KR20220024044A - 락토-ｎ-네오테트라오스의 정제 방법 - Google Patents

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스테판 제네바인
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크리스찬 한센 에이치엠오 게엠베하
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Abstract

발효 브로스로부터 LNnT(락토-N-네오테트라오스)를 정제하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 발효 브로스를 막 여과의 제1 단계에 적용하여 여과된 용액을 제공하고, 이러한 여과된 용액이 모의 이동층 크로마토그래피의 제2 단계를 거쳐 이의 정제된 용액을 수득한 다음 상기 정제된 용액을 결정화의 제3 단계에 적용하여 관심 LNnT를 함유하는 결정을 수득하고, 상기 결정을 건조의 제4 및 최종 단계에 적용하여 LNnT의 고도로 정제된 분말을 제공함을 포함한다.

Description

락토-Ｎ-네오테트라오스의 정제 방법
본 발명은 LNnT(락토-N-네오테트라오스, Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)의 정제 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 발효 공정으로부터 수득된 LNnT로부터 정제 공정을 통한 부산물, 불순물 및/또는 오염물의 분리에 관한 것이다.
모유는 유아의 발달을 위한 최고의 식단으로 간주된다. 이것은 지방, 단백질, 비타민, 미네랄, 미량 원소 및 복합 올리고당으로 구성된다. 락토스 외에도, 모유 및 다른 포유류의 우유는 모유 올리고당(HMO)으로도 알려진 각종 구조적으로 다양한 올리고당을 함유한다(Usashima T. et al., (2011) Milk 20 Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York ISBN 978-1-61122-831-1). 오늘날 모유에서 발견되는 150가지 이상의 구조적으로 다른 올리고당이 있는 것으로 생각된다. 거의 예외없이, HMO는 한편으로는 이들의 환원 말단에 락토스 이당류 잔기를 특징으로 한다. 다른 한편으로, 많은 HMO는 이들의 비환원 말단에 푸코스 잔기, 갈락토스 잔기 또는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 함유한다. 또한, 선형 및 측쇄 대표들이 있다. 일반적으로, HMO의 단당류 잔기는 D-글루코스, D-갈락토스, N-아세틸글루코사민, L-푸코스 및 N-아세틸뉴라민산(후자는 시알산 또는 락타민산으로 더 잘 알려져 있음)이다. 유아 영양을 위한 HMO의 중요성은 병원체로부터 신생아를 보호하고 유아의 면역계 및 인지 능력의 발달을 지원하는 것을 포함하는 이들의 생물학적 활성과 직접적으로 연관되어 있다. 또한, HMO는 비피도박테리아 또는 락토바실러스와 같은 유익한 박테리아의 기질로서 역할을 한다.
모유 올리고당의 화학적 합성과 관련된 문제로 인해, 몇 가지 효소적 방법과 발효적 접근법이 개발되었다. 특히, 발효 접근법은 수백 가지의 상이한 개별 화합물을 함유하는 매우 복잡한 발효 브로스(fermentation broth)로부터의 원하는 올리고당의 정제를 필요로 한다. 발효 브로스 단독의 탄수화물 분획은 단당류 및 올리고당의 복합 혼합물 뿐만 아니라 기질(예를 들어, 락토스, 프럭토스, 글루코스, 사카로스 및 탄소원으로서 사용되는 기타 당), 생합성 중간체, 개별 단당류(예를 들어 글루코스, 갈락토스, N-아세틸글루코사민, 푸코스 및 N-아세틸뉴라민산), 대사 부산물 및 미생물에 의해 합성되는 기타 올리고당 및 다당류를 포함한 이들의 유도체로 구성된다. 또한, 발효 브로스에서 발생하는 많은 올리고당의 구조는 확인하기 어렵다(예를 들어, 세포 표면 글리코실화 구조와 같이 자연적으로 합성 숙주에 의해 생산된 올리고당 또는 스트레스의 결과로서 유기체에 의해 생산된 올리고당). 따라서, 다수의 경우에 생명공학 산물의 정제는 이들의 발효에 의한 생산보다 훨씬 비용이 많이 들고 시간-소모적일 수 있다.
특히, 락토-N-네오테트라오스의 발효는 종종 락토-N-네오테트라오스의 생합성에서 생합성 중간체인 락토-N-트리오스 II(LNT II, GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)의 과도한 합성과 관련이 있으며, 이것은 목적하는 LNnT로 추가 전환되기 전에 종종 세포에서 배지로 내보내진다. 또한, 파라-락토-N-네오헥사오스(pLNnH, Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)는 LNnT가 내보내지는 대신 N-아세틸글루코사민(GalNAc) 및 글루코스로 추가 전환될 때 종종 부산물로서 발생하며, 심지어 파라-락토-N-네오옥타오스(pLNnO, Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)도 추가적으로 연장된 유도체로서 검출되었다. 마지막 부산물은 발효 동안 형성되는 글루코실락토스(GlcLac), 갈락토실락토스(GalLac), 글루코실화된 LNnT 및 갈락토실화된 LNnT를 통해 나타난다. 그러나, 락토-N-트리오스 II 또는 pLNnH 또는 pLNnO에 대한 중간체와 같이 비환원 말단에 GalNAc를 지닌 올리고당은 글리코시다제 처리에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 또한, 탄수화물(예를 들면 수크로스 또는 락토스)의 오토클레이빙(열 처리)은 알돌- 또는 마이야르-산물과 같은 원치 않는 부산물의 형성으로 이어질 수 있다. 이성체화 반응(예를 들어, 락토스에서 락툴로스로의 전환)은 또한 일반적으로 더 큰 오염을 가져오고 올리고당-이성체를 생성할 수 있다. 열 처리로 인한 부산물 형성을 피하기 위해, 기질과 C-소스는 종종 멸균 여과되지만 외부 성장 오염의 위험이 있다.
미생물 발효에 의한 모유 올리고당의 생산을 위해, 재조합 미생물(재조합 박테리아 또는 효모 균주)이 사용된다. 따라서, 이러한 발효 공정은 식품 산업 분야에서 매우 중요한 것으로 간주되는 유전자 변형 유기체(GMO)에 의존하고 있다. 따라서, 원하는 산물은 결과적으로 고객 및 규제 당국의 승인을 얻기 위해 세포, 세포 단편, 내독소 및 과도한 염과 같은 GMO 공정 잔류물로부터 정제되어야 한다. 따라서 락토-N-네오테트라오스는 DNA 및 RNA와 같은 재조합 핵산과 재조합 단백질로 이루어진 복합 혼합물을 포함하는 발효 브로스로부터 정제되어야 한다. 또한, 미생물 발효는 특히 대장균이 사용될 때 상당한 양의 내독소를 함유한다. 그러나, 재조합 DNA, 내독소 또는 단백질에 의한 인간 소비용 산물의 오염은 규제 당국이나 소비자가 허용하지 않는다. 따라서, 재조합 미생물로부터 생성된 임의의 핵산 및 단백질은 원하는 모유 올리고당으로부터 제거될 필요가 있다.
개별 올리고당을 정제하기 위한 공지된 방법은 기술적으로 복잡하고 종종 비경제적이며, 이러한 미가공 화합물이 발효 브로스로부터 유사하게 구축된 여러 작제물의 혼합물로서 수득되는 경우, 특히 상기 올리고당이 식품 용도로 의도되는 경우에 특히 그러하다. 유청 또는 당밀과 같은 복잡한 혼합물로부터 식품-등급 이당류인 락토스 또는 수크로스를 산업적으로 정제하기 위해, 다중 결정화 단계를 포함하는 생산적인 톤-규모 공정이 개발되었다. 그러나, 일반적으로 HMO, 보다 구체적으로, 락토-N-네오테트라오스는 오늘날까지 특히 발효 브로스로부터 유래되는 경우 정제하기 어려운 것으로 판명되었다. LNnT의 경우, 합성적으로 생산한 다음 생성된 산물을 결정화하여 식품 성분으로 사용할 수 있도록 하는 공정이 개발되었다. 그러나, 이 공정에서, 발효로부터의 허브 산물은 포함되지 않지만 공정은 거의 순수한 산물을 생산하며, 이것은 그후 경제적인 이유로 결정 물질로 단리된 다음 추가로 처리된다.
다양한 HMO의 단리, 특성화 및 결정화에 대한 초기 연구는 1950년대 Richard Kuhn과 동료에 의해 수행되었으며, 여기서 이러한 화합물은 활성탄/셀라이트 컬럼에서 크로마토그래피 정제를 통해 모유 탄수화물 분획으로부터 단리되었다. Kuhn 등으로부터 결정화된 첫 번째 HMO는 락토-N-비오스 I(Kuhn et al., Chem. Ber. 1954, 87(10), 1553-1560)이었고 다음 해에 무수히 많은 다른 탄수화물이 뒤따랐다: 락토-N-테트라오스(Kuhn et al., Chem. Ber. 1953, 86(6), 827-830; Chem. Ber. 1954, 87(3), 289-300; Chem. Ber. 1956, 89(2), 504-511), 락토-N-푸코펜타오스 I(Kuhn et al., Chem. Ber. 1956, 89(11), 2514-2523), 2'-푸코실락토스(Kuhn et al., Chem. Ber. 1955, 88(8), 1135-1146; 1956, 89(11), 2513), 락토-N-트리오스 I & II(Kuhn et al., Chem. Ber. 1956, 89(4), 1027-1033) 및 락토-N-네오테트라오스(Kuhn et al., Chem. Ber. 1962, 95(11), 518-522).
락토-N-네오테트라오스 및 밀접하게 관련된 모유 올리고당 락토-N-테트라오스(Glc(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)의 정제를 위해 크로마토그래피 공정, 특히 겔 여과 크로마토그래피가 사용되었다(Dumon et al., 2001 Glycoconj. J. 18(6), 465-474; Priem et al., Glycobiology 2002, 12(4), 235-240; Baumgartner et al., Chem. Bio. Chem. 2014 15(13), 1896-1900, Sprenger et al., 2017, J. Biotechnol. 258, 79-91). 이와 관련하여, 겔 여과 크로마토그래피를 통한 정제는 산업적 규모의 식품에 적합하지 않지만, 모의 이동층(simulated moving bed) 크로마토그래피는 정제된 LNnT를 최종 산물로서 생성하는 다른 정제 단계와 조합되어 식품 생산을 위한 LNnT의 정제에 적합한 방법으로 간주될 수 있다.
락토-N-네오테트라오스의 미생물 발효에서는, 트리오스(LNT II, GlcLac, GalLac)와 같은 다른 많은 탄수화물 및 헥사오스(pLNnH)와 같은 장쇄 올리고당도 형성될 수 있다. 또한, 생산된 올리고당의 가수분해 산물이 발효 및 후처리 공정 동안 형성된다. 여러 정제 단계를 포함하는 정제 공정을 사용하여, LNnT를 더 많은 양, 더 높은 순도 및 더 높은 수율로 수득할 수 있어, 이를 식품 조제식의 성분으로 또는 화장품 또는 의료 용도로 적합하게 만든다.
본 발명의 방법은 고체 분말 산물을 생성하는 선행 기술 방법에 대한 비용-효율적인 대안을 나타내며, 특히 영양학적 용도를 위한 및 특히 영유아 영양 제품, 의료용 영양 제품, 건강 보조 식품 또는 일반 영양 제품을 위한 락토-N-네오테트라오스의 정제와 관련이 있다.
공지된 공정의 이러한 모든 단점을 극복하기 위해, 본 발명은 발효 공정으로부터 수득된 락토-N-네오테트라오스의 정제를 위한 간단하고 비용 효율적이며 확장 가능한 신규한 정제 공정을 제공한다.
본 발명은 미생물 발효로부터 락토-N-네오테트라오스를 정제하기 위한 간단하고 경제적인 방법에 관한 것이다. 락토-N-네오테트라오스의 미생물 발효에 의해 트리오스와 같은 여러 다른 탄수화물 및 헥사오스와 같은 장쇄 올리고당도 형성될 수 있다. 또한, 생산된 올리고당의 가수분해 산물이 발효 및 후처리 공정 동안 형성된다.
본 발명의 목적은 발효 공정으로부터 수득된 정제된 락토-N-네오테트라오스를 주 생성물로서 수득하는 반면 락토-N-트리오스 II 및/또는 파라-락토-N-네오헥사오스 및/또는 파라-락토-N-네오옥타오스 및/또는 글루코실락토스 및/또는 갈락토실락토스와 같은 부산물, 불순물 및/또는 기타 오염물은 이러한 주 생성물로부터 분리하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 확장 가능한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, 및 ≥95%의 순도를 갖는 락토-N-네오테트라오스를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 정제 방법의 단계의 일반적인 도식을 보여준다.
도 2는 80 L의 보유물(retentate) 용적에 대한 실시예 1의 보유물 분석을 보여준다.
도 3은 60 L의 보유물 용적에 대한 실시예 1의 보유물 분석을 보여준다.
도 4는 40 L의 보유물 용적에 대한 실시예 1의 보유물 분석을 보여준다.
도 5는 20 L의 투과물(permeate) 1의 보유물 용적에 대한 실시예 1의 투과물 분석을 보여준다.
도 6은 20 L의 투과물 2의 보유물 용적에 대한 실시예 1의 투과물 분석을 보여준다.
도 7은 실시예 4에서 사용된 탄수화물 혼합물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 8은 실시예 4에서 사용된 탄수화물 혼합물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 9는 실시예 4에서 사용된 탄수화물 혼합물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 10은 실시예 5에서 결정화 후에 수득된 탄수화물 혼합물의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 11은 실시예 6에서 1차 결정화 후에 수득된 탄수화물 혼합물의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 12는 실시예 6에서 2차 결정화 후에 수득된 탄수화물 혼합물의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 13은 실시예 7에서 결정화 후에 수득된 탄수화물 혼합물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 14는 실시예 8에서 겔 여과를 통해 수득된 시드 결정의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 15는 실시예 9에서 사용된 LNnT 출발 물질의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 16은 실시예 9에서 사용된 LNnT 생성물의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 17은 실시예 10에서 수득된 LNnT 생성물의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 18은 실시예 11에서 수득된 LNnT 생성물의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 19는 실시예 12에서 수득된 LNnT 생성물의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 20은 실시예 13에서 균질화 후 수득된 탄수화물 혼합물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 21은 실시예 14에서 균질화 후 수득된 탄수화물 혼합물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 22는 실시예 15에서 수득된 LNnT 생성물의 HPAEC-PAD(펄스 전류측정 검출을 사용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 23은 도 16 내지 19에서 사용된 결정질 LNnT 출발 물질의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 24는 실시예 17에서 수득된 균질화된 LNnT 생성물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 25는 실시예 18에서 수득된 균질화된 LNnT 생성물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 26은 실시예 19에서 수득된 균질화된 LNnT 생성물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
도 27은 실시예 20에서 수득된 균질화된 LNnT 생성물의 HILIC-CAD(하전 에어로졸 검출기에 결합된 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 스펙트럼을 보여준다.
미생물 발효 공정으로부터 수득된 정제된 락토-N-네오테트라오스를 주 생성물로서 수득하는 반면 락토-N-트리오스 II 및/또는 글루코실락토스 및/또는 갈락토실락토스 및/또는 파라-락토-N-네오헥사오스 및/또는 파라-락토-N-네오옥타오스와 같은 부산물, 불순물 및/또는 기타 오염물은 이러한 주 생성물로부터 분리하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 확장 가능한 방법이 제공된다.
본 발명은 미생물 발효 공정에 의해 수득된 발효 브로스로부터 배치식으로 또는 연속식으로 락토-N-네오테트라오스(LNnT)를 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 및/또는 95% 이상의 순도를 갖는 정제된 LNnT가 제공된다. 발효 브로스는 중성 HMO, 바이오매스(biomass), 배지 성분(medium component), 오염물 및, LNnT 이외의 탄수화물을 함유한다. 발효 브로스에서 LNnT의 순도는 ≤60%이다.
본 출원의 본 발명의 방법은 출발 물질로서 다른 것들 중에서도 LNnT 및 다른 오염물, 예를 들어 트리오스, 헥사오스 및/또는 테트라오스를 포함하는 발효 브로스를 사용하며, 이러한 발효 브로스는 미생물 발효 공정으로부터 수득된다. 발효 브로스에서 LNnT의 순도는 ≤60%이다. 발효 브로스는 다음의 정제 단계를 거친다:
1) 용액의 적어도 하나의 막 여과 단계로서, 용액은 발효 브로스이고, 발효 브로스는 미생물 발효 공정으로부터 수득된 탄수화물의 혼합물을 함유하며 표준 다운스트림 프로토콜을 실행한 후 나노여과를 거쳐 펜타오스 및/또는 헥사오스와 같은 고급 당류의 함량을 10% 미만으로 상당히 감소시키고 여과된 용액에서 LNnT의 순도는 60% 이상, 65% 이상 또는 70% 이상이고;
2) 적어도 하나의 SMB 크로마토그래피 단계로서, 다음 단계에서 결정화를 적절하게 만들기 위해 헥사오스의 잔여량을 5% 미만으로 설정하고, 생성된 정제된 용액에서 LNnT의 순도는 75% 이상 또는 80% 이상이며;
3) 물로부터의 적어도 하나의 결정화 단계로서, 배수하고 이들의 농도를 3% 미만으로 설정함으로써 남아있는 더 작은 당류를 씻어내기 위해 처리되고 알콜, 알콜/물 혼합물 또는 용매 또는 용매/물 혼합물로 세척된 결정 매스(crystal mass)를 수득하고, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 생성된 결정에서의 LNnT의 순도를 수득하며;
4) 동결 건조, 분무 건조, 드럼/롤러 건조, 진공 드럼/롤러 건조, 밴드(band) 건조 또는 진공 밴드 건조에 의한 수득된 배수된 결정 매스의 균질화의 적어도 하나의 단계;
여기서 ≥90%의 순도를 갖는 정제된 LNnT를 함유하는 생성물이 제공된다.
본 발명의 방법의 제1 단계로서 막 여과는 더 작은 분자량의 원하는 LNnT로부터 더 높은 분자량을 갖는 올리고당의 함량을 감소시키기 위해 사용된다. 막 여과에 사용될 수 있는 다수의 상이한 유형의 막이 있지만 이들은 탄수화물에 대한 적합성에 있어서 모두 상이하다. 막에 사용되는 가장 일반적인 재료는 중합체 재료 및 세라믹 막 모듈이다. 중합체-막은 이들 고유의 유연성으로 인해 중공 섬유로서 또는 블록으로서 가공될 수 있지만, 세라믹 막은 중공 섬유 블록으로서 사용하는데 제한된다. 두 기술 모두는 혼합-재료-막으로 조합되거나 연속적으로 처리될 수 있지만 산업은 비용 및/또는 효율성 이유로 인해 주로 균질 재료의 생산에 집중한다.
락토-N-네오테트라오스보다 더 큰 분자량을 갖는 당류의 원하는 감소의 경우에, 막 여과 단계, 보다 구체적으로 나노여과 단계가 사용된다. 나노여과는 기본적으로 용해된 분자, 금속 이온 및 기타 입자를 분자량 컷오프(molecular weight cut-off)(MWCO) 한계 이상으로 유지하는 압력-구동식 막 공정이다. 나노여과에 사용되는 막은 ≤2nm의 기공 크기를 가지며, 이것이 이들을 한외여과 및 미세여과와 같은 다른 막 여과 방법에 사용되는 보다 조악한 막과 구별한다.
다른 막 여과 단계, 예를 들면 역삼투압과 비교하여, 나노여과는 상응하게 더 조악한 막 및 더 낮은 작동 압력을 사용한다. 그러나, 여과에 사용되는 막은 통상적으로 이들의 보유 특성 및/또는 온도 영향 또는 화학적 노출에 대한 내성이 제한되고/되거나 이에 크게 의존하므로, 방법의 적용이 본질적으로 물 및 수성 혼합물의 사용으로 제한된다. 락토-N-네오테트라오스는 707.6 Da의 분자량을 갖고 각각 1개 또는 2개의 단당류로 확장된 다음으로 큰 당류는 869.3 Da(LNnT + Glc/Gal), 910.3 Da(LNnT + GlcNAc) 및 1072.4 Da(LNnT + LacNAc)의 분자량을 갖는다. 따라서, 가능한 가장 작은 MWCO를 제공하는 나노여과 막(nanofiltration membrane)이 본 발명에서 사용되는 막이다. 본 발명에 사용된 막은 0.2 내지 3.5 kDa, 보다 바람직하게는 0.2 내지 2.0 kDa, 더욱 더 바람직하게는 0.2 내지 1.0 kDa의 MWCO를 갖는다.
LNnT보다 고급 당류 또는 일반적으로 트리오스보다 고급 당류의 감소를 수득하기 위해, 막에 압력을 적용함으로써 당 혼합물의 용액은 여과 공정에 착수한다. 3가지 당: LNnT, 헥사오스 및 트리오스가 분리에 사용되며, 이것은 또한 발효 브로스 혼합물에서 미생물 발효 공정에서 발생하는 부산물로서 존재한다.
이러한 첫 번째 막 여과 단계의 목적은 제1 접근법에서 후속 단계의 SMB 크로마토그래피 및 결정화를 가능한 한 효율적으로 만들기 위해 당 혼합물이 이에 맞춰 상대적으로 헥사오스를 덜 함유하도록 헥사오스를 고갈시키는 것이다. 대안적으로, 이러한 첫 번째 막 여과 단계는 제2 접근법에서 후속 SMB 크로마토그래피 단계 및 후속 결정화 단계 후에 정제된 LNnT를 수득할 수 있도록 하기 위해 트리오스에 비해 테트라오스 및 헥사오스 함량을 상대적으로 고갈시켜 최종적으로 보유물에서 LNnT 및 pLNnH를 풍부하게 하는데 사용될 수 있으며, 이러한 방식으로, 먼저 저급 당류를 제거한 다음 고급 당류를 제거한다.
LNnT를 포함한 적어도 2개, 바람직하게는 3개 또는 3개 이상의 올리고당의 수용액(여기서, 상기 올리고당 중 적어도 2개는 질량이 상이하고 모두는 박테리아 발효 공정으로부터 유래하며 미세여과, 한외여과, 음이온 및 양이온 교환, 활성탄 처리 및 이의 여과, 및/또는 정용여과 및 전기투석(ED)을 사용하여 당 성분까지의 정제 공정에 이미 착수한다)은 1-50bar, 보다 바람직하게는 2-30bar, 보다 바람직하게는 3-10bar 및 보다 바람직하게는 4-5bar의 압력을 적용함으로써 나노여과를 거친다. 막의 MWCO 한계는 0.2 내지 3.5kDa, 보다 바람직하게는 0.2 내지 2.0kDa, 보다 바람직하게는 0.2 내지 1.0kDa이다. 용액의 미리 설정된 당 농도는 0.01 내지 70%의 건조 고체 함량(DSC), 보다 바람직하게는 0.1 내지 60% DSC, 보다 바람직하게는 1 내지 50% DSC, 보다 바람직하게는 10 내지 40% DSC이다. 희석 계수는 0.01 내지 1 사이이다. 따라서, 희석 계수에 따라 보유물을 추가량의 물로 헹구어야 한다. 따라서 용리액(eluent)의 DSC는 0.01 내지 1의 계수까지 다양하다. 막 여과 단계로 헥사오스 함량은 보유물에서 20% 미만, 보다 바람직하게는 15% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만으로 감소된다.
막 여과 단계로부터 수득된 여과된 용액의 LNnT의 순도는 60% 이상, 65% 이상 또는 70% 이상이다.
추가의 실시양태로서, 트리오스 뿐만 아니라 테트라오스 및 헥사오스를 포함하는 혼합물로부터 트리오스를 분리하는 단계(여기서 이들 세 가지 유형의 당류는 당 용액의 주 성분일 수 있음)는 두 번째 막 여과 단계(이 경우 나노여과)를 통한 추가 정제를 허용하여, 적절한 재료와 기공 크기의 막을 선택함으로써 헥사오스를 감소시키고 최종적으로 정제된 LNnT 용액을 수득할 수 있다.
추가의 실시양태로서, 트리오스 뿐만 아니라 테트라오스 및 헥사오스를 포함하는 혼합물로부터 헥사오스를 분리하는 단계(여기서 이들 세 가지 유형의 당류는 당 용액의 주 성분일 수 있음)는 두 번째 막 여과 단계(이 경우 나노여과)를 통한 추가 정제를 허용하여, 적절한 재료와 기공 크기의 막을 선택함으로써 남아있는 트리오스를 감소시키고 최종적으로 정제된 LNnT 용액을 수득할 수 있다.
이러한 여과된 용액은 이제 특별히 채택된 매개변수에 의해 테트라오스를 함유하는 분획에 비해 헥사오스와 같은 특정 당 함유 분획의 함량을 조정하기 위해 사용되는 두 번째 모의 이동층 크로마토그래피(SMB 크로마토그래피) 단계를 거친다. 단계 1 막 여과로부터 생성된 용액인 여과된 용액은 20% 미만, 보다 바람직하게는 15% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만의 헥사오스 함량을 갖는다.
SMB 크로마토그래피의 단계는 중성 HMO-사당류 락토-N-네오테트라오스 및 기타 부산물 오염 물질을 포함하는 여과된 용액으로부터 연속 크로마토그래피에서 (또는 연속 방식으로) 추출물 또는 라피네이트(저급 당류의 것 또는 고급 당류의 것)가 사당류인 락토-N-네오테트라오스를 함유하는 HMO의 혼합물을 분리하기 위한 본 발명의 두 번째 단계를 제공하며, 여기서 여과된 용액은 락토-N-네오테트라오스의 혼합물을 포함하고 오염 물질은 단계 1, 막 여과로부터 유도된 용액을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 LNn 용액의 순도는 90% 미만이다.
여과된 용액은 모의 이동층 크로마토그래피를 사용한 적어도 하나의 정제 단계에 적용된다. 이러한 방식으로, 두 가지 용액이 수득되며, 이들 중 하나는 원하는 락토-N-네오테트라오스를 포함한다. 이러한 단계 2의 SMB 크로마토그래피를 적용한 후, 트리오스와 같은 저급 올리고당을 분리함으로써 또는 헥사오스와 같은 고급 당류를 분리함으로써 LNnT가 주로 추출물에 또는 라피네이트에 존재할 수 있다.
이러한 두 번째 모의 이동층 크로마토그래피 단계를 사용하여, 더 높은 순도를 갖는 LNnT가 연속 방식으로 제공된다. 따라서, 다량의 고품질 HMO가 매우 편리하고 경제적인 방식으로 제공될 수 있다. SMB 크로마토그래피 단계는 또한 이 단계에서 사용된 컬럼 재료(예를 들어, 양이온 컬럼 재료)의 재생 단계 없이도 매우 안정적이다. 바람직한 실시양태에서, 여과된 용액에서 LNnT의 순도는 60% 이상, 65% 이상 또는 70% 이상이다. "여과된 용액"이라는 용어는 단일 이동층 크로마토그래피의 정제 단계 이전의 LNnT를 함유하고 단계 1, 막 여과에서 생성된 용액을 지칭하는 반면 "정제된 용액"은 모의 이동층 크로마토그래피 단계 이후의 용액을 지칭한다.
적어도 하나의 모의 이동층 크로마토그래피 단계 2는 다음을 갖는다:
i) 적어도 4개의 컬럼, 바람직하게는 적어도 8개의 컬럼, 보다 바람직하게는 적어도 12개의 컬럼(여기서, 적어도 하나의 컬럼은 약한 또는 강한 양이온 교환 수지, 바람직하게는 H+-형태, Na+-형태, K+-형태 또는 Ca2 +-형태의 양이온 교환 수지를 포함한다); 및/또는
ii) 유속(flow rate)이 다른 4개의 구역 I, II, III 및 IV; 및/또는
iii) 물, 바람직하게는 에탄올과 물, 보다 바람직하게는 5-15 vol.-% 에탄올과 85-95 vol.-% 물, 가장 바람직하게는 9-11 vol.-% 에탄올과 89-91 vol.-% 물을 포함하거나 이로 구성된 용리액,
iv) 15℃ 내지 60℃, 바람직하게는 20℃ 내지 55℃, 보다 바람직하게는 25℃ 내지 50℃의 작동 온도.
정제하고자 하는 HMO가 락토-N-네오테트라오스이기 때문에, 적어도 하나의 모의 이동층 크로마토그래피 단계는 다음을 갖는다:
i) 유속이 다른 4개의 구역 I, II, III 및 IV(여기서, 유속은 바람직하게는: 구역 1에서는 22-32 ml/min, 구역 II에서는 17-23 ml/min, 구역 III에서는 18-25 ml/min 및/또는 구역 IV에서는 14-20 ml/min이다); 및/또는
ii) 0.5-4 ml/min, 바람직하게는 2 ml/min의 공급 속도; 및/또는
iii) 6-12 ml/min, 바람직하게는 8 ml/min의 용리액 유속; 및/또는
iv) 14-20 min, 바람직하게는 16-18 min, 보다 바람직하게는 17 min의 스위칭 시간(switching time). 바람직하게는, 컬럼 중 적어도 하나는 0.1 내지 5000 kg의 양이온 교환 수지, 바람직하게는 0.2 내지 500 kg의 양이온 교환 수지, 보다 바람직하게는 0.5 내지 50 kg의 양이온 교환 수지, 가장 바람직하게는 1.0 내지 20 kg의 양이온 교환 수지를 포함한다.
중요하게도, 양이온 교환 물질의 양, 다른 구역의 유속, 공급 속도, 용리액 유속 및/또는 스위칭 시간의 규모확장(scaling-up)이 가능하다. 규모확장은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000의 계수 또는 상기 값들 사이의 모든 가능한 스케일링 계수까지일 수 있다.
컬럼에서, 강한 양이온 교환 수지가 고정상으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 양이온 교환 수지는 설폰산 수지, 보다 바람직하게는 Purolite® PCR833H (Purolite, Ratingen, Germany), Lewatit MDS 2368 및/또는 Lewatit MDS 1368 수지이다. 양이온 교환 수지가 컬럼에 사용되는 경우, 이것은 황산으로 재생될 수 있다. 황산은 바람직하게는 10mM 이하의 황산 농도로 용리액에 사용될 수 있다. (강한) 양이온 교환 수지는 H+-형태 또는 Ca2+-형태로 존재할 수 있다.
60℃ 초과의 작동 온도는 모의 이동층 크로마토그래피 동안 바람직하지 않다. 특히 고정상으로서의 강한 양이온 교환 수지(H+-형태 또는 Ca2 +-형태)의 존재하에서, 적용된 중성 올리고당은 상당히 불안정화, 즉 해중합되어 LNnT의 최종 수율에 해로운 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 유리한 실시양태에서, 정제된 용액은 모의 이동층 크로마토그래피를 사용한 적어도 하나의 추가 정제 단계에 적용될 수 있으며, 여기서 >85%, 바람직하게는 >90%; 보다 바람직하게는 >93%의 순도를 갖는 중성 모유 올리고당을 포함하는 정제된 용액이 제공된다. 특히, 본 발명은 재조합 DNA가 없고 숙주 균주 단백질이 없는 HMO 산물을 생성한다.
추가의 모의 이동층 크로마토그래피는 다음을 갖는다:
i) 적어도 4개의 컬럼, 바람직하게는 적어도 8개의 컬럼, 보다 바람직하게는 적어도 12개 컬럼(여기서, 적어도 하나의 컬럼은 약한 또는 강한 양이온 교환 수지, 바람직하게는 H+-형태, Na+-형태, K+-형태 또는 Ca2 +-형태의 양이온 교환 수지를 포함한다); 및/또는
ii) 유속이 다른 4개의 구역 I, II, III 및 IV, 및/또는
iii) 물, 바람직하게는 에탄올과 물, 보다 바람직하게는 5-15 vol.-% 에탄올과 85-95 vol.-% 물, 가장 바람직하게는 9-11 vol.-% 에탄올과 89-91 vol.-% 물을 포함하거나 이로 구성된 용리액(여기서, 용리액은 임의로 황산, 바람직하게는 ≤10 mM 황산; 보다 바람직하게는 ≤2-5 mM 황산을 추가로 포함한다), 및/또는
iv) 15℃ 내지 60℃, 바람직하게는 20℃ 내지 55℃, 보다 바람직하게는 25℃ 내지 50℃의 작동 온도.
정제하고자 하는 HMO가 락토-N-네오테트라오스인 경우, 추가의 모의 이동층 크로마토그래피는 다음을 갖는다:
i) 유속이 다른 4개의 구역 I, II, III 및 IV(여기서, 유속은 바람직하게는: 구역 1에서는 22-32 ml/min, 구역 II에서는 18-23 ml/min, 구역 III에서는 19-25 ml/min 및/또는 구역 IV에서는 15-20 ml/min이다); 및/또는
ii) 1-4 ml/min, 바람직하게는 2 ml/min의 공급 속도; 및/또는
iii) 6-12 ml/min, 바람직하게는 9 ml/min의 용리액 유속; 및/또는
iv) 16-22 min, 바람직하게는 18-20 min, 보다 바람직하게는 19 min의 스위칭 시간.
특히, 컬럼 중 적어도 하나는 0.1 내지 5000 kg의 양이온 교환 수지, 바람직하게는 0.2 내지 500 kg의 양이온 교환 수지, 보다 바람직하게는 0.5 내지 50 kg의 양이온 교환 수지, 가장 바람직하게는 1.0 내지 20 kg의 양이온 교환 수지를 함유한다.
중요하게도, 양이온 교환 물질의 양, 다른 구역의 유속, 공급 속도, 용리액 유속 및/또는 스위칭 시간의 규모확장이 가능하다. 규모확장은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000의 계수 또는 상기 값들 사이의 모든 가능한 스케일링 계수까지일 수 있다. 모의 이동층 크로마토그래피를 사용한 정제 단계 후, 정제된 용액의 pH는 바람직하게는 염기를 첨가함으로써, 보다 바람직하게는 NaOH(예를 들어, 0.2M NaOH)를 첨가함으로써 pH 7로 조정될 수 있다.
모의 층 크로마토그래피 단계로부터 수득된 정제된 용액에서 LNnT의 순도는 75% 이상 또는 80% 이상이다.
이러한 정제된 용액은 이제 고도로 정제된 LNnT를 수득하기 위해 사용되는 세 번째 결정화 단계를 거친다. 단계 2, SMB 크로마토그래피로부터 생성된 정제된 용액은 20% 미만, 보다 바람직하게는 15% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만의 헥사오스 함량을 갖는다.
결정화 단계는 다음을 포함한다:
a) 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개 이상의 올리고당의 혼합물을 수득하는 단계, 여기서 이들 중 하나는 삼당류이거나 무작위 테트라오스보다는 저급 당류이고, 하나는 락토-N-네오테트라오스이고, 하나는 파라-락토-N-네오헥사오스이거나 언급된 올리고당의 무작위 테트라오스보다는 고급 당류이며, 단계 1 및 2 후 올리고당 중 하나가 바람직하게는 적어도 약 10% DSC, 특히 적어도 약 30% DSC, 특별히 적어도 약 50% DSC의 농도의 락토-N-네오테트라오스인 올리고당의 정제된 용액이 수득되며, 이 혼합물의 LNnT 순도는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 약 25%, 특히 적어도 약 40%, 특별히 적어도 약 60%이고,
b) 적어도 20-30℃, 바람직하게는 적어도 약 30-40℃, 바람직하게는 적어도 약 40-50℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 50-60℃의 출발 온도로부터 상기 올리고당의 혼합물을 결정화하고, 균질한 결정 매스를 수득하기 위해 적어도 40-50℃, 바람직하게는 적어도 약 30-40℃, 바람직하게는 적어도 약 20-30℃, 바람직하게는 적어도 약 10-20℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 0-10℃ 아래로 냉각시킴으로써 포화된 매스를 결정화되게 하는 단계,
c) 수득된 결정 매스를 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올 또는 글리콜 또는 글리세롤과 같은 알콜 용매 또는 임의의 다른 물질-혼화성 알콜 또는 용매 및 물의 혼합물로 엄격하게 처리하여(여기서, 용액의 알콜 또는 용매 함량은 10 내지 90 vol%, 바람직하게는 30 내지 80 vol%, 보다 바람직하게는 50 내지 70 vol%이다) 알콜 또는 용매-함유 용액 및 결정 매스의 혼합물을 생성하는 단계,
d) 결정 매스로부터 저급 당류의 함량을 감소시키기 위해 결정 매스의 알콜 또는 용매-함유 및 현재 당-함유 분획을 여과하는 단계, 바람직하게는 세척 공정은 저급 당류의 함량을 상기 결정 매스가 네 번째 균질화 단계를 거치기 전에 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 3% 미만인 특정 한계 미만으로 감소시키기 위해 적어도 2회 반복될 수 있다.
결정 매스 세척에 사용되는 알콜 또는 용매의 양은 중요하지 않지만, 10 킬로그램의 결정 매스당 적어도 약 40-100 L, 바람직하게는 약 30-70 L의 알콜 또는 용매가 사용된다. 바람직하게는, 알콜 또는 용매 용액은 작은 올리고당 부산물을 제거하기 위해 그후 여과된다. 현재 락토-N-네오테트라오스를 덜 함유하는 여과 후 알콜 또는 용매 용액을 필요에 따라 또 다른 결정화 사이클에서 사용하여 더 많은 락토-N-네오테트라오스를 제공할 수 있다. 그러나, 락토-N-네오테트라오스는 이러한 방식으로 정제될 수 있을 뿐만 아니라 상기 발효 브로스 또는 화학적 합성 또는 생체촉매작용에서 유래하는 삼당류 뿐만 아니라 펜토스, 헥사오스 및 옥타오스와 같은 고급 당류도 저급 올리고당을 이들 결정화 매스로부터의 알콜 또는 용매 함유 수성 혼합물로 세척함으로써 정제될 수 있다.
결정화 단계로부터 수득된 결정에서 LNnT의 순도는 85% 이상, 90% 이상 및 95% 이상이다.
결정은 이제 20% 이하의 잔류 수분 함량을 갖는 매우 균일하고 정제된 LNnT 생성물을 수득하기 위해 사용되는 네 번째 균질화 단계를 거친다.
결정의 균질화로, 미가공 결정 매스로부터 건조한 락토-N-네오테트라오스가 수득된다. 일반적으로 건조를 사용함으로써, 고체, 반고체 또는 액체로부터의 증발에 의한 물 또는 다른 용매의 제거로 구성된 물질 전달 공정을 거친다. 이 공정은 종종 최종 생산 단계로서 사용된다. 열원 및 공정에 의해 생성된 증기를 제거하기 위한 제제가 종종 수반된다. 식품, 곡물과 같은 바이오 산물 및 백신과 같은 의약품에서, 제거할 용매는 거의 언제나 물이다. 건조(desiccation)는 건조(drying)와 동의어이거나 건조의 극단적인 형태로 간주될 수 있다.
가장 일반적인 경우, 가스 스트림, 예를 들어 공기가 대류에 의해 열을 적용하고 증기를 습기로 가져가 버린다. 또 다른 가능성은 전도 또는 복사(또는 마이크로파)에 의해 열이 공급되는 진공 건조이며, 이렇게 생성된 증기는 진공 시스템에 의해 제거된다. 또 다른 간접 기술은 가열된 표면을 사용하여 에너지를 제공하고 흡인기가 실내 외부로 증기를 끌어들이는 드럼 건조이다.
결정화된 락토-N-네오테트라오스의 당해 경우에 적합한 제품 특이성의 균질화된 건조 물질을 제공하기 위해 몇 가지 방법이 사용될 수 있다. 사용되는 가장 일반적인 방법 중 하나는 오븐 건조 또는 진공 오븐 건조이다. 그러나, 미가공 결정 매스의 경우에 오븐 건조 또는 진공 오븐 건조는 단지 건조와 혼합의 조합에 의해 균질한 물질을 제공할 수 있다. 따라서 결정화 정제 단계로부터 수득된 배수된 결정 매스는 표면에 깔끔하게 분포되어 최대 표면을 수득할 수 있어야 하며, 이로부터 그후 용매가 공정 동안 증발할 수 있다. 오븐 건조 단계를 적용할 때, 온도는 용매를 증발시키기 위해 20 내지 200℃, 바람직하게는 25 내지 100℃, 더욱 더 바람직하게는 30 내지 50℃로 설정된다. 용매는 공기 스트림에 의해 제거된다. 진공 오븐 건조를 적용할 때, 온도는 용매를 증발시키기 위해 20 내지 200℃, 바람직하게는 25 내지 100℃, 더욱 더 바람직하게는 30 내지 50℃로 설정된다. 용매는 0.01-1000 mbar, 바람직하게는 0.1-100 mbar 또는 보다 바람직하게는 1-10 mbar 범위의 진공으로 설정된 펌프에 의해 제거된다. 건조는 두 경우 모두 1시간 내지 7일 동안 진행된다. 건조 전 또는 후에 재료가 혼합된다.
제2 실시양태에서, 재료의 건조는 첫 번째 결정화 및 후속 건조 공정 후에 실행되는 두 번째 결정화 사이클 후에 오븐 건조 또는 진공 오븐 건조를 적용함으로써 수행되기 때문에 최종 균질화는 필요하지 않다. 여기에서와 같이 결정화의 두 번째 및 세 번째 사이클이 있으면, 세척 공정은 필요하지 않으며 불균일한 물질은 형성되지 않는다. 일반적으로, 두 번째 및 세 번째 결정화 사이클에서, 결정은 수득된 더 높은 순도로 인해 더 잘 성장하며 따라서 상기 결정은 추가 결정화 단계 후에 더 쉽게 건조된다.
제3 실시양태에서, 균질화 방법은 동결-건조이다. 이 방법에서, 결정화 매스의 배수 후 수득된 결정은 동결 건조 공정을 거치기 전에 물에 용해된다. 따라서, LNnT 결정은 0.1 - 70% DCS, 바람직하게는 1 - 50% DSC, 더욱 바람직하게는 5 - 25% DSC 범위의 농도로 물에 용해된 다음 동결되고 동결 건조 장치에 적용되어, 여기서 물을 빼고 포말성 내지 겔-유형의 건조하고 균질한 당 생성물을 방출한다.
이상적으로는, 대부분의 다른 건조 방법과 달리 동결-건조를 적용하면 완전 무수의 또는 실질적으로 수분이 없는 생성물이 초래되어, 간접적으로 샘플의 수분 함량을 결정할 수 있다. 특히 사용되는 LNnT가 하나인 HMO와 같은 탄수화물의 경우, 첫째, 무수 용매에 잘 녹지 않고 둘째, 알콜-관능기(OH-그룹)가 물과 유사한 내지는 동일한 분광 특성을 갖기 때문에 잔류 수분을 결정하기가 어렵다.
제4 실시양태로서, 균질화 방법은 분무-건조이다. 분무 건조기는 액체 스트림을 취하여 용액 또는 현탁액을 고체로 분리하고 용매를 증기로 분리한다. 고체는 통상적으로 드럼 또는 사이클론에 수집된다. 액체 유입 스트림은 노즐을 통해 뜨거운 증기 스트림으로 분무되어 기화된다. 노즐은 통상적으로 액적을 가능한 한 작게 만들어 열 전달과 수분 증발 속도를 최대화하는데 사용된다. 분무 건조기는 다른 건조 방법에 비해 생성물을 매우 빠르게 건조할 수 있다. 이들은 또한 단일 단계로 용액 또는 슬러리를 건조되고 균질화된 분말로 바꾼다.
분무 건조는 바람직하게는 당 용액의 농도를 1 내지 70% DSC, 바람직하게는 10 내지 60% DSC, 바람직하게는 20 내지 50% DSC, 보다 바람직하게는 30 내지 40% DSC로 설정함으로써 적용된다. 그후, 당-함유 용액은 100 내지 160℃, 바람직하게는 110 내지 150℃, 보다 바람직하게는 120 내지 140℃로 설정된 입구 온도로 분무 건조기 노즐을 통해 압력하에 통과된다. 유속은 50-80℃, 바람직하게는 60-70℃, 보다 바람직하게는 66-67℃ 사이의 출구 온도를 유지하도록 조정된다. 이러한 설정을 사용하여 균질한 분무 건조 분말이 수득될 수 있다.
제5 실시양태로서, 락토-N-네오테트라오스를 수득하기 위한 균질화 방법은 롤러 또는 드럼 건조 또는 진공 롤러 건조이다. 롤러 건조 또는 드럼 건조는 불균일한 원료로부터 액체를 건조시키는데 사용되는 방법이다. 건조 공정에서, 원료 성분은 건조되고 균질한 생성물의 시트를 생산하는 회전식 고용량 롤 상에서 비교적 낮은 온도에서 건조된다. 드럼 건조 기술은 즉시 재구성되고 원래의 풍미, 색상 및 영양가를 많이 유지하는 건조된 재료를 생성한다. 롤러 건조의 몇 가지 장점은 다른 방법으로는 쉽게 건조할 수 없는 점성 불균질 용액을 건조할 수 있는 능력을 포함하고 드럼 건조기는 쉽게 청소할 수 있고 작동 및 유지가 용이하다.
롤러 건조가 적용될 때, 롤의 온도는 용매가 증발되도록 하기 위해 20 내지 200℃, 바람직하게는 50 내지 150℃, 보다 바람직하게는 75 내지 125℃로 설정된다. 용매는 공기 스트림에 의해 제거된다. 진공 롤러 건조를 적용할 때, 온도는 용매를 증발시키기 위해 20 내지 200℃, 보다 구체적으로 50 내지 150℃, 더욱 구체적으로 75 내지 125℃로 설정된다. 용매는 0.1-1000 mbar, 바람직하게는 1-500 mbar, 보다 바람직하게는 10-100 mbar 범위의 진공으로 설정된 펌프에 의해 제거된다. 두 경우 모두에서 롤은 0.1-100회전/분, 바람직하게는 1-10회전/분으로 회전한다.
제6 실시양태로서, 락토-N-네오테트라오스를 수득하기 위한 균질화 방법은 밴드 또는 진공 밴드 건조이다. 밴드 또는 진공 밴드 건조는 원료로부터 액체를 건조시키는데 사용되는 방법이다. 건조 공정에서, 원료 성분은 이동식 고용량 밴드 상에서 비교적 낮은 온도에서 건조되어 건조된 균질 생성물을 생산한다.
최종 분말 생성물은 정제된 제제의 건조물에 대해 ≥80%, 바람직하게는 ≥85%, 보다 바람직하게는 ≥90%의 정제된 제제에서의 LNnT의 순도를 갖는다.
본 발명은 특정 실시양태와 관련하여 도면을 참조하여 기술되지만, 본 발명은 이에 제한되지 않고 청구범위에 의해서만 제한된다. 또한, 설명 및 청구범위에서 용어 제1, 제2 등은 유사한 요소를 구별하기 위해 사용되며 반드시 시간적으로, 공간적으로, 순위에서 또는 임의의 다른 방식으로 순서를 설명하기 위해 사용되는 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어들은 적절한 상황하에서 상호교환 가능하며, 본원에 설명된 본 발명의 실시양태는 본원에 기술되거나 예시된 것과는 다른 순서로 작동할 수 있음을 이해해야 한다.
청구범위에 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 이후에 나열된 수단으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며; 이것은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않음을 주지해야 한다. 따라서 이것은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 명시하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 구성요소, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 따라서, "수단 A 및 B를 포함하는 장치"라는 표현의 범위는 구성요소 A 및 B로만 구성된 장치로 제한되어서는 안된다. 이것은 본 발명과 관련하여 장치의 유일한 관련 구성요소가 A 및 B임을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "하나의 실시양태(one embodiment)" 또는 "실시양태(an embodiment)"에 대한 참조는 실시양태와 관련하여 기술된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 "하나의 실시양태에서(in one embodiment)" 또는 "실시양태에서(in an embodiment)"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수 있다. 또한, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 본 개시내용으로부터 당업계의 통상의 숙련가에게 명백한 바와 같이 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
유사하게, 본 발명의 예시적인 실시양태의 설명에서, 본 발명의 다양한 특징은 때때로 본 개시내용을 간소화하고 하나 이상의 다양한 발명적 측면의 이해를 돕기 위해 단일 실시양태, 도면 또는 설명으로 함께 그룹화된다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 이러한 개시내용의 방법은 청구된 발명이 각 청구범위에 명시적으로 인용된 것보다 더 많은 특징을 필요로 한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 하기 청구범위가 반영하는 바와 같이, 발명적 측면은 단일의 전술한 개시된 실시양태의 모든 특징보다 적다. 따라서, 상세한 설명에 뒤따르는 청구범위는 이에 의해 이 상세한 설명에 명시적으로 통합되며, 각 청구범위는 그 자체로 본 발명의 별도의 실시양태로서 제시된다.
또한, 본원에 기술된 일부 실시양태는 다른 실시양태에 포함된 다른 특징이 아닌 일부를 포함하지만, 상이한 실시양태들의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도되고, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상이한 실시양태를 형성한다. 예를 들면, 하기 청구범위에서, 청구된 실시양태 중 어느 것은 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
또한, 일부 실시양태는 컴퓨터 시스템의 프로세서에 의해 또는 기능을 수행하는 다른 수단에 의해 구현될 수 있는 방법 또는 방법의 요소들의 조합으로서 본원에서 설명된다. 따라서, 이러한 방법 또는 방법의 요소를 수행하는데 필요한 명령이 있는 프로세서는 방법 또는 방법의 요소를 수행하기 위한 수단을 형성한다. 또한, 장치 실시양태의 본원에 기술된 요소는 본 발명을 수행할 목적으로 요소에 의해 수행되는 기능을 수행하기 위한 수단의 예이다.
본원에 제공된 설명 및 도면에서, 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 본 발명의 실시양태는 이러한 특정 세부사항 없이 실시될 수 있는 것으로 이해된다. 다른 경우에, 이러한 설명의 이해를 모호하게 하지 않기 위해 잘 알려진 방법, 구조 및 기술은 자세히 나타내지 않았다.
본 발명은 본 발명의 여러 실시양태의 상세한 설명에 의해 기술된다. 본 발명의 다른 실시양태는 본 발명의 진정한 사상 또는 기술적 교시를 벗어나지 않으면서 당업계의 숙련가들의 지식에 따라 구성될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 청구범위의 용어에 의해서만 제한된다는 것이 명백하다.
실시예 1: 분리하고자 하는 2개의 주요 부산물을 함유하는 80L 용적의 LNnT -함유 탄수화물 혼합물을 나노여과함으로써 pLNnH와 같은 고급 당류의 고갈 및 트리오스 및 LNnT와 같은 더 작은 당류의 축적을 달성한다.
80L의 당 혼합물의 수용액을 200Da 나노여과에 적용하여 pLNnH를 고갈시킨다. 당 용액의 건조 고체 함량(DSC)은 5.51%이고 고려되는 3개의 당의 비율은 다음과 같이 제공된다: 4.0% 트리오스, 62.0% LNnT 및 20.8% pLNnH. 이것은 4.41kg의 총 당 양(sugar amount) 및 2.73kg의 LNnT 양의 당량에 상응한다. 공급 펌프를 사용하여, 당 혼합물을 약 4 bar의 압력으로 여과 설비의 순환에 공급한다. 순환 펌프를 사용하여, 200Da 세라믹 막 주위에 5bar의 압력으로 당 용액을 원형으로 펌핑하여 여과한다. 투과물 쪽에서, 여과된 당 용액은 1bar의 압력에서 막을 떠난다. 각각 20리터를 연속적으로 여과한 후, 보유물과 투과물을 당 조성 및 당 농도에 대해 분석한다.
20리터 이후에는, 보유물이 다음과 같이 변한다. 60L 보유물은 이제 3.9% 트리오스, 61.7% LNnT 및 22.3% pLNnH로 구성된 6.85% DSC를 특징으로 한다. 이것은 4.11kg의 총 당 양 및 2.54kg의 LNnT 양의 당량에 상응한다. 투과물은 다음의 조성을 갖는다: 4.5% 트리오스, 67.2% LNnT 및 11.7% pLNnH의 조성으로 1.88% DSC. 이것은 총 380g 당 및 LNnT 양 253g에 상응한다.
추가로 20리터 이후에는, 보유물이 다음과 같이 변한다. 남은 40L 보유물은 이제 3.9% 트리오스, 62.5% LNnT 및 24.6% pLNnH의 조성을 갖는 9.95% DSC 의 건조 매스를 특징으로 한다. 이것은 3.98kg의 총 당 양 및 2.49kg의 LNnT 양에 상응한다. 20L 투과물은 다음의 조성을 갖는다: 4.6% 트리오스, 67.5% LNnT 및 12.1% pLNnH의 조성을 갖는 2.44% DSC. 490g의 당의 총량 및 329g의 LNnT 양의 당량.
이러한 결과는 각 당 성분에 대한 투과 계수를 계산할 수 있게 한다. 트리오스는 약 1.15, LNnT는 1.09, pLNnH는 0.55의 계수로 투과된다.
결과는 표 1, 표 2 및 표 3에 나타내어져 있다.
[표 1]
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
실시예 2: 분리하고자 하는 2개의 주요 부산물을 함유하는 35L 용적의 LNnT -함유 탄수화물 혼합물을 나노여과하고 공급물 용액에 또 다른 10L의 물을 중간 첨가하여 pLNnH와 같은 고급 당류의 고갈 및 트리오스 및 LNnT와 같은 더 작은 당류의 축적을 달성한다.
35L의 당 혼합물의 수용액을 200Da 나노여과에 적용하여 pLNnH를 고갈시킨다. 당 용액의 건조 고체 함량(DSC)은 7.88%이고 고려되는 3개의 당의 비율은 다음과 같이 제공된다: 2.8% 트리오스, 58.0% LNnT 및 26.1% pLNnH. 이것은 2.76kg의 총 당 양 및 1.60kg의 LNnT 양의 당량에 상응한다. 공급 펌프를 사용하여, 당 혼합물을 약 4 bar의 압력으로 여과 설비의 순환에 공급한다. 순환 펌프를 사용하여, 200Da 세라믹 막 주위에 5bar의 압력으로 당 용액을 원형으로 펌핑하여 여과한다. 투과물 쪽에서, 여과된 당 용액은 1bar의 압력에서 막을 떠난다. 당 용액을 5L의 증분으로 막을 통해 펌핑시키고 남은 보유물과 생성된 투과물을 당 조성 및 당 농도에 대해 분석한다. 처음 10L 이후에는, 5L의 신선한 물을 공급물에 두 번 첨가한다.
처음 5리터 이후에는, 보유물이 다음과 같이 변한다. 30L 보유물은 이제 2.2% 트리오스, 57.5% LNnT 및 26.1% pLNnH로 구성된 8.34% DSC를 특징으로 한다. 이것은 2.50kg의 총 당 양 및 1.44kg의 LNnT 양의 당량에 상응한다. 투과물은 다음의 조성을 갖는다: 3.5% 트리오스, 59.6% LNnT 및 16.5% pLNnH의 조성으로 2.37% DSC. 이것은 총 120g 당 및 LNnT 양 71g에 상응한다.
추가로 5L 이후에, 보유물은 다음과 같이 변한다. 남은 25L 보유물은 이제 2.3% 트리오스, 57.1% LNnT 및 26.9% pLNnH의 조성을 갖는 9.07% DSC의 건조 매스를 특징으로 한다. 이것은 보유물 중의 2.27kg의 총 당 양 및 1.30kg의 LNnT 양에 상응한다. 합한 10L 투과물은 다음의 조성을 갖는다: 3.5% 트리오스, 61.1% LNnT 및 16.3% pLNnH의 조성을 갖는 2.21% DSC. 220g의 당의 총량 및 135g의 LNnT 양의 당량.
이 시점에서 추가 여과 전에 5L의 물을 공급물에 첨가한다. 추가 5L 이후에, 보유물은 다음과 같이 변한다. 남은 25L 보유물은 이제 2.2% 트리오스, 56.1% LNnT 및 26.3% pLNnH의 조성을 갖는 8.95% DSC의 건조 매스를 특징으로 한다. 이것은 보유물 중의 2.24kg의 총 당 양 및 1.26 kg의 LNnT 양에 상응한다. 합한 15L 투과물은 다음의 조성을 갖는다: 3.6% 트리오스, 60.4% LNnT 및 16.6% pLNnH의 조성을 갖는 2.24% DSC. 340g의 당의 총량 및 203g의 LNnT 양의 당량.
이 시점에서 추가 여과 전에 또 다른 5L의 물을 공급물에 첨가한다. 추가 5L 이후에, 보유물은 다음과 같이 변한다. 남은 25L 보유물은 이제 2.2% 트리오스, 56.3% LNnT 및 26.9% pLNnH의 조성을 갖는 7.86% DSC의 건조 매스를 특징으로 한다. 이것은 보유물 중의 1.97kg의 총 당 양 및 1.11kg의 LNnT 양에 상응한다. 합한 20L 투과물은 다음의 조성을 갖는다: 3.4% 트리오스, 61.3% LNnT 및 16.5% pLNnH의 조성을 갖는 1.94% DSC. 390g의 당의 총량 및 238g의 LNnT 양의 당량.
추가 5L 이후에, 보유물은 다음과 같이 변한다. 남은 20L 보유물은 이제 2.2% 트리오스, 56.4% LNnT 및 27.4% pLNnH의 조성을 갖는 8.15% DSC의 건조 매스를 특징으로 한다. 이것은 보유물 중의 1.63kg의 총 당 양 및 919g의 LNnT 양에 상응한다. 합한 25L 투과물은 다음의 조성을 갖는다: 3.4% 트리오스, 61.9% LNnT 및 17.5% pLNnH의 조성을 갖는 1.94% DSC. 490g의 당의 총량 및 300g의 LNnT 양의 당량.
마지막 5L 이후에, 합한 30L 투과물은 다음의 조성을 갖는다: 3.5% 트리오스, 59.7% LNnT 및 16.5% pLNnH의 조성을 갖는 2.51% DSC. 750g의 총량 및 450g의 LNnT 양의 당량.
이러한 결과는 각 당 성분에 대한 투과 계수를 야기한다. 트리오스는 약 1.55, LNnT는 1.05, pLNnH는 0.62의 계수로 투과된다.
결과는 표 4, 표 5 및 표 6에 나타내어져 있다.
[표 4]
Figure pct00004
[표 5]
Figure pct00005
[표 6]
Figure pct00006
실시예 3: 분리하고자 하는 2개의 주요 부산물을 함유하는 LNnT -함유 탄수화물 혼합물을 모의 이동층 크로마토그래피하여 3% 미만의 pLNnH와 같은 고급 당류의 고갈 및 트리오스 및 LNnT와 같은 더 작은 당류의 축적을 달성한다.
SMB 정제를 위해, 상기 3개의 올리고당을 포함하는 입자가 없는 투명한 용액을 45℃에서 진공 농축기를 사용하여 약 300g/L로 농축하였다. SMB 크로마토그래피의 경우, 2 x 4 구역에 배열된 12개의 컬럼(치수: 40mm x 740mm의 Prosep® 컬럼(Latek, Eppelheim, Germany))이 장착된 폐쇄 루프 다성분 SMB 시스템이 사용되었다. 각 컬럼에는 760g의 Purolite® PCR833H+(Purolite, Ratingen, Germany) 강한 양이온 교환 수지가 포함되어 있다.
시스템은 다음과 같이 설정된 유동 매개변수로 25℃에서 작동되었다: 구역 I의 유속은 30.00 ml/min, 구역 II의 유속은 21.00 ml/min, 구역 III의 유속은 21.48 ml/min, 구역 IV의 유속은 18.44 ml/min으로 설정하였고, 공급물은 3.00 ml/min으로 설정하였으며, 용리액 유속은 11.56 ml/min으로 설정하였고 스위칭 시간은 17.92분으로 설정하였다. 용리액으로서, 10%(v/v) 식품 등급 에탄올을 갖는 물을 사용하였다. 펜타오스보다 작은 당류, 예를 들어 트리오스 및 LNnT, 예를 들어 락토스, 락토-N-비오스, 글루코스, 갈락토스 및 N-아세틸 갈락토사민과 같은 더 작은 가수분해 생성물이 주로 추출물로 분획되었다. 고급 올리고당, 더 정확하게는 테트라오스보다 큰 당류, 예를 들어, 펜타오스, 헥사오스, 예를 들어 pLNnH 뿐만 아니라 헵타오스 또는 옥타오스와 같은 더 큰 올리고당 뿐만 아니라 용리액 또는 수지 부하로 인한 잔류 염 오염물질이 라피네이트로 분획되었다. 기술된 설정에서 SMB 시스템은 적어도 3개월 동안 연속적으로 작동할 수 있다.
이 프로토콜을 사용하면 LNnT 순도가 상당히 증가할 수 있다. 이러한 첫 번째 예에서는, 다음 사양을 갖는 LNnT가 사용되었다: 3.5% 트리오스, 59.7% LNnT 및 16.5% pLNnH의 조성을 갖는 12,7% DSC. SMB 크로마토그래피 후 추출물은 다음의 구성을 가졌다: 4.9% 트리오스, 70.4% LNnT 및 2.2% pLNnH. 차례로, 라피네이트는 다음의 구성을 가졌다: 0.7% 트리오스, 1.1% LNnT 및 59.5% pLNnH. 정제의 수율은 대략 80%였다.
결과는 표 7에 나타내어져 있다.
[표 7]
Figure pct00007
실시예 4: 분리하고자 하는 2개의 주요 부산물을 함유하는 LNnT -함유 탄수화물 혼합물을 모의 이동층 크로마토그래피하여 3% 미만의 pLNnH와 같은 고급 당류의 고갈 및 트리오스 및 LNnT와 같은 더 작은 당류의 축적을 달성한다.
SMB 정제를 위해, 상기 3개의 올리고당을 포함하는 입자가 없는 투명한 용액을 45℃에서 진공 농축기를 사용하여 약 300g/L로 농축하였다. SMB 크로마토그래피의 경우, 2 x 4 구역에 배열된 12개의 컬럼(치수: 40mm x 740mm의 Prosep® 컬럼(Latek, Eppelheim, Germany))이 장착된 폐쇄 루프 다성분 SMB 시스템이 사용되었다. 각 컬럼에는 760g의 Purolite® PCR833H+(Purolite, Ratingen, Germany) 강한 양이온 교환 수지가 포함되어 있다.
시스템은 다음과 같이 설정된 유동 매개변수로 25℃에서 작동되었다: 구역 I의 유속은 30.00 ml/min, 구역 II의 유속은 21.00 ml/min, 구역 III의 유속은 21.48 ml/min, 구역 IV의 유속은 18.44 ml/min으로 설정하였고, 공급물은 3.00 ml/min으로 설정하였으며, 용리액 유속은 11.56 ml/min으로 설정하였고 스위칭 시간은 17.92분으로 설정하였다. 용리액으로서, 10%(v/v) 식품 등급 에탄올을 갖는 물을 사용하였다. 펜타오스보다 작은 당류, 예를 들어 트리오스 및 LNnT, 예를 들어 락토스, 락토-N-비오스, 글루코스, 갈락토스 및 N-아세틸 갈락토사민과 같은 더 작은 가수분해 생성물이 주로 추출물로 분획되었다. 고급 올리고당, 더 정확하게는 테트라오스보다 큰 당류, 예를 들어, 펜타오스, 헥사오스, 예를 들어 pLNnH 뿐만 아니라 헵타오스 또는 옥타오스와 같은 더 큰 올리고당 뿐만 아니라 용리액 또는 수지 부하로 인한 잔류 염 오염물질이 라피네이트로 분획되었다. 기술된 설정에서 SMB 시스템은 적어도 3개월 동안 연속적으로 작동할 수 있다.
이 프로토콜을 사용하면 LNnT 순도가 상당히 증가할 수 있다. 이러한 두 번째 예에서는, 다음 사양을 갖는 LNnT가 사용되었다: 3.7% 트리오스, 67.6% LNnT 및 15.4% pLNnH.. SMB 크로마토그래피 후 추출물은 다음의 구성을 가졌다: 4.3% 트리오스, 80.3% LNnT 및 0.6% pLNnH. 차례로, 라피네이트는 다음의 구성을 가졌다: 5.3% 트리오스, 2.1% LNnT 및 47.9% pLNnH. 정제의 수율은 대략 80%였다.
결과는 표 8에 나타내어져 있다.
[표 8]
Figure pct00008
실시예 5: 분리하고자 하는 하나의 주요 부산물을 함유하는 LNnT -함유 탄수화물 혼합물을 결정화하여 3% 미만의 트리오스와 같은 저급 당류의 고갈을 달성한다.
하기 구성을 갖는 탄수화물 혼합물 385.3g을 결정화 공정에 적용하였다. 트리오스: 4.9%, LNnT: 70.4%, pLNnH: 2.2%. 재료를 이의 DSC가 감압에서 회전 증발기를 사용하여 70%로 설정되기 전에 대략 0.4L 탈이온수에 용해시켰다. 대략 10°/h의 느린 냉각 속도를 보장하는 환경에서 저장하기 전에 상기 탄수화물 혼합물을 회전식 증발기로부터 제거하였다. 이로써 고체 층이 혼합물의 표면에 형성되기 시작하여 3일 후에 최종적으로 완전한 결정질 매스가 생성되었다. 완전한 결정화 후 상기 결정 매스를 두 파트의 70vol.% 에탄올 용액(70vol.% EtOH/30vol.% H2O)과 격렬하게 혼합하고 생성된 세척 용액을 최종적으로 깔때기 프릿 필터를 사용하여 감압하에 제거하였다. 상기 세척 공정을 2회 반복하여 배수되고 정제된 LNnT 결정 매스를 생성하고 이를 3mbar 및 35℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결정화의 수율은 228.0g(59.2%)으로 결정되었고; 화합물 구성은 다음과 같이 결정되었다: 트리오스 함량: 0.5%, LNnT 함량: 94.4%, pLNnH 함량: 1.2%. 그러나, 출발 물질 뿐만 아니라 결정질 생성물의 LNnT 순도를 고려할 때, 수율은 79.3%((94.4%*228g)/(70.4%*385.3g))로 증가한다.
결과는 표 9에 나타내어져 있다:
[표 9]
Figure pct00009
실시예 6: 분리하고자 하는 하나의 주요 부산물을 함유하는 LNnT -함유 탄수화물 혼합물을 결정화하여 3% 미만의 트리오스와 같은 저급 당류의 고갈을 달성한다.
하기 구성을 갖는 탄수화물 혼합물 462.3g을 결정화 공정에 적용하였다. 트리오스: 4.3%, LNnT: 80.3%, pLNnH: 0.6%. 이의 LNnT 양은 371.1g으로 결정되었다. 재료를 이의 DSC가 감압에서 회전 증발기를 사용하여 69%로 설정되기 전에 대략 0.5L 탈이온수에 용해시켰다. 대략 10°/h의 느린 냉각 속도를 보장하는 환경에서 저장하기 전에 상기 탄수화물 혼합물을 회전식 증발기로부터 제거하였다. 이로써 고체 층이 혼합물의 표면에 형성되기 시작하여 2일 후에 최종적으로 완전한 결정질 매스가 생성되었다. 완전한 결정화 후 상기 결정 매스를 두 파트의 70vol.% 에탄올 용액(70vol.% EtOH/30vol.% H2O)과 격렬하게 혼합하고 생성된 세척 용액을 최종적으로 깔때기 프릿 필터를 사용하여 감압하에 제거하였다. 상기 세척 공정을 반복하여 배수되고 정제된 LNnT 결정 매스를 생성하고 이를 3mbar 및 35℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결정화의 수율은 244.0g(52.8%)으로 결정되었고; 화합물 구성은 다음과 같이 결정되었다: 트리오스 함량: 6.6%, LNnT 함량: 89.7%, pLNnH 함량: < 0.5%. 여기서, 결정화를 통한 정제는 성공적이지 않았다. 그러나, 상기 생성물은 다른 결정화에 사용되었다.
244.0g의 탄수화물 혼합물을 결정화 공정으로 보냈다. LNnT 양은 218.9g으로 결정되었다. 재료를 이의 DSC가 감압에서 회전 증발기를 사용하여 70%로 설정되기 전에 대략 0.25L 탈이온수에 용해시켰다. 대략 10°/h의 느린 냉각 속도를 보장하는 환경에서 저장하기 전에 상기 탄수화물 혼합물을 회전식 증발기로부터 제거하였다. 이로써 고체 층이 혼합물의 표면에 형성되기 시작하여 5일 후에 최종적으로 완전한 결정질 매스가 생성되었다. 완전한 결정화 후 상기 결정 매스를 두 파트의 70vol.% 에탄올 용액과 격렬하게 혼합하고 생성된 세척 용액을 최종적으로 깔때기 프릿 필터를 사용하여 감압하에 제거하였다. 상기 세척 공정을 2회 반복하여 배수되고 정제된 LNnT 결정 매스를 생성하고 이를 3mbar 및 35℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결정화의 수율은 204.6g(83.9%)으로 결정되었고; 화합물 구성은 다음과 같이 결정되었다: 트리오스 함량: 0.7%, LNnT 함량: 97.4%, pLNnH 함량: 0.2%. 출발 물질 뿐만 아니라 결정질 생성물의 LNnT 순도를 고려할 때, 수율은 91.1%((97.4%*204.6g)/(89.7%*244.0g))로 증가한다.
결과는 표 10에 나타내어져 있다:
[표 10]
Figure pct00010
실시예 7: 분리하고자 하는 하나의 주요 부산물을 함유하는 pLNnH -함유 탄수화물 혼합물을 결정화하여 4% 미만의 LNnT와 같은 저급 당류의 고갈을 달성한다.
하기 구성을 갖는 탄수화물 혼합물 약 250g을 결정화 공정에 적용하였다. 트리오스: < 0.5%, LNnT: 2.1%, pLNnH: 47.9%. 남은 고체는 실질적으로 잔류 염으로 구성되었다. 재료를 이의 DSC가 감압에서 회전 증발기를 사용하여 55%로 설정되기 전에 대략 0.5L 탈이온수에 용해시켰다. 대략 10°/h의 느린 냉각 속도를 보장하는 환경에서 저장하기 전에 상기 탄수화물 혼합물을 회전식 증발기로부터 제거하였다. 이로써 고체 층이 혼합물의 표면에 형성되기 시작하여 5일 후에 최종적으로 완전한 결정질 매스가 생성되었다. 완전한 결정화 후 50g의 조악한 상기 결정 매스를 두 파트의 70vol.% 에탄올 용액(70vol.% EtOH/30vol.% H2O)과 격렬하게 혼합하고 생성된 세척 용액을 최종적으로 깔때기 프릿 필터를 사용하여 감압하에 제거하였다. 상기 세척 공정을 2회 반복하여 배수되고 정제된 pLNnH 결정 매스를 생성하고 이를 3mbar 및 35℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결정화의 수율은 13.0g(26.0%)으로 결정되었고; 화합물 구성은 다음과 같이 결정되었다: 트리오스 함량: 0%, LNnT 함량: 3.75%, pLNnH 함량: 80.6%. 그러나, 출발 물질 뿐만 아니라 결정질 생성물의 pLNnH 순도를 고려할 때, 25%의 배수된 결정 매스의 습도를 고려하여 수율은 58.3%((80.6%*13.0g)/(0.75*47.9%*50g))로 증가한다.
실시예 8: 탈이온수로부터의 LNnT의 시드 결정의 제조
발효 공정으로부터 수득된 56% LNnT 혼합물을 용매로서 순수(Biorad Bio-Gel® P-2, fine)를 사용하여 반복적인 겔 여과 단계를 통해 정제하여 회전 증발기를 사용하여 용적을 감소시킨 후 최종적으로 LNnT 시드 결정을 수득하였다. 분무-건조된 출발 물질 10.0g을 순수한 물로 50% DSC로 희석하고 3회 여과하였다. 모든 여과 단계에서, 주로 LNnT 함유 분획을 합하고, 진공에서 재농축하고, 50% DSC로 되도록 다시 희석하고, 다른 라운드의 겔 여과로 보냈다. 감압에서 농축 후 2.8g의 겔형 물질이 수득되었으며, 이것은 정치시 결정화하였다. 생성물을 HPAEC PAD 크로마토그래피를 통해 분석하였다; 세척되지 않은 결정의 순도는 주요 부산물로서 6.3%의 분리되지 않은 트리오스를 갖는 83.1% LNnT였다.
실시예 9: NaCl의 첨가에 의한 LNnT의 200g 결정화
LNnT의 결정화 동안 겔 형성을 방지하기 위해, 1 질량%의 식품 적합성 염, 예를 들어 NaCl을 용액에 첨가한다. 200g의 LNnT(15.0% 트리오스, 65.9% LNnT, 4.4% pLNnH; 이것은 131.8g의 순수 LNnT와 같음) 및 2.0g의 NaCl을 200mL의 물에 용해시킨다. 그후 용액을 70%의 DSC로 설정한다. 일부 시드 결정은 매우 점성인 슬러리에 첨가하고 LNnT를 실온에서 하루 동안 결정화되도록 한다. 완전한 결정화 후, 결정 매스를 두 파트의 80% vol.% 에탄올 용액(80vol.% EtOH/20vol.% H20)과 혼합하고 6000rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 침전된 탄수화물 혼합물을 또 다른 파트의 80% vol.% 에탄올 용액으로 현탁시키고 다시 원심분리한다. 이 공정을 반복한다. 3회 주기의 원심분리 후, 침전물을 동결-건조한다. 1차 결정화 후 163.6g의 LNnT가 수득된다. LNnT의 순도는 65.9%에서 76.5%(6.5% 트리오스, 5.2% pLNnH)로 대략 11% 증가할 수 있어 125.1g의 순수한 LNnT(94.9% 수율)가 생성되었다.
실시예 10: LNnT의 200g 2차 결정화
실시예 9로부터 채취된 158.6g의 LNnT을 결정화한다. 따라서, 출발 물질을 159mL의 탈이온수에 용해시키고 감압에서 70% DSC로 되도록 농축한다. 시드 결정을 매우 점성인 슬러리에 첨가하고 LNnT를 실온에서 하루 동안 결정화되도록 한다. 완전한 결정화 후, 결정 매스를 두 파트의 80% vol.% 에탄올 용액(80vol.% EtOH/20vol.% H20)과 혼합하고 6000rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 침전된 탄수화물 혼합물을 또 다른 파트의 80% vol.% 에탄올 용액으로 현탁시키고 다시 원심분리한다. 이 공정을 반복한다. 3회 주기의 원심분리 후, 침전물을 동결-건조한다. 2차 결정화 후 115.2g의 LNnT가 수득된다. LNnT의 순도는 76.5%에서 82.4%(2.4% 트리오스, 5.7% pLNnH)로 대략 6% 증가할 수 있어 94.9g의 순수한 LNnT(78.2% 수율)가 생성되었다.
실시예 11: NaCl의 첨가에 의한 LNnT의 100 g 결정화
100g의 LNnT(15.0% 트리오스, 65.9% LNnT, 4.4% pLNnH; 131.8g의 순수한 LNnT와 같음) 및 1.0g의 NaCl을 100ml의 물에 용해시킨 다음 70%의 DSC로 되도록 감압하에 농축시킨다. 시드 결정을 매우 점성인 슬러리에 첨가하고 LNnT를 실온에서 1일 결정화되도록 한다. 완전한 결정화 후, 결정 매스를 두 파트의 80% vol.% 에탄올 용액(80vol.% EtOH/20vol.% H20)과 혼합하고 6000rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 침전된 생성물을 또 다른 용적 ml의 80% EtOH로 현탁시키고 다시 원심분리한다. 이 공정을 반복한다. 그후 침전물을 동결-건조한다. 1차 결정화 후 67.0g의 LNnT가 수득된다. 재료의 순도는 65.9%에서 81.7%(6.2% 트리오스, 6.0% 헥사오스)로 대략 15% 증가할 수 있어 54.7g의 순수한 LNnT(83.1% 수율)가 생성되었다.
실시예 12: LNnT의 100g 2차 결정화
실시예 11로부터 채취된 50.0g의 LNnT을 결정화한다. 따라서, 출발 물질을 100mL의 물에 용해시키고 60℃에서 70% DSC로 되도록 농축한다. 시드 결정을 매우 점성인 슬러리에 첨가하고 LNnT를 실온에서 1일 동안 결정화되도록 한다. 완전한 결정화 후, 결정 매스를 두 용적의 80% vol.% 에탄올 용액(80vol.% EtOH/20vol.% H20)과 혼합하고 6000rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 침전된 탄수화물 혼합물을 또 다른 용적의 80% EtOH로 2회 현탁시키고 다시 원심분리한다. 그후 침전물을 동결-건조한다. 2차 결정화 후 36.0g의 LNnT가 수득된다. 재료의 순도는 81.7%에서 84.3%(2.9% 트리오스, 6.4% 헥사오스)로 대략 3% 증가할 수 있어 30.3g의 순수한 LNnT(74.3% 수율)가 생성되었다.
실시예 13: 분무-건조를 사용한 LNnT의 균질화
다음 구성을 갖는 228.0g의 LNnT를 Buchi 장치 B-290에서 상기 생성물을 분무-건조함으로써 균질화하였다: (0.5% 트리오스, 94.4% LNnT, 1.2% pLNnH). 따라서, 재료를 물 1.5L(15.2% DSC)에 용해시킨 다음 멸균 여과(45mm 기공-크기)하고 130℃ 입구 및 66℃ 출구 온도에서 분무-건조하였다. 칼-피셔 적정에 의해 측정하여 8.6%의 잔류 수분 함량을 갖는 178.0g(78.1%)의 균일한 백색 분말이 수득되었다. 재료의 순도는 0.4% 트리오스, 94.4% LNnT 및 1.1% pLNnH로 결정되어 168.0g의 순수하고 균일하게 분무-건조된 LNnT가 생성되었다.
실시예 14: 분무-건조를 사용한 LNnT의 균질화
다음 구성을 갖는 204.0g의 LNnT를 Buchi 장치 B-290에서 상기 생성물을 분무-건조함으로써 균질화하였다: (0.7% 트리오스, 97.4% LNnT, 0.2% pLNnH). 따라서, 재료를 물 1.2L(14.6% DSC)에 용해시킨 다음 멸균 여과(45mm 기공-크기)하고 130℃ 입구 및 66℃ 출구 온도에서 분무-건조하였다. 칼-피셔 적정에 의해 측정하여 7.1%의 잔류 수분 함량을 갖는 129.0g(63.2%)의 균일한 백색 분말이 수득되었다. 재료의 순도는 0.3% 트리오스, 96.3% LNnT 및 <0.25% pLNnH로 결정되어 124.2g의 순수하고 균일하게 분무-건조된 LNnT가 생성되었다.
실시예 15: 분무-건조를 사용한 LNnT의 균질화
다음 구성을 갖는 110.7g의 LNnT를 Buchi 장치 B-290에서 상기 생성물을 분무-건조함으로써 균질화하였다: (2.4% 트리오스, 82.4% LNnT, 5.7% pLNnH). 따라서, 재료를 물 300ml(27% DSC)에 용해시킨 다음 멸균 여과(45mm 기공-크기)하고 130℃ 입구 및 66℃ 출구 온도에서 분무-건조하였다. 71.9g(65.0%)의 균일한 백색 분말이 수득되었으며, 이것은 수득된 물질의 분무 건조 적합성의 증거로서 실시예 10으로부터의 출발 물질과 거의 동일한 스펙트럼을 나타냈다.
실시예 16: 오븐 건조를 사용한 LNnT의 건조
9.629g의 결정질 LNnT를 오븐-건조하였다. 35℃에서 7일 후, 이의 중량은 99.8%에 해당하는 9.612g으로 감소하였다. 이의 LNnT 순도는 건조 전 88.7%, 건조 후 88.2%로 결정되었으며, 이것은 35℃에서 오븐 건조가 적합함을 입증하였다.
실시예 17: 진공 오븐 건조를 사용한 LNnT의 건조
10.307g의 결정질 LNnT를 오븐-건조하였다. 35℃에서 7일 후, 이의 중량은 99.8%에 해당하는 10.219g으로 감소하였다. 이의 LNnT 순도는 건조 전 88.7%, 건조 후 90.3%로 결정되었으며, 이것은 35℃에서 오븐 건조가 적합함을 입증하였다.
실시예 18: 동결-건조를 사용한 LNnT의 균질화
10.265g의 결정질 LNnT를 Christ BETA 2-8 LD 플러스 장치에서 동결-건조하였다. 따라서, 상기 HMO를 대략 90mL의 탈이온수에 용해시키고 -80℃에서 동결한 다음 2.0*1O- 3mbar로 설정된 동결-건조 공정에 적용하고 -85℃로 냉각시켰다. 7일 후 중량은 94.2%에 해당하는 9.668g으로 감소하였다. 이의 LNnT 순도는 건조 전 88.7%, 건조 후 90.2%로 결정되었으며, 이것은 동결-건조가 균질화에 적합한 방법임을 입증하였다.
실시예 19: 동결-건조를 사용한 LNnT의 균질화
15.404g의 결정질 LNnT를 Christ BETA 2-8 LD 플러스 장치에서 동결-건조하였다. 따라서, 상기 HMO를 대략 60mL의 탈이온수에 용해시키고 -80℃에서 동결한 다음 2.0*1O- 3mbar로 설정된 동결-건조 공정에 적용하고 -85℃로 냉각시켰다. 7일 후 중량은 94.6%에 해당하는 14.566g으로 감소하였다. 이의 LNnT 순도는 건조 전 88.7%, 건조 후 89.5%로 결정되었으며, 이것은 동결-건조가 균질화에 적합한 방법임을 입증하였다.

Claims (15)

  1. - LNnT, 바이오매스(biomass), 배지 성분(medium component), 오염물질 및, LNnT 이외의 탄수화물을 함유하는 발효 브로스(fermentation broth)를 제공하는 단계;
    - 발효 브로스를 나노여과 막(nanofiltration membrane)을 사용하는 적어도 하나의 막 여과 단계에 적용하여 LNnT를 함유하는 여과된 용액을 제공하는 단계;
    - 여과된 용액을 적어도 하나의 모의 이동층(simulated moving bed) 크로마토그래피 단계에 적용하여 LNnT를 함유하는 정제된 용액을 제공하는 단계;
    - 정제된 용액을 적어도 하나의 결정화 단계에 적용함으로써, 결정 매스(crystal mass)를 제공하는 단계; 및
    - 상기 결정 매스를 적어도 하나의 균질화 단계에 적용함으로써, 균질화되고 건조 정제된 LNnT를 제공하는 단계를 포함하고;
    여기서 정제된 제제가 ≥ 90%의 순도를 갖는 LNnT를 함유하는, 발효 브로스로부터 LNnT (락토-N-네오테트라오스)를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 막 여과 단계가 0.2 내지 3.5kDa의 분자량 컷오프(molecular weight cut-off)를 갖는 막을 사용하는 나노여과인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 막이 0.2 내지 2.0kDa의 분자량 컷오프를 갖는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 막이 0.2 내지 1.0kDa의 분자량 컷오프를 갖는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 막 여과 단계로부터 수득된 여과된 용액이 60% 이상, 65% 이상, 또는 70% 이상의 순도를 갖는 LNnT를 함유하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 모의 이동층 크로마토그래피 단계가
    i) 적어도 하나의 컬럼이 약한 또는 강한 양이온 교환 수지, 바람직하게는 H+-형태, Na+-형태, K+-형태 또는 Ca2 +-형태의 양이온 교환 수지를 포함하는 적어도 4개의 컬럼, 바람직하게는 적어도 8개의 컬럼, 보다 바람직하게는 적어도 12개의 컬럼; 및/또는
    ii) 유속(flow rate)이 다른 4개의 구역 I, II, III 및 IV; 및/또는
    iii) 물, 바람직하게는 에탄올과 물, 보다 바람직하게는 5-15 vol.% 에탄올과 85-95 vol.% 물, 가장 바람직하게는 9-11 vol.% 에탄올과 89-91 vol.% 물을 포함하거나 이로 구성된 용리액(eluent),
    iv) 15℃ 내지 60℃, 바람직하게는 20℃ 내지 55℃, 보다 바람직하게는 25℃ 내지 50℃의 작동 온도를 포함하는 방법.
  7. 제1항 및 제6항에 있어서, 상기 모의 이동층 크로마토그래피 단계가
    i) 유속이 다른 4개의 구역 I, II, III 및 IV(여기서, 유속은 바람직하게는 구역 1에서는 22-32 ml/min, 구역 II에서는 17-23 ml/min, 구역 III에서는 18-25 ml/min 및/또는 구역 IV에서는 14-20 ml/min이다); 및/또는
    ii) 0.5-4 ml/min, 바람직하게는 2 ml/min의 공급 속도; 및/또는
    iii) 6-12 ml/min, 바람직하게는 8 ml/min의 용리액 유속; 및/또는
    iv) 14-20 min, 바람직하게는 16-18 min, 보다 바람직하게는 17 min의 스위칭 시간(switching time)을 포함하고, 바람직하게는, 컬럼 중 적어도 하나가 0.1 내지 5000 kg의 양이온 교환 수지, 바람직하게는 0.2 내지 500 kg의 양이온 교환 수지, 보다 바람직하게는 0.5 내지 50 kg의 양이온 교환 수지, 가장 바람직하게는 1.0 내지 20 kg의 양이온 교환 수지를 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 이동층 크로마토그래피로부터 수득된 정제된 용액이 75% 이상 또는 80% 이상의 순도를 갖는 LNnT를 함유하는 방법.
  9. 제1항 및 제6항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 모의 이동층 크로마토그래피 단계로부터 수득된 정제된 용액이 모의 이동층 크로마토그래피를 사용한 적어도 하나의 다른 추가 정제 단계에 적용될 수 있고, 여기서 > 85%, 바람직하게는 > 90%; 보다 바람직하게는 > 93%의 순도를 갖는 LNnT를 포함하는 정제된 용액이 제공되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 결정화 단계가
    - 적어도 약 1% DSC, 바람직하게는 적어도 10% DSC, 바람직하게는 적어도 30% DSC, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% DSC의 농도로 적어도 LNnt를 함유하는 적어도 두 개의 올리고당의 혼합물을 수득하는 단계(여기서, 상기 혼합물의 이러한 LNnT 순도는 적어도 약 15%, 바람직하게는 적어도 약 25%, 바람직하게는 약 40%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%이다).
    - 적어도 약 20-30℃, 바람직하게는 적어도 약 30-40℃, 바람직하게는 적어도 약 40-50℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 50-60℃의 출발 온도로부터 모의 이동층 크로마토그래피로부터 수득된 정제된 용액을 결정화하는 단계;
    - 적어도 40-50℃, 바람직하게는 적어도 약 30-40℃, 바람직하게는 적어도 약 20-30℃, 바람직하게는 적어도 약 10-20℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 0-10℃ 아래로 냉각함으로써 포화된 매스를 결정화되게 하여 균질한 결정 매스를 수득하는 단계,
    - 상기 결정 매스를 알콜, 용매, 또는 물질-혼화성 알콜 또는 용매 및 물의 혼합물(여기서, 용액의 알콜 또는 용매 함량은 10 내지 90 vol.%, 바람직하게는 30 내지 80 vol.%, 보다 바람직하게는 50 내지 70 vol.%이다)로 처리하여 알콜 또는 용매-함유 용액과 결정 매스의 혼합물을 수득하는 단계; 및
    - 결정 매스로부터 저급 당류의 함량을 감소시키기 위해 결정 매스의 알콜 또는 용매-함유 또는 당-함유 분획을 적어도 1회 세척하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제1항 또는 제10항에 있어서, 저급 당류의 함량을 감소시키기 위해 결정의 알콜 또는 용매-함유 또는 당-함유 분획의 세척이 적어도 2회 반복될 수 있는 방법.
  12. 제1항, 제10항 및 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 저급 당류의 함량이 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 3% 미만인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 결정화 단계로부터 수득된 결정이 85% 이상, 90% 이상, 및 95% 이상의 순도를 갖는 LNnT를 함유하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 균질화 단계가 동결-건조, 분무-건조, 롤러 또는 드럼 건조 및/또는 밴드(band) 또는 진공 밴드 건조로부터 선택될 수 있는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 제제에서 LNnT의 순도가 정제된 제제의 건조 물질에 대해 ≥80%, 바람직하게는 ≥85%, 보다 바람직하게는 ≥90%인 방법.
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