KR20220047807A - 근육 소모 및 다른 상태의 치료 및 예방에 적합한 화합물 - Google Patents

근육 소모 및 다른 상태의 치료 및 예방에 적합한 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이며, 여기서 가변기는 청구범위 및 발명의 설명에 정의된 바와 같다. 본 발명은 또한 근육 소모 상태, 골격근 또는 심근 위축, 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 상태, 특히 근병증 및 다른 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물; 의약으로서 사용하기 위한 화학식 I의 화합물; 화학식 I의 적어도 1종의 화합물을 포함하는 제약 조성물 및 상기 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

근육 소모 및 다른 상태의 치료 및 예방에 적합한 화합물
본 발명은 신규 치환된 4-[(2-옥소-크로멘-7-일)헤테로메틸]벤조산 화합물, 특히 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I의 화합물에 관한 것이다. 화합물은 가치있는 치료 특성을 보유하고, 근육 소모 상태의 치료 및 예방, 뿐만 아니라 특히 증가된 근육 링 핑거 1(Muscle RING Finger 1; MuRF1) 발현과 연관된 근병증의 치료 또는 예방에 적합하다.
근육 소모 및 근육 약화는 심장 악액질, 심근경색, 고혈압, 암, 특정 약물을 사용한 암 치료, 당뇨병, 신질환 및 신부전, 유전적 근육 위축 및 중증 감염을 비롯한 다양한 임상 상태 하에, 뿐만 아니라 구제적 질환과 연관되지 않는 여러 신체 상태, 예컨대 부동화, 장기간 기계적 환기, 장기간 무중력 또는 고령 하에 관찰되는 쇠약 합병증이다. 근육 소모는 사지 근육 및 호흡 근육 둘 다에서 발생하는 근육 질량의 손실을 특징으로 한다. 근육 소모는 전형적으로 증상 및 예후의 악화를 유도하고, 회복기를 연장시킨다.
근육 소모의 기저 메카니즘은 아직 완전히 이해되지 않는다. 근육 소모는 자가포식소체 및 유비퀴틴 프로테아솜 시스템 (UPS)을 통한 근육 단백질의 분해를 증진시키는 소위 아트로진의 활성화를 포함하는 것으로 공지되어 있다.
불행하게도, 상기 언급된 임상 상태에 의해 개시되는 근육 단백질의 손실을 차단하는 신뢰가능한 전략은 소수만 공지되어 있다 (예를 들어 운동 훈련). 이들 공지된 전략은 일반적으로 아트로진의 발현을 하향-조절 또는 불활성화시키고/거나 그의 유비퀴틸화 활성을 억제하는 것을 목표로 한다.
WO2015/010107 A1은, 예를 들어 신호 전달자 및 전사 활성인자 3 (Stat 3)의 염증성 시토카인-유도된 (IL-6-유도된) 티로신 인산화를 억제함으로써 근육 약화 및/또는 근육 소모 및/또는 악액질을 감소시키기 위한 소분자의 용도를 기재한다. Stat 3 인산화의 억제는 특정 아트로진의 발현을 상향-조절함으로써 근육-성장을 차단하는 것으로 공지된 미오스타틴의 발현 증가를 방지한다.
근육 단백질의 손실을 차단하는 또 다른 유망한 전략은 근육 링 핑거 1 (MuRF1)의 기능을 억제하는 것이다. MuRF1은 근육-특이적 유비퀴틴 E3 리가제이며, 이는 분해를 위해 다중-유비퀴틴화 근육 단백질을 유비퀴틴 프로테아솜 시스템으로 전달하는데 주요 단계를 제공하는 것으로 여겨진다. 그의 발현은 수많은 임상 상태에서 근육 소모와 밀접하게 연관되지만, 그의 유전자 불활성화는 근육 소모 상태에 대한 부분적 저항성을 부여한다. 지난 15년에 걸친 수많은 연구는 다수의 근육 관련 질환, 즉 근병증, 예컨대, 예를 들어 중대 질병 근병증, 네말린 근병증, 만성 염증성 근병증, 당뇨병 또는 폐고혈압으로부터의 근병증 (이는 근육 약화를 초래함)이 MuRF1 발현의 상향-조절과 연관될 수 있다는 것을 제시하였다.
문헌 [Hooijman et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med., 2015, 191(10), 1126-1138]은 기계적 환기를 받는 위중한 환자 (중대 질병 근병증)에서 전형적으로 관찰되는 횡경막 근섬유 힘 손실 및 근육 단백질 분해와 MuRF1 발현 사이의 연관성을 기재한다. 이들은 이러한 근섬유 힘 손실이 기계적 환기를 받는 MuRF1-KO 마우스에서 감쇠된다는 것을 관찰하였으며, 이에 의해 중대 질병 근병증과 MuRF1 발현 사이의 연관성을 밝혀냈다.
문헌 [Li and Granzier, Hum. Mol. Genet., 2015 Sep 15, 24(18), 5219-5233]은 당분해 섬유가 풍부한 근육이 MuRF-1을 포함한 단백질분해 경로를 상향조절하고 발육부전을 겪어 보다 작은 단면적 (CSA)을 생성함으로써 그의 힘 결핍을 악화시키는 네말린 근병증에 대한 마우스 모델을 기재한다. 따라서, MuRF1 억제는, 특히 당분해 섬유가 풍부한 근육 유형, 예컨대 사두근에 대한 네말린 근병증에서 근섬유 CSA 및 근섬유 힘을 보호하는 것으로 예측된다.
문헌 [Adams et al., J. Mol. Biol., 2008, 384, 48-59]은 C57Bl6 마우스에의 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 복강내 주사가 150 Hz에서의 가자미근의 힘 발생을 25%만큼 감소시켰다는 것을 기재한다. 이러한 TNF-α 유도된 근육 힘 손실은 MuRF-1 녹아웃 동물에서 감쇠되었다. 따라서, MuRF1 억제는 TNF-α 수준이 상승된 만성 염증성 상태에서 유용할 것으로 예측된다.
문헌 [De Man et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med., 2011 May 15, 183(10), 1411-1418]은 횡경막 섬유 CSA가 대조군과 비교하여 폐고혈압 (PH)을 갖는 래트에서 유의하게 더 작다는 것을 기재한다. 이러한 래트 데이터와 일치하게, PH 환자에 대한 연구는 대조군 대상체와 비교하여 횡경막 근섬유의 유의하게 감소된 CSA 및 손상된 수축성을 밝혀냈다. 이들은 추가로 이러한 횡경막 섬유 CSA의 감소가 E3-리가제 MAFbx 및 MuRF-1의 증가된 발현과 연관된다는 것을 발견하였다.
지금까지, MuRF1 기능의 억제에 관한 치료 접근법은 제한적인 양만 존재한다.
예를 들어, 문헌 [Castillero et al., Metabolism, 2013, 62, 1495-1502]은 배양된 L6 근관의 덱사메타손-유도된 위축을 방지하는, 아트로진-1 및 MuRF1의 아데노바이러스 녹-다운을 기재한다.
문헌 [Eddins et al., Cell Biochem. Biophys., 2011, 60, 113-118]은 세포 위축 모델에서 근육 소모의 유의한 감소를 유발하는, 근육 특이적 소분자에 의한 MuRF1 유비퀴틸화의 표적화된 억제를 기재한다.
이들 치료 연구는 소분자에 의한 MuRF1 기능의 억제가 근관에서 위축을 방지할 수 있다는 것을 입증하지만, 이러한 접근법은 임상적으로 유의미한 동물 모델에서와 같은 생체내 환경에 아직 적용되지 않았다. 따라서, 근육 소모 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물 및 방법의 제공에 대해 관련 기술분야에서 실질적으로 충족되지 않은 필요가 여전히 존재한다.
발명의 간단한 설명
본 발명의 목적은 근육 소모 상태 또는 근육 상태를 개선시킴으로써 감쇠될 수 있는 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 적합한 추가의 소분자를 제공하는 것이다.
상기 목적 및 추가 목적은 하기 기재된 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 의해 달성된다:
Figure pct00001
여기서
R1은 수소 또는 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 수소, C1-C3-알킬, 비치환되거나 또는 할로겐, 시아노, C1-C3-알킬, C1-C3-할로알킬 및 C1-C3-알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 라디칼을 보유할 수 있는 페닐; 및 비치환되거나 또는 1, 2 또는 3개의 라디칼 R7을 보유할 수 있는, 고리원(들)으로서 N, NRc, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자 또는 헤테로-기를 함유하는 5- 내지 10-원 헤테로방향족 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 수소, 메틸 또는 플루오린화 메틸이고;
R3은 수소, 메틸 또는 플루오린화 메틸이고;
R4는 수소 또는 C1-C4-알킬이고;
각각의 R5는 독립적으로 할로겐, 시아노, C1-C3-알킬, C1-C3-할로알킬, C1-C3-알콕시 및 C1-C3-할로알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R6은 독립적으로 할로겐, 시아노, C1-C3-알킬, C1-C3-할로알킬, C1-C3-알콕시 및 C1-C3-할로알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R7은 독립적으로 할로겐, 시아노, C1-C3-알킬, C1-C3-할로알킬, C1-C3-알콕시 및 C1-C3-할로알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X1은 NRa 또는 O이고;
X2는 NRb, O 또는 S이고;
Y는 산소 원자 (따라서 C=Y는 C=O임) 또는 2개의 수소 원자 (따라서 C=Y는 CH2임)를 나타내고;
Ra, Rb, Rc는 각각 독립적으로 수소 및 C1-C4-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
a는 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
b는 0, 1, 2 또는 3이다.
따라서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 및 화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
화합물 I의 약리학적 특성을 고려하면, 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
신규 화합물은 세포 시험뿐만 아니라 임상적으로 유의미한 동물 모델에서 근육 소모 및 수축 기능장애를 감쇠시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 근육 소모 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
본 발명은 특히 하기 질환 또는 상태: 울혈성 심부전, 만성 심부전, 암, 근독성 물질을 사용한 암 치료, 선천성 근병증, AIDS, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성 신질환, 신부전, 당뇨병, 중증 화상, 노화 동안의 근육감소증, 혈액 공급의 감소, 일시적 또는 장기간 부동화, 장기간 기계적 환기, 탈신경, 장기간 무중력 및 영양실조 중 하나로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
추가로, 본 발명의 화합물은 MuRF1의 유비퀴틴 E3 리가제 활성을 억제하고 표적 근육 단백질, 예컨대 티틴에 대한 MuRF1의 결합을 억제하는, MuRF1 기능의 강력한 억제제이다. 따라서, 본 발명은 추가로 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 상태, 특히 증가된 MuRF1 발현과 연관된 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
또한, 화학식 I의 화합물은 근육 상태에 대한 그의 효과와 직접적으로 관련되지 않은 수축기 또는 확장기 기능장애와 연관된 심장 상태에서 유익한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 수축기 또는 확장기 기능장애와 연관된 심장 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
또한, 화학식 I의 화합물은 당뇨병에서 유익한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 당뇨병, 특히 제II형 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I의 적어도 1종의 화합물 또는 화학식 I의 화합물의 적어도 1종의 제약상 허용되는 염을 포함하는 의약에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I의 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 적어도 1종의 제약상 허용되는 염 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 근육 소모 상태의 치료 또는 예방; 또는 상기 열거된 상태 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 상기 열거된 상태 또는 장애 중 하나의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 열거된 상태 또는 장애 중 하나를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
용어 "화학식 I의 화합물" 및 "화합물 I"은 동의어로서 사용된다.
용어 "제약상 허용되는 염"은 무기 또는 유기 염기 및 무기 또는 유기 산을 포함한 제약상 허용되는 비-독성 염기 또는 산으로부터 반대 이온이 유도된 양이온성 또는 음이온성 염 화합물을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 화학식 I의 화합물에 대한 언급은 또한 제약상 허용되는 염을 포함하도록 의도된다는 것이 이해될 것이다.
화학식 I의 화합물이 염기성인 경우에, 염은 무기 및 유기 산을 포함한 제약상 허용되는 비-독성 산으로부터 제조될 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 산 부가염은 아세트산, 트리플루오로아세트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 캄포르술폰산, 시트르산, 에탄술폰산, 푸마르산, 글루콘산, 글루탐산, 브로민화수소산, 염산, 이세티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄술폰산, 뮤신산, 질산, 파모산, 판토텐산, 인산, 숙신산, 황산, 타르타르산, p-톨루엔술폰산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 시트르산, 브로민화수소산, 염산, 말레산, 인산, 황산, 푸마르산 및 타르타르산이 특히 바람직하다.
화학식 I의 화합물이 산성인 경우에, 염은 무기 및 유기 염기를 포함한 제약상 허용되는 비-독성 염기로부터 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 염기 염은 금속 양이온, 예컨대 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 양이온뿐만 아니라 아민을 포함한, 염기로부터 유도된 비독성 염을 포함한다. 적합한 금속 양이온의 예는 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 아연 및 알루미늄을 포함한다. 적합한 아민의 예는 아르기닌, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에틸아민, 디에탄올아민, 디시클로헥실아민, 에틸렌디아민, 글리신, 리신, N-메틸글루카민, 올라민, 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올 및 프로카인을 포함한다. 바람직한 제약상 허용되는 염기 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 아연, 알루미늄 및 디에탄올아민이다.
유용한 산 부가염 및 염기 염의 논의에 대해서는, 예를 들어 문헌 [S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts," 66 J. Pharm. ScL 1-19 (1977)]을 참조한다.
용어 "C1-C4-알킬"은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec.-부틸, 이소부틸 또는 tert.-부틸을 지칭한다. 바람직하게는, C1-C4-알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 특히 메틸 및 에틸로부터 선택된다.
용어 "C1-C3-알킬"은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필을 지칭한다. 바람직하게는, C1-C3-알킬은 메틸 및 에틸, 특히 메틸로부터 선택된다.
용어 "할로겐"은 플루오린, 염소, 브로민 및 아이오딘을 지칭한다. 바람직하게는, 할로겐은 플루오린 및 염소, 특히 플루오린이다.
용어 "플루오린화 메틸"은 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 바람직하게는 트리플루오로메틸을 지칭한다.
용어 "플루오린화 메톡시"는 플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, 바람직하게는 트리플루오로메톡시를 지칭한다.
용어 "C1-C3-알콕시"는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시 및 이소프로폭시를 지칭한다. 바람직하게는, C1-C3-알콕시는 메톡시 및 에톡시로부터, 특히 메톡시로부터 선택된다.
용어 "C1-C3-할로알킬"은 상기 정의된 바와 같은 C1-C3-알킬 라디칼의 수소 원자 중 적어도 1개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 수소 원자가 할로겐 원자, 바람직하게는 염소 또는 플루오린 원자, 특히 플루오린 원자에 의해 대체된 C1-C3-알킬 라디칼을 지칭한다. C1-C3-할로알킬의 예는 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 2-클로로에틸, 2,2-디클로로에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 2-플루오로에틸, 2,2-디플루오로에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 1-플루오로에틸, 1,1-디플루오로에틸, 1,1,2,2-테트라플루오로에틸, 펜타플루오로에틸 등을 포함한다. 특히, "C1-C3-할로알킬"은 상기 정의된 바와 같은 플루오린화 메틸로부터 및 또한 트리클로로메틸, 2,2,2-트리클로로에틸 및 2,2,2-트리플루오로에틸로부터, 특히 트리플루오로메틸로부터 선택된다.
용어 "C1-C3-할로알콕시"는 상기 정의된 바와 같은 C1-C3-알콕시 라디칼의 수소 원자 중 적어도 1개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 수소 원자가 할로겐 원자, 바람직하게는 염소 또는 플루오린 원자, 특히 플루오린 원자에 의해 대체된 C1-C3-알콕시 라디칼을 지칭한다. C1-C3-할로알콕시의 예는 클로로메톡시, 디클로로메톡시, 트리클로로메톡시, 2-클로로에톡시, 2,2-디클로로에톡시, 2,2,2-트리클로로에톡시, 플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, 2-플루오로에톡시, 2,2-디플루오로에톡시, 2,2,2-트리플루오로에톡시, 1-플루오로에톡시, 1,1-디플루오로에톡시, 1,1,2,2-테트라플루오로에톡시, 펜타플루오로에톡시 등을 포함한다. 특히, "C1-C3-할로알콕시"는 상기 정의된 바와 같은 플루오린화 메톡시로부터 및 또한 트리클로로메톡시, 2,2,2-트리클로로에톡시 및 2,2,2-트리플루오로에톡시로부터, 특히 트리플루오로메톡시로부터 선택된다.
용어 "5- 내지 10-원 헤테로방향족 고리"는 5- 내지 6-원 모노시클릭 방향족 고리 또는 융합된 8- 내지 10-원 비시클릭 방향족 고리를 지칭하며, 여기서 모노시클릭 또는 비시클릭 방향족 고리는 N, NRc, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자 또는 헤테로-기를 함유하고, 여기서 Rc는 수소 및 C1-C4-알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 5- 내지 6-원 모노시클릭 방향족 고리의 예는 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 푸라자닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리미딜, 피리다지닐, 피라지닐, 1,2,4-트리아지닐, 1,3,6-트리아지닐 등을 포함한다. 이러한 8- 내지 10-원 비시클릭 방향족 고리의 예는 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 이미다조피리딜, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 프테리디닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 아자인돌릴, 인돌리지닐, 인다졸릴, 퓨리닐, 피롤로피리디닐, 푸로피리디닐, 벤조푸라닐, 이소벤조푸라닐, 벤조티에닐, 벤조이미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤조이속사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이소티아졸릴, 벤족사디아졸릴, 벤조티아디아졸릴 등을 포함한다.
의도된 용도와 관련하여, 화학식 I에서의 가변기 R1, R2, R3, R4, R5, R6, X1, X2, Y, Ra, Rb, Rc, a 및 b는 특히 하기 의미를 가지며, 여기서 이들은 그 자체로 및 화학식 I의 화합물의 적어도 하나의 다른 또는 모든 특수 실시양태와 조합되어 둘 다로 고려된다:
R1은 바람직하게는 수소 또는 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 수소, 메틸, 페닐 및 고리원(들)으로서 N, NRc, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자 또는 헤테로-기를 함유하는 5- 내지 10-원 헤테로방향족 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 5- 내지 10-원 헤테로방향족 고리는 비치환되거나 또는 1, 2 또는 3개의 라디칼 R7을 보유할 수 있고, 여기서 Rc 및 R7은 상기 일반적 의미 중 하나를 갖거나 또는 특히 하기 바람직한 의미 중 하나를 갖는다.
보다 바람직하게는, R1은 수소 및 기 -CH2R1a로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R1a는 수소, 메틸 및 고리원(들)으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자, 특히 1개의 헤테로원자를 함유하는 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리는 비치환되거나 또는 1개의 라디칼 R7을 보유하고, 여기서 R7은 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히, R1은 수소 및 기 -CH2R1a로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R1a는 수소 및 고리원(들)으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자, 특히 1개의 헤테로원자를 함유하는 비치환된 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 특히, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 고리원(들)으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 비치환된 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리이다. 구체적으로, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 고리원으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 헤테로원자를 함유하는 비치환된 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리이다. 매우 구체적으로, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 푸릴, 티에닐 또는 피리딜이다.
대안적으로 보다 바람직한 실시양태에서, R1은 수소, 메틸 및 기 CH2-I' 또는 CH2-II'로부터 선택되고,
Figure pct00002
여기서 *는 우레아 질소 원자에 대한 부착 지점을 나타내고,
X3은 NRc, O 또는 S이고;
c는 0, 1, 2 또는 3이고;
R7은 본원에 정의된 바와 같다.
특히, R1은 CH2-I' 및 CH2-II'로 이루어진 군으로부터 선택되고,
Figure pct00003
여기서 *는 우레아 질소 원자에 대한 부착 지점을 나타내고, R7, X3 및 c는 본원에 정의된 바와 같다.
R2는 바람직하게는 수소 또는 메틸이다. 특히 R2는 수소이다.
R3은 바람직하게는 수소 또는 메틸이다. 특히 R3은 수소이다.
R4는 바람직하게는 메틸 또는 에틸이다. 특히 R4는 메틸이다.
바람직하게는, 각각의 R5는 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시 플루오린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 각각의 R5는 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 각각의 R5는 독립적으로 플루오린, 메틸 및 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 각각의 R5는 독립적으로 플루오린 및 메틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 각각의 R6은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시 플루오린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 각각의 R6은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 각각의 R6은 독립적으로 플루오린, 메틸 및 트리플루오로메틸로부터 선택된다. 특히, 각각의 R6은 독립적으로 플루오린 또는 메틸로부터 선택된다.
X1은 NRa또는 O이다. 바람직하게는, X1은 NH 또는 O이다.
바람직하게는, X2는 O 또는 S이다. 특히, X2는 O이다.
바람직한 실시양태에서, Y는 산소 원자이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, Y는 2개의 수소 원자를 나타낸다.
바람직하게는, Ra, Rb, Rc는 각각 독립적으로 수소 및 C1-C3-알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, Ra, Rb, Rc는 각각 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택된다. 특히, Ra, Rb, Rc는 수소이다.
바람직하게는, a는 0, 1, 2 또는 3이다. 보다 바람직하게는, a는 0, 1 또는 2이다. 특히 a는 0이다.
바람직하게는, b는 0, 1 또는 2이다. 보다 바람직하게는, b는 0 또는 1이다. 특히 b는 0이다.
화학식 CH2-I'의 기에서, 가변기 X3, c 및 R7은, 존재하는 경우, 그 자체로 및 적어도 하나의 다른 것 또는 모두와 조합되어 둘 다로 고려되며, 특히 하기 의미를 갖는다:
바람직하게는, 각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 각각의 R7은 독립적으로 플루오린, 메틸 및 트리플루오로메틸로부터 선택된다. 특히, 각각의 R7은 독립적으로 플루오린 및 메틸로부터 선택된다.
바람직하게는, X3은 O 또는 S이다. 특히, X3은 O이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, X3은 S이다.
바람직하게는, c는 0, 1 또는 2이다. 보다 바람직하게는, c는 0 또는 1이다. 특히 c는 0이다.
화학식 CH2-II'의 기에서, 가변기 c 및 R7은, 존재하는 경우, 그 자체로 및 적어도 하나의 다른 것 또는 모두와 조합되어 둘 다로 고려되며, 특히 하기 의미를 갖는다:
바람직하게는, 각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 각각의 R7은 독립적으로 플루오린, 메틸 및 트리플루오로메틸로부터 선택된다. 특히, 각각의 R7은 독립적으로 플루오린 및 메틸로부터 선택된다.
바람직하게는, c는 0, 1 또는 2이다. 보다 바람직하게는, c는 0 또는 1이다. 특히 c는 0이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
R1은 수소 또는 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 수소 또는 고리원(들)으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자, 특히 1개의 헤테로원자를 함유하는 비치환된 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리이고;
R2는 수소 또는 메틸이고;
R3은 수소 또는 메틸이고;
R4는 C1-C2-알킬이고;
각각의 R5는 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R6은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X1은 NRa 또는 O이고;
X2는 O 또는 S이고;
Y는 산소 원자 또는 2개의 수소 원자를 나타내고;
Ra는 수소 및 C1-C3-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
a는 0, 1, 2 또는 3이고;
b는 0, 1 또는 2이다.
본 발명의 보다 바람직한 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
R1은 수소 또는 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 수소 또는 고리원으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 헤테로원자를 함유하는 비치환된 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리이고;
R2는 수소 또는 메틸이고;
R3은 수소이고;
R4는 메틸이고;
X1은 NH 또는 O이고;
X2는 O이고;
Y는 산소 원자 또는 2개의 수소 원자를 나타내고;
a는 0이고;
b는 0이다.
본 발명의 특정한 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 고리원으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 헤테로원자를 함유하는 비치환된 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리이고;
R2는 수소이고;
R3은 수소이고;
R4는 메틸이고;
X1은 NH 또는 O이고;
X2는 O이고;
Y는 산소 원자 또는 2개의 수소 원자를 나타내고;
a는 0이고;
b는 0이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
R1은 수소, 메틸 또는 기 CH2-I' 또는 CH2-II'이고,
R2는 수소 및 메틸로부터 선택되고;
R3은 수소 및 메틸로부터 선택되고;
R4는 C1-C2-알킬이고;
각각의 R5는 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R6은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X1은 NRa 또는 O이고;
X2는 O 또는 S이고;
X3은 O 또는 S이고;
Y는 산소 원자 또는 2개의 수소 원자를 나타내고;
Ra는 수소 및 C1-C3-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
a는 0, 1, 2 또는 3이고;
b는 0, 1 또는 2이고;
c는 0, 1 또는 2이다.
본 발명의 또 다른 보다 바람직한 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
R1은 수소, 메틸 또는 기 CH2-I' 또는 CH2-II'이고,
R2는 수소 또는 메틸이고;
R3은 수소이고;
R4는 메틸이고;
각각의 R5는 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R6은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X1은 NH 또는 O이고;
X2는 O이고;
X3은 O 또는 S이고;
Y는 산소 원자 또는 2개의 수소 원자를 나타내고;
a는 0, 1 또는 2이고;
b는 0 또는 1이고;
c는 0 또는 1이다.
본 발명의 보다 더 바람직한 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
R1은 수소, 메틸 또는 기 CH2-I' 또는 CH2-II'이고,
R2는 수소 또는 메틸이고;
R3은 수소이고;
R4는 메틸이고;
각각의 R5는 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R6은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X1은 NH 또는 O이고;
X2는 O이고;
X3은 O 또는 S이고;
Y는 산소 원자 또는 2개의 수소 원자를 나타내고;
a는 0이고;
b는 0이고;
c는 0이다.
본 발명의 또 다른 특정한 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
R1은 기 CH2-I' 또는 CH2-II'이고,
R2는 수소이고;
R3은 수소이고;
R4는 메틸이고;
X1은 NH 또는 O이고;
X2는 O이고;
X3은 O 또는 S이고;
Y는 산소 원자 또는 2개의 수소 원자를 나타내고;
a는 0이고;
b는 0이고;
c는 0이다.
실시양태의 또 다른 바람직한 군은 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다:
기 CH2-I'이고;
X3은 O 또는 S이고;
각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
c는 0, 1 또는 2이다.
실시양태의 또 다른 바람직한 군은 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다:
기 CH2-II'이고;
각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C2-할로알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
c는 0, 1 또는 2이다.
실시양태의 보다 더 바람직한 군은 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다:
기 CH2-I'이고;
X3은 O 또는 S이고;
각각의 R7은 독립적으로 플루오린, 메틸 또는 트리플루오로메틸로부터 선택되고;
c는 0 또는 1이다.
실시양태의 보다 더 바람직한 군은 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다:
기 CH2-II'이고;
각각의 R7은 독립적으로 플루오린, 메틸 또는 트리플루오로메틸로부터 선택되고;
c는 0 또는 1이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 화학식 I-A에 상응하는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
Figure pct00004
여기서
X1은 NH 또는 O이고;
X3은 O 또는 S이다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 실시양태는 화학식 I-B에 상응하는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
Figure pct00005
여기서
X1은 NH 또는 O이다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 실시양태는 화학식 I-C에 상응하는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
Figure pct00006
여기서
X1은 NH 또는 O이고;
X3은 O 또는 S이다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 실시양태는 화학식 I-D에 상응하는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다:
Figure pct00007
여기서
R1은 수소 또는 메틸로부터 선택되고;
X1은 NH 또는 O이다.
특히 바람직한 화학식 I의 화합물은 [2-(2-푸릴메틸카르바모일-아미노)-2-옥소-에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 (즉, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 푸란-2-일이고, R2는 H이고, R3은 H이고, R4는 메틸이고, X1은 O이고, X2는 O이고, Y는 O이고, a는 0이고, b는 0인 화합물 I) 및 그의 제약상 허용되는 염이다. 이 화합물은 또한 하기에서 MyoMed-946으로 명명된다.
또 다른 특히 바람직한 화학식 I의 화합물은 N-[2-(2-푸릴메틸카르바모일아미노)-2-옥소-에틸]-4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤즈아미드 (즉, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 푸란-2-일이고, R2는 H이고, R3은 H이고, R4는 메틸이고, X1은 NH이고, X2는 O이고, Y는 O이고, a는 0이고, b는 0인 화합물 I) 및 그의 제약상 허용되는 염이다.
또 다른 특히 바람직한 화학식 I의 화합물은 [2-옥소-2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-벤조에이트 (즉, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 티엔-2-일이고, R2는 H이고, R3은 H이고, R4는 메틸이고, X1은 O이고, X2는 O이고, Y는 O이고, a는 0이고, b는 0인 화합물 I) 및 그의 제약상 허용되는 염이다.
또 다른 특히 바람직한 화학식 I의 화합물은 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-N-[2-옥소-2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸]-벤즈아미드 (즉, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 티엔-2-일이고, R2는 H이고, R3은 H이고, R4는 메틸이고, X1은 NH이고, X2는 O이고, Y는 O이고, a는 0이고, b는 0인 화합물 I) 및 그의 제약상 허용되는 염이다.
또 다른 특히 바람직한 화학식 I의 화합물은 [2-옥소-2-(2-피리딜메틸카르바모일아미노)에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시-메틸]벤조에이트 (즉, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 피리딘-2-일이고, R2는 H이고, R3은 H이고, R4는 메틸이고, X1은 O이고, X2는 O이고, Y는 O이고, a는 0이고, b는 0인 화합물 I) 및 그의 제약상 허용되는 염이다. 이 화합물은 또한 하기에서 MyoMed-203으로 명명된다.
또 다른 특히 바람직한 화학식 I의 화합물은 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-N-[2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸]벤즈아미드 (즉, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 티엔-2-일이고, R2는 H이고, R3은 H이고, R4는 메틸이고, X1은 NH이고, X2는 O이고, Y는 2개의 수소 원자를 나타내고 (즉, C=Y는 CH2임), a는 0이고, b는 0인 화합물 I) 및 그의 제약상 허용되는 염이다. 이 화합물은 또한 하기에서 MyoMed-205로 명명된다.
또 다른 특히 바람직한 화학식 I의 화합물은 (1-메틸-2-옥소-2-우레이도-에틸) 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 (즉, R1은 H이고, R2는 메틸이고, R3은 H이고, R4는 메틸이고, X1은 O이고, X2는 O이고, Y는 O이고, a는 0이고, b는 0인 화합물 I) 및 그의 제약상 허용되는 염이다. 이 화합물은 또한 하기에서 MyoMed-946-5로 명명된다.
또 다른 특히 바람직한 화학식 I의 화합물은 [1-메틸-2-(메틸카르바모일-아미노)-2-옥소-에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-벤조에이트 (즉, R1은 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 H이고, R2는 메틸이고, R3은 H이고, R4는 메틸이고, X1은 O이고, X2는 O이고, Y는 O이고, a는 0이고, b는 0인 화합물 I) 및 그의 제약상 허용되는 염이다. 이 화합물은 또한 하기에서 MyoMed-946-8로 명명된다.
본 발명에 따른 화합물 I은 문헌으로부터 공지된 방법과 유사하게 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물에 대한 중요한 접근법은 반응식 1에 도시된 바와 같이 4-브로모알킬-치환된 메틸벤조에이트 화합물 II를 크로멘-2-온 화합물 III과 반응시켜 2-옥소크로멘-치환된 메틸벤조에이트 화합물 IV를 수득하고, 이를 중간체 벤조산 화합물 V로 가수분해함으로써 제공된다.
반응식 1:
Figure pct00008
반응식 1에서, 가변기 R3, R4, R5, R6, X2, a 및 b는 상기 언급된 의미를 갖는다.
반응식 1의 단계 a)에서, 화학식 (II)의 브로마이드는 친핵성 치환 반응에 적합한 조건 하에 화합물 III의 OH, SH 또는 HNRb 기 (H-X2-기)와 반응한다. 통상의 기술자는 이러한 유형의 친핵성 치환 반응에 요구되는 반응 조건에 친숙하다. 전형적으로, 이 반응은 염기의 존재 하에 수행된다. 적합한 염기는 무기 또는 유기일 수 있다. 적합한 무기 염기의 예는 알칼리 금속 탄산염, 예를 들어 Li2CO3, Na2CO3, K2CO3 또는 Cs2CO3, 알칼리 금속 수산화물, 예를 들어 LiOH, NaOH 또는 KOH, 또는 인산염, 예를 들어 Li3PO4, Na3PO4, K3PO4 또는 Cs3PO4이다. 적합한 유기 염기의 예는, 예를 들어 3급 아민, 예를 들어 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에틸디이소프로필아민 (DIPEA) 등, 염기성 N-헤테로사이클, 예컨대 모르폴린, 피리딘, 루티딘, DABCO, DBU 또는 DBN, 또는 알콕실레이트, 예컨대 소듐 또는 포타슘 메탄올레이트, 에탄올레이트, 프로판올레이트, 이소프로판올레이트, 부탄올레이트 또는 tert-부탄올레이트이다.
이에 따라 수득된 화학식 (IV)의 메틸 에스테르 화합물은 반응식 1의 단계 b)에서 강염기, 예컨대 알칼리 금속 수산화물, 예를 들어 LiOH, NaOH 또는 KOH의 존재 하에 비누화되어 화학식 (V)의 벤조산 화합물을 생성한다.
이어서, 반응식 2에 도시된 바와 같이, 중간체 벤조산 화합물 V는 우레아 화합물 VIa 또는 VIb와 추가로 반응하여 본 발명에 따른 화합물 I을 생성한다.
반응식 2:
Figure pct00009
반응식 2에서, 가변기 R1, R2, R3, R4, R5, R6, X2, Y, Ra, a 및 b는 상기 언급된 의미를 갖는다.
반응식 2의 단계 c)에서, 화학식 (V)의 벤조산 중간체는 클로라이드 기를 함유하는 화학식 (VIa)의 우레아 화합물과 또는 N(H)Ra 기를 함유하는 화학식 (VIb)의 우레아 화합물과 반응하여 화학식 I의 상응하는 에스테르 또는 아미드 화합물을 형성한다. 반응식 2의 단계 c)에서 화학식 (V)의 벤조산 중간체와 클로라이드 기를 함유하는 화학식 (VIa)의 우레아 화합물의 반응은 친핵성 치환 반응에 적합한 조건 하에 수행된다. 통상의 기술자는 이들 유형의 반응에 요구되는 반응 조건에 친숙하다. 전형적으로, 이 반응은 반응 동안 형성된 산을 중화시키기 위해 상기 정의된 바와 같은 염기의 존재 하에 수행된다. 원하는 경우에, 화합물 (VIa)는 친핵성 치환 반응에 적합한 브로마이드- 또는 특히 아이오다이드 염을 첨가함으로써 계내에서 추가로 활성화될 수 있다. 적합한 브로마이드- 또는 아이오다이드 염은, 예를 들어 알칼리 금속 브로마이드 또는 아이오다이드 및 테트라알킬암모늄 브로마이드 또는 아이오다이드이다. 예는 브로민화나트륨, 아이오딘화나트륨, 브로민화칼륨, 아이오딘화칼륨, 테트라부틸암모늄 브로마이드 및 테트라부틸암모늄 아이오다이드를 포함한다.
반응식 2의 단계 c)에서 화학식 (V)의 벤조산 중간체와 N(H)Ra 기를 함유하는 화학식 (VIb)의 우레아 화합물의 반응은 아미드 결합 형성에 적합한 조건 하에 수행된다. 통상의 기술자는 이러한 유형의 반응에 요구되는 반응 조건에 친숙하다. 전형적으로, 아미드 결합 형성은 커플링 시약의 존재 하에 수행된다. 적합한 커플링 시약 (활성화제)은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 카르보디이미드, 예컨대 EDCI (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드; 또한 EDC로 약칭됨), DCC (디시클로헥실카르보디이미드) 및 DIC (디이소프로필카르보디이미드), 벤조트리아졸 유도체, 예컨대 HOAt (1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, HOBt (1-히드록시벤조트리아졸), HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), HBTU ((O-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 및 HCTU (1H-벤조트리아졸륨-1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-5-클로로 테트라플루오로보레이트), 포스포늄-유도된 활성화제, 예컨대 BOP ((벤조트리아졸-1-일옥시)-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트), Py-BOP ((벤조트리아졸-1-일옥시)-트리피롤리딘포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 및 Py-BrOP (브로모트리피롤리딘포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 및 다른 것, 예컨대 COMU ((1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄-헥사플루오로포스페이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 활성화제는 또한 서로 조합되어 사용될 수 있다. 일반적으로, 활성화제는 과량으로 사용되지 않은 반응물에 대해 적어도 등몰량으로 사용된다. 벤조트리아졸 및 포스포늄 커플링 시약은 일반적으로 염기성 매질 중에서 사용된다. 대안적으로, 화학식 (V)의 카르복실산 중간체는 먼저 소위 활성 에스테르로 전환될 수 있고, 이는 형식적 의미에서 카르복실산과 활성 에스테르-형성 알콜, 예컨대 p-니트로페놀, N-히드록시벤조트리아졸 (HOBt), N-히드록시숙신이미드 또는 OPfp (펜타플루오로페놀)의 반응에 의해 수득된다. 이어서, 활성 에스테르는 커플링 시약의 존재 또는 부재 하에 아민 3과 반응한다.
화학식 (II) 및 (III)의 화합물은 구입될 수 있거나 또는 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
화학식 (VIa) 및 (VIb)의 화합물은 구입될 수 있거나 또는 예를 들어 반응식 3에 도시된 바와 같은 절차에 따라 합성될 수 있다.
반응식 3:
Figure pct00010
반응식 3에서, 가변기 R1, R2 및 Ra는 상기 언급된 의미를 갖는다. 반응식 3의 단계 d)에서, Y가 산소 원자를 나타내는 경우에, 우레아 화합물 (VII)은 친핵성 아실화 조건 하에 산 클로라이드 (VIIIa) 또는 (VIIIb)와 반응한다. 아실화 반응에 적합한 반응 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. Y가 2개의 수소 원자를 나타내는 경우에, 이는 친핵성 치환 반응에 적합한 조건 하에 수행된다. 통상의 기술자는 이들 유형의 반응에 요구되는 반응 조건에 친숙하다. 원하는 경우에, 화합물 (VIIIa)는 상기 기재된 바와 같이 계내에서 추가로 활성화될 수 있다. 전형적으로, 단계 d)는 상기 정의된 바와 같은 염기, 예컨대 3급 아민의 존재 하에 수행되어, 반응 동안 형성되는 히드로클로라이드 또는 다른 산을 켄칭한다.
일부 특정한 경우에, 화합물 (VII), (VIIIa) 또는 (VIIIb)에 존재할 수 있고 반응에서 경쟁하거나 반응을 방해할 수 있는 다른 반응성 기와의 부반응을 피하기 위해 적절한 보호기를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 이들 경우에, 아미드 결합 형성 후 이들 보호기를 제거하기 위해 추가의 탈보호 단계가 필요할 수 있다. 적합한 보호기 및 이러한 적합한 보호기를 사용하여 상이한 치환기를 보호 및 탈보호하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며; 이의 예는 문헌 [T. Greene and P. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (3rd ed.), John Wiley & Sons, NY (1999)]에서 찾아볼 수 있다.
추가로, 화합물 (VIc)는, 예를 들어 반응식 4에 도시된 바와 같은 절차에 따라 화합물 (VIa)로부터 제조될 수 있다.
반응식 4:
Figure pct00011
반응식 4에서, 가변기 R1, R2 및 Y는 상기 언급된 의미를 갖는다. 반응식 4의 단계 e)에서, 우레아 화합물 (VIa)는 아지드 공급원, 예컨대 포스포릴 아지드, 히드라조산 또는 아지드화나트륨, 아지드의 존재 하에 또는 문헌 [Zwierzak, A. in Phosphorus, Sulfur, and Silicon and the Related Elements (1993), 75:1-4, 51-54]에 기재된 바와 같이 PPh3 또는 다른 인 시약과의 슈타우딩거 반응을 통해 아지드 화합물 (IX)로 전환된다. 전형적으로, 단계 e)는 상기 정의된 바와 같은 염기, 예컨대 3급 아민의 존재 하에 수행되어, 반응 동안 형성되는 히드로클로라이드를 켄칭한다.
반응식 4의 단계 f)에서, 화합물 (IX)의 아지드 기는 수소화 촉매의 존재 하에 수소로 환원되거나 또는 히드라이드와 반응하여 아민 화합물 (VIc)를 생성한다. 이러한 유형의 반응에 적합한 반응 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
달리 나타내지 않는 한, 상기 기재된 반응은 전형적으로 유기 용매, 예컨대 비양성자성 유기 용매, 예를 들어 치환된 아미드, 락탐 및 우레아; 예컨대 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 테트라메틸 우레아, 시클릭 에테르; 예컨대 디옥산, 테트라히드로푸란, 할로겐화 탄화수소; 예컨대 디클로로메탄 및 그의 혼합물뿐만 아니라 C1-C6-알칸올 및/또는 물과의 그의 혼합물 중에서 수행된다.
상기 기재된 반응은 사용된 화합물의 반응성에 따라 실온 내지 사용된 용매의 비등 온도의 온도에서 통상적으로 수행될 것이다.
반응 혼합물은 통상적인 방식으로, 예를 들어 물과 혼합하고, 상을 분리하고, 적절한 경우에 조 생성물을 크로마토그래피에 의해 정제함으로써 후처리된다. 중간체 및 최종 생성물이 고체로서 수득되는 경우에, 재결정화 또는 소화에 의해 정제가 또한 수행될 수 있다.
반응 조건, 시약 및 합성 경로 순서의 적절한 조작, 반응 조건과 상용성이 아닐 수 있는 임의의 화학적 관능기의 보호, 및 제조 방법의 반응 순서의 적합한 시점에서의 탈보호를 포함한 상용 실험은 상용 기술 내에 있다.
상기에 이미 언급된 바와 같이, 화학식 I의 화합물은 세포 시험에서 뿐만 아니라 임상적으로 유의미한 동물 모델에서 근육 소모 및 수축 기능장애를 감쇠시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 근육 소모 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.
근육 소모 상태 및 근병증과 관련하여 본원에 사용된 용어 "치료하는" 및 "치료"는 상태 및/또는 질환과 연관된 증상, 즉 근육 소모 또는 근육 약화의 치료를 지칭한다.
근육 소모 상태 및 근병증과 관련하여 본원에 사용된 용어 "예방"은 예방적 치료, 즉 상태 및/또는 질환과 연관된 근육 소모 또는 근육 약화의 위험을 예방하거나 감소시키기 위한 치료를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "근육 소모"는 과학 및 의학 문헌에서 근육 위축으로도 지칭되는, 근육 질량의 감소로서 가시적인 근육 섬유의 크기 (감소된 단면적) 및 수의 감소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "근병증"은 근육 섬유가 적절하게 기능하지 않는 근육의 질환을 지칭한다. 이는 근육 약화를 초래한다. 본원에 사용된 용어 "근병증"은 특히 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 근병증을 지칭한다. 그러나, 본 발명의 화합물의 효과는 상기 경로에 제한되지는 않는 것으로 가정된다.
근육 소모는 근육 단백질 합성과 근육 단백질 분해 사이의 균형의 변화에 의해 유발되는 것으로 가정된다. 특히, 위축 동안 근육 단백질의 분해 경로, 예컨대 근육 단백질의 유비퀴틴화가 활성화되는 것으로 가정된다.
근육 소모는 전형적으로 악액질, 예를 들어 심장 질환에 의해 유발된 악액질, 즉 심장 악액질을 앓고 있는 환자에서 관찰된다. 추가로, 근육 소모는 특히 골격근에 영향을 미쳐, 골격근의 분해, 즉 골격근 위축을 유도한다. 그러나, 근육 소모는 또한 심근에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태는 심장 악액질, 골격근 위축 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.
심장 악액질, 심근 및 골격근 위축은, 예를 들어 심근경색을 앓고 있는 환자에서 관찰되며, 이는 전형적으로 그의 증상의 악화 및 예후를 유도하고, 그의 회복을 유의하게 연장시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정한 실시양태는 심장 악액질, 골격근 위축 또는 심근 위축 (여기서 심장 악액질 및 심근 또는 골격근 위축은 심근경색에 의해 유발됨)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.
다수의 공지된 질환 관련 상태뿐만 아니라 심근 또는 골격근 위축 및/또는 악액질을 유발하는 질환과 연관되지 않은 수많은 신체 상태가 있다.
심근 또는 골격근 위축 및/또는 악액질을 유발할 수 있는 질환 관련 상태는, 예를 들어 울혈성 심부전, 만성 심부전, 심근경색, 암, 선천성 근병증, AIDS, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 다발성 경화증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 혈액 공급의 감소, 호르몬 결핍, 만성 신질환, 신부전, 당뇨병, 감염성 질환, 만성 췌장염 및 자가면역 장애이다.
골격근 위축 및/또는 악액질을 유발할 수 있고 질환과 연관되지 않는 신체 상태는, 예를 들어 중증 화상, 탈신경, 일시적 또는 장기간 부동화, 장기간 기계적 환기, 노화 동안의 근육감소증, 장기간 무중력, 영양실조 및 약물 중독이다.
암 치료에 사용되는 특정 화학요법제는 심장독성 및 근독성을 나타낸다. 예를 들어, 다양한 암 치료에 사용되는 효율적인 화학요법 약물인 독소루비신의 사용은 초기 및 만성 심장독성 및 근독성과 연관된다 (K.M. Cho et al., Oncotarget, 2017, 8(45), 79441-79452; D.S. Hydock et al., Characterization of the Effect of In Vivo Doxorubicin Treatment on Skeletal Muscle Function in the Rat, International Journal of Cancer Research and Treatment, 2011, 2028, 2023-2028; T.A. Nissinen et al., Sci. Rep., 2016, 6, 32695; M.S. Willis et al., Circulation: Heart Failure, 2019, 12(3), 1-12). 설치류에서, 독소루비신의 단일 주사는 심근 및 골격근 질량을 감소시킬 수 있고, 기능의 현저한 손상이 이어진다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 하기 질환 또는 상태: 울혈성 심부전, 만성 심부전, 암, 근독성 물질을 사용한 암 치료, 선천성 근병증, AIDS, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성 신질환, 신부전, 당뇨병, 중증 화상, 노화 동안의 근육감소증, 혈액 공급의 감소, 일시적 또는 장기간 부동화, 장기간 기계적 환기, 탈신경, 장기간 무중력 및 영양실조 중 하나로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 당뇨병, 특히 제II형 당뇨병의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 당뇨병에 대한 긍정적 효과는 근육의 인슐린 감수성을 증진시키는 MuRF1 억제에 기초하는 것으로 가정된다. 에스. 히르너(S. Hirner) 등은 문헌 [J. Mol. Biol., 2008, 379, 666-677]에서, MuRF1은 글리코겐 저장을 고갈시키고 당분해를 억제하는 반면 인슐린은 당분해 및 글리코겐 저장을 상향조절한다는 의미에서 MuRF1 및 인슐린이 길항제 방식으로 기능적으로 연결된 것으로 이해될 수 있다는 것을 제시하였다. 결과적으로, MuRF1의 억제는 보다 낮은 인슐린 요구로 이어질 수 있고, 당뇨병을 치료하기 위한 전략을 구성할 수 있다.
본 발명은 특히 하기에 관한 것이다:
- 울혈성 심부전으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 만성 심부전으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 암으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 근독성 및/또는 심장독성 물질, 예컨대 독소루비신을 사용한 암 치료로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 선천성 근병증으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- AIDS로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 만성 신질환으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 신부전으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 당뇨병으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 중증 화상으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 노화 동안의 근육감소증으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 혈액 공급의 감소로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 일시적 또는 장기간 부동화로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 장기간 기계적 환기로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 탈신경으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 장기간 무중력으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 영양실조로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
본 발명은 특히 추가로 하기에 관한 것이다:
- 심장 악액질의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 종양 악액질의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 심근경색의 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 만성 심부전의 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 기계적 환기로부터의 회복에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
본 발명은 구체적으로 하기에 관한 것이다:
- 박출 계수 감소된 심부전 (HF-rEF)으로부터 유발되거나 그와 연관된 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 박출 계수 보존된 심부전 (HF-pEF)으로부터 유발되거나 그와 연관된 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 고혈압으로부터 유발되거나 그와 연관된 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 종양 악액질로부터 유발되거나 그와 연관된 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 독소루비신에 의해 유도된 근육 위축 및/또는 심장 독성의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 노화로 인한 근육감소증 및/또는 심근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 만성 신질환으로 인한 근육 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 기계적 환기 또는 울혈성 심부전으로 인한 횡경막 약화의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 선천성 근병증, 특히 동일 유전적 기원의(congenetic) 근육 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 당뇨병-유도된 근육 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 당뇨병, 특히 제II형 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
MuRF1의 유비퀴틴 E3 리가제 활성을 억제함으로써, 뿐만 아니라 MuRF1이 표적 근육 단백질, 예컨대 티틴에 결합하는 것을 억제함으로써 MuRF1의 기능을 하향조절하는 능력으로 인해, 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염은 또한 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 상태; 및 특히 오균형화된 근육 단백질 합성 및 근육 단백질 분해로 인해 근육 소모 및 근병증으로 이어지는, 전형적으로 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 적합하다.
따라서, 본 발명은 추가로 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 추가로 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.
증가된 MuRF1 발현과 연관된 근병증은, 예를 들어 중대 질병 근병증, 네말린 근병증, 염증성 근병증, 당뇨병으로부터의 근병증, 폐고혈압으로부터의 근병증, 만성 심부전, 특히 하위유형인 박출 계수 감소된 심부전 (HFrEF) 및 박출 계수 보존된 심부전 (HFpEF) 동안 발생하는 근병증, 신부전으로부터의 근병증 및 종양 악액질로부터의 근병증으로부터 선택된다.
증가된 MuRF1 발현과 폐고혈압으로부터의 근병증 사이의 연관성은, 예를 들어 문헌 [de Man et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2011 May 15, 183(10), 1411-1418]에 기재되어 있다.
증가된 MuRF1 발현과 안지오텐신 II에 의해 촉진된 만성 심부전 및/또는 신부전 근병증 사이의 연관성은, 예를 들어 문헌 [du Bois et al., Circ. Res., 2015 Aug 14, 117(5), 424-436]에 기재되어 있다.
마찬가지로, 문헌 [Bowen et al., Eur. J. Heart. Fail., 2015 Mar, 17(3), 263-272]은 증가된 MuRF1 발현과 확장기 심부전 (HFpEF) 동안 발생한 근병증 사이의 연관성을 기재한다.
MuRF1의 상향조절은 만성 신부전 환자에서 보고되었고, 이는 근육 위축과 밀접한 상관관계가 있다 (J. Aniort et al., J. Cachexia Sarcopenia Muscle, 2019, 10(2), 323-337; S.H. Lecker et al., J. Am. Soc. Nephrol., 2011, 22(5), 821-824). 따라서, MuRF1을 하향조절하는 화합물은 만성 신부전 동안 골격근을 보호하는 것으로 예측된다. 신장 손상 및 근육 위축의 개념은 또한 급성 겐타마이신 유도된 신장 손상을 사용하는 동물 모델에서 추가로 검증되었다 (J. Aniort et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 2016, 79, 505-516).
MuRF1은 골격근에서 노화 동안 상향조절된다 (O. Rom et al., Free Radic. Biol. Med. 2016, 98, 218-230). 이는 근육감소증 (근원섬유의 손실) 및 심근병증에 기여하는 것으로 추정되는 미토콘드리아 기능장애와 연관된다 (H.W. Liu et al., Biogerontology. 2020, 21(3), 367-380). 미토콘드리아 기능장애의 구제는 마우스 모델에서 심근병증을 구제한다 (Y.A. Chiao et al., eLife, 2020, 9, 55513). 따라서, 미토콘드리아 기능을 개선시키고 MuRF1을 하향조절하는 화합물은 연령-연관 근육감소증 및 심근병증으로부터의 보호를 제공할 것으로 예측된다.
기계적 환기 (H.W. van Hees et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2008, 294(6), L1260-8) 또는 울혈성 심부전 (P.E. Hooijman et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2015, 191(10), 1126-1138)에 의한 횡경막에 대한 스트레스는 MuRF1 (van Hees, Loc. cit; Hoojiman, Loc. cit.)을 포함한 유비퀴틴 및 프로테아솜 시스템을 활성화시킨다. 이것이 단순히 상관관계가 있는 발견이 아니라는 사실은, 보르테조미드에 의한 프로테아솜 시스템의 억제 (van Hees, Loc. cit) 또는 녹아웃 모델을 사용한 MuRF1의 제거 (Hoojiman, Loc. cit.)가 횡경막 약화로부터의 보호 (Hoojiman, Loc. cit.)를 제공한다는 발견에 의해 뒷받침된다. 따라서, 본원에 기재된 화합물은 울혈성 심부전 및 중대 질병에서 횡경막 수축력을 보호할 것으로 예측된다 (van Hees, Loc. cit; Hoojiman, Loc. cit.).
유전적 근육 위축은 현저한 근육 조직의 손실 및 근육 강도의 손실과 연관된다. MuRF1의 상향조절은 기계론적으로 이에 연루되었다 (J. Shin et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 2013, 45(10), 2266-2279). 이에 대한 구체적 예로서, 네말린 근병증이 언급될 수 있으며, 여기서 당분해적으로 활성인 근육 섬유에서의 섬유 수준에 대한 MuRF1의 상향조절은 가장 위축성이 되는 섬유 및 조직과 밀접한 상관관계가 있다 (F. Li et al., Hum. Mol. Genet., 2015, 24(18), 5219-5233).
당뇨병을 포함한 많은 유형의 대사성 스트레스 상태는 MuRF1 발현을 활성화시키는 것으로 나타났다 (S.H. Lecker et al., FASEB J. 2004, 18(1), 39-51). 당뇨병에 대한 동물 모델 (즉, 마우스에서의 스트렙토토진-유도된 당뇨병)에서, 이는 Foxo-MuRF1 신호전달 축을 활성화시키고, 이는 다시 근육 소모와 밀접한 상관관계가 있는 것으로 제시되었다 (B.T. O'Neill et al., Diabetes, 2019, 68(3), 556-570).
중증 비만은 골격 단백질 합성 및 분해에 영향을 미치는 순환 인자 (예를 들어 인슐린 및 아미노산)의 변화를 동반한다 (C.S. Katsanos et al., Obesity, 2011, 19, 469-475). 인슐린 저항성은 유비퀴틴-프로테아솜 경로의 활성화에 의해 근육 단백질 분해를 가속화시킨다 (X. Wang, Endocrinology, 147(9), 4160-4168). 이전의 연구는 비만에서 체중 감소의 최대 30%가 상이한 양식의 식이를 사용한 근육 질량의 감소로 인한 것일 수 있다는 것을 밝혀냈다 (D.L. Ballor et al., Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 1994, 18, 35-40).
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태는 중대 질병 근병증, 네말린 근병증, 염증성 근병증, 당뇨병으로부터의 근병증, 폐고혈압으로부터의 근병증, 만성 심부전 (특히 하위유형인 HFrEF 및 HFpEF)으로부터의 근병증, 신부전으로부터의 근병증, 종양 악액질로부터의 근병증, 기계적 환기 또는 울혈성 심부전에 의한 횡경막에 대한 스트레스로부터의 횡경막 약화, 선천성 근병증, 특히 동일 유전적 기원의 근육 위축; 연령-연관 근육감소증 및 심근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 특히 하기에 관한 것이다:
- 중대 질병 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 네말린 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 염증성 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 당뇨병으로부터의 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 폐고혈압으로부터의 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 만성 심부전으로부터의 근병증, 특히 하위유형인 HFrEF 및 HFpEF의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 신부전으로부터 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 종양 악액질로부터의 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 기계적 환기 또는 울혈성 심부전에 의한 횡경막에 대한 스트레스로 인한 횡경막 약화의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 선천성 근병증, 특히 동일 유전적 기원의 근육 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 연령-연관 근육감소증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 연령-연관 심근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
- 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물.
더욱이, 근육 상태에 대한 작용과 독립적으로, 화합물 I 및 그의 염은 수축기 또는 확장기 기능장애와 연관된 심장 상태에서 유익한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 수축기 또는 확장기 기능장애와 연관된 심장 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 I 및 그의 염에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물로부터 선택된 적어도 1종의 화합물 또는 그의 적어도 1종의 제약상 허용되는 염 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물 (즉, 의약)에 관한 것이다.
이들 제약상 허용되는 담체는 제약 형태 및 목적하는 투여 방식에 따라 선택된다.
본 발명의 화합물은 비경구 (예를 들어, 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 수조내 주사 또는 주입, 피하 주사 또는 이식물), 경구, 설하, 기관내, 비강내, 국소, 경피, 질 또는 직장 투여를 위한 제약 조성물을 제조하는데 사용될 수 있고, 상기 상태 또는 질환의 예방 또는 치료를 위해, 통상적인 제약 담체와 혼합된 단위 투여 형태로 동물 또는 인간에게 투여될 수 있다.
제약 조성물에서, 본 발명의 적어도 1종의 화합물은 일반적으로 비-독성이고/거나 제약상 허용되는 통상적인 담체를 함유하는 적합한 투여 단위 제제로, 단독으로 또는 추가의 활성 화합물과 함께 제제화될 수 있다. 담체는 활성 화합물을 위한 비히클, 담체 또는 매질로서의 역할을 하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 적합한 담체는 전문 의약 연구논문에 열거되어 있다. 추가로, 제제는 제약상 허용되는 담체 또는 통상의 보조 물질, 예컨대 활택제; 습윤제; 유화제 및 현탁화제; 보존제; 항산화제; 항자극제; 킬레이트화제; 코팅 보조제; 에멀젼 안정화제; 필름 형성제; 겔 형성제; 냄새 차폐제; 맛 교정제; 수지; 히드로콜로이드; 용매; 가용화제; 중화제; 확산 촉진제; 안료; 4급 암모늄 화합물; 재지방화제 및 과지방화제; 연고, 크림 또는 오일을 위한 원료; 실리콘 유도체; 확산 보조제; 안정화제; 멸균제; 좌제 베이스; 정제 보조제, 예컨대 결합제, 충전제, 활택제, 붕해제 또는 코팅; 추진제; 건조제; 불투명화제; 증점제; 왁스; 가소제 및 백색 미네랄 오일을 포함할 수 있다. 이와 관련하여 제제는, 예를 들어 문헌 [Fiedler, H. P., Lexikon der Hilfsstoffe fuer Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete [Encyclopedia of auxiliary substances for pharmacy, cosmetics and related fields], 4th edition, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996]에 기재된 바와 같은 전문 지식을 기초로 한다.
적합한 단위 투여 형태는 경구 투여를 위한 형태, 예컨대 경구 섭취를 위한 정제, 젤라틴 캡슐, 분말, 과립 및 용액 또는 현탁액, 설하, 협측, 기관내 또는 비강내 투여를 위한 형태, 에어로졸, 이식물, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여 형태 및 직장 투여 형태를 포함한다.
본 발명의 화합물은 국소 투여를 위한 크림, 연고 또는 로션에 사용될 수 있다.
고체 조성물이 정제 형태로 제조되는 경우, 주요 성분은 제약상 허용되는 담체, 예컨대 젤라틴, 전분, 락토스, 스테아르산마그네슘, 활석, 이산화규소 등과 혼합된다.
정제는 장기간 또는 지연된 활성을 나타내고 미리 결정된 양의 활성 염기성 성분을 연속적으로 방출시키기 위해 수크로스, 셀룰로스 유도체 또는 또 다른 적합한 물질로 코팅되거나 달리 처리될 수 있다.
젤라틴 캡슐 형태의 제제는 활성 성분을 증량제와 혼합하고, 생성된 혼합물을 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐에 녹임으로써 수득된다.
시럽 또는 엘릭시르 형태의 제제 또는 점적제 형태의 투여를 위한 제제는 활성 성분을, 바람직하게는 칼로리가 없는 감미제, 방부제로서의 메틸파라벤 또는 프로필파라벤, 향미제 및 적합한 착색제와 함께 포함할 수 있다.
수분산성 분말 또는 과립은 분산제, 습윤제 또는 현탁화제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 및 감미제 또는 맛 개선제와 혼합된 활성 성분을 포함할 수 있다.
직장 투여는 직장 온도에서 용융되는 결합제, 예를 들어 코코아버터 또는 폴리에틸렌 글리콜과 함께 제조된 좌제의 사용에 의해 달성된다.
비경구 투여는 약리학상 적합한 분산제 및/또는 습윤제, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 수성 현탁액, 등장성 염 용액 또는 멸균된 주사가능한 용액을 사용함으로써 수행된다.
활성 성분은 또한 적합한 경우 1종 이상의 담체 또는 첨가제와 함께 마이크로캡슐 또는 리포솜/중심체로서 제제화될 수 있다.
화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 추가로, 본 발명의 조성물은 상기 나타낸 손상 또는 질환의 치료에 유익할 수 있는 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 복수의 활성 성분이 함께 존재하는 제약 조성물에 관한 것이며, 여기서 그 중 적어도 1종은 본 발명의 화합물이다.
제약 조성물을 제조하는 경우에, 본 발명에 따른 화합물은 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체와 혼합되거나 또는 그로 희석된다.
본 발명은 추가로 상기 정의된 상태, 예컨대 상기 정의된 바와 같은 근육 소모 상태, 또는 상기 정의된 바와 같은 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 상태, 특히 근병증, 또는 수축기 또는 확장기 기능장애와 연관된 심장 상태, 또는 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.
상기 의약의 제조에 관해서는, 상기 기재된 제약 조성물과 관련하여 주어진 설명을 참조한다.
본 발명은 또한 상기 정의된 상태, 예컨대 상기 정의된 바와 같은, 근육 소모 상태, 또는 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 상태, 특히 근병증, 또는 수축기 또는 확장기 기능장애와 연관된 심장 상태, 또는 당뇨병의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 정의된 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
마찬가지로, 본 발명은 스트레스 상태, 예컨대 장기간 기계적 환기, 수술, 만성 심부전 또는 원발성 근육 질환 동안의 횡경막 수축성의 보호 또는 증진을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 횡경막 수축성을 보호 또는 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 하기에 관한 것이며:
- 울혈성 심부전으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축 및/또는 횡경막 약화를 치료 또는 예방하는 방법;
- 만성 심부전으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 암으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 근독성 및/또는 심장독성 물질, 예컨대 독소루비신을 사용한 암 치료로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 선천성 근병증으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- AIDS로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 만성 신질환으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 신부전으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 당뇨병으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 중증 화상으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 노화 동안의 근육감소증으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 혈액 공급의 감소로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 일시적 또는 장기간 부동화로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 장기간 기계적 환기로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축 및/또는 횡경막 약화를 치료 또는 예방하는 방법;
- 탈신경으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 장기간 무중력으로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 영양실조로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법;
- 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법;
- 수축기 또는 확장기 기능장애와 연관된 심장 상태를 치료 또는 예방하는 방법;
상기 방법들은 그를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 특히 추가로 하기에 관한 것이며:
- 집중 치료 동안 횡경막 수축성 및 기능의 보호를 포함한, 중대 질병 근병증을 치료 또는 예방하는 방법;
- 네말린 근병증을 치료 또는 예방하는 방법;
- 염증성 근병증을 치료 또는 예방하는 방법;
- 당뇨병으로부터의 근병증을 치료 또는 예방하는 방법;
- 폐고혈압으로부터의 근병증을 치료 또는 예방하는 방법;
- 만성 심부전, 특히 하위유형인 HFrEF 및 HFpEF로부터의 근병증을 치료 또는 예방하는 방법;
- 신부전으로부터의 근병증을 치료 또는 예방하는 방법;
- 종양 악액질로부터의 근병증을 치료 또는 예방하는 방법;
상기 방법들은 그를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 구체적으로 하기에 관한 것이다:
- 박출 계수 감소된 심부전 (HF-rEF)으로부터 유발되거나 그와 연관된 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법.
- 박출 계수 보존된 심부전 (HF-pEF)으로부터 유발되거나 그와 연관된 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법.
- 고혈압으로부터 유발되거나 그와 연관된 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법.
- 종양 악액질로부터 유발되거나 그와 연관된 골격근 또는 심근 위축을 치료 또는 예방하는 방법.
- 독소루비신에 의해 유도된 근육 위축 및/또는 심장 독성을 치료 또는 예방하는 방법.
- 노화로부터 유발되는 근육감소증 및/또는 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법.
- 만성 신질환으로부터 유발되는 근육 위축을 치료 또는 예방하는 방법.
- 기계적 환기 또는 울혈성 심부전으로 인한 횡경막 약화를 치료 또는 예방하는 방법.
- 선천성 근병증, 특히 동일 유전적 기원의 근육 위축을 치료 또는 예방하는 방법.
- 당뇨병-유도된 근육 위축을 치료 또는 예방하는 방법.
- 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법.
- 수축기 또는 확장기 기능장애와 연관된 심장 상태를 치료 또는 예방하는 방법.
본원에 사용된 용어 "그를 필요로 하는 대상체"는 상기 언급된 상태 또는 질환 중 1종 이상을 앓고 있는 대상체를 지칭하거나 또는 상기 언급된 상태 또는 질환 중 1종 이상이 발생할 가능성이 있는 대상체를 지칭한다. 바람직하게는, 용어 "그를 필요로 하는 대상체"는 포유동물, 특히 인간, 생산적 동물 또는 가축을 지칭한다. 특히, 용어 "그를 필요로 하는 대상체"는 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 및 "치료 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 대상 화합물의 양을 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 유효량의 본 발명의 화합물을 사용하여 현재 근육 소모 상태 및/또는 근병증을 앓는 환자를 치료함으로써 또는 이들 장애를 앓는 환자를 예방적으로 치료함으로써 이들 장애에 영향을 미칠 수 있는 것으로 인식된다.
상기 기재된 바와 같은 방법과 관련하여 본원에 사용된 용어 "치료" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 근육 소모 상태 및/또는 근병증의 진행을 둔화, 중단, 정지, 제어 또는 정지시킬 수 있지만 반드시 이들 상태 또는 장애의 모든 증상의 총체적 제거를 나타내는 것은 아닌 모든 과정, 뿐만 아니라 특히 이러한 상태 또는 장애에 걸리기 쉬운 환자에서의 상기 언급된 상태의 예방적 요법을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조성물"은 명시된 성분을 명시된 양으로 포함하는 생성물, 뿐만 아니라 명시된 성분의 명시된 양으로의 조합으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 포괄하는 것으로 의도된다. 제약 조성물과 관련하여 이러한 용어는 활성 성분(들) 및 담체를 구성하는 불활성 성분(들)을 포함하는 생성물, 뿐만 아니라 성분 중 임의의 2종 이상의 조합, 복합체화 또는 응집으로부터 또는 성분 중 1종 이상의 해리로부터 또는 성분 중 1종 이상의 다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 포괄하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 혼합함으로써 제조된 임의의 조성물을 포괄한다.
"제약상 허용되는"은 담체, 희석제 또는 부형제가 제제의 다른 성분과 상용성이어야 하고 그의 수용자에게 유해하지 않아야 한다는 것을 의미한다.
용어 "화합물의 투여" 및/또는 "화합물을 투여하는"은 치료를 필요로 하는 개체에게 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물의 전구약물을 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
증가된 MuRF1 발현과 연관된 상기 기재된 근육 소모 상태 및 근병증의 치료 및/또는 예방에서, 적절한 투여량 수준은 일반적으로 그를 필요로 하는 대상체의 kg 체중당 1일에 약 2 내지 500 mg일 것이며, 이는 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여량 수준은 1일에 약 5 내지 약 250 mg/kg일 것이다.
경구 투여를 위해, 조성물은 바람직하게는 그를 필요로 하는 대상체에 대한 투여량의 대증적 조정을 위해 10 내지 5000 밀리그램의 활성 성분, 특히 50.0, 100.0, 200.0, 500.0, 1000.0, 2000.0, 3000.0, 4000.0 및 5000.0 밀리그램의 활성 성분을 함유하는 정제의 형태로 제공된다.
이러한 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 그러나, 임의의 특정한 환자에 대한 구체적 용량 수준 및 투여 빈도는 달라질 수 있고, 사용되는 구체적 화합물의 활성, 그 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간, 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 방식 및 시간, 배출 속도, 약물 조합, 특정한 상태의 중증도 및 요법을 받고 있는 숙주를 포함한 다양한 인자에 좌우될 것임이 이해될 것이다.
본 발명의 화합물은 비경구 (예를 들어, 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 수조내 주사 또는 주입, 피하 주사 또는 이식물), 경구, 흡입 스프레이, 비강, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여 경로를 포함한 통상적인 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 다른 작용제와 조합되어 상기 언급된 질환 및 상태의 치료 및/또는 예방 방법에 추가로 유용하다.
본 발명의 화합물은 1종 이상의 다른 약물과 조합되어 화학식 I의 화합물 또는 다른 약물이 유용성을 가질 수 있는 상기 언급된 질환 및 상태의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있으며, 여기서 약물의 조합은 함께 약물 단독보다 더 안전하거나 또는 더 효과적이다. 이러한 다른 약물(들)은 이에 따라 통상적으로 사용되는 경로 및 양으로, 화학식 I의 화합물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 화학식 I의 화합물이 1종 이상의 다른 약물과 동시에 사용되는 경우에, 이러한 다른 약물 및 화학식 I의 화합물을 함유하는 단위 투여 형태의 제약 조성물이 바람직하다. 그러나, 조합 요법은 또한 화학식 I의 화합물 및 1종 이상의 다른 약물이 상이한 중첩 스케줄로 투여되는 요법을 포함할 수 있다. 또한, 1종 이상의 다른 활성 성분과 조합되어 사용되는 경우에, 본 발명의 화합물 및 다른 활성 성분은 각각이 단독으로 사용되는 경우보다 더 낮은 용량으로 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 상기 조합은 본 발명의 화합물과 1종의 다른 활성 화합물뿐만 아니라 2종 이상의 다른 활성 화합물의 조합을 포함한다.
본 발명의 화합물 대 제2 활성 성분의 중량비는 달라질 수 있고, 각각의 성분의 유효 용량에 좌우될 것이다. 일반적으로, 각각의 유효 용량이 사용될 것이다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 화합물이 또 다른 작용제와 조합되는 경우에, 본 발명의 화합물 대 다른 작용제의 중량비는 일반적으로 약 1000:1 내지 약 1:1000, 바람직하게는 약 200:1 내지 약 1:200의 범위일 것이다. 본 발명의 화합물과 다른 활성 성분의 조합은 일반적으로 또한 상기 언급된 범위 내에 있을 것이지만, 각각의 경우에, 각각의 활성 성분의 유효 용량이 사용되어야 한다. 이러한 조합에서, 본 발명의 화합물 및 다른 활성제는 개별적으로 또는 함께 투여될 수 있다. 추가로, 한 요소의 투여는 다른 작용제(들)의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 이루어질 수 있다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 추가의 예시를 위해 의도된다.
약어:
ALPHA 증폭된 발광 근접 동질 검정;
DSF 시차 주사 형광측정법;
GST 글루타티온-S-트랜스퍼라제;
UBE1 재조합 인간 His6-유비퀴틴 활성화 효소;
DMSO 디메틸술폭시드;
CDI 1,1'-카르보닐디이미다졸;
DMEM 둘베코 변형 이글 배지;
모의(Sham) 염수-처리;
DEX 덱사메타손;
PBS 포스페이트 완충 염수;
MCT 모노크로탈린;
TA 전경골근;
TL 경골 길이;
EDL 장지신근;
CSA 단면적;
LAD 좌측 전방 외부 관상 동맥의 결찰;
MI 심근경색;
WB 웨스턴 블롯;
BW 체중;
CHF 만성 심부전;
LV 좌심실;
LVEDD 좌심실 확장말기 직경;
LVEF 좌심실 박출 계수;
LVESD 좌심실 수축말기 직경;
LVFS 좌심실 분획 단축;
MRPS-5 미토콘드리아 리보솜 단백질 5;
Nox 2 NADPH 옥시다제 2;
CS 시트레이트 신타제;
SDH 숙시네이트 데히드로게나제;
TOM-20 외부 미토콘드리아 막의 트랜스로카제 20;
GAPDH 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제;
AU 임의 단위;
HPRT 하이포크산틴-포스포리보실-트랜스퍼라제;
FRET 형광 공명 에너지 전달;
MAFbx 근육 위축 F-박스;
CARP 심장 아드리아마이신-반응성 단백질;
GAPDH 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제;
eIF2B-델타 번역 개시 인자 eIF-2B 서브유닛 델타;
AS3MT 아르세나이트 메틸트랜스퍼라제;
ATPAF1 ATP 신타제 미토콘드리아 F1 복합체 어셈블리 인자 1;
GHDC GH3 도메인-함유 단백질;
BAX 아폽토시스 조절제 BAX.
도 1: 증가하는 농도의 화합물 MyoMed-946, MyoMed-946-5, MyoMed-946-8의 존재 하에 배양된 근모세포에서의 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 활성의 방출에 기초한 세포독성 시험 결과.
도 2: 증가하는 농도의 화합물 MyoMed-946, MyoMed-946-5, MyoMed-946-8의 존재 하에 배양된 근세포에서의 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 활성의 방출에 기초한 세포독성 시험 결과.
도 3 내지 7: 모의 (n=20) 및 정상 사료가 공급된 모노크로탈린 (MCT; n=27) 또는 MyoMed-946 화합물이 공급된 모노크로탈린 (MCT + MyoMed-946; n=27)으로 처리된 마우스의 물리적 특징. 데이터는 MCT 처리가 손상된 체중 증가 (도 3), 증가된 폐 울혈 (도 4) 및 체중 (BW) 대비 증가된 심장 중량 (도 5)에 의해 입증된 바와 같이, 투여된 사료에 비의존성으로 심장 악액질을 유도하였다는 것, 및 심장의 대표적인 H&E 염색된 내측 단면 (도 7)에 의해 가시화된 우심실 (RV) 비대 (도 6)가 감쇠된다는 것을 확인시켜 준다. *P<0.01 vs. 모의.
도 8 내지 12: MuRF1 억제제 MyoMed-946의 부재 또는 존재 하에 MCT-처리된 마우스에서의 장지신근 (EDL) (도 8), 가자미근 (도 9), 전경골근 (TA) (도 10)에 대한 골격근 습윤-중량 (경골 길이; TL에 대해 정규화됨). 추가로, TA 근육에 대한 섬유 단면적 (CSA)이 또한 제시되고 (도 11), 이는 대표적인 H&E 염색에 의해 가시화된다 (도 12). *P<0.05 vs. 모의; §P<0.01 vs. 모의 및 MCT + MyoMed-946.
도 13 내지 18: 모의 (n=10) 및 정상 사료가 공급된 모노크로탈린 (MCT; n=10) 또는 MuRF1 억제제 MyoMed-946이 공급된 모노크로탈린 (MCT + MyoMed-946; n=10), MyoMed-203이 공급된 모노크로탈린 (MCT + MyoMed-203; n=10) 및 MyoMed-205가 공급된 모노크로탈린 (MCT + MyoMed-205; n=10)으로 처리된 마우스의 물리적 특징. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다. 도 13: *** p<0.001 vs. 시작; 도 14: *** p<0.001 vs. 모의 ** p<0.01 vs. 모의; 도 15: *** p<0.001, ** p<001 vs. 모의, §§ p<0.01, § p<0.05 vs. MCT; 도 16 내지 18: *P<0.01 vs. 모의. 데이터는 MCT 처리가 손상된 체중 증가 (도 13), 증가된 폐 울혈 (도 14) 및 체중 (BW) 대비 증가된 심장 중량 (도 15)에 의해 입증된 바와 같이, 투여된 사료에 비의존성으로 심장 악액질을 유도하였다는 것, 및 우심실 (RV) 비대가 MuRF1 억제제 MyoMed-946, MyoMed-203 및 MyoMed-205에 의해 감쇠된다는 것 (도 16 내지 18)을 확인시켜 준다.
도 19 및 20: MuRF1 억제제 MyoMed-946, MyoMed-203 및 MyoMed-205의 부재 (모의) 또는 존재 하에 MCT-처리된 마우스에서의 장지신근 (EDL) (도 19) 및 전경골근 (TA) (도 20)에 대한 골격근 습윤-중량 (경골 길이; TL에 대해 정규화됨).
도 21: MuRF1 억제제 MyoMed-946, MyoMed-203 및 MyoMed-205의 부재 (모의) 또는 존재 하에 MCT-처리된 마우스에 대한 횡경막 최대 힘.
도 22 및 23: MuRF1 억제제 MyoMed-946, MyoMed-203 및 MyoMed-205의 부재 (모의) 또는 존재 하에 MTC-처리된 마우스의 전경골근 조직에서의 MuRF1 (도 22) 및 텔레토닌 (도 23)의 발현.
도 24 내지 27: 심근경색 (MI) 후 박출 계수 감소된 (HFrEF) 만성 심부전 (CHF)을 앓고 있는 마우스로부터의 횡경막 근섬유 다발의 등척성 수축 (도 24) 및 또한 등장성 수축 (도 25) 동안 평가된 횡경막 기능이며, 이에 의해 횡경막 최대 힘 (도 26) 및 횡경막 피크 일률 (도 27)을 결정하였다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. CHF, §P < 0.05, 및 §§P < 0.01 vs. CHF + MyoMed-946.
도 28 내지 30: 등척성 수축 (도 28) 및 또한 등장성 수축 동안 평가된 시험관내 골격근 수축 기능, 이에 의해 단축 속도 (도 29) 및 일률 (도 30)을 결정하였다. MCT 처리된 마우스는 모의와 비교하여 약 20%만큼의 단축 속도 및 일률의 손상을 나타낸다. 이들 손상은 MyoMed-946 화합물이 공급된 MCT 마우스에서 본질적으로 예방된다. *P<0.05 vs 모의; §P<0.01 vs. 모의 및 MCT + MyoMed-946.
도 31: B16F10 세포 접종된, 정규 사료를 받는 마우스 (종양) 및 B16F10 세포 접종된, 화합물 MyoMed-946 (종양 + MyoMed-946) 및 MyoMed-205 (종양 + MyoMed-205)가 공급된 마우스에서의 전경골근 (TA)의 근육 습윤-중량.
도 32: 접종 9일, 16일 및 23일 후 B16F10 세포 접종된 마우스 (흑색종 종양 세포 모델)의 와이어-행 시험. 종양 성장은 대조군 (모의)의 마우스와 비교하여 근육 기능의 유의한 감소를 유도한다 (종양군). 이러한 근육 기능의 감소는 화합물 MyoMed-946 (종양 + MyoMed-946) 및 MyoMed-205 (종양 + MyoMed-205)가 공급된 마우스에서 감쇠된다.
도 33 내지 35: 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 모의, MCT 및 MCT + MyoMed-946 마우스에 대한 eIF2B 서브유닛-델타 (도 33) 및 BAX (도 34)의 발현 수준과 대표적인 블롯 (도 35). *P<0.05 vs 모의; §P<0.01 vs. MCT.
도 36 내지 38: 모의, MCT 및 MCT + MyoMed-946 마우스에서의 MuRF1 (도 36), MAFBx (도 37) 및 CARP (도 38)에 대한 단백질 발현 수준 및 대표적인 웨스턴 블롯. MCT 처리는 MuRF1 및 CARP 발현의 증가를 유도하지만, 이는 MyoMed-946 화합물이 공급된 마우스에서 감쇠된다. MAFBx의 수준에서는 변화가 검출되지 않는다. *P<0.05 vs. 모의 및 MCT + MyoMed-946.
도 39: 모의, CHF 및 CHF + MyoMed-946 마우스의 횡경막 조직에서의 MRPS-5에 대한 단백질 발현 수준 및 대표적인 웨스턴 블롯. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다.
도 40 내지 42: 모의, CHF 및 CHF + MyoMed-946 마우스의 횡경막 조직에서의 MuRF1 (도 40), MuRF2 (도 41) 및 텔레토닌 (도 42)에 대한 단백질 발현 수준 및 대표적인 웨스턴 블롯. CHF는 MuRF1 및 MuRF2 발현의 증가 및 텔레토닌 발현의 감소를 유도하지만, 이들 효과는 MyoMed-946 화합물이 공급된 마우스에서 감쇠된다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다.
도 43 내지 46: 웨스턴 블롯 (WB) 분석 (도 43), Nox 2 (도 44) 및 LC3 I/II (도 46)을 통해 결정된 MuRF1의 단백질 발현 수준, 뿐만 아니라 정규 사료 (종양)가 공급되거나 화합물 MyoMed-946 (종양 + MyoMed-946) 또는 MyoMed-205 (종양 + MyoMed-205)가 공급된 B16F10 세포 접종된 마우스의 근육 조직에서의 반응성 산소 종 마커 니트로티로신 (도 45)의 수준. 종양 성장은 대조군 (모의) 마우스와 비교하여 종양군에서 MuRF1 및 Nox 2의 단백질 발현 수준뿐만 아니라 니트로티로신 수준의 유의한 증가 및 LC3 I/II의 발현 수준의 유의한 감소를 유도한다. 이들 변화는 화합물 MyoMed-946 (종양 + MyoMed-946) 또는 MyoMed-205 (종양 + MyoMed-205)가 공급된 마우스에서 감쇠된다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다.
도 47 내지 49: 모의, 만성 심부전 (CHF) 및 CHF + MyoMed-946 마우스로부터의 횡경막 조직 샘플에서의 시트레이트 신타제 (도 47), 숙시네이트 데히드로게나제 (도 48) 및 미토콘드리아 복합체 I (도 49)의 효소 활성. 데이터는 모의와 비교할 때 CHF에서 시트레이트 신타제, 숙시네이트 데히드로게나제 및 미토콘드리아 복합체 I 활성의 유의한 하향-조절을 나타내나, 이는 화합물 MyoMed-946이 공급된 마우스에서 감쇠된다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다.
도 50 및 51: 모의, 만성 심부전 (CHF) 및 CHF + MyoMed-946 마우스로부터의 횡경막 조직 샘플에서의 외부 미토콘드리아 막의 미토콘드리아 포린 (도 50) 및 TOM-20 (도 51)의 단백질 발현 수준. 데이터는 모의와 비교할 때 CHF에서 포린 및 TOM-20 발현의 유의한 하향-조절을 나타내나, 이는 화합물 MyoMed-946이 공급된 마우스에서 감쇠된다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다.
도 52 및 53: 모의로부터의 근육 조직 샘플, 정규 사료가 공급된 B16F10 세포 접종된 마우스 (종양) 및 화합물 MyoMed-946 (종양 + MyoMed-946) 또는 MyoMed-205 (종양 + MyoMed-205)가 공급된 B16F10 세포 접종된 마우스에서의 시트레이트 신타제 (도 52) 및 미토콘드리아 복합체 I (도 53)의 효소 활성. 데이터는 모의와 비교할 때 종양군에서 시트레이트 신타제 및 미토콘드리아 복합체 I 활성의 유의한 하향-조절을 나타내나, 이는 화합물 MyoMed-946 또는 MyoMed-205가 공급된 마우스에서 감쇠된다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다.
도 54: 덱사메타손 (DEX; 10 μmol/L)과의 24시간 인큐베이션 후 근관에서의 mRNA 수준의 MuRF1의 발현. 비처리 세포 (DEX) 및 0.1 μmol/L 및 10 μmol/L의 MyoMed-946 화합물로 2시간 동안 전처리된 세포의 배수 변화가 디스플레이된다. 전처리된 세포는 감소된 MuRF1 mRNA 수준을 나타낸다. *P<0.05 vs. 대조군. §P<0.05 vs. DEX.
도 55: PBS-완충제 중 MuRF1 중심 단편 (실선), PBS-완충제 플러스 1% DMSO 중 MuRF1 중심 단편 (파선), 및 PBS-완충제 플러스 DMSO 중 화합물 MyoMed-946의 10 mM 원액 1% (MyoMed-946의 최종 농도: 100 μM) 중 MuRF1 중심 단편 (점선)에 대한, 열 구배에 대한 350nm에서의 형광 신호 대 330nm에서의 형광 신호의 비로서 플롯팅된 시차 주사 형광측정법 (DSF) 용융 곡선.
도 56: HFpEF 래트 모델 실험을 위한 연구 설계의 개략적 도면.
도 57: HFpEF 래트 모델 실험에서의 심근 기능 심장초음파검사 및 침습적 혈류역학 측정의 결과.
도 58: HFpEF 래트 모델 실험에서의 골격근 질량 및 기능 측정의 결과.
도 59: 독소루비신-유도된 근육 위축 및 심장 독성 마우스 모델에서의 악액질 및 신체 스트레스 결과.
도 60: 독소루비신-유도된 근육 위축 및 심장 독성 마우스 모델에서의 심장초음파검사 결과.
도 61: 식이-유도된 체중 감소 동안 제2형 당뇨병을 갖는 비만 마우스에서의 와이어 행 시험. MyoMed-205를 사용한 처리는 근육 기능의 손실을 감쇠시켰다.
도 62: DIO 대조군 마우스와 비교한 MyoMed-203-처리된 DIO 마우스에서의 6시간 공복 후 혈액 글루코스 수준.
도 63 및 64: DIO 대조군 마우스와 비교한 MyoMed-203-처리된 DIO 마우스의 시험 제14일 및 제28일에서의 경구 글루코스 내성 시험 결과.
도 65: DIO 대조군 마우스와 비교한 MyoMed-203-처리된 DIO 마우스의 인슐린 내성 시험 결과.
I. 화합물 I의 합성
1. 분석
달리 언급되지 않는 한, 400 MHz NMR 기기 (브루커 아반스(Bruker AVANCE) III) 상에서 d6-디메틸술폭시드 (DMSO-d6) 중 1H NMR 및 결국 13C NMR을 통해 화합물을 특징화하였다.
자기 핵 공명 스펙트럼 특성 (NMR)은 백만분율 (ppm)로 표현된 화학적 이동 (δ)을 지칭한다. 1H NMR 스펙트럼에서의 이동의 상대 면적은 분자 내 특정한 관능기 유형에 대한 수소 원자의 수에 상응한다. 다중도와 관련하여 이동의 특성은 단일선 (s), 넓은 단일선 (s. br.), 이중선 (d), 넓은 이중선 (d br.), 삼중선 (t), 넓은 삼중선 (t br.), 사중선 (q), 오중선 (quint.) 및 다중선 (m)으로 나타내어진다.
C18-물질에 대한 빠른 구배로 HPLC-MS 및/또는 UPLC-MS에 의해 화합물을 추가로 특징화하였다 (전기분무-이온화 (ESI) 모드). 달리 언급되지 않는 한, ESI MS-데이터는 양성 모드로 기록된다. MS-데이터는 전하 대비 질량 비 (m/z) (여기서 z는 1임)로서 주어진 양성자화된 화합물 (M+H)+을 지칭한다.
HPLC-MS 사양:
HPLC-MS 기기: DAD/ELSD가 구비된 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 LC/MSD 시스템 및 애질런트 LC/MSD VL (G1956A), SL (G1956B) 질량-분광계 또는 DAD/ELSD가 구비된 애질런트 1200 시리즈 LC/MSD 시스템 및 애질런트 LC/MSD SL (G6130A), SL (G6140A) 질량-분광계. 모든 LC/MS 데이터는 양성/음성 모드 스위칭을 사용하여 수득하였다.
획득 방법: 칼럼: 조르박스(Zorbax) SB-C18 1.8 μm 4.6x15mm 신속 분해 카트리지 (PN 821975-932). 이동상: A: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산; B: 물 + 0.1% 포름산. 유량: 3ml/분; 주입 부피: 1μl.
용매 구배:
100% B 0분에서 0.01분까지;
100%에서 0% B 0.01분에서 1.5분까지, 선형 구배;
0% B 1.5분에서 1.8분까지;
0%에서 100% B 1.8분에서 1.81분까지.
이온화 모드: 대기압 화학적 이온화 (APCI);
스캔 범위: m/z 80-1000.
UPLC-MS 사양:
UPLC-MS 기기: 단일 사중극자가 구비된 애질런트 인피니티 1290, 전기분무 이온화 질량-분광계;
획득 방법: 칼럼: 액퀴티(Acquity) UPLC BEH C18; 1.7μm; 2.1x50mm; T=40℃. 이동상: A: 물 + 0.1% 트리플루오로아세트산; B: MeCN + 0.1% 트리플루오로아세트산. 유량: 1ml/분; 주입 부피 3μl; 실행시간 3분.
용매 구배 (3분 구배):
5%에서 100% B 0분에서 2.3분까지, 선형 구배;
100% B 2.3분에서 2.5분까지;
100%에서 5% B 2.5분에서 2.6분까지, 선형 구배;
100% B 2.6분에서 3.0분까지.
달리 언급되지 않는 한, ESI MS-데이터는 양성 모드로 기록된다. MS-데이터는 전하 대비 질량 비 (m/z) (여기서 z는 1임)로서 주어진 양성자화된 화합물 (M+H)+을 지칭한다.
2. 합성
2.1 정제용 HPLC-정제
HPLC (H2O-MeOH 또는 H2O-CH3CN; 워터스 선파이어 C18 OBD 정제용 칼럼 100Å, 5 μm, 19 mm X 100 mm와 선파이어 C18 정제용 가드 카트리지 100Å, 10 μm, 19 mm X 10 mm를 사용하는, DAD 및 질량-검출기가 장착된 애질런트 1260 인피니티 시스템)를 사용하여 정제용 HPLC-정제를 수행하였다. 미가공 화합물을 0.7 mL DMSO 중에 용해시켰다. 유량: 30mL/분. 수득된 분획의 순도를 분석용 LCMS에 의해 검사하였다. 각각의 분획이 크로마토그래피 직후에 용액 형태로 수득됨에 따라 그에 대해 스펙트럼을 기록하였다. 80℃에서 N2의 유동 하에 용매를 증발시켰다. 크로마토그래피-후 LCMS 분석에 기초하여 개별 분획을 합하였다. 고체 분획을 0.5 mL MeOH/CH3CN 중에 용해시키고, 사전-칭량된 표시된 바이알로 옮겼다. 수득된 용액을 80℃에서 N2의 유동 하에 다시 증발시켰다. 건조 후, 생성물을 최종적으로 LC-MS 및 1H-NMR에 의해 특징화하였다.
2.2 중간체
2.2.1 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]아세트산
무수 아세톤 (800 mL) 중 80.6 g (0.458 mol) 7-히드록시-4-메틸쿠마린, 110.1 g의 메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트 (0.480 mol) 및 무수 K2CO3 95 g (0.686 mol)의 혼합물을 3시간 동안 환류 하에 가열하였다. 이어서, 혼합물을 냉각시키고, 여과하고, 여과물을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 DMSO (450 mL) 중에 용해시키고, 수산화칼륨 수용액 (200 mL, 20% KOH)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 72시간 동안 교반하였다. 가수분해의 완결 후, 1 L의 물을 첨가하고, 용액을 10% 염산에 의해 pH=1-2로 산성화시켰다. 형성된 침전물을 여과하고, 진공 하에 건조시켜 순수한 생성물을 수득하였다. 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]아세트산의 수율은 75% (106 g)였다.
HPLC-MS (양성 모드): m/z 311 (M+H)+; 체류 시간: 1.11분.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): δ = 13.01 (br s, 1H), 8.0-7.97 (m, 2H), 7.71 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.60-7.58 (m, 2H), 7.09-7.05 (m, 2H), 6.23 (s, 1H), 5.34 (s, 2H), 2.40 (s, 3H).
2.2.2 2-아미노-N-(2-푸릴메틸카르바모일)아세트아미드
15 mL의 에탄올 중 1.46 g (6.74 mmol) 2-클로로-N-(2-푸릴메틸-카르바모일)아세트아미드 및 아지드화나트륨 90 mg (NaN3, 2당량)의 혼합물을 70℃에서 밤새 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 고체를 제거하고, 수득된 여과물을 진공 하에 농축시켰다 (1/3 부피). 잔류물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 MeOH 중에 용해시키고, Pd/C를 그 안에 첨가하였다. 혼합물을 탈기하고, 실온에서 수소 분위기 하에 밤새 교반되도록 하였다. 촉매를 제거하고, 여과물을 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 조 아민을 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. (X=O 0.8g 60%; X=O 0.7g 62% (2 단계로부터)).
2.2.3 2-아미노-N-(2-티에닐메틸카르바모일)아세트아미드
2-아미노-N-(2-티에닐메틸카르바모일)아세트아미드를 실시예 2.2.2와 유사하게 제조하되, 예외로 출발 물질로서 2-클로로-N-(2-푸릴메틸-카르바모일)아세트아미드 대신 1.26 g (5.41 mmol) 2-클로로-N-(2-티에닐메틸카르바모일)-아세트아미드를 사용하였다. 이에 따라 수득된 조 2-아미노-N-(2-티에닐메틸-카르바모일)아세트아미드를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 수율: 0.7g 62% (2 단계로부터).
2.3 화합물 I
실시예 1
[2-(2-푸릴메틸카르바모일아미노)-2-옥소-에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 (MyoMed-946)의 합성
310 mg (1.0 mmol)의 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-아세트산, 228 mg (1.05 mmol)의 2-클로로-N-(2-푸릴메틸카르바모일)아세트아미드, 75 mg (0.5 mmol)의 NaI 및 155 mg (1.2 mmol)의 DIPEA의 혼합물을 6 mL의 DMSO 중에 용해시켰다. 생성된 슬러리를 실온에서 72시간 동안 교반하여 반응을 완결시키고; 전환을 LC-MS에 의해 제어하였다. 이어서, 반응 혼합물을 50 mL의 물에 붓고, 생성된 침전물을 여과하고, 후속적으로 추가 분량의 물, 이소프로필 알콜 및 헥산으로 세척하였다. 고체 생성물을 진공 하에 건조시켰다. 2-(2-푸릴메틸카르바모일아미노)-2-옥소-에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시-메틸]벤조에이트 (MyoMed-946)의 수율은 61% (289 mg)였다.
[2-(2-푸릴메틸카르바모일아미노)-2-옥소-에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 (MyoMed-946)는 실온에서 수개월 저장에 걸쳐 붕괴 흔적을 나타내지 않았다 (NMR 및 LC-MS를 통해 확인됨).
HPLC-MS (양성 모드): m/z 491/492 (M+H)+; 체류 시간: 1.436분.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): δ = 10.50 (br.s, 1H, NH), 7.85 (br.s, 1H, NH), 7.55 (d, J = 8.0Hz, 2H, CH+CH), 7.22 (d, J = 8.4Hz, 1H, CH), 7.15 (d, J = 8.0Hz, 2H, CH+CH), 7.09 (s, 1H, CH), 6.60 (m, 2H, CH+CH), 5.90 (m, 1H, CH), 5.78 (d, J = 1.4Hz, 1H, CH), 5.74 (s, 1H, CH), 4.87 (s, 2H, OCH2), 4.44 (s, 2H, OCH2), 3.88 (d, J = 5.2Hz, 2H, NCH2), 1.91 (s, 3H, CH3).
MyoMed-946의 추가 분석 특징화
화합물의 순도 및 정체를 하기와 같이 1D 및 2D NMR 및 UPLC-MS를 사용하여 추가로 평가하였다:
NMR 분석을 위해, 2mg의 MyoMed-946을 미량의 CCl4가 있는 1 ml d6-디메틸술폭시드 중에 용해시켰다. 1H- 및 13C-스펙트럼뿐만 아니라 1H NMR 피크 배정을 위한 COSY 및 HSQC 2D-NMR 스펙트럼을 기록하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6 + CCl4): δ = 10.68 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.05 (d, J = 7.37 Hz, 2H), 7.53-7.45 (m, 4H), 7.14-6.91 (m, 2H), 6.40 (s, 1H), 6.30-6.16 (m, 2H), 5.37 (s, 2H), 4.94 (s, 2H), 4.44-4.23 (m, 2H), 2.41 (s, 3H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6 + CCl4): δ = 169.0, 165.1, 161.0, 160.0, 154.6, 153.3, 152.5, 151.8, 142.3 (2C), 129.6 (2C), 128.5, 127.6 (2C), 126.6, 113.5, 112.6, 111.4, 110.4, 107.0, 101.8, 69.1, 62.7, 36.0, 18.1.
UPLC-MS 분석을 위해, 소량의 MyoMed-946을 아세토니트릴 (MeCN) 중에 용해시키고, 이 용액 3 μl를 C18 UPLC 칼럼 (액퀴티 UPLC BEH C18; 1.7μm; 2.1x50mm) 상에 주입하였다. 사용된 UPLC-MS 시스템 및 분석 방법은 상기 기재된 바와 같았다.
UPLC-MS (양성 모드): m/z = 491.1 (M+H)+; 체류 시간: 1.7분.
실시예 2:
(1-메틸-2-옥소-2-우레이도-에틸) 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 (MyoMed-946-5)의 합성
실시예 1과 유사하되, 예외로 2-클로로-N-(2-푸릴메틸-카르바모일)아세트아미드 대신 N-카르바모일-2-클로로-프로판아미드를 사용하여 합성을 수행하였다.
HPLC-MS (양성 모드): m/z 439 (M+H)+; 체류 시간 1.388분.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): δ = 10.63 (br.s, 1H), 8.05-7.98 (m, 3H), 7.72-7.68 (m, 1H), 7.68-7.59 (m, 2H), 7.05-7.01 (m, 2H), 6.23 (s, 1H), 5.35 (s, 2H), 5.22-5.14 (m, 1H), 2.70 (d, 3H), 2.39 (s, 3H), 1.50 (d, 3H).
실시예 3:
[1-메틸-2-(메틸카르바모일아미노)-2-옥소-에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 (MyoMed-946-8)의 합성
실시예 1과 유사하되, 예외로 2-클로로-N-(2-푸릴메틸-카르바모일)아세트아미드 대신 2-클로로-N-(메틸카르바모일)프로판아미드를 사용하여 합성을 수행하였다.
HPLC-MS (양성 모드): m/z 425 (M+H)+; 체류 시간 1.327분.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): δ = 10.51 (br.s, 1H), 8.06-7.97 (m, 2H), 7.73-7.67 (m, 1H), 7.67-7.59 (m, 2H), 7.54 (br, s, 1H), 7.33 (br, s, 1H), 7.09-7.02 (m, 2H), 6.22 (s, 1H), 5.35 (s, 2H), 5.22-5.14 (m, 1H), 2.39 (s, 3H), 1.51 (d, 3H).
실시예 4:
N-[2-(2-푸릴메틸카르바모일아미노)-2-옥소-에틸]-4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤즈아미드의 합성
2 mL의 DMF 중 실시예 2.2.2에서 수득된 2-아미노-N-(2-푸릴메틸카르바모일)아세트아미드 (0.6 mmol), 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-아세트산 558 mg (1.8 mmol), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 109 mg (HOAt, 0.8 mmol)의 냉각된 용액에 EDC 124 mg (0.8 mmol)을 적가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 형성된 침전물을 수집하고, 메탄올에 이어서 물로 세척하고, 다시 메탄올로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물 110 mg을 수득하였다. 수율: 37%.
1H NMR (400 MHz, DMSO-D6, ppm): δ = 10.53 (s, 1H), 8.82 (t, J = 5.7Hz, 1H), 8.51 (br.s, 1H), 7.89 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.56 (m, 3H), 7.06 (m, 2H), 6.37 (s, 1H), 6.24 (d, J = 2.5Hz, 1H), 6.21 (s, 1H), 3.50 (s, 2H), 4.35 (d, J = 5.7Hz, 2H), 3.99 (d, J = 5.0Hz, 2H), 2.38 (s, 3H).
실시예 5:
[2-옥소-2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트의 합성
310 mg (1.0 mmol)의 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-아세트산, 250 mg (1.05 mmol)의 2-클로로-N-(2-티에닐메틸카르바모일)아세트아미드, 75 mg (0.5 mmol)의 NaI 및 155 mg (1.2 mmol)의 DIPEA의 혼합물을 6 mL의 DMSO 중에 용해시켰다. 생성된 슬러리를 실온에서 72시간 동안 교반하여 반응을 완결시키고; 전환을 LC-MS 스펙트럼에 의해 제어하였다. 이어서, 반응 혼합물을 50 mL의 물에 붓고, 형성된 침전물을 여과하고, 후속적으로 추가 분량의 물, 이소프로필 알콜 및 헥산으로 세척하였다. 생성물을 진공 조건 하에 건조시켰다. 수율: [2-옥소-2-(2-티에닐메틸카르바모일-아미노)에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 61% (310 mg).
HPLC-MS (양성 모드): m/z 507/508 (M+H)+; 체류 시간 1.399분.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): δ = 10.67 (br s, 1H), 8.47 (br s, 1H), 8.03 (d, J = 8.0, 2H), 7.71 (d, J = 8.0, 1H), 7.64 (d, J = 8.0, 2H), 7.39 (d, J = 4.0, 1H), 7.08-6.95 (m, 4H), 6.22 (s, 1H), 5.35 (s, 2H), 4.92 (s, 2H), 4.52 (d, J = 4.6, 2H), 2.39 (s, 3H).
실시예 6:
4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-N-[2-옥소-2-(2-티에닐메틸-카르바모일아미노)에틸]벤즈아미드
표제 화합물을 실시예 3과 유사하게 제조하였다. 표제 화합물 90 mg을 수득하였다. 수율: 30%.
1H NMR (400 MHz, DMSO-D6, ppm): δ = 10.52 (s, 1H), 8.82 (t, J = 5.7Hz, 1H), 8.63 (br.s, 1H), 7.89 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.39 (d, J = 4.2Hz, 1H), 7.07 (m, 2H), 6.98 (s, 1H), 6.95 (m, 1H), 6.21 (s, 1H), 5.31 (s, 2H), 4.23 (d, J = 5.2Hz, 2H), 4.00 (d, J = 5.7Hz, 2H), 2.39 (s, 3H).
실시예 7
[2-옥소-2-(2-피리딜메틸카르바모일아미노)에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 (MyoMed-203)의 합성
2-클로로-N-(2-피리딜메틸카르바모일)아세트아미드의 제조:
-10℃로 냉각시킨 무수 디클로로메탄 (100 mL) 중 2-피리딜메탄아민 (7.84 g, 72.5 mmol)의 교반 용액에, 클로로아세틸 이소시아네이트 (8.66 g, 72.5 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 디클로로메탄 (2 x 30 mL)으로 세척하고, 건조시켜 2-클로로-N-(2-피리딜메틸카르바모일)아세트아미드 12.0 g (52.7 mmol, 수율: 73%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d): δ = 9.45 (s, 1H), 9.05 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 7.67 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24 - 7.18 (m, 1H), 4.65 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 4.13 (s, 2H).
HPLC-MS (음성 모드) m/z 226 (M-H)+; 체류 시간 0.565분.
4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조산의 제조:
아세톤 (1000 mL) 중 7-히드록시-4-메틸-크로멘-2-온 (80.6 g, 458 mmol)의 용액에 K2CO3 (94.9 g, 687 mmol) 및 메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트 (110 g, 480 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 환류하였다. 이어서, 이를 실온으로 냉각시키고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 물 (1000 mL)과 혼합하였다. 불용성 고체를 여과에 의해 수집하고, 물, 2-프로판올 및 헥산으로 세척하고, 건조시키고, DMSO (500 mL) 중에 용해시켰다. 20% 수성 KOH (150 mL)를 수득된 메틸 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반되도록 두었다. 반응이 완결된 후, 이를 물 (3000 mL)에 붓고, 10% 염산에 의해 pH 1-2까지 산성화시켰다. 30분 동안 교반한 후, 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물, 2-프로판올 및 헥산으로 세척하고, 건조시켜 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조산 106 g (342 mmol, 수율: 75%)을 수득하였다.
메틸 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트:
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 7.98 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.12 - 6.96 (m, 2H), 6.20 (s, 1H), 5.32 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.38 (s, 3H).
4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조산:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 12.99 (br s, 1H), 7.96 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.11 - 6.99 (m, 2H), 6.20 (s, 1H), 5.31 (s, 2H), 2.37 (s, 3H).
HPLC-MS (양성 모드) m/z 311 (M+H)+; 체류 시간 1.242분.
[2-옥소-2-(2-피리딜메틸카르바모일아미노)에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트의 제조:
DMSO (100 mL) 중 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조산 (9.28 g, 29.9 mmol), 2-클로로-N-(2-피리딜메틸카르바모일)아세트아미드 (7.49 g, 32.9 mmol), DIPEA (4.64 g, 35.9 mmol) 및 NaI (0.900 g, 6.00 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 냉수 (500 mL)에 부었다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물, 2-프로판올 및 헥산으로 세척하고, 건조시켜 [2-옥소-2-(2-피리딜메틸카르바모일-아미노)에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 (MyoMed-203) 13.8 g (27.5 mmol, 수율: 92%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 10.65 (br s, 1H), 8.69 (br s, 1H), 8.47 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.73 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.26 - 7.20 (m, 1H), 7.08 - 6.97 (m, 2H), 6.19 (s, 1H), 5.33 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 4.46 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H).
HPLC-MS (음성 모드) m/z 502 (M-H)+; 체류 시간 1.176분.
실시예 8
4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-N-[2-(2-티에닐메틸-카르바모일아미노)에틸]벤즈아미드 (MyoMed-205)의 합성
tert-부틸 N-[2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸]카르바메이트의 제조:
무수 아세토니트릴 (400 mL) 중 CDI (42.8 g, 264 mmol)의 현탁액에 2-티에닐메탄아민 (14.9 g, 132 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 초음파 조에 실온에서 1시간 동안 유지하였다. 이어서, 물 (2.5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 초음파 조에 추가로 30분 동안 유지하였다. 용액의 탈기 후, N-boc-에틸렌디아민 (21.1 g, 132 mmol)을 첨가하고, 반응물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 물 (100 mL)로 연화처리하고, 여과하고, 건조시켜 tert-부틸 N-[2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)-에틸]카르바메이트 35.2 g (118 mmol, 89%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.35 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 6.97 - 6.88 (m, 2H), 6.83 - 6.72 (m, 1H), 6.55 - 6.38 (m, 1H), 6.07 - 5.93 (m, 1H), 4.34 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.11 - 3.00 (m, 2H), 2.99 - 2.88 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
HPLC-MS (양성 모드) m/z 300 (M+H)+; 체류 시간 1.156분.
2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸암모늄 클로라이드의 제조:
무수 디클로로메탄 (200 mL) 중 tert-부틸 N-[2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)-에틸]카르바메이트 (19.5 g, 65.1 mmol)의 용액에 10% 디옥산/HCl (50 mL)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 진공 하에 건조시켜 2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸암모늄 클로라이드 14.3 g (60.6 mmol, 95%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 8.08 (br s, 3H), 7.35 (s, 1H), 6.93 (s, 2H), 6.78 (br s, 1H), 6.51 (br s, 1H), 4.38 - 4.29 (m, 2H), 3.31 - 3.19 (m, 2H), 2.88 - 2.74 (m, 2H).
HPLC-MS (양성 모드) m/z 200 (M+H)+; 체류 시간 0.428분.
4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조산의 제조:
아세톤 (1000 mL) 중 7-히드록시-4-메틸-크로멘-2-온 (80.6 g, 458 mmol)의 용액에 K2CO3 (94.9 g, 687 mmol) 및 메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트 (110 g, 480 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 환류하였다. 이어서, 이를 실온으로 냉각시키고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 물 (1000 mL)과 혼합하였다. 불용성 고체를 여과에 의해 수집하고, 물, 2-프로판올 및 헥산으로 세척하고, 건조시키고, DMSO (500 mL) 중에 용해시켰다. 20% 수성 KOH (150 mL)를 수득된 메틸 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반되도록 두었다. 반응이 완결된 후, 이를 물 (3000 mL)에 붓고, 10% 염산에 의해 pH 1-2까지 산성화시켰다. 30분 동안 교반한 후, 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물, 2-프로판올 및 헥산으로 세척하고, 건조시켜 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조산 106 g (342 mmol, 수율: 75%)을 수득하였다.
메틸 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트:
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 7.98 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.12 - 6.96 (m, 2H), 6.20 (s, 1H), 5.32 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.38 (s, 3H).
4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조산:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 12.99 (br s, 1H), 7.96 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.11 - 6.99 (m, 2H), 6.20 (s, 1H), 5.31 (s, 2H), 2.37 (s, 3H).
HPLC-MS (양성 모드) m/z 311 (M+H)+; 체류 시간 1.242분.
4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-N-[2-(2-티에닐-메틸카르바모일아미노)에틸]벤즈아미드의 제조:
DMA (150 mL) 중 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조산 (12.6 g, 40.6 mmol)의 용액에 CDI (7.26 g, 44.8 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)-에틸암모늄 클로라이드 (10.1 g, 42.7 mmol) 및 트리에틸아민 (4.90 g, 48.4 mmol)을 첨가하고, 반응물을 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 물 (600 mL)을 첨가하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물, 2-프로판올 및 헥산으로 세척하고, 건조시켜 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-N-[2-(2-티에닐-메틸카르바모일아미노)에틸]벤즈아미드 (MyoMed-205) 13.3 g (27.1 mmol, 67%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.61 - 8.47 (m, 1H), 7.86 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.38 - 7.27 (m, 1H), 7.12 - 7.02 (m, 2H), 6.51 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 6.22 (s, 1H), 6.17 - 6.06 (m, 1H), 5.30 (s, 2H), 4.36 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.32 - 3.17 (m, 4H), 2.39 (s, 3H).
HPLC-MS (양성 모드) m/z 492 (M+H)+; 체류 시간 1.249분.
II. 생화학적 검정
1. MuRF1 - 티틴 상호작용 검정:
MuRF1과 티틴 사이의 상호작용을 억제하는 화합물을 확인하기 위해 ALPHA 스크린을 사용하여 소분자 스크린을 수행하였다. 이러한 스크린은 MuRF1 B-박스-코일드 도메인이 티틴 A169와 상호작용하는 것을 확인한 MuRF1과 티틴 상호작용 연구를 기초로 한다 (예를 들어, 문헌 [Mrosek et al., Biochemistry 2008, 47, 10722-10730] 참조). 이러한 ALPHA 스크린 검정의 원형은 WO 2009/077618에 기재되어 있다.
절차:
이들 상호작용 단편을 WO 2009/077618에 기재된 바와 같이 GST 및 비오틴 융합 단백질로서 발현시켜 각각 글루타티온 수용자 및 아비딘 공여자 비드로 복합체 형성을 모니터링할 수 있었다. 280,000개 화합물의 조사 (사내 라이브러리, EMBL 화학 핵심 시설)는 MuRF1-티틴 상호작용에 대한 Ki 값이 5-25 μmol/L인 총 40개의 분자를 확인하였다.
2. MuRF1 E3 리가제 활성의 억제의 결정:
이어서, 75 nmol/L UBE1 (보스턴 바이오켐(Boston Biochem)), 1μmol/L UbcH5c (보스턴 바이오켐), 100 μmol/L 유비퀴틴, 4 mmol/L ATP, 100 nmol/L 티틴 A168-170을 20-100 μmol/L의 각각의 화합물과 혼합함으로써, 화합물을 티틴 또는 MuRF1 자체 (자기-유비퀴틴화)에 대해 지시된 MuRF1 E3 리가제 활성에 대한 효과에 대해 평가하였다. 220 nmol/L MuRF1의 첨가에 의해 반응을 시작하고, 이어서 37℃에서 1시간, SDS PAGE와 MuRF1 및 티틴 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 모든 반응은 또한 5% DMSO를 포함하였다. MyoMed-946, MyoMed-946-5 및 MyoMed-946-8을 시험하였으며, 이는 유비퀴틴화 패턴에 기초하여 MuRF1 E3 리가제 활성을 유의하게 억제하는 것으로 확인될 수 있었다.
3. 화합물 MyoMed-946의 부재 및 존재 하에서의 MuRF1 중심 단편의 시차 주사 형광측정법 (DSF):
MuRF1 단백질 안정성에 대한 화합물 MyoMed-946의 효과를 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 시험관내에서 결정하였다.
방법:
"MuRF1 중심 단편"을 이전에 기재된 바와 같이 발현시키고 (Mrosek M et al., FASEB J, 2007, 21, 1383-1392), DSF 실험에 75 μM 최종 농도로 사용하였다. 화합물 MyoMed-946을 DMSO 중 10 mM 원액으로부터 DSF 검정 완충제로서의 PBS 중 100 μM로 희석하여, 1% DMSO의 최종 농도를 생성하였다. 실온에서 1시간 사전-인큐베이션 후, 단백질 수용액을 모세관에 침지시키고, 프로메테우스(Prometheus) NT.48 나노DSF 장치 (나노템퍼 테크놀로지스(NanoTemper Technologies), 독일 뮌헨)에 넣었다. 열 구배에서의 단백질 언폴딩시 LED 레이저 여기 후 발생한 고유 트립토판 또는 티로신 형광의 변화를 각각 330 nm 및 350 nm에서 검출하였다. 열 구배에서의 고유 단백질 형광의 변화를 각각 350 nm 및 330 nm에서 모니터링하였다. 열 단백질 언폴딩시 350/330 nm의 형광 파장 비의 1차 도함수를 사용하여 단일 및 다중 전이 상태의 전이 중간점 (Tm)을 계산하였다.
결과:
도 55로부터 볼 수 있는 바와 같이, PBS 중 MuRF1 중심 단편의 Tm은 65.2℃ (실선)였고, 1% DMSO의 첨가에 의해 65.8℃로 무시할만한 변화만이 있었다 (파선). 대조적으로, 화합물 MyoMed-946의 첨가에 의해 MuRF1의 열 언폴딩에 대한 강한 효과가 관찰되었다 (점선). 화합물 MyoMed-946은 52.5℃의 유의하게 감소된 주요 Tm에 의해 나타난 바와 같이 MuRF1을 탈안정화시켰다.
III. 생물학적 조사
1. 세포 배양 실험
뮤린 C2C12 근모세포 (CRL-1772, ATCC)를 10% 소 태아 혈청 (FCS; 깁코(Gibco)®인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)이 보충된 DMEM (론자(Lonza); 스위스 바젤) 중에서 배양하였다. 근관으로의 분화를 유도하기 위해, 전면생장 미만의 배양물을 2% 말 혈청 함유 DMEM (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 독일 실츠)으로 교체시켰다. 후속적으로, 화합물 농도를 증가시키면서 (0.1에서 10 μmol/L, DMSO 중에 용해됨) 또는 동일 부피의 DMSO를 사용하여 근관을 2시간 동안 전처리한 후, 10 μmol/L 덱사메타손 (DEX; 시그마-알드리치; 독일 실츠)으로 24시간 동안 처리하였다. 이어서, 근관 직경을 영상 분석 소프트웨어 (어낼리시스 3.0, 올림푸스 소프트 이미징 솔루션즈 게엠베하(Olympus Soft Imaging Solutions GmbH), 독일 뮌스터)에 의해 평가하였다. 선택된 화합물의 세포독성을 결정하기 위해, 증가하는 농도로 근모세포 또는 근관을 24시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 문헌 [Bellocci et al., Anal Biochem, 2008, 374, 48-55]에 기재된 바와 같이 세포 파괴에 대한 척도로서 세포 배양 상청액 중 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 활성의 농도를 정량화하였다. 도 1 및 2로부터 볼 수 있는 바와 같이, 화합물 MyoMed-946은 근모세포 및 근관 (근세포) 둘 다에서 낮은 독성을 나타낸다.
2. 동물 실험
2.1 폐고혈압 마우스 모델:
2.1.1 MuRF1 억제제 MyoMed-946을 사용한 시험 시리즈 1:
동물 실험은 카를스루에 지역 행정청(Regierungspraesidium Karlsruhe) (35-9185.81/G-141/13) 및 라이프치히 지역 행정청(Regierungspraesidium Leipzig) (TVV 40/16)에 의해 승인되었다. 1) 염수-처리군 (모의; n=20); 2) 정상 사료가 공급된 모노크로탈린 (MCT)-처리군 (MCT; n=27); 및 3) MuRF1 억제제 사료가 공급된 MCT-처리군 (MCT+화합물; n=27)을 포함한 3개의 마우스 군을 본 연구에 포함시켰다. 간략하게, 문헌 [Ahn et al., PLoS One, 2013, 8:e62702]에 기재된 바와 같이, MCT가 식욕부진보다는 폐고혈압 및 후속 RV 기능장애로 인한 심장 악액질을 유도하는 것으로 알려진 기간인 6주 동안 C57BL/6 마우스 (8주령)에게 MCT (600 mg/kg) 또는 매칭되는 부피의 염수를 매주 피하로 주사하였다. 마우스를 12:12시간 명/암 주기 하에 음식물 및 물을 자유롭게 제공하면서 동일한 조건에 노출시켰다. MCT+화합물 군은 MCT 주사 1주 전에 억제제 사료를 받기 시작하였고, 한편 모의 및 MCT 군에는 선택된 화합물이 첨가되지 않은 것을 제외하고는 동일한 사료를 공급하였다. 체중을 각각의 마우스에 대해 매주 기록하였다. 마우스를 펜타닐 (0.05 mg/kg), 메데토미딘 (0.5 mg/kg), 미다졸람 (5 mg/kg) 및 케타민 (100 mg/kg)의 i.p. 투여에 의한 깊은 마취 후에 희생시켰다. 희생시, 심장 및 폐를 절제하고, 세정하고, 블롯팅 건조하고, 칭량하고, 심장을 4% PBS-완충 포르말린 중에 고정시켰다. 좌측 전경골근 (TA), 가자미근, 장지신근 (EDL) 및 늑골 횡경막의 절편을 또한 절제하고, 칭량하고, 4% PBS 완충 포르말린 중에 고정시킨 한편, 나머지 근육 부분은 분자 분석을 위해 액체 N2로 즉시 동결시켰다.
조직학적 평가를 위해, 파라핀-포매된 TA 근육 절편 (3 μm)을 H&E로 염색한 다음, 섬유 단면적 (CSA)을 영상화 소프트웨어 (애널리시스 3.0, 올림푸스 소프트 이미징 솔루션즈 게엠베하, 독일 뮌스터)에 의해 평가하였다. 추가로, 심장의 내측 단면 (3 μm)을 유리 슬라이드 상에 탑재하고, 후속적으로 H&E로 염색하여 RV 벽 두께를 평가하였다.
도 3 내지 5로부터 볼 수 있는 바와 같이, 체중 증가, 폐 중량 및 심장 중량은 MCT 공급된 마우스와 MCT+MyoMed-946 공급된 마우스 사이에 거의 동일하였으며, 이는 화합물 공급과 상관없이 두 군 모두에서 질환이 진행되었다는 것을 시사한다. 중요하게는, 도 6 및 7로부터 볼 수 있는 바와 같이, MuRF1 억제제 MyoMed-946은 우심실 비대의 발생을 감쇠시킨다. 추가로, 도 8 내지 12로부터 볼 수 있는 바와 같이, MCT 처리된 마우스는 골격근 질량의 점진적 손실을 나타낸 반면, MCT + 화합물 공급된 마우스는 이러한 경향을 따르지 않았고 보호되었다 - TA 근육에서 가장 명백한 효과가 관찰되었다.
2.1.2 MuRF1 억제제 MyoMed-946, MyoMed-203 및 MyoMed-205를 사용한 시험 시리즈 2:
시험 시리즈 1과 유사하게 시험 시리즈 2를 수행하였다. 간략하게, 3개의 마우스 군을 본 연구에 포함시켰다: 1) 염수-처리된 마우스 (모의; n=10); 2) 정상 사료가 공급된 모노크로탈린 (MCT)-처리된 마우스 (MCT; n=10); 및 3) MuRF1 억제제 사료가 공급된 MCT-처리된 마우스 (MCT+화합물; 각각의 화합물에 대해 n=10). 8주령 C57BL/6 마우스에게 MCT (600 mg/kg) 또는 매칭되는 부피의 염수를 8주 동안 매주 피하로 주사하였다. MCT+화합물 군은 MCT 주사 1주 전에 억제제 사료를 받기 시작하였고, 한편 모의 및 MCT 군에는 선택된 화합물이 첨가되지 않은 것을 제외하고는 동일한 사료를 공급하였다. 사료 중 화합물 농도는 0.1 중량%로, 마우스당 약 3 mg의 1일 화합물 섭취가 이루어졌다. 체중을 각각의 마우스에 대해 매주 기록하였다. 마우스를 8주 처리 후에 희생시켰다. 희생시, 시험 시리즈 1에 기재된 바와 같이 검사 및 조직 분석을 수행하였다.
도 13 내지 15로부터 볼 수 있는 바와 같이, 체중 증가, 폐 중량 및 심장 중량은 MCT 공급된 마우스와 MCT + 화합물 공급된 마우스 사이에 유사하였으며, 이는 화합물 공급과 상관없이 두 군 모두에서 질환이 진행되었다는 것을 시사한다. 또한 이 시험 시리즈에서, 도 16 내지 18로부터 볼 수 있는 바와 같이, MuRF1 억제제 MyoMed-946, MyoMed-203 및 MyoMed-205는 우심실 비대의 발생을 감쇠시킨다. 추가로, 도 19 내지 21로부터 볼 수 있는 바와 같이, MCT 처리된 마우스는 골격근 질량의 점진적 손실을 나타낸 반면, MCT + 화합물 공급된 마우스는 이러한 경향을 따르지 않았고 보호되었다 - 화합물 MyoMed-203에 대해 가장 현저한 효과가 관찰되었다. 추가로, 도 22로부터 볼 수 있는 바와 같이, TA 근육 조직에서의 MuRF1-발현 수준은 MCT + 화합물 공급된 마우스에서 명확하게 감소되었으며, 여기서 화합물 MyoMed-205에 대해 가장 현저한 감소가 관찰되었다. 또한, 도 23으로부터 볼 수 있는 바와 같이, MuRF1 표적 단백질인 텔레토닌의 발현 수준은 MCT + 화합물 공급된 마우스에서 본질적으로 정상화되었다.
2.2 심근경색 LAD 마우스 모델:
하기 기재된 바와 같이 좌측 전방 외부 관상 동맥 (LAD)을 결찰하여 급성 심근경색 (MI)을 유도한 다음 만성 (수축기) 심부전 (CHF)이 발생하도록 함으로써 박출 계수 감소된 심부전 (HFrEF)을 앓고 있는 심근경색 마우스 모델을 생성하였다.
LAD 결찰 절차:
라이프치히 심장 센터에서 12주령의 C57/BL6 마우스에 대해, 관련 분야에서 확립되고 널리 공지된 절차에 따라 소형 동물 수술을 수행하였다 (예를 들어 문헌 [Bowen et al., J Appl Physiol, 2015, 118, 11-19; Mangner et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle, 2015, 6, 381-390] 참조). 간략하게, LAD 군으로부터의 마우스를 MMF; 메데토미딘 (0.5 mg/kg 체중), 미다졸람 (5.0 mg/kg 체중), 펜타닐 (0.05 mg/kg 체중)의 i.p. 주사에 의해 마취시켰다. 무의식 마우스를 수술대에 고정시켰다. 흉곽의 복측 부분을 면도하고, 세척하고, 멸균하였다. 이어서, 무의식 마우스에 삽관하고, 동물 호흡기 (TSE 게엠베하(TSE GmbH), 61352 바트 홈부르크 지멘스스트라쎄 21; 제품: http://tinateb.com/wp-content/uploads/2016/06/TSE_ Respirator-Compact_20080724_HR.pdf)를 사용하여 정상 실내 공기로 환기시켰다. LAD 수술을 위해, 흉곽을 칼돌기 위 약 1 cm 및 흉골연 좌측 약 1 cm 여기서 피부를 절제함으로써 개방하였다. 아래에 위치한 흉근을 추가 손상 없이 측면으로 이동시켜 흉곽 벽에 접근하도록 하였다. 2개의 늑골 사이의 늑간근을 늑골의 파괴 없이 측면으로 이동시켰다. 이에 의해 생성된 흉곽내 접근부를 심막 위에 삽입된 수술용 스프레더에 의해 넓혔다. 심막을 2개의 해부 겸자를 사용하여 수술로 절단부 개방하였다. 흉선이 수술 영역에 존재하는 경우에, 이를 수술용 스왑으로 측면으로 밀어 대동맥 근부에 접근하도록 하였다. 후크를 사용하여 심장을 심막 밖으로 조심스럽게 이동시키고, 좌심방을 수술용 스왑으로 측면에 두었다. 이어서, LAD를 5.0 프롤렌 봉합사 (에티콘(Ethicon), http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/non-absorbable-sutures/prolene-polypropylene 참조)로 결찰하였다. 대동맥 근부에 근접하게 결찰을 수행하고, 관상 동맥 전방 벽이 창백하게 보일 때까지 봉합사를 조였다. 결찰 후에, 흉곽 벽 및 이어서 피부를 4.0 프롤렌 봉합사 (회사: 에티콘)를 사용하여 단일의 잠금 이음매로 닫았다.
대조군으로서, 모의 수술을 수행하였다. 모의 대조군에 대해, 하기 절차는 상기 기재된 바와 정확히 동일하되, 예외로 5.0 프롤렌 봉합사를 조이지 않고 LAD 주위에 느슨하게 나와있도록 하였다.
발관 및 아티파메졸 (2.5 mg/kg 체중) 및 플루마제닐 (0.5 mg/kg 체중)의 i.p. 주사에 의한 마취 길항작용에 의해 수술을 종료하였다. 마우스를 깨어날 때까지 따뜻한 매트 상에 둔 다음, 다시 동물 케이지로 옮겼다. 전문가 스태프에 의한 상기 전체 절차의 시간은 대략 30분이었다.
LAD 결찰 1주 후에, 심장초음파검사를 M-모드로 수행하여 MI를 확인하였고, 즉 좌심실 확장말기 (LVEDD) 및 좌심실 수축말기 (LVESD) 직경을 평가하여 좌심실 (LV) 분획 단축 (LVFS = [LVEDD _ LVESDLVEDD] x 100)을 계산하였다. 후속적으로, 경색이 큰 마우스 (좌심실 박출 계수 (LVEF) <20%)만을 2개의 군, 즉 정상 사료를 받는 제1 군 (CHF, n = 11) 및 화합물이 보충된 사료를 받는 제2 군 (0.1%의 화합물 MyoMed-946, CHF + MyoMed-946, n = 12)으로 무작위화하였다. 모의 수술 동물은 정상 사료만을 받았다 (n=15). 9주 후에, 심장초음파검사를 다시 수행하였다.
표 1: 10주의 개입 후 동물 특징
Figure pct00012
*P < 0.05 vs. 모의; ***P < 0.001 vs. 모의.
기능적 및 분자적 특징화를 위해 동물을 희생시켜 조직, 특히 횡경막 조직을 수집하였다. 모든 실험 및 절차는 지역 동물 연구 협의회, 라이프치히 대학교 및 작센 주 관청(Landesbehoerde Sachsen) (TVV 36/15)에 의해 승인되었다.
2.3 수축 기능:
직접적 기능적 평가를 제공하기 위해, 골격근 섬유 다발, 즉 MCT 마우스 및 CHF 마우스의 횡경막으로부터의 섬유 다발에서의 수축성을 하기와 같이 측정하였다. 횡경막으로부터의 섬유 다발을 단리하여, 문헌 [Bowen et al., FASEB J, 2017, 31]에 기재된 바와 같이 길이-제어 레버 시스템 (301B, 오로라 사이언티픽 인크.(Aurora Scientific Inc.), 캐나다 오로라)을 사용하여 시험관내 수축 기능이 평가되도록 하였다. 간략하게, 근육 다발을 완충제-충전된 기관 조 (~22℃)에 수직으로 탑재하고, 최적 길이로 설정하고, 15분 후에 1-300 Hz (600 mA; 500 ms 트레인 지속기간; 0.25 ms 펄스 폭)의 힘-주파수 프로토콜을 통해 자극하였다. 이어서, 근육을 150 Hz로 300 ms 동안 자극한 후에 외부 부하 (최대 테타니성 힘의 80 - 10%; 각각 1분 이격)에 대해 단축되도록 하는 힘-속도 프로토콜을 근육에 적용하였다. 길이의 제1 변화 10 ms 후 및 과도의 선형 구간 (DMA 소프트웨어, 오로라 사이언티픽)에서 단축 속도를 결정하였다. 근육 질량 (g)을 Lo (cm)와 추정된 근육 밀도 (1.06)의 곱으로 나눔으로써 힘 (N)을 근육 단면적 (CSA; cm2)에 대해 정규화하여 비력 (N/cm2)을 계산하였다. 단축 속도를 최적 근육 길이에 대해 정규화하고 (Lo/s), 각각의 부하에 대해 단축 속도와 비력의 곱으로서 일률을 계산하였다 (W/cm2).
도 24 내지 27로부터 볼 수 있는 바와 같이, 만성 심부전 마우스 (CHF 마우스)로부터의 횡경막 근섬유 다발은 전기 자극 동안 보다 적은 힘을 발생하였고 (도 24), 또한 감소된 최대 힘 (도 25 및 26) 및 피크 일률 (도 27)을 가졌다. 따라서, 모의 동물과 비교하여, 대조군 사료를 받는 CHF 마우스는 제10주에 횡경막 근병증이 발생하였다. 화합물 MyoMed-946의 공급은 마우스를 이러한 경색후 횡경막 약화로부터 보호하였다. 만성 심부전으로 인한 횡경막 기능 및 횡경막 최대 힘의 손실은 CHF 마우스의 비처리군과 비교하여 화합물 MyoMed-946이 공급된 마우스에서 유의하게 감소될 수 있다. 이는 화합물 MyoMed-946에 의한 MuRF1의 선택적 억제가 심근경색에 의해 유도된 박출 계수 감소된 심부전 (HFrEF) 후 횡경막 기능에 대한 이익을 매개한다는 것을 나타낸다.
마찬가지로, 도 28 내지 30으로부터 볼 수 있는 바와 같이, MCT-유도된 폐고혈압을 앓고 있는 마우스에서의 횡경막의 수축 기능장애 (단축 속도 및 일률 면에서)도 또한, MCT 마우스에게 화합물 MyoMed-946 (MCT + MyoMed-946)을 공급한 경우에 본질적으로 방지되었다.
따라서, 종합하면, 상기 발견은 화합물 MyoMed-946에 의한 MuRF1의 선택적 억제가 만성 심부전 및 심장 악액질에서 골격근 양 (즉, 질량) 및 품질 (즉, 수축 기능) 둘 다에 대한 이익을 매개한다는 것을 시사한다.
2.4 종양 마우스 모델:
8주령 암컷 C57BL/6N 마우스에게 B16F10 흑색종 세포 (9x105개 세포) 또는 염수 (모의, n = 10)를 접종하였다. 종양 접종 후 처음 3일 이내에, B16F10 마우스뿐만 아니라 모의 마우스는 정규 사료를 받았다. 이어서, B16F10 마우스를 무작위로 3개의 군으로 나누었으며, 여기서 제1 군은 MyoMed-946 사료 (종양 + MyoMed-946, n = 10)를 받았고, 제2 군은 MyoMed-205 사료 (종양 + MyoMed-205, n = 10)를 받았고, 제3 군은 선택된 화합물이 첨가되지 않은 것을 제외하고는 동일한 사료 (종양, n = 10)를 받았다. 사료 중 화합물 농도는 0.1 중량%로, 마우스당 약 3 mg의 1일 화합물 섭취가 이루어졌다. 또한 모의 군에는 선택된 화합물이 첨가되지 않은 것을 제외하고는 동일한 사료를 공급하였다. 종양 접종 9, 16 및 23일 후 각각의 마우스로 와이어-행 시험 (근육 기능)을 수행하였다. 이러한 목적을 위해, 바닥 위 70 cm의 높이에서 와이어 (길이: 40 cm, 직경: 2.5 mm)가 있는 표준 와이어 행 구축물을 사용하였다. 와이어의 중심 아래에 톱밥이 있는 큰 상자를 놓았다. 시험을 위해, 마우스를 두 사지로 와이어에 매달고, 매달린 시간을 기록하였다. 각각의 동물을 각각 최대 180초 동안 3회 시도하였다. 3회 시도 후, 최대 유지 임펄스를 계산하였다 (매달린 시간 x 체중).
마우스를 종양 접종 25일 후에 희생시켰다. 희생시, 상기 기재된 바와 같이 검사 및 조직 분석을 수행하였다.
도 31로부터 볼 수 있는 바와 같이, 종양 유도된 골격근 위축 (TA 근육 중량에 기초함)은 종양 마우스와 비교하였을 때 종양 + MyoMed-946 마우스 및 종양 + MyoMed-205 마우스에서 적어도 어느 정도 감쇠될 수 있었다. 이러한 효과는 와이어-행 시험에서 보다 현저하며 (도 32), 여기서 화합물 MyoMed-946 및 MyoMed-205의 투여 (종양 + MyoMed-946 마우스 및 종양 + MyoMed-205 마우스)는 정상 식이를 받는 종양 마우스와 비교하여 근육 기능의 손실을 유의하게 감쇠시킨다.
2.5 박출 계수 보존된 심부전 (HFpEF)에서의 심근 및 골격근 변경 - 래트 모델
연구 설계의 개략적 도면이 도 56에 제시된다. 이 시험을 위해, ZSF1 래트를 사용하였다. 20주령 후, ZSF1 래트는 확장기 순응도를 상실하여, 증가된 확장말기 부피를 유도하고, 따라서 인간 HFpEF (또한 확장기 심부전으로 공지됨)를 모방한다.
암컷 ZSF1 마른 (대조군, n=25) 및 ZSF1 비만 (n=40) 래트를 연구에 포함시켰다. 20주령에 HFpEF의 발생을 심장초음파검사 / 침습적 혈류역학 측정에 의해 확인하고, 동물의 하위세트로부터의 조직 물질을 수집하였다 (대조군 n=10; ZSF1 비만 n=10). 나머지 대조군 래트 (대조군, n=15)를 또 다른 12주 동안 정적으로 유지시켰고, 반면 나머지 ZSF1 비만 동물 (n=30)은 하기 군으로 무작위화하였다: (1) 정상 사료를 받는 래트 (HFpEF 군, n = 15) 또는 화합물 MyoMed-205가 보충된 사료 (0.1%의 MyoMed-205, HFpEF+MyoMed-205, n = 15). 래트를 12시간 명/암 주기 하에 음식물 및 물을 자유롭게 제공하면서 동일한 조건에 노출시켰다. 무작위화 12주 후에, 심장초음파검사 및 침습적 혈류역학 측정을 수행하여 확장기 기능장애의 정도를 규명하였다. 래트를 후속적으로 희생시키고 (깊은 마취 하에 흉부의 개방), 기능적 및 분자 분석을 위해 골격근 및 심근 조직을 수거하였다 (포르말린 고정 및 액체 질소 중에 순간 동결). 모든 실험 및 절차는 지역 동물 연구 위원회, TU 드레스덴 및 작센 주 관청 (TVV 42/2018)에 의해 승인되었다.
심장초음파검사
래트를 이소플루란 (1.5-2%)에 의해 마취시키고, 베보(Vevo) 3100 시스템 및 21-MHz 트랜스듀서 (비주얼 소닉(Visual Sonic), 후지필름(Fujifilm))를 사용하여 경흉부 심장초음파검사를 수행함으로써 이전에 기재된 바와 같이 심장 기능을 평가하였다 (T.S. Bowen et al., Eur. J. Heart Fail., 2015, 17, 263-272). 수축기 기능의 경우, 흉골연 장축 및 단축의 B- 및 M-모드를 유두근의 수준에서 측정하였다. 확장기 기능은 좌심실의 중격벽 내 기저 중격 분절의 수준에서 펄스파 도플러 (승모판 속도의 초기 (E) 및 심방 (A) 파의 측정을 위함) 및 조직 도플러 (심근 속도 (E' 및 A')의 측정을 위함)를 사용하여 심첨 4방도에서 평가하였다. 베보 LAB 2.1.0 소프트웨어를 사용하여 기능적 파라미터 (즉, LV 박출 계수 (LVEF) 및 일회 박출량 (SV)) 및 [E/E'] 및 [E/A]의 비를 수득하였다.
침습적 혈류역학 측정
침습적 혈류역학 압력 측정을 최종 절차로서 수행하였다. 마취되었지만 (케타민, 크실라진) 자발적으로 호흡하는 래트에서, 우측 경동맥에 래트 PV 카테터 (SPR-838, AD인스트루먼츠 리미티드(ADInstruments Limited))를 캐뉼라삽입하고, 이를 조심스럽게 좌심실의 중간에 배치하였다. LV 확장말기 및 수축말기 압력, 최대 압력 상승률 (dP/dtmax), 최대 압력 하락률 (dP/dtmin) 및 LV 이완에 대한 시간 상수 (τ)를 측정하고, 이 후에 카테터를 대동맥 내로 회수하고, 위상 및 평균 동맥압을 측정하였다. 평균 동맥압은 상행 대동맥에서 측정하였다. 데이터를 랩차트8 소프트웨어 (AD인스트루먼츠)에 기록하였다.
골격근 기능
우측 EDL 및 좌측 가자미근을 절제하고, 후크와 힘 트랜스듀서 사이의 크렙스-헨셀라이트(Krebs-Henseleit) 완충제-충전된 기관 조에 수직으로 탑재하고, 출력을 연속적으로 기록하고 디지털화하였다 (1205A: 단리된 근육계 - 래트, 오로라 사이언티픽 인크., 캐나다 온타리오). 고출력 양극성 자극기 (701C; 오로라 사이언티픽 인크., 캐나다 온타리오)로부터의 초-최대 전류 (700 mA, 500 ms 트레인 지속기간, 0.25 ms 펄스 폭)로 근육을 자극하는 백금 전극에 의해 시험관내 근육 기능을 평가하였다. 근육 다발을 생성된 최대 연축 힘과 등가의 최적 길이 (Lo)로 설정하고, 이 후 조 온도를 25℃로 증가시키고, 15분 열 평형화 기간이 이어졌다. 이어서, 힘-주파수 프로토콜을 1분 휴지 간격으로 이격된 1, 15, 30, 50, 80 및 120 Hz에서 수행하였다. 5분 휴지 기간 후, 이어서 근육을 5분에 걸쳐 (2초마다 40 Hz) 피로 프로토콜에 적용하였다. 피로 프로토콜 동안 생성된 힘을 생성된 초기 힘에 대해 정규화하여 피로도의 상대 평가를 제공하였다.
결과:
20주 (무작위화 시점)에서의 동물 특징
동물을 상이한 처리군으로 무작위화하기 전에 HFpEF의 발생을 검증하기 위해, 10마리의 ZSF1-마른 및 10마리의 ZSF1-비만 동물을 심장초음파검사, 침습적 혈류역학 측정 및 골격근 기능의 측정에 의해 분석하였다. ZSF1-비만 동물은 증가된 체중 (비만의 징후)을 나타냈고, 심근 비대의 징후 (경골 길이에 대해 정규화하였을 때 증가된 심장 중량)가 명백하였다. 확장기 기능에 대한 마커와 관련하여, 비 E/e 및 좌심실 확장말기 압력 (LVEDP)은 ZSF1-비만 동물에서 유의하게 증가하였다. 확장기 기능의 장애에도 불구하고, 좌심실 박출 계수 (LVEF)는 정상이었고 (>60%), 심지어 마른 대조군 래트와 비교하였을 때 약간 더 높았다. 평균 동맥 혈압 (MABP)과 관련하여, ZSF1-비만 동물에서 유의한 상승이 관찰되었다. 이러한 MABP의 증가는 HFpEF 환자로부터 널리 알려진 특색인 동물에서의 과다긴장 상태의 징후이다. 말초 골격근과 관련하여, ZSF1-비만 동물은 근육 위축 및 골격근 기능장애가 발생하였다. 요약하면, 20주령의 동물은 HFpEF의 진단에 따르는 특색이 발생하였다.
HFpEF에서의 심장 파라미터에 대한 MyoMed-205 처리의 영향
심근 기능에 대한 MyoMed-205의 영향을 평가하기 위해, 심장초음파검사 및 침습적 혈류역학 측정을 수행하였다. 도 57에 제시된 바와 같이, 좌심실 박출 계수 (LVEF) (도 57A)는 대조군 ZSF1-마른 동물과 비교하였을 때 비-처리된 HFpEF 동물에서 유의하게 감소되었다. 이러한 감소는 MyoMed-205를 사용한 12주 처리에 의해 유의하게 감쇠된다. 확장기 기능에 대한 파라미터인 비 E/e (도 57B) 및 LVEDP (도 57C)와 관련하여, MyoMed-205를 사용한 처리는 ZSF1-비만 비처리 동물에서 관찰된 증가를 감쇠시켰다. MyoMed-205의 처리 효과는 MABP에서는 관찰되지 않았다 (도 57D). 종합하면, 이들 결과는 MyoMed-205를 사용한 처리가 수축기뿐만 아니라 확장기 기능을 유의하게 개선시켰고, 이러한 효과는 혈압을 조정함으로써 매개되지 않는다는 것을 제시한다.
골격근 질량 및 기능에 대한 MyoMed-205 처리의 영향
골격 질량 및 골격근 기능은 상이한 처리군으로의 무작위화 시점에 ZSF1-비만 동물에서 이미 손상되었다. 본 시험은 MyoMed-205가 골격근 질량 및 기능을 조정할 수 있는지 여부를 검사하였다. 결과는 도 58에서 볼 수 있다. 전경골근 (TA)의 근육 중량의 분석 (도 58A)은 HFpEF 비처리 동물에서 근육 습윤 중량의 유의한 하락을 밝혀냈다. 이러한 근육 위축은 MyoMed-205에 의해 감쇠되었다. EDL (도 58C) 및 가자미근 (도 58B)과 관련하여, HFpEF의 발생은 근육 습윤 중량에 영향을 미치지 않았다. 그러나, EDL 근육에서 MyoMed-205를 사용한 처리는 근육 중량의 작지만 유의한 증가를 유발하였다 (도 58C).
근육 위축의 발생에 대한 근육 중량을 측정하는 것 이외에도, 근육 기능의 평가가 매우 중요하다. 도 58D에 제시된 바와 같이, 처리되지 않은 ZSF1-비만 동물은 ZSF1-마른 대조군과 비교하였을 때 골격근 기능장애가 발생하였다. 이러한 근육 힘의 강하는 절대 비 근육 힘을 측정하였을 때 가자미근에서 명백하였다 (도 58D). HFpEF 동물을 12주 동안 MyoMed-205로 처리한 것은 기능적 손실의 감쇠를 유발하였다.
결론:
결과는 HFpEF에서 MyoMed-205가 심근 확장기 기능장애의 발생을 감쇠시키고 골격근 위축 및 골격근 기능장애를 감쇠시킨다는 것을 제시한다.
2.6 독소루비신-유도된 근육 위축 및 심장 독성
독소루비신 (DOX)은 다양한 암 치료에 사용되는 효율적인 화학요법 약물이다. 그러나, 그의 사용은 초기 및 만성 심장독성 및 근독성과 연관된다. 설치류에서, 독소루비신의 단일 주사는 심근 및 골격근 질량을 감소시킬 수 있고, 이어서 기능의 현저한 손상이 이어진다.
독소루비신으로 처리된 마우스 모델에서 MyoMed-205 풍부한 음식물의 효과를 평가하였다. C57bl/6 마우스를 사육장에서 3일 동안 순응시킨 다음, 하기와 같이 4개의 군으로 무작위로 분류하였다: 1. 대조군 (위약 음식물 + 0.9% 염수 i.p.) 주사); 2. MyoMed-205 (MyoMed-205-음식물, 1g/kg MyoMed-205가 보충된 음식물; + 0.9% 염수 주사); 3. DOX (위약 음식물 + DOX 주사): 4. DOX+MyoMed-205 (MyoMed-205 음식물 + DOX 주사). 동물에게 제1 DOX 주사 전 7일 동안 MyoMed-205 음식물 또는 위약을 사전-공급하였다. DOX 처리는 총 투여량 25mg/kg을 각각 제10일, 제12일, 제16일, 제25일 및 제28일에 5회 주사로 제공하는 것이었다. 동물의 체중 및 음식물 섭취를 매일 하루 중 동일한 시간에 측정하여 음식물 소비 및 체중 증가를 평가하였다. 심장 기능을 제19일 및 제42일에 심장초음파검사에 의해 평가하였다. 도 59에 제시된 바와 같이, MyoMed-205를 공급하는 것은 제43일까지 악액질 소모 및 신체 스트레스의 특색을 현저하게 감소시킬 수 있었다: MyoMed-205-공급된 마우스는 제지방 질량이 더 높았고 (도 59A), 체지방을 더 많이 보유하였으며 (도 59B), 간질성 부종이 없는 액체가 약 2배 덜하였다 (도 59C). *는 p<0.05 v. 대조군을 의미하고; $는 p<0.05 vs. MyoMed-205를 의미하고; §는 p<0.05 vs. DOX+MyoMed-205를 의미한다 (터키 사후-검정).
제15일 및 25mg/Kg 축적된 DOX 투여량 후의 심장초음파검사는 도 60으로부터 볼 수 있는 바와 같이 심장 독성 및 부전을 나타냈으며, 즉 각각 감소된 심장 중량 (경골 길이에 의해 보정됨) (도 60C), 감소된 박출 계수 (장축 계획으로부터 계산됨) (도 60A) 및 감소된 분획 단축 (단축 계획으로부터 계산됨) (도 60B)을 나타냈다. 제43일까지의 MyoMed-205 처리는 이를 방지하였다. 요약하면, DOX 화학요법 동안 MyoMed-205의 투여는 심장을 보호하는데 유용하다. *는 p<0.05 v. 대조군을 의미하고; $는 p<0.05 vs. MyoMed-205를 의미하고; §는 p<0.05 vs. DOX+MyoMed-205를 의미한다 (터키 사후-검정).
2.7 식이-유도된 체중 감소 동안 제2형 당뇨병을 갖는 비만 마우스에서의 근육 기능 (DIO 마우스 모델: 인슐린 저항성 및 비만을 동반한 당뇨병)
당뇨병의 진행 동안 근병증이 또한 발생하는 당뇨병 마우스 모델에서 화합물-공급의 효과를 시험하였다. DIO 마우스에서 4개월 동안 고프룩토스 고지방 식이 (HFD)에 의해 당뇨병을 유도하였다. 체중 증가는 22.2%였다. 마우스는 증가된 공복 글루코스 및 인슐린 저항성이 발생하였다. 대조군 동물은 정상 설치류 식이 (정규 식이)를 받았다. 이어서, 30일의 시험 기간 동안 체중 감소를 유도하였다. 제1 단계에서, 동물에게 16일 동안 정상 설치류 식이를 공급하였다. 이어서, 제2 단계에서, 동물은 14일 동안 저칼로리 식이를 받았다. 체중은 종점에서 평균 12.4% 감소하였다. 제1 단계의 시작 2일 후에, 식이에 MyoMed-205를 (1g 화합물 /1kg 음식물로) 보충하였다. 제1 단계의 시작에 이어서 시험 기간의 제3일, 제7일, 제14일, 제21일 및 제28일에, 화합물-공급된 마우스 및 대조군 마우스를 와이어 행 시험에 의해 그의 근육 강도에 대해 비교하였다.
시험 설계: ICR-DIO 수컷 마우스를 각각 8-10마리 동물의 군으로 무작위로 배정하였다. 3개의 대조군을 포함시켰다: 비만이 없는 마우스의 대조군 (대조군; 정규 식이 (RD); n=10), 전체 연구 기간 동안 고프룩토스 고지방 식이가 공급된 비만 마우스 (DIO HFD; n=8); 및 체중 감소가 개시된 비만 마우스 (DIO 대조군; n=8).
와이어 행 시험: 와이어 행 시험 (WHT)을 위해, 바닥 위 70 cm의 높이에서 와이어 (길이: 40 cm, 직경: 2.5 mm)가 있는 표준 와이어 행 구축물을 사용하였다. 와이어의 중심 아래에 톱밥이 있는 큰 상자를 놓았다. 시험을 위해, 마우스를 두 사지로 와이어에 매달고, 마우스가 떨어지기 전 와이어를 잡고 있을 수 있었던 시간을 기록하였다. 각각의 동물을 최대 180초 동안 3회 시도하였다. 3회 시도 후, 최대 유지 임펄스를 계산하였다 (매달린 시간 x 체중).
결과:
Figure pct00013
도 61은 DIO 대조군 마우스와 비교한 MyoMed-205-처리된 DIO 마우스의 WHT의 결과의 그래프 예시이다. 볼 수 있는 바와 같이, MyoMed-205는 제4주 (28일)까지 DIO 대조군 마우스와 비교하여 근육 강도를 유의하게 개선시켰다. 근육 강도는 또한 DIO HFD 마우스와 비교하여 유의하게 개선되었고, 제4주까지 대조군 (RD) 마우스 군과 유의하게 상이하지 않았다 (도 61에 제시되지 않음).
2.8 식이-유도된 체중 감소 동안 제2형 당뇨병을 갖는 비만 마우스에서의 글루코스 및 인슐린 조절 (DIO 마우스 모델: 인슐린 저항성 및 비만을 동반한 당뇨병)
실시예 2.7과 유사하게, DIO 마우스에서 4개월 동안 고프룩토스 고지방 식이 (HFD)에 의해 당뇨병을 유도하였다. 마우스는 증가된 공복 글루코스 및 인슐린 저항성이 발생하였다. 대조군 동물은 정상 설치류 식이 (정규 식이)를 받았다. 이어서, 30일의 시험 기간 동안 체중 감소를 유도하였다. 제1 단계에서, 동물에게 16일 동안 정상 설치류 식이를 공급하였다. 이어서, 제2 단계에서, 동물은 14일 동안 저칼로리 식이를 받았다. 제1 단계의 시작 2일 후에, 식이에 MyoMed-203을 (1g 화합물 /1kg 음식물로) 보충하였다.
시험 설계: ICR-DIO 수컷 마우스를 각각 8-10마리 동물의 군으로 무작위로 배정하였다. 3개의 대조군을 포함시켰다: 비만이 없는 마우스의 대조군 (대조군; 정규 식이 (RD); n=10), 전체 연구 기간 동안 고프룩토스 고지방 식이가 공급된 비만 마우스 (DIO HFD; n=8); 및 체중 감소가 개시된 비만 마우스 (DIO 대조군; n=8).
혈액 글루코스 수준의 결정
혈액 글루코스 수준의 결정을 6시간 공복 후에 수행하였다. 온 콜 플러스(On Call Plus) 혈당측정기 (아콘 래보러토리즈, 인크.(Acon Laboratories, Inc.), 미국) 및 특이적 시험 스트립 (REF G133-111)을 글루코스 수준의 결정에 사용하였다. 꼬리 끝을 절개하여 꼬리 정맥으로부터 혈액을 수득하였다. 5-6 μl의 혈액을 각각의 검정에 사용하였다.
MyoMed-203-처리된 동물에서, 혈액 글루코스 수준은 처리 기간 전반에 걸쳐 DIO 대조군과 비교하여 유의하게 더 낮았으며, 여기서 공복 혈액 글루코스 값은 연구 제2일 및 제21일에 유의하게 변화하였다. 도 62는 MyoMed-203-처리된 DIO 마우스와 DIO 대조군 마우스의 비교를 보여준다.
글루코스 내성 시험
경구 글루코스 내성 시험 (OGTT)을 위해, 마우스를 6시간 공복 후 10 ml/kg의 용량 부피로 2 g/kg의 용량의 글루코스에 의해 경구 처리하였다. 처리 직전 및 글루코스 투여 15, 30, 60 및 120분 후에 글루코스 측정을 수행하였다. 시험 동안 각각의 마우스에서의 혈액 글루코스 배출률을 기재하는 AUC를 하기 식을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00014
MyoMed-203은 OGTT 데이터에 따른 처리 및 체중 감소 14일 후 비만 마우스에서 약간의 혈당강하 효과를 나타냈다. 이 동물 군에서의 혈액 글루코스 수준은 DIO 대조군과 비교하여 30분의 OGTT 시험에서 더 낮은 경향이 있었다. 글루코스 제거를 기재하는 계산된 AUC에 대해서도 마찬가지이다. 유사한 경향이 연구 제28일에 계속되었다: 모든 대조군과 비교하여 MyoMed-203 처리군에서, 120분에서 글루코스 수준의 유의한 감소가 관찰되었고; 계산된 글루코스 제거 곡선하 면적 또한 더 낮은 경향이 있었다. 도 63 및 도 64는 MyoMed-203-처리된 DIO 마우스 및 DIO 대조군 마우스의 각각 제14일 및 제28일에서의 OGTT 데이터를 보여준다.
인슐린 작용에 대한 내성 시험
인슐린 내성 시험 (ITT)을 위해, 마우스에게 6시간 공복 후 5 ml/kg의 부피로 0.75 또는 0.60 IU/g 체중의 용량의 재조합 인간 인슐린 용액 (릴리(Lilly), 프랑스; REF C620001K)을 복강내로 주사하였다. 처리 직전 및 인슐린 투여 15, 30, 60 및 120분 후에 글루코스 측정을 수행하였다. 혈액 글루코스 배출률의 결과를 곡선하 면적 (AUC)으로서 표현하였다.
모든 대조군과 비교하여 MyoMed-203-처리된 마우스에서 인슐린 주사 후 120분에서 글루코스 수준의 유의한 감소가 관찰되었다. 도 65는 MyoMed-203-처리된 DIO 마우스 및 DIO 대조군 마우스에서의 ITT 결과를 보여준다.
3. 조직 분석
3.1 프로테옴 및 웨스턴 블롯 분석:
3.1.1 MCT 마우스:
프로테옴 분석:
모의, MCT 및 MCT+화합물 마우스 (군당 n=3)에서의 동결된 횡경막 샘플로부터의 단백질을 액체 N2 하에 분말화하였다. 이어서, 문헌 [Konzer et al., Methods in molecular biology, 2013, 1005, 39-52]에 기재된 바와 같이, 바트 나우하임 소재의 DZHK 질량 분광측정법 핵심 시설에서 질량 분광측정법을 수행하였다. MCT/모의 및 MCT+화합물/MCT에 대한 상대비를 결정하였으며, 히트만을 차등 발현되고 고도로 유의한 것으로 간주하고 (P<0.01), 웨스턴 블롯에 의해 추가로 연구하였다.
웨스턴 블롯 분석:
웨스턴 블롯 분석은 동결된 TA 근육 샘플을 프로테아제 억제제 믹스 (억제제 믹스 M, 세르바(Serva), 독일 하이델베르크)를 함유하는 RIPA 완충제 (50 mmol/L 트리스, 150 mmol/L 염화나트륨, 1 mmol/L EDTA, 1% NP-40, 0.25% 소듐-데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1% 트리톤 X-100; pH 7.4) 또는 이완 완충제 (90 mmol/L HEPES, 126 mmol/L 염화칼륨, 1 mmol/L MgCl, 50 mmol/L EGTA, 8 mmol/L ATP, 10 mmol/l 크레아틴포스페이트; pH 7.4) 중에서 균질화하고, 초음파처리하고, 16,000 x g로 5분 동안 원심분리하는 것으로 이루어졌다. 상청액의 단백질 농도를 결정하고 (BCA 검정, 피어스(Pierce), 독일 본), 분취물 (5 - 20 μg)을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막 (PVDF)으로 옮기고, 하기 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다: MAFbx (1/2000, 유로젠텍(Eurogentec), 벨기에 세라잉), MuRF1 (1/1000, 미오메딕스 리미티드(Myomedix Ltd.), 독일 넥카르게뮌드), CARP (1/500, 미오메딕스 리미티드, 독일 넥카르게뮌드), BAX (1/1000; 압캠(Abcam), 영국 캠브리지) 및 eIF2B-델타 (1/200; 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 미국 산타 크루즈). 후속적으로 막을 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 효소적 화학발광 (슈퍼 시그널 웨스트 피코(Super Signal West Pico), 써모 피셔 사이언티픽 인크.(Thermo Fisher Scientific Inc.), 독일 본)에 의해 특이적 밴드를 가시화하고, 1D 스캔 소프트웨어 패키지 (스캐널리틱스 인크.(Scanalytics Inc.), 미국 록빌)를 사용하여 밀도측정을 정량화하였다. 이어서, 블롯을 로딩 대조군 GAPDH (1/30000; 하이테스트 리미티드(HyTest Ltd), 핀란드 투르쿠)에 대해 정규화하였다. 모든 데이터는 모의 대비 배수 변화로서 제시된다.
MCT 및 MCT+MyoMed-946 프로테옴의 비교에 의해 나타난 바와 같이, 5종의 단백질의 발현 수준은 화합물에 특이적으로 반응하는 것으로 밝혀졌다. 이들 단백질의 발현 수준이 표 2에 요약되어 있다.
표 2
Figure pct00015
이는 도 33 내지 35로부터 볼 수 있는 바와 같이, eIF2B (델타 서브유닛)의 상향조절 및 BAX의 하향조절을 포함하였으며, 이는 후속적으로 이뮤노블롯팅에 의해 확인되었다. eIF2B 경로는 공지된 단백질 합성의 번역 조절인자이다. eIF2B는 이전에 MuRF1 상호작용 인자로서 확인되었으며, 이는 MuRF1이 MCT 스트레스 하에 번역 개시 인자 eIF2B의 고갈을 매개하였으나 이것이 화합물에 의해 완화되었다는 것을 시사한다. 추가로, 화합물은 또한 아폽토시스촉진 조절제 BAX를 조정하였으며, 여기서 이 단백질은 모의와 비교하여 MCT 마우스에서 상향조절되고, MCT + MyoMed-946 군에서 정상화되었다. 만성 심부전을 갖는 인간 환자에서, 아폽토시스는 골격근에서 증가되고, 위축의 정도와 밀접한 상관관계가 있다 (예를 들어 문헌 [Adams et al., J Am Coll Cardiol, 1999, 33, 959-965 및 Vescovo et al., Heart, 2000, 84, 431-437] 참조). 실제로, BAX는 심장 악액질에서 상승되고 증가된 MuRF1 발현과 연관된다는 것이 이전에 주목되었다 (예를 들어 문헌 [Dalla Libera et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2004, 286, C138-144 및 Rezk et al., PLoS One, 2012, 7, e30276] 참조).
도 36 내지 38로부터 추가로 볼 수 있는 바와 같이, 프로테옴 분석은 MCT 마우스에서 MuRF1의 증가된 단백질 발현이 화합물 MyoMed-946에 의해 방지되지만, MAFBx (또 다른 주요 아트로진 E3 리가제)에 대해서는 효과가 관찰되지 않았다는 것을 확인시켜 주었다. 이는 화합물의 기저 메카니즘이 MuRF1 특이적인 것으로 보인다는 것을 나타내며, 이는 예비 시험관내 연구에 기초하여 예상될 것이다. MuRF1은 또한 수많은 기질과 상호작용하는 것으로 공지되어 있으며, 이 중 하나의 기질은 특히 전사 기능을 갖는 핵- 및 근절 (티틴)-기반 단백질인 CARP (근육 안키린 반복 단백질 (MARP) 패밀리의 구성원)이다 (예를 들어, 문헌 [Miller et al., J Mol Biol, 2003, 333, 951-964] 참조). CARP는 스트레스-관련 상태에서 상향조절되는 것으로 공지되어 있고, 수축 기능장애 및 근육 위축과 연관된다 (예를 들어, 문헌 [Laure et al., The FEBS journal, 2009, 276, 669-684 및 Moulik et al., J Am Coll Cardiol, 2009, 54, 325-333] 참조). 이러한 증거와 일치하게, MCT-스트레스 받은 마우스에서 CARP 발현의 증가가 관찰되는 반면 이러한 효과는 MyoMed-946 공급된 마우스에서 제거되며, 이는 이 화합물이 MuRF1에 대한 그의 억제를 통해 CARP 발현을 둔화시킬 수 있고, 이는 다시 근육 질량 및 기능의 유지에 기여할 수 있다는 것을 시사한다.
3.1.2 CHF 마우스:
CHF를 앓고 있는 MyoMed-946-처리된 마우스의 관찰된 생리학적 변화 및 이익의 기저를 이루는 분자 메카니즘을 분석하기 위해, 모의, CHF 및 CHF + MyoMed-946-처리된 마우스로부터의 횡경막 조직의 비교 정량적 프로테옴 분석뿐만 아니라 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
프로테옴 분석:
DZHK 핵심 시설 (독일 바트 나우하임)에서 질량 분광측정법-기반 프로테옴 분석을 수행하였다. 수득된 MS 미가공 데이터를 안드로메다(Andromeda) 검색 엔진 및 무스 무스쿨루스(Mus musculus)에 대한 유니프롯(Uniprot) 데이터베이스 (2017년 4월 20일자)를 사용하여 맥스퀀트(MaxQuant) (1.6.0.1)에 의해 가공하였다. 1%의 오류 발견율 (펩티드 및 단백질 수준 둘 다)에서, >2600개의 단백질 군이 확인되었다. 사용된 환원성 디메틸화 프로토콜 (문헌 [Boersema et al., Nat Protoc, 2009, 4, 484-494] 참조)은 CHF + MyoMed-946, CHF 및 모의 조건으로부터의 단백질 사이의 쌍별 상대 비교 정량화 (비)를 산출하였으며, 이를 표준 통계적 시험을 사용하여 유의한 차이에 대해 통계적으로 질의하였다. 여러 단백질이 통계적으로 상이한 것으로 확인되었다 (예를 들어 TNNT3, Timm9, Ccdc5, Adi1, Ptges3 및 Ndufa3). 화합물 공급의 존재 및 부재 하의 CHF 마우스의 비교를 위한 다중 가설 검정 (벤자미니-호크베르크; 보정된 P < 0.05)을 적용한 후에, 미토콘드리아 리보솜에서 단백질 개시 및 신장을 담당하는 미토콘드리아-시토졸 셔틀 단백질인 Mrps5 (미토콘드리아 리보솜 단백질 5)만이 유의하게 상향-조절된 단백질로서 남아있었으며 (P = 0.02; 도 4A), 이를 하기 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 연구하였다.
도 39로부터 볼 수 있는 바와 같이, CHF 연구에 포함된 모든 동물의 횡경막의 웨스턴 블롯 분석은, 모의 대조군과 비교하여 CHF 군에서 Mrps5 발현의 유의한 감소가 있으며, 이것이 화합물 MyoMed-946 공급에 의해 역전되었다는 것을 나타낸다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다.
웨스턴 블롯 분석:
웨스턴 블롯 분석을 위해, 동결된 횡경막을 프로테아제 억제제 믹스 (억제제 믹스 M, 세르바, 독일 하이델베르크)를 함유하는 이완 완충제 (90 mmol/L HEPES, 126 mmol/L 염화칼륨, 36 mmol/L 염화나트륨, 1 mmol/L 염화마그네슘, 50 mmol/L EGTA, 8 mmol/L ATP 및 10 mmol/L 크레아틴 포스페이트, pH 7.4) 중에서 균질화시키고, 초음파처리하였다. 상청액의 단백질 농도를 결정하고 (비신코닌산 검정, 피어스, 독일 본), 분취물 (5-20 μg)을 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮기고, 하기 1차 항체를 사용하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다: 포린 및 텔레토닌 (둘 다 1/1000, 압캠, 영국 캠브리지), MRPS-5 (1/500, 써모 피셔, 미국 일리노이주 록포드), MuRF1 및 MuRF2 (둘 다 1/1000; 미오메딕스 (독일 넥카르게뮌드)로부터 상업적으로 입수가능함) 및 Tom20 (1:200, 산타 크루즈 바이오테크놀로지스, 독일 하이델베르크). 후속적으로 막을 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 효소적 화학발광 (슈퍼 시그널 웨스트 피코, 써모 피셔 사이언티픽 인크., 독일 본)에 의해 특이적 밴드를 가시화하고, 1차원 스캔 소프트웨어 패키지 (스캐널리틱스 인크., 미국 메릴랜드주 록빌)를 사용하여 밀도측정을 정량화하였다. 측정치를 로딩 대조군 GAPDH (1/30,000; 하이테스트 리미티드, 핀란드 투르쿠) 또는 α-튜불린 (1:1000, 산타 크루즈 바이오테크놀로지스)에 대해 정규화하였다. 모든 데이터는 모의 대비 배수 변화로서 제시된다.
도 40 내지 42로부터 볼 수 있는 바와 같이, MuRF1 및 MuRF2 발현은 CHF 군에서 유의하게 상향조절되었고, 이는 화합물 MyoMed-946을 사용한 처리에 의해 방지되었다 (도 40 및 41). MuRF1 표적 단백질인 텔레토닌의 발현을 정량화하였을 때, CHF 군에서의 감소된 발현을 향한 경향 (P = 0.08)이 관찰되었고, 이는 화합물 MyoMed-946-처리군에서는 명백하지 않았다 (도 42).
3.1.3 B16F10 마우스 (종양 마우스):
B16F10 마우스의 근육 조직에서의 MuRF1, Nox 2 및 LC3 I/II의 단백질 발현을 MCT 및 CHF 마우스에 대해 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. 추가로, 반응성 산소 종 마커 니트로티로신의 수준을 결정하였다.
도 43 내지 46으로부터 볼 수 있는 바와 같이, MuRF1 발현은 종양군에서 유의하게 상향조절되었고, 이는 화합물 MyoMed-946 및 MyoMed-205를 사용한 처리에 의해 방지되었다 (도 43). 추가로, 공지된 내인성 반응성 산소 종 (ROS)인 Nox 2의 발현뿐만 아니라 니트로티로신의 조직 수준 또한 종양 마우스 군에서 유의하게 상향조절된 반면, 종양 + MyoMed-946 및 종양 + MyoMed-205 마우스 군에서는 이들 종의 양이 근육 조직에서 유의하게 감소되었다 (도 44 및 45). 다른 한편으로, 자가포식에 수반되는 주요 단백질인 LC3 I/II의 발현 수준은 종양군에서 하향조절되었으며, 이는 종양 + MyoMed-946 및 종양 + MyoMed-205 군에서는 관찰되지 않았다 (도 46).
3.2 효소 활성 측정:
3.2.1 CHF 마우스:
프로테옴 프로파일링 데이터는 손상된 미토콘드리아 항상성을 시사하기 때문에, CHF 마우스의 횡경막 조직에서의 주요 미토콘드리아 효소의 효소적 활성을 측정하였다.
횡경막 조직을 이완 완충제 중에서 균질화하고, 분취물을 효소 활성 측정에 사용하였다. 락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.27), 피루베이트 키나제 (EC 2.7.1.40), 숙시네이트 데히드로게나제 (SDH, EC 1.3.5.1), 시트레이트 신타제 (CS, EC 2.3.3.1), β-히드록시아실-COA 데히드로게나제 (EC 1.1.1.35) 및 미토콘드리아 복합체 I에 대한 효소 활성을 이전에 상세히 기재된 바와 같이 분광광도계로 측정하였다 (Mukherjee et al., J Biol Chem, 1976, 251, 2155-2160; Vanderlinde et al., Ann Clin Lab Sci, 1985, 15, 13-31; Dzeja et al., Mol Cell Biochem, 1999, 201, 33-40; Takashi et al., Biochim Biohphys Acta, 1979, 574, 258-267; Schwarzer et al., J Physiol, 2014, 592, 3767-3782). 효소 활성 데이터는 모의 대비 배수 변화로서 제시된다.
도 47 내지 51로부터 볼 수 있는 바와 같이, 시트레이트 신타제 (도 47), 숙시네이트 데히드로게나제 (도 48) 및 미토콘드리아 복합체 I (도 49)을 포함한 미토콘드리아 효소의 효소 활성은 모의와 비교하였을 때 CHF 동물의 횡경막에서 각각 21, 28 및 27%만큼 유의하게 감소되었다. 크레아틴 키나제에 대해서는 차이가 나타나지 않았다. 미토콘드리아 포린 발현 (도 50) 및 TOM-20 (도 51)의 단백질 발현에 의해 평가시 횡경막 조직에서의 미토콘드리아의 양은 CHF 마우스에서 또한 유의하게 감소되었다. 미토콘드리아 기능에 대한 효과와 일치하게, 화합물 MyoMed-946을 사용한 처리는 시트레이트 신타제, 숙시네이트 데히드로게나제 및 미토콘드리아 복합체 I 효소 활성을 부분적으로 개선시켰고 (도 47 내지 49), 정상에 가까운 포린 및 보통이지만 통계적으로 유의한 TOM-20 발현의 개선을 유발하였다 (도 50 및 51).
대조적으로, 당분해 및 지방산 대사에 대한 세포질 효소 (당분해: 피루베이트 키나제 및 락테이트 데히드로게나제; 지방산 대사: β-히드록시아실-COA 데히드로게나제)를 평가하였을 때, 이들 3개의 군 사이에 차이가 검출되지 않았다.
3.2.2 B16F10 마우스 (종양 마우스):
B16F10 접종된 마우스의 근육 조직에서의 시트레이트 신타제 및 미토콘드리아 복합체 I의 효소 활성을 CHF 마우스에 대해 상기 기재된 바와 같이 결정하였다.
도 52 및 53으로부터 볼 수 있는 바와 같이, 미토콘드리아 효소 시트레이트 신타제 (도 52) 및 미토콘드리아 복합체 I (도 53)의 효소 활성은 모의와 비교하였을 때 종양군의 근육 조직에서 유의하게 감소되었다. 화합물 MyoMed-946 및 MyoMed-205를 사용한 처리는 B16F10 접종된 마우스의 근육 조직에서 시트레이트 신타제 및 미토콘드리아 복합체 I 효소 활성을 부분적으로 또는 완전히 회복시켰다 (도 52 및 53).
4. C2C12 근관 세포 배양, 역전사 PCR
C2C12 근관을 화합물 MyoMed-946의 존재 또는 부재 하에 10 μmol/L의 최종 농도로 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후에, 총 RNA를 C2C12 세포로부터 단리하고, 무작위 육량체 및 센시스크립트 리버스 트랜스크립타제 (퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. cDNA의 분취물을 라이트 사이클러(Light Cycler) 시스템 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 독일 만하임)이 적용되는 정량적 RT-PCR에 사용하였다. 특이적 유전자의 발현을 하이포크산틴-포스포리보실-트랜스퍼라제 (HPRT)-mRNA의 발현에 대해 정규화하였다. MuRF-1 발현의 정량화를 위해, 하기 프라이머 (TIB 몰바이올(TIB MolBiol), 독일 베를린) 및 조건을 사용하여 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 기술을 적용하였다: HPRT: 5'-CTCATggACTgATTATggACAggAC-3' (서열식별번호: 1) 및 5'-gCAggTCAgCAAAgAACTTATAgCC-3' (서열식별번호: 2), 60℃ 어닐링; MuRF-1:5'-gATgTgCAAggAACACgAA-3' (서열식별번호: 3), 5'-CCTTCACCTggTggCTATTC-3' (서열식별번호: 4), LC640-gCACAAggAgCAAgTAggCACCTCAC-PH (서열식별번호: 5), 5'-gCCTggTgAgCCCCAAACACCT-FL (서열식별번호: 6), 58℃에서 어닐링. LC640은 형광 염료인 LC 레드 640을 나타낸다. FL은 플루오레세인을 나타낸다. PH는 포스페이트 기를 나타낸다 (폴리머라제에 의한 바람직하지 않은 연장에 대해 유리 3'-히드록실 기를 차단함).
도 54로부터 볼 수 있는 바와 같이, MCT 마우스에서 MuRF1의 증가된 단백질 발현은 화합물 MyoMed-946에 의해 방지되었다.
5. 통계적 분석:
데이터는 평균±SEM으로 제시된다. 일원 분산 분석 (ANOVA)에 이어서 본페로니 사후 검정을 사용하여 군을 비교하였고, 이원 반복 측정 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 검정을 사용하여 수축 기능을 평가하였다 (그래프패드 프리즘). 유의성은 P<0.05로서 허용되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Adams, Volker Labeit, Siegfried <120> COMPOUNDS SUITABLE FOR THE TREATMENT AND PROPHYLAXIS OF MUSCLE WASTING AND OTHER CONDITIONS <130> M/60137-PCT <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 1 ctcatggact gattatggac aggac 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 2 gcaggtcagc aaagaactta tagcc 25 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 3 gatgtgcaag gaacacgaa 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 4 ccttcacctg gtggctattc 20 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 5 gcacaaggag caagtaggca cctcac 26 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 6 gcctggtgag ccccaaacac ct 22

Claims (23)

  1. 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00016

    여기서
    R1은 수소 또는 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 수소, C1-C3-알킬, 비치환되거나 또는 할로겐, 시아노, C1-C3-알킬, C1-C3-할로알킬 및 C1-C3-알콕시로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 라디칼을 보유할 수 있는 페닐; 및 비치환되거나 또는 1, 2 또는 3개의 라디칼 R7을 보유할 수 있는, 고리원으로서 N, NRc, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자 또는 헤테로-기를 함유하는 5- 내지 10-원 헤테로방향족 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 수소, 메틸 및 플루오린화 메틸로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R3은 수소, 메틸 및 플루오린화 메틸로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 수소 및 C1-C4-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R5는 독립적으로 할로겐, 시아노, C1-C3-알킬, C1-C3-할로알킬, C1-C3-알콕시 및 C1-C3-할로알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R6은 독립적으로 할로겐, 시아노, C1-C3-알킬, C1-C3-할로알킬, C1-C3-알콕시 및 C1-C3-할로알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R7은 독립적으로 할로겐, 시아노, C1-C3-알킬, C1-C3-할로알킬, C1-C3-알콕시 및 C1-C3-할로알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    X1은 NRa 또는 O이고;
    X2는 NRb, O 또는 S이고;
    Y는 산소 원자 또는 2개의 수소 원자를 나타내고;
    Ra, Rb, Rc는 각각 독립적으로 수소 및 C1-C4-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    a는 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
    b는 0, 1, 2 또는 3이다.
  2. 제1항에 있어서, R1은 수소 및 기 -CH2R1a로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R1a는 수소, 메틸 및 고리원으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자, 특히 1개의 헤테로원자를 함유하는 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리는 비치환되거나 또는 1개의 라디칼 R7을 보유하고, 여기서 R7은 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, R1은 수소 및 기 -CH2R1a로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R1a는 수소 및 고리원으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자, 특히 1개의 헤테로원자를 함유하는 비치환된 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 R1은 특히 기 -CH2R1a이고, 여기서 R1a는 고리원으로서 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자, 특히 1개의 헤테로원자를 함유하는 비치환된 5- 내지 6-원 모노시클릭 헤테로방향족 고리인 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2는 수소 또는 메틸이고;
    R3은 수소이고;
    R4는 메틸이고;
    각각의 R5는 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R6은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    X1은 NH 또는 O이고;
    X2는 O이고;
    a는 0, 1 또는 2이고;
    b는 0 또는 1인
    화합물.
  5. 제1항에 있어서, R1은 기 CH2-I' 또는 CH2-II'로부터 선택되고,
    Figure pct00017

    여기서 *는 우레아 질소 원자에 대한 부착 지점을 나타내고;
    각각의 R7은 독립적으로 할로겐, 시아노, C1-C3-알킬, C1-C3-할로알킬, C1-C3-알콕시 및 C1-C3-할로알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    X3은 NRc, O 또는 S이고;
    Rc는 수소 및 C1-C4-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    c는 0, 1, 2 또는 3인
    화합물.
  6. 제5항에 있어서,
    R2는 수소 또는 메틸이고;
    R3은 수소이고;
    R4는 메틸이고;
    각각의 R5는 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R6은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R7은 독립적으로 할로겐, C1-C3-알킬 및 C1-C2-알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    X1은 NH 또는 O이고;
    X2는 O이고;
    X3은 O 또는 S이고;
    a는 0, 1 또는 2이고;
    b는 0 또는 1이고;
    c는 0 또는 1인
    화합물.
  7. 제6항에 있어서,
    R2는 수소이고;
    R3은 수소이고;
    R4는 메틸이고;
    X1은 NH 또는 O이고;
    X2는 O이고;
    X3은 O 또는 S이고;
    a는 0이고;
    b는 0이고;
    c는 0인
    화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I-A에 상응하는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화학식 I-B에 상응하는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화학식 I-C에 상응하는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화학식 I-D에 상응하는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00018

    여기서
    X1은 NH 또는 O이고;
    X3은 O 또는 S이다;
    Figure pct00019

    여기서
    X1은 NH 또는 O이다;
    Figure pct00020

    여기서
    X1은 NH 또는 O이고;
    X3은 O 또는 S이다;
    Figure pct00021

    여기서
    R1은 수소 또는 메틸이고;
    X1은 NH 또는 O이다.
  9. 화합물 [2-(2-푸릴메틸카르바모일아미노)-2-옥소-에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 및 그의 제약상 허용되는 염.
  10. 화합물 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-N-[2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸]벤즈아미드 및 그의 제약상 허용되는 염.
  11. 화합물 [2-옥소-2-(2-피리딜메틸카르바모일아미노)에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 및 그의 제약상 허용되는 염.
  12. 제1항에 있어서, N-[2-(2-푸릴메틸카르바모일아미노)-2-옥소-에틸]-4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤즈아미드, [2-옥소-2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-벤조에이트 및 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]-N-[2-옥소-2-(2-티에닐메틸카르바모일아미노)에틸]-벤즈아미드로부터 선택된 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염.
  13. 제1항에 있어서, (1-메틸-2-옥소-2-우레이도-에틸) 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트 및 [1-메틸-2-(메틸카르바모일아미노)-2-옥소-에틸] 4-[(4-메틸-2-옥소-크로멘-7-일)옥시메틸]벤조에이트로부터 선택된 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 화학식 I의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 적어도 1종의 제약상 허용되는 염 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 소모 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 질환 또는 상태: 울혈성 심부전, 만성 심부전, 암, 근독성 및/또는 심장독성 물질, 예컨대 독소루비신을 사용한 암 치료, 선천성 근병증, AIDS, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성 신질환, 신부전, 당뇨병, 중증 화상, 노화 동안의 근육감소증, 혈액 공급의 감소, 일시적 또는 장기간 부동화, 장기간 기계적 환기, 탈신경, 장기간 무중력 및 영양실조 중 하나로부터 유발되는 골격근 또는 심근 위축의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 상태, 특히 증가된 근육 링 핑거 1 (MuRF1) 발현과 연관된 근병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  19. 제18항에 있어서, 근병증이 중대 질병 근병증, 네말린 근병증, 염증성 근병증, 당뇨병으로부터의 근병증, 폐고혈압으로부터의 근병증, 만성 심부전으로부터의 근병증, 신부전으로부터의 근병증 및 종양 악액질로부터의 근병증으로부터 선택된 것인 화합물.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 수축기 또는 확장기 기능장애와 연관된 심장 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 박출 계수 감소된 심부전 (HF-rEF), 박출 계수 보존된 심부전 (HF-pEF), 고혈압 또는 종양 악액질로부터 유발되거나 그와 연관된 골격근 또는 심근 위축;
    - 독소루비신에 의해 유도된 근육 위축 및/또는 심장 독성;
    - 노화로 인한 근육감소증 및/또는 심근병증;
    - 만성 신질환으로 인한 근육 위축;
    - 기계적 환기 또는 울혈성 심부전으로 인한 횡경막 약화;
    - 선천성 근병증, 특히 동일 유전적 기원의 근육 위축;
    - 당뇨병-유도된 근육 위축; 및/또는
    - 당뇨병
    의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 상태를 치료 또는 예방하는 방법.
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