열번호 22)을 도시한다. VH CDR1(서열번호23), VH CDR2(서열번호 24) 및 VH CDR3(서열번호 25)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 24a는 ASC03의 VL 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 26)을 도시한다.
도 24b는 ASC03의 VL 도메인의 아미노산 서열(서열번호 27)을 도시한다. VL CDR1(서열번호 28), VL CDR2(서열번호 29) 및 VL CDR3(서열번호 30)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 25a는 ASC04의 VH 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 31)을 도시한다.
도 25b는 ASC04의 VH 도메인의 아미노산 서열(서열번호 32)을 도시한다. VH CDR1(서열번호33), VH CDR2(서열번호 34) 및 VH CDR3(서열번호 35)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 26a는 ASC04의 VL 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 36)을 도시한다.
도 26b는 ASC04의 VL 도메인의 아미노산 서열(서열번호 37)을 도시한다. VL CDR1(서열번호 38), VL CDR2(서열번호 39) 및 VL CDR3(서열번호 40)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 27a는 ASC05의 VH 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 41)을 도시한다.
도 27b는 ASC05의 VH 도메인의 아미노산 서열(서열번호 42)을 도시한다. VH CDR1(서열번호 43), VH CDR2(서열번호 44) 및 VH CDR3(서열번호 45)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 28a는 ASC05의 VL 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 46)을 도시한다.
도 28b는 ASC05의 VL 도메인의 아미노산 서열(서열번호 47)을 도시한다. VL CDR1(서열번호 48), VL CDR2(서열번호 49) 및 VL CDR3(서열번호 50)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 29a는 ASC06의 VH 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 51)을 도시한다.
도 29b는 ASC06의 VH 도메인의 아미노산 서열(서열번호 52)을 도시한다. VH CDR1(서열번호 53), VH CDR2(서열번호 54) 및 VH CDR3(서열번호 55)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
도 30a는 ASC06의 VL 도메인의 뉴클레오티드 서열(서열번호 56)을 도시한다.
도 30b는 ASC06의 VL 도메인의 아미노산 서열(서열번호 57)을 도시한다. VL CDR1(서열번호 58), VL CDR2(서열번호 59) 및 VL CDR3(서열번호 60)은 밑줄처리된 볼드체로 표시된다.
본 기술의 실질적인 이해를 제공하기 위해 본 기술의 특정 양태, 방식, 실시양태, 변형 및 특징이 다양한 수준의 상세내용으로 이하에 기재되는 것이 이해되어야 한다. 본 기술은 허혈성 뇌졸중 및/또는 관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 ASIC1a 단백질을 표적으로 하는 예시된 항체는 scFv 및 IgG1 항체이지만, 설명은 임의의 면역학적 결합제, 예컨대 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 및 이의 유전적으로 변형된 IgG 및 단편뿐만 아니라 본원에 기재된 항원 결합 활성을 보유하는 항체 상보성 결정 영역(CDR) 도메인을 포함하는 폴리펩티드까지 광범위하게 포함하는 것으로 의도된다.
정의
본 명세서에 사용된 바와 같은 특정 용어의 정의가 이하에 제공된다. 달리 정의되지 않는 한, 일반적으로, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 기술이 속한 업계에 통상적인 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부의 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, "세포(a cell)"에 대한 기재는 둘 이상의 세포의 조합 등을 포함한다. 일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 하기에 기재된, 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학, 분석 화학 및 핵산 화학 및 혼성화(hybridization)에서의 실험실상 절차는 당업계에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다.
본원에 사용된 바와 같이, 수와 관련한 용어 "약"은 일반적으로, 달리 명시되지 않거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 수(초과 또는 미만)의 어느 방향으로든 1%, 5% 또는 10% 범위 내에 속한 수를 포함하는 것으로 간주된다(그러한 수가 가능한 값의 0% 미만이거나 100% 초과일 경우는 제외).
본원에 사용된 바와 같이, 대상체에 대한 작용제, 약물 또는 펩티드의 "투여"는 이의 의도된 기능을 수행하기 위해 대상체에게 화합물을 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는 경구, 비강내, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하) 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 두개내(뇌실내) 경로, 척추강내 경로 또는 동맥내 경로에 의해 투여된다. 투여는 자가-투여와 타인에 의한 투여를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 적어도 하나의 아미노 기 및 적어도 하나의 카복실 기를 함유하는 임의의 유기 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 전형적으로, 적어도 하나의 아미노 기는 카복실 기에 관하여 α 위치에 있다. 용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 포함한다. 자연 발생 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화되는 아미노산뿐만 아니라 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카복실 기, 아미노 기 및 R 기, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 지칭한다. 아미노산은 통상적으로 알려진 세 글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 한 글자 기호로 본원에서 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자를 통틀어 지칭하고, 이는 예를 들어, 비제한적으로 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들의 조합 및 임의의 척추동물, 예를 들어 인간, 염소, 토끼 및 마우스와 같은 포유동물뿐만 아니라, 비-포유동물 종의 면역 반응 중에 생성되는 유사 분자들, 예컨대 상어 면역글로불린을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "항체"(온전한 면역글로불린 포함) 및 "항원 결합 단편"은, 다른 분자에 대한 결합은 실질적으로 제외하고, 관심 분자(또는 고도로 유사한 관심 분자들의 그룹)에 특이적으로 결합한다(예를 들어, 생물학적 샘플에서, 관심 분자에 대한 결합 친화도가 다른 분자에 대한 결합 친화도보다 적어도 103 M-1 더 크거나, 적어도 104 M-1 더 크거나 적어도 105 M-1 더 큰 항체 및 항체 단편). 또한, 용어 "항체"는 키메라 항체(예를 들어, 인간화 뮤린 항체), 이종접합 항체(예컨대, 이중특이적 항체)와 같은 유전적으로 조작된 형태를 포함한다. 또한, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997를 참조하라.
보다 특히, 항체는 항원의 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합하는 경쇄 면역글로불린 가변성 영역 또는 중쇄 면역글로불린 가변성 영역을 적어도 포함하는 폴리펩티드 리간드를 지칭한다. 항체는 중쇄 및 경쇄로 구성되며, 이들 각각은 가변성 중쇄(VH) 영역 및 가변성 경쇄(VL) 영역이라 일컫는, 가변성 영역을 갖는다. VH 영역과 VL 영역은, 함께, 항체에 의해 인식되는 항원에 대한 결합을 담당한다. 전형적으로 면역글로불린은 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 중쇄(H)와 경쇄(L)를 갖는다. 람다(λ)와 카파(k) 두 종류의 경쇄가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5가지 주요 중쇄 클래스(또는 동종)로는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE가 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변성 영역을 함유한다(영역은 "도메인"로도 알려짐). 조합하면, 중쇄 및 경쇄 가변성 영역은 항원에 특이적으로 결합한다. 경쇄 및 중쇄 가변성 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로도 지칭되는 3개의 초가변성 영역에 의해 차단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위가 정의되어 있다(Kabat et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991를 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함됨). 카밧(Kabat) 데이터베이스는 이제 온라인으로 유지된다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 구성적 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역인, 항체의 프레임워크 영역은 대체로 β-시트 형태를 채택하고, CDR은 일부 경우에 β-시트 구조를, 일부 형성하고 이를 연결하는 루프(loop)를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 쇄-상호 간에 비-공유 상호작용에 의해 정확한 방향으로 CDR을 위치시키는 것을 제공하는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다.
CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 각 쇄의 CDR은 전형적으로 N-말단에서 시작하여 순차적으로 번호가 매겨진 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭되며, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치된 쇄에 의해 식별된다. 따라서, VH CDR3은 그것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변성 도메인에 위치하는 반면, VL CDR1은 그것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변성 도메인으로부터의 CDR1이다. CD19 단백질에 결합하는 항체는 특이적 VH 영역 및 VL 영역 서열과 이에 따라 특이적 CDR 서열을 가질 것이다. 상이한 특이성을 갖는 항체(즉, 상이한 항원에 대한 상이한 결합 부위)는 상이한 CDR을 갖는다. 항체마다 다른 것은 CDR이지만, CDR 내의 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접적으로 관여된다. CDR 내의 이러한 위치를 특이성 결정 잔기(SDR)라 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같은 "본 기술의 항-ASIC1a 항체"는 항체(단클론성 항체, 다클론성 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체 등을 포함)뿐만 아니라 항체 단편을 지칭한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-관련 폴리펩티드"는 가변성 영역(들)을, 단독으로 또는 하기 폴리 펩티드 요소의 전부 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있는 단일-쇄 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편을 의미한다: 항체 분자의 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인. 또한, 본 기술에는 가변성 영역(들) 및 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합이 포함된다. 본 방법에 유용한 항체-관련 분자는, 예를 들어, 비제한적으로, Fab, Fab′ 및 F(ab′)2, Fd, 단일-쇄 Fvs(scFv), 단일-쇄 항체, 디설파이드-연결 Fvs(sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편이다. 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab′)2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 상기 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변성 영역을 포함할 수 있다. 항체 단편 또는 항원 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 이중특이적 항체; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접합된"은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의한 2개의 분자의 회합(association)을 지칭한다. 적절한 종류의 화합은 화학적 결합 및 물리적 결합을 포함한다. 화학 결합은, 예를 들어, 공유 결합 및 배위 결합이 포함한다. 물리적 결합은, 예를 들어, 수소 결합, 쌍극자 상호작용, 반 데르 발 힘, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 및 방향족 적층(aromatic stacking)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하며, 이때 단편은 동일한 폴리펩티드쇄(VH VL) 내에서 경쇄 가변성 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변성 도메인(VH)을 포함한다. 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 쇄에서 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루게 함으로써, 도메인은 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2개의 항원 결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448(1993)에 보다 충분히 기재된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일-쇄 항체" 또는 "단일-쇄 Fv(scFv)"는 Fv 단편, VL 및 VH의 두 도메인의 항체 융합 분자를 지칭한다. 단일-쇄 항체 분자는 다수의 개별 분자를 갖는 중합체, 예를 들어 이량체, 삼합체 또는 다른 중합체를 포함할 수 있다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH는, 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일-쇄 Fv(scFv)로 알려짐)로 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. Bird et al. (1988) Science 242:423-426 and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883. 이러한 단일-쇄 항체는 재조합 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원"은 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 천연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 폴리펩티드(예를 들어, ASIC1a 폴리펩티드)일 수 있다. 항원은 또한 동물에서 면역 반응을 발생시키기 위해 동물에게 투여될 수 있다.
용어 "항원 결합 단편"은 항원에 대한 결합을 담당하는 폴리펩티드의 일부를 갖는 전체 면역글로불린 구조의 단편을 지칭한다. 본 기술에 유용한 항원 결합 단편의 예는 scFv,(scFv)2, Fab, Fab′및 F(ab′)2를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
상기 항체 단편 중 임의의 것은 당업자에게 알려진 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 결합 특이성 및 중화 활성을 위해 스크리닝된다.
"결합 친화도"란, 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원 또는 항원성 펩티드) 사이의 총 비공유 상호작용의 강도를 의미한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여, 당업계에 알려진 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. 낮은 친화도 복합물은 일반적으로 항원에서 쉽게 해리되는 경향을 나타내는 항체를 함유하는 반면, 높은 친화도 복합물은 일반적으로 더 긴 기간 동안 항원에 결합된 채로 있는 경향을 나타내는 항체를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 살아있는 세포로부터 유래된 샘플 물질을 의미한다. 생물학적 샘플은 대상체로부터 단리된, 조직, 세포, 단백질 또는 세포의 막 추출물 및 생물학적 유체(예를 들어, 복수 유체 또는 뇌척수 유체(CSF))뿐만 아니라, 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함할 수 있다. 본 기술의 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 유방 조직, 신장 조직, 자궁경, 자궁 내막, 두경부, 쓸개, 이하선 조직, 전립선, 뇌, 뇌하수체, 신장 조직, 근육, 식도, 위장, 소장, 결장, 간, 비장, 췌장, 갑상선 조직, 심장 조직, 폐 조직, 방광, 지방 조직, 림프절 조직, 자궁, 난소 조직, 부신 조직, 고환 조직, 편도선, 흉선, 혈액, 모발, 볼, 피부, 혈청, 혈장, CSF, 정액, 전립선 유체, 정액 유체, 소변, 대변, 땀, 침, 가래, 점액, 골수, 림프 및 눈물로부터 취득한 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 내부 장기의 생검으로부터 또는 암으로부터 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은 진단 또는 연구를 위해 대상체로부터 수득될 수 있거나 대조군 또는 기초 연구를 위해 질환이 없는 개체로부터 수득될 수 있다. 샘플은, 예를 들어, 정맥 채혈(venous puncture) 및 외과적 생검을 포함하는 표준 방법에 의해 수득될 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 피부 조직, 모발, 손톱, 피지샘 또는 근육 생검 샘플이다.
본원에 사용된 바와 같이, "대조군"은 비교 목적으로 실험에 사용된 대안적인 샘플이다. 대조군은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다. 예를 들어, 실험 목적이 특정 종류의 질환에 대한 치료를 위한 치료제의 효험의 상관관계를 결정하는 것인 경우, 양성 대조군(원하는 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 화합물 또는 조성물) 및 음성 대조군(치료를 받지 않거나 위약(placebo)을 받은 대상체 또는 샘플)이 전형적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들어, 본원에 기재된 질환 또는 병태 또는 본원에 기재된 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 징후 또는 증상의 예방 또는 감소를 초래하는 양을 지칭한다. 치료적 또는 예방적 용례의 맥락에서, 대상체에게 투여되는 조성물의 양은, 질환의 구성, 정도, 종류 및 중증도 및 개체의 특징, 예컨대, 일반 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 따라 달라질 것이다. 당업자는 이러한 요인 및 다른 요인에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 조성물은 또한 하나 이상의 추가 치료 화합물과 병용하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 방법에서, 치료 조성물은 본원에 기재된 질환 또는 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 조성물의 "치료적 유효량"은 질환 또는 병태의 생리학적 효과가 개선되거나 제거되는 조성물 수준을 지칭한다. 치료적 유효량은 1회 이상의 투여로 제공될 수 있다.
"단리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드 또는 펩티드는 작용제가 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 폴리펩티드가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 예를 들어, 본 기술의 단리된 항-ASIC1a 항체는 작용제의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이 없을 것이다. 이러한 방해 물질은 효소, 호르몬 및 다른 단백성 및 비단백성 용질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체로의 특이적 결합이 가능한 단백질 결정인자(determinant)를 의미한다. 에피토프는 보통 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되고, 보통은 특이적 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 형태학적 에피토프 및 비-형태학적 에피토프는, 변성 용매의 존재 하에서, 전자에 대한 결합이 손실되지만 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 일부 실시양태에서, "에피토프"는 ASIC1a의 세포외 도메인을 포함하여, 본 기술의 항-ASIC1a 항체가 특이적으로 결합하는 ASIC1a 단백질 삼합체의 영역이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결할 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 형태학적 에피토프 또는 비-형태학적 에피토프이다. 에피토프에 결합하는 항-ASIC1a 항체를 스크리닝하기 위해, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 기재된 것과 같은 일상적 교차-차단 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은 항-ASIC1a 항체가 본 기술의 항-ASIC1a 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 에피토프 맵핑(mapping)은 당업계에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체 서열은, 예컨대 알라닌 스캐닝에 의해 돌연변이를 유발시켜, 도 9e에 도시된 바와 같이, 접촉 잔기를 식별할 수 있다. 다른 방법에서, ASIC1a 단백질의 상이한 영역에 상응하는 펩티드는 테스트 항체 또는 특성화되거나 알려진 에피토프를 갖는 항체 및 테스트 항체와의 경쟁 검정에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 유전자를 전구체 mRNA로 전사; 성숙 mRNA를 생성하기 위한 전구체 mRNA의 스플라이싱 및 다른 처리; mRNA 안정성; 성숙한 mRNA를 단백질로 번역(코돈 사용 및 tRNA 가용성 포함); 및 적절한 발현 및 기능에 필요한 경우, 번역 산물의 글리코실화 및/또는 다른 변형.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 발현을 제어하는 프로모터(promoter), 엑손, 인트론 및 다른 비번역 영역을 포함하는, RNA 산물의 조절된 생합성을 위한 모든 정보를 함유하는 DNA의 분절(segment)을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 상동이다. 서열 간의 상동성 정도는 서열이 공유하는 일치하거나 상동인 위치의 수의 함수이다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은, 또 다른 서열에 대한, 특정 백분율(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 갖고, 이는 정렬된 경우, 두 서열을 비교할 때 그 백분율의 염기(또는 아미노산)가 같은 것임을 의미한다. 이러한 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 알려진 소프트웨어 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기본 매개변수(default parameter)가 정렬을 위해 사용된다. 하나의 정렬 프로그램은 기본 매개변수를 사용하는 BLAST이다. 특히, 프로그램은 이하의 기본 매개변수를 사용하는, BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=둘; 컷오프=60; 기대값=10; 매트릭스=BLOSUM62; 디스크립션(Description)=50 서열; 〓높은 점수로 정렬; 데이터베이스=비-중복, 젠뱅크(GenBank) + EMBL + DDBJ + PDB + 젠뱅크 CDS 번역+스위스프로틴(SwissProtein) + SP업데이트(Spupdate) + PIR. 이러한 프로그램의 상세한 내용은 국립 생물정보 센터(National Center for Biotechnology)에서 확인할 수 있다. 생물학적으로 균등한 폴리뉴클레오티드는 명시된 퍼센트 상동성을 갖고 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 것이다. 2개의 서열은 서로 40% 미만의 동일성 또는 25% 미만의 동일성을 공유하는 경우 "비관련" 또는 "비-상동"으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간화" 형태의 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변성 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여자 항체)로부터의 초가변성 영역 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 결합 친화도와 같은 항체 성능을 추가로 개량하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변성 도메인(예를 들어, Fab, Fab′, F(ab′)2 또는 Fv)을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 이때 초가변성 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역은 결합 친화도를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있지만, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 합의 FR 서열의 것이다. FR에서 이러한 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H쇄에서 6개 이하이고, L쇄에서 3개 이하이다. 선택적으로, 인간화 항체는 또한, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 보다 상세한 내용은, Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)를 참조하라. 예를 들어, Ahmed & Cheung, FEBS Letters 588(2):288-297(2014); Saxena & Wu, Frontiers in immunology 7: 580(2016)를 참조하라.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 사용되는 경우, 이하에 기재된 기본 매개변수와 함께 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, NCBI 웹 부위)에 의해 측정된 바와 같이 비교 윈도우 또는 지정 영역에 대한 최대 일치성(correspondence)에 대해 비교 또는 정렬될 때, 동일한 둘 이상의 서열 또는 부분서열 또는 명시된 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드(즉, 명시된 영역(예를 들어, 본원에 기재된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열)에 대해 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성)를 갖는 둘 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다. 그러면, 상기 서열은 "실질적으로 동일"하다고 한다. 이러한 용어는 또한 테스트 서열의 보충(complement)을 지칭하거나 이에 적용될 수 있다. 상기 용어는 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열뿐만 아니라 치환을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 적어도 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이 또는 50-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "온전한 항체" 또는 "온전한 면역글로불린"은 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 폴리펩티드 및 2개의 경쇄(L) 폴리펩티드를 갖는 항체를 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변성 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변성 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 지칭되는, 보다 보존된 영역으로 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라 지칭되는 초가변성의 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복실-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 순으로 배열된, 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 작동 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 구성요소(C1q)를 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "개체", "환자" 또는 "대상체"는 개별 유기체, 척추동물, 포유동물 또는 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체, 환자 또는 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 예를 들어, 단클론성 항체는 제조하는 방법이 아니라, 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래된 항체일 수 있다. 단클론성 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 단클론성 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 더욱이, 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (다클론성) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 단클론성 항체는 예를 들어, 비제한적으로, 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술을 포함하는 당업계에 알려진 매우 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 방법에 따라 사용될 단클론성 항체는 Kohler et al., Nature 256:495(1975)에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "단클론성 항체"는 또한, 예를 들어 Clackson et al., Nature 352:624-628(1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 투여에 호환가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균 화합물, 등장성 및 흡수 지연 화합물 등을 포함하도록 의도된다. 악학적으로 허용가능한 담체 및 이들의 제형은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences(20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.)에 기재된다.
본원에 사용된 바와 같이, 장애 또는 병태의 "예방" 또는 "예방하는"은, 통계적 샘플에서, 미처리된 대조군 샘플에 비해 처리된 샘플에서 장애 또는 병태의 발생을 감소시키거나 발병을 지연시키거나, 미처리된 대조군 샘플에 비해 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 동배체(isostere)에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산을 포함하는 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리펩티드는 통상적으로 펩티드, 글리코펩티드 또는 올리고머로 지칭되는 단쇄 및 일반적으로 단백질로 지칭되는 장쇄을 모두 지칭한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자-암호화된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 번역-후 처리와 같은 자연적인 처리 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "개별" 치료 용도는 상이한 경로에 의해 동시에 또는 실질적으로 동시에 적어도 2개의 활성 성분의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "순차" 치료 용도는 상이한 시간에 적어도 2개의 활성 성분의 투여를 지칭하며, 투여 경로는 동일하거나 상이하다. 보다 특히, 순차 사용은 다른 하나 또는 다른 것들의 투여가 시작되기 전에 활성 성분 중 하나의 전체 투여를 지칭한다. 따라서, 다른 활성 성분 또는 성분을 투여하기 전에 활성 성분 중 하나를 몇 분, 몇 시간 또는 며칠에 걸쳐 투여하는 것이 가능하다. 이러한 경우에는 동시 치료가 없다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동시" 치료 용도는 동일한 경로에 의해 동시에 또는 실질적으로 동시에 적어도 2개의 활성 성분의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 어떤 하나의 분자(예를 들어, 항원)를 인식하고 이에 결합하지만, 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않고 이에 결합하지 않는 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정 분자(예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 상의 에피토프)에 "특이적 결합", 이에 "특이적으로 결합하다" 또는 이에 "대해 특이적이다"란 용어는, 예를 들어, 그것이 결합하는 분자에 대해, 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M의 KD를 갖는 분자에 의해 나타낼 수 있다. 용어 "특이적으로 결합하다"는 또한 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고, 특정 폴리펩티드(예를 들어, ASIC1a 폴리펩티드) 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 개별 유기체, 척추동물, 포유동물 또는 인간일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 인간과 같은 대상체에서, 본원에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 포괄하고, (i) 질환 또는 장애를 억제하는 것, 즉, 이의 발달을 저지시키는 것; (ii) 질환 또는 장애를 완화하는 것, 즉, 장애의 퇴보를 유발하는 것; (iii) 장애의 진행을 늦추는 것; 및/또는 (iv) 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 진행을 억제, 완화 또는 늦추는 것을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 장애의 다양한 치료 방식은 "실질적"을 의미하는 것으로 의도되며, 이는 전체 치료를 포함하지만 전체에 못 미치는 치료도 포함하여, 일부 생물학적으로 또는 의학적으로 관련된 결과가 달성된다는 것을 이해해야 한다. 치료는 만성 질환에 대한 연속적인 장기간 치료 또는 급성 병태의 치료를 위한 단일 또는 수회 투여일 수 있다.
본원에 기재된 항-ASIC1a 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항-ASIC1a 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산에 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 수득된 항체가 원하는 특성을 갖는 한, 관심 항체를 수득하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어진다. 변형은 또한 단백질의 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 치환 돌연변이유발에 대한 가장 큰 관심 부위는 초가변성 영역을 포함하지만, FR 변경도 고려된다. "보존적 치환"은 하기 표에 나타나 있다.
Figure pct00001
치환 변이체의 하나의 종류는 모 항체의 하나 이상의 초가변성 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 수반한다. 구체적으로, 여러 초가변성 영역 부위(예를 들어, 6-7 부위)가 돌연변이화되어 각 부위에서 가능한 모든 아미노산 치환을 생성한다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합체로서 사상(filamentous) 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 파지-디스플레이된 변이체는 이어서 본원에 개시된 바와 같은 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변성 영역 부위를 식별하기 위해서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 항원 결합에 유의미하게 기여하는 초가변성 영역 잔기를 식별할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합물의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 식별하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 본원에 상술된 기술에 따른 치환 후보이다. 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널은 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝되고 하나 이상의 관련 검정에서 유사하거나 우수한 특성을 갖는 항체가 추가 개발을 위해 선택될 수 있다.
허혈성 뇌졸중의 발병기전
뇌졸중은 뇌의 일부로의 산소-풍부 혈액 공급의 중단 또는 감소로 인해 초래된다. 산소가 없으면, 뇌 세포는 몇 분 내로 죽기 시작한다. 뇌졸중은 보통 갑작스러운 쇠약; 특히 신체 한쪽에서 얼굴, 팔 또는 다리의 마비 또는 무감각; 얼굴 한쪽의 처짐; 착란; 말하기의 어려움, 예컨대 어눌한 말씨 또는 말을 이해하기 어려움; 한쪽 또는 양쪽 눈의 불편한 시력, 예컨대 한쪽 또는 양쪽 눈의 흐릿하거나 검은 시야 또는 이중 시야; 호흡 곤란; 현기증; 보행의 어려움; 예를 들어, 이유 없는 넘어짐을 야기하는, 균형 또는 협응능력 상실; 의식 상실 및 갑작스러운 심한 두통과 같은 증상을 통해 나타난다. 가장 흔한 증상은 갑작스러운 안면 마비(예를 들어, 얼굴 한쪽의 처짐), 팔의 표류 및 비정상적인 말투를 포함한다. 이러한 증상은 전형적으로 몇 초 내지 몇 분에 걸쳐 갑자기 시작되며, 대부분의 경우 더 이상 진행되지 않는다. 즉각적인 응급 치료는 기능할 수 있는 능력과 뇌에 대한 최소한의 손상으로 뇌졸증을 견뎌 내는 데 중요하다.
전체 뇌졸중의 약 87%를 차지하는 허혈성 뇌졸중은 혈전 또는 다른 입자에 의한 혈관의 막힘으로 인해 뇌의 일부로의 혈액 공급이 차단될 경우 발생한다. 플라크라 지칭되는 지방 침착물도 혈관에 축적되어 폐색을 유발할 수 있다. 허혈성 뇌졸중에서 차단된 혈류는, 시간이 지남에 따라 동맥이 좁아지는 동맥경화증에 의해 야기될 수 있다. 허혈성 뇌졸중은 뇌에 영양을 공급하는 동맥을 따라 어디에서든 폐색에 의해 야기될 수 있다.
허혈성 뇌졸중은 혈전 또는 플라크 단편이 신체의 다른 어딘가에서(보통 심장) 형성되고 뇌로 이동하는 색전성 뇌졸중일 수 있다. 일단 뇌에 들어가면, 혈전은 이의 통행을 차단시킬 만큼 충분히 작은 혈관으로 이동한다. 혈전이 그곳에 머물면서 혈관을 막아 뇌졸중을 야기한다. 색전성 뇌졸중의 약 15%는 섬유성 연축(fibrillation, Afib)을 가진 사람에서 발생한다.
허혈성 뇌졸중은 뇌에 혈액을 공급하는 동맥 중 하나의 내부에 형성되는 혈전에 의해 야기되는 혈전성 뇌졸중일 수 있다. 이러한 종류의 뇌졸중은 보통 콜레스테롤 수치가 높고 동맥경화증을 가진 사람에서 발견된다. 혈전성 뇌졸중은 대혈관 혈전증 또는 소혈관 질환일 수 있다. 대혈관 혈전증은 뇌의 대동맥에서 발생한다. 이는 대부분의 경우에 빠른 혈전 형성과 합동하여 장기간의 동맥경화증에 의해 야기된다. 높은 콜레스테롤은 이러한 종류의 뇌졸중에 대한 통상적인 위험 요소이다. 소혈관 질환이나 열공성 뇌경색(lacunar infarction)은 고혈압과 밀접하게 연관된다.
본 기술의 항- ASIC1a 항체
본 기술은 본 기술의 항-ASIC1a 항체(예를 들어, 항-ASIC1a 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 생성 및 사용을 위한 방법 및 조성물을 기재한다. 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 허혈성 뇌졸중의 진단 또는 치료에 유용할 수 있다. 본 기술의 범위 내에서 본 기술의 항-ASIC1a 항체는, 예를 들어, 비제한적으로 표적 폴리펩티드, 이의 동족체, 유도체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 단클론성, 키메라, 인간화, 이중특이적 항체 및 디아바디를 포함한다.
본 기술의 항-ASIC1a 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 서열이 이하 표에 제공된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
따라서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(본 기술의 항-ASIC1a 항체)은 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함할 수 있고, 여기서 VH는 본원에 개시된 상보성 결정 영역 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VL은 본원에 개시된 상보성 결정 영역 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 VH는 서열번호 3, 13, 23, 33, 43 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34, 44 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35, 45 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고; VL은 서열번호 8, 18, 28, 38, 48 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 서열번호 10, 20, 30, 40, 50 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, VH는 서열번호 3, 13, 23, 33 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34 및 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고; VL은 서열번호 8, 18, 28, 38 및 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39 및 49로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 서열번호 10, 20, 30, 40 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 동종형의 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a 단백질에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a의 세포외 도메인에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결하는 에피토프에 결합한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a를 억제한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 양성자-유도된 ASIC1a 전류를 억제한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 본 기술은 본원에 개시된 임의의 핵산을 발현하는 숙주 세포 또는 벡터를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 사용 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 방사성 표지, 형광성 표지 및 색소생산성 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출가능한 표지에 커플링된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 2차 항체를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 검출가능한 표지에 접합된, 본원에 개시된 임의의 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 및 생물학적 샘플에서 검출가능한 표지의 존재 및 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 ASIC1a 단백질을 검출하기 위한 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 4에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 5에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 8에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 9 에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 10에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 13에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 14에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 15에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 18에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 19 에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 20에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 23에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 24에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 25에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 28에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 29 에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 30에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 33에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 34에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 35에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 38에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 39 에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 40에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 43에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 44에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 45에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 48에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 49 에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 50에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 53에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 54에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 55에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 58에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 59 에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 60에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH는 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편(본 기술의 항-ASIC1a 항체)은 ASIC1a 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 ASIC1a의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결하는 에피토프에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 ASIC1a 삼합체의 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 ASIC1a 삼합체를 안정시킨다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 다른 ASIC1 이성체와 ASIC1a의 헤테로올리고머화(예를 들어, 헤테로삼합체화)를 억제한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체, scFv,(scFv)2, Fab, Fab′, F(ab′)2 또는 scFv-Fc 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체이다. 일부 실시양태에서, scFv 항체는 ASC01, ASC02, ASC03, ASC04, ASC05 또는 ASC06이다.
제형
예로서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 단순 전달 비히클에서 제형화된다. 그러나, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 동결건조되거나 겔, 크림, 생체물질, 서방성 전달 비히클에 포함될 수 있다.
본 기술의 항-ASIC1a 항체는 일반적으로 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 조성물을 투여받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 자체적으로 유도하지 않고 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약학적 담체를 지칭한다. 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산 및 아미노산 공중합체와 같은 크고 천천히 대사되는 거대분자일 수 있다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 치료 조성물에서 약학적으로 허용가능한 담체는 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함할 수 있다. 또한, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 예를 들어, 무기산 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로보로마이드, 포스페이트, 설페이트 등; 및 유기산 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등, 약학적으로 허용가능한 염 또한, 약학 조성물에 존재할 수 있다.
투여 방식 및 효과적인 투여량
세포, 장기 또는 조직을 본 기술의 면역글로불린 관련 조성물과 접촉시키기 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법을 포함한다. 전형적으로, 생체내 방법은 상기 기재된 것과 같은 본 기술의 항-ASIC1a 항체를, 포유동물, 적합하게는 인간에게 투여하는 것을 포함한다. 치료를 위해 생체내에서 사용될 때, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 유효량(즉, 원하는 치료 효과를 갖는 양)으로 대상체에게 투여된다. 투여 및 투여량 요법은 대상체에서 증상의 정도, 사용된 본 기술의 특정 항-ASIC1a 항체의 특성, 예를 들어, 이의 치료 지수, 대상체 및 대상체의 병력에 따라 다를 것이다.
유효량은 전임상 시험 및 임상 시험 동안 의사 및 임상의에게 친숙한 방법으로 결정될 수 있다. 방법에 유용한 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 유효량은 약학적 화합물을 투여하기 위한 다수의 잘 알려진 방법 중 임의의 것에 의해, 이를 필요로 하는 포유동물에 투여될 수 있다. 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 면역글로불린 관련 조성물은 본원에 기재된 장애의 치료 또는 예방을 위해 대상체에게 단독으로 또는 조합하여 투여하기 위해 약학 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 활성제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 투여와 호환가능한, 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 또한, 보충 활성 화합물이 조성물에 포함될 수 있다.
약학 조성물은 전형적으로 이의 의도된 투여 경로와 호환가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구(예를 들어, 정맥내, 피내, 복강내 또는 피하), 경구, 흡입, 경피(국소), 안내, 이온삼투(iontophoretic) 및 경점막 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질알코올, 메틸파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제; 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 복수 용량 바이알(multiple dose vial)에 넣어질 수 있다. 환자 또는 치료하는 의사의 편의를 위해 투여 제형은 치료 과정(예를 들어, 7일의 치료) 동안 필요한 모든 장비(예를 들어, 약물 바이알, 희석제 바이알, 주사기 및 바늘)를 포함하는 키트로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 면역글로불린 관련 조성물은 비경구 경로로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 국소 경로에 의해 투여된다.
주사가능한 용도에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말을 포함할 수 있다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리학적 식염수, 정균수(bacteriostatic water), 크레오포어(Cremophor) ELTM(뉴저지 파시패니 소재의 바스프(BASF)) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 비경구 투여를 위한 조성물은 멸균이어야 하고 쉬운 주사 가용성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 보관 조건에서 안정해야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다.
본 기술의 항-ASIC1a 항체 조성물은, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는, 담체를 포함할 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 글루타티온 및 다른 항산화제가 산화 방지를 위해 포함될 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨이 조성물에 포함된다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은, 활성 화합물을, 필요에 따라, 위에 열거된 성분 중 하나 또는 조합을 가진 적절한 용매에 혼입한 후, 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 전형저인 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조를 포함하며, 이들은 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 및 추가적인 임의의 원하는 성분의 분말을 수득할 수 있다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용가능한 담체를 포함한다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 정제, 트로치(troche) 또는 캡슐, 예를 들어, 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세정제로 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약학적으로 호환가능한 결합제 및/또는 보조제 물질은 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로치 등은 다음과 같은 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 바인더, 예컨대 미정질 셀룰로오스, 검 트래거캔스 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제(glidant), 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미료.
흡입에 의한 투여의 경우, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 적절한 추진제(propellant), 예를 들어, 이산화탄소와 같은 기체 또는 네뷸라이저(nebulizer)를 함유하는 압축 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달될 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 번호 6,468,798에 기재된 것을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과될 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 경점막 투여를 위한, 세제, 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 연고, 안약(salve), 겔 또는 크림으로 제형화된다. 하나의 실시양태에서, 경피 투여는 이온삼투요법(iontophoresis)에 의해 수행될 수 있다.
본 기술의 항-ASIC1a 항체는 담체 시스템에서 제형화될 수 있다. 담체는 콜로이드 시스템일 수 있다. 콜로이드 시스템은 인지질 이중층 비히클인 리포솜일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 기술의 치료적 항-ASIC1a 항체는 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 무결성을 유지하면서 리포솜에 캡슐화된다. 당업자가 인식할 것인 바와 같이, 리포솜을 제조하는 다양한 방법이 있다(Lichtenberg et al., Methods Biochem. Anal., 33:337-462(1988); Anselem et al., Liposome Technology, CRC Press(1993) 참조). 리포솜 제형은 클리어런스를 지연시키고 세포 흡수를 증가시킬 수 있다(Reddy, Ann. Pharmacother., 34(7-8):915-923(2000) 참조). 또한, 활성제는 비제한적으로, 가용성, 불용성, 투과성, 불투과성, 생분해성 또는 위장체류(gastroretentive) 중합체 또는 리포솜을 포함하는 약학적으로 허용가능한 성분으로부터 제조된 입자에 로딩될 수 있다. 이러한 입자는, 비제한적으로 나노입자, 생분해성 나노입자, 마이크로입자, 생분해성 마이크로입자, 나노스피어, 생분해성 나노스피어, 마이크로스피어, 생분해성 마이크로스피어, 캡슐, 에멀젼, 리포솜, 미셀 및 바이러스 벡터 시스템을 포함한다.
담체는 또한 중합체, 예를 들어, 생분해성, 생체에 적합한 중합체 매트릭스일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 단백질 무결성을 유지하면서 중합체 매트릭스에 매립될 수 있다. 중합체는 폴리펩티드, 단백질 또는 다당류와 같은 천연 또는 폴리 α-하이드록시산과 같은 합성일 수 있다. 예는, 예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 니트레이트, 다당류, 피브린, 젤라틴 및 이들의 조합으로 제조된 담체를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 중합체는 폴리-락트산(PLA) 또는 코폴리 락트산/글리콜산(PGLA)이다. 고분자 매트릭스는 마이크로스피어 및 나노스피어를 포함하여, 다양한 형태와 크기로 제조되고 단리될 수 있다. 중합체 제형은 치료 효과의 지속 기간을 연장할 수 있다(Reddy, Ann. Pharmacother., 34(7-8):915-923(2000) 참조). 인간 성장 호르몬(hGH)용 중합체 제형이 임상 시험에 사용되었다(Kozarich and Rich, Chemical Biology, 2:548-552(1998) 참조).
중합체 마이크로스피어 서방성 제형의 예는 PCT 공개 WO 99/15154(Tracy et al.), 미국 특허 번호 5,674,534 및 5,716,644(둘 모두 Zale et al.), PCT 공개 WO 96/40073(Zale et al.) 및 PCT 공개 WO 00/38651(Shah et al.)에 기재된다. 미국 특허 번호 5,674,534 및 5,716,644 및 PCT 공개 WO 96/40073은 염과의 응집에 대해 안정화된 에리트로포이에틴(erythropoietin) 입자를 함유하는 중합체 매트릭스를 기재한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는, 이식 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 제어 방출 제형과 같이, 신체로부터의 신속한 제거에 대해 본 기술의 항-ASIC1a 항체를 보호할 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은, 생분해성인, 생체에 적합한 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형은 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 물질은 또한, 예를 들어, 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈 주식회사(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 또한, 리포솜 현탁액(세포-특이적 항원에 대해 단클론성 항체로 특정 세포를 표적화 하는 리포솜 포함)은 약학적으로 허용가능한 담체로 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이, 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 기술의 항-ASIC1a 항체는 또한 세포내 전달을 향상시키기 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 리포솜 전달 시스템이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, Chonn and Cullis, "Recent Advances in Liposome Drug Delivery Systems", Current Opinion in Biotechnology 6:698-708 (1995); Weiner, "Liposomes for Protein Delivery: Selecting Manufacture and Development Processes", Immunomethods, 4(3):201-9 (1994); 및 Gregoriadis, "Engineering Liposomes for Drug Delivery: Progress and Problems", Trends Biotechnol., 13(12):527-37 (1995)를 참조하라. Mizguchi et al., Cancer Lett., 100:63-69 (1996)는 생채내 또는 시험관내 둘 모두에서 세포에 단백질을 전달하기 위해 융합생성 리포솜(fusogenic liposome)의 사용을 기재한다.
본 기술의 항-ASIC1a 항체의 투여량, 독성 및 치료적 효험은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 약량) 또는 ED50(집단의 50%에 치료적으로 유효한 약량)을 결정하기 위한, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 약량 비율이 치료 지수이고, 이는 비율 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 높은 치료 지수를 나타낸다. 독성 부작용을 나타내는 본 기술의 항-ASIC1a 항체가 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키기 위해, 영향을 받은 조직의 부위로 이러한 화합물을 표적화시키는 전달 시스템을 디자인하도록 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는 데 이용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도(circulating concentration) 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 활용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 바뀔 수 있다. 본 방법에 사용된 본 기술의 임의의 항-ASIC1a 항체의 경우, 치료적으로 유효한 약량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 약량은 동물 모델에서 제형화되어, 세포 배양에서 결정된 바와 같은 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에 유용한 약량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
전형적으로, 치료 또는 예방적 효과를 달성하기에 충분한, 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 유효량은, 하루에 킬로그램 체중 당 약 0.000001 mg 내지 하루에 킬로그램 체중 당 약 10,000 mg의 범위이다. 적합하게는 투여량은 킬로그램 체중 당 약 0.0001 mg 내지 킬로그램 체중 당 약 100 mg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 매일, 2일마다 또는 3일마다 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수 있거나 매주, 2주마다 또는 3주마다 1-10 mg/kg의 범위 내에 있을 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 단일 투여량은 kg 체중 당 0.001-10,000 마이크로그램의 범위이다. 하나의 실시양태에서, 담체에서 본 기술의 항-ASIC1a 항체 농도는 전달된 밀리리터당 0.2 내지 2000 마이크로그램의 범위이다. 예시적인 치료 요법은 1일 1회 또는 1주 1회 투여를 수반한다. 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지 그리고 대상체가 질환의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지, 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자는 예방 요법을 투여받을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 치료적 유효량은 10-12 내지 10-6 몰, 예를 들어, 대략 10-7 몰의 표적 조직에서 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 농도로서 정의될 수 있다. 이러한 농도는 0.001 내지 100 mg/kg의 전신적 약량 또는 체표면적에 따른 균등한 약량으로 전달될 수 있다. 투여 일정은 표적 조직에서 치료 농도를 유지하도록 최적화될 것이다. 일부 실시양태에서, 약량은 단일의 매일 또는 매주 투여에 의해 투여되지만, 연속 투여를 포함할 수도 있다(예를 들어, 비경구 주입 또는 경피 적용). 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 투여량은 "낮은", "중간" 또는 "높은" 약량 수준으로 제공된다. 하나의 실시양태에서, 낮은 약량은 약 0.0001 내지 약 0.5 mg/kg/h, 적합하게는 약 0.001 내지 약 0.1 mg/kg/h로 제공된다. 하나의 실시양태에서, 중간 약량은 약 0.01 내지 약 1.0 mg/kg/h, 적합하게는 약 0.01 내지 약 0.5 mg/kg/h로 제공된다. 하나의 실시양태에서, 높은 약량은 약 0.5 내지 약 10 mg/kg/h, 적합하게는 약 0.5 내지 약 2 mg/kg/h로 제공된다.
예를 들어, 치료적 유효량은 갑작스러운 쇠약; 특히, 신체의 한쪽에서 얼굴, 팔 또는 다리의 마비 또는 무감각; 얼굴 한쪽의 처짐; 착란; 말하기의 어려움, 예컨대 어눌한 말씨 또는 말을 이해하기 어려움; 한쪽 또는 양쪽 눈의 불편한 시력, 예컨대 한쪽 또는 양쪽 눈의 흐릿하거나 검은 시야 또는 이중 시야; 호흡 곤란; 현기증; 보행의 어려움; 예를 들어, 이유 없는 넘어짐을 야기하는 균형 또는 협응능력 상실; 의식 상실 및 갑작스러운 심한 두통을 포함하는, 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 부분적으로 또는 완전히 완화시킬 수 있다. 치료적 유효량은 비제한적으로, 얼굴의 갑자기 발병한 안면 마비(예컨대 한쪽의 처짐), 팔의 표류 및 비정상적인 말투를 포함하는 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 부분적으로 또는 완전히 완화시킬 수 있다.
당업자는, 비제한적으로 대상체의 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 일반적인 건강 및/또는 연령 및 다른 질환의 존재를 포함하여, 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 필요한 투여량 및 시기에 영향을 줄 수 있음을 인식할 것이다. 더욱이, 대상체를 치료적 유효량의 본원에 기재된 치료 조성물로 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료들을 포함할 수 있다.
본 방법에 따라 치료되는 포유동물은 임의의 표유동물일 수 있으며, 이는 예를 들어, 가축, 예컨대 양, 돼지, 소 및 말; 애완 동물, 예컨대 개 및 고양이; 실험용 동물, 예컨대 래트, 마우스 및 토끼를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
본 기술의 항- ASIC1a 항체의 용도
총론(General). 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 ASIC1a 단백질 또는 이의 돌연변이체의 국부화 및/또는 정량화와 관련한 당업계에 알려진 방법(예를 들어, 적절한 생리학적 샘플 내에서 ASIC1a 단백질의 수준을 측정하는 데 사용하기 위한 것, 진단 방법에 사용하기 위한 것, 폴리펩티드를 영상화하는 데 사용하기 위한 것 등)에 유용하다. 본 기술의 ASIC1a 항체는 친화도 크로마토그래피 또는 면역침강법과 같은, 표준 기술에 의해 ASIC1a 단백질을 단리하는 데 유용하다. 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 생물학적 샘플, 예를 들어, 포유류 혈청 또는 세포뿐만 아니라 숙주 시스템에서 발현되는 재조합적으로 제조된 면역반응성 ASIC1a 단백질로부터 천연 면역반응성 ASIC1a 단백질의 정제를 촉진할 수 있다. 더욱이, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 면역반응성 폴리펩티드의 발현 패턴 및 풍부도를 평가하기 위해서 면역반응성 ASIC1a 단백질 또는 이의 단편을 (예를 들어, 혈장, 세포 용해물 또는 세포 상청액에서) 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 진단적으로 사용되어, 임상 테스트 절차의 일부로서 조직에서 면역반응성 ASIC1a 단백질 수준을 모니터링하고, 예를 들어, 주어진 치료 요법의 효험을 결정할 수 있다. 상기와 같이, 검출은 본 기술의 항-ASIC1a 항체를 검출가능한 물질에 커플링(즉, 물리적으로 연결)함으로써 촉진될 수 있다.
ASIC1a 단백질의 검출. 생물학적 샘플에서 면역반응성 ASIC1a 단백질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 예시적인 방법은, 면역반응성 ASIC1a 단백질의 존재가 생물학적 샘플에서 검출되도록, 테스트 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하고, 생물학적 샘플을 면역반응성 ASIC1a 단백질을 검출할 수 있는 본 기술의 항-ASIC1a 항체와 접촉시키는 것을 수반한다. 검출은 항체에 부착된 검출가능한 표지에 의하여 달성될 수 있다.
본 기술의 항-ASIC1a 항체와 관련하여 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 항체에 커플링(즉, 물리적으로 연결)함으로써 항체를 직접 표지하는 것 뿐만 아니라 2차 항체와 같이 직접적으로 표지된 또 다른 화합물과의 반응성에 의해 항체를 간접적으로 표지하는 것을 포함하도록 의도된다. 간접 표지의 예는, 형광성-표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴을 이용한 DNA 프로브의 말단-표지 및 형광성-표지된 2차 항체를 사용하는 1차 항체의 검출을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 하나 이상의 검출가능한 표지에 접합된다. 이러한 용도를 위해, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 색소생산성, 효소, 방사성동위원소, 동위원소, 형광성, 독소, 화학발광성, 핵자기 공명 조영제 또는 다른 표지의 공유적 또는 비-공유적 부착에 의해 검출가능하게 표지될 수 있다.
적합한 색소생산성 표지의 예는 디아미노벤지딘 및 4-하이드록시아조-벤젠-2-카복실산을 포함한다. 적합한 효소 표지의 예는 말레이트 데하이드로게나제, 스타필로코커스 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), Δ-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알코올 데하이드로게나제, α-글리세롤 포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린 에스테라제를 포함한다.
적합한 방사성동위원소 표지의 예는 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd 등을 포함한다. 111In은, 생체내 영상화를 사용할 경우, 간에 의한 125I 또는 131I-표지된 ASIC1a-단백질 결합 항체의 탈할로겐화의 문제를 피하기 때문에, 예시적인 동위원소이다. 또한, 이 동위원소는 영상화에 보다 유리한 감마 방출 에너지를 갖는다(Perkins et al, Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301(1985); Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 25:281-287(1987)). 예를 들어, 1-(P- 이소티오시아네이토벤질)-DPTA를 가진 단클론성 항체에 커플링된 111In은 비-종양 조직, 특히 간에서 약간의 흡수를 나타내고, 종양 국부화의 특이성을 향상시킨다(Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870(1987)). 적합한 비-방사성 동위원소 표지의 예는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr 및 56Fe를 포함한다.
적합한 형광성 표지의 예는 152Eu 표지, 플루오레세인 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, 초록색 형광성 단백질(GFP) 표지, o-프탈데하이드(phthaldehyde) 표지 및 플루오레스카민 표지를 포함한다. 적합한 독소 표지의 예는 디프테리아 독소, 라이신 및 콜레라 독소를 포함한다.
화학발광성 표지의 예는 루미놀 표지, 이소루미놀 표지, 방향족성 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시퍼라제 표지 및 에쿠오린 표지를 포함한다. 핵자기 공명 조영제의 예는 Gd, Mn 및 철과 같은 중금속 핵을 포함한다.
본 기술의 검출 방법은 시험관내 뿐만 아니라 생체내 생물학적 샘플에서 면역반응성 ASIC1a 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 면역반응성 ASIC1a 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침강법, 방사선면역검정 및 면역형광법을 포함한다. 더욱이, 면역반응성 ASIC1a 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 표지된 본 기술의 항-ASIC1a 항체를 대상체에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 대상체에서의 존재 및 위치가 표준 영상화 기술에 의해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 테스트 대상체로부터의 ASIC1a 단백질 분자를 함유한다.
면역검정 및 영상화. 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 항체-기반 기술을 사용하여 생물학적 샘플(예를 들어, 인간 혈장)에서 면역반응성 ASIC1a 단백질 수준을 검정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직에서 단백질 발현은 고전적인 면역조직학적 방법으로 연구될 수 있다. Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985, 1985; Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987. 단백질 유전자 발현을 검출하기 위해 유용한 다른 항체-기반 방법은 면역 검정, 예컨대 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사선면역검정(RIA)을 포함한다. 적합한 항체 검정 표지는 당업계에 알려져 있으며, 효소 표지, 예컨대 글루코스 옥시다제 및 방사성동위원소 또는 다른 방사성 작용제, 예컨대 아이오딘(125I, 121I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(112In) 및 테크네튬(99mTc) 및 형광성 표지, 예컨대 플루오레세인, 로다민 및 초록색 형광성 단백질(GFP)뿐만 아니라 비오틴을 포함한다.
생물학적 샘플에서 면역반응성 ASIC1a 단백질 수준을 검정하는 것 외에도, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 ASIC1a 단백질의 생체내 영상화에 사용될 수 있다. 이러한 방법에 유용한 항체는 X-방사선촬영, NMR 또는 ESR에 의해 검출가능한 것들을 포함한다. X-방사선촬영의 경우, 적절한 표지는 검출가능한 방사선을 방출하지만 대상체에게 명백하게 유해하지 않은 바륨 또는 세슘과 같은 방사성동위원소를 포함한다. NMR 및 ESR에 적합한 마커는 관련 scFv 클론에 대한 영양소의 표지에 의해 본 기술의 항-ASIC1a 항체에 포함될 수 있는 중수소와 같은 검출가능한 특유의 스핀(spin)을 갖는 것들을 포함한다.
방사성동위원소(예를 들어, 131I, 112In, 99mTc), 방사성-비투과성 물질 또는 핵자기 공명에 의해 검출가능한 물질과 같은, 적절한 검출가능한 영상화 모이어티로 표지된 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 대상체에게 (예를 들어, 비경구로, 피하로 또는 복강내로) 도입된다. 대상체의 크기와 사용된 영상화 시스템이 진단 이미지를 생성하는 데 필요한 영상화 모이어티의 양을 결정할 것은 당업계에서 이해될 것이다. 방사성동위원소 모이어티의 경우에, 인간 대상체에 대해, 주입되는 방사능의 양은 보통 99mTc의 약 5 내지 20밀리퀴리 범위일 것이다. 그 후, 표지된 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 특정 표적 폴리펩티드를 함유하는 세포의 위치에 축적될 것이다. 예를 들어, 표지된 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 ASIC1a 단백질이 국부화되어 있는 세포 및 조직에서 대상체 내에 축적될 것이다.
따라서, 본 기술은 (a) 개체의 세포 또는 체액에서 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 결합을 측정함으로써 면역반응성 ASIC1a 단백질의 발현을 검정하는 것; (b) 샘플에 존재하는 면역반응성 ASIC1a 단백질의 양을 표준 참조와 비교하되, 표준과 비교하여 면역반응성 ASIC1a 단백질 수준의 증가 또는 감소가 의학적 상태를 나타내는 것을 수반하는, 의학적 상태의 진단 방법을 제공한다.
친화도 정제. 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 샘플로부터 면역반응성 ASIC1a 단백질을 정제하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 고체 지지체 상에 고정된다. 이러한 고체 지지체의 예는 플라스틱, 예컨대 폴리카보네이트, 복합 탄수화물, 예컨대 아가로스 및 세파로스, 아크릴 수지, 예컨대 폴리아크릴아미드 및 라텍스 비드를 포함한다. 이러한 고체 지지체에 항체를 커플링하기 위한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Weir et al., "Handbook of Experimental Immunology" 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974)).
항원을 항체-지지체 매트릭스에 결합시키는 가장 단순한 방법은 컬럼에서 비드를 수집하고 항원 용액을 컬럼 아래로 통과시키는 것이다. 이러한 방법의 효율은 고정된 항체와 항원 간의 접촉 시간에 의존하며, 이는 낮은 유속을 이용하여 연장될 수 있다. 고정된 항체는 항원이 유동하여 지나갈 때 항원을 포획한다. 대안적으로, 항원은 항원 용액을 지지체(예를 들어, 비드)와 혼합하고 슬러리를 회전시키거나 흔들어 항원과 고정된 항체 간 최대 접촉을 가능하게 함으로써 항체-지지체 매트릭스와 접촉될 수 있다. 결합 반응이 완료된 후, 슬러리는 비드 수집을 위해 컬럼으로 통과된다. 비드는 적절한 세척 완충제를 사용하여 세척되고, 그 후, 순수 또는 실질적으로 순수한 항원이 용리된다.
관심 항체 또는 폴리펩티드는 비드와 같은 고체 지지체에 접합될 수 있다. 더욱이, 비드와 같은 제1 고체 지지체는 또한, 원하는 경우, 폴리펩티드를 지지체에 접합하기 위해 본원에 개시된 것들을 포함하여, 임의의 적합한 수단에 의해, 제2 비드 또는 다른 지지체일 수 있는 제2 고체 지지체에 접합될 수 있다. 따라서, 고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 접합과 관련하여 본원에 개시된 접합 방법 및 수단 중 임의의 것은 제1 지지체를 제2 지지체에 접합시키기 위해 적용될 수도 있으며, 여기서 제1 및 제2 고체 지지체는 동일하거나 상이할 수 있다.
고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 접합에 사용하기 위한 가교제일 수 있는 적절한 링커는 지지체의 표면에 존재하는 작용기 또는 폴리펩티드 또는 둘 모두와 반응할 수 있는 다양한 작용제를 포함한다. 가교제로서 유용한 시약은 동종-이-기능성, 특히 이종-이-기능성 시약을 포함한다. 유용한 이-기능성 가교제는, 비제한적으로, N-SIAB, 디말레이미드, DTNB, N-SATA, N-SPDP, SMCC 및 6-HYNIC를 포함한다. 가교제는 폴리펩티드와 고체 지지체 사이에 선택적으로 절단가능한 결합을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 3-아미노-(2-니트로페닐)프로피온산과 같은, 광불안정성(photolabile) 가교제는 고체 지지체로부터 폴리펩티드를 절단하기 위한 수단으로 사용될 수 있다(Brown et al., Mol. Divers, pp, 4-12(1995); Rothschild et al., Nucl. Acids Res., 24:351-66(1996); 및 US. Pat. No. 5,643,722). 다른 가교 시약이 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 앞선 Wong(1991); 및 앞선 Hermanson(1996) 참조).
항체 또는 폴리펩티드는 카복실기 기능화된 비드 및 폴리펩티드의 아미노 말단 사이에 형성된 공유 아미드 결합 또는 반대로, 아미노 기 기능화된 비드 및 폴리펩티드의 카복실 말단 사이에 형성된 공유 아미드 결합을 통해, 비드와 같은 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 또한, 이-기능성 트리틸 링커는 아미노 수지를 통한 수지 상의 아미노 기 또는 카복실 기를 통해, 지지체, 예를 들어, 수지, 예컨대 왕(Wang) 수지 상의 4-니트로페닐 활성 에스테르에 부착될 수 있다. 이-기능성 트리틸 접근법을 이용하여, 고체 지지체는 폴리펩티드가 절단되고 제거될 수 있도록 보장하기 위해, 포름산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 휘발성 산을 이용한 처리를 필요로 할 수 있다. 이러한 경우에, 폴리펩티드는 고체 지지체의 웰 바닥 또는 고체 지지체의 편평한 표면에 비드 없는 패치로서 침착될 수 있다. 매트릭스 용액의 첨가 후, 폴리펩티드는 MS로 탈착될 수 있다.
또한, 소수성 트리틸 링커는 휘발성 산 또는 적절한 매트릭스 용액, 예를 들어, 3-HPA를 함유하는 매트릭스 용액을 사용하여 폴리펩티드로부터 아미노 연결된 트리틸 기를 절단함으로써 산-불안정성 링커로 활용될 수 있다. 또한, 산 불안정성은 변경될 수 있다. 예를 들어, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 또는 트리메톡시트리틸은 폴리펩티드의, 적절한 p-치환 또는 더 많은 산-불안정성 트리틸아민 유도체로 변경될 수 있고, 즉, 트리틸 에테르 및 트리틸아민 결합이 폴리펩티드에 만들어질 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 소수성 인력을 방해하거나, 원하는 경우, 매트릭스, 예컨대 3-HPA가 산으로 작용하는 전형적인 MS 조건을 포함하는 산성 조건 하에서, 트리틸에테르 또는 트리틸아민 결합을 절단함으로써 소수성 링커로부터 제거될 수 있다.
또한, 직교로 절단가능한 링커는 제1 고체 지지체, 예를 들어, 비드를 제2 고체 지지체에 결합하거나, 관심 폴리펩티드를 고체 지지체에 결합하는 데 유용할 수 있다. 이러한 링커를 사용하여, 제1 고체 지지체, 예를 들어, 비드는, 지지체로부터 폴리펩티드를 절단하지 않고, 제2 고체 지지체로부터 선택적으로 절단될 수 있고; 그 후, 폴리펩티드는 추후 비드로부터 절단될 수 있다. 예를 들어, DTT와 같은 환원제를 사용하여 절단될 수 있는 디설파이드 링커를 사용하여 비드를 제2 고체 지지체에 결합시킬 수 있고, 산 절단가능한 이-기능성 트리틸 기를 사용하여 폴리펩티드를 지지체에 고정시킬 수 있다. 원하는 바와 같이, 고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 연결을 먼저 절단하여, 예를 들어, 제1 지지체 및 제2 지지체 사이의 연결을 온전한 상태로 둘 수 있다. 트리틸 링커는 공유 또는 소수성 접합을 제공할 수 있고, 접합의 성질에 관계없이 트리틸 기는 산성 조건에서 쉽게 절단된다.
예를 들어, 비드는 고체 지지체에 대한 비드의 고밀도 결합 또는 비드에 대한 폴리펩티드의 고밀도 결합이 촉진되도록 하는 길이 및 화학적 성질을 갖도록 선택될 수 있는 연결 기를 통해 제2 지지체에 결합될 수 있다. 이러한 연결 기는, 예를 들어, "나무-유사(tree-like)" 구조를 가짐으로써, 고체 지지체 상의 부착 부위 당 다수의 작용기를 제공할 수 있다. 이러한 연결 기의 예는 폴리라이신, 폴리글루탐산, 펜타-에리트롤 및 트리스-하이드록시-아미노메탄을 포함한다.
비공유 결합 관련. 비공유 상호작용을 통해, 항체 또는 폴리펩티드가 고체 지지체에 접합될 수 있거나, 제1 고체 지지체가 제2 고체 지지체에 접합될 수도 있다. 예를 들어, 자화될 수 있는 강자성 물질로 제조된 자성 비드는 자성 고체 지지체로 이끌릴 수 있고, 자기장의 제거에 의해 지지체로부터 해제될 수 있다. 대안적으로, 고체 지지체는 이온성 또는 소수성 모이어티와 함께 제공될 수 있으며, 이는 이온성 또는 소수성 모이어티가 각각, 폴리펩티드, 예를 들어, 부착된 트리틸 기를 함유하는 폴리펩티드 또는 소수성 특징을 갖는 제2 고체 지지체와 상호작용할 수 있게 한다.
또한, 고체 지지체는 특이적 결합 쌍의 구성원과 함께 제공될 수 있는 바, 상보성 결합 모이어티를 함유하는 제2 고체 지지체 또는 폴리펩티드에 접합될 수 있다. 예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅된 비드는, 이의 내부에 혼입된 비오틴 모이어티를 갖는 폴리펩티드 또는 비오틴 또는 비오틴의 유도체, 예컨대 이미노비오틴으로 코팅된 제2 고체 지지체에 결합될 수 있다.
본원에 개시되거나 그와 달리 당업계에 알려진 임의의 결합 구성원이 뒤바뀔 수 있음이 인식되어야 한다. 따라서, 비오틴은 예를 들어, 폴리펩티드 또는 고체 지지체에 혼입될 수 있고, 반대로 아비딘 또는 다른 비오틴 결합 모이어티가 지지체 또는 폴리펩티드에 각각 혼입될 것이다. 본원에 사용하기 위해 고려되는 다른 특이적 결합 쌍은, 비제한적으로, 호르몬 및 이의 수용체, 효소 및 이의 기질, 뉴클레오티드 서열 및 이의 상보성 서열, 항체 및 이에 특이적으로 상호작용하는 항원을 포함하고, 다른 이러한 쌍은 당업자에 알려져 있다.
A. 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 진단 용도
총론. 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 진단 방법에 유용하다. 이와 같이, 본 기술은 대상체에서 ASIC1a 단백질 활성의 진단에 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 ASIC1a 단백질에 대한 임의의 수준의 에피토프 결합 특이성 및 매우 높은 결합 친화도를 갖도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 항체의 결합 친화도가 높을수록 면역검정에 보다 엄격한 세척 조건을 수행하여, 표적 폴리펩티드를 제거하지 않고 비특이적으로 결합된 물질을 제거할 수 있다. 따라서, 진단 검정에 유용한 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 보통 약 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 또는 1012 M-1의 결합 친화도를 갖는다. 또한, 진단 시약으로 사용되는 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 적어도 12시간, 적어도 다섯(5) 시간 또는 적어도 한(1) 시간 후, 표준 조건에서 평형에 도달하기에 충분한 동역학적 온-레이트(kinetic on-rate)를 갖는 것이 바람직하다.
본 기술의 항-ASIC1a 항체를 사용하여 다양한 표준 검정 형식에서 면역반응성 ASIC1a 단백질을 검출할 수 있다. 이러한 형식은 면역침강법, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역검정 및 면역계측 검정을 포함한다. Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988); 미국 특허 번호 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,879,262; 4,034,074, 3,791,932; 3,817,837; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 및 4,098,876을 참조하라. 생물학적 샘플은 대상체의 임의의 조직 또는 체액으로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암의 초기 단계에 있다. 하나의 실시양태에서, 암의 초기 단계는 대상체로부터 수득된 샘플에서 ASIC1a 단백질의 수준 또는 발현 패턴에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 샘플은 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 침, 양수, 뇌척수액(CSF) 및 생검된 신체 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
면역계측 또는 샌드위치 검정은 본 기술의 진단 방법에 대한 하나의 형식이다. 미국 특허 번호 4,376,110, 4,486,530, 5,914,241 및 5,965,375를 참조하라. 이러한 검정은 하나의 항체, 예를 들어, 고체상에 고정된 본 기술의 항-ASIC1a 항체 또는 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 집단 및 용액 중의 또 다른 본 기술의 항-ASIC1a 항체 또는 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 집단을 사용한다. 전형적으로, 용액으로서 본 기술의 항-ASIC1a 항체 또는 본 기술의 항-ASIC1a 항체 집단은 표지된다. 항체 집단이 사용되는 경우, 집단은 표적 폴리펩티드 내의 상이한 에피토프 특이성에 결합하는 항체를 함유할 수 있다. 따라서 고체상 및 용액 항체 모두에 동일한 집단이 사용될 수 있다. 본 기술의 항-ASIC1a 항체가 사용되는 경우, 상이한 결합 특이성을 갖는 제1 및 제2 ASIC1a 단백질 단클론성 항체가 고체 및 용액상에 대해 사용된다. 고체상("포획"으로도 지칭됨) 및 용액("검출"로도 지칭됨) 항체는 순서대로 또는 동시에 표적 항원과 접촉될 수 있다. 고체상 항체가 먼저 접촉되는 경우, 검정은 순차적 검정(forward assay)으로 지칭된다. 반대로, 용액 항체가 먼저 접촉되는 경우, 검정은 역순 검정(reverse assay)으로 지칭된다. 표적이 두 항체와 동시에 접촉되는 경우, 검정은 동시 검정으로 지칭된다. ASIC1a 단백질을 본 기술의 항-ASIC1a 항체와 접촉시킨 후, 보통 약 10분에서 약 24시간까지 달리하며 통상 약 1시간인 기간 동안 샘플을 항온처리한다. 그 후, 세척 단계를 수행하여 진단 시약으로 사용되는 본 기술의 항-ASIC1a 항체에 특이적으로 결합되지 않은 샘플의 구성요소를 제거한다. 고체상 및 용액 항체가 별도의 단계에서 결합되는 경우, 결합 단계 중 하나 또는 둘 모두 이후에 세척이 수행될 수 있다. 세척 후, 전형적으로 표지된 용액 항체의 결합을 통해 고체상에 연결된 표지를 검출함으로써 결합을 정량화한다. 일반적으로, 주어진 한 쌍의 항체 또는 항체 집단 및 주어진 반응 조건을 위해, 알려진 농도의 표적 항원을 함유하는 샘플로부터 검량선을 준비한다. 그 후, 테스트되는 샘플에서 면역반응성 ASIC1a 단백질의 농도를 검량선(즉, 표준 곡선)으로부터 보간법(interpolation)으로 판독한다. 분석물은 평형에서 결합된 표지된 용액 항체의 양으로부터 또는 평형에 도달하기 전 일련의 시점에서 결합된 표지된 용액 항체의 동역학적 측정에 의해 측정될 수 있다. 이러한 곡선의 기울기는 샘플에서 ASIC1a 단백질의 농도의 척도이다.
상기 방법에 사용하기에 적합한 지지체는, 예를 들어, 니트로셀룰로오스 막, 나일론 막 및 유도체화된(derivatized) 나일론 막 및 또한 입자, 예컨대 아가로스, 덱스트란-계 겔, 딥스틱, 미립자, 미소구체, 자성 입자, 테스트 튜브, 마이크로타이터 웰, 세파덱스(SEPHADEX)TM(뉴저지 피스카타웨이 소재의 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)) 등을 포함한다. 고정화는 흡수 또는 공유 부착에 의한 것일 수 있다. 선택적으로, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 아비딘과 같은 표면 결합 링커에 부착하기 위해 비오틴과 같은 링커 분자에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 진단제에 접합된 본 기술의 항-ASIC1a 항체를 제공한다. 진단제는 방사성 또는 비-방사성 표지, 조영제(예컨대, 자기 공명 영상화, 컴퓨터 단층 촬영 또는 초음파용)를 포함할 수 있고, 방사성 표지는 감마-, 베타-, 알파-, 오제 전자- 또는 양전자-방출 동위원소일 수 있다. 진단제는 항체 모이어티, 즉, 항체 또는 항체 단편 또는 하위단편에 접합되어 투여되는 분자이며, 항원을 함유하는 세포를 찾아내어 질환을 진단하거나 검출하는 데 유용하다.
유용한 진단제는, 비제한적으로, 방사성동위원소, 염료(예컨대, 비오틴-스트렙타비딘 복합물을 가짐), 조영제, 형광성 화합물 또는 분자 및 자기 공명 영상화(MRI)용 강화 작용제(예를 들어, 상자성 이온)를 포함한다. 미국 특허 번호 6,331,175는 MRI 기술 및 MRI 강화 작용제에 접합되는 항체의 제조를 기재하고, 이의 전체가 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 진단제는 방사성동위원소, 자기 공명 영상화에 사용하기 위한 강화 작용제 및 형광성 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항체 구성요소에 방사성 금속 또는 상자성 이온을 로딩하기 위해, 이온 결합을 위한 다수의 킬레이트 기가 부착된 긴 미부(tail)를 갖는 시약과 반응시킬 필요가 있을 수 있다. 이러한 미부는 중합체, 예컨대 폴리라이신, 다당류 또는 예를 들어, 킬레이트 기, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카바존, 폴리옥심 및 이러한 목적에 유용한 것으로 알려진 유사 기에 결합될 수 있는 펜던트 기를 갖는 다른 유도체화되거나 유도체화가능한 쇄일 수 있다. 킬레이트는 표준 화학을 이용하여 본 기술의 항체에 커플링될 수 있다. 킬레이트는 보통 면역반응성의 손실을 최소화하고 응집 및/또는 내부 가교를 최소화하면서 분자에 대한 결합을 형성할 수 있는 기에 의해 항체에 연결된다. 킬레이트를 항체에 접합하기 위한 다른 방법 및 시약은 미국 특허 번호 4,824,659에 기재된다. 특히 유용한 금속-킬레이트 조합은 2-벤질-DTPA 및 이의 모노메틸 및 사이클로헥실 유사체를 포함하고, 이는 방사선-영상화를 위한 진단 동위원소와 함께 사용된다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비-방사성 금속과 착물을 이루는 경우, 동일한 킬레이트가 본 기술의 ASIC1a 단백질 항체와 함께 사용될 때 MRI에 유용하다.
B. 본 기술의 항-ASIC1a 항체의 치료적 용도
총론. 일부 양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 허혈성 뇌졸중 및 관련 병태의 예방, 개선 또는 치료를 위한 요법을 제공하는 본원에 개시된 방법에 유용하다.
하나의 양태에서, 본 기술은 허혈성 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서, 허혈성 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 a 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, VH는 서열번호 3, 13, 23, 33, 43 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34, 44 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35, 45 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고; VL은 서열번호 8, 18, 28, 38, 48 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 서열번호 10, 20, 30, 40, 50 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 4에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 5에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 8에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 열 식별 번호: 9에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 10에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 13에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 14에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 15에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 18에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 19에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 20에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 23에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 24에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 25에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 28에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 30에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 33에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 34에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 35에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 38에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 39에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 40에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 43에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 44에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 45에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 48에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 49에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 50에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 53에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 54에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 55에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 58에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 59에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 60에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH는 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상의 완화를 필요로 하는 대상체에서 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 완화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 3, 13, 23, 33, 43 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34, 44 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35, 45 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고; VL은 서열번호 8, 18, 28, 38, 48 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 서열번호 10, 20, 30, 40, 50 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 4에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 5에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 8에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 9에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 10에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 13에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 14에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 15에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 18에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 19에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 20에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 23에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 24에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 25에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 28에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 30에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 33에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 34에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 35에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 38에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 39에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 40에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 43에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 44에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 45에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 48에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 49에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 50에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 53에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 54에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 55에 따른 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1은 서열번호 58에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 59에 따른 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 60에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 기술은 허혈성 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57 중 어느 하나의 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열; 및/또는 (b) 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 또는 52중 어느 하나에 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열(VH)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a의 세포외 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASIC1a 삼합체의 기능을 억제한다.
일부 실시양태에서, 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상은 갑작스러운 쇠약; 특히 신체의 한쪽에서 얼굴, 팔 또는 다리의 마비 또는 무감각; 얼굴 한쪽의 처짐; 착란; 말하기의 어려움, 예컨대 어눌한 말씨 또는 말을 이해하기 어려움; 한쪽 또는 양쪽 눈의 불편한 시력, 예컨대 한쪽 또는 양쪽 눈의 흐릿하거나 검은 시야 또는 이중 시야; 호흡 곤란; 현기증; 보행의 어려움; 예를 들어, 이유 없는 넘어짐을 야기하는, 균형 또는 협응능력 상실; 의식 상실 및 갑작스러운 심한 두통이다. 일부 실시양태에서, 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상은 갑자기 발병한 안면 마비(예컨대, 얼굴 한쪽의 처짐), 팔의 표류 및 비정상적인 말투로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체, scFv,(scFv)2, Fab, Fab′, F(ab′)2 또는 scFv-Fc 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv 항체이다. 일부 실시양태에서, scFv 항체는 ASC01, ASC02, ASC03, ASC04, ASC05 또는 ASC06이다.
따라서, 예를 들어, 하나 이상의 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 (1) 공동-제형화되고 투여될 수 있거나, 단독 또는 다른 활성제 또는 본 기술의 항-ASIC1a 항체와 조합된 제형으로 동시에 전달될 수 있거나; (2) 별개의 제형으로서 교대로 또는 병렬적으로; 또는 (3) 당업계에 알려진 다른 병용 치료 요법에 의해 전달될 수 있다. 교대 요법으로 전달될 때, 본원에 기재된 방법은 활성 성분을 순차적으로, 예를 들어, 별개의 용액, 유화액, 현탁액, 정제, 알약 또는 캡슐로 투여 또는 전달하거나, 별개의 주사기로 상이한 주사에 의해 투여 또는 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 중에, 각각의 활성 성분은 유효 투여량으로 순차적으로, 즉, 연속적으로 투여되는 반면, 동시 요법에서는, 둘 이상의 활성 성분은 유효 투여량으로 함께 투여된다. 다양한 순서의 간헐적 병용 요법도 사용될 수 있다. 본 기술의 항-ASIC1a 항체 및 다른 활성제의 이러한 조합을 투여하는 것은 의학적 질환 또는 병태를 앓고 있고 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량으로 투여될 때, 생물학적 효과의 시너지를 초래할 수 있다. 이러한 접근법의 이점은 대상체에서 허혈성 뇌졸중을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체를 예방, 개선 또는 치료하기 위해 본 기술의 항-ASIC1a 항체 및/또는 다른 활성제의 더 낮은 용량이 필요로 될 수 있다는 것이다. 또한, 치료의 잠재적인 부작용은 본 기술의 항-ASIC1a 항체 및/또는 다른 활성제의 더 낮은 투여량을 사용하여 피할 수 있다.
본원에 기재된 본 기술의 항-ASIC1a 항체, 예컨대 ASC01, ASC02, ASC03, ASC04, ASC05, ASC06 등은 질환을 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 구체적으로, 본원은 허혈성 뇌졸중을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체를 치료하는 예방 또는 치료 방법 둘 모두를 제공한다. 따라서, 본 방법은 본 기술의 항-ASIC1a 항체를 유효량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 돌연변이체 이온 채널 단백질 삼합체의 기능을 회복시키는, 대상체에서 허혈성 뇌졸중을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체를 예방 및/또는 치료하는 것을 제공한다. 본기술은 ASC01, ASC02, ASC03, ASC04, ASC05, ASC06 등과 같이, 본원에 기재된 바와 같은 본 기술의 항-ASIC1a 항체를 치료적 유효량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 포유동물에서 허혈성 뇌졸중을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체를 치료하는 것을 제공한다.
본 기술의 항ASIC1a 항체의 생물학적 효과의 결정
다양한 실시양태에서, 본 기술의 항-ASIC1a 항체에 기반한 특정 치료제의 효과 및 이의 투여가 치료를 나타내는지 여부를 결정하기 위해 적합한 시험관내 또는 생체내 검정이 수행된다. 다양한 실시양태에서, 시험관내 검정은 본원에 개시된 CHO-K1/hASIC1a(전장 hASIC1a를 과발현하는 안정한 세포주)와 같은 대표적인 세포주인 CHO-K1 세포로 수행될 수 있다.
이러한 실험은 주어진 본 기술의 항-ASIC1a 항체가 ASIC1a 단백질 삼합체의 활성을 억제하는 데 원하는 효과를 발휘하는지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 치료에 사용하기 위한 화합물은 인간 대상체에서 테스트하기 전에, 비제한적으로 랫트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 토끼 등을 포함하는 적합한 동물 모델 시스템에서 테스트될 수 있다. 유사하게, 생체내 테스트를 위해, 인간 대상체에 투여하기 전에 당업계에 알려진 임의의 동물 모델 시스템이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, ASIC1a 활성은, 비제한적으로 본원에 개시된 바와 같은 패치 클램프와 같은 전기생리학적 검정을 포함하는 당업계에 널리 알려진 검정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, ASIC1a 활성은 동물 모델에서 생물학적 활성을 측정하는 검정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, ASIC1a 활성은, 비제한적으로 본원에 개시된 마우스 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO)-유도된 허혈성 뇌졸중 모델을 포함하는 동물 모델의 질환 표현형의 구제를 측정하는 검정에 의해 결정된다.
투여 방식 및 효과적인 투여량
세포, 기관 또는 조직을 본 기술의 면역글로불린 관련 조성물과 접촉시키기 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법을 포함한다. 생체내 방법은 전형적으로, 포유동물, 적합하게는 인간에게 상기한 것들과 같은 면역글로불린 관련 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 치료를 위해 생체내에서 사용될 때, 본 기술의 항-ASIC1a 항체는 유효량(즉, 원하는 치료 효과를 갖는 양)으로 대상체에게 투여된다. 투여 및 투여량 요법은 대상체의 증상 정도, 사용된 특정 면역글로불린의 특성, 예를 들어, 치료 지수, 대상체 및 대상체의 병력에 따라 달라질 것이다.
유효량은 전임상 시험 및 임상 시험 동안 의사 및 임상의에게 친숙한 방법으로 결정될 수 있다. 방법에 유용한 면역글로불린의 의 유효량은 약학적 화합물을 투여하기 위한 다수의 잘 알려진 방법 중 임의의 것에 의해, 이를 필요로 하는 포유동물에 투여될 수 있다. 면역글로불린은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
C.키트
본 기술은 허혈성 뇌졸중의 검출 및/또는 치료를 위한 키트를 제공하고, 이는 본 기술의 적어도 하나의 면역글로불린 관련 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편) 또는 이의 기능성 변이체(예를 들어, 치환 변이체)를 포함한다. 선택적으로, 상기 본 기술의 키트의 구성요소는 허혈성 뇌졸중의 진단 및/또는 치료를 위해 적절한 용기에 패키징되고 표지된다. 상기 구성요소는 단위 또는 복수-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플, 바이알, 병, 주사기 및 테스트 튜브에, 수성, 바람직하게는 멸균 용액 또는 동결건조, 바람직하게는 재구성용 멸균 제형으로 보관될 수 있다. 키트는 약학 조성물을 더 큰 부피로 희석하기에 적합한 희석제를 보유하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 희석제는, 비제한적으로, 약학 조성물의 약학적으로 허용가능한 부형제 및 식염수 용액을 포함한다. 더욱이, 키트는 약학 조성물 희석에 대한 지침서 및/또는 희석에 관계없이 약학 조성물 투여에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있고, 멸균 엑세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘(hypodermic injection needle)에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 가방 또는 바이알일 수 있음). 키트는 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 더 많은 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 하나 이상의 적합한 숙주를 위한 배양 배지를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 치료 또는 진단 제품의 상업적 패키지에 관례상 포함되는 지침서를 선택적으로 포함할 수 있으며, 설명서는, 예를 들어 이러한 치료 또는 진단 제품의 사용에 관한 적응증(indication), 사용법, 투여량, 제조, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함한다.
키트는 생물학적 샘플, 예를 들어, 비제한적으로, 예를 들어, 혈청, 혈장, 림프, 낭종액(cystic fluid), 소변, 대변, 뇌척수액, 복수 또는 혈액을 포함하고, 신체 조직의 생검 샘플을 포함하는 임의의 체액에서 면역반응성 ASIC1a 단백질의 존재를 검출하는 데 유용하다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플에서 ASIC1a 단백질에 결합할 수 있는 본 기술의 하나 이상의 인간화, 키메라 또는 이중특이적 항-ASIC1a 항체(또는 이의 항원 결합 단편); 샘플에서 ASIC1a 단백질의 양을 결정하기 위한 수단; 및 샘플 내의 면역반응성 ASIC1a 단백질의 양을 표준과 비교하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 하나 이상의 항-ASIC1a 항체가 표지될 수 있다. 키트 구성요소(예를 들어, 시약)는 적절한 용기에 패키징될 수 있다. 키트는 면역반응성 ASIC1a 단백질을 검출하기 위해 키트 사용에 대한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
항체-기반 키트의 경우, 키트는 예를 들어, 1) 제1 항체, 예를 들어, ASIC1a 단백질에 결합하는, 고체 지지체에 부착된, 본 기술의 인간화 또는 키메라 항-ASIC1a 항체(또는 이의 항원 결합 단편); 및 선택적으로, 2) ASIC1a 단백질 또는 제1 항체에 결합하고 검출가능한 표지에 접합된 상이한 제2 항체를 포함할 수 있다.
키트는 또한, 예를 들어, 완충제, 보존제 또는 단백질-안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 검출가능한 표지를 검출하기 위해 필요한 구성요소, 예를 들어, 효소 또는 기질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플을 함유할 수 있으며, 이는 검정되고 테스트 샘플과 비교될 수 있다. 키트의 각 구성요소는 개별 용기에 넣어질 수 있고, 다양한 모든 용기는 키트를 사용하여 수행된 검정 결과를 해석하기 위한 지침서와 함께 단일 패키지 내에 있을 수 있다. 본 기술의 키트는 키트 용기 위 또는 용기 내에 서면 제품을 함유할 수 있다. 서면 제품은 예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 ASIC1a 단백질의 검출을 위해 또는 허혈성 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서 허혈성 뇌졸중의 치료를 위해 키트에 함유된 시약을 사용하는 방법을 설명한다. 특정 실시양태에서, 시약의 사용은 본 기술의 방법에 따를 수 있다.
실시예
본 기술은 임의의 방식으로 한정하는 것으로 해석되어서는 안 되는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 하기 실시예 각각에 대해, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 및 유전적으로 변형된 IgG 및 본원에 기재된 이의 단편과 같은 임의의 면역학적 결합제가 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 하기 실시예에서 사용된 scFv 또는 IgG1 항체는 ASC01, ASC02, ASC03, ASC04, ASC05 또는 ASC06 등일 수 있다.
실시예 1: 물질 및 방법
시약 및 약어. 모든 시약은 시그마(Sigma)로부터 구입하였거나 그렇지 않으면 최고 분석 등급으로 명시된 대로 구입하였다. 종(예를 들어, 인간, 마우스, 래트 등)의 이니셜의 이탤릭체 소문자를 기호의 첫 글자로 사용하고 그 뒤에 유전자 이름을 사용하는 형식으로 재조합 단백질 기호를 사용한다(예를 들어, hASIC1a는 hASIC1a 단백질을 나타냄). 패닝 결과에 따라, 항체를 ASC00과 같이 임의로 번호를 매겼다. "-IgG1" 기호가 있거나 없는 임의의 숫자는 각각 Fc 또는 전장 IgG1(IgG1)과 융합된 scFv 형식의 항체를 나타낸다.
세포 배양. CHO-K1 세포주(#CRL-9618; ATCC)를 10%(vol/vol) FBS(#1600074; 깁코(Gibco))를 함유하는 F-12k 배지(#21127022; 깁코)에서 유지한 반면, 프리스타일(FreeStyle) 293F(# R79007; 서모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)) 세포주를 프리스타일 293 발현 배지(#12338026; 서모피셔 사이언티픽)에서 배양하였다. 스포도프테라 프루기페르다 9(Spodoptera frugiperda 9)(Sf9) 세포(#12659017; 서모피셔 사이언티픽)를 ESF921 배지(#96-001-01; 익스프레션 시스템즈(Expression Systems))에서 27℃로 배양하였다. E18-d-올드 C57 BL/6 마우스 또는 ASIC1a-/- 마우스로부터 해부된 1차 피질 뉴런을 B27(#17504044; 깁코) 및 글루타엠엑스(Glutamx) I(#35050061; 깁코)로 보충된 신경기본 배지(Neurobasal media)(#21103049; 깁코)에서 유지하였다. 전장 hASIC1a(1-528개 아미노산) 채널을 과발현하는 CHO-K1/hASIC1a 안정 세포주를 다음과 같이 생성하였다: C-말단 eYFP 융합 또는 C-말단 mCherry 융합을 갖는 전장 hASIC1a의 cDNA를 구성하고, pCDNA3.1-Neo 발현 벡터에 클로닝하고, 리포펙틴(Lipofectin) 2000을 사용하여 CHO-K1 세포에 형질감염시켰다. CHO-K1/hASIC1a 안정 세포주를 항생제인 제네티신(geneticin)(최대 1 mg/mL)에 의해 선택하고, 유세포 분석을 이용하여 융합 형광 단백질 eYFP(λex = 488 nm, λem = 528 nm) 또는 mCherry 형광(λex = 587 nm, λem = 610 nm)에 의해 확인하였다. 80%를 넘는 양성 세포가, 30일 동안 200 μg/mL 제네티신의 존재 하에 배양될 때 생존하였다. 클론성 안정 세포주를 eYFP(6H7 세포주) 및 mCherry(4C12 세포주)의 발현에 기반한 유세포 분석 기기(BD FACSAria III)를 사용하여 분류하고, 10%(vol/vol) FBS 및 200 μg/mL 제네티신이 보충된 F-12K 배지를 사용하여 확장시켰다. hASIC1a-특이적 단클론성 항체인 ASC06을 사용하여 hASIC1a의 과발현을 추가로 확인하였다.
재조합 절단된 hASIC1a의 정제. N-말단 플래그-태그에 융합된 절단된 hASIC1a(ΔhASIC1a)를 암호화하는 cDNA를 pEG 백맘(BacMam) 발현 벡터(오리건 주 포틀랜드 소재의 오리건 보건 과학 대학교(Oregon Health and Science University), 하워드 휴즈 의학 연구소(Howard Hughes Medical Institute), 에릭 구옥스(Eric Gouaux) 제공)에 클로닝하였다. ΔhASIC1a 단백질을 백맘 시스템을 사용하여 HEK293F 세포에서 이종 발현하였다. Goehring, et al., Nat Protoc 9:2574-2585(2014). 간략하게는, pEG 백맘-ΔhASIC1a 구성물을 DH10Bac 대장균 세포(ΔhASIC1a 백미드(bacmid))로 형질전환시켰다. 그 후, 생성된 백미드를 푸젠(FuGENE) 형질감염 시약(프로메가(Promega))을 사용하여 Sf9 세포에 형질감염시켜 P3 배큘로바이러스를 얻었다(2회 증폭). HEK293F 세포(mL당 2 x 106 세포)를 37℃에서 24시간 동안 1:25(바이러스:세포)의 감염 다중도(MOI)로 배큘로바이러스에 의해 감염시켰다. 감염된 세포를 48시간 동안 37℃에서 2 mM 부티르산나트륨의 존재 하에 항온처리하여, 표적 단백질의 발현을 증대시켰다. 1분당 2,000 x g으로 원심분리하여 세포를 수확하였다.
달리 명시하지 않은 한, 하기 단계는 얼음 위에서 수행되었다. 2 L 배양액의 세포 펠릿을 프로테아제 억제제 혼합물(50 mL당 1정; 로체(Roche))이 보충된 100 mL의 저장성 완충액(10 mM 트리스, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 20 mM KCl)에서 먼저 재현탁하였다. 세포를 다운스(Dounce) 균질화기를 사용하여 분쇄하고, 80,000 x g으로 40분 동안 원심분리하였다. 상기 과정을 1회 반복한 후, 생성된 펠릿을 100 mL의 고장성(hypertonic) 완충액(10 mM 트리스, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 20 mM KCl, 1 M NaCl)에 재현탁하고 균질화하고 원심분리하였다. 또한 이 절차를 1회 더 반복하였다. 그 후, 생성된 펠릿을 혼합하고, 프로테아제 억제제를 함유하는 50 mL의 저장성 완충액에서 2 mg/mL 아이오도아세트아미드로 30분 동안 처리하였다. 재조합 ΔhASIC1a 단백질을 4℃에서 3시간 동안 조심스럽게 교반하면서 세포 용해 완충액(100 mM 트리스, pH 7.5, 1.6 M NaCl, 1% n-도데실 b-D-말토파이라노사이드(DDM), 0.2% 콜레스테릴 헤미석시네이트(CHS))에서 추출하였다. 30분간 15,000 x g으로 원심분리한 후, 상청액을 조심스럽게 교반하면서 항-플래그(FLAG) M2 자성 비드(#M8823; 시그마)와 함께 밤새 항온처리하였다. 자성 비드를 완충액 A(50 mM 트리스, pH 7.5, 800 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.1% DDM, 0.02% CHS, 10 mM MgCl2) 및 완충액 B(25 mM 트리스, pH 7.5, 800 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.05% DDM, 0.01% CHS)으로 각각 1회씩 세척하였다. ΔhASIC1a 단백질을 0.1 mg/mL 플래그 펩티드로 보충된 완충액 B를 사용하여 용리시키고, 농축하고, 슈퍼덱스 200 컬럼(GE 헬스케어)에서 SEC를 사용하여 추가로 정제하고, 농축하여 15 mg/mL의 스톡 용액 60 μL를 수득하였다. 도 12a에 도시된 바와 같이, 생성된 동종 ΔhASIC1a는 SDS-PAGE 분석에 의해 판단하였을 때 순도가 >90%였다.
hASIC1a 채널의 나노디스크 조립체. 세포막의 지질 이중층 환경을 모방하기 위해, ΔhASIC1a 단백질과 막 스캐폴드 단벡질(membrane scaffold protein, MSP) 및 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)를 3:2:65의 몰비로 혼합함으로써, 정제된 ΔhASIC1a 단백질을 지질 나노디스크에 혼입시켰다. 바이오-비드 SM2[바이오-비드:DDM = 10:1(wt/wt); 바이오-라드(Bio-Rad)]와 함께 밤새 조심스럽게 교반하여 관련 세재를 제거하였다. ΔhASIC1a-매립된 나노디스크를 플래그 펩티드-특이적 자성 비드를 사용하여 미조립된 나노디스크로부터 분리하였다. D'Antona et al., Biochemistry 53:127-134(2014). 원하는 ΔhASIC1a 나노디스크 조립체를 20 mM 트리스, pH 7.5 및 150 mM NaCl을 함유하는 완충액에서 수퍼로즈(Superose) 6 컬럼(GE 헬스케어)을 사용하여 추가로 정제하고 수집하였다. 빈 나노디스크를 ΔhASIC1a의 추가 없이 패키징하였다. 조립된 ΔhASIC1a 나노디스크의 조성을 SDS-PAGE, EM 및 동적 광 산란에 의해 분석하였다(도 9a-c, 12a, 12b).
조합 항체 라이브러리의 차등 농축-기반 스크리닝. 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드(#21925; 피어스(Pierce))에 고정된 비오틴화된 ΔhASIC1a 나노디스크에 대해 3회의 친화도 농축 후, 조합 인간 단클론성 scFv 항체 파지 라이브러리(1011 다양성)으로부터 hASIC1a-특이적 scFv 항체를 선택하였다. 변형된 절차를 사용하여 파지 항체 라이브러리 패닝을 수행하였다. Xu, et al. Front Mol Neurosci 10: 298(2017). 간략하게는, 항원(ΔhASIC1a 나노디스크)에 결합하는 파지미드(항체 라이브러리를 디스플레이함)를 각각의 사이클에서 농축하였고 글라이신-HCl(pH 2.2)로 용리시켰다. XL1-블루 세포를 사용하여 다음 회차의 패닝을 위한 산출 파지미드를 발현하고 증폭하였다. 비특이적 농축을 최소화하기 위해, 차등 농축 파지 디스플레이 선택을 이용하였으며, 이는 제2 및 제3 사이클에서 ΔhASIC1a 나노디스크에 대해 패닝하기 전에 과량의 빈 나노디스크(ΔhASIC1a 나노디스크 양 2배 초과)를 사용하여 비특이적 파지미드를 끌어당겼다(pull down). 3회 반복한 후, 96개의 양성 콜로니를 선택하고 파지 ELISA에 의해 분석하였다. Xu, et al. Front Mol Neurosci 10: 298(2017). 모든 양성 클론을 시퀀싱하였다. 국제 면역유전학(ImMunoGeneTics) 정보 플랫폼을 이용하여 CDR3 도메인의 DNA 및 단백질 서열을 모두 분석하였다. CDR3 서열을 정렬한 후 계통수(phylogenetic tree)를 구성하였다. 6가지의 독특한 scFv 서열을 고도로 농축하였다.
항체의 발현 및 정제. 후보 scFv 서열을 암호화하는 유전자를 변형된 p퓨즈(pFUSE) 발현 벡터(#pfuse-hg1fc2; 인비트로겐(Invivogen))에 클로닝하여 인간 IgG1의 전체 Fc 도메인을 구성하는 scFv-Fc 융합 단백질을 수득하였다. 전장 IgG1 항체의 경우, scFv 벡터로부터의 중쇄(VH 도메인) 및 경쇄(VL 도메인)의 가변성 영역을 온전한 불변 중쇄 도메인(CH1, CH2 및 CH3) 및 온전한 불변 경쇄 도메인(CL)을 각각 갖는 플라스미드에 클로닝하였다. scFv-Fc 벡터로 형질감염되거나 동일 몰의 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터로 공동 형질감염된 HEK293F 세포를 4일 동안 배양하였다. 원심분리 후, 배지에 분비된 scFv-Fc 또는 전장 IgG1 항체를 아크타(AKTA) 정제기 100(GE헬스케어)에서 시트레이트 용리 완충액, pH 3.4와 함께 하이트랩 단벡질(HiTrap Protein) A HP 컬럼(#17-0403-03; GE 헬스케어)을 사용하여 정제하였다. 그 후, 정제된 항체를 농축(15 mg/mL)하고, pH 7.4인 PBS 완충액에서 -80℃로 보관하였다. 예를 들어, 도 12d에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE 분석은 정제된 단일 쇄 및 전장 항체가 적어도 90% 순수하였음을 보여주었다.
음성 염색 전자 현미경(Negative Stain Electron Microscopy, EM): (1) 샘플 준비 및 데이터 수집. ASC06-IgG1을 파파인으로 분해(digesting)시키고, 이어서 단백질 A 친화도 정제 및 겔 여과하여 ASC06-IgG1의 항원 결합 단편(ASC06-Fab)을 제조하였다. N-말단 융합된 IL-2 태그 및 플래그 태그를 갖는 hASIC1a의 엑토도메인(hASIC1a-ECD)을 HEK293F 세포에서 발현시키고, pH 7.4인 PBS 완충액을 사용하여 겔 여과 및 항-플래그 M2 자성 비드에 의해 정제하였다. ASC06-Fab 및 hASIC1a-ECD를 3:1의 몰비로 pH 7.4인 PBS 완충액에서 4℃로 밤새 항온처리하여 3차 복합물을 형성하였다. 이 복합물을 겔 여과에 의해 추가로 단리하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 복합물은 ASC06-Fab 단독 및 hASIC1a-ECD 단독 둘 모두와 구별가능한 별개의 피크를 형성하였다. 이러한 복합물을 함유하는 피크 분획을 수집하고 음성 염색 EM을 수행하였다. hASIC1a-ECD 및 ASC06-Fab의 정제된 복합물을 0.01 mg/mL로 희석하여 EM 샘플을 제조하였다. 그 후, 4 μL의 샘플 액적을 박형의 연속적인 탄소 필름(#BZ31024a; 베이징 종징케이아이 테크놀로지(Beijing Zhongjingkeyi Technology))으로 덮인 새로운 글로우-방전 구리 그리드(glow-discharged copper) 위에서 1분 동안 흡수시켰다. 그리드를 탈이온수 2방울로 세척한 후, 여과지로 블로팅하기 전에 0.75%(wt/vol) 우라닐 포르메이트(#22450; 일렉트론 마이크로스코피 사이언스(Electron Microscopy Sciences)) 2방울로 1분 동안 음성으로 염색하고, 이어서 공기 건조하였다.
120 kV에서 작동되는 LaB6 캐소드 및 67,000배의 교정된 배율의 4,000 x 4,000 이글 CCD 카메라가 장착된 테크나이 G2 스피릿(Tecnai G2 Spirit) 투과 전자 현미경(FEI)으로 모든 현미경 사진을 기록하였고, 그 결과 픽셀 크기는 1.74 Å이었다.
EM 이미지 처리 및 3D 재구성. 스키피온(Scipion) 소프트웨어 묶음을 모든 이미지 처리 단계에 사용하였다. de la Rosa-Trevin et al., J Struct Biol 157:38-46(2016). 기록된 모든 현미경 사진을 먼저 두 배로 데시메이트(decimate)하였다(3.48 Å의 픽셀 크기를 초래함). 그 후, 96 x 96 픽셀의 박스 크기를 이용하는 에만2 박서(EMAN2 Boxer) 기능으로 100개의 마이크로그래프로부터 총 5,064개의 입자를 수동으로 선택하였다. Tang et al., J Struct Biol. 157(1):38-46(2007). 참조 없는 2D 클래스 평균 분석을 엑스미프(Xmipp) CL2D 기능을 사용하여 생성하였다. de la Rosa-Trevin et al., J Struct Biol 184:321-328.(2013).
분자 역학 시뮬레이션. Fab 형식의 hASIC1a 및 ASC06에 대한 모델을 스위스 모델 웹부위를 이용하여 상동성에 의해 유도하였다. Biasini et al. Nucleic Acids Res 42:W252-W258 (2014). ASIC1a 단백질의 주형을 절단된 닭 단백질[단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank) (PDB) ID 코드 4FZ0]의 구조로부터 수득하였다. 가능한 원자 모델과 음성 염색 결과를 비교하기 위해, 클러스프로(ClusPro) 2.0 서버 및 항체 도킹 모드를 사용하여 hASIC1a의 ECD에 대한 일련의 다른 가능한 Fab의 도킹들(잔기 73-425만 유지됨)을 먼저 생성하였다. Comeau et al., Bioinformatics 28:2608-2614SR (2004); and Brenke et al., Bioinformatics 28(20):2608-14 (2012). 그 후, 음성 염색에 의해 설명된 것과 더욱 호환가능한 기하 구조를 갖는 hASIC1a의 ECD에 대한 Fab의 도킹 중 8개를 하위 선택하고, 에너지 최소화를 수행한 후, 20-ns 분자 동역학 모의실험을 수행하여 상호작용을 완화하고 복합물의 구조를 안정화하였다. 이러한 절차 후, 단 하나의 모델이 음성 염색 실험에서 실험적으로 관찰된 전체 기하 구조를 충족하는 듯하였다. 시뮬레이션을 그로맥스(Gromacs) 4.6.7 패키지 및 앰버14ffSB(Amber14ffSB) 포스 필드를 사용하여 수행하였다. Pronk et al., Bioinformatics 29: 845-854 (2013); and Lindorff-Larsen et al., Proteins 78: 1950-1958 (2010). 모든 시스템을 ~0.15 M 농도의 Cl- 및 K+ 이온을 함유하는 전체 원자 TIP3P 수로 용매화하여 생리학적 이온 강도를 모방하였다.
온도 T 및 압력 P를 베렌드센(Berendsen) 온도 조절 장치 및 압력 조절기를 사용하여, 300 K 및 1 atm에서 각각 일정하게 유지하였다. Berendsen et al., J Chem Phys 81:3684-3690(1984). 직접 상호작용을 위해 1.0 nm의 컷오프로 장거리 정전기 상호작용에 대해 빠르고 부드러운 입자-메시 에발트 적산법(Ewald summation)을 이용하였다. Darden et al., J Chem Phys 98:10089-10093(1993).
도 12a에 도시된 바와 같이, ASIC1a 삼합체를 갖고 91 DMPC 분자로 채워진 복합물에서 MSP1 단백질(PDB ID 코드 2MSC)의 결정 구조로부터 시작하여 나노디스크에 삽입된 ASIC1a의 모델을 수득하였다.
ELISA 검정. 아비딘(#21121; 피어스)을 탄산염-중탄산염 완충액(#C3041; 시그마)에서 2 ng/μL의 최종 농도로 희석시켰다. 생성된 아비딘 용액을 사용하여 96-웰 플레이트(웰당 25 μL)를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 0.05% 트윈-20(PBST)(웰당 150 μL)을 함유하는 포스페이트 완충 용액으로 1회 세척한 후, 37℃에서 1시간 동안, 각 웰에 25 μL의 비오틴화된 ΔhASIC1a 나노디스크 용액(2 ng/μL)을 첨가하고 항온처리하였다. PBST 완충액 단독 및 빈 나노디스크 용액(2 ng/μL)을 백그라운드 및 음성 대조군으로 각각 사용하였다. 항온처리 용액을 제거한 후, 생성된 플레이트를 PBST 완충액을 사용하여 1회 헹구고 PBST(웰당 150 μL) 중 5%(vol/vol) 젖을 함유하는 차단 용액과 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 차단 및 PBST 세척(1회) 후, 25 μL의 scFv-Fc 항체 용액(1%(vol/vol) 젖을 함유하는 PBST 중 10 μg/mL)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 생성된 플레이트를 HRP 검출에 적용하기 전에 PBST를 사용하여 8회 헹구었다. 염소 항-인간 Fc HRP-접합된 2차 항체(희석 인자 1:5,000; #A0170; 시그마) 및 항-M13 HRP-접합된 2차 항체(희석 인자 1:5,000; #27-9421-01; GE/아머샴(Amersham)/왓맨(Whatman))을 함유하는 용액을 상기 플레이트(웰당 50 μL)에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 플레이트를 PBST로 8회 세척하고, 이어서 50 μL 2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산]-디암모늄 염 용액(#11684302001; 로체)을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 20분의 항온처리 후, 각 웰의 405 nm에서 흡수 변화를 마이크로플레이트 판독기(엔스파이어(Enspire); 퍼킨엘머(PerkinElmer))에서 측정하였다.
친화도 결정. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 유세포 분석을 사용하여 단클론성 항체와 hASIC1a 간의 상호작용을 연구하였다. 비아코어 T200(GE 헬스케어)에서 SPR-결합 연구를 수행하였다. 항-플래그 항체는 바이오센서 칩 CM5 시리즈 S(GE 헬스케어)의 표면에 커플링된 아민이었다. 그 후, 재조합 플래그-태깅된 ΔhASIC1a를 칩 표면에 고정시켰다. 연속 희석된 항체 ASC06-IgG1(1, 5, 10, 50, 100 nM)을 25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 0.05% EDTA 및 0.05% DDM을 함유하는 실행 완충액(pH 7.4)에 적용하였다. 결합/해리의 동역학을 SPR 신호 공명 단위의 변화로서 측정하였다. 단일-사이클 동역학 모델을 갖는 비아코어 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 겉보기 결합 친화도를 계산하였다.
유세포 분석 결합 실험에서, ASIC1a-eYFP-발현 안정 세포(6H7)를 수집하고 매우 차가운 FACS 완충액(PBS, 0.05% BSA, 2 mM EDTA)에 재현탁하였다. 그 후, 동일한 수의 6H7 세포(튜브당 50,000개 세포)를 4℃에서 20분 동안 다른 농도의 ASC06-IgG1과 함께 항온처리하고, 1 mL의 매우 차가운 FACS 완충액으로 세척하고, 원심분리하고, 인간 Fc를 인식하는 Alexa555-접합된 2차 항체((1:800(vol/vol) 희석; 라이프 테크놀로지(Life Technology))를 함유하는 100 μL의 매우 차가운 FACS 완충액에 펠렛을 재현탁하였다. 4℃에서 15분 동안 항온처리한 후, 세포를 2회 세척하고 FACS 완충액에 재현탁하였다. 세포를 분류하고 유세포 분석기(사이토플렉스(CytoFLEX) S; 벡크만 컬터(Beckman Culter))에서 분석하여, hASIC1a를 과발현하는 안정한 세포주로의 항체의 상대적 결합 수준을 결정하였다. eYFP 양성 세포에서 Alexa555의 평균 형광 강도를 기록하고 분석하여 항체의 겉보기 결합 친화도를 계산하였다.
면역세포화학(ICC)을 이용한 세포 막 공존분석 연구. 세포(CHO-K1)를 폴리-D-라이신-코팅된 유리 바닥 24-웰 플레이트에 mL당 2 x 105 세포의 농도로 시딩하였다. 12시간의 배양 후, CHO-K1 세포를 리포펙틴 3000 시약에 의해 ASIC 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고 차단 용액(PBS 중 5% 염소 혈청)에서 30분 동안 항온처리하였다. 생성된 세포를 4℃에서 밤새 2 μg/mL ASC06-IgG1과 함께 항온처리한 후, 각각 5분 동안 3회 PBS 세척하고, Alexa555-접합된 염소 항-인간 2차 항체(라이프 테크놀로지)와 함께 항온처리하였다. 각각 5분 동안 3회의 추가 PBS 세척 후, 세포의 핵을 DAPI(#10236276001; 로체)로 염색하였다. 63x N.A. 1.4 대물렌즈(objective)를 갖는 레이저 스캐닝 공초점 현미경(제이스(ZEISS) LSM710)에서 ICC 분석을 25℃에서 수행하였다. 이미지를 1,024 x 1,024 픽셀 EM-CCD 카메라에서 수집하였다. 젠(ZEN) 2012 전문 소프트웨어로 데이터 취득 및 분석을 수행하였다.
전기생리학적 실험. 패치-클램프 증폭기(액손(Axon) 200B; 액손 인스트루먼트(Axon Instruments))에 의한 표준 전-세포 기록 기술을 사용하여 내부 세포상 ASIC1a 전류를 단일 세포로부터 기록하였다. 디지데이터(Digidata) 1320A 인터페이스 및 클램프엑스(Clampex) 및 클램프핏(Clampfit) 소프트웨어(버전 9.0.1; 액손 인스트루먼트)를 가진 개인용 컴퓨터를 사용하여 막 전류를 샘플링하고 분석하였다. 전형적인 실험을 위해, 사용된 세포외액(ECF)은 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM D-글루코스, 2 mM CaCl2 및 1.0 mM MgCl2을 함유하였고, 이때 삼투압이 320-335 mOsm 범위였고, 5 M NaOH로 조정되어 pH 7.4였다. 패치 전극(4-6 MΩ)은 300 mOsm에서 30 mM NaCl, 120 mM KCl, 0.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2 mM MgATP 및 5 mM EGTA(5 M KOH로 조정된 pH 7.2)를 함유하였다. ASIC1a 활성화 ECF는 pH 6.0으로 ECF를 유지하기 위해 MES를 사용하여 HEPES를 대체한 점을 제외하면, 보통의 ECF와 동일하다. 표면에 분리되어 분포된 개별 CHO-ASIC1a 안정 세포(6H7)를 갖는 커버슬립을 도립 현미경에 장착된 에이엘에이(ALA) 8 채널 관류 시스템(에이엘에이 사이언티픽 인스트루먼트 주식회사(ALA Scientific Instruments Inc.))에 의해 생성된 일정한 관류(~2-3 mL/분) 하에 기록 챔버에 놓아 두었다. 브레이크-인(break-in)(전-세포) 구성을 달성한 후, 세포를 -70 mV의 유지 전위(holding potential)로 전압 고정시켰다. 보통의 ECF(pH 7.4)를 먼저 패치 세포(patched cell)에 관류한 후, pH 6.0의 활성화 ECF를 빠르게 적용하여 최대 내부 ASIC1a 전류를 대조군 전류로서 유도하였다. 항체의 억제 효과를 테스트할 때, 상이한 농도의 ASC06-IgG1을 함유하는 pH 7.4의 ECF를 저농도로부터 고농도까지 10-15분 동안 기록 챔버로 관류하였다. 전류 억제를 측정하기 위해, 해당 농도의 테스트 항체를 함유하는 pH 6.0의 활성화 ECF를 패치된 동일한 6H7 세포에 적용하여 동일한 세포의 대조군 전류로 정규화될 수 있는 내부 전류를 생성하였다. 소분자 억제제 아밀로라이드(#S1811; 셀렉(Selleck)) 및 독 펩티드 PcTx1(#4435s; 펩티드 인스티튜트(Peptide Institute))를 각각 30 μM 및 100 nM의 농도로 ASIC1a 전류 억제를 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 4 내지 5개 세포로부터 취득한 데이터를 억제 효과의 통계적 계산에 사용하였다.
정상 상태 둔감화(SSD) 측정을 위해, 조건형성 ECF의 pH를 (HEPES 완충액 중) 7.6, 7.4, 7.2, 7.0 및 6.8로 조정한 반면, 활성화 ECF를 (MES 완충액 중) pH 6.0으로 유지하였다. 6H7 안정 세포에서 hASIC1a의 pH 활성화 측정을 위해, 조건형성 ECF를 (HEPES 완충액 중) pH 7.6으로 고정하고, 활성화 ECF의 pH를 7.4, 7.2, 7.0, 6.8, 6.5, 6.3 및 6.0으로 조정하였다. 안정 세포주 6H7이 300 nM ASC06-IgG1의 존재 및 부재 하에 패치될 때 hASIC1a 전류를 기록하였다. 센서그램(I/I최대)에서 최대 진폭의 분수로 표현된 상대 전류를 계산하고 플롯팅하여 SSD 및 pH 활성화 프로파일을 구성하였다. 각각의 데이터 포인트를 패치된 적어도 5개 세포의 평균을 나타낸다.
칼슘 유입. FLIPR 칼슘 5 검정 키트를 사용하여 hASIC1a-mCherry-발현 안정 CHO-K1 세포(4C12)에서 산-유도된 칼슘 유입을 결정하였다. 세포를 검정 24시간 전에 웰당 10,000개의 밀도로 투명한 바닥 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 검정 완충액 및 염료 로딩 완충액(1.26 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.4 mM MgSO4, 5.33 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 4.17 mM NaHCO3, 138 mM NaCl, 0.338 mM Na2HPO4, 20 mM HEPES, pH 7.4)을 제조사의 지침에 따라 제조하였다. 프로페네시드(Probenecid)를 사용 직전에 2.5 mM의 최종 농도로 염료 로딩 완충액에 첨가하였다. ASC06-IgG1을 함유하는 검정 완충액 50 마이크로리터를 37℃에서 30분 동안 4C12 세포와 항온처리하고, 동일한 부피의 염료 로딩 완충액을 첨가하였다. 아밀로라이드뿐만 아니라 PcTx1 및 동종형 항체를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 FDSS/μ셀(μCELL) 플레이트 판독기(하마마츠(Hamamatsu))에서 판독하기 전에 염료 로딩 완충액과 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 100 μL의 pH 6.0 활성화 완충액(검정 완충액과 동일한 조성; pH는 6.0으로 조정됨)을 50 μL/s의 속도로 세포에 첨가하였다. FDSS/μ셀(여기 파장: 480 nm, 방출 파장: 540 nm) FLIPR 판독기에서 활성화 완충액(사전판독)를 추가하기 전 10초 동안, 그리고 추가 후 170초 동안 각 웰에서 생성된 칼슘 신호의 진행 곡선을 연속적으로 기록하였다. ASIC1a 매개 전류의 억제에서 ASC06-IgG1의 IC50 값을 결정하기 위해, ASC06-IgG1의 1:3 연속 희석을 각 농도에 대해 6회 반복하여 4C12 세포에 적용하였다.
산증-유도된 세포 죽음. hASIC1a-eYFP 안정 세포(6H7) 및 CHO-K1 세포를 처리 1일 전에 웰당 10,000개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. pH 5.5, 6.0 및 7.4의 ECF 용액을 사용하여 37℃에서 6시간 동안 세포를 처리하였다. ASC06-IgG1의 구조 효과(rescuing effect)를 테스트하기 위해, 산성 ECF(pH 5.5)에 항체를 용해시켜 최종 항체 농도를 0, 50, 100, 300, 500 및 1,000 nM으로 만들었다. 세포 배지에서 30분 동안 37℃에서 해당 농도의 항체와 6H7 세포를 먼저 사전항온처리하였다. 세포 배지를 해당하는 산성 ECF로 교체한 후, 세포를 37℃에서 6시간 동안 항온처리하고, PBS 완충액(pH 7.4)으로 세척한 후, 1% FBS DMEM/F-12K 배지에서 밤새 배양하였다. LDH 검정 키트(#88953; 서모피셔 사이언티픽)를 사용하여 LDH 방출 측정을 위해 밤샘 배양의 상청액을 수집하였다. 세포 생존력을 CCK-8 검정 키트(#CK04; 도진도(Dojindo))를 사용하여 결정하였다.
중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO) 모델. 동물 관리 및 실험 프로토콜은 중국 상하이 소재의 상하이 지아오 통 의학 대학교(Shanghai Jiao Tong University School of Medicine)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았다. 좌뇌 반구의 일시적인 허혈성 뇌졸중은 재관류 전 1시간 동안 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO)을 이용하여 수컷 마우스(C57 BL/6, 20-25 g)에서 확립되었다. 허혈 3시간 후, 신경보호제의 부재 또는 존재 하에 총 4 μL의 비히클 용액(PBS)(100 nM PcTx1 또는 3.0 μg/μL 엔도톡신-미포함 ASC06-IgG1(20 μM)))을 뇌 반구의 대측하는 측면에서 뇌실내(i.c.v) 주사에 의해 투여하였다. 관련 없는 엔도톡신-미포함 항체(3.0 μg/μL, 20 μM)를 동종형 대조군으로 사용하였다. 허혈이 성공적으로 유도되었는지 보장하기 위해 경두개(transcranical) 레이저 도플러에 의해 뇌의 혈류를 모니터링하였다. i.c.v. 주사 24시간 후 마우스를 희생시켰다. 마우스 뇌를 신속하게 해부하고 일련의 간격의 슬라이스로 횡방향 절단한 후, 2%의 생체 염료 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 하이드로클로라이드(TTC)로 염색하였다. 허혈 반구의 TTC로 염색된 정상 면적을 비허혈 반구의 면적으로부터 차감하여 경색 면적을 계산하였다. 모든 단면의 경색 면적을 합하고 슬라이스 두께를 곱하여 경색 부피를 계산하였다.
데이터 분석. 달리 표시하지 않는 한, 결과를 평균 ± SD로 표시하였다. 오리진프로(OriginPro) 2017 통계 소프트웨어를 사용하는 일원 아노바(ANOVA)에 의해 데이터 분석을 수행하였다. 유의성을 P 값 <0.05로 가정하였다.
실시예 2: 나노디스크를 사용하여 hASIC1a에 대한 기능성 항체의 선택
절단된 ASIC1a(아미노산 13-464; ΔhASIC1a)를 과발현시키고 정제하여 가용성 hASIC1a-디스플레이 시스템을 조립하였다. 천연-유사 막 환경을 모방하고 hASIC1a의 자연적인 세포외 형태를 유지하기 위해, 절단된 인간 ASIC1a 단백질을 본원에 기재된 바와 같이, 나노디스크에 조립시켰다. ΔhASIC1a의 첨가를 제외하고 동일한 절차를 이용하여 빈 나노디스크를 제조하였다. ΔhASIC1a-로딩된 나노디스크(ΔhASIC1a 나노디스크)를 수퍼로즈 6 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 정제하였다. ΔhASIC1a 나노디스크의 조성을 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. 도 12a에 도시된 바와 같이, ΔhASIC1a 단백질과 MSP1 단백질이 나노디스크에 존재하였다. 나노디스크에서 ΔhASIC1a 단백질은 SDS-PAGE 분석에 의해 판단하였을 때, 90% 초과의 순도였다. 막 스캐폴드 단백질 1(MSP1) 및 단량체 ΔhASIC1a에 해당하는 SDS/PAGE 밴드의 농도계 분석은 MSP1과 ΔhASIC1a의 몰비가 ~2:3임을 밝혀내었다. ΔhASIC1a 나노디스크와 빈 나노디스크를 동적 광 산란에 의해 분석하였다. 도 12b에 도시된 바와 같이, 각각의 나노디스크는 하나의 피크만을 나타내었고, 이는 나노디스크가 균질하다는 것을 시사한다. 조립된 ΔhASIC1a 나노디스크의 겉보기 직경은 약 15.5 nm인 반면, 빈 나노디스크는 약 9.9 nm의 겉보기 크기를 가졌으며(도 12b), 이는 ΔhASIC1a 나노디스크에 ΔhASIC1a 단백질이 혼입된 바와 일치한다(도 12b). 도 12b에 도시된 바와 같이, ΔhASIC1a 나노디스크의 계산 모델은 세포외 도메인(ECD)로부터 나노디스크의 하단 가장자리까지의 거리를 ~14.8 nm로 계산하였으며, 이는 가장 큰 거리로 계산되었다.
1011 구성원을 함유하는 파지에서 인간 scFv 조합 항체 라이브러리의 패닝을 위해 비오틴화된 나노디스크를 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드와 조합하여 사용하였다. 파지미드와 나노디스크 구조의 비특이적 상호작용을 최소화하기 위해, 빈 나노디스크를 사용하는 차등 농축 전략을 본원에 기재된 바와 같이 사용하였다. 3회의 패닝 후, 6개의 농축 서열(enriched sequence)을 획득하고, 6개의 항체를 scFv 형식으로 정제하고 ASC01-ASC06으로 명명하였다.
도 19a 및 19b는 ASC01의 중쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 각각 도시한다. 도 20a 및 20b는 ASC01의 경쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 각각 도시한다. ASC02의 중쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 도 21a 및 21b에 각각 도시된다. ASC02의 경쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 도 22a 및 22b에 각각 도시된다. ASC03의 중쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 도 23a 및 23b에 각각 도시된다. ASC03의 경쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 도 24a 및 24b에 각각 도시된다. ASC04의 중쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 도 25a 및 25b에 각각 도시된다. ASC04의 경쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 도 26a 및 26b에 각각 도시된다. ASC05의 중쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 도 27a 및 27b에 각각 도시된다. ASC05의 경쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 도 28a 및 28b에 각각 도시된다. ASC06의 중쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 도 29a 및 29b에 각각 도시된다. ASC06의 경쇄 가변성 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 도 30a 및 30b에 각각 도시된다.
실시예 3: ΔhASIC1a-나노디스크에 대한 결합 능력
빈 나노디스크와 비교하여 ΔhASIC1a-나노디스크에 대한 scFv 형식의 ASC01-ASC06 항체의 결합 능력을 ELISA를 이용하여 평가하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, ΔhASIC1a 나노디스크에서 관찰된 ELISA 신호는 빈 나노디스크에서 관찰된 신호보다 더 컸으며, 이는 나노디스크의 ΔhASIC1a 구성요소에 특이적인 scFv 항체의 풍부함을 시사한다. 그 후, 항체의 친화도를 측정하였다. 하기 표는 옥텟 시스템을 이용하여 측정하였을 때, ΔhASIC1a-나노디스크에 대한 ASC01-ASC06(scFv 형식)의 결합 친화도를 보여준다. ASC04와 ASC06은 ΔhASIC1a 나노디스크에 대해 가장 강한 친화도를 나타내었다.
Figure pct00004
실시예 4: 세포 표면 상에 발현된 ASIC1a 단백질에 대한 ASC01-ASC06의 결합
ASC01-ASC06이 세포 표면 상에 발현된 ASIC1a 단백질에 특이적으로 결합하는지 여부를 이해하기 위해, CHO-K1/hASIC1a 세포에 대한 항체의 결합을 면역세포화학을 이용하여 평가하였다. CHO-K1/hASIC1a 세포는 eYFP와 융합된 전장 hASIC1a(1-528개 아미노산) 단백질을 과발현한다. 면역세포화학(ICC) 연구는 세포 표면 상에 발현된 eYFP(초록색)를 나타내었다. 도 2에 도시된 바와 같이, ASC02, ASC03, ASC04 및 ASC06(빨간색)은 ASC01 및 ASC05에 비해 hASIC1a-eYFP를 발현하는 세포의 원형질막에 더 많이 국부화되어 있다. ASC06은 다른 항체에 비해 염색된 막에서 hASIC1a-eYFP와 더 많은 공동-국부화를 나타내었다. ASC01-ASC05는 특정 ASIC1a 확인 또는 하위집단을 인식할 가능성이 있다.
추가적인 연구를 위해 ASC06 항체를 전장 IgG1 형태(ASC06-IgG1)로 전환시켰다. ASC06-IgG1 및 ASC06의 정제 후 수율은 ~78 mg/L으로 유사하였다. 도 12d에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE 분석은 단일 쇄(ASC06) 및 전장(ASC06-IgG1) 항체가 90% 초과의 순도였으며, 예상된 위치에서 단백질 밴드를 나타내었음을 시사하였다. CHO-K1/hASIC1a 세포에 대한 ASC06-IgG1의 결합을 ASC06(scFv 형식) 항체와 비교하여 면역세포화학을 이용해 평가하였다. 도 3a에 도시된 바와 같이, ASC06-IgG1은 ASC06과 같은 세포 표면에서 hASIC1a와 막 공동-국부화를 나타내었다.
또한, ASC06-IgG1의 결합 특이성은 ASIC1a KO 마우스(ASIC1a-/-)로부터의 1차 피질 뉴런을 사용하여 도시되었다. 예상대로, KO 마우스로부터의 1차 뉴런은 융합된 미분 간섭 대비(DIC) 현미경 사진에서 ASC06-IgG1에 대한 명확한 결합을 나타내지 않았다. 도 10b에 도시된 바와 같이, 뉴런을 hASIC1a-mCherry로 일시적으로 형질감염시켰을 때, 뉴런 막 상의 hASIC1a 발현을 ASC06-IgG1에 의해 입증하고 시각화하였다. 더욱이, 신경염에서 ASC06-IgG1 신호의 증폭된 사진은 일시적으로 발현되어 ASC06-IgG1-표지된 hASIC1a가 주로 뉴런의 시냅스후 수상돌기에 위치함을 보여주고 있다(도 10b).
실시예 5: 정제된 ΔhASIC1a 단백질에 대한 ASC06-IgG1의 결합 친화도
정제된 ΔhASIC1a 단백질에 대한 ASC06-IgG1의 결합 친화도를 표면-플라즈몬-공명(SPR)을 이용하여 측정하였다. Fc와 융합된 독 펩티드 PcTx1(PcTx1-Fc)을 ΔhASIC1a 단백질로의 결합에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, PcTx1-Fc는 ΔhASIC1a 단백질로의 결합에 대해 1.0 nM의 겉보기 Kd를 나타내었으며, 이는 문헌의 보고와 일치한다. Hoagland et al., J Biol Chem 285:41852-41862(2010). 도 3b에 도시된 바와 같이, ASC06-IgG1은 비아코어 T200 기기를 사용하여 SPR에 의해 측정하였을 때, 정제된 ΔhASIC1a 단백질로의 결합에 대해 7.9 nM의 겉보기 KD 값을 나타내었다. 양성 대조군으로서, Fc와 융합된 독 펩티드 PcTx1(PcTx1-Fc)을 사용하였다.
실시예 6: 세포 표면 상에 발현된 ASIC1a 단백질에 대한 ASC06-IgG1의 결합 친화도
세포 표면 상에 발현된 전장 hASIC1a 단백질에 대한 ASC06-IgG1의 결합 친화도를 정량적 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 결정하였다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 겉보기 EC50 값(최대 결합의 50%를 제공하는 농도)은 2.06 ± 0.01 nM로 결정되었으며, 이는 정제된 ΔhASIC1a에 대해 측정된 KD 값(7.9 nM)과 일치하여 절단된 hASIC1a 및 세포 표면 발현된 전장 hASIC1a가 유사한 세포외 형태를 공유한다는 것을 시사한다.
실시예 7: ASC06-IgG1의 결합 선택성
ASC06-IgG1의 종 및 서브타입 선택성을 테스트하기 위해, 인간 ASIC1b-eYFP 융합, 래트 ASIC1a-eYFP 융합, 마우스 ASIC1a-eYFP 융합, hASIC2a-eYFP 융합, hASIC2b-eYFP 융합 및 hASIC3a-eYFP 융합을 암호화하는 벡터를 구성하였다. CHO-K1 세포를 이들 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. FACS 결합 검정 및 면역세포화학(ICC)을 수행하여 ASC06-IgG1이 세포 표면-발현된 ASIC 동족체 및 동종형에 결합할 수 있는지 여부를 결정하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, ICC 염색은 인간과 설치류 ASIC1a 사이의 높은 서열 상동성과 일치하는 hASIC1a-eYFP, rASIC1a-eYFP 및 mASIC1a-eYFP와 ASC06-IgG1의 막 공동-국부화를 보여주었다. 도 4b에 도시된 바와 같이, FACS 결과로 밝혀진 바는, ASC06-IgG1이, ASIC1a의 인간/마우스/래트 동족체만 인식하였으나, 다른 ASIC1 서브타입 hASIC1b, hASIC2a, hASIC2a/2b 또는 hASIC3a에 대해서는 그렇지 않아서, ASC06-IgG1 항체의 서브타입 선택성을 나타낸다는 점이다.
실시예 8: 세포 배양에서 ASC06-IgG1의 효능: 패치 클램프 실험
ASC06-IgG1의 기능을 전기생리학 접근법을 이용하여 특성화하였다. 세포에서 산 유도된, hASIC1a-매개된 전류에 대한 ASC06-IgG1 항체의 효과를 분석하였다. PcTx1을 양성 대조군으로 사용하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 전-세포 기록 방식은 세포외 pH 값을 (pH 7.4에서 pH 6.0으로) 감소시키면 안정한 세포주를 과발현하는 hASIC1a에서 전류가 형성되는 것을 보여주었다. 안정한 세포의 hASIC1a-매개된 내부 전류의 진폭을 기록하고 ASC06-IgG1의 부재 및 존재 하에 정량화하였고, 이때 독 펩티드 PcTx1(100 nM)을 양성 대조군으로 사용하였다. 도 5b-5c에 도시된 바와 같이, ASC06-IgG1은 85 ± 6 nM의 겉보기 IC50 값으로 최대 80%의 산(pH 6.0)-유도된 전류의 지속적이면서(30분) 투여량-의존적인 억제를 나타내었다. 대조적으로, 도 5a 및 5c에 도시된 바와 같이, 양성 대조군 PcTx1은 전류의 거의 완전한 억제를 나타내었다. 세척 후 항체의 지속적인 억제와 달리, PcTx1의 억제는 5분 이내로 쉽게 세척될 수 있었다(도 5c).
ASC06-IgG1이 hASIC1a 전류를 차단한 매커니즘을 이해하기 위해, ASC06-IgG1의 부재 및 존재 하에 hASIC1a의 pH 활성화 및 SSD를 조사하였다. SSD 곡선 및 hASIC1a에 대한 pH 활성화 곡선의 pH50(ASIC1a 채널의 50%를 개방할 수 있는 세포외 pH의 하락) 값을 측정하고 300 nM ASC06-IgG1이 있거나 없는 경우와 비교하였다. 도 11a-11b에 도시된 바와 같이, SSD는 상이한 pH 값을 가진 조건형성 세포외액(ECF) 및 pH 6.0의 활성화 ECF를 적용할 때 유도된 반면, pH 활성화 곡선은 다양한 pH 값을 가진 활성화 ECF 및 pH 7.6의 조건형성 ECF를 적용할 때 구성되었다. 300 nM ASC06-IgG1이 있는 경우 SSD의 pH50 값 및 pH 활성화에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 또한, 도 16a-16b에 도시된 바와 같이, ASC06-IgG1은, ASC06-IgG1 처리/미처리된 ASIC1a 전류의 활성화 및 SSD 둘 모두의 대표적인 트레이스에서 보여지는 바와 같이, SSD나 ASIC1a의 활성화를 방해하지 않았다. 따라서, ASC06-IgG1은 양성자 농도와 비경쟁적인 메커니즘을 이용하여 hASIC1a의 활성화를 차단하는 듯하였다.
실시예 9: 세포 배양에서 ASC06-IgG1의 효능: ASC06-IgG1에 의한 ASIC1a 매개된 칼슘 유입의 억제에 대한 FLIPR-기반 검정
ASIC1a의 칼슘 유입을 hASIC1a-mCherry 융합을 발현하는 안정한 세포주 4C12를 사용하여 FLIPR 기기에서 측정하였다. ASC06-IgG1 항체가 세포 내 산 유도된, hASIC1a-매개된 칼슘 유입에 미치는 영향을, FLIPR 기기를 사용하여 칼슘 민감성 염료(칼슘 5, 몰큘러 디바이스(Molecular Devices))의 세포내 형광 신호를 측정함으로써 분석하였고, 여기서 hASIC1a-mCherry 융합을 발현하는 안정한 세포주를 이용하였다. 4C12 세포에서, 기록의 10초째에 pH 6.0에서 동종 hASIC1a의 활성화가 강한 칼슘 유입을 유도하는 듯하였고, 반면에 산-유도된 칼슘 유입은 hASIC1a 발현이 없이 CHO-K1 세포에 대해 관찰되지 않았다(도 17a). 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이, 기록 10초째에 안정한 세포에서 pH 6.0의 동종 hASIC1a 채널의 활성화가 강한 칼슘 유입을 유도하는 것으로 나타났다. hASIC1a 특이적 항체인 ASC06-IgG1은 2.9 ± 0.2 nM의 IC50으로 칼슘 유입의 투여량-의존적 억제를 나타내었다. 대조적으로, 도 17b에 도시된 바와 같이, 비선택적 소분자 ASIC 차단제인 아밀로라이드는 30 μM에서 21%의 억제만을 나타내었다.
실시예 10: ASC06-IgG1의 pH 안정성
산성 조건에 대한 ASC06-IgG1의 내성을 테스트하였다. 농축된 ASC06-IgG1 용액(3.3 μM)을 37℃에서 6시간 동안 상이한 pH 값(7.4 내지 5.0)에서 항온처리하고, SEC-HPLC 분석을 수행하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, ASC06-IgG1의 유의미한 분해 또는 응집이 관찰되지 않았다.
실시예 11: ASC06-IgG1이 시험관내 산증-유도된 세포 죽음을 방지함
뇌졸중 또는 허혈-재관류 손상에서 세포외 산증은 ASIC1a 채널의 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이는 아마도 ASIC1a에 의해 매개되는 세포내 칼슘 및 관련 세포 신호전달의 일시적인 증가를 통해 중추 신경계에서 신경세포 죽음을 초래한다. hASIC1a 과발현 안정 세포의 생존을 세포질 데하이드로게나제의 효소 활성(CCK8 검정) 및 세포 배지로 분비되는 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 농도를 측정함으로써 평가하였고, 이들은 세포 생존력 및 세포독성을 각각 반영한다. 도 7a 및 7b에 도시된 바와 같이, ASIC1a 안정 세포주(오른쪽 패널)는 특히 pH 5.5에서 대조군 CHO-K1 세포보다 더 높은 정도의 pH 민감성을 나타내었으며, 이는 관찰된 산에 대한 향상된 반응이 막에서 hASIC1a 채널을 통해 매개되었음을 시사한다. 동일한 실험 조건 및 pH 5.5에서, ASC06-IgG1은 상당한 투여량-의존적 보호 효과를 나타내었다(도 7c 및 7d). 1 μM ASC06-IgG1의 존재 하에, 안정한 세포를 발현하는 ASIC1a의 대략 45%는 항체의 부재 하에서는 약 5% 생존율인 것과 비교할 때, pH 5.5에서 생존하였다. 또한, CCK8 결과와 일치하게, 세포 배지로 방출된 LDH의 농도가 ASC06-IgG1의 첨가 후 감소하였고, 이 또한 투여량-의존적 방식이었다(도 7d).
이러한 결과는 본 기술의 항-ASIC1a 항체가 산증-유도된 세포 죽음을 예방하기 위한 방법에 유용하다는 것을 입증한다.
실시예 12: ASC06-IgG1가 생체내 산증-유도된 세포 죽음을 방지함
시험관내 항체 ASC06-IgG1의 보호 효과가 생체내 병리학으로 확장될 수 있는지를 결정하기 위해, 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO) 모델을 이용하여 항체의 신경보호 효과를 연구하였다. 재관류 전 60분 동안 마우스의 좌뇌 반구에 MCAO에 의해 허혈을 유도하였다. 도 8a에 도시된 바와 같이, 허혈 유도 3시간 후, 100 nM의 PcTx1 또는 3.0 μg/L의 ASC06-IgG1을 함유하는 비히클 용액(PBS) 총 4 μg을 마우스의 대측성 반구에 뇌실내(i.c.v.) 주사하였다. ASC06-IgG1과 동일한 농도를 갖는 관련 없는 항체(동종형)를 음성 대조군으로 투여하였다. 피질 및 선조체(striatum)의 경색 부피를 주사 24시간 후에 계산하였다. 도 8b에 도시된 바와 같이, 허혈은 PBS 그룹에서 뇌에 현저한 경색(대측성 뇌 영역과 비교할 때 대략 42% 부피)을 유도하였다. PcTx1은 경색 부피를 약 17%로 감소시켰다(도 8b). 동종형 항체는 어떠한 보호 효과도 나타내지 않았다. 반면에, ASC06-IgG1로 처리된 그룹은 PcTx1과 마찬가지로 유의미하게 감소된 경색 부피(약 23% 감소)를 나타내었으며, 이는 뇌졸중에 대한 항체의 강력한 신경보호 효과를 시사한다(도 8b).
이러한 결과는 본 기술의 항-ASIC1a 항체가 산증-유도된 세포 죽음을 방지하고 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위한 방법에 유용하다는 것을 입증한다.
실시예 13: hASIC1a의 형태학적 에피토프에 결합되는 ASC06-IgG1
본원에 입증된 바와 같이, 항체 ASC06-IgG1은 정제된 ASIC1a 단백질 및 세포 표면 상에 발현된 ASIC1a 단백질을 인식하고 이에 결합할 수 있는 것으로 나타났다. ASC06-IgG1과 hASIC1a 사이의 상호작용을 특성화하기 위해, hASIC1a-eYFP 융합 단백질을 발현하는 6H7 안정 세포주를 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 도 13a에 도시된 바와 같이, ASC06-IgG1은 웨스턴 블롯 검정에서 ASIC1a를 과발현하는 세포의 세포 용해물에서 hASIC1a를 인식할 수 없었다. 대조적으로, 상업용 염소 다클론성 항-ASIC1 항체 및 항-eYFP 항체 둘 모두는 약 100 kDa의 분자량으로 6H7 용해물에서 hASIC1a-eYFP 단백질을 검출할 수 있었다(도 13a 및 데이터는 도시되지 않음). 이러한 관찰은 항체가 형태 의존적 방식으로 ASIC1a를 인식하였음을 시사한다.
ASC06-IgG1을 이용하여 세포 용해물에서 천연 hASIC1a-YFP를 끌어당긴 후 hASIC1a-YFP 검출을 위해 항-eYFP 웨스턴 블롯을 수행하였다. 도 13b에 도시된 바와 같이, hASIC1a-eYFP를 나타내는 ~100 kDa의 명확한 밴드가 관찰되었으며, 이는 ASC06-IgG1이 형태-의존적 방식으로 hASIC1a를 인식하였음을 시사한다.
hASIC1a에 대한 ASC06의 결합 성질을 이해하기 위해, hASIC1a-ECD 및 ASC06-Fab를 혼합하여 복합물을 형성하였다. 복합물, hASIC1a-ECD 및 ASC06-Fab를 겔 여과를 이용하여 분리하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, hASIC1a-ECD는 용액에서 동종삼합체로 존재하였으며, 3개의 ASC06-Fab과 안정한 복합물을 형성하였다.
항체 결합의 성질을 추가로 이해하기 위해, Fab 형식의 ASC06(ASC06-Fab) 및 hASIC1a(hASIC1a-ECD)의 엑토도메인의 복합물로 음성 염색 EM 연구를 수행하였다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 미처리된 음성 염색 EM 이미지는 대부분의 입자가 형성된 복합물에 대해 삼각형 배열을 나타내는 것을 드러내고 있으며; 한편, 부메랑 형상 및 다른 형상의 입자도 관찰되었고, 이는 1개 또는 2개의 ASC06-Fab이 누락된 복합물을 나타낼 가능성이 있다. 도 9a에 도시된 바와 같이, EM 결과는 각각의 ASC06-Fab이 hASIC1a-ECD-ASC06-Fab 복합물에 결합되어 있음을 보여준다. 도 9d에 도시된 바와 같이, 분자 동역학 모의실험 모델에 기반하여 ASIC1a의 여러 아미노산이 hASIC1a에 대한 ASC06-IgG1의 결합에 중요할 것으로 예측되었다. 도 9c에 도시된 바와 같이, 2D 평균 분석 결과, 명확한 도메인 분할을 갖는 삼각형의 복합물이 보여지며, 이는 hASIC1a-ECD의 삼량체 구성에 대한 ASC06-Fab의 상호작용을 나타낸다. 분자 도킹 및 분자 동역학 모의실험을 조합하여, 명백한 실험 기하구조를 조악하게 재현하는 모델을 얻었다(도 9d). 도 9a-9c에 도시된 바와 같이, 에피토프는 2개의 hASIC1a-ECD 서브유닛에 의해 형성된 표면에 위치하였다.
이러한 아미노산의 역할을 확인하기 위해, 알라닌 돌연변이유발을 수행하였고, 4개의 아미노산이 항체 결합에 매우 중요함을 확인하였다. hASIC1a-eYFP의 단일 아미노산 돌연변이를 암호화하는 플라스미드를 구성하고, CHO-K1 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 그 후, FACS 결합 검정을 수행하여 ASC06-IgG1이 돌연변이된 hASIC1a를 발현하는 세포 표면에 여전히 결합하는지 여부를 테스트하였다. 도 9e에 도시된 바와 같이, ASC06-IgG1에 결합할 수 있는 WT hASIC1a와 달리, hASIC1a Y360A 돌연변이 또는 hASIC1a N322A 돌연변이는 ASC06-IgG1의 결합 능력을 감소시키고; hASIC1a Y318A 돌연변이는 ASC06-IgG1의 결합을 파괴하고, 이는 hASIC1a F252A 돌연변이도 마찬가지이다.
균등물
본 기술은 본 기술의 개별 양태의 단일 예시로서 의도된 본 출원에 기재된 특정 실시양태의 측면으로 한정되어서는 안된다. 본 기술의 많은 수정 및 변형이 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있으며, 이는 당업자에게 자명할 것이다. 본원에 열거된 것들에 외에도, 본 기술의 범위 내에서 기능적으로 동등한 방법 및 장치가 전술한 설명들로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 수정 및 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하도록 의도된다. 본 기술은 첨부된 청구항의 조건과 함께 상기 청구항에게 주어지는 균등물의 전체 범위에 의해서만 한정되어야 한다. 이러한 본 기술은 물론 다양할 수 있는, 특정 방법, 시약, 화합물 조성 또는 생물학적 시스템으로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하려는 목적일 뿐, 한정지으려 의도되지 않았음을 이해해야 한다.
또한, 본원의 특징 또는 양태가 마쿠쉬(Markush) 그룹의 측면에서 설명되는 경우, 당업자는 본원이 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 그룹의 측면에서도 그에 따라 설명된다는 점을 인식할 것이다.
당업자에 의해 이해된 바와 같이, 임의의 모든 목적을 위해, 특히 서면 설명을 제공하는 측면에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 그리고 모든 가능한 하위 범위 및 이들의 하위 범위의 조합을 포함한다. 임의의 나열된 범위는 적어도 동일한 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 나누어지는 동일한 범위를 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 논의된 각 범위는 하위 1/3, 중간 1/3, 상위 1/3 등으로 쉽게 나누어질 수 있다. 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, "최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 기재된 수를 포함하고, 상기 논의된 바와 같이 후속하여 하위 범위로 나누어질 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해된 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2 또는 3개의 세포를 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게는, 1-5개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 세포를 갖는 그룹 등을 지칭한다.
본원에 지칭되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 간행물은 이들이 본 명세서의 명시적 교시와 불일치하지 않는 정도까지, 모든 도면 및 표를 포함하여 그 전체가 참조로 포함된다.
다른 실시양태는 다음의 청구항 내에 기술된다.
SEQUENCE LISTING <110> ShanghaiTech University <120> ASIC1 CHANNEL ANTAGONIST ANTIBODY <130> 2019.7.23 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 caggtgcagc tggtggagac tggcccccga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctccggtgg ctccatcaat agtggcggtt actactgggg ctggatccgc 120 cagcattccg ggaagggcct ggagtggatt ggctacatct atcccagggg gagcagctac 180 tacaacccgt ccctcaggag tcgagttacc atatcagcag acacgtctag gaataacttc 240 tccctgaagt tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagtc 300 ggttatacgg gtgcttttga tatctggggc caaggcaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln His Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile 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tacggtatgg acgtctgggg ccaagggact acggtcaccg tctcctca 348 <210> 32 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 33 Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Asn 1 5 10 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 34 Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 35 Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Val 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Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 105 110 Thr Val Leu Gly 115 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 38 Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Arg Ile Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 39 Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 40 Ala Ile Trp His Ser Ser Ala Trp Val 1 5 <210> 41 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 41 caggtgcagc tggtggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgagggtt 60 tcctgcaagg catctggata cagtttcacc aactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaatt atcagcccta gtggtcgtag cacaagcttc 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atgcatttga gcagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaggggcg 300 tggtccactg atgcttttga tatctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 42 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Ser Pro Ser Gly Arg Ser Thr Ser Phe Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Trp Ser Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 43 Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 44 Ile Ile Ser Pro Ser Gly Arg Ser Thr Ser Phe Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 45 Gly Ala Trp Ser Thr Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 46 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 46 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggg agttataacc ttgtctcctg gtaccaacag 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgagggca gtaagcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240 caggctgagg atgaggctga gtatcactgc agctcattta caggcaaggg ttatgtcttc 300 ggaactggga ccaagctgac cgtcctaggt ggcctcggg 339 <210> 47 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 47 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr His Cys Ser Ser Phe Thr Gly Lys 85 90 95 Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Leu 100 105 110 Gly <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 48 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 49 Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 50 Ser Ser Phe Thr Gly Lys Gly Tyr Val 1 5 <210> 51 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 51 caggtacagc tgcagcagtc agggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatagt 300 ttctatgggt atagcaaggg ggactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Phe Tyr Gly Tyr Ser Lys Gly Asp Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 53 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 54 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 55 Asp Ser Phe Tyr Gly Tyr Ser Lys Gly Asp 1 5 10 <210> 56 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 56 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt gcttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120 cagccaggca aagcccccaa actcatgatt tatggggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacgcggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cacttatgtc 300 ttcggaactg ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 57 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 57 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ala Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 58 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr Val Ser Trp 1 5 10 15 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 59 Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 60 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Val 1 5 10

Claims (39)

  1. 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    VH가 서열번호 3, 13, 23, 33, 43 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34, 44 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35, 45 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고;
    VL이 서열번호 8, 18, 28, 38, 48 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 서열번호 10, 20, 30, 40, 50 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    허혈성 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 동종형의 Fc 도메인을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 ASIC1a 단백질에 결합하는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 ASIC1a의 세포외 도메인에 결합하는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결(span)하는 에피토프에 결합하는 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 양성자-유도된 ASIC1a 전류를 억제하는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    VH가 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    VL이 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이,
    서열번호 2 및 서열번호 7(ASC01);
    서열번호 12 및 서열번호 17(ASC02);
    서열번호 22 및 서열번호 27(ASC03);
    서열번호 32 및 서열번호 37(ASC04);
    서열번호 42 및 서열번호 47(ASC05); 및
    서열번호 52 및 서열번호 57(ASC06)
    로 각각 이루어진 군으로부터 선택되는 HC 아미노산 서열 및 LC 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 ASC06인, 방법.
  13. 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    VH가 서열번호 3, 13, 23, 33, 43 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34, 44 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35, 45 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고;
    VL이 서열번호 8, 18, 28, 38, 48 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39, 49 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 식별 번호: 10, 20, 30, 40, 50 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상의 완화를 필요로 하는 대상체에서 허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 완화하기 위한 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이,
    서열번호 2 및 서열번호 7(ASC01);
    서열번호 12 및 서열번호 17(ASC02);
    서열번호 22 및 서열번호 27(ASC03);
    서열번호 32 및 서열번호 37(ASC04);
    서열번호 42 및 서열번호 47(ASC05); 및
    서열번호 52 및 서열번호 57(ASC06)
    로 각각 이루어진 군으로부터 선택되는 HC 아미노산 서열 및 LC 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 동종형의 Fc 도메인을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체인, 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 ASIC1a 단백질에 결합하는 것인, 방법.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 ASIC1a의 세포외 도메인에 결합하는 것인, 방법.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결하는 에피토프에 결합하는 것인, 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편이 양성자-유도된 ASIC1a 전류를 억제하는 것인, 방법.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상이 갑작스러운 쇠약, 얼굴, 팔 또는 다리의 마비 또는 무감각, 얼굴 한쪽의 처짐(drooping), 착란, 말하기의 어려움, 말을 이해하기 어려움, 한쪽 또는 양쪽 눈의 불편한 시력, 흐릿한 시야, 검은 시야, 이중 시야, 호흡 곤란, 현기증, 보행의 어려움, 균형 상실, 협응능력 상실, 이유 없이 넘어짐, 의식 상실, 갑작스러운 두통 또는 심한 두통인, 방법.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    허혈성 뇌졸중의 하나 이상의 증상 갑자기 발병한 안면 마비, 얼굴 한쪽의 처짐, 팔의 표류(arm drift) 또는 비정상적인 말투인, 방법.
  24. (a) 서열번호 7, 17, 27, 37, 47 또는 57 중 어느 하나의 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열; 및/또는
    (b) 서열번호 2, 12, 22, 32, 42 또는 52 중 어느 하나에 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인 서열(VH)
    을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위한 방법.
  25. 중쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변성 도메인(VL)을 포함하며,
    VH가 서열번호 3, 13, 23, 33 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR1 서열; 서열번호 4, 14, 24, 34 및 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR2 서열; 및 서열번호 5, 15, 25, 35 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH-CDR3 서열을 포함하고;
    VL이 서열번호 8, 18, 28, 38 및 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR1 서열; 서열번호 9, 19, 29, 39 및 49로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR2 서열; 및 서열번호 10, 20, 30, 40 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL-CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제25항에 있어서,
    IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 동종형의 Fc 도메인을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    ASIC1a 단백질에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    ASIC1a의 세포외 도메인에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    2개의 ASIC1a 서브유닛을 연결하는 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    ASIC1a 전류를 억제하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 서열.
  34. 서열번호 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열.
  35. 제33항 또는 제34항의 핵산을 발현하는 숙주 세포 또는 벡터.
  36. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 사용 지침서를 포함하는 키트.
  37. 제36항에 있어서,
    항체 또는 항원 결합 단편이 방사성 표지, 형광성 표지 및 색소생산성(chromogenic) 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출가능한 표지에 커플링되는, 키트.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 2차 항체를 추가로 포함하는, 키트.
  39. 검출가능한 표지에 접합된 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    생물학적 샘플에서 검출가능한 표지의 존재 및 수준을 검출하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플에서 ASIC1a 단백질을 검출하기 위한 방법.
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