KR20220042131A - 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-lrrc25 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도 - Google Patents

골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-lrrc25 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220042131A
KR20220042131A KR1020227003081A KR20227003081A KR20220042131A KR 20220042131 A KR20220042131 A KR 20220042131A KR 1020227003081 A KR1020227003081 A KR 1020227003081A KR 20227003081 A KR20227003081 A KR 20227003081A KR 20220042131 A KR20220042131 A KR 20220042131A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
macrophages
agent
cell
myeloid cells
Prior art date
Application number
KR1020227003081A
Other languages
English (en)
Inventor
타티아나 아이. 노보브란트세바
이고르 펠드만
스티븐 엘. 사진스키
조셉 에이. 웨일
브라이언 오누알랭
Original Assignee
베르조 테라퓨틱스, 아이엔씨.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베르조 테라퓨틱스, 아이엔씨. filed Critical 베르조 테라퓨틱스, 아이엔씨.
Publication of KR20220042131A publication Critical patent/KR20220042131A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

본 발명은 부분적으로 분극화, 활성화 및/또는 기능을 포함하여 골수성 세포의 염증성 표현형, 예컨대, 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 조절하는 항-LRRC25 조성물(예를 들어, 단일클론 항체 및 이의 항원-결합 단편)의 발견 및 치료, 진단, 예후예측 및 스크리닝 목적을 위해 이러한 항-LRRC25 조성물을 사용하는 방법에 기초한다.

Description

골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-LRRC25 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2019년 6월 27일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/867,593호의 우선권을 주장하며; 상기 기초출원의 전체 내용은 참조에 의해 그 전문이 본 명세서에 원용된다.
단핵구와 대식세포는 불리한 이물질, 박테리아 및 죽은 또는 죽어가는 세포를 섭취함으로써 신체를 보호하는 세포인 포식세포의 한 유형이다. 단핵구 및 대식세포 외에도, 포식세포는 호중구, 수지상 세포 및 비만 세포를 포함한다.
대식세포는 전형적으로 식균 작용으로 알려진 과정을 통해 신체를 순찰하고, 세포 찌꺼기 및 이물질, 예컨대, 병원균, 미생물 및 암세포를 삼켜 소화시키는 대형의 백혈구 세포로 알려져 있다. 또한, 조직 대식세포 및 순환하는 단핵구-유래 대식세포를 포함하는 대식세포는 선천성 및 후천성 면역 체계 둘 다의 중요한 매개체이다.
대식세포 표현형은 전형적 또는 대안적 경로(예를 들어, 문헌[Classen et al. (2009) Methods Mol. Biol. 531:29-43] 참조)를 통한 활성화에 의존한다. 전형적으로 활성화된 대식세포는 인터페론 감마(interferon gamma: IFNγ) 또는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide: LPS)에 의해 활성화되며, M1 표현형을 나타낸다. 이러한 전-염증성 표현형은 면역 체계의 증가된 염증 및 자극과 관련이 있다. 대안적으로 활성화된 대식세포는 IL-4, IL-10 및 IL-13과 같은 사이토카인에 의해 활성화되며, M2 표현형을 나타낸다. 이러한 항-염증성 표현형은 면역 반응의 감소, 상처 치유의 증가, 조직 복구의 증가 및 배아의 발달과 관련이 있다.
비-병리적 조건하에서, 면역-자극성 대식세포 및 면역-조절성 대식세포의 균형 잡힌 집단이 면역 체계에 존재한다. 균형의 섭동(perturbation)은 다양한 질환 병태를 초래할 수 있다. 일부 암에서, 예를 들어, 종양은 상처-치유 경로를 활성화하고, 새로운 혈관의 성장(즉, 혈관신생)을 촉진하며, 종양에 영양분과 성장 신호를 제공하는 항-염증성의, 전-종양성 M2 표현형에 유리하게 대식세포 집단을 분극화하는(polarize) 면역 인자(예를 들어, 사이토카인 및 인터류킨)를 분비한다. 이러한 M2 대식세포는 종양 관련 대식세포(tumor associated macrophage: TAM) 또는 종양 침윤 대식세포(tumor infiltrating macrophage)로 칭해진다. 종양 미세환경에서 TAM은 암 진행 및 전이의 중요한 조절인자(regulator)이다(문헌[Pollard (2004) Nat. Rev. Cancer 4:71-78]). 대식세포 유전자 표적(예를 들어, CSF1R 및 CCR2)을 저해하도록 설계된 소분자 및 단일클론 항체는, 예컨대, 전-종양성 대식세포(예를 들어, TAM) 및 종양 형성을 저해할 수 있는 전-염증성 대식세포의 균형을 조절함으로써 대식세포 표현형의 조절인자로서 조사되었다.
대식세포 집단의 균형을 조절하기 위해 단핵구 및 대식세포의 동원, 분극화, 활성화 및/또는 기능을 조절하는 요법은 대식세포 면역요법으로 지칭된다. 그러나, 대식세포 생물학 분야의 발전에도 불구하고, 대식세포 면역요법에 사용하기 위한 대식세포 및 작용제의 염증성 표현형을 조절하기 위한 새로운 표적(예를 들어, 유전자 및/또는 유전자 산물)이 여전히 필요하다.
본 발명은 적어도 부분적으로 골수 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-LRRC25 조성물 및 방법과 치료, 진단, 예후예측 및 스크리닝 목적과 같은 이의 용도의 발견에 기초한다. 예를 들어, LRRC25 발현이 M2 대식세포에서 활성화시 증가되고, 그 항원-결합 단편을 포함하는 항-LRRC25 항체가 골수 염증성 표현형을 증가시킬 수 있음이 본 명세서에서 결정되었다.
예를 들어, 일 양태에서, LRRC25 폴리펩타이드를 발현하는 골수성 세포에 결합하고 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시키는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: a) 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉 후 다음 중 하나 이상을 초래하여 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시킴: i) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비; ii) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, LRRC25, TGFb 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비; iii) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18, GM-CSF, CCL3, CCL4, 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 분비; iv) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비; v) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; vi) CD8+ 세포독성 T 세포 활성화의 증가된 동원; vii) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; viii) CD4+ 헬퍼 T 세포 활성의 증가된 동원; ix) 증가된 NK 세포 활성; x) NK 세포의 증가된 동원; xi) 증가된 호중구 활성; xii) 증가된 대식세포 및/또는 수지상 세포 활성; 및/또는 xiii) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수; b) 다른 LRR 패밀리 구성원과 비교하여 LRRC25에 특이적으로 결합함; c) 인간 LRR 폴리펩타이드에 하나 이상의 다른 LRR 패밀리 구성원보다 적어도 1.1-배 이상 선택적으로 결합하되, 하나 이상의 LRR 패밀리 구성원은 세포 상에서 또는 시험관내에서 발현됨; d) 선택적으로 ELISA 또는 생물층 간섭계 검정(biolayer interferometry assay)에서 측정되는 바와 같이 약 0.00001 나노몰(nM) 내지 1000nM의 kD로 인간 LRRC25 폴리펩타이드에 결합함; e) 인간 LRRC25 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합함; f) 표 7에 열거된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩타이드에 결합함; g) LRRC25 리간드와 LRRC25의 결합과 경쟁, 이를 저해 또는 차단함; h) 사이노몰구스 LRRC25 폴리펩타이드와의 교차-반응; i) 표 2에 열거된 LRRC25 폴리펩타이드 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁함; j) 본 명세서에 기재된 ATCC에 기탁된 단일클론 항체로서 얻을 수 있음; k) 자극되지 않은 단핵구를 활성화하지 않음; l) LRRC25-발현 세포에 대한 ADCC 활성을 갖지 않음; m) LRRC25-발현 세포에 대한 CDC 활성을 갖지 않음; n) LRRC25-발현 세포에 결합시 및/또는 LRRC25-발현 세포에 의한 내재화시 LRRC25-발현 세포를 죽이지 않음; o) 또 다른 치료적 모이어티에 접합되지 않되, 선택적으로 또 다른 치료적 모이어티는 세포독성제임; 그리고/또는 p) 생체내 항종양 활성을 가짐. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) 표 2에 열거된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 중쇄 CDR 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) 표 2에 열거된 중쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 중쇄 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 경쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 경쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) 표 2에 열거된 중쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 경쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) 표 2에 열거된 중쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 경쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라, 인간화된 것, 뮤린 또는 인간 유래이다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출 가능하게 표지되며, 효과기 도메인을 포함하고/하거나 Fc 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, Fde, sdFv, 단일 도메인 항체(dAb) 및 다이어바디 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린으로부터 유래되는 불변 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 작용제에 접합되되, 선택적으로 작용제는 결합 단백질, 효소, 약물, 화학치료제, 생물학적 작용제, 독소, 방사성 핵종, 면역조절제, 검출 가능한 모이어티 및 태그로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제가 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 희석제, 가용화제, 유화제, 보존제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 20 EU 내독소/㎎ 단백질 미만을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1 EU 내독소/㎎ 미만의 단백질을 갖는다.
또 다른 양태에서, i) 엄격한 조건하에, 본 발명에 포함되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 보체와 혼성화하고; ii) 본 발명에 포함되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대해 전장에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖거나; 또는 iii) 표 2에 열거된 폴리펩타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 포함되는 핵산에 의해 암호화되는 단리된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 포함되는 단리된 핵산을 포함하는 벡터이되, 선택적으로 벡터는 발현 벡터인 벡터가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 포함되는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 본 발명에 포함되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하고; b) 본 발명에 포함되는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하며; c) 본 발명에 포함되는 벡터를 포함하고; 그리고/또는 d) 본 명세서에 기재된 ATCC 기탁 등록 번호로 기탁된 단일클론 항체로서 접근 가능한 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 장치 또는 키트로서, 상기 장치 또는 키트는 선택적으로 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검출하기 위한 표지를 포함하거나 또는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 복합체인 장치 또는 키트가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 포함되는 약제학적 조성물, 단리된 핵산 분자, 단리된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 장치 또는 키트가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서, 방법은 (i) 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 형질전환된, 형질전환된 숙주 세포를 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하기에 적합한 조건하에서 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 샘플을 수득하는 단계 및 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 샘플에서 상기 폴리펩타이드를 검출하는 단계를 포함하는 LRRC25 폴리펩타이드의 존재 또는 수준을 검출하는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, LRRC25 폴리펩타이드와 복합체를 형성하며, 복합체는 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사성 면역 검정(RIA), 면역화학 검정, 웨스턴 블롯, 질량 분석 검정, 핵자기 공명 검정의 형태로 또는 세포내 유동세포 검정을 사용하여 검출되는, 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 포함되는 작용제와 접촉한 후 증가된 염증성 표현형을 갖는 골수성 세포를 생성하는 방법으로서, 골수성 세포를 유효량의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하되, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 증가된 염증성 표현형을 갖는 골수성 세포를 생성하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 증가된 염증성 표현형을 갖는 골수성 세포는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉한 후 다음 중 하나 이상을 나타낸다: a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비; b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, LRRC25, TGFb 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18, GM-CSF, CCL3, CCL4 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 분비; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비; e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) CD8+ 세포독성 T 세포 활성화의 증가된 동원; g) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; h) CD4+ 헬퍼 T 세포 활성의 증가된 동원; i) 증가된 NK 세포 활성; j) NK 세포의 증가된 동원; k) 증가된 호중구 활성; l) 증가된 대식세포 및/또는 수지상 세포 활성; 및/또는 m) 현미경에 의해 평가된 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수. 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시킨 골수성 세포는 세포의 집단에 포함되며, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시키고/시키거나 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시킨 골수성 세포는 세포의 집단에 포함되며, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포의 집단에서 하기 i) 내지 ii)의 비를 증가시킨다: i) 제1형 및/또는 M1 대식세포 및 ii) 제2형 및/또는 M2 대식세포. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 1형 대식세포, M1 대식세포, 2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 시험관내 또는 생체외에서 접촉된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 일차 골수성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 작용제와 접촉하기 전에 정제 및/또는 배양된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 생체내(예를 들어, 작용제의 전신, 종양 부근 또는 종양내 투여에 의해)에서 접촉된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 조직 미세환경에서 접촉된다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 골수성 세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 면역치료제는 면역 관문 저해제, 면역-자극 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 포함되는 방법에 따라 생성되는 골수를 포함하는 조성물로서, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 골수성 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 하는, 본 발명에 포함되는 작용제와 접촉시킨 후 대상체에서 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시키는 방법으로서, 유효량의 작용제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시키는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 증가된 염증성 표현형을 갖는 골수성 세포는 작용제와 접촉한 후 다음 중 하나 이상을 나타낸다: a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비; b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, LRRC25 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 증가된 분비 ; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비; e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; g) 증가된 NK 세포 활성; h) 증가된 호중구 활성; i) 증가된 대식세포 및/또는 수지상 세포 활성; 및/또는 j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수. 다른 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시키고, 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시키고/시키거나 다음 i) 내지 ii)의 비를 증가시키되, 대상체에서 i)은 제1형 및/또는 M1 대식세포이고 ii)는 제2형 및/또는 M2 대식세포이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 세포독성 CD8+ T 세포의 수 및/또는 활성은 작용제의 투여 후에 증가된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 1형 대식세포, M1 대식세포, 2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 작용제는 작용제의 전신, 종양 부근 또는 종양내 투여에 의해 생체내에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 작용제는 조직 미세환경에서 골수성 세포와 접촉한다. 다른 실시형태에서, 방법은 골수성 세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 면역치료제는 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함한다.
다른 양태에서, 대상체에서 염증을 증가시키는 방법으로서, 본 발명에 포함되는 작용제와 접촉시킨 유효량의 골수성 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 대상체에서 염증을 증가시키는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 골수성 세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 대상체의 골수성 세포에 대하여 유전자 조작된 것, 자가유래(autologous), 동계(syngeneic) 또는 동종이계(allogeneic)이다. 또 다른 실시형태에서, 작용제는 전신으로, 종양 부근으로 또는 종양 내부로 투여된다.
또 다른 양태에서, 세포독성 CD8+ T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 대상체에서 암세포를 감작시키는(sensitizing) 방법으로서, 치료적 유효량의 본 발명에 포함되는 작용제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암세포를 감작시키는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 세포독성 CD8+ T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암을 앓고 있는 대상체에서 암세포를 감작시키는 방법으로서, 본 발명에 포함되는 작용제와 접촉시킨 치료적 유효량의 골수성 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체에서 암세포를 감작시키는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 수지상 세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 대상체의 골수성 세포에 대하여 유전자 조작된 것, 자가유래, 동계 또는 동종이계이다. 또 다른 실시형태에서, 작용제는 전신으로, 종양 근처로 또는 종양 내부로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 적어도 하나의 면역요법을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 면역요법은 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 면역관문 저해제는 PD-1, PD-L1, PD-L2 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 면역관문은 PD-1이다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 암을 치료하기 위한 추가적인 치료제 또는 양생법(regimen)을 대상체에 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 단계를 더 포함하되, 선택적으로, 추가적인 치료제 또는 양생법은 키메라 항원 수용체, 화학요법, 방사선, 표적화 요법 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 작용제는 암에서 증식하는 세포의 수를 감소시키고/시키거나 암세포를 포함하는 종양의 부피 또는 크기를 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 작용제는 암세포를 포함하는 종양을 침윤하는 CD8+ T 세포의 양 및/또는 활성을 증가시킨다. 또 다른 실시형태에서, 작용제는 a) 암세포를 포함하는 종양을 침윤하는 M1 대식세포의 양 및/또는 활성을 증가시키고/시키거나, b) 침윤 암세포를 포함하는 종양을 침윤하는 M2 대식세포의 양 및/또는 활성을 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 암을 치료하기 위한 적어도 하나의 추가적인 요법 또는 양생법을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 요법은 작용제 이전에, 이와 동시에 또는 이후에 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 이의 염증성 표현형을 증가시킬 수 있는 골수성 세포를 확인하는 방법으로서, a) 작용제를 사용하여 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계로서, 작용제는 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; b) 작용제를 사용하여 대조군에서 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되; 적어도 하나의 표적의 대조군의 양 및/또는 활성에 비해 골수성 세포에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는 골수성 세포가 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 이의 염증성 표현형을 증가시킬 수 있음을 나타내며, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 염증성 표현형을 증가시킬 수 있는 골수성 세포를 확인하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 방법은 세포를 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 작용제와 접촉시키고, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 방법은 대상체가 적어도 하나의 표적(예를 들어, 면역요법)을 조절함으로써 염증성 표현형을 증가시키는 것으로부터 혜택을 받지 않는 것으로 결정되는 경우, 세포를 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 작용제 이외의 암 요법과 접촉시키고, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 세포를 면역 반응을 증가시키는 적어도 하나의 추가적인 작용제와 접촉시키고/시키거나 이를 투여하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 추가적인 작용제는 표적화 요법, 화학요법, 방사선 요법 및/또는 호르몬 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 대조군은 대상체가 속한 동일한 종의 구성원으로부터 유래된다. 또 다른 실시형태에서, 대조군은 세포를 포함하는 샘플이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 다른 실시형태에서, 대조군은 대상체로부터의 암 샘플이다. 또 다른 실시형태에서, 대조군은 대상체로부터의 비-암성 샘플이다.
또 다른 양태에서, 암을 앓고 있는 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법으로서, a) 작용제를 사용하여 대상체로부터의 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계로서, 작용제는 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; b) 작용제를 사용하여 나쁜 임상 결과를 갖는 대조군으로부터 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 샘플 및 대조군 대상체로부터의 샘플에서 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되; 대조군에서의 양 및/또는 활성과 비교하여 대상체의 골수성 세포로부터의 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는 대상체가 나쁜 임상 결과를 나타내지 않음을 나타내며, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 암에 걸린 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 대상체에서 골수성 세포의 염증성 표현형을 모니터링하는 방법으로서, 방법은 a) 작용제를 사용하여 첫 번째 시점에서 첫 번째 대상체 샘플에서 대상체의 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 검출하는 단계, 작용제는 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 검출하는 단계; b) 이후의 시점에서 수득된 골수성 세포를 포함하는 후속 샘플을 사용하여 a) 단계를 반복하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되, 첫 번째 샘플의 골수성 세포로부터의 양 및/또는 활성과 비교하여 후속 샘플의 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소는, 대상체의 골수성 세포가 염증성 표현형을 상향조절함을 나타내거나; 또는 첫 번째 샘플의 골수성 세포로부터의 양 및/또는 활성과 비교하여 후속 샘플의 골수성 세포로부터의 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는, 대상체의 골수성 세포가 염증성 표현형을 하향조절함을 나타내며, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 대상체에서 골수성 세포의 염증성 표현형을 모니터링하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 시험관내에서 배양된 골수성 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 시험관내에서 배양되지 않은 골수성 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 대상체로부터 수득된 단일 샘플 또는 혼주된(pooled) 샘플의 일부이다. 또 다른 실시형태에서, 샘플은 대상체로부터 수득된 혈액, 혈청, 종양 부근 조직 및/또는 종양내 조직을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시키는 테스트 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서, a) 첫 번째 시점에서 골수성 세포를 포함하는 대상체 샘플에서 i) 작용제를 사용하여 골수성 세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 또는 활성(여기서, 작용제는 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편임) 및/또는 ii) 골수성 세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계; b) 골수성 세포가 테스트 작용제와 접촉된 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii)의 값을 비교하는 단계를 포함하되, 첫 번째 시점에서 샘플의 양 및/또는 활성과 비교하여 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 후속 샘플에서 ii)의 증가는, 테스트 작용제가 대상체에서 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시킴을 나타내고, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 염증성 표현형을 증가시키는 작용제의 효능을 평가하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 작용제와 접촉시킨 골수성 세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제는 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 작용제와 접촉시킨 골수성 세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제는 세포의 집단에서 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 시험관내 또는 생체외에서 접촉된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 일차 골수성 세포이다. 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 작용제와 접촉하기 전에 정제 및/또는 배양된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 생체내에서 접촉된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 작용제의 전신, 종양 부근 또는 종양내 투여에 의해 생체내에서 접촉된다. 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 조직 미세환경에서 접촉된다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 골수성 세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 면역치료제는 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 포유동물(예를 들어, 비인간 동물 모델 또는 인간)이다.
또 다른 실시형태에서, 대상체에서 암을 치료하기 위한 테스트 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서, a) 첫 번째 시점에서 골수성 세포를 포함하는 대상체 샘플에서 i) 작용제를 사용하여 골수성 세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성(여기서, 작용제는 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편임) 및/또는 ii) 골수성 세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계; b) 작용제의 투여 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii)의 값을 비교하는 단계를 포함하되, 첫 번째 시점에서 대상체 샘플의 골수성 세포에서 또는 그 위에서의 양 및/또는 활성과 비교하여 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 후속 시점에서 대상체 샘플의 골수성 세포에서 또는 그 위에서 ii)의 증가는, 테스트 작용제가 대상체에서 암을 치료함을 나타내며, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하기 위한 테스트 작용제의 효능을 평가하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 첫 번째 시점과 후속 시점 사이에서 치료를 받았거나, 치료를 완료하였고/하였거나 암에 대한 관해에 있다. 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 생체외 및 생체내 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 암의 비인간 동물 모델로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 대상체로부터 수득된 단일 샘플 또는 혼주된 샘플의 일부이다. 다른 실시형태에서, 샘플은 대상체로부터 수득된 세포, 혈청, 종양 부근 조직 및/또는 종양내 조직을 포함한다.
또 다른 양태에서, 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암세포를 감작시키는 테스트 작용제를 스크리닝하는 방법으로서, a) 테스트 작용제와 접촉시킨 골수성 세포의 존재하에서 암세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역 관문 요법과 접촉시키는 단계로서, 테스트 작용제는 작용제를 사용하여 결정된 골수성 세포 작용제에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 조절하며, 작용제는 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 상기 암세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역 관문 요법과 접촉시키는 단계; b) 테스트 작용제와 접촉시키지 않은 대조군 골수성 세포의 존재하에서 암세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; 및 c) b)와 비교하여 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법의 효능을 증가시키는 테스트 작용제를 확인함으로써 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암세포를 감작시키는 작용제를 확인하는 단계를 포함하되, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포인, 암세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 접촉 단계는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 발생한다. 다른 실시형태에서, 방법은 i) 암에서 증식하는 세포의 수의 감소 및/또는 ii) 암세포를 포함하는 종양의 부피 또는 크기의 감소를 결정하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 i) CD8+ T 세포 수의 증가 및/또는 ii) 암세포를 포함하는 종양을 침윤하는 제1형 및/또는 M1 대식세포 수의 증가를 결정하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 임상적 이득률, 사망할 때까지의 생존기간, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반-정량적 측정값, 임상적 완전 관해, 임상적 부분 관해, 임상적 안정 질환, 무재발 생존기간, 무전이 생존기간, 무질환 생존기간, 순환 종양 세포 감소, 순환하는 마커 반응 및 RECIST 기준으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기준에 의해 측정된 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 테스트 작용제에 대한 반응을 결정하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 방법은 암세포를 적어도 하나의 추가적인 암 치료제 또는 양생법과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 조절된 염증성 표현형을 갖는 골수성 세포는 다음 중 하나 이상을 나타낸다: a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 조절된 발현; b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, LRRC25 및/또는 IL-10의 조절된 발현; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 조절된 분비; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 조절된 비; e) 조절된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) 조절된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; g) 조절된 NK 세포 활성; h) 조절된 호중구 활성; i) 조절된 대식세포 및/또는 수지상 세포 활성; 및/또는 j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 조절된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수. 다른 실시형태에서, 세포 및/또는 골수성 세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 세포 및/또는 골수성 세포는 LRRC25을 발현하거나 또는 발현하는 것으로 결정된다. 또 다른 실시형태에서, 인간 LRRC25 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고/갖거나 사이노몰구스 LRRC25 폴리펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 암은 대식세포가 침윤된 고형 종양이되, 침윤성 대식세포는 종양 또는 종양 미세환경에서 질량, 부피 및/또는 세포 수의 적어도 약 5%를 나타내고/내거나 암은 중피종, 신장 투명세포형 신세포 암종, 교모세포종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종, 췌장 선암종, 유방 침습 암종, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 방광 요로상피성 암종, 뇌 저등급 신경교종, 유방 침습 암종, 자궁경부 편평세포 암종 및 자궁경내 선암종, 담관암종, 결장 선암종, 식도 암종, 다발성 교모세포종, 두경부 편평세포 암종, 혐색소 신세포암, 신장 투명세포형 신세포 암종, 신장 신유두세포 암종, 간세포 암종, 간 선암종, 간 편평세포 암종, 림프구성 세포종양 미만성 거대 B-세포 림프종, 중피종, 난소 장액성 종양, 낭샘암종, 췌장 선암종, 크롬 친화성 세포종, 부신경절종, 전립선 선암종, 직장 선암종, 육종, 피부 흑색종, 위 선암, 고환 생식세포 종양, 흉선종, 갑상선암종, 자궁 암육종, 자궁체부 내막 암종 및 포도막 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 골수성 세포는 TAM 및/또는 M2 대식세포이다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 LRRC25을 발현하거나 또는 발현하는 것으로 결정된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 일차 골수성 세포이다. 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 조직 미세환경 내에 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 골수성 세포는 인간 종양 모델 또는 암의 동물 모델에 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 다른 실시형태에서, 포유동물은 인간(예를 들어, 암을 앓고 있는 인간)이다.
도 1은 상단에서 LRRC25 발현이 가장 높은 LRRC25에 기반한 인간 암(TCGA, 암 게놈 지도(The Cancer Genome Atlas), 2017 버전, 오믹소프트(OmicSoft)/퀴아젠(Qiagen)에 의해 가공 및 배포됨)의 대규모 공개 데이터세트의 암 유형에 걸친 대식세포-침윤 종양의 순위 분포를 보여준다.
도 2는 대식세포 기능 검정에서 항-LRRC25 항체를 검증한 결과를 보여준다. 항-LRRC25 항체는 M2 마커의 감소 및 M1 전-염증성 사이토카인의 증가를 포함하여 일차 인간 대식세포에서 LRRC25을 저해한 후 M2-스큐잉(skewing) 조건하에서 대식세포 염증성 표현형을 조절하는 것으로 입증되었다.
도 3은 포도상구균 장독소 B(Staphylococcal enterotoxin B: SEB) 검정 실험의 결과를 보여준다.
도 4는 항-LRRC25 항체의 결합 특성화의 결과를 보여준다.
막대 히스토그램, 곡선 또는 범례와 관련된 기타 데이터를 나타내는 도면의 경우, 각 표시에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로 표시되는 막대, 곡선 또는 기타 데이터는 범례의 위에서 아래로의 상자 순서대로 직접 해당된다.
본 발명은 적어도 부분적으로 분극화, 활성화 및/또는 작용화를 포함하여 골수 염증성 표현형을 조절하는 항-LRRC25 조성물(예를 들어, 단일클론 항체)의 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 항-LRRC25 조성물뿐만 아니라 치료, 진단, 예후예측 및 스크리닝을 위한 골수 염증성 표현형의 조절을 제한 없이 포함하는 이의 방법 및 용도를 제공한다.
I. 정의
일부 실시형태에서 용어 "약"은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이내를 포함하는 값 또는 측정된 값 사이의 임의의 범위(예를 들어, 플러스 또는 마이너스 2% 내지 6%)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 방법, 검정 또는 측정된 값에서 오류의 내재적 변동, 예컨대, 실험간에 존재하는 변동을 지칭한다.
용어 "활성화 수용체"는 항원, 복합체화된 항원(예를 들어, 주 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 폴리펩타이드의 맥락에서)에 결합하거나 또는 항체에 결합하는 면역 세포 수용체를 포함한다. 이러한 활성화 수용체는 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR), B 세포 수용체(B cell receptor: BCR), 사이토카인 수용체, LPS 수용체, 보체 수용체, Fc 수용체 및 다른 ITAM 함유 수용체를 포함한다. 예를 들어, T 세포 수용체는 T 세포 상에 존재하며, CD3 폴리펩타이드와 연관이 있다. T 세포 수용체는 MHC 폴리펩타이드의 맥락에서 항원에 의해(또한 다중클론 T 세포 활성화 시약에 의해) 자극된다. TCR을 통한 T 세포 활성화는 수많은 변화, 예를 들어, 단백질 인산화, 막 지질 변화, 이온 플럭스, 고리형 뉴클레오타이드 변화, RNA 전사 변화, 단백질 합성 변화 및 세포 부피 변화를 초래한다. 사이토카인 수용체 또는 패턴 관련 분자 패턴(pattern associated molecular pattern: PAMP) 수용체와 같은 활성화 수용체를 통한 대식세포의 T 세포 활성화와 유사하게, 단백질 인산화, 표면 수용체 표현형에 대한 변화, 단백질 합성 및 방출뿐만 아니라 형태적 변화와 같은 변화가 발생한다.
폴리펩타이드와 관련하여 사용될 때, 용어 "활성"은 단백질의 구조에 고유한 활성을 포함한다. 예를 들어, 골수성 세포 단백질과 관련하여, 용어 "활성"은 천연 결합 단백질 결합 또는 세포의 세포 신호전달을 조절함으로써(예를 들어, 면역 세포 상의 천연 수용체 또는 리간드에 결합함으로써) 골수성 세포 단백질의 염증성 표현형을 조절하는 능력을 포함한다.
용어 "투여하는"은 숙주 및/또는 대상체와 같은 관심 생물학적 표적 내로 또는 위로(적절하게)의 작용제의 실제의 물리적 도입과 관련된다. 조성물은 시험관내 또는 생체내에서 세포에 투여(예를 들어, "접촉")될 수 있다. 조성물은 적절한 투여 경로를 통해 생체내에서 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물을 숙주로 도입하는 임의의 및 모든 방법이 본 발명에 따라 상정된다. 방법은 임의의 특정 도입 수단에 의존하지 않으며, 그렇게 해석되어서는 안 된다. 도입 수단은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 또한 본 명세서에 예시된다. 용어는 작용제가 의도된 기능을 수행할 수 있도록 하는 투여 경로를 포함한다. 사용될 수 있는 신체의 치료를 위한 투여 경로의 예는 주사(피하, 정맥내, 비경구, 복강내, 척추강내 등), 경구, 흡입 및 경피 경로를 포함한다. 주사는 볼루스 주사일 수 있거나, 또는 연속 주입일 수 있다. 투여 경로에 따라, 작용제는 의도된 기능을 수행하기 위한 능력에 해로운 영향을 미칠 수 있는 자연 조건으로부터 보호하기 위해 선택된 물질로 코팅되거나 처리될 수 있다. 작용제는 단독으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 투여될 수 있다. 작용제는 또한 생체내에서 활성인 형태로 전환되는 프로드러그로서 투여될 수 있다.
용어 "작용제(agent)"는 화합물, 초분자 복합체, 물질 및/또는 이들의 조합물 또는 혼합물을 지칭한다. 화합물(예를 들어, 분자)은 화학식, 화학 구조 또는 서열로 나타낼 수 있다. 작용제의 대표적인, 비-제한적 예는 예를 들어, 항체, 소분자, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, RNAi 작용제, siRNA, miRNA, piRNA, mRNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 압타머 등), 리피드 및 다당류를 포함한다. 일반적으로, 작용제는 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 대상체(예를 들어, 인간)에서 질환 또는 장애(예를 들어, 암)을 치료하는데 사용하기 위한 "치료제"일 수 있다.
용어 "효능제(agonist)"는 표적(들)(예를 들어, 수용체)에 결합하여 표적(들)의 생물학적 활성을 활성화하거나 증가시키는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, "효능제" 항체는 결합하는 항원(들)의 생물학적 활성을 활성화하거나 증가시키는 항체이다.
용어 "변경된 양" 또는 "변경된 수준"은 대조군 샘플에서의 카피 수 또는 발현 수준과 비교하여 바이오마커 핵산의 증가된 또는 감소된 카피 수(예를 들어, 생식세포 및/또는 신체) 또는 관심 샘플에서의 증가된 또는 감소된 발현 수준을 포함한다. 용어 바이오마커의 "변경된 양"은 또한 정상 및/또는 대조군 샘플에서 상응하는 단백질 수준과 비교하여 샘플, 예를 들어, 암 샘플에서 바이오마커 단백질의 증가된 또는 감소된 단백질 수준을 포함한다. 또한, 바이오마커 단백질의 변경된 양은 바이오마커 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 마커의 메틸화 상태와 같은 번역 후 변형을 검출함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, "변경된 양"은 참조 기준선이 각각 바이오마커의 부재 또는 존재일 수 있기 때문에 바이오마커의 존재 또는 부재를 지칭한다. 바이오마커의 부재 또는 존재는 바이오마커를 측정하기 위해 사용되는 주어진 검정의 민감성의 역치에 따라 결정될 수 있다.
대상체에서 바이오마커의 양은 바이오마커의 양이 양을 평가하기 위해 사용된 검정의 비정규 오차보다 큰 양 및 바람직하게는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 350%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상의 양으로 정상 수준보다 각각 크거나 작은 경우, 바이오마커의 정상적인 양보다 "현저하게(significantly)" 높거나 낮다. 대안적으로, 대상체에서 바이오마커의 양은 그 양이 바이오마커의 정상적인 양보다 각각 적어도 약 2배 및 바람직하게는 적어도 약 3배, 4배 또는 5배 높거나 낮은 경우, 정상적인 양보다 "현저하게" 높거나 낮은 것으로 간주될 수 있다. 이러한 "유의성(significance)"은 또한 발현, 저해, 세포 독성, 세포 성장 등과 같은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 측정된 매개변수에 적용될 수 있다.
용어 바이오마커의 "변경된 발현의 수준"은 발현 또는 카피 수를 평가하기 위해 사용된 검정의 비정규 오차보다 크거나 작은 테스트 샘플, 예를 들어, 암으로 고통받고 있는 환자로부터 유래된 샘플에서의 바이오마커의 발현 수준 또는 카피 수, 바람직하게는 대조군 샘플(예를 들어, 관련 질환을 가지지 않은 건강한 대상체로부터의 샘플)에서의 바이오마커의 적어도 2배 및 더욱 바람직하게는 3배, 4배, 5배 또는 10배 이상의 발현 수준 또는 카피 수, 바람직하게는 여러 대조군 샘플에서의 바이오마커의 평균 발현 수준 또는 카피 수를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 수준은 바이오마커 수준 그 자체, 변형된 바이오마커(예를 들어, 인산화된 바이오마커)의 수준 또는 대조군과 같은 다른 측정된 변수에 대한 바이오마커의 수준(예를 들어, 비인산화된 바이오마커에 대한 인산화된 바이오마커)을 지칭한다. 용어 "발현"은 핵산(예를 들어, DNA)이 전사되어 RNA를 생성하는 과정을 포함하며, 또한 RNA 전사체가 가공되어 폴리펩타이드로 번역되는 과정을 지칭할 수 있다. 핵산 및 이들의 폴리펩타이드 대응물(있는 경우)의 발현의 합계는 표 1에 열거된 하나 이상의 표적과 같은 바이오마커의 양에 기여한다.
용어 바이오마커의 "변경된 활성"은 정상의, 대조군 샘플에서의 바이오마커의 활성과 비교하여 질환 상태, 예를 들어, 암 샘플, 또는 치료된 상태에서 증가되거나 감소된 바이오마커의 활성을 지칭한다. 바이오마커의 변경된 활성은 예를 들어, 바이오마커의 변경된 발현, 바이오마커의 변경된 단백질 수준, 바이오마커의 변경된 구조 또는 예를 들어, 바이오마커로서 동일하거나 상이한 경로에 연관된 다른 단백질과의 변경된 상호작용, 또는 전사 활성인자 또는 저해제와의 변경된 상호작용의 결과일 수 있다.
용어 바이오마커의 "변경된 구조"는 바이오마커 핵산 또는 단백질 내의 돌연변이 또는 대립유전자 변이체, 예를 들어, 정상 또는 야생형 유전자 또는 단백질과 비교하여 바이오마커 핵산 또는 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 돌연변이의 존재를 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이는 치환, 결실 또는 부가 돌연변이를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 돌연변이는 바이오마커 핵산의 코딩 영역 또는 논-코딩 영역에 존재할 수 있다.
용어 바이오마커의 "변경된 세포내 국재화"는 세포 내에서, 예를 들어, 건강한 및/또는 야생형 세포 내에서의 정상적인 국재화와 비교하여 세포 내에서의 바이오마커의 잘못된 국재화를 지칭한다. 마커의 정상적인 국재화의 표시는 바이오마커 폴리펩타이드가 속하는 분야에서 공지된 세포내 국재화 모티프의 분석을 통해 결정될 수 있다.
용어 "길항제(antagonist)" 또는 "차단제(blocking)"는 작용제 표적(들)(예를 들어, 수용체)에 결합하여 표적(들)의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, "길항제" 항체는 결합하는 항원(들)의 생물학적 활성을 현저하게 저해하거나 감소시키는 항체이다.
본 명세서 내에서 달리 명시되지 않는 한, 용어 "항체" 및 "항체들"은 광범위하게 항체의 자연 발생적 형태(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE) 및 재조합 항체, 예컨대, 단일-쇄 항체, 키메라 및 인간화된 항체 및 다중-특이성 항체뿐만 아니라 전술한 것들 모두의 단편, 융합 단백질 및 유도체를 포함하며, 단편 및 유도체는 적어도 항원성 결합 부위를 갖는다. 항체 유도체는 항체에 접합된 단백질 또는 화학 모이어티를 포함할 수 있다.
용어 "바이오마커"는 골수성 세포에서의 관심 표현형과 같은 하나 이상의 관심 표현형의 조절을 위한 표적인 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 이러한 맥락에서, 용어 "바이오마커"는 "표적"과 동의어이다. 일부 실시형태에서, 그러나, 이 용어는 관심 결과물, 예컨대(예를 들어, 염증성 표현형, 암 상태 등을 조절하기 위한) 하나 이상의 진단적, 예후 예측적 및/또는 치료적 결과물을 나타내는 것으로 결정된 표적의 측정 가능한 독립체(entity)를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 용어는 항-유전자 산물 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하여 유전자 또는 유전자 산물을 조절하는 조성물을 추가로 포함한다. 따라서, 바이오마커는 제한 없이 핵산(예를 들어, 게놈 핵산 및/또는 전사된 핵산), 단백질 및 항체(뿐만 아니라 이의 항원-결합 단편), 특히 표 1에 열거된 것들을 포함할 수 있다.
용어 "암" 또는 "종양" 또는 "과증식성"은 암-유발 세포의 전형적인 특징, 예컨대, 제어되지 않는 증식, 불멸성, 침습 또는 전이 가능성, 빠른 성장 및 소정의 특징적인 형태학적 특징을 갖는 세포의 존재를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포는 면역관문 단백질, 예컨대, PD-1, PD-L1, PD-L2 및/또는 CTLA-4의 발현 및 활성으로 인해 부분적으로 또는 전체적으로 이러한 특성을 나타낸다.
암세포는 종종 종양의 형태로 존재하지만, 이러한 세포는 동물 내에서 단독으로 존재할 수 있거나, 또는 백혈병 세포와 같은 비-종양성 암세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 전암성뿐만 아니라 악성 암을 포함한다. 암은 다양한 암, 방광(가속화되고 전이성인 방광암을 포함), 유방, 결장(결장직장암을 포함), 신장, 간, 폐(소세포 및 비-소세포 폐암 및 폐 선암종을 포함), 난소, 전립선, 고환, 비뇨 생식기, 림프계, 직장, 후두, 췌장(외분비성 췌장 암종을 포함), 식도, 위, 담낭, 자궁경부, 갑상선 및 피부(편평세포 암종을 포함)의 것들을 포함하는 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종, 조직세포 림프종 및 버킷 림프종을 포함하는 림프성 계통의 혈액학적 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병 및 전골수성 백혈병을 포함하는 골수성 계통의 혈액학적 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근 육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 색소성 건피증, 각화 상피 종양, 정상피종, 갑상선 여포암 및 기형암종을 포함하는 기타 종양; 흑색종, 절제 불가능한 III 또는 IV기의 악성 흑색종, 편평세포 암종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 위장관암, 콩팥암, 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 다발성 교모세포종, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종 및 두경부암, 위장암, 생식세포 종양, 골암, 골 종양, 성인의 뼈의 악성 섬유성 조직구증; 유년기의 뼈의 악성 섬유성 조직구증, 육종, 소아 육종, 부비강 자연 살해, 신생물, 형질세포 신생물; 골수이형성 증후군; 신경모세포종; 고환 생식세포 종양, 안구내 흑색종, 골수이형성 증후군; 골수이형성/골수증식성 질환, 활액 육종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 필라델피아 세포 주기 양성 급성 림프아구성 백혈병(Ph+ALL), 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비만 세포증과 관련된 비만 세포증 및 임의의 증상 및 이들의 임의의 전이를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한, 장애는 다른 암 외에도 색소성 두드러기, 인간에서의 미만성 피부 비만 세포증, 고립성 비만세포종뿐만 아니라 개의 비만세포종 및 수포성, 홍피성 및 말초혈관 확장성 비만 세포증과 같은 일부 희귀한 아형, 골수증식성 또는 골수이형성 증후군 또는 급성 백혈병과 같은 혈액학적 장애와 관련된 비만 세포증과 같은 비만 세포증, 비만 세포증, 비만 세포 백혈병과 관련된 골수증식성 장애를 포함한다. 다른 암은 또한 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 장애의 범위 내에 포함된다: 편평세포 암종을 포함하는, 방광, 요로상피 암종, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 고환, 특히 고환 정상피종 및 피부의 것들을 포함하는 암종; 위장관 기질 종양("GIST(gastrointestinal stromal tumor)"); 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버킷 림프종을 포함하는 림프성 계통의 혈액학적 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수성 백혈병을 포함하는 골수성 계통의 혈액학적 종양; 섬유육종 및 횡문근 육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경교종을 포함하는 기타 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근 육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각화 상피 종양, 정상피종, 갑상선 여포암, 기형암종, 화학요법 불응성 비-정상피종성 생식세포 종양 및 카포시 육종을 포함하는 기타 종양 및 이들의 임의의 전이. 본 발명에 포함되는 방법을 적용할 수 있는 암의 유형의 다른 비-제한적 예는 인간 육종 및 암종, 예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관 내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근 육종, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭샘암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 골암, 뇌 종양, 폐 암종(폐 선암종을 포함), 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경 종양, 희소돌기 신경교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종; 백혈병, 예를 들어, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병(골수아구성, 전골수성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성다혈구증, 림프종(호지킨 질환 및 비-호지킨 질환), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 및 중쇄 질환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 사실상 상피이며, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장 암, 부인암, 콩팥암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암 또는 피부암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 상피 암은 비-소세포 폐암, 비유두형 신세포 암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예를 들어, 장액성 난소 암종) 또는 유방암종이다. 상피 암은 장액성, 자궁내막성, 점액성, 투명 세포, 브렌너 또는 비분화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 다른 방식으로 특성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 (진행성) 비-소세포 폐암, 흑색종, 두경부 편평세포 암, (진행성) 요로상피 방광암, (진행성) 신장암(RCC), 현미부수체 불안정성 암, 전형적인 호지킨 림프종, (진행성) 위장암, (진행성) 자궁경부암, 일차 종격동 B-세포 림프종, (진행성) 간세포성 암종 및 (진행성) 메르켈 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "분류하는"은 샘플을 질환 상태와 "연관시키는" 또는 "범주화하는" 것을 포함한다. 소정의 예에서, "분류하는"은 통계학적 증거, 경험적 증거 또는 둘 다를 기반으로 한다. 소정의 실시형태에서, 알려진 질환 상태를 갖는 소위 샘플의 트레이닝 세트의 사용을 분류하는 방법 및 시스템. 일단 확립되면, 트레이닝 데이터 세트는 샘플의 알려지지 않은 질환 상태를 분류하기 위해 샘플의 알려지지 않은 특징을 비교하는 기초 모델 또는 템플릿의 역할을 한다. 소정의 예에서, 샘플을 분류하는 것은 샘플의 질환 상태를 진단하는 것과 유사하다. 소정의 다른 예에서, 샘플을 분류하는 것은 샘플의 질환 상태를 다른 질환 상태와 구별하는 것과 유사하다.
용어 "코딩 영역(coding region)"은 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 지칭하는 반면, 용어 "논코딩 영역(noncoding region)"은 아미노산으로 번역되지 않는 뉴클레오타이드 서열의 영역(예를 들어, 5' 및 3' 비번역 영역)을 지칭한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편과 관련하여, 용어 "경쟁하다"는 제1 항체와 이의 동족 에피토프의 결합의 결과가 제2 항체의 부재하에 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재하에 검출 가능하게 감소되도록 하는, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하는 상황을 지칭한다. 제2 항체의 에피토프에 대한 결합이 또한 제1 항체의 존재하에 검출 가능하게 감소되는 대안이 있을 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 즉, 제1 항체는 제2 항체가 이의 각각의 에피토프에 대한 제1 항체의 결합을 저해하지 않고 제2 항체의 에피토프에 대한 결합을 저해할 수 있다. 그러나, 각 항체가 동족 에피토프 또는 리간드와 다른 항체의 결합을 검출 가능하게 저해하는 경우, 동일하거나, 더 크거나 또는 더 작든, 항체는 각 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"한다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 및 이의 항원-결합 단편 모두 본 발명에 포함된다(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 다른 항체 및 항원-결합 단편과 경쟁 또는 교차-경쟁하는 본 명세서에 기재된 항체 및 항원-결합 단편). 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생하는 메커니즘(예를 들어, 입체 장애, 입체형태 변화 또는 공통 에피토프 또는 이의 일부에 대한 결합)에 관계없이, 당업자는 본 명세서에 제공된 개시내용 및 최신 기술에 기초하여 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포함되며 본 명세서에 개시된 방법에 유용할 수 있음을 이해한다.
용어 "상보성(complementary)"은 2개의 핵산 가닥의 영역 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 잔기가 티민 또는 우라실인 경우, 제1 영역에 역평행인 제2 핵산 영역의 잔기와 특정 수소 결합("염기쌍 형성(base pairing)")을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 유사하게는, 제1 핵산 가닥의 사이토신 잔기는 잔기가 구아닌인 경우, 제1 가닥에 역평행인 제2 핵산 가닥의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 핵산의 제1 영역은 2개의 영역이 역평행 방식으로 배열될 때 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 경우, 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 이에 의해, 제1 부분 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 적어도 약 50% 및 바람직하게는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 이상의 제1 부분의 뉴클레오타이드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 제1 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상보적 폴리뉴클레오타이드는 "충분히 상보적(sufficiently complementary)"일 수 있거나, 또는 "충분한 상보성(sufficient complementary)", 즉, 듀플렉스(duplex)를 유지하고/하거나 목적하는 활성을 갖기에 충분한 상보성을 가질 수 있다. 예를 들어, RNAi 작용제의 경우에, 이러한 상보성은 mRNA의 번역을 부분적으로 또는 완전하게 방지하기에 충분한 작용제 및 표적 mRNA 사이의 상보성이다. 예를 들어, "표적-특이적 RNA 간섭(RNAi)를 지시하기 위해 표적 mRNA 서열에 충분히 상보적인 서열"을 갖는 siRNA는 siRNA가 RNAi 기구 또는 과정에 의해 표적 mRNA의 파괴를 촉발하기에 충분한 서열을 가짐을 의미한다.
용어 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 2개의 핵산 사이의 염기쌍이 형성된 이중 가닥 영역에서의 상보성을 지칭하며, 2개의 이중 가닥 영역 사이의 말단 오버행 또는 갭 영역과 같은 임의의 단일 가닥 영역이 아니다. 상보성은 완벽할 필요는 없으며; 임의의 수의 염기쌍 불일치가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 서열이 본 명세서에서 "실질적으로 상보적"이라고 지칭되는 경우, 이는 서열이 선택된 반응 조건하에서 혼성화하기에 충분히 서로 상보적임을 의미한다. 따라서, 실질적으로 상보적인 서열은 이중 가닥 영역에서 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60% 이상, 또는 임의의 수의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "연합 요법(conjoint therapy)" 및 "병용 요법(combination therapy)"은 2개 이상의 치료제, 예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적의 조절제의 조합, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적 중 적어도 하나의 조절제 및 추가적인 치료제, 예컨대, 면역 관문 요법의 조합, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적 중 하나 이상의 조절제의 조합 등 및 이들의 조합을 지칭한다. 병용 요법을 포함하는 상이한 작용제는 다른 작용제 또는 다른 작용제들의 투여와 함께, 그 이전에, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 병용 요법은 이러한 치료제의 공동 작용으로부터 유익한(추가적 또는 시너지) 효과를 제공하기 위한 것이다. 이들 치료제의 병용 투여는 정의된 기간(선택된 조합에 따라 일반적으로 분, 시간, 일 또는 주)에 걸쳐 수행될 수 있다. 병용 요법에서, 병용 치료제는 순차적 방식으로 또는 실질적으로 동시 적용에 의해 적용될 수 있다.
용어 "대조군"은 테스트 샘플에서 발현 산물과의 비교를 제공하기에 적합한 임의의 참조 비정규물질을 지칭한다. 일 실시형태에서, 대조군은 발현 산물 수준이 검출되고, 테스트 샘플로부터의 발현 산물 수준과 비교되는 "대조군 샘플"을 수득하는 것을 포함한다. 이러한 대조군 샘플은 골수성 세포를 갖는 대상체 및/또는 알려진 결과를 갖는 대조군 암 환자(보관된 샘플 또는 이전의 샘플 측정값일 수 있음)와 같은 대상체; 정상의 환자 또는 암 환자와 같은 대상체로부터 단리된 정상 조직 또는 세포, 정상의 대상체 또는 암 환자와 같은 대상체로부터 단리된 배양된 일차 세포/조직, 암 환자의 동일한 장기 또는 신체 위치로부터 수득된 인접 정상 세포/조직, 정상의 대상체로부터 단리된 조직 또는 세포 샘플 또는 기탁소로부터 얻은 일차 세포/조직으로부터의 샘플을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 샘플을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 하우스키핑 유전자, 정상 조직(또는 다른 이전에 분석된 대조군 샘플)으로부터의 발현 산물 수준 범위, 소정의 결과(예를 들어, 1년, 2년, 3년, 4년 등의 생존 기간 등)를 갖거나 소정의 치료(예를 들어, 비정규의 암 케어 요법)를 받고 있는 환자의 그룹 또는 일련의 환자로부터의 테스트 샘플 내의 이전에 결정된 발현 산물 수준 범위를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 공급원으로부터의 참조 비정규물질의 발현 산물 수준을 포함할 수 있다. 이러한 대조군 샘플 및 참조 비정규물질의 발현 산물 수준은 본 발명에 포함되는 방법에서 대조군으로서 조합하여 사용될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 일 실시형태에서, 대조군은 정상적인 또는 비-암성 세포/조직 샘플을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 일련의 환자, 예컨대, 일련의 암 환자 또는 소정의 치료를 받고 있는 일련의 암 환자 또는 하나의 결과 대 다른 결과를 갖는 일련의 환자에 대한 발현 수준을 포함할 수 있다. 전자의 경우에, 각각의 환자의 특정 발현 산물 수준은 발현의 백분위수(percentile) 수준으로 지정되거나 또는 참조 비정규물질의 발현 수준의 평균 또는 평균보다 높거나 낮게 표현될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 정상적인 세포, 병용 화학요법으로 치료된 환자로부터의 세포 및 양성 암을 갖는 환자로부터의 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 대조군은 또한 측정된 값, 예를 들어, 동일한 집단에서의 하우스키핑 유전자의 발현 수준과 비교한 집단에서의 특정 유전자의 발현의 평균 수준을 포함할 수 있다. 이러한 집단은 정상적인 대상체, 임의의 치료를 받지 않은(즉, 치료 경험이 없는(treatment naive)) 암 환자, 비정규의 케어 요법을 받은 암 환자 또는 양성 암을 갖는 환자를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 테스트 샘플에서 2개의 유전자의 발현 산물 수준의 비를 결정하고, 이를 참조 표준물질에서 동일한 2개의 유전자의 임의의 적합한 비와 비교하는 것; 테스트 샘플에서 2개 이상의 유전자의 발현 산물 수준을 결정하고 임의의 적합한 대조군에서 발현 산물 수준의 차이를 결정하는 것; 및 테스트 샘플에서 2개 이상의 유전자의 발현 산물 수준을 결정하고, 테스트 샘플에서 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 이들의 발현을 정규화하고, 임의의 적합한 대조군과 비교하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 발현 산물 수준의 비 변환(ratio transformation)을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 대조군은 테스트 샘플과 동일한 계통 및/또는 유형의 대조군 샘플을 포함한다. 다른 실시형태에서, 대조군은 암을 가진 모든 환자와 같은 일련의 환자 샘플 내에서 또는 이에 기초하여 백분위수로 그룹화된 발현 산물 수준을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어, 특정 백분위수에 비해 더 높거나 낮은 수준의 발현 산물이 결과 예측을 위한 기초로서 사용되는 대조군 발현 산물 수준이 확립된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군 발현 산물 수준은 공지된 결과를 갖는 암 대조군 환자로부터의 발현 산물 수준을 사용하여 확립되며, 테스트 샘플로부터의 발현 산물 수준은 결과를 예측하기 위한 기초로서 대조군 발현 산물 수준과 비교된다. 본 발명에 포함되는 방법은 테스트 샘플에서 발현 산물의 수준을 대조군과 비교할 때 특정 컷-오프 지점(cut-off point)의 사용으로 제한되지 않는다.
바이오마커 핵산의 "카피 수(copy number)"는 특정 유전자 산물을 암호화하는 세포(예를 들어, 생식세포 및/또는 신체)에서의 DNA 서열의 수를 지칭한다. 일반적으로, 주어진 유전자에 대해, 포유동물은 각 유전자의 두 카피를 갖는다. 그러나, 카피 수는 유전자 증폭 또는 복제에 의해 증가되거나 또는 결실에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 생식세포 카피 수 변화는 하나 이상의 게놈 유전자좌에서의 변화를 포함할 수 있되, 상기 하나 이상의 게놈 유전자좌는 대조군에서 생식세포 카피의 정상 보체에서의 카피 수(예를 들어, 특정 생식세포 DNA 및 상응하는 카피 수가 결정된 것과 동일한 종에 대한 생식세포 DNA에서의 정상 카피 수)에 의해 설명되지 않는다. 체세포 카피 수 변화는 하나 이상의 게놈 유전자좌에서의 변화를 포함하되, 상기 하나 이상의 게놈 유전자좌는 대조군의 생식세포 DNA의 카피 수(예를 들어, 체세포 DNA 및 상응하는 카피 수가 결정된 것과 동일한 대상체에 대한 생식세포 DNA에서의 카피 수)에 의해 설명되지 않는다.
활성화된 면역 세포와 관련하여 사용되는 용어 "공자극하다"는 증식 또는 효과기 기능을 유도하는 제2의 비-활성화 수용체 매개성 신호 ("공자극 신호 ")를 제공하는 공자극 폴리펩타이드의 능력을 포함한다. 예를 들어, 공자극 신호는, 예를 들어, T 세포-수용체-매개성 신호를 받은 T 세포에서 사이토카인 분비를 유발할 수 있다. 예를 들어, 수용체 활성화를 통해 세포-수용체 매개성 신호를 받은 면역 세포는 본 명세서에서 "활성화된 면역 세포"로 지칭된다.
용어 "공자극 수용체"는 공자극 신호를 면역 세포, 예를 들어, CD28에 전달하는 수용체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "저해성 수용체"는 음성 신호를 면역 세포(예를 들어, PD-1, CTLA-4 등)에 전달하는 수용체를 포함한다. 저해성 수용체에 의해 전달되는 저해성 신호는 공자극 수용체 (예컨대, CD28)가 면역 세포에 존재하지 않는 경우에도 발생할 수 있으며, 따라서, 이는 단순히 공자극 폴리펩타이드 결합에 대한 저해성 수용체와 공자극 수용체 간의 경쟁의 기능이 아니다(문헌[Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205]). 저해성 신호의 면역 세포로의 전달은 면역 세포에서 무반응성 또는 무력성(anergy) 또는 예정된 세포 사멸을 초래할 수 있다. 바람직하게는 저해성 신호의 전달은 아폽토시스를 포함하지 않는 메커니즘을 통해 작동한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아폽토시스"는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 특성화될 수 있는 예정된 세포 사멸을 포함한다. 아폽토시스 세포 사멸은, 예를 들어, 세포 단편화로 이어지는 세포 수축, 막 기포형성(membrane blebbing) 및 염색질 응축으로 특징지어질 수 있다. 아폽토시스가 일어나고 있는 세포는 또한 뉴클레오솜 사이 DNA 절단의 특징적인 패턴을 나타낸다. 수용체에 결합하는 폴리펩타이드의 형태에 따라, 신호는 전달될 수 있거나(예를 들어, 저해성 수용체 리간드의 다가 형태에 의해) 또는 신호는, 예를 들어, 하나 이상의 천연 결합 파트너에 결합하기 위해 리간드의 활성화 형태와 경쟁함으로써 저해될 수 있다(예를 들어, 저해성 수용체 리간드의 가용성 1가 형태에 의해). 그러나, 가용성 폴리펩타이드가 자극성일 수 있는 경우가 있다. 조절제의 효과는 본 명세서에 기재된 일상적인 스크리닝 검정을 사용하여 쉽게 입증될 수 있다.
용어 "사이토카인"은 면역 체계의 소정의 세포에 의해 분비된 물질을 지칭하며, 다른 세포에 생물학적 효과가 있다. 사이토카인은 인터페론, 인터류킨 및 성장 인자와 같은 다수의 상이한 물질일 수 있다.
용어 "대상체에게 적합한 치료 양생법을 결정하는 것"은 본 발명에 포함되는 바이오마커-매개성 분석의 결과에 기초하거나 또는 본질적으로 기초하거나 또는 적어도 부분적으로 기초하여 시작, 수정 및/또는 종료된 대상체에 대한 치료 양생법(즉, 대상체에서 암의 예방 및/또는 치료를 위해 사용되는 단일 요법 또는 상이한 요법의 조합)의 결정을 의미하는 것으로 간주된다. 하나의 예는 하나 이상의 바이오마커를 조절하는 본 발명에 포함되는 작용제를 사용하는 요법을 제공하기 위해 암에 대한 표적화 요법을 제공할지 여부를 결정하는 것이다. 다른 예는 재발의 위험을 줄이는 것이 목적인 수술 후 보조 요법을 시작하는 것이다. 또 다른 예는 특정 화학요법의 용량을 수정하는 것이다. 결정은 본 발명에 따른 분석 결과에 추가하여, 치료될 대상체의 개인 특성에 기초할 수 있다. 대부분의 경우, 대상체에 대한 적합한 치료 양생법의 실제 결정은 주치의 또는 의사에 의해 수행될 것이다.
용어 "내독소가 없는(endotoxin-free)" 또는 "실질적으로 내독소가 없는(substantially endotoxin-free)"은 내독소를 가장 미량(예를 들어, 대상체에 대해 임상적으로 불리한 생리학적 효과를 갖지 않는 양)으로, 바람직하게는 내독소를 검출 불가능한 양으로 함유하는 조성물, 용매 및/또는 용기를 지칭한다. 내독소는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 같은 그람-양성 박테리아에서 발견될 수 있지만, 내독소는 소정의 박테리아, 전형적으로 그람-음성 박테리아와 관련된 독소이다. 가장 널리 퍼져 있는 내독소는 다양한 그람-음성 박테리아의 외막에서 발견되는 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 리포-올리고-사카라이드(lipo-oligo-saccharide: LOS)이며, 이는 이러한 박테리아가 질환을 유발하는 능력의 중심이 되는 병원균성 특징을 나타낸다. 인간에서 소량의 내독소는 다른 불리한 생리학적 효과 중에서도 열, 혈압의 강하 및 염증과 응고의 활성화를 유발할 수 있다. 따라서, 의약품 생산에 있어서, 소량이라도 인간에게 부작용을 일으킬 수 있기 때문에, 의약품 및/또는 약물 용기로부터 대부분 또는 미량의 내독소를 제거하는 것이 종종 바람직하다. 대부분의 내독소를 분해하기 위해 전형적으로 300℃를 초과하는 온도가 필요하므로, 이러한 목적을 위해 발열원 제거 오븐(depyrogenation oven)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 주사기 또는 바이알과 같은 일차 패키징 물질을 기준으로, 250℃의 유리 온도와 30분의 유지 시간의 조합은 종종 내독소 수준을 3 로그 감소시키기에 충분하다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지되어 있는 것과 같은 크로마토그래피 및 여과 방법을 포함하는 내독소를 제거하는 다른 방법이 상정된다. 내독소는 당업계에 공지되어 있는 일상적인 기법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 투구게로부터의 혈액을 활용하는 투구게 변형세포 용해물(Limulus amoebocyte lysate) 검정은 내독소의 존재를 검출하기에 매우 민감한 검정이다. 이러한 테스트에서, 매우 낮은 수준의 LPS는 이러한 반응을 증폭시키는 강력한 효소적 캐스케이드로 인해 투구게 용해물의 검출 가능한 응고를 유발할 수 있다. 내독소는 또한 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 정량화될 수 있다. 실질적으로 내독소가 없기 위해서, 내독소 수준은 약 0.001 EU/㎖, 0.005 EU/㎖, 0.01 EU/㎖, 0.02 EU/㎖, 0.03 EU/㎖, 0.04 EU/㎖, 0.05 EU/㎖, 0.06 EU/㎖, 0.08 EU/㎖, 0.09 EU/㎖, 0.1 EU/㎖, 0.5 EU/㎖, 1.0 EU/㎖, 1.5 EU/㎖, 2 EU/㎖, 2.5 EU/㎖, 3 EU/㎖, 4 EU/㎖, 5 EU/㎖, 6 EU/㎖, 7 EU/㎖, 8 EU/㎖, 9 EU/㎖ 또는 10 EU/㎖ 미만 또는 0.05 EU/㎖ 내지 10 EU/㎖와 같은 범위를 포함하는 그 사이의 임의의 범위일 수 있다. 전형적으로, 1ng의 리포폴리사카라이드(LPS)는 약 1 내지 10 EU에 해당한다.
용어 "에피토프"는 항원-결합 단백질(예를 들어, 면역글로불린, 항체 또는 항원-결합 단편)이 결합하는 항원 상의 결정기 또는 부위를 지칭한다. 단백질 항원의 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 연결된 아미노산의 연속적인, 선형 서열로부터 형성된 에피토프를 지칭한다. 단백질 항원의 선형 에피토프는 전형적으로 화학적 변성제(예를 들어, 산, 염기, 용매, 가교제, 카오트로픽 작용제, 이황화 결합 환원제) 또는 물리적 변성제(예를 들어, 열적 가열, 방사능, 또는 기계적 전단 또는 응력)에 노출될 때 유지된다. 대조적으로, 입체형태 에피토프는 폴리펩타이드의 3차 폴딩에 의해 병치된 비-연속적인 아미노산으로부터 형성되는 에피토프를 지칭한다. 입체형태 에피토프는 전형적으로 변성제로 치료시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간 구조에 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 고유한 공간 구조에 includes 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개는 5개 미만의 아미노산을 포함한다. 일반적으로, 특정 표적 분자에 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물 내에서 표적 분자 상의 특정 에피토프를 우선적으로 인식하고 이에 결합할 것이다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 바이오마커 단백질의 세포외 도메인의 모든 아미노산을 포함하지 않는다.
용어 "발현 시그니처(expression signature)" 또는 "시그니처(signature)"는 관심 상태를 나타내는 하나 이상의 발현된 바이오마커의 그룹을 지칭한다. 예를 들어, 이러한 시그니처를 구성하는 유전자, 단백질 등은 특정 세포 계통, 분화 단계에서 또는 특정 생물학적 반응 중에 발현될 수 있다. 바이오마커는 세포의 염증성 상태, 암의 기원 세포, 생검에서 비-악성 세포의 특성 및 암의 원인이 되는 종양발생 메커니즘과 같이 종양이 발현되는 생물학적 양태를 반영할 수 있다. 발현 데이터 및 유전자 발현 수준은 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어, 마이크로어레이 또는 칩 판독 장치와 함께 사용되는 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장될 수 있다. 이러한 발현 데이터는 발현 시그니처를 생성하기 위해 조작될 수 있다.
용어 "고정된(fixed)" 또는 "부착된(affixed)"은 기질과 공유적으로 또는 비-공유적으로 회합된 물질을 의미하며, 이러한 기질은 분자의 상당한 부분이 기질에서 해리되지 않고 유체(예를 들어, 표준 시트르산 염수, pH 7.4)로 헹궈질 수 있다.
용어 "유전자"는 기능을 갖는 분자(예를 들어, RNA, 단백질 등)를 암호화하는 뉴클레오타이드(예를 들어, DNA) 서열을 포함한다. 유전자는 일반적으로 2개의 상보적 뉴클레오타이드 가닥(즉, dsDNA), 코딩 가닥 및 논-코딩 가닥을 포함한다. DNA 전사를 언급할 때, 코딩 가닥은 (티민은 우라실로 대체되지만) 염기 서열이 생성된 RNA 전사체의 염기 서열과 상응하는 DNA 가닥이다. 코딩 가닥은 코돈을 함유하는 반면, 논-코딩 가닥은 안티코돈을 함유한다. 전사하는 동안, RNA Pol II는 논-코딩 가닥에 결합하고, 안티-코돈을 읽고, 이들의 서열을 전사하여 상보적 염기를 갖는 RNA 전사체를 합성한다. 일부 실시형태에서, 열거된 유전자 서열(즉, DNA 서열)은 코딩 가닥의 서열이다.
"기능-보존적 변이체"는 단백질 또는 효소에서 주어진 아미노산 잔기가 폴리펩타이드의 전체 형태 및 기능을 변경하지 않고 변화된 것으로, 아미노산을 유사한 특성(예컨대, 예를 들어, 극성, 수소 결합 전위, 산성, 염기성, 소수성, 방향족 등)을 갖는 아미노산으로 대체하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 보존된 것으로 나타낸 것 이외의 아미노산은 단백질에서 상이할 수 있으므로 유사한 기능의 임의의 두 단백질 간의 단백질 백분율 또는 아미노산 서열 유사성은 다양할 수 있으며, 예를 들어, 클러스터 방법과 같은 정렬 체계에 따라 결정된 바와 같이 70% 내지 99%일 수 있되, 유사성은 MEGALIGN 알고리즘에 기초한다. 일부 실시형태에서, "기능-보존적 변이체"는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 결정된 바와 같이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 아미노산 동일성을 갖고, 비교 대상이 되는 천연 또는 모 단백질과 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 특성 또는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
용어 "유전자 산물"(본 명세서에서 "유전자 발현 산물" 또는 "발현 산물"로도 지칭됨)은 유전자의 발현으로부터 생성된 생성물, 예컨대, 유전자로부터 전사된 핵산(예를 들어, mRNA) 및 이러한 mRNA의 번역으로부터 발생하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 소정의 유전자 산물은 예를 들어, 세포에서 가공 또는 변형될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, mRNA 전사체는 번역 전에 스플라이싱, 폴리아데닐화 등을 겪고/겪거나 폴리펩타이드는 동시 번역 또는 번역 후 가공, 예컨대, 분비 신호 서열의 제거, 세포 기관 표적화 서열의 제거 또는 인산화, 글리코실화, 메틸화, 지방 아실화 등과 같은 변형을 겪을 수 있다. 용어 "유전자 산물"은 이러한 가공된 또는 변형된 형태를 포함한다. 인간을 포함하는 다양한 종으로부터의 게놈 mRNA 및 폴리펩타이드 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)(ncbi.nih.gov) 또는 보편적 단백질 자료(uniprot.org)로부터 이용할 수 있는 것들과 같이 공개적으로 접근할 수 있는 데이터베이스에서 이용할 수 있다. 다른 데이터베이스는 예를 들어, GenBank, RefSeq, Gene, UniProtKB/SwissProt, UniProtKB/Trembl 등을 포함한다. 일반적으로, NCBI 참조 서열 데이터베이스의 서열이 관심 유전자에 대한 유전자 산물 서열로 사용될 수 있다. 유전자의 다중 대립 유전자가 동일한 종의 개체 사이에 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 대안적 RNA 스플라이싱 또는 편집의 결과로서, 소정의 단백질의 여러 동형 단백질이 존재할 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 양태가 유전자 또는 유전자 산물에 관련되는 경우, 달리 나타내지 않는 한, 적용 가능한 경우, 대립유전자 변이체 또는 동형 단백질과 관련된 실시형태가 포함된다. 소정의 실시형태는 특정 서열(들), 예를 들어, 특정 대립유전자(들) 또는 동형 단백질(들)에 대한 것일 수 있다.
용어 "생성하는"은 직접 또는 간접적인 작용에 의해서와 같이 목적하는 결과가 달성되는 임의의 방식을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절된 표현형을 갖는 세포는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커를 조절하는 적어도 하나의 작용제와의 접촉과 같은 직접적인 작용에 의해 및/또는 목적하는 물리적, 유전적 및/또는 표현형 속성을 갖는 세포를 번식시키는 것과 같은 간접적인 작용에 의해 생성될 수 있다.
용어 "글리코실화 패턴"은 단백질, 보다 구체적으로 면역글로불린 단백질에 공유적으로 부착된 탄수화물 단위의 패턴이다. 당업자가 이종 항체의 글리코실화 패턴이 이식유전자의 CH 유전자가 유래되는 종보다 비인간 형질전환 동물의 종에서의 상기 글리코실화 패턴과 더욱 유사한 것으로 인식할 때, 이종 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 형질전환 동물의 종에 의해 생성된 항체에서 자연적으로 발생하는 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사한 것으로 특징지어질 수 있다.
세포 바이오마커 발현과 관련하여 용어 "높은", "낮은", "중간" 및 "음성"은 하나 이상의 참조 세포에 의한 바이오마커의 세포 발현에 대해 발현된 바이오마커의 양을 지칭한다. 바이오마커 발현은 하나 이상의 바이오마커 게놈 핵산, 리보핵산 및/또는 폴리펩타이드의 세포 수준, 활성, 구조 등의 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 이 용어는 각각 고도, 중간 또는 최저 수준으로 바이오마커를 발현하는 세포 집단의 정의된 퍼센트를 지칭한다. 이러한 퍼센트는 바이오마커를 고도로 발현하거나 약하게 발현하는 세포의 집단의 상위 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이상 또는 그 사이의 임의의 범위까지로 정의될 수 있다. 용어 "낮은"은 이러한 세포가 바이오마커 발현에 대해 "음성"이기 때문에, 바이오마커를 검출 가능하게 발현하지 않는 세포를 제외한다. 용어 "중간"은 바이오마커를 발현하지만, "높은" 수준으로 이를 발현하는 집단보다 낮은 수준의 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 용어는 또한 정성적 또는 통계학적 플롯 영역에 의해 확인된 바이오마커 발현의 세포 집단을 지칭할 수 있거나 대안적으로 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유세포 분석을 사용하여 분류된 세포 집단은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 평균 형광 세기 등과 같은 검출 가능한 모이어티 분석에 기초하여 별개의 플롯을 확인함으로써 바이오마커 발현 수준에 기초하여 구별될 수 있다. 이러한 플롯 영역은 관심 바이오마커에 대해 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 수, 모양, 중첩 등에 따라 개량될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 용어는 또한 추가적인 바이오마커에 대한 발현의 존재 또는 부재에 따라 결정될 수 있다.
용어 "실질적으로 동일한"은 예를 들어, 아래에 기재된 방법을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 제2 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 30%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭한다. "실질적 동일성"은 서열, 예컨대, 전장 서열, 기능성 도메인, 코딩 및/또는 조절 서열, 엑손, 인트론, 프로모터 및 게놈 서열의 다양한 유형 및 길이를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 2개의 폴리펩타이드 또는 핵산 서열 간의 퍼센트 서열 동일성은 예를 들어, BLAST 프로그램(베이식 로컬 정렬 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool)); (문헌[Altschul et al.(1995) J. Mol. Biol. 215:403-410]), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL 또는 메갈리안(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 결정된다. 또한, 당업자는 비교될 서열 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위한 목적을 위해 DNA 서열을 RNA 서열과 비교할 때, 티민 뉴클레오타이드는 우라실 뉴클레오타이드와 동등한 것으로 이해된다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 그룹 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 아이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 타이로신.
용어 "면역 세포"는 면역 반응에 직접 또는 간접적으로 참여할 수 있는 세포를 지칭한다. 면역 세포는 T 세포, B 세포, 항원 제시 세포, 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NK) 세포, 림포카인-할성화 살해(LAK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호염구, 호중구, 과립구, 비만 세포, 혈소판, 랑게르한스 세포, 줄기 세포, 말초 혈액 단핵 세포, 세포독성 T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "항원 제시 세포"(antigen presenting cell: APC)는 T 세포를 활성화할 수 있는 세포이며, 단핵구/대식세포, B 세포 및 수지상 세포(DC)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "수지상 세포" 또는 "DC"는 림프성 또는 비-림프성 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단의 임의의 구성원을 지칭한다. 이들 세포는 독특한 형태와 높은 수준의 표면 MHC-클래스 II 발현을 특징으로 한다. DC는 다수의 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. DC는 MHC-제한 T 세포를 감작시키는 높은 능력을 가지며, 항원을 현장에서 T 세포에 제시하는데 매우 효과적이다. 항원은 T 세포 발달 및 내성 동안 발현되는 자가-항원일 수 있으며, 정상적인 면역 과정 중에 존재하는 외래 항원일 수 있다. 용어 "호중구"는 일반적으로 선천성 면역 체계의 일부를 구성하는 백혈구를 지칭한다. 호중구는 전형적으로 약 2 내지 5개의 엽(lobe)을 함유하는 분절된 핵을 갖는다. 호중구는 외상 후 몇 분 이내에 손상 부위로 자주 이동한다. 호중구는 손상 또는 감염 부위에서 산화제, 프로테이스(protease) 및 사이토카인을 포함하는 세포독성 화합물을 방출함으로써 기능한다. 용어 "활성화된 DC"는 항원으로 펄스화되고, 면역 세포를 활성화할 수 있는 DC이다. 용어 "NK 세포"는 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 자연 살해(natural killer: NK) 세포를 지칭한다. 당업자는 예를 들어, 특정 표현형 마커(예를 들어, CD56)의 발현을 결정함으로써 NK 세포를 쉽게 확인할 수 있고, 예를 들어, 상이한 종류의 사이토카인을 발현하는 능력 또는 세포 독성을 유도하는 능력에 기초하여 그 기능을 확인할 수 있다. 용어 "B 세포"는 골수 및/또는 비장으로부터 유래된 면역 세포를 지칭한다. B 세포는 항체를 생산하는 형질세포로 발달할 수 있다. 용어 "T 세포"는 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 비롯한 다양한 세포-매개성 면역 반응에 참여하는 흉선-유래 면역 세포를 지칭한다. Tconv 또는 Teff로도 알려진 종래의 T 세포는 하나 이상의 T 세포 수용체의 발현에 의해 면역 반응을 증가시키기 위해 효과기 기능(예를 들어, 사이토카인 분비, 세포독성 활성, 항-자기-인식 등)을 갖는다. Tconv 또는 Teff는 일반적으로 Treg가 아닌 임의의 T 세포 집단으로 정의되며, 예를 들어, 미경험 T 세포, 활성화된 T 세포, 메모리 T 세포, 휴지(resting) Tconv 또는 예를 들어, Th1 또는 Th2 계통으로 분화된 Tconv를 포함한다. 일부 실시형태에서, Teff는 비-조절성 T 세포(Treg)의 서브세트이다. 일부 실시형태에서, Teff는 CD4+ Teff 또는 CD8+ Teff, 예컨대, CD4+ 헬퍼 T 림프구(예를 들어, Th0, Th1, Tfh 또는 Th17) 및 CD8+ 세포독성 T 세포(림프구)이다. 본 명세서에서 더 기재되는 바와 같이, 세포독성 T 세포는 CD8+ T 림프구이다. "미경험 Tconv(naive Tconv)"는 골수에서 분화된 CD4+　T 세포이며, 흉선에서 양성 및 음성 과정을 연속적으로 겪었지만 아직 항원 노출에 의해 활성화되지 않았다. 미경험 Tconv는 일반적으로 L-셀렉틴(CD62L)의 표면 발현, CD25, CD44 또는 CD69와 같은 활성화 마커의 부재 및 CD45RO과 같은 메모리 마커의 부재를 특징으로 한다. 미경험 Tconv는 따라서 휴지 상태(quiescent)이고 분열되지 않으며, 항상성 생존을 위해 인터류킨-7(IL-7) 및 인터류킨-15(IL-15)이 필요하다(적어도 WO 2010/101870 참조). 이러한 세포의 존재 및 활성은 면역 반응을 억제하는 맥락에서 바람직하지 않다. Treg와 달리, Tconv는 무력성이 아니며, 항원-기반 T 세포 수용체 활성화에 반응하여 증식할 수 있다(문헌[Lechler et al. (2001) Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 356:625-637]). 종양에서, 탈진된(exhausted) 세포는 무력성의 특징을 나타낼 수 있다.
용어 "면역 장애"는 암, 만성 염증성 질환 및 장애(예를 들어, 크론병, 염증성 장 질환, 반응성 관절염 및 라임병을 포함), 인슐린-의존성 당뇨병, 장기 특이적 자가면역(예를 들어, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 자가면역 포도막염 및 그레이브병 포함), 접촉성 피부염, 건선, 이식 거부, 이식편 대 숙주병, 유육종증, 아토피 병태(예를 들어, 천식 및 알레르기성 비염 및 위장 알레르기, 예컨대, 음식 알레르기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 알레르기를 포함), 호산구 증가증, 결막염, 사구체 신염, 전신 홍반성 루프스, 경피증, 기생충(예를 들어, 리슈만편모충증을 포함) 및 소정의 바이러스 감염(예를 들어, HIV 및 세균 감염, 예컨대, 결핵 및 나종형 나병을 포함) 및 말라리아와 같은 소정의 병원체 감수성을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 면역 질환, 병태 및 소인을 포함한다.
용어 "면역 반응"은 제한 없이 체내에 자연적으로 존재하는 물질(예를 들어, 자가-항원에 대한 자가면역) 또는 형질전환된(예를 들어, 암) 세포에 대한 방어 반응을 포함하는, 신체가 박테리아, 바이러스 및 병원균과 같은 "외부물질"뿐만 아니라 반드시 신체 외부에서 유래하지 않을 수 있는 표적에 대해 발생시키는 방어 반응을 의미한다. 특히 면역 반응은 면역 체계 세포(예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 및 호중구)의 활성화 및/또는 작용이며, 임의의 이러한 세포 또는 간(항체(체액 반응), 사이토카인 및 보체를 포함)에서 생성된 가용성 거대 분자는 침입 병원균, 병원균에 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상적인 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우, 정상적인 인간 세포 또는 조직의 척추동물의 신체로부터 선택적 표적화, 결합, 손상, 파괴 및/또는 제거를 초래한다. 항암 면역 반응은 신체가 비정상적인 종양 세포를 인식하고, 위험한 암세포를 제거하기 위해 선천성 및 후천성 면역 체계를 개시하는 면역 감시 메커니즘을 지칭한다.
용어 "면역조절인자"는 면역 반응을 조절하는 물질, 작용제, 신호전달 경로 또는 이의 성분을 지칭한다. 면역 반응과 관련하여 용어 "조절하는(regulating)", "변형하는(modifying)" 또는 "조절하는(modulating)"은 면역 체계의 세포 또는 이러한 세포의 활성의 임의의 변경을 지칭한다. 이러한 조절은 다양한 세포 유형의 수의 증가 또는 감소, 이러한 세포 활성의 증가 또는 감소 또는 면역 체계 내에서 발생할 수 있는 임의의 기타 변화에 의해 나타날 수 있는 면역 체계(또는 이의 고유한 부분)의 자극 또는 억제를 포함한다. 저해성 및 자극성 면역조절인자 모두 확인되었으며, 그 중 일부는 암 미세환경에서 기능이 향상되었을 수 있다.
용어 "면역치료제"는 대상체에서 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 숙주 면역 체계를 자극할 수 있는 임의의 분자, 펩타이드, 항체 또는 기타 작용제를 포함할 수 있다. 다양한 면역치료제가 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용하다.
용어 "저해하다(inhibit)" 또는 "하향조절하다(downregulate)"는 예를 들어, 특정 작용, 기능 또는 상호작용의 감소, 제한 또는 차단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암의 적어도 하나의 증상이 완화, 종결, 감속 또는 예방되는 경우, 암은 "저해된다". 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 암의 재발 또는 전이가 감소, 감속, 지연 또는 예방되는 경우, 암은 또한 "저해된다". 유사하게는, 단백질의 기능과 같은 생물학적 기능은 참조 상태, 예컨대, 야생형 상태와 같은 대조군과 비교하여 감소되는 경우 저해된다. 이러한 저해 또는 결핍은 특정 시간 및/또는 장소에의 작용제의 적용에 의해서와 같이 유도될 수 있거나, 또는 유전 가능한 돌연변이에 의해서와 같이 구성적일 수 있다. 이러한 저해 또는 결핍은 또한 부분적이거나 완전(예를 들어, 참조 상태, 예컨대, 야생형 상태와 같은 대조군과 비교하여 본질적으로 측정 가능한 활성이 없음)할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본질적으로 완전한 저해 또는 결핍은 차단이라고 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어는 주어진 생산량 또는 매개변수의 수준을 상응하는 대조군에서의 양보다 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이하의 양(예를 들어, 배경 염색, 바이오마커 신호전달, 바이오마커 면역저해성 기능 등)으로 줄이는 것을 지칭한다. 주어진 생산량 또는 매개변수의 감소된 수준은 생산량 또는 매개변수의 절대적인 부재를 의미할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 본 발명은 생산량 또는 매개변수를 완전히 제거하는 방법을 요구하지 않으며, 이로 제한되지 않는다. 주어진 생산량 또는 매개변수는 본 명세서 및 실시예에서 논의된 바와 같이 면역조직화학, 분자생물학, 세포생물학, 임상 및 생화학적 검정을 제한 없이 포함하는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 용어 "촉진하다(promote)" 또는 "상향조절하다(upregulate)"는 반대의 의미를 갖는다.
용어 "저해성 신호"는 면역 세포 상의 폴리펩타이드에 대한 저해성 수용체(예를 들어, CTLA4, PD-1 등)를 통해 전달되는 신호를 지칭한다. 이러한 신호는 활성화 수용체를 통해(예를 들어, TCR, CD3, BCR, TMIGD2, 또는 Fc 폴리펩타이드를 통해) 신호를 길항하고, 예를 들어, 2차 메신저 생성의 저해; 증식의 저해; 면역 세포에서 효과기 기능의 저해, 예를 들어, 감소된 식균작용, 감소된 항체 생성, 감소된 세포 세포독성, 면역 세포의 매개체(예컨대, 사이토카인(예를 들어, IL-2) 및/또는 알레르기 반응의 매개체) 생성의 실패; 또는 무력성의 발달을 초래할 수 있다.
"선천성 면역 체계"는 다른 유기체에 의한 감염으로부터 숙주를 방어하는 세포(예를 들어, 자연 살해 세포, 비만 세포, 호산구, 호염구; 및 대식세포, 호중구 및 수지상 세포를 포함하는 포식세포) 및 메커니즘을 포함하는 비-특이적 면역 체계이다. 선천성 면역 반응은 사이토카인의 생성, 활성 보체 캐스케이드 및 후천성 면역 반응을 개시할 수 있다. 후천성 면역 체계는 항원 제시 세포에 의한 항원 제시와 같이 고도로 전문화된 전신 세포 활성화 및 과정; 항원 특이적 T 세포 활성화 및 세포독성 효과에 필요하며 이에 관여하는 특유의 면역 체계이다.
두 분자 사이의 상호작용을 지칭할 때, 용어 "상호작용"은 분자가 서로 물리적 접촉(예를 들어, 결합)하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 이러한 상호작용은 상기 분자 중 하나 또는 둘 모두의 활성(생물학적 효과를 생성함)을 초래한다. 활성은 분자 중 하나 또는 둘 모두의 직접적인 활성(예를 들어, 신호 전달)일 수 있다. 대안적으로, 상호 작용에 있는 하나 또는 두 분자는 들의 리간드에 결합하는 것을 방지할 수 있고, 따라서 리간드 결합 활성(예를 들어, 리간드에 결합하고, 공동자극을 촉발하거나 저해함)과 관련하여 불활성으로 유지될 수 있다. 이러한 상호작용을 저해하는 것은 상호작용에 관여하는 하나 이상의 분자의 활성을 간섭하는 결과를 초래한다. 이러한 상호작용을 향상시키는 것은 상기 신체 접촉의 가능성을 연장 또는 증가시키고, 상기 활성의 가능성을 연장 또는 증가시키는 것이다.
"단리된 단백질"은 세포로부터 단리되거나 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 때 다른 단백질, 세포 물질, 분리 배지 및 배양 배지 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 단백질을 지칭한다. "단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질이 유래되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 표현 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 단백질이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 분리되는 바이오마커 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 제제를 포함한다. 일 실시형태에서, 표현 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 약 30%(건조 중량) 미만의 비-바이오마커 단백질(본 명세서에서 "오염 단백질"이라고도 칭함), 더욱 바람직하게는 약 20% 미만의 비-바이오마커 단백질, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 10% 미만의 비-바이오마커 단백질, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 비-바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 단백질 또는 이의 단편의 제제를 포함한다. 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질 또는 이들의 단편, 예를 들어, 이들의 생물학적으로 활성인 단편이 재조합적으로 생산될 때, 이는 또한 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 없다, 즉, 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만을 나타낸다.
용어 "동형(isotype)"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 클래스(예를 들어, IgM, IgG1, IgG2C 등)를 지칭한다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명에 개시된 항체의 결합 친화성은 표준 항체-항원 검정, 예를 들어, 경쟁적 검정, 포화 검정 또는 표준 면역검정, 예컨대, ELISA 또는 RIA에 의해 측정 또는 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 바이오마커, 예컨대, 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커에 대한 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD는 약 0.002nM 내지 약 200nM일 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 친화성은 약 250nM, 200nM, 약 100nM, 약 50nM, 약 45nM, 약 40nM, 약 35nM, 약 30nM, 약 25nM, 약 20nM, 약 15nM, 약 10nM, 약 8nM, 약 7.5nM, 약 7nM, 약 6.5nM, 약 6nM, 약 5.5nM, 약 5nM, 약 4nM, 약 3nM, 약 2nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 20pM, 약 15pM, 약 10pM, 약 5pM, 약 2pM 이하 중 임의의 것이다. 일부 실시형태에서, 결합 친화성은 약 250nM, 약 200nM, 약 100nM, 약 50nM, 약 30nM, 약 20nM, 약 10nM, 약 7.5nM, 약 7nM, 약 6.5nM, 약 6nM, 약 5nM, 약 4.5nM, 약 4nM, 약 3.5nM, 약 3nM, 약 2.5nM, 약 2nM, 약 1.5nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 약 50pM, 약 20pM, 약 10pM, 약 5pM, 또는 약 2pM 이하 또는 약 5nM 내지 약 35nM와 같은 그 사이의 임의의 범위 미만이다.
용어 "kd" 또는 "koff"는 복합체로부터 항체의 해리에 대한 오프-레이트 상수(off rate constant)를 지칭한다. kd의 값은 초당 붕괴 또는 해리되는 복합체의 비를 숫자로 나타낸 것으로, sec-1의 단위로 표시된다.
용어 "ka" 또는 "kon"은 항체와 항원의 회합에 대한 온-레이트 상수(on-rate constant)를 지칭한다. ka의 값은 항체 및 항원의 1몰(1M) 용액에서 초당 형성되는 항체/항원 복합체의 수를 숫자로 나타낸 것으로, M-1sec-1의 단위로 표시된다.
용어 "미세환경"은 일반적으로 관심 조직 영역에서 국재화된 영역을 지칭하며, 예를 들어, "종양 미세환경"을 지칭할 수 있다. 용어 "종양 미세환경" 또는 "TME"는 종양 세포와 그 환경 간의 상호간섭(cross-talk)을 가능하게 하는데 도움이 되는 종양 세포와 지속적으로 상호작용하는 주변 미세환경을 지칭한다. 종양 미세환경은 종양의 세포 환경, 주변 혈관, 면역 세포, 섬유모세포, 골수 유래 염증성 세포, 림프구, 신호전달 분자 및 세포외 매트릭스를 포함할 수 있다. 종양 환경은 성장 및 생존을 보장하기 위해 종양 미세환경의 도움을 받고 이에 영향을 받는 종양 세포 또는 악성 세포를 포함할 수 있다. 종양 미세환경은 또한 항종양 면역 반응을 자극하거나 저해할 수 있는 림프성 및 골수성 세포와 같은 종양-침윤 면역 세포 및 기질 세포, 예컨대, 종양-관련 섬유모세포 및 종양의 구조적 온전성에 기여하는 내피 세포를 포함할 수 있다. 기질 세포는 구조적 온전성에 기여하는 세포(섬유모세포)인 내피 세포 및 혈관주위세포와 같은 종양-관련 혈관을 구성하는 세포뿐만 아니라 단핵구, 호중구(PMN), 수지상 세포(DC), T 세포 및 B 세포, 비만 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 종양-관련 대식세포(TAM) 및 침윤 면역 세포를 포함한다. 기질 세포는 종양 세포질의 대부분을 구성하는 반면, 고형 종양에서 우세한 세포 유형은 대식세포이다.
용어 "조절하는" 및 이의 문법적 동등어는 증가 또는 감소(예를 들어, 침묵), 즉 상향조절 또는 하향조절을 지칭한다.
바이오마커 발현의 "정상적인" 수준은 대상체, 예를 들어, 암을 앓고 있지 않은 인간 환자의 세포에서의 바이오마커의 발현 수준이다.
바이오마커의 "과-발현" 또는 "현저하게 높은 수준의 발현"은 발현을 평가하기 위해 사용된 검정의 표준 오차보다 더 큰 테스트 샘플에서의 발현 수준을 지칭하며, 대조군 샘플(예를 들어, 바이오마커 관련 질환이 없는 건강한 대상체로부터의 샘플)에서의 바이오마커의 발현 활성 또는 수준 및 바람직하게는, 여러 대조군 샘플에서의 바이오마커의 평균 발현 수준보다 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 10.5배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배 이상 더 높다. 바이오마커의 "현저하게 낮은 수준의 발현"은 대조군 샘플(예를 들어, 바이오마커 관련 질환이 없는 건강한 대상체로부터의 샘플)에서의 바이오마커의 발현 수준 및 바람직하게는, 여러 대조군 샘플에서의 바이오마커의 평균 발현 수준보다 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 10.5배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배 이상 더 낮은 테스트 샘플에서의 발현 수준을 지칭한다.
이러한 "유의성" 수준은 또한 발현, 저해, 세포 독성, 세포 성장 등과 같은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 측정된 매개변수에 적용될 수 있다.
용어 "말초 혈액 세포 아형"은 호산구, 호중구, T 세포, 단핵구, 대식세포, NK 세포, 과립구 및 B 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 말초 혈액에서 일반적으로 발견되는 세포 유형을 지칭한다.
참조 폴리펩타이드와 관련하여 사용될 때 용어 "폴리펩타이드 단편" 또는 "단편"은 참조 폴리펩타이드 자체와 비교하여 아미노산 잔기가 결실되지만, 나머지 아미노산 서열은 일반적으로 참조 폴리펩타이드의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 결실은 참조 폴리펩타이드의 아미노-말단, 내부에서 또는 카복실-말단에서 또는 대안적으로 둘 다에서 발생할 수 있다. 단편은 전형적으로 적어도 2개, 6개, 8개 또는 10개의 아미노산 길이, 적어도 14개의 아미노산 길이, 적어도 20개, 30개, 40개 또는 50개의 아미노산 길이, 적어도 75개의 아미노산 길이 또는 적어도 100개, 150개, 200개, 300개, 500개 이상의 아미노산 길이이다. 이들은 전장 폴리펩타이드의 길이보다 짧은 한, 예를 들어, 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 120개, 140개, 160개, 180개, 200개, 220개, 240개, 260개, 280개, 300개, 320개, 340개, 360개, 380개, 400개, 420개, 440개, 460개, 480개, 500개, 520개, 540개, 560개, 580개, 600개, 620개, 640개, 660개, 680개, 700개, 720개, 740개, 760개, 780개, 800개, 820개, 840개, 860개, 880개, 900개, 920개, 940개, 960개, 980개, 1000개, 1020개, 1040개, 1060개, 1080개, 1100개, 1120개, 1140개, 1160개, 1180개, 1200개, 1220개, 1240개, 1260개, 1280개, 1300개, 1320개, 1340개 이상이고/이거나 이를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들은 전장 폴리펩타이드의 길이보다 짧은 한 그러한 범위보다 길지 않고/않거나 이는 제외될 수 있다.
용어 "미리 결정된" 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 단지 예로서, 특정 치료를 위해 선택될 수 있는 대상체를 평가, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 하나 이상의 조절인자와 같은 치료에 대한 반응을 평가 및/또는 질환 상태를 평가하기 위해 사용되는 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)일 수 있다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 암이 있거나 없는 환자와 같은 환자의 집단에서 결정될 수 있다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 모든 환자에게 동일하게 적용 가능한 단일 숫자일 수 있거나, 또는 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 환자의 특정 하위집단에 따라 달라질 수 있다. 대상체의 연령, 체중, 키 및 기타 요인은 개체의 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성은 각각의 대상체에 대해 개별적으로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정되고/되거나 비교된 양은 절대적 측정값에 기초한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정되고/되거나 비교된 양은 상대적 측정값, 예컨대, 비(예를 들어, 하우스키핑 또는 그렇지 않으면 일반적으로 일정한 바이오마커의 발현에 대해 정규화된 세포 비 또는 혈청 바이오마커)에 기초한다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 임의의 적합한 표준일 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 환자 선택이 평가될 동일하거나 상이한 인간으로부터 얻어질 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 동일한 환자의 이전의 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식으로, 환자의 선택의 진행은 시간이 지남에 따라 모니터링될 수 있다. 또한, 대조군은 다른 인간 또는 여러 인간, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 선택된 인간의 그룹의 평가로부터 수득될 수 있다. 이러한 방식으로, 선택이 평가될 인간의 선택의 범위는 적합한 다른 인간, 예를 들어, 유사하거나 동일한 병태(들)로 고통받고 있는 인간 및/또는 동일한 인종 그룹의 인간과 같은 관심 인간과 유사한 상황에 놓인 다른 인간과 비교될 수 있다.
용어 "예측적"은 목적하는 바의 가능성을 결정하기 위해 요법 이전, 도중 또는 이후에 바이오마커 핵산 및/또는 단백질 상태, 예를 들어, 종양의 과다-활성 또는 과소(under)-활성, 출현, 발현, 성장, 관해, 재발 또는 저항성의 사용을 포함한다. 바이오마커의 이러한 예측적 사용은 예를 들어, (1) 예를 들어, 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상의 검정된 인간 암 유형 또는 암 샘플에서, 증가된 또는 감소된 카피 수(예를 들어, FISH, FISH와 SKY, 단일-분자 시퀀싱, 예를 들어, 적어도 문헌[J. Biotechnol., 86:289-301]에 기재된 바와 같은 것 또는 qPCR에 의해), 바이오마커 핵산의 과발현 또는 과소발현(예를 들어, ISH, 노던 블롯 또는 qPCR에 의해), 증가된 또는 감소된 바이오마커 단백질(예를 들어, IHC에 의해), 또는 증가된 또는 감소된 활성; (2) 생물학적 샘플, 예를 들어, 대상체, 예를 들어, 암을 앓고 있는 인간으로부터의 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 구강 채취물, 침, 뇌척수액, 소변, 대변 또는 골수를 함유하는 샘플에서의 절대적 또는 상대적으로 조절된 존재 또는 부재; (3) 암을 가진 환자의 임상적 서브세트(예를 들어, T-세포 매개성 세포 독성의 특정 조절인자 단독 또는 면역요법과의 조합에 반응하는 환자 또는 이에 대한 저항성을 발달시키는 환자)에서 절대적 또는 상대적으로 조절된 존재 또는 부재에 의해 확인될 수 있다.
용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 등은 질환, 장애 또는 병태를 갖고 있지 않지만, 이의 위험이 있거나 이의 발병에 취약한 대상체에서 질환, 장애 또는 병태가 발생할 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다.
용어 "프로브"는 특별히 의도된 표적 분자, 예를 들어, 바이오마커 핵산에 의해 암호화되거나 또는 이에 상응하는 뉴클레오타이드 전사체 또는 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당업자에 의해 합성되거나 또는 적절한 생물학적 제제로부터 유도될 수 있다. 표적 분자의 검출을 위해, 프로브는 본 명세서에 기재된 바와 같이 표지되도록 특별히 설계될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "예후예측"은 암의 예상 경과 및 결과 또는 질환으로부터의 회복 가능성에 대한 예측을 포함한다. 일부 실시형태에서, 통계학적 알고리즘의 사용은 개체에서 암의 예후예측을 제공한다. 예를 들어, 예후예측은 수술, 임상적 하위유형의 암(예를 들어, 폐암, 흑색종 및 신세포 암종과 같은 고형 종양)의 발병, 하나 이상의 임상적 인자의 발생, 장암의 발생 또는 질환으로부터의 회복일 수 있다.
용어 "비(ratio)"는 두 숫자(예를 들어, 점수, 합산 등) 사이의 관계를 지칭한다. 비록, 비는 특정 순서(예를 들어, a 대 b 또는 a:b)로 표현될 수 있지만, 당업자는 비에 기초한 경향의 관찰 및 상관관계가 역전될 수 있지만, 기본 관계의 중요성을 읽지 않고 숫자 사이의 기본 관계가 임의의 순서로 표현될 수 있음을 인식할 것이다.
용어 "재배열된(rearranged)"은 V 분절이 각각 본질적으로 완전한 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 형태에서 D-J 또는 J 분절에 바로 인접하여 위치하는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 배열을 지칭한다. 재배열된 면역글로불린 유전자의 유전자좌는 생식세포계열 DNA와 비교하여 확인될 수 있으며; 재배열된 유전자좌는 적어도 하나의 재조합된 7량체/9량체 상동성 요소를 가질 것이다. 대조적으로, V 분절과 관련하여 용어 "재배열되지 않은" 또는 "생식세포계열 배열"은 V 분절이 D 또는 J 분절에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 배열을 지칭한다.
용어 "수용체"는 일반적으로 표적 장기, 조직 또는 세포 유형의 세포 표면에 존재하는 자연 발생적 분자 또는 분자의 복합체를 지칭한다.
용어 "암 반응", "면역요법에 대한 반응" 또는 "T-세포 매개성 세포 독성의 조절인자/면역요법 병용 요법에 대한 반응"은 암 작용제, 예컨대, T-세포 매개성 세포 독성의 조절인자 및 면역요법에 대한 과증식성 장애(예를 들어, 암)의 임의의 반응, 바람직하게는 신보조제(neoadjuvant) 또는 보조제 요법의 개시 후 종양 질량 및/또는 부피의 변화에 관한 것이다. 용어 "신보조제 요법"은 1차 치료 이전에 제공되는 치료를 지칭한다. 신보조제 요법의 예는 화학요법, 방사선 요법 및 호르몬 요법을 포함할 수 있다. 과증식성 장애 반응은 예를 들어, 효능에 대해 또는 신보조제 또는 보조제 상황에서 평가될 수 있으며, 여기서 전신 개입 후 종양의 크기는 CT, PET, 유방 조영술, 초음파 또는 촉진으로 측정된 초기 크기 및 치수와 비교될 수 있다. 반응은 또한 생검 또는 수술적 절제 후 종양의 캘리퍼스 측정 또는 병리학적 검사로 평가될 수 있다. 반응은 종양 부피의 퍼센트 변화와 같은 정량적 방식, 또는 "병리학적 완전 반응"(pathological complete response: pCR), "임상적 완전 관해"(pathological complete response: cCR), "임상적 부분 관해"(임상적 partial remission: cPR), "임상적 안정 질환"(clinical stable disease: cSD), "임상적 진행성 질환"(clinical progressive disease: cPD) 또는 다른 정성적 기준과 같은 정성적 방식으로 기록될 수 있다. 과증식성 장애 반응의 평가는 신보조제 또는 보조제 요법의 개시 후 초기에, 예를 들어, 몇 시간, 며칠, 몇 수 또는 바람직하게는 몇 개월 후에 수행될 수 있다. 반응 평가에 대한 전형적 종점(endpoint)은 신보조제 화학요법의 종료시 또는 잔류 종양 세포 및/또는 종양 베드(bed)의 외과적 제거시이다. 이는 전형적으로 신보조제 요법 개시 후 3개월이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료적 치료의 임상적 효능은 임상적 이득률(clinical benefit rate: CBR)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 임상적 이득률은 요법의 종료로부터 적어도 3개월 시점에서 완전 관해(CR)에 있는 환자의 퍼센트, 부분적 관해(PR)에 있는 환자의 수 및 안정 질환(SD)을 갖는 환자의 수의 합계를 결정함으로써 측정된다. 이러한 공식의 약칭은 6개월에 걸쳐 CBR=CR+PR+SD이다. 일부 실시형태에서, 특정 암 치료적 양생법에 대한 CBR은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 이상이다. 암 요법에 대한 반응을 평가하기 위한 추가적인 기준은 다음을 모두 포함하는 "생존"과 관련이 있다: 전체 생존기간이라고도 알려져 있는 사망할 때까지의 생존기간(상기 사망률은 원인과 무관하거나 종양과 관련이 있을 수 있음); "무재발 생존기간"(용어 재발은 국소 재발 및 원격 재발을 모두 포함하여야 함); 무전이 생존기간; 무질환 생존기간(용어 질환은 암 및 이와 관련된 질환을 포함하여야 함). 상기 생존의 기간은 정의된 시작 시점(예를 들어, 진단 또는 치료 시작의 시점) 및 종료 시점(예를 들어, 사망, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산될 수 있다. 또한, 치료의 효능 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 가능성, 주어진 기간 내의 전이 가능성 및 종양 재발의 가능성을 포함하도록 확장될 수 있다. 예를 들어, 적절한 역치 값을 결정하기 위해, 특정 암 치료적 양생법이 대상체의 집단에 투여될 수 있고, 결과는 임의의 암 요법의 투여 전에 결정된 바이오마커 측정값과 관련이 있을 수 있다. 결과 측정값은 신보조제 환경(setting)에서 주어진 요법에 대한 병리적 반응일 수 있다. 대안적으로, 전체 생존기간 및 무질환 생존과 같은 결과 측정은 바이오마커 측정값이 알려진 암 요법 후 대상체에 대해 일정 기간 동안 모니터링될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 투여되는 용량은 암 치료제에 대해 당업계에 공지된 표준 용량이다. 대상체가 모니터링되는 기간은 다를 수 있다. 예를 들어, 대상체는 적어도 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 12개월, 14개월, 16개월, 18개월, 20개월, 25개월, 30개월, 35개월, 40개월, 45개월, 50개월, 55개월 또는 60개월 동안 모니터링될 수 있다. 암 요법의 결과와 관련된 바이오마커 측정 역치값은 실시예 부문에 기재된 것들과 같은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
나타낸 바와 같이, 용어는 첫 번째 이벤트로서 두 번째 원발성 암에 대한 첫 번째 재발 검열 또는 재발의 증거가 없는 사망에 대한 기간인 재발까지의 시간의 증가, 또는 치료에서 임의의 원인으로 인한 사망까지의 기간인 전체 생존기간의 증가에 의해 반영되는 바와 같은 개선된 예후 예측을 지칭할 수 있다. 반응하거나 반응한다는 것은 자극에 노출되었을 때 얻을 수 있는 유익한 종말점이 있다는 것을 의미한다. 대안적으로, 자극에 노출되면 나쁜 또는 해로운 증상이 최소화, 완화 또는 약화된다. 종양 또는 대상체가 유리한 반응을 보일 가능성을 평가하는 것은 종양 또는 대상체가 유리한 반응을 나타내지 않을(즉, 반응의 결여를 나타내거나 무반응성일 수 있음) 가능성을 평가하는 것과 동일하다는 것이 이해될 것이다.
용어 "저항성(resistance)"은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상, 예컨대, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배 이상 또는 그 사이의 임의의 범위까지로 치료적 치료에 대해 감소된 반응을 갖는 것과 같이, 암 샘플 또는 포유동물이 암 요법에 대해 획득한 저항성 또는 천연의 저항성(즉, 치료적 치료에 대해 반응하지 않거나 또는 반응이 감소되거나 제한됨)을 지칭한다. 반응의 감소는 저항성이 획득되기 전에 동일한 암 샘플 또는 포유동물과 비교함으로써, 또는 다른 암 샘플 또는 치료적 치료에 대한 저항성이 없는 것으로 알려진 포유동물과 비교함으로써 측정될 수 있다. 화학요법에 대한 전형적인 후천적 저항성은 "다중약물 저항성(multidrug resistance)"이라 한다. 다중약물 저항성은 P-당단백질에 의해 매개될 수 있거나, 또는 다른 메커니즘에 의해 매개될 수 있거나, 또는 포유동물이 다중-약물-저항성 미생물 또는 미생물의 조합에 감염될 때 발생할 수 있다. 치료적 치료에 대한 저항성의 결정은 예를 들어, "감작시키는(sensitizing)" 것으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 증식성 검정 및 세포 사멸 검정에 의해 측정될 수 있는 당업계에서 일상적이며 통상적으로 숙련된 임상의의 기술 내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 용어 "역 저항성(reverses resistance)"은 1차 암 요법(예를 들어, 화학요법 또는 방사선 요법)만으로는 치료되지 않은 종양 부피와 비교하여 종양 부피의 통계학적으로 유의한 감소를 생성할 수 없는 상황에서 치료되지 않은 종양의 종양 부피와 비교할 때, 1차 암 요법(예를 들어, 화학요법 또는 방사선 요법)과 조합된 제2 작용제의 사용이 통계학적 유의성의 수준(예를 들어, p<0.05)으로 종양 부피의 유의한 감소를 생성할 수 있음을 의미한다. 이는 일반적으로 치료되지 않은 종양이 리드미컬하게 로그 성장할 때 시점에서 만들어진 종양 부피 측정값에 적용된다.
적어도 하나의 바이오마커의 존재 또는 수준을 검출하거나 결정하기 위해 사용되는 용어 "샘플"은 전형적으로 뇌 조직, 뇌척수액, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 소변, 대변(예를 들어, 대변), 눈물 및 임의의 다른 체액(예를 들어, "체액"의 정의하에서 위에 기재된 바와 같음) 또는 조직 샘플(예를 들어, 생검) 예컨대, 소장, 결장 샘플 또는 외과적 절제 조직이다. 소정의 예에서, 본 발명에 포함되는 방법은 샘플에서 적어도 하나의 마커의 존재 또는 수준을 검출 또는 결정하기 전에 개체로부터 샘플을 수득하는 단계를 더 포함한다.
용어 "감작시키다"는 암 요법(예를 들어, 항-면역관문, 화학요법 및/또는 방사선 요법)으로 관련된 암의 보다 효과적인 치료를 가능하게 하는 방식으로 암세포 또는 종양 세포를 변경하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 정상 세포는 요법에 의해 정상 세포가 과도하게 손상될 정도로 영향을 받지 않는다. 치료적 치료에 대해 증가된 감수성 또는 감소된 감수성은 세포 증식성 검정(문헌[Tanigawa et al. (1982) 암 Res. 42:2159-2164]) 및 세포 사멸 검정(문헌[Weisenthal et al. (1984) Cancer Res. 94:161-173; Weisenthal et al. (1985) Cancer Treat Rep. 69:615-632; Weisenthal et al., In: Kaspers G J L, Pieters R, Twentyman P R, Weisenthal L M, Veerman A J P, eds. Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers, 1993:415-432; Weisenthal (1994) Contrib. Gynecol. Obstet. 19:82-90])을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 아래의 본 명세서에 기재된 특정 치료 및 방법에 대한 당업계에 공지된 방법에 따라 측정된다. 감수성 또는 저항성은 또한 일정 기간, 예를 들어, 인간의 경우 6개월 및 마우스의 경우 4 내지 6주에 걸쳐 종양 크기 감소를 측정함으로써 동물에서 측정될 수 있다. 치료 감수성의 증가 또는 저항성의 감소가 이러한 조성물 또는 방법의 부재하에서 치료 감수성 또는 저항성에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상, 예컨대, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배 또는 그 이상 또는 그 사이를 포함하는 임의의 범위인 경우, 조성물 또는 방법은 치료적 치료에 대한 반응을 감작시킨다. 치료적 치료에 대한 감수성 또는 저항성의 결정은 당업계에서 일상적이며, 통상적으로 숙련된 임상의의 기술 내에서 이루어진다. 암 요법의 효능을 향상시키기 위한 본 명세서에 기재된 임의의 방법은 암 요법에 대해 과증식성 또는 그렇지 않으면 암성인 세포(예를 들어, 저항성 세포)를 감작시키는 방법에 동일하게 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
생물학적으로 활성인 작용제에 적용되는 용어 "선택적 조절인자" 또는 "선택적으로 조절하다"는 직접 표적을 통해 또는 표적과의 상호작용을 통해 표적외 세포 집단, 신호전달 활성 등과 비교하여 세포 집단, 신호전달 활성 등과 같은 표적을 조절하는 작용제의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 단백질과 다른 결합 파트너 사이의 다른 상호작용에 비해 단백질과 하나의 천연의 결합 파트너 사이의 상호작용 및/또는 관심 세포 집단에 대한 이러한 상호작용(들)을 선택적으로 작용하는 작용제는 상호작용을 적어도 하나의 다른 결합 파트너에 대해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 2×(배), 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 15×, 20×, 25×, 30×, 35×, 40×, 45×, 50×, 55×, 60×, 65×, 70×, 75×, 80×, 85×, 90×, 95×, 100×, 105×, 110×, 120×, 125×, 150×, 200×, 250×, 300×, 350×, 400×, 450×, 500×, 600×, 700×, 800×, 900×, 1000×, 1500×, 2000×, 2500×, 3000×, 3500×, 4000×, 4500×, 5000×, 5500×, 6000×, 6500×, 7000×, 7500×, 8000×, 8500×, 9000×, 9500×, 10000× 이상 또는 그 사이의 임의의 범위까지로 저해한다. 이러한 메트릭스는 전형적으로 상호작용/활성을 절반으로 감소시키는데 필요한 작용제의 상대적인 양의 관점에서 표현된다. 이러한 메트릭스는 핵산 분자를 하나 이상의 표적 서열에 결합하는 것과 같은 다른 선택성 배열에 적용한다.
보다 일반적으로, 용어 "선택적"은 우선적 작용 또는 기능을 지칭한다. 용어 "선택적"은 다른 표적과 비교하여 특정 관심 표적에서의 우선적 효과의 관점에서 정량화될 수 있다. 예를 들어, 측정된 변수(예를 들어, 목적하는 세포 대 다른 세포에서 바이오마커 발현의 조절, 목적하는 세포 대 다른 세포의 농축 및/또는 결실 등)는 관심 표적 대 의도하지 않거나 원하지 않는 표적에 있어서 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 1-배, 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배, 3.5-배, 4-배, 4.5-배, 5-배, 5.5-배, 6-배, 6.5-배, 7-배, 7.5-배, 8-배, 8.5-배, 9-배, 9.5-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 17-배, 18-배, 19-배, 20-배, 25-배, 30-배, 35-배, 40-배, 45-배, 50-배, 55-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배 이상, 또는 그 사이를 포함하는 임의의 범위(예를 들어, 50% 내지 16-배)로 상이하다. 동일한 배수 분석이 주어진 조직, 세포 집단, 측정된 변수 및/또는 측정된 효과 등에서의 효과의 크기, 예컨대, 세포 비, 과증식성 세포 성장률 또는 부피, 세포 증식률 등 세포 수 등을 확인하는데 사용될 수 있다.
대조적으로, 용어 "특이적"은 배타적인(exclusionary) 작용 또는 기능을 지칭한다. 예를 들어, 단백질과 하나의 결합 파트너 간의 상호작용의 특이적 조절은 그 상호작용의 배타적인 조절을 지칭하며, 단백질과 다른 결합 파트너 간의 상호작용의 임의의 현저한 조절을 지칭하지 않는다. 다른 예에서, 미리 결정된 항원에 대한 항체의 특이적 결합은 다른 항원에 결합하지 않고 관심 항원에 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 관심 항원을 분석물로 사용하고 항체를 리간드로 사용하여 BIACORE® 검정 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 사용하는 것과 같은 적절한 검정을 사용하여 결정되었을 때, 대략 1×10-7M 미만, 예컨대, 대략 10-8M 미만, 10-9M 미만, 10-10M 미만, 10-11M 미만 또는 그보다 낮은 친화성(KD)으로 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본 명세서에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
교차-반응을 결정하는 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, 유세포 분석 등을 사용하는 것과 같은 본 명세서에 기재된 표준 결합 검정을 포함한다.
용어 "소분자"는 당업계의 용어이며, 약 1000 분자량 미만 또는 약 500 분자량 미만인 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 소분자는 펩타이드 결합만을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 소분자는 올리고머가 아니다. 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 예시적 소분자 화합물은 펩타이드, 펩타이도모방체, 핵산, 탄수화물, 작은 유기 분자(예를 들어, 폴리케타이드)(문헌[Cane et al. (1998) Science 282:63]) 및 천연물 추출 라이브러리를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 화합물은 작은 유기 비-펩타이드성 화합물이다. 용어는 달리 명시되지 않는 한, 관심 화학 구조의 모든 입체이성질체, 기하이성질체, 호변이성질체 및 동위원소를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "대상체"는 동물, 척추동물, 포유동물 또는 인간을 지칭하며, 특히 그 중 하나에 예를 들어, 실험적, 진단적 및/또는 치료적 목적을 위해 작용제가 투여되거나, 또는 샘플이 투여되거나, 또는 절차가 수행된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말) 또는 다른 동물, 예컨대, 라마 및 낙타이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 가진 인간 대상체이다. 용어 "대상체"는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "생존"은 다음을 모두 포함한다: 전체 생존기간이라고도 알려져 있는 사망할 때까지의 생존기간(상기 사망률은 원인과 무관하거나 종양과 관련이 있을 수 있음); "무재발 생존기간"(용어 재발은 국소 재발 및 원격 재발을 모두 포함하여야 함); 무전이 생존기간; 무질환 생존기간(용어 질환은 암 및 이와 관련된 질환을 포함하여야 함). 상기 생존의 기간은 정의된 시작 시점(예를 들어, 진단 또는 치료 시작의 시점) 및 종료 시점(예를 들어, 사망, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산될 수 있다. 또한, 치료의 효능 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 가능성, 주어진 기간 내의 전이 가능성 및 종양 재발의 가능성을 포함하도록 확장될 수 있다.
용어 "시너지 효과"는 단독의 암 작용제/요법의 개별 효과의 합보다 큰 2개 이상의 작용제(예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 조절인자 및 면역요법 병용 요법)의 조합된 효과를 지칭한다.
용어 "표적"은 본 명세서에 기재된 작용제, 조성물 및/또는 제형에 의해 조절, 저해 또는 침묵되는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 표적 유전자 또는 유전자 산물은 야생형 및 돌연변이체 형태를 포함한다. 본 발명에 포함되는 표적의 비-제한적인, 대표적인 리스트는 표 1에 제공된다. 유사하게는, 동사로 사용되는 용어 "표적", "표적들" 또는 "표적화" 표적 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 조절하는 것을 지칭한다. 표적화는 표적 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 상향조절 또는 하향조절하는 것을 지칭할 수 있다.
용어 "치료적 효과"는 약리학적으로 활성인 물질에 의해 유발되는 동물, 특히 포유동물 및 보다 특히 인간에서의 국소적 또는 전신적 효과를 포함한다. 따라서, 용어는 질환의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방에 사용하거나 동물 또는 인간에서 바람직한 물리적 또는 정신적 발달 및 상태의 향상에 사용하기 위해 의도된 임의의 물질을 의미한다. 용어에 포함되는 예방적 효과는 질환 또는 병태의 출현을 지연 또는 제거, 질환 또는 병태의 증상의 개시를 지연 또는 제거, 질환 또는 병태의 진행을 감속, 중단 또는 역전시키는 것 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
용어 작용제(이러한 작용제를 포함하는 조성물 및/또는 제형을 포함)의 "유효량" 또는 "효과적인 용량"은 예를 들어, 선택된 투여 형태, 경로 및/또는 스케줄에 따라 세포 또는 유기체에 전달될 때, 목적하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 달성하기에 충분한 양을 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 효과적인 특정 작용제 또는 조성물의 절대량은 목적하는 생물학적 또는 약리학적 종말점, 전달될 작용제, 표적 조직 등과 같은 이러한 인자에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 "유효량"이 다양한 실시형태에서 단일 용량으로 또는 다중 용량의 사용을 통해 세포와 접촉되거나 대상체에게 투여될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 용어 "유효량"은 "치료적 유효량"일 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험비로 동물에서 세포의 적어도 하위집단에서 일부 목적하는 치료 효과를 생성하는데 효과적인 작용제의 양을 지칭한다. 대상 화합물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양물 또는 실험적 동물에서 예를 들어, LD50 및 ED50을 결정하기 위한 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 일부 실시형태에서, LD50(치명적 투여량)이 측정될 수 있으며, 작용제를 투여하지 않은 것과 비교하여 작용제에 대해 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상 감소될 수 있다. 유사하게는, ED50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 농도)이 측정될 수 있으며, 작용제를 투여하지 않은 것과 비교하여 작용제에 대해, 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상 증가될 수 있다. 또한, 유사하게는, IC50(즉, 암세포에 대해 절반-최대 세포독성 또는 세포증식 억제 효과를 달성하는 농도)이 측정될 수 있으며, 작용제를 투여하지 않는 것과 비교하여 작용제에 대해, 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검정에서 암세포 성장은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 100%로 저해될 수 있다. 다른 실시형태에서, 고형 악성종양의 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 100%의 감소가 달성될 수 있다.
더욱 일반적으로, 용어 "EC50"은 시험관내 및/또는 생체내 검정에서 최대 반응과 기준선 반응 사이의 통로(hallway)와 같이 최대 반응의 50%인 반응을 유도하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 작용제의 농도를 지칭한다.
용어 "내성" 또는 "무반응성"은 예를 들어, 활성화 수용체 또는 사이토 카인을 통한 자극에 대한 세포, 예컨대, 면역 세포의 무반응성 상태(refractivity)를 포함한다. 예를 들어, 면역 억제제에 노출되거나 고용량 항원에 노출되어 무반응성이 발생할 수 있다. 몇 가지 독립적인 방법이 내성을 유발할 수 있다. 하나의 메커니즘은 "무력성"으로 지칭되며, 이는 세포가 효과기 기능을 갖는 세포로 분화하기보다는 무반응성 세포로 생체내에서 지속되는 상태로 정의된다. 이러한 무반응성 상태는 일반적으로 항원-특이적이며, 내성 항원에 대한 노출이 중단된 후에도 지속된다. 예를 들어, T 세포의 무력성은 사이토카인, 예를 들어, IL-2의 생산의 결핍을 특징으로 한다. T 세포 무력성은 T 세포가 항원에 노출되고, 제2 신호(공동자극성 신호)의 부재하에서 제1 신호(T 세포 수용체 또는 CD-3 매개성 신호)를 받을 때 발생한다. 이러한 조건하에서, 동일한 항원에 대한 세포의 재노출은(공동자극성 폴리펩타이드의 존재하에서 재노출이 발생하더라도) 사이토카인 생산 실패를 초래하므로, 증식에 실패한다. 그러나, 무력성 T 세포는 사이토카인(예를 들어, IL-2)과 함께 배양하면 증식할 수 있다. 예를 들어, ELISA에 의해 또는 지표 세포주를 사용하는 증식 검정에 의해 측정된 T 림프구에 의한 IL-2 생산의 결핍에 의해 T 세포 무력성이 또한 관찰될 수 있다. 대안적으로, 리포터 유전자 작제물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 무력성 T 세포는 5' IL-2 유전자 인핸서의 제어하에서 이종성 프로모터 또는 인핸서 내에서 발견될 수 있는 AP1 서열의 다량체에 의해 유도된 IL-2 유전자의 전사를 개시하지 못한다(문헌[Kang et al. (1992) Science 257:1134]). 또 다른 메커니즘은 "고갈(exhaustion)"로 지칭된다. T 세포 고갈은 많은 만성 감염 및 암 동안 발생하는 T 세포 기능장애 상태이다. 이는 불량한 효과기 기능, 저해성 수용체의 지속적인 발현 및 기능적 효과기 또는 메모리 T 세포와 구별되는 전사 상태로 정의된다.
"전사된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 전사체"는 바이오마커 핵산의 전사 및 정상적인 전사 후 가공(예를 들어, 스플라이싱) 및 존재하는 경우, RNA 전사체 및 RNA 전사체의 역 전사에 의해 만들어진 성숙 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이거나 상동성인 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA, hnRNA, CDNA 또는 이러한 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다.
용어 "치료하다"는 관심 병태(예를 들어, 질환 또는 장애)의 치료적 관리 또는 개선을 지칭한다. 치료는 대상체에게 작용제 또는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 투여하는 것을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 치료는 전형적으로 대상체에게 유익한 방식으로 질환의 진행 과정을 변경하기 위한 노력의 일환으로 실시된다(이 용어는 임의의 질환, 장애, 증후군 또는 요법을 보장하거나 잠재적으로 보장할 수 있는 바람직하지 않은 병태를 나타내는 데 사용됨). 치료의 효과는 치료의 효과는 질환의 역전, 중증도 감소, 발병 지연, 치유, 진행 억제 및/또는 이의 발생 또는 재발 가능성 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 발현을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화(palliation) 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 치료제는 질환이 있거나 일반 집단에 비해 질환이 발생할 위험이 높은 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 질환이 있었지만 질환의 증거를 더 이상 나타내지 않는 대상체에게 투여될 수 있다. 작용제는 예를 들어, 분명한 질환의 재발 가능성을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 치료제는 예방적으로, 즉, 질환의 임의의 증상 또는 발현의 발생 전에 투여될 수 있다. "예방적 치료"는 질환이 발생할 가능성을 줄이거나 질환이 발생할 경우 그 중증도를 줄이기 위해, 질환이 발병되지 않았거나 질환의 증거를 보이지 않는 대상체에게 의료 및/또는 외과적 관리를 제공하는 것을 지칭한다. 대상체는 질환이 발병할 위험이 있는(예를 들어, 일반 집단에 비해 위험이 증가) 것으로 또는 질환이 발병할 가능성을 증가시키는 위험 인자를 가지는 것으로 확인될 수 있다.
용어 "무반응성"은 요법에 대한 암세포의 무반응성 상태 또는 자극, 예를 들어, 활성화 수용체 또는 사이토카인을 통한 자극에 대한 면역 세포와 같은 치료용 세포의 무반응성 상태를 포함한다. 무반응성은 예를 들어, 면역 억제제에의 노출 또는 고용량의 항원에의 노출 때문에 발생할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "무력성" 또는 "내성"은 활성화 수용체-매개성 자극에 대한 무반응성 상태를 포함한다. 이러한 무반응성 상태는 일반적으로 항원-특이적이며, 내성 항원에 대한 노출이 중단된 후에도 지속된다. 예를 들어, T 세포에서의 무력성은 (무반응성과는 대조적으로) 사이토카인, 예를 들어, IL-2 생산의 결핍을 특징으로 한다. T 세포 무력성은 T 세포가 항원에 노출되고, 제2 신호(공동자극성 신호)의 부재하에서 제1 신호(T 세포 수용체 또는 CD-3 매개성 신호)를 받을 때 발생한다. 이러한 조건하에서, 동일한 항원에 대한 세포의 재노출은(공동자극성 폴리펩타이드의 존재하에서 재노출이 발생하더라도) 사이토카인 생산 실패를 초래하므로, 증식에 실패한다. 그러나, 무력성 T 세포는 사이토카인(예를 들어, IL-2)과 함께 배양하면 증식할 수 있다. 예를 들어, ELISA에 의해 또는 지표 세포주를 사용하는 증식 검정에 의해 측정된 T 림프구에 의한 IL-2 생산의 결핍에 의해 T 세포 무력성이 또한 관찰될 수 있다. 대안적으로, 리포터 유전자 작제물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 무력성 T 세포는 5' IL-2 유전자 인핸서의 제어하에서 이종성 프로모터 또는 인핸서 내에서 발견될 수 있는 AP1 서열의 다량체에 의해 유도된 IL-2 유전자의 전사를 개시하지 못한다(문헌[Kang et al. (1992) Science 257:1134]).
용어 "백신"은 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 면역력을 생성하기 위한 조성물을 지칭한다.
또한, 특정 단백질의 아미노산 서열과 유전자 코드(아래에 나타냄)에 의해 정의된 바와 같이 단백질을 코딩할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 사이에는 알려져 있고 명확한 관련성이 있다. 마찬가지로, 특정 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 유전자 코드에 의해 정의된 바와 같이 그 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열 사이에는 알려져 있고 명확한 관련성이 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
유전자 코드의 중요하고 잘 알려진 특징은 불필요한 중복(redundancy)이다. 따라서, 단백질을 만드는 데 사용되는 대부분의 아미노산에 대해 하나 이상의 코딩 뉴클레오타이드 트리플릿이 사용될 수 있다(위에 예시됨). 따라서, 주어진 아미노산 서열에 대해 다수의 상이한 뉴클레오타이드 서열이 코딩될 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 모든 유기체에서 동일한 아미노산 서열을 생성하기 때문에 기능적으로 동등한 것으로 간주된다(소정의 유기체는 다른 것보다 일부 서열을 더 효율적으로 번역할 수 있음). 또한, 때대로, 퓨린 또는 피리미딘의 메틸화된 변이체가 주어진 뉴클레오타이드 서열에서 발견될 수 있다. 이러한 메틸화는 트라이뉴클레오타이드 코돈 및 상응하는 아미노산 사이의 코딩 관계에 영향을 미치지 않는다.
전술 한 관점에서, 바이오마커 핵산(또는 이들의 임의의 부분)을 암호화하는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오타이드 서열은 DNA 또는 RNA를 아미노산으로 번역하는 유전자 코드를 사용하여 폴리펩타이드 아미노산 서열을 유도하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩타이드 아미노산 서열의 경우, 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드로부터 추론될 수 있다(이는 중복성 때문에 임의의 주어진 아미노산 서열에 대해 다중 핵산 서열을 생성할 것이다). 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 본 명세서의 설명 및/또는 개시는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 설명 및/또는 개시를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 유사하게는, 본 명세서의 폴리펩타이드 아미노산 서열의 설명 및/또는 개시는 또한 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 모든 가능한 뉴클레오타이드 서열의 설명 및/또는 개시를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
II. 단핵구 및 대식세포
단핵구는 혈액, 골수 및 비장에서 순환하며 정상 상태에서 제한된 증식을 보이는 골수-유래 면역 효과기 세포이다. 　용어 "골수성 세포"는 골수 또는 척수의 과립구 또는 단핵구 전구체 세포, 또는 골수 또는 척수에서 발견되는 것과 유사한 것들을 지칭할 수 있다. 골수성 세포 계통은 말초 혈액에서 순환하는 단핵구성 세포 및 성숙, 분화 및/또는 활성화에 따라 생성되는 세포 집단을 포함한다. 이러한 집단은 비-말단성으로 분화된 골수성 세포, 골수 유래 억제 세포 및 분화된 대식세포를 포함한다. 분화된 대식세포는 비-분극화 및 분극화 대식세포, 휴지 및 활성화된 대식세포를 포함한다. 제한 없이, 골수성 계통은 또한 과립구성 전구체, 다형핵 유래 억제 세포, 분화된 다형핵 백혈구 세포, 호중구, 과립구, 호염구, 호산구, 단핵구, 대식세포, 미세아교세포, 골수성 유래 억제 세포, 수지상 세포 및 적혈구를 포함할 수 있다. 단핵구는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 발견되며, 이는 또한 다른 조혈 및 면역 세포, 예컨대, B 세포, T 세포, NK 세포 등을 포함한다. 단핵구는 단핵모세포라 불리는 조혈 줄기 세포 전구체로부터의 골수에 의해 생성된다. 단핵구는 면역 체계에서 두 가지 주요 기능을 가진다: (1) 정상 상태하에서 상주 대식세포 및 수지상 세포(DC)를 보충하기 위해 혈류를 빠져나갈 수 있으며, (2) 조직의 감염 부위로 빠르게 이동하고, 대식세포 및 염증성 수지상 세포로 분열/분화하여 염증 신호에 대한 반응으로 면역 반응을 이끌어낸다. 단핵구는 일반적으로 이들의 큰 이엽의 핵(bilobate nucleus)에 의해 염색된 얼룩으로 확인된다. 단핵구는 또한 감염 중에 혈액에서 조직으로의 이동을 매개하는 케모카인 수용체 및 병원균 인식 수용체를 발현한다. 이들은 염증성 사이토카인과 및 포식작용 세포를 생산한다. 일부 실시형태에서, 관심 골수성 세포는 CD11b+ 발현 및/또는 CD14+ 발현에 따라 확인된다.
아래에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 단핵구는 대식세포로 분화할 수 있다. 단핵구는 또한 예컨대, 사이토카인 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF) 및 인터류킨 4(IL-4)의 작용을 통해 수지상 세포로 분화할 수 있다. 일반적으로, 용어 "단핵구"는 미분화된 단핵구뿐만 아니라 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 그로부터 분화된 세포 유형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "단핵구"는 미분화된 단핵구를 지칭할 수 있다.
대식세포는 중요한 면역 효과기이며, 염증 및 선천성 면역 반응의 조절인자이다. 대식세포는 이종성이며, 조직에 상주하며, 말단-분화된 선천적 골수성 세포이며, 이는 현저한 가소성을 가지며, 미세환경으로부터의 국부적 신호(cue)에 반응하여 이들의 생리를 변화시킬 수 있고, 숙주 방어에서 조직 항상성에 이르기까지 다양한 기능적 요구사항을 맡을 수 있다(문헌[Ginhoux et al. (2016) Nat. Immunol. 17:34-40]). 대식세포는 신체의 거의 모든 조직에 존재한다. 이들은 조직 상주 대식세포, 예를 들어, 간에 상주하는 쿠퍼 세포이거나, 또는 주로 골수 및 비장 저장소에서 유래하고, 정상 상태에서 또는 염증 또는 다른 자극 신호에 반응하여 조직으로 이동하는 순환하는 단핵구성 전구체(즉, 단핵구)로부터 유래된다. 예를 들어, 단핵구는 혈액에서 조직으로 동원되어 뼈, 폐포(폐), 중추 신경계, 결합 조직, 위장관, 간, 비장 및 복막의 조직 특이적 대식세포를 보충할 수 있다.
용어 "조직-상주 대식세포"는 조직 면역-감시, 감염에 대한 반응 및 염증의 분해와 같은 조직-특이적 및/또는 미세-해부학적 환경-특이적 기능 및 전용의 항상성 기능을 총족시키는 면역 세포의 이종성 집단을 지칭한다. 조직 상주 대식세포는 배아의 난황낭에서 유래하고, 발달중인 태아의 특정 조직에서 성숙하여, 조직-특이적 역할을 획득하고 이들의 유전자 발현 프로파일을 변경한다. 콜로니-형성 능력을 유지하는 조직 상주 대식세포의 국소 증식은 조직에서 성숙 대식세포의 집단을 직접 유발할 수 있다. 조직 상주 대식세포는 또한 그들이 점유하는 조직에 따라 확인되고 명명될 수 있다. 예를 들어, 지방 조직 대식세포는 지방 조직을 점유하고, 쿠퍼 세포는 간 조직을 점유하며, 부비강 조직세포는 림프절을 점유하고, 폐포낭 대식세포(먼지 세포)는 폐포를 점유하며, 랑게르한스 세포는 피부 및 점막 조직을 점유하고, 거대세포에 이르는 조직세포는 결합 조직을 점유하며, 미세아교세포는 중추 신경계(CNS) 조직을 점유하고, 호프바우어 세포는 태반 조직을 점유하며, 사구체 안 혈관사이세포는 신장 조직을 점유하고, 파골세포는 뼈 조직을 점유하며, 유상피 세포는 육아종을 점유하고, 적색 속질 대식세포(동양혈관 내막세포)는 비장 조직의 적색 속질을 점유하며, 복막강 대식세포는 복막강 조직을 점유하고, 라이소솜성 세포는 파이어판(Peyer's patch) 조직을 점유하며, 췌장 대식세포는 췌장 조직을 점유한다.
감염원 및 다른 염증 반응에 대한 숙주 방어 외에도, 대식세포는 발달, 상처 치유 및 조직 복구 및 면역 반응의 조절을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 항상성 기능을 수행할 수 있다. 식균 작용을 통해 감염을 방어하는 체내 식균 작용 세포로 처음 인식된 대식세포는 선천성 면역력의 필수 구성요소이다. 병원균 및 다른 염증 자극에 대한 반응에서, 활성화된 대식세포는 감염된 박테리아 및 다른 미생물을 삼키고; 염증을 자극하고, 이러한 세포내 미생물에 전-염증성 분자의 칵테일을 방출한다. 병원균을 삼킨 후, 대식세포는 T 세포에 병원성 항원을 제시하여 방어를 위한 후천성 면역 반응을 더 활성화한다. 예시적 전-염증성 분자는 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α, 케모카인 MCP-1, CXC-5 및 CXC-6 및 CD40L을 포함한다.
감염에 대한 숙주 방어에 기여하는 것 외에도, 대식세포는 면역 반응에 관여하는 것과 관계없이 중요한 항상성 역할을 한다. 대식세포는 적혈구를 제거하는 엄청난 식세포이며, 철과 헤모글로빈과 같은 방출된 물질은 숙주가 재사용할 수 있도록 재활용될 수 있다. 이러한 제거 과정은 이 과정 없이는 숙주가 생존할 수 없는 중요한 대사적 기여이다.
대식세포는 또한 조직 리모델링 중에 생성되는 세포 찌꺼기의 제거 및 아폽토시스를 겪은 세포를 빠르고 효과적으로 제거하는데 관여한다. 대식세포는 아폽토시스성 세포의 제거를 통해 정상-상태 조직 항상성에 관여하는 것으로 여겨진다. 이러한 항상성 제거 과정은 일반적으로 스캐빈저 수용체, 포스파티딜 세린 수용체, 트롬보스폰딘 수용체, 인테그린 및 보체 수용체를 포함하는 대식세포에서 표면 수용체에 의해 매개된다. 식균 작용을 매개하는 이러한 수용체는 사이토카인-유전자 전사를 유도하는 신호를 전달하지 못하거나, 또는 저해성 신호 및/또는 사이토카인을 적극적으로 생성한다. 대식세포의 항상성 기능은 다른 면역 세포와 무관하다.
대식세포는 외상 또는 기타 세포에 대한 손상으로 인한 세포 찌꺼기/괴사 세포를 제거할 수 있다. 대식세포는 톨-유사 수용체(TLR), 세포내 패턴-인식 수용체 및 인터류킨-1 수용체(IL-1R)를 통해 괴사 세포의 찌꺼기에 존재하는 내인성 위험 신호를 감지하며, 이들 대부분은 어댑터 분자 골수성 분화 일차-반응 유전자 88(MyD88)를 통해 신호를 보낸다. 세포 찌꺼기의 제거는 대식세포의 생리를 현저하게 바꿀 수 있다. 괴사를 제거하는 대식세포는 표면 단백질 발현의 변화 및 사이토카인 및 전-염증성 매개체의 생성을 포함하여, 이들의 생리에서 극적인 변화를 겪을 수 있다. 이러한 자극에 대한 반응으로 대식세포 표면-단백질 발현의 변경은 잠재적으로 이러한 변경된 세포에 고유한 생화학적 마커를 확인하는데 사용될 수 있다.
대식세포는 백색 지방 조직, 갈색 지방 조직, 간 및 췌장과 같은 많은 조직에서 항상성을 유지하는데 중요한 기능을 한다. 조직 대식세포는 조직 세포가 적응할 수 있도록 일련의 변화를 유발하는 세포 신호전달 분자를 방출함으로써 조직에서의 변화하는 조건에 빠르게 반응할 수 있다. 예를 들어, 지방 조직에서 대식세포는 식이의 변화(예를 들어, 백색 지방 조직에서의 대식세포) 또는 저온에의 노출(갈색 지방 조직에서의 대식세포)에 반응하여 새로운 지방 세포의 생성을 조절한다. 쿠퍼 세포로 알려진 간의 대식세포는 식이 변화에 반응하여 포도당과 기질의 분해를 조절한다. 췌장의 대식세포는 고지방 식이에 대한 반응으로 인슐린 생산을 조절할 수 있다.
대식세포는 또한 상처 치유 및 조직 복구에 기여할 수 있다. 예를 들어, 손상된 조직 및 세포로부터 유래된 신호에 대한 반응으로, 대식세포는 활성화되고, 손상된 조직을 복구하기 위해 조직-복구 반응을 유도할 수 있다(문헌[Minutti et al. (2017) Science 356:1076-1080]).
배아 발달 과정에서, 대식세포는 또한 조직 리모델링 및 장기 발달에도 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 상주 대식세포는 신생아 마우스 심장의 혈관 발달을 적극적으로 형성한다(문헌[Leid et al.(2016) Circ. Res. 118:1498-1511]). 뇌의 미세아교세포는 배아 발달 동안 뇌 발달에 뉴런 및 혈관을 안내하는 성장 인자를 생성할 수 있다. 유사하게는, 대식세포-생산 단백질인 CD95L은 뉴런 표면의 CD95 수용체와 결합하여, 마우스 배아의 뇌에서 혈관을 발달시키고 뉴런 및 혈관 발달을 증가시킨다(문헌[Chen et al. (2017) Cell Rep. 19:1378-1393]). 리간드가 없으면, 뉴런의 분지 빈도가 줄어들고, 그 결과 성인 뇌는 전기적 활성을 적게 나타낸다. 파골세포로 알려진 단핵구-유래 세포는 뼈 발달에 관여하며, 이러한 세포가 없는 마우스는 조밀하고 딱딱한 뼈(골석화증으로 알려진 희귀한 병태)가 발생한다. 대식세포는 또한 유선의 발달을 조율하고, 출생 후 초기에 망막 발달을 돕는다(문헌[Wynn et al.(2013) Nature 496:445-455]).
위에 기재된 바와 같이, 대식세포는 면역 체계를 조절한다. 세포에 대한 항원 제시 외에도, 대식세포는 일부 조건에서 면역세포에 면역억제성/저해성 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 고환에서, 대식세포는 정자가 면역 체계의 공격을 받지 않도록 보호 환경을 조성한다. 고환의 조직 상주 대식세포는 정자에 대한 면역 세포 반응을 방지하는 면역억제 분자를 생산한다(문헌[Mossadegh-Keller et al.(2017) J. Exp. Med. 214:10.1084/jem.20170829]).
상이한 환경 신호에 반응하고 이들의 기능적 요구사항과 일치하는 대식세포의 가소성은 연속체의 두 극단, 즉 "전형적으로 활성화된" M1 및 "대안적으로 활성화된" M2 대식세포를 포함하는 다양한 대식세포 활성화 상태를 초래하였다.
용어 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하기 위해 충분히 자극되고/되거나 효과기 기능, 예컨대, 유도된 사이토카인 발현 및 분비, 식균 작용, 세포 신호전달, 항원 가공 및 제시, 표적 세포 살해 및 전-염증성 기능을 발휘하도록 자극된 골수성 세포의 상태를 지칭한다.
용어 "M1 대식세포" 또는 "전형적으로 활성화된 대식세포"는 전-염증성 표현형을 갖는 대식세포를 지칭한다. 용어 "대식세포 활성화"("전형적인 활성화"로도 지칭됨)는 병원균에 대한 이차 노출시 BCG(칼메트-게렝균(bacillus Calmette-Guerin)) 및 리스테리아에 대한 항원-의존적이지만 비-특이적으로 향상된, 대식세포의 살균 활성을 설명하기 위해 감염의 맥락에서 1960년대에 Mackaness에 의해 도입되었다(문헌[Mackaness (1962) J. Exp. Med. 116:381-406]). 향상은 나중에 항원-활성화 면역 세포에 의한 Th1 반응 및 IFN-γ 생성과 관련이 있으며(문헌[Nathan et al. (1983) J. Exp. Med. 158:670-689]), 세포독성 및 항종양 특성으로 확장되었다(문헌[Pace et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:3782-3786; Celada et al. (1984) J. Exp. Med. 160:55-74]). 따라서, 사이토카인 분비, 항원 제시, 식균 작용, 세포-세포 상호작용, 이동 등에 의해 염증을 향상시키는 임의의 대식세포 기능은 전-염증성으로 간주된다. 시험관내 및 생체내 검정은 다양한 종말점을 측정할 수 있고: 일반적인 시험관내 측정은 증식, 이동, 전-염증성 Th1 사이토카인/케모카인 분비 및/또는 이동에 의해 측정된 바와 같은 전-염증성 세포 자극을 포함하며, 일반적인 생체내 측정은 병원균 퇴치, 조직 손상 즉시 반응인자, 다른 세포 활성인자, 이동 유도제 등을 분석하는 것을 더 포함한다. 시험관내 및 생체내에 둘 다에 대해, 전-염증성 항원 제시가 평가될 수 있다. 리포폴리사카라이드(LPS), 소정의 톨-유사 수용체(TLR) 효능제, Th1 사이토카인 인터페론-감마(IFNγ)(예를 들어, 스트레스 및 감염에 대한 반응으로 NK 세포에 의해 생성된 IFNγ 및 지속적으로 생성되는 T 헬퍼 세포) 및 TNF와 같은 세균성 모이어티는 M1 경로에 따라 대식세포를 분극화시킨다. 활성화된 M1 대식세포가 포식하고, 미생물을 파괴하고, 손상된 세포(예를 들어, 종양 세포 및 아폽토시스성 세포)를 제거하고, 후천성 면역 반응을 증가시키기 위해 T 세포에 항원을 제시하고, 높은 수준의 전-염증성 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6 및 IL-23), 반응성 산소 종(ROS) 및 산화질소(NO)를 생산할 뿐만 아니라, 다른 면역 및 비-면역 세포를 활성화한다. 유도성 산화질소 신테이스(iNOS), 반응성 산소 종(ROS)의 발현 및 Th1-관련 사이토카인 IL-12의 생성을 특징으로 하는, M1 대식세포는 강력한 면역 반응을 촉진하도록 잘 조정된다. M1 대식세포의 대사는 강화된 호기성 해당과정, 포도당을 젖당으로 전환, 5탄당 인산 경로(PPP), 지방산 합성 및 절단된 트라이카복실산(TCA) 사이클을 통한 플럭스의 증가, 석시네이트 및 시트레이트의 축적 유발을 특징으로 한다.
"제1형" 또는 "M1-유사" 골수성 세포는 다음 중 적어도 하나를 특징으로 하는 전-염증성 반응에 기여할 수 있는 골수성 세포이다: 적어도 하나의 전-염증성 사이토카인을 분비하여 염증성 자극을 생성하는 것, 적어도 하나의 세포 표면 활성화 분자/활성화 분자에 대한 리간드를 그 표면에 발현하는 것, 적어도 하나의 다른 세포(다른 대식세포 및/또는 T 세포를 포함)를 동원/지시/상호작용하여 전-염증성 반응을 자극하는 것, 전-염증성 맥락에서 항원을 제시하는 것, 전-염증성 반응 개시를 허용하는 부위로 이동하는 것 또는 전-염증성 기능으로 이어질 것으로 예상되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 시작하는 것. 일부 실시형태에서, 용어는 세포독성 CD8+ T 세포를 활성화하는 것, 면역관문 요법과 같은 면역요법에 대해 암세포의 증가된 감수성을 매개하고/하거나 저항성에 대한 암세포의 역전을 매개하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 전-염증성 상태에 대한 이러한 조절은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다수의 잘 알려진 방식으로 측정될 수 있다: a) 증가된 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β, IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α); b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, LRRC25, TGFb 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18, GM-CSF, CCL3, CCL4 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 분비; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비; e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) CD8+ 세포독성 T 세포 활성화의 증가된 동원; g) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; h) CD4+ 헬퍼 T 세포 활성의 증가된 동원; i) 증가된 NK 세포 활성; j) NK 세포의 증가된 동원; k) 증가된 호중구 활성; l) 증가된 대식세포 및/또는 수지상 세포 활성; 및/또는 m) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
이미 전-염증성인 세포에서, 증가된 염증성 표현형은 더 많은 전-염증성 상태를 지칭한다.
대조적으로, 용어 "M2 대식세포"는 항-염증성 표현형을 갖는 대식세포를 지칭한다. Th2-유래 및 종양-유래 사이토카인, 예컨대, IL-4, IL-10, IL-13, 전환 성장인자 베타(transforming growth factor beta: TGF-β) 또는 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 M2 분극화를 전파할 수 있다. M2 대식세포의 대사 프로파일은 OXPHOS, FAO, 감소된 해당과정 및 PPP에 의해 정의된다. 만노스 수용체가 뮤린 대식세포에서 Th2 IL-4 및 IL-13에 의해 선택적으로 강화되고, 만노실화된 리간드의 높은 식작용성 제거를 유도하고, 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II 항원 발현을 증가시키고, 전-염증성 사이토카인 분비를 감소시켰다는 발견은, Stein, Doyle 및 동료들이 IL-4 및 IL-13이 IFN-γ 활성화와는 완전히 다르지만 비활성화와는 거리가 먼 상태인 대안적 활성화 표현형을 유도하였다는 제안에 이르게 하였다(문헌[Martinez and Gordon (2014) F1000 Prime Reports 6:13]). 시험관내 및 생체내 정의/검정은 다양한 종말점을 측정할 수 있고: 일반적인 시험관내 종말점은 증식, 이동, 항-염증성 Th2 사이토카인/케모카인 분비 및/또는 이동에 의해 측정된 항-염증성 세포 자극을 포함하며, 일반적인 생체내 M2 종말점은 병원균 퇴치, 조직 손상이 지연된/전-섬유증성 반응, 다른 세포 Th2 분극화, 이동 유도제 등을 분석하는 것을 더 포함한다. 시험관내 및 생체내에 둘 다에 대해, 전-면역관용 항원 제시가 평가될 수 있다.
"제2형" 또는 "M2-유사" 골수성 세포는 다음 중 적어도 하나를 특징으로 하는 항-염증성 반응에 기여할 수 있는 골수성 세포이다: 적어도 하나의 항-염증성 사이토카인을 분비함으로써 항-염증성 자극을 생성하는 것, 적어도 하나의 세포 표면 저해 분자/저해성 분자에 대한 리간드를 그 표면에 발현하는 것, 적어도 하나의 다른 세포를 동원/지시/상호작용하여 항-염증성 반응을 자극하는 것, 전-면역관용의 맥락에서 항원을 제시하는 것, 전-면역관용 반응 개시를 허용하는 부위로 이동하는 것 또는 전-면역관용/항-염증성 기능으로 이어질 것으로 예상되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 시작하는 것. 소정의 실시형태에서, 전-염증성 상태에 대한 이러한 조절은 제1형 전-염증성 상태 측정의 반대를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다수의 잘 알려진 방식으로 측정될 수 있다.
"증가된 염증성 표현형"을 갖는 세포는 a) 제1형의 열거된 기준 중 하나 이상의 증가 및/또는 b) 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)를 조절하는 작용제에 접촉되는 것과 같은 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)의 조절 후 제2형의 열거된 기준 중 하나 이상의 감소와 관련된 더 많은 전-염증성 반응 능력을 갖는 것이다.
"감소된 염증성 표현형"을 갖는 세포는 a) 제1형의 열거된 기준 중 하나 이상의 감소 및/또는 b) 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)을 조절하는 작용제에 접촉되는 것과 같은 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)의 조절 후 제2형의 열거된 기준 중 하나 이상의 증가와 관련된 더 많은 항-염증성 반응 능력을 갖는 것이다.
따라서, 대식세포는 제1형 및 제2형 상태 사이의 중간 표현형으로 대안적으로 활성화된 상태의 연속체를 취할 수 있으며(예를 들어, 문헌[Biswas et al. (2010) Nat. Immunol. 11: 889-896; Mosser and Edwards (2008) Nat. Rev. Immunol. 8:958-969; Mantovani et al. (2009) Hum. Immunol. 70:325-330] 참조), 이러한 증가되거나 감소된 염증성 표현형은 위에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대안적으로 활성화된 대식세포" 또는 "대안적으로 활성화된 상태"는 전형적으로 활성화된 M1 전-염증성 대식세포 이외의 본질적으로 모든 유형의 대식세포 집단을 지칭한다. 원래, 대안적으로 활성화된 상태는 M2형 항-염증성 대식세포에 대해서만 지정되었다. 용어는 이들의 생화학, 생리학 및 기능에 극적인 차이를 가진 대식세포의 다른 모든 대안적 활성화 상태를 포함하도록 확장되었다.
예를 들어, 대안적으로 활성화된 대식세포의 한 유형은 상처 치유와 관련된 것이다. 조직 손상(예를 들어, 외과적 상처) 중에 방출된 선천적 및 후천적 신호에 대한 반응으로, 예컨대, 호염구 및 비만 세포, 조직-상주 대식세포에 의해 생성된 IL-4는 상처 치유를 촉진하도록 활성화될 수 있다. 상처 치유 대식세포는 높은 수준의 전-염증성 사이토카인을 생성하는 대신 고발현의 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 키티네이스 및 키티네이스-유사 단백질 YM1/CHI3L3, YM2, AMCase 및 스태빌린을 분비하며, 이들 모두는 탄수화물 및 매트릭스-결합 활성을 나타내며 조직 복구에 관여한다.
대안적으로 활성화된 대식세포의 다른 예는 선천성 및 후천성 면역 반응에 의해 유도될 수 있는 조절성 대식세포를 포함한다. 조절성 대식세포는 면역-조절성 기능에 기여할 수 있다. 예를 들어, 대식세포는 시상하부-뇌하수체-부신(hypothalamic-pituitary-adrenal: HPA) 축(예를 들어, 글루코코르티코이드)로부터의 호르몬에 반응하여 전-염증성 사이토카인의 전사의 저해와 같은 숙주 방어 및 염증성 기능이 저해된 상태를 취할 수 있다. 조절성 대식세포는 조절성 사이토카인 TGF-β을 생성하여 소정의 조건에서, 예를 들어, 후천성 면역 반응의 후기 단계에서 면역 반응을 약화시킬 수 있다. 많은 조절성 대식세포가 높은 수준의 공동-자극 분자(예를 들어, CD80 및 CD86)를 발현하므로 T 세포에 대한 항원 제시가 향상될 수 있다.
많은 자극/신호가 조절성 대식세포의 분극화를 유도할 수 있다. 신호는 TLR 효능제 및 면역 복합체의 조합, 아폽토시스성 세포, IL-10, 프로스타글란딘, GPcR 리간드, 아데노신, 도파민, 히스타민, 스핑고신1-포스페이트, 멜라노코르틴 및 혈관작용성 장 펩타이드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 기생충, 바이러스 및 박테리아와 같은 일부 병원균은 특히 조절성 대식세포의 분화를 유도하여 결함이 있는 병원균 살해 및 감염된 미생물의 생존 및 확산을 향상시킬 수 있다.
조절성 대식세포 일부 공통적인 특징을 공유한다. 예를 들어, 조절성 대식세포는 이들의 항-염증성 활성을 유도하기 위해 두 가지의 자극을 필요로 한다. 상이한 자극/신호에 의해 유도되는 조절성 대식세포 하위집단 간의 차이 또한 관찰되어, 이들의 이종성을 반영한다.
조절성 대식세포는 또한 항상성 유지에서 발달 과정 중 대사에서 발견되는 다양한 하위집단을 포함하는 이종성 대식세포의 집단이다. 일 예에서, 대안적으로 활성화된 대식세포의 하위집단은 M-CSF/GM-CSF, CD16 리간드(예컨대, 면역글로불린) 및 IFN-γ의 존재하에서 유도될 수 있는 고유의 면역조절성 특성을 갖는 면역조절성 대식세포이다(PCT 출원 공개 WO2017/153607).
조직에서 대식세포는 시간이 지남에 따라 생체내에서 활성화 상태를 변경할 수 있다. 이러한 동역학은 대식세포를 조직으로 이동시키는 지속적인 유입, 활성화된 대식세포의 동적 변화 및 휴지 상태를 되돌리는 대식세포를 반영한다. 일부 조건에서, 환경에서의 상이한 신호는 상이한 활성화 상태의 혼합으로 대식세포를 유도할 수 있다. 예를 들어, 만성의 상처가 있는 상태에서, 대식세포는 시간이 지남에 따라 전-염증성 활성화 하위집단인, 상처 치유를 유도하는 대식세포 및 일부 분해 활성 유도를 나타내는 대식세포를 포함할 수 있다. 비-병리적 조건하에서, 면역-자극성 및 면역-조절성 대식세포의 균형 잡힌 집단이 면역 체계에 존재한다. 일부 질환 상태에서, 균형이 깨지며, 불균형으로 인해 많은 임상적 병태가 발생한다.
대식세포의 명확한 가소성은 또한 이들이 질환 상태에서 받는 환경 신호에 취약한 반응을 보이게 한다. 대식세포는 다양한 질환 상태에 반응하여 재분극화될 수 있으며, 뚜렷한 특징을 보여준다. 하나의 예는 종종 "종양 관련 대식세포"("TAM") 또는 "종양 침윤 대식세포"("TIM")로 불리는 말초 혈액 단핵구로부터 종양 조직으로 유인되고 여과되는 대식세포이다. 종양-관련 대식세포는 종양에서 가장 풍부한 염증성 세포 중 하나이며, 대부분의 암에 대해 높은 TAM 밀도와 더 나쁜 예후 사이에 중요한 상관관계가 발견되었다(문헌[Zhang et al. (2012) PloS One 7:e50946.10.1371/journal.pone.0050946]).
TAM은 M1-유사 전-염증성 및 M2-유사 항-염증성 하위집단 둘 다의 혼합된 집단이다. 종양형성의 초기 단계에서, 전-염증성 표현형을 갖는 전형적으로 활성화된 대식세포는 정상 산소성(normoxic) 종양 영역에 존재하며, 형질전환된 종양 세포의 조기 박멸에 기여하는 것으로 여겨진다. 그러나, 종양이 성장하고 진행됨에 따라, 말기 종양에서 대부분의 TAM은 종양의 저산소성 영역에 상주하는 M2-유사 조절성 대식세포이다. 대식세포의 이러한 표현형 변화는 종양 미세환경적 자극, 예컨대, 종양 세포외 매트릭스, 무산소 환경 및 종양 세포에 의해 분비된 사이토카인에 의해 현저하게 영향을 받는다. M2-유사 TAM은 상처 치유 대식세포와 조절성 대식세포의 하이브리드 활성화 상태를 보여주며, 높은 수준의 IL-10의 생성, 그러나 IL-12의 생성은 거의 없거나 전혀 없음, 결함이 있는 TNF 생성, 항원 제시 세포의 억제 및 종양 혈관신생에 대한 기여를 포함하는 다양한 고유의 특징을 보여준다.
일반적으로, TAM은 M2 표현형을 특징으로 하며, IL-10 및 IL-1β 생산을 통해 M1 대식세포-매개성 염증을 억제한다. 따라서, TAM은 증식 및 침입을 위한 영양분과 성장 신호를 제공하며, 새로운 혈관(즉, 혈관신생)의 생성을 촉진하는 상처-치유(즉, 항-염증성) 경로의 활성화를 통해 종양 성장 및 전이를 촉진한다. 또한, TAM은 면역 체계의 다른 성분이 종양을 인식하고 공격하는 것을 방지하는 항-염증성 신호를 분비하여 면역-억제성 종양 미세환경에 기여한다. TAM은 많은 유형의 암(예를 들어, 유방암, 성상세포종, 두경부 편평세포 암, 유두 신세포 암종 유형 II, 폐암, 췌장암, 담낭암, 직장암, 신경교종, 전형적인 호지킨 림프종, 난소암 및 결장직장암)에서 암 성장, 증식 및 전이를 촉진하는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 보고되었다. 일반적으로, 많은 TAM의 집단을 특징으로 하는 암은 좋지 않은 질환 예후 예측과 관련이 있다.
다양한 기능과 활성화 상태는 적절하게 규제되지 않으면 위험한 결과를 초래할 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 활성화된 대식세포는 숙주 조직에 손상을 줄 수 있고, 과다 활성화되면 주변 조직을 취약하게 하며 글루코스 대사에 영향을 미칠 수 있다.
많은 질환 상태에서, 대식세포 활성화 상태의 균형 잡힌 동역학이 중단되며, 불균형이 질환을 유발한다. 예를 들어, 종양은 대식세포로 풍부하게 구성되어 있다. 대식세포는 암의 75 퍼센트에서 발견될 수 있다. 공격적인 유형의 암은 종종 대식세포 및 다른 면역 세포의 더 높은 침투와 관련이 있다. 대부분의 악성 종양에서, TAM은 암세포 생존의 촉진, 증식, 침입, 혈관외 유출 및 전이, 혈관신생의 자극, 세포외 매트릭스의 리모델링 및 항종양 면역력의 억제를 포함하는 여러 종양-촉진 기능을 발휘한다(문헌[Qian and Pollard, 2010, Cell, 141(1): 39-51]). 이들은 또한 성장-촉진 분자, 예컨대, 오르니틴, VEGF, EGF 및 TGF-β를 생산할 수 있다.
TAM은 종양 미세환경에서 마주치는 CSF1 및 IL4/IL13에 대한 반응으로 종양 성장 및 생존을 자극한다. TAM은 또한 프로테이스, 예컨대, MMP, 카텝신 및 uPA 및 매트릭스 리모델링 효소(예를 들어, 라이실 옥시데이스 및 SPARC)의 발현을 통해 종양 미세환경을 리모델링할 수 있다.
TAM은 종양의 악성 상태의 전이에 필요한 종양 조직에서 혈관의 극적인 증가를 조절하는 종양 혈관신생에서 중요한 역할을 한다. 이러한 혈관 형성성 TAM은 안지오포이에틴 수용체, TIE2를 발현하고, VEGF 패밀리 구성원, TNFα, IL1β, IL8, PDGF 및 FGF를 포함하는 많은 혈관 형성성 분자를 분비한다.
대식세포의 다양한 하위집단은 이러한 개별적인 전-종양성 기능을 수행한다. 이러한 TAM은 대식세포 침윤의 정도가 다를 뿐만 아니라 종양 유형의 표현형이 다르다. 예를 들어, 인간 간세포성 암종의 상세한 프로파일링은 이들의 해부학적 위치 및 전-종양성과 항-종양성 특성의 측면에서 정의된 다양한 대식세포 하위-유형을 보여준다. M2-유사 대식세포가 TAM의 전-종양성 기능의 주요 자원인 것으로 나타났다. M2-유사 TAM은 항암 치료의 효능에 영향을 미치고, 요법 저항성에 기여하며, 종래의 암 요법 후 종양 재발을 매개하는 것으로 나타났다.
III. 골수 염증성 표현형을 조절하는데 유용한 표적 및 바이오마커
본 발명은 골수성 세포의 염증성 표현형을 조절하는데 유용한 LRRC25와 같은 바이오마커뿐만 아니라 상응하는 면역 반응(예를 들어, 항암 대식세포 면역요법을 증가시기 위해)을 포함한다.
LRRC25의 하향조절은 증가된 염증성 표현형(예를 들어, 제1형 표현형)과 관련이 있으며 이를 초래하고, 상향조절은 감소된 염증성 표현형(예를 들어, 제2형 표현형)과 관련이 있으며 이를 초래한다.
본 발명에 포함되는 유전자좌 및 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커)에 대한 핵산 및 아미노산 서열 정보는 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)와 같은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 쉽게 이용할 수 있다. 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 서열 데이터베이스로부터 유래된 예시적 핵산 및 아미노산 서열은 아래에 제공된다.
아래에서 더 논의되는 바와 같이, 골수성 세포에서 본 발명에 포함되는 바이오마커의 발현, 번역, 분해, 양, 세포내 국재화 및 다른 활성을 조절하는 작용제는 이러한 세포의 염증성 표현형을 조절할 뿐만 아니라 이러한 세포에 의해 매개된 면역 반응을 조절하는 데에도 유용하다.
인간 서열에 대한 다수의 대표적인 오르토로그가 아래에 제공되지만, 일부 실시형태에서, 인간 바이오마커(이의 조절 및 조절성 작용제를 포함)가 바람직하다. 일부 바이오마커의 경우, 인간에서 이러한 바이오마커에 의해 매개된 면역 반응은 인간 면역 체계와 다른 척추동물의 면역 체계 간의 차이를 고려하여 특히 유용하다고 여겨진다.
용어 "LRRC25"는 류신 풍부 반복부 함유 25(Leucine Rich Repeat Containing 25)를 지칭한다. RRC25 유전자는 비장 및 골수를 비롯한 조직에서 광범위하게 발현된다. LRRC25 단백질은 선천성 및 후천성 면역 세포의 활성화에 관여할 수 있다. 이는 CD40-활성화된 단핵구-유래 수지상 세포에서 하향조절된다. LRRC25와 관련된 질환은 일과성 전체 기억상실(transient global amnesia)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간의 19p 염색체에 위치한 LRRC25 유전자는 3개의 엑손으로 구성된다. 오르토로그는 침팬지, 레서스 원숭이, 개, 젖소, 마우스 및 래트에서 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 인간 LRRC25 단백질은 305개의 아미노산을 갖고/갖거나 33179Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, LRRC25 단백질은 2카피의 류신 풍부 반복부 및 GRB2-결합 어댑터를 포함한다.
용어 "LRRC25"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 LRRC25 cDNA 및 인간 LRRC25 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/126364 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 LRRC25 (NP_660299.2)은 전사체(NM_145256.2)에 의해 암호화된다. 인간 이외의 유기체에서 LRRC25 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 침팬지 LRRC25(XM_009435028.3 및 XP_009433303.1; 및 XM_001173930.6 및 XP_001173930.1), 레서스 원숭이 LRRC25(XM_001114428.3 및 XP_001114428.1), 개 LRRC25(XM_847238.5 및 XP_852331.3; 및 XM_014122405.2 및 XP_013977880.1), 소 LRRC25(XM_005208421.4 및 XP_005208478.1), 마우스 LRRC25(NM_153074.3 및 NP_694714.1) 및 래트 LRRC25(XM_573882.6 및 XP_573882.1; XM_006252977.3 및 XP_006253039.1; XM_008771187.2 및 XP_008769409.1; XM_006252978.3 및 XP_006253040.1; 및 XM_008771188.2 및 XP_008769410.1)를 포함한다. LRRC25 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
LRRC25 단백질을 검출하기에 적합한 항-LRRC25 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 항체 GTX45692(진텍스, 캘리포니아주 어바인 소재), 항체 sc-514216(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 NBP2-03747, NBP1-83476 및 NBP2-45673(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴 소재), 항체 ab84954(압캠, 메사추세츠주 케임브리지 소재), 항체 Cat #: TA504941 및 CF504941(오리젠, 메릴랜드주 록빌 소재) 등을 포함한다. 또한, LRRC25 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. LRRC25의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000541158.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티 소재)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, LRRC25 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대, 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR325688, shRNA 제품 # TL303467, TR303467, TG303467, TF303467, TL303467V 및 CRISPR 제품 #KN209911, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K3598208)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-414270) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-97675 및 sc-149064)에서 찾을 수 있다. 용어는 LRRC25 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 LRRC25 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
* 표 1에 열거된 본 발명에 포함되는 바이오마커의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 본 명세서에 제공된 고유 식별자로 GenBank에 제출되었으며, GenBank에 제출된 이러한 고유하게 확인된 각 서열은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
* RNA 핵산 분자(예를 들어, 우리딘으로 대체된 티미딘), 암호화된 단백질의 오르토로그를 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라, 표 1에 열거된 임의의 공개적으로 이용 가능한 서열의 핵산 서열(예를 들어, 하기를 참조) 또는 이들의 일부와 이들의 전체 길이에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 핵산 서열이 표 1에 포함되어 있다. 이러한 핵산 분자는 본 명세서에서 더 기재되는 바와 같이 전장 핵산의 기능을 가질 수 있다.
* 단백질의 오르토로그뿐만 아니라, 표 1에 열거된 공개적으로 이용 가능한 서열의 핵산 서열(예를 들어, 하기를 참조) 또는 이의 일부와 전체 길이에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 표 1에 포함되어 있다. 이러한 폴리펩타이드는 본 명세서에서 더 기재되는 바와 같이 전장 폴리펩타이드의 기능을 가질 수 있다.
* 열거된 바이오마커에 대한 추가적인 알려진 핵산 및 아미노산 서열이 표 1에 포함되어 있다.
IV. 항체 및 이의 항원-결합 단편
골수성 세포의 염증성 표현형은 소정의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)의 양 및/또는 활성을 조절함으로써 조절될 수 있으며, 이러한 염증성 표현형 조절은 또한 면역 반응을 조절한다.
본 발명은 표적 표 1에 열거된 표적을 조절하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 이러한 조성물은 단핵구 및/또는 대식세포 염증성 표현형을 상향조절 또는 하향조절하여 면역 반응을 각각 상향조절 또는 하향조절하는데 유용하다. 이러한 조성물은 또한 표적 표 1에 열거된 표적의 양 및/또는 활성을 검출하는데 유용하므로, 작용제는 이러한 표적에 의해 매개되는 효과를 진단, 예후예측 및 스크리닝하는데 유용하다.
대표적인, 예시적인, 비제한적인 항체가 아래 표 2에 제시된다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
* 표 2는 Kabat 명명법에 따른 CDR 서열로서 밑줄 친 서열 및 Chothia 명명법에 따른 CDR 서열로서 볼드체 서열을 열거한다. CDR1, CDR2 및 CDR3은 왼쪽(N-말단)에서 오른쪽(C-말단)으로 나타나는 표준 순서로 나타나 있다.
* 표 2는 Chothia CDR, Kabat CDR, AbM, CDR 접촉 영역 및/또는 형태적 정의를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 항체 및 항원-결합 단편의 대표적인 CDR 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat CDR이다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia CDR이다. 일부 실시형태에서, CDR은 확장된 CDR이며, 이는 Kabat 및 Chothia 명명법에 따라 확인된 모든 아미노산 잔기를 지칭한다. 따라서, 하나 이상의 CDR을 갖는 일부 실시형태에서, CDR 중 하나 이상은 Kabat, Chothia, 확장된 CDR 또는 이들의 조합 중 임의의 것일 수 있다.
* 표 2는 경쇄 및 중쇄 서열의 대표적인 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항체 및 항원-결합 단편은 표 2에 나타낸 경쇄의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 및 항원-결합 단편은 표 2에 나타낸 중쇄의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 및 항원-결합 단편은 표 2에 나타낸 경쇄 및 중쇄의 쌍의 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 및 항원-결합 단편은 표 2에 나타낸 동일한 대표적인 항체로부터의 경쇄 및 중쇄의 쌍의 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함한다.
a. 항체 및 이의 항원-결합 단편의 조성물
일반적으로, 본 발명에 포함되는 항체 및 이의 항원-결합 단편은 LRRC25 폴리펩타이드를 발현하는 골수성 세포에 결합하는 능력 및 골수성 세포의 염증성 표현형의 증가를 나타내는 것을 특징으로 한다.
LRRC25에 대해 지시되는 항체(예를 들어, 단리된 단일클론 항체)뿐만 아니라 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 일부 실시형태에서, mAb는 아래에 추가로 기술되는 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)에 기탁되었다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 한다는 것이 당업계에 잘 알려져 있기 때문에, 표 2에 제시된 것들과 같은 본 발명에 포함되는 항체는 바람직하게는 본 발명에 포함되는 가변 영역의 중쇄 및 경쇄 CDR3(예를 들어, 표2의 서열 또는 이의 일부를 포함)을 포함한다. 항체는 본 발명에 포함되는 가변 영역의 CDR2(예를 들어, 표2의 서열 또는 이의 일부를 포함)를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 본 발명에 포함되는 가변 영역의 CDR1(예를 들어, 표2의 서열 또는 이의 일부를 포함)을 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체는 CDR의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3은 본 발명에 포함되는 동일한 중쇄 또는 경쇄 서열(예를 들어, 표2의 서열 또는 이의 일부를 포함) 내에서 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3은 본 발명에 포함되는 동일한 중쇄 및 경쇄 서열 쌍(예를 들어, 표2의 서열 또는 이의 일부를 포함) 내에서 선택될 수 있다.
위에 기재된 항체 및 이의 항원-결합 단편의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 본 발명에 포함되는 가변 영역의 것(예를 들어, 표2의 서열 또는 이의 일부를 포함)과 같은 정확한 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자는 LRRC25에 효과적으로 결합하는 항체의 능력을 여전히 유지하면서 정확한 CDR 서열로부터 약간의 편차가 있을 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, 보존적 서열 변형). 따라서, 또 다른 실시형태에서, 조작된 항체는 본 발명에 포함되는 하나 이상의 CDR(예를 들어, 표2의 서열 또는 이의 일부를 포함)과, 예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR로 구성될 수 있다.
알려진, 비-인간 또는 인간 항체(예를 들어, 마우스 또는 비-설치류 항-인간 LRRC25 항체)의 구조적 특징은 LRRC25의 결합과 같은 본 발명에 포함되는 항체의 적어도 하나의 기능 특성을 유지하는 구조적으로 관련된 인간 항-인간 LRRC25 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 또 다른 기능 특성은 경쟁 ELISA 검정에서 원래의 알려진, 비-인간 또는 인간 항체의 결합을 저해하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 LRRC25에 결합할 수 있는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 제공되되, 이는 중쇄를 포함하며, 가변 도메인은 적어도 표 2에 제시된 중쇄 가변 도메인 CDR의 그룹과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
유사하게는, 인간 LRRC25와 결합할 수 있는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 또한 제공되되, 이는 경쇄를 포함하며, 가변 도메인은 적어도 표 2에 제시된 경쇄 가변 도메인 CDR의 그룹과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
인간 LRRC25에 결합할 수 있는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 또한 제공되되, 이는 중쇄를 포함하며, 가변 도메인은 적어도 표 2에 제시된 중쇄 가변 도메인 CDR의 그룹과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 CDR을 포함하고; 그리고 이는 경쇄를 포함하며, 가변 도메인은 적어도 표 2에 제시된 경쇄 가변 도메인 CDR의 그룹과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
당업자는 이러한 백분율 상동성이 본 발명에 포함되는 변이와 동등하거나 또는 대신에 주어진 관심 CDR 내에서 보존적 치환과 같은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있음에 유의하여야 할 것이다.
본 발명에 포함되는 항체 및 이의 항원-결합 단편은 중쇄를 포함할 수 있되, 가변 도메인은 적어도 표 2에 제시된 중쇄 가변 도메인 CDR 및 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 CDR을 포함하고, 가변 도메인은 적어도 표 2에 제시된 경쇄 가변 도메인 CDR로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
이러한 항체 및 이의 항원-결합 단편은 경쇄를 포함할 수 있되, 가변 도메인은 적어도 본 명세서에 기재된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 CDR을 포함하고; 그리고/또는 중쇄, 가변 도메인은 적어도 본 명세서에 기재된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 LRRC25에 결합할 수 있는 항체 및 이의 항원-결합 단편은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
본 발명에 포함되는 항체 및 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 도메인은 표 2에 제시된 vH 아미노산 서열 및/또는 본 발명에 포함되는 항체 및 이의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있고, 표 2에 제시된 vκ 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다.
본 발명에 포함되는 항체 및 이의 항원-결합 단편은 당업계에 잘 알려진 임의의 기법에 의해 생성되고 변형될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체 및 이의 항원-결합 단편은 뮤린 또는 비-설치류 항체일 수 있다. 유사하게는, 이러한 항체 및 이의 항원-결합 단편은 키메라, 바람직하게는 키메라 마우스/인간 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 및 이의 항원-결합 단편은 가변 도메인이 인간 수여체 프레임워크 영역 및 존재하는 경우, 선택적으로 인간 불변 도메인, 및 비-인간 공여체 CDR, 예컨대, 위에 정의된 바와 같은 마우스 또는 비-설치류 CDR을 포함하도록 하는 인간화된 항체이다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄는 각각 표 2에 제공된 vH 또는 vκ 가변 도메인 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 vH 가변 도메인, vκ 가변 도메인, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 본 발명의 항체, 면역글로불린 및 폴리펩타이드는 단리된(예를 들어, 정제된) 형태로 사용되거나 또는 막 또는 지질 소포(예를 들어, 리포솜)과 같은 벡터에 포함될 수 있다.
다수의 변형, 단편 등이 추가로 상정된다.
일반적으로, 용어 "항체" 또는 "Ab"는 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 제한 없이, 전체 항체, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 이중특이성 항체, 삼중특이성 또는 더 큰 다중특이성의 항체), 항체의 자연 발생적 형태(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE) 및 재조합 항체, 항체 단편, 다이어바디, 항체 변이체 및 다른 펩타이드의 일부이거나 이와 관련된 항체-유래 결합 도메인을 포함한다. 항체는 주로 아미노산 기반 분자이지만, 또한 하나 이상의 변형(당 모이어티, 형광 모이어티, 화학적 태그 등의 추가를 포함하지만 이들로 제한되지 않음)을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 항체는 비-아미노산-기반 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 항체는 자연 발생적이거나 또는 생물 공학에 의해 생성될 수 있다.
항체 및 이의 항원-결합 단편은 단리될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된 항체"는 다른 항체(예컨대, 상이한 항원 특이성을 갖는 것)가 실질적으로 없는 항체 조성물(예컨대, 목적하는 항원 특이성을 가짐)(예를 들어, LRRC25에 결합하며, LRRC25에 결합하지 않는 항체가 실질적으로 없는 단리된 항체)을 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 그러나, LRRC25에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 상이한 패밀리 구성원, 종 등으로부터의 것들과 같은 관심 다른 단백질에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 항체는 인간 및 비-설치류 동물, 또는 다른 포유동물 또는 비-포유동물 종과 같은 다른 동물과 같은 적어도 2개의 종에 대해 특이적인 결합 친화성을 유지한다. 그러나, 일부 실시형태에서, 항체는 인간 LRRC25에 대해 더 높거나 또는 실제로 특이적인 친화성 및/또는 선택성을 유지한다. 또한, 단리된 항체는 전형적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없다. 일 실시형태에서, 인간 LRRC25에 대해 상이한 특이성을 갖는 "단리된" 단일클론 항체의 조합은 잘 정의된 조성으로 조합된다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인뿐만 아니라 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 용어 "Fc 영역"은 천연-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄-사슬 Fc 영역은 일반적으로 Cys226 위치 또는 Pro230 위치의 아미노산 잔기에서 이의 카복실-말단까지 뻗어 있는 것으로 정의된다. 본 발명에 포함되는 항체에 사용하기에 적합한 천연-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B 등), IgG3 및 IgG4를 포함한다.
용어 "천연형 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질을 지칭한다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄애 연결되는 반면, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 동형 단백질(예를 들어, IgG, IgA, IgE 및 IgM)의 중쇄에 따라 다르다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 브리지를 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)이 있고, 그 뒤에 여러 불변 도메인이 있다. 각각의 경쇄는 하나의 말단(VL)에 가변 도메인이 있고, 및 다른 말단에 불변 도메인이 있으며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 항체의 두 중쇄 중 중쇄의 나머지 불변 도메인은 항체의 단편 결정화 가능(fragment crystallizable: Fc) 영역으로 구성된다.
항체의 꼬리 영역에 있는 Fc 영역은 Fc 수용체라고 하는 세포 표면 수용체 및 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용한다. 일반적으로, 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고 대립유전자 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이싱 형태를 포함하는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것이며, FcγRII 수용체는 세포질 도메인이 다른 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에 면역수용체 타이로신-기반 저해 모티프(ITIM)를 포함한다(문헌[M.
Figure pct00011
, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에서 검토되었다. 미래에 확인될 것을 포함하는 다른 FcR은 본 명세서에서 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하여 카파 및 람다라고하는 두 가지의 분명하게 구별되는 유형 중 하나에 할당된 임의의 척추동물 종의 항체 성분을 지칭한다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 클래스에 할당될 수 있다. 온전한 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 다섯 가지 주요 클래스가 있으며, 이들 중 일부는 하위클래스(동형 단백질), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 나뉠 수 있다. 인간 또는 인간 키메라 항체와 같은 항체의 CL은 카파 클래스 또는 람다 클래스와 같은 Ig에 속하는 임의의 영역일 수 있다.
용어 "가변 도메인"은 항체 사이에서 서열이 광범위하게 다르며 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는, 항체 중쇄 및 경쇄 둘 다의 특정 항체 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "VH"는 "중쇄 가변 도메인"을 지칭하고, 용어 "VL"은 "경쇄 가변 사슬"을 지칭한다. 가변 도메인은 초가변 영역을 포함한다. 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 아미노산 잔기를 포함하는 가변 도메인 내의 영역을 지칭한다. 이러한 영역은 서열에서 초가변적이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성한다. 초 가변 영역 내에 존재하는 아미노산은 항체의 항원-결합 부위의 일부가 되는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)의 구조를 결정한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH(H1, H2, H3)에 3개 그리고 VL(L1, L2, L3)에 3개를 포함한다. 천연형 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 다양성을 나타내며, 특히 H3은 항체에 우수한 특이성을 부여하는데 고유의 역할을 하는 것으로 여겨진다(예를 들어, 문헌[Xu et al. (2000) Immunity 13, 37-45; Johnson and Wu (2003) Meth. Mol. Biol. 248:1-25] 참조). 용어 "CDR"은 표적 항원 또는 에피토프에 상보적인 구조를 포함하는 항체의 영역을 지칭한다.
항원과 상호 작용하지 않는 가변 도메인의 다른 부분은 프레임워크(framework: FW) 영역으로 지칭된다. 항원-결합 부위(항원 결합 부위(antigen combining site) 또는 파라토프라고도 알려져 있음)는 특정 항원과 상호작용하는데 필요한 아미노산 잔기를 포함한다. 항원-결합 부위를 구성하는 정확한 잔기는 전형적으로 결합된 항원을 사용하는 공동 결정학에 의해 설명되지만, 다른 항체와의 비교에 기초한 계산적 평가 또한 사용될 수 있다(문헌[Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p47-54]). CDR을 구성하는 잔기를 결정하는 것은 Kabat(Wu et al. (1970) JEM 132:211-250; Kabat et al. (1992) in "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services; Johnson et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28:214-218]), Chothia(문헌[Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901; Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948), Lefranc (Lefranc et al. (1995) Immunome Res. 1:3]), Honegger(문헌[Honegger and Pluckthun (2001) J. Mol. Biol. 309: 657-670]) 및 MacCallum(문헌[MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 262:732])에 의해 교시된 것들을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 넘버링 체계의 사용을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 시스템에 따른 CDR 정의는 인접한 프레임워크 영역과 관련하여 길이 및 경계 영역이 상이할 수 있다. 예를 들어, Kabat, Chothia 및/또는 MacCallum 등을 참조한다(문헌[Kabat et al., in "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901; 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. (1996) 262, 732], 이들 각각은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
VH 및 VL 도메인은 각각 3개의 CDR을 갖는다. VL CDR은 가변 도메인 폴리펩타이드를 따라 N-말단에서 C-말단으로 이동할 때 발생하는 순서대로 본 명세서에서 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 지칭된다. VH CDR은 가변 도메인 폴리펩타이드를 따라 N-말단에서 C-말단으로 이동할 때 발생하는 순서대로 본 명세서에서 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 지칭된다. 각각의 CDR은 항원-결합 도메인에서 다양한 3차원 구조를 생성하는 항체 사이의 서열 및 길이가 매우 가변적일 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 제외하고는 표준 구조를 선호한다(문헌[Nikoloudis et al. (2014) Peer J. 2:e456]). 일부 경우에서, CDR-H3은 항체 다양성을 평가하기 위해 관련된 항체의 패널 중에서 분석될 수 있다. CDR 서열을 결정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 항체 서열에 적용될 수 있다(문헌[Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p47-54]).
본 명세서에 기재된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 Chothia CDR, Kabat CDR, AbM, CDR 접촉 영역 및/또는 형태적 정의에 따라 정의된 CDR을 포함하는 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. CDR 영역의 결정은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 및 Chothia CDR("조합된 CR" 또는 "확장된 CDR"로 지칭됨)의 조합일 수 있는 것으로 이해된다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat CDR이다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia CDR이다. 일부 실시형태에서, CDR은 확장된 CDR이며, 이는 Kabat 및 Chothia 명명법에 따라 확인된 모든 아미노산 잔기를 지칭한다. 따라서, 하나 이상의 CDR을 갖는 일부 실시형태에서, CDR 중 하나 이상은 임의의 Kabat, Chothia, 확장된 CDR 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 단편 및 변이체는 온전한 항체의 임의의 부분을 포함할 수 있다. 용어 "항체 단편" 및 "항체 변이체"는 또한 복합체를 형성하기 위해 특정 항원에 결합함으로써 항체처럼 작용하는 임의의 합성 또는 유전자 조작 단백질/폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 단편 및 변이체는 온전한 항체로부터의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; Fd, 다이어바디; 인트라바디, 선형 항체; 단일 사슬 가변 단편(단일 사슬 가변 단편: scFv)과 같은 단일-쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이성 항체 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 구조에 관계없이, 항체 단편 또는 변이체는 모 전장 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다.
야생형 항체의 제한된 단백질 가수분해에 의해 생성된 항체 단편은 단백질 가수분해성 항체 단편이라 불린다. 이는 Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. 또한 잔류 "Fc" 단편이 생성되며, 그 명칭은 쉽게 결정화할 수 있는 능력을 반영한다. 펩신 또는 피신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다. 일반적으로, F(ab')2 단편은 2개의 "암(arm)"을 포함하며, 이들 각각은 공통 항원에 대해 지시되며 이에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함한다. 2개의 Fab' 분자는 중쇄의 힌지 영역에서 사슬간 이황화 결합에 의해 연결되고; Fab' 분자는 동일한(2가) 또는 상이한(이중특이성) 에피토프에 대해 지시될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "Fab' 단편"은 Fab 및 힌지 영역을 통한 중쇄의 추가적인 부분을 포함하는 단일 항-결합 도메인을 함유한다. 본 발명에 포함되는 화합물 및/또는 조성물은 이러한 단편 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
용어 "Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 이러한 영역은 단단한, 비-공유 결합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. Fv 단편은 단백질 가수분해성 절단에 의해 생성될 수 있지만, 대체로 불안정하다. 전형적으로 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 가요성 링커의 삽입을 통해(단일 사슬 Fv(scFv)을 형성하기 위해) 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 사이에 이황화 브리지의 도입을 통해 안정한 Fv 단편을 생성하기 위한 재조합 방법이 당업계에 공지되어 있다(문헌[Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p46-47]).
용어 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv"는 VH 및 VL 항체 도메인의 융합 단백질을 지칭하되, 이러한 도메인은 가요성 펩타이드 링커에 의해 단일 폴리펩타이드 사슬로 함께 연결된다. 일부 실시형태에서, Fv 폴리펩타이드 링커는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, VH 및 VL 도메인은 10개 내지 30개의 아미노산 잔기의 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, scFv는 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 또는 다른 디스플레이 방법과 함께 이용되며, 여기서 이들은 표면 구성원(예를 들어, 파지 외피 단백질)과 함께 발현될 수 있고, 주어진 항원에 대한 고친화성 펩타이드의 확인에 사용된다. 일부 실시형태에서, 용어 "단일-쇄 항체"는 2개의 단일-쇄 항체(이들 각각은 상이한 에피토프로 향할 수 있음)가 이황화 결합에 의해 함께 연결된 이황화-연결된 Fv(dsFv)를 더 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 분자 유전학을 사용하여, 2개의 scFv는 "탠덤 scFv"(tascFv)라 불리는 링커 도메인에 의해 분리된 단일 폴리펩타이드로 나란히(in tandem) 조작될 수 있다. 2개의 상이한 scFv에 대한 유전자로 tascFv를 구축하면 "이중특이성 단일-쇄 가변 단편"(bis-scFv)이 생성된다(문헌[Nelson (2010) Mabs 2:77-83]). IgG의 맥시바디(Fc(CH2-CH3 도메인의 아미노 말단에 융합된 2가 scFv) 또한 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 변형된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 비-제한적 예로서, 변형된 Fc 영역은 미국 공개 US 2015-0065690에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있거나 또는 이에 기재된 임의의 영역일 수 있다.
본 발명에 포함되는 항체 및 항원-결합 단편은 "재조합"일 수 있으며, 이 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 및 이의 항원-결합 단편, 예컨대, (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마(아래에 추가로 기재됨)에 대해 유전자 이식(transgenic)되거나 또는 염색체 이식(transchromosomal)된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어, 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱 하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포계열 및/또는 비-생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 소정의 실시형태에서, 그러나, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 동물 형질전환이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거칠 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만 생체내 인간 항체 생식세포계열 래퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대, (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마(아래에 추가로 기재됨)에 대해 유전자 이식되거나 또는 염색체 이식된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어, 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱 하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포계열 및/또는 비-생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 소정의 실시형태에서, 그러나, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 동물 형질전환이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거칠 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만 인간 항체 생식세포계열 래퍼토리 생체내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "다중클론 항체"는 많은 에피토프를 갖는 단백질에 대한 면역원성 반응으로 생성된 항체를 포함한다. 따라서, 다중클론 항체의 조성물(예를 들어, 혈청)은 단백질 내의 동일하거나 상이한 에피토프에 대한 다양한 상이한 항체를 포함한다. 다중클론 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Cooper et al., Section III of Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, 1992, pages 11-37 to 11-41] 참조).
대조적으로, 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 세포(또는 클론)의 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 단일클론 항체의 생성 중에 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하고/하거나 항원의 동일한 특정 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원에 있는 단일 결정인자에 대해 지시된다. 변형인자(modifier) "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 단일클론 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성이며, 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인, "키메라" 항체(면역글로불린)뿐만 아니라 이러한 항체의 단편을 포함한다.
용어 "항체 변이체"는 변형된 항체(천연형 또는 출발 항체와 관련하여) 또는 천연형 또는 출발 항체(예를 들어, 항체 모방체)와 비교하여 이들의 아미노산 서열, 조성 또는 구조의 일부 차이를 포함하는 구조 및/또는 기능에서 천연형 또는 출발 항체와 유사한 생체 분자를 지칭한다. 항체 변이체는 천연형 항체와 비교하여 이들의 아미노산 서열, 조성 또는 구조가 변경될 수 있다. 항체 변이체는 변경된 동형 단백질(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM)을 갖는 항체, 인간화된 변이체, 최적화된 변이체, 다중특이성 항체 변이체(예를 들어, 이중특이성 변이체) 및 항체 단편을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, S228P와 같은 Ser 228에서 치환을 갖는 돌연변이체 IgG4와 같은 돌연변이체 불변 사슬 영역이 상정된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 항체 융합 단백질을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체 융합 단백질"은 동일하거나 상이한 특이성을 갖는 2개 이상의 동일하거나 상이한 천연의 항체, 단일-쇄 항체 또는 항체 단편 세그먼트가 연결된 재조합적으로 생성된 항원-결합 분자이다. 융합 단백질의 원자가는 융합 단백질이 항원 또는 에피토프에 대해 갖는 결합 암 또는 부위의 총 수를 나타낸다; 즉, 1가, 2가, 3가 또는 다가. 항체 융합 단백질의 다중 원자가는 항원에 대한 결합에서 다중 상호작용의 이점을 취할 수 있음을 의미하며, 따라서 항원에 대한 결합력을 증가시킨다. 특이성은 항체 융합 단백질이 결합할 수 있는 상이한 항원 또는 에피토프의 수, 즉, 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성, 다중특이성 등을 나타낸다. 이러한 정의를 사용하면, 천연의 항체, 예를 들어, IgG는 2개의 결합 암이 있기 때문에 2가이지만, 하나의 항원에 결합하기 때문에 단일특이성이다. 단일특이성의, 다가 융합 단백질은 에피토프에 대해 하나 이상의 결합 부위를 갖지만, 동일한 항원, 예를 들어, 동일한 항원과 반응하는 2개의 결합 부위를 갖는 다이어바디에서 동일한 에피토프와만 결합한다. 융합 단백질은 상이한 항체 성분의 다가 또는 다중특이성 조합 또는 동일한 항체 성분의 다중 카피를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 치료제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질에 적합한 치료제의 예는 면역조절인자("항체-면역조절인자 융합 단백질") 및 독소("항체-독소 융합 단백질")을 포함한다. 하나의 바람직한 독소는 리보뉴클레이스(RNase), 바람직하게는 재조합 RNase를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 다중특이성 항체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "다중특이성 항체"는 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "멀티바디" 또는 "다중특이성 항체"는 2개 이상의 가변 영역의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 에피토프는 동일하거나 상이한 표적에 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 다중특이성 항체는 PCT 공개 WO 2011/109726 및 미국 공개 제2015-0252119호에 기재된 방법에 의해 생성되고 최적화될 수 있다. 이러한 항체는 높은 특이성 및 고친화성을 갖는 다중 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 항체는 "이중특이성 항체"이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "이중특이성 항체"는 동일하거나 상이한 항원에 있는 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일 양태에서, 이중특이성 항체는 2개의 상이한 항원과 결합할 수 있다. 이러한 항체 전형적으로 적어도 2개의 상이한 항체로부터의 항원-결합 영역을 포함한다. 예를 들어, 이중특이성 단일클론 항체(BsMAb, BsAb)는 2개의 상이한 단일클론 항체의 단편으로 구성된 인공 단백질이므로, 따라서 BsAb가 2개의 상이한 유형의 항원에 결합할 수 있게 한다. 이중특이성 항체는 문헌[Riethmuller (2012) Cancer Immun. 12:12-18, Marvin et al. (2005) Acta Pharmacol. Sinica 26:649-658, 및 Schaefer et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:11187-11192]에 기재된 임의의 것들을 포함할 수 있다. "3작용성 이중특이성" 항체라 불리는 새로운 세대의 BsMAb가 개발되었다. 이는 2개의 상이한 항체로부터 각각 하나씩 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성되며, 여기서 2개의 Fab 영역(암)은 2개의 항원에 대해 지시되고, Fc 영역(발)은 2개의 중쇄를 포함하며, 세 번째 결합 부위를 형성한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조성물은 항-펩타이드 항체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항-펩타이드 항체"는 그것이 유래되는 단백질(예를 들어, 본 발명에 포함되는 표적 단백질)의 단리된 몇몇(바람직하게는, 하나) 에피토프에 상응하는 짧은(전형적으로, 5개 내지 20개의 아미노산) 면역원성 폴리펩타이드에 대한 체액 반응에서 생성되는 "단일특이성 항체"를 지칭한다. 복수의 항펩타이드 항체는 단백질의 특정 부분, 즉, 적어도 하나의, 바람직하게는 하나의 에피토프만을 함유하는 아미노산 서열에 대해 지시되는 다양한 상이한 항체를 포함한다. 항펩타이드 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Cooper et al., Section III of Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, 1992, pages 11-42 to 11-46] 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 다이어바디를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "다이어바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭한다. 다이어바디는 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 경쇄 가변 도메인 VL에 연결된 중쇄 가변 도메인 VH를 포함한다. 아주 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬에 있는 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하게 함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 다이어바디는 예를 들어, EP 제404,097호; WO 93/11161; 및 문헌[Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448]에 더 충분히 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 인트라바디를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "인트라바디"는 항체의 특성을 갖지만, 관심 세포내 표적에 결합하고/하거나 이를 저해하기 위해 세포 내에서 발현될 수 있는 잘 알려진 항원-결합 분자의 유형이다(문헌[Chen et al. (1994) 인간 유전자 Ther. 5:595-601]). 단일-쇄 항체(scFv)의 사용, 초안정성을 위한 면역글로불린 VL 도메인의 변형, 감소하는 세포내 환경에 저항하기 위한 항체의 변형, 세포내 안정성을 증가시키고/시키거나 세포내 국재화를 조절하는 융합 단백질의 생성 등과 같은, 세포내 모이어티를 표적화(예를 들어, 저해)하기 위해 항체를 적응시키기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 세포내 항체는 예를 들어, 예방적 및/또는 치료적 목적(예를 들어, 유전자 요법으로서)을 위해, 다세포 유기체의 하나 이상의 세포, 조직 또는 장기로 도입되고 발현될 수 있다(적어도 PCT 공개 WO 08/020079, WO 94/02610, WO 95/22618 및 WO 03/014960; 미국 특허 제7,004,940호; 문헌[Cattaneo and Biocca (1997)　Intracellular Antibodies: Development and Applications (Landes and Springer-Verlag publs.); Kontermann (2004) Methods 34:163-170; Cohen et al. (1998) Oncogene 17:2445-2456; Auf der Maur et al. (2001) FEBS Lett. 508:407-412; Shaki-Loewenstein et al. (2005) J. Immunol. Meth. 303:19-39] 참조).
인트라바디는 세포 과정 세포내 수송, 전사, 번역, 대사 과정, 증식성 신호전달 및 세포 분열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 세포 과정에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 방법은 인트라바디-기반 요법을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 가변 도메인 서열 및/또는 CDR 서열은 인트라바디-기반 요법을 위해 하나 이상의 작제물에 통합될 수 있다. 예를 들어, 인트라바디는 표적 하나 이상의 당화된 세포내 단백질을 표적으로 할 수 있거나 또는 하나 이상의 당화된 세포내 단백질과 대안적 단백질 간의 상호작용을 조절할 수 있다. 포유동물 세포의 상이한 구획에서 인트라바디의 세포내 발현은 기능을 차단하거나 조절할 수 있게 한다(문헌[Biocca et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Colby et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 17616-17621]). 인트라바디는 단백질 폴딩, 단백질-단백질, 단백질-DNA, 단백질-RNA 상호작용 및 단백질 변형을 변경할 수 있다. 이들은 표현형 넉아웃을 유도하고, 표적 항원에 직접 결합하거나, 세포내 수송을 우회하거나 또는 결합 파트너와의 결합을 저해함으로써 중화 작용제로 작용할 수 있다. 표적 항원에 대한 높은 특이성과 친화성으로, 인트라바디는 특정 표적 분자의 소정의 결합 상호작용을 차단하는 동시에 다른 것들을 절약하는 이점이 있다. 공여체 항체로부터의 서열은 인트라바디를 개발하는데 사용될 수 있다. 인트라바디는 종종 단리된 VH 및 VL 도메인과 같은 단일 도메인 단편 또는 세포 내의 단일 사슬 가변 단편(scFv) 항체로 재조합적으로 발현된다. 예를 들어, 인트라바디는 종종 가요성 링커 폴리펩타이드에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 단일 사슬 항체를 형성하기 위해 단일 폴리펩타이드로서 발현된다. 인트라바디는 전형적으로 이황화 결합이 결여되어 있으며, 이들의 특이적 결합 활성을 통해 표적 유전자의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다. 단일 사슬 인트라바디는 종종 재조합 핵산 분자로부터 발현되고, 세포내에서 유지되도록 조작된다(예를 들어, 세포질, 소포체 또는 주변 세포질에 유지됨). 인트라바디는 예를 들어, 문헌[Marasco et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7889-7893; Chen et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:5932-5936; Maciejewski et al. (1995) Nat. Med. 1:667-673; Marasco (1995) Immunotech. 1: 1-19; Mhashilkar et al. (1995) EMBO J. 14: 542-1451; Chen et al. (1996) Hum. Gene Therap. 7:1515-1525; Marasco (1997) Gene Ther. 4:11-15; Rondon and Marasco (1997) Annu. Rev. Microbiol. 51:257-283; Cohen et al. (1998) Oncogene 17:2445-2456; Proba et al. (1998) J. Mol. Biol. 275:245-253; Cohen et al. (1998) Oncogene 17:2445-2456; Hassanzadeh et al. (1998) FEBS Lett. 437:81-86; Richardson et al. (1998) Gene Ther. 5:635-644; Ohage and Steipe (1999) J. Mol. Biol. 291:1119-1128; Ohage et al. (1999) J. Mol. Biol. 291:1129-1134; Wirtz and Steipe (1999) Protein Sci. 8:2245-2250; Zhu et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:207-222; Arafat et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:1250-1256; der Maur et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:45075-45085; Mhashilkar et al. (2002) Gene Ther. 9:307-319; 및 Wheeler et al. (2003) FASEB J. 17:1733-1735)]에 기재되고 검토된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 키메라 항체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 중쇄 및 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성이며, 사슬(들)의 나머지는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인 재조합 항체를 지칭한다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855] 참조). 예를 들어, 본 명세서에서 관심 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 구대륙 원숭이, 예컨대, 개코 원숭이, 레서스 또는 사이노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 복합 항체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "복합 항체(composite antibody)"는 2개 이상의 비관련된 가변 영역으로부터의 생식세포계열 또는 비-생식세포계열 면역글로불린 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 추가적으로, 용어 "복합 인간 항체"는 인간 생식세포계열 또는 비-생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 불변 영역 및 2개 이상의 비관련된 인간 가변 영역으로부터의 인간 생식세포계열 또는 비-생식세포계열 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 복합 인간 항체는 인체 내에서 복합 인간 항체의 항원성이 저하되기 때문에 본 발명에 따른 치료제의 유효 성분으로 유용하다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 이종 항체를 포함할 수 있다. 용어 "이종 항체"는 이러한 항체를 생성하는 형질전환 비-인간 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는 형질전환 비-인간 동물로 구성되지 않은 유기체 및 일반적으로 형질전환 비-인간 동물 이외의 종으로부터 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 인간화된 항체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "인간화된 항체"는 하나 이상의 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체 공급원으로부터의 최소 부분과 하나 이상의 인간 면역글로불린 공급원으로부터 유래된 나머지를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수여체의 항체로부터의 초 가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 비인간 종(공여체 항체), 예컨대, 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 항체로부터의 초 가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수여체 항체)이다. 일 실시형태에서, 항체는 인간화된 전장 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 단백질 공학 기법(예를 들어, 문헌[Gussow and Seemann (1991) Meth. Enzymol. 203:99-121])을 사용하여 생성될 수 있다. 비-제한적 예로서, 항체는 미국 공개 제2013/0303399호에 교시된 방법을 사용하여 인간화되었을 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "인간화된 항체"는 또한 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식세포계열로부터 유래되는 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 인간화된 마우스는 기능하는 인간 유전자, 세포, 조직 및/또는 장기를 보유하는 마우스이다. 인간화된 마우스는 일반적으로 인간 치료제를 위한 생물학적 및 의학적 연구에서 작은 동물 모델로 사용된다. 누드 마우스 및 중증 복합형 면역부전증(severe combined immunodeficiency: SCID) 마우스가 이러한 목적으로 위해 사용될 수 있다. NCG 마우스, NOG 마우스 및 NSG 마우스는 다른 모델보다 더 효율적으로 인간 세포 및 조직을 이식하는데 사용될 수 있다. 이러한 인간화된 마우스 모델은 건강 및 병리의 시나리오에서 인간 면역 체계를 모델링하는데 사용될 수 있으며, 인간 생리와 관련된 생체내 환경에서 치료적 후보물질의 평가를 가능하게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 시스테인-변형된 항체를 포함할 수 있다. "시스테인-변형된 항체에서", 시스테인 아미노산은 유전적 조작에 의해 항체의 표면에 삽입되거나 치환되고, 예를 들어, 이황화 브리지를 통해 항체를 다른 분자에 접합시키는데 사용된다. 항체에 대한 시스테인 치환 또는 삽입은 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,219,996호 참조). 항체의 부위-특이적 접합에 사용하기 위해 IgG 항체의 불변 영역에 시스테인 잔기를 도입하는 방법은 문헌[Stimmel et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:330445-30450]에 의해 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체 변이체 항체 모방체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체 모방체(antibody mimetic)"는 항체의 기능 또는 효과를 모의하고, 이들의 분자 표적에 특이적으로 특이적으로 높은 친화성으로 결합하는 임의의 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항체 모방체는 단백질 스캐폴드로서 피브로넥틴 유형 III 도메인(Fn3)을 통합하도록 설계된 모노바디일 수 있다(미국 특허 제6,673,901호 및 제6,348,584호 참조). 일부 실시형태에서, 항체 모방체는 어피바디 분자, 아필린, 아피틴, 안티칼린, 아비머, 센타이린, DARPINS™, 파이노머 및 쿠니츠 및 도메인 펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 것들을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체 모방체는 하나 이상의 비-펩타이드 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 단일 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 극도로 작고, 분자량이 전체 크기의 mAb에서 관찰된 것의 대략 1/10이다. 또한, 항체는 경쇄가 결여되어 있는 낙타 및 라마에서 발견되는 중쇄 항체의 항원-결합 가변 중쇄 영역(VHH)으로부터 유래된 "나노바디"를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Nelson (2010) Mabs 2:77-83] 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 "소형화"될 수 있다. mAb 소형화의 하나의 예는 작은 모듈형 면역의약품(small modular immunopharmaceuticals: SMIP)이다. 1가 또는 2가일 수 있는 이러한 분자는 모두 링커 도메인에 의해 연결된 하나의 VL, 하나의 VH 항원-결합 도메인 및 1개 또는 2개의 불변 "효과기" 도메인을 함유하는 재조합 단일-쇄 분자이다(예를 들어, 문헌[Nelson (2010) Mabs 2:77-83] 참조). 이러한 분자는 불변 도메인에 의해 부여된 면역 효과기 기능을 유지하면서 단편에 의해 얻어진 증가된 조직 또는 종양 투과성의 이점을 제공하는 것으로 여겨진다. 소형화된 항체의 다른 예는 힌지 영역이 IgG4 분자로부터 제거된 "유니바디"라 한다. IgG4 분자는 불안정하며 경쇄-중쇄 이종이량체를 서로 교환할 수 있지만, 힌지 영역의 결실은 중쇄-중쇄 쌍을 완전히 방지하여 매우 특이적인 1가의 경쇄/중쇄 이종이량체를 남기고, Fc 영역을 유지하여 안정성 및 생체내 반감기를 보장한다. 이러한 구성은 IgG4가 FcR과 제대로 상호작용하지 않고 1가의 유니바디가 세포내 신호전달 복합체 형성을 촉진하지 못하기 때문에, 면역 활성화 또는 종양성 성장의 위험을 최소화할 수 있다(예를 들어, 문헌[Nelson (2010) Mabs 2:77-83] 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체 변이체는 단일-도메인 항체(sdAb 또는 나노바디)일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "sdAb" 또는 "나노바디"는 단일 모노머성 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 전체 항체와 마찬가지로, 이는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 일 양태에서, sdAb는 "낙타 Ig" 또는 "낙타 VHH"일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "낙타 Ig"는 중쇄 항체의 알려진 가장 작은 항원-결합 단위를 지칭한다(문헌[Koch-No lte et al (2007) FASEB J. 21:3490-3498]). "중쇄 항체" 또는 "낙타 항체"는 2개의 VH 도메인을 함유하고 경쇄가 없는 항체를 지칭한다(문헌[Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:733-736; Riechmann et al (1999) J. Immunol. Meth. 231:25-38]; PCT 공개 WO 1994/04678 및 WO 1994/025591; 및 미국 특허 제6,005,079호). 다른 양태에서, sdAb는 "면역글로불린 신규 항원 수용체"(immunoglobulin new antigen receptor: IgNAR)일 수 있다. 용어 "면역글로불린 신규 항원 수용체"는 1개의 가변 신규 항원 수용체(variable new antigen receptor: VNAR) 도메인과 5개의 불변 신규 항원 수용체(constant new antigen receptor: CNAR) 도메인의 동종이량체로 구성된 상어 면역 레퍼토리로부터의 항체의 클래스를 지칭한다. IgNAR은 알려진 가장 작은 면역 글로불린-기반 단백질 스캐폴드 중 일부를 나타내며, 매우 안정적이며 효율적인 결합 특징을 가지고 있다. 내재된 안정성은 (i) 뮤린 항체에서 발견되는 종래의 항체 VH 및 VL 도메인에 비해 상당한 수의 하전되고 친수성 표면 노출 잔기를 제공하는 기본 Ig 스캐폴드; 및 (ii) 루프간 이황화 브리지 및 루프내 수소 결합의 패턴을 포함하는 상보성 결정 역(CDR) 루프에서 구조적 특징의 안정화 둘 다에 기인할 수 있다. 다른 소형화된 항체 단편은 "상보성 결정 영역 펩타이드" 또는 "CDR 펩타이드"를 포함할 수 있다. CDR 펩타이드("최소 인식 단위"로도 알려짐)는 단일 상보성-결정 영역(CDR)에 상응하는 펩타이드이며, 관심 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 구성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어, 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위해 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 제조된다(예를 들어, 문헌[Larrick et al (1991) Methods Enzymol. 2:106] 참조).
항체의 항원-결합 단편을 포함하는 다른 변이체는 이황화-연결된 Fvs(sdFv), VL, VH, 낙타 Ig, V-NAR, VHH, 삼중특이성(Fab3), 이중특이성(Fab2), 트라이어바디(3가), 테트라바디(4가), 미니바디((scFv-CH3)2), 이중특이성 단일-쇄 Fv(비스-scFv), IgG델타CH2, scFv-Fc, (scFv)2-Fc, 어피바디, 펩타이드 압타머, 아비머 또는 나노바디 또는 온전한 면역글로불린의 다른 항원 결합 서브서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 미국 특허 제5,091,513호에 기재된 것과 같은 항체일 수 있다. 이러한 항체는 생합성 항체 결합 부위(biosynthetic antibody binding site: BABS)로 거동하는 영역을 구성하는 아미노산의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 부위는 1) 비-공유적으로 결합되거나 이황화 결합된 합성 VH 및 VL 이량체, 2) VH 및 VL이 폴리펩타이드 링커에 의해 부착된 VH-VL 또는 VL-VH 단일 사슬 또는 3) 개별 VH 또는 VL 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 별도의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있는 연결된 CDR 및 FR 영역을 포함한다. 생합성 항체는 또한 예를 들어, 효소, 독소, 고정화 매질 또는 방사성 원자에 대한 결합 부위 또는 부착 부위로 기능하는 다른 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 생합성 항체를 생산하고, 항체의 생체내 생성에 의해 유도될 수 있는 임의의 특이성을 갖는 BABS를 설계하고, 이의 유사체를 생산하는 방법이 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 미국 특허 제8,399,625호에 교시된 항체 수용체 프레임워크를 갖는 항체일 수 있다. 이러한 항체 수용체 프레임워크는 관심 항체로부터 CDR을 수용하는데 특히 적합할 수 있다.
일 실시형태에서, 항체는 조건부 활성 생물학적 단백질일 수 있다. 항체는 야생형의 정상적인 생리학적 조건에서 가역적 또는 비가역적으로 불활성화되는 조건부 활성 생물학적 단백질을 생성하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 조건부 활성 생물학적 단백질 및 이러한 조건부 활성 생물학적 단백질의 용도가 제공된다. 이러한 방법 및 조건부 활성 단백질은 예를 들어, PCT 공개 WO 2015/175375 및 WO 2016/036916 및 미국 공개 제2014/0378660호에 교시되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 치료적 항체이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 항체"는 질환 또는 장애가 있거나 이에 대한 소인이 있는 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 항체를 의미한다. 항체는 세포 침투 항체, 중화 항체, 효능제 항체, 부분적 효능제, 역 효능제, 부분적 길항제 또는 길항제 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 네이키드 항체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "네이키드 항체"는 독소, 또는 방사성 핵종에 결합하기 위한 킬레이트와의 접합과 같은 추가 변형을 함유하지 않는 온전한 항체 분자이다. 네이키드 항체의 Fc 부분은 보체 고정 및 ADCC(항체 의존성 세포 세포독성(antibody dependent cell cytotoxicity))과 같은 효과기 기능을 제공할 수 있으며, 이는 세포 용해를 초래할 수 있는 작용으로 메커니즘을 설정한다(예를 들어, 문헌[Markrides (1998) Pharmacol. Rev. 50:59-87] 참조).
항체가 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 세포외에 보유하는 세포의 고갈을 유발할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 고갈은 항체-매개성 세포 세포독성(ADCC), 보체-의존적 용해 및 항체에 의해 표적화되는 항원을 통해 주어진 신호를 통한 종양 성장의 직접적인 항-종양 저해의 적어도 세 가지 메커니즘을 통해 매개될 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 첫 번째 구성요소가 동족 항원에 결합된 항체에 결합함으로써 시작된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al. (1997)]에 기술되어 있는 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.
"항체-의존적 세포-매개성 세포독성" 또는 "ADCC"는 소정의 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비된 항체가 이들 세포독성 효과기 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 표적 세포를 죽일 수 있도록 하는 세포 독성의 형태를 지칭한다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기술된 것과 같은 시험관내 ADCC 검정이 수행될 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, Fc 부분은 Fc 수용체와의 목적하는 상호작용 또는 이의 결핍에 영향을 미치도록 조작될 수 있다.
Fc 수용체는 면역 반응에 참여하는 많은 세포에서 발견된다. Fc 수용체 (FcR)는 면역글로불린 폴리펩타이드(Ig)의 Fc 부분에 대한 세포 표면 수용체이다. 지금까지 확인된 인간 FcR 중에는 IgG(Fcγ R로 표기됨), IgE(Fcε R1), IgA(Fcα) 및 중합된 IgM/A(Fcμα R)을 인식하는 것들이 있다. FcR은 다음 세포 유형에서 발견된다: Fcε R I(비만 세포), Fcε R.II(많은 백혈구), Fcα R(호중구) 및 Fcμα R(선 상피(glandular epithelium), 간세포)(문헌[Hogg, N. (1988) Immunol. Today 9:185-86]). 널리 연구된 FcγR은 세포 면역 방어의 중심이며, 자가면역 질환의 발병기전에 관여하는 염증의 매개체 및 가수분해 효소의 방출을 자극하는 역할을 한다(문헌[Unkeless, J. C. et al. (1988) Annu. Rev. Immunol. 6:251-81]). FcγR은 대식세포/단핵구, 다형핵 백혈구 및 자연 살해(NK) 세포 FcγR이 IgG에 의해 매개되는 특이적인 인식 요소를 부여하기 때문에, Ig를 분비하는 효과기 세포와 림프구 사이에 중요한 연결을 제공한다. 인간 백혈구는 IgG에 대해 적어도 세 가지의 상이한 수용체를 갖는다: h Fcγ RI(단핵구/대식세포에서 발견됨), hFcγ RII(단핵구, 호중구, 호산구, 혈소판, 가능하게는 B 세포 및 K562 세포주에서) 및 Fcγ III(NK 세포, 호중구, 호산구 및 대식세포에서).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 따라 검출 목적을 위해 하나 이상의 검출 가능한 표지와 접합될 수 있다. 표지는 방사성 동위원소, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자 또는 당업계에 공지되어 있는 임의의 다른 표지일 수 있다. 일부 실시형태에서, 목적하는 표적(본 명세서에서 "일차 항체"로도 지칭됨)에 결합하는 항체는 표지되지 않지만, 일차 항체에 특이적으로 결합하는 제2 항체(본 명세서에서 "이차 항체"로 지칭됨)의 결합에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 2차 항체는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체에 부착될 수 있는 효소는 서양고추냉이 퍼옥시데이스(horseradish peroxidase: HRP), 알칼리성 포스파테이스 및 글루코스 옥시데이스(glucose oxidase: GOx)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 형광 화합물은 에티듐 브로마이드; 플루오레세인 및 이의 유도체(예를 들어, FITC); 사이아닌 및 이의 유도체(예를 들어, 인도카보사이아닌, 옥사카보사이아닌, 티아카보사이아닌 및 메로사이아닌); 로다민; 오레곤 그린; 에오신; 텍사스 레드; 나일 레드; 나일 블루; 크리스탈 바이올렛; 옥사진 170; 프로플라빈; 아크리딘 오렌지; 아크리딘 옐로우; 아우라민; 크리스탈 바이올렛; 말라카이트 그린; 포핀; 프탈로사이아닌; 빌리루빈; 알로피코시아닌(allophycocyanin: APC); 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP) 및 이의 변이체(예를 들어, 황색 형광 단백질 YFP, 청색 형광 단백질 BFP 및 시안 형광 단백질 CFP); ALEXIFLOUR® 화합물(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 매사추세츠주 월섬); 및 양자점을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 표지 항체를 표지하는데 사용될 수 있는 다른 접합체는 바이오틴, 아비딘 및 스트렙타비딘을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 포함되는 항체 또는 다른 단백질과 이종 작용제의 접합은 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 이작용성 단백질 커플링제를 사용하여 이루어질 수 있다. N-석신이미딜 (2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜 (N-말레이미도메틸)사이클로헥세인-1-카복실레이트, 이미노티올레인(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥세인다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6 다이아이소사이아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠). 예를 들어, 탄소 표지된 1-아이소티오사이아나토벤질 메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)이 항체에 대한 방사성뉴클레오타이드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다(WO 94/11026).
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포독소, 약물 및/또는 방사성 동위원소와 같은 치료적 모이어티에 접합된 관심 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체를 특징으로 한다. 세포독소에 접합될 때, 이들 항체 접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한(예를 들어, 이를 죽이는) 임의의 작용제를 포함한다. 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시 안트라신 다이온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제는 항대사성물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 붑설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 마이토마이신 C 및 시스-다이클로로다이아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 유사분열 저해제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명에 포함되는 항체는 방사성 동위원소, 예를 들어, 방사성 요오드에 접합되어 암과 같은 관련 장애를 치료하기 위한 세포독성 방사성의약품을 생성할 수 있다.
접합된 항-바이오마커 항체는, 예를 들어, 주어진 치료 양생법의 효능을 결정하거나 또는 면역요법에 가장 반응할 가능성이 있는 환자를 선택하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 조직에서 폴리펩타이드 수준을 모니터링하기 위해 진단적으로 또는 예후예측적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 관심 바이오마커에 결합하는 항체가 인식된 세포내 에피토프를 표적으로 하고, 접합된 분자로부터 나오는 신호를 분석하여 결합을 검출할 수 있도록 유세포 분석 검정에서 투과될 수 있다. 검출은 항체를 검출 가능한 물질에 커플링(즉, 물리적으로 연결)함으로써 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리 포스파테이스, β-갈락토시데이스 또는 아세틸콜린스터레이스를 포함하고; 적합한 보결 분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC), 로다민, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린(PE)을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며; 생물발광 물질의 예는 루시퍼레이스, 루시페린 및 에쿼린을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다. 항체와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "표지된"은 방사성 작용제 또는 형광단(예를 들어, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE) 또는 인도사이아닌(Cy5))과 같은 검출 가능한 물질을 항체에 커플링(즉, 물리적으로 연결)함으로써 항체의 직접적인 표지뿐만 아니라 검출 가능한 물질과의 반응성에 의한 항체의 간접적인 표지를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 포함되는 항체 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변경하는데 사용될 수 있다. 치료적 모이어티는 고전적 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 아브린, 리신 A(ricin A), 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소와 같은 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 활성 단편; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-.감마.와 같은 단백질; 또는, 생물학적 반응 개질제, 예컨대, 예를 들어, 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF") 또는 다른 사이토카인 또는 성장 인자를 포함할 수 있다.
이러한 치료적 모이어티를 항체에 접합하는 기법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303 16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119 58 (1982)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 접합은 세포에서 세포독성제 또는 성장 저해제의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"를 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티데이스-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 이황화물-함유 링커(예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 참조)가 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 및 세포독성제 또는 성장 저해제를 포함하는 융합 단백질은 재조합 기법 또는 펩타이드 합성에 의해 만들어질 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 또는 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩타이드를 암호화하는 영역에 의해 분리된 접합체의 2개의 부분을 암호화하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 항체-약물 접합체(다른 접합체: ADC) 작용제를 포함한다. ADC는 작용제가 항체에 의해 부여된 표적화 능력과 모이어티에 의해 부여된 추가적인 효과를 갖도록 하는 다른 모이어티와 항체의 접합체이다. 예를 들어, 세포독성 약물은 질환 진행(예를 들어, 종양 진행)에 기여하는 관심 세포에 대한 약물을 표적화하는 단일클론 항체에 연결되며, 내재화시 독성 페이로드(payload)를 세포로 방출할 수 있다. 위에 기재된 바와 같이 접합된 모이어티에 기초하여 상이한 효과가 달성된다.
일부 실시형태에서, 항체(및 이의 항원-결합 단편)의 구조 및 이를 암호화하는 DNA 서열에 추가적인 변형 및 변경이 이루어질 수 있으며, 바람직한 특징을 갖는 항체 및 폴리펩타이드를 암호화하는 기능적 분자를 얻을 수 있다. 예를 들어, 소정의 아미노산은 활성의 상당한 손실 없이 단백질 구조의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 상호작용 능력 및 성질이 단백질의 생물학적 기능 활성을 정의하기 때문에, 소정의 아미노산 치환은 단백질 서열 및 물론 이의 DNA 암호화 서열에서 이루어질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 얻을 수 있다. 따라서, 생물학적 활성의 상당한 손실 없이 본 발명의 항체 서열 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열에서 다양한 변경이 이루어질 수 있음이 상정된다
일 실시형태에서, 아미노산 변화는 유전자 코드의 보존에 기초한 보존적 치환을 암호화하도록 DNA 서열의 코돈을 변경함으로써 달성될 수 있다. 구체적으로, 특정 단백질의 아미노산 서열과 유전자 코드(아래에 표시됨)에 의해 정의되는 바와 같이 단백질을 코딩할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 사이에는 알려진 명확한 일치가 있다. 마찬가지로, 특정 핵산의 뉴클레오타이드 서열 및 유전자 코드(위의 유전자 코드 차트 참조)에 의해 정의된 바와 같이 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열 사이에는 알려진 명확한 일치가 있다.
위에 기재된 바와 같이, 유전자 코드의 중요하고 잘 알려진 특징은 중복성으로, 단백질을 만드는데 사용되는 대부분의 아미노산에 대해, 하나 이상의 코딩 뉴클레오타이드 트리플릿이 이용될 수 있다(위에 예시됨). 따라서, 다수의 상이한 뉴클레오타이드 서열이 주어진 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 모든 유기체에서 동일한 아미노산 서열을 생성하기 때문에 기능적으로 동등한 것으로 간주된다(소정의 유기체는 일부 서열을 다른 것으로 더 효율적으로 번역할 수 있음). 더욱이, 때때로, 퓨린 또는 피리미딘의 메틸화된 변이체가 주어진 뉴클레오타이드 서열에서 발견될 수 있다. 이러한 메틸화는 트라이뉴클레오타이드 코돈과 상응하는 아미노산 사이의 코딩 관계에 영향을 미치지 않는다.
폴리펩타이드의 아미노 서열을 변경할 때, 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다. 아미노산의 상대적인 소수성 특성은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하며, 이는 차례로 단백질과 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 정의함이 인정된다. 각 아미노산은 다음과 같은 소수성 및 전하 특징에 따라 소수성 지수가 지정되었다: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(<RTI 3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
소정의 아미노산은 유사한 소수성 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질, 즉 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 얻을 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다.
위에 개략적으로 설명된 바와 같이, 따라서 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 다양한 전술한 특징을 고려하는 예시적인 치환은 당업계에 잘 알려져 있으며, 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 아이소류신을 포함한다.
본 발명의 항체의 또 다른 유형의 아미노산 변형은, 예를 들어, 안정성을 증가시키기 위해 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변경하는데 유용할 수 있다. "변경하는"은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고/시키거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 추가하는 것을 의미한다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결된다. "N-연결된"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 측쇄로의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에서 이러한 트라이펩타이드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 추가는 아미노산 서열을 변경하여 상기 기술된 트라이펩타이드 서열(N-연결된 글리코실화 부위의 경우) 중 하나 이상을 함유하도록 편리하게 달성된다. 또 다른 유형의 공유적 변형은 글리코시드를 항체에 화학적으로 또는 효소적으로 커플링하는 것을 포함한다. 이러한 절차는 N- 또는 O-연결된 글리코실화에 대한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서의 항체의 생산을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 모드에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실기, (c) 시스테인과 같은 유리 설피드릴기, (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린과 같은 유리 하이드록실기, (e) 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판과 같은 방향족 잔기 또는 (f) 글루타민의 아마이드기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 WO87/05330에 기술되어 있다.
유사하게는, 항체에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 화합물 트라이플루오로메테인설폰산 또는 동등한 화합물에 대한 항체의 노출을 필요로 한다. 이러한 처리는 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당의 절단을 초래하는 반면, 항체는 온전한 상태로 남게 된다. 화학적 탈글리코실화는 문헌[Sojahr H. et al. (1987) and by Edge, A S. et al. (1981). Enzymatic cleavage of carbohydrate moieties on antibodies may be achieved by the use of a variety of endo- and exo-glycosidases as described by Thotakura, N R. et al. (1987)]에 기술되어 있다.
다른 변형은 면역접합체의 형성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 공유적 변형의 한 유형에서, 항체 또는 단백질은 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 다양한 비-단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 공유적으로 연결된다.
b. 항체 공학
위에 기재된 바와 같이, 항체 및 항체 단편, 예컨대, Fab 및 scFv를 생산하는 데 사용될 수 있는 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258, 498호; 문헌[Miersch et al. (2012) Methods 57:486-498; Chao et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-768), Huston et al. (1991) Methods Enzymol. 203:46-88; Shu et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7995-7999; 및 Skerra et al. (1988) Science 240:1038-1041]에 기재된 것을 포함한다.
표적 항원-특이적 항체의 단리 또는 선택 후, 항체 서열이 이러한 항체의 재조합 생성 및/또는 최적화를 위해 사용될 수 있다. 디스플레이 라이브러리로부터의 항체 단편 단리의 경우, 단리된 단편으로부터의 코딩 영역은 인간 항체를 포함하는 전체 항체 또는 임의의 다른 목적하는 표적 결합 단편을 생성하고, 예를 들어, 아래에 더 상세히 기재되는 바와 같이 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 목적하는 숙주에서 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 원한다면, IgG 항체(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생산되거나 선택된 가변 도메인 단편으로부터 추가의 테스트 및/또는 제품 개발을 위해 합성될 수 있다. 이러한 항체는 목적하는 아미노산 서열을 암호화하는 cDNA의 하나 이상의 세그먼트를 IgG 생성에 적합한 발현 벡터에 삽입함으로써 생산될 수 있다. 발현 벡터는 포유동물 세포에서 IgG 발현에 적합한 포유동물 발현 벡터를 포함할 수 있다. IgG의 포유동물 발현은 생산된 항체가 포유동물 단백질의 특징인 변형(예를 들어, 글리코실화)을 포함하고/하거나 항체 제제에 내독소 및/또는 세균성 발현 시스템의 단백질 제제에 존재할 수 있는 기타 오염물질이 없음을 보장하도록 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 친화성 성숙이 수행된다. 용어 "친화성 성숙"은 항체- 또는 항체 단편-암호화 cDNA 서열의 연속적인 라운드의 돌연변이 및 선택을 통해 주어진 표적에 대한 친화성을 증가시켜 항체를 생산하는 방법을 지칭한다. 일부 경우에서, 이러한 과정은 시험관내에서 수행된다. 이를 달성하기 위해, 가변 도메인 서열(일부 경우, CDR 코딩 서열로 제한됨)의 증폭은 점 돌연변이, 영역 돌연변이, 삽입 돌연변이 및 결실 돌연변이를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 돌연변이를 함유하는 수백만 개의 카피를 생성하기 위해 오류가 발생하기 쉬운 PCR(error-prone PCR)을 사용하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "점 돌연변이"는 뉴클레오타이드 서열 내의 하나의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드로 변경되는 핵산 돌연변이를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "영역 돌연변이"는 2개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드로 변경되는 핵산 돌연변이를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "삽입 돌연변이"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열에 삽입된 핵산 돌연변이를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "결실 돌연변이"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열로부터 제거된 핵산 돌연변이를 지칭한다. 삽입 또는 결실 돌연변이는 전체 코돈의 완전한 대체 또는 시작 코돈의 하나 또는 두개의 뉴클레오타이드를 변경함으로써 하나의 코돈을 다른 코돈으로 변경하는 것을 포함할 수 있다.
중쇄 및 경쇄 CDR 영역에 단일 돌연변이를 갖는 수백만 개의 돌연변이체를 생성하기 위해 CDR-암호화 cDNA 서열에서 돌연변이 유발이 수행될 수 있다. 다른 접근법에서, 무작위 돌연변이는 친화성을 향상시킬 가능성이 가장 높은 CDR 잔기에만 도입된다. 이러한 새로 생성된 돌연변이 유발 라이브러리는 표적 펩타이드에 대해 훨씬 더 높은 친화성을 갖는 항체 단편을 암호화하는 클론을 스크리닝하기 위한 과정을 반복하는데 사용될 수 있다. 계속되는 라운드의 돌연변이 및 선택은 더 크고 더 큰 친화성으로 클론의 합성을 촉진한다(예를 들어, 문헌[Chao et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-768] 참조).
친화성 성숙된 클론은 결합 검정(예를 들어, FACS, ELISA, 표면 플라스몬 공명 등)에 의해 결정되는 바와 같이 친화성에 기초하여 선택될 수 있다. 그런 다음, 선택된 클론은 IgG로 전환되고, 친화성 및 기능적 활성에 대해 추가로 테스트될 수 있다. 일부 경우에, 친화성 최적화의 목표는 원래의 항체의 친화성과 비교하여 친화성을 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 30-배, 적어도 40-배, 적어도 20-배, 적어도 100-배, 적어도 200-배 또는 적어도 1,000-배 이상 증가시키는 것이다. 최적화된 친화성이 목적하는 것보다 작은 경우, 과정은 반복될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 및/또는 인간화된 항체를 생성하는 것이 유용하다. 예를 들어, 인간에서 항체의 생체내 사용 및 시험관내 검출 검정을 포함하는 일부 사용의 경우, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 뮤린 단일클론 면역글로불린 및 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체와 같이 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자이다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Gillies et al. (1989) J. Immunol. Meth. 125:191-202]; 및 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호 참조).
인간화된 항체는 목적하는 표적에 결합하고, 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 분자이다. 종종, 인간 프레임워크 영역에서 프레임워크 잔기는 표적 결합을 변경, 바람직하게는 개선시키기 위해 공여체 항체의 CDR 및 프레임워크 영역으로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 이러한 프레임워크 치환은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들어, 표적 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링하고, 특정 위치에서 비정상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 서열 비교함으로써 확인된다(예를 들어, 미국 특허 제5,693,762호 및 제5,585,089호; 문헌[Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327] 참조).
항체는 예를 들어, CDR-이식(예를 들어, 유럽 공개 제239,400호; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호 참조); 베니어링 또는 리서페이싱(예를 들어, 유럽 공개 제592,106호; 유럽 공개 제519,596호; 문헌[Padlan (1991) Mol. Immunol. 28:489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Eng. 7:805-814; Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:969-973] 참조); 및 사슬 셔플링(예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호 참조)을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 인간화될 수 있다.
완전 인간 항체는 외래 단백질에 대한 면역 반응을 피하거나 완화시키기 위해 인간 환자의 치료적 치료에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하여, 위에 기재된 바와 같은 항체 디스플레이 방법을 포함하는 다양한 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741 참조). 인간 항체는 기능적 내인성 면역글로불린은 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드를 발현할 수 있는 형질전환 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드 복합체는 마우스 배아 줄기 세포에 무작위로 또는 상동 재조합으로 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오타이드에 더하여 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드는 상동 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과는 별도로 또는 동시에 비기능적으로 만들어질 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포는 증식되고, 키메라 마우스를 생성하기 위해 배반포에 미세주입된다. 그런 다음, 키메라 마우스는 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생성하기 위해 사육된다. 형질전환 마우스는 선택된 면역원(예를 들어, 표적 항원)으로 정상적인 방식으로 면역화된다. 이러한 기법을 사용하여, 유용한 인간 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 항체를 생성할 수 있다. 위에 예시한 바와 같이, 인간 항체 및 인간 단일클론 항체를 생산하는 방법 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있다(또한, 예를 들어, PCT 공개 WO 98/24893, WO 92/01047, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 제5,885,793호; 제5,916,771호; 제5,939,598호; 제6,075,181호; 및 제6,114,598호 참조).
일단 본 발명에 포함되는 항체 분자가 동물, 세포주에 의해 생산되거나, 화학적으로 합성 또는 재조합적으로 발현되면, 이는 면역글로불린 또는 폴리펩타이드 분자의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 특정 표적에 대한 친화성, 단백질 A 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제(즉, 단리)될 수 있다. 또한, 본 발명에 포함되는 항체 또는 이의 단편은 정제를 용이하게 하기 위해 본 명세서에 기재된 또는 그렇지 않으면 당업계에 공지된 이종성 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
본 발명에 따르면, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 용액에 존재하거나 또는 기질에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 셀룰로스 나노비드에 결합되며, 검출 장치의 기질의 하나 이상의 검출 영역에 제한된다.
c. 항체 생성
본 발명에 포함되는 항체 및 이의 항원-결합 단편은 자연 발생적이거나, 또는 종래의 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 돌연변이 또는 공지의 항체의 최적화, 항체 라이브러리 또는 항체 단편 라이브러리로부터의 선별 및 면역화에 의해 생성된 단일클론 항체(mAb)와 같이 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 인공적으로 제조된 것일 수 있다. 단일클론이든 다중클론이든 항체의 생성은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체의 생산을 위한 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 and "Therapeutic Antibody Engineering: Current and Future Advances Driving the Strongest Growth Area in the Pharmaceutical Industry" Woodhead Publishing, 2012]에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체뿐만 아니라 변이체 및/또는 이의 단편은 재조합 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 생산될 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 항체, 단편 또는 이의 변이체 중 적어도 하나를 암호화하기 위해 모듈형 디자인을 갖는다. 비-제한적 예로서, 폴리뉴클레오타이드 작제물은 임의의 다음의 디자인을 암호화할 수 있다: (1) 항체의 중쇄, (2) 항체의 경쇄, (3) 항체의 중쇄 및 경쇄, (4) 링커에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄, (5) VH1, CH1, CH2, CH3 도메인, 링커 및 경쇄 또는 (6) VH1, CH1, CH2, CH3 도메인, VL 영역 및 경쇄. 임의의 이러한 디자인은 또한 임의의 도메인 및/또는 영역 사이에 선택적 링커를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 항체 또는 임의의 성분 부분을 출발 분자로 사용하여 임의의 표준 클래스의 면역글로불린을 생산하도록 조작될 수 있다.
항체 개발의 방법은 전형적으로 항체 친화성 및/또는 특이성의 선택, 면역화 및/또는 확인을 위한 표적 분자의 사용에 의존한다. 일부 실시형태에서, 항체는 당업자에게 공지된 잘 확립된 방법을 사용하여 면역원으로서 작용하여 면역학적 반응을 유도하는 하나 이상의 표적 항원을 이용한 숙주의 면역화를 통해 제조될 수 있다.
d. 항체 특성화 및 효과
본 발명에 포함되는 항체는 구조, 동형 단백질, 결합(예를 들어, 친화성 및 특이성), 접합, 글리코실화 및 다른 구별되는 특징으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 포함되는 이러한 작용제는 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 항체는 인간, 뮤린(예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭 기원의 항체이다. 본 발명에 포함되는 항체는 단일특이성 또는 다중특이성일 수 있다. 다중특이성 항체는 본 발명에 포함되는 펩타이드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 본 발명에 포함되는 펩타이드 및 이종성 펩타이드 또는 고체 지지체 물질과 같은 이종성 에피토프 둘 다에 특이적일 수 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360 및 WO 92/05793; 문헌[Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69]; 미국 특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 및 제5,601,819호; 및 문헌[Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553] 참조). 예를 들어, 항체는 본 발명에 포함되는 펩타이드 서열의 반복된 단위를 포함하는 펩타이드에 대해 생성될 수 있거나, 본 발명에 포함되는 2개 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합에 대해 생성될 수 있다. 비-제한적 예로서, 비만 세포 결합 IgE 항체에 대한 항원 결합을 경쟁적으로 저해하여 비만 세포 탈과립을 저해하는 헤테로2가 리간드(heterobivalent ligand: HBL) 시스템이 설계되었다(문헌[Handlogten et al. (2011) Chem. Biol. 18:1179-1188]).
항체 특징은 시험관내 또는 생체내에서 정상적인 생리학적 조건하에서 표준과 관련하여 결정될 수 있다. 항체의 존재 또는 부재에 대해 측정될 수 있다. 이러한 측정 방법은 웨스턴 블롯, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 활성 검정, 리포터 검정, 루시퍼레이스 검정, 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 어레이, 유전자 어레이, 실시간 역전사효소(RT) PCR 등과 같은 혈청 또는 혈액과 같은 조직 또는 체액에서의 표준 측정을 포함한다.
항체는 표적 단백질상의 또는 이를 따라 임의의 수의 위치와 결합하거나 상호작용할 수 있다. 상정되는 항체 표적 부위는 표적 단백질상의 임의의 그리고 모든 가능한 부위를 포함한다. 항체는 특정 표적상의 하나 이상의 에피토프에 결합(가역적 또는 비가역적)하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 표적상의 에피토프는 하나 이상의 특징, 영역, 도메인, 화학기, 작용기 또는 모이어티를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 에피토프는 하나 이상의 원자, 원자 그룹, 원자 구조, 분자 구조, 고리형 구조, 소수성 구조, 친수성 구조, 당, 지질, 아미노산, 펩타이드, 글리코펩타이드, 핵산 분자 또는 임의의 다른 항원 구조로 구성될 수 있다.
에피토프 매핑을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 제한 없이 구조적, 기능적 및 컴퓨터를 이용한 방법을 포함한다. X-선 결정학은 결합된 항체-항원 쌍의 결정 구조가 항원의 에피토프와 항체의 파라토프 모두에서 양쪽 측쇄의 개별 아미노산과 주쇄 원자 사이의 주요 상호작용을 매우 정확하게 결정할 수 있는 잘 알려진 구조적 접근법이다. 서로 4 옹스트롬 이내의 아미노산은 일반적으로 접촉 잔기로 간주된다. 방법론은 전형적으로 항체 및 항원의 정제, 복합체의 형성 및 정제, 그리고 그 이후 회절-품질 결정을 얻기 위한 결정화 스크리닝 및 최적화의 연속 라운드를 포함한다. 구조적 용액은 싱크로트론(synchrotron) 공급원에서 빈번하게 x-선 결정학에 따라 얻어진다. 에피토프 매핑을 위한 다른 구조적 방법은 질량 분석에 결합된 수소-중수소 교환, 가교결합 질량 분석 및 핵자기 공명(NMR)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다(문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996); Abbott et al. (2014) Immunol. 142:526-535]).
에피토프 매핑을 위한 기능적 방법도 또한 당업계에 잘 알려져 있으며, 전형적으로 전체 단백질, 단백질 단편 또는 펩타이드에 대한 항체 결합의 평가 또는 정량화를 포함한다. 에피토프 매핑을 위한 기능적 방법은, 예를 들어, 선형 또는 입체형태 에피토프를 확인하는데 사용될 수 있고/있거나 2개 이상의 별도의 항체가 동일하거나 또는 유사한 에피토프에 결합할 때 추론하는데 사용될 수 있다. 에피토프 매핑을 위한 기능적 방법은, 예를 들어, 면역블롯팅 및 면역침강 검정을 포함하되, 관심 바이오마커로부터의 중첩 또는 인접 펩타이드는 본 명세서에 기재된 것과 같은 항-바이오마커 항체와의 반응성에 대해 테스트된다. 에피토프 매핑을 위한 다른 기능적 방법은 어레이-기반 올리고펩타이드 스캐닝(대안적으로 "중첩 펩타이드 스캐닝" 또는 "펩스캔 분석"으로도 알려짐), 부위-지정 돌연변이유발(예를 들어, 알라닌-스캐닝 돌연변이유발) 및 고처리량 돌연변이유발 매핑(예를 들어, 샷건 돌연변이유발 매핑)을 포함한다.
많은 유형의 경쟁적 결합 검정이 알려져 있으며, 이는 다음의 비제한적인 예를 포함한다: 고체상 직접 또는 간접 방사선면역검정(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA), 샌드위치 경쟁 검정(문헌[Stahli et al. (1983) Meth. Enzymol. 9:242]); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(문헌[Kirkland et al. (1986) J. Immunol. 137:3614]); 고체상 직접 표지된 검정 또는 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정(문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)]); I125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA(문헌[Morel et al. (1988) Mol. Immunol. 25:7]); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(문헌[Cheung et al. (1990) Virol. 176:546]); 및 직접 표지된 RIA(문헌[Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77]). 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원 및 1) 표지되지 않은 테스트 항원-결합 단백질 및 표지된 참조 항원-결합 단백질 또는 2) 표지된 테스트 항원-결합 단백질 및 표지되지 않은 참조 항원-결합 단백질의 사용을 포함한다. 경쟁적 저해는 테스트 항원-결합 단백질의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합하는 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 일반적으로, 테스트 항원-결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항원-결합 단백질(경쟁 항원-결합 단백질)은 참조 항원-결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원-결합 단백질 및 입체 장애가 발생하도록 참조 항원-결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접한 에피토프에 결합하는 항원-결합 단백질을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하는 방법에 관한 추가적인 세부사항은 본 명세서의 실시예에 제공된다. 일반적으로, 경쟁 항원-결합 단백질이 과량(예를 들어, 약 1-배, 약 5-배, 약 10-배, 약 20- 약 50-배, 또는 약 100-배 과량)으로 존재할 때, 이는 공통 항원에 대한 참조 항원-결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 50% 내지 55%, 약 55% 내지 60%, 약 60% 내지 65%, 약 65% 내지 70%, 약 70% 내지 75% 또는 약 75% 이상 저해 또는 차단할 것이다. 일부 예에서, 결합은 적어도 약 80% 내지 85%, 약 85% 내지 90%, 약 90% 내지 95%, 약 95% 내지 97% 또는 약 97% 이상 저해된다.
본 명세서에 기재된 작용제, 예컨대, 항체, 이의 항원-결합 단편, 세포 등의 효과는 특히 실시예의 관점에서 당업자에게 잘 알려진 시약, 방법, 및 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군은 위의 정의에 설명된 것과 같은 비교를 위해 사용된다. 예를 들어, 검정은 세포 또는 기질과 같은 바이오마커 표적을 관심 작용제와 접촉시키고, 목적하는 측정치(예를 들어, 양, 활성, 사이토카인 생산, 세포 증식, 세포 사멸 등)를 결정하고, 관심 항원에 특이적으로 결합하지 않는 대조군 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 대조군 작용제와의 접촉으로부터 얻어진 측정치와 같은 참조 또는 대조군으로부터의 측정치와 비교하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 알려진 측정치 또는 검정, 특히 종래의 사이토카인 생산 결정 검정, 세포 활성화 검정, 세포 증식 검정, 세포 사멸 검정, 세포 이동 검정, 세포 신호전달 검정 등과 같은 실시예에 제시된 것이 사용될 수 있다.
또한, 위의 정의에 설명된 바와 같이, 목적하는 측정치의 "현저한" 조절은 소정의 수치 이상(예를 들어, 백분율), 소정의 수치 미만(예를 들어, 백분율) 또는 소정의 수치 범위 내(예를 들어, 백분율 범위)와 같이 수치적으로 정량화될 수 있다. 정량적 측정치의 대표적인 비제한적인 예는 친화성(KD), kd, ka, 바이오마커 발현의 백분율의 증가 또는 감소, 세포의 백분율의 증가 또는 감소(예를 들어, 목적하는 세포, 목적하지 않은 세포, 목적하는 세포 대 목적하지 않은 세포의 비, 목적하는 세포 대 총 세포의 비, 목적하지 않은 세포 대 총 세포의 비 등, 한 시점 또는 상이한 시점에서의 비교 등)를 포함한다.
V. 핵산, 벡터 및 숙주 세포를 비롯한 세포
본 발명의 추가의 목적은 본 명세서에 기재된 항체 및 이의 항원-결합 단편(및 이의 단편)을 암호화하는 핵산 서열뿐만 아니라 폴리펩타이드, 벡터 및 숙주 세포를 비롯한 세포에 관한 것이다.
a. 핵산 작용제
본 발명에 포함되는 일 양태는 핵산 분자의 사용을 포함한다. 핵산 분자는 데옥시리보핵산(DNA) 분자(예를 들어, cDNA, 게놈 DNA 등), 리보핵산(RNA) 분자(예를 들어, mRNA, 긴 논-코딩 RNA, 작은 RNA 종 등), DNA/RNA 하이브리드, 및 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체일 수 있다. RNA 작용제는 RNAi(RNA 간섭) 작용제(예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA)), 단일-가닥 RNA(ssRNA) 분자(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드) 또는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자를 포함할 수 있다. dsRNA 분자는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하되, 제2 가닥은 제1 가닥에 실질적으로 상보적이며, 제1 가닥 및 제2 가닥은 적어도 하나의 이중 가닥 듀플렉스 영역을 형성한다. dsRNA 분자는 둔단(blunt-ended)이거나 또는 적어도 하나의 말단 오버행을 가질 수 있다. 표적 핵산 서열에 결합하는 작용제로서 사용될 때, 본 발명에 포함되는 핵산 작용제는 인핸서 영역, 프로모터 영역, 전사 시작 및/또는 종결 영역, 스플라이스 부위, 코딩 영역, 3'-비번역 영역(3'-UTR), 5'-비번역 영역(5'-UTR), 5' 캡, 3' 폴리 아데닐일 꼬리 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 게놈 서열 및/또는 mRNA 서열과 같은 표적 서열의 임의의 영역에 혼성화할 수 있다.
"단리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자와 분리된 것이다. 바람직하게는, "단리된" 핵산 분자는 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 자연적으로 핵산(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)의 측면에 있는 서열(바람직하게는, 단백질-암호화 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 실시형태에서, 단리된 핵산 분자는 핵산이 유래되는 세포의 게놈 DNA에서 자연적으로 핵산 분자의 측면에 있는 약 5kB, 4kB, 3kB, 2kB, 1kB, 0.5kB 또는 0.1kB 미만의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 또한, "단리된" 핵산 분자, 예컨대, cDNA 분자는 재조합 기법에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있거나 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 발명에 포함되는 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기법 및 본 명세서에 기재된 데이터베이스 기록의 서열 정보를 사용하여 단리될 수 있다. 이러한 핵산 서열의 전부 또는 일부를 사용하여, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 표준 혼성화 및 클로닝 기법을 사용하여 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2012]에 기재된 바와 같음).
본 발명에 포함되는 핵산 분자는 표준 PCR 증폭 기법에 따라 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA, 및 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산 분자는 적절한 벡터로 클로닝되고, DNA 서열 분석에 의해 특성화될 수 있다. 또한, 본 발명에 포함되는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 상응하는 핵산 분자는 표준 합성 기법에 의해, 예를 들어, 자동화된 핵산 합성기를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 핵산이 서브 클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자는 안티센스 배향으로 클로닝될 수 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 아래에서 추가로 기재되는 바와 같이 관심 표적 핵산에 대한 안티센스 배향이 될 것임).
더욱이, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 핵산 서열의 일부만을 포함할 수 있되, 전장 핵산 서열은 본 발명에 포함되는 마커를 포함하거나, 또는 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 이러한 핵산 분자는 예를 들어, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 프로브/프라이머는 전형적으로 하나 이상의 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오타이드로서 사용된다. 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 엄격한 조건하에서 적어도 약 7개, 바람직하게는 약 15개, 더욱 바람직하게는 약 25개, 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개 또는 400개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 바이오마커 핵산 서열과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 포함한다. 바이오마커 핵산 분자의 서열에 기초한 프로브는 본 발명에 포함되는 하나 이상의 마커에 상응하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 프로브는 그것에 부착되는 표지기, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자를 포함한다.
바이오마커 핵산 분자는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 바이오마커에 상응하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열과 다르므로, 동일한 단백질을 암호화하는 바이오마커 핵산 분자 또한 상정된다.
또한, 아미노산 서열의 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성이 집단(예를 들어, 인간 집단) 내에 존재할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 이러한 유전적 다형성은 천연의 대립유전자 변이로 인해 집단내 개체 간에 존재할 수 있다. 대립 유전자는 주어진 유전자좌에서 교대로 발생하는 유전자 그룹 중 하나이다. 또한, RNA 발현 수준에 영향을 미치는 DNA 다형성이 또한 그 유전자의 전체 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는(예를 들어, 조절 또는 분해에 영향을 줌으로써) 존재할 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에서 "대립유전자 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 용어 "대립 유전자(대립유전자)"는 유전자 또는 이의 일부의 대안적 형태를 지칭한다. 대립 유전자는 상동 염색체에서 동일한 유전자좌 또는 위치를 점유한다. 대상체가 유전자의 2개의 동일한 대립 유전자를 가지고 있는 경우, 대상체는 유전자 또는 대립 유전자에 대해 동형접합이라고 한다. 대상체가 유전자의 2개의 상이한 대립 유전자를 가지고 있는 경우, 대상체는 유전자 또는 대립 유전자에 대해 이형접합이라고 한다. 예를 들어, 바이오마커 대립 유전자는 단일 뉴클레오타이드 또는 여러 뉴클레오타이드에서 서로 다를 수 있으며, 뉴클레오타이드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립 유전자는 또한 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 유전자의 형태일 수 있다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "유전자의 다형성 영역의 대립유전자 변이체" 또는 "대립유전자 변이체"는 집단 내의 유전자의 해당 영역에서 발견되는 여러 가능한 뉴클레오타이드 서열 중 하나를 갖는 유전자의 대안적 형태를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는, 대립유전자 변이체는 기능적 대립유전자 변이체, 비-기능적 대립유전자 변이체, SNP, 돌연변이 및 다형성을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "단일 뉴클레오타이드 다형성"(single nucleotide polymorphism: SNP)은 대립 유전자 서열 간의 변이 부위인 단일 뉴클레오타이드가 차지하는 다형성 부위를 지칭한다. 부위는 일반적으로 대립 유전자의 고도로 보존된 서열(예를 들어, 집단의 1/100 또는 1/1000 구성원 미만으로 변하는 서열)이 선행되고 그 뒤를 따른다. SNP는 일반적으로 다형성 부위에서 하나의 뉴클레오타이드가 다른 뉴클레오타이드로 치환되어 발생할 수 있다. SNP는 또한 참조 대립 유전자와 비교하여 뉴클레오타이드의 결실 또는 뉴클레오타이드의 삽입으로부터 발생할 수 있다. 전형적으로 다형성 부위는 기준 염기 이외의 염기에 의해 점유된다. 예를 들어, 참조 대립 유전자가 다형성 부위에 염기 "T"(티미딘)를 함유하는 경우, 변경된 대립 유전자는 다형성 부위에 "C"(사이티딘), "G"(구아닌) 또는 "A"(아데닌)를 함유할 수 있다. SNP는 단백질-코딩 핵산 서열에서 발생할 수 있으며, 이 경우 결함이 있거나 그렇지 않으면 변이체 단백질 또는 유전적 질환을 일으킬 수 있다. 이러한 SNP는 유전자의 코딩 서열을 변경할 수 있으므로 다른 아미노산("미스센스(missense)" SNP)을 지정하거나, 또는 SNP는 정지 코돈("넌센스(nonsense)" SNP)을 도입할 수 있다. SNP가 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 경우, SNP는 "침묵(silent)"이라 한다. SNP는 또한 뉴클레오타이드 서열의 논코딩 영역에서도 발생할 수 있다. 이는 예를 들어, 대안적 스플라이싱의 결과로 결함이 있는 단백질 발현을 초래하거나, 또는 이는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 천연의 대립유전자 변이는 전형적으로 주어진 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 1% 내지 5%의 변이를 초래할 수 있다. 대안적인 대립 유전자는 여러 다른 개체에서 관심 유전자를 시퀀싱함으로써 확인될 수 있다. 이는 다양한 개체에서 동일한 유전자좌를 확인하기 위해 혼성화 프로브를 사용하여 쉽게 수행될 수 있다. 천연의 대립유전자 변이의 결과이며 기능적 활성을 변경하지 않는 임의의 그리고 모든 이러한 뉴클레오타이드 변이 및 생성된 아미노산 다형성 또는 변이는 본 발명에 포함되는 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
다른 실시형태에서, 바이오마커 핵산 분자는 적어도 7개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 60개, 80개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 550개, 650개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개, 2000개, 2200개, 2400개, 2600개, 2800개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 엄격한 조건하에서 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 핵산 분자 또는 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자와 혼성화할 수 있다. 용어 "엄격한 조건하에서 혼성화하다"는 서로 적어도 30%(65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상) 동일한 뉴클레오타이드 서열이 전형적으로 서로 혼성화를 유지하는 혼성화 및 세척을 위한 조건을 설명하는 것으로 의도된다. 이러한 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)]의 6.3.1 내지 6.3.6 부문에서 찾을 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 바람직한, 비-제한적 예는 약 45℃에서 6×소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)에서 혼성화한 다음, 50℃ 내지 65℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS로 1회 이상 세척하는 것이다.
집단에 존재할 수 있는 본 발명에 포함되는 핵산 분자의 자연 발생적 대립유전자 변이체 외에도, 당업자는 서열 변화가 돌연변이에 의해 도입될 수 있고, 이에 따라 암호화된 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않고 암호화된 단백질의 아미노산 서열의 변화를 초래할 수 있음을 더 이해할 할 것이다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환으로 이어지는 뉴클레오타이드 치환이 만들어질 수 있다. "비-필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경하지 않고 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 필수적이다. 예를 들어, 보존되지 않은 아미노산 잔기 또는 다양한 종의 상동체 중에 반-보존된 아미노산 잔기는 활성에 필수적이지 않을 수 있으므로 변경의 표적이 될 수 있다. 대안적으로, 다양한 종(예를 들어, 뮤린 및 인간)의 상동체 사이에 보존된 아미노산 잔기는 활성에 필수적일 수 있으므로 변경의 표적이 될 가능성이 없다.
따라서, 본 발명에 포함되는 다른 양태는 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기의 변화를 포함하는 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 자연 발생적 단백과 아미노산 서열이 다르지만 생물학적 활성을 유지한다. 일 실시형태에서, 바이오마커 단백질은 본 명세서에 기재된 바이오마커 단백질의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 그 이상 또는 그 사이의 임의의 범위, 예컨대, 90% 내지 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 유사하게는, 이러한 바이오마커 단백질을 암호화하는 서열을 갖는 핵산 분자가 상정된다.
변이체 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 추가 또는 결실을 본 발명에 포함되는 핵산 뉴클레오타이드 서열로 도입함으로써 생성될 수 있으며, 따라서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환, 추가 또는 결실이 암호화된 단백질 내로 도입된다. 돌연변이는 표준 기법, 예컨대, 부위-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개성 돌연변이 유발에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 예측된 비-필수 아미노산 잔기에서 이루어진다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비-극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는 포화 돌연변이 유발에 의해 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이는 활성을 유지하는 돌연변이를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 유발 후, 암호화된 단백질은 발현된 재조합적으로 발현될 수 있고, 단백질의 활성이 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 게놈 내의 핵산이 유용하며, 표적 및/또는 작용제로 사용될 수 있다. 예를 들어, 게놈 내의 표적 DNA는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 조작될 수 있다. 게놈 내의 표적 DNA는 결실, 삽입 및/또는 돌연변이, 예컨대, 레트로바이러스 삽입, 인공 염색체 기법, 유전자 삽입, 조직 특이적 프로모터의 무작위 삽입, 유전자 표적화, 전이 인자 및/또는 외래 DNA를 도입하거나 변형된 DNA/변형된 핵 DNA를 생성하는 임의의 다른 방법에 의해 조작될 수 있다. 다른 변형 기법은 게놈에서 DNA 서열을 결실시키고/시키거나 핵 DNA 서열을 변경시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 핵 DNA 서열은 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 변경될 수 있다.
b. 벡터 및 다른 핵산 비히클
본 발명에 따르면, 핵산 분자 및 이의 변이체는 직접 합성 및 유전자 재조합 기법과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 핵산 분자는 순수한 핵산 분자, 플라스미드, DNA 벡터, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 입자와 같은 임의의 형태로 존재할 수 있다. 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 본 발명에 포함되는 벡터는 또한 패키징된 폴리뉴클레오타이드를 세포, 국소 조직 부위 또는 대상체에 전달하는데 사용될 수 있다.
벡터의 한 유형은 추가적인 핵산 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 유형은 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 "바이러스 벡터"이다. 바이러스 핵산 전달 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 포진 바이러스 및 이들의 변이체를 포함하는 임의의 종류일 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 잘 알려져 있으며, 문헌[Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (4th Ed.), New York)]에 기재되어 있다.
소정의 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 세균성 복제 기점을 갖는 세균성 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈에 혼입되고, 이에 따라 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 소정의 벡터, 즉 발현 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드(벡터)의 형태이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함이 있는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 이러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 포함되는 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명에 포함되는 핵산을 포함한다. 이는 재조합 발현 벡터가 발현에 사용되는 숙주 세포를 기준으로 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결됨을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되어 있음을 의미하는 것으로 의도된다(예를 들어, 벡터가 숙주 세포로 도입될 때 시험관내 전사/번역 시스템 또는 숙주 세포에서). 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 대조군 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌[Goeddel, Methods in Enzymology: Gene Expression Technology vol.185, Academic Press, San Diego, CA (1991)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것과 소정의 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시하는 것(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 이러한 인자에 의존할 수 있음은 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명에 포함되는 발현 벡터는 본 명세서에 기재된 핵산에 의해 암호화된 융합 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로, 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능하는 복제 기점, 프로모터 서열 및 편리한 제한 엔도뉴클레이스 부위, 및 하나 이상의 선별 마커, 예를 들어, 약물 저항성 유전자를 함유한다. 벡터는 본 발명에 포함되는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 천연형 또는 비-천연형 프로모터를 포함할 수 있다. 선택된 프로모터는 강한, 약한, 구성적, 유도성, 조직 특이적, 발달 단계-특이적 및/또는 유기체 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 벡터가 도입될 숙주 세포의 유형에 특이적인 조절 서열, 예컨대, 인핸서, 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 재조합 발현 벡터는 원핵세포(예를 들어, 대장균) 또는 진핵세포(예를 들어, 곤충 세포, 예컨대, 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용, 효모 세포 또는 포유동물 세포)에서 본 발명에 포함되는 바이오마커에 상응하는 폴리펩타이드의 발현을 위해 설계될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 위의 문헌[Goeddel]에서 추가로 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머레이스를 사용하여 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다.
원핵생물에서 단백질의 발현은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 대장균에서 가장 자주 수행된다. 융합 벡터는 일반적으로 재조합 단백질의 아미노 말단에 암호화된 단백질에 여러 아미노산을 추가한다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 다음의 세 가지 목적을 수행한다: 1) 재조합 단백질의 발현 증가; 2) 재조합 단백질의 용해도 증가; 및 3) 친화성 정제에서 리간드로 작용하여 재조합 단백질의 정제를 도움. 종종, 융합 발현 벡터에서, 융합 단백질의 정제 후에 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 하기 위해 융합 모이어티 및 재조합 단백질의 연결지점에 단백질 가수분해성 절단 부위가 도입된다. 이러한 효소 및 이들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로카이네이스를 포함한다. 전형적 융합 발현 벡터는 pGEX(파마시아 바이오테크 인코포레이션(Pharmacia Biotech Inc); 문헌[Smith and Johnson (1988) Gene 67:31-40]), pMAL(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 비벌리) 및 pRIT5(파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)를 포함하며, 이들은 글루타티온 S-트랜스퍼레이스(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 각각 표적 재조합 단백질로 융합한다.
대표적인, 적합한 유도성 비-융합 대장균 발현 벡터의 비-제한적 예는 pTrc(문헌[Amann et al. (1988) Gene 69:301-315]) 및 pET 11d(문헌[Studier et al. (1991) Meth. Enzymol. 185:60-89])를 포함한다. pTrc 벡터로부터의 표적 바이오마커 핵산 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머레이스 전사에 의존한다. pET 11d 벡터 로부터의 표적 바이오마커 핵산 발현은 공동 발현된 바이러스 RNA 폴리머레이스(T7 gn1)에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터의 전사에 의존한다. 이러한 바이러스 폴리머레이스는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어하에서 T7 gn1 유전자를 보유하는 상주 프로파지로부터 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다.
대장균에서 재조합 단백질 발현을 최대화시키기 위한 한 가지 전략은 재조합 단백질을 단백질 가수분해성으로 절단하는 능력이 손상된 숙주 박테리아에서 단백질을 발현하는 것이다(문헌[Gottesman (1990) Meth. Enzymol. 185:119-128]). 또 다른 전략은 발현 벡터에 삽입될 핵산의 핵산 서열을 변경하여 각각의 아미노산에 대한 개별 코돈이 대장균에서 우선적으로 사용되는 코돈이 되도록 하는 것이다(문헌[Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118]). 본 발명에 포함되는 핵산 서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)에서의 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1(문헌[Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234]), pMFa(문헌[Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943]), pJRY88(문헌[Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123]), pYES2(인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation), 캘리포니아주 샌디에고) 및 pPicZ(인비트로젠 코포레이션, 캘리포니아주 샌디에고)를 포함한다.
대안적으로, 발현 벡터는 바큘로바이러스 발현 벡터이다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, Sf 9 세포)에서의 단백질의 발현에 이용 가능한 바큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(문헌[Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165]) 및 pVL 시리즈(문헌[Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39])를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8(문헌[Seed (1987) Nature 329:840]) 및 pMT2PC(문헌[Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195])를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵세포 및 진핵세포 둘 다에 적합한 다른 적합한 발현 시스템의 경우, 위의 문헌[Sambrook et al]의 챕터 16과 17을 참조.
일부 실시형태에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형에 우선적으로 핵산의 발현을 지시할 수 있다(예를 들어, 조직-특이적 조절 요소가 핵산을 발현하는데 사용됨). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비-제한적 예는 알부민 프로모터(간-특이적; 문헌[Pinkert et al. (1987) Gene Dev. 1:268-277]), 림프성-특이적 프로모터(문헌[Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]), T 세포 수용체의 특정 프로모터(문헌[Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733]) 및 면역글로불린(문헌[Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748]), 뉴런-특이적 프로모터(예를 들어, 뉴로필라멘트 프로모터; 문헌[Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5473-5477]), 췌장-특이적 프로모터(문헌[Edlund et al. (1985) Science 230:912-916]) 및 유선-특이적 프로모터(예를 들어, 우유 유장 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 공개 제264,166호)를 포함한다. 발달적으로-조절된 프로모터, 예를 들어, 뮤린 혹스 프로모터(문헌[Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379]) 및 α-태아단백질 프로모터(문헌[Camper and Tilghman (1989) Gene Dev. 3:537-546]) 또한 포함된다.
본 발명은 또한 아래에 추가로 기재되는 바와 같이 안티센스 핵산을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, DNA 분자는 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA에 대한 안티센스인 RNA 분자의 발현(DNA 분자의 전사에 의해)을 허용하는 방식으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다양한 세포 유형, 예를 들어, 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서에서 안티센스 RNA 분자의 연속적 발현을 지시하는 안티센스 배향으로 클로닝된 핵산에 작동 가능하게 연결된 조절 서열이 선택될 수 있거나, 또는 안티센스 RNA의 구성적, 조직-특이적 또는 세포 유형 특이적 발현을 지시하는 조절 서열이 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 안티센스 핵산이 고효율 조절성 영역의 제어하에서 생산되며, 그 활성이 벡터가 도입되는 세포 유형에 의해 결정될 수 있는, 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독화된 바이러스의 형태일 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하는 유전자 발현의 조절에 대한 논의의 경우 (문헌[Weintraub et al. (1986) Trends Genet. 1(1)] 참조).
일부 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 본 발명에 따라 유용하다. 레트로바이러스는 숙주 세포 게놈에 통합되기 전에 바이러스 RNA 게놈의 DNA로의 역전사해야 하기 때문에 유명하다. 따라서, 레트로바이러스 벡터의 가장 중요한 특징은 유전 물질을 표적/숙주 세포의 게놈에 영구적으로 통합하는 것이다. 핵산 전달을 위해 가장 일반적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 비히클/입자이다. 렌티바이러스의 일부 예는 인간 면역결핍 바이러스: HIV-1 및 HIV-2, 시미안 면역결핍 바이러스(Simian Immunodeficiency virus: SIV), 고양잇과 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV), 소 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus: BIV), 젬브라나병 바이러스(Jembrana disease virus: JDV), 말 감염성 빈혈바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV), 말 감염성 빈혈바이러스, 비스나/매디 및 산양 관절염 뇌염 바이러스(caprine arthritis encephalitis virus: CAEV)를 포함한다.
전형적으로, 유전자 전달 비히클을 구성하는 렌티바이러스 입자는 자체적으로 복제 결함이 있어서 숙주 세포에서 복제할 수 없고 단 하나의 세포만을 감염시킬 수 있다(또한 "자가-비활성화"라고도 지칭됨). 렌티바이러스는 온전한 숙주 핵 외피를 통한 진입 메커니즘으로 인해 분열 및 비-분열 세포 모두를 감염시킬 수 있다(문헌[Naldini et al. (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:457-463]). 재조합 렌티바이러스 비히클/입자는 HIV 독성 유전자를 다중으로 약독화시킴으로써 생성되었고, 예를 들어, 유전자 Env, Vif, Vpr, Vpu, Nef 및 Tat가 결실되어 벡터가 생물학적으로 안전하다. 상대적으로, 예를 들어, HIV-1/HIV-2로부터 유래된 렌티바이러스 비히클은 이식유전자의 비-분열 세포로의 효율적인 전달, 통합 및 장기 발현을 매개할 수 있다. 용어 "재조합"은 렌티바이러스 서열 및 비-렌티바이러스 레트로바이러스 서열 둘 다를 함유하는 벡터 또는 다른 핵산을 지칭한다. 렌티바이러스 입자는 바이러스 패키징 요소 및 벡터 게놈 자체를 HEK293T 세포, 293G 세포, STAR 세포 및 다른 바이러스 발현 세포주와 같은 생산 세포에서 공동 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 요소는 일반적으로 3개(2세대 렌티바이러스 시스템에서) 또는 4개의 개별 플라스미드(3세대 렌티바이러스 시스템에서)로 제공된다. 생산 세포는 바이러스의 코어(즉, 구조적 단백질)와 효소적 성분을 포함하는 렌티바이러스 성분을 암호화하는 플라스미드, 및 외피 단백질(들)(패키징 시스템으로도 지칭됨) 및 비히클 자체(전달 벡터라고도 지칭됨)인 표적세포로 전달되는 외래 이식유전자를 포함하는 게놈을 암호화하는 플라스미드로 공동 형질감염된다.
재조합 렌티바이러스 벡터의 외피 단백질은 다른 바이러스로부터의 이종성 외피 단백질, 예컨대, 수포성 구내염 바이러스의 G 단백질(VSV G) 또는 바큘로바이러스 gp64 외피 단백질일 수 있다. VSV-G 당단백질은 특히 수포성 바이러스 속으로 분류되는 종: 카라자스 바이러스(Carajas virus: CJSV), 찬디푸라 바이러스(Chandipura virus: CHPV), 코칼 바이러스(Chandipura virus: COCV), 이스파한 바이러스(Isfahan virus: ISFV), 마라바 바이러스(Maraba virus: MARAV), 피리 바이러스(Piry virus: PIRYV), 수포성 구내염 알라고아스 바이러스(Vesicular stomatitis Alagoas virus: VSAV), 수포성 구내염 인디안 바이러스(Vesicular stomatitis Indiana virus: VSIV) 및 수포성 구내염 뉴 저지 바이러스(Vesicular stomatitis New Jersey virus: VSNJV) 및/또는 초어 라브도바이러스, BeAn 157575 바이러스(BeAn 157575), 보테케 바이러스(Boteke virus: BTKV), 칼차키 바이러스(Calchaqui virus: CQIV), 엘 바이러스 아메리메이(Eel virus Amerimay: EVA), 그레이 로지 바이러스(Gray Lodge virus: GLOV), 쥬론 바이러스(Jurona virus: JURY), 클래머스 바이러스(Klamath virus: KLAV), 콰타 바이러스(Kwatta virus: KWAV), 라 호야 바이러스(La Joya virus: LJV), 말파이스 봄 바이러스(Malpais Spring virus: MSPV), 마운트 엘곤 배트 바이러스(Mount Elgon bat virus: MEBV), 페리넷 바이러스(Perinet virus: PERV), 파이크 플라이 라브도바이러스(Pike fry rhabdovirus: PFRV), 포톤 바이러스(Porton virus: PORV), 라디 바이러스(Radi virus: RADIV), 잉어의 봄 바이러스(Spring viremia of carp virus: SVCV), 투파이아 바이러스(Tupaia virus: TUPV), 궤양성 질환 라브도바이러스(Ulcerative disease rhabdovirus: UDRV) 및 유그 보그다노박 바이러스(Yug Bogdanovac virus: YBV)와 같은 수포성 바이러스 속으로 잠정적으로 분류되는 계통 중에서 선택될 수 있다. gp64 또는 다른 바큘로바이러스 외피 단백질은 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica nucleopolyhedrovirus: AcMNPV), 아나그라파 팔시페라 핵다각체병 바이러스, 봄빅스 모리 핵다각체병 바이러스, 코리스토네우라 푸미페라나 핵다각체병 바이러스, 오르기아 슈도추가타 단일 캡시드 핵다각체병 바이러스, 에피피아스 포스트비타나 핵다각체병 바이러스, 하이판트리아 쿠네아 핵다각체병 바이러스, 갈레리아 멜로넬라 핵다각체병 바이러스, 도리 바이러스, 토고토 바이러스, 안테라에아 페미 핵다각체병 바이러스 또는 바트켄 바이러스로부터 유래될 수 있다.
재조합 렌티바이러스 입자를 생성하는 방법은 당업계, 예를 들어, 미국 특허 제8,846,385호; 제7,745,179호; 제7,629,153호; 제7,575,924호; 제7,179,903호; 및 제6,808,905호에서 논의된다.
사용되는 렌티바이러스 벡터는 pLVX, pLenti, pLenti6, pLJM1, FUGW, pWPXL, pWPI, pLenti CMV puro DEST, pLJM1-EGFP, pULTRA, pInducer20, pHIV-EGFP, pCW57.1, pTRPE, pELPS, pRRL 및 pLionII로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 당업계에 공지된 렌티바이러스 비히클도 또한 사용될 수 있다(미국 특허 제9,260,725호; 제9,068,199호; 제9,023,646호; 제8,900,858호; 제8,748,169호; 제8,709,799호; 제8,420,104호; 제8,329,462호; 제8,076,106호; 제6,013,516호; 및 제5,994,136호; PCT 공개 WO 2012079000 참조).
5' 또는 3' 말단에 레트로바이러스 LTR(긴-말단 반복체), 레트로바이러스 유출 요소, 선택적으로 렌티바이러스 역 반응 요소(RRE), 프로모터 또는 이의 활성 부분, 및 유전자좌 대조군 영역(유전자좌 대조군 영역: LCR) 또는 이의 활성 부분을 포함하는 추가적인 요소가 재조합 렌티바이러스 입자에 포함될 수 있다. 다른 요소는 비-분열 세포에서 형질도입 효율을 향상시키는 중앙 폴리퓨린 관(polypurine tract: cPPT) 서열, 이식유전자의 발현을 향상시키고 역가를 증가시키는 우드척 간염 바이러스(Woodchuck Hepatitis: WHP) 전사후 조절 요소(Posttranscriptional Regulatory Element: WPRE)를 포함한다. 효과기 모듈은 벡터에 연결된다. 복합체 HIV-1/2에 기초한 렌티바이러스 벡터 외에도, 단순 감마-레트로바이러스에 기초한 레트로바이러스 벡터가 치료용 핵산을 전달하는데 널리 사용되었으며, 광범위한 세포 유형을 형질도입할 수 있는 임상적으로 가장 효율적이고 및 강력한 핵산 전달 시스템 중 하나로 입증되었다. 감마 레트로바이러스의 예시적 종은 뮤린 백혈병 바이러스(murine leukemia virus: MLV) 및 고양잇과 백혈병 바이러스(feline leukemia virus: FeLV)를 포함한다. 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)와 같은 포유동물 감마-레트로바이러스로부터 유래된 감마-레트로바이러스 벡터는 재조합될 수 있다. 감마 레트로바이러스의 MLV 패밀리는 동종숙주형, 양종향성, 이종향성 및 다방향성 서브패밀리를 포함한다. 동종숙주형 바이러스는 mCAT-1 수용체를 사용하는 뮤린 세포만을 감염시킬 수 있다. 동종숙주형 바이러스의 예는 몰로니(Moloney) MLV 및 AKV이다. 양종향성 바이러스는 Pit-2 수용체를 통해 뮤린, 인간 및 다른 종을 감염시킨다. 양종향성 바이러스의 한 예는 4070A 바이러스이다. 이종향성 및 다방향성 바이러스는 동일한(Xpr1) 수용체를 이용하지만, 이들의 종 향성은 상이하다. NZB-9-1과 같은 이종향성 바이러스는 인간과 다른 종을 감염시키지만 뮤린 종은 감염시키지 않는 반면, 초점-형성 바이러스(focus-forming virus: MCF)와 같은 다방향성 바이러스는 뮤린, 인간 및 다른 종을 감염시킨다.
감마-레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 구조적 및 효소적(gag-pol) 폴리단백질을 암호화하는 것, 외피(env) 단백질을 암호화하는 것 및 새로 형성된 바이러스 입자에 패키징될 본 발명에 포함되는 조성물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 mRNA를 암호화하는 것을 포함하는 여러 플라스미드로 공동 형질감염시킴으로써 패키징 세포에서 생산될 수 있다. 재조합 감마-레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스로부터의 외피 단백질로 가성형태화(pseudotyped)될 수 있다. 외피 당단백질은 바이러스 입자의 외부 지질층에 통합되어 세포 향성을 증가/변경할 수 있다. 예시적 외피 단백질은 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 외피 단백질(gibbon ape leukemia virus envelope protein: GALV) 또는 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSV-G) 또는 시미안 내인성 레트로바이러스 외피 단백질 또는 홍역 바이러스 H 및 F 단백질 또는 인간 면역결핍 바이러스 gp120 외피 단백질 또는 코칼 수포성 바이러스 외피 단백질을 포함한다(예를 들어, 미국 공개 제2012/164118호 참조). 다른 실시형태에서, 외피 당단백질은 표적화/결합 리간드를 감마-레트로바이러스 벡터, 펩타이드 리간드, 단일 사슬 항체 및 성장 인자(문헌[Waehler et al. (2007) Nat. Rev. Genet. 8:573-587])를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 결합 리간드로 통합하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 조작된 당단백질은 벡터를 이들의 상응하는 표적 모이어티를 발현하는 세포로 목표 재설정(retarget)할 수 있다. 다른 양태에서, "분자 브리지"는 벡터를 특정 세포로 유도하기 위해 도입될 수 있다. 분자 브리지는 이중 특이성을 가지고 있다: 한쪽 말단은 바이러스 당단백질을 인식할 수 있고, 다른 말단은 표적 세포의 분자 결정기에 결합할 수 있다. 이러한 분자 브리지, 예컨대, 리간드-수용체, 아비딘-바이오틴, 화학적 접합, 단일클론 항체 및 조작된 융해성 단백질은 바이러스 벡터를 형질도입을 위해 표적 세포에 부착하도록 지시할 수 있다(문헌[Yang et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 101:357-368; Maetzig et al. (2011) viruses 3:677-713]). 재조합 감마-레트로바이러스 벡터는 자가-비활성화(self-inactivating: SIN) 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 복제 기능이 없다. SIN 벡터는 초기에 인핸서/프로모터 활성을 포함하는 3' U3 영역 내에 결실을 보유할 수 있다. 또한, 5' U3 영역은 사이토메갈로바이러스 또는 RSV로부터 유래된 강력한 프로모터(패키징 세포주에 필요함) 또는 선택된 내부 프로모터 및/또는 인핸서 요소로 대체될 수 있다. 내부 프로모터의 선택은 본 발명에 포함되는 특정 목적에 필요한 유전자 발현의 특정 요구를 따라 이루어질 수 있다.
유사하게는, 재조합 아데노-관련 바이러스(recombinant adeno-associated viral: rAAV) 벡터는 본 발명에 포함되는 핵산 분자를 패키징하고 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 벡터 또는 바이러스 입자는 임의의 공지된 혈청형 캡시드 또는 혈청형 캡시드의 조합을 이용하도록 설계될 수 있다. 혈청형 캡시드는 임의의 확인된 AAV 혈청형 및 이의 변이체, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV2G9, AAV3, AAV4, AAV4-4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 및 AAVrh10(예를 들어, 미국 공개 제20030138772호 참조) 또는 이들의 변이체로부터의 캡시드를 포함할 수 있다. AAV 벡터는 단일 가닥 벡터뿐만 아니라 자가-상보적 AAV 벡터(self-complementary AAV vector: scAAV)를 포함한다. scAAV 벡터는 함께 어닐링하여 이중 가닥 벡터 게놈을 형성하는 DNA를 포함한다. 두 번째 가닥 합성을 생략함으로써, scAAV는 세포에서 빠른 발현을 가능하게 한다. rAAV 벡터는 sf9 곤충 세포에서 또는 HEK293 세포와 같은 인간 세포의 현탁 세포 배양물에서 삼중 형질감염에 의해서와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 AAV 캡시드에 패키징될 하나 이상의 바이러스 게놈에서 암호화될 수 있다. 이러한 벡터 또는 바이러스 게놈은 또한 적어도 1개 또는 2개의 ITR(역 말단 반복부) 외에도, 벡터 또는 바이러스 게놈으로부터의 발현에 필요한 소정의 조절 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 프로모터, 인트론, 스페이서, 스터퍼 서열 등을 포함한다.
또한, 핵산 분자의 비-바이러스성 전달 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다. 용어 "비-바이러스성 벡터"는 바이러스 입자를 사용하지 않고 본 발명에 포함되는 핵산 분자를 관심 세포로 전달하는 임의의 비히클을 총괄하여 지칭한다. 이러한 비-바이러스성 전달 벡터의 대표적인 예는 벡터 상의 양이온성 부위와 유전자를 구성하는 음으로 하전된 핵산 상의 음이온성 부위 사이의 전기적 상호작용에 기초하여 핵산을 코딩하는 벡터이다. 전달을 위한 일부 예시적 비-바이러스성 벡터는 네이키드(naked) 핵산 전달 시스템, 중합체성 전달 시스템 및 리포솜 전달 시스템을 포함할 수 있다. 양이온성 중합체 및 양이온성 지질은 음이온성 뉴클레오타이드와 쉽게 복합체화될 수 있기 때문에 핵산 전달에 사용된다. 일반적으로 사용되는 중합체는 폴리에틸렌이민, 폴리-L-라이신, 키토산 및 덴드리머를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 양이온성 지질은 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아니딘 함유 지질, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체: 폴리(에틸렌이민)(PEI), 폴리-l-라이신(PLL), 프로타민, 다른 양이온성 중합체 및 지질-중합체 하이브리드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터 DNA는 종래의 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵세포 또는 진핵세포에 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침, DEAE-덱스트란-매개성 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 포함하는, 외래 핵산을 숙주 세포로 도입하기 위한 다양한 당업계에서 인정된 기법을 지칭하는 것으로 의도된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 적합한 방법은 문헌[Sambrook, et al.](상기) 및 기타 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
포유동물 세포의 안정적인 형질감염을 위해, 사용된 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라, 세포의 작은 분획만이 외래 DNA를 이들의 게놈에 통합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 통합체를 확인하고 선택하기 위해, 선별 마커(예를 들어, neo, DHFR, Gln 신테테이스, ADA 등과 같은 항생제에 대한 저항성에 대한 것)를 암호화하는 유전자는 일반적으로 관심 유전자와 함께 숙주 세포로 도입된다. 바람직한 선별 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여하는 것들을 포함한다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질 감염된 세포는 약물 선택에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 선별 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존하는 반면 다른 세포는 죽을 것임).
따라서, 본 발명은 본 발명에 포함되는 핵산 및/또는 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 포함하며, 이는 하기에 추가로 기술된다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 소정의 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모세포와 동일할 수 없지만 여전히 본 명세서에서 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다. 숙주 세포는 임의의 원핵세포(예를 들어, 대장균) 또는 진핵세포(예를 들어, 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포)일 수 있다.
c. 단백질 작용제
본 발명에 포함되는 다른 양태는 아미노산-기반 작용제의 사용을 포함한다. 작용제는 융합 단백질, 합성 폴리펩타이드 및 펩타이드뿐만 아니라 이의 단편(예를 들어, 생물학적으로 활성인 단편)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이 또한 제공된다.
본 발명에 포함된 아미노산-기반 작용제(예를 들어, 항체 및 재조합 단백질)는 독립적으로 하나 이상의 핵산, 복수의 핵산, 핵산의 단편 또는 전술한 임의의 변이체에 의해 암호화될 수 있는 전체 폴리펩타이드, 복수의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 단편으로 존재할 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 가장 자주 함께 연결되는 아미노산 잔기(천연의 또는 비천연)의 중합체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 지칭한다. 따라서, 용어 폴리펩타이드는 용어 "펩타이드" 및 "단백질"을 상호 포함한다. 용어 "융합 단백질"은 상이한 자원으로부터의 적어도 2개의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드 분자를 지칭하되, 성분 아미노산 서열은 직접 또는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 펩타이드-결합에 의해 서로 연결된다. 일부 예에서, 암호화된 폴리펩타이드는 약 50개의 아미노산보다 작으며, 이후 폴리펩타이드는 "펩타이드"로 불린다. 폴리펩타이드가 펩타이드이면, 이는 적어도 약 2개, 3개, 4개 또는 적어도 2개의 아미노산 잔기 길이가 될 것이다. 따라서, 폴리펩타이드는 유전자 산물, 자연 발생적 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드, 상동체, 오르토로그, 파라로그, 단편 및 다른 등가물, 변이체 및 전술한 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단일 분자일 수 있거나, 또는 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 다중-분자 복합체일 수 있다. 이들은 또한 단일 사슬 또는 다중 사슬 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 결합되거나 연결될 수 있다. 용어 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생적 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 마커에 상응하는 천연형 폴리펩타이드는 표준 단백질 정제 기법을 사용하여 적절한 정제 계획에 의해 세포 또는 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드는 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다. 재조합 발현에 대한 대안으로, 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드는 표준 펩타이드 합성 기법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
폴리펩타이드 단편은 관심 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 또는 이로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하지만, 전장 단백질보다 더 적은 아미노산을 포함한다. 이들은 또한 상응하는 전장 단백질의 적어도 하나의 활성을 나타낼 수 있다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 상응하는 단백질의 적어도 하나의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 본 발명에 포함되는 단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들어, 10개, 25개, 50개, 100개 이상의 아미노산 길이인 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 단백질의 다른 영역이 결실된 다른 생물학적 활성 부분은 재조합 기법에 의해 제조될 수 있으며, 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드의 천연 형태의 기능적 활성 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.
바람직한 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 같은 관심 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는다. 다른 유용한 단백질은 이러한 서열 중 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 약 40%, 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)하며, 상응하는 자연 발생적 단백질의 단백질 기능적 활성은 유지하지만, 천연의 대립유전자 변이 또는 돌연변이 유발로 인해 아미노산 서열은 다르다.
아미노산 서열에 적용되는 용어 "동일성"은 필요한 경우 최대 퍼센트 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후 제2 서열의 아미노산 서열에 있는 잔기와 동일한 후보 아미노산 서열의 잔기의 퍼센트로 정의된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 상동성은 퍼센트 동일성의 계산에 의존하지만, 계산에 도입된 갭과 패널티로 인해 가치가 다를 수 있음이 이해된다.
두 아미노산 서열 또는 두 핵산의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 제2 아미노 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해, 제1 아미노산의 서열 또는 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있음). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, %의 동일성=동일한 위치의 수/위치의 총 수(예를 들어, 중첩 위치)×100). 일 실시형태에서, 두 서열은 동일한 길이이다.
두 서열 간의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 두 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한, 비-제한적 예는 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268]의 알고리즘 및 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877]에서와 같이 수정된 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 발명에 포함되는 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램(점수=100, 단어 길이=12)으로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명에 포함되는 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램(점수=50, 단어 길이=3)으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast가 분자 간의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행을 수행하는데 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수가 사용될 수 있다(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov 참조). 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한, 비-제한적 예는 문헌[Myers and Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티가 사용될 수 있다. 국소 서열 유사성 및 정렬 영역을 확인하기 위한 또 다른 유용한 알고리즘은 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448]에 기재된 바와 같은 FASTA 알고리즘이다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 비교하기 위해 FASTA 알고리즘을 사용할 때, PAM120 가중치 잔기 표는 예를 들어, 2의 k-튜플 값(tuple value)으로 사용될 수 있다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭을 허용하거나 허용하지 않고 위에 기재된 바와 같은 것들과 유사한 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성을 계산하는 데 있어서, 정확히 일치하는 항목만 계산된다.
용어 "폴리펩타이드 변이체" 또는 "아미노산 서열 변이체"는 천연형 또는 참조 서열과 아미노산 서열이 다른 분자를 지칭한다. 아미노산 서열 변이체는 천연형 또는 참조 서열과 비교하여 아미노산 서열 내의 소정의 위치에 치환, 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 서열을 언급할 때 용어 "천연형" 또는 "참조"는 비교가 이루어질 수 있는 원래의 분자를 지칭하는 상대적인 용어이다. 천연형 또는 참조 서열은 야생형 서열과 혼동해서는 안 된다. 천연형 서열 또는 분자는 야생형(자연에서 발견되는 서열)을 나타낼 수 있지만, 야생형 서열과 동일할 필요는 없다. 변이체는 천연형 또는 참조 서열에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5% 또는 적어도 약 99.9%의 아미노산 서열 동일성(상동성)을 가질 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가지며, 일부 실시형태에서, 효능제 또는 길항제로서 기능할 수 있다. 변이체는 돌연변이 유발, 예를 들어, 불연속 점 돌연변이 또는 절단에 의해 생성될 수 있다. 효능제는 자연 발생적 형태의 단백질의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하거나 또는 이의 서브세트를 유지할 수 있다. 단백질의 길항제는 예를 들어, 관심 단백질을 포함하는 세포 신호전달 캐스케이드의 하류 또는 상류 구성원에 경쟁적으로 결합함으로써 자연 발생적 형태의 단백질의 활성 중 하나 이상을 저해할 수 있다. 따라서, 특정 생물학적 효과는 제한된 기능의 변이체로 처리하여 유도될 수 있다. 자연 발생적 형태의 단백질의 생물학적 활성의 서브세트를 갖는 변이체로 대상체를 처리하는 것은 자연 발생적 형태의 단백질로의 처리에 비해 대상체에서 더 적은 부작용을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, "변이 모의체(variant mimic)"가 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "변이 모의체"는 활성화된 서열을 모의할 수 있는 하나 이상의 아미노산을 함유하는 변이체를 지칭한다. 예를 들어, 글루타메이트는 포스포-트레오닌 및/또는 포스포-세린에 대한 모의체 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 변이 모의체는 비활성화를 초래하거나 또는 모의체를 함유하는 불활성화된 생성물을 초래할 수 있으며, 예를 들어, 페닐알라닌은 타이로신에 대한 불활성화 치환으로서 작용할 수 있고; 또는 알라닌은 세린에 대한 불활성화 치환으로 작용할 수 있다. 아미노산 서열은 자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있으므로, 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 이의 단편으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 포함되는 작용제는 자연적 발생적 및 비-자연 발생적 아미노산 둘 다를 포함할 수 있다. 비-자연 발생적 아미노산은 카보닐기 또는 아미노옥시기 또는 하이드라자이드기 또는 세미카바자이드기 또는 아자이드기를 포함하는 아미노산을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
아미노산 서열에 적용되는 용어 "상동체"는 제2 종의 제2 서열과 실질적인 동일성을 갖는 다른 종의 상응하는 서열을 의미한다.
용어 "유사체" 하나 이상의 아미노산 변경, 예를 들어, 모 폴리펩타이드의 특성을 여전히 유지하는 아미노산 잔기의 치환, 추가 또는 결실에 의해 상이한 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "유도체"는 용어 "변이체"와 동의어로 사용되며, 참조 분자 또는 출발 분자와 관련하여 임의의 방식으로 변형 또는 변화된 분자를 지칭한다. 본 발명은 변이체 및 유도체를 포함하는 아미노산 기반인 여러 유형의 화합물 및/또는 조성물을 상정한다. 이는 치환, 삽입, 결실 및 공유 변이체 및 유도체를 포함한다. 따라서, 치환, 삽입, 추가, 결실 및/또는 공유 변형을 포함하는 작용제가 본 발명에 포함되는 범위 내에 포함된다. 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열의 카복시- 및 아미노-말단 영역에 위치한 아미노산 잔기는 선택적으로 결실되어 절단된 서열을 제공할 수 있다. 소정의 아미노산(예를 들어, C-말단 또는 N-말단 잔기)은 대안적으로 가용성이거나 또는 고체 지지체에 연결된 더 큰 서열의 일부로서 서열의 발현과 같이 서열의 사용에 따라 결실될 수 있다.
단백질에 대해 언급할 때 "치환 변이체"는 천연형 또는 참조 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 동일한 위치에서 그 자리에 다른 아미노산이 삽입된 것이다. 치환은 분자에서 단 하나의 아미노산만이 치환된 단일일 수 있거나, 또는 2개 이상의 아미노산이 동일한 분자에서 치환된 다중일 수 있다. 일 예에서, 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드에서 아미노산은 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 갖는 다른 아미노산으로 치환된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "보존적 아미노산 치환"은 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산을 유사한 크기, 전하, 극성, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 관련 잔기의 양친매성 성질의 다른 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 치환의 예는 다른 비-극성 잔기에 대한 알라닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 아이소류신, 발린, 류신 및 메티오닌과 같은 비-극성(소수성) 잔기의 치환을 포함한다. 마찬가지로, 보존적 치환의 예는 아르기닌과 라이신간, 글루타민과 아스파라긴간 및 글리신과 세린간과 같이 하나의 극성(친수성) 잔기를 다른 것으로 치환하는 것을 포함한다. 추가적으로, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기를 다른 것으로 치환하거나, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 하나의 산성 잔기를 다른 산성 잔기로 치환하는 것은 보존적 치환의 추가적인 예이다. "비-보존적 치환"은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반한다. 비-보존적 치환의 예는 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 라이신과 같은 극성(친수성) 잔기에 대한 아이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 메티오닌과 같은 비-극성(소수성) 아미노산 잔기의 치환 및/또는 비-극성 잔기에 대한 극성 잔기의 치환을 포함한다. 아미노산 치환은 당업계에 잘 알려져 있는 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정 돌연변이 유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 화학적 변형과 같은 유전 공학 이외의 방법에 의해 아미노산의 측쇄기를 변경하는 방법이 또한 유용할 수 있는 것으로 상정된다.
단백질을 언급할 때 용어 "삽입 변이체"는 천연형 또는 시작 서열의 특정 위치에서 아미노산에 바로 인접하여 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖는 것들이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "바로 인접한"은 시작 또는 참조 아미노산의 알파-카복시 또는 알파-아미노 작용기에 연결된 인접 아미노산을 지칭한다. 대조적으로, 단백질을 언급할 때 용어 "결실 변이체"는 천연형 또는 시작 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것들이다. 일반적으로, 결실 변이체는 분자의 특정 영역에서 하나 이상의 아미노산이 결실될 것이다.
용어 "유도체"는 유기 단백질성 또는 비-단백질성 유도체화제를 이용한 하나 이상의 변형 및 번역 후 변형을 포함하는 천연형 또는 참조 단백질의 변이체를 포함한다. 공유 변형은 전통적으로 단백질의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키거나 또는 선택된 재조합 숙주 세포에서 기능하는 번역 후 변형의 메커니즘을 활용하여 도입된다. 생성된 공유 유도체는 생물학적 활성, 면역검정 또는 재조합 당단백질의 면역친화성 정제를 위한 항-단백질 항체의 제조에 중요한 잔기를 확인하기 위한 프로그램에 유용하다. 이러한 변형은 당해 기술 분야의 통상의 기술 내에 있으며, 과도한 실험 없이 수행된다.
소정의 번역 후 변형은 발현된 폴리펩타이드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타민일 및 아스파라긴일 잔기는 종종 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 번역 후 탈아마이드화된다. 대안적으로, 이러한 잔기는 약산성 조건에서 탈아미드화된다. 이러한 잔기의 어느 형태든 본 발명에 따라 사용되는 단백질에 존재할 수 있다. 다른 번역 후 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화를 포함한다(문헌[T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]).
일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드 및/또는 비-폴리펩타이드 변형으로 변형된 폴리펩타이드와 같은 공유적으로 변형된 폴리펩타이드(예를 들어, 융합 단백질)가 제공된다. 예를 들어, 공유 유도체는 구체적으로 본 발명에 포함되는 단백질이 비-단백질성 중합체에 공유 결합된 융합 분자를 포함한다. 비-단백질성 중합체는 일반적으로 친수성 합성 중합체(즉, 자연에서 달리 발견되지 않는 중합체)이다. 그러나, 자연으로부터 단리된 중합체와 마찬가지로, 자연에 존재하며 재조합 또는 시험관내 방법에 의해 생산되는 중합체가 유용하다. 친수성 폴리바이닐 중합체, 예를 들어, 폴리바이닐알코올 및 폴리바이닐피롤리돈이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 특히 유용한 것은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜(PEG)과 같은 폴리바이닐알킬렌 에터이다. 단백질은 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 다양한 비-단백질성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 연결될 수 있다. 융합 분자는 다른 생물학적으로 활성인 분자 또는 링커에 공유 결합된 본 발명에 포함되는 단백질을 더 포함할 수 있다.
용어 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종성 폴리펩타이드(예를 들어, 바이오마커 폴리펩타이드 이외의 폴리펩타이드)에 작동 가능하게 연결된 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드에 상응하는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부(바람직하게는 생물학적 활성 부분)을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 단백질 내에서, 용어 "작동 가능하게 연결"은 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드 및 이종성 폴리펩타이드가 서로 인-프레임으로 융합되는 것을 나타내는 것으로 의도된다. 이종성 폴리펩타이드는 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드의 아미노-말단 또는 카복실-말단에 융합될 수 있다.
하나의 유용한 융합 단백질은 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드가 GST 서열의 카복실 말단에 융합된 GST 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질은 본 발명에 포함되는 재조합 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 할 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 이종성 신호 서열, 면역글로불린 융합 단백질, 독소 또는 다른 유용한 단백질 서열을 함유한다. 본 발명에 포함되는 키메라 및 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 종래의 기법에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 이어서 키메라 유전자 서열(예를 들어, 위의 문헌[Ausubel et al.] 참조)을 생성하기 위해 어닐링되고 재증폭될 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이에 상보적 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 이미 융합 모이어티(예를 들어, GST 폴리펩타이드)를 암호화하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 이용 가능하다. 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 융합 모이어티가 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드에 인-프레임으로 연결되도록 이러한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
신호 서열은 분비된 단백질 또는 다른 관심 단백질의 분비 및 단리를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 신호 서열은 전형적으로 하나 이상의 절단 이벤트에서 분비 동안 성숙 단백질로부터 일반적으로 절단되는 소수성 아미노산의 코어를 특징으로 한다. 이러한 신호 펩타이드는 분비 경로를 통과할 때 성숙 단백질로부터 신호 서열을 절단할 수 있는 가공 부위를 함유한다. 따라서, 본 발명은 신호 서열을 갖는 기재된 폴리펩타이드뿐만 아니라 신호 서열이 단백질 가수분해성으로 절단된 폴리펩타이드(즉, 절단 생성물)를 포함한다. 일 실시형태에서, 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 관심 단백질, 예컨대, 통상적으로 분비되지 않거나 또는 그렇지 않으면 단리하기 어려운 단백질의 발현 벡터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 신호 서열은 발현 벡터가 형질전환되는 진핵 숙주로부터와 같이 단백질의 분비를 지시하며, 신호 서열은 후속적으로 또는 동시에 절단된다. 그런 다음, 단백질은 당업계에서 인정된 방법에 의해 세포외 배지로부터 쉽게 정제될 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 정제를 용이하게 하는 서열을 사용하여, 예컨대, GST 도메인을 사용하여 관심 단백질에 연결될 수 있다.
단백질을 언급할 때 용어 "특징"은 분자의 별개의 아미노산 서열-기반 성분으로서 정의된다. 본 발명에 포함되는 단백질의 특징은 표면 발현, 국소 입체 형태, 폴드, 루프, 하프-루프, 도메인, 하프-도메인, 부위, 말단 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 단백질을 언급할 때 용어 "표면 발현"은 최외각 표면에 나타나는 단백질의 폴리펩타이드에 기초한 성분을 지칭한다. 단백질을 언급할 때 용어 "국소 입체 형태"는 단백질의 정의 가능한 공간 내에 위치되는 단백질의 구조적 발현에 기초한 폴리펩타이드를 지칭한다. 단백질을 언급할 때 용어 "폴드"는 에너지 최소화시 아미노산 서열의 결과적 형태를 지칭한다. 폴드는 폴딩 과정의 2차 또는 3차 수준에서 발생할 수 있다. 2차 수준 폴드의 예는 베타 시트 및 알파 헬릭스를 포함한다. 3차 폴드의 예는 에너지 힘의 응집 또는 분리로 인해 형성된 도메인 및 영역을 포함한다. 이러한 방식으로 형성된 영역은 소수성 및 친수성 포켓 등을 포함한다. 단백질 형태와 관련하여 용어 "턴"은 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 골격의 방향을 변경하고, 1개, 2개, 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있는 굴곡부(bend)를 지칭한다. 단백질과 관련하여 용어 "루프"는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 골격의 방향을 역전시키고 및 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 구조적 특징을 지칭한다(문헌[Oliva et al. (1997) J. Mol. Biol. 266:814-830]). 단백질을 언급할 때 용어 "하프-루프"는 아미노산 잔기의 수의 적어도 절반이 그것이 유래되는 루프로서 존재하는 확인된 루프의 부분을 지칭한다. 루프가 항상 짝수의 아미노산 잔기를 함유하는 것은 아니라는 것이 이해된다. 따라서, 따라서 루프가 홀수 개의 아미노산을 포함하거나 포함하는 것으로 확인되는 경우, 홀수 루프의 하프-루프는 루프의 정수 부분 또는 다음 정수 부분(루프의 아미노산의 수/2+/-0.5 아미노산)을 포함할 것이다. 예를 들어, 7개의 아미노산 루프로 확인된 루프는 3개의 아미노산 또는 4개의 아미노산의 하프-루프를 생성할 수 있다 (7/2=3.5+/-0.5는 3 또는 4임). 단백질을 언급할 때 용어 "도메인"은 하나 이상의 확인 가능한 구조적 또는 기능적 특징 또는 특성(예를 들어, 결합 능력 및/또는 단백질-단백질 상호작용을 위한 부위로서의 역할)을 갖는 폴리펩타이드의 모티프를 지칭한다. 단백질을 언급할 때 용어 "하프-도메인"은 아미노산 잔기 수의 적어도 절반이 그것이 유래하는 도메인으로 존재하는 확인된 도메인의 부분을 지칭한다. 도메인이 항상 짝수의 아미노산 잔기를 포함하는 것은 아니라는 것이 이해된다. 따라서, 도메인이 홀수 개의 아미노산을 포함하거나 포함하는 것으로 확인된 경우, 홀수 도메인의 하프-도메인은 도메인의 정수 부분 또는 다음 정수 부분(도메인의 아미노산의 수/2+/-0.5 아미노산)을 포함할 것이다. 예를 들어, 7개의 아미노산 도메인으로 확인된 도메인은 3개의 아미노산 또는 4개의 아미노산의 하프-도메인을 생성할 수 있다(7/2=3.5+/-0.5는 3 또는 4임). 하위-도메인은 도메인 또는 하프-도메인 내에서 확인될 수 있으며, 이들 하위 도메인은 이들이 유래되는 도메인 또는 하프 도메인에서 확인된 모든 구조적 또는 기능적 특성보다 적다는 것이 또한 이해된다. 본 명세서에서 임의의 도메인 유형을 포함하는 아미노산은 폴리펩타이드의 골격을 따라 인접할 필요가 없다는 것이 또한 이해된다(즉, 비인접 아미노산은 도메인, 하프-도메인 또는 하위 도메인을 생성하도록 구조적으로 폴딩될 수 있음). 아미노산-기반 실시형태에 속하는 용어 "부위"는 "아미노산 잔기" 및 "아미노산 측쇄"와 동의어로 사용된다. 부위는 본 발명에 포함되는 아미노산 기반 분자 내에서 변형, 조작, 변경, 유도체화 또는 변화될 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 내의 위치를 나타낸다. 단백질을 언급할 때 용어 "말단(termini)" 또는 "말단(terminus)"은 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 맨 끝을 지칭한다. 이러한 맨 끝은 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 첫 번째 또는 최종 부위로만 제한되지 않고, 말단 영역에 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 분자에 기반한 폴리펩타이드는 N-말단(즉, 유리 아미노기(NH2)를 갖는 아미노산에 의해 종결됨) 및 C-말단(즉, 유리 카복실기(COOH)를 갖는 아미노산에 의해 종결됨) 둘 다를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 포함되는 단백질은 일부 경우에 이황화 결합 또는 고발현체 또는 올리고머와 같은 비-공유적 힘에 의해 결합된 다중 폴리펩타이드 사슬을 구성한다. 이러한 단백질은 여러 개의 N- 및 C-말단을 갖는다. 대안적으로, 폴리펩타이드의 말단은 경우에 따라 유기 접합체와 같은 비-폴리펩타이드 기반 모이어티로 시작 또는 종료되도록 변형될 수 있다.
임의의 특징이 본 발명에 포함되는 분자의 성분으로 확인되거나 정의되면, 이러한 특징의 임의의 여러 조작 및/또는 변형은 이동, 교환, 반전, 결실, 무작위화 또는 복제에 의해 수행될 수 있다. 또한, 특징의 조작은 본 발명에 포함된 분자에 대한 변형과 동일한 결과를 초래할 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 도메인 결실을 수반하는 조작은 전장 분자보다 적게 암호화하는 핵산의 변형과 마찬가지로 분자 길이의 변경을 초래할 것이다. 변형 및 조작은 부위 지정 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 작용제는 동위원소인 하나 이상의 원자를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "동위원소"는 중수소 동위원소와 같은 하나 이상의 추가적인 중성자를 갖는 화학 원소를 지칭한다.
d. 숙주 세포를 포함하는 세포-기반 작용제
다른 양태에서, 세포-기반 작용제가 상정된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염, 감염 또는 형질전환된 세포를 포함한다. 용어 "형질전환"은 "외부"(즉, 외부 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포에 도입하여, 숙주 세포가 목적하는 물질, 전형적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 효소를 생산하기 위해 도입된 유전자 또는 서열을 발현하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받아 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"되었다.
본 발명에 포함되는 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은, 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 위한 적합한 조건하에서의 숙주 세포 및 양립 가능한 벡터를 의미한다.
공통 발현 시스템은 대장균 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 바큘로바이러스 벡터 및 포유동물 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예는 제한 없이 원핵생물 세포(예컨대, 세균) 및 진핵생물 세포(예컨대, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)을 포함한다. 특정 예는 대장균, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모, 포유동물 세포주(예를 들어, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등)뿐만 아니라 일차 또는 확립된 포유동물 세포 배양물(예를 들어, 림프아세포, 섬유아세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방 세포 등으로부터 생성됨)을 포함한다. 예는 또한 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 다이하이드로폴레이트 리덕테이스 유전자(이하 "DHFR 유전자"라 함)에 결함이 있는 CHO 세포(문헌[Urlaub G et al; 1980]), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL 1662, 이후 "YB2/0 세포"라 함) 등을 포함한다. YB2/0 세포는 이 세포에서 발현될 때 키메라 또는 인간화된 항체의 ADCC 활성이 향상되기 때문에 바람직하다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 포함되는 작용제와 접촉된 세포가 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 골수성 세포는 하나 이상의 작용제와 접촉되어 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적)을 조절하는 것과 같이 조작된다. 예를 들어, 배양된 세포 및/또는 일차 세포는 작용제와 접촉되고, 처리되고, 검정, 대상체 등에 도입될 수 있다. 이러한 세포의 자손은 본 명세서에 기재된 세포-기반 작용제에 포함된다.
일부 실시형태에서, 골수성 세포는 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적)를 조절하기 위해 재조합적으로 조작된다. 예를 들어, 위에 기재된 바와 같이, 관심 바이오마커의 구성적 또는 유도된 넉아웃 또는 돌연변이와 같은 게놈 편집이 관심 바이오마커의 카피 수 또는 유전자 서열의 조절을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템은 게놈 핵산의 정확한 편집을 위해(예를 들어, 비-기능적 또는 널(null) 돌연변이를 생성하기 위해) 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, CRISPR 가이드 RNA 및/또는 Cas 효소가 발현될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA만을 함유하는 벡터는 Cas9 효소에 대해 형질전환된 동물 또는 세포에 투여될 수 있다. 유사한 전략이 사용될 수 있다(예를 들어, 아연 핑거 뉴클레이스(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레이스(transcription activator-like effector nuclease: TALEN) 또는 호밍 메가뉴클레이스(homing meganuclease: HE), 예컨대, MegaTAL, MegaTev, Tev-mTALEN, CPF1 등). 이러한 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제8,697,359호; 문헌[Sander and Joung (2014) Nat. Biotech. 32:347-355; Hale et al. (2009) Cell 139:945-956; Karginov and Hannon (2010) Mol. Cell 37:7]; 미국 공개 제2014/0087426호 및 제2012/0178169호; 문헌[Boch et al. (2011) Nat. Biotech. 29:135-136; Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501; Weber et al. (2011) PLoS One 6:e19722; Li et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39:6315-6325; Zhang et al. (2011) Nat. Biotech. 29:149-153; Miller et al. (2011) Nat. Biotech. 29:143-148; Lin et al. (2014) Nucl. Acids Res. 42:e47]). 이러한 유전적 전략은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 구성적 발현 시스템 또는 유도성 발현 시스템을 사용할 수 있다.
세포-기반 작용제는 대상 숙주에 대한 면역적합성 관계를 가지며, 임의의 이러한 관계는 본 발명에 따라 사용하기 위해 상정된다. 예를 들어, 입양 골수성 세포, T 세포 등과 같은 세포는 동계일 수 있다. 용어 "동계(syngeneic)"는 특히 항원 또는 면역적 반응과 관련하여 유전적으로 동일한 동일한 종으로부터 유래, 기원하는 또는 이의 구성원인 상태를 지칭할 수 있다. 이는 일치하는 MHC 유형을 가진 일란성 쌍둥이를 포함한다. 따라서, "동계 이식"은 공여체와 유전적으로 동일하거나 또는 바람직하지 않은 불리한 면역원성 반응(예를 들어, 명세서에 기재된 면역학적 스크리닝 결과의 해석에 불리할 수 있는 것과 같은 것) 없이 이식이 가능하도록 충분히 면역학적으로 적합한 수여체에게 세포를 전달하는 것을 지칭한다.
동계 이식은 전달된 세포가 동일한 대상체로부터 얻어지고 이식되는 경우 "자가(autologous)"일 수 있다. "자가 이식"은 대상체 자신의 세포 또는 장기의 수확 및 재주입 또는 이식을 지칭한다. 자가 세포의 배타적 또는 보충적 사용은 세포를 숙주로 다시 투여하는 많은 부작용, 특히 이식편대 숙주 반응을 제거하거나 감소시킬 수 있다.
동계 이식은 전달된 세포가 동일한 종의 다른 구성원으로부터 얻어지고 이식되지만 주 조직적합성 복합체(MHC) 항원과 충분히 일치하여 불리한 면역 원성 반응을 피하는 경우 "일치 동종이계(matched allogeneic)"일 수 있다. MHC 불일치 정도를 결정하는 것은 당업계에 공지되고 사용되는 표준 테스트에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, 인간의 MHC 유전자에는 이식 생물학에서 중요한 것으로 확인된 적어도 3개의 주요 범주가 있다. HLA-A, HLA-B, HLA-C는 HLA 클래스 I 단백질을 암호화하는 반면, HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP는 HLA 클래스 II 단백질을 암호화한다. 이러한 각 그룹 내의 유전자는 인간 집단에서 발견되는 수많은 HLA 대립 유전자 또는 변이체에 반영된 대로 고도로 다형성이며, 이러한 그룹 간의 차이는 이식된 세포에 대한 면역 반응의 강도와 관련이 있다. MHC 일치 정도를 결정하기 위한 표준 방법은 HLA-B 및 HLA-DR 또는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR 그룹 내의 대립 유전자를 검사한다. 따라서, 테스트는 각각 2개 또는 3개의 HLA 그룹 내에서 적어도 4 및 심지어 5개 또는 6개의 MHC 항원으로 이루어질 수 있다. 혈청학적 MHC 테스트에서, 각각의 HLA 항원 유형에 대한 항체는 항체와 반응하는 소정의 MHC 항원의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 한 대상체(예를 들어, 공여체)로부터의 세포와 반응된다. 이는 다른 대상체(예를 들어, 수여체)의 반응성 프로파일과 비교된다. 항체와 MHC 항원의 반응은 전형적으로 항체를 세포와 인큐베이션한 다음 보체를 추가하여 세포 용해(즉, 림프구 독성 테스트)를 유도함으로써 결정된다. 반응은 반응에서 용해된 세포의 양에 따라 조사되고 등급이 매겨진다(예를 들어, 문헌[Mickelson and Petersdorf (1999)　Hematopoietic Cell Transplantation, Thomas, E. D. et al. eds., pg 28-37, Blackwell Scientific, Malden, Mass.] 참조). 다른 세포-기반 검정은 표지된 항체 또는 효소 연결 면역검정(ELISA)을 사용하는 유세포 분석을 포함한다. MHC 유형을 결정하는 분자 방법은 잘 알려져 있으며, 일반적으로 HLA 단백질을 암호화하는 특정 유전자 서열을 검출하기 위해 합성 프로브 및/또는 프라이머를 사용한다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 특정 HLA 유형과 관련된 제한 단편 길이 다형성을 검출하기 위해 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다(문헌[Vaughn (2002)　Method. Mol. Biol. MHC Protocol.　210:45-60]). 대안적으로, 프라이머는 HLA 서열을 증폭하는데 사용될 수 있으며(예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응 또는 결찰 연쇄 반응에 의해), 그 생성물은 직접 DNA 시퀀싱, 제한 단편 다형성 분석(restriction fragment polymorphism analysis: RFLP) 또는 일련의 서열 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머와의 혼성화(series of sequence specific oligonucleotide primer: SSOP)에 의해 더 검사될 수 있다(문헌[Petersdorf et al. (1998)　Blood　92:3515-3520; Morishima et al. (2002)　Blood 99:4200-4206; 및　Middleton and　Williams (2002)　Method. Mol. Biol. MHC Protocol.　210:67-112]).
동계 이식은 전형적으로 근친교배에 의해 정의된 유전자좌, 예컨대, 단일 유전자좌가 상이할 경우 "유사유전자형(congenic)"일 수 있다. 용어 "유사유전자형"은 동일한 종으로부터 유래, 기원하는 또는 이의 구성원인 것을 지칭하며, 여기서 구성원은 작은 유전적 영역, 전형적으로 단일 유전자좌(즉, 단일 유전자)를 제외하고는 유전적으로 동일하다. "유사유전자형 이식"은 공여체로부터 수여체에게 세포 또는 장기를 전달하는 것을 지칭하며, 여기서 수여체는 단일 유전자좌를 제외하고는 공여체에 대해 유전적으로 동일하다. 예를 들어, CD45는 여러 대립유전자 형태로 존재하며, CD45.1 또는 CD45.2 대립유전자 버전이 발현되는지에 따라 마우스 계통이 다른 유사유전자형 마우스 계통이 존재한다.
대조적으로, "불일치 동종이계(mismatched allogeneic)"는 전형적으로 불리한 면역원성 반응을 이끌어내기에 충분한 정의된 수의 MHC 항원의 혈청학적 또는 분자 분석과 같은 당업계에서 사용되는 표준 검정에 의해 결정되는 바와 같이 비-동일한 주 조직적합성 복합체(MHC) 항원(즉, 단백질)을 갖는 동일한 종으로부터 유래, 기원하는 또는 이의 구성원인 것을 지칭한다. "부분적 불일치"는 구성원 간에, 전형적으로 공여체와 수여체 간에 테스트된 MHC 항원의 부분적 일치를 지칭한다. 예를 들어, "절반 불일치"는 두 구성원 간에 상이한 MHC 항원 유형을 보여주는 것으로 테스트된 MHC 항원의 50%를 지칭한다. “완전(전체 또는 완전한)” 미스매치는 테스트된 모든 MHC 항원이 두 구성원 간에 상이한 것을 지칭한다.
유사하게는, 대조적으로, "이종(xenogeneic)"은 상이한 종, 예를 들어, 인간 및 설치류, 인간 및 돼지, 인간 및 침팬지 등으로부터 유래, 기원하는 또는 이의 구성원인 것을 지칭한다. "이종 이식"은 세포 또는 장기를 공여체로부터 수여체에게 전달하는 것을 지칭하며, 여기서 수여체는 공여체와는 상이한 형태의 종이다.
또한, 세포는 단일 공급원 또는 다수의 공급원(예를 들어, 단일 대상체 또는 다수의 대상체)로부터 수득될 수 있다. 복수는 적어도 2개(예를 들어, 하나 이상)을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 비인간 포유동물은 마우스이다. 관심 세포 유형이 수득될 수 있는 동물은 성체, 신생아(예를 들어, 생후 48시간 미만), 미성숙일 수 있거나 또는 자궁 내(in utero)에 있을 수 있다. 관심 세포 유형은 일차 암세포, 암 줄기 세포, 확립된 암세포주, 불멸화된 일차 암세포 등일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 숙주 대상체의 면역 체계는 이식된 암세포와 면역학적으로 적합하도록 조작되거나 또는 그렇지 않으면 선택될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 인간 세포와 양립하기 위해 "인간화"될 수 있다. 용어 "인간화된 면역 체계"는 숙주 동물로부터 거부되지 않고 생존하여 인간 조혈과 후천성 및 선천성 면역력 둘 다를 숙주 동물에서 재구성되도록 하는 인간 HSC 계통 세포 및 인간 후천성 및 선천성 면역 세포를 포함하는 마우스와 같은 동물을 지칭한다. 후천성 면역 세포는 T 세포 및 B 세포를 포함한다. 선천성 면역 세포는 대식세포, 과립구(호염구, 호산구, 호중구), DC, NK 세포 및 비만 세포를 포함한다. 대표적인, 비-제한적 예는 SCID-hu, Hu-PBL-SCID, Hu-SRC-SCID, NSG(NOD-SCID IL2r-감마(널)은 선천성 면역 체계, B 세포, T 세포 및 사이토카인 신호전달이 결여됨), NOG(NOD-SCID IL2r-감마(절단됨)), BRG(BALB/c-Rag2(널)IL2r-감마(널)) 및 H2dRG(Stock-H2d-Rag2(널)IL2r-감마(널)) 마우스(예를 들어, 문헌[Shultz et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7:118; Pearson et al. (2008) Curr. Protocol. Immunol. 15:21; Brehm et al. (2010) Clin. Immunol. 135:84-98; McCune et al. (1988) Science 241:1632-1639], 미국 특허 제7,960,175호 및 미국 공개 제2006/0161996호 참조), 또한 Rag1(B 세포 및 T 세포가 결여됨), Rag2(B 세포 및 T 세포가 결여됨), TCR 알파(T 세포가 결여됨), 퍼포린(cD8+ T 세포는 세포독성 기능이 결여됨), FoxP3(기능성 CD4+ T 조절성 세포가 결여됨), IL2rg 또는 Prfl과 같은 면역-관련 유전자의 관련 널 돌연변이체, 또한 인간 면역 세포의 효율적인 생착을 허용하고/하거나 마우스와 같은 면역 손상 동물의 구획-특이적 모델을 제공하는 PD-1, PD-L1, Tim3 및/또는 2B4의 돌연변이체 또는 넉아웃(예를 들어, PCT 공개 WO 2013/062134 참조)을 포함한다. 또한, NSG-CD34+(NOD-SCID IL2r-감마(널) CD34+) 인간화된 마우스는 마우스와 같은 동물 모델에서 인간 유전자 및 종양 활성을 연구하는데 유용하다.
본 명세서에 사용되는, 생물학적 물질 공급원으로부터 "수득된"은 공여체로부터 생물학적 물질의 공급원을 채취하거나 분할하는 임의의 종래의 방법을 의미한다. 예를 들어, 생물학적 물질은 고형 종양, 말초혈액 또는 제대혈 샘플과 같은 혈액 샘플로부터 수득되거나 또는 골수 또는 양수와 같은 다른 체액으로부터 채취될 수 있다. 이러한 샘플을 얻는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에서, 샘플은 신선할 수 있다(즉, 동결 없이 공여체로부터 수득됨). 또한, 샘플은 확장 전에 외부의 또는 원치 않는 성분을 제거하기 위해 더 조작될 수 있다. 샘플은 또한 보존된 스톡으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 세포주 또는 말초혈액 또는 제대혈과 같은 체액의 경우에, 샘플은 이러한 세포주 또는 체액의 극저온 또는 그렇지 않으면 보존된 은행에서 회수될 수 있다. 이러한 샘플은 임의의 적합한 공여체로부터 수득될 수 있다.
수득된 세포의 집단은 직접 사용되거나 또는 나중에 사용하기 위해 냉동될 수 있다. 냉동 보존을 위한 다양한 배지 및 프로토콜이 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 동결 배지는 약 5% 내지 10%의 DMSO, 10% 내지 90%의 혈청 알부민 및 50% 내지 90%의 배양 배지를 포함할 것이다. 세포 보존에 유용한 다른 첨가제는 예로서 제한 없이, 트레할로스(문헌[Scheinkoniget al. (2004) Bone Marrow Transplant.　34:531-536])와 같은 이당류 또는 헤타전분(hetastarch)(즉, 하이드록시에틸 전분)과 같은 혈장 부피 확장제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포스페이트-완충 식염수와 같은 등장성 완충액 용액이 사용될 수 있다. 예시적 동결보존 조성물은 4% HSA, 7.5% 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 및 2% 헤타전분을 함유하는 세포-배양 배지를 갖는다. 동결보존을 위한 다른 조성물 및 방법은 잘 알려져 있으며, 당업계에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Broxmeyer et al. (2003)　Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.　100:645-650] 참조). 세포는 약 -135℃ 미만의 최종 온도에서 보존된다.
일부 실시형태에서, 면역요법은 CAR(키메라 항원 수용체(키메라 항원 수용체))-T 요법일 수 있으며, 여기서 T 세포는 관심 종양 세포상의 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 항원 결합시 세포내 신호를 전파하기 위해 목적하는 항원 특이성 및 신호전달 도메인을 갖는 수용체를 지칭한다. 예를 들어, T 림프구는 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II 분자에 의해 제시된 짧은 펩타이드를 갖는 T 세포 수용체(TCR)의 상호작용을 통해 특정 항원을 인식한다. 초기 활성화 및 클론 확장을 위해, 미경험 T 세포는 추가적인 공동-자극성 신호를 제공하는 전문 항원-제시 세포(antigen-presenting cell: APC)에 의존한다. 공동-자극의 부재하에서 TCR 활성화는 무반응성 및 클론성 무력성을 초래할 수 있다. 면역화를 우회하기 위해, 이식된 인식 특이성을 갖는 세포독성 효과기 세포의 유도를 위한 상이한 접근법이 개발되었다. TCR-관련 CD3 복합체의 세포-표면 성분에 특이적인 천연의 리간드 또는 항체로부터 유래된 결합 도메인으로 구성된 CAR이 구축되었다. 항원 결합시, 이러한 키메라 항원 수용체는 효과기 세포의 내인성 신호 전달 경로에 연결되어 TCR 복합체에 의해 시작된 것과 유사한 활성화 신호를 생성한다. 키메라 항원 수용체에 대한 첫 번째 보고 이후, 이러한 개념은 꾸준히 개선되었고, 키메라 수용체의 분자 설계가 최적화되었으며, scFV, Fav 및 단편 본 명세서에 기재된 다른 단백질 결합과 같은 임의의 수의 잘 알려진 결합 도메인을 일상적으로 사용하고 있다.
일부 실시형태에서, 단핵구 및 대식세포는 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작될 수 있다. 변형된 세포는 종양에 침투하여 표적 암세포를 죽임으로써 강력한 면역 효과기로서 작용하는 종양 미세환경에 동원될 수 있다. CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인은 표적 세포상의 항원에 결합한다. CAR의 항원 결합 도메인에 결합하는 항원으로 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아, 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암세포(예를 들어, 종양 항원)와 관련된 것들을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 관심 종양 또는 암에 특이적인 항원과 같은 종양 항원에 결합한다. 종양 관련 항원의 비-제한적 예는 BCMA, CD19, CD24, CD33, CD38; CD44v6, CD123, CD22, CD30, CD117, CD171, CEA, CS-1, CLL-1, EGFR, ERBB2, EGFRvIII, FLT3, GD2, NY-BR-1, NY- ESO-1, p53, PRSS21, PSMA, ROR1, TAG72, Tn Ag, VEGFR2를 포함한다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CAR에서 하나 이상의 도메인과 자연적으로 결합된다. 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 특별히 사용되는 막관통 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 및 TLR9로부터 유래될 수 있다(즉, 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함함). 일부 예에서, 인간 Ig(면역글로불린) 힌지를 포함하는 다양한 인간 힌지도 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, CAR의 세포 내 도메인은 신호 활성화 및/또는 형질도입을 담당하는 도메인을 포함한다. 세포내 도메인의 예는 TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 공통 FcR 감마, FcR 베타(Fc 엡실론 Rib), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, DAP 12, T 세포 수용체(TCR), CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD l id, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(택타일), CEACAMl, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGLl, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), LRRC25(CD 162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 본 명세서에 기재된 다른 공동-자극성 분자, 이의 임의의 유도체, 변이체 또는 단편, 동일한 기능적 능력을 갖는 공동 자극성 분자의 임의의 합성 서열 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 분자 또는 수용체로부터의 단편 또는 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제, 조성물 및 방법은 다른 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포에 항원을 제시하는 능력을 증가시키기 위해 단핵구 및 대식세포를 재조작하는데 사용될 수 있다. 항원 제시 세포(APC)로서 조작된 단핵구 및 대식세포는 종양 항원을 가공하고, T 세포에 항원성 에피토프를 제시하여 종양 세포 공격에 대한 후천성 면역 반응을 자극할 것이다.
VI. 용도 및 방법
본 명세서에 기재된 조성물 및 작용제는 본 명세서에 기재된 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적)에 관한 다양한 조절, 치료법, 스크리닝, 진단, 예후 예측 및 치료적 적용에 사용될 수 있다. 조절 방법, 치료 방법, 스크리닝 방법, 진단 방법, 예후 예측 방법 또는 이들의 조합과 같은 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서, 방법의 모든 단계는 단일 행위자에 의해 또는 대안적으로 한 명 이상의 행위자에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 진단은 치료적 치료를 제공하는 행위자에 의해 직접 수행될 수 있다. 대안적으로, 치료제를 제공하는 사람은 진단 검정이 수행되도록 요청할 수 있다. 진단자 및/또는 치료 중재자는 치료 전략을 결정하기 위해 진단 검정 결과를 해석할 수 있다. 유사하게는, 이러한 대안적 과정은 예후 예측 검정과 같은 다른 검정에 적용될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 본 발명에 포함된 임의의 양태는 단독으로 또는 하나, 둘 이상의 또는 이들의 모든 실시형태를 포함하는 본 발명에 포함된 임의의 다른 양태와 조합하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 진단 및/또는 스크리닝 방법은 단독으로 또는 적절한 진단 및/또는 스크리닝 결과를 결정할 때 적절한 요법을 제공하는 것과 같이 치료 단계와 조합하여 수행될 수 있다.
항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한 소정의 바람직한 조성물이 본 명세서에 기재되어 있지만, 이러한 작용제는 단독으로 또는 염증성 표현형을 상향조절 또는 하향조절하여 면역 반응을 각각 상향조절 또는 하향조절하기 위해 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)의 양 및/또는 활성을 조절하는 것과 같은 다른 유용한 작용제와 조합하여 사용될 수 있는 것으로 상정된다. 이러한 작용제는 또한 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)의 양 및/또는 활성을 검출하는데 유용하므로, 작용제는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)에 의해 매개되는 효과를 진단, 예후예측 및 스크리닝하는데 유용하다.
표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제는 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시킨다.
유사하게는, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제는 골수성 세포의 염증성 표현형을 감소시킨다.
항체 및 이의 항원-결합 단편, casme에 의해 접촉된 세포 등을 포함하여 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)를 조절하는 작용제는 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 작용제는 적어도 하나의 바이오마커에 의해 매개되는 유전자 서열, 카피 수, 유전자 발현, 번역, 번역 후 변형, 세포내 국재화, 분해, 형태, 안정성, 분비, 효소적 활성, 전사 인자, 수용체 활성화, 신호 전달 및 기타 생화학적 기능을 조절할 수 있다. 이러한 작용제는 임의의 세포 모이어티, 예컨대, 수용체, 세포 막, 항원 결정기기 또는 표적 분자 또는 표적 세포에 존재하는 다른 결합 부위에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 세포 내에서 작용할 수 있는 세포로 확산되거나 또는 수송될 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 세포-기반이다. 대표적인 작용제는 제한 없이 핵산(cDNA 및 mRNA와 같은 DNA 및 RNA), 올리고뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체, 융합 단백질, 항생제, 소분자, 지질/지방, 당, 벡터, 접합체, 백신, 유전자 요법 작용제, 세포 요법 작용제 등, 예컨대, 소분자, mRNA 암호화 폴리펩타이드, CRISPR 가이드 RNA(gRNA), RNA 간섭 작용제, 작은 간섭 RNA(siRNA), CRISPR RNA(crRNA 및 tracrRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 피위-결합 RNA(piRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 펩타이도모방체 저해제, 압타머, 천연의 리간드 및 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 단백질 바이오마커, 항체, 인트라바디 또는 세포에 결합하여 이를 활성화하거나 저해하는 이들의 유도체를 포함한다.
본 발명에 포함되는 이러한 작용제는 임의의 수, 유형 및 양식을 포함할 수 있다. 예를 들어, 작용제는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상 또는 그 사이를 포함하는 임의의 범위, 바이오마커 또는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 동일한 표적을 조절하는 2개의 작용제, 표 1에 열거된 표적을 조절하는 작용제와 표 1에 열거된 동일한 표적을 조절하는 또 다른 작용제, 표 1에 열거된 표적을 조절하는 작용제와 표 1에 열거된 또 다른 표적을 조절하는 또 다른 작용제 등)를 조절하는 작용제의 수를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조절성 작용제는 포식세포, 예를 들어, 골수성 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 추가적인 작용제를 더 포함한다. 이러한 단핵구/대식세포 표적화 작용제는 CD11b를 표적으로 하는 로벨리주맙, MNRP1685A(뉴로필린-1을 표적으로 함)를 포함하는 소분자, ANG2를 표적으로 하는 네스쿠맙, IL-4에 특이적인 파스콜리주맙, IL4Rα에 특이적인 두필루맙, IL-6R에 특이적인 토실리주맙과 사릴루맙, TNF-α에 특이적인 아달리무맙, 세르톨리주맙, 태너셉트, 골리무맙 및 인플릭시맙, 및 CD40을 표적화하는 CP-870과 CP-893을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에 포함되는 항체 및 이의 항원-결합 단편과 함께 사용하기 위한 예시적인 작용제는 본 명세서 및 당업계에 추가로 기술되어 있다(예를 들어, 2018년 6월 29일자로 출원된 U.S.S.N. 62/692,463, 2019년 2월 26일자로 출원된 U.S.S.N. 62/810,683, 2019년 6월 4일자로 출원된 U.S.S.N. 62/857,199 및 "Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macro파지 Inflammatory Phenotypes and Immunotherapy Uses Thereof"라는 명칭의 2019년 6월 27일자로 Novobrantseva 등(버소 테라퓨틱스 인코포레이션(Verseau Therapeutics, Inc.))에 의해 출원된 동시 계류중인 출원 참조; 상기 출원 각각의 전체 내용은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
1. 조절 및 치료 방법
본 발명에 포함되는 일 양태는 치료적 목적을 위해서와 같이 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적, 실시예 등)의 양(예를 들어, 발현) 및/또는 활성(예를 들어, 신호전달의 조절, 결합 파트너에 대한 결합의 저해 등)을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이러한 작용제는 골수성 세포의 특정 하위집단을 조작하고, 생리학적 조건에서 이들의 수 및/또는 활성을 조절하는데 사용될 수 있으며, 대식세포 관련 질환 및 다른 임상적 병태를 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 조성물 및 약제학적 제형을 포함하는 작용제는 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적, 실시예 등)의 양 및/또는 활성을 조절할 수 있으며, 이에 의해 골수성 세포의 염증성 표현형을 조절하고, 면역 반응을 추가로 조절한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응 자체를 조절하기보다는 세포 활성(예를 들어, 사이토카인 분비, 세포 집단 비 등)이 조절된다. 본 명세서에 기재된 작용제, 조성물 및 제형을 사용하여 단핵구 및 대식세포 염증성 표현형을 조절하는 방법이 제공된다. 따라서, 작용제, 조성물 및 방법은 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적, 실시예 등)의 양 및/또는 활성을 조절함으로써 면역 반응을 조절하는데 사용될 수 있고, 소정의 유형의 세포를 고갈 또는 농축시키고/시키거나 세포 유형의 비를 조절한다. 예를 들어, 소정의 표 1에 열거된 표적은 세포 생존에 필요하며, 이러한 표적을 저해하는 것은 세포 사멸로 이어진다. 면역 반응을 매개하는 세포 유형(예를 들어, 전-염증성 대 항-염증성 세포)의 비가 조절되기 때문에, 이러한 조절은 면역 반응을 조절하는데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 암을 앓고 있는 대상체에서 암을 치료하는데 사용된다.
본 개시내용은 대식세포에서 이러한 유전자의 양 및/또는 활성의 하향조절이 대식세포를 재분극화(예를 들어, 표현형을 변화시킴)할 수 있음을 보여준다. 일부 실시형태에서, M2 대식세포의 표현형은 제1형(M2-유사) 또는 M1 표현형을 갖는 대식세포를 생성하도록 변경되거나, 또는 M1 대식세포 및 제2형(M2-유사) 또는 M2 표현형과 관련하여 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 M2 표현형을 갖는 단핵구 및 대식세포의 조절(예를 들어, 저해) 수송, 분극화 및/또는 활성화에 사용되거나, 또는 제1형 및 M1 대식세포와 관련하여 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본 발명은 M1 대식세포, M2 대식세포(예를 들어, 종양에서의 TAM) 등과 같은 관심 골수성 세포의 집단을 감소시키는 방법을 더 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 전-종양성 대식세포 및 항-종양성 대식세포와 같은 이들의 하위유형을 포함하는 골수성 세포의 분포를 변화시키는 방법을 제공한다. 일 예에서, 본 발명은 항-염증성 면역 반응으로부터 전-염증성 면역 반응으로 대식세포를 유도하는 방법을 제공하며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 세포 유형은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상, 또는 그 사이를 포함하는 임의의 범위, 예컨대, 45% 내지 55%까지 고갈 및/또는 농축될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절은 세포, 예컨대, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 다른 포식세포에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 기재된 대식세포 하위유형과 같은 대식세포 하위유형이다. 예를 들어, 대식세포는 혈류에서 순환하는 단핵구로부터 유래된 조직 상주 대식세포(TAM) 또는 대식세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 골수 염증성 표현형을 조절하는 것은 목적하는 조절된 면역 반응, 예컨대, 비정상적인 단핵구 이동 및 증식의 조절, 조직 상주 대식세포의 조절되지 않은 증식, 조절되지 않은 전-염증성 대식세포, 조절되지 않은 항-염증성 대식세포, 조직에서 전-염증성 및 항-염증성 대식세포 하위집단의 불균형한 분포, 질환 병태에서 단핵구 및 대식세포의 비정상적으로 채택된 활성화 상태, 조절된 세포독성 T-세포 활성화 및 기능, 요법에 대한 암세포의 저항성 및 면역관문 요법과 같은 요법에 대한 암세포의 감수성의 극복이 발생한다. 일부 실시형태에서, 이러한 표현형은 역전된다.
단핵구 및 대식세포와 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법은 세포를 시험관내, 생체외 또는 생체내(예를 들어, 대상체에게 투여)에서 본 발명에 포함되는 작용제 및 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 작용제 및 조성물은 단핵구 및 대식세포의 이동, 동원, 분화 및 분극화, 활성화, 기능 및/또는 생존을 조절한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오마커의 조절(예를 들어, 저해 또는 고갈)은 종양 조직과 같은 조직 미세환경에서 단핵구 및 대식세포의 증식, 동원, 분극화 및/또는 활성화를 조절하기 위해 사용된다.
본 발명에 포함되는 일 양태에서, 골수성 세포의 항-염증성 활성을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명에 포함되는 다른 양태에서, 골수성 세포의 전-염증성 활성을 증가시키는 방법이 제공된다.
본 발명에 포함되는 다른 양태에서, 조직에서 전-염증성 단핵구 및 대식세포 및 항-염증성 단핵구 및 대식세포의 균형을 맞추는 방법이 제공된다.
본 발명에 포함되는 조절 방법은 세포를 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)를 포함하고, 표 1 및 실시예에 열거된 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적) 또는 이의 단편 또는 세포와 관련된 바이오마커 활성 중 하나 이상의 활성을 조절하는 작용제를 포함하는 본 발명에 포함되는 바이오마커의 하나 이상의 조절인자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바이오마커 활성을 조절하는 작용제는 본 명세서에 기재된 작용제, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 또한, 다른 작용제는 위에 기재된 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩타이드, 바이오마커의 자연 발생적 결합 파트너, 바이오마커에 대한 항체의 조합 및 다른 면역 관련 표적에 대한 항체, 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적) 효능제 또는 길항제, 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적) 효능제 또는 길항제의 펩타이도모방체, 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적) 펩타이도모방체, 다른 소분자, 또는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적) 핵산 유전자 발현 산물에 대해 지시되거나 이를 모의하는 작은 RNA 등)과 조합하여 사용될 수 있다.
a. 대상체
본 발명 및 실시예에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적) 또는 이의 단편의 상향-조절 또는 하향-조절로부터 혜택을 얻을 수 있는 병태 또는 장애, 예를 들어, 바이오마커 또는 이의 단편의 원치 않는, 불충분한 또는 비정상적인 발현 또는 활성을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 바이오마커 발현 또는 활성을 조절(예를 들어, 상향조절 또는 하향조절)하는 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 작용제) 또는 작용제의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 요법을 필요로 하는 대상체는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있으며, 본 명세서에 또한 기재된 것들과 같은 추가적인 방법은 진단, 예후 예측, 관찰 등을 위한 방법(예를 들어, 관심 바이오마커의 발현이 확인된 골수성 세포의 집단 및 이러한 골수성 세포를 포함하는 대상체의 조절)과 같은 이러한 치료 방법과 조합될 수 있다.
바이오마커 활성의 자극은 바이오마커가 비정상적으로 하향조절되고/되거나 증가된 바이오마커 활성이 유익한 효과를 가질 가능성이 있는 상황에서 바람직하다. 마찬가지로, 바이오마커 활성의 저해는 바이오마커가 비정상적으로 상향조절되고/되거나 감소된 바이오마커 활성이 유익한 효과를 가질 가능성이 있는 상황에서 바람직하다.
일부 실시형태에서, 대상체는 동물이다. 동물은 어느 하나의 성별일 수 있으며, 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 동물은 포유동물과 같은 척추동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비인간 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가축, 예컨대, 개, 고양이, 젖소, 돼지, 말, 양 또는 염소이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 반려 동물, 예컨대, 개 또는 고양이이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가축, 예컨대, 젖소, 돼지, 말, 양 또는 염소이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 동물원의 동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 연구 동물, 예컨대, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 개, 돼지 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 동물은 유전자 조작 동물이다. 일부 실시형태에서, 동물은 형질전환 동물(예를 들어, 형질전환 마우스 및 형질전환 돼지)이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 물고기 또는 파충류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암의 동물 모델이다. 예를 들어, 동물 모델은 인간-유래 암의 동소 이종 이식 동물 모델일 수 있다.
본 발명에 포함되는 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 치료, 예컨대, 화학요법, 방사선 요법, 표적화 요법 및/또는 면역요법을 받지 않았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 치료, 예컨대, 화학요법, 방사선 요법, 표적화 요법 및/또는 면역요법을 받았다.
일부 실시형태에서, 대상체는 암성 또는 전암성 조직을 제거하기 위해 수술을 받았다. 일부 실시형태에서, 암성 조직은 제거되지 않았으며, 예를 들어, 암성 조직은 신체의 수술 불가능한 영역, 예컨대, 생명에 필수적인 조직 또는 외과적 절차가 환자에게 상당한 위험을 초래할 수 있는 영역에 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체 또는 이의 세포는 면역관문 저해제 요법에 대한 저항성과 같은 관련 요법에 저항성이 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커를 조절하는 것은 면역관문 저해제 요법에 대한 저항성을 극복할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 원치 않는 부재, 존재 또는 비정상적인 발현 및/또는 활성을 갖는 것으로 확인되는 바와 같이, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 따른 조절을 필요로 한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 종양 또는 종양 미세환경에서 질량, 부피 및/또는 세포의 수의 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60% 이상 또는 임의의 범위까지, 예컨대, 적어도 약 5% 내지 적어도 약 20%를 나타내는 대식세포가 침윤된 고형 종양을 갖는다. 이러한 세포는 본 명세서의 다른 실시형태에서 유용한 것으로 기재된 임의의 것, 예컨대, 제1형 대식세포, M1 대식세포, TAM, CD11b 또는 CD14 또는 CD11과 CD14 둘 다를 발현하는 골수성 세포 등일 수 있다.
본 발명에 포함되는 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 대상체에서 많은 상이한 암의 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응성을 결정하는데 사용될 수 있다.
또한, 이러한 조절성 작용제는 또한 목적하는 활성을 더 조절하기 위해 병용 요법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, IL-4, IL-4Rα, IL-13 및 CD40을 표적으로 하는 작용제 및 조성물은 골수 분화 및/또는 분극화를 조절하기 위해 사용될 수 있다. CD11b, CSF-1R, CCL2, 뉴로필린-1 및 ANG-2를 표적으로 하는 작용제 및 조성물은 조직에 대한 대식세포 동원을 조절하기 위해 사용될 수 있다. IL-6, IL-6R 및 TNF-α를 표적으로 하는 작용제 및 조성물은 대식세포 기능을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 추가적인 작용제는 제한 없이 화학치료제, 호르몬, 항혈관신생제, 방사성 표지, 화합물, 또는 수술, 저온요법 및/또는 방사선 요법을 포함한다. 선행 치료 방법은 종래의 요법과 연속하여, 이의 이전 또는 이후에 다른 형태의 종래의 요법(예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 암에 대한 표준(standard-of-care) 치료)과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조절성 작용제는 치료적 유효량의 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 조절성 작용제는 화학치료제의 활성 및 효능을 향상시키기 위한 화학요법과 함께 투여된다. 의사 처방 참고서(Physicians' Desk Reference: PDR)는 다양한 암의 치료에 사용된 화학치료제의 용량을 개시하고 있다. 치료적으로 효과적인 이러한 전술된 화학요법 약물의 투여 양생법 및 투여량은 치료되는 특정 흑색종, 질환의 정도 및 숙련된 의사에게 친숙한 기타 요인에 따라 달라질 것이며, 의사에 의해 결정될 수 있다.
b. 암 요법
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 암을 치료하는데 사용된다. 예를 들어, 본 발명은 골수성 세포(즉, 종양 형성)의 전-종양성 기능을 감소시키고/시키거나 골수성 세포의 항-종양성 기능을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 방법은 1) 종양 관련 대식세포(TAM)의 동원 및 분극화, 2) 종양 혈관신생, 3) 종양 성장, 4) 종양 세포 분화, 5) 종양 세포 생존, 6) 종양 침입 및 전이, 7) 면역 저해 및 8) 면역억제성 종양 미세환경을 포함하는, 대식세포의 전-종양성 기능 중 적어도 하나를 감소시킬 수 있다.
암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자) 또는 요법의 조합(예를 들어, 적어도 하나의 면역요법과 조합하여, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)은 접촉 암세포와 접촉하는데 사용되고/되거나 원하는 대상체, 예컨대, 대상체 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)에 반응할 가능성이 있는 것으로 나타난 대상체에게 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)은 대상체가 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)에 대해 반응할 가능성이 없는 것으로 나타나면 회피될 수 있으며, 대안적 치료 양생법, 표적화 및/또는 비표적화 암 요법이 투여될 수 있다. 병용 요법이 또한 상정되며, 예를 들어, 하나 이상의 화학치료제 및 방사선, 하나 이상의 화학치료제 및 면역요법 또는 하나 이상의 화학치료제, 방사선 및 화학요법을 포함할 수 있고, 이들 각각의 조합은 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)과 함께이거나 이것이 없을 수 있다.
본 발명에 포함되는 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적)를 조절하는데 유용한 대표적인 예시적 작용제는 위에 기재된 바와 같다. 아래에 더 기재되는 바와 같이, 항암제는 바이오 치료적 항암제(예를 들어, 인터페론, 사이토카인(예를 들어, 종양 괴사 인자, 인터페론 α, 인터페론 γ 등), 백신, 조혈 성장 인자, 단일클론 혈청 요법, 면역자극제 및/또는 면역조절성 작용제(예를 들어, IL-1, 2, 4, 6 및/또는 12), 면역 세포 성장 인자(예를 들어, GM-CSF) 및 항체(예를 들어, 트라스투주맙, T-DM1, 베바시주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙 등)뿐만 아니라 화학치료제를 포함한다.
용어 "표적화 요법"은 선택된 생체 분자와 선택적으로 상호작용하여 암을 치료하는 작용제의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 면역관문 저해제의 저해에 관한 표적화 요법은 본 발명에 포함되는 방법과 조합하여 유용하다.
용어 "면역요법" 또는 "면역요법들"은 일반적으로 유익한 방식으로 면역 반응을 조절하기 위한 임의의 전략을 지칭하며, 면역 반응을 유도, 향상, 억제 또는 그렇지 않으면 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의해 질환에 걸린 또는 질환에 걸리거나 재발의 위험이 있는 대상체의 치료뿐만 아니라, 암과 같은 질환과 싸우기 위해 대상체의 면역 체계의 특정 부분을 사용하는 임의의 치료를 포함한다. 대상체 자신의 면역 체계는 그 목적을 위해 하나 이상의 작용제를 투여하거나 투여하지 않고 자극(또는 억제)된다. 면역 반응을 유도하거나 증폭하도록 설계된 면역 요법은 "활성화 면역요법"으로 지칭된다. 면역 반응을 감소시키거나 억제하도록 설계된 면역요법은 "억제 면역요법"으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 암세포와 같은 관심 세포에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 "비표적화"될 수 있으며, 이는 면역계 세포와 선택적으로 상호작용하지 않지만 면역 체계 기능을 조절하는 작용제의 투여를 지칭한다. 비표적화된 요법의 대표적인 예는 제한 없이 화학요법, 유전자 요법 및 방사선 요법을 포함한다.
면역요법의 일부 형태는 예를 들어, 암 백신 및/또는 감작된 항원 제시 세포의 사용을 포함할 수 있는 표적화된 요법이다. 예를 들어, 종양용해성 바이러스는 암세포를 감염시키고 용해시킬 수 있는 바이러스로, 정상 세포는 손상되지 않게 하여 암 요법에 잠재적으로 유용하다. 종양용해성 바이러스의 복제는 종양 세포 파괴를 촉진하고 종양 부위에서 용량 증폭을 일으킨다. 이들은 또한 항암 유전자의 벡터 역할을 하여, 종양 부위에 특이적으로 전달될 수 있다. 면역요법은 암 항원 또는 질환 항원에 대해 지시된 미리 형성된 항체의 투여(예를 들어, 종양 항원에 화학치료제 또는 독소에 선택적으로 연결된 단일클론 항체의 투여)에 의해 달성된 숙주의 단기 보호를 위한 수동 면역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-VEGF 및 mTOR 저해제는 신세포 암종을 치료하는데 효과적인 것으로 알려져 있다. 면역요법은 또한 암세포주의 세포독성 림프구-인식 에피토프를 사용하는 데 초점을 맞출 수 있다. 대안적으로, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임, RNA 간섭 분자, 삼중 나선 폴리뉴클레오타이드 등이 종양 또는 암의 개시, 진행 및/또는 병리에 연계된 생체 분자를 선택적으로 조절하는데 사용될 수 있다. 유사하게는, 면역요법은 세포-기반 요법의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 입양 세포 면역요법은 T 세포와 같은 면역 세포를 사용하는 면역요법의 한 유형으로, 환자의 암에 대해 천연의 또는 유전자 조작 반응성이 생성된 다음 암 환자에게 다시 전달될 수 있다. 다수의 활성화된 종양-특이적 T 세포의 주사는 완전하고 지속적인 암의 퇴행을 유도할 수 있다.
면역요법은 암 항원 또는 질환 항원에 대해 지시된 사전 형성된 항체의 투여(예를 들어, 종양 항원에 화학치료제 또는 독소에 선택적으로 연결된 단일클론 항체의 투여)에 의해 달성된 숙주의 단기 보호를 위한 수동 면역을 포함할 수 있다. 면역요법은 또한 암세포주의 세포독성 림프구-인식 에피토프를 사용하는 데 초점을 맞출 수 있다. 대안적으로, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임, RNA 간섭 분자, 삼중 나선 폴리뉴클레오타이드 등이 종양 또는 암의 개시, 진행 및/또는 병리에 연계된 생체 분자를 선택적으로 조절하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역치료제는 면역-자극성 분자의 효능제; 면역-저해성 분자의 길항제; 케모카인의 길항제; T 세포 활성화를 자극하는 사이토카인의 효능제; T 세포 활성화를 저해하 사이토 카인을 길항하거나 저해하는 작용제; 및/또는 B7 패밀리의 막 결합 단백질에 결합하는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 면역치료제는 면역-저해성 분자의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 면역치료제는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자에 대한 작용제, 예를 들어, 종양 관련 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 및 IL-10, TGF-β 및 VEGF을 포함하는 기타 가용성 인자의 저해 효과를 중화시키는 중화 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역요법 하나 이상의 면역 체크 포인트의 저해제를 포함한다. 용어 "면역관문"는 항-종양 면역 반응을 하향조절하거나 저해하는 것과 같이 항암 면역 반응을 조절함으로써 면역 반응을 미세 조정하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 세포 표면상의 분자 그룹을 지칭한다. 면역관문 단백질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 제한 없이 CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD200R, CD160, gp49B, PIR-B, KRLG-1, KIR 패밀리 수용체, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3(CD223), IDO, GITR, 4-IBB, OX-40, BTLA, SIRP알파(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, 뷰티로필린 및 A2aR을 포함한다(예를 들어, WO 2012/177624 참조). 용어는 생물학적으로 활성인 단백질 단편뿐만 아니라 전장 면역 관문 단백질을 암호화하는 핵산 및 이의 생물학적으로 활성인 단백질 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어는 본 명세서에 제공된 상동성 설명에 따른 임의의 단편을 추가로 포함한다.
일부 면역관문은 면역 체계의 기능(예를 들어, 면역 반응)을 저해, 하향조절 또는 억제하는 분자(예를 들어, 단백질)를 포함하는 "면역-저해성 면역관문"이다. 예를 들어, CD274 또는 B7-H1로도 알려진 PD-L1(프로그래밍된 사멸-리간드 1)은 면역 체계를 억제하기 위해 T 세포의 증식을 감소시키는 저해성 신호를 전달하는 단백질이다. CD152로도 알려진 CTLA-4(세포독성 T-림프구-관련 단백질 4)는 면역 반응을 하향조절하는 면역관문("오프" 스위치) 역할을 하는 항원-제시 세포 표면상의 단백질 수용체이다. HAVCR2로도 알려진 TIM-3(T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3)은 대식세포 활성화를 조절하기 위해 면역관문 역할을 하는 세포 표면 단백질이다. VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자)는 T 세포 효과기 기능을 저해하고 말초 내성을 유지하는 면역관문 역할을 하는 유형 I 막관통 단백질이다. LAG-3(림프구-활성화 유전자 3)은 T 세포의 증식, 활성화 및 항상성을 음성적으로 조절하는 면역관문 수용체이다. BTLA(B- and T-lymphocyte attenuator: B- 및 T-림프구 감쇠인자))는 종양 괴사 패밀리 수용체(TNF-R)와의 상호 작용을 통해 T 세포 저해를 나타내는 단백질이다. KIR(killer-cell immunoglobulin-like receptor: 살해-세포 면역글로불린-유사 수용체))은 NK 세포상에서 발현되는 단백질의 패밀리로, NK 세포의 세포독성 활성을 억제하는 소수의 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역치료제는 T 세포와 NK 세포를 억제하는 면역관문 단백질인 아르기네이스(ARG)와 인돌아민 2,3-다이옥시게네이스(indoleamine 2,3-dioxygenase: IDO)의 활성을 차단할 수 있고, 면역억제성 종양 미세환경에서 아미노산 아르기닌 및 트립토판의 이화작용을 변화시키는 저해제와 같은 면역억제성 효소에 특이적인 작용제일 수 있다. 저해제는 ARG-발현 M2 대식세포를 표적화하는 N-하이드록시-L-Arg(NOHA), ARG 및 산화질소 신테이스(NOS)를 동시에 차단하는 나이트로아스피린 또는 실데나필(Viagra®); 및 1-메틸-트립토판과 같은 IDO 저해제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어는 생물학적으로 활성인 단백질 단편뿐만 아니라 전장 면역관문 단백질을 암호화하는 핵산 및 이의 생물학적으로 활성인 단백질 단편을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어는 본 명세서에 제공된 상동성 설명에 따른 임의의 단편을 더 포함한다.
대조적으로, 다른 면역관문은 면역 체계의 기능(예를 들어, 면역 반응)을 활성화, 자극 또는 촉진하는 분자(예를 들어, 단백질)를 포함하는 "면역-자극성"을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역-자극성 분자는 CD28, CD80(B7.1), CD86(B7.2), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), CD27, CD70, CD40, CD40L, CD122, CD226, CD30, CD30L, OX40, OX40L, HVEM, BTLA, GITR 및 이의 리간드 GITRL, LIGHT, LTβR, LTαβ, ICOS(CD278), ICOSL(B7-H2) 및 NKG2D이다. CD40(분화 클러스터 40)은 활성화에 필요한 항원 제시 세포에서 발견되는 공동자극성 단백질이다. 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4) 또는 CD134로도 알려진 OX40은 T 세포 사멸을 방지하고 이후 사이토카인 생성을 증가시킴으로써 활성화 후 면역 반응을 유지하는데 관여한다. CD137은 활성화된 T 세포를 공동 자극하여 증식 및 T 세포 생존을 향상시키는 종양 괴사 인자 수용체(종양 괴사 인자 수용체: TNF-R) 패밀리의 구성원이다. CD122는 인터류킨-2 수용체(IL-2) 단백질의 서브유닛이며, 이는 미성숙 T 세포의 조절성, 효과기 또는 메모리 T 세포로의 분화를 촉진한다. CD27은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이며, 공동-자극성 면역관문 분자 역할을 한다. CD28(분화 클러스터 28)은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공동-자극성 신호를 제공하는 T 세포에서 발현되는 단백질이다. TNFRSF18 및 AITR로도 알려진 GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein: 글루코코르티코이드-유도성 TNFR-관련 단백질))은 조절성 T 세포에 의해 유지되는 우세한 면역학적 자가-내성에서 핵심적인 역할을 하는 단백질이다. CD278로도 알려진 ICOS(inducible T-cell co-stimulator: 유도성 T-세포 공동자극인자))는 활성화된 T 세포에서 발현되며 T 세포 신호전달 및 면역 반응에서 역할을 하는 CD28-슈퍼패밀리 공동자극성 분자이다.
면역관문 및 이들의 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 대표적인 실시형태가 아래에 더 기재된다. 면역관문은 일반적으로 저해성 수용체의 쌍과 천연의 결합 파트너(예를 들어, 리간드)와 관련된다. 예를 들어, PD-1 폴리펩타이드는 저해성 신호를 면역 세포에 전달하여 면역 세포 효과기 기능을 저해할 수 있거나 또는 예를 들어, 가용성의 모노머 형태로 존재할 때 면역 세포의 공동자극(예를 들어, 경쟁적 저해에 의해)을 촉진할 수 있는 저해성 수용체이다. 바람직한 PD-1 패밀리 구성원은 PD-1과 서열 동일성을 공유하며, 하나 이상의 B7 패밀리 구성원, 예를 들어, B7-1, B7-2, PD-1 리간드 및/또는 항원 제시 세포상의 다른 폴리펩타이드에 결합한다. 용어 "PD-1 활성"은 예를 들어, 항원 제시 세포에 천연의 PD-1 리간드를 결합시킴으로써, 활성화된 면역 세포에서 저해성 신호를 조절하기 위한 PD-1 폴리펩타이드의 능력을 포함한다. 면역 세포에서 저해성 신호의 조절은 면역 세포의 증식 및/또는 사이토카인 분비를 조절한다. 따라서, 용어 "PD-1 활성"은 천연의 리간드(들)에 결합하는 PD-1 폴리펩타이드의 능력, 면역 세포 저해성 신호를 조절하는 능력 및 능력 면역 반응을 조절하는 능력을 포함한다. 용어 "PD-1 리간드"는 PD-1 수용체의 결합 파트너를 지칭하며, PD-L1(문헌[Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027-1034]) 및 PD-L2(문헌[Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2:261]) 둘 다를 포함한다. 용어 "PD-1 리간드 활성"은 천연의 수용체(들)(예를 들어, PD-1 또는 B7-1)에 결합하는 PD-1 리간드 폴리펩타이드의 능력, 면역 세포 저해성 신호를 조절하는 능력 및 면역 반응을 조절하는 능력을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역관문 요법"은 이들의 핵산 및/또는 단백질을 저해하는 것과 같이 면역-저해성 면역관문을 저해하는 작용제의 사용을 지칭한다. 하나 이상의 이러한 면역관문의 저해는 저해성 신호를 차단하거나 그렇지 않으면 중화시켜 암을 보다 효과적으로 치료하기 위해 면역 반응을 상향조절할 수 있다. 면역관문을 억제하는데 유용한 예시적 작용제는 면역관문 단백질에 결합하고/하거나 이를 불활성화 또는 저해할 수 있는 항체, 소분자, 펩타이드, 펩타이도모방체, 천연의 리간드 및 천연의 리간드의 유도체, 또는 이들의 단편뿐만 아니라; 면역관문 핵산 또는 이의 단편의 발현 및/또는 활성을 하향조절할 수 있는 RNA 간섭, 안티센스, 핵산 압타머 등을 포함한다. 면역 반응을 상향 조절하기 위한 예시적 작용제는 단백질과 이의 천연의 수용체(들) 간의 상호작용을 차단하는 하나 이상의 면역관문 단백질; 비-활성화 형태의 하나 이상의 면역관문 단백질(예를 들어, 우세한 음성 폴리펩타이드); 하나 이상의 면역관문 단백질과 이의 천연의 수용체(들) 간의 상호작용을 차단하는 소분자 또는 펩타이드; 천연의 수용체(들)에 결합하는 융합 단백질(예를 들어, 항체 또는 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 면역관문 저해 단백질의 세포외 부분); 면역관문 핵산 전사 또는 번역을 차단하는 핵산 분자 등에 대한 항체를 포함한다. 이러한 작용제는 저해성 신호를 방지하고 면역 반응을 상향조절하기 위해 하나 이상의 면역관문과 이의 천연의 수용체(들)(예를 들어, 항체) 간의 상호작용을 직접 차단할 수 있다. 대안적으로, 작용제는 저해성 신호를 방지하고 면역 반응을 상향조절하기 위해 하나 이상의 면역관문 단백질과 이의 천연의 수용체(들) 간의 상호작용을 간접적으로 차단할 수 있다. 예를 들어, 안정화된 세포외 도메인과 같은 면역관문 단백질 리간드의 가용성 버전은 적절한 리간드에 결합하는 수용체의 유효 농도를 간접적으로 감소시키기 위해 이의 수용체에 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-PD-L2 항체는 단독으로 또는 조합하여 면역관문을 저해하는데 사용된다. PD-1 경로를 차단하는 데 사용되는 치료제는 길항 항체 및 가용성 PD-L1 리간드를 포함한다. PD-1 및 PD-L1/2 저해성 경로에 대한 길항 작용제는 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 PD-1 또는 PD-L1/2에 대한 길항 항체(예를 들어, 17D8, 2D3, 4H1, 5C4(니볼루맙 또는 BMS-936558로도 알려져 있음), 4A11, 7D3 및 5F4; 미국 특허 제8,779,105호; 제8,552,154호; 제8,217,149호; 제8,168,757호; 제8,008,449호; 제7,488,802호; 제7,943,743호; 제7,635,757호; 및 제6,808,710호에 개시된 AMP-224, 피디리주맙(CT-011), 펨브롤리주맙 및 항체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 유사하게는, 추가적인 대표적인 관문 저해제는 미국 특허 제8,748,815호; 제8,529,902호; 제8,318,916호; 제8,017,114호; 제7,744,875호; 제7,605,238호; 제7,465,446호; 제7,109,003호; 제7,132,281호; 제6,984,720호; 제6,682,736호; 제6,207,156호; 및 제5,977,318호뿐만 아니라 유럽 특허 제1212422호, 미국 공개 제2002/0039581호 및 제2002/086014호 및 문헌[Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:10067-10071]에 개시된 것들과 같이, 저해성 조절인자 CTLA-4(항-세포독성 T-림프구 항원 4 항-세포독성 T-림프구 항원 4), 예컨대, 이필리무맙, 트레멜리무맙(완전히 인간화됨), 항-CD28 항체, 항-CTLA-4 애드넥틴, 항-CTLA-4 도메인 항체, 단일 사슬 항-CTLA-4 항체 단편, 중쇄 항-CTLA-4 단편, 경쇄 항-CTLA-4 단편에 대한 항체 및 기타 항체일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
PD-1, PD-L1, PD-L2 및 CTLA-4에 대해 예시된 면역관문 활성, 리간드, 차단 등의 대표적인 정의는 일반적으로 다른 면역관문에 적용된다.
용어 "비표적화 요법"은 선택된 생체 분자와 선택적으로 상호작용하지 않지만 암을 치료하는 작용제의 투여를 지칭한다. 비표적화 요법의 대표적인 예는 제한 없이 화학요법, 유전자 요법 및 방사선 요법을 포함한다.
일 실시형태에서, 화학요법이 사용된다. 화학요법은 화학치료제의 투여를 포함한다. 이러한 화학치료제는 다음 화합물의 군 중에서 선택되는 것들일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다: 백금 화합물, 세포독성 항생제, 대사 길항물질, 항-유사분열 작용제, 알킬화제, 비소 화합물, DNA 토모아이소머레이스 저해제, 탁세인, 뉴클레오사이드 유사체, 식물 알칼로이드 및 독소; 및 이들의 합성 유도체. 예시적 작용제는 알킬화제: 질소 머스타드(예를 들어, 사이클로포스파마이드, 아이포스파마이드, 트로포스파마이드, 클로람부실, 에스트라무스틴 및 멜팔란), 나이트로소우레아(예를 들어, 카무스틴(BCNU) 및 로무스틴(CCNU)), 알킬설포네이트(예를 들어, 뷰설판 및 트레오설판), 트라이아젠(예를 들어, 다카바진, 테모졸로마이드), 시스플라틴, 트레오설판 및 트로포스파마이드; 식물 알칼로이드: 빈블라스틴, 파클리탁셀, 도세탁솔; DNA 토모아이소머레이스 저해제: 테니포사이드, 크리스나톨 및 미토마이신; 항-폴레이트: 메토트렉세이트, 마이코페놀산 및 하이드록시우레아; 피리미딘 유사체: 5-플루오로우라실, 독시플루리딘 및 사이토신 아라비노사이드; 퓨린 유사체: 머캅토퓨린 및 티오구아닌; DNA 대사 길항물질: 2'-데옥시-5-플루오로우리딘, 아피디콜린 글리시네이트 및 피라졸로이미다졸; 및 항유사분열 작용제: 할리콘드린, 콜히친 및 리족신을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 유사하게는, 추가적인 예시적 작용제는 백금-함유 화합물(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴), 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈), 탁소이드(예를 들어, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 등가물, 예컨대, 나노입자 알부민-결합 파클리탁셀(ABRAXANE), 도코사헥사엔산 결합-파클리탁셀(DHA-파클리탁셀, 탁소프렉신), 폴리글루타메이트 결합-파클리탁셀(PG-파클리탁셀, 파클리탁셀 폴리글루멕스, CT-2103, XYOTAX), 종양-활성화된 전구약물(TAP) ANG1005(3개의 분자의 파클리탁셀에 결합된 안지오페프-2), 파클리탁셀-EC-1(ErbB2-인식 펩타이드 EC-1에 결합된 파클리탁셀) 및 글루코스-접합된 파클리탁셀, 예를 들어, 2'-파클리탁셀 메틸 2-글루코피라노실 석시네이트; 도세탁셀, 탁솔), 에피포도필린(예를 들어, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 테니포사이드, 토포테칸, 9-아미노캄토테신, 캄토이리노테칸, 이리노테칸, 크리스나톨, 마이토마이신 C), 대사 길항물질, DHFR 저해제(예를 들어, 메토트렉세이트, 다이클로로메토트렉세이트, 트라이메트렉세이트, 에다트렉세이트), IMP 데하이드로게네이스 저해제(예를 들어, 마이코페놀산, 티아조퓨린, 리바비린 및 EICAR), 리보뉴클레오타이드 리덕테이스 저해제(예를 들어, 하이드록시우레아 및 데페록사민), 우라실 유사체(예를 들어, 5-플루오로우라실(5-FU), 플록사우리딘, 독시플루리딘, 라티트렉세드, 테가퓨르-우라실, 카페시타빈), 사이토신 유사체(예를 들어, 시타라빈(아라 C), 사이토신 아라비노사이드 및 플루다라빈), 퓨린 유사체(예를 들어, 머캅토퓨린 및 티오구아닌), 바이타민 D3 유사체(예를 들어, EB 1089, CB 1093 및 KH 1060), 아이소프레닐화 저해제(예를 들어, 로바스타틴), 도파민성 신경독소(예를 들어, 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온), 세포 주기 저해제(예를 들어, 스타우로스포린), 악티노마이신(예를 들어, 악티노마이신 D, 닥티노마이신), 블레오마이신(예를 들어, 블레오마이신 A2, 블레오마이신 B2, 페플로마이신), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화된 리포솜 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 피라루비신, 조루비신, 미톡산트론), MDR 저해제(예를 들어, 베라파밀), Ca2+ ATPase 저해제(예를 들어, 탑시가긴), 이마티닙, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 타이로신 카이네이스 저해제(예를 들어, 악시티닙(AG013736), 보수티닙(SKI-606), 세디라닙(RECENTIN™, AZD2171), 다사티닙(SPRYCEL®, BMS-354825), 에를로티닙(TARCEVA®), 게피티닙(IRESSA®), 이마티닙(Gleevec®, CGP57148B, STI-571), 라파티닙(TYKERB®, TYVERB®), 레스타우르티닙(CEP-701), 네라티닙(HKI-272), 닐로티닙(TASIGNA®), 세막사닙(세막시닙, SU5416), 수니티닙(SUTENT®, SU11248), 토세라닙(PALLADIA®), 반데타닙(ZACTIMA®, ZD6474), 바탈라닙(PTK787, PTK/ZK), 트라스투주맙(HERCEPTIN®), 베바시주맙(AVASTIN®), 리툭시맙(RITUXAN®), 세툭시맙(ERBITUX®), 파니투무맙(VECTIBIX®), 라니비주맙(Lucentis®), 닐로티닙(TASIGNA®), 소라페닙(NEXAVAR®), 에벨로리무스(AFINITOR®), 알렘투주맙(CAMPATH®), 겜투주맙 오조가미신(MYLOTARG®), 템시롤리무스(TORISEL®), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, 도비티닙 락테이트(TKI258, CHIR-258), BIBW 2992(TOVOK™), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120(VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, 티보자닙(AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647 및/또는 XL228), 프로테아솜 저해제(예를 들어, 보르테조밉(Velcade)), mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신, 템시롤리무스(CCI-779), 에벨로리무스(RAD-001), 리다포롤리무스, AP23573(아리아드(Ariad)), AZD8055(아스트라제네카(AstraZeneca)), BEZ235(노바티스(Novartis)), BGT226(노바티스), XL765(사노피 아벤티스(Sanofi Aventis)), PF-4691502(화이자(Pfizer), GDC0980(제넨테크(Genentech)), SF1126(Semafoe) 및 OSI-027(OSI)), 오블리메센, 겜시타빈, 카미노마이신, 류코보린, 페메트렉세드, 사이클로포스파마이드, 다카바진, 프로카비진, 프레드니솔론, 덱사메타손, 캄파테신, 플리카마이신, 아스파라기네이스, 아미노프테린, 메토프테린, 포르피로마이신, 멜팔란, 류로시딘, 류로신, 클로람부실, 트라벡테딘, 프로카바진, 다이스코데몰라이드, 카미노마이신, 아미노프테린 및 헥사메틸 멜라민을 포함한다. 하나 이상의 화학치료제(예를 들어, FLAG, CHOP)를 포함하는 조성물이 또한 사용될 수 있다. FLAG는 플루다라빈, 사이토신 아라비노사이드(아라-C) 및 G-CSF를 포함한다. CHOP는 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 프레드니손을 포함한다. 다른 실시형태에서, PARP(예를 들어, PARP-1 및/또는 PARP-2) 저해제가 사용되며, 이러한 저해제는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 올라파립, ABT-888, BSI-201, BGP-15(리엔-진 리서치 래버러토리스 인코포레이션(N-Gene Research Laboratories, Inc.)); INO-1001(이노텍 파마슈티칼스 인코포레이션(Inotek Pharmaceuticals Inc.)); PJ34(문헌[Soriano et al., 2001; Pacher et al., 2002b]); 3-아미노벤즈아마이드(트레비겐(Trevigen)); 4-아미노-1,8-나프탈리마이드(트레비겐); 6(5H)-페난트리다이논(트레비겐); 벤즈아마이드(미국 특허 Re. 36,397); 및 NU1025(문헌[Bowman et al.]). 작용 메커니즘은 일반적으로 PARP 저해제가 PARP에 결합하여 이의 활성을 감소시키는 능력과 관련이 있다. PARP는 베타-나이코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+)의 나이코틴아마이드 및 폴리-ADP-리보스(PAR)로의 전환을 촉매한다. 폴리(ADP-리보스) 및 PARP는 둘 다 전사, 세포 증식, 게놈 안정성 및 발암성의 조절과 관련이 있다(문헌[Bouchard et.al. (2003) Exp. Hematol. 31:446-454); Herceg (2001) Mut. Res. 477:97-110]). 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이스 1(PARP1)는 DNA 단일-가닥 절단(DNA single-strand break: SSB)의 복구에서 핵심 분자이다(문헌[de Murcia J. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:7303-7307; Schreiber et al. (2006) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:517-528; Wang et al. (1997) Genes Dev. 11:2347-2358]). PARP1 기능의 저해에 의한 SSB 복구의 넉아웃은 결함이 있는 상동성-지정 DSB 복구로 암세포에서 합성 치사를 촉발할 수 있는 DNA 이중-가닥 절단(DNA double-strand break: DSB)을 유도한다(문헌[Bryant et al. (2005) Nature 434:913-917; Farmer et al. (2005) Nature 434:917-921]). 화학치료제의 전술한 예는 예시적이며 제한하려는 의도가 아니다.
다른 실시형태에서, 방사선 요법이 사용된다. 방사선 요법에 사용되는 방사선은 전리 방사선일 수 있다. 방사선 요법은 또한 감마선, X-선 또는 양성자 빔일 수 있다. 방사선 요법의 예는 외부-빔 방사선 요법, 방사성 동위원소(I-125, 팔라듐, 이리듐)의 간질 이식, 스트론튬-89와 같은 방사성 동위원소, 흉부 방사선 요법, 복강내 P-32 방사선 요법 및/또는 전체 복부 및 골반 방사선 요법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 방사선 요법에 대한 일반적인 개요는 문헌[Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita et al., eds., J. B. Lippencott Company, Philadelphia]을 참조. 방사선 요법은 외부 빔 방사선 또는 원격 요법으로서 투여될 수 있되, 방사선은 원격 공급원으로부터 유도된다. 방사선 치료는 또한 내부 요법 또는 근접 요법으로서 투여될 수 있되, 방사성 공급원은 암세포 또는 종양 덩어리에 가까운 체내에 배치된다. 또한, 광감작제, 예컨대, 헤마토포르피린 및 이의 유도체, 베토포르피린(BPD-MA), 프탈로사이아닌, 광감작제 Pc4, 데메톡시-하이포크렐린 A; 및 2BA-2-DMHA의 투여를 포함하는 광역학 요법의 사용이 포함된다.
다른 실시형태에서, 호르몬 요법이 사용된다. 호르몬 치료적 치료는 예를 들어, 호르몬 효능제, 호르몬 길항제(예를 들어, 플루타마이드, 바이칼루타마이드, 타목시펜, 랄록시펜, 류프롤리드 아세테이트(LUPRON), LH-RH 길항제), 호르몬 생합성 및 가공 저해제, 및 스테로이드(예를 들어, 덱사메타손, 레티노이드, 델토이드, 베타메타손, 코르티솔, 코르티손, 프레드니손, 데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 프로게스틴), 바이타민 유도체(예를 들어, 올-트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid: ATRA)); 바이타민 D3 유사체; 항프로게스테론(예를 들어, 미페프리스톤, 오나프리스톤) 또는 항안드로겐(예를 들어, 사이프로테론 아세테이트)을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 신체 조직이 고온(최대 106℉)에 노출되는 절차인 온열요법(hyperthermia)이 사용된다. 열은 세포를 손상시키거나 생존에 필요한 물질을 박탈함으로써 종양을 축소하는 데 도움이 될 수 있다. 온열요법 요법은 외부 및 내부 가열 장치를 사용하는 국소(local), 국부(regional) 및 전신(whole-body) 온열요법일 수 있다. 온열요법은 효과를 높이기 위해 거의 항상 다른 형태의 요법(예를 들어, 방사선 요법, 화학요법 및 생물학적 요법)과 함께 사용된다. 국소 온열요법은 종양과 같은 매우 작은 부위에 가해지는 열을 지칭한다. 부위는 신체 외부 장치에서 종양을 겨냥한 고주파로 외부에서 가열될 수 있다. 내부 가열을 달성하기 위해, 얇고 가열된 와이어 또는 따뜻한 물로 채워진 속이 빈 튜브; 이식된 마이크로파 안테나; 및 고주파 전극을 포함하는 여러 유형의 멸균 프로브 중 하나가 사용될 수 있다. 국부 온열요법에서는, 장기 또는 사지가 가열된다. 높은 에너지를 생성하는 자석 및 장치는 가열될 부위 위에 배치된다. 관류(per융합)이라 불리는 또 다른 접근 방식에서, 환자의 혈액 일부가 제거되고 가열된 다음 내부에서 가열될 부위로 펌핑(관류)된다. 전신 가열은 몸 전체에 퍼진 전이성 암을 치료하는 데 사용된다. 이는 따뜻한 물 담요, 뜨거운 왁스, 유도 코일(전기 담요에 있는 것과 같음) 또는 열 챔버 (대형 인큐베이터와 유사함)를 사용하여 달성될 수 있다. 온열요법은 방사선 부작용이나 합병증의 임의의 현저한 증가를 일으키지 않는다. 그러나 피부에 직접 가해지는 열은 치료받은 환자의 약 절반에서 불편함 또는 심지어 상당한 국소 통증을 유발할 수 있다. 이는 또한 일반적으로 빠르게 치유되는 물집을 일으킬 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 광역학 요법(PDT, 광방사선 요법, 광요법 또는 광화학요법이라고도 함)이 일부 유형의 암의 치료에 사용된다. 이는 광감작제로도 알려진 소정의 화학물질이 유기체가 특정 유형의 광선에 노출될 때 단세포 유기체를 죽일 수 있다는 발견을 기반으로 한다. PDT는 광감작제와 함께 고정 주파수 레이저 광선의 사용을 통해 암세포를 파괴한다. PDT에서, 광감작제는 혈류에 주입되어 몸 전체의 세포에 의해 흡수된다. 작용제는 정상 세포보다 더 오래 암세포에 남아 있다. 처리된 암세포가 레이저 광선에 노출될 때, 광감작제는 광선을 흡수하여 처리된 암세포를 파괴하는 활성 형태의 산소를 생성한다. 광선 노출은 대부분의 광감작제가 건강한 세포에서 사라졌지만 여전히 암세포에 존재할 때 발생하도록 신중하게 시간을 맞춰야 한다. PDT에 사용되는 레이저 광선은 광섬유(매우 얇은 유리 가닥)를 통해 전달될 수 있다. 광섬유는 적절한 양의 광선을 전달하기 위해 암 가까이에 배치된다. 광섬유는 폐암의 치료를 위해 기관지경을 통해 폐로, 식도암의 치료를 위해 내시경을 통해 식도로 향할 수 있다. PDT의 이점은 건강한 조직에 최소한의 손상을 유발할 수 있다는 것이다. 그러나, 현재 사용중인 레이저 광선은 조직의 약 3㎝(1인치 및 8인치 이상)를 통과할 수 없기 때문에, PDT는 주로 피부 위나 바로 아래 또는 내부 장기의 내벽에 있는 종양을 치료하는데 사용된다. 광역학 요법은 치료 후 6주 이상 동안 피부와 눈을 빛에 민감하게 만든다. 환자는 적어도 3주 동안 직사광선과 밝은 실내 조명을 피하는 것이 좋다. 환자가 야외로 나가야 하는 경우, 선글라스를 포함한 보호복을 착용해야 한다. PDT의 다른 일시적인 부작용은 특정 부위의 치료와 관련이 있으며, 기침, 연하 곤란, 복통, 힘든 호흡 또는 숨가쁨을 포함할 수 있다. 1995년 12월, 미국 식품의약국(Food and Drug Administration: FDA)은 폐색을 유발하는 식도암의 증상을 완화하고 레이저만으로는 만족스럽게 치료할 수 없는 식도암에 대해 포피머 소듐 또는 Photofrin®이라는 광감작제를 승인하였다. 1998년 1월, FDA는 일반적인 폐암 치료가 적절하지 않은 환자의 초기 비소세포 폐암 치료용으로 포피머 소듐을 승인하였다. 국립 암 연구소 및 기타 기관은 방광암, 뇌암, 후두암 및 구강암을 포함하는 여러 유형의 암에 대한 광역학 요법의 사용을 평가하기 위한 임상 시험(리서치 연구)을 지원하고 있다.
또 다른 실시형태에서, 레이저 요법은 암세포를 파괴하기 위해 고강도 광선을 이용하기 위해 사용된다. 이러한 기법은 특히 다른 치료법으로 암을 치료할 수 없는 경우, 출혈이나 폐색과 같은 암의 증상을 완화하는데 종종 사용된다. 이는 또한 종양을 축소하거나 파괴하여 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 용어 "레이저"는 방사선의 자극 방출에 의한 광선 증폭을 의미한다. 전구에서 나오는 것과 같은 일반 광선은 파장이 많고 모든 방향으로 퍼진다. 반면에 레이저 광선은 특정 파장을 가지며 좁은 빔에 집중된다. 이러한 유형의 고강도 광선은 많은 에너지를 포함한다. 레이저는 매우 강력하며, 강철을 자르거나 다이아몬드 모양을 만드는데 사용될 수 있다. 레이저는 또한 눈의 손상된 망막을 복구하거나 조직을 절단(메스 대신)하는 것과 같은 매우 정밀한 수술 작업에 사용될 수 있다. 여러 종류의 레이저가 있지만, 의학에서 널리 사용되는 것은 세 종류뿐이다: 이산화탄소(CO2) 레이저--이 유형의 레이저는 더 깊은 층을 투과하지 않고 피부 표면에서 얇은 층을 제거할 수 있다. 이러한 기법은 피부 깊숙이 퍼지지 않은 종양과 소정의 전암성 병태를 치료하는데 특히 유용하다. 전통적인 메스 수술의 대안으로 CO2 레이저는 피부를 절단할 수도 있다. 레이저는 이러한 방식으로 피부암을 제거하는 데 사용된다. 네오디뮴:이트륨-알루미늄-가넷(Nd:YAG) 레이저--이러한 레이저로부터의 광선은 다른 유형의 레이저로부터의 광선보다 조직 깊숙이 침투할 수 있으며, 혈액 응고를 빠르게 유발할 수 있다. 광섬유를 통해 신체의 접근하기 어려운 부분으로 이동할 수 있다. 이러한 유형의 레이저는 때때로 인후암 치료에 사용된다. 아르곤 레이저--이러한 레이저는 조직의 표면층만을 통과할 수 있으므로, 피부과 및 눈 수술에 유용하다. 이는 또한 광역학 요법(PDT)으로 알려진 절차에서 종양을 치료하기 위해 빛-민감성 염료와 함께 사용된다. 레이저는 메스보다 더 정확하다는 것을 포함하여 표준 수술 도구에 비해 몇 가지 장점이 있다. 주변 피부 또는 다른 조직과 거의 접촉하지 않기 때문에, 절개부 근처의 조직이 보호된다. 레이저에 의해 발생하는 열은 수술 부위를 살균하여 감염 위험을 줄인다. 레이저의 정밀도는 더 작은 절개를 가능하게 하기 때문에 더 적은 작동 시간이 필요할 수 있다. 치유 시간은 종종 단축되며; 레이저 열은 혈관을 밀봉하기 때문에 출혈, 부기 또는 흉터가 적다. 레이저 수술은 덜 복잡할 수 있다. 예를 들어, 광섬유를 사용하면, 레이저 광선은 크게 절개하지 않고도 신체 부위에 비춰질 수 있다. 외래 환자를 대상으로 더 많은 절차가 수행될 수 있다. 레이저는 암을 치료하기 위해 다음의 두 가지 방식으로 사용될 수 있다: 열로 종양을 축소하거나 파괴시키는 것 또는 암세포를 파괴하는 화학 물질(광감작제로 알려짐)을 활성화하는 것. PDT에서, 광감작제는 암세포에 남아 있으며, 빛에 의해 자극되어 암세포를 죽이는 반응을 일으킬 수 있다. CO2 및 Nd:YAG 레이저는 종양을 축소하거나 파괴하는데 사용된다. 이는 의사가 방광과 같은 신체의 소정의 부위를 볼 수 있는 튜브인 내시경과 함께 사용될 수 있다. 일부 레이저의 광선은 광섬유가 장착된 가요성 내시경을 통해 전송될 수 있다. 이는 의사가 수술을 제외하고는 도달할 수 없는 신체 부위에서 보고 작업할 수 있게 하며, 따라서 레이저 빔을 매우 정밀하게 조준할 수 있다. 레이저는 또한 저출력 현미경과 함께 사용될 수 있으므로, 의사가 치료중인 부위를 명확하게 볼 수 있다. 다른 기기와 함께 사용되는 레이저 시스템은 매우 가는 나사의 너비보다 작은 직경 200 마이크론의 절단 부위를 생성할 수 있다. 레이저는 여러 유형의 암을 치료하는 데 사용된다. 레이저 수술은 성문 (성대), 자궁 경부암, 피부암, 폐암, 질암, 외음부암 및 음경암의 소정의 단계에 대한 표준 치료이다. 암을 파괴하는데 사용하는 것 외에도, 레이저 수술은 암으로 인한 증상의 완화를 돕는 데에도 사용된다(완화 치료관리). 예를 들어, 레이저는 환자의 기도(기관)을 막고 있는 종양을 축소하거나 파괴하여 호흡을 더 쉽게 하기 위해 사용될 수 있다. 이는 또한 때때로 결장직장암 및 항문암의 완화를 위해 사용된다. 레이저-유도성 간질 열요법(Laser-induced interstitial thermotherapy: LITT)은 레이저 요법의 가장 최근 개발 중 하나이다. LITT는 열이 세포를 손상시키거나 생존에 필요한 물질을 박탈함으로써 종양을 축소하는데 도움이 될 수 있는 온열요법이라고 하는 암 치료와 동일한 아이디어를 사용한다. 이러한 치료에서, 레이저는 신체의 간질 영역(장기 사이 영역)으로 향한다. 레이저 광선은 종양의 온도를 높여 암세포를 손상시키거나 파괴한다.
암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)을 이용한 치료 기간 및/또는 용량은 표 1에 열거된 바이오마커의 특정 조절인자 또는 이들의 조합에 따라 달라질 수 있다. 특정 암 치료제에 대한 적절한 치료 시간은 당업자에 의해 인식될 것이다. 본 발명은 각각의 암 치료제에 대한 최적의 치료 스케줄의 지속적인 평가를 상정하며, 여기서, 본 발명에 포함되는 방법에 의해 결정된 대상체의 암의 표현형은 최적의 치료 용량 및 스케줄을 결정하는 요소이다.
2. 스크리닝 방법
본 발명에 포함되는 다른 양태는 스크리닝 검정을 포함한다.
일부 실시형태에서, 골수성 세포에서 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적)의 양 및/또는 활성을 조절하는 작용제(예를 들어, 항체, 융합 단백질, 펩타이드 또는 소분자)를 선택하기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 선택된 작용제는 또한 이러한 골수성 세포에 의해 매개되는 면역 반응을 조절한다(예를 들어, CD8+ 세포독성 T 세포 살해를 조절함; 면역관문 요법에 대한 암세포의 감수성을 조절함; 면역관문 요법과 같은 항암 요법에 대한 저항성을 조절함; 암 요법을 조절을 조절함; NK, 호중구 및 대식세포와 같은 면역 세포 이동, 동원, 분화 및/또는 생존을 조절함; 등). 따라서, 본 명세서에 기재된 임의의 진단, 예후 예측 또는 스크리닝 방법은 하나 이상의 바이오마커의 조절을 확인하고/하거나 조절된 면역 반응, 면역관문 차단 등에 대한 감수성 등과 같은 목적하는 표현형의 판독물에서 작용제의 효과를 확인하기 위해, 조절된 면역 표현형과 같은 목적하는 표현형의 판독물뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 양 및/또는 활성을 조절하는 작용제로서 본 명세서에 기재된 바이오마커를 사용할 수 있다. 이러한 방법은 세포-기반 및 비-세포 기반 검정을 포함하는 스크리닝 검정을 이용할 수 있다.
예를 들어, 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법으로서, a) 표에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 감소시키는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 골수성 세포의 존재하에, 암세포와 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법을 접촉시키는 단계; b) 적어도 하나의 작용제 또는 작용제들과 접촉시키지 않은 대조군 골수성 세포의 존재하에, 암세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법을 접촉시키는 단계; 및 c) b)와 비교하여 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법 효능(예컨대, 세포 살해)을 증가시키는 작용제를 확인함으로써 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암세포를 감작시키는 작용제를 확인하는 단계를 포함하는, 암세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 검정은 하나 이상의 바이오마커의 반대 조절 효과를 검정함으로써 면역 세포 증식 및/또는 효과기 기능을 저해하거나 또는 무력성 클론 결실 및/또는 고갈을 유도하는 작용제를 확인하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 면역 세포 증식 및/또는 효과기 기능을 저해하거나 또는 이러한 조절을 통해 무력성, 클론 결실 및/또는 고갈을 유도하는 방법을 더 포함한다.
다른 예에서, 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법으로서, a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 감소시키도록 조작된 골수성 세포의 존재하에, 암세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; b) 대조군 골수성 세포의 존재하에, 암세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; 및 c) b)와 비교하여 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법 효능(예컨대, 세포 살해)에 대해 암세포를 감작시키는 작용제를 확인하는 단계를 포함하는 암세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
일반적으로, 본 발명은 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1, 실시예 등에 열거된 표적)에 결합하거나 또는 이의 활성을 조절하는 테스트 화합물과 같은 스크리닝 작용제에 대한 검정을 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 반응을 조절하는 작용제를 확인하는 방법은 표 1에 열거된 하나 이상의 표적을 저해하는 작용제의 능력을 결정하는 단계를 수반한다. 이러한 작용제 제한 없이, 항체, 단백질, 융합 단백질, 소분자 및 핵산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 반응을 향상시키는 작용제를 확인하는 방법은 하나 이상의 바이오마커를 조절하고, 관심 면역 반응, 예컨대, 조절된 염증성 표현형, 세포독성 T 세포 활성화 및/또는 활성, 면역관문 요법에 대한 암세포의 감수성 등을 추가로 조절하기 위한 후보 작용제의 능력을 결정하는 단계를 수반한다.
일부 실시형태에서, 검정은 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적)를 테스트 작용제와 접촉시키는 단계, 및 예를 들어, 아래 기재된 바와 같이 직접 또는 간접 매개변수를 측정함으로써 바이오마커의 양 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 상향조절 또는 하향조절)하는 테스트 작용제의 능력을 결정하는 단계를 포함하는, 무세포 또는 세포-기반 검정이다.
일부 실시형태에서, 검정은 예를 들어, (a) 관심 세포(예를 들어, 골수성 세포)를 테스트 작용제와 접촉시키는 단계 및 하나 이상의 바이오마커와 하나 이상의 천연의 결합 파트너 사이의 결합과 같은 하나 이상의 바이오마커의 양 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 상향조절 또는 하향조절)하는 테스트 작용제의 능력을 결정하는 단계를 포함하는 것과 같은 세포-기반 검정이다. 폴리펩타이드가 서로 결합하거나 상호작용하는 능력을 결정하는 것은 예를 들어, 직접 결합을 측정하거나 면역 세포 활성화의 매개변수를 측정함으로써 달성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 검정은 암세포를 세포독성 T 세포, 골수성 세포 및 테스트 작용제와 접촉시키는 단계, 및 예를 들어, 아래 기재되는 바와 같이 직접 또는 간접적으로 측정함으로써 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 조절하는 테스트 작용제의 능력 및/또는 조절된 면역 반응을 결정하는 단계를 포함하는 세포-기반 검정이다.
상기 및 위에 기재된 바와 같은 방법은 또한 하나 이상의 바이오마커의 조절을 확인하고/하거나 조절된 면역 반응, 면역관문 차단에 대한 감수성 등과 같은 원하는 표현형의 판돈에 대한 작용제의 효과를 확인하기 위해, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 양 및/또는 활성을 조절하는 것으로 이미 공지된 하나 이상의 작용제를 테스트하기 위해 적합화될 수 있다.
직접 결합 검정에서, 바이오마커 단백질(또는 이들 각각의 표적 폴리펩타이드 또는 분자)은 결합이 복합체에서 표지된 단백질 또는 분자를 검출함으로써 결정될 수 있도록 방사성 동위원소 또는 효소적 표지와 결합될 수 있다. 예를 들어, 표적은 직접 또는 간접적으로 125I, 35S, 14C 또는 3H로 표지될 수 있으며, 방사성 동위원소는 방사성 방출의 직접 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출된다. 대안적으로, 표적은 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리성 포스파테이스 또는 루시퍼레이스로 효소적으로 표지될 수 있으며, 효소적 표지는 적절한 기질에서 생성물로의 전환의 결정에 의해 검출된다. 바이오마커와 기질 간의 상호 작용을 결정하는 것은 또한 표준 결합 또는 효소적 분석 검정을 사용하여 달성될 수 있다. 위에 기재된 검정 방법의 하나 이상의 실시형태에서, 단백질 또는 분자 중 하나 또는 둘 다의 비복합체화된 형태로부터 복합체의 분리를 용이하게 할 뿐만 아니라 검정의 자동화를 도모하기 위해 폴리펩타이드 또는 분자를 고정화시키는 것이 바람직할 수 있다.
표적에 대한 테스트 작용제의 결합은 반응물을 포함하기에 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 이러한 용기의 비-제한적 예는 미세역가 플레이트, 테스트 튜브 및 마이크로-원심분리 튜브를 포함한다. 본 발명에 포함되는 항체의 고정된 형태는 또한 다공성, 미세 다공성(평균 기공 직경이 약 1 마이크론 미만) 또는 거대 다공성(평균 기공 직경이 약 10 마이크론 초과) 물질, 예컨대, 막, 셀룰로스, 나이트로셀룰로스 또는 유리 섬유; 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 또는 라텍스로 만들어진 것과 같은 비드; 또는 폴리스타이렌으로 만들어진 것과 같은 디쉬, 플레이트 또는 웰의 표면과 같은 고체 상(고체상)에 결합된 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 직접 결합 검정에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 상호작용 및/또는 결합 이벤트와 같은 활성이 복합체에서 표지된 단백질을 검출함으로써 결정될 수 있도록 방사성 동위원소 또는 효소적 표지와 결합될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 직접 또는 간접적으로 125I, 35S, 14C 또는 3H으로 표지될 수 있으며, 방사성 동위원소는 방사성 방출의 직접 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출된다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리성 포스파테이스 또는 루시퍼레이스로 효소적으로 표지될 수 있으며, 효소적 표지는 적절한 기질에서 생성물로의 전환의 결정에 의해 검출된다.
임의의 상호작용 물질의 표지 없이 관심 매개변수를 조절하는 작용제의 능력을 결정하는 것 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터는 모니터링될 폴리펩타이드의 표지없이 폴리펩타이드 간의 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다(문헌[McConnell et al. (1992) Science 257:1906-1912]). 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마이크로피지오미터(microphysiometer)"(예를 들어, 사이토센서(Cytosensor))는 광-지시형 전위차계 센서(light-addressable potentiometric sensor: LAPS)를 사용하여 세포가 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이다. 이러한 산성화 속도의 변화는 화합물과 수용체 간의 상호작용의 지표로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 주어진 폴리펩타이드 세트 간의 상호작용을 길항하는 차단 작용제(예를 들어, 항체, 융합 단백질, 펩타이드 또는 소분자)의 능력을 결정하는 것은 폴리펩타이드 세트의 하나 이상의 구성원의 활성을 결정함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 단백질 및/또는 하나 이상의 천연의 결합 파트너의 활성은 세포의 제2 메신저(예를 들어, 세포내 신호전달)의 유도를 검출하거나, 적절한 기질의 촉매적/효소적 활성을 검출하거나, 리포터 유전자(검출 가능한 마커, 예를 들어, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼레이스를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 표적-반응성 조절 요소를 포함함)의 유도를 검출하거나 또는 단백질 및/또는 하나 이상의 천연의 결합 파트너에 의해 조절된 세포 반응을 검출함으로써 결정될 수 있다. 상기 폴리펩타이드에 결합하거나 이와 상호작용하는 차단 작용제의 능력을 결정하는 것은 예를 들어, 증식 검정에서 면역 세포 공동자극 또는 저해를 조절하는 화합물의 능력을 측정하거나 또는 이의 일부를 인식하는 항체에 결합하는 상기 폴리펩타이드의 능력을 방해함으로써 달성될 수 있다.
하나 이상의 천연의 결합 파트너와의 상호작용과 같은 바이오마커 양 및/또는 활성을 조절하는 작용제는 면역 세포 증식 및/또는 효과기 기능을 저해하거나 또는 시험관내 검정에 첨가될 때 무력성의 클론 결실 및/또는 고갈을 유도하는 이들의 능력에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 세포는 활성화 수용체를 통해 신호 전달을 자극하는 작용제의 존재하에서 배양될 수 있다. 세포 활성화에 대한 다수의 인식된 판독은 활성화제의 존재하에서 세포 증식 또는 효과기 기능(예를 들어, 항체 생성, 사이토카인 생성, 식균 작용)을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 활성화를 차단하는 테스트 작용제의 능력은 당업계에 공지되어 있는 기법을 사용하여 측정되는 증식 또는 효과기 기능의 감소에 영향을 미치는 작용제의 능력을 측정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 포함되는 작용제는 문헌[Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027 및 Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2:261]에 기재된 바와 같이 T 세포 검정에서 공동자극을 저해하거나 향상시키는 능력에 대해 테스트될 수 있다. CD4+ T 세포는 인간 PBMC로부터 단리되고, 활성화 항-CD3 항체로 자극될 수 있다. T 세포의 증식은 3H 티미딘 혼입에 의해 측정될 수 있다. 검정은 검정에서 CD28 공동자극을 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다. 유사한 검정이 주캇(Jurkat) T 세포 및 PBMC로부터의 PHA-아세포를 사용하여 수행될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 포함되는 작용제는 하나 이상의 바이오마커의 조절에 반응하여 면역 세포에서 생성되거나 또는 그 생성이 향상되거나 저해되는 사이토카인의 세포 생성을 조절하는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 관심 면역 세포에 의해 방출된 지시(indicative) 사이토카인은 ELISA 또는 사이토카인에 의해 유도되는 면역 세포 증식 또는 다른 세포 유형의 증식을 저해하는 사이토카인을 차단하는 항체의 능력에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, IL-4 ELISA 키트는 IL-7 차단 항체와 마찬가지로 젠자임(Genzyme)(메사추세츠주 케임브리지)에서 구입할 수 있다. IL-9 및 IL-12에 대한 차단 항체는 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)(메사추세츠주 케임브리지)에서 구입할 수 있다. 시험관내 면역 세포 공동자극 검정은 또한 하나 이상의 바이오마커의 조절에 의해 조절될 수 있는 사이토카인을 확인하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 공동자극시 유도된 특정 활성, 예를 들어, 면역 세포 증식이 공지된 사이토카인에 대한 차단 항체의 첨가에 의해 저해될 수 없는 경우, 활성은 미지의 사이토카인의 작용에 기인할 수 있다. 공동자극 후, 이러한 사이토카인은 종래의 방법에 의해 배지로부터 정제될 수 있으며, 이의 활성은 면역 세포 증식을 유도하는 능력에 의해 측정된다. 내성 유도의 역할을 할 수 있는 사이토카인을 확인하기 위해, 위에 기재된 바와 같이 시험관내 T 세포 공동자극 검정이 사용될 수 있다. 이러한 경우에, T 세포는 활성화 신호를 받고 선택된 사이토카인과 접촉될 것이지만, 공동자극성 신호는 제공되지 않을 것이다. 면역 세포의 세척 및 휴지 후, 세포는 1차 활성화 신호 및 공동자극성 신호 둘 다로 재자극될 것이다. 면역 세포가 반응하지 않는다면(예를 들어, 사이토카인을 증식시키거나 생산함), 이들은 내성을 가지게 되며, 사이토카인은 내성의 유도를 방지하지 못했다. 그러나, 면역 세포가 반응하면, 내성의 유도는 사이토카인에 의해 방지된다. 내성의 유도를 방지할 수 있는 사이토카인은 이식 수여체 또는 자가면역 질환을 갖는 대상체에서 내성을 유도하는 보다 효율적인 수단으로서 B 림프구 항원을 차단하는 시약과 함께 생체내 차단을 위해 표적화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 검정은 바이오마커 및/또는 하나 이상의 천연의 결합 파트너 간의 상호작용을 조절하는 작용제에 대한 스크리닝을 위한 무세포 검정으로서, 폴리펩타이드 및 하나 이상의 천연의 결합 파트너 또는 이의 생물학적 활성 부분을 테스트 작용제와 접촉시키는 단계 및 폴리펩타이드 및 하나 이상의 천연의 결합 파트너 또는 이의 생물학적 활성 부분 간의 상호작용을 조절하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는, 작용제에 대한 스크리닝을 위한 무세포 검정이다. 테스트 화합물의 결합은 위에 기재된 바와 같이 직접 또는 간접적으로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 검정은 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 부분을 이의 결합 파트너와 접촉시켜 검정 혼합물을 형성하는 단계, 검정 혼합물과 테스트 화합물을 접촉시키는 단계 및 검정 혼합물에서 폴리펩타이드와 상호작용하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하되, 폴리펩타이드와 상호작용하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것은 결합 파트너와 비교하여 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 부분에 우선적으로 결합하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포-기반 또는 무세포 검정에 관계없이, 테스트 작용제는 다른 결합 파트너를 사용하여, 폴리펩타이드와 하나 이상의 천연의 결합 파트너 간의 상호작용의 결합 및/또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 더 검정될 수 있다. 다른 유용한 결합 분석 방법은 실시간 생체 분자 상호작용 분석(real-time Biomolecular Interaction Analysis: BIA)(문헌[Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 및 Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705])의 사용을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "BIA"는 임의의 상호작용 물질(예를 들어, BIAcore)을 표지하지 않고 실시간으로 생체특이적 상호작용을 연구하는 위한 기술이다. 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR)의 광학 현상의 변화는 생물학적 폴리펩타이드 간의 실시간 반응의 지표로 사용될 수 있다. 관심 폴리펩타이드는 BIAcore 칩에 고정될 수 있으며, 여러 작용제(차단 항체, 융합 단백질, 펩타이드 또는 소분자)가 관심 폴리펩타이드의 결합에 대해 테스트될 수 있다. BIA 기술 사용의 예는 문헌[Fitz et al. (1997) Oncogene 15:613]에 기재되어 있다.
본 발명에 포함되는 무세포 검정은 가용성 및/또는 막-결합 형태의 단백질을 모두 사용할 수 있다. 막-결합 형태 단백질이 사용되는 무세포 검정의 경우, 막-결합 형태의 단백질이 용액에서 유지되도록 가용화제를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 가용화제의 예는 비-이온성 세제, 예컨대, n-옥틸글루코사이드, n-도데실글루코사이드, n-도데실말토사이드, 옥타노일-N-메틸글루카마이드, 데카노일-N-메틸글루카마이드, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, 아이소트라이데시폴리(에틸렌 글리콜 에터)n, 3-[(3-콜라미도프로필)다이메틸암미니오]-1-프로페인 설포네이트(CHAPS), 3-[(3-콜라미도프로필)다이메틸암미니오]-2-하이드록시-1-프로페인 설포네이트(CHAPSO) 또는 N-도데실=N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로페인 설포네이트를 포함한다.
위에 기재된 검정 방법의 하나 이상의 실시형태에서, 단백질 중 하나 또는 둘 다의 비복합체화된 형태로부터 복합체의 분리를 용이하게 할 뿐만 아니라 검정의 자동화를 도모하기 위해 어느 하나의 폴리펩타이드를 고정하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩타이드에 대한 테스트 화합물의 결합은 반응물을 포함하기에 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 이러한 용기의 예는 미세역가 플레이트, 테스트 튜브 및 마이크로-원심분리 튜브를 포함한다. 일 실시형태에서, 단백질 중 하나 또는 둘 다가 매트릭스에 결합되도록 하는 도메인을 추가하는 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼레이스-기반 폴리펩타이드 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트랜스퍼레이스/표적 융합 단백질이은 글루타티온 세파로스 비드(시그마 케미칼(Sigma Chemical), 미주리주 세인트루이스) 또는 글루타티온 유도체화된 미세역가 플레이트에 흡착되고, 그런 다음 테스트 화합물과 배합되고, 혼합물은 복합체 형성(예를 들어, 염 및 pH에 대한 생리학적 조건에서)에 도움이 되는 조건하에서 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 후, 비드 또는 미세역가 플레이트 웰은 임의의 비결합 성분, 비드의 경우 고정화된 매트릭스를 제거하기 위해 세척되며, 복합체는 위에 기재된 바와 같이 직접 또는 간접적으로 결정된다. 대안적으로, 복합체는 매트릭스로부터 해리될 수 있으며, 폴리펩타이드 결합 또는 활성의 수준은 표준 기법을 사용하여 결정된다.
대안적 실시형태에서, 관심 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적)의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것은 예를 들어, 폴리펩타이드 하류에서 기능하는 폴리펩타이드의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력을 결정함으로써, 세포-기반 검정에 대해 위에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 예를 들어, 제2 메신저의 수준이 결정될 수 있고, 적절한 표적에 대한 상호작용인자 폴리펩타이드의 활성이 결정될 수 있거나 또한 적절한 표적에 대한 상호작용인자의 결합이 전술된 바와 같이 결정될 수 있다.
본 발명은 추가로 위에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 신규한 작용제에 관한 것이다. 따라서, 적절한 동물 모델에서 본 명세서에 기재된 바와 같이 확인된 작용제를 추가로 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 확인된 작용제는 이러한 작용제를 사용한 치료의 효능, 독성 또는 부작용을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 확인된 작용제는 이러한 작용제의 작용의 메커니즘을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료를 위한 상기 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 신규한 작용제에 관한 것이다.
3. 진단적 용도 및 검정
본 발명은 부분적으로, 생물학적 샘플이 관심 산출물(생산량), 예컨대, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커 중 하나의 조절에 따라 조절된 표현형을 가질 수 있는 관심 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 표적)인 골수성 세포의 발현, 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자) 등에 반응할 가능성이 있는 암 등과 관련이 있는지 여부를 정확하게 분류하기 위한 방법, 시스템 및 코드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은은 통계학적 알고리즘 및/또는 경험적 데이터(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 또는 활성)를 사용하여 샘플(예를 들어, 대상체 유래)을 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)과 관련이 있거나 또는 이에 반응하거나 반응하지 않을 위험이 있는 것으로 분류하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 표 1, 실시예 등에 열거된 것과 같은 본 명세서에 기재된 바이오마커의 존재, 부재 및/또는 조절된 발현의 검출에 기초하여 골수성 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포, M1, 제1형, M2, 제2형 등)의 면역 표현형 상태를 검출하는 방법을 포함한다.
바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적)의 양 또는 활성을 검출하고, 따라서 샘플이 염증성 표현형, 암 요법 등의 조절에 반응할 가능성이 있거나 또는 없는지 여부를 분류하는데 유용한 예시적 방법은 생물학적 샘플을 작용제, 예컨대, 생물학적 샘플에서 바이오마커의 양 또는 활성을 검출할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 단백질-결합제 또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 핵산-결합제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 테스트 대상체로부터 유래되는 것과 같은 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 작용제가 사용되되, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 이러한 작용제가 조합하여(예를 들어, 샌드위치 ELISA에서) 또는 연속적으로 사용될 수 있다. 소정의 예에서, 통계학적 알고리즘은 단일 학습 통계 분류자 시스템이다. 예를 들어, 단일 학습 통계 분류자 시스템은 예측값 또는 확률값 및 바이오마커의 존재 또는 수준에 기초하여 샘플을 분류하는데 사용될 수 있다. 단일 학습 통계 분류자 시스템의 사용은 전형적으로 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 민감성, 특이성, 양성 예측값, 음성 예측값 및/또는 전체 정확도를 갖는 샘플을 분류한다.
다른 적합한 통계학적 알고리즘은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 학습 통계 분류자 시스템은 복합 데이터 세트(예를 들어, 관심 마커의 패널)에 대해 적합화되며, 이러한 데이터 세트에 기초하여 판단할 수 있는 기계 학습 알고리즘 기법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류 트리(예를 들어, 무작위 포레스트)와 같은 단일 학습 통계 분류자 시스템이 사용된다. 다른 실시형태에서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 학습 통계 분류자 시스템의 조합이, 바람직하게는 동시에, 사용된다. 학습 통계 분류자 시스템의 예는 귀납적 학습을 이용하는 것들(예를 들어, 무작위 포레스트, 분류 및 회귀 트리(C&RT), 부스티드 트리(boosted tree) 등과 같은 판단/분류 트리), 확률적 근사 정확(Probably Approximately Correct: PAC) 학습, 연결주의 학습(예를 들어, 신경 네트워크(neural network: NN), 인공 신경 네트워크(artificial neural network: ANN), 뉴로 퍼지 네트워크(neuro fuzzy network: NFN), 네트워크 구조, 퍼셉트론(perceptron), 예컨대, 다층 퍼셉트론, 다층 피드-포워드 네트워크, 신경 네트워크의 적용, 신뢰 네트워크에서 베이시안 학습 등), 강화 학습(예를 들어, 알려진 환경에서의 수동 학습, 예컨대, 미경험 학습, 맞춤 동적 학습 및 시간차 학습, 알려지지 않은 환경에서의 수동 학습, 능동적 학습, 학습 작용-가치 함수, 강화 학습의 적용 등) 및 유전 알고리즘 및 진화 프로그래밍을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 학습 통계 분류자 시스템은 서포트 벡터 머신(예를 들어, 커넬법), 다변량 적응 회귀 스플라인(multivariate adaptive regression spline: MARS), 르벤버그-마쿼트((Levenberg-Marquardt) 알고리즘, 가우스-뉴턴 알고리즘, 가우시안의 혼합, 구배 하강 알고리즘 및 학습 벡터 양자화(learning vector quantization: LVQ)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 방법은 샘플 분류 결과를 임상의, 예를 들어, 종양학자에게 보내는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체의 진단에 이어 진단에 기초하여 치료적 유효량의 정의된 치료제를 개체에게 투여한다.
일부 실시형태에서, 방법은 대조군 생물학적 샘플(예를 들어, 암에 걸리지 않았거나 암 요법에 취약한 대상체로부터의 생물학적 샘플, 관해 중에 있는 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 암 요법에도 불구하고 진행중인 암 발병에 대한 치료중인 대상체로부터의 생물학적 샘플)을 수득하는 단계를 더 포함한다.
4. 예측 의학
본 발명 또한 진단 검정, 예후 예측 검정 및 모니터링 임상 시험이 예후 예측(예측) 목적으로 사용되어 개체를 예방적으로 치료하는 예측 의학 분야에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 포함되는 일 양태는 본 명세서에 기재된 바이오마커, 예컨대, 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 세포 또는 조직)의 맥락에서 표 1에 열거된 것들의 존재, 부재, 양 및/또는 활성 수준을 결정(예를 들어, 검출)하여 원래의 암 또는 재발 암에 관계없이 암을 앓고 있는 개체가 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 반응할 가능성이 있는지 여부를 결정하기 위한 진단 검정을 포함한다. 이러한 검정은 예후 예측 또는 예측 목적으로 사용되어 바이오마커 폴리펩타이드, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 또는 이와 관련된 장애의 발병 이전 또는 재발 후 개체를 예방적으로 치료할 수 있다. 당업자는 임의의 방법은 본 명세서에 기재된 바이오마커, 예컨대, 표 1에 열거된 것들 중 하나 이상(예를 들어, 조합)을 사용할 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 기재된 진단 방법은 관심 바이오마커의 발현 또는 이의 결핍과 관련된 장애가 있거나 또는 발병할 위험이 있는 대상체를 확인하는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비정상적인"은 정상 수준에서 벗어나는 관심 바이오마커의 상향조절 또는 하향조절을 포함한다. 비정상적인 발현 또는 활성은 증가된 또는 감소된 발현 또는 활성뿐만 아니라 발현의 정상적인 발달 패턴 또는 발현의 세포하 패턴(subcellular pattern)을 따르지 않는 발현 또는 활성을 포함한다. 예를 들어, 비정상적인 수준은 바이오마커 유전자 또는 조절 서열의 돌연변이 또는 염색체 유전자의 증폭이 관심 바이오마커의 상향조절 또는 하향조절을 야기하는 경우를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "원치 않는"은 면역 세포 활성화와 같은 생물학적 반응과 관련된 원치 않는 현상을 포함한다.
본 명세서 및 적어도 실시예에 추가로 설명된 바와 같이 관심 바이오마커와 관련된 많은 장애가 당업자에게 공지되어 있다.
선행하는 진단 검정 또는 다음 검정과 같은 본 명세서에 기재된 검정은 관심 바이오마커의 잘못된 조절과 관련된 장애가 있거나 또는 발병할 위험이 있는 대상체를 확인하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 테스트 샘플이 대상체로부터 얻어지고 바이오마커가 검출되는 비정상적이거나 원치 않는 바이오마커 조절과 관련된 장애를 확인하는 방법을 제공하되, 바이오마커 폴리펩타이드의 존재는 비정상적이거나 또는 원치 않는 바이오마커 발현 및/또는 활성과 관련된 장애가 있거나 또는 발병할 위험이 있는 대상체에 대해 진단적이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "테스트 샘플"은 관심 대상체로부터 얻어지는 생물학적 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 테스트 샘플은 생물학적 유체(예를 들어, 뇌척수액 또는 혈청), 세포 샘플, 또는 조직, 예컨대, 종양 미세환경, 종양 주위 영역 및/또는 종양내 영역의 조직병리학적 슬라이드일 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 예후예측 검정은 대상체가 비정상적이거나 또는 원치 않는 바이오마커 발현 및/또는 활성과 관련이 있는 장애를 치료하기 위해 작용제(예를 들어, 항체, 효능제, 길항제, 펩타이도모방체, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 소분자 또는 다른 약물 후보물질)가 투여될 수 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 대상체가 하나의 작용제 또는 작용제의 조합으로 효과적으로 치료될 수 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 테스트 샘플이 얻어지고 바이오마커가 검출되는 비정상적이거나 또는 원치 않는 바이오마커 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 작용제로 효과적으로 치료될 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다(예를 들어, 바이오마커 폴리펩타이드의 존재비는 장애를 치료하기 위해 항체 또는 항원-결합 단편이 투여될 수 있는 대상체에 대해 진단적임).
본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어, 관심 바이오마커와 관련된 질환 또는 질병의 증상 또는 가족력을 나타내는 환자를 진단하기 위해 임상 환경에서 편리하게 사용될 수 있는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 시약을 포함하는 사전-팩킹된 진단 키트를 이용함으로써 수행될 수 있다.
또한, 관심 바이오마커가 발현되는 임의의 세포 유형 또는 조직은 본 명세서에 기재된 예후예측 검정에 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 비정상적이거나 또는 원치 않는 바이오마커 발현 및/또는 활성과 관련된 장애가 있는 개체로부터의 생물학적 샘플에서 관심 바이오마커(예를 들어, 바이오마커 단독, CD11b+ 상태, CD14+ 상태 등과 같은 다른 관심 계층화 지표 단독 또는 이들의 조합)가 분석되고, 정보는 바람직하게는 유사한 연령 및 인종인 대조군(예를 들어, 장애가 없는 개체; 대조군은 "건강한" 또는 "정상적인" 개체 또는 주어진 시간 경과 연구에서 초기 시점으로 지칭될 수 있음)과 비교되는 연관성 및/또는 계층화 분석을 위한 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 용도를 포함한다. 환자 및 대조군의 적절한 선택은 연관성 및/또는 계층화 연구의 성공에 중요하다. 따라서, 잘 특성화된 표현형을 갖는 개체의 풀은 극히 바람직하다. 질환 진단, 질환 소인 스크리닝, 질환 예후예측, 약물 반응성 결정(약물유전체학), 약물 독성 스크리닝 등에 대한 기준이 본 명세서에 기재되어 있다.
상이한 연구 설계가 유전적 연관성 및/또는 계층화 연구를 위해 사용될 수 있다(문헌[Modern Epidemiology, Lippincott Williams & Wilkins (1998), 609-622]). 환자의 반응이 방해받지 않는 관찰 연구가 가장 자주 수행된다. 첫 번째 유형의 관찰 연구는 질환의 의심되는 원인이 있는 사람의 샘플 및 의심되는 원인이 없는 사람의 또 다른 샘플을 확인한 다음, 2개의 샘플에서 질환의 발병 빈도를 비교한다. 이러한 표본 모집단은 코호트라 불리며, 연구는 전향적(prospective) 연구이다. 다른 유형의 관찰 연구는 사례-대조군(case-control) 또는 후향적(retrospective) 연구이다. 전형적인 사례-대조군 연구에서, 샘플은 질환의 소정의 징후와 같은 관심 표현형을 갖는 개체(사례), 및 결론을 도출해야 하는 집단(표적 집단)에서 표현형이 없는 개체(대조군)로부터 수집된다. 그런 다음, 질환의 가능한 원인이 후향적으로 조사된다. 사례-대조군 연구에서 샘플을 수집하는 시간과 비용이 전향적 연구에 비해 상당히 적기 때문에, 사례-대조군 연구는 적어도 탐사 기간 동안 유전적 연관성 연구에서 더 일반적으로 사용되는 연구이다.
모든 관련 표현형 및/또는 유전형 정보가 얻어진 후, 통계학적 분석이 대립유전자의 존재 또는 유전자형과 개체의 표현형 특징 사이에 임의의 유의미한 상관관계가 있는지 결정하기 위해 수행된다. 바람직하게는, 데이터 검사 및 정리는 유전적 연관성에 대한 통계학적 테스트를 수행하기 전에 먼저 수행된다. 샘플의 역학적 및 임상적 데이터는 당업계에 잘 알려진 표 및 그래프와 함께 기술 통계에 의해 요약될 수 있다. 데이터 검증은 데이터 완료(data completion), 불일치 엔트리(inconsistent entry) 및 이상치(outlier)을 확인하기 위해 수행하는 것이 바람직하다. 그런 다음, 카이-제곱 검정 및 t-검정(분포가 정규식이 아닌 경우, 윌콕슨 순위합 검정)이 이산 및 연속 변수 각각에 대한 사례와 대조군 간의 유의한 차이를 확인하는데 사용될 수 있다.
유전적 연관성 테스트의 수행에서 가능한 결정 중 하나는 검정의 p-값이 해당 수준에 도달할 때 유의미한 연관성이 선언될 수 있는 유의 수준을 결정하는 것이다. 후속 확증 테스트에서 긍정적인 히트(hit)가 추적될 탐색적 분석에서, 예를 들어, 0.2 미만의 조정되지 않은 p-값(관대한 측면의 유의 수준)이 장애의 소정의 표현형 특징을 갖는 관심 바이오마커의 수준의 유의한 연관성에 대한 가설을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 수준이 질환과 관련된 것으로 간주되기 위해서는, 0.05 미만의 p-값(당업계에서 전통적으로 사용되는 유의 수준)이 달성되는 것이 바람직하다. 동일한 공급원의 더 많은 샘플 또는 상이한 공급원으로부터의 상이한 샘플에서의 확증 분석에서 히트가 더 추적되는 경우, 실험별 오류율을 0.05로 유지하면서 히트의 초과 수를 방지하기 위해 다중 검정에 대한 조정이 수행될 것이다. 여러 종류의 오류율을 조절하기 위해 다중 검정를 조정하는 여러 방법이 있지만, 일반적으로 사용되지만 다소 보존적인 방법은 실험별 또는 패밀리별 오류율을 조절하는 본페로니 보정(Bonferroni correction)이다(다중 비교 및 다중 검정, 문헌[Westfall et al, SAS Institute (1999)]). 위발견율(false discovery rate) FDR을 조절하기 위한 순열 검정이 더 강력할 수 있다(문헌[Benjamini and Hochberg, Journal of the Royal Statistical Society, Series B 57, 1289-1300, 1995, Resampling-based Multiple Testing, Westfall and Young, Wiley (1993)]). 다중성을 조절하기 위한 이러한 방법은 테스트가 종속적이며 위발견율에 대한 조절이 실험별 오류율을 조절하는 것과는 대조적으로 충분할 때 바람직할 것이다.
일단 유전적 또는 비-유전적 개별 위험 인자가 질환의 소인에 대해 발견되면, 개체가 이의 표현형 및/또는 유전자형 및 기타 비-유전적 위험 인자에 대해 의존하게 될 범주(예를 들어, 질환 또는 무질환)를 예측하기 위해 분류/예측 체계가 설정될 수 있다. 이산 특성(trait)에 대한 로지스틱 회귀 및 연속 특성에 대한 선형 회귀는 이러한 작업에 대한 표준 기법이다(문헌[Applied Regression Analysis, Draper and Smith, Wiley (1998)]). 더욱이, 분류를 설정하기 위해 다른 기법이 또한 사용될 수 있다. 이러한 기법은 상이한 방법의 성능을 비교하는데 사용하기에 적합한 MART, CART, 신경 네트워크 및 판별 분석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(문헌[The Elements of Statistical Learning, Hastie, Tibshirani & Friedman, Springer (2002)]).
본 발명에 포함되는 다른 양태는 관심 세포의 표 1에 열거된 표적 및/또는 염증성 표현형의 발현 또는 활성에 대한 작용제(예를 들어, 약물, 화합물 및 작은 핵산-기반 분자)의 영향을 모니터링하는 것을 포함한다. 이러한 및 기타 작용제는 다음 부문에서 더 상세히 기재된다.
5. 임상 시험 동안 효과의 모니터링
관심 바이오마커 폴리펩타이드에 대한 작용제(예를 들어, 항체, 화합물, 약물, 소분자 등)의 영향(예를 들어, 단핵구 및/또는 대식세포 염증성 표현형의 조절)을 모니터링하는 것은 기본 약물 스크리닝뿐만 아니라 임상 시험에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 폴리펩타이드 수준 또는 활성을 조절하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 스크리닝 검정에 의해 의해 결정된 작용제의 효과는, 예컨대, 본 명세서에 기재된 항체 또는 단편을 사용하여 조절된 바이오마커 폴리펩타이드 수준 또는 활성을 나타내는 대상체의 임상 시험에서 모니터링될 수 있다. 이러한 임상 시험에서, 관심 바이오마커의 발현 또는 활성 및/또는 관심 장애의 증상 또는 마커가 특정 세포, 조직 또는 시스템의 표현형의 "판독(read out)" 또는 마커로서 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 (i) 대상체 작용제의 투여 전에 대상체로부터 투여 전 샘플을 수득하는 단계; (ii) 투여 전 샘플에서 바이오마커 폴리펩타이드의 수준 및/또는 활성을 검출하는 단계; (iii) 대상체로부터 하나 이상의 투여 후 샘플을 수득하는 단계; (iv) 투여 후 샘플에서 바이오마커 폴리펩타이드의 수준 및/또는 활성을 검출하는 단계; (v) 투여 전 샘플에서의 바이오마커 폴리펩타이드 수준 및/또는 활성을 투여 후 샘플 또는 샘플들에서의 바이오마커 폴리펩타이드 수준 및/또는 활성과 비교하는 단계; 및 (vi) 그에 따라 대상체에 대한 작용제의 투여를 변경하는 단계를 포함하는, 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 항체, 효능제, 길항제, 펩타이도모방체, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 소분자, 또는 다른 약물 후보물질)를 이용한 대상체의 치료의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다. 면역조직화학(IHC)에 의해서와 같은 바이오마커 폴리펩타이드 분석이 또한 면역요법과 같은 요법을 받을 환자를 선택하는데 사용될 수 있다.
당업자는 또한 소정의 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 방법이 컴퓨터 프로그램 및 컴퓨터 시스템을 구현함을 이해할 것이다. 예를 들어, 컴퓨터 프로그램은 본 명세서에 기재된 알고리즘을 수행하는데 사용될 수 있다. 컴퓨터 시스템은 본 발명의 방법을 구현하는데 컴퓨터 시스템에 의해 사용될 수 있는 복수의 바이오마커 신호 변화/프로파일을 포함하는 본 발명에 포함되는 방법에 의해 생성된 데이터를 저장하고 조작할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 컴퓨터 시스템은 바이오마커 발현 데이터를 수신하고; (ii) 데이터를 저장하고; 및 (iii) 암성 또는 전암성 조직으로부터 유익한 바이오마커의 상태를 결정하기 위해 본 명세서에 기재된 임의의 수의 방식(예를 들어, 적절한 대조군에 대한 분석)으로 데이터를 비교한다. 다른 실시형태에서, 컴퓨터 시스템은 (i) 결정된 발현 바이오마커 수준을 역치 값과 비교하고; 및 (ii) 상기 바이오마커 수준이 역치 값을 현저하게 조절(예를 들어, 초과 또는 미만)하는지 여부의 표시 또는 상기 표시에 기초한 표현형을 출력한다.
소정의 실시형태에서, 이러한 컴퓨터 시스템은 또한 본 발명에 포함되는 부분으로 간주된다. 생물 정보학 및/또는 컴퓨터 기술 분야의 당업자가 보유한 지식에 따라 본 발명의 분석 방법을 구현하기 위해 다양한 유형의 컴퓨터 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 컴퓨터 시스템이 작동하는 동안 여러 소프트웨어 구성요소를 메모리에 로딩할 수 있다. 소프트웨어 구성요소는 당업계에서 표준인 소프트웨어 구성요소와 본 발명에 특별한 구성요소(예를 들어, 문헌[Lin et al. (2004) Bioinformatics 20, 1233-1240]에 기재된 dCHIP 소프트웨어; 당업계에 공지된 방사형 기반 기계 학습 알고리즘(radial basis machine learning 알고리즘: RBM)) 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명에 포함되는 방법은 또한 사용될 특정 알고리즘을 포함하여 방정식의 기호 입력 및 높은 수준의 처리 사양을 허용하는 수학적 소프트웨어 패키지로 프로그래밍되거나 모델링될 수 있으므로, 사용자는 개별 방정식을 절차적으로 프로그래밍할 필요가 없다. 이러한 패키지는 예를 들어, 매스웍스(Mathworks)(매사추세츠주 나티크)의 Matlab, 볼프람 리서치(Wolfram Research)(일리노이주 섐페인)의 Mathematica 또는 매스소프트(MathSoft)(워싱턴주 시애틀)의 S-Plus를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 컴퓨터는 바이오마커 데이터를 저장하기 위한 데이터베이스를 포함한다. 이러한 저장된 프로파일이 액세스되고, 나중에 관심 비교를 수행하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 비-암성 조직으로부터 유래된 샘플의 바이오마커 발현 프로파일 및/또는 동일한 종의 관련 집단에서 관심 정보 유전자좌의 집단-기반 분포에서 생성된 프로파일이 저장되고, 나중에 대상체의 암성 조직 또는 대상체의 암성으로 의심되는 조직으로부터 유래된 샘플의 것과 비교될 수 있다.
본 명세서에 기재된 예시적 프로그램 구조 및 컴퓨터 시스템에 추가하여, 다른 대안적인 프로그램 구조 및 컴퓨터 시스템이 당업자에게 쉽게 명확할 것이다. 따라서, 사상 또는 범위 내에서 위에 기재된 컴퓨터 시스템 및 프로그램 구조로부터 벗어나지 않는 이러한 대체 시스템은 첨부된 청구범위 내에서 이해되도록 의도된다.
또한, 본 명세서에 기재된 예후 예측 검정은 비정상적인 바이오마커 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위해 작용제(예를 들어, 효능제, 길항제, 펩타이도모방체, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 소분자 또는 다른 약물 후보)가 투여될 수 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
6. 임상적 효능
임상적 효능은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응은 요법에 대한 암, 예를 들어, 종양의 임의의 반응, 바람직하게는 신보조제 또는 보조제 화학요법의 개시 후와 같은 암세포의 수, 종양 질량 및/또는 종양 부피의 변화에 관한 것이다. 종양 반응은 전신적 개입 후 종양의 크기가 CT, PET, 유방조영술, 초음파 또는 촉진에 의해 측정된 초기 크기 및 치수와 비교될 수 있고, 종양의 세포질이 조직학적으로 평가되고, 치료 개시 전에 수행된 종양 생검의 세포질과 비교될 수 있는 신보조제 또는 보조제 상황에서 평가될 수 있다. 반응은 또한 생검 또는 외과적 절제 후 종양의 캘리퍼 측정 또는 병리학적 검사에 의해 평가될 수 있다. 반응은 종양 부피 또는 세포질의 퍼센트 변화와 같은 정량적 방식으로, 또는 잔류 암 부담과 같은 반정량적 점수 시스템(문헌[Symmans et al., J. Clin. Oncol. (2007) 25:4414-4422]) 또는 "병리학적 완전 반응"(pCR), "임상적 완전 관해"(cCR), "임상적 부분 관해"(cPR), "임상적 안정 질환"(cSD), "임상적 진행성 질환"(cPD) 또는 다른 정성적 기준과 같은 정성적 방식에서 밀러-페인 점수(문헌[Ogston et al., (2003) Breast (Edinburgh, Scotland) 12:320-327])를 사용하여 기록될 수 있다. 종양 반응의 평가는 신보조제 또는 보조제 요법의 개시 후 초기에, 예를 들어, 몇 시간, 며칠, 몇 주 후 또는 바람직하게는 몇 개월 후에 수행될 수 있다. 반응 평가를 위한 전형적 평가 종점은 신보조제 화학요법의 종료 후 또는 잔류 종양 세포 및/또는 종양 베드의 외과적 제거시이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료적 치료의 임상적 효능은 임상적 이득률(CBR)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 임상적 이득률은 요법의 종료 후 적어도 3개월의 시점에서 완전 관해(CR)에 있는 환자의 백분율, 부분적 관해(PR)에 있는 환자의 수 및 안정 질환(SD)을 갖는 환자의 수의 합을 결정함으로써 측정된다. 이러한 식의 약칭은 6개월에 걸쳐 CBR=CR+PR+SD이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커 표 1에 열거된 치료적 양생법의 특정 조절인자에 대한 CBR은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 이상이다.
암 요법(예를 들어, 예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응을 평가하기 위한 추가적인 기준은 다음을 모두 포함하는 "생존"에 관한 것이다: 전체 생존기간으로도 알려진 사망할 때까지의 생존기간(상기 사망률은 원인 또는 종양과 무관할 수 있음); "무재발 생존기간"(용어 재발은 국소 재발 및 원격 재발을 모두 포함해야 함); 무전이 생존기간; 무질환 생존기간(용어 질환은 암 및 이와 관련된 질환을 포함해야 함). 상기 생존 기간은 정의된 시작 지점(예를 들어, 진단 또는 치료 시작 시간) 및 종료 지점(예를 들어, 사망, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산될 수 있다. 또한, 치료의 효능의 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 가능성, 주어진 기간 내의 전이 가능성 및 종양 재발의 가능성을 포함하도록 확장될 수 있다.
예를 들어, 적절한 역치 값을 결정하기 위하여, 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 표적)의 특정 조절인자는 대상체의 집단에 투여될 수 있으며, 결과는 임의의 암 요법(예를 들어, 예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)의 투여 전 결정된 바이오마커 측정값과 관련이 있을 수 있다. 결과 측정값은 신보조제 환경에서 주어진 요법에 대한 병리학적 반응일 수 있다. 대안적으로, 전체 생존기간 및 무질환 생존과 같은 결과 측정값은 바이오마커 측정값이 알려져 있는 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자) 후 대상체에 대해 일정 기간에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 바이오마커를 조절하는 작용제의 동일한 용량이 각 대상체에게 투여된다. 관련 실시형태에서, 투여되는 용량은 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 표적)를 조절하는 작용제에 대해 당업계에 공지된 표준 용량이다. 대상체가 모니터링되는 기간은 다를 수 있다. 예를 들어, 대상체는 적어도 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 12개월, 14개월, 16개월, 18개월, 20개월, 25개월, 30개월, 35개월, 40개월, 45개월, 50개월, 55개월 또는 60개월 동안 모니터링될 수 있다. 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)의 결과와 관련이 있는 바이오마커 측정값 역치 값은 실시예 부문에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
7. 바이오마커의 분석
a. 샘플 수집 및 제조
일부 실시형태에서, 대상체로부터의 샘플에서의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 미리 결정된 대조군(표준) 샘플과 비교된다. 대상체로부터의 샘플은 전형적으로 암세포 또는 조직과 같은 병든 조직으로부터 유래된다. 대조군 샘플은 동일한 대상체 또는 상이한 대상체로부터 유래될 수 있다. 대조군 샘플은 전형적으로 정상의, 병들지 않은 샘플이다. 그러나, 일부 실시형태에서, 예컨대, 질환의 병기 결정 또는 치료 효능의 평가를 위해, 대조군 샘플은 병든 조직으로부터 유래될 수 있다. 대조군 샘플은 여러 상이한 대상체로부터의 샘플의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체로부터의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 미리 결정된 수준과 비교된다. 이러한 미리 결정된 수준은 전형적으로 정상적인 샘플로부터 얻어진다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, "미리 결정된" 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 예로서 치료, 암 요법(예를 들어, 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응을 평가 및/또는 암 요법(예를 들어, 적어도 하나의 면역요법의 조합에서 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응을 평가하기 위해 선택될 수 있는 대상체를 평가하기 위해서만 사용되는 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)일 수 있다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 암이 있거나 없는 환자 집단에서 결정될 수 있다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 모든 환자에게 동일하게 적용 가능한 단일 숫자일 수 있거나, 또는 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 환자의 특정 하위집단에 따라 달라질 수 있다. 대상체의 연령, 체중, 키 및 기타 인자는 개체의 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성은 각 대상체에 대해 개별적으로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정되고/되거나 비교되는 양은 절대적 측정값에 기초한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정되고/되거나 비교되는 양은 상대적 측정값, 예컨대, 비(예를 들어, 바이오마커 카피 수, 수준 및/또는 치료 전 대 치료 후 활성, 표준물질 첨가(spiked) 대조군 또는 인공(man-made) 대조군에 대한 바이오마커 측정값, 하우스키핑 유전자의 발현에 대한 바이오마커 측정값 등)에 기초한다. 예를 들어, 상대적 분석은 치료 후 바이오마커 측정값과 비교하여 치료 전 바이오마커 측정값의 비에 기초할 수 있다. 치료 전 바이오마커 측정은 암 요법의 개시 전 임의의 시점에서 수행될 수 있다. 치료 후 바이오마커 측정은 암 요법의 개시 후 임의의 시점에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료 후 바이오마커 측정은 암 요법의 개시 후 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주 이상, 지속적인 모니터링을 위해 무기한으로 더 오래 수행된다. 치료는 암 요법, 예컨대, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 하나 이상의 조절인자를 포함하는 치료적 양생법을 단독으로 또는 면역관문 저해제와 같은 다른 암 작용제와 조합하여 포함할 수 있다.
미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 임의의 적합한 표준일 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 환자 선택이 평가되는 동일하거나 상이한 인간으로부터 얻어질 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 동일한 환자의 이전의 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식으로, 환자 선택의 진행 상황은 시간이 지남에 따라 모니터링될 수 있다. 또한, 대조군은 다른 인간 또는 여러 인간, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 선택된 인간의 그룹의 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식으로, 선택이 평가될 인간의 선택의 범위는 적합한 다른 인간, 예를 들어, 관심 인간, 예컨대, 유사하거나 동일한 병태(들)로 고통받고 있는 인간 및/또는 동일한 인종 그룹과 유사한 상황에 있는 다른 인간과 비교될 수 있다.
본 발명에 포함되는 일부 실시형태에서, 미리 결정된 수준으로부터의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)의 변화는 약 0.1배, 0.2배, 0.3배, 0.4배, 0.5배, 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배 또는 5.0배 또는 그 이상 또는 그 사이의 임의의 범위까지이다. 측정값이 상대적 변화에 기초, 예컨대, 치료 후 바이오마커 측정값과 비교하여 치료 전 바이오마커 측정값의 비에 기초할 때, 이러한 컷-오프(cut-off) 값은 동일하게 적용된다.
생물학적 샘플은 핵산 및/또는 단백질을 포함하는 체액 샘플, 세포 샘플 또는 조직 샘플을 포함하는 환자로부터의 다양한 공급원으로부터 수집될 수 있다. "체액"은 신체로부터 배출되거나 분비되는 액체뿐만 아니라 일반적으로 그렇지 않은 액체(예를 들어, 양수, 수양액, 담즙, 혈액 및 혈액 혈장, 뇌척수액, 이구(cerumen) 및 귀지(earwax), 쿠퍼액 또는 사정 전액, 유미(chyle), 미즙(chyme), 대변, 여성 사정액, 간질액, 세포내액, 림프, 월경, 모유, 점액, 흉막액, 고름, 침, 피지, 정액, 혈청, 땀, 활액, 눈물, 소변, 질 윤활액, 유리액, 구토 등)를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체 및/또는 대조군 샘플은 세포, 세포주, 조직학적 슬라이드, 파라핀 포매 조직, 생검, 전혈, 유두 흡인물, 혈청, 혈장, 구강 채취물, 침, 뇌척수액, 소변, 대변 및 골수로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 샘플은 혈청, 혈장 또는 소변이다. 다른 실시형태에서, 샘플은 혈청이다.
샘플은 장기(예를 들어, 일, 주, 월, 연간, 2년 등의 단위로 1회 이상)에 걸쳐 반복적으로 개체로부터 수집될 수 있다. 일정 기간에 걸쳐 개체로부터 수많은 샘플을 수득하는 것은 조기 검출로부터 결과를 확인하고/하거나 예를 들어, 질환 진행, 약물 치료 등의 결과로서 생물학적 패턴의 변화를 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체 샘플은 본 발명에 따라 매월, 매 2개월 또는 1개월, 2개월 또는 3개월 간격의 조합으로 채취 및 모니터링될 수 있다. 또한, 시간 경과에 따라 수득된 대상체의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값은 모니터링 기간 동안 정상적인 대조군의 측정값과는 물론 서로 편리하게 비교되어 대상체 자신의 값을 장기 모니터링을 위한 내부 또는 개인 대조군으로 제공할 수 있다.
샘플은 살아 있는 세포/조직, 신선한 냉동 세포, 신선한 조직, 생검, 고정된 세포/조직, 파라핀과 같은 매질에 포매된 세포/조직, 조직학적 슬라이드 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
샘플 제조 및 분리는 수집된 샘플의 유형 및/또는 바이오마커 측정값(들)의 분석에 따라 임의의 절차를 포함할 수 있다. 이러한 절차는 단지 예로서 농도, 희석, pH의 조정, 고발현(high abundance) 폴리펩타이드(예를 들어, 알부민, 감마 글로불린 및 트랜스페린 등)의 제거, 방부제 및 교정제(calibrant)의 첨가, 프로테이스 저해제의 첨가, 변성제의 첨가, 샘플의 탈염, 샘플 단백질의 농축, 지질의 추출 및 정제를 포함한다.
샘플 제조는 다른 단백질(예를 들어, 담체 단백질)에 비-공유 복합체로 결합된 분자를 단리할 수 있다. 이러한 과정은 특정 담체 단백질(예를 들어, 알부민)에 결합된 이러한 분자를 단리하거나 또는 단백질 변성을 통해, 예를 들어, 산을 사용하여 모든 담체 단백질로부터 결합된 분자를 방출시킨 후 담체 단백질을 제거하는 것과 같은 보다 일반적인 과정을 사용할 수 있다.
샘플로부터 원치 않는 단백질(예를 들어, 고발현의, 유익하지 않은 또는 검출 불가능한 단백질)의 제거는 고친화성 시약, 고분자량 필터, 초원심분리 및/또는 전기투석을 사용하여 달성될 수 있다. 고친화성 시약은 고발현 단백질에 선택적으로 결합하는 항체 또는 다른 시약(예를 들어, 압타머)을 포함한다. 샘플 제조는 또한 이온 교환 크로마토그래피, 금속 이온 친화성 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 흡착 크로마토그래피 등전 포커싱 및 관련 기법을 포함할 수 있다. 분자량 필터는 크기와 분자량에 기초하여 분자를 분리하는 막을 포함한다. 이러한 필터는 역 삼투, 나노여과, 한외여과 및 정밀여과를 추가로 사용할 수 있다.
초원심분리는 샘플에서 원치 않는 폴리펩타이드를 제거하는 방법이다. 초원심분리는 입자의 침전(또는 이의 부족)을 광학 시스템으로 모니터링하면서 약 15,000rpm 내지 60,000rpm에서 샘플을 원심분리하는 것이다. 전기투석은 전위 구배의 영향하에서 반투과성 막을 통해 한 용액에서 다른 용액으로 이온이 이동하는 과정에서 전기막 또는 반투과성 막을 사용하는 절차이다. 전기 투석에 사용되는 막은 양전하 또는 음전하를 갖는 이온을 선택적으로 수송하거나, 반대 전하의 이온을 거부하거나, 크기와 전하에서 따라 종(species)이 반투과성 막을 통해 이동하도록 허용하는 능력을 가질 수 있기 때문에, 전해액의 농도, 제거 또는 분리에 유용한 전기 투석을 제공한다.
본 발명에서 분리 및 정제는 당업계에 공지된 임의의 절차, 예컨대, 모세관 전기영동(예를 들어, 모세관 또는 단일 칩(on-chip)에서) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 모세관, 칼럼 또는 단일 칩에서)을 포함할 수 있다. 전기영동은 전기장의 영향하에서 이온 분자를 분리하는데 사용할 수 있는 방법이다. 전기영동은 겔, 모세관 또는 마이크로채널 단일 칩에서 수행될 수 있다. 전기영동을 위해 사용되는 겔의 예는 전분, 아크릴아마이드, 폴리에틸렌 옥사이드, 아가로스 또는 이들의 조합을 포함한다. 겔은 가교-결합, 세제 또는 변성제의 첨가, 효소 또는 항체(친화성 전기영동) 또는 기질(자이모그래피)의 고정화 및 pH 구배의 혼입에 의해 변형될 수 있다. 전기영동에 사용되는 모세관의 예는 전기분무와 접속하는 모세관을 포함한다.
모세관 전기영동(Capillary electrophoresis: CE)은 복잡한 친수성 분자와 고하전 용질을 분리하는데 바람직하다. CE 기술은 또한 미세유체 칩에서 구현될 수 있다. 사용되는 모세관 및 완충액의 유형에 따라, CE는 모세관 구역 전기영동(capillary zone electrophoresis: CZE), 모세관 등전 포커싱(capillary isoelectric focusing: CIEF), 모세관 등속전기영동(capillary isotachophoresis: cITP) 및 모세관 전기크로마토그래피(capillary electrochromatography: CEC)와 같은 분리 기법으로 더 세분화될 수 있다. CE 기법을 전기분무 이온화에 결합시키는 실시형태는 휘발성 용액, 예를 들어, 휘발성 산 및/또는 염기 및 유기물, 예컨대, 알코올 또는 아세토나이트릴을 함유하는 수성 혼합물의 사용을 포함한다.
모세관 등속전기영동(cITP)은 분석물이 일정한 속도로 모세관을 통해 이동하지만 그럼에도 불구하고 각각의 이동성에 의해 분리되는 기법이다. 유리-용액 CE(free-solution CE: FSCE)로도 알려진 모세관 구역 전기영동(CZE)은 분자의 전하에서 의해 결정되는 종의 전기영동 이동성과 이동 중에 분자가 만나는 마찰 저항의 차이를 기반으로 한다. 모세관 등전 포커싱(CIEF)은 약한 이온화 가능한 양쪽성 분자를 pH 구배에서 전기영동에 의해 분리될 수 있게 한다. CEC는 전통적인 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 CE 간의 하이브리드기법이다.
본 발명에 사용되는 분리 및 정제 기법은 당업계에 공지되어 있는 임의의 크로마토그래피 절차를 포함한다. 크로마토그래피는 소정의 분석물의 차등 흡착 및 용리 또는 이동상과 고정상 사이의 분석물의 분할을 기반으로 할 수 있다. 크로마토그래피의 다른 예는 액체 크로마토그래피(LC), 가스 크로마토그래피(GC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
b. 바이오마커 폴리펩타이드의 분석
바이오마커 단백질의 활성 또는 수준은 발현된 폴리펩타이드를 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 것에 의해서와 같이 검출 및/또는 정량화될 수 있다. 폴리펩타이드는 당업자에게 잘 알려진 임의의 여러 수단에 의해 검출 및 정량화될 수 있다. 바이오마커 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드 및 이의 단편 또는 유전적 변경(예를 들어, 이의 조절 또는 프로모터 영역에서)을 포함하는 이의 기능적으로 유사한 상동체의 비정상적인 수준의 폴리펩타이드 발현은 단독 또는 면역요법 치료와의 병용에서 T 세포 매개성 세포 독성의 조절인자에 대한 암의 반응 가능성과 관련이 있다. 폴리펩타이드를 검출하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 면역확산, 면역전기영동, 방사성 면역검정(RIA), 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역형광 검정, 웨스턴 블로팅, 결합제-리간드 검정, 면역조직화학적 기법, 응집, 보체 검정, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 고확산 크로마토그래피 등(예를 들어, 문헌[Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton and Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991])을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항체를 에피토프 또는 에피토프들과 반응시키고, 표지된 폴리펩타이드 또는 이의 유도체를 경쟁적으로 대체하는 것을 포함하는 결합제-리간드 면역검정 방법이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 제한 없이 방사선면역검정, 웨스턴 블롯 검정, 면역형광 검정, 효소 면역검정, 면역침강 검정, 화학발광 검정, 면역조직화학 검정, 도트 블롯 검정 또는 슬롯 블롯 검정을 포함하는 잘 알려진 면역검정 형태 중 어느 하나에 사용될 수 있다. 위에 언급된 다양한 면역검정 및 기법의 다른 변형을 수행하는데 사용되는 일반적인 기법, 예컨대, 원위치 근접 연결 검정(in situ proximity ligation assay: PLA), 형광 편광 면역검정(fluorescence polarization immunoassay: FPIA), 형광 면역검정(fluorescence immunoassay: FIA), 효소 면역검정(enzyme immunoassay: EIA), 혼탁 저해 면역검정(nephelometric inhibition immunoassay: NIA), 효소 연결 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA) 및 방사선면역검정(radioimmunoassay: RIA), ELISA 등을 단독으로 또는 조합으로 또는 대안적으로 NMR, MALDI-TOF, LC-MS/MS와 조합하는 것은 당업자에게 공지되어 있다.
이러한 시약은 또한, 예를 들어, 저해제의 최적 투여량을 모니터링하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 세포 또는 조직, 예를 들어, 백혈구 또는 림프구에서 단백질 수준을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출 가능한 물질에 커플링(예를 들어, 물리적으로 연결)시킴으로써 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리 포스파테이스, β-갈락토시데이스, 또는 아세틸콜린스터레이스를 포함하고; 적합한 보결 분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질을 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며; 생물발광 물질의 예는 루시퍼레이스, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
예를 들어, ELISA 및 RIA 절차는 원하는 바이오마커 단백질 표준이 표지(125I 또는 35S와 같은 방사성 동위원소 또는 서양고추냉이 퍼옥시데이스 또는 알칼리성 포스파테이스와 같은 검정 가능한 효소로)되고, 그리고 표지되지 않은 샘플과 함께 상응하는 항체와 접촉하고(여기서 제2 항체는 제1 항체에 결합하기 위해 사용됨), 방사능 또는 고정된 효소가 검정(경쟁적 검정)되도록 수행될 수 있다. 대안적으로, 샘플에서 바이오마커 단백질은 상응하는 고정된 항체와 반응하도록 허용되고, 방사성 동위원소-표지된 또는 효소-표지된 항-바이오마커 단백질 항체는 시스템과 반응하도록 허용되며, 방사능 또는 효소는 검정(ELISA-샌드위치 검정)된다. 다른 종래의 방법이 또한 적합하게 사용될 수 있다.
위의 기법은 본질적으로 "1-단계" 또는 "2-단계" 검정으로 수행될 수 있다. "1-단계" 검정은 항원과 고정된 항체를 접촉시키고, 세척하지 않고 혼합물을 표지된 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. "2-단계" 검정은 혼합물을 표지된 항체와 접촉시키기 전에 세척하는 것을 포함한다. 다른 종래의 방법이 또한 적합하게 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 바이오마커 단백질 수준을 측정하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: 생물학적 표본을 항체 또는 바이오마커 단백질에 선택적으로 결합하는 이의 변이체(예를 들어, 단편)와 접촉시키는 단계, 및 상기 항체 또는 이의 변이체가 상기 샘플에 결합되는지 여부를 검출하는 단계 및 이에 의해 바이오마커 단백질의 수준을 측정하는 단계.
바이오마커 단백질 및/또는 항체의 효소적 및 방사성 표지는 종래의 수단에 의해 수행될 수 있다. 이러한 수단은 일반적으로 효소를 글루타알데하이드와 같은 문제의 항원 또는 항체에 공유 결합하여 특히 효소의 활성에 악영향을 미치지 않도록 하는 것을 포함할 것이며, 이는 효소가 여전히 이의 기질과 상호작용할 수 있어야 함을 의미하지만, 모든 효소가 활성화될 필요는 없지만 검정이 수행될 수 있도록 충분히 활성 상태로 남아 있으면 된다. 실제로, 결합 효소에 대한 일부 기법은 비-특이적이며(예컨대, 폼알데하이드 사용), 활성 효소의 일부만을 생성할 것이다.
일반적으로 검정 시스템의 한 성분을 지지체에 고정하여 시스템의 다른 성분을 성분과 접촉시키고, 힘들고 시간-소모적인 노동 없이 쉽게 제거할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 제2 상이 제1 상에서 멀리 고정될 수 있지만, 하나의 상이 일반적으로 충분하다.
효소 자체를 지지체에 고정하는 것이 가능하지만, 고체-상 효소가 필요하다면, 이는 일반적으로 항체에 결합하고 항체를 당업계에 잘 알려진 지지체, 모델 및 시스템에 부착하여 가장 잘 달성된다. 간단한 폴리에틸렌은 적합한 지지체를 제공할 수 있다.
표지에 사용할 수 있는 효소는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 옥시데이스기의 구성원으로부터 선택될 수 있다. 이들은 기질과의 반응에 의해 과산화수소의 생산을 촉매하며, 글루코스 옥시데이스는 종종 좋은 안정성, 가용성 및 저렴함뿐만 아니라 기질(글루코스)의 가용성을 위해 사용된다. 옥시데이스의 활성은 당업계에 잘 알려진 제어된 조건하에서 효소-표지된 항체와 기질의 반응 후에 형성된 과산화수소의 농도를 측정함으로써 분석될 수 있다.
본 개시내용을 기반으로 의사의 선호도에 따라 바이오마커 단백질을 검출하기 위해 다른 기법이 사용될 수 있다. 이러한 기술 중 하나는 적절하게 처리된 샘플이 나이트로셀룰로스 필터와 같은 고체 지지체로 옮겨지기 전에 SDS-PAGE 겔에서 실행되는 웨스턴 블로팅(문헌[Towbin et al. (1979) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 76:4350])이다. 그런 다음, 항-바이오마커 단백질 항체(표지되지 않음)는 지지체와 접촉시키고, 표지된 단백질 A 또는 항-면역글로불린(125I, 서양고추냉이 퍼옥시데이스 및 알칼리성 포스파테이스를 포함하는 적합한 표지)과 같은 2차 면역학적 시약에 의해 검정된다. 크로마토그래피 검출이 또한 사용할 수 있다.
면역조직화학은 예를 들어, 생검 샘플에서 바이오마커 단백질의 발현을 검출하는데 사용될 수 있다. 적합한 항체는 예를 들어, "얇은 세포층과 접촉시키고, 세척한 다음 제2의 표지된 항체와 접촉시킨다. 표지는 형광 마커, 효소, 예컨대, 퍼옥시데이스, 아비딘 또는 방사성 표지에 의해 수행될 수 있다. 검정은 현미경을 사용하여 시각적으로 채점된다.
인트라바디와 같은 항-바이오마커 단백질 항체는 또한 예를 들어, 대상체의 세포 및 조직에서 바이오마커 단백질의 존재를 검출하기 위해 이미징 목적으로 사용될 수 있다. 적합한 표지는 방사성 동위원소, 아이오딘(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트라이튬(3H), 인듐(112In) 및 테크네튬(99mTc), 형광 표지, 예컨대, 플루오레세인 및 로다민 및 바이오틴을 포함한다.
생체내 이미징 목적을 위해, 항체는 신체 외부에서 검출할 수 없으므로 검출을 가능하게 하기 위해 표지 또는 그렇지 않으면 변형되어야 한다. 이러한 목적을 위한 마커는 항체 결합을 실질적으로 방해하지 않지만 외부 검출을 허용하는 임의의 것일 수 있다. 적합한 마커는 X-방사선 촬영, NMR 또는 MRI에 의해 검출될 수 있는 것들을 포함할 수 있다. X-방사선 촬영 기법의 경우, 적합한 마커는 검출 가능한 방사선을 방출하지만, 예를 들어, 바륨 또는 세슘과 같이 대상체에게 명확히 해롭지 않은 임의의 방사성 동위원소를 포함한다. NMR 및 MRI에 적합한 마커는 일반적으로 예를 들어, 관련 하이브리도마에 대한 영양소의 적합한 표지에 의해 항체에 혼입될 수 있는 중수소와 같은 검출 가능한 특징적 스핀을 갖는 것들을 포함한다.
대상체의 크기와 사용되는 이미징 시스템은 진단 이미지를 생성하는 데 필요한 이미징 모이어티의 양을 결정할 것이다. 방사성 동위원소 모이어 티의 경우에, 인간 대상체의 경우 주입되는 방사능의 양은 일반적으로 약 5 내지 20 밀리큐리의 테크네튬-99일 것이다. 표지된 항체 또는 항체 단편은 바이오마커 단백질을 함유하는 세포의 위치에 우선적으로 축적될 것이다. 표지된 항체 또는 항체 단편은 공지된 기법을 사용하여 검출될 수 있다.
바이오마커 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있는 항체는 검출될 바이오마커 단백질에 충분히 강하고 특이적으로 결합하는 천연의 또는 합성, 전장 또는 이의 단편, 단일클론 또는 다중클론 여부에 관계없이 임의의 항체를 포함한다. 항체는 최대 약 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M 또는 10-12M의 Kd를 가질 수 있다. 문구 "특이적으로 결합하다"는 예를 들어, 결합이 동일하거나 유사한 에피토프, 항원 또는 항원 결정기의 제2 제제와 대체되거나 경쟁될 수 있는 방식으로 항체가 에피토프 또는 항원 또는 항원 결정기에 결합하는 것을 지칭한다. 항체는 관련 단백질과 같은 다른 단백질에 비해 바이오마커 단백질에 우선적으로 결합할 수 있다.
항체는 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 펩타이드와 같은 항체 이외의 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 작용제가 사용된다. 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 단백질의 특정 펩타이드 결합제는 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하기 위해 스크리닝될 수 있다.
VII. 제형 및 약제학적 조성물을 포함하는, 조성물
본 발명에 포함되는 작용제, 예컨대, 항체, 이의 항원-결합 단편, 세포 등을 포함하는 조성물이 제한 없이 상정된다. 예를 들어, 작용제는 단독으로 또는 다른 작용제, 예컨대, 핵산-기반 조성물(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA), cDNA, siRNA, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, DNA자임, 압타머, 핵산 유인물, 핵산 키메라, 삼중 나선 구조 등), 단백질-기반 조성물과 함께 조합하여 사용될 수 있으며, 세포-기반 조성물뿐만 아니라 이들의 변이체, 변형 및 조작된 버전은 본 명세서에 기재된 방법에서뿐만 아니라 조성물 그 자체로 사용하기 위한 것으로 상정된다. 일부 실시형태에서, 각각 본 명세서에 기재된 서열로부터 선택된 센스 가닥 핵산 서열 및 안티센스 가닥 핵산 서열을 갖는 siRNA 분자뿐만 아니라 서열 변이체 및/또는 이의 화학적으로 변형된 버전은 본 발명에 포함되며, 위에 상세하게 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 조절된 염증성 표현형을 갖는 골수성 세포와 같은 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다.
이러한 조성물은 약제학적 조성물 및/또는 제형 내에 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 공지되거나 또는 이후 약리학 분야에서 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분과 같은 작용제를 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시키는 단계, 및 그 후 필요 및/또는 바람직하다면 목적하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 분할, 성형 및/또는 패키징하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "활성 성분"은 노출될 때 인간 또는 동물에서 생리학적 효과를 갖는 임의의 화학적 및 생물학적 물질을 지칭한다. 본 발명에 포함되는 맥락에서, 제형 내의 활성 성분은 본 발명에 포함되는 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적)를 조절하는 임의의 작용제일 수 있다.
1. 조성물 제조
본 발명에 따른 조성물은 단일 단위 용량 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로 대량으로 제조, 패키징 및/또는 판매될 수 있다. 본 명세서에 사용되는, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 별개의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 용량 및/또는 그러한 용량의 편리한 분획, 예를 들어, 이러한 용량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 합리적인 이익/위험비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간과 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 의학적 판단의 범위 내에 있는 작용제, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 무수 약제학적 제형 및 투여 형태, 액체 약제학적 제형, 고체 약제학적 제형, 백신 등으로 제공될 수 있다. 적합한 액체 제제는 선택된 pH로 완충되는 등장성 수성 용액, 현탁액, 에멀션 또는 점성 조성물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
아래에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 본 발명에 포함되는 작용제 및 다른 조성물은 (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌치(수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제, 볼루스, 분말, 과립, 페이스트; (2) 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액과 같은 예를 들어, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의한 비경구 투여; (3) 예를 들어, 피부에 적용되는(즉, 도포되는) 크림, 연고 또는 스프레이와 같은 국소 적용; (4) 예를 들어, 페서리, 크림 또는 폼과 같은 질내 또는 직장내; 또는 (5) 예를 들어, 화합물을 함유하는 수성 에어로졸, 리포솜 제제 또는 고체 입자와 같은 에어로졸과 같은 다양한 투여 경로에 적합한 것을 포함하는 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별히 제형화될 수 있다. 정제, 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약 및 관장제와 같지만 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 작용제 또는 조성물에 대한 임의의 적절한 형태 인자가 상정된다.
본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 개별 투여 형태, 예컨대, 캡슐, 사셰 또는 정제, 또는 각각 미리 결정된 양의 활성 성분을 분말 또는 과립으로 함유하는 액체 또는 에어로졸 스프레이, 용액, 또는 수성 또는 비수성 액체 중 현탁액, 수중유 에멀션, 유중수 액상 에멀션, 재구성용 분말, 경구 섭취용 분말, 병(병에 들어있는 분말 또는 액체 포함), 경구 용해 필름, 로젠지, 페이스트, 튜브, 검 및 팩으로 제공될 수 있다. 이러한 투여 형태는 임의의 약학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분으로 압축 또는 성형하여 제조될 수 있다. 압축된 정제는 결합제(예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제(예를 들어, 소듐 전분 글리콜레이트 또는 가교결합된 소듐 카복시메틸 셀룰로스), 표면-활성제 또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말화된 펩타이드 또는 펩타이도모방체의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다.
정제, 및 당의정, 캡슐, 알약 및 과립과 같은 다른 고체 투여 형태는 선택적으로 스코어링되거나 또는 장용 코팅 및 제약 제제 분야에 잘 알려진 기타 코팅과 같은 코팅 및 셸로 제조될 수 있다. 이들은 또한 예를 들어, 목적하는 방출 프로파일, 다른 중합체 매트릭스, 리포솜 및/또는 마이크로스피어를 제공하기 위해 다양한 비율로 예를 들어, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스를 사용하여 활성 성분의 느린 또는 제어된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다. 이들은 또한 예를 들어, 박테리아 보유 필터를 통한 여과 또는 사용 직전에 멸균수 또는 일부 다른 멸균 주사용 매질에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있으며, 활성 성분(들)만을 방출하거나, 우선적으로 위장관의 소정의 부분에서, 선택적으로 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 활성 성분은 또한 적절한 경우 하나 이상의 부형제와 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태(캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 활성 성분은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대, 소듐 시트레이트 또는 다이칼슘 포스페이트 및/또는 임의의 다음의 것과 혼합된다: (1) 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 규산과 같은 충전제 또는 증량제; (2) 예를 들어, 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리바이닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤과 같은 보습제; (4) 한천, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 소정의 실리케이트 및 소듐 카보네이트와 같은 붕해제; (5) 파라핀과 같은 용액 지연제; (6) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (7) 예를 들어, 아세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카올린 및 벤토나이트 점토와 같은 흡수제; (9) 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트 및 이들의 혼합물과 같은 윤활제; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐의 충전제로서 사용될 수 있다.
경구 투여를위한 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용 가능한 에멀션, 마이크로에멀션, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다. 활성 성분에 더하여, 액체 투여 형태는 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대, 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-뷰틸렌 글리콜, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스터 및 이들의 혼합물과 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 방부제와 같은 보조제를 포함한다. 활성제 이외에 현탁액은 예를 들어, 에톡실화된 아이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스터, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트래거캔스 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
직장 또는 질 투여용 제형은 좌약으로 제공될 수 있으며, 이는 하나 이상의 작용제를 하나 이상의 적합한 비자극성 부형제 또는 예를 들어, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있고, 이는 상온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이므로 직장이나 질강에서 녹아 활성제를 방출한다.
질 투여에 적합한 제형은 또한 당업계에서 적절한 것으로 알려진 이러한 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형을 포함한다.
바이오마커 발현 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 저해)하는 작용제의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분은 멸균 조건하에서 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 필요할 수 있는 임의의 방부제, 완충액 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 작용제 이외에, 부형제, 예컨대, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트래거캔스, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 아연 옥사이드 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 바이오마커 발현 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 저해)하는 작용제 외에도, 부형제, 예컨대, 락토스, 활석, 규산, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아마이드 분말 또는 이러한 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 클로로플루오로탄화수소와 같은 통상적인 추진제 및 뷰테인 및 프로페인과 같은 휘발성 비치환 탄화수소를 추가로 함유할 수 있다.
작용제는 에어로졸에 의해 투여될 수 있다. 이는 화합물을 함유하는 수성 에어로졸, 리포솜 제제 또는 고체 입자를 제조함으로써 달성된다. 비수성(예를 들어, 플루오로카본 추진제) 현탁액이 사용될 수 있다. 음파 분무기는 화합물의 분해를 초래할 수 있는 전단(shear)에 작용제가 노출되는 것을 최소화기 때문에 바람직하다.
일반적으로, 수성 에어로졸은 종래의 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 안정화제와 함께 작용제의 수용액 또는 현탁액을 제형화함으로써 제조된다. 담체 및 안정화제는 특정 화합물의 요건에 따라 다르지만 일반적으로 비이온성 계면활성제(트윈, 플루로닉 또는 폴리에틸렌 글리콜), 혈청 알부민과 같은 무해한 단백질, 소르비탄 에스터, 올레산, 레시틴, 글리신과 같은 아미노산, 완충액, 염, 당 또는 당 알코올을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장성 용액으로 제조된다.
경피 패치는 신체에 작용제의 제어된 전달을 제공하는 추가 이점이 있다. 이러한 투여 형태는 적절한 매질에 작용제를 용해 또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 흡수 강화제는 또한 피부를 통한 펩타이도모방체의 플럭스를 증가시키는데 사용될 수 있다. 이러한 플럭스의 속도는 속도 제어막을 제공하거나 중합체 매트릭스 또는 겔에 펩타이도모방체를 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
안과용 제형, 눈 연고, 분말, 용액 등도 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 상정된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화된다. 비경구 제형은 담체 또는 부형제, 예컨대, 염, 탄수화물 및 완충제(예를 들어, pH 3 내지 9)를 함유하는 수성 용액 또는 멸균 비-수성 용액 또는 멸균된, 발열원이 없는 물과 같은 적합한 비히클과 함께 사용될 수 있는 건조된 형태일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 치료제의 수성 용액은 등장성 식염수, 5% 글루코스 또는 예를 들어, 미국 특허 제7,910,594호에 개시된 것과 같은 기타 약제학적으로 허용 가능한 액체 담체, 예컨대, 액체 알코올, 글리콜, 에스터 및 아마이드를 포함한다. 다른 예에서, 본 발명에 포함되는 치료제의 수성 용액은 PCT 공개 WO 2011/014821에 개시된 바와 같은 정맥내 투여를 위한 포스페이트 완충 제형(pH 7.4)을 포함한다. 비경구 투여 형태는 본 발명에 포함되는 치료제의 용량을 포함하는 재구성 가능한 동결 건조물의 형태일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,713,249호; 제5,266,333호; 및 제5,417,982호에 기재된 생분해성 탄수화물 매트릭스와 같은 당업계에 공지된 임의의 연장 방출 투여 형태가 이용될 수 있거나, 또는 대안적으로, 느린 펌프(예를 들어, 삼투 펌프)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 멸균 조건하에서 동결건조에 의한 멸균 조건하에서 비경구 제형의 제조는 당업자에게 잘 알려진 표준 약제학적 기법을 사용하여 쉽게 달성될 수 있다. 비경구 제형의 제조에 사용되는 본 발명에 포함되는 치료제의 용해도는 용해도 향상제의 혼입과 같은 적절한 제형 기법을 사용하여 증가될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 수성 또는 비 수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션, 또는 사용 직전에 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합된 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있으며, 이는 항산화제, 완충액, 세균발육 저지제, 제형을 의도된 수여체의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 등장성 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
이러한 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시킴으로써 미생물 작용을 방지할 수 있다. 당, 소듐 클로라이드 등과 같은 등장성 작용제를 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 작용제를 포함시킴으로써 주사 가능한 약제학적 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다.
일부 경우에서, 약물의 효과를 연장하기 위해 피하 또는 근육내 주사로 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는 수용해도가 좋지 않은 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 달라지며, 이는 결정 크기와 결정 형태에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 오일 비히클에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다.
주사용 데포 형태는 폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체에서 바이오마커 발현 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 저해)하는 작용제의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비와 사용되는 특정 중합체의 특성에 따라 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스터) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포 주사용 제형은 또한 약물을 신체 조직과 상용성인 리포솜 또는 마이크로에멀션에 포획함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 포함되는 작용제가 약제로서 인간 및 동물에게 투여되는 경우, 이들은 그 자체로 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 예를 들어, 0.1% 내지 99.5%(더욱 바람직하게는, 0.5% 내지 90%)의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 대상체에게 독성이 없이 특정 대상체, 조성물 및 투여 방식에 대한 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 본 발명에 포함되는 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "제어된 방출"은 치료 결과에 영향을 미치기 위해 특정 방출 패턴을 따르는 약제학적 조성물 또는 화합물 방출 프로파일을 지칭한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조성물은 본 명세서에 기재되고/되거나 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위해 당업계에 공지된 전달제 내로 캡슐화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "캡슐화하다"는 동봉하거나(enclose) 둘러싸거나(surround) 감싸는(encase) 것을 의미한다. 본 발명에 포함되는 제형과 관련하여, 캡슐화는 실질적, 완전적 또는 부분적일 수 있다. 용어 "실질적으로 캡슐화된"은 적어도 20%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.9% 초과 또는 99.999% 초과의 본 발명에 포함되는 치료제가 입자 내에 동봉되거나, 둘러싸이거나 감싸질 수 있음을 의미한다. 용어 "부분적 캡슐화"는 10, 10, 20, 30, 40, 50 미만의 본 발명에 포함되는 접합체가 입자 내에 동봉되거나, 둘러싸이거나 감싸질 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 99.99% 초과의 본 발명에 포함되는 약제학적 조성물 또는 화합물이 제형에 캡슐화된다.
일부 실시형태에서, 이러한 제형이 또한 구성될 수 있거나, 또는 조성물은 단핵구, 대식세포 및 다른 면역 세포(예를 들어, 수지상 세포, 항원 제시 세포, T 림프구, B 림프구 및 자연 살해 세포), 암세포 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 생체내 상이한 세포 유형으로 수동적으로 또는 능동적으로 지시되도록 변경된다. 제형은 폴레이트, 트랜스페린, N-아세틸갈락토사민(N-아세틸갈락토사민: GalNAc) 및 항체 표적화된 접근법에 의해 예시되지만 이들로 제한되지 않는 바와 같이 표면상의 상이한 리간드의 발현을 통해 선택적으로 표적화될 수 있다.
2. 추가적인 성분
본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 (1) 안정성을 증가시키고; (2)(예를 들어, 데포 제형으로부터) 지속 또는 지연 방출을 허용하며; (3) 체내 분포(예를 들어, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 작용제의 표적화)를 변경하고; (4) 생체내에서 작용제의 방출 프로파일을 변경하기 위해 하나 이상의 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다. 부형제의 비-제한적 예는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제 등장성 작용제, 증점제 또는 유화제 및 방부제를 포함한다. 본 발명에 포함되는 부형제는 또한 제한 없이, 리피도이드, 리포솜, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 코어-셸 나노입자, 펩타이드, 단백질, 하이아루로니데이스, 나노입자 모의체 및 이들의 조합을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 목적하는 특정 투여 형태에 적합하게 하는 것과 같은 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁액 작용제, 표면 활성제 등장성 작용제, 증점제 또는 유화제, 붕해제, 방부제, 완충제, 고체 결합제, 윤활제, 오일, 코팅, 항균제 및 항진균제, 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 문헌[Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)]은 약제학적 조성물의 제형화에 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시하고 있다. 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 그렇지 않으면 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 임의의 통상적인 부형제 매질이 물질 또는 이의 유도체와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 그 사용은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 상정된다. 보충 활성 성분이 또한 기재된 조성물에 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 또는 100% 순수하다. 일부 실시형태에서, 부형제는 인간 및 수의학 용도로 승인된다. 일부 실시형태에서, 부형제는 미국 식품의약국에 의해 승인된다. 일부 실시형태에서, 부형제는 약제학적 등급이다. 일부 실시형태에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전 및/또는 국제 약전의 표준을 충족한다.
예시적 희석제는 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다이칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 수소 포스페이트, 소듐 포스페이트 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말화된 당 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 과립화제 및/또는 분산제는 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 소듐 전분 글리콜레이트, 점토, 알긴산, 구아 검, 시트러스 펄프, 아가, 벤토나이트, 셀룰로스 및 목재 제품, 천연의 스폰지, 양이온 교환 수지, 칼슘 카보네이트, 실리케이트, 소듐 카보네이트, 가교 폴리(바이닐-피롤리돈)(크로스포비돈), 소듐 카복시메틸 전분(소듐 전분 글리콜레이트), 카복시메틸 셀룰로스, 가교 소듐 카복시메틸 셀룰로스(크로스카멜로스), 메틸셀룰로스, 전호화 전분(전분 1500), 미세결정질 전분, 수불용성 전분, 칼슘 카복시메틸 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트(VEEGUM®), 소듐 라우릴 설페이트, 4차 암모늄 화합물 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 표면 활성제 및/또는 유화제는 천연의 유화제(예를 들어, 아카시아, 아가, 알긴산, 소듐 알기네이트, 트래거캔스, 콘드럭스, 콜레스테롤, 잔탄, 펙틴, 젤라틴, 난황, 카세인, 양모지, 콜레스테롤, 왁스 및 레시틴), 콜로이드성 점토(예를 들어, 벤토나이트[알루미늄 실리케이트] 및 VEEGUM®[마그네슘 알루미늄 실리케이트]), 긴 사슬 아미노산 유도체, 고분자량 알코올(예를 들어, 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 올레일 알코올, 트라이아세틴 모노스테아레이트, 에틸렌 글리콜 다이스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트 및 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리바이닐 알코올), 카보머(예를 들어, 카복시 폴리메틸렌, 폴리아크릴산, 아크릴산 중합체 및 카복시바이닐 중합체), 카라기난, 셀룰로스 유도체(예를 들어, 카복시메틸셀룰로스 소듐, 분말화된 셀룰로스, 하이드록시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스), 소르비탄 지방산 에스터(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트[TWEEN®20], 폴리옥시에틸렌 소르비탄[TWEENn®60], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트[TWEEN®80], 소르비탄 모노팔미테이트[SPAN®40], 소르비탄 모노스테아레이트[SPAN®60], 소르비탄 트라이스테아레이트[SPAN®65], 글리세릴 모노올리에이트, 소르비탄 모노올리에이트[SPAN®80]), 폴리옥시에틸렌 에스터(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트[MYRJ®45], 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리에톡실화 피마자유, 폴리옥시메틸렌 스테아레이트 및 SOLUTOL®), 수크로스 지방산 에스터, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스터(예를 들어, CREMOPHOR®), 폴리옥시에틸렌 에터(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에터[BRIJ®30]), 폴리(바이닐-피롤리돈), 다이에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 올리에이트, 소듐 올리에이트, 포타슘 올리에이트, 에틸 올리에이트, 올레산, 에틸 라우레이트, 소듐 라우릴 설페이트, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, 세트리모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 도큐세이트 소듐 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 결합제는 전분(예를 들어, 옥수수 전분 및 전분 페이스트); 젤라틴; 당(예를 들어, 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 덱스트린, 당밀, 락토스, 락티톨, 만니톨,); 천연의 및 합성 검(예를 들어, 아카시아, 소듐 알기네이트, 아일랜드 이끼의 추출물, 판와 검, 가티 검, 이사폴 겉껍질의 점액, 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(바이닐-피롤리돈), 마그네슘 알루미늄 실리케이트(Veegum®) 및 낙엽송 아라비노갈락탄); 알기네이트; 폴리에틸렌 옥사이드; 폴리에틸렌 글리콜; 무기 칼슘 염; 규산; 폴리메타크릴레이트; 왁스; 물; 알코올; 등; 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 방부제는 항산화제, 킬레이트제, 항균 방부제, 항진균 방부제, 알코올 방부제, 산성 방부제 및/또는 다른 방부제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 항산화제는 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아스코빌 팔미테이트, 뷰틸화 하이드록시아니솔, 뷰틸화 하이드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 포타슘 메타바이설파이트, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 소듐 아스코르베이트, 소듐 바이설파이트, 소듐 메타바이설파이트 및/또는 소듐 설파이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 킬레이트제는 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산 모노하이드레이트, 다이소듐 에데테이트, 다이포타슘 에데테이트, 에데트산, 퓨마르산, 말산, 인산, 소듐 에데테이트, 타타르산 및/또는 트라이소듐 에데테이트를 포함한다. 예시적 항균 방부제는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 브로노폴, 세트라이마이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로뷰탄올, 클로로크레솔, 클로로자일렌올, 크레솔, 에틸 알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 페닐머큐릭나이트레이트, 프로필렌 글리콜 및/또는 티메로살을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 항진균 방부제는 뷰틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 하이드록시벤조산, 포타슘 벤조에이트, 포타슘 소르베이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 프로피오네이트 및/또는 소르브산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 알코올 방부제는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 페놀, 페놀성 화합물, 비스페놀, 클로로뷰탄올, 하이드록시벤조에이트 및/또는 페닐에틸 알코올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 산성 방부제는 바이타민 A, 바이타민 C, 바이타민 E, 베타-카로틴, 시트르산, 아세트산, 데하이드로아세트산, 아스코르브산, 소르브산 및/또는 피트산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 방부제는 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 데테록심 메실레이트, 세트라이마이드, 뷰틸화 하이드록시아니솔(BHA), 뷰틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 에틸렌다이아민, 소듐 라우릴 설페이트(SLS), 소듐 라우릴 에터 설페이트(SLES), 소듐 바이설파이트, 소듐 메타바이설파이트, 포타슘 설파이트, 포타슘 메타바이설파이트, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, 메틸파라벤, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™ 및/또는 EUXYL®을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 완충제는 시트레이트 완충액 용액, 아세테이트 완충액 용액, 포스페이트 완충액 용액, 암모늄클로라이드, 칼슘 카보네이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, D-글루콘산, 칼슘 글리세로포스페이트, 칼슘 락테이트, 프로파논산, 칼슘 레불리네이트, 펜탄산, 이염기성 칼슘 포스페이트, 인산, 삼염기성 칼슘 포스페이트, 칼슘 하이드록사이드 포스페이트, 포타슘 아세테이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 글루코네이트, 포타슘 혼합물, 이염기성 포타슘 포스페이트, 일염기성 포타슘 포스페이트, 포타슘 포스페이트 혼합물, 소듐 아세테이트, 소듐 바이카보네이트, 소듐 클로라이드, 소듐 시트레이트, 소듐 락테이트, 이염기성 소듐 포스페이트, 일염기성 소듐 포스페이트, 소듐 포스페이트 혼합물, 트로메타민, 마그네슘 하이드록사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알긴산, 발열원이 없는 물 등장성 식염수, 링거 용액, 에틸 알코올 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 활석, 엿기름, 글리세릴 베헤네이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 류신, 마그네슘 라우릴 설페이트, 소듐 라우릴 설페이트 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 오일은 아몬드, 아프리코트 커넬, 아보카도, 바바수, 베르가못, 블랙 커런트씨, 보리지, 케이드, 캐모마일, 카놀라, 캐러웨이, 카나우바, 피마자, 시나몬, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 목화씨, 에뮤, 유칼립투스, 달맞이꽃, 물고기, 아마씨, 제라니올, 박, 포도씨, 개암, 우슬초, 아이소프로필 미리스테이트, 호호바, 쿠쿠이 너트, 라반딘, 라벤더, 레몬, 릿치아 쿠베바, 마카데미아 너트, 아욱, 망고씨, 메도우폼씨, 밍크, 육두구, 올리브, 오렌지, 오렌지 러피, 야자, 야자 커넬, 복숭아 커넬, 땅콩, 양귀비씨, 호박씨, 유채, 쌀겨, 로즈마리, 홍화, 백단, 새스콰나, 세이보리, 산자나무, 참깨, 시어 버터, 실리콘, 대두, 해바라기, 티트리, 엉겅퀴, 동백, 베티버, 호두 및 밀 배아 오일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 오일은 뷰틸 스테아레이트, 카프릴릭 트라이글리세라이드, 카프릭 트라이글리세라이드, 사이클로메티콘, 다이에틸 세바케이트, 다이메티콘 360, 아이소프로필 미리스테이트, 미네랄 오일, 옥틸도데칸올, 올레일 알코올, 실리콘 오일 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
코코아 버터 및 좌약 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제 및/또는 방향제 작용제와 같은 부형제는 제조자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적 제형은 또한 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 당업계에 공지되어 있는 다양한 유기 및 무기 반대 이온으로부터 유래되는 염을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Berge et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염은 작용제의 최종 단리 및 정제 동안 현장에서 제조되거나 또는 유리 염기 형태의 정제된 작용제를 적합한 유기 또는 무기산과 개별적으로 반응시키고 이렇게 형성된 염을 단리함으로써 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 산 부가염은 무기산 및 유기산으로 형성될 수 있다. 염이 유래될 수 있는 무기산은 예를 들어, 하이드로클로르산, 하이드로브롬산, 황산, 질산 및 인산을 포함한다. 염이 유래될 수 있는 유기산은 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 퓨마르산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, p-톨루엔설폰산 및 살리실산을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 무기 및 유기 염기로 형성될 수 있다. 염이 유래될 수 있는 무기 염기는 예를 들어, 소듐, 포타슘, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간 및 알루미늄을 포함한다. 염기 유래될 수 있는 유기 염기는 예를 들어, 일차, 이차 및 삼차 아민, 자연 발생적으로 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 고리형 아민 및 염기성 이온 교환 수지를 포함한다. 특정 예는 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민 및 에탄올아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 암모늄, 포타슘, 소듐, 칼슘 및 마그네슘 염으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 하나 이상의 산성 작용기를 함유할 수 있고, 따라서 약제학적으로 허용 가능한 염기와 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있다. 이러한 예에서 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 바이오마커 발현을 조절(예를 들어, 저해)하는 작용제의 비교적 무독성의, 무기 및 유기 염기 부가염을 지칭한다. 이러한 염은 마찬가지로 작용제의 최종 단리 및 정제 동안 현장에서 제조되거나 또는 암모니아 또는 약제학적으로 허용 가능한 유기 일차, 이차 또는 삼차 아민과 함께 유리 산 형태의 정제된 작용제를 약제학적으로 허용 가능한 금속 양이온의 하이드록사이드, 카보네이트 또는 바이카보네이트와 같은 적합한 염기와 별도로 반응시켜 제조될 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리성 토류염은 리튬, 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등을 포함한다. 염기 부가염의 형성에 유용한 대표적인 유기 아민은 에틸아민, 다이에틸아민, 에틸렌다이아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 피페라진 등을 포함한다(예를 들어, 상기 문헌[Berge et al.] 참조).
용어 "공-결정"은 당업계에 공지되어 있는 다수의 공-결정 형성제로부터 유래되는 분자 복합체를 지칭한다. 염과 달리, 공-결정은 전형적으로 공-결정과 약물 사이의 수소 전달을 포함하지 않으며, 대신 공-결정 형성제와 결정 구조 내의 약물 사이의 분자간 수소 결합, 방향족 고리 스태킹 또는 분산력과 같은 분자간 상호작용을 포함한다.
본 발명에 포함되는 약제학적 조성물 및 투여 형태를 형성하는데 사용될 수 있는 예시적 계면활성제는 친수성 계면활성제, 친유성 계면활성제 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 즉, 친수성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있거나, 친유성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있거나 또는 적어도 하나의 친수성 계면활성제와 적어도 하나의 친유성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있다. 친수성 계면활성제는 이온성이거나 또는 비-이온성일 수 있다. 적합한 이온성 계면활성제는 알킬암모늄염; 푸시드산염; 아미노산, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드의 지방산 유도체; 아미노산, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드의 글리세라이드 유도체; 레시틴 및 수소화 레시틴; 라이소레시틴 및 수소화 라이소레시틴; 포스포리피드 및 이의 유도체; 라이소포스포리피드 및 이의 유도체; 카르니틴 지방산 에스터염; 알킬설페이트의 염; 지방산염; 소듐 도큐세이트; 아실악틸레이트; 모노- 및 다이-글리세라이드의 모노- 및 다이-아세틸화된 타타르산 에스터; 석시닐화된 모노- 및 다이-글리세라이드; 모노- 및 다이-글리세라이드의 시트르산 에스터; 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이온성 계면활성제는 예로서: 레시틴, 라이소레시틴, 포스포리피드, 라이소포스포리피드 및 이들의 유도체; 카르니틴 지방산 에스터염; 알킬설페이트의 염; 지방산염; 소듐 도큐세이트; 아실악틸레이트; 모노- 및 다이-글리세라이드의 모노- 및 다이-아세틸화된 타타르산 에스터; 석시닐화된 모노- 및 다이- 글리세라이드; 모노- 및 다이-글리세라이드의 시트르산 에스터; 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
이온성 계면활성제는 레시틴, 라이소레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 라이소포스파티딜글리세롤, 라이소포스파티드산, 라이소포스파티딜세린, PEG-포스파티딜에탄올아민, PVP-포스파티딜에탄올아민, 지방산의 락틸릭 에스터, 스테아로일-2-락틸레이트, 스테아로일 락틸레이트, 석시닐화된 모노글리세라이드, 모노/다이글리세라이드의 모노/다이아세틸화된 타타르산 에스터, 모노/다이글리세라이드의 시트르산 에스터, 코릴사코신, 카프로에이트, 카프릴레이트, 카프레이트, 라우레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 올리에이트, 리신올리에이트, 리놀리에이트, 리놀렌에이트, 스테아레이트, 라우릴 설페이트, 테라세실 설페이트, 도큐세이트, 라우로일 카르니틴, 팔미토일 카르니틴, 미리스토일 카르니틴 및 염 및 이들의 혼합물의 이온화된 형태일 수 있다.
친수성 비-이온성 계면활성제는 알킬글루코사이드; 알킬말토사이드; 알킬티오글루코사이드; 라우릴 마크로골글리세라이드; 폴리옥시알킬렌 알킬 에터, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에터; 폴리옥시알킬렌 알킬페놀, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 페놀; 폴리옥시알킬렌 알킬 페놀 지방산 에스터, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 모노에스터 및 폴리에틸렌 글리콜 지방산 다이에스터; 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 지방산 에스터; 폴리글리세롤 지방산 에스터; 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스터, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스터; 글리세라이드, 식물성 오일, 수소화 식물성 오일, 지방산 및 스테롤로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원과 폴리올의 친수성 에스터교환 생성물; 폴리옥시에틸렌 스테롤, 유도체 및 이의 유사체; 폴리옥시에틸화된 바이타민 및 이의 유도체; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체; 및 이들의 혼합물; 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스터, 및 트라이글리세라이드, 식물성 오일 및 수소화 식물성 오일로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원과 폴리올의 친수성 에스터교환 생성물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리올은 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 펜타에리트리톨 또는 당류일 수 있다.
다른 친수성-비-이온성 계면활성제는 제한 없이, PEG-10 라우레이트, PEG-12 라우레이트, PEG-20 라우레이트, PEG-32 라우레이트, PEG-32 다이라우레이트, PEG-12 올리에이트, PEG-15 올리에이트, PEG-20 올리에이트, PEG-20 다이올리에이트, PEG-32 올리에이트, PEG-200 올리에이트, PEG-400 올리에이트, PEG-15 스테아레이트, PEG-32 다이스테아레이트, PEG-40 스테아레이트, PEG-100 스테아레이트, PEG-20 다이라우레이트, PEG-25 글리세릴 트라이올리에이트, PEG-32 다이올리에이트, PEG-20 글리세릴 라우레이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-20 글리세릴 스테아레이트, PEG-20 글리세릴 올리에이트, PEG-30 글리세릴 올리에이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-40 글리세릴 라우레이트, PEG-40 팜커넬유, PEG-50 경화 피마자유, PEG-40 피마자유, PEG-35 피마자유, PEG-60 피마자유, PEG-40 경화 피마자유, PEG-60 경화 피마자유, PEG-60 옥수수유, PEG-6 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, PEG-8 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, 폴리글리세릴-10 라우레이트, PEG-30 콜레스테롤, PEG-25 파이토 스테롤, PEG-30 소야 스테롤, PEG-20 트라이올리에이트, PEG-40 소르비탄 올리에이트, PEG-80 소르비탄 라우레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, POE-9 라우릴 에터, POE-23 라우릴 에터, POE-10 올레일 에터, POE-20 올레일 에터, POE-20 스테아릴 에터, 토코페릴 PEG-100 석시네이트, PEG-24 콜레스테롤, 폴리글리세릴-10올리에이트, 트윈 40, 트윈 60, 수크로스 모노스테아레이트, 수크로스 모노라우레이트, 수크로스 모노팔미테이트, PEG 10-100 노닐 페놀 시리즈, PEG 15-100 옥틸 페놀 시리즈 및 폴록사머를 포함한다.
적합한 친유성 계면활성제는 지방 알코올; 글리세롤 지방산 에스터; 아세틸화된 글리세롤 지방산 에스터; 저급 알코올 지방산 에스터; 프로필렌 글리콜 지방산 에스터; 소르비탄 지방산 에스터; 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스터; 스테롤 및 스테롤 유도체; 폴리옥시에틸화된 스테롤 및 스테롤 유도체; 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에터; 당 에스터; 당 에터; 모노- 및 다이-글리세라이드의 락트산 유도체; 글리세라이드, 식물성 오일, 수소화 식물성 오일, 지방산 및 스테롤로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원과 폴리올의 소수성 에스터교환 생성물; 유용성(oil-가용성) 바이타민/바이타민 유도체; 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 그룹 내에서, 바람직한 친유성 계면활성제는 글리세롤 지방산 에스터, 프로필렌 글리콜 지방산 에스터 및 이들의 혼합물을 포함하거나, 또는 식물성 오일, 수소화 식물성 오일 및 트라이글리세라이드로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원의 폴리올의 소수성 에스터교환 생성물이다.
본 발명에 포함되는 작용제(예를 들어, 화학적 화합물)의 우수한 가용화 및/또는 용해를 보장하고, 본 발명에 포함되는 약물 양식의 침전을 최소화하기 위해 가용화제가 본 제형에 포함될 수 있다. 이는 주사용 조성물과 같은 비-경구용 조성물에 특히 중요할 수 있다. 가용화제는 또한 친수성 약물 및/또는 계면활성제와 같은 다른 성분의 용해도를 증가시키거나 또는 조성물을 안정하거나 균질한 용액 또는 분산으로 유지하기 위해 첨가될 수 있다. 적합한 가용화제의 예는 다음의 알코올 및 폴리올, 예컨대, 에탄올, 아이소프로판올, 뷰탄올, 벤질 알코올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 뷰테인다이올 및 이의 이성질체, 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨, 만니톨, 트랜스큐톨, 다이메틸 아이소소바이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리바이닐알코올, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 다른 셀룰로스 유도체, 사이클로덱스트린 및 사이클로덱스트린 유도체; 평균 분자량이 약 200 내지 약 6000인 폴리에틸렌 글리콜의 에터, 예컨대, 테트라하이드로퍼퓨릴알코올 PEG 에터(글리코퓨롤) 또는 메톡시 PEG; 아마이드 및 다른 질소-함유 화합물, 예컨대, 2-피롤리돈, 2-피페리돈,
Figure pct00012
-카프로락탐, N-알킬피롤리돈, N-하이드록시알킬피롤리돈, N-알킬피페리돈, N-알킬카프로락탐, 다이메틸아세트아마이드 및 폴리바이닐피롤리돈; 에스터, 예컨대, 에틸 프로피오네이트, 트라이뷰틸시트레이트, 아세틸 트라이에틸시트레이트, 아세틸 트라이뷰틸 시트레이트, 트라이에틸시트레이트, 에틸 올리에이트, 에틸 카프릴레이트, 에틸 뷰티레이트, 트라이아세틴, 프로필렌 글리콜 모노아세테이트, 프로필렌 글리콜 다이아세테이트, 엡실론-카프로락톤 및 이의 이성질체,
Figure pct00013
-발레로락톤 및 이의 이성질체,
Figure pct00014
-뷰티로락톤 및 이의 이성질체; 및 당업계에 공지된 다른 가용화제, 예컨대, 다이메틸 아세트아마이드, 다이메틸 아이소소바이드, N-메틸 피롤리돈, 모노옥타노인, 다이에틸렌 글리콜 모노에틸 에터 및 물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
가용화제의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 예는 트라이아세틴, 트라이에틸시트레이트, 에틸 올리에이트, 에틸 카프릴레이트, 다이메틸아세트아마이드, N-메틸피롤리돈, N-하이드록시에틸피롤리돈, 폴리바이닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 사이클로덱스트린, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 200-100, 글리코퓨롤, 트랜스큐톨, 프로필렌 글리콜 및 다이메틸 아이소소바이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특히 바람직한 가용화제는 소르비톨, 글리세롤, 트라이아세틴, 에틸 알코올, PEG-400, 글리코퓨롤 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 필요에 따라 제형에 포함될 수 있다. 이러한 첨가제 및 부형제는 제한 없이, 탈점착제(detackifier), 항소포제, 완충제, 중합체, 항산화제, 방부제, 킬레이트제, 점성 조절제, 긴장제, 향미제, 착색제, 착취제, 불투명화제, 현탁제, 결합제, 충전제, 가소제, 윤활제 및 이들의 혼합물을 포함한다.
또한, 산 또는 염기는 가공을 용이하게 하고 안정성을 향상시키기 위해 또는 다른 이유로 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염기의 예는 아미노산, 아미노산 에스터, 암모늄하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 소듐 하이드록사이드, 소듐 수소 카보네이트, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 카보네이트, 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 합성 알루미늄 실리케이트, 합성 하이드로칼사이트, 마그네슘 알루미늄 하이드록사이드, 다이아이소프로필에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, 트라이에탄올아민, 트라이에틸아민, 트라이아이소프로판올아민, 트라이메틸아민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메테인(TRIS) 등을 포함한다. 또한, 아세트산, 아크릴산, 아디프산, 알긴산, 알케인설폰산, 아미노산, 아스코르브산, 벤조산, 붕산, 뷰티르산, 탄산, 시트르산, 지방산, 폼산, 퓨마르산, 글루콘산, 하이드로퀴노설폰산, 아이소아스코르브산, 락트산, 말레산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 타닌산, 타타르산, 티오글리콜산, 톨루엔설폰산, 요산 등과 같은 약제학적으로 허용 가능한 산의 염인 염기도 적합하다. 다양성자산의 염, 예컨대, 소듐 포스페이트, 다이소듐 수소 포스페이트 및 소듐 다이하이드로겐 포스페이트가 또한 사용될 수 있다. 염기가 염인 경우, 양이온은 암모늄, 알칼리 금속 및 알칼리 토금속과 같은 임의의 편리하고 약제학적으로 허용 가능한 양이온일 수 있다. 예는 소듐, 포타슘, 리튬, 마그네슘, 칼슘 및 암모늄을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 산은 약제학적으로 허용 가능한 유기산 또는 무기산이다. 적합한 무기산의 예는 하이드로클로르산, 하이드로브롬산, 하이드리오드산, 황산, 질산, 붕산, 인산 등을 포함한다. 적합한 유기산의 예는 아세트산, 아크릴산, 아디프산, 알긴산, 알케인설폰산, 아미노산, 아스코르브산, 벤조산, 붕산, 뷰티르산, 탄산, 시트르산, 지방산, 폼산, 퓨마르산, 글루콘산, 하이드로퀴노설폰산, 아이소아스코르브산, 락트산, 말레산, 메테인설폰산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 타닌산, 타타르산, 티오글리콜산, 톨루엔설폰산 및 요산을 포함한다.
IX. 투여 및 투여량
본 명세서에 기재된 작용제(예를 들어, 조성물, 제형, 세포 등)는 목적하는 대상(예를 들어, 세포, 무세포 결합 파트너 등)과 접촉할 수 있고/있거나 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 유기체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 작용제는 양이온성 리포솜 및 중합체와 같은 화학적 방법 또는 유전자 총, 전기 천공, 입자 충격, 초음파 이용 및 자기감염과 같은 물리적 방법을 통해 세포로 전달될 수 있다.
접촉 대식세포에 투여하는 방법은 특히 대식세포가 조직 유형에 걸쳐 일반적으로 존재하기 때문에 당업계에 잘 알려져 있다(문헌[Ries et al. (2014) Cancer Cell 25:846-859; Perry et al. (2018) J. Exp. Med. 215:877-893; Novobrantseva et al. (2012) Mol. Ther. Nucl. Acids 1:e4; Majmudar et al. (2013) Circulation 127:2038-2046; Leuschner et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:11] 참조). 또한, 투여 방법은 예를 들어, 공간적으로 제한된 대식세포의 집단을 표적화하기 위해 작용제의 국소 투여를 사용함으로써, 관심 대식세포 집단을 표적화하기 위해 조정될 수 있다(예를 들어, TAM을 표적으로 하기 위한 종양내 투여)(문헌[Shirota et al. (2012) J. Immunol. 188:1592-1599; Wang et al. (Oct. 2016) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113:11525-11530] 참조). 이러한 차별적 투여 방법은 다른 대 식세포 집단과의 접촉을 줄이거나 제거하면서 관심 대식세포 집단을 선택적으로 표적화(예를 들어, 순환하는 대식세포로부터 선택적으로 TAM을 표적으로 하는 종양내 투여)할 수 있다.
작용제는 치료적으로 유효한 결과를 가져오는 임의의 경로에 의해 유효량으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 장내(장으로), 위장, 경막외(경막 내로), 경구(입을 통해), 경피, 경막주위, 뇌내(대뇌로), 뇌실내(대뇌 뇌실로), 표피(피부에 적용), 피내(피부 자체에), 피하(피부 아래), 비강 투여(코를 통해), 정맥내(정맥으로), 정맥내 볼루스, 정맥내 점적, 동맥내(동맥으로), 근육내(근육으로), 심장내(심장으로), 골수내 주입(골수로), 척수강내(척수 관으로), 복강내,(복막으로 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내,(눈을 통해), 해면내 주사(병리학적 공동으로), 강내(음경 기저로), 질내 투여, 자궁내, 양수외 투여, 경피(전신 분포를 위해 온전한 피부를 통한 확산), 경점막(점막을 통한 확산), 경질, 흡입(코흡입), 설하, 입술밑, 관장, 점안액(결막으로), 이어 드롭으로, 귀(귀내 또는 귀를 통해), 협측(뺨쪽으로 향함), 결막, 피부, 치과(치아 또는 치아들로), 전기 삼투, 자궁경부, 내시경, 기관내, 체외, 혈액 투석, 침윤, 간질, 복강내, 양막내, 관절내, 담도내, 기관지내, 점액내, 연골내(연골 내로), 미추내(꼬리 내로), 낭내(소내연수조 내로), 각막내(각막 내로), 치아내, 관상동맥내(관상 동맥 내로), 해면체내(음경의 해면체의 팽창되는 공간 내로), 추간판내(디스크 내로), 관내(샘의 관 내로), 십이지장내(십이지장 내로), 경막내(경질 내로 또는 아래로), 표피내(표피까지), 식도 내(식도로), 위내(위 내로), 치은내(치은 내로), 회장내(소장의 말단 부분 내로), 병변내(국소 병변 내로 또는 직접 도입), 강내(관의 내강 내), 림프내(림프 내로), 골수내(골수강 내로), 뇌막내(수막 내로), 심근내(심근 내로), 안구내(눈 내로), 난소내(난소 내로), 심낭내(심낭 내로), 흉강내(흉막 내로), 전립선내(전립선 내로), 폐내(폐 또는 기관지 내로), 강내(비강 또는 안와주위 부비강 내로), 척추내(척주 내로), 활액내(관절의 활액 내로), 건내(건 내로), 고환내(고환 내로), 수막강내(뇌척수 축의 임의의 수준에서 뇌척수액 내로), 흉곽내(흉곽 내로), 세관내(기관의 세관 내로), 종양내(종양 내로), 고실내(고실 내부로), 관내(혈관 또는 혈관들 내로), 심실내(심실 내로), 이온 삼투법(용해성 염 이온이 신체 조직으로 이동하는 전류 사용), 관주(개방된 상처 또는 체강을 세척 또는 수세), 후두(후두에 직접), 경비(코를 통해 위까지), 폐쇄 드레싱 기법(국소 경로 투여 후 그 부분을 밀봉하는 붕대로 덮음), 안과(외부 눈에), 구강인두(입과 인두에 직접), 비경구, 경피, 관절주위, 경막주위, 신경주위, 치주, 직장, 호흡기(국소적 또는 전신적 효과를 위해 구강 또는 비강으로 흡입하여 호흡기 내로), 안구뒤(뇌교뒤 또는 안구뒤), 심근내(심근에 들어감), 연조직, 지주막하, 결막하, 점막하, 국소, 태반(태반을 통하거나 가로지름), 경기관(기관 벽을 통해), 고막(고막강을 가로지르거나 통과함), 요관(요관으로), 요도(요도로), 질, 미주 차단, 진단, 신경 차단, 담도 관류, 심장 관류, 광선요법 또는 척추를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
작용제는 전형적으로 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위한 용량 단위 형태로 제형화된다. 그러나, 본 발명에 포함되는 작용제의 총 일일 사용량은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있음이 이해될 것이다. 특정 환자에 대한 특정 치료적 효과, 예방적 효과 또는 적절한 이미징 용량 수준은 치료될 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 작용제의 활성; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 사용되는 특정 작용제의 투여 시간, 투여 경로 및 배설률; 치료 기간; 사용되는 특정 화합물과 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 그리고 의학 분야에서 잘 알려진 요인들과 같은 것을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 작용제는 목적하는 치료, 진단, 예방 또는 이미징 효과를 얻기 위해, 하루에 한 번 이상 대상체 체중의 약 0.0001 ㎎/㎏ 내지 약 1000 ㎎/㎏, 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 0.05 ㎎/㎏, 약 0.005 ㎎/㎏ 내지 약 0.05 ㎎/㎏, 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 0.005 ㎎/㎏, 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 0.5 ㎎/㎏, 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏, 약 0.5 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏, 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏, 또는 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 25 ㎎/㎏, 또는 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 또는 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 500 ㎎/㎏을 전달하기에 충분한 용량 수준으로 투여될 수 있다. 목적하는 용량은 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 격일, 3일마다, 매주, 2주마다, 3주마다, 또는 4주마다 또는 2개월마다 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 목적하는 투여량은 다중 투여(예를 들어, 2번, 3번, 4번, 5번, 6번, 7번, 8번, 9번, 10번, 11번, 12번, 13번, 14번 이상 투여)를 사용하여 전달될 수 있다. 다중 투여가 사용되는 경우, 본 명세서에 기재된 것과 같은 분할 투여 양생법이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 항체이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체의 치료적 유효량(즉, 효과적인 용량)은 약 0.001 내지 30 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 약 0.01 내지 25 ㎎/㎏ 체중, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 체중 및 훨씬 더욱 바람직하게는 약 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏ 내지 9 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏ 내지 8 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏ 내지 7 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏ 내지 6 ㎎/㎏ 체중의 범위이다. 당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 용량에 특정 인자가 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 치료적 유효량의 항체로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 대상체는 약 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 체중 범위의 항체로, 약 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 7주 및 훨씬 더욱 바람직하게는 약 4주, 5주 또는 6주 동안 매주 1회 치료된다. 치료에 사용되는 항체의 유효한 투여량은 특정 치료의 과정에 걸쳐 증가 또는 감소할 수 있음이 또한 이해될 것이다. 투여량의 변화는 진단 검정의 결과로 인해 발생할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "분할 용량"은 단일 단위 용량 또는 총 1일 용량을 2회 이상의 용량, 예를 들어, 단일 단위 용량의 2회 이상의 투여로 분할하는 것이다. 본 명세서에 사용되는 "단일 단위 용량"은 1회 용량/한번에/단일 경로/단일 접촉 지점, 즉, 단일 투여 이벤트로 투여되는 임의의 치료제의 용량이다. 본 명세서에 사용되는 "총 일일 용량"은 24시간 동안 제공되거나 처방된 양이다. 이는 단일 단위 용량으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 투여 형태은 액체 투여 형태일 수 있다. 비경구 투여용 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용 가능한 에멀션, 마이크로에멀션, 용액, 현탁액, 시럽 및/또는 엘릭서를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 활성 성분 이외에, 액체 투여 형태는 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대, 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-뷰틸렌 글리콜, 다이메틸폼아마이드, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로퍼퓨릴알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스터 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 소정의 실시형태에서, 조성물은 가용화제, 예컨대, CREMOPHOR®, 알코올, 오일, 변형된 오일, 글리콜, 폴리소르베이트, 사이클로덱스트린, 중합체 및/또는 이들의 조합물과 혼합될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 투여 형태는 주사용일 수 있다. 주사용 제제, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있으며, 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 용매 중 멸균 주사용 용액, 현탁액 및/또는 에멀션, 예를 들어, 1,3-뷰테인다이올 중 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매는 물, 링거 용액, U.S.P. 및 등장성 소듐 클로라이드 용액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 멸균, 고정유는 일반적으로 용매 또는 현탁 매질로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 다이글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드 고정유가 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산이 주사의 제조에 사용될 수 있다. 주사용 제형은 예를 들어, 세균성-보유 필터를 통한 여과하고/하거나 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다.
일부 실시형태에서, 정제, 당의정, 캡슐, 알약 및 과립의 고체 투여 형태는 코팅 및 셸, 예컨대, 장용 코팅 및 제약 분야에서 잘 알려진 기타 코팅으로 제조될 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있고, 활성 성분(들)만을 방출하거나 우선적으로 장관의 소정의 부분에서, 선택적으로 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 유사한 유형의 고체 조성물이 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐의 충전제로 사용될 수 있다.
세포는 대상체 체중의 킬로그램당 0.1×106, 0.2×106, 0.3×106, 0.4×106, 0.5×106, 0.6×106, 0.7×106, 0.8×106, 0.9×106, 1.0×106, 5.0×106, 1.0×107, 5.0×107, 1.0×108, 5.0×108 이상의 세포, 또는 그 사이의 임의의 범위 또는 그 사이의 임의의 값으로 투여될 수 있다. 이식된 세포의 수는 주어진 시간 동안 목적하는 생착 수준에 기초하여 조정될 수 있다. 일반적으로, 필요에 따라 1×105 내지 약 1×109　세포/체중의 ㎏, 약 1×106　내지 약 1×108　세포/체중의 ㎏ 또는 약 1×107　세포/체중의 ㎏ 이상의 세포가 이식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 평균 크기 마우스에 대해 적어도 약 0.1×106, 0.5×106, 1.0×106, 2.0×106, 3.0×106, 4.0×106 또는 5.0×106의 총 세포의 이식이 효과적이다.
세포는 주입과 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있다. 세포는 또한 다른 항암제 이전에, 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다.
투여는 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 세포를 포함하는 작용제는 직접 주사에 의해, 또는 혈관내, 뇌내, 비경구, 복강내, 정맥내, 경막외, 척추내, 흉골내, 활막내, 척추강내, 동맥내, 심장내 또는 근육내 투여를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에서 사용되는 임의의 다른 수단에 의해 목적하는 부위에 도입될 수 있다. 예를 들어, 관심 대상체는 다양한 경로에 의해 이식된 세포와 생착될 수 있다. 이러한 경로는 정맥내 투여, 피하 투여, 특정 조직에 대한 투여(예를 들어, 초점 이식), 대퇴골 골수 강으로의 주사, 비장으로의 주사, 태아 간의 신피막 아래 투여 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 암 백신은 종양 내부로 또는 피하로 대상체에게 주사된다. 세포는 한 번의 주입으로 또는 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 정의된 기간 동안 연속 주입을 통해 투여될 수 있다. 이식된 세포의 이식, 생착 평가 및 마커 표현형 분석을 위한 예시적 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Pearson et al. (2008) Curr. Protoc. Immunol. 81:15.21.1-15.21.21; Ito et al. (2002) Blood 100:3175-3182; Traggiai et al. (2004) Science 304:104-107; Ishikawa et al. Blood (2005) 106:1565-1573;　Shultz et al. (2005) J. Immunol. 174:6477-6489; 및 Holyoake et al. (1999) Exp. Hematol. 27:1418-1427] 참조).
세포-기반 요법 및 줄기 세포의 입양 세포 전달, 암 백신 및 세포-기반 요법 등과 같은 2개 이상의 세포 유형이 조합되고 투여될 수 있다. 예를 들어, 입양 세포-기반 면역요법은 본 발명에 포함된 세포-기반 요법과 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포-기반 작용제는 단독으로 또는 입양 T 세포 요법(adoptive T cell therapy: ACT)과 같은 면역요법과 같은 추가적인 세포-기반 작용제과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, CD19를 인식하도록 유전자 조작된 T 세포가 여포성 B 세포 림프종을 치료하는데 사용된다. ACT를 위한 면역 세포는 수지상 세포, T 세포, 예컨대, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포, 자연 살해(NK) 세포, NK T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 종양 침윤 림프구(TIL), 림포카인 할성화 살해(LAK) 세포, 메모리 T 세포, 조절성 T 세포(Treg), 헬퍼 T 세포, 사이토카인-유도성 킬러(CIK) 세포 및 이들의 임의의 조합일 수 있다. 방사선 조사된 자가유래 또는 동종이계 종양 세포, 종양 용해물 또는 아폽토시스성 종양 세포, 항원-제시 세포-기반 면역요법, 수지상 세포-기반 면역요법, 입양 T 세포 전달, 입양 CAR T 세포 요법, 자가유래 면역 강화 요법(autologous immune enhancement 요법: AIET), 암 백신 및/또는 항원 제시 세포를 제한 없이 포함하는 입양 세포-기반 면역요법 양식이 잘 알려져 있다. 이러한 세포-기반 면역요법은 면역 반응을 더 조절하기 위해 하나 이상의 유전자 산물을 발현, 예컨대, GM-CSF와 같은 사이토카인을 발현하고/하거나 Mage-1, gp-100 등과 같은 종양-관련 항원(TAA) 항원을 발현하도록 더 변형될 수 있다. 암세포와 같은 본 발명에 포함되는 작용제와 본 발명에 포함되는 다른 작용제 또는 다른 조성물의 비는 서로에 대해 1:1(예를 들어, 동일한 양의 2개의 작용제, 3개의 작용제, 4개의 작용제 등)일 수 있지만, 목적하는 임의의 양(예를 들어, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 이상)으로 조절될 수 있다.
이식된 세포의 생착은 종양 부피, 사이토카인 수준, 투여 시간, 이식 후 하나 이상의 시점에서 대상체로부터 수득된 관심 세포의 유세포 분석과 같지만 이들로 제한되지 않는 임의의 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28일을 대기하는 시간-기반 분석은 종양 채취를 위한 시간을 표시할 수 있다. 임의의 이러한 지표는 항암 면역요법에 대한 반응에 대한 변수의 효과를 결정하기 위해 잘 알려진 매개변수에 따라 조정될 수 있는 변수이다. 또한, 이식된 세포는 사이토카인, 세포외 매트릭스, 세포 배양 지지체 등과 같은 다른 작용제와 공동 이식될 수 있다.
X. 키트 및 장치
본 발명 또한 본 명세서에 기재된 바이오마커를 검출 및/또는 조절하기 위한 키트를 포함한다. "키트"는 본 발명에 포함되는 마커의 발현을 특이적으로 검출하고/하거나 이에 영향을 주기 위한 적어도 하나의 시약, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 임의의 제조물(예를 들어, 패키지 또는 용기)이다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 단위로 홍보, 배포 또는 판매될 수 있다. 키트는 본 발명에 포함되는 방법에 유용한 하나 이상의 작용제를 검출, 발현, 스크리닝하는 등에 필요한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 바이오마커(예를 들어, 표 1에 열거된 표적)을 검출하는 데 유용한 작용제의 조합은 바이오마커 및 이의 조절을 검출하기 위한 키트로 제공될 수 있으며, 이는 골수 염증성 표현형, 면역 반응, 항암 기능, 면역관문 요법에 대한 감수성 등을 확인하는데 유용하다. 이러한 조합은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상, 예컨대, 본 발명에 포함되는 모든 바이오마커를 포함하는 바이오마커를 검출하기 위한 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 참조 표준물질, 예를 들어, 세포 성장, 분열, 이동, 생존 또는 아폽토시스를 제어하는 신호전달 경로에 영향을 미치지 않거나 이를 조절하지 않는 단백질을 암호화하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 당업자는 일반적인 분자 태그(예를 들어, 녹색 형광 단백질 및 베타-갈락토시데이스), 유전자 온톨로지(GeneOntology) 참고자료에 의해 세포 성장, 분열, 이동, 생존 또는 아폽토시스를 포함하는 임의의 경로로 분류되지 않은 단백질 또는 보편적인 하우스키핑 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 많은 이러한 대조군 단백질을 구상할 수 있다. 키트의 시약은 개별 용기에 제공되거나 단일 용기에 2개 이상의 시약 혼합물로 제공될 수 있다. 또한, 키트 내의 조성물의 사용을 설명하는 지침 자료가 포함될 수 있다. 본 발명에 포함되는 키트는 또한 본 명세서에 제공되는 바와 같은 개시된 발명의 방법에서 개시된 발명의 키트 또는 항체의 사용을 개시하거나 설명하는 지침 자료를 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트가 설계된 특정 적용을 용이하게 하기 위해 추가적인 성분을 포함한다. 예를 들어, 키트는 추가적으로 표지를 검출하는 수단(예를 들어, 효소적 표지를 위한 효소 기질, 형광 표지를 검출하기 위한 필터 세트, 양 항-마우스-HRP 등과 같은 적절한 이차 표지) 및 대조에 필요한 시약(예를 들어, 대조군 생물학적 샘플 또는 표준물질)을 함유한다. 키트는 추가적으로 개시된 발명의 방법에 사용하기 위해 인식되는 완충액 및 기타 시약을 포함할 수 있다. 비-제한적 예는 담체 단백질 또는 세제와 같은 비-특이적 결합을 감소시키는 작용제를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항체 및 이의 항원-결합 단편과 같은 본 발명에 포함되는 조성물은 진단적 적용의 용도와 같이 성분 또는 장치와 관련될 수 있다. 비제한적인 예는 이러한 검정에 사용하기 위해 고체 표면 상에 고정된(예를 들어, 위에 기재된 바와 같이 광 또는 방사선 방출을 기반으로 하는 검출 가능한 표지에 연결 및/또는 접합됨) 항체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 "샌드위치" 또는 경쟁적 검정, 면역조직화학, 면역형광 현미경 등과 같은 면역크로마토그래피 또는 면역화학 검정의 사용에 의해 관심 바이오마커를 검출하기 위한 장치 또는 스트립과 관련이 있다. 이러한 장치 또는 스트립의 추가적인 예는 가정 테스트 또는 신속한 현장 진료 테스트를 위해 설계된 것들이다. 추가의 예는 단일 샘플에서 다중 분석물의 동시 분석을 위해 설계된 것들이다. 예를 들어, 표지되지 않은 본 발명의 항체는 생물학적 샘플에서 바이오마커 폴리펩타이드를 "포획"하기 위해 적용될 수 있고, 포획된(또는 고정된) 바이오마커 폴리펩타이드는 검출을 위해 본 발명의 항-바이오마커 항체의 표지된 형태에 결합될 수 있다. 예를 들어, 면역확산, 면역전기영동, 면역조직병리학, 면역조직화학 및 조직병리학에 기초함 검정을 포함하는 면역검정의 다른 표준 실시형태는 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 포함되는 다른 실시형태가 하기 실시예에 기재된다. 본 발명은 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 기재된다.
실시예
실시예 1: LRRC25는 T 세포의 제한된 서브세트와 함께 인간 골수성 세포에서 우세하게 발현된다
말초 면역 세포의 집단에 대한 LRRC25의 발현을 특성화하기 위해, 살아 있는 세포를 PBMC 집단으로부터 수득하고, 유세포 분석을 사용하여 세포 표면에서 LRRC25 단백질 발현에 대해 분석하였다. 유세포 분석을 위해, 세포를 수집하고, 50㎕의 FACS 완충액(2.5% FBS 및 0.5% 소듐 아자이드를 포함한 PBS)에 재현탁하고, 얼음 위에서 TruStain FcX™(바이오레전드(Biolegend) Cat. No. 422302)로 15분 동안 차단시켰다. 항체를 제조업체의 지침에 따라 FACS 완충액에 희석하고, 얼음 위에서 15분 동안 세포에 첨가하였다. 표지된 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 분석 분석을 위해 PBS와 2% 파라폼알데하이드로 Attune™ 유세포 분석기(써모피셔) 상에 고정하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 통해 분석하였다. 대조군으로서 그리고/또는 유세포 분석에 사용된 시약 항체는 아래 표 3에 나타나 있다.
Figure pct00015
건강한 PBMC를 분석하는 것 외에도, 질환 부위에서 LRRC25의 발현을 결정하는 것이 중요하다. 이를 위해, 부인과 종양 및 고체 종양으로부터의 복수액과 같은 세포 공급원을 이용하였다. 종양의 분석을 수행하기 위해, 각 종양을 먼저 단일 세포 현탁액으로 준비하였다. 종양을 2 내지 4㎣의 작은 조각으로 절단하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 종양 해리 키트 효소 믹스(엠에이씨에스 밀텐이 바이오텍(MACS Miltenyi Biotec))를 제조하였다. 종양 조각 및 해리 효소를 5㎖의 스냅록 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 직선 가위를 사용하여 조직을 다졌다. 튜브를 200 내지 250rpm으로 37℃에서 45분 내지 1시간 동안 진탕기에 두었다. 인큐베이션 시간이 끝나면, 분해된 종양을 40μM의 세포 여과기를 통해 50㎖ Falcon™ 원추형 원심 분리 튜브로 여과하였다. 각 튜브를 차가운 2% 내지 5% FBS/PBS 혼합물로 채워 분해를 중단하였다. 나머지 단계는 모두 얼음에서 수행하였다. 특히, 각 튜브를 300xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포를 차가운 2% 내지 5% FBS/PBS 혼합물로 2회 세척하였다. 마지막 세척 후, 세포를 1㎖ 내지 5㎖의 차가운 2% 내지 5% FBS/PBS 혼합물에 재현탁시키고 세포 계수를 수행하였다. 유세포 분석을 위에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 1은 상단에 생성된 LRRC25 발현이 가장 높은 LRRC25의 발현에 기반한 인간 암(TCGA, 암 게놈 지도(The Cancer Genome Atlas), 2017 버전, 오믹소프트/퀴아젠에 의해 가공 및 배포됨)의 대규모 공개 데이터세트의 암 유형에 걸친 대식세포-침윤 종양의 순위 분포를 보여준다. 종양 침윤은 컷오프 위의 표준 골수성 마커 CD11b의 존재에 의해 측정된다. 컷오프는 데이터세트의 모든 원발성 종양에 걸친 CD11b mRNA 발현 분포의 첫 번째 사분위수로 정의된다. 이러한 LRRC25-양성 대식세포-침윤 종양은 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 따른 조절에 특히 유용한 것으로 여겨진다.
실시예 2: 인간 LRRC25에 대한 뮤린 항체의 생성
마우스의 면역화에 이어 파지 디스플레이 Fab 라이브러리 생성 및 마우스 면역 라이브러리의 스크리닝에 의해 뮤린 항-인간 LRRC25 항체를 생성하였다.
2마리의 Balb/c 마우스를 His-태그된 인간 LRRC25 세포외 도메인 단백질, 인간 LRRC25-His(서열번호 6)로 복강내로 면역화하고, His-태그된 사이노몰구스 원숭이 LRRC25 세포외 도메인 단백질, cyno LRRC25-His (서열번호 7)의 최종 부스트를 투여하였다. 림프절 및 비장을 수확하고, 단일 세포 현탁액으로부터 추출된 총 RNA로 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 구성하였다(라이브러리 생성 및 스크리닝은 페어저니 바이오로직스(FairJourney Biologics; 포르투갈 포르토 소재)에서 수행함). 간략하게는, 마우스 가변 영역 특이적 프라이머를 이용하여 총 RNA로부터 PCR 증폭을 통해 각각의 면역화된 마우스에 대해 개별 Fab 중쇄 및 카파 경쇄 라이브러리를 구축한 후, pCB3 파지미드로 클로닝하였다. Fab 중쇄 하위-라이브러리를 경쇄 라이브러리로 클로닝하여 전장 Fab를 생성함으로써 각 마우스에 대한 Fab 라이브러리를 구축하였다.
바이오티닐화된 인간 LRRC25-His 및 바이오티닐화된 인간 LRRC25-Fc(서열번호 8) 단백질에 대해 2라운드의의 용액내 파지 디스플레이 선택을 수행한 후, CHO-K1 세포(LRRC25-CHO)에서 발현된 전장 인간 LRRC25(서열번호 9)에 대한 최종 선택 라운드를 거쳐 세포 상에서 발현된 LRRC25를 또한 인식하는 결합제를 단리하였다. 병행 접근법으로, 파지 디스플레이 선택의 두 번째 라운드에서, 강화된 라이브러리를 사이노몰구스 원숭이 LRRC25 세포외 도메인 단백질 - cyno LRRC25-His 및 cyno LRRC25-Fc(서열번호 10)에 대해 패닝한 후, 인간 LRRC25-CHO 세포에 대한 최종 선택 라운드를 수행하였다.
모든 항원에 대한 세포 결합 선택의 결과로부터 클론 스크리닝을 위해 농축된 Fab를 선택하였다. 유세포 분석에 의해 LRRC25-CHO 세포에 대한 결합에 대해 Fab 클론의 대장균 주변세포질 추출물을 스크리닝하고, 세포 결합제를 시퀀싱하여 고유한 클론을 결정하였다. ELISA에 의해 플레이트-고정된 인간 LRRC25-Fc 및 cyno LRRC25-Fc에 대한 결합에 대해 고유한 Fab를 대장균 주변세포질 추출물로서 스크리닝하였다.
항체 생성 과정에서 사용된 펩타이드 및 폴리펩타이드의 서열은 아래 표 4에 기재되어 있다.
Figure pct00016
일부 항체가 마우스 가변 영역 및 카파 경쇄와 쌍을 이루는 S228P 중쇄 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4 골격을 갖는 마우스/인간 키메라로 발현되었다. 가변 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 서열을 표 5에 나타낸 항체 불변 영역 서열을 포함하는 벡터에 클로닝하였다. 표 5는 또한 람다 경쇄와 쌍을 이루는 것이 유용한 경우 사용될 수 있는 대표적인 인간 람다 경쇄 영역을 열거한다.
Figure pct00017
중쇄- 및 경쇄-함유 독점 벡터를 현탁액-적합화된 HEK293 세포로 일시적 형질감염시킴으로써 ATUM(뉴왁, 캐나다)에 의해 단백질 발현 및 정제를 수행하였다. 세포 배양 상청액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 용리되고, 중성화된 단백질을 PBS(pH 7.4)로 완충액 교환하고, 필터 멸균하였다. 정제된 항체를 일차 아미노산 서열에서 계산된 흡광 계수를 사용하여 OD280에 의해 정량화하였다. 정제된 항체는 모세관 겔 전기영동, HPLC-SEC 및 내독소 수준으로 특징지어진다.
실시예 3: 단핵구 및 대식세포 검정을 사용한 단핵구 및/또는 대식세포 염증성 표현형 증가에 대한 항-LRRC25 항체의 검증
인간 대식세포는 전-염증성(M1-유사, 제1형으로도 지칭됨)에서 전-종양성/항-염증성(M2-유사, 제2형으로도 지칭됨)가지의 분화 스펙트럼을 따라 존재한다(예를 들어, 문헌[Biswas et al. (2010) Nat. Immunol. 11: 889-896; Mosser and Edwards (2008) Nat. Rev. Immunol. 8:958-969; Mantovani et al. (2009) Hum. Immunol. 70:325-330]). 이러한 기능 스펙트럼에 따라, 대식세포는 여러 다른 특징을 변경하는 것 외에도 이들의 표면 마커 발현 및 형태를 변경한다. 이러한 마커가 일차 인간 대식세포에서 이러한 스펙트럼을 따라 어떻게 변하는지 이해하는 것은 종양(종양-관련 대 식세포) 및/또는 염증이 있는 조직과 같은 주어진 면역학적 환경에 어떤 세포가 존재하는지 이해하고 이러한 대식세포가 이러한 조직 내 면역 반응에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 데 중요하다. CD163, CD16 및 CD206을 포함하는 소정의 세포 표면 마커는 전통적으로 대식세포 하위유형을 분류하는데 사용되었다.
이러한 분화된 상태에 따라, 대식세포는 면역 반응을 유도 또는 억제하도록 생물학적으로 최적화된다. 따라서, 항체를 통해 대식세포의 표면에서 LRRC25을 표적화하는 것은 면역 반응의 개시, 억제 및/또는 영속화를 변경할 수 있게 할 것이다.
본 명세서에 기재된 각각의 단핵구/대식세포 세포-기반 실험을 위해, 세포주를 사용한 것과는 반대로, 단리된 세포 유형을 갖는 임의의 시험관내 실험적 시스템이 허용하는 가장 가까운 가능한 방식으로 생체내의 기존의 세포를 모방한 생물학적 특성을 재현하기 위해 일차 인간 단핵구/대식세포 및/또는 PBMC를 사용하였다. 특히, 이 시스템은 일차 세포의 천연의 생물학적 특성을 연구할 수 있는 기회를 제공하고, 상이한 유전적 및 환경적 노출된 상이한 공여체로부터 발생하는 천연의 다양성에 대한 접근을 제공한다. 따라서, 분석 결과를 해석할 때 인간 집단 간의 천연의 유전 적 및 면역학적 가변성을 고려하는 것이 중요하다.
실시예 2에 기술된 항체는 기능적 검정에 이용되었다. 대식세포 분화 상태에 대한 이러한 항체의 효과는 사이토카인 분비 및 복잡한 다세포 검정에서 공동 면역 반응을 영속화하는 능력과 같은 기타 기능적 특성을 포함하는 판독에 의해 측정하였다.
예를 들어, 도 2는 대식세포 기능 검정에 이용된 표 2에 열거된 항체의 결과를 보여준다. 단핵구는 시험관내에서 M1-유사(제1형) 및/또는 M2-유사(제2형) 표현형으로 분화시켰다(문헌[Ries et al. (2014) Cancer Cell 25:846-859; Vogel et al. (2014) Immunobiol. 219:695-703]). 단핵구를 M2 대식세포 단핵구로 구별하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 RosetteSep™ 인간 단핵구 농축 칵테일(스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies), 캐나다주 밴쿠버 소재)을 사용한 피콜 분리에 의해 건강한 공여자의 전혈에서 단핵구를 단리하였다. 단리된 단핵구를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 IMDM 배지에서 밤새 24- 또는 96-웰 플레이트에 배열하고, 24시간 후에 부착되지 않은 세포를 세척하였다. 단핵구를 IMDM 10% FBS와 M2 대식세포의 경우 50 ng/㎖ 인간 M-CSF)에서 6일 동안 배양하여 대식세포로 분화시켰다. 6일 후, M2 대식세포를 20 ng/㎖의 IL-10으로 분극화시키고, 제7일에 100 ng/㎖의 LPS로 활성화하였다.
표 3 및 표 5에 열거된 단일클론 항체를 배양 7일째에 10 ㎍/㎖의 최종 농도로 투여하였다. 위의 실시예 2에서 생성된 항체에 대해 기재된 바와 같이 클로닝하고, 발현된 표 3 및 표 5에 열거된 것들로부터 선택된 일부 상업적으로 이용 가능한 항체뿐만 아니라 단일클론 항체를 대조군으로서 유사하게 투여하였다.
제8일에, 세포 사이토카인 및 케모카인을 측정하여 특정 mAb가 대식세포의 전-염증성 또는 항-염증성 특성을 변경하는 능력을 평가하였다. 상청액으로부터의 사이토카인을 제조업체의 프로토콜에 따라 루미넥스 패널(써모 피셔, 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 측정하였다. 발광을 Cytation™ 5 이미징 판독기(바이오텍(Biotek), 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 검출하였다. 데이터는 적어도 3명 내지 4명의 건강한 공여자를 대표한다.
대식세포는 다양한 사이토카인 및 케모카인을 생산한다. 예를 들어, M1 대식세포는 GM-CSF, IL-12 및 TNF-알파를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 더 많은 전-염증성 사이토카인을 생산하는 반면, M2 대식세포는 더 많은 종양형성성 및 면역억제성 사이토카인, 예컨대, VEGF, IL-10 및 TGFb를 생산한다. 이러한 검정을 통해, 대식세포는 강력한 사이토카인 IL-10 및 M-CSF의 존재를 통해 M2 표현형으로 강력하게 유도된다. 1A01, 4A03 등과 같은 다중 mAb는 IL-12 및 TNFα와 같은 전-염증성 사이토카인 또는 생성을 입증한 바와 같이 이러한 M2 대식세포를 보다 M1-유사 상태로 유도할 수 있었다. 도 2는 또한 분석된 다른 사이토카인 간의 변화의 일치를 보여준다. 이들 도면은 또한 M2 대식세포의 기능적 특징을 보다 M1-유사 상태로 변경하는 항-LRRC25 항체의 능력을 추가로 입증한다. 중요하게는, 분화를 겪고 있는 이러한 검정 내의 세포는 검정 전체를 통해 강력한 스큐잉 조건의 존재하에 남아 있다. 또한, 항체는 배양물에 24시간 동안만 존재하였다. 이는 위에 나타낸 바와 같이 세포가 이미 M2 스펙트럼을 따라 어느 정도 분화될 것으로 알려진 종양과 같은 질환 환경을 더 잘 나타낸다. 이 제한된 기간 동안에도 mAb는 전염증성 사이토카인의 증가에 의해 입증된 바와 같이 M2 대식세포의 보다 M1-유사 상태로의 분극화에 극적으로 영향을 미칠 수 있었다. 이러한 검정의 까다로운 분극화 조건을 고려하더라도, 이 검정에서 mAb는 GM-CSF, IL-12, TNFa, IL-10, CXCL9, CCL-4 및 IL-1b를 포함한 하나 이상의 사이토카인의 50% 이상의 변화 및/또는 IL-10의 50%의 감소를 유도할 수 있는 경우, M2-유사 대식세포를 M1-유사 대식세포로 기능적으로 전환할 수 있는 것으로 간주하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 대부분의 mAb는 사이토카인 또는 케모카인 중 하나의 변화에 영향을 미칠 뿐만 아니라 여러 변화에 영향을 미친다. 또한, 도 2는 항-LRRC25 항체가 M2 대식세포의 기능적 특징을 역전시켜 M1과 보다 유사하게 만드는 능력을 보여준다.
실시예 4: 복합 면역 세포 검정을 사용한 단핵구 및/또는 대식세포 염증성 표현형 증가에 대한 항-LRRC25 항체의 검정
대식세포가 종양 면역원성을 유도하거나 자가면역 및 염증성 장애의 과정을 역전시키기 위해서는, 일반적으로 협동 면역 반응을 유도하거나 차단할 수 있어야 한다. 여기에는 골수성 및 림프성 세포 둘 다에 대한 직접 및 하류 효과가 포함될 수 있다. 이러한 효과를 분석하기 위해서는 림프성 및 골수성 계통 둘 다의 일차 세포로 구성된 복합 다세포 검정이 필요하다.
스타필로코커스 내독소 B(Staphylococcal enterotoxin B: SEB) 검정 시스템을 이용하여 본 명세서에 기재된 검증된 표적이 통합 면역 반응을 유도하는 능력을 입증하였다. 이러한 검정은 연구하기에 가장 자연적인 세포이며 인간 질환과 같은 생체내 질환에 대한 최고의 예측력을 가진 일차 인간 세포를 활용한다. 이러한 검정 자연적으로 백그라운드 활성 및 반응의 진폭 모두에서 공여자마다 높은 가변성을 갖는다.
SEB 검정의 경우, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll® 분리에 의해 신선한 공여자의 혈액에서 단리, 장기 보관을 위해 -150℃에서 90% 소 태아 혈청 (FBS), 10% DMSO에 냉동하였다. PBMC를 10% FBS, 50nM 2-머캅토에탄올, 비-필수 아미노산, 1mM 소듐 피루베이트 및 10mM HEPES를 함유하는 완전 RPMI 배지로 해동하였다. 다음으로, 완전한 RPMI로 96-웰 플레이트의 각 웰에 200,000개의 세포를 플레이팅하였다. 항-인간 PD-1 펨브롤리주맙(머크, KEYTRUDA®®, MK-3475)을 5 ㎍/㎖로 첨가하고, 실시예 1에 기재된 다른 항체를 표시된 농도로 첨가하였다. 세포와 mAb를 37℃에서 30분 동안 배양하고, 포도상 구균의 장 독소 B(SEB)(이엠디 밀리포어, 매사추세츠주 빌레리카 소재)를 최종 농도 0.1 ㎍/㎖로 첨가하였다. 활성화 4일 후, 상청액을 수집하고 -20℃에서 냉동하였다. 다중-매개변수 ProcartaPlex™ 검정(써모피셔 사이언티픽)을 사용하여 사이토카인 농도를 측정하였다. 데이터는 적어도 4명 내지 6명의 건강한 공여자를 나타낸다. 중요하게는, SEB 검정은 단핵구를 포함하며, 특히 검정의 초기 단계에서 검정의 시작시에 대식 세포는 거의 없거나 또는 전혀 없기 때문에, SEB 검정에서 세포의 항체 처리는 단핵구에 영향을 미치므로 검정 결과에 영향을 미칠 것이다.
이 검정에서, 항-LRRC25 항체가 다세포 면역 반응에 영향을 미칠 수 있음이 입증되었다. 이러한 일관 다세포 반응에는 이전에 입증된 바와 같이 골수 세포의 기능뿐만 아니라 림프 세포, 특히 T 세포의 기능적 결과물을 변경하는 것도 포함된다. 이 검정에서, mAb는 GM-CSF, IL-12, TNFa, IL-10, CXCL9, CCL-4, IL-1b 및/또는 IFNg를 포함하는 사이토카인 중 하나 이상에서 50% 이상의 변화를 유도할 수 있는 경우 기능적인 것으로 간주하였다. 도 3은 SEB 검정으로부터 분비된 사이토카인 수준을 보여준다. mAb로 처리하면 골수-유래 사이토카인 및 케모카인(예를 들어, IL-1B, GM-CSF 및 CCL4) 및 T 세포 유래 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFNγ 및 IL-10)의 생산이 변경되었다. 중요하게는, 이러한 항-LRRC25 mAb의 능력은 SEB 검정 내에서 면역 종양학 및 강력한 활성제에서 승인된 요법인 KEYTRUDA®와 비교되었다. 도 3은 항-LRRC25 mAb가 KEYTRUDA® 처리된 샘플의 효과와 같거나 또는 이를 초과할 수 있음을 보여준다.
위의 실시예 3에 기술된 대식세포 단독 검정에서와 같이, 결과는 3C01 및 1H04 등과 같은 mAb가 대식세포를 보다 전-염증성 M1-유사 상태로 유도하고, 복합 다세포 면역 세포 검정에서 일관된 효과를 나타내며, 증가 전-염증성 사이토카인을 증가시킴을 명확하게 보여준다.
실시예 6: LRR 특이성에 대한 항-LRRC25 항체의 생물물리학적 특성화
인간 LRRC25에 대한 항-LRRC25 항체의 상대적 결합 강도 및 사이노몰구스 원숭이 LRRC25와의 교차 반응성을 확립하기 위해, 항체 결합 곡선 분석을 수행하고 플레이트-고정된 재조합 인간 및 cyno LRRC25 단백질에 대한 EC50 값을 결정하였다.
웰당 1 ㎍/㎖/100㎕의 PBS(pH 7.4) 중 인간 LRRC25-His 또는 cyno LRRC25-His를 고결합 미세역가 웰을 4℃에서 밤새 코팅하여 전형적인 ELISA를 수행하였다. 항-인간 LRRC25 항체(2A3, 엘에스 바이오(LS Bio), LS-C174039-100) 및 항-HIS-HRP(밀테니 바이오텍; 130-092-783)을 각각 인간 및 cyno LRRC25 단백질에 대한 코팅 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 세척 완충액(0.05% tween 20을 함유하는 PBS(pH 7.4))으로 3회 세척하고, PBS(pH 7.4) 중 차단 완충액(4% 탈지유(마블(Marvel); 3021601)으로 실온에서 2시간 동안 즉시 차단하였다. 항-LRRC25 항체를 500nM로 첨가(웰당 100㎕)하고, 검정 완충액(PBS(pH 7.4) 중 1% 탈지유)에 3-배 연속 희석하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 검정 완충액 중 HRP-접합 2차 항체를 첨가하고[웰당 100㎕; 염소 항-인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치, cat# 715-035-150)], 플레이트를 이전과 같이 인큐베이션하였다. 플레이트-고정된 LRRC25(ECD)-HIS에 결합된 항체를 HRP 기질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB); 이바이오사이언스; 00-4201-56); 100㎕/웰)을 사용하여 A450㎚에서 결정하였다.
도 4는 플레이트-고정된 인간 및 cyno LRRC25-HIS 단백질에 대한 3개의 항-LRRC25 항체(mAb 1E01, 2D09 및 3A08)에 대한 대표적인 결합 곡선을 보여준다. 항체는 약 1.0nM(mAb 1E01 및 2D09) 내지 약 50nM(mAb 3A08) 범위의 EC50으로 인간 LRRC25-HIS에 결합하였다. 대조적으로, mAb 2D09는 고정된 cyno 단백질(EC50 = 약 0.7nM)에 가장 단단하게 결합하였고, mAb 1E01은 중간의 결합력(avidity)(EC50 약 80nM)을 보였으며, mAb 3A08은 전혀 결합하지 않았다. 플레이트-고정된 인간 LRRC25-HIS에 대한 기능적 항-LRRC25 항체에 대한 EC50 값은 0.4nM 내지 약 1uM 범위의 값으로 표 6에 나타나 있다. 10개의 항체가 0.6nM 내지 1uM 범위의 EC50으로 cyno LRRC25-HIS 단백질과 교차반응하였다(표 6).
Figure pct00018
실시예 7: 중첩 펩타이드를 갖는 항-LRRC25 항체의 에피토프 매핑
기능적 키메라 항-LRRC25 항체가 LRRC25의 특정 영역을 인식하는지 확인하기 위해, 10개의 플레이트-고정된 16-머 내지 20-머 중첩 LRRC25(ECD) 바이오틴 펩타이드를 사용하여 ELISA 실험을 수행하였다(표 7). 바이오티닐화된 인간 LRRC25-His를 양성 대조군으로 사용하였다. 웰당 3 ㎍/㎖/25㎕의 PBS 중 스트렙타비딘(잭슨 이뮤노리서치, Cat. #016-030-084)을 반면적 고결합 미세역가 웰(코닝 Cat. #3690)에서 4℃에서 밤새 코팅하여 전형적인 ELISA를 수행하였다. 플레이트를 세척 완충액(0.05% tween 20을 함유하는 PBS(pH 7.4))으로 3회 세척하고, 차단 완충액[3% BSA (밀리포어시그마, Cat. #126593) in PBS(pH 7.4)]으로 37℃에서 1시간 동안 즉시 차단하였다. 바이오틴 펩타이드 또는 바이오티닐화된 인간 LRRC25-His 단백질을 검정 완충액(0.05% tween 20을 함유하는 차단 완충액)에 이중으로 첨가(웰당 2 ㎍/㎖/25㎕)하고, 플레이트를 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 검정 완충액 중 20nM의 항-LRRC25 항체를 적절한 웰에 이중으로 첨가하고, 플레이트를 이전과 같이 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 검정 완충액 중 HRP-접합된 2차 항체를 첨가하고[웰당 25㎕; 염소 항-인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치, Cat. #715-035-150)] 이전과 같이 인큐베이션하였다. 플레이트-고정된 펩타이드(들) 또는 단백질에 결합된 항체를 HRP 기질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB); 이바이오사이언스; Cat. #00-4201-56); 100㎕/웰)을 사용하여 A450㎚에서 결정하였다.
표 8운 23개의 기능적 항체 중 10개가 LRRC25(96-115) 펩타이드를 특이적으로 인식하였을 보여주며, LRRC25의 이러한 아미노산 스트레치가 확인된 모든 기능적 항체 의 거의 절반에 결합하는데 중요하였음을 나타낸다. 특히, 후자의 펩타이드는LRRC25의 류신 반복부 도메인 3(LRR3; 86번 내지 107번 잔기)으로 구성된 잔기의 절반을 포함하였다. 나머지 13개의 항체 중 12개는 10개의 중첩 LRRC25(ECD) 바이오틴 펩타이드 중 어떠한 것도 인식하지 못했으며, 이는 이러한 항체가 입체형태 에피토프를 인식하였음을 나타낸다. MAb 2D09는 LRR2 도메인의 22개의 아미노산 잔기 중 15개를 포함하는 펩타이드인 LRRC25(81-100) 펩타이드와 특이적으로 반응하였지만, 바이오티닐화된 LRRC25 단백질과의 결합에 대한 것보다 약 4-배 더 낮은 검정 신호를 나타낸다.
Figure pct00019
Figure pct00020
생물학적 기탁
본 발명의 대표 물질은 2019년 6월 20일에 버소 테라퓨틱스 인코포레이션(버소 테라퓨틱스 인코포레이션)에 의해 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)에 기탁되었다. 특히, "1F01"(PTA-126025) 및 "3C01"(PTA-126026)의 이름을 가진 단일 클론 항체가 개별 기탁으로 기탁되었고, 표 2 및 실시예에 나타낸 특성을 확인하였으며, 특허 절차 및 그에 따른 규정을 목적으로 하는 미생물 기탁에 대한 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(부다페스트 조약)의 조항에 따라 버소 테라퓨틱스 인코포레이션에 의해 2019년 6월 20일 ATCC에 기탁되었다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 유효한 기탁의 유지를 보장한다. 기탁은 부다페스트 조약의 조건에 따라 ATCC에 의해 제공되며, 버소 테라퓨틱스 인코포레이션과 ATCC 사이의 계약에 따라 해당 미국 특허 또는 관련 미국 특허의 발행시 대중에게 영구적이고 제한되지 않은 기탁의 이용 가능성을 보장한다. 미국 또는 외국 특허 출원 중 먼저 도래하는 것이 공개될 때, 35 U.S.C. 섹션 122 및 이에 따른 위원의 규칙에 따라 미국 특허 및 상표 국장이 결정한 기탁의 이용 가능성을 보장한다(886 OG 638에 대한 특정 참조와 함께 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함).
본 출원의 양수인은 기탁이 소실되거나 파기되어야 할 경우, 해당 물질은 통지하는 즉시 동일한 다른 것으로 대체될 것이라는 데 동의하였다. 이러한 기탁은 공인된 기탁소에 보관되며, 돌연변이, 생존 불가능 또는 파괴의 경우 기탁소가 가장 최근에 샘플의 반출 요청을 받은 후 적어도 2년 동안, 또는 기탁일로부터 적어도 30년 동안 또는 관련 특허의 집행 가능한 기간 중 가장 긴 기간 동안 대체될 것이다. 이러한 세포주의 대중에 대한 이용 가능성에 대한 모든 제한은 출원에서 특허가 발행되면 취소 불가능하게 제거된다. 기탁된 물질의 이용 가능성은 특허법에 따라 임의의 정부의 권한하에서 부여된 권리를 위반하여 발명을 실시할 수 있는 라이센스로 해석되어서는 안 된다.
참조에 의한 원용
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그 전문이 참조에 의해 원용된다. 상충되는 경우, 본 명세서에 정의된 정의를 포함하는 본 출원이 우선한다.
또한 월드 와이드 웹 상의 게놈 연구소(The Institute for Genomic Research: TIGR) 및/또는 월드 와이드 웹 상의 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)에 의해 유지되는 것과 같은 공개 데이터베이스의 항목과 관련된 수탁 번호를 참조하는 모든 폴리 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 그 전체가 참조에 의해 원용된다.
등가물 및 범위
본 발명에 포함되는 하나 이상의 실시형태의 세부 사항은 위의 설명에 기재되어 있다. 바람직한 물질 및 방법이 위에 기재되었지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 물질 및 방법이 본 발명에 포함되는 실시형태의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있다. 본 발명과 관련된 다른 특징, 목적 및 이점은 설명으로부터 명확하다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 위에 제공된 본 설명이 우선한다.
당업자는 일상적인 실험, 본 명세서에 기재된 본 발명에 포함되는 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 사용하여 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명에 포함되는 범위는 본 명세서에 제공된 설명으로 제한되지 않으며, 이러한 등가물은 첨부된 청구범위에 포함되도록 의도된다.
단수 표현은 반대로 지시되거나 문맥에서 달리 명확하지 않는 한, 단수 표현의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다. 하나 이상의 그룹의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 그룹 구성원 중 하나, 둘 이상 또는 모든 구성원이 상반되는 것으로 표시되거나 문맥에서 달리 명확하지 않는 한 주어진 제품 또는 프로세스에 존재하거나, 사용되거나 또는 달리 관련되는 경우 충족된 것으로 간주된다. 본 발명은 그룹의 정확히 하나의 구성원이 주어진 제품 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련되는 실시형태를 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 또는 전체 그룹 구성원이 주어진 제품 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련되는 실시형태를 포함한다.
또한, 용어 "포함하는"은 개방적이며 허용되는 것으로 의도되지만, 추가적인 요소 또는 단계를 포함할 필요가 없다는 점에 유의한다. 용어 "포함하는"이 본 명세서에서 사용되는 경우, 따라서 용어 "이루어지는"도 또한 포함되고 개시된다.
범위가 제공되는 경우, 종료 지점이 포함된다. 또한, 달리 표시되지 않거나 또는 문맥 및 당업자의 이해로부터 명확하지 않는 한, 범위로 표현되는 값은 본 발명은 문맥상 명확히 달리 명시하지 않는 한, 범위의 하한의 단위의 10 분의 1까지 본 발명에 포함된 다른 실시형태에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 추정할 수 있음이 이해되어야 한다.
또한, 종래 기술에 속하는 본 발명에 포함되는 임의의 특정 실시형태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명시적으로 배제될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 실시형태는 당업자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 본 명세서에서 배제가 명시 적으로 기재되지 않더라도 배제될 수 있다. 본 발명에 포함되는 조성물의 임의의 특정 실시형태(예를 들어, 임의의 항생제, 치료 또는 활성 성분, 임의의 생산 방법, 임의의 사용 방법 등)는 선행 기술의 존재와 유무와 관련 없이 임의의 이유로 임의의 하나 이상의 청구항에서 배제될 수 있다.
사용된 단어는 제한이 아니라 설명을 위한 단어이며, 더 넓은 측면에서 본 발명에 포함된 진정한 범위 및 정신을 벗어나지 않고 첨부된 청구범위의 범위 내에서 변경이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명이 여러 기재된 실시형태에 대해 어느 정도 상세하게 설명되었지만, 이러한 특정 또는 실시형태 또는 임의의 특정 실시형태로 제한되어야 하는 것은 아니지만, 이는 종래 기술의 관점에서 그러한 청구범위의 가능한 가장 넓은 해석을 제공하고 따라서 본 발명에 포함되는 의도된 범위를 효과적으로 포함하도록 첨부된 청구범위를 참조하여 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> VERSEAU THERAPEUTICS, INC. <120> ANTI-LRRC25 COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING MYELOID CELL INFLAMMATORY PHENOTYPES AND USES THEREOF <130> WO2020263650 <140> PCT/US2020/038115 <141> 2020-06-17 <150> 62/867,593 <151> 2019-06-27 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2430 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccagaggaa cgccagcgac cccagcagcg ctgcggacgg tgctggccgt ggccgctgcg 60 gcccccgtgt ccaggtgggc caggacgcag cctctgggcg ccgtcgcttt tccagcatcg 120 cagaggcaaa agcgtggcag tgggacccaa aaggtaggac tgaggctcta gaacttgcac 180 ctgtgcaggg actgcaaacc agacctggga ggaccctttc agcagccccc actccaccct 240 atcccaggac ttcccagcga cccgccgttc tgggagatac cgggagcgtg atcagggggc 300 ggggccgttt ccaaggcaac cgcttatttg catagggtcc cgtcctggcc aacgagggcg 360 ccccaaatgt tcaggacata gaagaagggg ttaactggcc cggatctcct cctcgccttc 420 caagcccgct aagcactggg gttatctacc cattccccag aaggggagac tgaggcagcc 480 caccagccaa aggaggcgac cagactgggg ctgcgtttta ccatttcaga agcggcttga 540 gctggtctga gctataataa taaacactgg cggtggaggc gagggcgacc acagggctga 600 ggtcagggct aggattccgg tgtctctacg taggttgctt gaatgggggg caccctggca 660 tggacgctgc tgttgccgct gctgctgcgg gagtcagaca gcctagaacc gtcgtgcacc 720 gtgtcctccg cggatgtgga ctggaacgcg gagttcagtg ccacgtgcct gaatttcagt 780 ggcctcagcc tgagcctgcc tcacaaccag tctctgcggg ccagcaacgt gattctcctt 840 gacctgtctg ggaacggcct gcgagagctt ccagtgacct tctttgccca cctgcagaag 900 cttgaggtcc tgaacgtgct acgcaacccc ttgtctcgtg tggatggggc gctggccgcc 960 cgctgtgacc ttgacctgca ggccgactgc aactgtgccc tggagtcctg gcacgacatc 1020 cgccgagaca actgctctgg ccagaagcct ctgctctgct gggacacaac cagctcccag 1080 cacaacctct ctgccttcct ggaggtcagc tgcgcccctg gcctggcctc tgcaactatc 1140 ggggcagtgg tggtcagcgg gtgcctgctt cttggacttg ccatcgctgg ccctgtgctg 1200 gcctggagac tctggcgatg ccgagtggcc agaagccggg agctgaacaa accctgggct 1260 gctcaggatg ggcccaagcc cggtttaggc ttgcagccac ggtacggcag ccggagcgcc 1320 cccaagcccc aagtggccgt gccatcctgc ccctccactc ccgactatga gaacatgttt 1380 gtgggccagc cagcagccga gcaccagtgg gatgaacaag gggctcaccc ttcagaggac 1440 aatgactttt acatcaacta caaggacatc gacctggctt cccagcctgt ctactgtaac 1500 ctgcagtcac tgggccaggc cccaatggat gaagaggagt acgtgatccc cgggcactga 1560 gcctaagatg tcctaacctc cacccagaac cccttcagtc cctgctgggt gactcagggc 1620 gtcctaacgc ctccatggcc tcagtttccc catctgaaga atgggtacag gaaaggattg 1680 tccttgaggc cccaggaagc tctgccgccc cctccctgtc cctcatgccg ctcctcagct 1740 ccctcagctc ctagaggggg aagaggagag acccccaaca aggggacagg acggtcactg 1800 tgccaatcct gtcatcaccc tcctgtggat gtacaggcag tgctcaataa atgcttcgag 1860 gctgatgagg ctgctggctc agggtgcgtg ggttcctcaa ggtggggatt tctgagttct 1920 aagaccaagt ctccatctga gactcccaaa ttgctcccca cctcccatcc ctgttttttt 1980 ttgttgttgt tgtttgtttg tttgtttttg aaactgagtg tcactctgtc acccaggctg 2040 gagtgcaatg ctgcggtctc agctcactgc aacctccgcc tcctgggttc aagtgattct 2100 cctgcctcag cctcctgagt agctgggatt acagcacccg ccaccatgcc gagctaattt 2160 ttgtatttat aatagagatg gggtttcgcc atgttggcca ggctggtctc gaactcctga 2220 cctcaagcga tctgcccgcc tcggcctcct gaagtgctgg gattacaggc gtggccactg 2280 cgcccaggca cattcctccc ttctgcccct ctcagggccc cttcccaggt ccctgatctc 2340 caggcttggc ctccagagca gcccacacca accccaaaat aaaaaaatgt atatattcct 2400 ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2430 <210> 2 <211> 305 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Gly Thr Leu Ala Trp Thr Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg 1 5 10 15 Glu Ser Asp Ser Leu Glu Pro Ser Cys Thr Val Ser Ser Ala Asp Val 20 25 30 Asp Trp Asn Ala Glu Phe Ser Ala Thr Cys Leu Asn Phe Ser Gly Leu 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Pro His Asn Gln Ser Leu Arg Ala Ser Asn Val Ile 50 55 60 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Asn Gly Leu Arg Glu Leu Pro Val Thr Phe 65 70 75 80 Phe Ala His Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Asn Val Leu Arg Asn Pro 85 90 95 Leu Ser Arg Val Asp Gly Ala Leu Ala Ala Arg Cys Asp Leu Asp Leu 100 105 110 Gln Ala Asp Cys Asn Cys Ala Leu Glu Ser Trp His Asp Ile Arg Arg 115 120 125 Asp Asn Cys Ser Gly Gln Lys Pro Leu Leu Cys Trp Asp Thr Thr Ser 130 135 140 Ser Gln His Asn Leu Ser Ala Phe Leu Glu Val Ser Cys Ala Pro Gly 145 150 155 160 Leu Ala Ser Ala Thr Ile Gly Ala Val Val Val Ser Gly Cys Leu Leu 165 170 175 Leu Gly Leu Ala Ile Ala Gly Pro Val Leu Ala Trp Arg Leu Trp Arg 180 185 190 Cys Arg Val Ala Arg Ser Arg Glu Leu Asn Lys Pro Trp Ala Ala Gln 195 200 205 Asp Gly Pro Lys Pro Gly Leu Gly Leu Gln Pro Arg Tyr Gly Ser Arg 210 215 220 Ser Ala Pro Lys Pro Gln Val Ala Val Pro Ser Cys Pro Ser Thr Pro 225 230 235 240 Asp Tyr Glu Asn Met Phe Val Gly Gln Pro Ala Ala Glu His Gln Trp 245 250 255 Asp Glu Gln Gly Ala His Pro Ser Glu Asp Asn Asp Phe Tyr Ile Asn 260 265 270 Tyr Lys Asp Ile Asp Leu Ala Ser Gln Pro Val Tyr Cys Asn Leu Gln 275 280 285 Ser Leu Gly Gln Ala Pro Met Asp Glu Glu Glu Tyr Val Ile Pro Gly 290 295 300 His 305 <210> 3 <211> 1273 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 ctcctcctct cgtgagagcc tgaggctggc agagggctct ctgctgtccc ctccactcct 60 acacctactc gtcttcccgt cttcccgcag gcgtggatta acaggtggaa agcaccagga 120 gctgtgaacc ccaacccaga ccctaggacc ctgaggctta cgagacatca cgaaggccag 180 gaggttgctg ggatgggaag catcagaact aggttgctgt ggttatgtct cctgatgctg 240 ttggccctgc ttcacaagtc aggaagtcaa gatctcacct gcatggttca cccgagcagg 300 gtagactgga ctcagacatt taatggcacc tgcctcaatt tcagtggcct tggcctgtcc 360 ctgccaagga gccccttgca ggccagccat gctcaagtcc tggacctgtc taagaatggc 420 ctgcaggtgc tccctggggc tttcttcgac aagctggaaa agctgcagac cctgattgtc 480 acccacaacc agctggacag tgtggacagg tccctggcct tgcgctgtga cctggagctc 540 aaggcagact gcagctgtgg gctggcctcc tggtatgctc tccgccagaa ctgctccggg 600 cagcagcagc tactgtgtct acacccagcc accgaagctc caaggaacct ctccaccttc 660 cttcaggtca gctgtccccc cagctggggc ccggggacca ttggagccct tgttgctggg 720 actatctccc tggctgtggc tgtcagtgga tctgtgctgg cctggagact tcttcgccgc 780 cgccgcagag ccagtgagca cagcctcagc aaagcccaga tgtccccaca cgatatcccc 840 aaaccagtga cagatttcct gccaaggtac agcagccggc gacctggccc caaggcccca 900 gactcaccac ccagcaggtt cacaatggat tatgagaatg tctttattgg ccagccggcc 960 gaggactgct catggtctgc agccagaaac agcccttctg gggacagtga ctgctacatg 1020 aactacagga gtgtcgacca ggactctcag cccgtctatt gcaacctgga gtccctgggg 1080 cgatgaggag agtgtggtct cctggcgctg aaccagcctc cgacagcccc caggatccag 1140 cacgctcaac atcacagggg gtagaggaca ccccaccccc ccacccccaa agcagaagga 1200 gggtcagaaa caaccctccg gtcagtgtgc atgcatgtga tgctcaataa aagctctggg 1260 agcagctgac tct 1273 <210> 4 <211> 297 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Gly Ser Ile Arg Thr Arg Leu Leu Trp Leu Cys Leu Leu Met Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu His Lys Ser Gly Ser Gln Asp Leu Thr Cys Met Val 20 25 30 His Pro Ser Arg Val Asp Trp Thr Gln Thr Phe Asn Gly Thr Cys Leu 35 40 45 Asn Phe Ser Gly Leu Gly Leu Ser Leu Pro Arg Ser Pro Leu Gln Ala 50 55 60 Ser His Ala Gln Val Leu Asp Leu Ser Lys Asn Gly Leu Gln Val Leu 65 70 75 80 Pro Gly Ala Phe Phe Asp Lys Leu Glu Lys Leu Gln Thr Leu Ile Val 85 90 95 Thr His Asn Gln Leu Asp Ser Val Asp Arg Ser Leu Ala Leu Arg Cys 100 105 110 Asp Leu Glu Leu Lys Ala Asp Cys Ser Cys Gly Leu Ala Ser Trp Tyr 115 120 125 Ala Leu Arg Gln Asn Cys Ser Gly Gln Gln Gln Leu Leu Cys Leu His 130 135 140 Pro Ala Thr Glu Ala Pro Arg Asn Leu Ser Thr Phe Leu Gln Val Ser 145 150 155 160 Cys Pro Pro Ser Trp Gly Pro Gly Thr Ile Gly Ala Leu Val Ala Gly 165 170 175 Thr Ile Ser Leu Ala Val Ala Val Ser Gly Ser Val Leu Ala Trp Arg 180 185 190 Leu Leu Arg Arg Arg Arg Arg Ala Ser Glu His Ser Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Gln Met Ser Pro His Asp Ile Pro Lys Pro Val Thr Asp Phe Leu Pro 210 215 220 Arg Tyr Ser Ser Arg Arg Pro Gly Pro Lys Ala Pro Asp Ser Pro Pro 225 230 235 240 Ser Arg Phe Thr Met Asp Tyr Glu Asn Val Phe Ile Gly Gln Pro Ala 245 250 255 Glu Asp Cys Ser Trp Ser Ala Ala Arg Asn Ser Pro Ser Gly Asp Ser 260 265 270 Asp Cys Tyr Met Asn Tyr Arg Ser Val Asp Gln Asp Ser Gln Pro Val 275 280 285 Tyr Cys Asn Leu Glu Ser Leu Gly Arg 290 295 <210> 5 <211> 305 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 5 Met Gly Gly Thr Leu Ala Trp Thr Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Gln 1 5 10 15 Glu Ser Asp Ser Gln Glu Pro Ser Cys Thr Met Pro Ser Thr Asp Val 20 25 30 Asp Trp Asn Thr Glu Phe Ser Ala Thr Cys Leu Asn Phe Ser Gly Arg 35 40 45 Gly Leu Ser Leu Pro Leu Asn Gln Ser Leu Arg Ala Ser Asn Val Leu 50 55 60 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Asn Gly Leu Arg Glu Leu Pro Val Thr Phe 65 70 75 80 Phe Ala His Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Asn Leu Leu His Asn Pro 85 90 95 Leu Ser Arg Val Asp Gly Ala Leu Ala Ala Arg Cys Asp Leu Asp Leu 100 105 110 Arg Ala Asp Cys Ser Cys Ala Leu Glu Ser Trp His Glu Val Arg Arg 115 120 125 Asp Asn Cys Ser Gly Gln Lys Pro Leu Leu Cys Trp Asp Thr Thr Ser 130 135 140 Phe Gln His Asn Leu Ser Ala Phe Leu Glu Val Ser Cys Ala Pro Gly 145 150 155 160 Leu Ala Pro Ala Thr Ile Gly Ala Val Ala Val Ser Gly Cys Leu Leu 165 170 175 Leu Gly Leu Ala Ile Ala Gly Pro Val Leu Ala Trp Arg Leu Trp Arg 180 185 190 Cys Arg Val Ala Arg Ser Arg Asp Leu Asp Lys Pro Trp Pro Ala Gln 195 200 205 Asp Arg Pro Lys Pro Ser Leu Gly Leu Gln Pro Arg Tyr Gly Ser Arg 210 215 220 Ser Thr Pro Lys Pro Gln Val Val Thr Pro Pro Arg Pro Ser Thr Pro 225 230 235 240 Asp Tyr Glu Asn Met Phe Val Gly Gln Pro Ala Ala Glu His Gln Trp 245 250 255 Ala Glu Gln Gly Ala His Pro Ser Glu Asp Asn Asp Phe Tyr Met Asn 260 265 270 Tyr Lys Asp Ile Asp Leu Ala Ser Gln Pro Val Tyr Cys Asn Leu Gln 275 280 285 Ala Leu Gly Gln Ala Pro Met Asp Glu Glu Glu Tyr Val Ile Pro Gly 290 295 300 Arg 305 <210> 6 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Leu Glu Pro Ser Cys Thr Val Ser Ser Ala Asp Val Asp Trp Asn Ala 1 5 10 15 Glu Phe Ser Ala Thr Cys Leu Asn Phe Ser Gly Leu Ser Leu Ser Leu 20 25 30 Pro His Asn Gln Ser Leu Arg Ala Ser Asn Val Ile Leu Leu Asp Leu 35 40 45 Ser Gly Asn Gly Leu Arg Glu Leu Pro Val Thr Phe Phe Ala His Leu 50 55 60 Gln Lys Leu Glu Val Leu Asn Val Leu Arg Asn Pro Leu Ser Arg Val 65 70 75 80 Asp Gly Ala Leu Ala Ala Arg Cys Asp Leu Asp Leu Gln Ala Asp Cys 85 90 95 Asn Cys Ala Leu Glu Ser Trp His Asp Ile Arg Arg Asp Asn Cys Ser 100 105 110 Gly Gln Lys Pro Leu Leu Cys Trp Asp Thr Thr Ser Ser Gln His Asn 115 120 125 Leu Ser Ala Phe Leu Glu Val Ser Cys Ala Pro Gly Leu Ala Ser Ala 130 135 140 Thr Gly Ser Gly His His His His His His 145 150 <210> 7 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Gln Glu Pro Ser Cys Thr Met Pro Ser Thr Asp Val Asp Trp Asn Thr 1 5 10 15 Glu Phe Ser Ala Thr Cys Leu Asn Phe Ser Gly Arg Gly Leu Ser Leu 20 25 30 Pro Leu Asn Gln Ser Leu Arg Ala Ser Asn Val Leu Leu Leu Asp Leu 35 40 45 Ser Gly Asn Gly Leu Arg Glu Leu Pro Val Thr Phe Phe Ala His Leu 50 55 60 Gln Lys Leu Glu Val Leu Asn Leu Leu His Asn Pro Leu Ser Arg Val 65 70 75 80 Asp Gly Ala Leu Ala Ala Arg Cys Asp Leu Asp Leu Arg Ala Asp Cys 85 90 95 Ser Cys Ala Leu Glu Ser Trp His Glu Val Arg Arg Asp Asn Cys Ser 100 105 110 Gly Gln Lys Pro Leu Leu Cys Trp Asp Thr Thr Ser Phe Gln His Asn 115 120 125 Leu Ser Ala Phe Leu Glu Val Ser Cys Ala Pro Gly Leu Ala Pro Ala 130 135 140 Thr Gly Ser Gly His His His His His His 145 150 <210> 8 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Leu Glu Pro Ser Cys Thr Val Ser Ser Ala Asp Val Asp Trp Asn Ala 1 5 10 15 Glu Phe Ser Ala Thr Cys Leu Asn Phe Ser Gly Leu Ser Leu Ser Leu 20 25 30 Pro His Asn Gln Ser Leu Arg Ala Ser Asn Val Ile Leu Leu Asp Leu 35 40 45 Ser Gly Asn Gly Leu Arg Glu Leu Pro Val Thr Phe Phe Ala His Leu 50 55 60 Gln Lys Leu Glu Val Leu Asn Val Leu Arg Asn Pro Leu Ser Arg Val 65 70 75 80 Asp Gly Ala Leu Ala Ala Arg Cys Asp Leu Asp Leu Gln Ala Asp Cys 85 90 95 Asn Cys Ala Leu Glu Ser Trp His Asp Ile Arg Arg Asp Asn Cys Ser 100 105 110 Gly Gln Lys Pro Leu Leu Cys Trp Asp Thr Thr Ser Ser Gln His Asn 115 120 125 Leu Ser Ala Phe Leu Glu Val Ser Cys Ala Pro Gly Leu Ala Ser Ala 130 135 140 Thr Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 145 150 155 160 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 165 170 175 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 180 185 190 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 195 200 205 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 210 215 220 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 225 230 235 240 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 245 250 255 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 260 265 270 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 275 280 285 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 290 295 300 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 305 310 315 320 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 325 330 335 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 340 345 350 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 355 360 365 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 9 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Met Gly Gly Thr Leu Ala Trp Thr Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg 1 5 10 15 Glu Ser Asp Ser Leu Glu Pro Ser Cys Thr Val Ser Ser Ala Asp Val 20 25 30 Asp Trp Asn Ala Glu Phe Ser Ala Thr Cys Leu Asn Phe Ser Gly Leu 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Pro His Asn Gln Ser Leu Arg Ala Ser Asn Val Ile 50 55 60 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Asn Gly Leu Arg Glu Leu Pro Val Thr Phe 65 70 75 80 Phe Ala His Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Asn Val Leu Arg Asn Pro 85 90 95 Leu Ser Arg Val Asp Gly Ala Leu Ala Ala Arg Cys Asp Leu Asp Leu 100 105 110 Gln Ala Asp Cys Asn Cys Ala Leu Glu Ser Trp His Asp Ile Arg Arg 115 120 125 Asp Asn Cys Ser Gly Gln Lys Pro Leu Leu Cys Trp Asp Thr Thr Ser 130 135 140 Ser Gln His Asn Leu Ser Ala Phe Leu Glu Val Ser Cys Ala Pro Gly 145 150 155 160 Leu Ala Ser Ala Thr Ile Gly Ala Val Val Val Ser Gly Cys Leu Leu 165 170 175 Leu Gly Leu Ala Ile Ala Gly Pro Val Leu Ala Trp Arg Leu Trp Arg 180 185 190 Cys Arg Val Ala Arg Ser Arg Glu Leu Asn Lys Pro Trp Ala Ala Gln 195 200 205 Asp Gly Pro Lys Pro Gly Leu Gly Leu Gln Pro Arg Tyr Gly Ser Arg 210 215 220 Ser Ala Pro Lys Pro Gln Val Ala Val Pro Ser Cys Pro Ser Thr Pro 225 230 235 240 Asp Tyr Glu Asn Met Phe Val Gly Gln Pro Ala Ala Glu His Gln Trp 245 250 255 Asp Glu Gln Gly Ala His Pro Ser Glu Asp Asn Asp Phe Tyr Ile Asn 260 265 270 Tyr Lys Asp Ile Asp Leu Ala Ser Gln Pro Val Tyr Cys Asn Leu Gln 275 280 285 Ser Leu Gly Gln Ala Pro Met Asp Glu Glu Glu Tyr Val Ile Pro Gly 290 295 300 His 305 <210> 10 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Gln Glu Pro Ser Cys Thr Met Pro Ser Thr Asp Val Asp Trp Asn Thr 1 5 10 15 Glu Phe Ser Ala Thr Cys Leu Asn Phe Ser Gly Arg Gly Leu Ser Leu 20 25 30 Pro Leu Asn Gln Ser Leu Arg Ala Ser Asn Val Leu Leu Leu Asp Leu 35 40 45 Ser Gly Asn Gly Leu Arg Glu Leu Pro Val Thr Phe Phe Ala His Leu 50 55 60 Gln Lys Leu Glu Val Leu Asn Leu Leu His Asn Pro Leu Ser Arg Val 65 70 75 80 Asp Gly Ala Leu Ala Ala Arg Cys Asp Leu Asp Leu Arg Ala Asp Cys 85 90 95 Ser Cys Ala Leu Glu Ser Trp His Glu Val Arg Arg Asp Asn Cys Ser 100 105 110 Gly Gln Lys Pro Leu Leu Cys Trp Asp Thr Thr Ser Phe Gln His Asn 115 120 125 Leu Ser Ala Phe Leu Glu Val Ser Cys Ala Pro Gly Leu Ala Pro Ala 130 135 140 Thr Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 145 150 155 160 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 165 170 175 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 180 185 190 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 195 200 205 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 210 215 220 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 225 230 235 240 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 245 250 255 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 260 265 270 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 275 280 285 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 290 295 300 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 305 310 315 320 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 325 330 335 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 340 345 350 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 355 360 365 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Leu Glu Pro Ser Ser Thr Val Ser Ser Ala Asp Val Asp Trp Asn Ala 1 5 10 15 Glu Phe Ser Ala Gly Gly Lys 20 <210> 12 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Ala Glu Phe Ser Ala Thr Ser Leu Asn Phe Ser Gly Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Pro His Asn Gly Gly Lys 20 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Ser Leu Pro His Asn Gln Ser Leu Arg Ala Ser Asn Val Ile Leu Leu 1 5 10 15 Asp Leu Ser Gly Gly Gly Lys 20 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Leu Asp Leu Ser Gly Asn Gly Leu Arg Glu Leu Pro Val Thr Phe Phe 1 5 10 15 Ala His Leu Gln Gly Gly Lys 20 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Phe Ala His Leu Gln Lys Leu Glu Val Leu Asn Val Leu Arg Asn Pro 1 5 10 15 Leu Ser Arg Val Gly Gly Lys 20 <210> 16 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Pro Leu Ser Arg Val Asp Gly Ala Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Asp 1 5 10 15 Leu Gln Ala Asp Gly Gly Lys 20 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Asp Leu Gln Ala Asp Ser Asn Ser Ala Leu Glu Ser Trp His Asp Ile 1 5 10 15 Arg Arg Asp Asn Gly Gly Lys 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Ile Arg Arg Asp Asn Ser Ser Gly Gln Lys Pro Leu Leu Ser Trp Asp 1 5 10 15 Thr Thr Ser Ser Gly Gly Lys 20 <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Asp Thr Thr Ser Ser Gln His Asn Leu Ser Ala Phe Leu Glu Val Ser 1 5 10 15 Ser Ala Pro Gly Gly Gly Lys 20 <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ser Ala Phe Leu Glu Val Ser Ser Ala Pro Gly Leu Ala Ser Ala Thr 1 5 10 15 Gly Gly <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Glu Glu Lys Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 23 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Arg Asn Ile Leu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Gly Ser Thr Met Ile Thr Ser Leu Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 25 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Arg Asn Ile Leu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Gly Ser Thr Met Ile Thr Ser Leu Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Phe Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Glu Glu Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Arg Asn Ile Leu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Gly Gly Gly Ser Thr Met Ile Thr Ser Leu Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Phe Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gly 100 105 110 <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Asp Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Leu Thr Gly Thr Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 31 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asn Tyr Gly Asn Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 33 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 34 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asn Tyr Gly Asn Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ala 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Asp Val Asn Leu Glu Val Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Arg Asp Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Glu Val Lys Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Arg Asp Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 38 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 39 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr 85 90 95 Lys Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 42 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 43 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 44 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gln Glu Leu Arg Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 45 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Glu Val Gln Leu Leu Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gln Glu Leu Arg Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 46 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 46 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 47 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gln Glu Leu Arg Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 48 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 49 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gln Glu Leu Arg Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 50 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 50 Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 51 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Ser Asn Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Val Leu Leu Arg Pro Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 53 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg His Arg Asp Tyr Asp Ser Arg Gly His Trp Tyr Phe 100 105 110 Gly Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 55 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Thr Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Pro Arg Asp Phe Tyr Gly Gly Gly His Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 56 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 57 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Leu Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Pro Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly His Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 58 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 59 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Glu Val Lys Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Ala Val Ser Gln Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Thr Tyr Ser Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 61 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Leu Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Arg Asp Tyr Tyr Asn Ser Gly His Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 62 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 63 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 64 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (117)

  1. 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, LRRC25 폴리펩타이드를 발현하는 골수성 세포에 결합하고, 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시키며, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    a) 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉 후 다음 중 하나 이상을 초래하여 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시킴:
    i) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비;
    ii) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1, TGFb 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비;
    iii) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18, GM-CSF, CCL3, CCL4, 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 분비;
    iv) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비;
    v) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화;
    vi) CD8+ 세포독성 T 세포 활성화의 증가된 동원;
    vii) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성;
    viii) CD4+ 헬퍼 T 세포 활성의 증가된 동원;
    ix) 증가된 NK 세포 활성;
    x) NK 세포의 증가된 동원;
    xi) 증가된 호중구 활성;
    xii) 증가된 대식세포 및/또는 수지상 세포 활성; 및/또는
    xiii) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수;
    b) 다른 LRR 패밀리 구성원과 비교하여 LRRC25에 특이적으로 결합함;
    c) 인간 LRR25 폴리펩타이드에 하나 이상의 다른 LRR 패밀리 구성원보다 적어도 1.1-배 이상 선택적으로 결합하되, 하나 이상의 LRR 패밀리 구성원은 세포 상에서 또는 시험관내에서 발현됨;
    d) 선택적으로 ELISA 또는 생물층 간섭계 검정(biolayer interferometry assay)에서 측정되는 바와 같이 약 0.00001 나노몰(nM) 내지 1000nM의 kD로 인간 LRRC25 폴리펩타이드에 결합함;
    e) 인간 LRRC25 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 결합함;
    f) 표 7에 열거된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩타이드에 결합함;
    g) LRRC25 리간드와 LRRC25의 결합과 경쟁, 이를 저해 또는 차단함;
    h) 사이노몰구스 LRRC25 폴리펩타이드와의 교차-반응;
    i) 표 2에 열거된 LRRC25 폴리펩타이드 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁함;
    j) 본 명세서에 기재된 ATCC에 기탁된 단일클론 항체로서 얻을 수 있음;
    k) 자극되지 않은 단핵구를 활성화하지 않음;
    l) LRRC25-발현 세포에 대한 ADCC 활성을 갖지 않음;
    m) LRRC25-발현 세포에 대한 CDC 활성을 갖지 않음;
    n) LRRC25-발현 세포에 결합시 및/또는 LRRC25-발현 세포에 의한 내재화시 LRRC25-발현 세포를 죽이지 않음;
    o) 또 다른 치료적 모이어티에 접합되지 않되, 선택적으로 또 다른 치료적 모이어티는 세포독성제임; 그리고/또는
    p) 생체내 항종양 활성을 가짐.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
    a) 표 2에 열거된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 중쇄 CDR 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 경쇄 CDR 서열
    을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
    a) 표 2에 열거된 중쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 중쇄 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 경쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 경쇄 서열
    을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
    a) 표 2에 열거된 중쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 경쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR 서열
    을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
    a) 표 2에 열거된 중쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 경쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 서열
    을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라, 인간화된 것, 뮤린 또는 인간 유래인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출 가능하게 표지되며, 효과기 도메인을 포함하고/하거나 Fc 도메인을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, Fde, sdFv, 단일 도메인 항체(dAb) 및 다이어바디 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린으로부터 유래되는 불변 도메인을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 작용제에 접합되되, 선택적으로 상기 작용제는 결합 단백질, 효소, 약물, 화학치료제, 생물학적 작용제, 독소, 방사성 핵종, 면역조절제, 검출 가능한 모이어티 및 태그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 약제학적 조성물로서, 치료적 유효량의 적어도 하나의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 희석제, 가용화제, 유화제, 보존제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약 20 EU 내독소/㎎ 단백질 미만을 갖는, 약제학적 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약 1 EU 내독소/㎎ 단백질 미만을 갖는, 약제학적 조성물.
  17. 단리된 핵산 분자로서, i) 엄격한 조건하에, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 보체와 혼성화하고; ii) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대해 전장에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖거나; 또는 iii) 표 2에 열거된 폴리펩타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는, 단리된 핵산 분자.
  18. 제17항의 핵산에 의해 암호화되는 단리된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드.
  19. 단리된 제17항의 핵산을 포함하는 벡터로서, 선택적으로 상기 벡터는 발현 벡터인, 벡터.
  20. 단리된 제17항의 핵산을 포함하는 숙주 세포:
    a) 상기 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하고;
    b) 상기 제18항의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하며;
    c) 상기 제19항의 벡터를 포함하고; 그리고/또는
    d) ATCC 기탁 등록 번호로 기탁된 단일클론 항체로서 접근 가능하다.
  21. 장치 또는 키트로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 장치 또는 키트는 선택적으로 상기 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 복합체를 검출하기 위해 표지를 포함하는, 장치 또는 키트.
  22. 장치 또는 키트로서, 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 상기 약제학적 조성물, 단리된 핵산 분자, 단리된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는, 장치 또는 키트.
  23. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서, (i) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 형질전환된, 형질전환된 숙주 세포를 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하기에 적합한 조건하에서 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. LRRC25 폴리펩타이드의 존재 또는 수준을 검출하는 방법으로서, 샘플을 수득하는 단계 및 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 사용에 의해 상기 샘플에서 상기 폴리펩타이드를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 LRRC25 폴리펩타이드와 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사성 면역 검정(RIA), 면역화학 검정, 웨스턴 블롯, 질량 분석 검정, 핵자기 공명 검정의 형태로 또는 세포내 유동 검정을 사용하여 검출되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 작용제와 접촉 후 증가된 염증성 표현형을 갖는 골수성 세포를 생성하는 방법으로서, 골수성 세포를 유효량의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하되, 선택적으로 상기 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 증가된 염증성 표현형을 갖는 골수성 세포는 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉 후 다음 중 하나 이상을 나타내는 방법:
    a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비;
    b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, LRRC25, TGFb 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비;
    c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18, GM-CSF, CCL3, CCL4 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 분비;
    d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비;
    e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화;
    f) CD8+ 세포독성 T 세포 활성화의 증가된 동원;
    g) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성;
    h) CD4+ 헬퍼 T 세포 활성의 증가된 동원;
    i) 증가된 NK 세포 활성;
    j) NK 세포의 증가된 동원;
    k) 증가된 호중구 활성;
    l) 증가된 대식세포 및/또는 수지상 세포 활성; 및/또는
    m) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉된 상기 골수성 세포는 세포의 집단 내에 포함되며, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 세포의 집단에서 1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시키고/시키거나 2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시키는, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉된 상기 골수성 세포는 세포의 집단 내에 포함되며, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 세포의 집단에서 i) 대 ii)의 비를 증가시키되, 상기 세포의 집단에서 i)는 1형 및/또는 M1 대식세포이고, ii)는 2형 및/또는 M2 대식세포인, 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포는 1형 대식세포, M1 대식세포, 2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(tumor-associated macrophage: TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하는, 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포는 시험관내 또는 생체외에서 접촉되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 골수성 세포는 일차 골수성 세포인, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 골수성 세포는 상기 작용제와 접촉하기 전에 정제 및/또는 배양되는, 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포는 생체내에서 접촉되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 골수성 세포는 상기 작용제의 전신, 종양 부근 또는 종양내 투여에 의해 생체내에서 접촉되는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 골수성 세포는 조직 미세환경에서 접촉되는, 방법.
  37. 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역치료제는 면역 관문 저해제, 면역-자극 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함하는, 방법.
  38. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 생성된 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 조성물로서, 선택적으로 상기 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 조성물.
  39. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 작용제와 접촉 후 대상체에서 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시키는 방법으로서, 유효량의 작용제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로 상기 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 증가된 염증성 표현형을 갖는 상기 골수성 세포는 상기 작용제와 접촉 후 다음 중 하나 이상을 나타내는, 방법:
    a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비;
    b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, LRRC25 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비;
    c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 증가된 분비;
    d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비;
    e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화;
    f) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성;
    g) 증가된 NK 세포 활성;
    h) 증가된 호중구 활성;
    i) 증가된 대식세포 및/또는 수지상 세포 활성; 및/또는
    j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 상기 대상체에서 1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시키거나, 2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시키고/시키거나 i) 대 ii)의 비를 증가시키되, i)는 1형 및/또는 M1 대식세포이고, ii)는 2형 및/또는 M2 대식세포인, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 세포독성 CD8+ T 세포의 수 및/또는 활성은 상기 작용제의 투여 후에 증가되는, 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포는 1형 대식세포, M1 대식세포, 2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하는, 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 상기 작용제의 전신, 종양 부근 또는 종양내 투여에 의해 생체내에 투여되는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 작용제는 조직 미세환경에서 골수성 세포와 접촉하는, 방법.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역치료제는 면역 관문 저해제, 면역-자극 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함하는, 방법.
  47. 대상체에서 염증을 증가시키는 방법으로서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 작용제와 접촉시킨 유효량의 골수성 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 선택적으로 상기 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 골수성 세포는 1형 대식세포, M1 대식세포, 2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하는, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 골수성 세포는 상기 대상체의 골수성 세포에 대하여 유전자 조작된 자가유래(autologous), 동계(syngeneic) 또는 동종이계(allogeneic)인, 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 전신으로, 종양 부근으로 또는 종양 내부로 투여되는, 방법.
  51. 세포독성 CD8+ T 세포-매개성 살해 및/또는 면역 관문 요법에 대해 대상체에서 암세포를 감작시키는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 작용제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 세포독성 CD8+ T 세포-매개성 살해 및/또는 면역 관문 요법에 대해 암을 앓고 있는 대상체에서 암세포를 감작시키는 방법으로서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 작용제와 접촉시킨 치료적 유효량의 골수성 세포를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 선택적으로 상기 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 골수성 세포는 1형 대식세포, M1 대식세포, 2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하는, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 골수성 세포는 상기 대상체의 골수성 세포에 대하여 유전자 조작된 자가유래, 동계 또는 동종이계인, 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 전신으로, 종양 부근으로 또는 종양 내부로 투여되는, 방법.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 면역요법을 상기 대상체에 투여함으로써 상기 대상체에서 상기 암을 치료하는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역요법은 면역 관문 저해제, 면역-자극 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 면역 관문은 PD-1, PD-L1, PD-L2 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 면역 관문은 PD-1인, 방법.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하기 위한 추가적인 치료제 또는 양생법을 상기 대상체에 투여함으로써 상기 대상체에서 상기 암을 치료하는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 상기 추가적인 치료제 또는 양생법은 키메라 항원 수용체, 화학요법, 방사선, 표적화 요법 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 상기 암에서 증식하는 세포의 수를 감소시키고/시키거나 상기 암세포를 포함하는 종양의 부피 또는 크기를 감소시키는, 방법.
  61. 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 상기 암세포를 포함하는 종양을 침윤하는 CD8+ T 세포의 양 및/또는 활성을 증가시키는, 방법.
  62. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 a) 상기 암세포를 포함하는 종양을 침윤하는 M1 대식세포의 양 및/또는 활성을 증가시키고/시키거나 b) 상기 암세포를 포함하는 종양을 침윤하는 M2 대식세포의 양 및/또는 활성을 감소시키는, 방법.
  63. 제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암을 치료하기 위한 적어도 하나의 추가적인 요법 또는 양생법을 상기 대상체에 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요법은 상기 작용제 이전에, 이와 동시에 또는 이후에 투여되는, 방법.
  65. 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 증가시킬 수 있는 골수성 세포를 확인하는 방법으로서,
    a) 작용제를 사용하여 상기 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계로서, 상기 작용제는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 상기 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계;
    b) 작용제를 사용하여 대조군에서 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및
    c) a) 및 b) 단계에서 검출된 상기 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 비교하는 단계
    를 포함하되, 상기 적어도 하나의 표적의 대조군의 양 및/또는 활성에 비해 상기 골수성 세포에서 표 1에 열거된 상기 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는 상기 골수성 세포가 상기 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 이의 염증성 표현형을 증가시킬 수 있음을 나타내며, 선택적으로 상기 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 작용제를 상기 세포와 접촉시키는 단계, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 증가시키는 것으로부터 혜택을 받지 않는 것으로 결정된 경우, 상기 세포를 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 작용제 이외의 암 요법과 접촉시키는 단계, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 암 요법은 면역요법인, 방법.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응을 증가시키는 적어도 하나의 추가적인 작용제를 상기 세포와 접촉시키고/시키거나 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 추가적인 작용제는 표적화 요법, 화학요법, 방사선 요법 및/또는 호르몬 요법으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  71. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 상기 대상체가 속하는 동일한 종의 구성원으로부터 유래되는, 방법.
  72. 제65항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 세포를 포함하는 샘플인, 방법.
  73. 제65항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 암을 앓고 있는, 방법.
  74. 제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 대상체로부터의 암 샘플인, 방법.
  75. 제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 대상체로부터의 비-암 샘플인, 방법.
  76. 암을 앓고 있는 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법으로서,
    a) 작용제를 사용하여 상기 대상체로부터의 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계로서, 상기 작용제는 적어도 하나의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 상기 대상체로부터의 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계;
    b) 작용제를 사용하여 나쁜 임상 결과를 갖는 대조군으로부터의 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및
    c) 상기 대상체 샘플 및 상기 대조군 대상체로부터의 샘플에서 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 비교하는 단계
    를 포함하되, 상기 대조군에서의 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 대상체의 골수성 세포로부터의 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는 상기 대상체가 나쁜 임상 결과를 나타내지 않음을 나타내며, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  77. 대상체에서 골수성 세포의 염증성 표현형을 모니터링하는 방법으로서,
    a) 첫 번째 시점에서 첫 번째 대상체 샘플에서 작용제를 사용하여 상기 대상체의 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 검출하는 단계로서, 상기 작용제는 적어도 하나의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 상기 대상체의 골수성 세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 검출하는 단계;
    b) 후속 시점에서 수득된 골수성 세포를 포함하는 후속 샘플을 사용하여 a) 단계를 반복하는 단계; 및
    c) a) 및 b) 단계에서 검출된 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 또는 활성을 비교하는 단계
    를 포함하되,
    상기 첫 번째 샘플의 골수성 세포로부터의 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 후속 샘플의 골수성 세포로부터의 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소는 상기 대상체의 골수성 세포가 염증성 표현형을 상향조절함을 나타내거나; 또는
    상기 첫 번째 샘플의 골수성 세포로부터의 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 후속 샘플의 골수성 세포로부터의 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는 상기 대상체의 골수성 세포가 염증성 표현형을 하향조절함을 나타내며, 선택적으로 상기 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 시험관내에서 배양된 골수성 세포를 포함하는, 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 시험관내에서 배양되지 않은 골수성 세포를 포함하는, 방법.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 상기 대상체로부터 수득된 단일 샘플 또는 혼주된 샘플의 일부인, 방법.
  81. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 대상체로부터 수득된 혈액, 혈청, 종양 부근 조직 및/또는 종양내 조직을 포함하는, 방법.
  82. 대상체에서 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시키는 테스트 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서,
    a) 첫 번째 시점에서 골수성 세포를 포함하는 대상체 샘플에서 i) 작용제를 사용하여 상기 골수성 세포에서 또는 그 위에서 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 또는 활성(여기서 상기 작용제는 적어도 하나의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편임) 및/또는 ii) 골수성 세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계;
    b) 테스트 작용제와 접촉된 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및
    c) a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii)의 값을 비교하는 단계
    를 포함하되, 상기 첫 번째 시점에서 상기 샘플의 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 후속 샘플에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 ii)의 증가는 상기 테스트 작용제가 상기 대상체에서 골수성 세포의 염증성 표현형을 증가시킴을 나타내며, 선택적으로 상기 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 작용제와 접촉된 상기 골수성 세포는 세포의 집단 내에 포함되며, 상기 작용제는 상기 세포의 집단에서 1형 및/또는 M1대식세포의 수를 증가시키는, 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 작용제와 접촉된 상기 골수성 세포는 세포의 집단 내에 포함되며, 상기 작용제는 상기 세포의 집단에서 2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시키는, 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포는 시험관내 또는 생체외에서 접촉되는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 골수성 세포는 일차 골수성 세포인, 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 골수성 세포는 상기 작용제와 접촉하기 전에 정제 및/또는 배양되는, 방법.
  88. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포는 생체내에서 접촉되는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 골수성 세포는 상기 작용제의 전신, 종양 부근 또는 종양내 투여에 의해 생채내에서 접촉되는, 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 골수성 세포는 조직 미세환경에서 접촉되는, 방법.
  91. 제82항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역치료제는 면역 관문 저해제, 면역-자극 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함하는, 방법.
  92. 제82항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 포유동물인, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 포유동물은 비-인간 동물 모델 또는 인간인, 방법.
  94. 대상체에서 암을 치료하기 위한 테스트 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서,
    a) 첫 번째 시점에서 골수성 세포를 포함하는 상기 대상체 샘플에서 i) 작용제를 사용하여 골수성 세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 또는 활성(여기서 상기 작용제는 적어도 하나의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편임) 및/또는 ii) 골수성 세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계;
    b) 상기 작용제의 투여 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및
    c) a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii) 값을 비교하는 단계
    를 포함하되, 상기 첫 번째 시점에서 상기 대상체 샘플의 골수성 세포에서 또는 그 위에서의 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 후속 시점에서 상기 대상체 샘플의 골수성 세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 ii)의 증가는 상기 테스트 작용제가 상기 대상체에서 암을 치료함을 나타내며, 선택적으로 상기 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 첫 번째 시점과 상기 후속 시점 사이에서, 상기 대상체는 치료를 받았거나, 치료를 완료하였고/하였거나 암에 대한 관해에 있는, 방법.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 생체외 및 생체내 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 암의 비-인간 동물 모델로부터 수득되는, 방법.
  98. 제94항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 상기 대상체로부터 수득된 단일 샘플 또는 혼주된 샘플의 일부인, 방법.
  99. 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 대상체로부터 수득된 세포, 혈청, 종양 부근 조직 및/또는 종양내 조직을 포함하는, 방법.
  100. 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암세포를 감작시키는 테스트 작용제를 스크리닝하는 방법으로서,
    a) 테스트 작용제와 접촉시킨 골수성 세포의 존재하에서 암세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역 관문 요법과 접촉시키는 단계로서, 상기 테스트 작용제는 작용제를 사용하여 결정된 골수성 세포 작용제에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 조절하며, 상기 작용제는 적어도 하나의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 상기 암세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역 관문 요법과 접촉시키는 단계;
    b) 테스트 작용제와 접촉시키지 않은 대조군 골수성 세포의 존재하에서 암세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역 관문 요법과 접촉시키는 단계; 및
    c) b)와 비교하여 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역 관문 요법 효능을 증가시키는 작용제를 확임함으로써 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역 관문 요법에 대해 암세포를 감작시키는 테스트 작용제를 확인하는 단계
    를 포함하되, 선택적으로 골수성 세포는 억제성 골수성 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구 및/또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 접촉 단계는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 일어나는, 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, i) 상기 암에서 증식하는 세포의 수의 감소 및/또는 ii) 상기 암세포를 포함하는 종양의 부피 또는 크기의 감소를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, i) CD8+ T 세포의 증가된 수 및/또는 ii) 상기 암세포를 포함하는 종양을 침윤하는 1형 및/또는 M1 대식세포의 증가된 수를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  104. 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 임상적 이득률, 사망할 때까지의 생존기간, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반-정량적 측정값, 임상적 완전 관해, 임상적 부분 관해, 임상적 안정 질환, 무재발 생존기간, 무전이 생존기간, 무질환 생존기간, 순환 종양 세포 감소, 순환하는 마커 반응 및 RECIST 기준으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기준에 의해 측정된 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 상기 테스트 작용제에 대한 반응을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법
  105. 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 상기 암세포를 적어도 하나의 추가적인 암 치료제 또는 양생법과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절된 염증성 표현형을 갖는 골수성 세포는 다음 중 하나 이상을 나타내는, 조성물 또는 방법:
    a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 조절된 발현;
    b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, LRRC25 및/또는 IL-10의 조절된 발현;
    c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 조절된 분비;
    d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 조절된 비;
    e) 조절된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화;
    f) 조절된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성;
    g) 조절된 NK 세포 활성;
    h) 조절된 호중구 활성;
    i) 조절된 대식세포 및/또는 수지상 세포 활성; 및/또는
    j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 조절된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 및/또는 골수성 세포는 1형 대식세포, M1 대식세포, 2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 세포 및/또는 골수성 세포는 LRRC25을 발현하거나 또는 이를 발현하는 것으로 결정된, 조성물 또는 방법.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 LRRC25 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고/갖거나 사이노몰구스 LRRC25 폴리펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는, 조성물 또는 방법.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 대식세포가 침윤된 고형 종양이되, 상기 침윤 대식세포는 상기 종양 또는 상기 종양 미세환경에서 세포의 질량, 부피 및/또는 수의 적어도 약 5%를 나타내고/내거나 상기 암은 중피종, 신장 투명세포형 신세포 암종, 교모세포종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종, 췌장 선암종, 유방 침습 암종, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 방광 요로상피성 암종, 뇌 저등급 신경교종, 유방 침습 암종, 자궁경부 편평세포 암종 및 자궁경내 선암종, 담관암종, 결장 선암종, 식도 암종, 다발성 교모세포종, 두경부 편평세포 암종, 혐색소 신세포암, 신장 투명세포형 신세포 암종, 신장 신유두세포 암종, 간세포 암종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종, 림프구성 세포종양 미만성 거대 B-세포 림프종, 중피종, 난소 장액성 종양, 낭샘암종, 췌장 선암종, 크롬 친화성 세포종, 부신경절종, 전립선 선암종, 직장 선암종, 육종, 피부 흑색종, 위 선암, 고환 생식세포 종양, 흉선종, 갑상선암종, 자궁 암육종, 자궁체부 내막 암종 및 포도막 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물 또는 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 골수성 세포는 1형 대식세포, M1 대식세포, 2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 골수성 세포는 TAM 및/또는 M2 대식세포인, 조성물 또는 방법.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 상기 골수성 세포는 LRRC25을 발현하거나 또는 이를 발현하는 것으로 결정된, 조성물 또는 방법.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포는 일차 골수성 세포인, 조성물 또는 방법.
  113. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포는 조직 미세환경 내에 포함되는, 조성물 또는 방법.
  114. 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수성 세포는 암의 인간 종양 모델 또는 동물 모델 내에 포함되는, 조성물 또는 방법.
  115. 제1항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 포유동물인, 조성물 또는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 조성물 또는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 인간은 암을 앓고 있는, 조성물 또는 방법.
KR1020227003081A 2019-06-27 2020-06-17 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-lrrc25 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도 KR20220042131A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962867593P 2019-06-27 2019-06-27
US62/867,593 2019-06-27
PCT/US2020/038115 WO2020263650A1 (en) 2019-06-27 2020-06-17 Anti-lrrc25 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220042131A true KR20220042131A (ko) 2022-04-04

Family

ID=74060354

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227003081A KR20220042131A (ko) 2019-06-27 2020-06-17 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-lrrc25 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220363752A1 (ko)
EP (1) EP3990017A4 (ko)
JP (1) JP2022539038A (ko)
KR (1) KR20220042131A (ko)
CN (1) CN114423452A (ko)
AU (1) AU2020306772A1 (ko)
BR (1) BR112021026411A2 (ko)
CA (1) CA3142838A1 (ko)
IL (1) IL289166A (ko)
WO (1) WO2020263650A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024077170A1 (en) * 2022-10-05 2024-04-11 Shangpharma Innovation, Inc. Anti-urokinase-type plasminogen activator receptor antibodies and methods of use
CN116380755B (zh) * 2023-03-20 2023-11-21 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院） CD127+PMN-MDSCs在诊断支气管肺发育不良中的应用及诊断试剂盒

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10279018B2 (en) * 2012-12-03 2019-05-07 Unity Biotechnology, Inc. Immunogenic compositions for inducing an immune response for elimination of senescent cells
EP3311173A2 (en) * 2015-06-18 2018-04-25 Thomas Mole Herd Methods of characterising cancer
WO2017004153A1 (en) * 2015-06-29 2017-01-05 The Broad Institute Inc. Tumor and microenvironment gene expression, compositions of matter and methods of use thereof
WO2017216227A1 (en) * 2016-06-14 2017-12-21 Advanced Biodesign Monoclonal antibody specific for gamma-glutamyl-l-epsilon-lysine for the monitoring of apoptosis
JP2019532017A (ja) * 2016-07-14 2019-11-07 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター がんを治療するための異なるエピトープ結合を示す複数の二重特異性結合ドメイン構築物
CN113164589A (zh) * 2018-06-29 2021-07-23 维西欧制药公司 用于调节单核细胞和巨噬细胞发炎表型的组合物和方法以及其免疫疗法用途

Also Published As

Publication number Publication date
BR112021026411A2 (pt) 2022-03-15
EP3990017A1 (en) 2022-05-04
CN114423452A (zh) 2022-04-29
CA3142838A1 (en) 2020-12-30
AU2020306772A1 (en) 2022-02-17
EP3990017A4 (en) 2023-04-26
US20220363752A1 (en) 2022-11-17
JP2022539038A (ja) 2022-09-07
IL289166A (en) 2022-02-01
WO2020263650A1 (en) 2020-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220396627A1 (en) Anti-siglec-9 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
US20210115144A1 (en) Kir3dl3 as an hhla2 receptor, anti-hhla2 antibodies, and uses thereof
US20230348603A1 (en) Anti-vsig4 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
US20220363752A1 (en) Anti-lrrc25 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
US20220251233A1 (en) Anti-cd53 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
US20220396632A1 (en) Anti-psgl-1 compositions and methods for modulating myeloid cell infalmmatory phenotypes and uses thereof