KR20220042046A

KR20220042046A - Nurr1 단백질 발현을 증가시키기 위한 mir-204 억제제의 용도

Info

Publication number: KR20220042046A
Application number: KR1020217004230A
Authority: KR
Inventors: 류진협; 이상무
Original assignee: 주식회사 바이오오케스트라
Priority date: 2019-06-04
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2022-04-04
Also published as: WO2020245749A1; US20220081690A1

Abstract

본 명세서는 Nurr1 단백질의 감소된 수준과 연합된 질환 또는 병태 치료를 위한 벡터의 용도를 내포한다. 본 명세서에서 유용한 벡터는 프로모터와 RNA 발현 영역을 포함하며, 이때 상기 RNA 발현 영역은 상기 프로모터의 하류에 위치하며, 이때 해당 RNA 발현 영역은 적어도 하나의 miR-204 결합 부위를 포함하는 RNA를 발현시키는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그리고 이때 해당 RNA 발현 영역은 단백질을 인코드하지 않는다.

Description

NURR1 단백질 발현을 증가시키기 위한 MIR-204 억제제의 용도

관련 출원들에 대한 교차-참조

본 PCT 출원은 2019년 6월 4일자로 제출된 미국 가출원 번호 62/857,202를 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.

전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 언급

이 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일 (이름: 4366_001PC01_SequenceListing_ST25.txt; 크기: 25,061 바이트; 그리고 생성 날짜: 2020년 6월 3일)에 전자로 제출된 서열 목록의 내용은 그 전문이 본원의 참고자료에 편입된다.

분야

본 명세서는 miR-204 억제제의 용도, 예를 들면, Nurr1 단백질의 발현 감소와 연합된 신경퇴행성 장애 치료를 위해 적어도 하나의 microRNA (miR) 204 결합 부위를 포함하는 RNA를 만들 수 있는 예를 들면, 바이러스 벡터의 용도를 제공한다.

배경기술

MicroRNAs (miRNAs 또는 miRs)는 이들의 표적 mRNAs와 염기 쌍을 이루어 유전자 발현의 전사-후 조절자 역할을 하는 풍부한 클래스의 짧은 내인성 RNAs이다. 성숙한 miRNAs는 RNAse III 리보뉴클레아제 Drosha 및 Dicer에 의해 더 긴 헤어핀 전사체들로부터 순차적으로 처리된다. 대부분의 동물 miRNAs는 불완전한 염기-쌍을 통해 3'-UTRs에 위치한 이들의 표적 부위들을 인지하고, 이 표적 유전자들의 해독을 억제시킨다. 증가하고 있는 연구에 따르면, 동물 miRNAs는 세포 성장 및 세포 사멸, 조혈 계통 분화, 수명-조절, 광수용체 분화, 호메오박스(homeobox) 유전자 조절, 뉴런의 비대칭, 인슐린 분비, 뇌 형태발생, 근육 증식 및 분화, 심장발생 및 후기 배아 발달에서 기본적인 생물학적 역할을 한다는 것을 보여준다.

miRNAs는 다양한 인간 질환에 관여한다. 예를 들면, miRNAs는 척추 근육 위축 (SMA), 뚜레(Tourette) 증후군, 취약 X 정신 지체, 디조지(DiGeorge) 증후군에 관여한다.

신경퇴행성 질환 이를 테면, 알츠하이머 질환과 파킨슨 질환 증후군의 진단 및 치료의 발전에도 불구하고, 이들의 예후는 여전히 나쁘다. MicroRNAs는 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있으며 치료요법적으로 사용될 수 있다. miRNA를 사용한 효과적인 치료를 위해 극복하기 어려운 점은 치료요법적 miRNA를 세포, 조직 또는 기관에 효율적으로 투여하는 것이다.

간단한 요약

일부 측면들에서, 본 명세서는 Nurr1 단백질의 감소된 수준과 관련된 질환 또는 병태의 치료를 요하는 대상체에서 이를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 miR-204 억제제를 투여하는 것을 포함하는 것을 포함한다. 다른 측면들에서, 본 명세서는 세포에서 Nurr1 단백질 발현을 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 해당 세포에 miR-204 억제제를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 세포는 대상체에 존재한다.

특정 측면들에서, 상기 miR-204 억제제는 적어도 하나의 miR-204 결합 부위를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 측면들에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터와 RNA 발현 영역을 포함하는 벡터다. 예를 들면, 상기 RNA 발현 영역은 이 프로모터의 하류에 위치할 수 있으며, 이때 해당 RNA 발현 영역은 적어도 하나의 miR-204 결합 부위를 포함하는 RNA를 발현시키는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이때 해당 RNA 발현 영역은 단백질을 인코드하지 않는다. 다른 측면들에서, 상기 벡터는 이 벡터에 이종성(heterologous)인 단백질을 인코드하지 않는다.

일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 내인성 miR-204에 결합하고, 하나 또는 그 이상의 내인성 폴리펩티드의 발현을 조절한다. 다른 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR204 결합 부위는 Nurr1 단백질의 발현을 증가시킨다.

다른 측면들에서, 본 명세서에 유용한 miR204 억제는 NMDA 수용체의 발현을 증가시키지 않는다. 다른 측면들에서, 상기 miR204 억제제는 EphB2 단백질의 발현을 증가시키지 않는다. 여전히 다른 측면들에서, 상기 miR204 억제제는 상기 투여 또는 접촉 후 Nurr1 단백질의 발현을 상기 투여 또는 접촉 전 발현과 비교하였을 때, 적어도 약 1.5 배, 적어도 약 2 배, 적어도 약 2.5 배, 적어도 약 3 배, 적어도 약 3.5 배, 적어도 약 4 배, 적어도 약 4.5 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 5.5 배, 적어도 약 6 배, 적어도 약 6.5 배, 적어도 약 7 배, 적어도 약 7.5 배, 또는 적어도 약 8 배 증가시킨다.

일부 측면들에서, 상기 miR204 억제제는 NMDA 수용체 및/또는 EphB2 단백질의 감소된 발현과는 무관하고, Nurr1 단백질의 감소된 발현과 연합된 질환 또는 병태를 치료한다. 다른 측면들에서, 상기 질환 또는 병태 해마 기능의 감소와는 관련없다. 다른 측면들에서, 상기 질환 또는 병태는 파킨슨 질환, 프리온 질환, 운동 뉴런 질병, 헌팅턴 질환, 척수소뇌성 운동실조, 척추 근육 위축, 근위축성 측삭 경화증, 또는 이들의 임의의 조합이다.

일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-5p에 혼성화된다. 일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-5p에 완전히 상보적이다. 일부 측면들에서, 상기 miR-204-5p는 서열 식별 번호: 1에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 서열 식별 번호: 2에서 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 RNA를 발현시키는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별 번호: 3에서 제시된 핵산 서열을 포함한다.

일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-3p에 혼성화된다. 일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-3p에 완전히 상보적이다. 일부 측면들에서, 상기 miR-204-3p는 서열 식별 번호: 5에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 서열 식별 번호: 6에서 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 RNA를 발현시키는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별 번호: 7에서 제시된 핵산 서열을 포함한다.

일부 측면들에서, 상기 RNA는 적어도 2개의 miR-204 결합 부위를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 RNA는 2개 miR-204 결합 부위, 3개 miR-204 결합 부위, 4개 miR-204 결합 부위, 5개 miR-204 결합 부위, 또는 6개 miR-204 결합 부위를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 RNA는 2개 miR-204 결합 부위를 포함한다. 일부 측면들에서, 각각의 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 이의 5' 단부에 서열 식별 번호: 19에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 각각의 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 이의 3' 단부에 서열 식별 번호: 20에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 2개 miR-204 결합 부위는 이들 miR-204 결합 부위 사이에 루프를 형성하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 루프는 서열 식별 번호: 13에 제시된 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 2개 miR-204 결합 부위를 포함하는 RNA는 제 1 스템(stem) 영역과 제 2 스템 영역을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제 1 스템 영역은 서열 식별 번호: 9에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 식별 번호: 11에 제시된 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 상기 2개 miR-204 결합 부위중 적어도 하나에 연계된다. 일부 측면들에서, 상기 제 2 스템 영역은 서열 식별 번호: 15에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 식별 번호: 17에 제시된 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 상기 2개 miR-204 결합 부위중 적어도 하나에 연계된다. 일부 측면들에서, 상기 RNA는 서열 식별 번호: 23, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 또는 57에서 제시된 핵산 서열을 포함한다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터는 바이러스, 플라스미드, 또는 파아지미드이다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터는 바이러스이다. 일부 측면들에서, 상기 바리어스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스 (AAV), SV40-유형 바이러스, 폴리오마바이러스, Epstein-Barr 바이러스, 유두종 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 소아마비 바이러스 및 RNA 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AAV이다. 일부 측면들에서, 상기 AAV는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3A, AAV 유형 3B, AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 측면들에서, 상기 프로모터는 RNA Pol III 프로모터이다. 일부 측면들에서, 상기 RNA Pol III 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, 7SK 프로모터, 5S 프로모터, 아데노바이러스 2 (Ad2) VAI 프로모터, 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 측면들에서, 상기 프로모터는 U6 프로모터를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 측면들에서, 상기 구성적 프로모터는 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 (CMV), 유인원 바이러스 (예를 들어, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), Rous 육종 바이러스, 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR) 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 측면들에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 측면들에서, 상기 유도성 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 측면들에서, 상기 조직 특이적 프로모터는 뉴런, 교질 세포, 또는 뉴런과 교질 세포 모두에서 코딩 영역의 전사를 유도한다.

일부 측면들에서, 상기 miR204 억제제는 약제학적으로 수용가능한 운반체와 함께 약제학적 조성물로 제형화된다. 일부 측면들에서, 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 인지 증상과 비교하여, 해당 대상체에서 하나 또는 그 이상의 인지 증상을 개선시킨다. 일부 측면들에서, 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 기억 상실과 비교하여, 해당 대상체에서 기억 상실을 감소시킨다. 일부 측면들에서, 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 기억 보존과 비교하여, 해당 대상체에서 기억 보존을 개선시킨다. 일부 측면들에서, 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 아밀로이드 베터 (Aβ) 플락 로드와 비교하여, 해당 대상체에서 아밀로이드 베터 (Aβ) 플락 로드를 감소시킨다. 일부 측면들에서, 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 뉴런의 수지상 척추 밀도와 비교하여, 해당 대상체에서 뉴런의 수지상 척추 밀도를 증가시킨다.

일부 측면들에서, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막아래, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 통한 투여다.

도 1A는 4명의 연령-일치된 대조군과 4명의 AD 환자로부터 얻은 mRNA 마이크로어레이 데이터의 분석을 보여준다. 발현 데이터는 NCBI gene expression omnibus (GEO)에 수탁 번호 GES16759로 이용가능하다.
도 1B는 AD 환자의 조직과 비-AD 환자의 조직 간의 Nurr1 mRNA를 비교한 것을 나타낸다.
도 2A는 60명의 AD 환자 뇌의 측두엽 피질로부터의 mRNA 마이크로어레이 데이터의 분석을 보여준다. 발현 데이터는 NCBI's Gene Expression Omnibus(Edgar, 2002)에서 이용가능하며, GEO 일련 수탁 번호 GSE106241을 통하여 접근가능하다. 도 2A는 해당 샘플의 Braak 단계를 보여준다.
도 2B는 상기 AD 환자들 사이의 Nurr1 mRNA 발현의 비교 데이터를 보여준다: Braak 0-3을 갖는 한 그룹과 Braak 4-6을 갖는 또다른 그룹.
도 3은 데이터세트 식별자 PXD008016B를 사용하여 PRIDE 파트너 레파지토리를 통한 ProteomeXchange Consortium의 질량 분석 단백질체학의 임상 데이터를 나타낸다.
도 4는 60명의 AD 환자 뇌의 측두엽 피질로부터의 mRNA 마이크로어레이 데이터의 분석을 보여준다. 마이크로어레이 데이터는 NCBI's Gene Expression Omnibus(Edgar, 2002)에 기탁되었으며, GEO 일련 수탁 번호 GSE106241을 통하여 접근가능하다. 이것은 Nurr1 발현 패턴이 APOE4 유전자형에 의존적임을 보여준다.
도 5는 60명의 AD 환자 뇌의 측두엽 피질 데이터세트로부터 질량분석 단백질체학 데이터 분석을 보여준다. 이 데이터세트는 식별자 PXD008016으로 식별된다. Nurr1 mRNA 발현 패턴 (Y 축)은 아밀로이드 β 단백질의 수준에 따라 달라진다. 이 공보에서 논의된 마이크로어레이 데이터는 NCBI's Gene Expression Omnibus(Edgar, 2002)에 기탁되었으며, GEO 일련 수탁 번호 GSE106241을 통해 접근할 수 있다. 질량 분석 단백질체학의 임상 데이터는 데이터세트 식별자 PXD008016 (

et al., 2016)와 함께 PRIDE 파트너 레파지토리를 통한 ProteomeXchange Consortium에 기탁되었다.
도 6은 60명의 AD 환자 뇌의 측두엽 피질 데이터세트로부터 질량분석 단백질체학 데이터 분석을 보여준다. 이 데이터세트는 식별자 PXD008016으로 식별된다. Nurr1 mRNA 발현 패턴 (Y 축)은 β 세크레타제 수준 (X 축)에 따라 달라진다.
도 7은 호모 사피엔스 핵 수용체 서브패밀리 4 그룹 A 구성원 2 (NR4A2), 전사체 변이체 1, mRNA의 'UTR을 보여준다. 밑줄친 서열은 miR-204-5p의 서열에 결합하는 서열이다. 도 8 참고.
도 8은 Nurr1 3' UTR 영역의 일부분과 함께 정렬된 miR-204-5p 씨드(seed) 서열을 보여준다.
도 9는 miR-204-5p 결합 부위를 발현시키는 pCMV-miR-204-5p가 각 벡터에 추가될 때, 인간 Nurr1의 야생형 3'UTR (좌측 2 개 막대) 또는 인간 Nurr 1의 돌연변이 3'UTR (우측 2 개 막대)을 포함하는 각 벡터로부터 발현된 루시퍼라제 활성을 비교한 것이다.
도 10은 항-miR204-5p 억제제의 기전을 나타낸다. 항-miR-204-5p는 miR-204-5p와 Nurr1의 3' UTR 사이의 상호작용을 방지하고, 이로 인하여 Nurr1 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
도 11은 대조군 모의(Mock)-또는 항-miR-204-5p-처리된 일차 뉴런 배양 세포주의 세포 용해물에서 Nurr1 단백질의 면역블랏을 나타낸다. 항-miR 204-5p는 일차 뉴런 배양 세포주에서 Nurr1 발현을 증가시킨다.
도 12는 AAV 바이러스성 치료요법적 시스템을 도시한다.
도 13은 Nurr1의 공-초점 영상으로부터의 대표적인 피질 영상을 보여준다. 좌측 페널에서는 음성 대조군을 투여한 후 5XFAD 마우스 피질을 보여준다; 우측 페널에서는 항-miR-204를 발현시키는 바이러스성 시스템을 투여 한 후 5X FAD 마우스 피질을 보여준다.
도 14A 및 14B는 대조군 모의-또는 바이러스성 시스템 항-miR-204-5p-처리된 5xFAD의 뇌 용해물에서 Nurr1 단백질의 면역블랏 검출을 나타낸다. 바이러스성 시스템 항-miR 204-5p는 5xFAD 뇌에서 Nurr1 발현을 촉진시킨다.
도 15는 5xFAD의 치아 이랑(dentate gyrus)의 면역조직화학적 분석을 나타낸다. 바이러스성 시스템 항-miR-204는 5XFAD에서 아밀로이드 플락 부하를 감소시킨다. 모의 또는 바이러스성 시스템 항-miR-204를 투여한 후, 치아 이랑의 면역 조직 화학적 분석. 뇌 절편에서 확산 플락은 항-아밀로이드 베타 (클론 6E10, 적색) 및 핵 (청색)으로 착색되었다.
도 16은 항-miR-204 억제제를 발현시키는 바이러스성 시스템 및 음성 대조군을 투여한 후, 새로운 물체 인지 테스트 결과를 나타낸다.
도 17은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 microRNA 결합 부위를 포함하는 예시적인 Tough Decoys 구조체를 나타낸다. 좌측 상단 다이어그램은 둘 또는 그 이상의 mRNA 결합 부위 (MBS)를 포함하는 Tough Decoy의 모듈 구조를 보여준다.

상세한 설명

본 명세서는 miR-204 억제제, 예를 들면, 벡터, 예를 들면, AAV 벡터, 프로모터와 예를 들면, 이 프로모터의 하류에 위치한 RNA 발현 영역을 포함하는 AAV 벡터의 용도에 관계하며, 이때 상기 RNA 발현 영역은 적어도 하나의 miRNA-204 결합 부위를 포함하는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 상기 RNA 발현 영역은 단백질을 인코드하지 않는다. 상기 miR-204 결합 부위 또는 부위들은 내인성 miR-204에 결합하여 하나 또는 그 이상의 내인성 폴리펩티드의 발현을 조절하고, 이는 다시 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환 또는 파킨슨 질환의 증상을 치료, 또는 증상을 개선시킨다. 다양한 측면의 비-제한적인 예시들은 본 개시에 제시되어 있다.

본 명세서를 더 상세하게 기술하기 전에, 본 명세서는 기술된 특정 조성물 또는 공정 단계에 국한되지 않고, 물론 변할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서를 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에 설명되고 예시된 각각의 개별적인 측면은 본 개시의 범위 또는 사상으로부터 이탈하지 않고, 임의의 다른 여러 측면들중의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 또는 조합될 수 있는 별개의 구성 요소 및 특징을 갖는다. 언급된 임의의 방법은 언급된 사안의 순서대로 실행되거나, 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실행될 수 있다.

본 명세서에 제공된 표제는 본 명세서의 다양한 측면의 제한하는 것이 아니라, 이는 명세서 전체를 참조하여 정의될 수 있을 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 측면을 설명하기 위한 목적이고, 임의의 제한을 두려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 하는데, 그 이유는 본 명세서의 범위는 오로지 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.

따라서 바로 아래에 정의된 용어들은 이들 모두 명세서를 참조하여 보다 완전하게 정의된다.

I. 정의

본 명세서를 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 상세한 명세서 전반에 걸쳐 추가적인 정의가 제시된다.

"a" 또는 "an"가 붙은 용어는 그 대상 중 하나 이상을 지칭하고; 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 단수 부정관사("a", "an"), "하나 또는 그 이상의" 그리고 "적어도 하나"는 상호 교환적으로 사용된다. 임의의 선택적 요소를 배제하기 위해, 청구 범위의 초안이 작성될 수 있다는 점에 유의한다. 따라서,이 진술은 청구항 요소의 인용 또는 부정적 제한의 사용과 관련하여, "단독", "전용" 등과 같은 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로 사용되도록 의도되었다.

더욱이, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"이란 서로를 포함하거나 또는 포함하지 않는 2 개의 특정된 특징 또는 구성 요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 구절에서 사용된 용어 "및/또는", 이를 테면 "A 및/또는 B"는 "A와 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함한다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 문구에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 다음 각 측면을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).

본 명세서에서 "~를 포함하는(comprising)"이라는 언어로 측면들이 기술되는 경우, 그렇지 않으면 "~로 구성되는(consisting of)" 및/또는 "본질적으로 ~로 구성되는(consisting essentially of)"의 관점에서 설명된 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.

명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 명세서에 관련된 당업계 숙련자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 본 명세서에 사용된 많은 용어의 일반 사전적 의미를 숙련자에게 제공한다.

단위, 접두사 및 기호는

International de Unites (SI) 승인 양식에 표시되어 있다. 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 값의 범위가 언급되는 경우, 그 범위의 언급된 상한과 하한 사이의 각각의 중간 정수 값, 그리고 이들 각각의 분수가 또한 그러한 값 사이의 각 하위 범위와 함께 구체적으로 개시된다는 것을 이해해야 한다. 임의의 범위의 상한과 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 또는 배제될 수 있으며, 어느 하나 또는 둘 다 포함되지 않는 각 범위도 본 개시 내용에 포함된다. 따라서, 본원에 언급된 범위는 언급된 종점을 포함하는 범위 내의 모든 값에 대한 축약 형으로 이해된다. 예를 들면, 1 내지 10의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 그리고 10으로 구성된 군에서 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위-범위를 내포하는 것으로 이해된다.

값이 명시적으로 인용되는 경우, 인용된 값과 거의 동일한 양 또는 양인 값도 본 개시의 범위 내에 있음을 이해해야 한다. 조합이 개시되는 경우, 그 조합의 요소의 각 하위 조합도 구체적으로 개시되며 본 개시의 범위 내에 있다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소 그룹이 개별적으로 개시되는 경우, 이들의 조합도 개시된다. 명세서에서 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 배제되는 해당 명세서의 예시 또한 본 명세서에 개시되고; 본 명세서의 하나 이상의 요소는 그러한 배제를 가질 수 있고, 그러한 배제를 갖는 요소의 모든 조합이 본 명세서에 개시된다.

뉴클레오티드는 통상적으로 인정되는 단일-문자 코드로 언급된다. 달리 표시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3'방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 아미노산은 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에서 권장하는 통상적으로 알려진 1-문자 기호에 의해 본 명세서에서 지칭된다. 따라서 'a'는 아데닌, 'c'는 시토신, 'g'는 구아닌, 't'는 티민, 그리고 'u'는 우라실을 나타낸다.

아미노산 서열은 좌측에서 우측 아미노에서 카르복시 방향으로 기록된다. 아미노산은 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에서 권장하는 통상적으로 알려진 3-문자 기호 또는 1-문자 기호에 의해 본 명세서에서 지칭된다.

용어 "약(about)"이란 대략적으로, 어림잡아, 대개 또는 이의 범위를 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. "약"이라는 용어가 숫자 범위와 함께 사용되는 경우, 지정된 숫자 값의 위-아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"이란 명시된 값의 위 또는 아래 (더 높거나 또는 낮은) 예를 들어, 상-하 10%까지 변동된 수치적 값으로 수정할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아데노-연합된 바이러스" (AAV)에는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3 (유형 3A 및 3B 내포됨), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, AAVrh.74, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, Gao et al. (J. Virol. 78:6381 (2004)) 및 Moris et al. (Virol. 33:375 (2004))에서 개시된 AAV 혈청형과 클레이드(clades), 그리고 현재 공지된 또는 나중에 발견될 임의의 다른 AAV들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers) 참고. 일부 구체예들에서, "AAV"에는 공지의 AAV의 유도체가 내포된다. 일부 구체예들에서, "AAV"에는 변형된 또는 인공적인 AAV가 내포된다.

용어 "투여", "투여하는" 및 이의 문법적으로 변형된 형태는 약제학적으로 허용되는 경로를 통해 본 명세서의 벡터와 같은 조성물을 대상체로 도입시키는 것을 지칭한다. 본 명세서의 벡터와 같은 조성물을 대상체로 도입시키는 것은 예를 들면, 종양내, 경구, 폐, 비강내, 비-경구 (정맥내, 동맥-내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프액안으로, 척수강내(intrathecally), 안구 주위 또는 국소와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 이루어진다. 투여에는 자가-투여와 타인에 의한 투여가 내포된다. 적합한 투여 경로는 해당 조성물 또는 제제의 의도된 기능을 수행하게끔 한다. 예를 들면, 적합한 경로가 정맥내 경우인 경우, 상기 조성물은 대상체의 정맥으로 이 조성물 또는 제제를 도입시킴으로써 투여된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 관심 값에 용어 "대략적으로(approximately)"가 적용될 경우, 이는 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 측면들에서, 용어 "대략적으로"란 다른 언급이 없거나, 또는 문맥에서 명시적으로 나타나지 않는 한, 언급된 참조 값의 임의의 한 방향(더 많거나, 또는 더 작은)으로 이 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 (해당 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외) 안에 속하는 값의 범위를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보존된(conserved)"이란 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열에서 비교되는 2개 또는 그 이상의 서열 상의 동일한 위치에서 변경되지 않은, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기들을 지칭한다. 상대적으로 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산은 더욱 관련된 서열들 중에서 해당 서열의 다른 부분에 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 더 보존된 것들이다.

일부 측면들에서, 2개 또는 그 이상의 서열이 서로에 대해 100% 동일하다면, 이들은 "완전히 보존된" 또는 "동일"하다라고 한다. 일부 측면들에서, 2개 또는 그 이상의 서열이 서로에 대해 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 또는 적어도 95% 동일하다면 "매우 보존된"것이라고 한다. 일부 측면들에서, 2개 또는 그 이상의 서열이 서로에 대해 약 70% 동일한, 약 80% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 경우, 이들은 "매우 보존된" 것이라고 한다. 일부 측면들에서, 2개 또는 그 이상의 서열이 서로에 대해 적어도 30% 동일한, 적어도 40% 동일한, 적어도 50% 동일한, 적어도 60% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 90% 동일한, 또는 적어도 95% 동일한 경우, "보존된"것이라고 한다. 일부 측면들에서, 2개 또는 그 이상의 서열이 서로에 대해 약 30% 동일한, 약 40% 동일한, 약 50% 동일한, 약 60% 동일한, 약 70% 동일한, 약 80% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95% 동일한, 약 98% 동일한, 또는 약 99% 동일한 경우, "보존된"것이라고 한다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이, 또는 이의 일부, 이의 영역 또는 이의 특징에 적용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "~로부터 유래된(derived from)"이란 명시된 분자 또는 유기체로부터 단리되거나, 또는 명시된 분자 또는 유기체로부터 얻은 명시된 분자 또는 유기체, 또는 정보 (예를 들면, 아미노산 또는 핵산 서열)를 이용하여 만든 성분을 지칭한다. 예를 들면, 제 2 핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열은 제 2 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 내포할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 경우, 유래된 종은 예를 들면, 자연 발생적 돌연변이유발, 인공적으로 지시된 돌연변이유발 또는 인공적인 무작위 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 유도하기 위해 사용되는 돌연변이유발은 의도적으로 지시되거나 또는 의도적으로 무작위화되거나, 또는 이들 각각의 혼합일 수 있다. 상기 제 1 로부터 유래된 상이한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 생성하기 위해 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 돌연변이유발은 무작위 사건 (예를 들면, 중합효소 부정(infidelity)에 의해 야기됨)일 수 있고, 이러한 유래된 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 적절한 스크리닝 방법, 예를 들면, 본원에서 논의되는 방법에 의해 식별될 수 있다. 폴리펩티드의 돌연변이유발은 전형적으로 해당 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 조작을 수반한다. 일부 구체예들에서, 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 해당 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대해 각각 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일성을 갖고, 이때 해당 제 1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 해당 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 유지한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "RNA 발현 영역" 또는 "RNA 발현 서열"이란 RNA 서열로 전사될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에서 이용된 RNA 발현 영역은 아미노산으로 해독되지 않고, 오로지 RNAs로만 남아있다. 상기 RNA 발현 영역은 프로모터와 종료 서열에 작동가능하도록 연계될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"이란 아미노산으로 해독가능한 코돈으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일부분이다. "중지 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA)은 일반적으로 아미노산으로 해독되지 않지만, 이것은 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있지만, 그러나 임의의 측면 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 그리고 이와 유사한 것들은 코딩 영역의 일부가 아니다. 코딩 영역의 경계는 생성된 폴리펩티드의 아미노 말단을 인코딩하는 5' 말단의 시작 코돈과 생성된 폴리펩티드의 카르복실 말단을 인코딩하는 3' 말단의 해독 중지 코돈에 의해 일반적으로 결정된다.

용어 "상보적인(complementary)" 그리고 "상보성(complementarity)"이란 또는 Watson-Crick 염기-쌍형성 규칙에 의해 서로 관련된 2개 또는 그 이상의 올리고머 (즉, 각각은 핵염기 서열을 포함함), 또는 올리고머와 표적 유전자를 지칭한다. 예를 들면, 핵염기 서열 "T-G-A (5'→3')"은 핵염기 서열 "A-C-T (3'→ 5')"에 상보적이다. 염기-쌍형성 규칙에 따라, 주어진 핵 염기 서열의 모든 핵 염기보다 적은 수가 다른 핵 염기 서열과 매칭되는 경우 이때 상보성은 "부분적(partial)"이라고 할 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 주어진 핵염기 서열과 다른 핵염기 서열 간의 상보성은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%일 수 있다. 또는, 주어진 핵염기 서열과 또다른 핵염기 서열 간에 "완전한"또는 "완벽한"(100%) 상보성이 있을 수 있으며, 예시를 계속 들 수 있다. 핵 염기 서열 간의 상보성의 정도는 서열 간의 혼성화(hybridization)의 효율성과 강도에 상당한 영향을 미친다.

용어 "하류(downstream)"란 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 3'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정 구체예들에서, 하류 뉴클레오티드 서열은 전사의 출발 점에 이어서 나오는 서열과 관련된다. 예를 들면, 유전자의 해독 개시 코돈은 전사의 출발 부위의 하류에 위치한다.

용어 "부형제" 및 "담체"는 호환되며, 화합물의 투여를 더 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 추가되는 비활성 물질을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"이란 폴리뉴클레오티드가 유전자 산물, 예를 들면, RNA를 만드는 과정을 지칭한다 발현에는 폴리뉴클레오티드가 micro RNA 결합 부위, 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사를 내포하나, 이에 국한되지 않는다. 발현으로 "유전자 산물"이 생성된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 산물이란 예를 들면, 핵산, 이를 테면, 유전자의 전사에 의해 만들어진 RNA일 수 있다. 본원에서 기재된 유전자 산물에는 전사 후 변형, 예를 들면, 폴리아데닐화된 핵산이 추가 포함된다. 용어 "수율(yield)"이란 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자의 발현에 의해 생성된 유전자 산물의 양을 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상동성(homology)"이란 중합체 분자, 예를 들면 핵산 분자 (예를 들면 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이, 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "상동성"은 두 분자 간의 진화적 관계를 의미한다. 따라서, 두 분자가 상동성이라면, 공통적인 진화론적 조상을 가질 것이다. 본 명세서의 맥락에서, 용어 상동성에는 동일성 및 유사성 모두 포괄된다.

일부 측면들에서, 중합체 분자는 해당 분자에서 단랑체의 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 동일하거나(정확하게 동일한 단량체) 또는 유사한 경우(보존적 치환), 이들은 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 용어 "상동성"은 반드시 적어도 2개의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열) 간의 비교를 지칭한다.

본 명세서의 맥락에서, 치환은 핵산 수준 (아미노산 치환으로 지칭되는 경우에도)에서 수행되는데, 즉, 아미노산 잔기가 대체 아미노산 잔기로의 치환은 제 1 아미노산을 인코딩하는 코돈을 제 2 아미노산을 인코딩하는 코돈으로 치환시켜 수행된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동일성(identity)이란 중합체 분자 간의, 예를 들면, 폴리펩티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 분자 (예를 들면 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 간의 전반적인 단량체 보존을 지칭한다. 용어 "동일한"이란 임의의 추가적인 수식어구가 없는 경우, 예를 들면, 단백질 A가 단백질 B에 동일하다란 말은 서열이 100% 동일하다 (100% 서열 동일성)라는 것을 의미한다. 두 서열의 설명이 예를 들면, "70% 동일한" 두 서열의 설명은 이들이 예를 들면, "70% 서열 동일성"을 갖는 것으로 설명되는 것에 대등하다.

예를 들어, 두 폴리펩티드 서열의 동일성 백분율 계산은 최적의 비교 목적을 위해, 두 서열을 정렬하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제 1 폴리펩티드 서열과 제 2 폴리펩티드 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-동일 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 특정 측면들에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 그 다음 대응하는 아미노산 위치에 있는 아미노산을 비교한다.

제 1 서열의 한 위치를 제 2 서열의 대응 위치에 있는 동일한 아미노산이 차지하는 경우, 이들 분자는 해당 위치에서 동일하다. 두 서열의 최적 배열을 위하여 도입이 필요했던 각 갭의 수, 각 갭의 길이를 고려하여, 두 서열 간의 동일성 백분율은 이들 서열에 의해 공유되는 동일한 위치들의 수에 대한 함수가된다. 서열들의 비교 및 두 서열 간의 동일성 백분율 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 실행될 수 있다.

적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 출처에서 구할 수 있으며, 단백질 및 뉴클레오티드 서열의 정렬에 사용할 수 있다. 서열 동일성 백분율 결정에 적합한 프로그램 중 하나는 U.S. government's National Center for Biotechnology Information BLAST 웹 사이트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공하는 BLAST 프로그램 세트의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 서열을 비교한다. BLASTN은 핵산 서열 비교에 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열 비교에 사용된다. 다른 적합한 프로그램은 예를 들어, Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher이며, 이는 EMBOSS 생물정보학 프로그램 제품 군의 일부이며, www.ebi.ac.uk/Tools/psa의 European Bioinformatics Institute (EBI)에서도 이용가능하다.

서열 정렬은 MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 함께 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 안에 상이한 영역은 각각 고유한 서열 동일성 백분율을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성 백분율 값은 소수점 첫째 자리는 근사치로 반올림된다. 예를 들면, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 내림되고, 반면 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 올림된다. 또한 길이 값은 항상 정수이어야 한다.

특정 측면들에서, 제 2 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 제 1 아미노산 서열 (또는 핵산 서열) 또는 제 1 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)의 동일성 백분율 (ID% )은 ID% = 100 x (Y/Z)로 계산되고, 여기서 Y는 제 1 서열과 제 2 서열의 정렬(시각적 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)에서 상동적 일치로 등급화된 아미노산 잔기 (또는 핵 염기)의 수이고, Z는 제 2 서열의 총 잔기 수이다. 제 1 서열의 길이가 제 2 서열의 길이보다 길다면, 해당 제 1 서열의 해당 제 2 서열에 대한 상동성 백분율은 해당 제 2 서열이 해당 제 1 서열에 대한 동일성 백분율보다 더 높을 것이다.

당업자는 서열 동일성 백분율 계산을 목적으로 한 서열 정렬 생성은 일차 서열 데이터에 의해 독점적으로 구동되는 이원(binary) 서열-서열 비교에 국한되지 않음을 인지할 것이다. 서열 정렬은 구조적 데이터 (예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터 (예를 들어, 돌연변이의 위치) 또는 계통발생 데이터와 같은 이종(heterogeneous) 출처로부터의 데이터와 서열 데이터를 통합함으로써 생성될 수 있음을 또한 인지할 것이다. 이종 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 생성하는 적절한 프로그램은 T-Coffee이며, www.tcoffee.org에서 구할 수 있으며, EBI와 같이 대안으로 구할 수 있다. 서열 동일성 백분율 계산에 사용되는 최종 정렬은 자동 또는 수동으로 큐레이팅될 수 있음을 인지할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된", "정제된", "추출된" 그리고 이들의 문법적 변형 용어는 호환적으로 사용되며, 하나 또는 그 이상의 정제 과정을 거친 본 명세서의 원하는 벡터의 제조 상태를 지칭한다. 일부 측면들에서, 본원에서 사용된 바와 같이, 단리(isolating) 또는 정제(purifying)란 세포가 함유된 샘플로부터 본 명세서의 벡터를 포함하는 조성물을 빼내는, 부분적으로 빼내는(예를 들어, 분획) 프로세스를 말한다. 일부 측면들에서, 단리된 조성물은 검출가능한 원치 않는 활성을 갖지 않거나, 또는 대안적으로 원치 않는 활성의 수준 또는 양이 허용가능한 수준 또는 양 이하이다. 다른 측면들에서, 단리된 조성물은 이의 농도 및/또는 활성의 허용되는 양 및/또는 그 이상에서 본 명세서의 원하는 벡터의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 측면들에서, 상기 단리된 조성물은 이 조성물이 수득되는 출발 물질 (예를 들면, 세포 준비물)과 비교하여 충부하다. 이러한 풍도(enrichment)는 출발 물질과 비교하였을 때 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 적어도 약 99.99%, 적어도 약 99.999%, 적어도 약 99.9999%, 또는 99.9999% 초과일 수 있다. 일부 측면들에서, 단리된 준비물은 실질적으로 잔류 생물학적 산물이 없다. 일부 측면들에서, 상기 단리된 준비물에는 임의의 생물학적 오염 물질이 100% 없고, 적어도 약 99% 없고, 적어도 약 98% 없고, 적어도 약 97% 없고, 적어도 약 96% 없고, 적어도 약 95% 없고, 적어도 약 94% 없고, 적어도 약 93% 없고, 적어도 약 92% 없고, 적어도 약 91% 없고, 또는 적어도 약 90% 없다. 잔류 생물학적 산물에는 비생물적(abiotic) 물질(화학물질 내포됨) 또는 원치않은 핵산, 단백질, 지질, 또는 대사산물이 내포될 수 있다

용어 "연계된(linked)이란 본원에서 사용된 바와 같이, 제 1 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 제 2 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 공유적 또는 비-공유적으로 결합된 것을 지칭한다. 상기 제 1 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 제 2 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 직접 연결되거나, 또는 병치되거나, 또는 대안적으로 개재(intervening) 서열을 이용하여 해당 제 1 서열을 해당 제 2 서열에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 용어 "연계된"이란 제 1 폴리뉴클레오티드 서열이 이의 5'-단부 또는 3'-단부에서 제 2 폴리뉴클레오티드 서열에 융합된 것 뿐만 아니라, 제 1 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 (또는 상기 제 2 폴리뉴클레오티드 서열)가 해당 제 2 폴리뉴클레오티드 서열 (또는 해당 제 1 폴리뉴클레오티드 서열, 각각)의 임의의 두 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것도 내포된다. 상기 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은 제 2 폴리뉴클레오티드 서열에 포스포디에스테르 결합 또는 링커를 통하여 연계될 수 있다. 상기 링커는 예를 들면, 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

용어 "miRNA" 또는 "miR" 또는 "microRNA"는 호환적으로 사용되며, 진핵 생물에서 발견되는 RNA-기반 유전자 조절에 관여하는 microRNA 분자를 의미한다. 이 용어는 전구체로부터 프로세싱된 단일-가닥으로된 RNA 분자를 지칭할 때 이용될 수 있다. 본 명세서에 관련된 miRNAs 이름 및 이들의 서열은 본원에 제공된다. MicroRNAs는 불완전한 염기-쌍형성을 통해 표적 mRNAs를 인지하고, 이에 결합하여 표적 mRNA의 불안정화 또는 해독 억제를 유도하고, 이로 인하여 표적 유전자 발현을 하향 조절된다. 반대로, miRNA 결합 부위를 포함하는 분자 (일반적으로 miRNA의 씨드 영역에 상보적인 서열을 포함하는 분자)를 통해 miRNAs를 표적화하면 해당 표적 유전자의 상향 조절을 유도하는 miRNA-유도된 해독 억제를 감소시키거나 또는 억제할 수 있다.

용어 "미스매치(mismatch)" 또는 "미스매치들"이란 염기-쌍형성 규칙에 따라, 올리고머 핵염기 서열에서 표적 pre-mRNA에 일치하지 않는 하나 또는 그 이상의 핵 염기(연속적이건 또는 별개이건)를 지칭한다. 완벽한 상보성이 대개 바람직하지만, 일부 구체예들에는 표적 pre-mRNA에 대해 하나 또는 그 이상의, 바람직하게는 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개 미스매치가 내포될 수 있다. 상기 올리고머 안 임의의 위치에 변이가 내포된다. 특정 구체예들에서, 본 명세서의 안티센스 올리고머에는 말단 근처의 핵염기 서열에 변이, 내부의 변이들이 내포되며, 존재하는 경우, 5' 말단 및/또는 3' 말단의 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개 서브유닛 안에 있다. 특정 구체예들에서, 1개, 2개, 또는 3개 핵염기가 제거될 수 있고, 여전히 표적-상 결합을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "조절하다", "변형하다" 및 이의 문법적 변형은 일반적으로 특정 농도, 수준, 표현, 기능 또는 거동에 적용될 때, 예를 들어, 길항제 또는 작용제로서 작용하도록 하기 위해, 가령, 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 거동을 증가 또는 감소시킴으로써, 예를 들면, 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 거동을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진/자극/상향-조절하거나, 또는 억제/하향-조절을 간섭하는 것을 지칭한다. 일부 경우들에서, 조절제는 대조군에 비해, 또는 일반적으로 예상되는 활성의 평균 수준에 비해, 또는 활성의 대조 수준에 비해 특정 농도, 수준, 활성 또는 기능을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다.

"핵산", "핵산 분자", "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드", 및 이의 문법적 변이는 호환적으로 사용되며, 리보뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르 중합체 형태 (아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드 (데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자"), 또는 이의 임의의 포스포에스테르 유사체, 이를 테면, 단일 가닥으로된 형태 또는 이중-가닥으로된 헬릭스(helix)의 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를 지칭한다. 단일 가닥으로된 핵산 서열이란 단일-가닥으로된 DNA (ssDNA) 또는 단일-가닥으로된 RNA (ssRNA)를 지칭한다. 이중 가닥으로된 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 헬릭스가 가능하다. 용어 핵산 분자, 구체적으로 DNA 또는 RNA 분자는 이 분자의 일차 및 2 차 구조만을 지칭하며, 임의의 특정 3-차 형태로 제한하지 않는다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자 (예를 들어, 제한 단편), 플라스미드, 슈퍼코일(supercoiled) DNA 및 염색체에서 발견되는 이중-가닥으로된 DNA가 내포된다. 특정 이중-가닥으로된 DNA 분자의 구조 논의에있어서, 본원에서 서열은 정상적인 관례에 따라 DNA의 비-전사 가닥(즉, mRNA에 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라 5 '에서 3'방향의 서열 만을 제공하는 것으로 기재될 수 있다. "재조합 DNA 분자"란 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자다. DNA에는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반-합성 DNA가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 본 명세서의 "핵산 조성물"은 본원에서 기재된 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함한다.

본원에 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이란 장 및 국소 투여보다는, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막아래, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

용어 "약제학적으로-허용되는 담체", "약제학적으로-허용되는 부형제" 및 이의 문법적 변형은 U.S. 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 인간을 포함한 동물에 사용하기 위해 U.S. Pharmacopeia에 열거된 모든 제제, 뿐만 아니라 대상체에게 조성물의 투여를 금지하고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐지하지 않는 정도로 바람직하지 않은 생리적 효과의 생성을 야기하지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포괄한다. 약제학적 조성물 제조에 유용한, 일반적으로 안전하고 무독성이며, 바람직한 부형제 및 담체가 내포된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"이란 하나 또는 그 이상의 다른 화학적 성분들, 이를 테면, 약제학적으로-허용되는 담체 및 부형제에 혼합되거나, 또는 서로 섞이거나, 또는 이에 현탁된 본원에서 기재된 하나 또는 그 이상의 화합물, 이를 테면, 예를 들면, EV, 본 명세서의 엑소좀(exosome)을 지칭한다. 약제학적 조성물의 한 가지 목적은 EVs, 예를 들면, 엑소좀 준비물을 대상체에게 투여를 용이하기 위한 것이다.

용어 "플라스미드"는 대개 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 운반하는 염색체-외 요소를 말하며, 일반적으로 원형 이중-가닥으로된 DNA 분자의 형태를 말한다. 이러한 요소는 임의의 출처로부터 유도된 단일-또는 이중-가닥으로된 DNA 또는 RNA의 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파아지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형, 원형 또는 수퍼 코일일 수 있으며, 여기에서 다수의 뉴클레오티드 서열이 프로모터 단편과 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열, 그리고 적절한 3' 비-해독 서열을 세포 안으로 도입시킬 수 있는 독특한 구조로 결합되거나 또는 재조합된다.

용어 "폴리뉴클레오티드"란 본원에서 사용된 바와 같이 임의의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 지칭하는데, 여기에는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이의 유사체들, 또는 이의 혼합물이 내포된다. 이 용어는 해당 분자의 일차 구조를 지칭한다. 따라서, 이 용어에는 삼중-, 이중-그리고 단일-가닥으로된 데옥시리보핵산 ("DNA"), 뿐만 아니라 삼중-, 이중-그리고 단일-가닥으로된 리보핵산 ( "RNA")이 내포된다. 또한, 예를 들어, 알킬화 및/또는 캡핑(capping)에 의한 변형된 폴리뉴클레오티드, 그리고 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드 또한 내포된다. 보다 구체적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"에는 tRNA, rRNA, hRNA, siRNA 및 mRNA가 내포된 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유), 스플라이싱 여부에 관계없이 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드 그리고 및 정상뉴클레오티드(normucleotidic) 백본을 함유하는 다른 중합체, 예를 들어, 폴리아미드 (예를 들면, 펩티드 핵산 "PNAs") 및 폴리몰로리노 중합체와 다른 합성 서열-특이적 핵산 중합체 (이들 중합체는 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기 쌍형성과 염기 적층(stacking)을 허용하는 배치의 핵염기를 함유한다)가 내포된다. 본 명세서의 일부 측면들에서, EV, 예를 들면, 엑소좀에 말레이미드 모이어티를 경유하여 부착된 생물학적 활성 분자는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 특정 측면들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 mRNA를 포함한다. 다른 측면에서, 상기 mRNA는 합성 mRNA이다. 일부 측면들에서, 상기 합성 mRNA는 적어도 하나의 비-천연 핵염기를 포함한다. 일부 측면들에서, 특정 부류의 모든 핵염기는 비-천연 핵염기로 대체되었다 (예를 들어, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 모든 우리딘은 비-천연 핵 염기, 예를 들어, 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있음). 본 명세서의 일부 측면들에서, 상기 생물학적으로 활성 분자는 폴리뉴클레오티드이다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질" 은 본원에서 호환되며, 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 상기 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개입, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 라벨링 성분과의 콘쥬게이션과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포괄한다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산 및 크레아틴과 같은 비-천연 아미노산 내포) 뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드도 이 정의 안에 또한 내포된다. 용어 "폴리펩티드"란 본원에서 사용된 바와 같이, 임의의 크기, 구조 또는 기능을 갖는 단백질, 폴리펩티드, 그리고 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드에는 유전자 산물, 자연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 상동체(homologs), 오르토로그(orthologs), 파라로그(paralogs), 단편 및 전술한 것들의 다른 등가물, 변이체 및 전술한 유사체가 내포된다. 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드이거나, 또는 다중-분자 복합체, 이를 테면, 이량체, 삼량체 또는 사량체일 수 있다. 이들은 단일-쇄 또는 다중-쇄 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있다. 가장 일반적으로 이황화 링키지들이 다중-쇄 폴리펩티드에서 발견된다. 상기 폴리펩티드 용어에는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학 유사 체인 아미노산 중합체에 또한 적용될 수 있다. 일부 측면들에서, "펩티드"는 50개 길이 또는 이보다 적은 수의 아미노산, 예를 들면, 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 또는 50개 길이의 아미노산일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다(prevent)", "예방하는(preventing)", 그리고 이의 변형은 질환, 장애 및/또는 병태의 부분적 또는 완전한 개시; 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 또는 그 이상의 증상, 속성, 또는 임상적 현시 개시의 부분적 또는 완전한 지연; 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 또는 그 이상의 증상, 속성, 또는 현시 개시의 부분적 또는 완전한 지연; 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 진행을 부분적 또는 안전하게 지연; 및/또는 해당 질환, 장애 및/또는 병태와 연합된 병리 발달 위험의 감소를 지칭한다. 일부 측면들에서, 결과 예방은 예방적 치료를 통해 달성된다.

본원에서 용어 "프로모터" 및 "프로모터 서열"은 호환적으로 사용되며, 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 전체적으로 고유(native) 유전자에서 파생되거나, 또는 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 다른 요소로 구성되거나, 또는 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수도 있다. 당업자는 상이한 프로모터들이 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 인지할 것이다. 대부분의 세포 유형에서 대부분 시점에 유전자가 발현될 수 있도록 하는 프로모터를 일반적으로 "구성적(constitutive) 프로모터"라고 한다. 특정 세포 유형에서 유전자가 발현될 수 있도록 하는 프로모터는 일반적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"라고 한다. 특정 발달 단계 또는 세포 분화에서 유전자가 발현될 수 있도록 하는 프로모터를 일반적으로 "발생-특이적 프로모터"또는 "세포 분화-특이적 프로모터"라고 한다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화학제, 리간드, 빛 또는 이와 유사한 것으로 세포를 노출 또는 처리한 후, 유전자가 발현될 수 있도록하는 프로모터는 일반적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절가능한 프로모터"라고 한다. 대부분의 경우, 조절 서열의 정확한 경계가 완전하게 특정되지 않았기 때문에, 길이가 상이한 DNA 단편들이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 추가로 인지된다.

상기 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에 전형적으로 결합되고, 배경 수준 이상의 검출가능한 수준에서 전사 개시에 필요한 최소 수의 염기 또는 요소이 내포되도록 상류(5'-방향)으로 연장된다. 프로모터 서열 내에서 전사 개시 부위 (예를 들어, 뉴클레아제 S1로 매핑함으로써 통상적으로 정의됨) 뿐만 아니라 RNA 중합 효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인 (컨센서스(consensus) 서열)을 볼 수 있을 것이다. 일부 구체예들에서, 상이 핵산 분자는 조직 특이적 프로모터를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "예방적"이란 질환 또는 병태의 발병을 예방하거나, 또는 질환 또는 병태와 관련된 증상의 예방 또는 지연에 사용되는 치료 또는 작용 과정을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "예방"이란 건강을 유지하고 출혈의 개시를 예방 또는 지연시키거나, 질환 또는 병태와 관련된 증상의 예방 또는 지연을 위한 조치를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 조절 영역" 또는 "조절 영역"이란 코딩 영역의 상류 (5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 안, 또는 코딩 서열의 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치하고, 연합된 코딩 영역의 전사, RNA 프로세싱, 안정성 또는 해독에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 영역에는 프로모터, 해독 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인지 서열, RNA 프로세싱 부위, 작동체(effector) 결합 부위, 또는 스템-루프 구조가 내포될 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현되도록 의도된 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.

본 명세서의 miRNA 결합 쪽을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및/또는 하나 또는 그 이상의 코딩 영역에 작동가능하도록 연합된 다른 발현 (예를 들면, 전사) 조절 요소들을 내포할 수 있다. 작동가능한 연합에서, 유전자 산물에 대한 코딩 영역은 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현이 배치되는 방식으로 하나 또는 그 이상의 조절 영역과 연합된다. 예를 들면, 프로모터 기능 유도에 의해 코딩 영역에 의해 인코드된 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA가 전사된다면, 그리고 해당 프로모터와 코딩 영역 사이의 링키지 속성이 이 프로모터가 해당 유전자 산물의 발현을 지시하는 능력을 간섭하지 않거나, 또는 DNA 주형이 전사되는 능력을 간섭하지 않는다면, 이들 코딩 영역과 프로모터는 "작동가능하도록 연합된다". 프로모터 이외의 다른 발현 조절 요소들, 예를 들면 인헨서, 오퍼레이터, 리프레서(repressors), 및 전사 종료 신호는 유전자 산물 발현을 지시하기 위해 코딩 영역과 작동가능하도록 또한 연합될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유사성(similarity)"이란 중합체 분자, 예를 들면 폴리뉴클레오티드 분자 (예를 들면 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이, 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 중합체 분자의 서로에 대한 유사성 백분율 계산은 동일성 백분율 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있지만, 유사성 백분율 계산은 당업계에서 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려한다. 유사성의 백분율은 사용된 비교 척도, 즉, 아미노산이 진화적 근접성, 전하, 부피, 유연성, 극성, 소수성, 방향성(aromaticity), 등전점, 항원성 또는 이의 조합에 따라 비교되는지 여부에 따라 달라지는 것으로 이해된다.

용어 "대상체", "환자", "개체" 및 "숙주" 및 이의 변형 용어들은 본원에서 호환적으로 사용되며, 인간, 가축 (예를 들면, 개, 고양이 및 이와 유사한 것들), 농장 동물 (예를 들면, 소, 양, 돼지, 말 및 이와 유사한 것들) 및 실험실 동물 (예를 들면, 원숭이, 쥐, 생쥐, 토끼, 기니피그 및 이와 유사한 것들)을 포함하는 진단, 처치(treatment) 또는 치료요법(therapy)을 요하는 임의의 포유류 대상체, 특히 인간를 지칭한다. 본원에 기술된 방법들은 인간 치료요법 및 수의학적 응용 모두에 적용가능하다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이를 필요로 하는 대상체"라는 어구는 예를 들어, 지혈을 개선하기 위해 본 명세서의 핵산 분자 또는 벡터를 투여하여 이익을 얻을 수 있는 포유류 대상체가 내포된다.

본원에 사용된 "전신 투여", "전신으로 투여된", "말초 투여" 및 "말초적으로 투여된"이라는 문구는 중추 신경계로 직접 투여되는 것을 제외하고 화합물, 약물 또는 기타 물질을 환자의 시스템으로 진입시키는 투여를 의미하여, 이러한 투여에 의해, 따라서 투여된 물질은 환자의 신진 대사 및 기타 유사한 과정을 겪게 되는데, 예를 들어, 피하 투여를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료요법적으로 효과량"이란 이를 필요로 하는 대상체에 원하는 치료 효과, 약리학 적 및/또는 생리학적 효과를 생성하기에 충분한 본 명세서의 EV 또는 엑소좀을 포함하는 시약 또는 약제학적 화합물의 양을 말한다. 치료요법적으로 효과량이란 예방이 치료요법으로 간주될 수 있기 때문에 "예방적 효과량"이 될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "전사 대조군 서열"이란 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 DNA 조절 서열, 이를 테면, 프로모터, 인헨서, 종결자, 그리고 이와 유사한 것들을 지칭한다. 다양한 전사 대조군 영역들이 당업자에게 공지되어 있다. 이것들에는 척추동물 세포에서 기능을 하는 전사 조절 영역 이를 테면, 사이토메갈로바이러스의 프로모터 및 인헨서 세그먼트(인트론-A와 함께 즉각 초기 프로모터), 시미언 바이러스 40 (초기 프로모터), 및 레트로바이러스 (이를 테면 Rous 육종 바이러스)를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자, 이를 테면 액틴, 열 쇼크 단백질, 소의 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈, 뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열로부터 유도된 것들이 포함된다. 추가적으로 적합한 전사 대조군 영역에는 조직-특이적 프로모터와 인헨서, 뿐만 아니라 림포킨-유도성 프로모터 (예를 들면, 인터페론 또는 인터루킨에 의한 유도성 프로모터)가 내포된다.

유사하게, 다양한 해독 조절 요소들은 당업자들에게 공지되어 있다. 이들에는 피코르나 바이러스로부터 유도된 리보솜 결합 부위, 해독 개시 및 종료 코돈, 및 요소(구체적으로 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, CITE 서열로도 불림)를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

용어 "치료하다", "치료", 또는 "치료하는"이란 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들면, 질환 또는 병태의 중증도 감소; 질환 과정 경과 기간의 감소; 질환 또는 병태와 연합된 하나 또는 그 이상의 증상의 개선 또는 제거; 질환 또는 병태를 가진 대상체에게 이 질환 또는 병태를 반드시 치유하지 않고 유익한 효과를 제공하는 것을 지칭한다. 이 용어에는 질환 또는 병태 또는 이의 증상들의 예방 또는 방지 또한 내포된다. 한 측면에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"이란 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 의미한다.

용어 "상류(upstream)"란 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정 구체예들에서, 상류 뉴클레오티드 서열이란 코딩 영역의 5' 측면 또는 전사의 출발 지점에 위치한 서열에 관계한다. 예를 들면, 대부분 프로모터들이 전사의 출발 부위의 상류에 위치한다.

"벡터"란 핵산의 클로닝 및/또는 숙주 세포로의 전달을 위한 임의의 비히클을 의미한다. 벡터는 부착된 세그먼트의 복제를 야기하기 위해 다른 핵산 세그먼트가 부착될 수 있는 레플리콘(replicon)일 수 있다. "레플리콘"이란 생체 내에서 자율 복제 단위로서 기능하는, 즉, 자체 제어 하에 복제할 수 있는 임의의 유전적 요소 (예를 들어, 플라스미드, 파아지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"에는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포 안으로 핵산을 도입하기 위한 바이러스 및 비-바이러스 비히클 모두를 포함한다. 예를 들어, 플라스미드, 변형된 진핵 바이러스 또는 변형된 박테리아성 바이러스가 내포된 많은 수의 벡터가 당업계에 알려져 있고 사용된다. 폴리 뉴클레오티드를 적합한 벡터로 삽입시키는 것은 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 상보적인 코헤시브(cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터에 연결시킴으로써 이루어질 수 있다.

벡터는 해당 벡터가 통합된 세포를 선택 또는 식별할 수 있도록 하는 선별가능한 마커 또는 리포터가 인코딩되도록 조작될 수 있다. 선별가능한 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에 포함된 다른 코딩 영역을 숙주 세포에 통합시키고, 이를 발현시킴으로써, 해당 숙주 세포를 식별해내고 및/또는 선택할 수 있도록 한다. 당업계에 공지되고 사용되는 선별가능한 마커 유전자의 예시에는 다음이 내포된다: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타 마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 설폰아미드 및 이와 유사한 것들에 대한 내성을 제공하는 유전자; 그리고 표현형 마커로 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자 및 이와 유사한 유전자. 당업계에 공지되고 사용되는 리포터의 예시에는 루시퍼라제 (Luc), 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), β-갈락토시다제 (LacZ), β-글루쿠로니다제 (Gus) 및 이와 유사한 것이 내포된다. 선별가능한 마커는 또한 리포터로 간주될 수 있다.

II. 치료 및 용도

본 명세서는 핵 수용체 서브패밀리 4 그룹 A 구성원 2 (Nurr1) 단백질의 증가된 수준과 연합된 질환 또는 병태 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서는 신경퇴행성 장애 치료를 필요로 하는 대상체에게서 이 장애 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 해당 대상체에게 치료요법적으로 효과량의 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 명세서는 miR204 억제제가 Nurr1 단백질의 발현 감소를 필요로 하는 대상체에서 이의 발현을 감소시킬 수 있음을 제공한다. Nurr1 단백질은 즉각-조기 반응 단백질 NOT, Orphan 핵 수용체 NURR1, 또는 전사적으로-유도성 핵 수용체로 또한 알려져 있다. 이 유전자 이름은 NR4A2, NOT, NURR1, 또는 TINUR로 알려져 있다. Nurr1 단백질 아이소폼(isoform) 1의 아미노산 서열은 598개 아미노산을 함유한다. 이의 아이소폼 2는 아미노산 1-63이 없다. 아이소폼 1의 서열 (서열 식별 번호: 63)은 하기에 나타낸다:

일부 측면들에서, 상기 miR204 억제제는 NMDA 수용체의 발현을 증가시키지 않는다. 다른 측면들에서, 상기 miR204 억제제는 EphB2 단백질의 발현을 증가시키지 않는다.

특정 측면들에서, 상기 miR204 억제제는 이러한 투여 또는 접촉 전과 비교하였을 때, Nurr1 단백질의 발현을 해당 투여 또는 접촉 후 적어도 약 1.5 배, 적어도 약 2 배, 적어도 약 2.5 배, 적어도 약 3 배, 적어도 약 3.5 배, 적어도 약 4 배, 적어도 약 4.5 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 5.5 배, 적어도 약 6 배, 적어도 약 6.5 배, 적어도 약 7 배, 적어도 약 7.5 배, 또는 적어도 약 8 배 증가시킨다.

일부 다른 측면들에서, 상기 miR204 억제제는 Nurr1 단백질 발현 감소와 연합된 질환 또는 병태를 치료하지만, 그러나 NMDA 수용체 및/또는 EphB2 단백질의 감소된 발현과 연합된 질환 또는 병태는 치료하지 않는다. 일부 측면들에서, 상기 질환 또는 병태 해마 기능의 감소와는 관련없다.

특정 측면들에서, 상기 질환 또는 병태는 알츠하이머 질환이다.

다른 측면들에서, 상기 질환 또는 병태는 파킨슨 질환, 프리온 질환, 운동 뉴런 질병, 헌팅턴 질환, 척수소뇌성 운동실조, 척추 근육 위축, 근위축성 측삭 경화증, 또는 이들의 임의의 조합이다.

일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 투여 전의 대상체의 인지 증상과 비교하였을 때, 해당 대상체의 하나 또는 그 이상의 인지 증상이 개선된다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 대상체에서 경도 인지 손상 (MCI)이 개선된다. 전문가들은 영향을 받는 사고 능력에 따라 경미한 인지 장애를 분류한다: 주로 기억에 영향을 미치는 MCI는 "건망증 MCI"로 알려져 있다. 건망증 MCI가 있는 사람의 경우, 이전에 쉽게 기억할 수 있었던 중요한 정보, 예를 들면, 약속, 대화 또는 최근 사건을 잊기 시작할 수 있다. 기억력 이외의 사고 능력에 영향을 미치는 MCI는 "비-건망증 MCI"라고 한다. 비-건망증 MCI의 영향을 받을 수 있는 사고 능력에는 건전한 결정을 내리고, 복잡한 작업을 완료하는데 필요한 시간 또는 단계 순서를 판단하는 능력, 또는 시지각(visual perception)이 내포된다.

일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 해당 대상체의 인지 손상중 하나 또는 그 이상의 발생 또는 발생 위험이 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 감소시킨다.

일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 투여 전 대상체에서의 기억 상실과 비교하여 해당 대상체에서 기억 상실이 감소된다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 대상체의 기억 상실 또는기억 상실 발생 위험이 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 감소된다.

일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 투여 전 대상체의 기억 보존과 비교하였을 때, 해당 대상체의 기억 보존이 개선된다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 해당 대상체의 기억 보존이 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 개선 및/또는 증가된다.

일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 투여 전 대상체에서의 아밀로이드 베터 (Aβ) 플락 로드와 비교하여 해당 대상체에서 아밀로이드 베터 (Aβ) 플락 로드가 감소된다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 처리되지 않은 대상체와 비교하였을 때, 해당 대상체에서 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 수준으로 아밀로이드 베타 플락 로드를 감소시키고, 아밀로이드 베타 플락 로드의 발생을 방지 또는 억제시키고, 아밀로이드 베타 플락 로드 발생 개시를 지연시키고, 또는 아밀로이드 베타 플락 로드 발생 위험을 낮춘다.

일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 투여 전 대상체의 뉴런의 수지상 척추 밀도와 비교하였을 때, 해당 대상체의 뉴런의 수지상 척추 밀도를 증가시킨다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 수준으로 해당 대상체에서 뉴런의 수지상 척추 밀도를 증가시키고, 뉴런의 수지상 척추 상실을 감소시키고, 뉴런의 수지상 척추 상실을 지연시키고, 뉴런의 수지상 척추 상실을 방지하고, 뉴런 상에서 수지상 척추 상실 개시를 지연시키고, 뉴런의 수지상 척추 상실 위험을 감소시키고, 또는 이의 조합을 감소시킨다.

본 명세서는 알츠하이머 질환의 하나 또는 그 이상의 인지 증상의 개선을 필요로 하는 대상체에서 이를 개선시키는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 해당 대상체에게 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 해당 대상체에서 알츠하이머 질환의 하나 또는 그 이상의 인지 증상의 발생 또는 발생 위험을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 감소시킨다.

본 명세서는 파킨슨 질환의 하나 또는 그 이상의 인지 증상의 개선을 필요로 하는 대상체에서 이를 개선시키는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 해당 대상체에게 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 해당 대상체의 질환의 하나 또는 그 이상의 인지 증상이 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 개선된다.

본 명세서는 파킨슨 질환의 하나 또는 그 이상의 운동 증상 또는 비-운동 증상의 개선을 필요로 하는 대상체에서 이를 개선시키는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 해당 대상체에게 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 해당 대상체의 질환의 하나 또는 그 이상의 운동 증상이 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 개선된다. 파킨슨 질환 또는 이의 진단에서 주요 원인으로 간주되는 운동 증상은 떨림, 운동의 둔화 (운동느림증), 경직 및 자세 불안정이다. 비-운동 증상에는 자율 신경 기능장애, 신경정신병적 문제 (기분, 인지, 거동 또는 사고 변화), 감각 변화 (특히 후각 변화) 및 수면 장애가 내포된다. 자율 신경계의 변화는 기립성 저혈압 (일어날 때 저혈압), 지성 피부 및 과도한 발한, 요실금 및 성기능 변화로 이어질 수 있다. 변비 및 위 배출 장애 (위 운동장애)는 불편함을 유발하고, 건강을 위협할 만큼 심각해질 수 있다. 파킨슨 질환은 경증에서 중증 범위의 다양한 신경정신병적 장애를 일으킬 수 있다. 파킨슨 질환에서 가장 흔한 인지 결함은 집행 기능 장애다. 다른 인지 장애로는 인지 처리속도 저하, 기억력 저하, 인지 손상 및 시간 예측 손상이 내포된다. 시공간적 어려움 또한 이 질환의 일부다. 파킨슨 질환 환자는 일반 집단과 비교하여 치매 위험이 2 ~ 6 배 높다. 병적 도박, 강박적 성행위, 폭식, 강박적 쇼핑 및 무모한 관대함이 내포된 충동 조절 장애는 약물, 특히 경구 활성 도파민 작용제로 인해 발생될 수 있다. 가장 빈번한 기분 장애는 우울증, 무관심 및 불안이다. 환각 또는 망상은 파킨슨 질환이 진행되는 동안 이 질병 환자의 약 50%에서 발생하며, 치매 발생의 전조일 수도 있다.

본 명세서는 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 파킨슨 질환 또는 알츠하이머 질환을 갖는 대상체에서 시냅스 기능을 개선시키는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 해당 대상체에게 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 해당 대상체에서 시냅스 기능이 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 개선된다.

본 명세서는 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 파킨슨 질환 또는 알츠하이머 질환을 갖는 대상체에서 시냅스 기능 상실을 예방, 지연 또는 개선시키는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 해당 대상체에게 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 수준으로 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 파킨슨 질환 또는 알츠하이머 질환을 갖는 대상체에서 시냅스 기능 상실을 예방, 지연 또는 개선된다.

본 명세서는 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 파킨슨 질환 또는 알츠하이머 질환을 갖는 대상체에서 수지상 척추 밀도를 증가시키고, 수지상 척추 밀도의 감소를 지연시키고, 수지상 척추 밀도의 감소를 개선시키고, 수지상 척추 밀도의 감소를 중단시키고, 수지상 척추 밀도의 감소를 예방하고, 수지상 척추 밀도를 유지시키는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 해당 대상체에게 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 파킨슨 질환 또는 알츠하이머 질환을 갖는 대상체에서 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 수준으로 수지상 척추 밀도를 증가시키고, 수지상 척추 밀도의 감소를 지연시키고, 수지상 척추 밀도의 감소를 개선시키고, 수지상 척추 밀도의 감소를 중단시키고, 수지상 척추 밀도의 감소를 예방하고, 수지상 척추 밀도를 유지시킨다.

아밀로이드 베터 (Aβ) 플락은 뉴런 변화, 예를 들면, 시냅스 조성의 일탈, 시냅스 모양, 시냅스 밀도, 시냅스 전도성 상실, 수상돌기 직경의 변화, 수상돌기 길이의 변화, 척추 밀도의 변화, 척추 구역의 변화, 척추 길이의 변화, 또는 척추 헤드 직경의 변화의 원인으로 알려져 있다. 따라서, 본 명세서는 Aβ 플락 침착을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환을 갖는 대상체에서 전술한 변화를 치료, 예방, 감소, 개시의 지연, 추가 진행의 중단, 개선시키는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 해당 대상체에게 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물의 투여로 이러한 적어도 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물로 치료를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, Aβ 플락 침착을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환을 갖는 대상체에서 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 수준으로 전술한 변화를 치료, 예방, 감소, 개시의 지연, 추가 진행의 중단, 또는 개선시킨다.

당업계에서는 Aβ 플락이 Lewy 체(body) 치매, 봉입체 근염, 뇌 아밀로이드 혈관병, 그리고 다운 증후군 (아밀로이드 전구체 단백질에 대한 유전자가 염색체 21에 위치하며, 따라서 다운 증후군이 있는 사람은 알츠하이머 질환 발병률이 매우 높다)의 일부 변종에도 또한 존재한다는 것이 공지되어 있다.

본원에 개시된 방법의 일부 측면들에서, 알츠하이머 질환은 치매-전 알츠하이머 질환, 초기 알츠하이머 질환, 중등도 알츠하이머 질환, 진행된 알츠하이머 질환, 조기 발병 가족성 알츠하이머 질환, 염증성 알츠하이머 질환, 비-염증성 알츠하이머 질환, 피질 알츠하이머 질환, 조기-발병 알츠하이머 질환, 또는 후기-발병 알츠하이머 질환이다.

일부 측면들에서, 상기 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물은 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막아래, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 통해 투여된다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터, 예를 들면, AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물은 본 명세서에서 개시된 질환 또는 병태의 치료에 적합한 다른 약품 또는 치료와 동시에 사용될 수 있다.

III. 본 명세서에 대한 유용한 벡터

본 명세서는 적어도 miR-204 결합 부위를 인코딩하는 벡터를 벡터에 관한 것이다. 용어 "miR-204 결합 부위"는 miR-204 antimir, miR-204 antagomir, 또는 항-miR204 올리고뉴클레오티드와 호환 사용될 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터, 예를 들면, AVV 벡터는 하나 또는 그 이상의 조절 요소들 (예를 들면, 프로모터)과 예를 들면, 조절 요소 (예를 들면, 프로모터)의 하류에 위치한 하나의 RNA 발현 영역을 포함하며, 이때 상기 RNA 발현 영역은 적어도 하나의 miR-204 결합 부위를 포함하는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 상기 RNA 발현 영역은 단백질을 인코드하지 않는다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 이중 가닥으로 되어 있다. 다른 측면들에서, 상기 벡터는 단일 가닥으로 되어 있다.

일부 측면들에서, 상기 miR-204 결합 부위는 성숙한 miR-204-5p (서열 식별 번호: 1) 또는 miR-204-3p (서열 식별 번호: 5)의 서열에 상보적인 단일-가닥으로된 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이는 차례로 miR-204-5p 또는 miR-204-3p (miR-204)의 억제제로 기능한다. 다양한 측면의 비-제한적인 예시들은 본 개시에 제시되어 있다.

상기 miR-204 헤어핀 전구체는 miR-204-5p 및 miR-204-3p를 모두 생성시킬 수 있다. 본 명세서의 맥락에서, 달리 명시되지 않는 한, "miR-204"에는 miR-204-5p와 miR-204-3p 모두 포괄된다. 인간의 성숙한 miR-204-5p는 서열 5'-uucccuuugucauccuaugccu-3' (서열 식별 번호: 5; miRBase 수탁 번호 MIMAT0000265)을 갖는다. miR-204-5p 5'-uucccuu-3' (서열 식별 번호: 25)의 5' 말단 하위서열은 씨드 서열이다. 인간의 성숙한 miR-204-3p는 서열 5'-gcugggaaggcaaagggacgu-3' (서열 식별 번호: 5; miRBase 수탁 번호 MIMAT0022693)을 갖는다. miR-204-3p 5'-gcuggga-3' (서열 식별 번호: 26)의 5' 말단 하위서열은 씨드 서열이다.

miRNA의 씨드 영역은 표적 mRNA와 함께 단단한 듀플렉스를 형성한다. 대부분의 miRNA는 표적 mRNAs의 3' 비-해독 영역 (UTR)과 불완전하게 염기-쌍을 형성하고, miRNA의 5' 근위 "씨드(seed)" 영역은 결합 특이성의 대부분을 제공한다. 어떤 이론에도 얽매이지 않고, (씨드 서열을 포괄하는) 처음 9 개의 miRNA 뉴클레오티드가 더 큰 특이성을 제공하는 반면, 이 영역의 miRNA 3' 리보뉴클레오티드는 더 낮은 서열 특이성을 허용하고, 따라서 더 높은 수준의 미스매치 염기-쌍형성(이때 위치 2 ~ 7가 가장 중요함)이 허용되는 것으로 보인다. 따라서, 본 명세서의 특정 측면들에서, 상기 miR-204 결합 부위는 miR-204의 전체 길이의 씨드 서열에 대해 완전하게 상보적인(즉, 100% 상보적인) 하위서열이다.

본 개시 내용의 맥락에서 사용될 수있는miRNA 서열과 miRNA 결합 서열에는 본원에서 제공되는 서열 목록에 있는 이들 서열의 전부 또는 일부, 뿐만 아니라 이들 miRNA 전구체 서열, 또는 이들 miRNAs의 하나 또는 그 이상의 보체가 내포되지만, 이에 국한되지 않는다. miRNAs 또는 이름에 의해 이들 서열의 상보적인 서열로 간주되는 특이적 miRNAs 또는 miRNA 결합 부위와 관련된 본 명세서의 임의의 측면은 명시된 miRNA 서열의 성숙한 서열 또는 이의 상보적 서열에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일하다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 miRNA 결합 서열에는 변형 서열이 miR-204에 특이적으로 여전히 결합할 수 있다면, 본원에서 제공된 서열 목록에 있는 서열의 5', 3', 또는 5' 및 3' 단부 모두에 추가 뉴클레오티드를 내포할 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 miRNA 결합 서열은 변형 서열이 miR-204에 특이적으로 여전히 결합할 수 있다면, 본원에서 제공된 서열 목록에 있는 서열과 비교하여 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 상이할 수 있다.

본원에서 miRNA 결합 분자 또는 miRNA와 관련하여 논의된 임의의 방법 및 조성물은 합성 miRNAs 결합 분자로 실현될 수 있다는 것이 특별히 또한 고려된다. 또한, 본 명세서에서 RNA 서열과 관련된 개시 내용이 상응하는 DNA 서열에 동일하게 적용될 수 있다.

일부 측면들에서, 본원의 다른 부분에서 언급된 바와 같이, 본 명세서의 벡터내 RNA 발현 영역은 단백질을 인코드하지 않고, 예를 들면, 상기 벡터는 해당 벡터에 이종성인 단백질을 인코드하지 않는다. 그러나, 다른 측면들에서, 상기 벡터의 RNA 발현 영역은 miR-204 결합 부위를 발현시키는 것에 추가적으로 해당 miR-204 결합 부위 이외의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가적인 RNAs를 발현시킬 수 있다.

상기 본 명세서의 벡터에 의해 발현되는 miR-204 결합 부위 또는 부위들은 내인성 miR-204에 결합하고, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 내인성 폴리펩티드의 발현 (예를 들면, EphB2 또는 SIRT1)을 조절하고, 이는 다시 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머 질환 또는 파킨슨 질환의 증상을 치료, 또는 개선시킨다.

일부 측면들에서, 상기 본 명세서의 벡터는 하나 또는 그 이상의 내인성 폴리펩티드, 예를 들면, SIRT1의 발현을 증가시킨다. SIRT1은 또한 NAD-의존적 데아세틸라제 시르투인-1 (Uniprot Q96EB6)으로 알려져 있으며, 이는 인간에서 SIRT1 유전자에 의해 인코드되는 단백질이다. SIRT1을 인코딩하는 mRNAs에는 예를 들면, RefSeq 서열 NM_001142498, NM_001314049, 및 NM_012238이 내포된다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터에 의해 발현되는 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 성숙한 miR-204-5p (서열 식별 번호: 1) 또는 이의 하위서열에 혼성화된다. 일부 측면들에서, 상기 miR-204-5p 하위서열은 상기 씨드 서열을 포함한다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터에 의해 발현되는 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-5p에 대해 완전하게 상보적이다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터에 의해 발현되는 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 서열 식별 번호: 2에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터에서 적어도 하나의 miR-204 결합 부위를 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 3에 제시된 서열을 포함한다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터에 의해 발현되는 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 미스매치를 제외하고, miR-204-5p에 대해 상보적이다. 일부 측면들에서, 상기 미스매치중에서 상기 하위서열에서 miR-204-5p 씨드 서열에 상보적인 미스매치는 없다. 일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-5p 씨드 서열에 대해 상보적인 영역을 지나 5' 방향으로 연장된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개 뉴클레오티드와 해당 씨드 서열에 완전하게 상보적인 서열을 포함한다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터에 의해 발현되는 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 성숙한 miR-204-3p (서열 식별 번호: 5) 또는 이의 하위서열에 혼성화된다. 일부 측면들에서, 상기 miR-204-3p 하위서열은 상기 씨드 서열을 포함한다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터에 의해 발현되는 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-3p에 대해 완전하게 상보적이다. 일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 서열 식별 번호: 6에서 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터에서 적어도 하나의 miR-204 결합 부위를 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 7에 제시된 서열을 포함한다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 벡터에 의해 발현되는 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 미스매치를 제외하고, miR-204-3p에 대해 상보적이다. 일부 측면들에서, 상기 미스매치중에서 상기 하위서열에서 miR-204-3p 씨드 서열에 상보적인 미스매치는 없다. 일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-3p 씨드 서열에 대해 상보적인 영역을 지나 5' 방향으로 연장된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개 뉴클레오티드와 해당 씨드 서열에 완전하게 상보적인 서열을 포함한다.

일부 측면들에서, 상기 본 명세서의 벡터에 의해 발현된 RNA는 적어도 2개의 miR-204 결합 부위를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 본 명세서의 벡터에 의해 발현된 RNA는 2개 miR-204 결합 부위, 3개 miR-204 결합 부위, 4개 miR-204 결합 부위, 5개 miR-204 결합 부위, 또는 6개 miR-204 결합 부위를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 본 명세서의 벡터에 의해 발현된 RNA는 2개 miR-204 결합 부위를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 모든 miR-204 결합 부위는 동일하다. 일부 측면들에서, 상기 모든 miR-204 결합 부위는 상이하다. 일부 측면들에서, 상기 miR-204 결합 부위중 적어도 하나는 상이하다. 일부 측면들에서, 상기 모든 miR-204 결합 부위는 miR-204-5p 결합 부위이다. 다른 측면들에서, 상기 모든 miR-204 결합 부위는 miR-205-3p 결합 부위이다.

일부 측면들에서, 상기 본 명세서의 벡터는 바이러스, 플라스미드, 또는 파아지미드이다. 일부 측면들에서, 상기 바리어스는 아데노-연합된 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, SV40-유형 바이러스, 폴리오마바이러스, Epstein-Barr 바이러스, 유두종 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 소아마비 바이러스 및 RNA 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다.

당업계에 공지된 임의의 AAV 벡터는 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 상기 AAV 벡터는 공지된 벡터를 포함할 수 있거나 또는 이의 변이체, 단편 또는 융합체를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 AAV 벡터는 AAV 유형 1 (AAV1), AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비 영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.

일부 구체예들에서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 AAV 벡터로부터 유래된다.

일부 구체예들에서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 적어도 두 개의 AAV 벡터로부터 유래된 키메라 벡터이다.

특정 구체예들에서, 상기 AAV 벡터는 당업계에 공지된 적어도 2 개의 상이한 AAV 벡터의 영역을 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 AAV 벡터는 제 1 AAV (예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AVV, 새우 AVV, AVV, 뱀 AVV, 또는 이의 임의의 유도체)로부터 역전된 말단 반복부와 제 2 AAV (예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AVV, 새우 AVV, AVV, 뱀 AVV, 또는 이의 임의의 유도체)로부터 역전된 제 2 말단 반복부를 포함한다.

일부 측면들에서, 상기 AVV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 AAV의 일부분을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 AAV 벡터는 AAV2를 포함한다.

일부 측면들에서, 상기 AAV 벡터는 스플라이스(splice) 수용자 부위를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 AAV 벡터는 프로모터를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 프로모터가 AAV 본 명세서의 벡터에 이용될 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 프로모터는 RNA Pol III 프로모터이다. 일부 측면들에서, 상기 RNA Pol III 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, 7SK 프로모터, 5S 프로모터, 아데노바이러스 2 (Ad2) VAI 프로모터, 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 측면들에서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 유전자 (CMV) 프로모터, EF1a 프로모터, SV40 프로모터, PGK1 프로모터, Ubc 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, TRE 프로모터, UAS 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, CaMKIIa 프로모터, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, TEF 프로모터, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, 또는 Ubi 프로모터이다. 특정 측면에서, 상기 프로모터는 U6 프로모터를 포함한다.

일부 측면들에서, 상기 AAV 벡터는 구성적 활성 프로모터 (구성적 프로모터)를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 구성적 프로모터는 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 (CMV), 유인원 바이러스 (예를 들어, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), Rous 육종 바이러스, 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 뮤린 스템 세포 바이러스(MSCV) 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 측면들에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 측면들에서, 상기 유도성 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 특정 측면들에서, 상기 조직 특이적 프로모터는 뉴런, 교질 세포, 또는 뉴런과 교질 세포 모두에서 상기 AAV 벡터의 코딩 영역의 전사를 유도한다.

일부 측면들에서, 상기 AAV 벡터는 하나 또는 그 이상의 인헨서를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 인헨서는 상기 AAV에 단독으로 존재하거나, 또는 본원에서 개시하고 있는 프로모터와 함께 존재한다. 일부 구체예들에서, 상기 AAV 벡터는 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A), 액틴 폴리(A), 헤모글로빈 폴리(A), 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함한다.

IV. 본 명세서 내용에 유용한 폴리뉴클레오티드

일부 특정 측면들에서, 상기 본 명세서의 벡터는 서열 식별 번호: 23에 제시된 핵산 서열을 포함하는 RNA를 발현시킨다. 이러한 RNA의 구조는 일반적으로 도 17의 좌측 상단에 도식적 표현으로 제시된다. 서열 식별 번호: 23의 서열의 토폴로지(topology) 또한 도 17의 도식적 제시 E에 나타낸다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 RNA는 "TD RNA", 즉, "Tough Decoy" (TD) 토폴로지를 갖는, 예를 들면, 도 17에 제시된 예시적인 TD 토폴로지로 구체화된, 폴리뉴클레오티드이다. 도 17의 좌측 상단 다이어그램에서는 TD의 모듈 구조를 보여주는데, 구체적으로 MBS (microRNA 결합 부위), 스템, 그리고 임의선택적으로 스페이서의 위치를 나타낸다. 본 명세서의 맥락에서, 명칭 스템 I 및 스템 1, 그리고 이의 변형 (예를 들면, 스템 II와 스템 2, 스템 III과 스템 3)은 호환가능하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Tough Decoy" (약칭 "TD")은 적어도 하나의 microRNA 결합 도메인 (MBD)을 갖는 안정화된 스템-루프 RNA 분자를 지칭한다. 본원에 개시된 TD는 벡터-구동된 발현을 통해, 또는 화학적 또는 효소적 시험관-내 합성을 통해 생성된 RNA의 인공 가닥이며, 이때 miRNA-결합 도메인은 상보적 염기-쌍형성을 통해 표적 miRNA를 안정적인 복합체로 격리시키고, 특정 RNA 간섭 경로를 비활성화시킬 수 있다. 따라서, miRNAs가 리프레서 역할을 하는 반면, TDs는 이중-리프레서 역할을 하고, 따라서 TDs의 존재로 단백질 산출량이 증가된다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TDs는 포유류 프로모터, 예를 들면, 포유류 세포로 형질감염될 때 생체내에서 TF 발현을 구동시키기 위한 U6 프로모터를 함유하는 바이러스성 플라스미드에 통합된다. 따라서, 일부 측면들에서, 본원에서 개시된 적어도 하나의 miR-204 결합 부위를 포함하는 RNA, 예를 들면, TD는 본 명세서의 벡터, 즉, AAV 벡터 안의 폴리뉴클레오티드에 의해 발현된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현된", "발현" 및 문법적 변형은 본 명세서의 벡터에서 폴리뉴클레오티드에 적용될 경우, 본원에서 개시된 적어도 하나의 miR-204 결합 부위 예를 들어, TD를 포함하는 RNA의 다중 복사체의 전사를 지칭한다.

일부 측면들에서, 상기 TD RNA는 이중 가닥으로된 제 1 스템 영역 (스템 1), 이중 가닥으로된 제 2 스템 영역 (스템 2), 단일 가닥으로된 2개의 miR-204 결합 부위 (microRNA-204 결합 부위 1과 microRNA-204 결합 부위 2), 그리고 루프 영역을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 TD RNA는 도식 I에 상응하는 구성을 갖는다:

도식 I

이때

ST₁ 및 ST₁'는 상보적인 스템 1 서열이며;

ST₂ 및 ST₂'는 상보적인 스템 2 서열이며;

miR204₁ 및 miR204₂는 miR-204 결합 부위 (MBS)이며;

LOOP는 루프 서열이며;

SP는 임의선택적 스페이서 서열이며; 그리고

L은 임의선택적 링커 서열이다.

일부 측면들에서, 추가적인 링커 서열은 TD 구조체의 안정성을 개선시키기 위해 도식 I의 다른 요소들 사이 예를 들면, ST₂'와 SP-miR204₂ 사이에 존재할 수 있다.

일부 측면들에서, ST₁ 및 ST₁'은 차례로 서열 5'-gacggcgctaggatcatc-3' (서열 식별 번호: 16)와 5'gatgatcctagctccgtc3' (서열 식별 번호: 18)을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 이로 본질적으로 구성된다. 일부 측면들에서, ST₁과 ST₁'는 완전하게 상보적이다.

일부 측면들에서, ST₂ 및 ST₂'는 차례로 서열 5'-gtattctg-3' (서열 식별 번호: 10)과 5'-cagaatac-3' (서열 식별 번호: 12)을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 이로 본질적으로 구성된다. 일부 측면들에서, ST₂와 ST₂'는 완전하게 상보적이다.

일부 측면들에서, 상기 루프 서열은 서열 5'-gtca-3' (서열 식별 번호: 14)를 포함하거나, 이로 구성하거나, 이로 본질적으로 구성된다.

일부 측면들에서, SP₁은 서열 5'-acc-3'을 포함하거나, 이로 구성하거나, 이로 본질적으로 구성된다. 일부 측면들에서, SP₂는 서열 5'-acc-3'을 포함하거나, 이로 구성하거나, 이로 본질적으로 구성된다. 일부 측면들에서, SP₁과 SP₂는 완전하게 상보적이다.

일부 측면들에서, L은 서열 5'-aacaatac-3'을 포함하거나, 이로 구성하거나, 이로 본질적으로 구성된 링커 서열이다.

일부 측면들에서, miR204₁과 miR204₂는 모두 miR-204-5p 결합 부위다. 일부 측면들에서, miR204₁과 miR204₂는 모두 miR-204-3p 결합 부위다. 일부 측면들에서, miR204₁은 miR-204-5p 결합 부위이며, miR204₂는 miR-204-3p 결합 부위다. 일부 측면들에서, miR204₁은 miR-204-3p 결합 부위이며, miR204₂는 miR-204-5p 결합 부위다. 일부 측면들에서, miR204₁과 miR204₂는 동일하다. 일부 측면들에서, 그리고 miR204₁과 miR204₂는 상이하다. 2개 초과의 miR-204_x 결합 부위가 존재하는 일부 측면들에서, 이들은 miRNA-204-5p 결합 부위 또는 miRNA-204-30 결합 부위일 수 있고, 이들은 차례로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

일부 측면들에서, miR204₁은 22-mer 서열 식별 번호: 2에 제시된 핵산 서열 (5'aggcauaggaugacaaagggaa3')을 포함한다. 일부 측면들에서, miR204₁은 22-mer 서열 식별 번호: 2에 제시된 핵산 서열 (5'aggcauaggaugacaaagggaa3')로 구성된다. 일부 측면들에서, miR204₁은 서열 식별 번호: 2로부터 7개, 8개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면들에서, miR204₁는 서열 식별 번호: 2로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드로 구성된다.

일부 측면들에서, miR204₁은 서열 식별 번호: 2로부터 7개, 8개, 9개 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 5' 말단 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면들에서, miR204₁은 서열 식별 번호: 2로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 3' 말단 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면들에서, miR204₁은 서열 식별 번호: 2로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 5' 말단 뉴클레오티드와 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 3' 말단 뉴클레오티드를 포함한다.

일부 측면들에서, miR204₁은 서열 식별 번호: 2로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 5' 말단 뉴클레오티드로 구성된다. 일부 측면들에서, miR204₁은 서열 식별 번호: 2로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 3' 말단 뉴클레오티드로 구성된다. 일부 측면들에서, miR204₁은 서열 식별 번호: 2로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 5' 말단 뉴클레오티드와 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 3' 말단 뉴클레오티드로 구성된다.

일부 측면들에서, miR204₁ 또는 이의 하위서열은 서열 식별 번호: 2에 제시된 핵산 서열 (5'aggcauaggaugacaaagggaa3') 또는 이의 하위서열과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개 뉴클레오티드 만큼 상이하며, 이때 miR204₁는 표적 microRNA에 여전히 특이적으로 결합하여, 이를 저해할 수 있다.

일부 측면들에서, miR204₂는 21-mer 서열 식별 번호: 6에서 제시된 핵산 서열 (5'acgucccuuugccuucccagc3')을 포함한다. 일부 측면들에서, miR204₂는 21-mer 서열 식별 번호: 6에서 제시된 핵산 서열 (5'acgucccuuugccuucccagc3')로 구성된다.

일부 측면들에서, miR204₂ 는 서열 식별 번호: 6으로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면들에서, miR204₂는 서열 식별 번호: 6으로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 21개의 연속 뉴클레오티드로 구성된다.

일부 측면들에서, miR204₂는 서열 식별 번호: 6으로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 5' 말단 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면들에서, miR204₂는 서열 식별 번호: 6으로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 3' 말단 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면들에서, miR204₂는 서열 식별 번호: 6으로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 5' 말단 뉴클레오티드와 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 3' 말단 뉴클레오티드를 포함한다.

일부 측면들에서, miR204₂는 서열 식별 번호: 6으로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 5' 말단 뉴클레오티드로 구성된다. 일부 측면들에서, miR204₂는 서열 식별 번호: 6으로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 3' 말단 뉴클레오티드로 구성된다. 일부 측면들에서, miR204₂는 서열 식별 번호: 6으로부터 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속 뉴클레오티드, 그리고 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 5' 말단 뉴클레오티드와 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가적인 3' 말단 뉴클레오티드로 구성된다.

일부 측면들에서, miR204₂ 또는 이의 하위서열은 서열 식별 번호: 6에서 제시된 핵산 서열 (5'acgucccuuugccuucccagc3') 또는 이의 하위서열과 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개 뉴클레오티드 만큼 상이하며, 이때 miR204₂는 표적 microRNA에 여전히 특이적으로 결합하여, 이를 저해할 수 있다.

일부 측면들에서, miR204₁은 miR204-5p의 씨드 영역에 완전하게 상호적인 서열 식별 번호: 2의 하위서열을 포함하는 7-mer, 8-mer, 9-mer 또는 10-mer이다. 따라서, 일부 측면들에서, miR204₁은 서열 5'-aagggaa-3' + 0, 1, 2, 또는 3 추가적인 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드로 구성되며, 이때 miR204₁은 표적 microRNA에 여전히 특이적으로 결합하고, 이를 억제할 수 있다.

일부 측면들에서, miR204₂는 miR204-5p의 씨드 영역에 완전하게 상호적인 서열 식별 번호: 2의 하위서열을 포함하는 7-mer, 8-mer, 9-mer 또는 10-mer이다. 따라서, 일부 측면들에서, miR204₂는 서열 5'-ucccagc-3' + 0, 1, 2, 또는 3 추가적인 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드로 구성되며, 이때 miR204₂는 표적 microRNA에 여전히 특이적으로 결합하고, 이를 억제할 수 있다.

일부 측면들에서, 상기 TD는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 microRNA 결합 부위 (MBS)를 포함한다. 하나의 MBS를 포함하는 예시적인 토폴로지, 예를 들어, 도 17의 구조 A, B 및 C에 도시되어 있다. 일부 측면에서, 구조 A, B 및 C에서 MBS, 또는 선택적 스페이서를 포함하는 이의 변이체는 위에 개시된 임의의 miR204₁ 또는 miR204₂일 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 TD는 예를 들면, 예시적인 구조 D 및 E에서 나타낸 바와 같이, 2개의 MBS를 포함하며, 이때 각 MBS C는 상기에서 개시된 임의의 miR204₁ 또는 miR204₂일 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 TD는 예를 들면, 도 17의 예시적인 구조 F, 또는 선택적 스페이서를 포함하는 이의 변이체에서 나타낸 바와 같이, 3개 MBS를 포함하고, 이때 각 MBS는 상기에서 개시된 임의의 miR204₁ 또는 miR204₂일 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 TD는 예를 들면, 도 17의 예시적인 구조 G, 또는 선택적 스페이서를 포함하는 이의 변이체에서 나타낸 바와 같이, 4개 MBS를 포함하고, 이때 각 MBS는 상기에서 개시된 임의의 miR204₁ 또는 miR204₂일 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 TD는 예를 들면, 도 17의 예시적인 구조 H 및 I에서 나타낸 바와 같이, 5개 MBS를 포함하고, 이때 각 MBS는 상기에서 개시된 임의의 miR204₁ 또는 miR204₂일 수 있다.

일부 측면들에서, 상기 본 명세서의 벡터는 단일 유형의 TD를 발현시킬 수 있다. 다른 측면들에서, 상기 본 명세서의 벡터는 하나 이상의 유형 TD를 발현시킬 수 있는데, 예를 들면, (i) 동일한 miRNA (예를 들면, miR204-5p 또는 miR204-3p)를 표적으로 하는 상이한 구조체를 갖는 TD; (ii) 상이한 miRNAs (예를 들면, miR204-5p 또는 miR204-3p)를 표적으로 하는 상이한 구조체를 갖는 TD; (iii) 동일한 miRNA (예를 들면, miR204-5p 또는 miR204-3p)를 표적으로 하는 동일한 구조체를 갖는 TD; 또는 (iv) 이의 조합을 발현시킬 수 있다. 유사하게, 시험관내 화학적 또는 효소적 합성에 의해 수득된 TD를 포함하는 본 발명의 조성물은 (i) 동일한 miRNA (예를 들면, miR204-5p 또는 miR204-3p)를 표적으로 하는 상이한 구조체를 갖는 TD; (ii) 상이한 miRNAs (예를 들면, miR204-5p 또는 miR204-3p)를 표적으로 하는 상이한 구조체를 갖는 TD; (iii) 동일한 miRNA (예를 들면, miR204-5p 또는 miR204-3p)를 표적으로 하는 동일한 구조체를 갖는 TD; 또는 (iv) 이의 조합을 포함할 수 있다.

본 명세서를 위한 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예는 하기에 제시된다:

일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 또는 57에 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 해당 TD 구조체는 miR-204-5p를 저해할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 TD 구조체는 서열 식별 번호: 27에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 28에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 29에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 30에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 31에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 32에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 33에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 34에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 35에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 36에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 37에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 38에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 39에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 40에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 41에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 42에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 43에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 44에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 45에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 46에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 47에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 48에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 49에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 50에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 51에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 52에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 53에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 54에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 55에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 56에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 TD 구조체는 서열 식별 번호: 57에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

IV. 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드

일부 측면에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 화학적으로 변형될 경우, 이 폴리뉴클레오티드는 "변형된 폴리뉴클레오티드"로 지칭될 수 있다.

"뉴클레오시드(nucleoside)"란 유기 염기 (예를 들면, 퓨린 또는 피리미딘) 또는 이의 유도체 (본원에서 "핵염기"로도 불림)와 함께, 당 분자 (예를 들면, 오탄당 또는 리보스) 또는 이의 유도체를 함유하는 화합물을 지칭한다.

"뉴클레오티드"란 포스페이트 기가 내포된 뉴클레오시드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드는 임의의 유용한 방법, 이를 테면, 예를 들면, 화학적으로, 효소적으로, 또는 재조합적 방법을 이용하여, 하나 또는 그 이상의 변형된 또는 비-천연 뉴클레오시드가 내포되도록 합성될 수 있다.

폴리뉴클레오티드는 연계된 뉴클레오시드의 영역 또는 영역들을 포함할 수 있다. 이러한 영역들은 가변 백본(backbone) 링키지를 가질 수 있다. 상기 링키지는 표준 포스포디에스테르 링키지일 수 있고, 이 경우 해당 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 영역을 포함할 것이다.

본원에 개시된 변형된 폴리뉴클레오티드는 다양한 별개 변형을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 폴리뉴클레오티드는 하나 또는 둘, 또는 그 이상의 (임의선택적으로 상이한) 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 변형을 함유한다. 일부 측면들에서, 변형된 폴리뉴클레오티드는 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드와 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 바람직한 성질, 예를 들면, 개선된 열적 또는 화학적 안정성, 감소된 면역 원성, 감소된 분해, 표적 microRNA에 대한 결합 증가, 다른 microRNA 또는 다른 분자에 대한 비-특이적 결합 감소를 나타낼 수 있다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)는 화학적으로 변형된다. 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "화학적 변형" 또는 적절한 경우, "화학적으로 변형된"이란 아데노신 (A), 구아노신 (G), 우리딘 (U), 티미딘 (T) 또는 시티딘 (C) 리보-또는 데옥시리보뉴클레오시드의 핵염기, 당, 백본, 또는 이들의 임의의 조합이 내포되나, 이에 국한되지 않는 위치, 패턴, 백분율, 또는 집단 중 하나 또는 그 이상에서 변형을 지칭한다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)는 또는 모든 또는 임의의 동일한 뉴클레오시드 유형의 균일한 화학적 변형, 또는 모든 또는 임의의 동일한 뉴클레오시드 유형에서 동일한 출발 변형의 하류 적정에 의해 생성된 변형 집단, 또는 모든 임의의 동일한 뉴클레오시드 유형의 화학적 변형을 다만 무작위 통합에 의해 변형된 측정된 백분율을 가질 수 있다. 또다른 측면에서, 상기 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD)는 전체 폴리뉴클레오티드를 통하여 동일한 뉴클레오시드 유형중 2개, 3개, 또는 4개의 균일한 화학적 변형을 가질 수 있다 (이를 테면, 모든 우리딘 및/또는 모든 시티딘, 등등이 동일한 방식으로 변형된다).

변형된 뉴클레오티드 염기 쌍형성은 표준 아데닌-티민, 아데닌-우라실, 또는 구아닌-시토신 염기쌍 뿐만 아니라, 비-표준 염기 또는 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드 사이에 형성된 염기쌍도 포괄하며, 이때 수소 결합 공여자와 수소 결합 수용자의 배열은 비-표준 염기와 표준 염기 사이의 수소 결합, 또는 2개 상보적인 비-표준 염기 구조 사이의 수소 결합을 허용한다. 이러한 비-표준 염기 쌍형성의 한 가지 예는 변형된 핵염기 이노신과 아데닌, 시토신 또는 우라실 사이의 염기 쌍형성이다. 염기/당 또는 링커의 임의의 조합이 본 명세서의 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있다.

달리 언급되지 않는 한, 본 출원에 제시된 폴리 뉴클레오티드 서열이 대표적인 DNA 서열에서 "T"를 언급할 것이지만, 서열이 RNA를 나타내는 경우 "T"는 "U"로 대체될 것임을 당업자는 인지할 것이다. 예를 들어, 본 명세서의 TD는 RNA, DNA, 또는 RNA와 DNA 단위 둘 모두를 포함하는 하이브리드 분자로서 투여될 수 있다.

일부 측면들에서, 상기 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)에는 적어도 2개의 (예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 8개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 18개, 20개 또는 그 이상의) 변형된 핵염기가 내포된다.

일부 측면들에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)에서 핵염기, 당, 백본 링키지, 또는 이들의 임의의 조합은 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 변형된다.

(i) 염기 변형

특정 측면들에서, 상기 화학적 변형은 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)의 핵염기에서의 변형이다. 일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 변형된 우리딘 (예를 들면, 슈도우리딘 (ψ), 2-티오우리딘 (s2U), 1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ), 1-에틸-슈도우리딘 (e1ψ), 또는 5-메톡시-우리딘 (mo5U)), 변형된 시토신 (예를 들면, 5-메틸-시티딘 (m5C)) 변형된 아데노신 (예를 들면, 1-메틸-아데노신 (m1A), N6-메틸-아데노신 (m6A), 또는 2-메틸-아데닌 (m2A)), 변형된 구아노신 (예를 들면, 7-메틸-구아노신 (m7G) 또는 1-메틸-구아노신 (m1G)), 또는 이의 조합이다.

일부 측면들에서, 상기 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)는 특정 변형을 위해 균일하게 변형된다 (예를 들면, 완전하게 변형됨, 전체 서열에 걸쳐 변형됨). 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 동일한 유형의 염기 변형, 예를 들면, 5-메틸-시티딘 (m5C)로 균일하게 변형될 수 있는데, 이는 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 모든 시토신 잔기가 5-메틸-시티딘 (m5C)로 대체됨을 의미한다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 임의의 것과 같은 변형된 뉴클레오시드로 대체함으로써, 해당 서열에 존재하는 임의의 유형의 뉴클레오시드 잔기에 대해 균일하게 변형될 수 있다.

일부 측면들에서, 상기 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)에는 적어도 2개의 (예를 들면, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의)변형된 핵염기가 내포된다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)에서 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 핵염기 유형은 변형된 핵염기이다.

(ii) 백본 변형

일부 측면들에서, 상기 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)에는 뉴클레오시드 사이에 임의의 유용한 링키지가 내포될 수 있다. 본 명세서의 조성물에 유용한 백본 변형이 내포된 이러한 링키지에는 다음이 내포되지만, 이에 국한되지는 않는다: 3'-알킬렌 포스포네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트, 알켄 함유 백본, 아미노알킬포스포라미데이트, 아미노알킬 포스포트리에스테르, 보라노포스페이트, -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂-, 키랄 포스포네이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌 (메틸이미노), 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌 히드라지노 백본, 모르폴리노 결합, -N(CH₃)-CH₂-CH₂-, 올리고뉴클레오시드 헤테로원자 뉴클레오시드 간 연결, 포스피네이트, 포스포라미데이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드 간 연결, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, PNA, 실록산백본, 설파메이트 백본, 설파이드 설폭사이드 및 설폰 백본, 설포네이트 및 설폰아미드 백본, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 그리고 티오노포스포라미데이트.

일부 측면들에서, 상기 기재된 백본 링키지가 존재함으로써 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)의 안정성 및 분해에 대한 저항성이 증가된다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드(예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)의 백분 링키지의 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%는 변형된다 (예를 들면, 이들 모두는 포스포로티오에이트다).

일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드(예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 21개 백분 링키지는 변형된다 (예를 들면, 포스포로티오에이트).

(iii) 당 변형

본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, TD 또는 이의 일부, 예를 들어 MBS)에 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 핵산의 당에서 변형될 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 당 변형으로 MBS가 이의 표적 miRNA에 대한 결합 친화력이 증가된다. MBS에 친화력-강화 뉴클레오티드 유사체, 이를 테면, LNA 또는 2'-치환된 당의 통합으로 MBS의 길이를 줄일 수 있고, 또한 비-특이적 또는 비-정상적인 결합이 일어나기 전, MBS 크기의 상한을 또한 감소시킬 수 있다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드에서 상기 뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)의 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%는 당 변형 (예를 들면, LNA)을 함유할 수 있다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 뉴클레오티드 단위는 당 변형 (예를 들면, LNA)된다.

일반적으로, RNA에는 상기 당 그룹 리보스가 내포되는데, 이는 산소를 갖는 5-원(membered) 고리다. 예시적인, 비-제한적인 변형된 뉴클레오티드에는 리보스에 산소의 대체 (예를 들면, S, Se, 또는 알킬렌, 이를 테면, 메틸렌 또는 에틸렌으로 대체); 이중 결합의 추가 (예를 들면, 리보스를 시클로펜테닐 또는 시클로렉세닐로 대체시키기 위해); 리보스의 고리 축소 (예를 들면, 시클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리를 형성하기 위해); 리보스의 고리 확장 (예를 들면, 이를 테면, 무수헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥 세닐, 그리고 포스포라미데이트 골격을 또한 갖는 몰폴리노와 같이 추가적인 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6-원 또는 7-원 고리를 형성하기 위해); 다환형 (예를 들면, 트리시클로; 그리고 "잠금해제된(unlocked)" 형태, 이를 테면, 글리콜 핵산 (GNA) (예를 들면, R-GNA 또는 S-GNA, 여기에서 리보스는 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위로 대체됨, 트레오스 핵산 (TNA, 여기에서 리보스는 α-L-트레오푸라노실-(3'→2')로 대체됨), 그리고 펩티드 핵산 (PNA, 여기에서 2-아미노-에틸-글리신 링키지는 리보스 및 포스포디에스테르 백본을 대체함)이 내포된다. 상기 당 그룹은 또한 리보스에서 대응하는 탄소의 것과 반대되는 입체 화학적 배열을 소유하는 하나 또는 그 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 분자는 당으로써 예를 들면, 아라비노스를 함유하는 뉴클레오티드를 또한 내포할 수 있다.

리보스의 2' 히드록실 기 (OH)는 다수의 상이한 치환체로 변형되거나 또는 대체될 수 있다. 2'-위치에서 예시적인 치환으로는 H, 할로, 임의선택적으로 치환된 C_1-6 알킬; 임의선택적으로 치환된 C_1-6 알콕시; 임의선택적으로 치환된 C_6-10 아릴옥시; 임의선택적으로 치환된 C_3-8 시클로알킬; 임의선택적으로 치환된 C_3-8 시클로알콕시; 임의선택적으로 치환된 C_6-10 아릴옥시; 임의선택적으로 치환된 C_6-10 아릴-C_1-6 알콕시, 임의선택적으로 치환된 C_1-12 (헤테로시클일)옥시; 당 (예를 들면, 리보스, 펜토스, 또는 본원에 기재된 임의의 것들); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), -O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OR, 여기에서 R은 H 또는 임의선택적으로 치환된 알킬이며, n은 0 내지 20의 정수 (예를 들면, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 그리고 4 내지 20); "잠김(locked)" 핵산 (LNA) 이때 2'-히드록실은 C_1-6 알킬렌 또는 C_1-6 헤테로알킬렌 다리를 통하여 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결되며, 여기에서 예시적인 다리에는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 아미노 다리, 아미노알킬, 아미노알콕시, 아미노, 및 아미노산이 내포된다

일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, TD 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는, 예를 들면, 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-O-알킬-SNA, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, 아라비노 핵산 (ANA) 유닛, 2'-플루오로-ANA 유닛, HNA 유닛, INA (중간개재(intercalating) 핵산) 유닛, 2'MOE 유닛, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 LNA는, 예를 들면, 옥시-LNA (이를 테면, 베타-D-옥시-LNA, 또는 알파-L-옥시-LNA), 아미노-LNA (이를 테면, 베타-D-아미노-LNA 또는 알파-L-아미노-LNA), 티오-LNA (이를 테면, 베타-D-티오0-LNA 또는 알파-L-티오-LNA), ENA (이를 테면, 베타-D-ENA 또는 알파-L-ENA), 또는 이들의 임의의 조합이다.

일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, 또는 이의 일부분, 예를 들면, MBS)는 변형된 RNA 뉴클레오티드 유사체 (예를 들면, LNA)와 DNA 유닛을 모두 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 MBS는 갭머(gapmer)이다. 예를 들면, U.S. 특허 번호 8,404,649; 8,580,756; 8,163,708; 9,034,837 참고; 이들 모두는 전문이 본원에 참조자료에 편입된다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 MBS는 마이크로미르(micromir)이다. U.S. 특허 출원 공개 번호 US20180201928 참고; 이는 전문이 본원에 참조자료에 편입된다.

V. 약제학적 조성물

본 명세서는 벡터, 예를 들면, AAV 벡터, 또는 본 명세서의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 대상체에게 투여용으로 적합한 약제학적 조성물을 또한 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 일반적으로 벡터, 예를 들면, AAV 벡터, 또는 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 및 약제학적으로-허용되는 부형제 또는 담체를 대상체에게 투여용으로 적합한 형태로 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 투여되는 특정 조성물, 뿐만 아니라, 이 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방법에 의해 일부분적으로 결정된다.

따라서, 다수의 EVs (예를 들면, 엑소좀)을 포함하는 약제학적 조성물의 적합한 제형은 다양하게 존재한다. (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18th ed. (1990) 참고). 상기 약제학적 조성물은 일반적으로 U.S. Food and Drug Administration의 모든 Good Manufacturing Practice(GMP) 규정을 완전히 준수하여 멸균 제형으로 제형화된다. 일부 측면들에서, 상기 약제학적 조성물은 본원에서 기술된 하나 또는 그 이상의 벡터, 예를 들면, AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 측면들에서, 약제학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 치료요법제 및 하나 또는 그 이상의 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 측면들에서, 상기 벡터, 예를 들면, AAV 벡터, 그리고 본원에서 기재된 폴리뉴클레오티드는 약제학적으로 허용가능한 담체 안에서 하나 또는 그 이상의 추가적인 치료요법제와 공동-투여된다. 일부 측면들에서, 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 약제학적 조성물은 추가적인 치료요법제(들)을 투여하기 전에 투여된다. 다른 측면들에서, 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 약제학적 조성물은 추가적인 치료요법제(들)을 투여한 후 투여된다. 추가 측면들에서, 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 약제학적 조성물은 추가적인 치료요법제(들)과 동시에 투여된다.

벡터, 예를 들면, 본원에서 원하는 순도를 갖는 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드, 그리고 약제학적으로 수용가능한 운반체또는 부형제를 포함하고, 대상체에게 투여용으로 적합한 형태의 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물 및 조성물 투여에 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 다수의 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물의 적합한 제형은 다양하게 존재한다. (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 21st ed. (2005) 참고). 상기 약제학적 조성물은 일반적으로 U.S. Food and Drug Administration의 모든 Good Manufacturing Practice(GMP) 규정을 완전히 준수하여 멸균 제형으로 제형화된다.

일부 측면들에서, 약제학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 치료요법제와 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 측면들에서, 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드는 약제학적으로 허용가능한 담체에서 하나 또는 그 이상의 추가적인 치료요법제와 공동-투여된다. 일부 측면들에서, 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 약제학적 조성물은 추가적인 치료요법제들을 투여하기 전에 투여된다.

다른 측면들에서, 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 약제학적 조성물은 추가적인 치료요법제들을 투여한 후 투여된다. 추가 측면들에서, 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 약제학적 조성물은 추가적인 치료요법제들과 동시에 투여된다.

수용가능한 운반체, 부형제, 또는 안정화제는 이용되는 투약형 및 농도에서 수령자(예를 들면, 동물 또는 인간)에게 비독성이며, 그리고 생리학적으로 수용가능한 담체의 예로는 완충액, 이를 테면, 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산; 아스코르브산, 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (이를 테면, 옥타데실디메틸벤질 암모니움 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로로이드, 벤제토니움 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 이를 테면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르씨놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레솔); (약 10개 미만 잔기의) 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 이를 테면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 폴리머 이를 테면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 이를 테면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린이 포함된 기타 탄수화물; 킬레이트 물질들, 이를 테면 EDTA; 슈가, 이를 테면, 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 솔비톨; 염-형성 카운터-이온, 이를 테면, 나트륨, 금속 착물 (가령, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 이를 테면, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 내포된다.

이러한 담체 또는 희석제의 예로는 물, 염수, Ringer 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민이 내포되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 활성인 물질용 이러한 매질 및 화합물의 이용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 화합물이 벡터, 예를 들어, AAV 벡터 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드와 양립할 수 는 경우를 제외하고, 해당 성물에서의 이들의 사용이 고려된다. 보충 치료제 또한 상기 조성물에 혼합될 수 있다. 전형적으로, 약학 조성물은 의도된 투여 경로에 양립될 수 있도록 제형화된다. 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드는 비-경, 국소, 정맥 내, 경구, 피하, 동맥-내, 피내(intradermal), 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비강내, 종양내, 근육내 경로에 의해 또는 흡입제로서 투여될 수 있다. 특정 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들면 주사에 의해 정맥내로 투여된다. 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드가 의도하는 질환, 장애 또는 병태 치료에 적어도 부분적으로 효과적인 다른 치료요법제와 임의선택적으로 병용 투여될 수 있다.

용액 또는 현탁액에는 다음의 성분들이 내포될 수 있다: 물, 식염수, 고정 유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제, 이를 테면, 주사용수, 염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균 화합물, 이를 테면, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 이를 테면, 아스코르브산 또는 중아황산 나트륨; 킬레이팅 화합물, 이를 테면, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 이를 테면, 아세테이트, 구연산 또는 인산염, 그리고 등장성 조절 화합물, 이를 테면, 염화 나트륨 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 수산화 나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 제재는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 넣을 수 있다.

주사용으로 적합한 약제학적 조성물에는 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말이 내포된다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산 완충된 염수 (PBS)를 포함한다. 상기 성물은 일반적으로 무균이며, 주사의 용이성이 존재할 정도로 유동적이다. 상기 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이와 유사한 것들), 그리고 이들의 적합한 혼합물들이 포함된 용매 또는 분산액 매질이 될 수 있다. 예를 들면, 피복제, 이를 테면 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 아스크르빈산, 티메로졸 및 이와 유사한 것들과 같은 다양한 항균 화합물 및 항진균 화합물을 포함시킴으로써 확보될 수 있다. 원하는 경우, 등장성 화합물, 예를 들어, 당, 만니톨, 소르비톨 및 염화나트륨과 같은 폴리알코올이 조성물에 첨가될 수 있다. 흡수를 지연시키는 물질, 이를 테면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 화합물이 조성물에 포함됨으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수를 가져올 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 벡터, 예를 들어, AAV 벡터, 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 유효량으로, 그리고 원하는 대로 본원에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매로 혼입함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 벡터, 예를 들어, AAV 벡터 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 염기성 분산 매질 및 임의의 원하는 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 통합함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분의 분말과 미리 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드의 지속적 방출 또는 박동 방출이 허용되는 방식으로 제형화될 수 있는 데포(depot) 주사 또는 이식 제제의 형태로 투여될 수 있다.

벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 전신 투여는 또한 경-점막 수단에 의한 것일 수 있다. 경-점막 투여를 위해, 침투되는 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 예컨데, 점막 투여용으로, 세제, 담즙 염 및 푸시딘산(fusidic acid) 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이의 사용을 통해 수행될 수 있다.

특정 측면들에서 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물은 이 약제학적 조성물로부터 이익을 얻을 대상체에게 정맥내 투여된다. 특정 다른 측면에서, 상기 조성물은 림프계에, 예를 들어 림프 내 주사 또는 결절 내 주사 (예를 들어, Senti et al., PNAS 105 (46) : 17908 (2008) 참조)에 의해, 또는 근육 내, 피하 투여, 종양 내 주사, 흉선 또는 간으로의 직접 주사주사에 의해 투여된다.

특정 측면들에서, 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물은 액체 현탁액으로 투여된다. 특정 측면들에서, 상기 약제학적 조성물은 투여 후 데포(depot)를 형성할 수 있는 제형으로 투여된다. 특정 바람직한 측면들에서, 상기 데포는 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드를 순환계로 천천히 방출시키거나, 또는 데포 형에 유지된다.

전형적으로, 약제학적으로-허용되는 조성물은 오염 물질이 없도록 고도로 정제되고, 생체적합성이며 독성이 없으며, 대상체에게 투여용으로 적합하다. 물이 담체의 구성 요소인 경우, 물은 고도로 정제되고, 오염물질, 예를 들면, 내독소(endotoxins)가 없도록 처리된다.

상기 약제학적으로-허용되는 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아레이트 마그네슘 및/또는 미네랄 오일일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 상기 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미료, 풍미 증강제, 유화제, 현탁제 및/또는 보존제를 추가로 내포할 수 있다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 상기 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 AAV 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드와 임의선택적으로 약제학적으로 활성 또는 치료제를 포함한다. 상기 치료 제제는 생물학적 제제, 작은 분자 제제, 또는 핵산 제제일 수 있다.

벡터, 예를 들면, AAV 벡터, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 포함하는 투약형(dosage forms)이 제공된다. 일부 측면들에서, 상기 투약형은 정맥-내 주사를 위한 액체 현탁액으로 제형화된다.

상기 벡터, 예를 들면, AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물은 다른 약물과 동시에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 명세서의 벡터, 예를 들면, AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물은 의약품, 이를 테면, 호르몬 치료제, 화학 요법제, 면역 치료제, 세포 성장 인자 또는 성장 인자 수용체 및 이와 유사한 것들의 작용을 억제하는 약품과 같은 약제와 함께 사용될 수 있다.

VI. 키트

본 명세서는 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물 및 사용을 위한 지침을 임의선택적으로 포함하는 키트, 제조 제품을 또한 제공한다. 일부 측면들에서, 상기 키트, 또는 제조 제품은 하나 또는 그 이상의 용기 안에 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 키트, 또는 제조 제품은 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물과 브로셔를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 키트, 또는 제조 제품은 벡터, 예를 들면, 본 명세서의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약제학적 조성물과 사용 지침을 포함한다. 당업자는 본 명세서의 벡터, 폴리뉴클레오티드 및 약제학적 조성물, 또는 이들의 조합이 당해 분야에 널리 공지된 확립된 키트 포맷 중 하나에 쉽게 통합될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.

서열

본 명세서의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 이식유전자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들면, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. 특허 번호 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) 그리고 Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.) 참고.

상기 인용된 모든 참고 문헌 및 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참고자료에 편입된다.

다음 실시예들은 제한이 아닌 예시로서 제공된다.

실시예

실시예 1

데이터 분석

본 연구에 의해 생성된 발현 데이터는 수탁 번호 GSE16759로서 NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)에서 사용할 수 있다. 도 1A 및 1B는 4명의 연령-일치된 대조군과 4명의 AD 환자로부터 얻은 수탁 번호 GES16759의 mRNA 마이크로어레이 데이터의 분석을 보여준다. 도 1A는 샘플 정보를 나타낸다. 도 1B는 AD 환자의 조직이 정상 조직에 비교하여 Nurr1 mRNA의 수준이 낮음을 보여준다.

마이크로어레이 데이터는 NCBI's Gene Expression Omnibus(Edgar, 2002)에 기탁되었으며, GEO 일련 수탁 번호 GSE106241을 통하여 접근가능하다. 질량 분석 단백질체학의 임상 데이터는 데이터세트 식별자 PXD008016 (

et al., 2016)와 함께 PRIDE 파트너 레파지토리를 통한 ProteomeXchange Consortium에 기탁되었다. 도 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4 및 5는 상기 데이터의 분석으로 유래된 것들이다.

실시예 2

루시퍼라제 리포터 검정법.

예측된 miR-204-5p 결합 서열 또는 돌연변이 3'-UTR (aaaggga는 tttgggt로 돌연변이됨)를 함유하는 Nurr1 mRNA의 야생형 (WT) 3'-UTR 영역을 갖는 서열 세그먼트를 PCR 증폭시키고, psiCHECK-2 루시베라제 리포터 벡터 (Promega, Madison, WI, USA)에 클론시켰다. 도 9 참고. 루시퍼라제 활성 검정을 위하여, HEK 293 T 세포를 24-웰 플레이트에 도말시키고, psiCHECK2-Nurr1-3'UTR-WT 또는 psiCHECK2-Nurr1-3'UTR-MT, pCMV-MIR(Origene), pCMV-MIR-miR-204-5p로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 후 48 h 시점에서, 반딧불이 및 Renilla 루시퍼라제 활성은 이중-루시퍼라제 리포터 검정 시스템 (Promega)을 통해 결정되었다. 상대적인 Renilla 루시퍼라제 활성은 반딧불이 루시퍼라제 활성에 대해 정상화시킴으로써 측정되었다. 도 9에서는 miR-204 결합 부위를 발현시키는 pCMV miR 204-5p가 Nurr1의 야생형 3' UTR을 함유하는 벡터에 추가했을 때, 이의 발광이 약 60% 감소되었음을 보여준다. 그러나, Nurr1의 돌연변이 3' UTR을 함유하는 벡터에 pCMV-miR 204-5p를 추가한 경우, 음성 대조군에 비교하여 발광 활성이 감소하지 않았다.

실시예 3

구조체 생성

바이러스 구조체: Tough Decoy (TD) miR-204-5p 플라스미드의 작제를 위해, 스템, 스템 루프, 그리고 Xho1/Xho1 부위에 의한 2개 miR-204-5p 결합 부위를 함유하는 DNA 서열 (5-aactcgaggttcgatacaggggcatcaagaggcataggatgacaaagggaagaatttggaacgtcagttccaaaaagaagaatagaaggcataggatgacaaagggaagaagatgcccctgtatcgaacttttttggaactcgagaa-3) (서열 식별 번호: 64)을 합성하였고, 이를 pAAV-IRES-GFP 벡터 (CELL BIOLABS, Inc., San Diego, USA에서 구입함)의 Xho1/Xho1 부위로 클론시켰으며, 여기에서 CMV 프로모터는 작은 RNA의 발현을 효과적으로 구동시킨다.

스템, 스템 루프, 그리고 Xho1/Xho1 부위 측면에 있는 2개 스크램블(scramble) 서열 결합 부위를 함유하는 DNA 서열(5-aactcgaggttcgatacaggggcatcaagaagaggcttgcacagtgcattgaatttggaacgtcagttccaaaaagaagaatagaaagaggcttgcacagtgcattgaagatgcccctgtatcgaacttttttggaactcgagaa-3) (서열 식별 번호: 65)은 TD 대조군 플라스미드 생성에 있어서 비-특이적 대조군 용으로 만들었다. 바이러스성 역가는 AAV TD 대조군의 경우 1×10⁹ IFU/ml이었으며, AAV TD miR-204-5p의 경우 2×10⁹ IFU/ml이었다.

대상체: 5XFAD APP 이식유전자 마우스 (비축 번호:000664)는 Jackson Laboratory에서 구입했다. 본 연구에 TG 및 연령-일치된 야생형 (WT) 한배 새끼들이 이용되었다. 모든 동물은 온도와 습도, 음식과 물이 조절되며, 12/12-시간 명암 주기로 개별 케이지에서 관리되었다.

정위 주입(Stereotactic injection): 모든 동물은 초기에 산소에 3 ~ 5% 이소플루란으로 마취하고, 정위 프레임 (JeongDo)에 고정시켰다. 상기 AAV2는 2.5ul (역가 1x109 TU/ml)로 ICV (AP: -2mm, ML: ±1.2 mm, DV: 정수리로부터 -1.5mm)으로 정위적으로 주사되었다. 일차 피질 뉴런 배양, 형질감염 및 Western 블랏

일차 피질 배양물은 배아 일 (E) 18-19 시점의 마우스 피질로부터 준비했다. 뉴런은 TransIT-X2® 형질감염 시약 (Mirus Bio)을 이용하여 9d 시점에 시험관(DIV)에서 형질감염되었다. 뉴런은 프로테아제 억제제가 함유된 얼음-냉각된 RIPA 완충제에 용해되고, 12,000 r.p.m.에서 30 분 동안 4 ℃에서 원심분리되었으며, 상청액을 수집하였다. 상기 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리시키고, PVDF 막으로 옮긴 후, 다음의 일차 항체와 함께 항온처리되었다 : 마우스 항-Nurr1 (Santa Cruz, Cat# sc-376984) 및 항-엑틴 (Santa Cruz, Cat#sc-47778). 거동 테스트 후, H/I 마우스에서 해마 영역과 피질 영역을 잘라내고, 프로테아제 억제제가 함유된 얼음-냉각된 RIPA 완충제에서 뇌 조직을 균질화했다. 균질물은 12,000 r.p.m.에서 30 분 동안 4 ℃에서 원심분리시키고, 상청액을 수집하였다. 이 결과는 강화된 화학발광 시스템을 사용하여 시각화되었고, 밀도측정 분석 (Image J 소프트웨어, NIH)으로 정량화되었다. 모든 실험은 적어도 세 번 독립적으로 수행되었다.

면역조직화학: 면역조직화학을 위해, 뇌를 제거하고, 파라핀에 부가하여 매립시켰다. 경색을 통한 관상 절편 (10-μm 두께)을 마이크로톰을 사용하여 절단하고, 슬라이드에 탑재했다. 상기 파라핀을 제거하고, 절편들을 PBS-T로 세척하고 10% 소 혈청 알부민에서 2 시간 동안 차단시켰다. 그 다음, 하기 일차 항체들을 제공했다: 마우스 항-Nurr1 (Santa Cruz, Cat# sc-376984), 토끼 항-NeuN (Abcam, Cat# EPR12763) 및 항-아밀로이드 베타 (BioLegend, 클론 6E10). 거동 테스트 후, H/I 마우스에서 해마 영역과 피질 영역을 잘라내고, 프로테아제 억제제가 함유된 얼음-냉각된 RIPA 완충제에서 뇌 조직을 균질화했다. 균질물은 12,000 r.p.m.에서 30 분 동안 4 ℃에서 원심분리시키고, 상청액을 수집하였다. 이 결과는 강화된 화학발광 시스템을 사용하여 시각화되었고, 밀도측정 분석 (Image J 소프트웨어, NIH)으로 정량화되었다. 모든 실험은 적어도 세 번 독립적으로 수행되었다.

도 13은 Nurr1의 공-초점 영상으로부터의 대표적인 피질 영상을 보여준다. 5XFAD 마우스의 피질에서 바이러스성 시스템 항-miR-204 전달로 Nurr1이 증가된다. Nurr1 (녹색-상단), 뉴런 (적색-중간) 및 Nucleus (청색-하단)에 대한 삼중 착색의 공-초점 이미징에서 얻은 대표적인 피질 이미지. 도 14A 및 14B는 대조군 모의-또는 바이러스성 시스템 항-miR-204-5p-처리된 5xFAD의 뇌 용해물에서 Nurr1 단백질의 면역 블롯 검출을 보여준다. 바이러스성 시스템 항-miR 204-5p는 5xFAD 뇌에서 Nurr1 발현을 촉진시킨다. 도 15는 5xFAD의 치아 이랑의 면역조직화학적 분석을 나타낸다. 바이러스성 시스템 항-miR-204는 5XFAD에서 아밀로이드 플락 부하를 감소시킨다. 모의 또는 바이러스성 시스템 항-miR-204를 투여한 후, 치아 이랑의 면역 조직 화학적 분석. 뇌 절편에서 확산 플락은 항-아밀로이드 베타 (클론 6E10, 적색) 및 핵 (청색)으로 착색되었다.

실시예 4

거동 테스트

새로운 물체 인식 테스트 (NORT)에 의해 처리를 받은 마우스와 처리를 받지 않은 마우스에서 마우스를 죽이기 전 새로운 물체 인지에 대한 해마-의존적 인지 기억은 평가되었다. 처음 3 일 동안 각 마우스는 아무런 물체가 없는 개방 열린 필드 상자에 적응하도록 남겨두었다 (10 분/세션). 4일 차에, 두 개의 동일한 물체 (A + A)를 탐색하도록 마우스를 10 분 동안 방치시켰다. 5 일 차에, 각 마우스를 익숙한 물체 A와 새로운 물체, 즉 B에 10 분 동안 노출시켰다. 그 다음 이들 물체와 개방 필드 상자를 비누와 물로 세척하여 후각 징후가 나타나지 않도록 했다. 녹화된 영상을 분석하고, 식별 지수 (DI)는 새로운 물체의 탐사 시간을 총 탐사 시간으로 나누어 산출하였다 [21]. 탐사란 물체를 킁킁거리거나 또는 만지는 것으로 정의 하였다. 물체에 대해 총 탐사 시간이 <5 초인 마우스들은 분석에서 제외했다. 도 16에서 항-miR-204-5p를 제공받은 마우스가 음성 대조군을 제공받은 마우스보다 더 나은 지수를 갖는다는 것을 보여준다. 이 데이터는 항-miR-204 억제제를 투여받은 마우스의 인지, 학습 및 기억이 대조군 마우스에 비해 향상되었음을 보여 주었다.

실시예 5

항-miR-204 억제제가 염증성 매개체에 끼지는 영향

세포는 음성 대조군과 항-miR-204 억제제로 시험관 내에서 처리될 것이다. 그런 다음, 이들 세포는 알파-시누클레인(synuclein) 단백질로 처리되고, TNF-α 및/또는 IL-1β와 같은 염증 매개체의 섹션을 결정하기 위해 측정될 것이다. 상기 염증성 매개체들이 감소될 것으로 예상된다.

실시예 6

Nurr1 단백질 발현 증가에 의한 항-miR-204 억제제의 신경보호 효과

항-miR-204의 신경보호 효과를 테스트하기 위해, 일차 마우스 해마 세포를 항-miR-204로 처리한 다음, 아밀로이드 베타 (Aβ) 또는 알파-시누클레인과 반응시킬 것이다. 그런 다음, 항-miR-204가 Nurr1 단백질 발현을 증가시킬 것으로 예상되기 때문에, 항-miR-204 치료가 Aβ 또는 알파-시누클레인에 의한 세포 사멸을 구제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 세포 사멸을 측정할 것이다. MTT 검정법 또는 TUNEL 검정법이 이 분석을 위해 사용될 수 있다. 항-miR-204 억제제는 신경보호 효과를 갖는 것으로 예상된다.

Nurr1 단백질과 알파-시누클레인 사이의 세포 사멸 상관관계를 결정하기 위해, HT22 마우스 해마 세포주는 Nurr1 shRNAs를 포함하는 렌티바이러스로 처리될 것이다. 그 다음 Nurr1 녹-다운(knock down)은 세포 사멸 검정법에 의해 측정될 것이다. Nurr1 단백질이 부족한 세포는 세포 사멸이 증가될 것으로 예상된다.

죽어가는 소교세포(microglia)는 염증 반응을 유도할 수 있는 소교 세포 활성화 제 (MMP3, 라미닌, α-시누클레인, 뉴로멜라닌 등둥)를 분비한다. 아밀로이드 베타 또는 알파-시누클레인 처리된 소교세포에서 항-miR-204의 효과를 테스트할 것이다. 항-miR-204는 상기 소교세포 작동체 분비를 감소시킬 것으로 예상된다.

실시예 7

Nurr1 단백질 발현을 증가시킴으로써 항-miR-204 억제제의 신경발생

성인 신경발생(neurogenesis)에 대한 항-miR-204의 효과를 결정하기 위해, 신경 전구세포는 성인 CNS로부터 분리시키고, 적절한 조건에서 성장시킬 것이다. 상기 전구 세포를 항-miR-204로 처리되고, BrdU ELISA에 의해 세포의 증식에 대해 측정할 것이다. 상기 항-miR-204는 성인의 신경발생을 증가시킬 것으로 예상된다.

실시예 8

항-miR-204 바이러스성 시스템의 효능 기간

항 -miR204 바이러스 시스템을 사용하는 효능 기간은 항 -miR-204 바이러스 시스템의 투여 후 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 시점에서 바이러스 역가를 측정함으로써 결정될 것이다.

실시예 9

Nurr1 단백질 발현 증가와 수상돌기 척추 밀도 상실 간의 상관관계

슬라이스된 뇌 조직은 시냅토피신/PSD-95 항체, 시냅스-전/-후 마커로 착색될 것이며, 시냅스의 밀도가 정량화될 것이다. 이 연구에서는 정상 대조군 마우스, 식염수 투여된 마우스 및 항-miR-204 바이러스 시스템으로 처리된 마우스에서 해마의 시냅스 밀도 차이를 조사할 것이다. 그런 다음, Nurr1 단백질 발현 증가로 인해 수지상 척추 밀도의 상실이 보호되는지 여부를 조사할 것이다.

실시예 10

인지 손상에 있어서 항-miR-204 바이러스성 시스템의 영향

항-miR-204 발현시키는 바이러스를 5XFAD 마우스에게 투여한 후, AD의 가장 중요한 증상인 인지 기능 감소를 Y-maze 작업과 상황별 공포 조절 작업에 의해 측정할 것이다. 상기 항-miR-204 발현시키는 바이러스를 제공받은 5XFAD 마우스 군의 인지 능력은 염수를 제공받은 5XFAD 마우스의 능력과 비교하여 증가될 것이다.

실시예 11

거동 기능 감소에 있어서 항-miR-204 발현시키는 바이러스의 영향

상기 항-miR-204 발현 바이러스를 투여한 후, 파킨슨 질환 (PD)의 가장 중요한 증상인 거동동 기능의 저하를 확인하기 위해 로타로드(rotarod) 및 폴(pole) 테스트를 사용할 것이다. 항-miR-204 발현시키는 바이러스로 처리된 PD 동물 모델 군의 거동 기능은 염수-처리된 PD 동물 모델 (6-OHDA 유도된 모델, PFF 유도된 모델, MPTP 유도된 모델 및 hA53T 알파-시누클레인 TG 마우스)의 기능과 비교하였을 때 개선될 것으로 기대한다.

실시예 12

신경-염증성 반응에 있어서 항-miR-204 발현시키는 바이러스의 효과

미세아교세포종은 파킨슨 질환과 알츠하이머 질환의 주요 병변중 하나로 알려져 있으며, Nurr1 단백질의 발현 증가에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다. 미세아교세포종이 항-miR-204 발현시키는 바이러스에 의해 변경될 수 있는 지를 조사하기 위해, Iba1을 이용하여 소교세포를 착색시키고, 그 결과를 정량화시킬 것이다. 항-miR-204 발현시키는 바이러스로 처리된 5XFAD 마우스의 해마와 피질은 염수로 처리된 5XFAD 마우스와 비교하였을 때, 미세아교세포중이 상당히 감소될 것으로 예상된다.

실시예 13

뉴런 손상에 있어서 항-miR-204의 효과

신경 세포 손실은 파킨슨 질환 및 알츠하이머 질환의 가장 특징적인 성향으로 알려져 있다. 항-miR-204의 효과를 분석하기 위해, 뉴런 핵 항원 (NeuN)을 뉴런에 대한 마커로 사용하여 면역조직화학적 착색을 수행할 것이다. 항-miR-204 투여로 해마에서 세포 손상이 상당히 억제될 것으로 예상된다.

실시예 14

ALS 환자의 척수 운동 뉴런에서 Nurr1 발현 분석

Nurr1 발현이 ALS에 의해 증가 또는 감소되는 지를 결정하기 위해, 실시간 PCR 및 Western 블랏 분석이 이용될 수 있다. ALS 환자와 정상 대상체에서 척수 운동 뉴런에서의 Nurr1 단백질 발현을 비교할 것이다.

실시예 15

파킨슨 질환 환자의 척수 운동 뉴런에서 Nurr1 발현 분석

파킨슨 질환에서 Nurr1 발현을 테스트하기 위해, 실시간 PCR 및 Western 블롯팅을 사용할 것이다. Nurr1 단백질의 발현은 정상인과 비교하였을 때 감소될 것으로 예상된다.

***

요약 및 요약 섹션이 아니라, 상세한 설명 섹션이 청구항을 해석하기 위해 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 요약 및 요약 섹션은 본 발명자(들)에 의해 고려된 바와 같이 본 명세서의 하나 이상의 예시적인 실시예들을 제시하지만, 그리고 따라서, 본 명세서 및 첨부된 청구 범위를 임의의 방식으로 제한하려는 것이 아니다.

본 명세서는 특정 기능 및 그 관계의 구현을 나타내는 기능적 빌딩 블록을 이용하여 설명되었다. 이들 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본 명세서에서 임의로 정의되었다. 특정 기능 및 그 관계가 적절히 수행되는 한, 대체 경계가 정의될 수 있다.

특정 실시예들에 대한 전술한 설명은 본 명세서의 일반적인 본질을 충분히 밝힐 것이며, 본 명세서의 일반적인 개념을 벗어나지 않으면서, 과도한 실험없이 이러한 특정 실시예와 같은 다양한 응용예를 당업계 기술 범위내에 지식을 적용함으로써 다른 이들도 용이하게 수정 및/또는 적응시킬 수 있다. 따라서, 이러한 적응 및 수정은 본 명세서에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 실시예의 등가의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본 명세서의 문구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아니며, 본 명세서의 용어 또는 문구는 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 한다.

본 명세서의 폭 및 범위는 전술한 예시적인 구체예 중 어느 것에 의해 제한되지 않아야 하며, 다음의 청구범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.

본 출원의 청구범위는 모 출원 및 기타 관련 출원의 청구항과 상이하다. 따라서 출원인은 모 출원 또는 본 출원과 관련된 모든 선행 출원에서 이루어진 청구 범위의 임의의 권리불요구(disclaimer)를 철회한다. 따라서 심사관은 그러한 이전 권리불요구 및 인용된 자료를 피하기 위해 인용된 인용문을 다시 방문해야 할 수도 있음을 알려드린다. 또한, 심사관은 본 출원에 작성된 임의의 권리불요구를 모 출원에 대해 판독하거나, 이에 대항해서 판독되어서 안된다는 점을 상기해야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Biorchestra, Ltd. <120> USE OF MIR-204 INHIBITOR TO INCREASE NURR1 PROTEIN EXPRESSION <130> 4366.0010000 <150> US 62/857,202 <151> 2019-06-04 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-5p (RNA) <400> 1 uucccuuugu cauccuaugc cu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-5p (RNA) complement <400> 2 aggcauagga ugacaaaggg aa 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-5p (DNA) <400> 3 ttccctttgt catcctatgc ct 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-5p (DNA) complement <400> 4 aggcatagga tgacaaaggg aa 22 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-3p (RNA) <400> 5 gcugggaagg caaagggacg u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-3p (RNA) complement <400> 6 acgucccuuu gccuucccag c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-3p (DNA) <400> 7 gctgggaagg caaagggacg t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-3p (DNA) complement <400> 8 acgtcccttt gccttcccag c 21 <210> 9 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem 2 (RNA) <400> 9 guauucug 8 <210> 10 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem 2 (DNA) <400> 10 gtattctg 8 <210> 11 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem 2 complement (RNA) <400> 11 cagaauac 8 <210> 12 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem 2 complement (DNA) <400> 12 cagaatac 8 <210> 13 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop (RNA) <400> 13 guca 4 <210> 14 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop (DNA) <400> 14 gtca 4 <210> 15 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem 1 (RNA) <400> 15 gacggcgcua ggaucauc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem 1 (DNA) <400> 16 gacggcgcta ggatcatc 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem 1 complement (RNA) <400> 17 gaugauccua gctccguc 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem 1 complement (DNA) <400> 18 gatgatccta gctccgtc 18 <210> 19 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Spacer (DNA/RNA) <400> 19 aac 3 <210> 20 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Spacer (DNA/RNA) <400> 20 caa 3 <210> 21 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker (RNA) <400> 21 aacaauac 8 <210> 22 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker (DNA) <400> 22 aacaatac 8 <210> 23 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-5p TD construct <400> 23 aaggatccga cggcgctagg atcatcaaca ggcataggat gacaaaggga acaagtattc 60 tggtcacaga atacaacagg cataggatga caaagggaac aagatgatcc tagcgccgtc 120 ttttttggaa aagcttaa 138 <210> 24 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR416 Control construct <400> 24 aaggatccga cggcgctagg atcatcaacg gttcgtacgt acactgttca caagtattct 60 ggtcacagaa tacaacggtt cgtacgtaca ctgttcacaa gatgatccta gcgccgtctt 120 ttttggaaaa gcttaa 136 <210> 25 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-5p seed sequence <400> 25 uucccuu 7 <210> 26 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR204-3p seed sequence <400> 26 gcuggga 7 <210> 27 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype1 <400> 27 aactcgaggt tcgatacagg ggcatcaaga ggcataggat gacaaaggga agaatttgga 60 acgtcagttc caaaaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga agatgcccct 120 gtatcgaact tttttggaac tcgagaa 147 <210> 28 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype2 <400> 28 aactcgagtg cgcgctttgt ggatgtaaga ggcataggat gacaaaggga agaaacccca 60 gtgtcaactg gggtaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aacatccaca 120 aagcgcgcat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 29 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype3 <400> 29 aactcgagaa taactagaca caatcgaaga ggcataggat gacaaaggga agaaaccttc 60 tggtcacaga aggtaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga acgattgtgt 120 ctagttattt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 30 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype4 <400> 30 aactcgaggt ttttatatgc caacacaaga ggcataggat gacaaaggga agaatacccg 60 aagtcattcg ggtaaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga agtgttggca 120 tataaaaact tttttggaac tcgagaa 147 <210> 31 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype5 <400> 31 aaggatcccc ttgggcttgt agcctaaaga ggcataggat gacaaaggga agaagttgag 60 cggtcacgct caacaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga ataggctaca 120 agcccaaggt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 32 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype6 <400> 32 aaggatcctg tggattttcc aaaaggaaga ggcataggat gacaaaggga agaaaagatc 60 gtgtcaacga tcttaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga accttttgga 120 aaatccacat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 33 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype7 <400> 33 aaggatccaa gtcagcctta ttggacaaga ggcataggat gacaaaggga agaaagcaat 60 aggtcactat tgctaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga agtccaataa 120 ggctgacttt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 34 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype8 <400> 34 aaggatccta cgaccgagtt cgtagtaaga ggcataggat gacaaaggga agaacagtga 60 aagtcatttc actgaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aactacgaac 120 tcggtcgtat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 35 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype9 <400> 35 aaggatcccc cggcgaaata ctgcgaaaga ggcataggat gacaaaggga agaatagcat 60 tcgtcagaat gctaaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga atcgcagtat 120 ttcgccgggt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 36 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype10 <400> 36 aaggatcctg gtggggacac tgagctaaga ggcataggat gacaaaggga agaagtctcg 60 cagtcatgcg agacaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aagctcagtg 120 tccccaccat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 37 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype11 <400> 37 aaggatccta aacagatcaa cacgctaaga ggcataggat gacaaaggga agaaagttgg 60 gcgtcagccc aactaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aagcgtgttg 120 atctgtttat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 38 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype12 <400> 38 aaggatcccg tcctacttaa gagagtaaga ggcataggat gacaaaggga agaagtctat 60 acgtcagtat agacaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aactctctta 120 agtaggacgt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 39 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype13 <400> 39 aaggatcctg tgttccgcgg agatcaaaga ggcataggat gacaaaggga agaaacaaaa 60 acgtcagttt ttgtaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga atgatctccg 120 cggaacacat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 40 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype14 <400> 40 aaggatcctc ctgatgtaag cttacaaaga ggcataggat gacaaaggga agaaaattat 60 tcgtcagaat aattaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga atgtaagctt 120 acatcaggat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 41 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype15 <400> 41 aaggatccct ttaagtggga cgatggaaga ggcataggat gacaaaggga agaagaacgg 60 ctgtcaagcc gttcaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga accatcgtcc 120 cacttaaagt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 42 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype16 <400> 42 aaggatccac tcttagtgtc cttatgaaga ggcataggat gacaaaggga agaaagatcg 60 aagtcattcg atctaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga acataaggac 120 actaagagtt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 43 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype17 <400> 43 aaggatccgc agcgatcgct cgtacaaaga ggcataggat gacaaaggga agaacaatcc 60 aagtcattgg attgaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga atgtacgagc 120 gatcgctgct tttttggaac tcgagaa 147 <210> 44 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype18 <400> 44 aaggatccta ctaagacagt atctccaaga ggcataggat gacaaaggga agaagtctct 60 aggtcactag agacaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aggagatact 120 gtcttagtat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 45 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype19 <400> 45 aaggatcctg cggcgcgact aaccgaaaga ggcataggat gacaaaggga agaaggtcac 60 tcgtcagagt gaccaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga atcggttagt 120 cgcgccgcat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 46 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype20 <400> 46 aaggatccta cctatatctc cacgttaaga ggcataggat gacaaaggga agaagacgaa 60 tcgtcagatt cgtcaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aaacgtggag 120 atataggtat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 47 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype21 <400> 47 aaggatccga cgagtcgtag cgcagaaaga ggcataggat gacaaaggga agaacagttg 60 ctgtcaagca actgaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga atctgcgcta 120 cgactcgtct tttttggaac tcgagaa 147 <210> 48 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype22 <400> 48 aaggatccgt aaatcaccct actgccaaga ggcataggat gacaaaggga agaaactctt 60 atgtcaataa gagtaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aggcagtagg 120 gtgatttact tttttggaac tcgagaa 147 <210> 49 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype23 <400> 49 aaggatccct aagttgttaa taattgaaga ggcataggat gacaaaggga agaaatgtgc 60 cggtcacggc acataagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga acaattatta 120 acaacttagt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 50 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype24 <400> 50 aaggatccca gaccagccag atcggcaaga ggcataggat gacaaaggga agaacgcgaa 60 cggtcacgtt cgcgaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga agccgatctg 120 gctggtctgt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 51 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype25 <400> 51 aaggatcctg cgtaacgaag tgggggaaga ggcataggat gacaaaggga agaatagagg 60 aggtcactcc tctaaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga acccccactt 120 cgttacgcat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 52 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype26 <400> 52 aaggatccca cggtcctagt cttttgaaga ggcataggat gacaaaggga agaatcgtct 60 aagtcattag acgaaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga acaaaagact 120 aggaccgtgt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 53 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype27 <400> 53 aaggatccat agactgcgga ggcggtaaga ggcataggat gacaaaggga agaatacaaa 60 ctgtcaagtt tgtaaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aaccgcctcc 120 gcagtctatt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 54 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype28 <400> 54 aaggatcctc aggtttaaac caacctaaga ggcataggat gacaaaggga agaaactgac 60 ctgtcaaggt cagtaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga aaggttggtt 120 taaacctgat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 55 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype29 <400> 55 aaggatcctc tgacatactt ggggaaaaga ggcataggat gacaaaggga agaaacttac 60 gagtcatcgt aagtaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga attccccaag 120 tatgtcagat tttttggaac tcgagaa 147 <210> 56 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype30 <400> 56 aaggatccaa gagttaagta gcctgaaaga ggcataggat gacaaaggga agaaatcaat 60 aggtcactat tgataagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga atcaggctac 120 ttaactcttt tttttggaac tcgagaa 147 <210> 57 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA complex_204-5p_subtype31 <400> 57 aaggatccga cggcgctagg atcatcaaca ggcataggat gacaaaggga acaagtattc 60 tggtcacaga atacaacagg cataggatga caaagggaac aagatgatcc tagcgccgtc 120 ttttttggaa ctcgagaa 138 <210> 58 <211> 1307 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear receptor subfamily 4 group A member 2 (NR4A2) <400> 58 gacctcctcc caagcacttc aaaggaactg gaatgataat ggaaactgtc aagagggggc 60 aagtcacatg ggcagagata gccgtgtgag cagtctcagc tcaagctgcc ccccatttct 120 gtaaccctcc tagccccctt gatccctaaa gaaaacaaac aaacaaacaa aaactgttgc 180 tatttcctaa cctgcaggca gaacctgaaa gggcattttg gctccggggc atcctggatt 240 tagaacatgg actacacaca atacagtggt ataaactttt tattctcagt ttaaaaatca 300 gtttgttgtt cagaagaaag attgctataa tgtataatgg gaaatgtttg gccatgcttg 360 gttgttgcag ttcagacaaa tgtaacacac acacacatac acacacacac acacacacag 420 agacacatct taaggggacc cacaagtatt gccctttaac aagacttcaa agttttctgc 480 tgtaaagaaa gctgtaatat atagtaaaac taaatgttgc gtgggtggca tgagttgaag 540 aaggcaaagg cttgtaaatt tacccaatgc agtttggctt tttaaattat tttgtgccta 600 tttatgaata aatattacaa attctaaaag ataagtgtgt ttgcaaaaaa aaagaaaata 660 aatacataaa aaagggacaa gcatgttgat tctaggttga aaatgttata ggcacttgct 720 acttcagtaa tgtctatatt atataaatag tatttcagac actatgtagt ctgttagatt 780 ttataaagat tggtagttat ctgagcttaa acattttctc aattgtaaaa taggtgggca 840 caagtattac acatcagaaa atcctgacaa aagggacaca tagtgtttgt aacaccgtcc 900 aacattcctt gtttgtaagt gttgtatgta ccgttgatgt tgataaaaag aaagtttata 960 tcttgattat tttgttgtct aaagctaaac aaaacttgca tgcagcagct tttgactgtt 1020 tccagagtgc ttataatata cataactccc tggaaataac tgagcacttt gaattttttt 1080 tatgtctaaa attgtcagtt aatttattat tttgtttgag taagaatttt aatattgcca 1140 tattctgtag tatttttctt tgtatatttc tagtatggca catgatatga gtcactgcct 1200 ttttttctat ggtgtatgac agttagagat gctgattttt tttctgataa attctttctt 1260 tgagaaagac aattttaatg tttacaacaa taaaccatgt aaatgaa 1307 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nurr1 <400> 59 atcctgacaa aagggacaca tagtg 25 <210> 60 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nurr1 <400> 60 aatacataaa aaagggacaa gcatgt 26 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nurr1 <400> 61 aagcacttca aaggaactgg aatgat 26 <210> 62 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 62 uccguauccu acuguuuccc uu 22 <210> 63 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isoform <400> 63 Met Pro Cys Val Gln Ala Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Gly Ala Ser 1 5 10 15 Pro Ala Ser Gln Ser Tyr Ser Tyr His Ser Ser Gly Glu Tyr Ser Ser 20 25 30 Asp Phe Leu Thr Pro Glu Phe Val Lys Phe Ser Met Asp Leu Thr Asn 35 40 45 Thr Glu Ile Thr Ala Thr Thr Ser Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Met 50 55 60 Asp Asn Tyr Ser Thr Gly Tyr Asp Val Lys Pro Pro Cys Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Met Pro Leu Ser Gly Gln Gln Ser Ser Ile Lys Val Glu Asp Ile Gln 85 90 95 Met His Asn Tyr Gln Gln His Ser His Leu Pro Pro Gln Ser Glu Glu 100 105 110 Met Met Pro His Ser Gly Ser Val Tyr Tyr Lys Pro Ser Ser Pro Pro 115 120 125 Thr Pro Thr Thr Pro Gly Phe Gln Val Gln His Ser Pro Met Trp Asp 130 135 140 Asp Pro Gly Ser Leu His Asn Phe His Gln Asn Tyr Val Ala Thr Thr 145 150 155 160 His Met Ile Glu Gln Arg Lys Thr Pro Val Ser Arg Leu Ser Leu Phe 165 170 175 Ser Phe Lys Gln Ser Pro Pro Gly Thr Pro Val Ser Ser Cys Gln Met 180 185 190 Arg Phe Asp Gly Pro Leu His Val Pro Met Asn Pro Glu Pro Ala Gly 195 200 205 Ser His His Val Val Asp Gly Gln Thr Phe Ala Val Pro Asn Pro Ile 210 215 220 Arg Lys Pro Ala Ser Met Gly Phe Pro Gly Leu Gln Ile Gly His Ala 225 230 235 240 Ser Gln Leu Leu Asp Thr Gln Val Pro Ser Pro Pro Ser Arg Gly Ser 245 250 255 Pro Ser Asn Glu Gly Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys 260 265 270 Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys 275 280 285 Arg Thr Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn 290 295 300 Cys Pro Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe 305 310 315 320 Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp 325 330 335 Ser Leu Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser Pro 340 345 350 Gln Glu Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Val Ser Leu Ile Ser Ala Leu 355 360 365 Val Arg Ala His Val Asp Ser Asn Pro Ala Met Thr Ser Leu Asp Tyr 370 375 380 Ser Arg Phe Gln Ala Asn Pro Asp Tyr Gln Met Ser Gly Asp Asp Thr 385 390 395 400 Gln His Ile Gln Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Thr Gly Ser Met Glu Ile 405 410 415 Ile Arg Gly Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Ala Asp Leu Pro Lys 420 425 430 Ala Asp Gln Asp Leu Leu Phe Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe Val 435 440 445 Leu Arg Leu Ala Tyr Arg Ser Asn Pro Val Glu Gly Lys Leu Ile Phe 450 455 460 Cys Asn Gly Val Val Leu His Arg Leu Gln Cys Val Arg Gly Phe Gly 465 470 475 480 Glu Trp Ile Asp Ser Ile Val Glu Phe Ser Ser Asn Leu Gln Asn Met 485 490 495 Asn Ile Asp Ile Ser Ala Phe Ser Cys Ile Ala Ala Leu Ala Met Val 500 505 510 Thr Glu Arg His Gly Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val Glu Glu Leu Gln 515 520 525 Asn Lys Ile Val Asn Cys Leu Lys Asp His Val Thr Phe Asn Asn Gly 530 535 540 Gly Leu Asn Arg Pro Asn Tyr Leu Ser Lys Leu Leu Gly Lys Leu Pro 545 550 555 560 Glu Leu Arg Thr Leu Cys Thr Gln Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu 565 570 575 Lys Leu Glu Asp Leu Val Pro Pro Pro Ala Ile Ile Asp Lys Leu Phe 580 585 590 Leu Asp Thr Leu Pro Phe 595 <210> 64 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 64 aactcgaggt tcgatacagg ggcatcaaga ggcataggat gacaaaggga agaatttgga 60 acgtcagttc caaaaagaag aatagaaggc ataggatgac aaagggaaga agatgcccct 120 gtatcgaact tttttggaac tcgagaa 147 <210> 65 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 65 aactcgaggt tcgatacagg ggcatcaaga agaggcttgc acagtgcatt gaatttggaa 60 cgtcagttcc aaaaagaaga atagaaagag gcttgcacag tgcattgaag atgcccctgt 120 atcgaacttt tttggaactc gagaa 145

Claims

Nurr1 단백질의 감소된 수준과 관련된 질환 또는 병태의 치료를 요하는 대상체에서 이러한 질환 또는 병태 치료용 miR-204 억제제에 있어서, 이때 이 miR-204 억제제는 해당 대상체에게 투여용으로 적합한, 억제제.
세포에서 Nurr1 단백질 발현 증가용 miR-204 억제제에 있어서, 이때 이 miR-204 억제제는 세포와 접촉할 때 Nurr1 단백질 발현을 증가시키는, 억제제.
청구항 2에 있어서, 이때 상기 세포는 대상체에 존재하는. miR-204 억제제.
청구항 1 내지 3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 miR-204 억제제는 적어도 하나의 miR-204 결합 부위를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 4에 있어서, 이때 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터와 RNA 발현 영역을 포함하는 벡터인, miR-204 억제제.
청구항 5에 있어서, 이때 상기 RNA 발현 영역은 상기 프로모터의 하류에 위치하며, 이때 해당 RNA 발현 영역은 적어도 하나의 miR-204 결합 부위를 포함하는 RNA를 발현시키는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그리고 이때 해당 RNA 발현 영역은 단백질을 인코드하지 않는, miR-204 억제제.
청구항 5 또는 6에 있어서, 이때 상기 벡터는 이 백터에 이종성인 단백질을 인코드하지 않는, miR-204 억제제.
청구항 4 내지 7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위 내인성는 miR-204에 결합하고, 하나 또는 그 이상의 내인성 폴리펩티드의 발현을 조절하는, miR-204 억제제.
청구항 8에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 miR204 결합 부위는 Nurr1 단백질의 발현을 증가시키는, miR-204 억제제.
청구항 1 내지 9중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 miR204 억제제는 NMDA 수용체의 발현을 증가시키지 않는, miR-204 억제제.
청구항 10에 있어서, 이때 상기 miR204 억제제는 EphB2 단백질의 발현을 증가시키지 않는, miR-204 억제제.
청구항 1 내지 11중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 miR204 억제제는 상기 투여 또는 접촉 전 발현과 비교하였을 때, 이러한 투여 또는 접촉 후 Nurr1 단백질의 발현을 적어도 약 1.5 배, 적어도 약 2 배, 적어도 약 2.5 배, 적어도 약 3 배, 적어도 약 3.5 배, 적어도 약 4 배, 적어도 약 4.5 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 5.5 배, 적어도 약 6 배, 적어도 약 6.5 배, 적어도 약 7 배, 적어도 약 7.5 배, 또는 적어도 약 8 배 증가시키는, miR-204 억제제.
청구항 1 내지 12중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 miR204 억제제는 NMDA 수용체 및/또는 EphB2 단백질의 감소된 발현과는 무관하고, Nurr1 단백질의 감소된 발현과 연합된 질환 또는 병태를 치료하는, miR-204 억제제.
청구항 1 내지 13중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 질환 또는 병태는 해마 기능의 감소와는 관련없는, miR-204 억제제.
청구항 13 또는 14에 있어서, 이때 상기 질환 또는 병태는 알츠하이머 질환인, miR-204 억제제.
청구항 1, 13, 및 14중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 질환 또는 병태는 파킨슨 질환, 프리온 질환, 운동 뉴런 질병, 헌팅턴 질환, 척수소뇌성 운동실조, 척추 근육 위축, 근위축성 측삭 경화증, 또는 이들의 임의의 조합인, miR-204 억제제.
청구항 1 내지 16중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-5p에 혼성화되는, miR-204 억제제.
청구항 4 내지 17중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-5p에 완전히 상보적인, miR-204 억제제.
청구항 17 또는 18에 있어서, 이때 상기 miR-204-5p는 서열 식별 번호: 1에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 4 내지 19중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 서열 식별 번호: 2에서 제시된 핵산 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 5 내지 20중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 RNA를 발현시키는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별 번호: 3에서 제시된 핵산 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 4 내지 16중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-3p에 혼성화되는, miR-204 억제제.
청구항 22에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 miR-204-3p에 완전하게 상보적인, miR-204 억제제.
청구항 22 또는 23에 있어서, 이때 상기 miR-204-3p는 서열 식별 번호: 5에서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 22 내지 24중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 서열 식별 번호: 6에서 제시된 핵산 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 22 내지 25중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 RNA를 발현시키는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별 번호: 7에서 제시된 핵산 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 5 내지 26중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 RNA는 적어도 2개의 miR-204 결합 부위를 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 27에 있어서, 이때 상기 RNA는 2개 miR-204 결합 부위, 3개 miR-204 결합 부위, 4개 miR-204 결합 부위, 5개 miR-204 결합 부위, 또는 6개 miR-204 결합 부위를 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 27에 있어서, 이때 상기 RNA는 2개 miR-204 결합 부위를 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 4 내지 29중 임의의 한 항에 있어서, 이때 각각의 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 이의 5' 단부에 서열 식별 번호: 19에 제시된 핵산 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 4 내지 30중 임의의 한 항에 있어서, 이때 각각의 적어도 하나의 miR-204 결합 부위는 이의 3' 단부에 서열 식별 번호: 20에 제시된 핵산 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 29에 있어서, 이때 상기 2개 miR-204 결합 부위는 이들 miR-204 결합 부위 사이에 루프를 형성하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 32에 있어서, 이때 상기 루프는 서열 식별 번호: 13에 제시된 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 29 내지 33중 임의의 한 항에 있어서, 이때 두 개 miR-204 결합 부위를 포함하는 RNA는 제 1 스템 영역과 제 2 스템 영역을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 34에 있어서, 이때 상기 제 1 스템 영역은 서열 식별 번호: 9에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 식별 번호: 11에 제시된 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 상기 2개 miR-204 결합 부위중 적어도 하나에 연계된, miR-204 억제제.
청구항 34 또는 35에 있어서, 이때 상기 제 2 스템 영역은 서열 식별 번호: 15에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 식별 번호: 17에 제시된 이의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 상기 2개 miR-204 결합 부위중 적어도 하나에 연계된, miR-204 억제제.
청구항 5 내지 36중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 RNA는 서열 식별 번호: 23, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 또는 57에서 제시된 핵산 서열을 포함하는, miR-204 억제제.
청구항 1 내지 37중 임의의 한 항에 있어서, 바이러스, 플라스미드, 또는 파아지미드인 miR-204 억제제.
청구항 1 내지 38중 임의의 한 항에 있어서, 바이러스인 miR-204 억제제.
청구항 39에 있어서, 이때 상기 바리어스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스 (AAV), SV40-유형 바이러스, 폴리오마바이러스, Epstein-Barr 바이러스, 유두종 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 소아마비 바이러스 및 RNA 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된, miR-204 억제제.
청구항 1 내지 40중 임의의 한 항에 있어서, AAV인 miR-204 억제제.
청구항 41에 있어서, 이때 상기 AAV는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3A, AAV 유형 3B, AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는, miR-204 억제제.
청구항 5 내지 42중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 프로모터는 RNA Pol III 프로모터인, miR-204 억제제.
청구항 43에 있어서, 이때 상기 RNA Pol III 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, 7SK 프로모터, 5S 프로모터, 아데노바이러스 2 (Ad2) VAI 프로모터, 그리고 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, miR-204 억제제.
청구항 5 내지 44중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 프로모터는 U6 프로모터인, miR-204 억제제.
청구항 5 내지 43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 프로모터는 구성적 프로모터인, miR-204 억제제.
청구항 46에 있어서, 이때 상기 구성적 프로모터는 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 (CMV), 유인원 바이러스 (예를 들어, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), Rous 육종 바이러스, 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR) 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, miR-204 억제제.
청구항 5 내지 43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 프로모터는 유도성 프로모터인, miR-204 억제제.
청구항 48에 있어서, 이때 상기 유도성 프로모터는 조직 특이적 프로모터인, miR-204 억제제.
청구항 49에 있어서, 이때 상기 조직 특이적 프로모터는 뉴런, 교질 세포, 또는 뉴런과 교질 세포 모두에서 코딩 영역의 전사를 유도하는, miR-204 억제제.
청구항 1 내지 50중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 miR204 억제제는 약제학적으로 수용가능한 운반체와 함께 약제학적 조성물로 제형화되는, miR-204 억제제.
청구항 1 및 4 내지 51중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 인지 증상과 비교하여, 해당 대상체에서 하나 또는 그 이상의 인지 증상을 개선시키는, miR-204 억제제.
청구항 1 및 4 내지 52중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 기억 상실과 비교하여, 해당 대상체에서 기억 상실을 감소시키는, miR-204 억제제.
청구항 1 및 4 내지 53중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 기억 보존과 비교하여, 해당 대상체에서 기억 보존을 개선시키는, miR-204 억제제.
청구항 1 및 4 내지 54중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 아밀로이드 베터 (Aβ) 플락 로드와 비교하여, 해당 대상체에서 아밀로이드 베터 (Aβ) 플락 로드를 감소시키는, miR-204 억제제.
청구항 1 및 4 내지 55중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 투여는 이러한 투여 전, 대상체의 뉴런의 수지상 척추 밀도와 비교하여, 해당 대상체에서 뉴런의 수지상 척추 밀도를 증가시키는, miR-204 억제제.
청구항 1 및 4 내지 56중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 투여는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막아래, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 통한 투여인, miR-204 억제제.
서열 식별 번호: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 또는 56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서, 이때 이 뉴클레오티드 서열은 miR-204-5p를 억제시킬 수 있는, 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 58에 있어서, 이때 상기 miR-204-5p는 서열 식별 번호: 1을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 58 또는 59에 있어서, 이때 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 식별 번호: 1에 혼성화되는, 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 58 내지 60중 임의의 한 항에 있어서, Nurr1 단백질 증가를 필요로 하는 대상체에서 이를 증가시키기 위한 용도의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 이때 이 폴리뉴클레오티드 서열은 해당 대상체에게 투여용으로 적합한, 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 61에 있어서, 이때 상기 투여로 Nurr1 단백질 수준이 증가된 것과 연합된 질환 또는 병태가 치료되는,폴리뉴클레오티드 서열