KR20220033140A

KR20220033140A - Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunocytokines and antibodies against human pd-l1

Info

Publication number: KR20220033140A
Application number: KR1020200115150A
Authority: KR
Inventors: 스테판 불슐레거; 더글라스 하나한; 데아크 로라 코다리; 크리스티안 클라인; 발레리아 니콜리니; 파블로 우마나
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2022-03-16

Abstract

The present invention relates to a combination therapy of specific PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines with a specific antibody that binds to human PD-L1. According to the present invention, the therapy is used for preventing or treating the metastasis of cancer.

Description

PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 인간 PD-L1에 대한 항체의 병용 요법{COMBINATION THERAPY OF PD-1-TARGETED IL-2 VARIANT IMMUNOCYTOKINES AND ANTIBODIES AGAINST HUMAN PD-L1}COMBINATION THERAPY OF PD-1-TARGETED IL-2 VARIANT IMMUNOCYTOKINES AND ANTIBODIES AGAINST HUMAN PD-L1

본 발명은 특이적인 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과, 인간 PD-L1에 결합하는 특이적인 항체와의 병용 요법에 관한 것이다.The present invention relates to combination therapy of a specific PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine with a specific antibody that binds to human PD-L1.

암은 경제 선진국에서 사망의 선도 원인이며 개발 도상국에서는 사망의 두 번째 선도 원인이다. 화학요법의 최근의 진보 및 암세포에서 성장 신호의 전달 및 조절을 방해하도록 분자 수준에서 표적화된 작용제의 개발에도 불구하고, 진행된 암을 갖는 환자의 예후는 일반적으로 여전히 불량하다. 결과적으로, 허용가능하지 않은 독성을 유발하지 않으면서 생존을 증가시키기 위해 기존의 치료에 부가될 수 있는 신규의 요법을 개발할 지속적이고 긴급한 의학적 요구가 존재한다.Cancer is the leading cause of death in developed economies and the second leading cause of death in developing countries. Despite recent advances in chemotherapy and the development of agents targeted at the molecular level to interfere with the transmission and regulation of growth signals in cancer cells, the prognosis of patients with advanced cancer is generally still poor. Consequently, there is an ongoing and urgent medical need to develop novel therapies that can be added to existing treatments to increase survival without causing unacceptable toxicity.

IL-2 및 PD-1-표적화된 IL-2-기반 면역사이토카인IL-2 and PD-1-targeted IL-2-based immunocytokines

인터류킨 2(IL-2)는 림프구 및 자연살해(NK) 세포를 활성화시키는 사이토카인이다. IL-2는 항-종양 활성을 갖는 것으로 입증되었으나; 높은 수준의 IL-2는 폐 독성에 이르게 되며; IL-2의 항-종양 활성은 다수의 억제 피드백 고리에 의해 제한된다.Interleukin 2 (IL-2) is a cytokine that activates lymphocytes and natural killer (NK) cells. IL-2 has been demonstrated to have anti-tumor activity; High levels of IL-2 lead to lung toxicity; The anti-tumor activity of IL-2 is limited by multiple inhibitory feedback loops.

항-종양 효능에 기반하여, 고-용량 IL-2(알데스류킨, 프로류킨(Proleukin)(등록상표)으로서 시중에 나와있다) 치료는 미국에서 전이성 신세포 암종(RCC) 및 악성 흑색종 환자, 및 유럽에서 전이성 RCC 환자에 대해 사용이 승인되었다. 그러나, IL-2의 작용 방식의 결과로서, IL-2의 전신 및 표적화되지 않은 적용은 T_reg 세포 및 AICD의 유도를 통해 항-종양 면역성을 상당히 손상시킬 수 있다. 전신 IL-2 치료의 추가적인 우려는 정맥내 투여시의 심한 부작용과 관련되며, 상기 부작용은 중증 심혈관, 폐 부종, 간, 위장(GI), 신경학적, 및 혈액학적 사건들을 포함한다(Proleukin (aldesleukin) Summary of Product Characteristics [SmPC]: http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/19322/SPC/ (accessed May 27, 2013)). 저-용량 IL-2 섭생이 환자에서 시험되었지만, 최적이 아닌 치료학적 결과의 대가가 있었다. 종합해보면, IL-2를 사용하는 치료학적 접근법은 그의 적용과 관련된 골칫거리가 극복될 수 있다면 암 치료법에 유용할 수 있다. PD-1-표적화된 항원 결합 부분 및 IL-2-기반 효과기 부분을 포함하는 면역접합체가 예를 들어 WO 2018/184964 A1에 기재되어 있다.Based on anti-tumor efficacy, high-dose IL-2 (Aldesleukin, marketed as Proleukin®) treatment is indicated in patients with metastatic renal cell carcinoma (RCC) and malignant melanoma in the United States. , and in Europe for patients with metastatic RCC. However, as a result of the mode of action of IL-2, systemic and untargeted application of IL-2 can significantly impair anti-tumor immunity through induction of T _reg cells and AICD. A further concern with systemic IL-2 therapy is the severe side effects of intravenous administration, which include severe cardiovascular, pulmonary edema, hepatic, gastrointestinal (GI), neurological, and hematological events (Proleukin (aldesleukin (aldesleukin) ) Summary of Product Characteristics [SmPC]: http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/19322/SPC/ (accessed May 27, 2013)). Low-dose IL-2 regimens have been tested in patients, but at the cost of suboptimal therapeutic outcomes. Taken together, therapeutic approaches using IL-2 may be useful for cancer therapy if the headaches associated with their application can be overcome. Immunoconjugates comprising a PD-1-targeted antigen binding moiety and an IL-2-based effector moiety are described, for example, in WO 2018/184964 A1.

PD-1 및 PD-1 항체PD-1 and PD-1 Antibodies

세포예정사 단백질 1(PD-1 또는 CD279)은 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 또한 포함하는, 수용체들의 CD28 패밀리의 억제성 구성원이다. PD-1은 세포 표면 수용체이며 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수성 세포상에서 발현된다(문헌[Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82]; 문헌[Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8]). PD-1의 구조는 하나의 면역글로불린 가변-형 세포외 도메인 및 면역수용체 타이로신-기반 억제 동기(ITIM) 및 면역수용체 타이로신-기반 스위치 동기(ITSM)를 함유하는 세포질 도메인으로 이루어진 단량체성 1형 막관통 단백질이다. PD-1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2가 식별되었으며, 이들은 PD-1에 결합시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 입증되었다(문헌[Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34]; 문헌[Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8]; 문헌[Carter et al (2002) Eur J Immunol 32:634-43]). PD-L1 및 PD-L2는 모두, PD-1에 결합하지만 다른 CD28 패밀리 구성원에는 결합하지 않는 B7 동족체이다. PD-1에 대한 하나의 리간드인 PD-L1은 다양한 인간 암에 풍부하다(문헌[Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9]). PD-1과 PD-L1간의 상호작용은 종양 침윤성 림프구의 감소, T 세포 수용체 매개된 증식의 감소, 및 암성 세포에 의한 면역감시 회피를 생성시킨다(문헌[Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7]; 문헌[Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314]; 문헌[Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100]). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1과의 국소적인 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있으며, 그 효과는 PD-1과 PD-L2와의 상호작용이 차단될 때 또한 부가된다(문헌[Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7]; 문헌[Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66]). PD-1에 결합하는 항체는 예를 들어 WO 2017/055443 A1에 기재되어 있다.Apoptotic death protein 1 (PD-1 or CD279) is an inhibitory member of the CD28 family of receptors, which also includes CD28, CTLA-4, ICOS and BTLA. PD-1 is a cell surface receptor and is expressed on activated B cells, T cells and myeloid cells (Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. ( 2003) J Immunol 170:711-8]). The structure of PD-1 is a monomeric type 1 membrane consisting of one immunoglobulin variable-type extracellular domain and a cytoplasmic domain containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motive (ITIM) and an immunoreceptor tyrosine-based switch motive (ITSM). It is a penetrating protein. Two ligands for PD-1, PD-L1 and PD-L2, have been identified and demonstrated to downregulate T cell activation upon binding to PD-1 (Freeman et al (2000) J Exp Med 192). : 1027-34; Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Both PD-L1 and PD-L2 are B7 homologues that bind PD-1 but not other CD28 family members. One ligand for PD-1, PD-L1, is abundant in a variety of human cancers (Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9). The interaction between PD-1 and PD-L1 results in a decrease in tumor infiltrating lymphocytes, a decrease in T cell receptor mediated proliferation, and evasion of immunosurveillance by cancerous cells (Dong et al. (2003) J. MoI). Med. 81:281-7;Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100 ]). Immune suppression can be reversed by inhibiting the local interaction of PD-1 with PD-L1, and the effect is also amplified when the interaction of PD-1 with PD-L2 is blocked (Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66). Antibodies that bind to PD-1 are described, for example, in WO 2017/055443 A1.

PD-L1 및 PD-L1 항체PD-L1 and PD-L1 Antibodies

T 세포에 대한 2개의 별개 신호의 공-자극 또는 제공은 항원-제시 세포(APC)에 의한 휴지 T 림프구의 림프구 활성화에 대한 광범위하게 허용되는 모델이다. 문헌[Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975)].Co-stimulation or presentation of two distinct signals to T cells is a widely accepted model for lymphocyte activation of resting T lymphocytes by antigen-presenting cells (APCs). Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53 :27-42 (1975)].

상기 모델은 비-자기로부터 자기의 구별 및 면역관용을 추가로 제공한다. 문헌[Bretscher et al., Science 169: 1042-1049 (1970)]; 문헌[Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999)]; 문헌[Jenkins et al., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)]. 1차 신호 또는 항원 특이성 신호는 주조직적합성-복합체(MHC)의 상황에서 제시된 외부 항원 펩타이드의 인식에 이어서 T 세포 수용체(TCR)를 통해 전달된다. 2차 또는 공-자극 신호는 항원-제시 세포(APC)상에서 발현된 공-자극 분자에 의해 T 세포로 전달되고, 클론 확대, 사이토카인 분비 및 효과기 기능을 촉진하도록 T 세포를 유도한다. 문헌[Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996)]. 공-자극의 부재하에서, T 세포는 항원 자극에 불응성으로 될 수 있으며, 유효 면역 반응의 수준에 올라서지 못하고, 더욱이 외부 항원에 대한 내성 또는 고갈을 생성시킬 수도 있다.This model further provides for differentiation of self from non-self and immune tolerance. Bretscher et al., Science 169 : 1042-1049 (1970); Bretscher, PA, PNAS USA 96 :185-190 (1999); Jenkins et al., J. Exp. Med. 165 :302-319 (1987)]. A primary signal or antigen-specific signal is transmitted via the T cell receptor (TCR) following recognition of a foreign antigenic peptide presented in the context of the major histocompatibility-complex (MHC). Secondary or co-stimulatory signals are delivered to T cells by co-stimulatory molecules expressed on antigen-presenting cells (APCs) and induce T cells to promote clonal expansion, cytokine secretion and effector function. Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14 :233 (1996)]. In the absence of co-stimulation, T cells may become refractory to antigenic stimulation, fail to elevate the level of an effective immune response, and further develop resistance or depletion to foreign antigens.

단순한 2-신호 모델은 TCR 신호의 강도가 실제로는 T 세포 활성화 및 분화에 정량적인 영향을 미치기 때문에 지나친 단순화일 수 있다. 문헌[Viola et al., Science 273: 104-106 (1996)]; 문헌[Sloan-Lancaster, Nature 363: 156-159 (1993)]. 더욱이, T 세포 활성화는 TCR 신호 강도가 높은 경우 공-자극 신호의 부재하에서조차 발생할 수 있다. 보다 중요하게, T 세포는 양성 및 음성 2차 공-자극 신호를 모두 수용한다. 상기와 같은 양성 및 음성 신호의 조절은 면역관용을 유지하고 자가면역성을 예방하면서 숙주의 보호면역 반응을 최대화하는데 중요하다.A simple two-signal model may be an oversimplification as the strength of the TCR signal actually has a quantitative effect on T cell activation and differentiation. Viola et al., Science 273 : 104-106 (1996); Sloan-Lancaster, Nature 363 :156-159 (1993). Moreover, T cell activation can occur even in the absence of a co-stimulatory signal when the TCR signal intensity is high. More importantly, T cells accept both positive and negative secondary co-stimulatory signals. Modulation of such positive and negative signals is important for maximizing the protective immune response of the host while maintaining immune tolerance and preventing autoimmunity.

음성 2차 신호는 T 세포 내성의 유도에 필요한 것으로 보이는 반면, 양성 신호는 T 세포 활성화를 촉진한다. 상기 단순한 2-신호 모델은 여전히 미경험 림프구에 타당한 설명을 제공하지만, 숙주의 면역 반응은 동적인 과정이며, 공-자극 신호가 또한 항원-노출된 T 세포에 제공될 수 있다.A negative secondary signal appears to be required for the induction of T cell resistance, whereas a positive signal promotes T cell activation. Although this simple two-signal model still provides a valid explanation for naive lymphocytes, the host's immune response is a dynamic process, and co-stimulatory signals can also be provided to antigen-exposed T cells.

공-자극의 기전은 공-자극 신호의 조작이 세포-기반 면역반응을 증대시키거나 종결시키는 수단을 제공하는 것으로 입증되었기 때문에 치료학적으로 중요하다. 최근에, T 세포 기능장애 또는 면역성 결여가 억제 수용체, 세포예정사 1 폴리펩타이드(PD-1)의 유도 및 지속된 발현과 동시에 발생하는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, PD-1 및 PD-1과의 상호작용을 통해 신호를 전달하는 다른 분자, 예를 들어 세포예정사 리간드 1(PD-L1) 및 세포예정사 리간드 2(PD-L2)를 표적화하는 치료제에 관심이 집중되고 있다. PD-L1 신호전달의 억제는 암(예를 들어 종양 면역성) 및 감염(급성 및 만성(예를 들어 지속성) 감염 모두를 포함하여)의 치료를 위해 T 세포 면역성을 증대시키는 수단으로서 제시되었다. 그러나, 상기 경로 중 표적에 대한 최적의 치료제는 아직 상업화되지 않았기 때문에, 상당한 미충족 의학적 요구가 존재한다. PD-L1에 대한 항체는 예를 들어 WO　2010/077634에 기재되어 있다.The mechanism of co-stimulation is of therapeutic importance because manipulation of co-stimulatory signals has been demonstrated to provide a means to augment or terminate cell-based immune responses. Recently, it has been shown that T cell dysfunction or immunodeficiency co-occurs with the induction and sustained expression of an inhibitory receptor, apoptosis 1 polypeptide (PD-1). As a result, PD-1 and other molecules that transduce signals through interaction with PD-1, such as programmed apoptosis ligand 1 (PD-L1) and programmed apoptosis ligand 2 (PD-L2), are Attention is focused on therapeutics. Inhibition of PD-L1 signaling has been suggested as a means of enhancing T cell immunity for the treatment of cancer (eg tumor immunity) and infections (including both acute and chronic (eg persistent) infections). However, there is a significant unmet medical need because optimal therapeutics for the targets in this pathway have not yet been commercialized. Antibodies to PD-L1 are described, for example, in WO2010/077634.

본 발명은 암 또는 종양의 치료에 사용하기 위한, 전이의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능을 자극하는데 사용하기 위한, PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법을 포함한다.The present invention provides a PD-1-targeted IL-2 variant for use in the treatment of cancer or tumors, for use in the prevention or treatment of metastases, or for use in stimulating an immune response or function, such as T cell activation. Combination therapy with an immunocytokine and an antibody that binds to human PD-L1 is included.

본 발명은 암 또는 종양의 치료에 사용하기 위한, 전이의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능을 자극하는데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, PD-1 또는 T 세포-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인의 용도를 포함하며, 여기에서 상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여한다.The present invention relates to PD-1 or T, for use in the treatment of cancer or tumors, for use in the prevention or treatment of metastases, or for the manufacture of a medicament for use in stimulating an immune response or function, such as T cell activation. comprising the use of a cell-targeted IL-2 variant immunocytokine, wherein said PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is administered in combination with an antibody that binds to human PD-L1.

본 발명은 암 또는 종양의 치료에 사용하기 위한, 전이의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능을 자극하는데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 인간 PD-L1에 결합하는 항체의 용도를 포함하며, 여기에서 상기 인간 PD-L1에 결합하는 항체를 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 함께 투여한다.The present invention relates to human PD-L1 for use in the treatment of cancer or tumors, for use in the prevention or treatment of metastases, or for the manufacture of a medicament for use in stimulating an immune response or function such as T cell activation. comprising the use of an antibody that binds, wherein said antibody that binds human PD-L1 is administered in combination with a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine.

본 발명은 암 또는 종양의 치료 방법, 전이의 예방 또는 치료 방법, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극 방법을 포함하며, 상기 방법은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법을 투여함을 포함한다.The present invention includes a method of treating cancer or tumor, a method of preventing or treating metastasis, or a method of stimulating an immune response or function such as T cell activity, wherein the method comprises a PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine and combination therapy with an antibody that binds to human PD-L1.

상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 a) 서열번호 5의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 6의 경쇄 가변 도메인 VL, 및 서열번호 2의 폴리펩타이드 서열, 또는 b) 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 c) 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 d) 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 a) 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL, 또는 b) 서열번호 19의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 20의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy comprises: a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 5 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 6, and the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, or b) a polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or c) a polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, or d) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: It is characterized in that it comprises the polypeptide sequence of 14; The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy comprises a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16, or b) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 It is characterized in that it comprises a light chain variable domain VL of

본 발명의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법은 암 치료에 사용하기 위한 것이다. PD-1은 종양 세포 환경에 제시될 수 있다. 상기 암은 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 흑색종암, 방광암, 신세포암, 신장암, 간암, 두경부암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 위암종암, 식도암, 중피종, 전립선암, 백혈병, 림프종, 골수종으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.In an embodiment of the invention, the combination therapy of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein with an antibody that binds human PD-L1 is for use in the treatment of cancer. PD-1 can be presented in the tumor cell environment. The cancer is breast cancer, lung cancer, colon cancer, ovarian cancer, melanoma cancer, bladder cancer, renal cell cancer, kidney cancer, liver cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, melanoma, pancreatic cancer, gastric carcinoma, esophageal cancer, mesothelioma, prostate cancer, leukemia, lymphoma , may be selected from the group consisting of myeloma.

본 발명의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법은 전이의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다.In an embodiment of the present invention, combination therapy of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein with an antibody that binds human PD-L1 is for use in the prevention or treatment of metastasis. will be.

본 발명의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법은 종양 면역성과 같은 면역 관련 질병을 치료하거나 그의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 것이다.In an embodiment of the invention, combination therapy of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein and an antibody that binds to human PD-L1 is used to treat an immune-related disease such as tumor immunity. or to delay its progression.

본 발명의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법은 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능을 자극하는데 사용하기 위한 것이다.In an embodiment of the present invention, combination therapy of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein with an antibody that binds to human PD-L1 is administered in combination with an immune response or function, such as T cell activation. It is intended to be used to stimulate

본 발명은 the present invention

i) 종양에서 종양 성장의 억제; 및/또는i) inhibition of tumor growth in a tumor; and/or

ii) 종양이 있는 피실험자의 중간 및/또는 전체 생존의 증대ii) an increase in median and/or overall survival of subjects with tumors

에 사용하기 위한 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함하고, 여기에서 상기 면역사이토카인은 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여되며; 여기에서A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine for use in, wherein the immunocytokine is administered in combination with an antibody that binds to human PD-L1 as described herein; From here

PD-1은 면역세포, 특히 T 세포상에, 종양 세포 환경에 제시되고, 상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 a) 서열번호 5의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 6의 경쇄 가변 도메인 VL, 및 서열번호 2의 폴리펩타이드 서열, 또는 b) 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 c) 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 d) 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 a) 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL, 또는 b) 서열번호 19의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 20의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.PD-1 is presented in the tumor cell environment, on immune cells, particularly T cells, and the PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine used in the combination therapy is a) heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO:5 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 6, and the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, or b) the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or c) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and sequence characterized in that it comprises the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 9, or d) the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy comprises a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16, or b) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 It is characterized in that it comprises a light chain variable domain VL of

본 발명은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 면역사이토카인은 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여되고, 여기에서 상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.The present invention may include a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine, wherein the immunocytokine is administered in combination with an antibody that binds to human PD-L1 as described herein, wherein The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine used in the combination therapy is characterized in that it comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; The antibody binding to human PD-L1 used in the combination therapy is characterized in that it comprises a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16.

본 발명은 바람직하게는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함하며, 여기에서 상기 면역사이토카인은 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여되고, 여기에서 상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 아테졸리주맙이다.The present invention preferably comprises a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine, wherein said immunocytokine is administered in combination with an antibody that binds to human PD-L1, wherein said immunocytokine is used in said combination therapy. wherein the PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is atezolizumab.

면역사이토카인의 항체 성분 및 항체는 인간 IgG1 하위부류 또는 인간 IgG4 하위부류의 것일 수 있다. 상기 항체는 감소되거나 최소의 효과기 기능을 가질 수 있다. 상기 최소의 효과기 기능은 무효과기(effectorless) Fc 돌연변이로부터 생성될 수 있다. 상기 무효과기 Fc 돌연변이는 L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A 또는 D265A/N297A일 수 있다.The antibody component and antibody of the immunocytokine may be of the human IgG1 subclass or the human IgG4 subclass. The antibody may have reduced or minimal effector function. Said minimal effector function may result from effectorless Fc mutations. The null and void Fc mutation may be L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A or D265A/N297A.

본 발명의 추가의 태양에서, PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 환자에게 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여하며, 여기에서 상기 환자는 면역요법으로 치료되거나 사전-치료되었다. 상기 면역요법은 입양세포 전달, 단클론 항체의 투여, 사이토카인의 투여, 암 백신의 투여, T 세포 관여 요법 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 입양세포 전달은 키메라 항원 수용체 발현 T 세포(CAR T 세포), T 세포 수용체(TCR) 변형된 T 세포, 종양-침윤성 림프구(TIL), 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 자연살해 세포, T 세포 수용체(TCR) 형질도입된 세포, 수지상 세포 또는 이들의 임의의 조합을 투여함을 포함할 수 있다.In a further aspect of the invention, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is administered to a patient in combination with an antibody that binds to human PD-L1 as described herein, wherein the patient is immunotherapy treated with or pre-treated. The immunotherapy may include adoptive cell transfer, administration of monoclonal antibodies, administration of cytokines, administration of cancer vaccines, T cell-engaged therapy, or any combination thereof. The adoptive cell transfer is a chimeric antigen receptor expressing T cell (CAR T cell), a T cell receptor (TCR) modified T cell, a tumor-infiltrating lymphocyte (TIL), a chimeric antigen receptor (CAR)-modified natural killer cell, T and administering the cell receptor (TCR) transduced cells, dendritic cells, or any combination thereof.

본 발명은 또한The present invention also

A) i) 종양 성장의 억제;A) i) inhibition of tumor growth;

방법(여기에서 PD-1은 면역세포, 특히 T 세포상에 제시되고, PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여된다), 또는a method, wherein the PD-1 is presented on an immune cell, particularly a T cell, and the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is administered with an antibody that binds to human PD-L1, or

B) 종양을 갖는 환자의 치료 방법(여기에서 PD-1은 종양 세포 환경에서 발현되고, PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여된다)B) A method of treating a patient with a tumor, wherein PD-1 is expressed in the tumor cell environment and the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is administered with an antibody that binds to human PD-L1

을 추가로 포함하며, 여기에서 상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 a) 서열번호 5의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 6의 경쇄 가변 도메인 VL, 및 서열번호 2의 폴리펩타이드 서열, 또는 b) 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 c) 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 d) 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in said combination therapy comprises: a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 5 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 6; the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, or b) the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or c) the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, or d) SEQ ID NO: 12, characterized in that it comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14;

상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 a) 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL, 또는 b) 서열번호 19의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 20의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy comprises a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16, or b) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 It is characterized in that it comprises a light chain variable domain VL of

본 명세서에 기재된 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 항체의 병용 요법은 종양 세포상에 또는 종양 세포 환경에 제시된 항원을 표적화하는 치료법이 필요한 환자에게 이득을 나타낸다. 상기 본 명세서에 기재된 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 항체의 병용 요법은 PD-1-표적화 요법이 필요한 환자에게 이득을 나타낸다. 본 발명에 따른 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 본 명세서에 기재된 항-PD-L1 항체와 함께 표적-발현 종양이 있는 피실험자의 중간 및/또는 전체 생존의 증대에 효능을 나타내며 그 중에서도 암 및 전이의 치료에 특히 유용하다. 본 발명에 따른 상기 특이적인 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 종양에 대한 종양 성장 억제 활성에서 효능을 나타내며, 여기에서 PD-1은 종양 세포 환경에서 발현되고 그 중에서도 본 명세서에 기재된 특이적인 항-PD-L1 항체와 함께 암 및 전이의 치료에 특히 유용하다. 본 발명에 따른, 인간 PD-L1에 결합하는 특이적인 항체, 예를 들어 아테졸리주맙은 종양이 있는 피실험자의 중간 및/또는 전체 생존의 증대에 효능을 나타내며, 여기에서 PD-1은 종양 세포 환경에서 발현되고, 그 중에서도 본 명세서에 기재된 특이적인 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 함께 암 및 전이의 치료에 특히 유용하다.Combination therapy of the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines and antibodies described herein is of benefit to patients in need of therapies that target antigens presented on or in the tumor cell environment. Combination therapy of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine and an antibody described herein above shows benefit in patients in need of PD-1-targeted therapy. The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine according to the present invention, together with the anti-PD-L1 antibody described herein, is efficacious in enhancing the median and/or overall survival of subjects with target-expressing tumors. Among them, it is particularly useful for the treatment of cancer and metastasis. The specific PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine according to the present invention exhibits efficacy in tumor growth inhibitory activity against tumors, wherein PD-1 is expressed in the tumor cell environment, inter alia, as described herein. It is particularly useful in the treatment of cancer and metastasis in combination with the specific anti-PD-L1 antibodies described. According to the present invention, a specific antibody that binds to human PD-L1, for example atezolizumab, is efficacious in enhancing the median and/or overall survival of subjects with a tumor, wherein PD-1 is a tumor cell milieu It is particularly useful in the treatment of cancer and metastasis in combination with the specific PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines described herein, inter alia.

본 발명의 실시태양에서, 전이의 예방 또는 치료에서 병용 요법으로서 사용하기 위한, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극에서 병용 요법으로서 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 제공하며, 여기에서 상기 환자는 면역요법으로 치료되거나 사전-치료되었다. 상기 면역요법은 입양세포 전달, 단클론 항체의 투여, 사이토카인의 투여, 암 백신의 투여, T 세포 관여 요법 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 입양세포 전달은 키메라 항원 수용체 발현 T 세포(CAR T 세포), T 세포 수용체(TCR) 변형된 T 세포, 종양-침윤성 림프구(TIL), 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 자연살해 세포, T 세포 수용체(TCR) 형질도입된 세포, 수지상 세포 또는 이들의 임의의 조합을 투여함을 포함할 수 있다.In an embodiment of the present invention, human PD-L1 as described herein for use as a combination therapy in the prevention or treatment of metastases, or for use as a combination therapy in stimulation of an immune response or function, such as T cell activity. Provided is a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to, wherein the patient has been treated with or pre-treated with immunotherapy. The immunotherapy may include adoptive cell transfer, administration of monoclonal antibodies, administration of cytokines, administration of cancer vaccines, T cell-engaged therapy, or any combination thereof. The adoptive cell transfer is a chimeric antigen receptor expressing T cell (CAR T cell), a T cell receptor (TCR) modified T cell, a tumor-infiltrating lymphocyte (TIL), a chimeric antigen receptor (CAR)-modified natural killer cell, T and administering the cell receptor (TCR) transduced cells, dendritic cells, or any combination thereof.

도 1은 단일제로서 및 병용 설정에서 muPD1-IL2v 및 muPD-L1 Mab에 의한 효능 실험의 결과를 나타낸다. MC38 결장직장 암종 세포주를 블랙 6 마우스에게 피하 주사하여 피하 모델에서의 종양 성장 억제를 연구하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 치료법은 종양이 150 ㎣에 도달했을 때 시작하였다. 마우스당 주사된 항체의 양은 1차 투여에 대해서 muPD1-IL2v qw의 경우 0.5 ㎎/㎏ 및 muPD-L1의 경우 10 ㎎/㎏이고, 이어서 그 후에 5 ㎎/㎏ 2qw이었다. 상기 처리를 2주 지속하였다. 병용 군에서 항체를 동반 투여하였다. muPD-IL2v + muPD-L1 Mab 병용은 비히클, muPD1-IL2v 및 muPD-L1 Mab 단일제 군에 비해 종양 성장 억제의 면에서 우수한 효능을 매개하였다.
도 2A 내지 2C는 RipTag5 마우스의 비장에서 TAG 항원-특이성 CD8+ T 세포의 확대를 생성시키고 상기 마우스의 종양에서 CD8+ T 세포 침윤물을 증가시킴을 나타낸다. 종양 함유 RipTag5 마우스를 14일 동안 표시된 약물로 처리하였다. 도 2A는 유식 세포측정에 의해 측정된 비장 중 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 2B는 전체 CD8+ T 세포의 백분율로서 도시된 비장 중 TAG 항원-특이성 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 2C는 표시된 항체로 염색된 PanNET 종양의 IHC를 나타낸다(n=3-5; 스케일 바 = 200 ㎛).
도 3A 내지 3E는 PD1-IL2v와 항-PD-L1과의 병용시의 증가된 치료학적 효능을 나타낸다. 종양 함유 RipTag5 마우스에게 약물 처리를 가하고 종양 진행을 초음파 영상화에 의해 모니터하였다. 도 3A는 처리되지 않은 마우스(n=3)의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 3B는 PD1-IL2v로 처리된 RipTag5 마우스(n=6)의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 3C는 표시된 항체로 염색된 처리되지 않은 및 PD1-IL2v 재발된 종양의 IHC를 나타낸다(n=3; 스케일 바 = 50 ㎛). 도 3D는 항-PDL1로 처리된 마우스(n=4)의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 3E는 PD1-IL2v 및 항-PDL1로 처리된 RipTag5 마우스(n=7)의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 4A 및 4B는 항-PD-L1과의 병용 요법이 PD1-IL2v의 효능을 개선시킴을 나타낸다. 도 4A는 생존 그래프로서 나타낸 반응률을 나타낸다. PD-IL2v에서 2마리의 마우스 및 PD1-IL2v + 항-PD-L1 처리 군에서 한 마리의 마우스는 완전한 반응으로 인해 중증 고혈당증을 나타내었고 안락사시켜야 했다. 이들 마우스는 그래프에서 여전히 완전한 반응자로서 간주되었다. 도 4B는 0 및 2주의 PD1-IL2v 및 PD1-IL2v + 항-PD-L1 처리시의 종양의 초음파 영상을 나타낸다. 통계학적 분석: 로그-순위 만텔-콕스 검정, *p<0.02. 마우스의 수: 항-PD-L1 n=4, PD1-IL2v n=10, PD1-IL2v + 항-PD-L1 n=7.1 shows the results of efficacy experiments with muPD1-IL2v and muPD-L1 Mab as single agents and in a combination setting. The MC38 colorectal carcinoma cell line was injected subcutaneously into Black 6 mice to study tumor growth inhibition in a subcutaneous model. Tumor size was measured using calipers. Treatment was started when the tumor reached 150 mm 3 . The amount of antibody injected per mouse was 0.5 mg/kg for muPD1-IL2v qw and 10 mg/kg for muPD-L1 followed by 5 mg/kg 2qw for the first dose. The treatment lasted 2 weeks. Antibodies were concomitantly administered in the combination group. The muPD-IL2v + muPD-L1 Mab combination mediated superior efficacy in terms of tumor growth inhibition compared to the vehicle, muPD1-IL2v and muPD-L1 Mab single agent groups.
2A-2C show that RipTag5 mice generate expansion of TAG antigen-specific CD8+ T cells in the spleen and increase CD8+ T cell infiltrates in tumors of these mice. Tumor bearing RipTag5 mice were treated with the indicated drugs for 14 days. 2A shows the frequency of CD8+ T cells in the spleen as measured by flow cytometry. 2B shows the frequency of TAG antigen-specific CD8+ T cells in the spleen, plotted as a percentage of total CD8+ T cells. Figure 2C shows the IHC of PanNET tumors stained with the indicated antibodies (n=3-5; scale bar=200 μm).
3A-3E show the increased therapeutic efficacy of PD1-IL2v in combination with anti-PD-L1. Tumor bearing RipTag5 mice were treated with drugs and tumor progression was monitored by ultrasound imaging. 3A shows the tumor growth curves of untreated mice (n=3). 3B shows tumor growth curves of RipTag5 mice (n=6) treated with PD1-IL2v. Figure 3C shows the IHC of untreated and PD1-IL2v relapsed tumors stained with the indicated antibodies (n=3; scale bar = 50 μm). 3D shows tumor growth curves of mice (n=4) treated with anti-PDL1. 3E shows tumor growth curves of RipTag5 mice (n=7) treated with PD1-IL2v and anti-PDL1.
4A and 4B show that combination therapy with anti-PD-L1 improves the efficacy of PD1-IL2v. Figure 4A shows the response rate presented as a survival graph. Two mice in PD-IL2v and one mouse in the PD1-IL2v + anti-PD-L1 treated group developed severe hyperglycemia due to a complete response and had to be euthanized. These mice were still considered complete responders in the graph. Figure 4B shows ultrasound images of tumors at 0 and 2 weeks of PD1-IL2v and PD1-IL2v + anti-PD-L1 treatment. Statistical analysis: log-rank Mantel-Cox test, *p<0.02. Number of mice: anti-PD-L1 n=4, PD1-IL2v n=10, PD1-IL2v+anti-PD-L1 n=7.

IL-2 경로IL-2 pathway

시험관내 및 생체내 모두에서 림프구 및 NK 세포 집단을 확대시키고 활성화시키는 IL-2의 능력은 IL-2의 항-종양 효과를 설명한다. 그러나, 과도한 면역 반응 및 잠재적인 자가면역성을 방지하기 위한 조절 기전으로서, IL-2는 활성화-유도된 세포사(AICD)를 이끌고 활성화된 T 세포를 Fas-매개된 세포사멸에 민감하게 한다.The ability of IL-2 to expand and activate lymphocyte and NK cell populations both in vitro and in vivo explains the anti-tumor effect of IL-2. However, as a regulatory mechanism to prevent excessive immune response and potential autoimmunity, IL-2 leads to activation-induced cell death (AICD) and sensitizes activated T cells to Fas-mediated apoptosis.

더욱이, IL-2는 말초 CD4⁺ CD25⁺ T_reg 세포의 유지 및 확대에 관련된다(문헌[Fontenot JD, Rasmussen JP, Gavin MA, et al. A function for interleukin 2 in Foxp3 expressing regulatory T cells. Nat Immunol. 2005; 6:1142-1151]; 문헌[D'Cruz LM, Klein L. Development and function of agonist-induced CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the absence of interleukin 2 signaling. Nat Immunol. 2005; 6:1152 1159]; 문헌[Maloy KJ, Powrie F. Fueling regulation: IL-2 keeps CD4+ T_reg cells fit. Nat Immunol. 2005; 6:1071-1072]). 상기 세포는 세포-세포 접촉을 통해서 또는 면역억제성 사이토카인, 예를 들어 IL-10 또는 형질전환 성장 인자(TGF)-β의 방출을 통해서 효과기 T 세포가 자기 또는 표적을 파괴하는 것을 억제한다. T_reg 세포의 고갈은 IL-2-유도된 항-종양 면역성을 증대시키는 것으로 입증되었다(문헌[Imai H, Saio M, Nonaka K, et al. Depletion of CD4+CD25+ regulatory T cells enhances interleukin-2-induced antitumor immunity in a mouse model of colon adenocarcinoma. Cancer Sci. 2007; 98:416-423]).Moreover, IL-2 is implicated in the maintenance and expansion of peripheral CD4 ⁺ CD25 ⁺ T _reg cells (Fontenot JD, Rasmussen JP, Gavin MA, et al. A function for interleukin 2 in Foxp3 expressing regulatory T cells. Nat Immunol 2005; 6:1142-1151; D'Cruz LM, Klein L. Development and function of agonist-induced CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the absence of interleukin 2 signaling. Nat Immunol. 2005; ]; Maloy KJ, Powrie F. Fueling regulation: IL-2 keeps CD4+ T _reg cells fit. Nat Immunol. 2005; 6:1071-1072). The cell inhibits effector T cells from destroying themselves or their target either through cell-cell contact or through the release of immunosuppressive cytokines such as IL-10 or transforming growth factor (TGF)-β. Depletion of T _reg cells has been demonstrated to enhance IL-2-induced anti-tumor immunity (Imai H, Saio M, Nonaka K, et al. Depletion of CD4+CD25+ regulatory T cells enhances interleukin-2- induced antitumor immunity in a mouse model of colon adenocarcinoma. Cancer Sci. 2007; 98:416-423]).

IL-2는 또한 CD8+ T 세포의 1차 및 2차 확대 동안 기억 CD8+ T 세포 분화에 중요한 역할을 한다. IL-2는 1차 항원 공격에 따른 효과기 기능의 최적의 확대 및 생성을 담당하는 것으로 보인다. 대부분의 항원-특이성 CD8+ T 세포가 세포사멸에 의해 사라지는 면역 반응의 수축 단계 동안, IL-2 신호는 CD8+ T 세포를 세포사로부터 구제하고 기억 CD8+ T 세포의 지속적인 증가를 제공할 수 있다. 기억 단계에서, CD8+ T 세포 빈도를 외인성 IL-2의 투여에 의해 증대시킬 수 있다. 더욱이, 초기 초회항원자극 동안 IL-2 신호를 수용한 CD8+ T 세포만이 재개된 항원 공격에 따른 효율적인 2차 확대를 매개할 수 있다. 따라서, 상이한 면역 반응 단계 동안 IL-2 신호는 CD8+ T 세포 기능의 최적화에 핵심이며, 이에 의해 상기 T 세포의 1차 및 2차 반응 모두에 영향을 미친다(문헌[Adv Exp Med Biol. 2010;684:28-41. The role of interleukin-2 in memory CD8 cell differentiation. Boyman O1, Cho JH, Sprent J]).IL-2 also plays an important role in memory CD8+ T cell differentiation during primary and secondary expansion of CD8+ T cells. IL-2 appears to be responsible for optimal amplification and generation of effector functions following primary challenge. During the contractile phase of the immune response, in which most antigen-specific CD8+ T cells disappear by apoptosis, IL-2 signaling can rescue CD8+ T cells from apoptosis and provide a sustained increase in memory CD8+ T cells. In the memory phase, CD8+ T cell frequency can be enhanced by administration of exogenous IL-2. Moreover, only CD8+ T cells that received IL-2 signals during initial priming are able to mediate efficient secondary expansion following resumed challenge. Thus, IL-2 signaling during the different stages of the immune response is key to the optimization of CD8+ T cell function, thereby influencing both the primary and secondary responses of these T cells (Adv Exp Med Biol. 2010;684). :28-41. The role of interleukin-2 in memory CD8 cell differentiation. Boyman O1, Cho JH, Sprent J] ) .

항-종양 효능에 기반하여, 고-용량 IL-2(알데스류킨, 프로류킨(등록상표)으로서 시중에 나와있다) 치료는 미국에서 전이성 신세포 암종(RCC) 및 악성 흑색종 환자, 및 유럽에서 전이성 RCC 환자에 대해 사용이 승인되었다. 그러나, IL-2의 작용 방식의 결과로서, IL-2의 전신 및 표적화되지 않은 적용은 T_reg 세포 및 AICD의 유도를 통해 항-종양 면역성을 상당히 손상시킬 수 있다. 전신 IL-2 치료의 추가적인 우려는 정맥내 투여시의 심한 부작용과 관련되며, 상기 부작용은 중증 심혈관, 폐 부종, 간, 위장(GI), 신경학적, 및 혈액학적 사건들을 포함한다(Proleukin (aldesleukin) Summary of Product Characteristics [SmPC]: http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/19322/SPC/ (accessed May 27, 2013)). 저-용량 IL-2 섭생이 환자에서 시험되었지만, 최적이 아닌 치료학적 결과의 대가가 있었다. 종합해보면, IL-2를 사용하는 치료학적 접근법은 그의 적용과 관련된 골칫거리가 극복될 수 있다면 암 치료법에 유용할 수 있다. Based on anti-tumor efficacy, high-dose IL-2 (Aldesleukin, marketed as Proleukin) treatment is indicated for patients with metastatic renal cell carcinoma (RCC) and malignant melanoma in the United States, and Europe. approved for use in patients with metastatic RCC. However, as a result of the mode of action of IL-2, systemic and untargeted application of IL-2 can significantly impair anti-tumor immunity through induction of T _reg cells and AICD. A further concern with systemic IL-2 therapy is the severe side effects of intravenous administration, which include severe cardiovascular, pulmonary edema, hepatic, gastrointestinal (GI), neurological, and hematological events (Proleukin (aldesleukin (aldesleukin) ) Summary of Product Characteristics [SmPC]: http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/19322/SPC/ (accessed May 27, 2013)). Low-dose IL-2 regimens have been tested in patients, but at the cost of suboptimal therapeutic outcomes. Taken together, therapeutic approaches using IL-2 may be useful for cancer therapy if the headaches associated with their application can be overcome.

PD-1-표적화된 항원 결합 부분 및 IL-2-기반 효과기 부분을 포함하는 면역접합체가 예를 들어 WO 2018/184964에 기재되어 있다.Immunoconjugates comprising a PD-1-targeted antigen binding moiety and an IL-2-based effector moiety are described, for example, in WO 2018/184964.

특히, 돌연변이 IL-2(예를 들어 IL-2 qm으로서 공지된 4중 돌연변이체)는 IL-2Rα 서브유닛(CD25)에의 결합을 제거함으로써 야생형 IL-2(예를 들어 알데스류킨) 또는 1세대 IL-2-기반 면역사이토카인의 한계를 극복하도록 설계되었다. 상기 돌연변이 IL-2 qm은 다양한 종양-표적화 항체, 예를 들어 WO 2012/146628 및 WO 2012/107417에 기재된 CEA에 대한 인간화된 항체 및 FAP에 대한 항체에 커플링되었다. 또한, 상기 항체의 Fc 영역은 Fcγ 수용체 및 C1q 복합체에의 결합을 방지하도록 변형되었다. 생성되는 종양-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인(예를 들어 CEA-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 FAP-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인)은 비임상적인 시험관내 및 생체내 실험에서 종양 세포를 제거할 수 있는 것으로 입증되었다.In particular, mutant IL-2 (eg, a quadruple mutant known as IL-2 qm) can abrogate wild-type IL-2 (eg aldesleukin) or 1 by abrogating binding to the IL-2Ra subunit (CD25). Designed to overcome the limitations of generational IL-2-based immunocytokines. The mutant IL-2 qm has been coupled to various tumor-targeting antibodies, such as humanized antibodies to CEA and antibodies to FAP described in WO 2012/146628 and WO 2012/107417. In addition, the Fc region of the antibody was modified to prevent binding to the Fcγ receptor and Clq complex. The resulting tumor-targeted IL-2 variant immunocytokine (eg, CEA-targeted IL-2 variant immunocytokine and FAP-targeted IL-2 variant immunocytokine) is non-clinical in vitro and in vivo. It has been demonstrated in experiments that tumor cells can be eliminated.

따라서, 생성되는 면역사이토카인은 IL-2Rα 서브유닛(CD25)에의 결합을 제거함으로써 IL-2의 골칫거리를 다루는 표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인의 한 부류를 나타낸다:Thus, the resulting immunocytokines represent a class of targeted IL-2 mutant immunocytokines that address the headache of IL-2 by abrogating its binding to the IL-2Ra subunit (CD25):

야생형 IL-2 및 IL-2 변체의 성질Properties of wild-type IL-2 and IL-2 variants

"IL-2" 또는 "인간 IL-2"란 용어는 야생형, 및 예를 들어 다이설파이드-가교된 IL-2 이량체의 형성을 피하기 위해 C125A 치환을 갖는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 야생형 IL-2의 아미노산 서열 중에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변체를 포함한 인간 IL-2 단백질을 지칭한다. IL-2를 또한 N- 및/또는 O-글리코실화 부위를 제거하도록 돌연변이시킬 수도 있다.The term "IL-2" or "human IL-2" refers to wild-type and wild-type IL- as shown in SEQ ID NO: 2 with a C125A substitution to avoid the formation of, for example, disulfide-bridged IL-2 dimers. Refers to a human IL-2 protein comprising a variant comprising one or more mutations in the amino acid sequence of 2. IL-2 may also be mutated to remove N- and/or O-glycosylation sites.

PD-1/PD-L1/PD-L2 경로PD-1/PD-L1/PD-L2 pathway

T 세포 활성화를 조절하는 중요한 음성 공-자극 신호는 세포예정사-1 수용체(PD-1)(CD279), 및 그의 리간드 결합 상대 PD-L1(B7-H1, CD274; 서열번호 88) 및 PD-L2(B7-DC, CD273)에 의해 제공된다. PD-1의 음성 조절 역할은 자가면역성의 경향이 있는 PD-1 녹아웃(Pdcd1-/-)에 의해 밝혀졌다. 문헌[Nishimura et al., Immunity 11: 141-51 (1999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001)]. PD-1은 CD28 및 CTLA-4와 관련되지만, 이종이량체화를 허용하는 막 근접 시스테인은 없다. PD-1의 세포질 도메인은 면역수용체 타이로신-기반 억제 동기(ITIM, V/IxYxxL/V)를 함유한다. PD-1은 오직 PD-L1 및 PD-L2에만 결합한다. 문헌[Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000)]; 문헌[Dong et al., Nature Med. 5: 1365-1369 (1999)]; 문헌[Latchman et al., Nature Immunol. 2: 261-268 (2001)]; 문헌[Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)].Important negative co-stimulatory signals regulating T cell activation are the programmed apoptosis-1 receptor (PD-1) (CD279), and its ligand binding partners PD-L1 (B7-H1, CD274; SEQ ID NO: 88) and PD- provided by L2 (B7-DC, CD273). A negative regulatory role of PD-1 was revealed by the autoimmune-prone PD-1 knockout (Pdcd1-/-). Nishimura et al., Immunity 11: 141-51 (1999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001)]. PD-1 is associated with CD28 and CTLA-4, but lacks a membrane proximal cysteine that allows heterodimerization. The cytoplasmic domain of PD-1 contains an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motive (ITIM, V/IxYxxL/V). PD-1 binds only to PD-L1 and PD-L2. See Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000)]; Dong et al., Nature Med. 5: 1365-1369 (1999)]; Latchman et al., Nature Immunol. 2: 261-268 (2001)]; Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)].

PD-1은 T 세포, B 세포, 자연살해 T 세포, 활성화된 단핵세포 및 수지상 세포(DC)상에서 발현될 수 있다. PD-1은 활성화된 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포, B 세포 및 골수성 세포에 의해서 발현되지만, 자극되지 않은 상기 세포들에 의해서는 발현되지 않는다. 이는 CD28 및 CTLA-4의 보다 제한된 발현과 대조적이다. 문헌[Nishimura et al., Int. Immunol. 8: 773-80 (1996)]; 문헌[Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)]. (i) 엑손 2, (ii) 엑손 3, (iii) 엑손 2 및 3 또는 (iv) 엑손 2 내지 4가 없는 전사물을 포함하여, 활성화된 인간 T 세포로부터 클로닝된 PD-1의 적어도 4개의 변체가 존재한다. 문헌[Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)]. PD-1 Δex3을 제외하고, 모든 변체가 휴지 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 완전길이 PD-1과 유사한 수준으로 발현된다. 모든 변체의 발현은 항-CD3 및 항-CD28에 의한 인간 T 세포의 활성화시에 현저하게 유도된다. 상기 PD-1 Δex3 변체는 막관통 도메인이 없으며, 자가면역성에 중요한 역할을 하는 용해성 CTLA-4와 유사하다. 문헌[Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003)]. 상기 변체는 류머티스성 관절염이 있는 환자의 활액 및 혈청 중에 풍부하다. 문헌[Wan et al., J. Immunol. 177: 8844-50 (2006)].PD-1 can be expressed on T cells, B cells, natural killer T cells, activated monocytes and dendritic cells (DCs). PD-1 is expressed by activated human CD4+ and CD8+ T cells, B cells and myeloid cells, but not by these unstimulated cells. This is in contrast to the more restricted expression of CD28 and CTLA-4. Nishimura et al., Int. Immunol. 8: 773-80 (1996)]; Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)]. (i) exon 2, (ii) exon 3, (iii) exon 2 and 3 or (iv) exons 2-4 at least four of cloned PD-1 from activated human T cells, including transcripts Variants exist. See Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)]. With the exception of PD-1 Δex3, all variants are expressed at levels similar to full-length PD-1 in resting peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Expression of all variants is markedly induced upon activation of human T cells by anti-CD3 and anti-CD28. The PD-1 Δex3 variant lacks a transmembrane domain and is similar to soluble CTLA-4, which plays an important role in autoimmunity. Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003). This variant is abundant in the synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis. Wan et al., J. Immunol. 177: 8844-50 (2006)].

상기 2개의 PD-1 리간드는 그의 발현 패턴이 상이하다. PD-L1은 마우스 T 및 B 세포, CD, 대식세포, 중간엽 줄기세포 및 골수-유래된 비만세포상에서 구성적으로 발현된다. 문헌[Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)]. PD-L1은 광범위한 비조혈성 세포(예를 들어 각막, 폐, 혈관 상피, 비실질성 간세포, 중간엽 줄기세포, 췌장섬, 태반 합포체영양막, 각질세포 등)상에서 발현되며(문헌[Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)]), 활성화 후에 다수의 세포 유형상에서 상향 조절된다. I형 및 II형 인터페론 IFN은 모두 PD-L1을 상향조절한다. 문헌[Eppihimer et al., Microcirculation 9: 133-45 (2002)]; 문헌[Schreiner et al., J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004)]. 세포주에서 PD-L1 발현은 MyD88, TRAF6 및 MEK가 억제될 때 감소된다. 문헌[Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)]. JAK2가 또한 PD-L1 유도에 연루되었다. 문헌[Lee et al., FEBS Lett. 580: 755-62 (2006)]; 문헌[Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)]. 포스파타제, 및 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K) 및 Akt 신호전달을 변형시키는 세포성 포스파타제인 텐신 동족체(PTEN)의 상실 또는 억제는 암에서 전사-후 PD-L1 발현을 증가시켰다. 문헌[Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-88 (2007)].The two PD-1 ligands have different expression patterns. PD-L1 is constitutively expressed on mouse T and B cells, CDs, macrophages, mesenchymal stem cells and bone marrow-derived mast cells. Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)]. PD-L1 is expressed on a wide range of non-hematopoietic cells (eg cornea, lung, vascular epithelium, nonparenchymal stem cells, mesenchymal stem cells, pancreatic islets, placental syncytial trophoblast, keratinocytes, etc.) (Keir et al. ., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)]), which is upregulated on many cell types after activation. Both type I and type II interferon IFNs upregulate PD-L1. Eppihimer et al., Microcirculation 9: 133-45 (2002); Schreiner et al., J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004)]. PD-L1 expression in cell lines is reduced when MyD88, TRAF6 and MEK are repressed. Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007). JAK2 has also been implicated in PD-L1 induction. Lee et al., FEBS Lett. 580: 755-62 (2006)]; Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007). Loss or inhibition of phosphatase and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and tensin homolog (PTEN), a cellular phosphatase that modifies Akt signaling, increased post-transcriptional PD-L1 expression in cancer. Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-88 (2007)].

PD-L2 발현은 PD-L1보다 더 제한된다. PD-L2는 DC, 대식세포, 및 골수-유래된 비만세포상에서 유도적으로 발현된다. PD-L2는 또한 휴지 복막 B1 세포의 약 1/2 내지 2/3상에서 발현되지만, 통상적인 B2 B 세포상에서는 발현되지 않는다. 문헌[Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)]. PD-L2+ B1 세포는 포스파티딜콜린과 결합하며 세균 항원에 대한 선천적인 면역반응에 중요할 수 있다. IFN-감마에 의한 PD-L2의 유도는 NF-κB에 부분적으로 의존한다. 문헌[Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003)]. PD-L2는 또한 GM-CF, IL-4 및 IFN-감마에 의해 단핵세포 및 대식세포상에서 유도될 수 있다. 문헌[Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)]; 문헌[Loke et al., PNAS 100:5336-41 (2003)].PD-L2 expression is more restricted than PD-L1. PD-L2 is inducibly expressed on DCs, macrophages, and bone marrow-derived mast cells. PD-L2 is also expressed on about 1/2 to 2/3 of resting peritoneal B1 cells, but not on conventional B2 B cells. See Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)]. PD-L2+ B1 cells bind phosphatidylcholine and may be important for the innate immune response to bacterial antigens. Induction of PD-L2 by IFN-gamma depends in part on NF-κB. Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003)]. PD-L2 can also be induced on monocytes and macrophages by GM-CF, IL-4 and IFN-gamma. Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)]; Loke et al., PNAS 100:5336-41 (2003).

PD-1 신호전달은 전형적으로 세포 증식에 대해서보다 사이토카인 생성에 대해서 더 큰 효과를 가지며, IFN-감마, TNF-알파 및 IL-2 생성에 현저한 효과를 갖는다. PD-1 매개된 억제성 신호전달은 또한 TCR 신호전달의 강도에 따라 변하며, 이때 낮은 수준의 TCR 자극에서 더 큰 억제가 전달된다. 이러한 감소는 CD28을 통한 공자극(문헌[Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)]) 또는 IL-2의 존재(문헌[Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)])에 의해서 극복될 수 있다.PD-1 signaling typically has a greater effect on cytokine production than on cell proliferation, and a marked effect on IFN-gamma, TNF-alpha and IL-2 production. PD-1 mediated inhibitory signaling also varies with the strength of TCR signaling, with greater inhibition being delivered at low levels of TCR stimulation. This reduction was reduced by costimulation via CD28 (Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)) or in the presence of IL-2 (Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)]).

PD-L1 및 PD-L2를 통한 신호전달이 양방향성일 수 있다는 증거가 쌓이고 있다. 즉, TCR 또는 BCR 신호전달의 변형 외에, 신호전달은 또한 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 세포로 다시 전달될 수 있다. 발덴스트롬 마크로글로불린혈증이 있는 환자로부터 단리된 천연 인간 항-PD-L2 항체에 의한 수지상 세포의 처리는 MHC II 또는 B7 공자극 분자를 상향조절하지 않는 것으로 밝혀졌지만, 상기와 같은 세포는 보다 많은 양의 염증전 사이토카인, 특히 TNF-알파 및 IL-6을 생성시켰으며, T 세포 증식을 자극하였다. 문헌[Nguyen et al., J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002)]. 상기 항체에 의한 마우스의 처리는 또한 (1) 이식된 b16 흑색종에 대한 내성을 증대시켰으며 종양-특이성 CTL을 신속하게 유도하였고(문헌[Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003)]; 문헌[Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004)]; 문헌[Heckman et al., Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007)]); (2) 알러지성 천식의 마우스 모델에서 기도 염증 질병의 발생을 차단하였다(문헌[Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004)]; 문헌[Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005)]).Evidence is accumulating that signaling through PD-L1 and PD-L2 may be bidirectional. That is, in addition to modification of TCR or BCR signaling, signaling can also be transduced back to cells expressing PD-L1 and PD-L2. Treatment of dendritic cells with native human anti-PD-L2 antibodies isolated from patients with Waldenstrom's macroglobulinemia was found to not upregulate MHC II or B7 costimulatory molecules, however, such cells were found to be of proinflammatory cytokines, particularly TNF-alpha and IL-6, and stimulated T cell proliferation. See Nguyen et al., J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002)]. Treatment of mice with this antibody also (1) enhanced resistance to transplanted b16 melanoma and rapidly induced tumor-specific CTLs (Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38). (2003); Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004); (2) blocked the development of airway inflammatory disease in a mouse model of allergic asthma (Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005)]).

수지상 세포("DC") 내로의 역 신호전달의 추가적인 증거는 용해성 PD-1(Ig 불변 영역에 융합된 PD-1 EC 도메인 - "s-PD-1")과 함께 배양된 골수 유래된 DC의 연구로부터 생성된다. 문헌[Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006)]. 상기 sPD-1은 항-PD-1의 투여를 통해 가역적인 방식으로, DC 활성화를 억제하고 IL-10 생성을 증가시켰다.Additional evidence of reverse signaling into dendritic cells (“DCs”) is that of bone marrow-derived DCs cultured with soluble PD-1 (PD-1 EC domain fused to an Ig constant region—“s-PD-1”). generated from research. Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006)]. The sPD-1 inhibited DC activation and increased IL-10 production in a reversible manner through administration of anti-PD-1.

추가로, 다수의 연구가 PD-1과 독립적인 PD-L1 또는 PD-L2에 대한 수용체를 나타내고 있다. B7.1은 이미 PD-L1에 대한 결합 상대로서 식별되었다. 문헌[Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007)]. 화학적 가교결합 연구는 PD-L1 및 B7.1이 그들의 IgV-유사 도메인을 통해 상호작용할 수 있음을 제시한다. B7.1:PD-L1 상호작용은 T 세포내로의 억제 신호를 유도할 수 있다. B7.1에 의한 CD4+ T 세포상의 PD-L1의 결찰 또는 PD-L1에 의한 CD4+ T 세포상의 B7.1의 결찰은 억제 신호를 전달한다. CD28 및 CTLA-4가 없는 T 세포는 항-CD3 + B7.1 코팅된 비드에 의해 자극시 감소된 증식 및 사이토카인 생성을 나타낸다. B7.1에 대한 모든 수용체(즉, CD28, CTLA-4 및 PD-L1)가 없는 T 세포에서, T 세포 증식 및 사이토카인 생성은 항-CD3 + B7.1 코팅된 비드에 의해 더 이상 억제되지 않았다. 이는 B7.1이 CD28 및 CTLA-4의 부재하에서 T 세포상의 PD-L1을 통해 특이적으로 작용함을 가리킨다. 유사하게, PD-1이 없는 T 세포는 항-CD3 + PD-L1 코팅된 비드의 존재하에서 자극시 감소된 증식 및 사이토카인 생성을 나타내었으며, 이는 T 세포상의 B7.1에 대한 PD-L1 결찰의 억제 효과를 입증한다. T 세포가 PD-L1에 대한 모든 공지된 수용체가 없는(즉 PD-1 및 B7.1이 없는) 경우, T 세포 증식은 항-CD3 + PD-L1 코팅된 비드에 의해 더 이상 손상되지 않았다. 따라서, PD-L1은 B7.1 또는 PD-1을 통해 T 세포에 대한 억제 효과를 발휘할 수 있다.Additionally, a number of studies have shown receptors for PD-L1 or PD-L2 independent of PD-1. B7.1 has already been identified as a binding partner for PD-L1. Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007). Chemical crosslinking studies suggest that PD-L1 and B7.1 can interact through their IgV-like domains. B7.1:PD-L1 interaction can induce inhibitory signals into T cells. Ligation of PD-L1 on CD4+ T cells by B7.1 or ligation of B7.1 on CD4+ T cells by PD-L1 transmits an inhibitory signal. T cells lacking CD28 and CTLA-4 show reduced proliferation and cytokine production upon stimulation with anti-CD3 + B7.1 coated beads. In T cells lacking all receptors for B7.1 (i.e., CD28, CTLA-4 and PD-L1), T cell proliferation and cytokine production were no longer inhibited by anti-CD3 + B7.1 coated beads. didn't This indicates that B7.1 acts specifically through PD-L1 on T cells in the absence of CD28 and CTLA-4. Similarly, T cells without PD-1 showed reduced proliferation and cytokine production upon stimulation in the presence of anti-CD3 + PD-L1 coated beads, indicating PD-L1 ligation to B7.1 on T cells. demonstrate the inhibitory effect of When T cells lack all known receptors for PD-L1 (ie, lack PD-1 and B7.1), T cell proliferation was no longer impaired by anti-CD3 + PD-L1 coated beads. Thus, PD-L1 can exert an inhibitory effect on T cells via B7.1 or PD-1.

B7.1과 PD-L1간의 직접적인 상호작용은 공자극에 대한 현재의 이해가 불완전함을 암시하며, T 세포상에서의 이들 분자의 발현에 대한 중요성을 보여준다. PD-L1-/- T 세포의 연구는 T 세포상의 PD-L1이 T 세포 사이토카인 생성을 하향조절할 수 있음을 가리킨다. 문헌[Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004)]. PD-L1 및 B7.1이 모두 T 세포, B 세포, DC 및 대식세포상에서 발현되기 때문에, 이들 세포 유형상에서의 B7.1과 PD-L1간의 지향성 상호작용의 가능성이 존재한다. 추가로, 비-조혈 세포상의 PD-L1은 T 세포상의 PD-1뿐만 아니라 B7.1과도 상호작용할 수 있으며, 이는 PD-L1이 이들의 조절에 관련되는지의 여부에 대한 의문을 제기한다. B7.1:PD-L1 상호작용의 억제 효과에 대한 한 가지 가능한 설명은 T 세포 PD-L1이 CD28과의 상호작용으로부터 APC B7.1을 가두거나 멀리 분리시킬 수 있다는 것이다.The direct interaction between B7.1 and PD-L1 suggests that the current understanding of costimulation is incomplete, demonstrating the importance of expression of these molecules on T cells. Studies of PD-L1-/- T cells indicate that PD-L1 on T cells may downregulate T cell cytokine production. Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004)]. Since both PD-L1 and B7.1 are expressed on T cells, B cells, DCs and macrophages, the possibility of a directional interaction between B7.1 and PD-L1 on these cell types exists. Additionally, PD-L1 on non-hematopoietic cells can interact with B7.1 as well as PD-1 on T cells, raising the question of whether PD-L1 is involved in their regulation. One possible explanation for the inhibitory effect of the B7.1:PD-L1 interaction is that T cell PD-L1 may trap or dissociate APC B7.1 from its interaction with CD28.

그 결과, PD-1, B7.1 또는 이 둘 모두와의 상호작용으로부터 PD-L1의 차단을 포함하여, PD-L1을 통한 신호전달의 길항작용(이에 의해 PD-L1이 T 세포 및 다른 항원 제시 세포로 음성 공-자극 신호를 보내는 것을 방지한다)은 감염(예를 들어 급성 및 만성) 및 종양 면역성에 반응하여 면역성을 증대시키는 듯하다. 또한, 본 발명의 항-PD-L1 항체를 PD-1:PD-L1 신호전달의 다른 성분들의 길항물질, 예를 들어 길항물질 항-PD-1 및 항-PD-L2 항체와 병용할 수 있다.As a result, antagonism of signaling through PD-L1, including blockade of PD-L1 from interaction with PD-1, B7.1, or both, thereby causing PD-L1 to interact with T cells and other antigens (prevents sending negative co-stimulatory signals to presenting cells) appears to enhance immunity in response to infection (eg acute and chronic) and tumor immunity. In addition, the anti-PD-L1 antibodies of the present invention may be used in combination with antagonists of other components of PD-1:PD-L1 signaling, such as antagonist anti-PD-1 and anti-PD-L2 antibodies. .

"인간 PD-L1"이란 용어는 인간 단백질 PD-L1(서열번호 4, 전형적으로 PD-1 신호전달)을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인간 PD-L1에 결합하는" 또는 "인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는" 또는 "인간 PD-L1에 결합하다" 또는 "항-PD-L1 항체"는 1.0 x 10^-8 mol/l 이하의 KD-값, 하나의 실시태양에서, 1.0 x 10^-9 mol/l 이하의 KD-값의 결합 친화성으로 인간 PD-L1 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 상기 결합 친화성은 표준 결합 분석, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기법(비아코어(BIAcore)(등록상표), GE-헬쓰케어 웁살라(GE-Healthcare Uppsala), 스웨덴 소재)으로 측정된다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "인간 PD-L1에 결합하는 항체"는 KD 1.0 x 10^-8 mol/l 이하(하나의 실시태양에서, 1.0 x 10^-8 mol/l 내지 1.0 x 10^-13 mol/l), 하나의 실시태양에서, KD 1.0 x 10^-9 mol/l 이하(하나의 실시태양에서, 1.0 x 10^-9 mol/l 내지 1.0 x 10^-13 mol/l)의 결합 친화성으로 인간 PD-L1 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.The term “human PD-L1” refers to the human protein PD-L1 (SEQ ID NO: 4, typically PD-1 signaling). As used herein, “binds to human PD-L1” or “binds specifically to human PD-L1” or “binds to human PD-L1” or “anti-PD-L1 antibody” means An antibody that specifically binds to human PD-L1 antigen with a binding affinity of a KD-value of 1.0 x 10 ^-8 mol/l or less, in one embodiment, a KD-value of 1.0 x 10 ^-9 mol/l or less refers to The binding affinity is determined by standard binding assays, such as surface plasmon resonance techniques (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden). Thus, "an antibody that binds to human PD-L1" as used herein refers to a KD of 1.0 x 10 ^-8 mol/l or less (in one embodiment, 1.0 x 10 ^-8 mol/l to 1.0 x 10 ^{- 13} mol/l), in one embodiment, a KD of 1.0 x 10 ^-9 mol/l or less (in one embodiment, 1.0 x 10 ^-9 mol/l to 1.0 x 10 ^-13 mol/l) Refers to an antibody that specifically binds to human PD-L1 antigen by chemotaxis.

특히, 본 발명자들은 PD-1-표적화된 돌연변이 IL-2가 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용될 때 생체내에서 우수한 치료학적 효과를 제공함을 발견하였다.In particular, the present inventors have found that PD-1-targeted mutant IL-2 provides superior therapeutic effects in vivo when combined with an antibody that binds to human PD-L1.

림프구 및 자연살해(NK) 세포를 확대시키고 활성화시키는 IL-2의 능력은 IL-2의 항-종양 활성의 기저를 이룬다. IL-2의 IL-2α 서브유닛(CD25)에의 결합을 제거하도록 설계된 IL-2 돌연변이체는 IL-2의 한계를 극복하며 종양-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인, 예를 들어 CEA-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 또는 FAP-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인의 부분으로서 종양 세포를 제거할 수 있는 것으로 입증되었다.The ability of IL-2 to expand and activate lymphocytes and natural killer (NK) cells underlies its anti-tumor activity. IL-2 mutants designed to abolish the binding of IL-2 to the IL-2α subunit (CD25) overcome the limitations of IL-2 and include tumor-targeted IL-2 mutant immunocytokines such as CEA-targeting It has been demonstrated that it can eliminate tumor cells as part of an IL-2 mutant immunocytokine or FAP-targeted IL-2 mutant immunocytokine.

면역사이토카인 및 항체Immune cytokines and antibodies

본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy described herein is

PD-1 발현 면역 세포, 특히 T 세포상에서 또는 종양 세포 환경에서 PD-1에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 및an antibody, or antigen-binding fragment thereof, that binds to PD-1 on PD-1 expressing immune cells, particularly T cells or in the context of a tumor cell, and

IL-2 돌연변이체, 특히 IL-2 수용체의 α-서브유닛에 대해 감소된 결합 친화성(야생형 IL-2, 예를 들어 서열번호 2로서 나타낸 인간 IL-2에 비해)을 갖는 인간 IL-2의 돌연변이체, 예를 들어IL-2 mutants, in particular human IL-2 with reduced binding affinity (compared to wild-type IL-2, eg human IL-2 shown as SEQ ID NO:2) for the α-subunit of the IL-2 receptor. mutants of, for example

i) 서열번호 2로서 나타낸 인간 IL-2의 42, 45 및 72번 잔기에 상응하는 위치 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 위치(들)에서의 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환(들), 예를 들어 3개의 위치에서의 3개의 치환, 예를 들어 특정한 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G; 또는i) 1, 2 or 3 amino acid substitution(s) at 1, 2 or 3 position(s) selected from the positions corresponding to residues 42, 45 and 72 of human IL-2 shown as SEQ ID NO:2, e.g. 3 substitutions at 3 positions, eg the specific amino acid substitutions F42A, Y45A and L72G; or

ii) i)에 제시된 바와 같은 특징 + 서열번호 2로서 나타낸 인간 IL-2의 3번 잔기에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환, 예를 들어 특정한 아미노산 치환 T3A; 또는ii) features as set forth in i) plus an amino acid substitution at the position corresponding to residue 3 of human IL-2 shown as SEQ ID NO: 2, eg the specific amino acid substitution T3A; or

iii) 서열번호 2로서 나타낸 인간 IL-2의 3, 42, 45 및 72번 잔기에 상응하는 위치에서의 4개의 아미노산 치환, 예를 들어 특정한 아미노산 치환 T3A, F42A, Y45A 및 L72Giii) 4 amino acid substitutions at positions corresponding to residues 3, 42, 45 and 72 of human IL-2 shown as SEQ ID NO: 2, for example the specific amino acid substitutions T3A, F42A, Y45A and L72G

를 포함하는 IL-2IL-2 comprising

를 포함한다.includes

면역세포, 특히 T 세포상에, 또는 종양 세포 환경에 제시된 PD-1에 결합하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 및 2개의 서브유닛으로 이루어지고 2개의 일치하지 않는 폴리펩타이드 쇄의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함하는 Fc 도메인, 및A heterodimer of two mismatched polypeptide chains consisting of a heavy and light chain variable domain and two subunits of an antibody that binds to PD-1 presented on immune cells, particularly T cells, or in the context of a tumor cell. an Fc domain comprising a modification that promotes oxidation, and

를 포함하는 IL-2IL-2 comprising

를 포함할 수 있다.may include.

상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 a) 서열번호 5의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 6의 경쇄 가변 도메인 VL, 및 서열번호 2의 폴리펩타이드 서열, 또는 b) 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 c) 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 d) 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy comprises: a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 5 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 6, and the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, or b) a polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or c) a polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, or d) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 polypeptide sequences.

일부 실시태양에서, 상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함한다.In some embodiments, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, and SEQ ID NO:9.

상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 그의 항원 결합 부분, Fc 도메인 및 효과기 부분의 성분 부분들과 함께 WO 2018/184964에 기재된 면역접합체의 예로서 기재된다. 예를 들어, 서열번호 7 및 8 및 9로서 나타낸 서열을 갖는 항-CEA 항체 CH1A1A 98/99 2F1 및 IL-2 4중 돌연변이체(qm)(서열번호 3) 기반의 특정한 면역사이토카인 'PD-1-표적화된 IgG-IL-2 qm 융합 단백질'이 예를 들어 2018/184964의 실시예 1 및 2에 기재되어 있다.Said PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is described as an example of an immunoconjugate described in WO 2018/184964 together with its antigen binding moiety, Fc domain and component parts of the effector moiety. For example, the anti-CEA antibody CH1A1A 98/99 2F1 and the specific immunocytokine 'PD- 1-targeted IgG-IL-2 qm fusion proteins' are described, for example, in Examples 1 and 2 of 2018/184964.

2018/184964에 기재된 특정한 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하기의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다:The specific PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine described in 2018/184964 is characterized in that it comprises the following polypeptide sequence as described herein:

WO 2012/146628에 기재된 바와 같이, IL-2 돌연변이체는 IL-2 수용체의 α-서브유닛에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. β- 및 γ-서브유닛(또한 각각 CD122 및 CD132로서 공지됨)과 함께, 상기 α-서브유닛(또한 CD25로서 공지됨)은 이종삼량체성 고 친화성 IL-2 수용체를 형성하는 반면, 단지 β- 및 γ-서브유닛으로만 이루어진 이량체성 수용체는 중간-친화성 IL-2 수용체라 지칭된다. WO 2012/146628에 기재된 바와 같이, 상기 IL-2 수용체의 α-서브유닛에 대해 감소된 결합을 갖는 IL-2 돌연변이 폴리펩타이드는 야생형 IL-2 폴리펩타이드에 비해, 조절성 T 세포에서 감소된 IL-2 신호전달 유도 능력을 가지며, T 세포에서 적은 활성화-유도된 세포사(AICD)를 유도하고, 생체내에서 감소된 독성 프로파일을 갖는다. 감소된 독성을 갖는 상기와 같은 IL-2 돌연변이체의 사용은 Fc 도메인의 존재로 인해 긴 혈청 반감기를 갖는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인에 특히 유리하다. 상기 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2에 비해, 상기 IL-2 수용체의 α-서브유닛(CD25)에 대한 상기 IL-2 돌연변이체의 친화성을 감소시키거나 없애지만 상기 중간-친화성 IL-2 수용체(IL-2 수용체의 β- 및 γ-서브유닛으로 이루어진다)에 대한 상기 IL-2 돌연변이체의 친화성은 보존하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환일 수 있다. 상기 IL-2 돌연변이체는 인간 IL-2(서열번호 2로서 나타낸)의 42, 45 및 72번 잔기에 상응하는 위치들 중에서 선택된 1, 2 또는 3개의 위치(들)에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 상기 IL-2 돌연변이체는 인간 IL-2의 42, 45 및 72번 잔기에 상응하는 위치에 3개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 상기 IL-2 돌연변이체는 인간 IL-2의 돌연변이체일 수 있다. 상기 IL-2 돌연변이체는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G를 포함하는 인간 IL-2일 수 있다. 상기 IL-2 돌연변이체는 인간 IL-2의 3번 위치에 상응하는 위치에 아미노산 돌연변이를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 돌연변이는 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거한다. 특히, 상기 추가적인 아미노산 돌연변이는 쓰레오닌 잔기를 알라닌 잔기에 의해 대체시키는 아미노산 치환이다. 본 발명에 유용한 특정한 IL-2 돌연변이체는 인간 IL-2(서열번호 2로서 나타낸)의 3, 42, 45 및 72번 잔기에 상응하는 위치에 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 구체적인 아미노산 치환은 T3A, F42A, Y45A 및 L72G이다. WO 2012/146628의 실시예에서 설명된 바와 같이, 상기 4중 돌연변이 IL-2 폴리펩타이드(IL-2 qm)는 CD25에 대해 검출 가능하지 않은 결합, T 세포에서 감소된 세포사멸 유도 능력, T_reg 세포에서 감소된 IL-2 신호전달 유도 능력, 및 생체내에서 감소된 독성 프로파일을 나타낸다. 그러나, 상기 폴리펩타이드는 효과기 세포에서 IL-2 신호전달을 활성화시키고, 효과기 세포의 증식을 유도하며, NK 세포에 의해 2차 사이토카인으로서 IFN-y를 생성시키는 능력을 유지한다. 상기 기재 중 어느 하나에 따른 IL-2 돌연변이체는 증가된 발현 또는 안정성과 같은 추가의 장점을 제공하는 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 125번 위치의 시스테인을 알라닌과 같은 중성 아미노산으로 교체시켜 다이설파이드-가교된 IL-2 이량체의 형성을 피할 수 있다. 따라서, IL-2 돌연변이체는 인간 IL-2의 125번 잔기에 상응하는 위치에 추가적인 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 추가적인 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 C125A일 수 있다. 상기 IL-2 돌연변이체는 서열번호 3의 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.As described in WO 2012/146628, IL-2 mutants have reduced binding affinity for the α-subunit of the IL-2 receptor. Together with the β- and γ-subunits (also known as CD122 and CD132, respectively), the α-subunit (also known as CD25) forms the heterotrimeric high affinity IL-2 receptor, whereas only β Dimeric receptors consisting only of - and γ-subunits are referred to as intermediate-affinity IL-2 receptors. As described in WO 2012/146628, the IL-2 mutant polypeptide with reduced binding to the α-subunit of the IL-2 receptor has reduced IL in regulatory T cells, compared to the wild-type IL-2 polypeptide. -2 has the ability to induce signaling, induces little activation-induced cell death (AICD) in T cells, and has a reduced toxicity profile in vivo. The use of such IL-2 mutants with reduced toxicity is particularly advantageous for PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokines with a long serum half-life due to the presence of the Fc domain. The IL-2 mutant reduces or eliminates the affinity of the IL-2 mutant for the α-subunit (CD25) of the IL-2 receptor, but the medium-affinity IL compared to wild-type IL-2. The affinity of the IL-2 mutant for the -2 receptor (consisting of the β- and γ-subunits of the IL-2 receptor) may comprise at least one amino acid mutation that conserves. The one or more amino acid mutations may be amino acid substitutions. The IL-2 mutant contains 1, 2 or 3 at 1, 2 or 3 position(s) selected from the positions corresponding to residues 42, 45 and 72 of human IL-2 (represented as SEQ ID NO:2). amino acid substitutions. The IL-2 mutant may comprise three amino acid substitutions at positions corresponding to residues 42, 45 and 72 of human IL-2. The IL-2 mutant may be a mutant of human IL-2. The IL-2 mutant may be human IL-2 comprising amino acid substitutions F42A, Y45A and L72G. The IL-2 mutant may further comprise an amino acid mutation at a position corresponding to position 3 of human IL-2, wherein the mutation removes an O-glycosylation site of IL-2. In particular, said additional amino acid mutation is an amino acid substitution in which a threonine residue is replaced by an alanine residue. Particular IL-2 mutants useful in the present invention contain four amino acid substitutions at positions corresponding to residues 3, 42, 45 and 72 of human IL-2 (shown as SEQ ID NO:2). Specific amino acid substitutions are T3A, F42A, Y45A and L72G. As described in the examples of WO 2012/146628, the quadruple mutant IL-2 polypeptide (IL-2 qm) has undetectable binding to CD25, reduced ability to induce apoptosis in T cells, T _reg It shows a reduced ability to induce IL-2 signaling in cells, and a reduced toxicity profile in vivo. However, the polypeptide retains the ability to activate IL-2 signaling in effector cells, induce proliferation of effector cells, and produce IFN-y as a secondary cytokine by NK cells. An IL-2 mutant according to any of the above descriptions may comprise additional mutations that provide additional advantages such as increased expression or stability. For example, the formation of a disulfide-bridged IL-2 dimer can be avoided by replacing the cysteine at position 125 with a neutral amino acid such as alanine. Accordingly, the IL-2 mutant may contain an additional amino acid mutation at a position corresponding to residue 125 of human IL-2. The additional amino acid mutation may be the amino acid substitution C125A. The IL-2 mutant may include the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 3.

바람직한 실시태양에서, PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인의 PD-1 표적화는 WO 2018/1184964에 기재된 바와 같이, PD-1을 표적화함으로써 성취될 수 있다. PD-1-표적화는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 성취될 수 있다. 항-PD-1 항체는 서열번호 5의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 중쇄 가변 영역 서열 또는 기능성을 유지하는 그의 변체를 포함할 수 있다. 항-PD-1 항체는 서열번호 6의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 경쇄 가변 영역 서열 또는 기능성을 유지하는 그의 변체를 포함할 수 있다. 항-PD-1 항체는 서열번호 5의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 중쇄 가변 영역 서열 또는 기능성을 유지하는 그의 변체, 및 서열번호 6의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 경쇄 가변 영역 서열 또는 기능성을 유지하는 그의 변체를 포함할 수 있다. 항-PD-1 항체는 서열번호 5의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 6의 경쇄 가변 영역 서열을 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, PD-1 targeting of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine can be achieved by targeting PD-1, as described in WO 2018/1184964. PD-1-targeting can be accomplished with an anti-PD-1 antibody or antigen-binding fragment thereof. The anti-PD-1 antibody has a heavy chain variable region sequence or functionality that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ ID NO:5. It may include variants thereof that retain The anti-PD-1 antibody has a light chain variable region sequence or functionality that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ ID NO:6. It may include variants thereof that retain The anti-PD-1 antibody has a heavy chain variable region sequence or functionality that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ ID NO:5. retaining a light chain variable region sequence or functionality that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ ID NO:6; It may include a variant thereof. The anti-PD-1 antibody may comprise a heavy chain variable region sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region sequence of SEQ ID NO: 6.

PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩타이드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변체를 포함할 수 있다. 상기 PD-1- 표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 CEA에 특이적인 Fab 중쇄가 구멍 변형을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 폴리펩타이드 서열 또는 기능성을 유지하는 그의 변체를 포함할 수 있다. 상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 PD-1에 특이적인 Fab 경쇄를 포함할 수 있다. 상기 CEA-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 8 또는 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열 또는 기능성을 유지하는 그의 변체를 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드 쇄를 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유적으로 연결시킬 수 있다. 상기 Fc 도메인 폴리펩타이드 쇄는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(LALA P329G로서 지칭될 수도 있다)를 포함할 수 있다.The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine may comprise a polypeptide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, or a variant thereof that retains functionality. The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine may comprise a polypeptide sequence in which a CEA-specific Fab heavy chain shares a carboxy-terminal peptide bond with an Fc domain subunit comprising a hole modification. The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine may include a polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or a variant thereof that retains functionality. The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine may include a PD-1 specific Fab light chain. The CEA-targeted IL-2 mutant immunocytokine may include the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or a variant thereof that retains functionality. The polypeptide chains may be covalently linked, for example by disulfide bonds. The Fc domain polypeptide chain may comprise amino acid substitutions L234A, L235A and P329G (also referred to as LALA P329G).

WO 2018/184964에 기재된 바와 같이, PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 8 및 9로서 나타낸 서열을 갖는 PD-1-표적화된 IgG-IL-2 qm 융합 단백질(예를 들어 WO 2018/184964의 실시예 1에 기재된 바와 같은)일 수 있다. 상기 서열번호 7, 8 및 9로서 나타낸 서열을 갖는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 본 명세서에서 "PD1-IL2v"로서 지칭한다.As described in WO 2018/184964, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is a PD-1-targeted IgG-IL-2 qm fusion protein having the sequences shown as SEQ ID NOs: 7, 8 and 9 ( for example as described in Example 1 of WO 2018/184964). The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine having the sequence shown in SEQ ID NOs: 7, 8 and 9 above is referred to herein as “PD1-IL2v”.

본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 면역세포, 특히 T 세포상에, 또는 종양 세포 환경에 제시된 항원에 결합하는 항체, 및 IL-2 수용체의 서브유닛에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 IL-2 돌연변이체를 포함할 수 있다. 상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 면역세포, 특히 T 세포상에, 또는 종양 세포 환경에 제시된 PD-1에 결합하는 항체, 및 IL-2 수용체의 서브유닛에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 IL-2 돌연변이체로 필수적으로 이루어질 수 있다. 상기 항체는 IgG 항체, 특히 IgG1 항체일 수 있다. 상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 상기 IL-2 수용체의 서브유닛에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 단일 IL-2 돌연변이체를 포함할 수 있다(즉, 하나 이하의 IL-2 돌연변이 부분이 존재한다).The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines used in the combination therapy described herein include antibodies that bind antigens presented on immune cells, particularly T cells, or in the tumor cell environment, and of IL-2 receptors. IL-2 mutants with reduced binding affinity for the subunit. The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is an antibody that binds to PD-1 presented on immune cells, particularly T cells, or in the tumor cell environment, and has reduced levels of IL-2 receptor subunits. It may consist essentially of an IL-2 mutant with binding affinity. The antibody may be an IgG antibody, in particular an IgG1 antibody. The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine may comprise a single IL-2 mutant with reduced binding affinity for a subunit of the IL-2 receptor (ie, less than one IL -2 mutant moieties are present).

본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 면역세포, 특히 T 세포에, 또는 종양 세포 환경에서 결합하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인, 및 2개의 서브유닛으로 이루어지고 2개의 일치하지 않는 폴리펩타이드 쇄의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함하는 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 면역세포, 특히 T 세포에 또는 종양 세포 환경에서 결합하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및 손잡이 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛, 면역 세포, 특히 T 세포에, 또는 종양 세포 환경에서 결합하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및 구멍 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛, 및 면역세포, 특히 T 세포에, 또는 종양 세포 환경에서 결합하는 항체의 경쇄 가변 도메인 및 상기 IL-2 수용체의 서브유닛에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 IL-2 돌연변이체를 포함할 수 있다. 따라서, 면역사이토카인은 2개의 일치하지 않는 폴리펩타이드 쇄의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함하는 Fc 도메인을 포함할 수 있다. "이종이량체화를 촉진하는 변형"은 동종이량체를 형성하기 위한 폴리펩타이드와 일치하는 폴리펩타이드와의 회합을 감소시키거나 방지하는 펩타이드 주쇄의 조작 또는 폴리펩타이드의 번역-후 변형이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 이종이량체화를 촉진하는 변형은 특히 이량체화를 형성하기 위해 요구되는 2개의 폴리펩타이드 각각에 대해 이루어진 별도의 변형을 포함하며, 여기에서 상기 변형은 상기 두 폴리펩타이드의 회합을 촉진하기 위해 서로에 대해 상보성이다. 예를 들어, 이종이량체화를 촉진하는 변형은 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 유리한 폴리펩타이드의 회합을 이루기 위해서 이량체 형성에 요구되는 상기 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두의 구조 또는 전하를 변경시킬 수 있다. 이종이량체화는 2개의 일치하지 않는 폴리펩타이드, 예를 들어 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이에서 발생하며, 여기에서 상기 서브유닛 각각에 융합된 추가의 면역접합체 성분(예를 들어 항원 결합 부분, 효과기 부분)은 동일하지 않다. 본 발명에 따른 면역접합체에서, 상기 이종이량체화를 촉진하는 변형은 Fc 도메인 중에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 이종이량체화를 촉진하는 변형은 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 이종이량체화를 촉진하는 변형은 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에, 별도의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 폴리펩타이드 쇄간의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 상기 변형은 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 변형은 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나에 손잡이 변형 및 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 다른 하나에 구멍 변형을 포함하는, 구멍에-손잡이 변형이다.As described herein, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy described herein is a heavy chain variable domain of an antibody that binds to immune cells, particularly T cells, or in the tumor cell environment. and a light chain variable domain, and an Fc domain consisting of two subunits and comprising a modification that promotes heterodimerization of two mismatched polypeptide chains. The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy described herein is an Fc domain comprising a knob mutation and a heavy chain variable domain of an antibody that binds to immune cells, particularly T cells or in the tumor cell environment. a subunit, an Fc domain subunit comprising a hole mutation and a heavy chain variable domain of an antibody that binds to an immune cell, in particular a T cell, or in a tumor cell environment, and an immune cell, in particular a T cell, which binds to or in the tumor cell environment an IL-2 mutant having reduced binding affinity for the light chain variable domain of the antibody and the subunit of the IL-2 receptor. Thus, an immunocytokine may comprise an Fc domain comprising a modification that promotes heterodimerization of two mismatched polypeptide chains. A "modification that promotes heterodimerization" is a post-translational modification of a polypeptide or manipulation of a peptide backbone that reduces or prevents association of a polypeptide with a conforming polypeptide to form a homodimer. As used herein, a modification that promotes heterodimerization includes, inter alia, separate modifications made to each of the two polypeptides required to form dimerization, wherein the modification comprises of the two polypeptides. They are complementary to each other to facilitate association. For example, a modification that promotes heterodimerization may alter the structure or charge of one or both of the polypeptides required for dimer formation to achieve sterically or electrostatically favorable association of the polypeptide, respectively. there is. Heterodimerization occurs between two non-identical polypeptides, e.g., two subunits of the Fc domain, wherein additional immunoconjugate components (e.g. antigen binding moieties; effector part) are not identical. In the immunoconjugate according to the present invention, the modification promoting heterodimerization is in the Fc domain. In some embodiments, the modification that promotes heterodimerization comprises an amino acid mutation, specifically an amino acid substitution. In a particular embodiment, said modification promoting heterodimerization comprises a separate amino acid mutation, specifically an amino acid substitution, in each of the two subunits of said Fc domain. The most extensive site of protein-protein interaction between the two polypeptide chains of a human IgG Fc domain is in the CH3 domain of said Fc domain. Thus, in one embodiment, said modification is in the CH3 domain of said Fc domain. In a specific embodiment, said modification is a hole-in-handle modification comprising a handle modification in one of the two subunits of the Fc domain and a hole modification in the other of the two subunits of the Fc domain.

구멍에-손잡이 기술은 예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호; 미국특허 제 7,695,936 호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 제1 폴리펩타이드의 계면에 돌출부("손잡이") 및 제2 폴리펩타이드의 계면 중에 상응하는 공동("구멍")을, 상기 돌출부가 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 상기 공동 중에 위치할 수 있게 도입시킴을 포함한다. 돌출부는 상기 제1 폴리펩타이드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어 타이로신 또는 트립토판)로 교체시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어 알라닌 또는 쓰레오닌)으로 교체시킴으로써 상기 제2 폴리펩타이드의 계면 중에 상기 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 보상성 공동이 생성된다. 상기 돌출부 및 공동은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을, 예를 들어 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해 또는 펩타이드 합성에 의해 변경시킴으로써 생성될 수 있다. 특정한 실시태양에서, 손잡이 변형은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나에 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 구멍 변형은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 추가의 특정한 실시태양에서, 상기 손잡이 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 아미노산 치환 S354C를 추가로 포함하고, 상기 구멍 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C를 추가로 포함한다.Hole-on-handle technology is described, for example, in US Pat. Nos. 5,731,168; US Pat. No. 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). In general, the method includes a protrusion (“handle”) at the interface of a first polypeptide and a corresponding cavity (“hole”) at the interface of a second polypeptide, wherein the protrusion promotes heterodimer formation and homodimers. and introducing positionable in the cavity to prevent formation. Overhangs are constructed by replacing small amino acid side chains from the interface of the first polypeptide with larger side chains (eg tyrosine or tryptophan). Compensatory cavities of the same or similar size as the overhangs are created in the interface of the second polypeptide by replacing large amino acid side chains with smaller ones (eg alanine or threonine). The overhangs and cavities can be created by altering the nucleic acid encoding the polypeptide, for example, by site-specific mutagenesis or by peptide synthesis. In a specific embodiment, the knob modification comprises the amino acid substitutions T366W in one of the two subunits of the Fc domain and the hole modification comprises the amino acid substitutions T366S, L368A and Y407V in the other of the two subunits of the Fc domain. In a further specific embodiment, the subunit of the Fc domain comprising the knob modification further comprises the amino acid substitution S354C, and the subunit of the Fc domain comprising the hole modification further comprises the amino acid substitution Y349C.

이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개의 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교를 형성시켜, 이량체를 추가로 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)]). 상기 Fc 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭한다)에 따른다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 Fc 도메인의 "서브유닛"은 이량체성 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩타이드 중 하나, 즉 안정한 자기-회합이 가능한, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어 IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.Introduction of these two cysteine residues forms a disulfide bridge between the two subunits of the Fc region, further stabilizing the dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)). The numbering of amino acid residues in the Fc region is described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991] according to the EU numbering system (also referred to as the EU index). A “subunit” of an Fc domain, as used herein, is one of the two polypeptides that form the dimeric Fc domain, i.e., a poly containing the C-terminal constant region of an immunoglobulin heavy chain capable of stable self-association. refers to peptides. For example, a subunit of an IgG Fc domain comprises an IgG CH2 and an IgG CH3 constant domain.

또 다른 실시태양에서, 2개의 일치하지 않는 폴리펩타이드 쇄의 이종이량체화를 촉진하는 변형은 예를 들어 WO 2009/089004에 기재된 바와 같은 정전기 조종 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하게 되지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록, 상기 두 폴리펩타이드 쇄의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기에 의해 교체시킴을 수반한다.In another embodiment, modifications that promote heterodimerization of two mismatched polypeptide chains include modifications that mediate electrostatic steering effects, for example as described in WO 2009/089004. In general, the method replaces one or more amino acid residues at the interface of the two polypeptide chains by charged amino acid residues such that homodimer formation becomes electrostatically disadvantageous but heterodimerization becomes electrostatically favorable. is accompanied by

IL-2 수용체의 서브유닛에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 IL-2 돌연변이체를 손잡이 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛의 카복시-말단 아미노산에 융합시킬 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 Fc 도메인의 손잡이-함유 서브유닛에 대한 IL-2 돌연변이체의 융합은 2개의 IL-2 돌연변이 폴리펩타이드를 포함하는 동종이량체성 면역사이토카인의 생성(2개의 손잡이-함유 폴리펩타이드의 입체적 충돌)을 더욱 최소화할 것이다.An IL-2 mutant with reduced binding affinity for the subunit of the IL-2 receptor can be fused to the carboxy-terminal amino acid of the subunit of the Fc domain comprising a knob modification. Without wishing to be bound by theory, fusion of the IL-2 mutant to the handle-containing subunit of the Fc domain results in the generation of homodimeric immunocytokines comprising two IL-2 mutant polypeptides (two steric collisions of the handle-containing polypeptide) will be further minimized.

면역사이토카인의 Fc 도메인을, WO 2012/146628에 기재된 바와 같이, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대해 변경된 결합 친화성, 구체적으로 Fcγ 수용체에 대해 변경된 결합 친화성을 갖도록 조작할 수 있다. 보체 성분, 구체적으로 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합을 WO 2012/146628에 기재된 바와 같이 변경시킬 수 있다. 상기 Fc 도메인은 상기 면역접합체에, 표적 조직에서 양호한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 유리한 조직-혈액 분포 비를 포함한 유리한 약동학적 성질을 부여할 수 있다. 그러나, 동시에 상기는 바람직한 항원-함유 세포에 대해서보다는 오히려 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대해서 상기 면역접합체의 바람직하지 못한 표적화를 이끈다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공-활성화는 사이토카인 방출을 이끌 수 있으며, 이는 상기 면역접합체의 효과기 부분 및 긴 반감기와 함께, 전신 투여시 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 심한 부작용을 생성시킨다. 이와 일치하게, 통상적인 IgG-IL-2 면역접합체가 융합 반응과 관련됨이 기재되었다(예를 들어 문헌[King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)]을 참조하시오).The Fc domain of an immunocytokine can be engineered to have an altered binding affinity to an Fc receptor, specifically an altered binding affinity to an Fcγ receptor, compared to an unengineered Fc domain, as described in WO 2012/146628 . The binding of the Fc domain to complement components, specifically Clq, can be altered as described in WO 2012/146628. The Fc domain may confer advantageous pharmacokinetic properties to the immunoconjugate, including a long serum half-life and favorable tissue-blood distribution ratio, which contributes to good accumulation in target tissues. However, at the same time this leads to undesirable targeting of the immunoconjugate to cells expressing Fc receptors rather than to the desired antigen-bearing cells. Moreover, co-activation of the Fc receptor signaling pathway can lead to cytokine release, which, together with the effector moiety and long half-life of the immunoconjugate, results in excessive activation of the cytokine receptor and severe side effects upon systemic administration. Consistent with this, it has been described that conventional IgG-IL-2 immunoconjugates are involved in fusion reactions (see, eg, King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)).

상응하게, 면역사이토카인의 Fc 도메인을 Fc 수용체에 대해 감소된 결합 친화성을 갖도록 조작할 수 있다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 상기 Fc 도메인의 상기 Fc 수용체에의 결합 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 존재한다. 하나의 실시태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 상기 Fc 도메인의 상기 Fc 수용체에의 결합 친화성을 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배까지 감소시킨다. 상기 Fc 도메인의 상기 Fc 수용체에의 결합 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 실시태양에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 상기 Fc 도메인의 상기 Fc 수용체에의 결합 친화성을 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 심지어 적어도 50배까지 감소시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 면역접합체는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 면역접합체에 비해 Fc 수용체에의 결합 친화성의 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만을 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 실시태양에서, 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 Fcγ RIIIa, Fcγ RI 또는 Fcγ RIIa 수용체이다. 바람직하게, 이들 각각의 수용체에의 결합이 감소된다. 일부 실시태양에서, 보체 성분에 대한 결합 친화성, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화성이 또한 감소된다. 하나의 실시태양에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화성은 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 Fc 도메인의 상기 수용체에의 결합 친화성의 보존은 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 면역접합체)이 상기 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태(또는 상기 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태를 포함하는 면역접합체)의 FcRn에 대한 결합 친화성의 약 70% 초과를 나타낼 때 성취된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 면역접합체는 상기와 같은 친화성의 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 P329번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 하나의 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 S228, E233, L234, L235, N297 및 P331 중에서 선택된 위치에 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 추가의 아미노산 치환은 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정한 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 P329, L234 및 L235번 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(LALA P329G)를 포함한다. 이러한 아미노산 치환의 조합은 WO 2012/130831(내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이, 인간 IgG Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 없앤다. WO 2012/130831은 또한 상기와 같은 돌연변이 Fc 도메인의 제조 방법 및 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능과 같은 그의 성질의 측정 방법을 기재한다. 상기 Fc 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭한다)에 따른다.Correspondingly, the Fc domain of an immunocytokine can be engineered to have reduced binding affinity to the Fc receptor. In one such embodiment, said Fc domain comprises one or more amino acid mutations that decrease the binding affinity of said Fc domain to said Fc receptor. Typically, there is one or more amino acid mutations that are identical in each of the two subunits of the Fc domain. In one embodiment, said amino acid mutation reduces the binding affinity of said Fc domain to said Fc receptor by at least 2-fold, at least 5-fold, or at least 10-fold. In embodiments in which there is more than one amino acid mutation that reduces the binding affinity of said Fc domain to said Fc receptor, the combination of these amino acid mutations results in a binding affinity of said Fc domain to said Fc receptor by at least 10-fold; It can be reduced by at least 20 fold, or even by at least 50 fold. In one embodiment, the immunoconjugate comprising an engineered Fc domain exhibits less than 20%, in particular less than 10%, more particularly less than 5% of binding affinity to an Fc receptor as compared to an immunoconjugate comprising a non-engineered Fc domain. indicates. In one embodiment, the Fc receptor is an activating Fc receptor. In certain embodiments, the Fc receptor is an Fcγ receptor, more specifically an Fcγ RIIIa, FcγRI or Fcγ RIIa receptor. Preferably, binding to each of these receptors is reduced. In some embodiments, the binding affinity for a complement component, specifically for C1q, is also reduced. In one embodiment, the binding affinity to the neonatal Fc receptor (FcRn) is not reduced. Substantially similar binding to FcRn, i.e., preservation of the binding affinity of the Fc domain to the receptor, results when the Fc domain (or an immunoconjugate comprising the Fc domain) is a non-engineered form of the Fc domain (or of the Fc domain). exhibiting greater than about 70% of the binding affinity for FcRn of an immunoconjugate (including an unengineered form). An Fc domain, or an immunoconjugate of the invention comprising said Fc domain, may exhibit greater than about 80% and even greater than about 90% of such affinity. In one embodiment, the amino acid mutation is an amino acid substitution. In one embodiment, the Fc domain comprises an amino acid substitution at position P329. In a more specific embodiment, said amino acid substitution is P329A or P329G, in particular P329G. In one embodiment, the Fc domain comprises an additional amino acid substitution at a position selected from among S228, E233, L234, L235, N297 and P331. In a more specific embodiment, said additional amino acid substitution is S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D or P331S. In a specific embodiment, the Fc domain comprises amino acid substitutions at positions P329, L234 and L235. In a more specific embodiment, said Fc domain comprises amino acid mutations L234A, L235A and P329G (LALA P329G). This combination of amino acid substitutions almost completely abolishes Fcγ receptor binding of the human IgG Fc domain, as described in WO 2012/130831, which is incorporated herein by reference in its entirety. WO 2012/130831 also describes a method for producing such a mutant Fc domain and a method for measuring its properties, such as Fc receptor binding or effector function. The numbering of amino acid residues in the Fc region is described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991] according to the EU numbering system (also referred to as the EU index).

돌연변이 Fc 도메인을 당해 분야에 주지되고 WO 2012/146628에 기재된 바와 같은 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조할 수 있다. 유전학적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오타이드 변화를 예를 들어 서열분석에 의해 입증할 수 있다.Mutant Fc domains can be prepared by amino acid deletions, substitutions, insertions or modifications using genetic or chemical methods well known in the art and as described in WO 2012/146628. Genetic methods may include site-specific mutagenesis of coding DNA sequences, PCR, gene synthesis, and the like. Exact nucleotide changes can be demonstrated, for example, by sequencing.

하나의 실시태양에서, 상기 Fc 도메인을, WO 2012/146628에 기재된 바와 같이, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작한다. 상기 감소된 효과기 기능은 비제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 감소된 보체 의존적인 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존적인 세포 식작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 감소된 항원-제시 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 감소된 NK 세포에의 결합, 감소된 대식세포에의 결합, 감소된 단핵세포에의 결합, 감소된 다형핵세포에의 결합, 세포사멸을 유도하는 감소된 직접적인 신호전달, 감소된 표적-결합된 항체의 가교결합, 감소된 수지상 세포 성숙화, 또는 감소된 T 세포 초회항원자극.In one embodiment, the Fc domain is engineered to have reduced effector function compared to an unengineered Fc domain, as described in WO 2012/146628. Said reduced effector function may include, but is not limited to, one or more of the following: reduced complement dependent cytotoxicity (CDC), reduced antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), reduced antibody- Cell dependent phagocytosis (ADCP), reduced cytokine secretion, reduced immune complex-mediated antigen uptake by antigen-presenting cells, reduced binding to NK cells, reduced binding to macrophages, reduced monocytes binding to, reduced binding to polymorphonuclear cells, reduced direct signaling inducing apoptosis, reduced cross-linking of target-bound antibodies, reduced dendritic cell maturation, or reduced T cell priming.

IgG₄ 항체는 IgG₁ 항체에 비해 감소된 Fc 수용체에의 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG₄ Fc 도메인, 특히 인간 IgG₄ Fc 도메인이다. 하나의 실시태양에서, 상기 IgG₄ Fc 도메인은 S228번 위치에 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P를 포함한다. Fc 수용체에의 그의 결합 친화성 및/또는 그의 효과기 기능을 더욱 감소시키기 위해서, 하나의 실시태양에서, 상기 IgG₄ Fc 도메인은 L235번 위치에 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 IgG₄ Fc 도메인은 P329번 위치에 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 IgG₄ Fc 도메인은 S228, L235 및 P329번 위치에 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다. 상기와 같은 IgG₄ Fc 도메인 돌연변이체 및 그의 Fcγ 수용체 결합 성질은 유럽 특허 출원 제 WO 2012/130831 호(내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.IgG ₄ antibodies exhibit reduced binding affinity to Fc receptors and reduced effector function compared to IgG ₁ antibodies. Thus, in some embodiments, the Fc domain of a T cell activating bispecific antigen binding molecule of the invention is an IgG ₄ Fc domain, particularly a human IgG ₄ Fc domain. In one embodiment, the IgG ₄ Fc domain comprises an amino acid substitution at position S228, specifically the amino acid substitution S228P. In order to further reduce its binding affinity to the Fc receptor and/or its effector function, in one embodiment, the IgG ₄ Fc domain comprises an amino acid substitution at position L235, specifically the amino acid substitution L235E. In another embodiment, the IgG ₄ Fc domain comprises an amino acid substitution at position P329, specifically the amino acid substitution P329G. In a specific embodiment, said IgG ₄ Fc domain comprises amino acid substitutions at positions S228, L235 and P329, specifically amino acid substitutions S228P, L235E and P329G. Such IgG ₄ Fc domain mutants and their Fcγ receptor binding properties are described in European Patent Application No. WO 2012/130831 (the entire contents of which are incorporated herein by reference).

본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 하기로 이루어진 군 중에서 선택된다:The antibody that binds to human PD-L1 for use in the combination therapy described herein is selected from the group consisting of:

243.55.S70, 243.55.H1, 243.55.H12, 243.55.H37, 243.55.H70, 243.55.H89, 243.55.S1, 243.55.5, 243.55.8, 243.55.30, 243.55.34, 243.55.S37, 243.55.49, 243.55.51, 243.55.62, 및 243.55.84.243.55.S70, 243.55.H1, 243.55.H12, 243.55.H37, 243.55.H70, 243.55.H89, 243.55.S1, 243.55.5, 243.55.8, 243.55.30, 243.55.34, 243.55.S37, 243.55. 49, 243.55.51, 243.55.62, and 243.55.84.

이들 항체는 WO　2010/77634에 기재되어 있다(서열은 WO 2010/77634의 도 11에 나타낸다).These antibodies are described in WO 2010/77634 (sequence is shown in FIG. 11 of WO 2010/77634).

본 발명의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 a) 서열번호 5의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 6의 경쇄 가변 도메인 VL, 및 서열번호 2의 폴리펩타이드 서열, 또는 b) 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 c) 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 d) 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 a) 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL, 또는 b) 서열번호 19의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 20의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.In an embodiment of the invention, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy described herein comprises a) a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 5 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 6; and the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, or b) the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or c) the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, or d) characterized in that it comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy comprises a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16, or b) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 It is characterized in that it comprises a light chain variable domain VL of

하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 5의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 6의 경쇄 가변 도메인 VL, 및 서열번호 2의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 한다.In one embodiment, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy described herein comprises a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 5 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: It is characterized in that it contains the polypeptide sequence of 2.

하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 한다.In one embodiment, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine for use in the combination therapy described herein comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8 and SEQ ID NO:9. do.

하나의 실시태양에서, 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.In one embodiment, the antibody that binds human PD-L1 for use in combination therapy is characterized in that it comprises a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.In a preferred embodiment of the present invention, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy described herein comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 and SEQ ID NO:9. characterized; The antibody binding to human PD-L1 used in the combination therapy is characterized in that it comprises a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 아테졸리주맙이다.In a preferred embodiment of the present invention, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy described herein comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 and SEQ ID NO:9. characterized; The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is atezolizumab.

정의Justice

본 명세서에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 및 항체 단편이 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 상기 항체 단편을 포함한 다양한 항체 구조물을 포함한다.The term "antibody" herein is used in its broadest sense and includes, but is not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and various antibody constructs, including antibody fragments, as long as the antibody fragments exhibit the desired antigen-binding activity. .

"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원과 결합하는 상기 온전한 항체의 일부를 포함하는 상기 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 다이아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 및 단일-도메인 항체를 포함한다. 몇몇 항체 단편에 대한 리뷰에 대해서, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조하시오. scFv 단편의 리뷰에 대해서, 예를 들어 문헌[Pl

ckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하시오; 또한 WO 93/16185; 및 미국특허 제 5,571,894 호 및 미국특허 제 5,587,458 호를 참조하시오. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해서, 미국특허 제 5,869,046 호를 참조하시오. 다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)]을 참조하시오. 트라이아바디 및 테트라바디는 또한 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기재되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월썸 소재; 예를 들어 미국특허 제 6,248,516 Bl 호를 참조하시오)이다. 항체 단편을 본 명세서에 기재된 바와 같이, 다양한 기법에 의해, 예를 들어 비제한적으로 온전한 항체의 단백질분해적 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이 또는 파지)에 의한 생성에 의해 제조할 수 있다."Antibody fragment" refers to a molecule other than the intact antibody comprising a portion of the intact antibody that binds the antigen to which the intact antibody binds. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diabodies, linear antibodies, single chain antibody molecules (eg scFv), and single-domain antibodies. do. For a review of several antibody fragments, see Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). For a review of scFv fragments, see, eg, Pl

ckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); see also WO 93/16185; and US Pat. Nos. 5,571,894 and 5,587,458. For a discussion of Fab and F(ab')2 fragments comprising rescue receptor binding epitope residues and having increased in vivo half-lives, see US Pat. No. 5,869,046. Diabodies are antibody fragments with two antigen binding sites that may be bivalent or bispecific. eg EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Triabodies and tetrabodies are also described in Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Single-domain antibodies are antibody fragments comprising part or all of the heavy chain variable domain or part or all of the light chain variable domain of an antibody. In some embodiments, the single-domain antibody is a human single-domain antibody (Domantis, Inc., Waltham, MA; see, eg, US Pat. No. 6,248,516 Bl). Antibody fragments are prepared as described herein by a variety of techniques, including, but not limited to, proteolytic cleavage of intact antibodies as well as production by recombinant host cells (eg Escherichia coli or phage). can do.

"항원 결합 도메인" 또는 "항체의 항원-결합 부분"이란 용어는 본 명세서에 사용시 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보성인 영역을 포함하는 항체의 부분을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 항체 가변 도메인(또한 항체 가변 영역이라 칭한다)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 항체의 항원-결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본 명세서에 정의된 바와 같은 고가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-에서부터 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이며 항체의 성질을 한정한다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의 및/또는 "고가변 고리"로부터의 잔기에 따라 결정된다.The term "antigen binding domain" or "antigen-binding portion of an antibody" as used herein refers to a portion of an antibody comprising a region that specifically binds to and is complementary to some or all of an antigen. Thus, the term refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen-binding. An antigen binding domain may be provided, for example, by one or more antibody variable domains (also called antibody variable regions). In particular, the antigen binding domain comprises an antibody light chain variable region (VL) and an antibody heavy chain variable region (VH). An antigen-binding portion of an antibody comprises amino acid residues from a “complementarity determining region” or “CDR”. A “framework” or “FR” region is a region of a variable domain other than the hypervariable region residues as defined herein. Thus, the light and heavy chain variable domains of an antibody comprise, from N- to C-terminus, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. In particular, the CDR3 of the heavy chain is the region most contributing to antigen binding and defines the properties of the antibody. The CDR and FR regions have the standard definition of Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) and/or "hypervariable rings" depending on the residues from

"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항체의 항원에의 결합에 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 고가변 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들어 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조하시오. 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.The term “variable region” or “variable domain” refers to the domain of an antibody heavy or light chain that is involved in binding of an antibody to an antigen. The variable domains of the heavy and light chains (VH and VL, respectively) of a native antibody generally have a similar structure, wherein each domain comprises four conserved framework regions (FRs) and three hypervariable regions (HVRs). . See, eg, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]. A single VH or VL domain may be sufficient to confer antigen-binding specificity.

"에피토프"란 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 항원, 예를 들어 CEA 또는 인간 PD-L1의 단백질 결정인자를 나타낸다. 에피토프는 대개 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 군들로 이루어지며 대개 에피토프는 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 상기 입체형태적 에피토프에 대한 결합은 상실되지만 상기 비입체형태적 에피토프에 대한 결합은 상실되지 않는다는 점에서 구별된다.The term "epitope" refers to a protein determinant of an antigen, such as CEA or human PD-L1, capable of specifically binding to an antibody. Epitopes usually consist of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or sugar side chains, and epitopes usually have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. Conformational and non-conformational epitopes are distinguished in that, in the presence of a denaturing solvent, binding to the conformational epitope is lost, but binding to the nonconformational epitope is not.

본 명세서에서 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대개 Cys226 또는 Pro230에서부터 중쇄의 카복실-말단까지 연장되도록 한정된다. 그러나, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭한다)에 따른다. 항체의 Fc 도메인은 항체의 항원에의 결합에 직접적으로 관련되지 않지만, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. "항체의 Fc 도메인"은 숙련가에게 주지된 용어이며 항체의 파파인 절단을 근거로 한정된다. 항체 또는 면역글로불린은 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되며, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상기 중쇄 불변 영역에 따라 면역글로불린의 상이한 부류를 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다. 항체의 Fc 도메인은 ADCC(항체-의존적인 세포-매개된 세포독성) 및 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합에 기반한 CDC(보체-의존적인 세포독성)에 직접적으로 관련된다. 보체 활성화(CDC)는 대부분의 IgG 항체 하위부류의 Fc 도메인에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 몇몇 조건에 의존적이지만, C1q에 대한 결합은 Fc 도메인 중의 한정된 결합 부위에 의해 야기된다. 상기와 같은 결합 부위는 현재의 기술적 수준에서 공지되어 있으며 예를 들어 하기의 문헌들에 의해 기재된다: 문헌[Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743]; 문헌[Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560]; 문헌[Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917]; 문헌[Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344]; 문헌[Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004]; 문헌[Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184]; 문헌[Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168]; 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324]; EP 0 307 434. 상기와 같은 결합 부위는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(카밧 E.A.의 EU 지수에 따른 넘버링, 상기 참조)이다. 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 대개 보체 활성화 및 C1q 및 C3 결합을 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않으며 C1q 및 C3에 결합하지 않는다.The term "Fc domain" or "Fc region" herein is used to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain containing at least a portion of the constant region. The term includes native sequence Fc regions and modified Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an IgG heavy chain may vary slightly, the human IgG heavy chain Fc region is usually defined to extend from Cys226 or Pro230 to the carboxyl-terminus of the heavy chain. However, the C-terminal lysine (Lys447) of the Fc region may or may not be present. Unless otherwise specified herein, the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991] according to the EU numbering system (also referred to as the EU index). The Fc domain of an antibody is not directly involved in the binding of an antibody to an antigen, but exhibits a variety of effector functions. The “Fc domain of an antibody” is a term well known to the skilled person and is defined based on papain cleavage of the antibody. Antibodies or immunoglobulins are classified according to the amino acid sequence of the constant region of their heavy chains into classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, many of which are subclasses (isotypes), for example IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, IgA1, and IgA2. The different classes of immunoglobulins according to the heavy chain constant region are called α, δ, ε, γ and μ, respectively. The Fc domain of an antibody is directly involved in ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) and CDC (complement-dependent cytotoxicity) based on complement activation, Clq binding and Fc receptor binding. Complement activation (CDC) is initiated by the binding of complement factor Clq to the Fc domain of most IgG antibody subclasses. The effect of an antibody on the complement system is dependent on several conditions, but binding to Clq is caused by defined binding sites in the Fc domain. Such binding sites are known at the state of the art and are described, for example, by the following publications: Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T. J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560]; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917]; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-004]; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434. Such binding sites are, for example, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 and P329 (numbering according to the EU index of Kabat E.A., see above). Antibodies of the subclasses IgG1, IgG2 and IgG3 usually exhibit complement activation and C1q and C3 binding, whereas IgG4 does not activate the complement system and does not bind C1q and C3.

하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 면역사이토카인의 항체 성분 또는 항체는 인간 기원으로부터 유래된 Fc 도메인 및 바람직하게는 인간 불변 영역의 다른 모든 부분을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "인간 기원으로부터 유래된 Fc 도메인"이란 용어는 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 Fc 도메인, 바람직하게는 인간 IgG1 하위부류로부터의 Fc 도메인, 인간 IgG1 하위부류로부터의 돌연변이된 Fc 도메인(하나의 실시태양에서, L234A + L235A상의 돌연변이를 갖는), 인간 IgG4 하위부류로부터의 Fc 도메인 또는 인간 IgG4 하위부류로부터의 돌연변이된 Fc 도메인(하나의 실시태양에서, S228P상의 돌연변이를 갖는)인 Fc 도메인을 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 감소되거나 최소의 효과기 기능을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 최소의 효과기 기능은 무효과기 Fc 돌연변이로부터 생성된다. 하나의 실시태양에서, 상기 무효과기 Fc 돌연변이는 L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A 또는 D265A/N297A이다. 하나의 실시태양에서, 상기 무효과기 Fc 돌연변이는 서로 독립적으로 각각의 항체에 대해 L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A 및 D265A/N297A(EU 넘버링)를 포함하는(이루어진) 군 중에서 선택된다.In one embodiment, the antibody component or antibody of an immunocytokine described herein comprises an Fc domain derived from human origin and preferably all other parts of a human constant region. The term "Fc domain derived from human origin" as used herein refers to the Fc domain of a human antibody of subclass IgGl, IgG2, IgG3 or IgG4, preferably an Fc domain from human IgGl subclass, human IgGl subclass A mutated Fc domain from a class (in one embodiment with a mutation on L234A + L235A), an Fc domain from a human IgG4 subclass or a mutated Fc domain from a human IgG4 subclass (in one embodiment S228P) Fc domain with mutations in In one embodiment, the antibody has reduced or minimal effector function. In one embodiment, said minimal effector function results from a null and void Fc mutation. In one embodiment, the null and void Fc mutation is L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A or D265A/N297A. In one embodiment, said invalidator Fc mutations are independently of each other selected from the group comprising (consisting of) L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A and D265A/N297A (EU numbering) for each antibody.

하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 면역사이토카인의 항체 성분 또는 항체는 인간 IgG 부류(즉 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 것이다.In one embodiment, the antibody component or antibody of an immunocytokine described herein is of the human IgG class (ie, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4).

바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 면역사이토카인의 항체 성분 또는 항체는 인간 IgG1 하위부류 또는 인간 IgG4 하위부류의 것이다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 면역사이토카인의 항체 성분 또는 항체는 인간 IgG1 하위부류의 것이다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 면역사이토카인의 항체 성분 또는 항체는 인간 IgG4 하위부류의 것이다.In a preferred embodiment, the antibody component or antibody of an immunocytokine described herein is of the human IgG1 subclass or the human IgG4 subclass. In one embodiment, the antibody component or antibody of an immunocytokine described herein is of the human IgG1 subclass. In one embodiment, the antibody component or antibody of an immunocytokine described herein is of the human IgG4 subclass.

하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 면역사이토카인의 항체 성분 또는 항체는 불변 쇄가 인간 기원의 것임을 특징으로 한다. 상기와 같은 불변 쇄는 현재의 기술적 수준에서 주지되어 있으며 예를 들어 카밧 E.A.에 의해 기재된다(예를 들어 문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218]을 참조하시오).In one embodiment, the antibody component or antibody of an immunocytokine described herein is characterized in that the constant chains are of human origin. Such constant chains are well known in the state of the art and are described, for example, by Kabat EA (see, for example, Johnson, G. and Wu, TT, Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). see).

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "핵산" 또는 "핵산 분자"란 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하고자 한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.As used herein, the term “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” is intended to include DNA molecules and RNA molecules. The nucleic acid molecule may be single-stranded or double-stranded, but is preferably double-stranded DNA.

본 출원내에서 사용되는 "아미노산"이란 용어는 알라닌(3문자 암호: ala, 단문자 암호: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라진(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 아이소류신(ile, I), 류신(leu, I), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 타이로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함한 천연 카복시 알파-아미노산의 군을 나타낸다.As used herein, the term "amino acid" refers to alanine (three letter code: ala, short letter code: A), arginine (arg, R), asparagine (asn, N), aspartic acid (asp, D). , cysteine (cys, C), glutamine (gln, Q), glutamic acid (glu, E), glycine (gly, G), histidine (his, H), isoleucine (ile, I), leucine (leu, I) , lysine (lys, K), methionine (met, M), phenylalanine (phe, F), proline (pro, P), serine (ser, S), threonine (thr, T), tryptophan (trp, W ), tyrosine (tyr, Y) and valine (val, V) represent a group of natural carboxy alpha-amino acids.

참조 폴리펩타이드 서열에 관하여 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요에 따라 서열 및 도입되는 틈을 정렬시켜 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취한 후에, 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고, 상기 참조 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트의 측정을 위한 정렬은 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 성취하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬에 적합한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성% 값을 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었으며 소스 암호는 미국 저작권 오피스(미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)(여기에 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로서 등록되어 있다)에 사용자 문서와 함께 제출되었다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수할 수 있거나 상기 소스 코드로부터 편집될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여 UNIX 작동 시스템상에서의 사용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 서열과의, 또는 상기 서열에 대한 아미노산 서열 일치성%(한편으로 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 서열과의, 또는 상기 서열에 대한 어느 정도의 아미노산 서열 일치성%를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)를 하기와 같이 산정할 수 있다:"Percent amino acid sequence identity" with respect to a reference polypeptide sequence is defined as any conservative substitution as part of the sequence identity after aligning the sequences and introduced gaps as necessary to achieve the maximum percent sequence identity. also without consideration, is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that match amino acid residues in the reference polypeptide sequence. Alignment for determination of percent amino acid sequence identity may be performed in various ways that are within the skill in the art, for example, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. can be achieved using Those skilled in the art can determine suitable parameters for sequence alignment, including any algorithms necessary to achieve maximal alignment over the entire length of the sequences being compared. However, for purposes herein, % amino acid sequence identity values are generated using the sequence comparison computer program ALIGN-2. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was written by Genentech, Inc. and the source code is registered here as U.S. Copyright Registration No. TXU510087 by the U.S. Copyright Office (Washington, DC, 20559, U.S.A.) ) was submitted with user documentation. The ALIGN-2 program is publicly available from Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) or may be compiled from the source code. The ALIGN-2 program must be edited for use on UNIX operating systems, including digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not change. In situations where ALIGN-2 is used for amino acid sequence comparison, the percent amino acid sequence identity of, to, to, or to a given amino acid sequence A (on the one hand, to a given amino acid sequence B; A given amino acid sequence A having or comprising some % amino acid sequence identity to or with said sequence can be calculated as follows:

100 x 분수 X/Y100 x Fractional X/Y

여기에서 X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램의 정렬에서 상기 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 일치하는 합치로서 기록된 아미노산 잔기의 수이고 Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 일치성%는 A에 대한 B의 아미노산 서열 일치성%와 같지 않음을 알 것이다. 달리 구체적으로 서술되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 아미노산 서열 일치성% 값은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에 기재된 바와 같이 획득된다. 적어도, 예를 들어 본 발명의 참조 뉴클레오타이드 서열에 95% "일치하는" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 각각 100개의 상기 참조 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있음을 제외하고, 상기 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 상기 참조 서열과 일치함을 의미한다. 즉, 참조 뉴클레오타이드 서열에 적어도 95% 일치하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해서, 상기 참조 서열 중의 뉴클레오타이드의 5% 이하를 결실시키거나 또 다른 뉴클레오타이드로 치환시키거나, 상기 참조 서열 중의 전체 뉴클레오타이드의 5% 이하의 다수의 뉴클레오타이드를 상기 참조 서열내에 삽입시킬 수 있다. 상기 참조 서열의 이러한 변경은 상기 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 상기 참조 서열 중의 잔기들 중에 개별적으로 또는 상기 참조 서열내의 하나 이상의 인접한 군 중에 산재된 상기 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 실질적인 문제로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는지의 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 폴리펩타이드에 대해 상기에 논의된 것들(예를 들어 ALIGN-2)을 사용하여 통상적으로 밝혀질 수 있다.where X is the number of amino acid residues recorded as matching matches by the sequence alignment program ALIGN-2 in the alignment of the sequence alignment program of A and B and Y is the total number of amino acid residues in B. It will be appreciated that if the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, then the % amino acid sequence identity of A to B is not equal to the % amino acid sequence identity of B to A. Unless specifically stated otherwise, all % amino acid sequence identity values used herein are obtained as described in the immediately preceding paragraph using the ALIGN-2 computer program above. At least, e.g., a nucleic acid or polynucleotide having a nucleotide sequence that is 95% "identical" to a reference nucleotide sequence of the invention, wherein said polynucleotide sequence exhibits no more than 5 point mutations per nucleotide of each 100 said reference nucleotide sequences It means that the nucleotide sequence of the polynucleotide matches the reference sequence, except that it may include. That is, in order to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical to the reference nucleotide sequence, 5% or less of the nucleotides in the reference sequence are deleted or substituted with another nucleotide, or all nucleotides in the reference sequence are deleted. Up to 5% of multiple nucleotides can be inserted into the reference sequence. Such alteration of the reference sequence may occur at the 5' or 3' terminal position of the reference nucleotide sequence, or any between the terminal positions, either individually among residues in the reference sequence or interspersed among one or more contiguous groups within the reference sequence. may occur at the location of As a practical matter, whether any particular polynucleotide sequence is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to a nucleotide sequence of the invention is determined by a known computer program. , eg, can be routinely identified using those discussed above for polypeptides (eg ALIGN-2).

"발현 카세트"란 용어는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소에 의해 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 재조합 발현 카세트를 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서도, 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.The term "expression cassette" refers to a polynucleotide produced recombinantly or synthetically by a set of specified nucleic acid elements that permit the transcription of a particular nucleic acid in a target cell. The recombinant expression cassette can be integrated into a plasmid, chromosome, mitochondrial DNA, plastid DNA, virus, or nucleic acid fragment. Typically, the recombinant expression cassette portion of an expression vector contains, among other sequences, a nucleic acid sequence to be transcribed and a promoter. In some embodiments, an expression cassette of the invention comprises a polynucleotide sequence encoding a polypeptide described herein or a fragment thereof.

"벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 "발현 구조물"과 동의어이며 표적 세포에서 상기와 작동적으로 관련되는 특정 유전자를 도입시키고 그의 발현을 유도하는데 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈 중에 통합된 벡터를 포함한다. 상기 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 허용한다. 일단 상기 발현 벡터가 표적 세포 내부에 있으면, 유전자에 의해 암호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생성된다. 하나의 실시태양에서, 상기 발현 벡터는 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.The term “vector” or “expression vector” is synonymous with “expression construct” and refers to a DNA molecule used to introduce and direct expression of a particular gene operatively associated therewith in a target cell. The term includes vectors as self-replicating nucleic acid constructs as well as vectors integrated in the genome of a host cell into which the vector has been introduced. The expression vector includes an expression cassette. Expression vectors allow for the transcription of large amounts of stable mRNA. Once the expression vector is inside the target cell, the ribonucleic acid molecule or protein encoded by the gene is produced by the cellular transcription and/or translation machinery. In one embodiment, the expression vector comprises an expression cassette comprising a polynucleotide sequence encoding a polypeptide or fragment thereof described herein.

"인공"이란 용어는 합성, 또는 비-숙주 세포 유래된 조성물, 예를 들어 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.The term “artificial” refers to a synthetic, or non-host cell derived composition, eg, a chemically synthesized oligonucleotide.

"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환 가능하게 사용되며, 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대수에 관계 없이 상기 세포로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 일치하지는 않으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 명세서에 포함된다. 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 생성시키는데 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포계이다. 하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 그의 Fc 영역 중에 변형된 올리고사카라이드를 갖는 폴리펩타이드의 생성을 허용하도록 조작된다. 몇몇 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII) 활성을 갖는, 증가된 수준의 하나 이상의 폴리펩타이드를 발현하도록 조작되었다. 몇몇 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 α-만노시다제 II(ManII) 활성을 갖는, 증가된 수준의 하나 이상의 폴리펩타이드를 발현하도록 추가로 조작되었다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 몇 가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함할 뿐만 아니라, 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다.The terms "host cell", "host cell line" and "host cell culture" are used interchangeably and refer to cells into which exogenous nucleic acid has been introduced, including progeny. Host cells include "transformants" and "transformed cells", which include primary transformed cells and progeny derived from such cells, regardless of the number of passages. The progeny do not completely match the nucleic acid content of the parent cell and may contain mutations. Mutant progeny having the same function or biological activity as selected or selected in the originally transformed cell are included herein. A host cell is any type of cell line that can be used to produce the polypeptides described herein. In one embodiment, the host cell is engineered to permit production of a polypeptide having an oligosaccharide modified in its Fc region. In some embodiments, the host cell has been engineered to express increased levels of one or more polypeptides having β(1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III (GnTIII) activity. In some embodiments, the host cell has been further engineered to express increased levels of one or more polypeptides having α-mannosidase II (ManII) activity. Host cells include cultured cells, such as mammalian cultured cells, such as CHO cells, BHK cells, NS0 cells, SP2/0 cells, YO myeloma cells, P3X63 mouse myeloma cells, PER cells, to name a few. PER.C6 cells or hybridoma cells, yeast cells, insect cells, and plant cells, as well as cells comprised within transgenic animals, transgenic plants or cultured plants or animal tissues.

본 명세서에 기재된 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 예를 들어 고체-상태 펩타이드 합성(예를 들어 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득할 수 있다. 재조합 생성을 위해서, 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 면역사이토카인(단편)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 단리하고 추가적인 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터내에 삽입시킨다. 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드를 통상적인 과정을 사용하여 쉽게 단리 및 서열분석할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다. 당해 분야의 숙련가들에게 주지된 방법을 사용하여, 적합한 전사/번역 조절 신호와 함께 면역접합체(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)]에 기재된 기법을 참조하시오. 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분이거나, 핵산 단편일 수 있다. 상기 발현 벡터는 상기 면역사이토카인(단편)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(즉 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능하게 연합되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 변역된 코돈으로 이루어진 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않는다 하더라도, 존재하는 경우 암호화 영역의 부분으로 간주될 수 있지만, 임의의 측면인접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 번역되지 않은 영역 등은 암호화 영역의 부분이 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오타이드 구조물 중에, 예를 들어 단일 벡터상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 구조물 중에, 예를 들어 별도의(상이한) 벡터상에 존재할 수 있다. 더욱 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유하거나, 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들어 벡터는 단백질분해적 절단을 통해 최종 단백질로 번역-후 또는 번역과 동시에 분리되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 또한, 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 또는 핵산은 상기 면역사이토카인(단편) 또는 그의 변체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 비제한적으로, 전문화된 요소 또는 동기, 예를 들어 분비 신호 펩타이드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동성 연합은 유전자 생성물, 예를 들어 폴리펩타이드에 대한 암호화 영역이 상기 유전자 생성물의 발현을 조절 서열(들)의 영향 또는 조절하에 두도록 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어 폴리펩타이드 암호화 영역 및 이와 연합된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 생성물을 암호화하는 mRNA의 전사를 생성시키는 경우 및 상기 2개의 DNA 단편간의 연결 성질이 상기 유전자 생성물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동적으로 연합된다". 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 핵산의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동적으로 연합될 것이다. 상기 프로모터는 오직 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이성 프로모터일 수 있다. 프로모터 외에, 다른 전사 조절 요소, 예를 들어 인헨서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호가 상기 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연합되어 세포-특이성 전사를 유도할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역은 본 명세서에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예를 들어 비제한적으로 거대세포바이러스(예를 들어 인트론-A와 함께, 전초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들어 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들어 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인헨서 분절이 있다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자, 예를 들어 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼

-글로빈으로부터 유래된 것들뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가적인 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이성 프로모터 및 인헨서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들어 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소가 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, 또한 CITE 서열로서 지칭됨)가 있다. 상기 발현 카세트는 또한 다른 특징, 예를 들어 복제 기원, 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노-관련된 바이러스(AAV) 역전된 말단 반복부(ITR)를 포함할 수 있다.The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines described herein can be obtained, for example, by solid-state peptide synthesis (eg Merrifield solid phase synthesis) or recombinant production. For recombinant production, one or more polynucleotides encoding an immunocytokine (fragment), eg, as described above, are isolated and inserted into one or more vectors for further cloning and/or expression in a host cell. Such polynucleotides can be easily isolated and sequenced using conventional procedures. In one embodiment, there is provided a vector, preferably an expression vector, comprising at least one of said polynucleotides. Methods well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing the coding sequence of an immunoconjugate (fragment) together with suitable transcriptional/translational control signals. Such methods include in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques and in vivo recombination/genetic recombination. See, eg, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989). The expression vector may be a plasmid, part of a virus, or a nucleic acid fragment. The expression vector comprises an expression cassette into which a polynucleotide (ie, a coding region) encoding the immunocytokine (fragment) is cloned in operable association with a promoter and/or other transcriptional or translational regulatory elements. As used herein, a “coding region” is a portion of a nucleic acid that consists of codons translated into amino acids. A "stop codon" (TAG, TGA or TAA), if present, may be considered part of a coding region, even if not translated into an amino acid, but may include any flanking sequence, e.g., a promoter, ribosome binding site, transcription terminator , introns, 5' and 3' untranslated regions, etc. are not part of the coding region. Two or more coding regions may be present in a single polynucleotide construct, eg on a single vector, or in separate polynucleotide constructs, eg on separate (different) vectors. Moreover, any vector may contain a single coding region, or may contain two or more coding regions, for example, the vector may contain one or more coding regions that are isolated post-translationally or concurrently with proteolytic cleavage into the final protein. may encode a polypeptide. In addition, the vector, polynucleotide, or nucleic acid may encode a heterologous coding region fused or unfused to a polynucleotide encoding the immunocytokine (fragment) or a variant or derivative thereof. Heterologous coding regions include, but are not limited to, specialized elements or motifs, such as secretion signal peptides or heterologous functional domains. An operative association is when a coding region for a gene product, eg, a polypeptide, associates with one or more regulatory sequences in such a way that it places expression of the gene product under the influence or control of the regulatory sequence(s). Two DNA fragments (e.g., a polypeptide coding region and a promoter associated therewith) are determined when induction of promoter function results in transcription of the mRNA encoding the desired gene product and the nature of the linkage between the two DNA fragments is determined by the gene. "Operably associated" if it does not interfere with the ability of an expression control sequence to direct expression of the product or interfere with the ability of the DNA template to be transcribed. Thus, a promoter region will be operatively associated with a nucleic acid encoding a polypeptide if the promoter is capable of influencing the transcription of the nucleic acid. The promoter may be a cell-specific promoter that directs substantial transcription of DNA only in the intended cell. In addition to promoters, other transcriptional regulatory elements, such as enhancers, operators, repressors and transcription termination signals, can be operatively associated with the polynucleotide to induce cell-specific transcription. Suitable promoters and other transcriptional regulatory regions are disclosed herein. Various transcriptional regulatory regions are known to those skilled in the art. These include, but are not limited to, transcriptional regulatory regions that function in vertebrate cells, including, but not limited to, cytomegalovirus (eg, with intron-A, an early promoter), simian virus 40 (eg, an early promoter). , and promoter and enhancer segments from retroviruses (eg, Rous sarcoma virus). Other transcriptional regulatory regions include vertebrate genes such as actin, heat shock protein, bovine growth hormone and rabbit

-Contains those derived from globin as well as other sequences capable of regulating gene expression in eukaryotic cells. Additional suitable transcriptional regulatory regions include tissue-specific promoters and enhancers as well as inducible promoters (eg promoter inducible tetracycline). Similarly, various translational regulatory elements are known to those of ordinary skill in the art. These include, but are not limited to, ribosome binding sites, translation initiation and termination codons, and elements derived from viral systems (particularly internal ribosome entry sites, or IRESs, also referred to as CITE sequences). The expression cassette may also contain other characteristics, such as an origin of replication, and/or a chromosomal integration element, such as a retroviral long terminal repeat (LTR), or an adeno-associated virus (AAV) inverted terminal repeat (ITR). may include

본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 암호화 영역은, 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩타이드를 암호화하는 추가적인 암호화 영역과 연합될 수 있다. 예를 들어, 면역사이토카인의 분비가 요구되는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 면역사이토카인 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 놓을 수 있다. 상기 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 조면소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 이동이 개시되었으면 성숙한 단백질로부터 절단되는 신호 펩타이드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야의 통상적인 숙련가들은 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드가 일반적으로, 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드를 가지며, 이는 번역된 폴리펩타이드로부터 절단되어 상기 폴리펩타이드의 분비된 또는 "성숙한" 형태를 생성시킨다. 몇몇 실시태양에서, 고유 신호 펩타이드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드, 또는 작동적으로 연합되는 폴리펩타이드의 분비를 유도하는 능력을 유지하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 한편으로, 이종 포유동물 신호 펩타이드, 또는 그의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열을 인간 조직 플라스미노겐 활성제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환시킬 수 있다.Polynucleotides and nucleic acid coding regions described herein may be associated with additional coding regions that encode secretory or signal peptides that direct secretion of the polypeptide encoded by the polynucleotide. For example, if secretion of an immunocytokine is desired, DNA encoding a signal sequence can be placed upstream of a nucleic acid encoding the immunocytokine or fragment thereof. According to this signaling hypothesis, proteins secreted by mammalian cells have a signal peptide or secretory leader sequence that is cleaved from the mature protein once migration of the growing protein chain across the rough endoplasmic reticulum has been initiated. Those of ordinary skill in the art will recognize that polypeptides secreted by vertebrate cells generally have a signal peptide fused to the N-terminus of the polypeptide, which is cleaved from the translated polypeptide to secrete or Produces a "mature" form. In some embodiments, functional derivatives of these sequences that retain the ability to induce secretion of native signal peptides, eg, immunoglobulin heavy or light chain signal peptides, or operatively associated polypeptides are used. Alternatively, a heterologous mammalian signal peptide, or a functional derivative thereof, may be used. For example, the wild-type leader sequence can be substituted with the leader sequence of human tissue plasminogen activator (TPA) or mouse β-glucuronidase.

나중에 정제를 촉진하거나(예를 들어 히스티딘 태그) 또는 면역사이토카인의 표지화를 지원하는데 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA를 면역사이토카인(단편) 암호화 폴리뉴클레오타이드 내에 또는 그의 단부에 포함시킬 수 있다.DNA encoding a short protein sequence that can later be used to facilitate purification (e.g., a histidine tag) or to support labeling of an immunocytokine may be included within or at the end of the immunocytokine (fragment) encoding polynucleotide. .

추가의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 각각 폴리뉴클레오타이드 및 벡터와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 면역사이토카인(그의 일부)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"란 용어는 면역사이토카인 또는 그의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포계를 지칭한다. 면역사이토카인을 복제하고 그의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 주지되어 있다. 상기와 같은 세포를 특정한 발현 벡터로 적합하게 형질감염시키거나 형질도입시킬 수 있으며 다량의 벡터 함유 세포를 임상적인 용도에 충분한 양의 면역사이토카인을 수득하기 위한 대규모 발효기의 시딩을 위해 증식시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 또는 다양한 진핵생물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소세포(CHO), 곤충세포 등을 포함한다. 예를 들어 폴리펩타이드를, 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성시킬 수 있다. 발현 후에, 상기 폴리펩타이드를 용해성 분획 중의 세균세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제시킬 수 있다. 원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모가, "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩타이드 생성을 생성시키는 글리코실화 경로를 갖는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 폴리펩타이드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 문헌[Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)]을 참조하시오. (글리코실화된) 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,959,177 호, 미국특허 제 6,040,498 호, 미국특허 제 6,420,548 호, 미국특허 제 7,125,978 호, 및 미국특허 제 6,417,429 호(트랜스제닉 식물에서 항체의 생성을 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)(상표)를 기재한다)를 참조하시오. 척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장하기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7); 인간 배아신장 계통(예를 들어 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 T 세포), 아기 햄스터 신장세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(VERO-76), 인간 경부암종 세포(HELA), 개 신장세포(MDCK), 버팔로 래트 간세포(BRL 3A), 인간 폐세포(W138), 인간 간세포(Hep G2), 마우스 유방종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들어 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, dhfr^- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]) 포함; 및 골수종 세포주, 예를 들어 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0를 포함한다. 단백질 생성에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주의 리뷰에 대해서, 예를 들어 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조하시오. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 몇 가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포, 및 또한 트랜스제닉 동물, 트렌스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프성 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다.In a further embodiment, a host cell comprising one or more polynucleotides described herein is provided. In some embodiments, a host cell comprising one or more vectors described herein is provided. The polynucleotides and vectors may comprise any one of the features described herein, alone or in combination, with respect to the polynucleotides and vectors, respectively. In one such embodiment, the host cell comprises (eg, transformed or transfected with) a vector comprising a polynucleotide encoding an immunocytokine (part thereof) described herein. As used herein, the term “host cell” refers to any type of cell line that can be engineered to produce an immunocytokine or fragment thereof. Suitable host cells for replicating and supporting expression of immunocytokines are well known in the art. Such cells can be suitably transfected or transduced with a specific expression vector, and large amounts of vector-containing cells can be propagated for seeding in large-scale fermenters to obtain sufficient amounts of immunocytokine for clinical use. . Suitable host cells include prokaryotic microorganisms such as Escherichia coli, or various eukaryotic cells such as Chinese Hamster Ovary Cells (CHO), insect cells, and the like. For example, polypeptides can be produced in bacteria, particularly when glycosylation is not required. After expression, the polypeptide can be isolated from the bacterial cell paste in the soluble fraction and further purified. In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms, such as filamentous fungi or yeast, are "humanized", including fungi and yeast strains, which have glycosylation pathways that result in the production of polypeptides with partial or complete human glycosylation patterns. A suitable cloning or expression host for a peptide-encoding vector. See Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), and Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Suitable host cells for expression of (glycosylated) polypeptides are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates). Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. A number of baculovirus strains have been identified that can be used for transfection of insect cells, in particular Spodoptera frugiperda cells. Plant cell cultures can also be used as hosts. For example, US Pat. No. 5,959,177, US Pat. No. 6,040,498, US Pat. No. 6,420,548, US Pat. No. 7,125,978, and US Pat. No. 6,417,429 (PLANTIBODIES for the production of antibodies in transgenic plants) ( trademark)). Vertebrate cells can also be used as hosts. For example, mammalian cell lines suitable for growth in suspension may be useful. Other examples of useful mammalian host cell lines include the monkey kidney CV1 line transformed by SV40 (COS-7); Human embryonic kidney lineage (eg 293 or 293 T cells as described in Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), baby hamster kidney cells (BHK), mouse Sertoli cells (eg, TM4 cells as described for example in Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), monkey kidney cells (CV1), African green monkey kidney cells (VERO-76), human cervical carcinoma cells (HELA) , canine kidney cells (MDCK), buffalo rat hepatocytes (BRL 3A), human lung cells (W138), human hepatocytes (Hep G2), mouse mammary tumor cells (MMT 060562), TRI cells (eg Mather et al. ., Annals NY Acad Sci 383, 44-68 (1982)), MRC 5 cells and FS4 cells. Other useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) cells, dhfr ^- CHO cells (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); and myeloma cell lines such as YO, NS0, P3X63 and Sp2/0. For a review of several mammalian host cell lines suitable for protein production, see, eg, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]. Host cells include cultured cells, such as mammalian cultured cells, yeast cells, insect cells, bacterial cells and plant cells, and also transgenic animals, transgenic plants or cultured plants or animal tissues, to name a few. containing cells. In one embodiment, said host cell is a eukaryotic cell, preferably a mammalian cell, such as a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, a human embryonic kidney (HEK) cell or a lymphoid cell (eg Y0, NS0). , Sp20 cells).

이들 시스템에서 외부 유전자를 발현시키는 표준 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 세포를, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 모두 갖는 항체이도록 항체 쇄의 다른 쇄를 또한 발현하도록 조작할 수 있다.Standard techniques for expressing foreign genes in these systems are known in the art. Cells expressing a polypeptide comprising a heavy or light chain of an antibody can be engineered to also express other chains of the antibody chain such that the expressed product is an antibody having both heavy and light chains.

본 명세서에 기재된 면역사이토카인의 생성 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 면역사이토카인의 발현에 적합한 조건하에서, 본 명세서에 제공된 바와 같이, 상기 면역사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 면역사이토카인을 회수함을 포함한다.Provided herein is a method for producing an immunocytokine described herein, wherein the method comprises a host cell comprising a polynucleotide encoding said immunocytokine, as provided herein, under conditions suitable for expression of said immunocytokine culturing, and recovering the immunocytokine from the host cell (or host cell culture medium).

면역사이토카인의 성분들은 유전학적으로 서로에 융합된다. 면역사이토카인을, 그의 성분들이 서로에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계할 수 있다. 상기 링커의 조성 및 길이를 당해 분야에 주지된 방법에 따라 결정할 수 있으며 효능에 대해 시험할 수 있다. 경우에 따라 상기 융합의 개별적인 성분을 분리시키기 위해 절단 부위를 통합시키기 위한 추가적인 서열, 예를 들어 엔도펩티다제 인식 서열을 포함시킬 수 있다.Components of immune cytokines are genetically fused to each other. Immunocytokines can be designed such that their components are fused to each other either directly or indirectly through linker sequences. The composition and length of the linker can be determined according to methods well known in the art and tested for efficacy. Optionally, additional sequences to incorporate cleavage sites, such as an endopeptidase recognition sequence, may be included to separate the individual components of the fusion.

면역사이토카인은 적어도, 항원성 결정인자와 결합할 수 있는 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비-천연 항체 및 그의 단편의 부분을 형성하며 상기로부터 유래될 수 있다. 다클론 항체 및 단클론 항체의 생성 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참조하시오). 비-천연 항체를 고상-펩타이드 합성을 사용하여 구성하거나, 재조합적으로 생성시키거나(예를 들어 미국특허 제 4,186,567 호에 기재된 바와 같이) 또는 예를 들어 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 선별함으로써 수득할 수 있다(예를 들어 맥카퍼티(McCafferty)의 미국특허 제 5,969,108 호를 참조하시오). 항원 결합 부분 및 그의 생성 방법이 또한 PCT 공보 WO 2011/020783에 상세히 기재되어 있으며, 상기 공보의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 인용된다.The immunocytokine comprises at least an antibody variable region capable of binding an antigenic determinant. Variable regions form part of, and may be derived from, native or non-native antibodies and fragments thereof. Methods for producing polyclonal and monoclonal antibodies are well known in the art (see, eg, Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Non-native antibodies may be constructed using solid-phase-peptide synthesis, generated recombinantly (eg, as described in U.S. Patent No. 4,186,567), or combinatorial libraries comprising, for example, variable heavy and variable light chains are constructed can be obtained by screening (see, eg, US Pat. No. 5,969,108 to McCafferty). Antigen binding moieties and methods for their production are also described in detail in PCT Publication WO 2011/020783, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역을 본 명세서에 기재된 면역사이토카인에 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 비-제한적인 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 쥐, 영장류 또는 인간 기원의 것일 수 있다. 상기 면역사이토카인을 인간 용도에 사용하고자 하는 경우, 항체의 불변 영역이 인간으로부터 유래하는 키메라 형태의 항체를 사용할 수 있다. 인간화된 또는 완전한 인간 형태의 항체를 또한 당해 분야에 주지된 방법에 따라 제조할 수 있다(예를 들어 윈터(Winter)의 미국특허 제 5,565,332 호를 참조하시오). 인간화는 비제한적으로, (a) 비-인간(예를 들어 공여 항체) CDR을, 중요한 프레임워크 잔기(예를 들어 양호한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 것들)를 유지하면서 또는 상기 유지 없이 인간(예를 들어 수용 항체) 프레임워크 및 불변 영역상에 접목시키거나, (b) 오직 비-인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변 영역상에 접목시키거나, (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식시키지만, 상기 도메인을 표면 잔기의 교체에 의해 인간-유사 섹션으로 "은폐시킴(cloaking)"을 포함한 다양한 방법에 의해 성취될 수 있다. 인간화된 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 리뷰되어 있으며, 예를 들어 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국특허 제 5,821,337 호, 미국특허 제 7,527,791 호, 미국특허 제 6,982,321 호, 및 미국특허 제 7,087,409 호; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)]; 문헌[Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)]; 문헌[Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)]; 문헌[Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)]; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)](SDR(a-CDR) 접목을 기재한다); 문헌[Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)]("재포장(resurfacing)"을 기재한다); 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기재한다); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법을 기재한다)에 추가로 기재되어 있다. 인간 항체 및 인간 가변 영역을 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 일반적으로 기재되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단클론 항체의 부분을 형성하고 상기로부터 유래될 수 있다(예를 들어 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]을 참조하시오). 인간 항체 및 인간 가변 영역을 또한, 온전한 인간 항체, 또는 항원 공격에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형시킨 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다(예를 들어 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)]을 참조하시오). 인간 항체 및 인간 가변 영역을 또한, 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리 중에서 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 생성시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]; 및 문헌[McCafferty et al., Nature 348, 552-554]; 문헌[Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)]을 참조하시오). 파지는 전형적으로 항체 단편을 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 내보인다. 파지 디스플레이에 의한 면역접합체에 대한 항원 결합 부분의 제조에 대한 상세한 기재를 PCT 공보 WO 2011/020783에 첨부된 실시예에서 찾을 수 있다.Antibodies, antibody fragments, antigen binding domains or variable regions of any animal species can be used in the immunocytokines described herein. Non-limiting antibodies, antibody fragments, antigen binding domains or variable regions useful in the present invention may be of murine, primate or human origin. When the immunocytokine is intended to be used for human use, a chimeric antibody in which the constant region of the antibody is derived from a human may be used. Humanized or fully human forms of antibodies may also be prepared according to methods well known in the art (see, eg, US Pat. No. 5,565,332 to Winter). Humanization includes, but is not limited to, (a) maintaining or maintaining non-human (eg, donor antibody) CDRs with important framework residues (eg, those important for maintaining good antigen binding affinity or antibody function). grafted onto human (eg recipient antibody) frameworks and constant regions without, or (b) only non-human specificity-determining regions (SDRs or a-CDRs; residues important for antibody-antigen interactions) in a human frame By various methods including grafting onto work and constant regions, or (c) grafting the entire non-human variable domain but “cloaking” the domain into a human-like section by replacement of surface residues. can be achieved Humanized antibodies and methods of making them are reviewed, e.g., in Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), e.g., Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (Riechmann et al., Nature 332, 323-329 ( 1988)]; Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Pat. No. 5,821,337, US Pat. No. 7,527,791, US Pat. No. 6,982,321, and US Pat. No. 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (describing SDR (a-CDR) grafting); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (describing "resurfacing"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (describing "FR shuffling"); and Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (“guided selection” approaches to FR shuffling) ) are further described. Human antibodies and human variable regions can be generated using a variety of techniques known in the art. Human antibodies are generally described in van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) and Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Human variable regions form part of and can be derived from human monoclonal antibodies prepared by the hybridoma method (see, e.g., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987)). Human antibodies and human variable regions can also be prepared by administering immunogen to intact human antibodies, or transgenic animals that have been modified to produce intact antibodies with human variable regions in response to antigen challenge (see, e.g., Lonberg , Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)). Human antibodies and human variable regions can also be generated by isolating Fv clone variable region sequences selected from human-derived phage display libraries (see, e.g., Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37). (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); and McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624- 628 (1991)). Phages typically display antibody fragments either as single chain Fv (scFv) fragments or as Fab fragments. A detailed description of the preparation of antigen binding moieties for immunoconjugates by phage display can be found in the examples attached to PCT publication WO 2011/020783.

몇몇 실시태양에서, 항체를 예를 들어 PCT 공보 WO 2011/020783(친화성 성숙화에 관한 실시예를 참조하시오) 또는 미국특허 출원 공보 제 2004/0132066 호(이들의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 인용된다)에 개시된 방법에 따라 증대된 결합 친화성을 갖도록 조작한다. 특정한 항원성 결정인자에 결합하는 면역사이토카인의 능력을 효소-연계된 면역흡수 분석(ELISA) 또는 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 다른 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기법(비아코어 T100 시스템상에서 분석됨)(문헌[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]), 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정할 수 있다. 경쟁 분석을 사용하여, 특정 항원에의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들어 CEA에의 결합에 대해 CH1A1A 98/99 2F1 항체와 경쟁하는 항체를 식별할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기와 같은 경쟁 항체는 상기 참조 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 예시적인 상세한 맵핑 방법이 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다. 예시적인 경쟁 분석에서, 고정화된 항원(예를 들어 CEA)을 상기 항원에 결합하는 제1 표지 항체(예를 들어 CH1A1A 98/99 2F1 항체) 및 상기 항원에의 결합에 대해 상기 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험하고자 하는 제2 비표지 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조용으로서, 고정화된 항원을, 상기 제1 표지 항체는 포함하지만 상기 제2 비표지 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. 상기 항원에 대한 제1 항체의 결합에 허용성인 조건하에서 배양 후에, 과잉의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정화된 항원과 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 항원과 회합된 표지의 양이 대조용 샘플에 비해 시험 샘플 중에서 실질적으로 감소하는 경우, 이는 상기 제2 항체가 상기 제1 항체와, 항원에의 결합에 대해 경쟁하고 있음을 가리킨다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조하시오.In some embodiments, the antibody is prepared in, for example, PCT Publication No. WO 2011/020783 (see Examples regarding affinity maturation) or U.S. Patent Application Publication No. 2004/0132066, the entire contents of which are incorporated herein by reference. It is engineered to have enhanced binding affinity according to the method disclosed in ). The ability of an immunocytokine to bind to a specific antigenic determinant is assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or other techniques familiar to those skilled in the art, such as surface plasmon resonance techniques (analyzed on a Biacore T100 system). ) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), and traditional binding assays (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). . Competition assays are used to identify antibodies, antibody fragments, antigen binding domains or variable domains that compete with a reference antibody for binding to a specific antigen, e.g., antibodies that compete with the CH1A1A 98/99 2F1 antibody for binding to CEA can do. In some embodiments, such a competing antibody binds to the same epitope (eg, a linear or conformational epitope) that is bound by the reference antibody. Exemplary detailed mapping methods for epitopes to which antibodies bind are described in Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). In an exemplary competition assay, an immobilized antigen (eg CEA) competes with a first labeled antibody (eg CH1A1A 98/99 2F1 antibody) that binds to said antigen and said first antibody for binding to said antigen Incubate in a solution containing the second unlabeled antibody to be tested for its ability to act. The second antibody may be present in the hybridoma supernatant. As a control, the immobilized antigen is cultured in a solution containing the first labeled antibody but not the second unlabeled antibody. After incubation under conditions permissive for binding of the first antibody to the antigen, excess unbound antibody is removed, and the amount of label associated with the immobilized antigen is measured. If the amount of label associated with the immobilized antigen is substantially reduced in the test sample compared to the control sample, it indicates that the second antibody is competing with the first antibody for binding to the antigen. See Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

본 명세서에 기재된 바와 같이 제조된 면역사이토카인을 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 젤 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 요인에 따라 변할 것이며, 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제를 위해서 면역사이토카인이 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 면역사이토카인의 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 기질을 사용할 수 있다. WO 2012/146628의 실시예에 필수적으로 기재된 바와 같이 순차적인 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 면역사이토카인을 단리할 수 있다. 상기 면역사이토카인의 순도를 젤 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 다양한 주지된 분석 방법 중 어느 하나에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 면역사이토카인은 환원성 SDS-PAGE에 의해 입증된 바와 같이 온전하고 적합하게 조립된 것으로 입증될 수 있다.The immunocytokine prepared as described herein can be purified by techniques known in the art, for example, high performance liquid chromatography, ion exchange chromatography, gel electrophoresis, affinity chromatography, size exclusion chromatography, and the like. there is. The actual conditions used for the purification of a particular protein will depend in part on factors such as net charge, hydrophobicity, hydrophilicity, etc., and will be apparent to those skilled in the art. For affinity chromatography purification, an antibody, ligand, receptor or antigen to which an immunocytokine binds may be used. For example, in the case of affinity chromatography purification of immunocytokine, a substrate having protein A or protein G may be used. Sequential Protein A or G affinity chromatography and size exclusion chromatography can be used to isolate immunocytokines as essentially described in the Examples of WO 2012/146628. The purity of the immunocytokine may be measured by any one of various well-known analytical methods including gel electrophoresis, high pressure liquid chromatography, and the like. For example, an immunocytokine can be demonstrated to be intact and properly assembled as demonstrated by reductive SDS-PAGE.

본 명세서에 기재된 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 WO 2018/184964에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines described herein can be prepared as described in WO 2018/184964.

본 명세서에 기재된 항체를 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생성시킨다. 상기와 같은 방법은 현재의 기술적 수준에서 광범위하게 공지되어 있으며 원핵생물 및 진핵생물 세포에서의 단백질 발현에 이어서 항체 폴리펩타이드의 단리 및 대개는 약학적으로 허용 가능한 순도로의 정제를 포함한다. 단백질 발현의 경우 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터내에 삽입시킨다. 발현을 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모, 또는 에스케리키아 콜라이 세포에서 수행하고, 항체를 상기 세포로부터(상등액으로부터 또는 세포 용해 후에) 회수한다.The antibodies described herein are preferably produced by recombinant means. Such methods are widely known at the state of the art and include expression of the protein in prokaryotic and eukaryotic cells followed by the isolation and usually purification of the antibody polypeptide to a pharmaceutically acceptable purity. For protein expression, nucleic acids encoding light and heavy chains or fragments thereof are inserted into expression vectors by standard methods. Expression is carried out in a suitable prokaryotic or eukaryotic host cell, such as a CHO cell, NS0 cell, SP2/0 cell, HEK293 cell, COS cell, yeast, or Escherichia coli cell, and the antibody is isolated from the cell (supernatant). from or after cell lysis).

항체의 재조합 생성은 현재의 기술적 수준에서 주지되어 있으며 예를 들어 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202]; 문헌[Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; 문헌[Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161]; 문헌[Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]의 리뷰 논문에 기재되어 있다.Recombinant production of antibodies is well known at the state of the art and is described, for example, in Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202]; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161]; Werner, R. G., Drug Res. 48 (1998) 870-880].

항체는 완전 세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제를 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해서, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 젤 전기영동을 포함한 표준 기법, 및 당해 분야에 주지된 다른 기법들에 의해 수행한다. 문헌[Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조하시오.Antibodies may be present in whole cells, in cell lysates, or in partially purified or substantially pure form. Purification to remove other cellular components or other contaminants such as other cellular nucleic acids or proteins, alkali/SDS treatment, CsCl banding, column chromatography, standard techniques including agarose gel electrophoresis, and well known in the art. performed by other methods. Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

NS0 세포에서의 발현은 예를 들어 문헌[Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123]; 문헌[Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 기재되어 있다. 일시적 발현은 예를 들어 문헌[Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌[Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837]; 문헌[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 문헌[Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템(HEK 293)은 문헌[Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 문헌[Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 기재되어 있다.Expression in NS0 cells is described, for example, in Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L. M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Transient expression is described, for example, in Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Cloning of variable domains is described in Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837]; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. A preferred transient expression system (HEK 293) is described in Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 and Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

본 발명에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 프로모터, 번역 개시, 불변 영역, 3' 번역되지 않은 영역, 폴리아데닐화, 및 전사 종결의 서열들과 조합하여 발현 벡터 구조물을 형성시킨다. 상기 중쇄 및 경쇄 발현 구조물을 숙주 세포내에 동시-형질감염된, 연속적으로 형질감염된, 또는 별도로 형질감염된 단일 벡터내에 조합시키고 이어서 융합시켜 상기 두 쇄를 모두 발현하는 단일 숙주 세포를 형성시킨다.The heavy and light chain variable domains according to the present invention are combined with the sequences of promoter, translation initiation, constant region, 3' untranslated region, polyadenylation, and transcription termination to form an expression vector construct. The heavy and light chain expression constructs are combined in a single vector co-transfected, serially transfected, or separately transfected into a host cell and then fused to form a single host cell expressing both chains.

원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 인헨서 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 공지되어 있다.Regulatory sequences suitable for prokaryotes include, for example, promoters, optionally operator sequences, and ribosome binding sites. Eukaryotic cells are known to use promoters, enhancers and polyadenylation signals.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동적으로 연결된다". 예를 들어 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 상기가 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우 상기 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 인헨서는 상기가 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 서열에 작동적으로 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 상기가 번역을 촉진하도록 위치될 때 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열들이 인접하고, 분비 리더의 경우에, 인접하고 판독 프레임 중에 있음을 의미한다. 그러나, 인헨서는 인접해야할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 수행된다. 상기와 같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 실행에 따라 사용한다.A nucleic acid is "operably linked" when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, DNA for a presequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a preprotein involved in secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of said sequence; A ribosome binding site is operably linked to a coding sequence when it is positioned to facilitate translation. In general, "operably linked" means that the DNA sequences being linked are contiguous and, in the case of a secretory leader, contiguous and in reading frame. However, enhancers need not be contiguous. Linkage is accomplished by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional practice.

단클론 항체를 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리시킨다. 상기 단클론 항체를 암호화하는 DNA 및 RNA는 통상적인 과정에 의해 쉽게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 상기와 같은 DNA 및 RNA의 공급원으로서 제공될 수 있다. 상기 DNA를 일단 단리하였으면 발현 벡터내에 삽입시킬 수 있으며, 이어서 상기를 달리 면역글로불린 단백질을 생성시키지 않는 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내에 형질감염시켜 상기 숙주 세포에서 재조합 단클론 항체의 합성을 획득한다.Monoclonal antibodies are suitably separated from the culture medium by conventional immunoglobulin purification procedures such as protein A-sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography. DNA and RNA encoding the monoclonal antibodies are readily isolated and sequenced by conventional procedures. Hybridoma cells can serve as a source of such DNA and RNA. Once isolated, the DNA can be inserted into an expression vector, which is then transfected into a host cell, such as HEK 293 cells, CHO cells, or myeloma cells, that otherwise does not produce immunoglobulin proteins, and the recombinant monoclonal antibody in the host cells. to obtain a synthesis of

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"이란 표현은 호환 가능하게 사용되며 상기와 같은 명칭은 모두 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달 수에 관계 없이 1차 피실험자 세포 및 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 의도적이거나 우연한 돌연변이로 인해, DNA 함량이 정확하게 일치하지 않을 수도 있음을 이해한다. 최초로 형질전환된 세포에서 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 변형 자손이 포함된다.As used herein, the terms “cell,” “cell line,” and “cell culture” are used interchangeably and all such designations include progeny. Accordingly, "transformants" and "transformed cells" include primary subject cells and cultures derived therefrom, regardless of the number of transfers. It is also understood that all progeny may not have exact DNA content matches due to intentional or accidental mutations. Modified progeny having the same function or biological activity as selected in the originally transformed cell are included.

치료 방법 및 조성물Treatment methods and compositions

본 발명은 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의, 본 발명에 따른 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법을 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 치료 방법을 포함한다.The present invention is characterized in that a therapeutically effective amount of a combination therapy of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine according to the invention and an antibody binding to human PD-L1 is administered to a patient in need thereof, and methods of treating said patient.

본 발명은 상기 기재된 병용 요법을 위한 본 발명에 따른 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 용도를 포함한다.The present invention includes the use of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine according to the invention with an antibody that binds to human PD-L1 for the combination therapy described above.

본 발명의 하나의 바람직한 실시태양은 암 또는 종양의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법이다.One preferred embodiment of the present invention is a combination therapy of a PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine of the invention for use in the treatment of cancer or tumors with an antibody that binds to human PD-L1.

따라서, 본 발명의 하나의 실시태양은 본 명세서에 기재된 바와 같이 항-PD-L1 항체와 함께 암 또는 종양의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인이다.Accordingly, one embodiment of the invention provides a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine described herein for use in the treatment of cancer or tumors in combination with an anti-PD-L1 antibody as described herein. am.

본 발명의 또 다른 실시태양은 본 명세서에 기재된 바와 같이 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 함께 암 또는 종양의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 항-PD-L1 항체이다.Another embodiment of the invention is an anti-PD-L1 antibody as described herein for use in the treatment of cancer or tumors in combination with a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein.

상기 암 또는 종양은 종양 세포 환경에, 예를 들어 PD-1+ T 세포상에 항원을 제시할 수 있다. 상기 병용 요법의 표적으로서 PD-1은 종양 세포 환경에, 예를 들어 PD-1+ T 세포 중에 제시될 수 있다. 상기 치료는 고형 종양의 치료일 수 있다. 상기 치료는 암종의 치료일 수 있다. 상기 암은 대장암, 두경부암, 비 소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 간암 및 위암으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 상기 암은 폐암, 결장암, 위암, 유방암, 두경부암, 피부암, 간암, 신장암, 전립선암, 췌장암, 뇌암 및 골격근암으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.The cancer or tumor may present antigens to the tumor cell environment, eg, on PD-1+ T cells. As a target of the combination therapy, PD-1 can be presented in the tumor cell environment, for example in PD-1+ T cells. The treatment may be treatment of a solid tumor. The treatment may be a treatment for carcinoma. The cancer may be selected from the group consisting of colorectal cancer, head and neck cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, liver cancer, and stomach cancer. The cancer may be selected from the group consisting of lung cancer, colon cancer, stomach cancer, breast cancer, head and neck cancer, skin cancer, liver cancer, kidney cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, brain cancer, and skeletal muscle cancer.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "암"이란 용어는 예를 들어 폐암, 비 소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위암, 위암, 위장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신세포 암종, 신우암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척추 종양, 뇌간 교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 슈반종, 뇌실막종, 수모세포종, 수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 선종, 림프종, 림프구성 백혈병, 및 상기 암 중 어느 하나의 불응성 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합일 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기와 같은 암은 유방암, 대장암, 흑색종, 두경부암, 폐암 또는 전립선암이다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기와 같은 암은 유방암, 난소암, 자궁경부암, 폐암 또는 전립선암이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기와 같은 암은 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 흑색종암, 방광암, 신세포암, 신장암, 간암, 두경부암, 대장암, 췌장암, 위암종 암, 식도암, 중피종, 전립선암, 백혈병, 림프종, 골수종이다.The term "cancer" as used herein includes, for example, lung cancer, non-small cell lung (NSCL) cancer, bronchoalveolar cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer , rectal cancer, anal area cancer, stomach cancer, gastrointestinal cancer, colon cancer, breast cancer, uterine cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine system cancer, thyroid cancer, thyroid cancer Thyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, mesothelioma, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, neoplasm of the central nervous system (CNS), spinal tumor, brainstem glioma, glioblastoma multiforme, astrocytoma, Schwannoma, ependymoma, medulloblastoma, meningioma, squamous cell carcinoma, pituitary adenoma, lymphoma, lymphocytic leukemia, and a refractory version of any one of the above cancers, or one of the above cancers It may be a combination of the above. In one preferred embodiment, such cancer is breast cancer, colorectal cancer, melanoma, head and neck cancer, lung cancer or prostate cancer. In one preferred embodiment, such cancer is breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, lung cancer or prostate cancer. In another preferred embodiment, such cancer is breast cancer, lung cancer, colon cancer, ovarian cancer, melanoma cancer, bladder cancer, renal cell cancer, kidney cancer, liver cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, gastric carcinoma cancer, esophageal cancer, mesothelioma , prostate cancer, leukemia, lymphoma, and myeloma.

본 발명의 실시태양은 상술한 암 또는 종양 중 어느 하나의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체와 병용되는 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인이다.An embodiment of the invention provides a PD-1-targeted IL-2 as described herein in combination with an anti-PD-L1 antibody as described herein for use in the treatment of any one of the aforementioned cancers or tumors. It is a mutant immune cytokine.

본 발명의 또 다른 실시태양은 상술한 암 또는 종양 중 어느 하나의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 병용되는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체이다.Another embodiment of the present invention provides a method as described herein in combination with a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein for use in the treatment of any one of the aforementioned cancers or tumors. It is an anti-PD-L1 antibody.

본 발명은 암 치료를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체와의 병용 요법을 포함한다.The present invention encompasses combination therapy of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein with an anti-PD-L1 antibody as described herein for the treatment of cancer.

본 발명은 전이의 예방 또는 치료를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체와의 병용 요법을 포함한다.The present invention encompasses combination therapy of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein with an anti-PD-L1 antibody as described herein for the prevention or treatment of metastasis.

본 발명은 면역 반응 또는 기능, 예를 들어 T 세포 활성의 자극에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체와의 병용 요법을 포함한다.The present invention relates to a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein for use in the stimulation of an immune response or function, eg, T cell activity, and an anti-PD- as described herein. combination therapy with an L1 antibody.

본 발명은 암 치료가 필요한 환자에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체를 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 암 치료 방법을 포함한다.The present invention relates to a patient in need of cancer treatment, characterized in that the PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine as described herein and an anti-PD-L1 antibody as described herein are administered, a method of treating cancer in a patient.

본 발명은 전이의 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체를 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 전이의 예방 또는 치료 방법을 포함한다.The present invention comprises administering to a patient in need of prevention or treatment of metastases a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein and an anti-PD-L1 antibody as described herein. It includes a method for preventing or treating metastasis in the patient.

본 발명은 면역 반응 또는 기능, 예를 들어 T 세포 활성의 자극이 필요한 환자에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체를 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 상기 자극 방법을 포함한다.The present invention provides a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein and an anti-PD- as described herein to a patient in need of stimulation of an immune response or function, eg, T cell activity. and the method for stimulating the patient, characterized in that the L1 antibody is administered.

본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-1 L1 항체와 함께 암 치료에 사용하기 위한, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체와 함께 암 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함한다.The present invention provides the present invention for use in the treatment of cancer in combination with an anti-PD-1 L1 antibody as described herein, or for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer in combination with an anti-PD-L1 antibody as described herein. PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines as described herein.

본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-1 L1 항체와 함께 전이의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 또는 한편으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체와 함께 전이의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함한다.The present invention provides for use in the prophylaxis or treatment of metastases with an anti-PD-1 L1 antibody as described herein, or alternatively for the prevention or treatment of metastases with an anti-PD-L1 antibody as described herein. PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein for the manufacture of a medicament for

본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-1 L1 항체와 함께 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극에 사용하기 위한, 또는 한편으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체와 함께 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함한다.The present invention provides for use in the stimulation of an immune response or function, such as T cell activity, together with an anti-PD-1 L1 antibody as described herein, or on the other hand an anti-PD-L1 antibody as described herein; together with a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein for the manufacture of a medicament for use in stimulation of an immune response or function, such as T cell activity.

본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 함께 암의 치료에 사용하기 위한, 또는 한편으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 함께 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체를 포함한다.The present invention provides for use in the treatment of cancer in combination with a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein, or on the one hand PD-1-targeted IL-2 as described herein. anti-PD-L1 antibodies as described herein for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer with a variant immunocytokine.

본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 함께 전이의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 또는 한편으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 함께 전이의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체를 포함한다.The present invention provides for use in the prophylaxis or treatment of metastasis with a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein, or on the one hand PD-1-targeted IL as described herein -2 anti-PD-L1 antibody as described herein for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of metastasis together with a mutant immunocytokine.

본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 함께 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극에 사용하기 위한, 또는 한편으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과 함께 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체를 포함한다.The present invention provides for use in the stimulation of an immune response or function, such as T cell activity, in combination with a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein, or on the one hand, a PD as described herein. anti-PD-L1 antibodies as described herein for the manufacture of a medicament for use in the stimulation of an immune response or function, such as T cell activity, together with a -1-targeted IL-2 variant immunocytokine.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상술한 병용 치료 및 상이한 질병의 의학적 용도에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인이며, 상기와 같은 병용 치료에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.In a preferred embodiment of the present invention, the PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine used for the aforementioned combination therapy and medical use of different diseases comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 It is a PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine, characterized in that it comprises It is characterized in that it comprises a light chain variable domain VL of 16.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상술한 병용 치료 및 상이한 질병의 의학적 용도에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인이며, 상기와 같은 병용 치료에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 아테졸리주맙이다.In a preferred embodiment of the present invention, the PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine used for the aforementioned combination therapy and medical use of different diseases comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 It is a PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine comprising a, and the antibody that binds to human PD-L1 used for such combination therapy is atezolizumab.

또 다른 태양에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein and human PD-L1 as described herein formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier. A composition containing an antibody or antigen-binding portion thereof that binds to, for example, a pharmaceutical composition is provided.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 적합한 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수/재흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 상기 담체는 주사 또는 주입에 적합하다.As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier" includes all physiologically compatible solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption/resorption delaying agents, and the like. Preferably, the carrier is suitable for injection or infusion.

본 발명의 조성물을 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있다. 숙련가에 의해 인식되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 변할 것이다.The composition of the present invention may be administered by a variety of methods known in the art. As will be appreciated by the skilled artisan, the route and/or mode of administration will vary depending on the desired result.

약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사성 용액 또는 분산액의 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 상기와 같은 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 담체는 물 외에, 예를 들어 등장성 완충 염수 용액일 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions or dispersions. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is known in the art. The carrier may be, in addition to water, for example an isotonic buffered saline solution.

선택된 투여 경로와 상관없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학 조성물을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여형으로 제형화한다.Irrespective of the route of administration selected, the compounds of the present invention, which can be used in a suitable hydrated form, and/or pharmaceutical compositions of the present invention, can be converted into pharmaceutically acceptable dosage forms by conventional methods known to those skilled in the art. formulate

본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준을, 환자에게 독성이지 않으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료학적 반응을 성취하기에 유효한 상기 활성 성분의 양(유효량)을 획득하도록 변화시킬 수 있다. 상기 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출율, 상기 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반적인 건강 및 선행 병력을 포함한 다양한 약동학적 요인, 및 의학 분야에 주지된 유사한 요인에 따라 변할 것이다.The actual dosage level of the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention is obtained by obtaining an amount (effective amount) of the active ingredient effective to achieve the desired therapeutic response for a particular patient, composition and mode of administration without being toxic to the patient. can be changed to The selected dosage level will depend on the activity of the particular composition of the present invention, or ester, salt or amide thereof, used, route of administration, time of administration, rate of excretion of the particular compound employed, other drugs, compounds used with the particular composition employed. and/or the substance, various pharmacokinetic factors including the age, sex, weight, condition, general health and prior medical history of the patient being treated, and similar factors well known in the medical arts.

하나의 태양에서, 본 발명은 동일하거나 별도의 용기에 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인, 및 (b) 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하고, 임의로 (c) 질병의 치료 방법으로서 병용 치료의 사용을 지시하는 인쇄된 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는, 질병 치료용 키트를 제공한다. 더욱이, 상기 키트는 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; (b) 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함하는 조성물을 함유하는 제2 용기; 및 임의로 (c) 추가적인 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제3 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시태양에서, 키트는 조성물을 특정 상태의 치료에 사용할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 키트는 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 세균발육저지성 주사용수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제3(또는 제4) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the invention provides, in the same or separate containers, (a) a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein, and (b) human PD- as described herein Provided is a kit for the treatment of a disease comprising an antibody that binds to L1, and optionally (c) a package insert comprising printed instructions directing the use of combination therapy as a method of treating the disease. Moreover, the kit comprises (a) a first container containing a composition comprising an antibody that binds to human PD-L1 as described herein; (b) a second container containing a composition comprising a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein; and optionally (c) a third container containing a composition comprising an additional cytotoxic or other therapeutic agent. In this embodiment of the invention, the kit may further comprise a package insert indicating that the composition can be used for the treatment of a particular condition. Alternatively, or in addition, the kit may comprise a third (or fourth) comprising a pharmaceutically acceptable buffer such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate-buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. ) may further include a container. It may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, such as other buffers, diluents, filters, needles and syringes.

하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함하는 용기, 및 (b) 질병의 치료를 위한 방법으로서 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체와의 병용 요법에서 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인의 용도를 지시하는 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는, 상기 질병 치료용 키트를 제공한다.In one aspect, the invention provides (a) a container comprising a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein, and (b) a method for the treatment of a disease described herein. Provided is a kit for treating said disease comprising a package insert comprising instructions directing the use of the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination therapy with an anti-PD-L1 antibody as described above.

또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체를 포함하는 용기, 및 (b) 질병의 치료를 위한 방법으로서 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과의 병용 요법에서 항-PD-L1 항체의 용도를 지시하는 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는, 상기 질병 치료용 키트를 제공한다.In another aspect, the invention provides (a) a container comprising an anti-PD-L1 antibody as described herein, and (b) PD-1-targeting as described herein as a method for the treatment of a disease. Provided is a kit for the treatment of the above disease, comprising a package insert comprising instructions for use of the anti-PD-L1 antibody in combination therapy with an IL-2 mutant immunocytokine.

추가의 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함하는 질병 치료용 약제를 제공하며, 여기에서 상기 약제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법에 사용하기 위한 것이며, 상기 질병의 치료 방법으로서 병용 치료의 사용을 지시하는 인쇄된 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 임의로 포함한다.In a further aspect, the present invention provides a medicament for the treatment of a disease comprising a PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine as described herein, wherein said medicament comprises a human as described herein. for use in combination therapy with an antibody that binds PD-L1, optionally comprising a package insert comprising printed instructions directing the use of the combination therapy as a method of treatment of said disease.

더욱 추가의 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하는 질병 치료용 약제를 제공하며, 여기에서 상기 약제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과의 병용 요법에 사용하기 위한 것이며, 상기 질병의 치료 방법으로서 병용 치료의 사용을 지시하는 인쇄된 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 임의로 포함한다.In a still further aspect, the present invention provides a medicament for the treatment of a disease comprising an antibody that binds to human PD-L1 as described herein, wherein said medicament is PD-1-targeting as described herein. for use in combination therapy with an IL-2 variant immunocytokine, optionally comprising a package insert comprising printed instructions directing the use of the combination therapy as a method of treatment of said disease.

"치료 방법"이란 용어 또는 그의 등가어는 예를 들어 암에 적용될 때, 환자에서 암세포의 수를 감소 또는 제거하거나, 암의 증상을 경감시키는 시술 또는 작용 과정을 지칭한다. 암 또는 또 다른 증식성 질환의 "치료 방법"은 암세포 또는 다른 질환이 실제로 제거되거나, 상기 세포의 수 또는 질환이 실제로 감소되거나, 암 또는 다른 질환의 증상이 실제로 경감됨을 반드시 의미하는 것은 아니다. 종종, 암의 치료 방법은 심지어 낮은 치료 가능성으로도 수행될 것이나, 그럼에도 불구하고 제공되는 환자의 병력 및 추정되는 생존 기대는 전체적으로 이로운 작용 과정을 유도하는 것으로 생각된다.The term “method of treatment” or its equivalent, when applied to, for example, cancer, refers to a procedure or process of action that reduces or eliminates the number of cancer cells in a patient or alleviates symptoms of cancer. A “method of treating” cancer or another proliferative disease does not necessarily mean that the cancer cells or other disease is actually eliminated, the number or disease of said cells is actually reduced, or the symptoms of the cancer or other disease are actually alleviated. Often, methods of treatment of cancer will be performed even with low curative potential, but nevertheless a given patient's medical history and estimated survival expectations are thought to lead to an overall beneficial course of action.

"와 함께 투여된" 또는 "공-투여", "공-투여하는", "병용 요법" 또는 "병용 치료"란 용어는 예를 들어 별도의 제형/적용으로서(또는 하나의 단일 제형/적용으로서) 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 PD-L1에 결합하는 항체의 투여를 지칭한다. 상기 공-투여는 동시적이거나 어느 한 순서로 순차적일 수 있으며, 여기에서 바람직하게는 두 활성제(또는 모든 활성제)가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 존재한다. 상기 활성제들은 동시에 또는 순차적으로(예를 들어 연속적인 주입을 통해 정맥내로(i.v.)) 공-투여된다. 상기 두 치료제를 모두 순차적으로 공-투여하는 경우에 용량은 2개의 별도의 투여에서 같은날에 투여되거나, 상기 작용제 중 하나는 제1일에, 두 번째는 제2일 내지 제7일, 바람직하게는 제2일 내지 제4일에 공-투여된다. 따라서, 하나의 실시태양에서, "순차적으로"란 용어는 제1 성분의 용량후 7일 이내, 바람직하게는 제1 성분의 용량후 4일 이내를 의미하며; "동시에"란 용어는 같은 시간을 의미한다. PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및/또는 항-PD-L1 항체의 유지 용량에 관하여 "공-투여"란 용어는 상기 유지 용량을, 치료 주기가 2개의 약물 모두에 적합한 경우 동시에, 예를 들어 매주 공-투여할 수 있음을 의미한다. 또는 상기 유지 용량을 순차적으로 공-투여한다, 예를 들어 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 항-PD-L1 항체의 용량을 격주로 제공한다.The terms “administered together” or “co-administration”, “co-administering”, “combination therapy” or “combination treatment” are used, for example, as separate formulations/applications (or as one single formulation/application). ) refers to the administration of an antibody that binds to a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein and to human PD-L1 as described herein. The co-administration may be simultaneous or sequential in either order, wherein preferably there is a period during which both active agents (or both active agents) exert their biological activity simultaneously. The active agents are co-administered simultaneously or sequentially (eg, intravenously (i.v.) via continuous infusion). When both said therapeutic agents are co-administered sequentially, the doses are administered on the same day in two separate administrations, or one of said agents on day 1 and the second on days 2-7, preferably is co-administered on days 2-4. Thus, in one embodiment, the term "sequentially" means within 7 days after the dose of the first component, preferably within 4 days after the dose of the first component; The term "at the same time" means the same time. The term "co-administration" with respect to a maintenance dose of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine and/or anti-PD-L1 antibody refers to such maintenance dose, when the treatment cycle is suitable for both drugs. At the same time, it means that it can be co-administered, for example weekly. or the maintenance doses are co-administered sequentially, eg, doses of the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine and anti-PD-L1 antibody are given every other week.

항체를 환자에게, 연구원, 수의학자, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 각 화합물 또는 조합의 양인 "치료 유효량"(또는 간단히 "유효량")으로 투여하는 것은 자명하다.A “therapeutically effective amount” (or simply “effective amount”), which is an amount of each compound or combination that elicits a biological or medical response in a tissue, system, animal or human being sought by a researcher, veterinarian, physician, or other clinician to administer the antibody to a patient. It is self-evident to administer as

공-투여의 양 및 공-투여의 타이밍은 치료되는 환자의 유형(종, 성별, 연령, 체중 등) 및 조건 및 치료되는 질병 또는 상태의 중증도에 따라 변할 것이다. 상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및/또는 항-PD-L1 항체를 환자에게 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐, 예를 들어 같은 날에 또는 그 다음날에 또는 매주 간격으로 적합하게 공-투여한다.The amount of co-administration and the timing of co-administration will vary depending on the type (species, sex, age, weight, etc.) of the patient being treated and the severity of the condition and disease or condition being treated. The PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine and/or anti-PD-L1 antibody may be administered to the patient at one time or over a series of treatments, eg, on the same day or the following day or at weekly intervals. suitably co-administered.

항-PD-L1 항체와 함께 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 외에, 또한 화학요법제를 투여할 수 있다.In addition to the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine along with the anti-PD-L1 antibody, chemotherapeutic agents may also be administered.

하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체와 함께 투여될 수 있는 상기와 같은 추가적인 화학요법제는 비제한적으로 알킬화제를 포함한 항-신생물제: 예를 들어 질소 머스터드, 예를 들어 메클로르에타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실; 니트로소유레아, 예를 들어 카머스틴(BCNU), 로머스틴(CCNU) 및 세머스틴(메틸-CCNU); 테모달(Temodal)(상표)(테모졸라미드), 에틸렌이민/메틸멜라민, 예를 들어 트라이에틸렌멜라민(TEM), 트라이에틸렌, 티오포스포아미드(티오테파), 헥사메틸멜라민(HMM, 알트레타민); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판; 트라이아진, 예를 들어 다카바진(DTIC); 폴산 유사체를 포함하는 대사길항물질, 예를 들어 메토트렉세이트 및 트라이메트렉세이트, 피리미딘 유사체, 예를 들어 5-플루오로유라실(5FU), 플루오로데옥시유리딘, 젬시타빈, 시토신 아라비노사이드(AraC, 시타라빈), 5-아자시티딘, 2,2'-다이플루오로데옥시시티딘, 퓨린 유사체, 예를 들어 6-머캅토퓨린, 6-티오구암, 아자티오프린, T-데옥시코포마이신(펜토스타틴), 에리쓰로하이드록시노닐아데닌(EHNA), 플루다라빈 포스페이트, 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈, 2-CdA); 유사분열억제 약물을 포함한 천연 생성물, 예를 들어 패클리탁셀, 빈블라스틴(VLB), 빈크리스틴 및 비노렐빈을 포함한 빈카 알칼로이드, 탁소테레, 에스트라머스틴 및 에스트라머스틴 포스페이트; 피포도필로톡신, 예를 들어 에토포시드 및 테니포시드; 항생제, 예를 들어 액티노마이신 D, 다우노마이신(루비도마이신), 독소루비신, 미톡산트론, 이다루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신), 미토마이신 C, 및 액티노마이신; 효소, 예를 들어 L-아스파라기나제; 생물 반응 변경제, 예를 들어 인터페론-알파, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF; 옥살리플라틴, 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 배위 착체, 안트라센다이온, 예를 들어 미톡산트론, 치환된 유레아, 예를 들어 하이드록시유레아, N-메틸하이드라진(MIH) 및 프로카바진을 포함한 메틸하이드라진 유도체, 부신피질 억제제, 예를 들어 미토탄(o,p-DDD) 및 아미노글루테티미드를 포함한 여러가지 다양한 작용제; 호르몬 및 아드레노코르티코스테로이드 길항물질을 포함한 길항물질, 예를 들어 프레드니손 및 균등물, 덱사메타손 및 아미노글루테티미드; 젬자(Gemzar)(상표)(젬시타빈), 프로제스틴, 예를 들어 하이드록시프로제스테론 카프로에이트, 메드록시프로제스테론 아세테이트 및 메제스트롤 아세테이트; 에스트로젠, 예를 들어 다이에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 균등물; 항에스트로젠, 예를 들어 타목시펜; 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론/균등물을 포함한 안드로젠; 항안드로젠, 예를 들어 플루타미드, 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체 및 류프롤리드; 및 비-스테로이드성 항안드로젠, 예를 들어 플루타미드를 포함한다. 비제한적으로 히스톤 데아세틸라제 억제제, 탈메틸화제(예를 들어 비다자) 및 전사 억제의 방출(ATRA) 요법을 포함한 후생적 기전을 표적화하는 요법을 또한 항원 결합 단백질과 병용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 화학요법제는 탁산(예를 들어 패클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소테레), 변형된 패클리탁셀(예를 들어 아브락산 및 오팍시오), 독소루비신, 수니티닙(수텐트), 소라페닙(넥사바) 및 다른 다중키나제 억제제, 옥살리플라틴, 시스플라틴 및 카보플라틴, 에토포시드, 젬시타빈 및 빈블라스틴으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 상기 화학요법제는 탁산(예를 들어 탁솔(패클리탁셀), 도세탁셀(탁소테레), 변형된 패클리탁셀(예를 들어 아브락산 및 오팍시오)로 이루어진 군 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 상기 추가적인 화학요법제는 5-플루오로유라실(5-FU), 류코보린, 이리노테칸 또는 옥살리플라틴 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 상기 화학요법제는 5-플루오로유라실, 류코보린 및 이리노테칸(FOLFIRI)이다. 하나의 실시태양에서, 상기 화학요법제는 5-플루오로유라실, 및 옥살리플라틴(FOLFOX)이다.In one embodiment, such additional chemotherapy may be administered in combination with a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein and an anti-PD-L1 antibody as described herein. Agents include, but are not limited to: anti-neoplastic agents including, but not limited to, alkylating agents: nitrogen mustards such as mechlorethamine, cyclophosphamide, ifosfamide, melphalan and chlorambucil; nitrosoureas such as carmustine (BCNU), lomustine (CCNU) and semustine (methyl-CCNU); Temodal® (Temozolamide), ethylenimine/methylmelamine such as triethylenemelamine (TEM), triethylene, thiophosphoamide (thiotepa), hexamethylmelamine (HMM, Altre) tamine); alkyl sulfonates such as busulfan; triazines such as dacarbazine (DTIC); Antimetabolites, including folic acid analogs, such as methotrexate and trimetrexate, pyrimidine analogs, such as 5-fluorouracil (5FU), fluorodeoxyuridine, gemcitabine, cytosine arabinoside (AraC, cytarabine), 5-azacytidine, 2,2'-difluorodeoxycytidine, purine analogs such as 6-mercaptopurine, 6-thioguam, azathioprine, T-de oxycopomycin (pentostatin), erythrohydroxynonyladenine (EHNA), fludarabine phosphate, and 2-chlorodeoxyadenosine (cladribine, 2-CdA); natural products, including mitotic drugs, for example, vinca alkaloids including paclitaxel, vinblastine (VLB), vincristine and vinorelbine, taxotere, estramustine and estramustine phosphate; pipodophyllotoxins such as etoposide and teniposide; antibiotics such as actinomycin D, daunomycin (rubidomycin), doxorubicin, mitoxantrone, idarubicin, bleomycin, plicamycin (mitramycin), mitomycin C, and actinomycin; enzymes such as L-asparaginase; biological response modifiers such as interferon-alpha, IL-2, G-CSF and GM-CSF; Platinum coordination complexes such as oxaliplatin, cisplatin and carboplatin, anthracendions such as mitoxantrone, substituted ureas such as hydroxyurea, N-methylhydrazine (MIH) and methylhydrazine, including procarbazine a variety of different agents including derivatives, adrenocortical inhibitors such as mitotan (o,p-DDD) and aminoglutethimide; antagonists including hormone and adrenocorticosteroid antagonists such as prednisone and equivalents, dexamethasone and aminoglutethimide; Gemzar™ (gemcitabine), progestins such as hydroxyprogesterone caproate, medroxyprogesterone acetate and megestrol acetate; estrogens such as diethylstilbestrol and ethinyl estradiol equivalents; antiestrogens such as tamoxifen; androgens including testosterone propionate and fluoxymesterone/equivalent; anti-androgens such as flutamide, gonadotropin-releasing hormone analogs and leuprolide; and non-steroidal anti-androgens such as flutamide. Therapies targeting epigenetic mechanisms including, but not limited to, histone deacetylase inhibitors, demethylating agents (eg Vidaza), and release of transcriptional repression (ATRA) therapies may also be combined with antigen binding proteins. In one embodiment, the chemotherapeutic agent is a taxane (eg paclitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotere), modified paclitaxel (eg Abraxane and Opaxio), doxorubicin, sunitinib) (Sutent), sorafenib (Nexavar) and other multikinase inhibitors, oxaliplatin, cisplatin and carboplatin, etoposide, gemcitabine and vinblastine. In one embodiment, the chemotherapy The agent is selected from the group consisting of a taxane (eg, taxol (Paclitaxel), docetaxel (Taxotere), modified paclitaxel (eg, Abraxane and Opaxio). In one embodiment, the additional The chemotherapeutic agent is selected from 5-fluorouracil (5-FU), leucovorin, irinotecan or oxaliplatin In one embodiment, the chemotherapeutic agent is 5-fluorouracil, leucovorin and irinotecan (FOLFIRI) In one embodiment, the chemotherapeutic agent is 5-fluorouracil, and oxaliplatin (FOLFOX).

추가적인 화학요법제와의 병용 요법의 구체적인 예는 예를 들어, 유방암 치료를 위한 탁산(예를 들어 도세탁셀 또는 패클리탁셀) 또는 변형된 패클리탁셀(예를 들어 아브락산 또는 오팍시오), 독소루비신), 카페시타빈 및/또는 베바시주맙(아바스틴) 요법; 난소암을 위한 카보플라틴, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 패클리탁셀, 독소루비신(또는 변형된 독소루비신(카엘릭스 또는 독실)), 또는 토포테칸(하이캄틴)과의 요법, 신장암 치료를 위한 다중-키나제 억제제, MKI, (수텐트, 넥사바, 또는 706) 및/또는 독소루비신과의 요법; 편평세포 암종 치료를 위한 옥살리플라틴, 시스플라틴 및/또는 방사선과의 요법; 폐암 치료를 위한 탁솔 및/또는 카르보플라틴과의 요법을 포함한다.Specific examples of combination therapy with additional chemotherapeutic agents include, for example, a taxane (eg docetaxel or paclitaxel) or a modified paclitaxel (eg abraxane or opaxio), doxorubicin for the treatment of breast cancer) , capecitabine and/or bevacizumab (Avastin) therapy; therapy with carboplatin, oxaliplatin, cisplatin, paclitaxel, doxorubicin (or modified doxorubicin (Caelix or Doxil)), or topotecan (Hycamtin) for ovarian cancer, a multi-kinase inhibitor for the treatment of kidney cancer; therapy with MKI, (Sutent, Nexavar, or 706) and/or doxorubicin; therapy with oxaliplatin, cisplatin and/or radiology for the treatment of squamous cell carcinoma; therapy with taxol and/or carboplatin for the treatment of lung cancer.

따라서, 하나의 실시태양에서, 상기 추가적인 화학요법제는 유방암 치료를 위한 탁산(도세탁셀 또는 패클리탁셀 또는 변형된 패클리탁셀(아브락산 또는 오팍시오), 독소루비신, 카페시타빈 및/또는 베바시주맙의 군 중에서 선택된다.Thus, in one embodiment, the additional chemotherapeutic agent is a taxane (docetaxel or paclitaxel or a modified paclitaxel (Abraxane or Opaxio), doxorubicin, capecitabine and/or bevacizumab for the treatment of breast cancer. is selected from the group of

하나의 실시태양에서, PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인/PD-L1 항체 병용 요법은 화학요법제가 투여되지 않는 것이다.In one embodiment, the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine/PD-L1 antibody combination therapy is not administered with a chemotherapeutic agent.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 포함한다.The present invention also includes a method of treating a patient suffering from a disease as described herein.

본 발명은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항-PD-L1 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법 및 상기와 같은 방법을 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 항-PD-L1 항체의 용도를 제공한다.The present invention also relates to an effective amount of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as described herein and an anti-PD-L1 antibody according to the invention as described herein together with a pharmaceutically acceptable carrier. There is provided a method for preparing a pharmaceutical composition comprising: and the use of a PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine and an anti-PD-L1 antibody according to the present invention as described herein for such a method .

본 발명은 또한 암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약제의 제조에 유효한 양으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항-PD-L1 항체의 용도를 제공한다.The present invention also relates to a PD-1-targeted IL- according to the invention as described herein in an amount effective for the manufacture of a medicament for the treatment of a patient suffering from cancer, preferably together with a pharmaceutically acceptable carrier. Two variant immunocytokines and the use of an anti-PD-L1 antibody according to the invention as described herein are provided.

세포요법cell therapy

일부 실시태양에서, 면역요법은 활성화 면역요법이다. 일부 실시태양에서, 면역요법은 암 치료로서 제공된다. 일부 실시태양에서, 면역요법은 입양세포 전달을 포함한다.In some embodiments, the immunotherapy is activating immunotherapy. In some embodiments, immunotherapy is provided as a cancer treatment. In some embodiments, immunotherapy comprises adoptive cell transfer.

일부 실시태양에서, 입양세포 전달은 키메라 항원 수용체-발현 T 세포(CAR T 세포)의 투여를 포함한다. 숙련가는 CAR이 세포외 종양-결합 부분, 가장 통상적으로는 단클론 항체로부터의 단쇄 가변 단편(scFv)에 융합된 세포내 T 세포 신호전달 도메인으로 구성된 항원-표적화된 수용체의 한 유형임을 알 것이다.In some embodiments, adoptive cell transfer comprises administration of chimeric antigen receptor-expressing T cells (CAR T cells). The skilled person will appreciate that CAR is a type of antigen-targeted receptor consisting of an intracellular T cell signaling domain fused to an extracellular tumor-binding moiety, most commonly a single chain variable fragment (scFv) from a monoclonal antibody.

CAR은 MHC-매개된 제시와 독립적으로 세포 표면 항원을 인식하여, 모든 환자에서 임의의 주어진 항원에 특이적인 단일 수용체 구조물의 사용을 허용한다. 초기의 CAR은 항원-인식 도메인을 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 CD3 활성화 쇄에 융합시켰다. 상기 1-세대 CAR은 시험관내에서 T 세포 효과기 기능을 유도하였지만, 생체내에서 불충분한 항종양 효능에 의해 대체로 제한되었다. 후속적인 CAR 반복은, CD28 또는 다양한 TNF 수용체 패밀리 분자, 예를 들어 4-1BB(CD137) 및 OX40(CD134)으로부터의 세포내 도메인을 포함하여, CD3와 나란히 2차 공자극 신호를 포함하였다. 더욱이, 3세대 수용체는 CD3 외에, 가장 통상적으로는 CD28 및 4-1BB로부터의 2개의 공자극 신호를 포함한다. 2세대 및 3세대 CAR은 항종양 효능을 대단히 개선시키며, 일부의 경우에 진행된 암이 있는 환자에서 완전한 차도를 유도한다. 하나의 실시태양에서, CAR T 세포는 CAR이 그의 항원에 결합할 때 활성화되는, CAR을 발현하도록 변형된 면역반응성 세포이다.CAR recognizes cell surface antigens independently of MHC-mediated presentation, allowing the use of a single receptor construct specific for any given antigen in all patients. Early CARs fused an antigen-recognition domain to the CD3 activation chain of the T cell receptor (TCR) complex. This first-generation CAR induced T cell effector function in vitro, but was largely limited by insufficient antitumor efficacy in vivo. Subsequent CAR repeats included secondary costimulatory signals alongside CD3, including intracellular domains from CD28 or various TNF receptor family molecules, such as 4-1BB (CD137) and OX40 (CD134). Moreover, third-generation receptors contain, in addition to CD3, two costimulatory signals most commonly from CD28 and 4-1BB. 2nd and 3rd generation CARs greatly improve antitumor efficacy and in some cases induce complete remission in patients with advanced cancer. In one embodiment, the CAR T cell is an immunoreactive cell modified to express a CAR, which is activated when the CAR binds to its antigen.

하나의 실시태양에서, CAR T 세포는 수용체가 그의 항원에 결합할 때 활성화되는 항원 수용체를 포함하는 면역반응성 세포이다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T 세포는 1세대 CAR T 세포이다. 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T 세포는 2세대 CAR T 세포이다. 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T 세포는 3세대 CAR T 세포이다. 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물 및 방법에 사용되는 CAR T 세포는 4세대 CAR T 세포이다. In one embodiment, the CAR T cell is an immunoreactive cell comprising an antigen receptor that is activated when the receptor binds to its antigen. In one embodiment, the CAR T cells used in the compositions and methods as disclosed herein are first generation CAR T cells. In another embodiment, the CAR T cells used in the compositions and methods as disclosed herein are second-generation CAR T cells. In another embodiment, the CAR T cells used in the compositions and methods as disclosed herein are third-generation CAR T cells. In another embodiment, the CAR T cells used in the compositions and methods as disclosed herein are fourth generation CAR T cells.

일부 실시태양에서, 입양세포 전달은 T 세포 수용체(TCR) 변형된 T 세포를 투여함을 포함한다. 숙련가는 TCR 변형된 T 세포가, 종양 조직으로부터 T 세포를 단리하고 그의 TCRa 및 TCRβ 쇄를 단리함으로써 제조됨을 알 것이다. 이들 TCRa 및 TCRβ는 나중에 클로닝되며 말초 혈액으로부터 단리된 T 세포내에 형질감염되고, 이어서 상기는 T 세포로부터 TCRa 및 TCRβ를 발현하여 종양을 인식한다.In some embodiments, adoptive cell transfer comprises administering T cell receptor (TCR) modified T cells. The skilled person will know that TCR modified T cells are prepared by isolating T cells from tumor tissue and isolating their TCRa and TCRβ chains. These TCRa and TCRβ are later cloned and transfected into T cells isolated from peripheral blood, which in turn express TCRa and TCRβ from the T cells to recognize tumors.

일부 실시태양에서, 입양세포 전달은 종양 침윤성 림프구(TIL)를 투여함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 입양세포 전달은 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 NK 세포를 투여함을 포함한다. 숙련가는 CAR-변형된 NK 세포가 환자로부터 단리된 NK 세포 또는 종양-특이성 단백질을 인식하는 CAR을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수할 수 있는 NK를 포함함을 알 것이다.In some embodiments, adoptive cell transfer comprises administering tumor infiltrating lymphocytes (TILs). In some embodiments, adoptive cell transfer comprises administering chimeric antigen receptor (CAR)-modified NK cells. The skilled artisan will appreciate that CAR-modified NK cells include NK cells isolated from a patient or commercially available NK engineered to express a CAR that recognizes a tumor-specific protein.

일부 실시태양에서, 입양세포 전달은 수지상 세포를 투여함을 포함한다.In some embodiments, adoptive cell transfer comprises administering dendritic cells.

일부 실시태양에서, 면역요법은 암 백신의 투여를 포함한다. 숙련가는 암 백신이 면역계를 암-특이성 항원 및 항원보강제에 노출시킴을 알 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 암 백신은 시풀류셀-T, GVAX, ADXS11-001, ADXS31-001, ADXS31-164, ALVAC-CEA 백신, AC 백신, 탈리모진 라허파렙벡, 바이오백스ID, 프로스트백, CDX110, CDX1307, CDX1401, CimaVax-EGF, CV9104, DNDN, NeuVax, Ae-37, GRNVAC, 탈모젠스, GI-4000, GI-6207, GI-6301, ImPACT 쎄라피, IMA901, 헵코르테스펜리시무트-L, 스티뮤백스, DCVax-L, DCVax-다이렉트, DCVax 프로스테이트, CBLI, Cvac, RGSH4K, SCIB1, NCT01758328, 및 PVX-410을 포함하는 군 중에서 선택된다.In some embodiments, immunotherapy comprises administration of a cancer vaccine. The skilled person will know that cancer vaccines expose the immune system to cancer-specific antigens and adjuvants. In some embodiments, the cancer vaccine is sipuleucel-T, GVAX, ADXS11-001, ADXS31-001, ADXS31-164, ALVAC-CEA vaccine, AC vaccine, talimozin laherparepvec, BiovacsID, Frostvac, CDX110 , CDX1307, CDX1401, CimaVax-EGF, CV9104, DNDN, NeuVax, Ae-37, GRNVAC, Thalgens, GI-4000, GI-6207, GI-6301, ImPACT Therapy, IMA901, Hepcortesfenrisimut-L, ST MuVax, DCVax-L, DCVax-Direct, DCVax Prostate, CBLI, Cvac, RGSH4K, SCIB1, NCT01758328, and PVX-410.

하기의 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 제시된다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 제시된 과정에서 변형이 이루어질 수 있음을 이해한다.The following examples, sequence listing and figures are provided to aid the understanding of the present invention, the true scope of which is set forth in the appended claims. It is understood that modifications may be made in the process presented without departing from the spirit of the invention.

하기의 서술에서, 본 발명의 실시태양을 기재한다:In the following description, embodiments of the present invention are described:

1. A) 암의 치료, 전이의 예방 또는 치료, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극에 사용하기 위한, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인; 또는1. A) PD-1-targeted IL- in combination with an antibody that binds to human PD-L1 for use in the treatment of cancer, prevention or treatment of metastasis, or stimulation of an immune response or function such as T cell activity 2 variant immunocytokine; or

B) 암의 치료, 전이의 예방 또는 치료, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인의 용도; 또는B) use of a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine for the manufacture of a medicament for use in the treatment of cancer, prevention or treatment of metastasis, or stimulation of an immune response or function such as T cell activation; or

C) 암의 치료, 전이의 예방 또는 치료, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극에 사용하기 위한 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인으로; C) as a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine for use in the treatment of cancer, prevention or treatment of metastasis, or stimulation of an immune response or function, such as T cell activation;

여기에서 상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여되며;wherein said PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is administered together with an antibody that binds to human PD-L1;

상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine used in the combination therapy is

a) 서열번호 5의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 6의 경쇄 가변 도메인 VL, 및 서열번호 2의 폴리펩타이드 서열, 또는 a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 5 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 6, and the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, or

b) 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는b) the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or

c) 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는 c) the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, or

d) 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 폴리펩타이드 서열d) the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14

을 포함함을 특징으로 하며; characterized in that it comprises;

상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is

a) 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL, 또는 a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16, or

b) 서열번호 19의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 20의 경쇄 가변 도메인 VLb) heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 19 and light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 20

을 포함함을 특징으로 한다.It is characterized in that it includes.

2. 선행 실시태양 중 어느 하나에 따른 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 또는 용도에서, 상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.2. A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine or use in combination with an antibody that binds human PD-L1 according to any one of the preceding embodiments, wherein the PD-1-targeted The IL-2 mutant immunocytokine is characterized in that it comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; The antibody binding to human PD-L1 used in the combination therapy is characterized in that it comprises a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16.

3. 선행 실시태양 중 어느 하나에 따른 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 또는 용도에서, 상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 아테졸리주맙이다.3. A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine or use in combination with an antibody that binds human PD-L1 according to any one of the preceding embodiments, wherein the PD-1-targeted The IL-2 mutant immunocytokine is characterized in that it comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is atezolizumab.

4. 선행 실시태양 중 어느 하나에 따른 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 또는 용도로서, 상기 면역사이토카인의 항체 성분 및 상기 항체는 인간 IgG1 하위부류 또는 인간 IgG4 하위부류의 것임을 특징으로 한다.4. A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine or use in combination with an antibody that binds to human PD-L1 according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody component of said immunocytokine and said antibody are human It is characterized as being of the IgG1 subclass or the human IgG4 subclass.

5. 선행 실시태양 중 어느 하나에 따른 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 또는 용도로서, 상기 항체는 감소되거나 최소의 효과기 기능을 가짐을 특징으로 한다.5. A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine or use in combination with an antibody that binds to human PD-L1 according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody has reduced or minimal effector function. characterized.

6. 선행 실시태양 중 어느 하나에 따른 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 또는 용도에서, 상기 최소의 효과기 기능은 무효과기 Fc 돌연변이로부터 생성된다.6. A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine or use in combination with an antibody that binds to human PD-L1 according to any one of the preceding embodiments, wherein said minimal effector function results from an invalidating phase Fc mutation do.

7. 선행 실시태양 중 어느 하나에 따른 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 또는 용도에서, 상기 무효과기 Fc 돌연변이는 L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A 또는 D265A/N297A(EU 넘버링)이다.7. The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine or use in combination with an antibody that binds human PD-L1 according to any one of the preceding embodiments, wherein the nullifying Fc mutation is L234A/L235A, L234A/ L235A/P329G, N297A or D265A/N297A (EU numbering).

8. A) 암의 치료, 전이의 예방 또는 치료, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극을 위한 방법으로서, 8. A) a method for the treatment of cancer, prevention or treatment of metastasis, or stimulation of an immune response or function, such as T cell activation,

여기에서 PD-1은 종양 세포 환경에 제시되고;where PD-1 is presented to the tumor cell environment;

여기에서 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여하거나;wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is administered in combination with an antibody that binds to human PD-L1;

B) 종양을 갖는 환자의 치료 방법으로서, B) a method of treating a patient having a tumor, the method comprising:

여기에서 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 PD-L1에 결합하는 항체와 함께 투여하며;wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine is administered together with an antibody that binds to PD-L1;

여기에서 상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 wherein the PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine used in the combination therapy is

을 포함함을 특징으로 하며; characterized in that it comprises;

을 포함함을 특징으로 한다.It is characterized in that it includes.

9. 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하거나, 전이의 예방 또는 치료가 필요한 환자에서 전이를 예방 또는 치료하거나, T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극이 필요한 환자에서 상기 반응 또는 기능을 자극하기 위한 방법으로서,9. Treating cancer in a patient in need of treatment for cancer, preventing or treating metastasis in a patient in need thereof, or stimulating an immune response or function, such as T cell activation, in a patient in need of stimulation of said response or function As a method for

상기 환자에게 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 항-PD-1 항체를 투여함을 포함하며,administering to the patient a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine and an anti-PD-1 antibody,

을 포함함을 특징으로 하며; characterized in that it comprises;

을 포함함을 특징으로 한다.It is characterized in that it includes.

10. 암 치료를 위한 실시태양 9에 따른 방법.10. A method according to embodiment 9 for the treatment of cancer.

11. 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 흑색종암, 방광암, 신세포암, 신장암, 간암, 두경부암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 위암종암, 식도암, 중피종, 전립선암, 백혈병, 림프종 또는 골수종의 치료를 위한 실시태양 10에 따른 방법.11. Breast cancer, lung cancer, colon cancer, ovarian cancer, melanoma cancer, bladder cancer, renal cell cancer, kidney cancer, liver cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, melanoma, pancreatic cancer, gastric carcinoma, esophageal cancer, mesothelioma, prostate cancer, leukemia, lymphoma or A method according to embodiment 10 for the treatment of myeloma.

12. 실시태양 8 내지 11 중 어느 하나에 따른 방법에서, 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.12. The method according to any one of embodiments 8 to 11, wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9. characterized by comprising; The antibody binding to human PD-L1 used in the combination therapy is characterized in that it comprises a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16.

13. 실시태양 8 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법에서, 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 아테졸리주맙이다.13. The method according to any one of embodiments 8 to 12, wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9. characterized by comprising; The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is atezolizumab.

14. 실시태양 8 내지 13 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 면역사이토카인의 항체 성분 및 항체는 인간 IgG1 하위부류 또는 인간 IgG4 하위부류의 것임을 특징으로 한다.14. The method according to any one of embodiments 8 to 13, characterized in that the antibody component and the antibody of the immunocytokine are of human IgG1 subclass or human IgG4 subclass.

15. 실시태양 8 내지 14 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 항체는 감소되거나 최소의 효과기 기능을 가짐을 특징으로 한다.15. The method according to any one of embodiments 8 to 14, wherein the antibody is characterized in that it has reduced or minimal effector function.

16. 실시태양 8 내지 15 중 어느 하나에 따른 방법에서, 최소의 효과기 기능은 무효과기 Fc 돌연변이로부터 생성된다.16. The method according to any one of embodiments 8 to 15, wherein the minimal effector function results from null and void Fc mutations.

17. 실시태양 8 내지 16 중 어느 하나에 따른 방법에서, 무효과기 Fc 돌연변이는 L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A 또는 D265A/N297A(EU 넘버링)이다.17. The method according to any one of embodiments 8 to 16, wherein the agnostic Fc mutation is L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A or D265A/N297A (EU numbering).

18. 실시태양 8 내지 17 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 인간 PD-L1에 결합하는 항체를 동시에 또는 순차적으로 투여한다.18. The method according to any one of embodiments 8 to 17, wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine and the antibody binding to human PD-L1 are administered simultaneously or sequentially.

19. 실시태양 8 내지 18 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 환자에게 화학요법제를 투여함을 추가 포함한다.19. The method according to any one of embodiments 8 to 18, further comprising administering a chemotherapeutic agent to the patient.

20. 동일하거나 별도의 용기에 (a) PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인, (b) 인간 PD-L1에 결합하는 항체, 및 (c) 임의로 병용 치료에서 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 인간 PD-L1에 결합하는 항체의 사용을 지시하는 인쇄된 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는, 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하거나, 전이의 예방 또는 치료가 필요한 환자에서 전이를 예방 또는 치료하거나, T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능을 자극하기 위해 의도된 키트로서,20. In the same or separate container (a) a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine, (b) an antibody that binds human PD-L1, and (c) optionally PD-1-targeting in combination therapy treating cancer in a patient in need thereof, or preventing or treating metastasis, comprising a package insert comprising printed instructions directing the use of an antibody that binds to an IL-2 variant immunocytokine and human PD-L1. A kit intended for preventing or treating metastasis or stimulating an immune response or function such as T cell activation in a patient in need thereof,

을 포함함을 특징으로 하며; characterized in that it comprises;

을 포함함을 특징으로 한다.It is characterized in that it includes.

21. (a) PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함하는 용기, 및 (b) 질병의 치료를 위한 방법으로서 인간 PD-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법에서 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인의 용도를 지시하는 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는, 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하거나, 전이의 예방 또는 치료가 필요한 환자에서 전이를 예방 또는 치료하거나, T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능을 자극하기 위해 의도된 키트로서,21. PD-1 in combination therapy with (a) a container comprising a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine, and (b) an antibody that binds to human PD-L1 as a method for the treatment of a disease -treating cancer in a patient in need of treatment for cancer, or preventing or treating metastasis in a patient in need thereof, comprising a package insert comprising instructions for use of the targeted IL-2 mutant immunocytokine or, as a kit intended for stimulating an immune response or function, such as T cell activity,

을 포함함을 특징으로 하며; characterized in that it comprises;

을 포함함을 특징으로 한다.It is characterized in that it includes.

22. (a) 인간 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하는 용기, 및 (b) 질병의 치료를 위한 방법으로서 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인과의 병용 요법에서 인간 PD-L1에 결합하는 항체의 용도를 지시하는 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는, 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하거나, 전이의 예방 또는 치료가 필요한 환자에서 전이를 예방 또는 치료하거나, T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능을 자극하기 위해 의도된 키트로서,22. (a) a container comprising an antibody that binds to human PD-L1, and (b) human PD- in combination therapy with a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine as a method for the treatment of a disease treating cancer in a patient in need thereof, preventing or treating metastasis in a patient in need thereof, or T cell activity comprising a package insert comprising instructions for use of an antibody that binds L1; As a kit intended to stimulate an immune response or function, such as,

을 포함함을 특징으로 하며; characterized in that it comprises;

을 포함함을 특징으로 한다.It is characterized in that it includes.

23. 암 치료를 위한 실시태양 21 또는 22에 따른 키트.23. A kit according to embodiment 21 or 22 for the treatment of cancer.

24. 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 흑색종암, 방광암, 신세포암, 신장암, 간암, 두경부암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 위암종암, 식도암, 중피종, 전립선암, 백혈병, 림프종 또는 골수종의 치료를 위한 실시태양 23에 따른 키트.24. Breast cancer, lung cancer, colon cancer, ovarian cancer, melanoma cancer, bladder cancer, renal cell cancer, kidney cancer, liver cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, melanoma, pancreatic cancer, gastric carcinoma, esophageal cancer, mesothelioma, prostate cancer, leukemia, lymphoma or A kit according to embodiment 23 for the treatment of myeloma.

25. 실시태양 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 키트에서, 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.25. The kit according to any one of embodiments 21 to 24, wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in the combination therapy comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9. characterized by comprising; The antibody binding to human PD-L1 used in the combination therapy is characterized in that it comprises a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16.

26. 실시태양 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 키트에서, 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 아테졸리주맙이다.26. The kit according to any one of embodiments 21 to 24, wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in combination therapy comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9. characterized by comprising; The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is atezolizumab.

27. 실시태양 21 내지 26 중 어느 하나에 따른 키트로서, 면역사이토카인의 항체 성분 및 항체는 인간 IgG1 하위부류 또는 인간 IgG4 하위부류의 것임을 특징으로 한다.27. The kit according to any one of embodiments 21 to 26, characterized in that the antibody component of the immunocytokine and the antibody are of human IgG1 subclass or human IgG4 subclass.

28. 실시태양 21 내지 27 중 어느 하나에 따른 키트로서, 상기 항체는 감소되거나 최소의 효과기 기능을 가짐을 특징으로 한다.28. The kit according to any one of embodiments 21 to 27, wherein the antibody is characterized in that it has reduced or minimal effector function.

29. 실시태양 21 내지 28 중 어느 하나에 따른 키트에서, 최소의 효과기 기능은 무효과기 Fc 돌연변이로부터 생성된다.29. The kit according to any one of embodiments 21 to 28, wherein the minimal effector function results from null and void Fc mutations.

30. 실시태양 21 내지 29 중 어느 하나에 따른 키트에서, 무효과기 Fc 돌연변이는 L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A 또는 D265A/N297A(EU 넘버링)이다.30. The kit according to any one of embodiments 21 to 29, wherein the null and void Fc mutation is L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A or D265A/N297A (EU numbering).

31. PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인을 포함하는, 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하거나, 전이의 예방 또는 치료가 필요한 환자에서 전이를 예방 또는 치료하거나, 염증 질병의 치료가 필요한 환자에서 염증 질병을 치료하거나, 면역 관련된 질병, 예를 들어 종양 면역성의 치료 또는 그의 진행의 지연이 필요한 환자에서 상기 질병을 치료하거나 그의 진행을 지연시키거나, T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극이 필요한 환자에서 상기 반응 또는 기능을 자극하기 위해 의도된 약제로서,31. Treating cancer in a patient in need thereof, preventing or treating metastasis in a patient in need thereof, or treating an inflammatory disease comprising a PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine. To treat an inflammatory disease in a patient in need thereof, or to treat or delay the progression of an immune-related disease, e.g., tumor immunity in a patient in need thereof, or an immune response such as T cell activation or A medicament intended to stimulate said response or function in a patient in need thereof, comprising:

여기에서 상기 약제는 인간 PL-L1에 결합하는 항체와의 병용 요법에 사용하기 위한 것이며, 병용 치료에서 상기 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인 및 인간 PD-L1에 결합하는 항체의 용도를 지시하는 인쇄된 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 임의로 포함하고, wherein the medicament is for use in combination therapy with an antibody that binds to human PL-L1, wherein the PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine and the antibody that binds to human PD-L1 are used in combination therapy. optionally comprising a package insert comprising printed instructions directing use;

을 포함함을 특징으로 하며; characterized in that it comprises;

을 포함함을 특징으로 한다.It is characterized in that it includes.

32. 암 치료를 위한 실시태양 31에 따른 약제.32. A medicament according to embodiment 31 for the treatment of cancer.

33. 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 흑색종암, 방광암, 신세포암, 신장암, 간암, 두경부암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 위암종암, 식도암, 중피종, 전립선암, 백혈병, 림프종 또는 골수종의 치료를 위한 실시태양 32에 따른 약제.33. Breast cancer, lung cancer, colon cancer, ovarian cancer, melanoma cancer, bladder cancer, renal cell cancer, kidney cancer, liver cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, melanoma, pancreatic cancer, gastric carcinoma, esophageal cancer, mesothelioma, prostate cancer, leukemia, lymphoma or A medicament according to embodiment 32 for the treatment of myeloma.

34. 실시태양 31 내지 33 중 어느 하나에 따른 약제에서, 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함함을 특징으로 한다.34. The medicament according to any one of embodiments 31 to 33, wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in combination therapy comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9. characterized by comprising; The antibody binding to human PD-L1 used in the combination therapy is characterized in that it comprises a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16.

35. 실시태양 31 내지 33 중 어느 하나에 따른 약제에서, 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함함을 특징으로 하며; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체는 아테졸리주맙이다.35. The medicament according to any one of embodiments 31 to 33, wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in combination therapy has the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9. characterized by comprising; The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is atezolizumab.

36. 실시태양 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 약제로서, 면역사이토카인의 항체 성분 및 항체는 인간 IgG1 하위부류 또는 인간 IgG4 하위부류의 것임을 특징으로 한다.36. The medicament according to any one of embodiments 31 to 35, characterized in that the antibody component of the immunocytokine and the antibody are of human IgG1 subclass or human IgG4 subclass.

37. 실시태양 31 내지 36 중 어느 하나에 따른 약제로서, 상기 항체는 감소되거나 최소의 효과기 기능을 가짐을 특징으로 한다.37. The medicament according to any one of embodiments 31 to 36, wherein the antibody is characterized in that it has reduced or minimal effector function.

38. 실시태양 31 내지 37 중 어느 하나에 따른 약제에서, 최소의 효과기 기능은 무효과기 Fc 돌연변이로부터 생성된다.38. The medicament according to any one of embodiments 31 to 37, wherein the minimal effector function results from a null and void Fc mutation.

39. 실시태양 31 내지 38 중 어느 하나에 따른 약제에서, 무효과기 Fc 돌연변이는 L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A 또는 D265A/N297A(EU 넘버링)이다.39. The medicament according to any one of embodiments 31 to 38, wherein the agnostic Fc mutation is L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A or D265A/N297A (EU numbering).

40. 면역요법에 의한 치료 또는 사전치료를 포함하는 실시태양 1 내지 39 중 어느 하나에 따른 약제의 용도 또는 용도들 또는 용도들의 조합.40. Use or combinations of uses or uses of a medicament according to any one of embodiments 1 to 39 comprising treatment or prior treatment with immunotherapy.

41. 실시태양 40에서, 상기 면역요법은 입양세포 전달, 단클론 항체의 투여, 사이토카인의 투여, 암 백신의 투여, T 세포 관여 요법 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.41. In embodiment 40, said immunotherapy comprises adoptive cell transfer, administration of a monoclonal antibody, administration of a cytokine, administration of a cancer vaccine, T cell engaging therapy, or any combination thereof.

42. 실시태양 41에서, 입양세포 전달은 키메라 항원 수용체 발현 T 세포(CAR T 세포), T 세포 수용체(TCR) 변형된 T 세포, 종양-침윤성 림프구(TIL), 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 자연살해 세포, T 세포 수용체(TCR) 형질도입된 세포, 수지상 세포 또는 이들의 임의의 조합을 투여함을 포함한다.42. The adoptive cell transfer of embodiment 41 is a chimeric antigen receptor expressing T cell (CAR T cell), a T cell receptor (TCR) modified T cell, a tumor-infiltrating lymphocyte (TIL), a chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cell. natural killer cells, T cell receptor (TCR) transduced cells, dendritic cells, or any combination thereof.

실시예Example

쥐 대용 PD-1-IL2v 면역접합체를 동계 마우스 모델 및 RT5 트랜스제닉 마우스 모델에서 그의 항-종양 효능에 대해 단독으로 및 쥐 대용 PD-L1 Mab와 함께 시험하였다.The murine surrogate PD-1-IL2v immunoconjugate was tested alone and in combination with the murine surrogate PD-L1 Mab for its anti-tumor efficacy in syngeneic and RT5 transgenic mouse models.

물질matter

PD1-Il2v 및 muPD1-IL2vPD1-I12v and muPD1-IL2v

항체 중쇄-인터류킨-2(IL-2) 융합 단백질에 대한 발현 카세트[항-인간 PD-1 항체의 중쇄 가변 영역, 인간 IgG1 중쇄(효과기 기능의 제거를 위한 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(EU 넘버링), 및 이종이량체화("손잡이")를 위한 돌연변이 S354C 및 T366W(EU 넘버링) 함유), (G4S)3 링커, 및 인간 IL-2v(돌연변이 T3A, F42A, Y45A, L72G 및 C125A 함유)], 항체 중쇄에 대한 발현 카세트[항-인간 PD-1 항체의 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 중쇄(효과기 기능의 제거를 위한 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(EU 넘버링), 이종이량체화("구멍")를 위한 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y410V(EU 넘버링), 및 임의로 돌연변이 H435R 및 Y436F(EU 넘버링) 함유] 및 항체 경쇄에 대한 발현 카세트[항-인간 PD-1 항체의 경쇄 가변 영역, 및 인간 카파 불변 영역]를 유전자-합성에 의해 생성시켰다.Expression cassette for antibody heavy chain-interleukin-2 (IL-2) fusion protein [heavy chain variable region of anti-human PD-1 antibody, human IgG1 heavy chain (mutations L234A, L235A and P329G (EU numbering) for elimination of effector function) , and containing mutations S354C and T366W (EU numbering) for heterodimerization (“handle”), (G4S)3 linker, and human IL-2v (containing mutations T3A, F42A, Y45A, L72G and C125A)], Expression cassettes for antibody heavy chains [heavy chain variable region of anti-human PD-1 antibody and human IgG1 heavy chain (mutations L234A, L235A and P329G (EU numbering) for removal of effector function), heterodimerization (“hole”) contains mutations Y349C, T366S, L368A and Y410V (EU numbering), and optionally mutations H435R and Y436F (EU numbering) for) and an expression cassette for the antibody light chain [light chain variable region of an anti-human PD-1 antibody, and human kappa constant region] was generated by gene-synthesis.

이들을 각각 HindIII 및 NheI 절단을 통해 CMV-프로모터의 조절하에서 발현 벡터내에 클로닝한 다음 인트론A를 클로닝하고 BGH-폴리 A 신호에 의해 종결시켰다. 상기 벡터는 세균성 암피실린 내성 유전자 및 에스케리키아 콜라이로부터의 복제 기원을 추가로 함유하였다.They were cloned into an expression vector under the control of a CMV-promoter via HindIII and NheI cleavage, respectively, and then intron A was cloned and terminated by BGH-poly A signal. The vector further contained a bacterial ampicillin resistance gene and an origin of replication from Escherichia coli.

인간 PD1-IL-2v 융합 단백질(서열번호 7, 8 및 9)을 진탕 플라스크에서 1:1:1의 비의 상술한 벡터들로 HEK293F 세포(인비트로젠(Invitrogen))를 동시형질감염시킴으로써 생성시켰다. 1주일 후에 상등액을 수확하고 멸균 필터를 통해 여과하였다.Human PD1-IL-2v fusion proteins (SEQ ID NOs: 7, 8 and 9) were generated by cotransfecting HEK293F cells (Invitrogen) with the above-described vectors in a 1:1:1 ratio in shake flasks. made it After one week, the supernatant was harvested and filtered through a sterile filter.

상기 융합 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합에 의해 상기 상등액으로부터 정제시켰다. 상기 수득된 생성물을 질량 분광분석 및 분석학적 성질, 예를 들어 모세관 전기영동(CE-SDS)에 의한 순도, 단량체 함량 및 안정성에 의해 정체에 대해 특성화하였다.The fusion protein was purified from the supernatant by a combination of Protein A affinity chromatography and size exclusion chromatography. The product obtained was characterized for identity by mass spectrometry and analytical properties such as purity by capillary electrophoresis (CE-SDS), monomer content and stability.

쥐 대용 PD1-IL2v 융합 단백질(서열번호 12, 13 및 14)을 유사하게 생성시켰다. 상기 대용 분자는 쥐 IgG1 항-마우스 PD-1 항체(효과기 기능의 제거 및 이종이량체화를 위한 Fc 돌연변이 함유) 및 인간 분자와 유사한 돌연변이를 갖는 쥐 인터류킨-2를 포함한다.A murine surrogate PD1-IL2v fusion protein (SEQ ID NOs: 12, 13 and 14) was generated similarly. Such surrogate molecules include a murine IgG1 anti-mouse PD-1 antibody (containing Fc mutations for elimination of effector function and heterodimerization) and murine interleukin-2 with mutations similar to human molecules.

상기 두 융합 단백질을 모두 양호한 수율로 생성시킬 수 있었으며 이들은 안정하다.Both fusion proteins were able to be produced in good yield and they are stable.

인간/마우스 교차반응성 항-PD-L1 항체를 연구에 사용하였다. 예를 들어, WO 2010/077634(도 11에 나타낸 서열)에 기재된 YW243.55.S70 PD-L1 항체에 기반한 항-마우스 PD-L1 대용 항체(YW243.55.S70 PD-L1 muIgG1이라 칭한다)를 생체내 종양 모델에 사용하기 위해 생성시켰다. 상기 항체는 FcγR 상호작용을 없애기 위한 DAPG 돌연변이를 함유하였다. YW243.55.S70의 가변 영역을 DAPG Fc 돌연변이를 갖는 쥐 IgG1 불변 도메인에 부착시켰다.A human/mouse cross-reactive anti-PD-L1 antibody was used in the study. For example, an anti-mouse PD-L1 surrogate antibody (referred to as YW243.55.S70 PD-L1 muIgG1) based on the YW243.55.S70 PD-L1 antibody described in WO 2010/077634 (sequence shown in FIG. 11 ) generated for use in in vivo tumor models. The antibody contained a DAPG mutation to abolish the FcγR interaction. The variable region of YW243.55.S70 was attached to the murine IgG1 constant domain with the DAPG Fc mutation.

YW243.55.S70 PD-L1 muIgG1의 폴리펩타이드 서열은 하기와 같다:The polypeptide sequence of YW243.55.S70 PD-L1 muIgG1 is as follows:

YW243.55.S70　PD-L1 muIgG1 DAPG HC(서열번호 21):YW243.55.S70　PD-L1 muIgG1 DAPG HC (SEQ ID NO: 21):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDAPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDAPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

YW243.55.S70　PD-L1 muIgG1 LC(서열번호 22):YW243.55.S70　PD-L1 muIgG1 LC (SEQ ID NO: 22):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNECDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVTYVCFLNNFYTKDEKDINVKWKSWTDYQDSKTSVVCFLNNFYTKDEKDINVKWTSKIDYQDSKNGECFN.

실시예 1Example 1

MC38 결장직장 피하 동계 모델MC38 colorectal subcutaneous syngeneic model

쥐 대용 PD1-IL2v 면역접합체(muPD1-IL2v: 서열번호 12, 13, 14)를 블랙 6 마우스내에 피하 주사된 마우스 결장직장 MC38 세포주에서 시험하였다. 상기 항-PD-L1 항체 PD-L1 6E11 muIgG1을 본 연구에 사용하였다(서열번호 21, 22).A murine surrogate PD1-IL2v immunoconjugate (muPD1-IL2v: SEQ ID NOs: 12, 13, 14) was tested in a mouse colorectal MC38 cell line injected subcutaneously into Black 6 mice. The anti-PD-L1 antibody PD-L1 6E11 muIgG1 was used in this study (SEQ ID NOs: 21, 22).

MC38 결장직장 암종 종양 세포주를 5% CO2의 수-포화된 분위기에서 37℃에서 10% FCS(깁코(Gibco))를 함유하는 DMEM 중에서 통상적으로 배양하였다. 계대 11을 91%의 생육력으로 이식에 사용하였다. 동물당 5x10⁵ 세포를 100 ㎕의 RPMI 세포 배양 배지(깁코) 중에서 1 ㎖ 튜베르쿨린 주사기(BD 바이오사이언시즈(Biosciences))를 사용하여 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다.The MC38 colorectal carcinoma tumor cell line was routinely cultured in DMEM containing 10% FCS (Gibco) at 37° C. in a water-saturated atmosphere of 5% CO 2 . Passage 11 was used for transplantation with 91% viability. 5x10 ⁵ cells per animal were injected subcutaneously into the flanks of mice using a 1 ml tuberculin syringe (BD Biosciences) in 100 μl of RPMI cell culture medium (Gibco).

실험의 출발시에 6 내지 8주된 암컷 블랙 6(챨스 리버스(Charles Rivers), 프랑스 리옹 소재)를 수임된 지침(GV-솔라스(Solas); 펠라사(Felasa); TierschG)에 따라 12h 명/12h 암의 1일 주기로 특정-병원체-부재 조건하에서 유지시켰다. 도착 후에, 동물을 새로운 환경에 익숙해지게 하고 관찰을 위해서 1 주일간 유지시켰다. 계속적인 건강 모니터링을 규칙적으로 수행하였다.At the start of the experiment, female Black 6 (Charles Rivers, Lyon, France), 6 to 8 weeks old, were given 12 h/person/in accordance with the guidelines (GV-Solas; Felasa; TierschG). It was maintained under specific-pathogen-free conditions with a 1 day cycle of 12 h cancer. Upon arrival, the animals were acclimatized to the new environment and maintained for 1 week for observation. Continuous health monitoring was performed regularly.

마우스에게 0 연구일에 5x10⁵의 MC38 세포를 피하 주사하고, 무작위 분류하고 칭량하였다. 종양 세포 주사후 1주일째(종양 부피>150 ㎣)에, 마우스에게 2주일 동안 muPD1-IL2v, muPD-L1-Mab 또는 muPD1-IL2v + muPD-L1 Mab의 조합을 i.v. 주사하였다. 모든 마우스에게 200 ㎕의 적합한 용액을 i.v. 주사하였다. 비히클 군 중의 마우스에게는 히스티딘 완충제를 주사하고 처리 군에게는 muPD1-IL2v 구조물 0.5 ㎎/㎏ qw 또는 muPD-L1 Mab 10 ㎎/㎏ iv 1회 및 그 후에 5 ㎎/㎏ 2qw 또는 muPD1-IL-2v + muPD-L1 Mab 조합을 주사하였다. 200 ㎕당 적합한 양의 면역접합체를 수득하기 위해서, 필요한 경우 모액을 히스티딘 완충제로 희석하였다.Mice were injected subcutaneously with 5x10 ⁵ MC38 cells on study day 0, randomized and weighed. One week after tumor cell injection (tumor volume >150 mm 3 ), mice were injected iv with muPD1-IL2v, muPD-L1-Mab or a combination of muPD1-IL2v + muPD-L1 Mab for 2 weeks. All mice were injected iv with 200 μl of the appropriate solution. Mice in vehicle group were injected with histidine buffer and treated groups were injected with muPD1-IL2v construct at 0.5 mg/kg qw or muPD-L1 Mab at 10 mg/kg iv once and thereafter at 5 mg/kg 2qw or muPD1-IL-2v + muPD -L1 Mab combination was injected. To obtain an appropriate amount of immunoconjugate per 200 μl, the stock solution was diluted with histidine buffer if necessary.

도 1 및 표 1A는 종양 성장 억제의 면에서 muPD1-IL2v 및 muPD-L1 Mab 단독에 비해 muPD-IL2v 및 muPD-L1 Mab 조합이 우수한 효능을 매개하였음을 나타낸다.1 and Table 1A show that the combination of muPD-IL2v and muPD-L1 Mab mediated superior efficacy compared to muPD1-IL2v and muPD-L1 Mab alone in terms of tumor growth inhibition.

[표 1A][Table 1A]

[표 1B][Table 1B]

실시예 2Example 2

Pan NET의 Rip-Tag5(RT5) 트랜스제닉 마우스 모델Pan NET's Rip-Tag5 (RT5) transgenic mouse model

방법method

PanNET의 Rip-Tag5(RT5) 트랜스제닉 마우스 모델.PanNET's Rip-Tag5 (RT5) transgenic mouse model.

Rip-Tag5 마우스의 생성은 앞서 기재되었다(문헌[J Clin Invest. 1996;97(1):54-64. https://doi.org/10.1172/JCI118406]). 본 연구에서 상기 Rip-Tag5 마우스는 C57B6/N 배경에 속하였다. 동물 실험을 승인된 면허 VD3133 및 VD3475하에서 수행하였다.The generation of Rip-Tag5 mice has been previously described (J Clin Invest. 1996;97(1):54-64. https://doi.org/10.1172/JCI118406). In this study, the Rip-Tag5 mice belonged to the C57B6/N background. Animal experiments were performed under approved licenses VD3133 and VD3475.

RT5 마우스에서 전임상 약물 시험.Preclinical drug testing in RT5 mice.

Rip-Tag5 마우스를 시험에 등록시키기 위해서, 22주 된 마우스를 MS550D 40 MHz 변환기(비주얼 소닉(Visual Sonic))가 있는 Vevo2100 시스템을 사용하여 초음파 영상화에 의해 PanNET의 존재에 대해 선별하였다. Rip-Tag5를 누적 종양 크기를 기준으로 상이한 처리 군들로 무작위 할당하였다. 장기적인 연구를 위해서 종양을 2주마다 모니터하였다.To enroll Rip-Tag5 mice in the trial, 22 week old mice were screened for the presence of PanNET by ultrasound imaging using a Vevo2100 system with an MS550D 40 MHz transducer (Visual Sonic). Rip-Tag5 was randomly assigned to different treatment groups based on cumulative tumor size. Tumors were monitored every 2 weeks for a long-term study.

약물 및 복용 섭생.Medication and dosing regimen.

실시예 2에 사용된 모든 약물은 본 명세서에서 명확하게 서술되지 않았지만 쥐 대용 분자였다. 쥐 항-PD-L1 항체 "6E11 결합제 muIgG2a(PGLALA)"는 6E11-muIgG2a로서 약기하였고, "6E11 결합제 muIgG1(DAPG)"는 6E11-muIgG1로서 약기하였으며, "YW243.55.S70 결합제 muIgG1(DAPG)"는 S70-muIgG1로서 약기하였고 이들을 사용하였다.All drugs used in Example 2 were mice surrogate molecules, although not explicitly described herein. The murine anti-PD-L1 antibody "6E11 binder muIgG2a (PGLALA)" was abbreviated as 6E11-muIgG2a, "6E11 binder muIgG1 (DAPG)" was abbreviated as 6E11-muIgG1, and "YW243.55.S70 binder muIgG1 (DAPG)" " was abbreviated as S70-muIgG1 and these were used.

도 3D에서 생성되는 4마리의 Rip-Tag5 마우스의 항-PD-L1 처리에서 쥐 항-PD-L1 항체를 표 2에 따라 투여하였다.In the anti-PD-L1 treatment of 4 Rip-Tag5 mice generated in FIG. 3D, murine anti-PD-L1 antibody was administered according to Table 2.

[표 2][Table 2]

도 3E에서 생성되는 7마리의 Rip-Tag5 마우스의 PD-1-IL2v 및 항-PD-L1의 병용 처리에서 쥐 항-PD-L1 항체를 표 3에 따라 투여하였다.In the combined treatment of PD-1-IL2v and anti-PD-L1 of 7 Rip-Tag5 mice generated in FIG. 3E, murine anti-PD-L1 antibody was administered according to Table 3.

[표 3][Table 3]

약물을 마우스당 하기의 양으로 i.p. 주사에 의해 투여하였다: 항-PD1-저: 22.75 ㎍, q1wk(PD1-IL2v와 동몰), 항-PD1-고: 250 ㎍, q1wk(치료학적 용량), DP47-IL2v: 25 ㎍, q1wk, PD1-IL2v: 25 ㎍, q1wk, 항-PDL1: 1차 용량 250 ㎍, 이어서 8주의 지속기간 동안 1주일에 2회, 125 ㎍.The drug was administered i.p. Administered by injection: anti-PD1-low: 22.75 μg, q1wk (equimolar with PD1-IL2v), anti-PD1-high: 250 μg, q1wk (therapeutic dose), DP47-IL2v: 25 μg, q1wk, PD1 -IL2v: 25 μg, q1wk, anti-PDL1: first dose 250 μg followed by 125 μg twice a week for a duration of 8 weeks.

유식 세포측정.flow cytometry.

비장의 단세포 현탁액을, 40 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 비장을 매쉬함(mashing)으로써 생성시켰다. 적혈구를 PD 팜라이스(PharmLyse) 완충제(BD 바이오사이언시즈 555899)로 용해시킨 후에, 비장세포를 항-마우스 CD16/32(바이오레전드(BioLegend), 카탈로그 번호 101302)로 차단하였다. 생/사 염색을 고정성의 생육력 염료 780(BD 565388)으로 수행하였다. TAG-특이성 CD8⁺ T 세포를 SV40 TAG 다량체(APC-MHC-H2Kb-VVYDFLKC, 로잔 대학)로 염색한 다음, 표면 항원에 대한 항체 염색을 수행하였다. 세포내 단백질을, 제조사의 설명에 따라 Foxp3 염색 키트(인비트로젠, 카탈로그 번호 00-5523-00)를 사용하여 고정화 및 투과후에 염색하였다. 패널은 하기의 항체들로 이루어졌다: CD4-BV510(바이오레전드, 카탈로그 번호 100553), CD8-BB515(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 564422), PD1-PE-Cy7(바이오레전드, 카탈로그 번호 109110), LAG3-BV421(바이오레전드, 카탈로그 번호 125221), TIGIT-PE-Dazzle 594(바이오레전드, 카탈로그 번호 142109), CD28-BB700(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 566513), ICOS-BV785(바이오레전드, 카탈로그 번호 313534), KLRG1-BV711(바이오레전드, 카탈로그 번호 138427), CD25-APC-R700(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 565135), CD127-BV650(바이오레전드, 카탈로그 번호 135043), CD27-BUV395(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 740247), Foxp3-PE(인비트로젠, 카탈로그 번호 12-5773-82). 샘플들을 BD LSR 포르테사(Fortessa) 유식 세포계상에서 분석하였으며 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)으로 처리하였다.A single cell suspension of the spleen was generated by mashing the spleen through a 40 μm cell strainer. After lysis of red blood cells with PD PharmLyse buffer (BD Biosciences 555899), splenocytes were blocked with anti-mouse CD16/32 (BioLegend, catalog number 101302). Live/dead staining was performed with fixed viability dye 780 (BD 565388). TAG-specific CD8 ⁺ T cells were stained with SV40 TAG multimer (APC-MHC-H2Kb-VVYDFLKC, University of Lausanne) followed by antibody staining against surface antigen. Intracellular proteins were stained after immobilization and permeabilization using a Foxp3 staining kit (Invitrogen, catalog number 00-5523-00) according to the manufacturer's instructions. The panel consisted of the following antibodies: CD4-BV510 (BioLegend, catalog number 100553), CD8-BB515 (BD Biosciences, catalog number 564422), PD1-PE-Cy7 (BioLegend, catalog number 109110), LAG3-BV421 (BioLegend, catalog number 125221), TIGIT-PE-Dazzle 594 (BioLegend, catalog number 142109), CD28-BB700 (BD Biosciences, catalog number 566513), ICOS-BV785 (BioLegend, catalog number) 313534); Siege, catalog number 740247), Foxp3-PE (Invitrogen, catalog number 12-5773-82). Samples were analyzed on a BD LSR Fortessa flow cytometer and data processed with FlowJo software and GraphPad Prism.

면역조직화학.Immunohistochemistry.

종양을 OCT 중에 포매시키고 드라이 아이스상에서 동결시켰다. 10 ㎛ 두께의 메탄올-고정된 섹션을 CD8-FITC(바이오레전드, 카탈로그 번호 100705), PD1-PE(바이오레전드, 카탈로그 번호 12-9981-82), CD31-FITC(PD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 553372), PDL1-PE(인비트로젠, 카탈로그 번호 12-5982-82), T-항원(TAG, 사내 생산), 항-토끼 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647(TAG에 대한 2차 항체, 애브캠(Abcam), 카탈로그 번호 ab150075)로 염색하고, DAPI(롯슈 카탈로그 번호 10236276001)로 대조염색하였다. 섹션들을 레이카(Leica) DM5500 현미경 및 올림푸스(Olympus) VS120 슬라이드 스캐너상에서 영상화하였다. 상들을 아도브 포토샵(Adobe Photoshop) 및 QuPath 소프트웨어로 처리하였다.Tumors were embedded during OCT and frozen on dry ice. Methanol-fixed sections 10 μm thick were transfected with CD8-FITC (BioLegend, Cat. No. 100705), PD1-PE (BioLegend, Cat. No. 12-9981-82), CD31-FITC (PD Biosciences, Cat. No. 553372). ), PDL1-PE (Invitrogen, catalog number 12-5982-82), T-antigen (TAG, produced in-house), anti-rabbit Alexa Fluor 647 (secondary antibody to TAG, Abcam ( Abcam), catalog number ab150075) and counterstained with DAPI (Roche catalog number 10236276001). Sections were imaged on a Leica DM5500 microscope and an Olympus VS120 slide scanner. Images were processed with Adobe Photoshop and QuPath software.

Rip-Tag5 마우스에서 전임상 약물 시험.Preclinical drug testing in Rip-Tag5 mice.

시험에 Rip-Tag5 마우스를 등록시키기 위해서, 7 mmol/L 미만의 혈당 수준을 나타내는 22주된 마우스를 MS550D 40 MHz 변환기(비주얼 소닉)가 있는 Vevo2100 시스템을 사용하여 초음파 영상화에 의해 PanNET 섬의 존재에 대해 선별하였다. Rip-Tag5를 누적 종양 크기를 기준으로 상이한 처리 군들로 무작위 할당하였다. 장기간 효능 연구를 위한 평균 출발 종양 크기는 28 mm2이고, 평균 출발 주령은 25주이며, 평균 출발 글루코스 수준은 5.8 mmol/L이었다. 종양을 최대 16주 동안 완전한 반응자에 대해서 2주마다 또는 4주마다 초음파 영상화에 의해 모니터하였다. 혈당 수준을 Accu-Chek 혈당계(롯슈)를 사용하여 매주 모니터하였다. 종점에 대한 기준은 종양 크기, 저혈당증(3 mmol/L 이하의 혈당), 일반적인 건강 상태 및 체중 감소(15% 초과)에 의해 한정되었다.To enroll Rip-Tag5 mice for testing, 22 week-old mice exhibiting blood glucose levels below 7 mmol/L were tested for the presence of PanNET islets by ultrasound imaging using a Vevo2100 system with an MS550D 40 MHz transducer (Visual Sonic). was selected. Rip-Tag5 was randomly assigned to different treatment groups based on cumulative tumor size. The mean starting tumor size for the long-term efficacy study was 28 mm2, the mean starting age was 25 weeks, and the mean starting glucose level was 5.8 mmol/L. Tumors were monitored by ultrasound imaging every 2 weeks or every 4 weeks for complete responders for up to 16 weeks. Blood glucose levels were monitored weekly using an Accu-Chek glucometer (Roche). Criteria for endpoints were defined by tumor size, hypoglycemia (glycemia <3 mmol/L), general health and weight loss (>15%).

결과result

CD8⁺ T 세포 표적화에 대한 이중-특이성 분자 PD1-IL2v의 영향을 평가하기 위해서, 종양 함유 Rip-Tag5 마우스를 14일 동안 PD1-IL2v로 처리하였다. 비장 중 총 CD8⁺ T 세포 및 종양 항원 TAG에 대해 반응성인 CD8⁺ T 세포의 확대를 유식 세포측정에 의해 측정하고 항-PD1, DP47-IL2v, 항-PDL1의 단일 처리 및 항-PD1 + DP47-IL2v 병용 처리와 비교하였다. 항-PD1에 대해서 2개의 농도를 사용하였으며; 항-PD1-저는 이중-특이성 분자 중의 PD1과 동몰이고 항-PD1-고는 상기 약물에 사용되는 치료학적 용량이다. DP47-IL2v 단독 또는 항-PD1과 병용된 처리는 처리되지 않은 대조용 마우스에 비해 총 CD8⁺ T 세포의 3 내지 4-배 증가를 생성시켰다(도 2A). 유사하게, PD1-IL2v 처리는 Rip-Tag5 마우스의 비장에서 총 CD8⁺ T 세포의 2.5-배 확대를 도출하였다(도 2A). DP47-IL2v는 총 CD8⁺ T 세포 집단을 효능 있게 증가시켰지만, TAG-특이성 CD8⁺ T 세포는 IL2v 분자가 PD1 부분에 연결된 경우, 오직 PD1-IL2v 처리시에만 확대되었다. PD1-IL2v 처리시 증대된 종양 항원-특이성 CD8⁺ T 세포 생성은 종양 부위에서 CD8⁺ T 세포의 증가된 침윤으로 번역된 반면, DP47-IL2v와 병용된 항-PD1의 처리는 종양내 CD8⁺ T 세포를 단지 보통으로 증가시켰다(도 2C). 예를 들어 항-PD-L1 또는 항-PD1에 사용된 바와 같은 "항-PD"란 용어는 도 2A 내지 2C, 도 3D 및 도 4A 및 4B에서 "aPD"라 약기된다.To evaluate the effect of the bi-specific molecule PD1-IL2v on CD8 ⁺ T cell targeting, tumor-bearing Rip-Tag5 mice were treated with PD1-IL2v for 14 days. Expansion of total CD8 ⁺ T cells and CD8 ⁺ T cells reactive to the tumor antigen TAG in the spleen was measured by flow cytometry and single treatment of anti-PD1, DP47-IL2v, anti-PDL1 and anti-PD1 + DP47- compared to IL2v combination treatment. Two concentrations were used for anti-PD1; Anti-PD1-low is equimolar with PD1 in the bi-specific molecule and anti-PD1-high is the therapeutic dose used for this drug. Treatment with DP47-IL2v alone or in combination with anti-PD1 produced a 3- to 4-fold increase in total CD8 ⁺ T cells compared to untreated control mice ( FIG. 2A ). Similarly, PD1-IL2v treatment elicited a 2.5-fold expansion of total CD8 ⁺ T cells in the spleen of Rip-Tag5 mice ( FIG. 2A ). DP47-IL2v potently increased the total CD8 ⁺ T cell population, but TAG-specific CD8 ⁺ T cells expanded only upon PD1-IL2v treatment when the IL2v molecule was linked to the PD1 moiety. Enhanced tumor antigen-specific CD8 ⁺ T cell production upon treatment with PD1-IL2v translated into increased infiltration of CD8 ⁺ T cells at the tumor site, whereas treatment of anti-PD1 in combination with DP47-IL2v resulted in intratumoral CD8 ⁺ T Cells only increased to moderate ( FIG. 2C ). For example, the term “anti-PD” as used in anti-PD-L1 or anti-PD1 is abbreviated as “aPD” in FIGS. 2A-2C, 3D and 4A and 4B.

치료학적 상황에서 PD1-IL2v의 효능을 평가하기 위해서, Rip-Tag5 마우스를 8주 동안 PD1-IL2v로 처리하였다. Rip-Tag5 마우스를 초음파 영상화에 의해 측정된 종양 크기를 기준으로 시험에 등록시키고 종양 성장을 12주 기간에 걸쳐 모니터하였다. 누적 출발 종양 크기 범위는 20 내지 40 ㎟이었다. RipTag5 마우스에서 발생한 췌장 신경내분비 종양(PanNET)은 처리되지 않은 마우스에서 4주의 배가 시간 비율로 성장하였다(도 3A). PD1-IL2v의 처리는 모든 마우스에서 종양 크기 수축을 도출하였다. 상기 처리의 처음 4주의 초기 감소 후에 상기 마우스의 50%가 PD1-IL2v에 대한 내성을 획득하였으며 종양이 진행하였다(도 3B).To evaluate the efficacy of PD1-IL2v in a therapeutic setting, Rip-Tag5 mice were treated with PD1-IL2v for 8 weeks. Rip-Tag5 mice were enrolled in the trial based on tumor size measured by ultrasound imaging and tumor growth was monitored over a 12-week period. The cumulative starting tumor size ranged from 20 to 40 mm 2 . Pancreatic neuroendocrine tumors (PanNET) developed in RipTag5 mice grew at a doubling time rate of 4 weeks in untreated mice (Fig. 3A). Treatment with PD1-IL2v induced tumor size contraction in all mice. After an initial decrease in the first 4 weeks of the treatment, 50% of the mice acquired resistance to PD1-IL2v and tumors progressed ( FIG. 3B ).

PD1-IL2v 치료법에 대해 획득된 내성의 기전을 조사하기 위해서, PD-IL2v에 대한 종양 내성을 분석하였다. 상기 재발된 종양의 분석은 특히 CD31 양성 종양 혈관구조상에서 PDL1의 상향조절을 밝혀내었다(도 3C). 처리되지 않은 PanNET 종양은 PDL1에 대해 음성 염색되었으며, 이는 PD1-IL2v상에서 관찰된 PDL1의 상향조절이 내성의 기전일 수 있음을 가리킨다(도 3C). 우리는 PD1-IL2v와 항-PDL1과의 병용이 종양 재발을 방지하는 추가적인 치료학적 이득을 생성시킴을 제기하였다. 종양 함유 Rip-Tag5 마우스에서 항-PDL1 단독요법이 종양 퇴행을 생성시키지 못한 반면(도 3D), PD1-IL2v와 병용된 항-PDL1은 PD1-IL2v 단독요법을 실질적으로 개선시켰다. 12주의 관찰된 시간 범위에 걸쳐, 항-PDL1과 병용된 PD1-IL2v로 처리된 모든 마우스는 상기 병용 요법에 대한 내성의 발생 없이 종양 퇴행을 보였다(도 3E). 종양 성장 곡선의 분석은 PD1-IL2v에 비해, 상기 병용 요법이 처음 2주의 처리 기간내에 증대된 종양 퇴행률을 생성시킴을 밝혀내었으며, 이는 초기 시점에서의 PDL1의 차단이 PD1-IL2v 단독요법의 개선에 필요할 수 있음을 가리킨다. 환언하면, 상기 데이터는 PD1-IL2v와 항-PDL1과의 병용이 PD1-IL2v의 치료학적 효능을 증가시키고 PanNET의 마우스 모델에서 종양 재발을 방지함을 밝혀내었다.To investigate the mechanism of acquired resistance to PD1-IL2v therapy, tumor resistance to PD-IL2v was analyzed. Analysis of the relapsed tumors revealed upregulation of PDL1, particularly on CD31 positive tumor vasculature ( FIG. 3C ). Untreated PanNET tumors stained negative for PDL1, indicating that the upregulation of PDL1 observed on PD1-IL2v may be a mechanism of resistance ( FIG. 3C ). We propose that the combination of PD1-IL2v with anti-PDL1 produces an additional therapeutic benefit in preventing tumor recurrence. Anti-PDL1 monotherapy did not produce tumor regression in tumor bearing Rip-Tag5 mice ( FIG. 3D ), whereas anti-PDL1 in combination with PD1-IL2v substantially improved PD1-IL2v monotherapy. Over the observed time span of 12 weeks, all mice treated with PD1-IL2v in combination with anti-PDL1 showed tumor regression without development of resistance to the combination therapy ( FIG. 3E ). Analysis of tumor growth curves revealed that compared to PD1-IL2v, the combination therapy produced an enhanced tumor regression rate within the first 2 weeks of treatment period, suggesting that blockade of PDL1 at the initial time point was the result of PD1-IL2v monotherapy. Indicates that improvement may be necessary. In other words, the data revealed that the combination of PD1-IL2v with anti-PDL1 increased the therapeutic efficacy of PD1-IL2v and prevented tumor recurrence in a mouse model of PanNET.

종양-함유 Rip-Tag5 마우스에게 PD1-IL2v 및 항-PD-L1에 의한 병용 약물 처리를 가하고, 종양 진행을 16주간 초음파 영상화에 의해 모니터하였다. 도 4A는 생존 그래프로서 표현된 반응률을 나타낸다. 상기 PD-IL2v에서 2마리의 마우스 및 상기 PD1-IL2v + 항-PD-L1 처리 군에서 한 마리의 마우스가 완전한 반응으로 인해 고혈당증이 발생하였으며 이들을 안락사시켜야 했다. 이들 마우스는 그래프에서 여전히 완전한 반응자로서 간주되었다. 도 4B는 항-PD-L1과 병용된 PD1-IL2v 처리시의 완전한 반응자를 포함하여, 0 및 2주의 항-PD-L1 및 PD1-IL2v + 항-PD-L1 처리시의 종양의 전형적인 초음파 영상을 도시한다.Tumor-bearing Rip-Tag5 mice were subjected to concomitant drug treatment with PD1-IL2v and anti-PD-L1, and tumor progression was monitored by ultrasound imaging for 16 weeks. 4A shows response rates expressed as survival graphs. Two mice in the PD-IL2v and one mouse in the PD1-IL2v + anti-PD-L1 treated group developed hyperglycemia due to a complete response and had to be euthanized. These mice were still considered complete responders in the graph. 4B is a typical ultrasound image of tumors at 0 and 2 weeks of anti-PD-L1 and PD1-IL2v plus anti-PD-L1 treatment, including complete responders upon PD1-IL2v treatment in combination with anti-PD-L1. shows

SEQUENCE LISTING <110> F.Hoffmann-La Roche AG <120> Combination therapy of PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines and antibodies against human PD-L1 <130> P36348 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 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Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe 260 265 270 Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala 305 310 315 320 Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg 325 330 335 Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Lys Glu Gln Met 340 345 350 Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro 355 360 365 Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn 370 375 380 Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 405 410 415 Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 420 425 430 Lys Ser Leu 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Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 27 <211> 592 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser 450 455 460 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 465 470 475 480 Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr 485 490 495 Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu 500 505 510 Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val 515 520 525 Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu 530 535 540 Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr 545 550 555 560 Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe 565 570 575 Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 580 585 590 <210> 28 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223 > Synthetic Construct <400> 28 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val T yr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 29 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser S er Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims

암의 치료에서 병용 요법으로서 사용하기 위한, 전이의 예방 또는 치료에서 병용 요법으로서 사용하기 위한, 또는 T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능의 자극에 병용 요법으로서 사용하기 위한, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인으로서,
상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인이
a) 서열번호 5의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 6의 경쇄 가변 도메인 VL, 및 서열번호 2의 폴리펩타이드 서열, 또는
b) 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는
c) 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는
d) 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 폴리펩타이드 서열
을 포함하고;
상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체가
a) 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL, 또는
b) 서열번호 19의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 20의 경쇄 가변 도메인 VL
을 포함하는,
인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.Binds to human PD-L1 for use as a combination therapy in the treatment of cancer, for use as a combination therapy in the prevention or treatment of metastases, or for use as a combination therapy in the stimulation of an immune response or function, such as T cell activity A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in combination with an antibody comprising:
The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine used in the combination therapy is
a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 5 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 6, and the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, or
b) the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or
c) the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, or
d) the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14
comprising;
The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is
a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16, or
b) heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 19 and light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 20
containing,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine for use in combination with an antibody that binds to human PD-L1.

제1항에 있어서,
암의 치료에 사용하기 위한, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.The method of claim 1,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to human PD-L1 for use in the treatment of cancer.

제2항에 있어서,
유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 흑색종암, 방광암, 신세포암, 신장암, 간암, 두경부암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 위암종암, 식도암, 중피종, 전립선암, 백혈병, 림프종 또는 골수종의 치료에 사용하기 위한, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.3. The method of claim 2,
Breast cancer, lung cancer, colon cancer, ovarian cancer, melanoma cancer, bladder cancer, renal cell cancer, kidney cancer, liver cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, melanoma, pancreatic cancer, gastric carcinoma, esophageal cancer, mesothelioma, prostate cancer, leukemia, lymphoma or myeloma A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to human PD-L1 for use in therapy.

제1항에 있어서,
전이의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.The method of claim 1,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to human PD-L1 for use in the prevention or treatment of metastasis.

제1항에 있어서,
종양 면역성과 같은 면역 관련 질병을 치료하거나 그의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.The method of claim 1,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to human PD-L1 for use in treating or delaying the progression of an immune related disease, such as tumor immunity.

제1항에 있어서,
T 세포 활성과 같은 면역 반응 또는 기능을 자극하는데 사용하기 위한, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.The method of claim 1,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to human PD-L1 for use in stimulating an immune response or function, such as T cell activity.

i) 종양에서 종양 성장의 억제; 및/또는
ii) 종양이 있는 피실험자의 중간 및/또는 전체 생존의 증대
에 사용하기 위한, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인으로서,
상기 PD-1이 면역세포, 특히 T 세포상에, 또는 종양 세포 환경에 제시되고,
상기 병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인이
a) 서열번호 5의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 6의 경쇄 가변 도메인 VL, 및 서열번호 2의 폴리펩타이드 서열, 또는
b) 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는
c) 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열, 또는
d) 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 폴리펩타이드 서열
을 포함하고;
상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체가
a) 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL, 또는
b) 서열번호 19의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 20의 경쇄 가변 도메인 VL
을 포함하는,
인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.i) inhibition of tumor growth in a tumor; and/or
ii) an increase in median and/or overall survival of subjects with tumors
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to human PD-L1 for use in
wherein said PD-1 is presented on immune cells, particularly T cells, or in the environment of tumor cells,
The PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine used in the combination therapy is
a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 5 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 6, and the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, or
b) the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or
c) the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, or
d) the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14
comprising;
The antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is
a) the heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and the light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16, or
b) heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 19 and light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 20
containing,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine for use in combination with an antibody that binds to human PD-L1.

제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인이 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함하고; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체가 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하는, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.8. The method according to any one of claims 1 to 7,
wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in combination therapy comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; PD-1 used in combination with an antibody that binds to human PD-L1, wherein the antibody binding to human PD-L1 used in the combination therapy comprises a heavy chain variable domain VH of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable domain VL of SEQ ID NO: 16 -targeted IL-2 mutant immunocytokine.

제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
병용 요법에 사용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인이 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열을 포함하고; 상기 병용 요법에 사용되는 인간 PD-L1에 결합하는 항체가 아테졸리주맙인, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.9. The method according to any one of claims 1 to 8,
wherein the PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine used in combination therapy comprises the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; A PD-1-targeted IL-2 mutant immunocytokine used in combination with an antibody that binds to human PD-L1, wherein the antibody that binds to human PD-L1 used in the combination therapy is atezolizumab.

제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
면역사이토카인의 항체 성분 및 항체가 인간 IgG1 하위부류 또는 인간 IgG4 하위부류의 것인, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.10. The method according to any one of claims 1 to 9,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to human PD-L1, wherein the antibody component of the immunocytokine and the antibody are of a human IgG1 subclass or a human IgG4 subclass.

제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
항체가, 감소되거나 최소의 효과기 기능을 갖는, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.11. The method according to any one of claims 1 to 10,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to human PD-L1, wherein the antibody has reduced or minimal effector function.

제11항에 있어서,
최소의 효과기 기능이 무효과기(effectorless) Fc 돌연변이로부터 생성되는, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.12. The method of claim 11,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine for use in combination with an antibody that binds to human PD-L1, wherein minimal effector function results from an effectorless Fc mutation.

제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
무효과기 Fc 돌연변이가 L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A 또는 D265A/N297A인, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.13. The method according to any one of claims 1 to 12,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds human PD-L1, wherein the nullifying Fc mutation is L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A or D265A/N297A.

제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
환자가 면역요법으로 치료되거나 사전-치료되는, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.14. The method according to any one of claims 1 to 13,
A PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds human PD-L1, wherein the patient is pre-treated or treated with immunotherapy.

제14항에 있어서,
면역요법이 입양세포 전달, 단클론 항체의 투여, 사이토카인의 투여, 암 백신의 투여, T 세포 관여 요법 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.15. The method of claim 14,
PD-1 in combination with an antibody that binds to human PD-L1, wherein the immunotherapy comprises adoptive cell transfer, administration of monoclonal antibodies, administration of cytokines, administration of cancer vaccines, T cell engaging therapy, or any combination thereof. -targeted IL-2 mutant immunocytokine.

제15항에 있어서,
입양세포 전달이 키메라 항원 수용체 발현 T 세포(CAR T 세포), T 세포 수용체(TCR) 변형된 T 세포, 종양-침윤성 림프구(TIL), 키메라 항원 수용체(CAR) 변형된 자연살해 세포, T 세포 수용체(TCR) 형질도입된 세포, 수지상 세포 또는 이들의 임의의 조합을 투여함을 포함하는, 인간 PD-L1에 결합하는 항체와 병용되는 PD-1-표적화된 IL-2 변이체 면역사이토카인.16. The method of claim 15,
Adoptive cell transfer is chimeric antigen receptor expressing T cells (CAR T cells), T cell receptor (TCR) modified T cells, tumor-infiltrating lymphocytes (TIL), chimeric antigen receptor (CAR) modified natural killer cells, T cell receptors. (TCR) a PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokine in combination with an antibody that binds to human PD-L1 comprising administering a transduced cell, dendritic cell, or any combination thereof.