KR20220045154A - 치쿤구니야 백신 제형 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 백신으로서 유용한 치쿤구니야 바이러스의 신규한 액체 및 동결건조된 제형, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 백신으로서 유용한 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)의 신규한 액체 및 동결건조된 제형 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
치쿤구니야 바이러스(CHIKV)는 현재 전 세계적으로 또는 적어도 지역적으로 확산될 가능성이 가장 높은 바이러스 중 하나로서 간주되고, 이러한 바이러스로 인한 이환율은 전 세계 및 지역 공중 보건에 심각한 위협으로 간주되어 효율적인 예방에 대한 긴급한 요구를 제기한다. 특히, 기후변화로 인해, 치쿤구니야에 의해 제기되는 위협은 증폭되어 감염 위험이 있는 인간 집단의 크기가 증가할 수 있다. 그러나, 현재, 이러한 CHIKV-유발 쇠약 질환(debilitating disease) 및 이의 다양한 증상에 대해 입수 가능한 치료 또는 백신이 존재하지 않는다. CHIKV는 100개 이상의 국가에서 보고되었으며, 미국에서만 220만 건 이상의 의심 사례가 있다(세계보건기구. 2013년 내지 2016년 미국 국가 또는 지역별 치쿤구니야 열의 보고 사례의 수: http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_topics).
CHIKV는 작은 구형 RNA 바이러스 및 토가바이러스(Togaviridae)과에서 알파바이러스(Alphavirus)속의 구성원이다. 절지동물-매개 바이러스는 로스 리버 바이러스(Ross River Virus), 마야로-바이러스(Mayaro-Virus), 및 오니옹-니옹-바이러스(O'nyong-nyong Virus)와 같은 유사한 증상을 유발시키는 아프리카, 남아메리카 및 오스트레일리아에서의 다른 바이러스와 매우 관련이 있다. 바이러스는 황열, 지카 및 댕기 바이러스도 전염시키는, 낮에 무는 에이데스 애집티 모기(Aedes aegypti mosquito)에 의해 매개된다. CHIKV는 또한, 치쿤구니야의 세계의 더 넓은 온대 지역으로의 전파를 용이하게 증진시키는 추위에 더 강한 모기인, 에이데스 알보픽투스 모기(Aedes albopictus mosquito)에 의해 전파될 수 있다. CHIKV로의 감염은 두통, 근육통 및 피부 발진을 갖는 급성 발열 질환을 동반하는, 모든 성별 및 연령 그룹에 영향을 미치는 만성 및 무력화 관절통을 초래한다. 감염된 환자의 중증의, 종종 쇠약해지는 관절통은 특히 성인에서 수년 동안 지속될 수 있다. 더욱 심각한 합병증의 위험이 높은 개체는 유아, 노인 및 만성 의학적 병태를 갖는 개체를 포함한다. CHIKV 감염을 예방하기 위한 특정 항바이러스 치료 또는 백신이 없기 때문에, CHIKV 감염에 대한 예방은 살충제의 사용, 긴 소매 및 바지 착용, 및 매개체 모기에 대한 노출을 제한하는 다른 수단과 같은 비-치료적 개입으로 제한된다.
최근에, CHIKV에 의해 유발된 질환의 예방을 위한 활성 면역접종을 위해 설계된 생-약독화된 치쿤구니야 바이러스 백신 후보물이 개발되었다(
et al., Novel Attenuated Chikungunya Vaccine Candidates Elicit Protective Immunity in C57BL/6 mice, Journal of Virology, 2014, Vol. 88(5) p. 2858-2866). 후보 백신은 풍토성 지역에서 살고 있는 일반 집단에서 CHIKV 질환을 예방할 뿐만 아니라 풍토성 지역 또는 다가오는 발병의 위험이 있는 지역으로의 여행자를 위한 예방적 수단으로서 역할을 하는 것을 목표로 더 개발되었다(또한, WO2019057793호, WO2017109223호, WO2017109224호 참조). 복제 CHIKV 백신은 비-구조 레플리카아제 복합 단백질 nsP3을 인코딩하는 nsP3 유전자에서 60개의 아미노산의 큰 결실을 포함하여, 생체내에서 바이러스의 약화를 초래한다. 후보 백신은 동부-중부 남아프리카 유전자형의 La Reunion 균주를 기초로 한 것이고, 베로 세포(Vero cell)에서 생산되고, 원심분리, 한외여과, 배취-크로마토그래피 및 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제된다. C57BL/6 마우스에서, 백신은 단일 면역접종 후 높은 역가의 결합 및 중화 항체를 유도하였고, 마우스는 후속하여, 고용량 CHIKV 시험감염(challenge)으로부터 보호되었다(
D, Kakoulidou M, Lulla A, Kummerer BM, Johansson DX, Mutso M, et al. Novel Attenuated Chikungunya Vaccine Candidates Elicit Protective Immunity in C57BL/6 mice. 2014 J Virol 88:2858-66. doi:10.1128/JVI.03453-1311). 본질적으로, 비-인간 영장류에서 단일 면역접종은 야생형 CHIKV 감염에 대해 보호하였다(Roques P, Ljungberg K, 
BM, Gosse L, Dereuddre-Bosquet N, Tchitchek N, et al. Attenuated and vectored vaccines protect nonhuman primates against Chikungnunya virus. 2017 JCI Insight 2:e83527. doi:10.1172/jci.insight.83527). 신규한 백신은 전 세계적으로 모든 순환하는 CHIKV 유전자형에 대해 보호하도록 설계된다.
CHIKV 백신의 전 세계 유통을 위해, 다양한 환경 조건 하에서 그리고 장기간에 걸쳐 이러한 백신이 안정하도록 백신을 제형화하는 것이 필요하다. 백신을 안정화시키기 위해 사용되는 성분들이 알려져 있다. 그러나, CHIKV 백신을 안정화시키는 데 유용한 성분들의 특정 제형은 결정되어야 하고, 백신, 예를 들어, 상술된 약독화된 백신 후모물질의 적합한 안정성을 달성하지 못할 수 있다. 불행하게도, 백신 사용을 위해 제안된 생-약독화된 형태의 CHIKV는 다양한 환경에서 다소 불안정할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 목적은 CHIKV 백신을 안정화시키고, 특히, 특정 용량에서 CHIKV 백신을 안정화시키는 제형을 제공하는 것이다.
본 발명은 백신으로서 유용한 신규한 CHIKV 제형 및 이의 제조 방법을 제공한다.
첨부된 도면은 일정한 비율로 그려지도록 의도된 것은 아니다. 도면은 단지 예시적인 것이고, 본 개시의 실시 가능성을 위해 필요한 것은 아니다. 명확하게 하기 위해, 모든 구성요소가 모든 도면에 표기되어 있지 않을 수 있다. 도면에서,
도 1 CHIKV-Δ5nsP3 게놈 구조의 개략도. 치쿤구니야 바이러스 게놈은 2개의 폴리단백질, 즉, 비-구조 단백질 1-4(nsP1-4) 및 구조 단백질(C, E3, E2, 6K, E1)을 인코딩한다. 야생형 게놈 서열과 비교하여, CHIKV-Δ5nsP3 서열은 nsP3(nsP1-4 폴리단백질에서 아미노산 1656 내지 1717)을 인코딩하는 서열의 3' 부분에서 183-bp 결실을 함유하고, 이는 nsP3 레플리카아제 단백질에서 60개 아미노산 결실을 초래한다(Δ60aa로 표시됨). SP, 서브게놈 프로모터; UTR, 비번역 영역. (문헌[
D, et al., 2014 상기 문헌]으로부터 변형된 도면).
도 2 37℃에서 냉동-건조된 CHIKV의 안정성에 대한 소르비톨, 염화마그네슘 및 L-메티오닌의 효과. WFI에서 동결건조된 펠릿의 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.3 log의 오차 막대).
도 3 실온에서 냉동-건조된 CHIKV의 안정성에 대한 소르비톨, 염화마그네슘 및 L-메티오닌의 효과. WFI에서 동결건조된 펠릿의 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.3 log의 오차 막대).
도 4 2 내지 8℃에서 냉동-건조된 CHIKV의 안정성에 대한 소르비톨, 염화마그네슘 및 L-메티오닌의 효과. WFI에서 동결건조된 펠릿의 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.3 log의 오차 막대).
도 5 동결건조 전 및 동결건조/재구성 후에 고용량 DS로부터 얻어진 DLS 신호의 오버레이(overlay).
도 6 WFI에서 동결건조 전 및 동결건조/재구성 후에 DP의 RT-qPCR 데이터. E168K 돌연변이와 비교한 개개 영역에서의 WT 서열.
도 7 2 내지 8℃에서 실험실 스케일 및 중간 스케일(기술 이전)에서의 동결건조된 CHIKV DP 제형의 안정성. WFI에서 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정의 결과(±0.5 log의 오차 막대).
도 8 실온에서 실험실 스케일 및 중간 스케일(기술 이전)에서의 동결건조된 CHIKV DP 제형의 안정성. WFI에서 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.5 log의 오차 막대).
도 9 37℃에서 실험실 스케일 및 중간 스케일(기술 이전)에서의 동결건조된 CHIKV DP 제형의 안정성. WFI에서 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.5 log의 오차 막대).
도 10 DLS에 의해 평가한 경우 액체 냉동된 제형에서 CHIKV 크기에 대한 포스페이트 농도 증가의 영향.
도 11 DLS에 의해 평가한 경우 액체 (냉동된) 제형에서 CHIKV 크기에 대한 NaCl 농도 증가의 영향.
도 12 DLS에 의해 평가한 경우 액체 (냉동된) 제형에서 CHIKV 크기에 대한 시트레이트 농도 증가의 영향.
도 13 다양한 온도에서 액체 (냉동된) 제형에서 CHIKV DS의 안정성.
도 14 다양한 온도에서 액체 (냉동된) 제형에서 CHIKV DP 고용량의 안정성. 물질은 유리 바이알에 저장됨.
도 15 임상 시험 설계(A) 및 프로파일(B).
도 16 중증도 등급화(안전성 집단)를 포함하는 단일 백신접종 및 재백신접종(시험감염)후 예측된 국소 및 전신 증상의 Radar 플롯. (A) 저용량(그룹 L; 3.2×103 TCID50/0.1㎖) (B) 중간 용량(그룹 M; 3.2×104 TCID50/1㎖) 및 (C) 고용량(그룹 H1 및 H2; 3.2×105 TCID50/1㎖)으로 단일 백신접종 후; 또는 6개월 (D) M6에서 그룹 H2; 또는 12개월 (E) M12에서 그룹 L; (F) M12에서 그룹 M; (G) M12에서 그룹 H1에서 고용량 재백신접종 후 최대 중증도에 의한, 14일 내에 예측된 AE를 갖는 참가자. 예측된 AE는 경증(등급 1), 중등도(등급 2) 또는 중증(등급 3)으로서 등급화되었다.
도 17 면역접종(A) 및 임의의 시험감염(B) 후 0, 3, 7 및 14일에 혈장에서의 바이러스혈증. 검출 한계(LOD) = 1087 GCE/㎖, 정량 하한치(LLOQ) = 3261 GCE/㎖. 치료 그룹에서 입수 가능한 결과가 없는 시점은 500으로서 그래프로 나타내었다. GCE/㎖ - 정량적 실시간 PCR에 의해 측정한 경우 ㎖당 게놈 카피 균등물.
도 18 백신접종(A) 및 임의의 시험감염(B) 후 0, 3, 7 및 14일 후 소변에서의 바이러스 입자의 배출. 검출 한계(LOD)=1087 GCE/㎖, 정량 하한치(LLOQ)=3261 GCE/㎖. 치료 그룹에서 입수 가능한 결과가 없는 시점은 500으로서 그래프로 나타내었다. GCE/㎖ - 정량적 실시간 PCR에 의해 측정한 경우 ㎖당 게놈 카피 균등물; * 그룹 L에서 단일 대상체.
도 19 단일 백신접종 후 중화 항체의 평가. 연구 그룹에 의한 단일 백신접종 후 혈청전환율(A) 및 기하 평균 역가(B). 혈청전환율은 시험 목적을 위해 대상체의 백분율로서 규정되고, 이는 적어도 20의 CHIKV-특이적 항체 역가에 도달한다(μNT50≥20). * 쌍별 테스트 p=0.0092.
도 20 180일(M6) 또는 12개월(M12)에 시험감염 후 중화 항체의 평가. 6개월 또는 12개월에 최고용량으로의 재-백신접종 전 및 후 그룹 L, M, H1 및 H2에서의 혈청전환율(A) 및 기하 평균 역가(B). 혈청전환은 시험 목적을 위해 대상체의 백분율로서 규정되고, 이는 적어도 20의 CHIKV-특이적 항체 역가에 도달한다(μNT50≥20).
도 21 점점 더 엄격한 컷오프 값을 이용한 혈청전환율의 평가. 연구일 및 치료 그룹에 의한 단일 및 재-백신접종 후 적어도 (A) 40(μNT50 1:40), (B) 80(μNT50 1:80) 및 (C) 160(μNT50 1:160)의 CHIKV-특이적 항체 역가에 도달하는 대상체의 백분율로서 규정된 혈청전환율.
도 22 (A) 백신 균주 CHIKV-Δ5nsP3(동부 중앙 님아프리카(ECSA) 유전자형의 La Reunion 균주(LR2006-OPY1)를 기초로 함)에 대한 μNT 및 아시아 유전자형의 약독화된 CHIKV 균주 181/클론 25에 대한 μPRNT에서 시험된 상이한 시점으로부터의 111 CHIKV-Δ5nsP3 1상 혈청의 패널의 중화 역가의 상관관계. 두 검정 모두(n=75)에서 역가 ≥ LLOQ를 갖는 모든 샘플을 이용한 피어슨 상관 계수에 의해 역가의 상관관계가 계산되었다(단지 양성 역가를 갖는 샘플만이 나타냄). (B) 아시아 유전자형의 CHIKV 균주 181/클론 25에 대한 μPRNT에서 시험된 CHIKV-Δ5nsP3 혈청의 중화 역가와 (서아프리카 균주 37997로부터의 바이러스 단백질 C, E1 및 E2를 기초로 한) CHIKV 전체 IgG ELISA 역가의 상관관계. 두 검정 모두(n=65)에서 역가 ≥ LLOQ를 갖는 모든 샘플을 이용한 피어슨 상관 계수에 의해 역가의 상관관계가 계산되었다(본 분석에서 단지 양성 역가를 나타냄).
도 23 백신 균주 CHIKV-Δ5nsP3(μNT50) 및 (A) 야생형 La Reunion 균주(PRNT50 wt CHIKV-LR) 및 (B) 야생형 서아프리카 균주 37997(PRNT50 wt CHIKV-WA 37997)에 대해 측정된 개별 대상체의 상이한 방문에서 수집된 CHIKV-Δ5nsP3 시험 혈청의 중화 역가의 쌍별 비교. PRNT50 wt CHIKV-LR 검정에서 역가 > 5,120을 갖는 3개의 샘플은 5,120으로서 플롯팅된다. 음성 샘플은 각 방법에 대해 LLOQ의 절반으로 전가되었다(μNT50=10, PRNT50=5).
도 24 WFI에서 재구성 직후 각 시점에서 TCID50에 의해 평가한 경우, 2 내지 8℃에서 각각 최대 19 및 21개월의 저장에서 중간 스케일(기술 이전) 및 실험실 스케일로 생산된 동결건조된 DP의 안정성 비교.
도 25 WFI에서 재구성 직후 각 시점에서 TCID50에 의해 평가한 경우, 2 내지 8℃, 실온(RT) 및 37℃에서 중간 스케일(기술 이전; TTR2)로 생산된 동결건조된 DP의 안정성.
도 1 CHIKV-Δ5nsP3 게놈 구조의 개략도. 치쿤구니야 바이러스 게놈은 2개의 폴리단백질, 즉, 비-구조 단백질 1-4(nsP1-4) 및 구조 단백질(C, E3, E2, 6K, E1)을 인코딩한다. 야생형 게놈 서열과 비교하여, CHIKV-Δ5nsP3 서열은 nsP3(nsP1-4 폴리단백질에서 아미노산 1656 내지 1717)을 인코딩하는 서열의 3' 부분에서 183-bp 결실을 함유하고, 이는 nsP3 레플리카아제 단백질에서 60개 아미노산 결실을 초래한다(Δ60aa로 표시됨). SP, 서브게놈 프로모터; UTR, 비번역 영역. (문헌[
도 2 37℃에서 냉동-건조된 CHIKV의 안정성에 대한 소르비톨, 염화마그네슘 및 L-메티오닌의 효과. WFI에서 동결건조된 펠릿의 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.3 log의 오차 막대).
도 3 실온에서 냉동-건조된 CHIKV의 안정성에 대한 소르비톨, 염화마그네슘 및 L-메티오닌의 효과. WFI에서 동결건조된 펠릿의 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.3 log의 오차 막대).
도 4 2 내지 8℃에서 냉동-건조된 CHIKV의 안정성에 대한 소르비톨, 염화마그네슘 및 L-메티오닌의 효과. WFI에서 동결건조된 펠릿의 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.3 log의 오차 막대).
도 5 동결건조 전 및 동결건조/재구성 후에 고용량 DS로부터 얻어진 DLS 신호의 오버레이(overlay).
도 6 WFI에서 동결건조 전 및 동결건조/재구성 후에 DP의 RT-qPCR 데이터. E168K 돌연변이와 비교한 개개 영역에서의 WT 서열.
도 7 2 내지 8℃에서 실험실 스케일 및 중간 스케일(기술 이전)에서의 동결건조된 CHIKV DP 제형의 안정성. WFI에서 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정의 결과(±0.5 log의 오차 막대).
도 8 실온에서 실험실 스케일 및 중간 스케일(기술 이전)에서의 동결건조된 CHIKV DP 제형의 안정성. WFI에서 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.5 log의 오차 막대).
도 9 37℃에서 실험실 스케일 및 중간 스케일(기술 이전)에서의 동결건조된 CHIKV DP 제형의 안정성. WFI에서 재구성 직후에 수행된 TCID50 검정(±0.5 log의 오차 막대).
도 10 DLS에 의해 평가한 경우 액체 냉동된 제형에서 CHIKV 크기에 대한 포스페이트 농도 증가의 영향.
도 11 DLS에 의해 평가한 경우 액체 (냉동된) 제형에서 CHIKV 크기에 대한 NaCl 농도 증가의 영향.
도 12 DLS에 의해 평가한 경우 액체 (냉동된) 제형에서 CHIKV 크기에 대한 시트레이트 농도 증가의 영향.
도 13 다양한 온도에서 액체 (냉동된) 제형에서 CHIKV DS의 안정성.
도 14 다양한 온도에서 액체 (냉동된) 제형에서 CHIKV DP 고용량의 안정성. 물질은 유리 바이알에 저장됨.
도 15 임상 시험 설계(A) 및 프로파일(B).
도 16 중증도 등급화(안전성 집단)를 포함하는 단일 백신접종 및 재백신접종(시험감염)후 예측된 국소 및 전신 증상의 Radar 플롯. (A) 저용량(그룹 L; 3.2×103 TCID50/0.1㎖) (B) 중간 용량(그룹 M; 3.2×104 TCID50/1㎖) 및 (C) 고용량(그룹 H1 및 H2; 3.2×105 TCID50/1㎖)으로 단일 백신접종 후; 또는 6개월 (D) M6에서 그룹 H2; 또는 12개월 (E) M12에서 그룹 L; (F) M12에서 그룹 M; (G) M12에서 그룹 H1에서 고용량 재백신접종 후 최대 중증도에 의한, 14일 내에 예측된 AE를 갖는 참가자. 예측된 AE는 경증(등급 1), 중등도(등급 2) 또는 중증(등급 3)으로서 등급화되었다.
도 17 면역접종(A) 및 임의의 시험감염(B) 후 0, 3, 7 및 14일에 혈장에서의 바이러스혈증. 검출 한계(LOD) = 1087 GCE/㎖, 정량 하한치(LLOQ) = 3261 GCE/㎖. 치료 그룹에서 입수 가능한 결과가 없는 시점은 500으로서 그래프로 나타내었다. GCE/㎖ - 정량적 실시간 PCR에 의해 측정한 경우 ㎖당 게놈 카피 균등물.
도 18 백신접종(A) 및 임의의 시험감염(B) 후 0, 3, 7 및 14일 후 소변에서의 바이러스 입자의 배출. 검출 한계(LOD)=1087 GCE/㎖, 정량 하한치(LLOQ)=3261 GCE/㎖. 치료 그룹에서 입수 가능한 결과가 없는 시점은 500으로서 그래프로 나타내었다. GCE/㎖ - 정량적 실시간 PCR에 의해 측정한 경우 ㎖당 게놈 카피 균등물; * 그룹 L에서 단일 대상체.
도 19 단일 백신접종 후 중화 항체의 평가. 연구 그룹에 의한 단일 백신접종 후 혈청전환율(A) 및 기하 평균 역가(B). 혈청전환율은 시험 목적을 위해 대상체의 백분율로서 규정되고, 이는 적어도 20의 CHIKV-특이적 항체 역가에 도달한다(μNT50≥20). * 쌍별 테스트 p=0.0092.
도 20 180일(M6) 또는 12개월(M12)에 시험감염 후 중화 항체의 평가. 6개월 또는 12개월에 최고용량으로의 재-백신접종 전 및 후 그룹 L, M, H1 및 H2에서의 혈청전환율(A) 및 기하 평균 역가(B). 혈청전환은 시험 목적을 위해 대상체의 백분율로서 규정되고, 이는 적어도 20의 CHIKV-특이적 항체 역가에 도달한다(μNT50≥20).
도 21 점점 더 엄격한 컷오프 값을 이용한 혈청전환율의 평가. 연구일 및 치료 그룹에 의한 단일 및 재-백신접종 후 적어도 (A) 40(μNT50 1:40), (B) 80(μNT50 1:80) 및 (C) 160(μNT50 1:160)의 CHIKV-특이적 항체 역가에 도달하는 대상체의 백분율로서 규정된 혈청전환율.
도 22 (A) 백신 균주 CHIKV-Δ5nsP3(동부 중앙 님아프리카(ECSA) 유전자형의 La Reunion 균주(LR2006-OPY1)를 기초로 함)에 대한 μNT 및 아시아 유전자형의 약독화된 CHIKV 균주 181/클론 25에 대한 μPRNT에서 시험된 상이한 시점으로부터의 111 CHIKV-Δ5nsP3 1상 혈청의 패널의 중화 역가의 상관관계. 두 검정 모두(n=75)에서 역가 ≥ LLOQ를 갖는 모든 샘플을 이용한 피어슨 상관 계수에 의해 역가의 상관관계가 계산되었다(단지 양성 역가를 갖는 샘플만이 나타냄). (B) 아시아 유전자형의 CHIKV 균주 181/클론 25에 대한 μPRNT에서 시험된 CHIKV-Δ5nsP3 혈청의 중화 역가와 (서아프리카 균주 37997로부터의 바이러스 단백질 C, E1 및 E2를 기초로 한) CHIKV 전체 IgG ELISA 역가의 상관관계. 두 검정 모두(n=65)에서 역가 ≥ LLOQ를 갖는 모든 샘플을 이용한 피어슨 상관 계수에 의해 역가의 상관관계가 계산되었다(본 분석에서 단지 양성 역가를 나타냄).
도 23 백신 균주 CHIKV-Δ5nsP3(μNT50) 및 (A) 야생형 La Reunion 균주(PRNT50 wt CHIKV-LR) 및 (B) 야생형 서아프리카 균주 37997(PRNT50 wt CHIKV-WA 37997)에 대해 측정된 개별 대상체의 상이한 방문에서 수집된 CHIKV-Δ5nsP3 시험 혈청의 중화 역가의 쌍별 비교. PRNT50 wt CHIKV-LR 검정에서 역가 > 5,120을 갖는 3개의 샘플은 5,120으로서 플롯팅된다. 음성 샘플은 각 방법에 대해 LLOQ의 절반으로 전가되었다(μNT50=10, PRNT50=5).
도 24 WFI에서 재구성 직후 각 시점에서 TCID50에 의해 평가한 경우, 2 내지 8℃에서 각각 최대 19 및 21개월의 저장에서 중간 스케일(기술 이전) 및 실험실 스케일로 생산된 동결건조된 DP의 안정성 비교.
도 25 WFI에서 재구성 직후 각 시점에서 TCID50에 의해 평가한 경우, 2 내지 8℃, 실온(RT) 및 37℃에서 중간 스케일(기술 이전; TTR2)로 생산된 동결건조된 DP의 안정성.
본 발명은 백신으로서 유용한 CHIKV의 신규한 제형 및 이의 제조 방법을 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 액체 및 동결건조된 CHIKV 백신을 위한 제형을 안정화시키는 것에 관한 것이다.
백신의 전 세계 분포, 주변 온도의 넓은 다양성, 및 제공 가능한 값으로 백신을 생산해야 하는 요건으로 인해, 이러한 백신이 다양한 환경 조건 하에서 안정적이고, 합리적인 비용이 발생하고, 예를 들어, 발병 동안 실질적으로 변동할 수 있는 수요에 따라 신속하게 생산될 수 있는 백신을 제형화하는 것이 필요하다. 이와 관련한 다양한 안정화 방법 및 접근방식(approach)이 사용되었다. 이러한 것은 하기를 포함한다:
a) 저온(-10℃ 내지 -70℃). 대부분의 백신은 극저온에서 저장하는 동안 안정적이다. 그러나, 저온 저장 설비는 고가이고, 특히, 개발도상국에서 항상 이용 가능할 수 있는 것은 아니다. 이는 이러한 접근방식의 유용성 및 실용성을 제한한다.
b) 동결건조. 냉동-건조된 백신은 상당히 안정적이고, 사전규정된 시간 동안 2 내지 8℃에서 보관될 수 있다. 그러나, 동결건조는 건조 동안 바이러스 역가의 손실을 초래하여, 제조 공정의 수율을 감소시킬 수 있거나, 이종 바이러스 집단에서 바이러스의 하위 집단을 변경할 수 있다. 동결건조된 바이러스 백신은 통상적으로, 액체 제형보다 더욱 안정적이다. 그러나, 장기간 저장 동안, 동결건조된 백신은 여전히, 때때로 면역화를 제공하는 데 불충분한 역가를 함유하는 포인트까지 악화할 수 있다. 또한, 동결건조된 백신이 사용 전에 재구성을 필요로 하기 때문에, 액체 재구성화된 제제는 사용하기 전에 실온에서 방치시키는 동안 효능을 손실할 수 있다. 재구성 동안 이러한 역가의 손실은 또한, 면역을 부여하는 데 불충분한 역가를 초래할 수 있다.
c) 안정화제. 이러한 것은 백신에 첨가되고 저온 저장 또는 동결건조 방법과 함께 사용되는 생물학적 분자 및/또는 일반적 약제학적 부형제와 상호작용하고 이를 안정화시키는 특정 화학적 화합물이다. 그러나, 이의 용도 및 효과는 신규한 바이러스에 대해 알려져 있지 않고, 제한될 수 있다.
이러한 제형은 (1) 안정화제에 벌크 백신의 희석, (2) 안정화제에 투석/정용여과, 또는 (3) 벌크 백신의 농축 및 안정화제에 희석 또는 정용여과 이후 동결건조에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 기술된 제형의 성분들의 양 및 농도는 당업자에 의해 동결건조된 또는 액체 제형을 지칭할 때 중량/부피 백분율을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 액체 제형에서 10% 농도는 100 밀리리터 당 10 그램이고, 동결건조된 제형의 10% 농도는 동결건조 전에 액체 형태에서 100 밀리리터 당 10 그램을 지칭한다. 동결건조된 제형은 동결건조 전과 대략 동일한 부피로 WFI 또는 다른 허용 가능한 희석제에서 재구성되고, 즉, 본 명세서에서 사용된 동결건조된 제형에서 농도는 일반적으로, 동결건조 전 및 재구성 후 둘 다에서 농도를 지칭한다. 다른 측정값, 예를 들어, 화합물의 몰농도는 동결건조 전 및 재구성 후 둘 다에서 액체 제형 또는 동결건조된 제형을 지칭한다.
본 발명의 조성물은 대략 명시된 양의 개개 구성성분을 함유한다. 편의를 위해, 양은 반올림으로 기술된다. 그러나, 당업자는 기술된 값의 10 또는 20% 내의 양이 또한, 적절한 것으로 예상될 수 있으며, 즉, 20%가 기술된 경우에, 16 내지 18% 내지 22 내지 24%의 범위, 예를 들어, 약 16 내지 24%의 범위가 암시적이고, 적절할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 과정에서, 특정 조건 하에서, 예를 들어, 히스티딘과 같은 특정의 완충제 시스템이 CHIKV 백신 후보물, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 것의 응집을 유도하였다는 것이 확인되었다. 다른 안정화 성분도 함유하는, CHIKV 입자의 동결건조로 처리 가능하고 이의 안정성 및 원하는 크기를 증진시키는 것으로 나타난, 낮은(예를 들어, 약 5mM) 포스페이트-시트레이트 완충제 시스템은 동결건조된 CHIKV 백신 제형에 대해 개발되었다. 액체(냉동된) CHIKV 백신에 대한 유사한 제형이 개발되었다.
액체 CHIKV 제형에 대해:
수크로스: 1 내지 50%(w/v)
인산나트륨 또는 인산칼륨: 1 내지 20mM
숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨: 1 내지 50mM
인간 혈청 알부민: 0.001 내지 1%
조직 배양 배지, 염수, 또는 물: 나머지 부피의 잔부
동결건조된 CHIKV 제형에 대해:
수크로스: 1 내지 20%(w/v)
인산나트륨 또는 인산칼륨: 1 내지 20mM
숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨: 1 내지 50mM
또한, 하기 성분들이 또한 존재할 수 있다:
MgCl2: 1 내지 10mM
D-소르비톨: 0.1 내지 5%(w/v)
L-메티오닌: 1 내지 20mM
백신 제형 중 완충제
임의의 백신 제형의 중요한 양태는 일정한 pH 값을 유지한다. 본 발명의 CHIKV 백신의 조성물을 위한 완충제는 저장 동안 pH를 유지할 뿐만 아니라, CHIKV 백신의 필수적인 가공 단계와 상용화 가능해야 한다. 예를 들어, CHIKV 백신은 제형화 후 멸균 여과되어야 한다. 이에 따라, 완충화 시스템(및 다른 성분들)은 여과하기에 너무 큰 바이러스 응집물의 형성을 촉진해서는 안된다. 완충제는 동결건조 동안 광범위한 온도 하에서 pH를 효과적으로 유지해야 한다. 이와 관련하여, 일반적으로 사용되는 농도, 예를 들어, 10mM 이상의 포스페이트의 사용은 특히 더 높은 포스페이트 농도에서 상당한 pH 변화를 초래하는, 냉동 동안 이의 농축 및 후속의 가능한 침전으로 인해 문제가 될 수 있다. 이러한 이유로, 대안적인 완충제가 조사되었지만, 개선된 안정성 또는 케이크 구조(데이터는 미도시됨)를 형성하지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 포스페이트가 lyo 제형에서 1 내지 5mM, 바람직하게는, 약 5mM까지 감소될 수 있다는 것이 확인되었다. 대안적으로, 약 20mM 농도의 HEPES 완충제가 또한 허용 가능하다. 포스페이트와 함께 추가 완충제를 사용하는 것이 바람직하고, 바람직하게는, 추가 완충제는 숙시네이트, 시트레이트, 푸마레이트, 타르타레이트, 말레에이트 및 락테이트, 바람직하게는, 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택된 카복실레이트이다. 이러한 특정 카복실레이트는 응집을 억제하는 데 도움이 된다.
하기 화합물은 수크로스 대신에 및 유사한 삼투압 농도로 사용될 수 있다: 수크로스, 만니톨, 덱스트란, 락토스, 소르비톨, 덱스트로스, 푸코스, 및 트레할로스. 바람직한 실시형태에서, 수크로스 및/또는 트레할로스가 사용되고, 가장 바람직하게는, 5%의 수크로스는 냉동/해동 스트레스 동안 CHIKV를 보호하는 것으로 나타났다. 트레할로스는 동결건조 공정 동안 고온을 사용할 수 있다는 장점을 갖는다.
당의 농도는 제형의 점도에 관한 것이다. 감소된 점도가 요망되는 경우에, 당해 분야에서 저농도의 당, 예를 들어, 수크로스를 사용하는 것이 바람직한 것으로 알려져 있다. 또한, 당업자에 의해, 당의 농도에 대한 상한치가 원하는 여과 또는 가공 단계를 거치는 제형의 능력에 의해 지시될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
아미노산은 본 명세서에 교시된 동결건조된 제형에서 사용될 수 있다. 아미노산이 동결건조된 제형에서 제조된 백신의 안정성을 개선시킬 수 있다는 것이 확인되었다. 바람직한 아미노산은 L-메티오닌, 아르기닌 및 글루타민이다. 약 1 내지 20mM의 농도가 적절하다. 약 10mM의 농도가 동결건조된 제형에서 바람직하다. 아미노산들의 조합이 사용될 수 있지만, 조합된 아미노산의 전체 농도는 20mM 이하이어야 한다.
동결건조된 제형에서 유용한 다른 부형제는 소량의 첨가가 동결건조된 항체(Chang et al. Liuquan (Lucy) Chang. Deanna Shepherd. Joanna Sun. Xiaolin (Charlie) Tang Michael J. Pikal; J Pharm Sci. 2005 Jul;94(7):1445-55. Effect of sorbitol and residual moisture on the stability of lyophilized antibodies: Implications for the mechanism of protein stabilization in the solid state) 및 리보뉴클레아제 A(Xie Guifu and Timasheff Serge. Protein Science 1997. 6. 211-221: Mechanism of the stabilization of ribonuclease A by sorbitol: Preferential hydration is greater for the denatured than for the native protein)에 대해 입증된 바와 같이 단백질 네이티브 구조의 보유 및 개선된 안정성을 초래할 수 있는 D-소르비톨이다.
동결건조된 제형에서 유용한 다른 부형제는 CHIKV의 RNA 구조를 안정화시킬 것으로 추정되고 저장 후 감염성에 대한 긍정적인 효과를 나타내는 염화마그네슘이다. 본 발명의 이러한 목적을 위한 특히 유용한 농도는 약 5mM이다.
본 명세서에 교시된 백신의 액체 및 동결건조된 제형 둘 다에서 유용한 다른 부형제는 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)이다. 재조합 인간 혈청 알부민은 유전자 발현 시스템을 사용하여 생산되고, 이에 따라, 인간의 혈청으로부터 단리된 알부민보다 더 안전하게 사용된다. 알부민의 농도는 통상적으로, 약 0.1 내지 약 2%의 범위, 바람직하게는, 약 1.0%이다. 그러나, 본 발명자는 알부민을 0.01%까지 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였는데, 이는 비용을 크게 감소시킬 수 있다.
조직 배양 배지, 염수 또는 물, 예를 들어, WFI 또는 milliQ 수, 바람직하게는, WFI는 희석제로서 사용될 수 있다. 동결건조된 케이크를 재구성하기 위해 사용되는 희석제의 양은 동결건조 전 제형의 부피의 0.25 내지 2.5배, 또는 0.5 내지 1.75배, 0.75 내지 1.25배일 수 있다. 그러나, 동결건조 전과 대략 동일한 부피로 동결건조된 케이크를 재구성하는 것이 명확하게 바람직하다.
본 발명의 액체 (냉동된) CHIKV 제형의 바람직한 제형은 하기와 같다:
이러한 바람직한 제형에서, 물 대신에 염수 또는 조직 배양 배지를 사용하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 동결건조된 제형의 바람직한 제형(농도는 동결건조 전뿐만 아니라 동결건조 및 재구성 후 제형을 지칭함)은 하기와 같다:
당해 분야에 공지된 동결건조의 임의의 일반적인 방법이 사용될 수 있다. 동결건조 공정의 일반적인 예로서, 냉동은 -40℃에서 수행되고, 이후에, 2 단계(예를 들어, -35℃에서 3시간, 이후 -25℃에서 30분 동안, 둘 다는 Pirani에 의해 측정한 경우 100 μbar에서임)로 1차 건조될 수 있다. 2차 건조는 20℃에서 수행한 후 2단계로 25℃에서 수행될 수 있다(둘 다는 70 μbar 진공에서). 적절한 케이크 구조, 즉, 균열이 없고 최소한으로 수축되는 케이크를 제공하는 동결건조 방법이 특히 바람직하다.
DP 벌크에 대한 DS의 희석 인자는 DS의 바이러스 농도에 따라 달라진다(TCID50 검정에 의해 결정됨). DS 및 DP 제형에 대한 제형 완충제는 동일하다: 25mM 시트르산나트륨. 5mM 인산칼륨. 5% 수크로스. 0.01% rHSA. 10mM L-메티오닌. 5mM MgCl2. 0.5% 소르비톨. pH 7.3. DP로 희석 후 표적 농도는 5.8 log10 TCID50/mL(= 6.3×105 TCID50/mL, DP 높음) 및 4.8 log10 TCID50/mL(= 6.3×104 TCID50/mL, DP 낮음)이다. 이는 더 큰 스케일에서 백신의 여과 및 충진/동결건조 동안 가능한 손실을 설명하고, 냉동 건조 후 약 105(약 104) TCID50의 바이알 당 최종 바이러스 용량을 보장해야 한다.
본 발명은 CHIKV 및 특히 약독화된 생 CHIKV, 바람직하게는, 본 명세서에서 CHIKV-Δ5nsP3(
, 상기 문헌, 도 1 및 서열번호 1 참조)으로도 지칭되는, nsP3 영역에서 60개의 아미노산 스트레치(stretch)가 결여된 CHIKV "LR2006_OPY1"인 "CHIKV-Δ5nsP3", 또는 여전히 상기 60개의 aa 스트레치의 결실을 포함하는, 95%, 바람직하게는, 96%, 97%, 98%, 99%, 가장 바람직하게는, 99% 서열 동일성을 갖는 CHIKV-Δ5nsP3의 임의의 기능적 변이체의 제형을 포함한다. CHIKV-Δ5nsP3의 변이체는 E168K(서열번호 3), G55R(서열번호 4), E247K(서열번호 5), G82R(서열번호 6) 및/또는 H232Y(서열번호 7)에서 하나 이상의 돌연변이(들)를 갖는 CHIKV-Δ5nsP3의 E2에서의 변이체를 포함한다. 변이체는 또한, 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 서열번호 2는 LR2006_OPY1의 E2 야생형 서열이다. 바람직한 실시형태에서, E2 구조 단백질에서 돌연변이(예를 들어, 돌연변이 E168K)는 70% 이하의 빈도로 존재하고, 예를 들어, 전체 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 70% 미만은 하나 이상의 돌연변이(또는 돌연변이 E168K)를 포함하고, 전체 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 30% 이상은 비-돌연변이된 E2 구조 단백질 또는 돌연변이 E168K를 포함하지 않는 E2 구조 단백질을 발현시킨다. 특히 바람직한 제형은 본 명세서에 기술된 2개 이상의 변이체의 집단을 포함한다. 훨씬 더 바람직한 제형은 서열번호 2(야생형) 및 서열번호 3(E168K 돌연변이를 가짐)의 E2 아미노산 서열에 대해 인코딩된 실질적으로 2개의 균주의 집단을 포함하고, 여기서, E1 구조 단백질은 변경되지 않으며, 즉, 게놈 서열에서 인코딩된 바와 같은 야생형 E1 단백질은 서열번호 1에 의해 제공된다. 상기 제형은 또한, "CHIKV-Δ5nsP3-inv" 집단을 포함하는 제형으로서 지칭되고, 여기서, 빈도는 서열번호 2의 약 10% 내지 90%이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 서열번호 2의 빈도는 대략 30 내지 70%, 더욱 바람직하게는, 약 50%일 수 있다.
단독으로 또는 조합하여 백신으로서 사용하는 데 적합한 CHIKV-Δ5nsP3-inv를 포함하는 상기 CHIKV-Δ5nsP3 작제물은 인간에 대한 안전성 및 인간에서 CHIKV 감염에 대한 면역 보호를 부여하는 능력에 의해 특징화된다. 흥미롭게도, 서열번호 1에 의해 제공된 DNA 서열에 해당하는 RNA 게놈 서열에 대한 작은 변화가 제형 용액에 노출된 전하의 변화로 인해 산업적 사용을 위해 덜 유용한 특정의 제형을 제공할 수 있다는 것이 확인되었다.
하나의 실시형태에서, 약제학적 조성물(본 명세서에서 단순하게 "제형" 또는 "백신"으로도 지칭됨, 상기 용어는 본 발명에서 혼용될 수 있음)은 약 5 내지 28일 내에, 백신접종된 인간 대상체에서 혈청 항체 역가를 대조군에 비해 적어도 1 log 증가한다. 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 14일 내에, 백신접종된 인간 대상체에서 혈청 항체 역가를 대조군에 비해 적어도 1 log 증가한다. 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 7일 내에, 백신접종된 인간 대상체에서 혈청 항체 역가를 대조군에 비해 적어도 1 log 증가한다. 하나의 실시형태에서, 상기 대조군은 동일한 인간 대상체로부터의, 예를 들어, 백신접종 전에 채혈된 면역전 혈청이다. 하나의 실시형태에서, 상기 대조군은 위약-처리된 또는 비-백신접종된 대상체 또는 대상체들로부터의 혈청이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 단일 백신접종의 14일 내에 백신접종된 대상체의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 최대 100%에서 혈청전환을 자극한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 단일 백신접종의 7일 내에 백신접종된 대상체의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 최대 100%에서 혈청전환을 자극한다. 하나의 실시형태에서, 혈청전환은 적어도 10의 CHIKV-특이적 항체 역가, 즉, 중화 항체 역가에 도달하는 것으로서 규정된다. 치쿤구니야 바이러스의 중화는 시험관내 검정, 예를 들어, TCID50 검정 및/또는 중화 검정, 예를 들어, PRNT, 즉, PRNT50 또는 마이크로역가 검정, 즉, μNT50에서 평가될 수 있으며, 여기서, 소정 범위의 혈청 희석은 CHIKV 성장의 중화에 대해 시험되고, 음성 대조군과 비교하여 성장의 50%를 중화시키는 희석을 계산한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, PRNT50 검정은 계수 가능한 플라크에서 판독값을 제공하고, μNT50 검정은 세포변성 효과에 비례하는 비색 판독값을 제공한다. 면역 혈청의 1:10 또는 1:20, 바람직하게는, 1:20, 또는 그 이상의 희석에 의한 TCID50 검정(또는 PRNT50 또는 μNT50 검정)에서의 CHIKV 바이러스 성장의 50% 감소는 본 명세서에서 혈청전환으로서 규정된다. 값은 희석 인자의 역수로서 보고되고, 예를 들어, 1:10 면역 혈청 희석에서 50% CHIKV 중화는 10의 중화 역가로서 지칭되거나, 1:20 면역 혈청 희석에서 50% CHIKV 중화는 20의 중화 역가로서 지칭된다. 본 명세서에서 규정된 10 또는 그 이상의 임의의 중화 역가 값은 모두 혈청전환으로서 규정되고, 10은 가능한 최소값이고, 20 또는 그 이상이 바람직하다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 보호 면역 반응이 오래 지속하는 CHIK 바이러스 질환에 대한 보호 면역 반응을 부여한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 CHIK 바이러스 질환에 대한 평생 보호를 부여한다. 하나의 실시형태에서, 보호 면역 반응은 적어도 6개월 내지 최대 평생, 예를 들어, 수십 년, 예를 들어, 10 내지 70년, 또는 그 이상 지속된다. 하나의 실시형태에서, 보호 면역 반응은 최대 적어도 50년, 적어도 40년, 적어도 30년, 적어도 25년, 적어도 20년, 적어도 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2년, 적어도 1년 지속된다. 바람직한 실시형태에서, 보호 면역 반응은 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 24개월 동안 지속한다. 보호 면역 반응은 치쿤구니야 바이러스 질환의 징후 또는 증상을 감소시키거나 예방하기에 충분한 중화 항체가 생산되는 면역 반응이다.
하나의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기에 적합하지만, 또한, 특정 암을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다. 특히, 약제학적 조성물은 인간 대상체를 백신접종하고 상기 대상체에서 보호 면역 반응을 자극시키는 데 사용하기에 적합하다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 유효량의, 본 명세서에서 규정된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 개시에 따른 CHIKV에 대한 백신접종을 필요로 하는 대상체는 바이러스에 대한 노출 위험성이 있는 임의의 인간 대상체, 예를 들어, 풍토성 또는 발병 국가의 여행자 또는 풍토성 또는 발병 국가 또는 발병 위험이 있는 국가의 거주자일 수 있다.
본 명세서에서 달리 규정하지 않는 한, 본 개시와 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 또한, 문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 개시의 방법 및 기술은 일반적으로, 당 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 본 명세서에 기술되는 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 바이러스학, 세포 또는 조직 배양, 유전학 및 단백질 및 핵 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이의 기술은 당 분야에서 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 본 개시의 방법 및 기술은 일반적으로, 당 분야에 널리 공지되고 달리 명시하지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같은 통상적인 방법에 따라 수행된다. 본 발명의 예를 들어, 백신과 같은 제형은 인간 또는 다른 감수성 동물에서 임의의 치쿤구니야 감염(임의의 CHIKV 균주에 의해 유발됨)의 예방 및/또는 치료에 특히 유용하다. 그러나, 상기 제형은 또한, 다른 적응증, 예를 들어, 임의의 형태의 암에서(다시 예방적 및/또는 치료적 환경에서) 유용할 수 있다.
백신접종 방법
이에 따라, 바람직하게는, 또한, 본 발명에서, 본 발명의 신규한 CHIKV 백신 조성물로 인간 CHIKV 감염에 대해 인간을 백신접종하는 방법이 포함된다. 약독화된 생 CHIKV 중 하나 이상 및 본 명세서에 기술된 부형제를 포함하는 제형, 즉, 백신 조성물은 바람직하게는, 근육내 또는 피하 경로에 의해, 본 명세서에서 또한 결정된 적합한 용량으로, 바람직하게는, 동결건조된(재구성된) 형태로 대상체에 투여된다.
일부 실시형태에서, 제제 또는 조성물은 통상적인 경로를 통해, 예를 들어, 비경구로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "비경구" 투여는 비제한적으로, 피하, 피내(intracutaneous), 피부내(intradermal), 정맥내, 근육내, 정맥내, 복강내, 척수강내 또는 주입을 포함한다.
근육내 또는 피하 경로에 대한 투여량은 본 명세서에 개시된 약독화된 CHIKV 후보물(서열번호 2의 E2 및 서열번호 3의 E2를 갖는 균주들의 혼합물)의 5.01×103 TCID50/용량(용량, 예를 들어, 부피가 1 ml, 이후 또한 5.01×103/ml)과 같은 표적으로 1×103 TCID50/용량 내지 2×104 TCID50/용량인 것으로 제안되고, 본 명세서에 제시된 데이터는 1차 백신접종 후 7일 내에 가능하게 완전히 보호되지만, 1차 백신접종 후 14일 후에 명확하게 보호되는 원 샷 투여량 투여를 뒷받침한다. 인간에서 CHIKV 감염은 미국을 포함하는 다양한 지리적 지역에서 발생하는 것으로 관찰되었다.
하기 실시예는 본 발명의 CHIKV 백신 제형의 제조, 사용 및 투여를 위한 방법을 예시한다. 이러한 실시예는 단지 예시적인 것이고, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1. CHIKV 냉동 건조된 (Lyo) 제품 제형 개발
정의 및 약어
CHIKV
치쿤구니야 바이러스
CHIKV-Δ5nsP3-inv
서열번호 1에 제공된 DNA 서열에 해당하는 RNA 게놈을 포함하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자 및 서열번호 1에 제공된 상응하는 DNA 서열과 적어도 99% 동일한 RNA 게놈을 갖는 CHIKV-Δ5nsP3 변이체를 포함하지만, 바람직하게는, 외피 단백질 E2를 인코딩하는 영역(본 명세서에서 CHIKV-Δ5nsP3으로도 지칭됨)에서 적어도 하나의 아미노산 차이를 갖는 바이러스 폴리단백질을 인코딩하는 면역원성 혼합물
CTMA
CTM 분석 및 개발 부서
CMO
위탁 생산 기관
DLS
시차 광 산란
DP
CHIKV-Δ5nsP3-inv를 포함하는 약물 제품
DS
CHIKV-Δ5nsP3-inv를 포함하는 약물 물질
DSP
다운 스트림 공정
mDSC
변조된 시차 주사 열량법
GCE
게놈 카피 균등물
HEPES
(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)
PC
폴리카보네이트
PD
공정 개발 부서
PETG
폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜-개질
PS
입자 크기
rHSA
재조합 인간 혈청 알부민
RT-qPCR
역전사 - 정량적 중합효소 연쇄 반응
SGP
수크로스 구배 풀
TCID50
조직 배양 감염 용량 50%
TRIS
트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄
TTR
기술 이전 실행(비-GMP)
WFI
주사용 증류수
물질 및 방법
CHIKV 물질
E2(서열번호 2)에 대해 인코딩된 서열번호 1을 갖는 CHIKV-Δ5nsP3-inv(E2에 대해 인코딩된 다른 실질적인 변이체 CHIKV-Δ5nsP3(서열번호 3, E1 및 변형되지 않은 다른 발현된 단백질을 가짐)을 포함함)을 베로 세포에서 제조하고, 다른 문헌(WO2019057793호, WO2017109223호, WO2017109224호 참조)에 기술된 공정에 따라 정제하였다. 본 명세서에서 사용되는 CHIKV-Δ5nsP3-inv는 또한, 본 명세서에서 CHIKV-Δ5nsP3, CHIKV 후보물로서 지칭된다.
관련 실험을 불순물 프로파일 및 바이러스 시드 계대배양(P3)과 관련하여 -여러 로트(lot)에서 제조된- 대표적인 바이러스 물질로 수행하였다.
TCID
50
검정
베로 세포 상에서 TCID50 검정에 의해 바이러스 감염성을 결정하였다. TCID50 검정을 이용하여 베로 세포 상에서 바이러스 역가를 결정하였다. 간단하게, 세포를 마이크로플레이트에 시딩하고, 0.5% FBS 및 2mM 글루타민이 보충된 EMEM에서 10배수 일련 희석된 바이러스 샘플로 감염시켰다. 35℃/5% CO2에서 1주 인큐베이션 후, 바이러스-유도 세포변성 효과를 모니터링하고, 바이러스 역가를 Reed and Muench 방법(Reed, L.J.; Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints (1938) The American Journal of Hygiene 27:493-497)에 따라 계산하였다. 검정 대조 샘플을 각 분석에서 포함하였다. 개별 실행 간의 검정 변동성은 ± 0.3 log10 TCID50으로서 추정되었다.
동적 광 산란(DLS)
동적 광 산란(DLS)은 1㎚ 내지 대략 1000㎚의 크기 범위의 용액 중 바이러스 입자를 포함하는 바이오폴리머의 크기 분포 프로파일을 결정하기 위해 사용될 수 있는 기술이다. 이러한 방법이 어떠한 사전-처리 없이(예를 들어, 더 큰 멀티머/응집물을 여과할 수 있는 크로마토그래피 컬럼이 없음) 천연 샘플로 사용될 수 있기 때문에, 용액 중 모든 입자의 전체 사진을 얻을 수 있다. DLS 측정을 위해 Malvern Zetasizer 시스템을 사용하였다. CHIKV-Δ5nsP3-inv 수크로스 구배 풀(Tris/NaCl 중 약 35% 수크로스)을 6.15 cP의 용액 점도 및 1.4의 굴절률을 가정하여, 어떠한 사전 처리(즉, 희석) 없이 분석하였다. 바이러스 입자 굴절률은 1.45로서 가정되었다. 정확한 측정을 위해, 입자 농도는 또한 입자 크기에 따라 달라지는 특정 임계값 이하로 떨어지지 않아야 한다. CHIKV-Δ5nsP3-inv에 대하여, 희석되지 않은 SGP에 대해 가장 정확한 결과를 얻었다. 대표적인 SGP 물질(표 1에서 SGP 풀)의 비교는 모든 분석된 SGP 샘플에 대해 대략 60㎚의 바이러스 입자 직경을 나타내었으며(데이터는 미도시됨), 이는 문헌에서 언급된 데이터와 관련이 있다.
화학물질
Lyo 제형 완충제의 제조
짧게 말하면, 예를 들어, 5 리터의 제형 완충제를 제조하기 위해 하기 절차를 적용하였다:
- 교반 막대를 구비한 계량된 유리병에 대략 4.5ℓ의 WFI를 채웠다.
교반 하에서 모든 완충제 성분들을 첨가하였다:
- 36.8g - 시트르산삼나트륨 2수화물
- 3.13g 인산수소이칼륨
- 0.975g 인산이수소칼륨
- 250g 수크로스
- 25g 소르비톨
- 7.46g L-메티오닌
- 5.08g 염화마그네슘 6수화물
- 2.5㎖ 재조합 인간 알부민(20% 용액)
투명한 용액이 얻어질 때까지 교반하였다.
WFI로 5000㎖의 최종 부피까지 채웠다.
최종 용액의 밀도(ρ)는 1.025 g/㎖(20℃)였다. 5000㎖를 제조하는 경우에, 얻어진 최종 중량은 5125g이었다.
냉동 건조기
실험실 스케일:
SP Scientific(USA)으로부터의 Intellitronics Control를 구비한 AdVantage Pro 벤치 톱 선반 트레이 건조기 상에서 동결건조를 수행하였다:
3개의 선반(총 2766 ㎠)
선반 온도: -60 내지 +60℃
최저 콘덴서 온도: -70℃
6L의 콘덴서 용량
스토퍼링: 하향식 공압
중간 스케일:
IMA(Industria Macchine Automatiche S.p.A., 이탈리아 소재)로부터의 Lyofast 7 냉동 건조기를 이용하여 중간 스케일에서의 동결건조를 수행하였다.
6개의 선반(총 6.7 ㎡)
선반 최소 온도: -55℃
최저 콘덴서 온도: -75℃
콘덴서 용량: 148Kg
1차 포장(바이알 및 스토퍼)
I상을 위해:
2R 타입 I plus® 유리 바이알(Schott AG), FluroTec stoppers(West Pharmaceutical Services)
추가 임상 시기를 위한 의도된 1차 포장(동결건조된 DP):
2R 타입 I 유리 바이알(Schott AG), 브로모부틸 스토퍼(West Pharmaceutical Services)
결과
실시예 2(본 명세서의 하기)의 액체 제형 완충제를 DS 및 DP 생산 동안 멸균 여과성을 보장하는 동결건조된 제형의 추가 개발을 위한 출발 완충제 조성물로서 선택하였다:
10mM 인산칼륨
25mM 시트르산나트륨
5% 수크로스
0.01% rHSA
pH 7.3
대부분의 분석 데이터를 TCID50 검정에 의해 생성하였는데, 이는 이러한 방법이 바이러스의 감염성을 나타낼 뿐만 아니라 방출 및 안정성 시험 동안 사용되기 때문이다. 또한, 입자 크기의 평가를 위한 동적 광 산란(DLS) 및 전체 바이러스 입자 결정을 위한 qPCR을 이용하였다. 도 2 내지 도 14 모두에 도시된 결과를 CHIKV 백신의 고용량의 제형을 사용하여 생성하였다.
완충제 성분의 타당한 이유(justification)
일반적으로, 냉동-건조되고 냉동된 시스템에서 사용되는 완충제 이온의 농도는 냉동 공정 동안 농도 효과를 방지하는 데 충분히 낮아야 하지만, 여전히 원하는 pH에서 적절한 완충 능력을 제공하기에 충분히 높아야 한다. 포스페이트 이온은 일반적으로, 농도 효과로서 냉동 건조 목적을 위해 방지되고, 냉동 동안 침전은 특히, 고농도에서 유의미한 pH 이동을 야기시킬 수 있다(Sek, D. Breaking old habits: moving away from commonly used buffers in pharmaceuticals 2012 European Pharmaceutical Review https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/article/13699/breaking-old-habits-moving-away-from-commonly-used-buffers-in-pharmaceuticals/). 따라서, Tris, HEPES 및 히스티딘을 대안적인 완충제 성분으로서 포스페이트(4mM, 5mM 및 10mM)와 함께 시험하였다. 10mM L-메티오닌 및 25mM 시트르산나트륨의 존재 하에서 동결건조된 제품의 안정성에 대한 이러한 완충제의 영향을 37℃, 실온 및 4℃ 저장 온도에서 평가하였다. 전체적으로, 포스페이트 및 HEPES 완충제(20mM)는 모든 조사된 온도에서 유사한 안정성 프로파일을 나타내었고, 다른 완충제 조성물을 능가하였다(데이터는 미도시됨). 따라서, 이러한 2개의 완충제의 비교를 위해 추가 실험을 수행하였다: 5mM 포스페이트 완충제 또는 20mM HEPES, 두 제형 모두 4% 수크로스, 1% 트레할로스, 10mM L-메티오닌, 2mM EDTA를 포함함), 이는 시간에 따른 lyo CHIKV 제형의 안정성의 유의미한 차이를 나타내지 않았다(데이터는 미도시됨).
전체 결과를 기초로 하여, (또한 시트레이트 완충제와 함께 액체 냉동된 제형에서와 같이) 완충제로서 포스페이트를 유지하지만, 5mM의 낮은 농도에서, 냉동 동안 완충제 농도 효과 및 가능한 pH 이동을 최소화하는 것으로 결정되었다.
포스페이트-시트레이트 완충제: 초기 임상 시기를 위한 액체 제형 완충제 개발은 DS 및 DP 제조 동안 CHIK 바이러스의 0.2㎛ 멸균 여과성을 목표로 하였다. pH 7.3에서 포스페이트 및 시트레이트로 이루어진 완충제 시스템은 CHIKV의 바이러스 입자 크기를 안정화시키고 0.2㎛ 여과성을 보장하는 것으로 입증되었으며, 이는 무균 제조를 위해 중요한 것이다. 가능한 이온 농도 효과를 최소화하고 동결건조를 촉진시키기 위해, lyo 제형에서 최종 포스페이트 농도는 5mM까지 감소되었다.
수크로스
다운스트림 처리 동안, CHIKV 물질의 최종 농도 및 폴리싱을 위해 수크로스 구배 원심분리를 수행하여, 수크로스 구배 풀(SGP) 중에 대략 35%의 수크로스 농도를 야기시켰다. 수크로스가 생물학적 물질의 냉동 동안 널리 공지된 안정화제이고 또한 벌크화 물질로서 역할을 하기 때문에, 이는 냉동 건조된 제품에 대한 제형 완충제에서 유지되었다. 5%에서의 수크로스는 냉동/해동 스트레스 동안 CHIKV를 보호하는 것으로 나타났다. 제형 완충제와 함께 SGP 대 DS(현재 1:60) 및 DP의 후속 희석에 의해, 5%의 최종 수크로스 농도를 얻었다.
재조합 인간 알부민
rHSA의 농도는 0.01%(0.1 mg/㎖)의 수준에서의 액체 제형과 비교하여 동결건조된 제품에 대해 일정하게 유지되었다. 최소량의 rHSA의 도입은 용기의 표면에 대한 비특이적 흡착을 방지하는 것이 바람직하다. 추가적으로, 이러한 농도에서의 rHSA는 CHIKV의 멸균 여과성 또는 냉동 건조된 제품의 안정성에 악영향을 미치지 않는다.
이러한 초기 연구 후에, 동결건조된 제형의 염기성 제형(basic formulation)("염기성 lyo(basic lyo)")은 다음과 같았다:
5mM 인산칼륨
25mM 시트르산나트륨
5% 수크로스
0.01% rHSA
pH 7.3
lyo 제형의 안정성 개선을 위해 시험된 추가 부형제:
D-소르비톨
염기성 lyo 완충제에서 CHIKV-Δ5nsP3-inv의 동결건조는 냉동 건조된 상태에서 불충분한 안정성을 나타내었다(도 2 내지 도 4 참조). 소르비톨의 단독 첨가는 특히 가속화된 저장 조건(37℃, RT; 각각 도 2 및 도 3) 하에서 안정성의 유의미한 개선을 나타내었다. CHIKV에 대한 소르비톨의 양성 안정화 효과를 개발 동안 시험된 모든 탐색 제형에 대해 관찰하였다. 수크로스 단독이 냉동 건조 동안 -32℃의 다소 낮은 붕괴 온도(Tc)를 나타내기 때문에, 냉동 건조된 제품의 유의미한 안정화를 제공하지만 전체 Tc의 추가적인 유의미한 감소를 방지하기 위해 소르비톨의 농도(Tc -45℃)를 0.5%로 설정하였다.
염화마그네슘
염화마그네슘은 CHIKV의 RNA 구조를 안정화시키는 것으로 가정되고, 저장 후 감염성에 대한 양성 효과를 나타내었다(도 2 내지 도 4). 이는 lyo 제형 완충제에 5mM의 농도로 도입된다.
L-메티오닌
L-메티오닌은 단백질 제형에 적용된 산화제 스캐빈저로서 여겨진다. 10mM의 최종 농도로 첨가될 때, 이는 2 내지 8℃에서 저장 동안 안정성을 증가시켰고(도 4), 가속화된 온도(37℃, RT; 각각 도 2 및 도 3)에서 더욱 두드러졌다.
냉동 건조된 상태에서 CHIKV 안정성에 대한 부형제의 효과
다양한 온도(37℃, RT 및 2 내지 8℃)에서 소르비톨(0.5%), 염화마그네슘(5mM) 및 L-메티오닌(10mM) 및 이들의 조합의 염기성 lyo 제형에 첨가된 냉동 건조된 CHIKV-Δ5nsP3-inv의 안정성의 양성 효과는 각각 도 2 내지 도 4에 요약되었다(저장 일수에 대한 TCID50로 평가됨). 이러한 염기성 완충제에 대한 개개 첨가제의 일-대-일 첨가는 그래프에 나타내었다. 출발점으로서, 모든 제형에 대해 DP 농도로의 희석 후 이론적 TCID50 값(5.7 log10 TCID50/㎖)이 추정되었다.
염기성 lyo 제형 완충제에서 CHIKV-Δ5nsP3-inv의 동결건조와 비교하여, 소르비톨 단독 및 특히, L-메티오닌 및 염화마그네슘과 함께 소르비톨의 첨가에 의한 유의미한 안정화는 가속화된 조건 하에서 관찰되었다.
37℃에서, 감염성의 손실은 1개월당 대략 3 log10 내지 1 log10 개선되었고, 실온에서 1개월당 대략 1 log10 내지 0.2 log10 개선되었다. CHIKV-Δ5nsP3-inv가 소르비톨, MgCl2 또는 L-메티오닌의 첨가 없이 염기성 lyo 제형 완충제에서 동결건조되고 2 내지 8℃에서 저장되었을 때(도 4), 다른 제형과 비교하여 유의미한 차이가 관찰될 수 있다(반년 후 대략 1 log10 손실).
동결건조된 CHIKV의 후속 시험을 하기와 같은 동결건조 완충제(본 명세서에서 동결 건조 제형 완충제 및 lyo 완충제로도 지칭됨)에서 수행하였다:
5mM 인산칼륨
25mM 시트르산나트륨
5% 수크로스
0.01% rHSA
5mM MgCl2
0.5% D-소르비톨
10mM L-메티오닌
pH 7.3
냉동 건조 전 및 후 CHIKV의 비교
동적 광 산란(DLS)
CHIKV의 정확한 크기는 낮은 바이러스 함량에서 완충제 부형제(예를 들어, rHSA)와의 신호 간섭으로 인해 농축된 샘플(예를 들어, SGP)에서만 결정될 수 있다. 바이러스 농도가 충분히 높은 한, lyo 제형 완충제(rHSA를 함유함)에 희석된 샘플에 대한 비교 결과가 얻어질 수 있다. 따라서, 로트 1 SGP(9.0 log10 TCID50/㎖)를 냉동 건조 제형 완충제에서 1:40 희석시켜 대략 7.4 log10 TCID50/㎖의 바이러스 농도를 형성하였다. 냉동 건조된 바이러스의 동결건조 전 및 동결건조/재구성 후에 둘 다에서 DLS에 의해 이러한 물질을 측정하였다(도 5). 냉동 건조 전(135㎚) 및 재구성 후(118㎚) 결정된 바이러스 크기는 유사하였다.
플라크 검정/RT-qPCR
숙주 세포에서 전파할 때, CHIKV는 RNA 게놈 서열에서 규정된 위치에서 최소의 유전적 이질성을 나타내어, 임의의 제공된 제조에서 상이한 바이러스 집단을 형성하였다. 일부 이러한 규정된 이질성은 바이러스(예를 들어, CHIKV E2 단백질에서 E168K 점 돌연변이)의 면역원성 감소에 의해 특징된다. 따라서, 동결건조 동안 개별 바이러스 유전적 집단의 상이한 안정성 프로파일로 인해 바이러스 조성물의 임의의 가능한 변화를 식별하는 것이 중요하였다.
5.7 log10 TCID50/㎖의 명목상 농도를 갖는 DP를 로트 3 SGP로부터 동결건조 완충제에서의 희석 및 후속 냉동 건조에 의해 제조하였다. 동결건조 전(5.69 log10 TCID50/㎖) 및 후(5.61 log10 TCID50/㎖)에 샘플을 취하고, 플라크 모폴로지(데이터는 미도시됨)를 결정하기 위해 플라크 검정에서 및 개개 영역의 야생형 서열과 비교하여 E168K 이질성의 정량화를 위한 RT-qPCR에 의해 분석하였다(도 6). 동결건조 및 재구성은 2개 집단의 비율에 대한 실질적인 효과를 나타내지 않는다.
CHIKV 안정성 동결건조된 DP
CHIKV 물질
본 보고서에서 요약된 관련된 실험(n=4)을 대표적인 DP 물질로 수행하였다. 하기 표 3은 조사된 DP 제형 및 사용되는 CHIKV 물질을 요약한 것이고, 이는 실험실 스케일 및 중간 스케일(TTR) 제형 둘 다를 포함하였다.
동결건조된 CHIKV DP의 표준 저장 조건은 2 내지 8℃이다. 도 7은 2 내지 8℃에서 저장된, 상이한 로트, 즉, TTR2, TTR3, F59B 및 F72의 안정성 데이터를 도시한 것이다. 데이터는 log10 TCID50/㎖ 값으로서 나타났다. 더 긴 안정성 데이터는 실험실 샘플 F72(21개월) 및 TTR2(19개월)에 대해 입수 가능하다(도 24 참조). 예상되는 바와 같이, 냉동 온도에서 동결건조된 제형의 역가 손실은 최소였다.
상승된 온도에서 샘플의 인큐베이션에 의해 수행된 가속화된 안정성 연구는 더 짧은 시간 프레임 내에서 안정성 차이와 관련한 정보를 제공한다. 도 8은 실온에서 저장된 TTR2, TTR3 및 F59B의 안정성 데이터를 도시한 것이다. TTR3의 안정성은 또한, 추가 대조군(TTR3-B)으로서 상이한 내부 부서에 의해 병렬로 평가하였다. 도 9는 37℃에서 동일한 제형의 안정성 데이터를 도시한 것이다. 모든 데이터는 재구성 직후에 평가한 경우 log10 TCID50/㎖ 값을 나타낸다.
두 가속화된 저장 온도 모두에서, 실험실 스케일 물질과 중간 스케일 물질 간의 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 37℃에서, 감염성의 손실은 1개월당 대략 1 log10, 및 실온에서 6개월에 대략 1 log10이었다. 세 가지 온도 모두에서 안정성을 비교하는 중간 스케일 샘플(TTR2) 중 하나로의 더 긴 연구로부터의 결과는 2 내지 8℃에서 최대 19개월까지 양호한 안정성을 나타내었다(도 25).
2 내지 8℃에서 장기 안정성의 예측가능성에 대한 TCID50 검정 변동의 영향을 예시하기 위해, 실험실 스케일 제형은 표 4에 나타내었다.
CHIKV-Δ5nsP3-inv는 실험실 스케일 및 중간 스케일에 대해 현재 입수 가능한 데이터를 기초로 하여 2 내지 8℃ 및 실온에서 우수한 안정성을 나타내었다. 대략 1 log10 TCID50/㎖의 감염성의 허용 가능한 손실은 37℃에서 28일 동안 저장하였을 때 관찰되었다. 2년 저장 후 1 log10 TCID50/㎖ 미만의 손실의 예상된 안정성 프로파일과 함께 2 내지 8℃에서 CHIKV-Δ5nsP3-inv의 장기 저장 안정성을 확인하기 위한 연구가 현재 진행 중에 있다.
또한, 동결건조 파라미터(예를 들어, 1차 및 2차 건조 동안 온도 및 기간)의 약간의 변이가 다양한 저장 온도에서 동결건조 후 CHIKV-Δ5nsP3-inv의 안정성 프로파일을 유의미하게 변화시키지 않는다는 것이 주지되어야 한다(데이터는 미도시됨).
CHIKV lyo 제형의 안정성에 대한 전체 결과: 2 내지 8℃에서 배취가 저장되었을 때 시간에 따른 감염성의 손실은 0.3 log10의 잠재적인 TCID50 검정 변동성을 고려하여 최소였다. 다시 말해서, 장기 저장 후에 2 내지 8℃에서의 유의미한 차이는 더 잘 평가될 수 있다. 기존 데이터를 기초로 하여 최대 2년의 안정성의 외삽은 2 내지 8℃에서 최대 1 log10 TCID50/㎖의 감염성의 손실을 추정한다.
가속화된 온도에서 생성된 안정성 데이터는 더 짧은 시간 프레임에서 배취들 간에 안정성 차이에 대한 정보를 제공한다. 이와 관련하여, 25℃ 및 37℃에서 수행된 연구로부터 실험실 스케일 및 중간 스케일로부터 유도된 동결건조된 DP 간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 얻어진 데이터를 기초로 하여, 37℃에서 감염성의 손실은 1개월당 대략 1 log10 TCID50/㎖ 및 25℃에서 6개월에 대략 1 log10 TCID50/㎖이다.
실시예 2. CHIKV 액체 냉동된 제형 개발
치쿤구니야 백신 후보물 CHIKV-Δ5nsP3-inv의 개발 동안, 바이러스 게놈에서 특정 돌연변이의 생성은 베로 세포 상에서 성장하는 데 필요한 적응에 대한 반응으로 관찰될 수 있다(또한 WO2019057793호 참조, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 이러한 돌연변이 중 하나는 구조 E2 단백질에서 위치 168에 위치되어, 글루탐산 잔기를 라이신(E168K)으로 변경하였다. 이러한 돌연변이는 베로 세포 상에서 후기 계대배양(P6 및 더 높음)에서 우세한 표현형이고, 마우스 모델에서 약독화된 CHIKV의 면역원성의 손실과 상관관계가 있다. 비-면역원성 배취를 생산할 위험을 감소시키기 위해, 바이러스 마스터 뱅크(virus master bank)를 P1로서 생성하였고, 작업 뱅크를 P2로서 생성하여, 생산 계대배양 P3을 형성하였다. 흥미롭게도, 상이한 바이러스 계대배양이, 명백하게 돌연변이에 의해 도입된 상이한 표면 전하로 인해, 안정성 및 분해 효과와 관련하여 상이한 완충제 조성물을 필요로 한다는 것이 확인되었다.
대부분의 초기 제형 개발 작업을 계대배양 8 물질을 이용하여 수행하였다. 하기 제형을 개발하였다:
초기 액체 제형 완충제의 조성물:
20mM 히스티딘 pH 6.8, 5% 수크로스, 0.1% rHSA
추가적으로, 초기 개발 동안, 완충제를 고순도의 MilliQ 수로 제조하였다. 그러나, 계대배양 3(P3) 물질을 동일한 제형 완충제를 사용하여 희석시켰지만 주사용 증류수(WFI)에서 제조하였을 때, 이러한 바이러스 계대배양은 완충제와 더 이상 혼화 가능하지 않았다는 것이 확인되었다. 희석 시에, 바이러스 크기는 가장 가능하게 응집으로 인해 바로 증가하였다(직경이 200㎚보다 크다). 따라서, 이러한 바이러스 용액은 살균 여과 가능하고(0.2㎛ 필터), 이는 백신 생산을 위한 전제조건이다. 포스페이트-시트레이트 완충 시스템은 CHIKV VLP와 혼화 가능한 것으로 보고되었다(Richard Schwartz, Formulation and Stability of a Chikungunya Virus-Like Particle (ChikV VLP) Based Vaccine" in "Vaccine Technology IV", B. Buckland, University College London, UK; J. Aunins, Janis Biologics, LLC; P. Alves, ITQB/IBET; K. Jansen, Wyeth Vaccine Research Eds, ECI Symposium Series, (2013). http://dc.engconfintl.org/vaccine_iv/17).
따라서, 하기 포스페이트-시트레이트 완충된 제형을 개발하고, 히스티딘-완충된 CHIKV 제형으로의 광범위한 이전 경험에 의해 가이딩하고, CHIKV를 제형화하는 이의 적합성에 대해 및 DS 및 DP 생산 동안 살균 여과성을 보장하기 위해 평가하였다:
유용한 농도 범위의 이러한 성분을 조사하였고, 하기 섹션에서 요약하였다. 최종 rHSA 농도가 대부분의 실험에서 고정되지 않았기 때문에, 표면에서 비특이적 흡착을 방지하기 위해 초기에 0.02% rHSA를 선택하였다. 대부분의 분석 데이터는 DLS에 의해 생성되었는데, 이러한 방법이 여과성에 대해 중요한, 입자 크기의 빠른 평가를 제공하기 때문이다.
포스페이트 농도의 영향
완충 성분, 즉 인산칼륨을 10 내지 50mM 범위에서 시험하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 생성된 DLS 데이터는 더 높은 포스페이트 농도가 CHIKV-Δ5nsP3-inv의 입자 크기를 증가시킴을 나타내었다(10mM에서 약 90㎚ 내지 50mM 포스페이트에서 약 140㎚). 10mM의 농도를 포스페이트에 대해 선택하였다.
포스페이트 완충된 용액에서 NaCl 농도의 영향
염화나트륨이 바이러스 크기와 관련하여 시트레이트와 유사한 효과를 나타내는 지를 평가하기 위해, 이는 0 내지 150mM(시트레이트가 존재하지 않음)에서 조사하였다. 완충제에 SGP의 첨가 후 15분 이내에 모든 실험을 수행하였다. 도 11은 포스페이트 완충된 용액에서 NaCl이 바이러스 크기를 대략 100㎚(NaCl 없음)에서 150mM NaCl에서 약 200㎚로 유의미하게 증가함을 명확하게 도시한 것이다. 따라서, NaCl은 추가로 조사되지 않았고, 추가 부형제로서 배제되었다.
시트레이트 농도의 영향
시트레이트는 CHIKV VLP의 응집을 억제하는 것으로 보고되었다(Kramer RM, et al. Development of a Stable Virus-Like Particle Vaccine Formulation against Chikungunya Virus and Investigation of the Effects of Polyanions. 2013 J Pharm Sci. 102(12): 4305-4314. doi:10.1002/jps.23749). 전체 CHIK 바이러스 입자가 CHIKV VLP에 대한 용액에서 유사하게 거동할 수 있다는 것을 추론하는 경우에, 바이러스 크기에 대한 이의 영향을 평가하기 위해 상이한 농도의 시트레이트를 시험하였다. 실제로, 시트레이트의 첨가에 의해 입자 크기에서 유의미한 및 용량-의존 감소를 관찰하였다(도 12). 시트레이트 없는 포스페이트 제형 완충제에서 바이러스는 25mM 시트레이트에서 약 90㎚와 비교하여 약 300㎚의 크기를 나타내었다. 따라서, 0.2㎛ 살균 여과를 촉진하기에 가능한 한 작게 바이러스 크기를 유지하기 위해 제형 완충제에서 시트레이트 농도를 25mM에서 고정시켰다.
pH의 영향
바이러스 단백질의 돌연변이 크기에 따라, 표면에 나타나는 전하는 변할 수 있다. 이러한 변화된 표면 전하와 관련하여, 또한, pH 변화는 바이러스의 응집 거동을 유의미하게 변화시킬 수 있다. pH를 7.0 내지 7.6(10mM 인산칼륨, 25mM 시트르산나트륨, 5% 수크로스, 0.02% rHSA)의 범위에서 조사하였다. 이러한 범위에서 pH 변화의 영향은 대략 100㎚의 입자 크기와 관련하여 유의미하지 않은 것으로 보인다(데이터는 미도시됨).
다른 첨가제의 영향
다양한 추가 완충제 첨가제를 CHIKV-Δ5nsP3-inv 크기에 대한 잠재적인 안정화 효과에 대해 조사하였다:
성분들을 제형 완충제(10mM PO4, 25mM 시트레이트, 5% 수크로스, 0.02% rHSA, pH 7.3)에 명시된 농도로 첨가하였다. DLS 측정을 바이러스 첨가 후 30분 내에 수행하였다. 본래 완충제와 비교하여 상이한 완충제 첨가제에 의해 야기된 CHIKV 직경에 대한 주요 영향이 관찰되지 않았다(데이터는 미도시됨). CHIKV 직경이 염기성 제형 완충제에서 이미 안정하기 때문에, 이러한 추가 부형제의 도입의 추가 장점은 결정되지 않을 수 있다. 그 외에, 또한 부정적인 효과도 결정되지 않았다. 따라서, 시험된 완충제 첨가제는 추후 CHIKV 제형 최적화를 위한 제형 완충제 시스템 내에서 추가 성분이 필요한 경우 기회를 나타낸다.
rHSA의 영향
rHSA가 CHIKV-Δ5nsP3-inv 크기에 미치는 영향을 평가하기 위해, 상이한 양의 rHSA(0 내지 0.1%)를 제형 완충제(10mM 인산칼륨, 25mM 시트르산나트륨, 5% 수크로스, pH 7.3)에 첨가하고, 바이러스 첨가(SGP, 개개 완충제 중에서 1:40) 직후에 DLS에 의해 측정하였다. rHSA 농도를 증가시켜, CHIKV 응집의 직경을 79㎚(rHSA 없음)에서 > 250㎚(0.1% rHSA)까지 야기시켰다. 부피에 따른 크기 분포에 대한 DLS 데이터를 분석할 때 동일한 결과가 얻어졌다. 개개 rHSA 농도에서 관찰된 CHIKV 직경은 표 5에 나열되어 있다. 시간에 따른 CHIKV 직경에 대한 rHSA의 효과는 표 6에 나타나 있다.
이러한 데이터를 기초로 하여, 최대 0.01%의 rHSA 농도가 0.2㎛ 여과에 여전히 적합한 반면, 0.02% 이상의 rHSA 농도가 살균 여과 동안 바이러스의 유의미한 손실을 야기시킨다는 결론을 내렸다.
최소량의 rHSA의 도입은 용기의 표면에 대한 비특이적 흡착을 방지하기 위해 바람직하다. 따라서, 제형 완충제에서 0.01% rHSA가 바람직하고, 바이러스 직경이 여전히 200㎚ 미만이기 때문에, DS 또는 DP의 0.2㎛ 살균 여과 동안 회수를 유의미하게 감소시키지 않으면서 존재할 수 있다.
따라서, 제형 완충제에 존재하는 rHSA 농도를 0.01%로 설정하여, 액체 (냉동) 제형을 위한 하기 완충제 조성물을 형성하였다:
DS 및 DP의 안정성 연구
완충제: 10mM 인산칼륨(K2HPO4 및 KH2PO4), 25mM 시트르산나트륨(Na3C6H5O7), 5% 수크로스, 0.01% rHSA, pH 7.3(전도도 6.0 mS/cm). 사용 전에, 제형 완충제를 0.2㎛ 살균 여과하였다. SGP-로트를 이러한 완충제에서 1:40으로 희석시키고(195㎖ 완충제 + 5㎖ SGP 로트), 3분 동안 교반하고, RT에서 15분 동안 잔류시켰다(큰 스케일에서 후속 제조 공정을 시뮬레이션한다). 이후에, 바이러스 용액을 250㎖ PETG 병으로 0.2㎛ 여과하였다(PALL Mini Kleenpak, 감마 조사에 의해 살균함). 여과 후 DS를, -80℃에서 냉동 상태로 저장할 때(안정성 연구 개시) 60㎖ PETG 병(25㎖ 충전 부피)에 또는 액체 형태에서 저장할 때(2 내지 8℃, RT, 37℃) 1.5㎖ 에펜도르프 튜브에 분취하였다.
예상되는 바와 같이, -80℃에서 저장된 액체 (냉동된) 제형에서 DS는 60일 시점에 적합하게 유지되었다(도 13). 2 내지 8℃에서 저장할 때, 주 당 대략 0.5 log TCID50/㎖의 감염성 감소가 관찰되었다. 물질이 실온(대략 2주 후) 및 37℃(1주 미만)에서 저장되었을 때, 짧은 시간 프레임 내에서 감염성의 완전한 손실을 관찰하였다.
이러한 DS를 DP로 1:50 희석(196㎖ 제형 완충제 + 4㎖ CHIKV DS)으로 추가 처리하였다. 3분 동안 혼합 및 실온에서 15분 동안 인큐베이션 후에, DP를 PETG 병(Mini Kleenpak EKV 막)으로 여과하고, Flurotec 스토퍼로 닫혀진 유리 바이알(1㎖ 충전 부피)에 충전하였다. 안정성 연구를 바이알 상에서 -20℃(정상 저장 온도)에서 및 가속화된 조건(2 내지 8℃ 및 RT) 하에서 수행하였다. 대략 8개월 저장 후 결과는 도 14에 도시되어 있다.
예상되는 바와 같이, 액체 (냉동된) 제형에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3-inv는 2 내지 8℃(주 당 약 0.5 log10 손실)에서 및 특히, 실온에서 저장하는 경우(2주 내에 감염성의 완전한 손실) 적합하지 않았다.
실시예 3. 약독화된 CHIKV-Δ5nsP3 백신의 안전성 및 내약성
건강한 남성 및 여성 지원자에서 3가지 증량적 투여량의 약독화 생치쿤구니야 바이러스 백신 후보물 CHIKV-Δ5nsP3(a.k.a. CHIKV-Δ5nsP3-inv; 즉, CHIKV-Δ5nsP3과 변이체의 혼합물)의 안전성, 면역원성 및 항체 지속성을 평가하기 위한 무작위, 관찰자 맹검, 다기관 1상 시험을 수행하였다. 시험을 위해, 본 명세서에 개시된 액체 냉동된 제형을 사용하였다. 18세 내지 45세의 건강한 지원자를 저용량 그룹, 중간 용량 그룹 및 고용량 그룹으로 1:1:2로 무작위로 할당하고(L=3.2×103 TCID50/0.1㎖ 용량, M=3.2×104 TCID50/1㎖ 용량, H=3.2×105 TCID50/1㎖ 용량), 각각 0일에 단일-샷 면역접종을 받았다. 그룹 H에서 개체의 절반(그룹 H2)에 6개월에 고용량으로 시험감염시키고, 이후에, 12개월까지 28일 시험감염시켰다. 그룹 L, M 및 H1에서의 개체에 12개월에 고용량 백신을 시험감염시키고, 28일까지 시험감염시켰다(도 15A 및 도 15B 참조).
본 연구를 인간 사용을 위한 의약품 등록을 위한 기술 요구사항/우수 임상 실무 지침의 현 국제 조화 회의(International Conference on Harmonisation (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use / Guideline for Good Clinical Practice)를 준수하고 헬싱키 선언에 기술된 원리에 따라 수행하였다. 연구 전반에 걸쳐, 4명의 외부 의료 전문가로 이루어진 독립적인 데이터 안전성 모니터링 위원회는 축적된 안전성 정보의 정기적 검토를 수행하였다. 모든 등록된 대상체는 임의의 연구-관련 절차 전에 서면 동의서를 제공하였다.
18세 내지 45세의 두 성별 모두의 건강한 성인은 시험에 포함에 대해 적격이었다. 대상체의 기준 특성은 표 13에 제공된다. 여성 참가자는 그들이 가임 가능성이 없는 경우(즉, 수술로 불임이거나 폐경후 5년) 적격이었다. 주요 제외 기준은 이전 CHIKV 감염, 면역-매개 또는 만성 관절염/관절통의 이력, 또는 본 연구에서 4주 이내 불활성화된 백신 또는 백신접종 전 8주 내에 생백신으로의 면역접종을 포함하였다. 포함 기준 및 제외 기준의 전체 목록은 표 2에 제공된다. 120명의 참가자를 선택하고, 0일에 단일 백신접종을 받기 위해 무작위로 할당하였다(도 15B). 29개의 백신은 13개월 전에 연구를 종료하였으며, 6명은 추적 관찰에 실패하였으며, 20명은 동의를 철회하였다(AE로 인한 것이 아님). AE(실신)로 인해 1명의 대상체는 시험감염에서 철회되었다. 2명의 다른 대상체는 알 수 없는 이유로 철회되었다. 모든 투여량 그룹에 대한 기준 특성은 유사하였으며, 대부분의 지원자가 남성인 것을 제외하였다(표 7). 이러한 성별 격차는 비-가임기 여성 대상체만을 등록할 수 있는 포함 기준에 의해 반영된다(표 8).
도 15A에 도시된 바와 같이, 0일에 단일 근육내(i.m.) 백신접종을 받기 위해 개체를 저용량(그룹 L) 3.2×103 TCID50/0.1㎖ 용량, 중간 용량(그룹 M) 3.2×104 TCID50/㎖ 용량 또는 고용량(그룹 H) 3.2×105 TCID50/㎖ 용량으로 1:1:2로 무작위화하였다. 투여량을 주사 부피에 의해 조정하였다. 6개월 또는 12개월에 고용량으로 시험감염시키기 위해 용량 그룹 H에서 참가자를 6개월에 1:1로 재-무작위화하였다. 낮은 및 중간 용량 그룹에서의 참가자에게 단지 12개월에 고용량 백신을 시험감염시켰다. 참가자 및 조사자는 용량 그룹에 배정에 대해 맹검화되었다. 무작위화를 오름차순으로 무작위화 엔벨로프를 통해 수행하였다. 백신을, 맹검 스태프 일원 및 참가자에 의해 관찰되지 않은, 비맹검 연구 스태프에 의해 제조하였다. 투여 전에 시린지 내용물을 마스킹하였다. 안전성 및 면역원성 평가를 위해, 백신접종 전(0일)에, 백신접종 후 3일, 7일, 14일, 28일 및 180일에뿐만 아니라 단일 백신접종 후 84일 및 12개월에 채혈하였다.
1차 목표는 단일 백신접종 후 백신의 안전성 및 내약성을 평가하기 위한 것이다. 참가자 일기는 백신접종 후 최대 14일까지 매일 구강 체온, 예측된 주사 및 전산 반응의 수집을 위해 사용되었으며, 이는 FDA의 독성 등급화 스케일을 이용하여 평가된다. 또한, 참가자는 열, 근육통, 두통, 요통 및 황반에서 반구진 발진, 때때로, 피부 소양증(족궁) 및 안면 및 사지의 부종, 다발성 선종, 사지(손목, 발목 및 지골)에서 가장 빈번하게 발생하는 급성 (다발성)관절염, 건활막염, 신경학적 증상 또는 심장 증상의 갑작스런 발병을 나타내는 전신 증상에 의해 나타나는 CHIKV-관련 사건의 급성 단계를 시사하는 증상에 대해 모니터링되었다.
백신접종 및 시험감염 후 바이러스혈증 및 배출의 측정을 위해, 대상체로부터의 혈장 및 소변을 역전사효소 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의해 CHIKV 게놈 RNA의 존재에 대해 분석하였다(Panning, M. et al., 2008, Chikungunya Fever in Travelers Returning to Europe from the Indian Ocean Region, 2006. Emerging Infectious Diseases 14(3):416-422; Pastorino B. et al., 2015, Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for detection and quantification of African Chikungunya viruses, Journal of Virological Methods, 65-71). 간단하게, 전체 RNA를 개체 시편으로부터 추출하고, CHIKV nsP1 유전자에 대해 특이적인 프라이머 및 가수분해 프로브를 사용하여 RT-qPCR로 처리하였다. 판독값은 정량적이고, 1㎖의 초기 대상체 시편 당 CHIKV 게놈 카피 균등물(GCE)의 수로서 보고되었다. 검정은 정밀도 및 특이성에 대해 자격을 갖추었다. 검출 및 정량화 한계는 각각 1087 GCE/㎖(10 GCE/반응) 및 3261 GCE/㎖(30 GCE/반응)로서 규정되었다. 치료 그룹에서 이용 가능한 결과가 없는 시점은 500에서 플롯팅되었다.
통계학적 분석. 120명의 참가자의 샘플 크기는 AE의 검출을 허용하였으며, 이는 일반적으로 백신접종에 대한 밀접한 관계를 가지며, 95%의 확률과 2.5%의 진정한 기저 유병률을 갖는다. 본 연구는 일반적이지 않거나 드문 AE를 검출하지 못하였으며, 따라서, 위약 그룹이 포함되지 않았다. 0일에 단일 백신접종을 받은 모든 참가자는 안전성 데이터세트에 포함되었다. 각 백신접종 후 최대 14일까지 예측된 주사 부위 및 전신 반응 및 예측되지 못한 AE 및 SAE를 갖는 개체의 수 및 백분율은 각 용량 그룹 전체에 대해 및 신체 시스템/선호 용어에 의해 제시되었고, 그룹 간의 차이에 대한 피셔 정확성 테스트를 이용하여 비교되었으며, 유의미한 전체 테스트는 개체 그룹 간의 쌍별 테스트에 의해 수정되었다.
본 연구의 1차 결과는 백신의 안정성 및 내약성을 평가하기 위한 것이었다. 약독화 생CHIKV-Δ5nsP3 백신은 일반적으로, 낮은 및 중간 투여량 그룹에서 단일 백신접종 후 최대 12개월까지 안전하고 내약성이 우수하였고, 모든 투여량 그룹에서 일반적으로 안전하였다. 단일 백신접종 후 부작용의 요약은 표 9에 제공된다. 낮은 및 중간 투여량은 높은 투여량 그룹과 비교하여 우수한 반응성 프로파일을 나타내었다(p-값 0.0089; 쌍별 테스트 M 대 H 0.0042). 용량 그룹에 걸친 대다수의 AE는 경증 또는 중등도로서 평가되었으며, 단일 백신접종 후 대부분의 AE가 보고되었다. 특별한 관심이 있는 부작용 및 백신 관련된 심각한 부작용이 보고되지 않았다. 2가지 관련되지 않은 심각한 부작용이 발생하였다. 교통사고 후 다발성 외상 1건 및 6개월 재-백신접종 후 62일에 심방 기외 수축 1건(표 9). 임의의 시험감염 후에, AE의 비율은 실질적으로 감소하였으며, 단지 6명의 참가자는 임의의 시험감염 후 28일 내에 관련된 AE 발생을 보고하였으며, 이는 참가자가 시험감염-유발 AE로부터 보호됨을 나타내었다(표 10에 제공된 요약).
단일 백신접종 후 14일 내에 국소 내약성 프로파일은 모든 용량 수준에서 우수한 것으로 간주되었으며, 백신의 7% 미만(그룹 H에서 4/59)은 임의의 국소적 AE를 보고하였다(p-값 전체 0.7827). 압통은 단일 백신접종 후 가장 일반적인 주사 부위 반응이었으며, 이는 대상체의 5% 이상에 영향을 미쳤다(그룹 H에서 3/59)(도 16A 내지 도 16C). 시험감염 후 6개월에 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다(도 16D). 시험감염 후 12개월에 통증, 압통 및 부기 각각의 1개의 경증 사례가 보고되었다(도 16E 내지 도 16G). 주목할 만한 전신 부작용은 단기 열, 두통, 피로 및 근육통을 포함하였다. 관련된 전신 AE의 비율은 높은 투여량 그룹과 비교하여 낮은 및 중간 투여량 그룹에서 유의미하게 낮았다(p-값 전체 0.0007; 쌍별 테스트 L 대 H 0.0017; M 대 H 0.0031). 9명의 개체는 10개의 관련된 중증 예측된 전신 AE를 경험하였으며(표 3 및 표 4), 단일 백신접종 후 2 내지 4일 내에 주로 열이 발생하였으며, 하나의 열 사례는 낮은 및 중간 투여량 그룹 각각에서 발생하였으며, 5개의 사례가 높은 투여량 그룹에서 발생하였으며, 하나의 중증 두통(H) 사례가 발생하였다(표 11). 6개월 또는 12개월에 시험감염 후에, 어떠한 백신도 열을 경험하지 않았으며, 용량 그룹 H2에서 2명의 개체는 시험감염 후 6개월에 매스꺼움이 보고되었으며, 용량 그룹 H1에서 시험감염 후 12개월에 중등도 두통 및 경증 관절통 각각의 1 사례가 보고되었다(표 12).
단일 백신접종 후 참가자의 1/3에서 혈구수의 변화가 관찰되었다: 가장 일반적으로 백혈구 감소증, 호중구 감소증 및 림프구 감소증(표 13). 모든 그룹에 걸쳐 중증 사례가 관찰되었다: 저용량 그룹에서 2개의 호중구 감소증 사례 및 중간 용량 그룹에서 1개의 사례; 고용량 그룹에서 2개의 림프구감소증 사례. 시험감염 후에, 중증 사례가 보고되지 않았으며, 단일 백신접종 후 비교에서 이러한 값들의 발생의 유의미한 감소(단일 백신접종 후 대 시험감염 후 7일에 쌍별 부호 순위 시험, p-값 < 0.0001, 표 13)가 관찰되었다.
혈장 및 소변 샘플을 상술된 바와 같은 PCR에 의해 바이러스혈증 및 바이러스 배출에 대해 스크리닝하였다. 모든 그룹에서 면역접종 후 3일에 바이러스혈증이 가장 높았으며, 그룹 H에서 최고 평균 게놈 카피 균등물(GCE)(2.3×105 GCE/㎖)을 갖는다. 그룹 L 및 M에서 GCE 값은 상당히 낮아서, 각각 7.4×104 및 8.9×104 GCE/㎖의 평균 역가에 도달하였다. 단일 백신접종 후 7일에, 보고 가능한 바이러스혈증 결과를 나타낸 대상체의 수는 모든 연구 부문에서 현저하게 감소하였으며, 혈장 바이러스 RNA의 평균값은 8814.0 GCE/㎖(그룹 L) 내지 27,028.0 GCE/㎖(그룹 H)의 범위였다. 14일에 임의의 용량 아암에서 어떠한 대상체도 보고 가능한 바이러스혈증 결과를 나타내지 않았다(도 17A). 시험감염 후 180일 또는 12개월에 바이러스혈증이 검출되지 않았다(도 17B). 백신접종(1.1×104 GCE/㎖) 후 7일에 그룹 L로부터의 단일 대상체에서 소변 배출이 검출되었고(도 18A), 시험감염 후 180일 또는 12개월에서 전혀 검출되지 않았다(도 18B).
재-백신접종 전 및 후에 발생하는 AE를 분리하기 위해 예측된 AE에 대한 사후 분석을 수행하였다. 또한, 단일 및 임의의 재-백신접종 후 7일 내지 28일에서의 비정상적인 림프구, 호중구, 및 백혈구 카운트의 비율의 통계학적 비교를 수행하였다.
실시예 4. 면역원성 연구
A. 단일-샷 CHIKV-Δ5nsP3 백신에 의해 부여된 중화 항체 역가 및 혈청보호
임상 시험의 2차 목표는 CHIKV-특이적 중화 항체에 의해 측정된 단일 백신접종 후 면역 반응, 약독화 생백신 후보물의 최적의 용량 수준의 식별, 시험감염 후 CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성의 평가, 및 단일 백신접종 후 12개월까지 항체 지속성의 평가를 포함하였다. 백신에 대한 중화 항체를 비색 CPE 판독을 기반으로 하는 마이크로중화 검정(μNT)을 이용하여 평가하였다. 간단하게, 동일한 부피의 혈청 샘플의 연속 2배수 희석액을 CHIKV-Δ5nsP3(100% CPE를 형성하는 농도로)과 혼합하고, 96 웰 플레이트에 플레이팅된 베로 세포 상으로 옮기기 전에, 37℃에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션하였다. 수일 후에, 세포 생존력을 평가함으로써 베로 세포 감염의 억제를 관찰하였다. 중화 역가는 중화 항체가 결여된 바이러스 대조군과 비교하여 세포 사멸로부터 50% 보호(μNT50)를 유도하는 혈청 희석배수의 역수로서 규정된다. 정량화 한계 미만의 역가(μNT50<20)는 10의 값을 제공하였다. 혈청전환은 베이스라인 혈청음성 대상체에 대해 적어도 20의 CHIKV-특이적 중화 항체 역가, 즉, μNT50 ≥ 20에 도달한 것으로서 규정되었다.
면역원성 분석은 ANOVA(인자 용량 그룹 공변량 연구 사이트)에 의해 28일에(즉, 백신접종 후 28일), 용량 그룹 L, M 및 H 간에 퍼-프로토콜(PP) 집단에서 기하 평균 역가(GMT) 및 혈청전환율(SCR)의 비교이다. 또한, GMT 및 기하 평균 배수 증가(GMFI)를 모든 시점에서 용량 그룹 간에 전체 및 쌍별(터키 HSD 테스트)로 비교하였다. 모든 분석을 SAS(버젼 9.3)에서 수행하였다.
3가지 백신 투여량 모두는 단일 백신접종 후 면역원성이 높았다. 단일 백신접종 후 14일에, 모든 투여량 그룹에서 100%의 대상체가 혈청전환되었다. (혈청전환은 적어도 20[μNT50≥20]의 CHIKV-특이적 중화 항체 역가를 달성한 대상체로서 규정됨). 또한, 모든 투여량 그룹에서 전환율은 12개월까지 지속되었다(도 19A). 28일에 항체 역가의 적어도 16 배수 증가는 모든 투여량 그룹에서 96.3% 또는 그 이상의 대상체에서 관찰되었다. 28일까지, 최고 CHIKV-특이적 중화 GMT은 592.6 내지 686.9의 범위인데, 이는 베이스라인에 비해 역가의 60배수 초과의 증가를 나타낸다(도 19B). 개체의 측정된 피크 역가는 최대 10,240에 도달하였다(그룹 M 및 H).
그룹 L, M, H1 및 H2에서 각각 대상체의 100%, 100%, 94.4% 및 96.2%에서, 시험감염 용량의 부스터 효과인 면역기억 반응의 결여가 시험감염 후에 관찰되었는데, 이는 시험감염 전 역가와 비교하여 항체 역가의 4배 이하 상승에 의해 특징되는 살균 면역을 나타낸다(도 20A 및 표 14). 시험감염 전에, 그룹 H2 GMT는 452.5(범위 40 내지 2560)에서 지속하였고, 시험감염 후 28일 동안 490.2(범위 80 내지 2560)에서 변하지 않고 유지되었다(도 20B). 유사하게는, 12개월에 시험감염 후 28일(13개월)에, 그룹 L, M 및 H1에서의 항체 수준은 시험감염 전과 동일하게 유지되었다(도 20B).
혈청보호 임계치의 설정. 문헌[Yoon et al. 2015 (상기 참조)]에 의해 확립된 혈청보호 임계치를 현 연구의 결과로 바꿀 때, >1:10의 역가는 100%의 대상체에서 14일째에 달성된다. 문헌[Yoon et al.]에서 사용된 PRNT 검정 및 본 연구에서 사용된 마이크로중화 검정이 비록 상이한 포맷에서 및 상이한 바이러스에 대해 시험되지만, 동일한 원리를 기초로 하기 때문에, 결과는 직접적으로 비교할 수 없다. 본 명세서에서 논의되는 바와 같이, PRNT는 약독화된 CHIKV 균주 181/클론 25를 사용한 플라크의 감소에 의해 바이러스 중화를 측정하고, μNT는 바이러스-유도 세포변성 효과의 감소에 의해 약독화된 CHIKV-Δ5nsP3의 중화를 결정한다. 그러나, 현 1상 연구에서 적용된 μNT50 ≥20의 보존적 혈청보호 임계값을 이용한 경우에도, 모든 대상체는 14일째에 중화 항체 역가를 나타내었으며, 이는 단일 백신접종 후 12개월 동안 지속되었다(도 19A). μNT50 ≥40 내지 ≥80의 예상 밖의 혈청보호 임계 역가를 이용함으로써 이를 더욱 더 강조하면, 상이한 용량에 걸쳐 거의 100%의 대상체는 CHIKV-Δ5nsP3로의 단일 백신접종 후 14일째에 보호될 것이다(도 21A 및 도 21B). 심지어 μNT50 ≥160의 불합리적으로 높은 임계 역가를 적용할 때, 모든 용량에 대해 대상체의 90% 초과가 적어도 12개월까지 CHIKV-Δ5nsP3으로의 단일 백신접종 후 보호될 것이다(도 21C). 단일-샷 약독화 생 CHIKV 백신 CHIKV-Δ5nsP3에 의해 유발된 높고 지속적인 기하 평균 항체 역가를 기초로 하여, 얻어진 중화 항체 수준은 보호를 나타내는 대리 종점보다 훨씬 높아야 한다.
아시아 CHIKV 균주에 대한 마이크로중화 PRNT 역가는 CHIKV-Δ5nsP3 백신에 의해 유발된 강력한 교차-중화를 나타냄
CHIKV-Δ5nsP3 백신에 의해 유발된 항체의 교차-중화 활성의 평가를 위해, 상이한 시점에서 임상 연구로부터의 혈청 패널을 또한, 아시아 유전자형의 약독화된 이종 CHIKV 균주 181/클론 25에 대한 중화 능력에 대해 μPRNT 검정에서 시험하였다. VLA1553-101 연구와 관련된 총 111개의 단일 혈청(37개의 백신접종전 샘플을 포함함) 및 5개의 인간 혈청을 시험하였다. 하나의 μPRNT 결과는 50% 중화 임계값을 2회 교차하는 샘플로 인해 유효하지 않았다. μNT 및 μPRNT에 의해 측정된 양성 역가들(n=75) 간의 상관관계를 피어슨 상관 계수를 이용하여 계산하였다. 도 22에 도시된 바와 같이, 동부 중앙 남아프리카(ECSA) 유전자형의 LR2006-OPY1 및 아시아 유전자형의 CHIKV 균주 181/클론 25를 기초로 하여, 백신 균주 CHIKV-Δ5nsP3(del5nsP3)에 대해 시험된 혈청의 중화 역가의 매우 통계학적으로 유의미한 상관관계가 존재하였다. CHIKV-Δ5nsP3 백신에 의해 유도된 항체가 또한, 181/클론 25 아시아 CHIKV 균주를 효율적으로 중화시키는 것으로 관찰되었다. 또한, 두 균주 모두에 대한 중화 항체 역가 값은 상이한 검정 포맷(μNT 대 μPRNT)을 사용하여 얻어짐에도 불구하고 매우 유사하였다. 이러한 데이터는 CHIKV-Δ5nsP3 백신이 CHIKV의 하나 초과의 균주에 대한 보호를 부여할 수 있음을 강력하게 시사한다.
상이한 CHIKV 유전자형들 간의 교차-중화가 이미 문헌에 나타났지만, 타당성 연구 동안 얻어진 결과는 CHIKV-Δ5nsP3-유도 항체의 교차-중화 능력에 대한 추가 통찰력을 제공하였다. 그럼에도 불구하고, 검정 시스템에서의 차이로 인해, 보고된 결과에서 약간의 차이가 예상되었다. μPRNT로부터 얻어진 결과를 뒷받침하기 위해, 항-CHIKV 전체 IgG 항체를 CHIKV 바이러스-유사 입자(서아프리카 균주 37997로부터의 E1, E2 및 C1 단백질)를 사용하여 ELISA에 의해 정량화하였고, 결과를 비교하였다.
방법
임상 개발 과정에서, 현 연구로부터 선택된 혈청 샘플을 CHIKV-Δ5nsP3의 중화를 측정하는 마이크로-중화 시험(μNT), 181/클론 25 CHIKV의 중화를 측정하는 마이크로-플라크 감소 중화 시험(μPRNT), 및 37997 서아프리카 37997 CHIKV 균주를 기초로 한 치쿤구니야 바이러스-유사 입자(VLP)-기반 IgG ELISA를 이용하여 시험하였다. ELISA에 대한 정제된 CHIKV 바이러스-유사 입자(VLP)는 서아프리카 균주로부터의 바이러스 단백질 C, E1 및 E2를 포함하였다. 혈청 샘플을 역가 범위에 걸쳐 임상 시험 동안 얻어진 중화 역가를 기준으로 선택하고, 이는 샘플 입수 가능성에 따라 달라진다. 111개의 CHIKV-Δ5nsP3 인간 혈청 샘플의 패널을 이러한 비교성 연구에서 포함하였다. 3가지 검정 모두를 결과와 검정 특징의 상관관계의 측면에서 비교하였다.
CHIKV μNT, μPRNT 및 IgG ELISA의 비교
111개의 임상 혈청 샘플의 서브-세트를 μNT, μPRNT 및 ELISA 검정에서 분석하였다. μNT, μPRNT 및 ELISA로 측정된 log-변환 역가들 간의 상관관계를 피어슨 상관 계수(피어슨 r)를 이용하여 계산하였으며, 여기서, "1"의 값은 전체 양성 선형 상관관계를 나타내며, "0"의 값은 선형 상관관계가 아님을 나타낸다. 정량 하한치(LLOQ) 미만의 역가를 갖는 샘플뿐만 아니라 양성 대조군을 상관관계 분석으로부터 배제하였다. 도 22A에 도시된 바와 같이, μNT 및 μPRNT와 관련한 피어슨 r에 대해 얻어진 값은 0.6724이었으며, 이는 중간 정도로 강한 양성 상관관계를 나타낸다. 또한, μPRNT 및 μNT로 얻어진 역가가 유사하다는 사실은 아시아인 계통의 CHIKV(181/클론 25)에 대한 CHIKV-Δ5nsP3의 교차-보호 능력을 나타낸다.
대조적으로, μPRNT 및 ELISA 결과에 대해 얻어진 피어슨 r 값은 0.1991이었으며, 이는 약한 양성 상관관계만을 나타내었다(도 22B 참조). 이러한 결과는 또한, μPRNT로 측정된 역가와 비교하여 ELISA에 의해 측정된 역가의 더 좁은 분포에서 반영된다. 아마도, 중화 검정에서 명백하게 되는 CHIKV 항체의 기능적 차이는 ELISA에 의해 검출되지 않았다. ELISA가 단지 전체 CHIKV-특이적 IgG 항체를 측정하는 반면, μPRNT는 모든 아이소형의 CHIKV-중화 항체를 검출한다. 그럼에도 불구하고, 양성 ELISA 역가를 갖는 모든 샘플은 또한, 양성 μPRNT 역가를 나타내었으며, 이러한 관찰은 항-CHIKV 면역 반응에서 ELISA의 예측된 값을 뒷받침한다. 14일 및 그 후로부터의 백신접종 후 샘플 모두는 ELISA에서 양성으로 시험되었다. 백신 균주와는 상이한 CHIKV 계통으로부터 CHIKV 균주가 유도되었기 때문에, μPRNT(균주 181/클론 25 아시아인) 및 ELISA(서아프리카 균주 37997) 둘 다에서 CHIKV-Δ5nsP3(ECSA)을 사용하였으며, CHIKV-Δ5nsP3이 교차-중화 항체로 유도하는 능력을 추가로 뒷받침하였다.
조기 혈청전환 면역 반응의 초기 시기 동안 수집된 샘플로의 시험 성능을 분석하기 위해 연구에서 모든 그룹으로부터의 총 10개의 방문 1B 샘플(백신접종 후 7±1일)을 포함하였다(표 A1 참조). 시험된 모든 샘플은 CHIKV IgG ELISA에서 LOD 미만의 IgG 수준을 가졌으며, 이는 백신접종 후 이러한 초기 시점에 CHIKV-특이적 IgG 항체의 부재를 나타내는 것이다. 그러나, 이러한 초기 시점에 CHIKV-중화 IgM 항체의 존재로 인해, 2개의 방문 1B 샘플을 제외하고 모두는 μPRNT에서 양성으로 시험되었고, 모두는 μNT 검정에서 양성으로 시험되었다.
표 A1.
CHIKV-Δ5nsP3 시험 중화된 야생형 CHIKV로부터의 환자 혈청 야생형 치쿤구니야 바이러스(인도양/ECSA 계통[La Reunion 균주; wt CHIKV-LR] 및 서아프리카 균주; wt CHIKV-WA 3797) 중화 항체를 정량화하기 위해 임상 시험으로부터의 혈청 샘플(n=47 단일 혈청)을 분석하였다. 개별 대상체의 상이한 방문시에 수집된 혈청을 PRNT에 의해 분석하였다(도 23 참조). 14일 또는 그 후에 얻어진 모든 VLA1553-101 백신접종후 샘플은 야생형 La Reunion CHIKV 및 서아프리카 계통의 불균일 균주 둘 다에 대한 실질적인 중화 활성을 나타내었다.
전체적으로, μNT에 의해 평가된 약독화된 CHIKV-Δ5nsP3 균주에 대한 특정 혈청의 중화 능력은 PRNT에 의해 평가된 2개의 야생형 CHIKV 균주에 대한 이의 중화 능력과 잘 상관되었다. 이러한 결과는 CHIKV-Δ5nsP3 백신의 교차-중화 능력을 입증할 뿐만 아니라, μNT 검정 및 PRNT 검정을 시용하여 얻어진 역가 값의 비교성을 나타내었다.
B. CHIKV-Δ5nsP3 임상 시험 혈청 및 유사한 회복기 인간 혈청으로부터의 GMT 값
CHIKV에 대한 자연 노출에 의해 부여된 GMT 자연 감염에 의해 부여된 항체는 CHIKV 열에 대한 평생 보호를 제공하는 것으로 가정되었으며(Galatas, et al. and Nitatpattana, et al.; 상기 참조); 따라서, 본 임상 샘플에서 관찰된 μNT 역가를 자연 감염으로부터 회복 중인 개체에서 중화 항체 역가와 비교하였다. 치쿤구니야 감염으로부터 회수된 개체로부터의 14개의 혈청 샘플(University of Texas Medical Branch(UTMB)를 통해 신종 바이러스 및 아보바이러스에 대한 세계 협력 센터(World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses: WRCEVA)에 의해 종류별로 제공되거나 SeraCare 및 Biomex로부터 구매함)을 현 임상 연구에서 사용되는 CHIKV-Δ5nsP3 μNT 검정에서 시험하였다. 3가지 소스 모두로부터의 회복기 혈청의 중화 역가는 유사하였다(표 A2 참조). 또한, 역가는 CHIKV-Δ5nsP3으로의 단일 백신접종 후 관찰된 것과 유사하였으며, 이는 모든 용량 그룹에서 28일에 최대 2560의 GMT 값에 도달하였다.
표 A2.
서열
서열번호 1 - CHIKV-△5nsP3의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 2
구조 폴리단백질로부터의 LR2006_OPY1 치쿤구니야 바이러스 균주―아미노산 339-742로부터의 E2 단백질의 아미노산 서열; GenBank 수탁: ABD95938.1 (1-1248 aa)
본 명세서에서 식별된 일부 E2 변이체
서열번호 3
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 E168K 변이체
서열번호 4
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 G55R 변이체
서열번호 5
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 E247K 변이체
서열번호 6
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 G82R 변이체
서열번호 7
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 H232Y 변이체
추가의 바람직한 양태:
1. i) 서열번호 1의 핵산 서열에서 규정된 바와 같은 약독화된 치쿤구니야 바이러스 및 이의 변이체의 조합물로서, 상기 변이체는 서열번호 1과 적어도 99% 동일하고 서열번호 1에서와 같이 nsP3의 전체 결실 돌연변이를 포함하는 핵산 서열을 갖는 조합물; 및 ii) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 실질적으로 안전하고, 단일 투여량 후 인간에서 치쿤구니야 바이러스에 대한 지속적인 보호 면역 반응을 유도할 수 있으며, 상기 투여량은 약 103 내지 5×104 TCID50/용량, 바람직하게는, 약 103 내지 2×104 TCID50/용량인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
2. 양태 1에 있어서, 상기 투여량이 약 5×103 TCID50/용량인, 약제학적 조성물.
3. 양태 1 또는 2에 있어서, 상기 약독화된 치쿤구니야 바이러스 변이체가 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 E2 단백질, 특히, 서열번호 3 내지 서열번호 7에서 규정된 E 단백질을 발현시키는, 약제학적 조성물.
4. 양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 약독화된 치쿤구니야 바이러스 변이체가 서열번호 3에서 규정된 E168K 돌연변이를 갖는 E2 단백질을 발현시키는, 약제학적 조성물.
5. 원-샷 백신(one-shot vaccine)인 약제학적 조성물로서, i) 서열번호 2에서 규정된 E2 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3, 서열번호 3에서 규정된 E2 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3; 및 ii) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 필수적으로 포함하고, 상기 혼합물은 약 103 내지 5×104 TCID50/용량, 바람직하게는, 약 103 내지 2×104 TCID50/용량의 용량으로 전달되는, 약제학적 조성물.
6. 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 액체 냉동된 조성물인, 약제학적 조성물.
7. 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 동결건조된 조성물인, 약제학적 조성물.
8. 양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 수크로스, 인산칼륨 및 시트르산나트륨 및, 선택적으로, 염화마그네슘, D-소르비톨, L-메티오닌 및 재조합 인간 혈청 알부민 rHSA를 필수적으로 포함하는, 약제학적 조성물.
9. 양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 약 5%(w/v) 수크로스, 약 10mM 인산칼륨, 약 25mM 시트르산나트륨 및 약 0.01%(w/v) 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 필수적으로 포함하는, 약제학적 조성물.
10. 양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 약 5%(w/v) 수크로스; 약 5mM 인산칼륨; 약 25mM 시트르산나트륨; 약 5mM MgCl2; 약 0.5%(w/v) D-소르비톨; 약 10mM L-메티오닌; 및 약 0.01%(w/v) 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 필수적으로 포함하는, 약제학적 조성물.
11. 양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 1차 면역접종(immunization)으로부터 약 14일 내에 대조군에 비해 인간에서 상기 바이러스에 대한 혈청 항체 역가를 적어도 1 log 증가시킬 수 있는, 약제학적 조성물.
12. 양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 1차 면역접종으로부터 약 7일 내에 대조군에 비해 인간에서 상기 바이러스에 대한 혈청 항체 역가를 적어도 1 log 증가시킬 수 있는, 약제학적 조성물.
13. 양태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 백신접종 7일 내에 백신접종된 대상체(vaccinated subject)의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 최대 100%에서 혈청전환을 자극할 수 있으며, 혈청전환은 적어도 10의 CHIKV-특이 항체 역가에 도달하는 것으로서 규정되는, 약제학적 조성물.
14. 양태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 백신접종 14일 내에 백신접종된 대상체의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 최대 100%에서 혈청전환을 자극할 수 있으며, 혈청전환은 적어도 10의 CHIKV-특이 항체 역가에 도달하는 것으로서 규정되는, 약제학적 조성물.
15. 양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 보호 면역 반응이 적어도 6개월 동안 지속하는, 약제학적 조성물.
16. 양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 보호 면역 반응이 적어도 12개월 동안 지속하는, 약제학적 조성물.
17. 양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 보호 면역 반응이 적어도 24개월 동안 지속하는, 약제학적 조성물.
18. 양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
19. 치쿤구니야 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 양태 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
1A. a) 유효량의 적어도 하나의 생치쿤구니야 바이러스 균주; b) 약 1 내지 50%(w/v) 당; c) 약 1mM 내지 약 20mM 포스페이트; d) 약 1mM 내지 약 50mM의 적어도 하나의 카복실레이트; e) 선택적으로, 약 1mM 내지 약 10mM MgCl2; f) 선택적으로, 약 0.1% 내지 약 5%(w/v) D-소르비톨; g) 선택적으로, 약 1mM 내지 20mM L-메티오닌; 및 h) 선택적으로, 약 0.001% 내지 약 0.1%(w/v) 인간 혈청 알부민을 포함하는 액체 냉동된 또는 동결건조된 생치쿤구니야 백신 제형(live chikungunya vaccine formulation).
2A. 양태 1A에 있어서, 인간 혈청 알부민이 재조합 인간 혈청 알부민인, 제형.
3A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 상기 적어도 하나의 카복실레이트가 숙시네이트, 시트레이트, 푸마레이트, 타르타레이트, 말레에이트 및 락테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제형.
4A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 상기 당이 수크로스, 만니톨, 락토스, 소르비톨, 덱스트로스, 푸코스 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제형.
5A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 당의 농도가 약 1 내지 약 10%이고; 포스페이트의 농도가 약 1 내지 약 10mM이고; 상기 적어도 하나의 카복실산이 약 10 내지 약 30mM 농도의 시트레이트 또는 숙시네이트인, 제형.
6A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, k) 소정 부피까지의 조직 배양 배지, 염수 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 희석제를 더 포함하는, 제형.
7A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0, 바람직하게는, pH 7.0 내지 pH 7.5, 가장 바람직하게는, pH 7.3인, 제형.
8A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 상기 포스페이트가 모노포스페이트, 폴리포스페이트 및 포스포릴화된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제형.
9A. 양태 8A에 있어서, 상기 모노포스페이트가 인산칼륨인, 제형.
10A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 제형이 유효량의 적어도 하나의 치쿤구니야 바이러스 균주; b) 약 5%(w/v) 농도의 수크로스; c) 약 5mM 내지 약 10mM 농도의 인산칼륨; d) 약 25mM 농도의 시트르산나트륨; e) 약 10mM 농도의 MgCl2; f) 약 0.5%(w/v) 농도의 D-소르비톨, g) 약 10mM 농도의 L-메티오닌; 및 h) 약 0.01%(w/v) 농도의 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는, 제형.
11A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 제형이 유효량의 적어도 하나의 치쿤구니야 바이러스 균주; b) 약 5%(w/v) 수크로스; c) 약 5mM 인산칼륨; d) 약 25mM 시트르산나트륨; e) 약 10mM MgCl2; f) 약 0.5%(w/v) D-소르비톨, g) 약 10mM L-메티오닌; 및 h) 약 0.01%(w/v) 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는, 제형.
12A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 상기 치쿤구니야 바이러스가 서열번호 1의 약독화된 치쿤구니야 바이러스; 서열번호 1에서와 같이 60aa가 결여된 서열번호 1과 99% 서열 동일성을 갖는 변이체; 및/또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 제형.
13A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 상기 치쿤구니야 바이러스가 서열번호 1의 약독화된 치쿤구니야 바이러스 및 서열번호 1과 99% 서열 동일성을 가지고 서열번호 1에서와 같이 60aa가 결여된 변이체를 본질적으로 포함하는, 제형.
14A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 상기 적어도 하나의 치쿤구니야 바이러스 균주가 실질적으로 2개의 변이체를 포함하는 약독화된 치쿤구니야 바이러스 집단으로부터 선택되고, 상기 변이체는 핵산 서열 서열번호 1의 관련된 부분에서 인코딩된 바와 같은 E1 야생형 아미노산 서열을 발현시키고, 하나의 변이체는 서열번호 2에서 규정된 바와 같은 야생형 E2 구조 단백질을 발현시키고, 다른 변이체는 서열번호 3에서 규정된 바와 같은 E2 구조 단백질에서 E168K 돌연변이를 발현시키는, 제형.
15A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 상기 치쿤구니야 바이러스가 실질적으로 2개의 변이체를 포함하는 약독화된 치쿤구니야 바이러스 집단이고, 상기 변이체는 서열번호 2 및 서열번호 3(E168K를 가짐)의 아미노산 서열에서 규정된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키고, 상기 2개의 변이체는 약 103 내지 2×104 TCID50/용량의 조합된 용량 및 약 5×103 TCID50/용량의 표적 효능을 갖는, 동결건조된 치쿤구니야 백신 제형.
16A. 임의의 선행하는 양태에 있어서, 상기 치쿤구니야 바이러스가 하나 이상의 변이체를 포함하는 약독화된 치쿤구니야 바이러스 집단이고, 변이체가 E2에 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 돌연변이는 E168K(서열번호 3), G55R(서열번호 4), E247K(서열번호 5), G82R(서열번호 6) 및/또는 H232Y(서열번호 7)를 갖는 E2 아미노산 서열에 대해 인코딩된 변이체의 그룹에 나타내는, 동결건조된 치쿤구니야 백신 제형.
17A. 치쿤구니야 바이러스 백신 제형을 제조하는 방법으로서,
(a) 치쿤구니야 바이러스를 배양하고, 치쿤구니야 바이러스를 농축된 안정화 용액과 혼합하여 바이러스 벌크를 형성하는 단계; 및 선택적으로,
(b) 바이러스 벌크를 투석하여 치쿤구니야 바이러스 백신 용액을 형성하는 단계를 포함하되, 여기서, 백신 용액은 a) 약 1 내지 50%(w/v) 당; b) 약 1mM 내지 약 20mM 포스페이트; c) 약 1mM 내지 약 50mM의 적어도 하나의 카복실레이트; d) 약 1mM 내지 약 10mM MgCl2; e) 약 0.1% 내지 약 5%(w/v) D-소르비톨; g) 약 1mM 내지 20mM L-메티오닌; 및 f) 약 0.001% 내지 약 0.1%(w/v) 인간 혈청 알부민을 포함하는, 방법.
18A. 양태 17A에 있어서, 안정화 용액이 a) 약 5%(w/v) 당; b) 약 20mM 포스페이트; c) 약 25mM 시트레이트; d) 약 10mM MgCl2; e) 약 0.5%(w/v) D-소르비톨; f) 약 10mM L-메티오닌; 및 g) 약 0.01%(w/v) 인간 혈청 알부민을 포함하는, 방법.
19A. 양태 17A 또는 18A에 있어서, 투석이 양태 1A 내지 16A 중 어느 하나의 제형을 형성하기 위해 수행되는, 방법.
20A. 양태 17A 내지 19A 중 어느 하나에 있어서, 백신 용액을 동결건조시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
1B. i) 약독화된 치쿤구니야 바이러스; 및 ii) 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 단위 투여량 조성물(pharmaceutical unit dosage composition)로서, 상기 약제학적 조성물은 단일 투여량 후 인간에서 치쿤구니야 바이러스에 대한 지속적인 보호 면역 반응을 유도할 수 있으며, 상기 단위 투여량 조성물은 약 103 내지 5×104 TCID50/용량, 바람직하게는, 약 103 내지 2×104 TCID50/용량을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
2B. 양태 1B에 있어서, 상기 약독화된 치쿤구니야 바이러스가 서열번호 1(CHIKV-Δ5nsP3)에서 규정된 DNA 서열에 해당하는 RNA 게놈 및/또는 이의 하나 이상의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 서열번호 1과 적어도 99% 동일하고 서열번호 1에서와 같이 nsP3에서 전체 60개 아미노산 결실을 포함하는 핵산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
3B. 양태 1B 또는 2B에 있어서, 상기 투여량이 약 5×103 TCID50/용량인, 약제학적 조성물.
4B. 양태 2B 또는 3B에 있어서, 상기 약독화된 치쿤구니야 바이러스 변이체가 서열번호 2에서 규정된 야생형 E2 단백질, 특히, 서열번호 3 내지 서열번호 7 중 어느 하나에서 규정된 E2 단백질과 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 E2 단백질을 발현시키는, 약제학적 조성물.
5B. 양태 2B 내지 4B 중 어느 하나에 있어서, 상기 약독화된 치쿤구니야 바이러스 변이체가 서열번호 3에서 규정된 E168K 돌연변이를 갖는 E2 단백질을 발현시키는, 약제학적 조성물.
6B. 치쿤구니야 바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 원-샷 백신(one-shot vaccine)으로서 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 i) 서열번호 2에서 규정된 E2 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3, 서열번호 3에서 규정된 E2 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3, 또는 이들의 혼합물; 및 ii) 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 조성물은 대상체에 약 103 내지 5×104 TCID50/용량, 바람직하게는, 약 103 내지 2×104 TCID50/용량의 용량으로 투여되는, 약제학적 조성물.
7B. 양태 1B 내지 6B 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 액체 냉동된 조성물인, 약제학적 조성물.
8B. 양태 1B 내지 6B 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 동결건조된 조성물인, 약제학적 조성물.
9B. 양태 1B 내지 8B 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 수크로스, 인산칼륨 및 시트르산나트륨 및, 선택적으로, 염화마그네슘, D-소르비톨, L-메티오닌 및 재조합 인간 혈청 알부민 rHSA를 필수적으로 포함하는, 약제학적 조성물.
10B. 양태 1B 내지 9B 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 약 5%(w/v) 수크로스, 약 10mM 인산칼륨, 약 25mM 시트르산나트륨 및 약 0.01%(w/v) 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 필수적으로 포함하는, 약제학적 조성물.
11B. 양태 1B 내지 9B 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 약 5%(w/v) 수크로스; 약 5mM 인산칼륨; 약 25mM 시트르산나트륨; 약 5mM MgCl2; 약 0.5%(w/v) D-소르비톨; 약 10mM L-메티오닌; 및 약 0.01%(w/v) 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 필수적으로 포함하는, 약제학적 조성물.
12B. 양태 1B 내지 11B 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 1차 면역접종(immunization)으로부터 약 14일 내에 대조군에 비해 인간에서 상기 바이러스에 대한 혈청 항체 역가를 적어도 1 log 증가시킬 수 있는, 약제학적 조성물.
13B. 양태 1B 내지 11B 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 1차 면역접종으로부터 약 7일 내에 대조군에 비해 인간에서 상기 바이러스에 대한 혈청 항체 역가를 적어도 1 log 증가시킬 수 있는, 약제학적 조성물.
14B. 양태 1B 내지 13B 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 백신접종 7일 내에 백신접종된 대상체의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 최대 100%에서 혈청전환을 자극할 수 있으며, 혈청전환은 적어도 10, 바람직하게는, 적어도 20의 중화 CHIKV 항체 역가에 도달하는 것으로서 규정되는, 약제학적 조성물.
15B. 양태 1B 내지 13B 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 백신접종 14일 내에 백신접종된 대상체의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 최대 100%에서 혈청전환을 자극할 수 있으며, 혈청전환은 적어도 10, 바람직하게는, 적어도 20의 중화 CHIKV 항체 역가에 도달하는 것으로서 규정되는, 약제학적 조성물.
16B. 양태 1B 내지 15B 중 어느 하나에 있어서, 상기 보호 면역 반응이 적어도 6개월 동안 지속하는, 약제학적 조성물.
17B. 양태 1B 내지 15B 중 어느 하나에 있어서, 상기 보호 면역 반응이 적어도 12개월 동안 지속하는, 약제학적 조성물.
18B. 양태 1B 내지 15B 중 어느 하나에 있어서, 상기 보호 면역 반응이 적어도 24개월 동안 지속하는, 약제학적 조성물.
19B. 양태 1B 내지 15B 중 어느 하나에 있어서, 상기 보호 면역 반응이 CHIK 바이러스 질환에 대한 평생 보호(life-long protection)를 부여하는, 약제학적 조성물.
20B. 양태 1B 내지 19B 중 어느 하나에 있어서, 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
21B. 치쿤구니야 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의, 양태 1B 내지 17B 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
SEQUENCE LISTING
<110> Valneva SE
<120> CHIKUNGUNYA VACCINE FORMULATIONS
<130> PAT041/PCT
<140> PCT/EP2020/072435
<141> 2020-08-10
<150> EP19190999.3
<151> 2019-08-09
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11674
<212> DNA
<213> Chikungunya virus
<400> 1
gatggctgcg tgagacacac gtagcctacc agtttcttac tgctctactc tgcaaagcaa 60
gagattaata acccatcatg gatcctgtgt acgtggacat agacgctgac agcgcctttt 120
tgaaggccct gcaacgtgcg taccccatgt ttgaggtgga accaaggcag gtcacaccga 180
atgaccatgc taatgctaga gcgttctcgc atctagctat aaaactaata gagcaggaaa 240
ttgaccccga ctcaaccatc ctggatatcg gcagtgcgcc agcaaggagg atgatgtcgg 300
acaggaagta ccactgcgtc tgcccgatgc gcagtgcgga agatcccgag agactcgcca 360
attatgcgag aaagctagca tctgccgcag gaaaagtcct ggacagaaac atctctggaa 420
agatcgggga cttacaagca gtaatggccg tgccagacac ggagacgcca acattctgct 480
tacacacaga cgtctcatgt agacagagag cagacgtcgc tatataccaa gacgtctatg 540
ctgtacacgc acccacgtcg ctataccacc aggcgattaa aggggtccga gtggcgtact 600
gggttgggtt cgacacaacc ccgttcatgt acaatgccat ggcgggtgcc tacccctcat 660
actcgacaaa ctgggcagat gagcaggtac tgaaggctaa gaacatagga ttatgttcaa 720
cagacctgac ggaaggtaga cgaggcaagt tgtctattat gagagggaaa aagctaaaac 780
cgtgcgaccg tgtgctgttc tcagtagggt caacgctcta cccggaaagc cgcaagctac 840
ttaagagctg gcacctgcca tcggtgttcc atttaaaggg caaactcagc ttcacatgcc 900
gctgtgatac agtggtttcg tgtgagggct acgtcgttaa gagaataacg atgagcccag 960
gcctttatgg aaaaaccaca gggtatgcgg taacccacca cgcagacgga ttcctgatgt 1020
gcaagactac cgacacggtt gacggcgaaa gaatgtcatt ctcggtgtgc acatacgtgc 1080
cggcgaccat ttgtgatcaa atgaccggca tccttgctac agaagtcacg ccggaggatg 1140
cacagaagct gttggtgggg ctgaaccaga gaatagtggt taacggcaga acgcaacgga 1200
atacgaacac catgaaaaat tatctgcttc ccgtggtcgc ccaagccttc agtaagtggg 1260
caaaggagtg ccggaaagac atggaagatg aaaaactcct gggggtcaga gaaagaacac 1320
tgacctgctg ctgtctatgg gcattcaaga agcagaaaac acacacggtc tacaagaggc 1380
ctgataccca gtcaattcag aaggttcagg ccgagtttga cagctttgtg gtaccgagtc 1440
tgtggtcgtc cgggttgtca atccctttga ggactagaat caaatggttg ttaagcaagg 1500
tgccaaaaac cgacctgatc ccatacagcg gagacgcccg agaagcccgg gacgcagaaa 1560
aagaagcaga ggaagaacga gaagcagaac tgactcgcga agccctacca cctctacagg 1620
cagcacagga agatgttcag gtcgaaatcg acgtggaaca gcttgaggac agagcgggcg 1680
caggaataat agagactccg agaggagcta tcaaagttac tgcccaacca acagaccacg 1740
tcgtgggaga gtacctggta ctctccccgc agaccgtact acgtagccag aagctcagtc 1800
tgattcacgc tttggcggag caagtgaaga cgtgcacgca caacggacga gcagggaggt 1860
atgcggtcga agcgtacgac ggccgagtcc tagtgccctc aggctatgca atctcgcctg 1920
aagacttcca gagtctaagc gaaagcgcaa cgatggtgta taacgaaaga gagttcgtaa 1980
acagaaagct acaccatatt gcgatgcacg gaccagccct gaacaccgac gaagagtcgt 2040
atgagctggt gagggcagag aggacagaac acgagtacgt ctacgacgtg gatcagagaa 2100
gatgctgtaa gaaggaagaa gccgcaggac tggtactggt gggcgacttg actaatccgc 2160
cctaccacga attcgcatat gaagggctaa aaatccgccc tgcctgccca tacaaaattg 2220
cagtcatagg agtcttcgga gtaccgggat ctggcaagtc agctattatc aagaacctag 2280
ttaccaggca ggacctggtg actagcggaa agaaagaaaa ctgccaagaa atcaccaccg 2340
acgtgatgag acagagaggt ctagagatat ctgcacgtac ggttgactcg ctgctcttga 2400
atggatgcaa cagaccagtc gacgtgttgt acgtagacga ggcgtttgcg tgccactctg 2460
gaacgctact tgctttgatc gccttggtga gaccaaggca gaaagttgta ctttgtggtg 2520
acccgaagca gtgcggcttc ttcaatatga tgcagatgaa agtcaactat aatcacaaca 2580
tctgcaccca agtgtaccac aaaagtatct ccaggcggtg tacactgcct gtgaccgcca 2640
ttgtgtcatc gttgcattac gaaggcaaaa tgcgcactac gaatgagtac aacaagccga 2700
ttgtagtgga cactacaggc tcaacaaaac ctgaccctgg agacctcgtg ttaacgtgct 2760
tcagagggtg ggttaaacaa ctgcaaattg actatcgtgg atacgaggtc atgacagcag 2820
ccgcatccca agggttaacc agaaaaggag tttacgcagt tagacaaaaa gttaatgaaa 2880
acccgctcta tgcatcaacg tcagagcacg tcaacgtact cctaacgcgt acggaaggta 2940
aactggtatg gaagacactt tccggcgacc cgtggataaa gacgctgcag aacccaccga 3000
aaggaaactt caaagcaact attaaggagt gggaggtgga gcatgcatca ataatggcgg 3060
gcatctgcag tcaccaaatg accttcgata cattccaaaa taaagccaac gtttgttggg 3120
ctaagagctt ggtccctatc ctcgaaacag cggggataaa actaaatgat aggcagtggt 3180
ctcagataat tcaagccttc aaagaagaca aagcatactc acctgaagta gccctgaatg 3240
aaatatgtac gcgcatgtat ggggtggatc tagacagcgg gctattttct aaaccgttgg 3300
tgtctgtgta ttacgcggat aaccactggg ataataggcc tggagggaaa atgttcggat 3360
ttaaccccga ggcagcatcc attctagaaa gaaagtatcc attcacaaaa gggaagtgga 3420
acatcaacaa gcagatctgc gtgactacca ggaggataga agactttaac cctaccacca 3480
acatcatacc ggccaacagg agactaccac actcattagt ggccgaacac cgcccagtaa 3540
aaggggaaag aatggaatgg ctggttaaca agataaacgg ccaccacgtg ctcctggtca 3600
gtggctataa ccttgcactg cctactaaga gagtcacttg ggtagcgccg ttaggtgtcc 3660
gcggagcgga ctacacatac aacctagagt tgggtctgcc agcaacgctt ggtaggtatg 3720
acctagtggt cataaacatc cacacacctt ttcgcataca ccattaccaa cagtgcgtcg 3780
accacgcaat gaaactgcaa atgctcgggg gtgactcatt gagactgctc aaaccgggcg 3840
gctctctatt gatcagagca tatggttacg cagatagaac cagtgaacga gtcatctgcg 3900
tattgggacg caagtttaga tcgtctagag cgttgaaacc accatgtgtc accagcaaca 3960
ctgagatgtt tttcctattc agcaactttg acaatggcag aaggaatttc acaactcatg 4020
tcatgaacaa tcaactgaat gcagccttcg taggacaggt cacccgagca ggatgtgcac 4080
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<211> 423
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<220>
<223> mutation arising from Vero passaging
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Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp
50 55 60
Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala Glu Arg
65 70 75 80
Ala Arg Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr
85 90 95
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100 105 110
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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Claims (22)
- 액체 냉동된 또는 동결건조된 생치쿤구니야 백신 제형(live chikungunya vaccine formulation)으로서, a) 유효량의 생치쿤구니야 바이러스 중 적어도 하나의 균주; b) 약 1 내지 50%(w/v) 당; c) 약 1mM 내지 약 20mM 포스페이트; d) 약 1mM 내지 약 50mM의 적어도 하나의 카복실레이트 완충제; e) 선택적으로, 약 1mM 내지 약 10mM MgCl2; f) 선택적으로, 약 0.1% 내지 약 5%(w/v) D-소르비톨; g) 선택적으로, 약 1mM 내지 20mM L-메티오닌; 및 h) 선택적으로, 약 0.001% 내지 약 0.1%(w/v) 인간 혈청 알부민을 포함하는, 액체 냉동된 또는 동결건조된 생치쿤구니야 백신 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 인간 혈청 알부민이 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)인, 제형.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 카복실레이트 완충제가 숙시네이트, 시트레이트, 푸마레이트, 타르타레이트, 말레에이트 및 락테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제형.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당이 수크로스, 만니톨, 락토스, 소르비톨, 덱스트로스, 푸코스 및 트레할로스, 바람직하게는, 수크로스 또는 트레할로스, 가장 바람직하게는, 수크로스로 구성되는 군으로부터 선택되는, 제형.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당의 농도가 약 1 내지 약 10%이고; 상기 포스페이트의 농도가 약 1 내지 약 10mM이고; 상기 적어도 하나의 카복실산이 약 10 내지 약 30mM 농도의 시트레이트 또는 숙시네이트인, 제형.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, k) 소정 부피까지의 조직 배양 배지, 염수 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 희석제를 더 포함하는, 제형.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0, 바람직하게는, pH 7.0 내지 pH 7.5, 가장 바람직하게는, pH 7.3인, 제형.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스페이트가 모노포스페이트, 폴리포스페이트 및 포스포릴화된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제형.
- 제8항에 있어서, 상기 모노포스페이트가 인산칼륨인, 제형.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 유효량의 적어도 하나의 치쿤구니야 바이러스 균주; b) 약 5%(w/v) 농도의 수크로스; c) 약 5mM 내지 약 10mM 농도의 인산칼륨; d) 약 25mM 농도의 시트르산나트륨; e) 약 10mM 농도의 MgCl2; f) 약 0.5%(w/v) 농도의 D-소르비톨, g) 약 10mM 농도의 L-메티오닌; 및 h) 약 0.01%(w/v) 농도의 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는, 제형.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 유효량의 적어도 하나의 치쿤구니야 바이러스 균주; b) 약 5%(w/v) 수크로스; c) 약 5mM 인산칼륨; d) 약 25mM 시트르산나트륨; e) 약 10mM MgCl2; f) 약 0.5%(w/v) D-소르비톨, g) 약 10mM L-메티오닌; 및 h) 약 0.01%(w/v) 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는, 제형.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치쿤구니야 바이러스가 서열번호 1의 약독화된 치쿤구니야 바이러스; 서열번호 1에서와 같이 60aa가 결여된 서열번호 1과 99% 서열 동일성을 갖는 변이체; 및/또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 제형.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치쿤구니야 바이러스가 서열번호 1의 약독화된 치쿤구니야 바이러스 및 서열번호 1과 99% 서열 동일성을 가지고 또한 서열번호 1에서와 같이 nsP3 단백질에 60aa가 결여된 변이체를 본질적으로 포함하는, 제형.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치쿤구니야 바이러스 균주가 실질적으로 2개의 변이체를 포함하는 약독화된 치쿤구니야 바이러스 집단으로부터 선택되고, 상기 2개의 변이체 둘 다는 핵산 서열 서열번호 1의 관련된 부분에서 인코딩된 바와 같은 E1 야생형 아미노산 서열을 발현시키고, 하나의 변이체는 서열번호 2에서 규정된 바와 같은 야생형 E2 구조 단백질을 발현시키고, 다른 변이체는 서열번호 3에서 규정된 바와 같은 E2 구조 단백질에서 E168K 돌연변이를 발현시키는, 제형.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치쿤구니야 바이러스가 실질적으로 2개의 변이체를 포함하는 약독화된 치쿤구니야 바이러스 집단이고, 상기 2개의 변이체는 각각 서열번호 2 및 서열번호 3(E168K를 가짐)의 아미노산 서열에서 규정된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키고, 상기 2개의 변이체는 약 103 내지 2×104 TCID50/용량의 조합된 용량 및 약 5×103 TCID50/용량의 표적 효능을 갖는, 동결건조된 치쿤구니야 백신 제형.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치쿤구니야 바이러스가 하나 이상의 변이체를 포함하는 약독화된 치쿤구니야 바이러스 집단이고, 상기 변이체는 E2에서 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 돌연변이는 E168K(서열번호 3), G55R(서열번호 4), E247K(서열번호 5), G82R(서열번호 6) 및/또는 H232Y(서열번호 7)를 갖는 E2 아미노산 서열에 대해 인코딩된 변이체의 그룹에 나타내는, 동결건조된 치쿤구니야 백신 제형.
- 치쿤구니야 바이러스 백신 제형을 제조하는 방법으로서,
(a) 치쿤구니야 바이러스를 배양하고, 상기 치쿤구니야 바이러스를 농축된 안정화 용액과 혼합하여 바이러스 벌크를 형성하는 단계; 및, 선택적으로,
(b) 상기 바이러스 벌크를 투석하여 치쿤구니야 바이러스 백신 용액을 형성하는 단계를 포함하되, 여기서, 상기 백신 용액은 a) 약 1 내지 50%(w/v) 당; b) 약 1mM 내지 약 20mM 포스페이트; c) 약 1mM 내지 약 50mM의 적어도 하나의 카복실레이트; d) 약 1mM 내지 약 10mM MgCl2; e) 약 0.1% 내지 약 5%(w/v) D-소르비톨; g) 약 1mM 내지 20mM L-메티오닌; 및 f) 약 0.001% 내지 약 0.1%(w/v) 인간 혈청 알부민을 포함하는, 방법. - 제17항에 있어서, 상기 안정화 용액이 a) 약 5%(w/v) 당; b) 약 20mM 포스페이트; c) 약 25mM 시트레이트; d) 약 10mM MgCl2; e) 약 0.5%(w/v) D-소르비톨; f) 약 10mM L-메티오닌; 및 g) 약 0.01%(w/v) 인간 혈청 알부민을 포함하는, 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 투석 단계가 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 제형을 형성하는, 방법.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신 용액을 동결건조시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 인간 대상체에서 치쿤구니야 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 자극하기 위해 인간 대상체를 백신접종(vaccinating)하는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 백신 제형.
- 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 치쿤구니야 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 의해 규정된 백신 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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