KR20220019697A - 항박테리아제 및 방법 - Google Patents

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트리스탄 코건
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알레산드로 리씨오
크리스티안 그론달
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Abstract

본 발명은 박테리아 사이의 접합을 수행하기 위한 수단에 관한 것이고, 특히 본 발명은 항미생물제를 포함하는 담체 박테리아 및 사용 방법에 관한 것이다. 담체 박테리아는 표적 세포로의 작용제를 코딩하는 DNA의 접합 전달이 가능하다. 본 발명은 추가로 동물에서 성장 또는 사료 전환율 촉진에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 살모넬라를 사멸시키거나 살모넬라의 성장 또는 증식을 억제하는 것에 관한 것이다.

Description

항박테리아제 및 방법
본 발명은 박테리아 사이의 접합을 수행하기 위한 수단에 관한 것이고, 특히 본 발명은 항미생물제를 포함하는 담체 박테리아 및 사용 방법에 관한 것이다. 담체 박테리아는 표적 세포로의 작용제를 코딩하는 DNA의 접합 전달이 가능하다.
본 발명은 추가로 동물에서 성장 또는 사료 전환율 (FCR) 촉진에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 살모넬라(Salmonella)를 사멸시키거나 살모넬라의 성장 또는 증식을 억제하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 예컨대 식물의 성장, 건조 중량, 습윤 중량 또는 작물 생산을 촉진하는데 유용한 슈도모나스(Pseudomonas)를 사멸시키거나 슈도모나스의 성장 또는 증식을 억제하는 것에 관한 것이다.
염색체외 복제 (ori) 및 전달 (tra)을 제어하는 DNA 서열은 서로 별개이며; 즉, 복제 서열은 일반적으로 플라스미드 전달을 제어하지 않으며 그 반대도 또한 마찬가지이다. 복제 및 전달 둘 다는 플라스미드- 및 숙주-코딩된 기능 둘 다를 사용하는 복잡한 분자 프로세스이다. 박테리아 접합은 한 박테리아에서 또 다른 박테리아로의 유전 정보의 단방향 및 수평 전송이다. 전달된 유전 물질은 플라스미드일 수 있거나, 염색체의 일부일 수 있다. 접합성 플라스미드를 보유하는 박테리아 세포는 공여자 및 수용자 세포의 커플링, 및 유전 정보의 전달에 관여하는 표면 구조 (성선모)를 함유한다. 접합은 세포 사이의 접촉을 포함하며, 유전 형질의 전달은 많은 플라스미드에 의해 매개될 수 있다. 모든 자연적 전달 메커니즘 중에서, 접합이 가장 효율적이다. 예를 들어, 이. 콜라이의 F 플라스미드, 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 pCFlO 플라스미드 및 바실루스 투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis)의 pXO16 플라스미드는 교배 쌍의 확립을 위해 상이한 메커니즘을 사용하고, 교배 응집체의 크기가 상이하고, 그람-음성 (F) 뿐만 아니라 그람-양성 (pCFlO 및 pXO16) 박테리아 내에서 상이한 숙주 범위를 갖는다. 이들의 플라스미드 크기가 또한 상이하며; 각각 54, 100 및 200 kb이다. 그러나, 놀랍게도, 이러한 접합 시스템은 액체 배지에서 접합 전달을 지속시킬 수 있고, 종종 매우 짧은 시간에 100%에 가까운 전달 효율에 도달한다는 매우 중요한 공통 특징을 갖는다. 그러므로, 접합 프로세스는 환경 뉴클레아제에 대한 플라스미드 DNA의 보호, 및 수용자 세포로의 플라스미드 DNA의 매우 효율적인 전달을 허용한다. 접합 기능은 자연적으로 플라스미드 코딩된다. 하나의 종 내에 (좁은 숙주 범위) 또는 많은 종 사이에 (광범위한 숙주 범위) 연관 유전자를 전달할 수 있는 수많은 접합성 플라스미드 (및 트랜스포존)가 공지되어 있다. 전송가능한 플라스미드는 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 바실루스(Bacillus), 클로스트리디움(Clostridium) 및 노카르디아(Nocardia)의 병원성 균주를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 그람-양성 속에서 보고되었다. 접합의 초기 단계는 일반적으로 그람-음성 및 그람-양성 박테리아에서 상이하다. 그람-음성 박테리아로부터의 접합성 플라스미드에서 일부 전달 유전자의 역할은 선모-매개 세포-대-세포 접촉, 접합 기공의 형성 및 관련 형태학적 기능을 제공하는 것이다. 선모는 그람-양성 박테리아에서 접합을 개시하는데 관여하는 것으로 보이지 않는다.
본 발명은 하기를 제공한다:
대상체의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 방법 (예를 들어, 비의학적 또는 의학적)으로서, 여기서 대상체는 박테리아 표적 세포를 포함하고, 방법은 표적 세포에 독성이 있는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제1 DNA는 표적 세포로 전달되고 작용제가 발현되어, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키고 대상체의 성장 또는 중량을 증진시키는 것인 방법.
한 실시양태에서, 하기가 제공된다:
대상체의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 방법 (예를 들어, 비의학적 또는 의학적)으로서, 여기서 방법은 복수의 담체 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 박테리아 표적 세포를 포함하고, 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키고 대상체의 성장 또는 중량을 증진시키는 것인 방법.
유리하게는, 대상체에서 FCR이 개선 (즉, 증진)되며, 즉, FCR 수가 저하된다. 본 발명의 방법이 대상체의 그룹 (예를 들어, 동물, 예컨대 가축 동물의 그룹)에 대해 수행되는 경우, FCR이 그룹의 개체에서 저하되거나, 평균 FCR이 그룹에서 저하된다. 저하는 담체 세포(들)의 투여 전 FCR과의 비교로서 또는 동일한 종, 연령 그룹의 동물에 대한 평균 및 비교가능한 또는 동일한 식이를 공급할 때의 평균과 비교하여 평가될 수 있다. 통상의 기술자는 예컨대 가축 동물, 예를 들어 새끼 돼지, 돼지, 양, 소 (젖소 또는 육우), 어류, 조개류, 가금류 (예를 들어, 닭 (육용계 또는 알을 낳는 암탉), 거위, 오리 또는 칠면조)에 대한 표준 FCR에 친숙할 것이다.
본 발명은 또한 하기를 제공한다:
담체 세포로서, 여기서 세포는 박테리아 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 항박테리아제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 이에 의해 표적 세포를 사멸시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 담체 세포는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 세포인 담체 세포.
병원성 박테리아 표적 세포에 의한 감염을 치료하기 위해 대상체에게 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법에서 사용하기 위한 복수의 담체 세포를 포함하는 조성물로서, 여기서 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 조성물.
동물 (임의로 가축 동물)에서 인수공통전염성 박테리아 표적 세포를 사멸시키는 비의학적 방법으로서, 방법은 동물에게 복수의 담체 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 임의로 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 방법.
DNA (임의로 본 발명의 방법에서 사용하기 위한)로서, 여기서 DNA는 표적 세포에 도입될 수 있으며, 여기서 DNA는 CRISPR/Cas 시스템의 복수의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하며, 여기서 가이드 RNA 또는 crRNA는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 복수의 프로토스페이서 서열을 인식하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동가능하며; 여기서
(a) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 병원성 섬 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
(b) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 침입 유전자 서열을 포함하고/거나;
(c) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 분비 시스템 유전자 서열을 포함하고/거나;
(d) 프로토스페이서 서열은 살모넬라의 avrA, sptP, sicP, sipA, sipD, sipC, sipB, sicA, invB, ssaE, sseA, sseB, sscA, sseC, sseD, sseE, sscB, sseF, sseG, mgtC, cigR, pipA, pipB, pipC, sopB 및 pipD (임의로 invB, sicP, sseE, pipA, pipB, pipC, hilA, marT 및 sopB로부터 선택됨), 및 그의 오르토로그 또는 상동체로부터 선택된 A 유전자로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
DNA.
또한 본 발명은 하기 구성을 제공한다:-
제1 구성에서
제1 에피솜 DNA를 포함하는 담체 박테리아 세포로서, DNA는 관심 핵산 서열 (NSI)을 코딩하거나 표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 임의로 여기서
(a) 담체 세포는 제1 DNA와 상이한 제2 DNA를 포함하며, 여기서 제2 DNA는 제1 DNA의 복제에 필요한 제1 인자를 포함하거나 코딩하고;
(b) 제1 DNA는 상기 제1 인자를 포함하거나 코딩하지 않으며, 여기서 제1 DNA는 제1 인자의 부재 하에 자기-복제적이지 않지만, 제2 DNA에 의해 제공된 제1 인자의 존재 하에 담체 세포에서 복제할 수 있고;
(c) 여기서 세포는 표적 박테리아 세포로의 제1 DNA의 접합 전달을 수행하기에 충분한 하나 이상의 접합 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인
담체 박테리아 세포.
실시양태에서, 본 발명은 표적 세포 게놈에서 표적 서열 인식에 의해 작용하지만 담체 세포에서는 작용하지 않는 항박테리아제를 사용하는 이점을 유용하게 인식하며, 이는 담체 세포에 독성이 없는 담체 세포에서 자유롭게 복제되는 제1 DNA의 능력을 자유롭게 한다.
제2 구성에서
표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 표적 세포로의 접합 전달을 위한 DNA를 운반할 수 있는 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하거나 NSI를 코딩하는 DNA로서, 여기서 제1 DNA는 제1 DNA의 복제에 필요한 제1 인자를 포함하거나 코딩하지 않으며, 여기서 제1 DNA는 표적 박테리아 세포로의 제1 DNA의 접합 전달에 필요한 성분이 결여되어 있는 것인 DNA.
제3 구성에서
인간 또는 동물 대상체의 성장 또는 중량을 증진시키는 방법으로서, 여기서 방법은 본 발명에 따른 복수의 담체 세포를 대상체의 미생물총에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 미생물총은 표적 세포를 포함하고, 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포 (예를 들어, 살모넬라 세포)를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키는 것인 방법.
제4 구성에서
식물의 성장 또는 중량을 증진시키는 방법으로서, 여기서 방법은 본 발명에 따른 복수의 담체 세포를 식물의 미생물총에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 미생물총은 표적 세포를 포함하고, 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 식물에서 표적 세포 (예를 들어, 슈도모나스 세포)를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키는 것인 방법.
제5 구성에서
대상체에 의해 포함되거나 표면에 포함된 생물막을 감소시키는 방법으로서, 여기서 생물막은 표적 세포 (예를 들어, 슈도모나스 세포)를 포함하며, 여기서 방법은 본 발명에 따른 복수의 담체 세포를 생물막에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 생물막에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키는 것인 방법.
제6 구성에서
제1 DNA (예를 들어, 접합성 플라스미드에 의해 포함됨)를 복제하여 상기 DNA의 복수의 카피를 생성하는 방법으로서, 방법은 본 발명에 따른 복수의 담체 박테리아 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 제1 DNA는 세포에서 복제되는 것인 단계; 및 임의로 담체 세포로부터 제1 DNA의 복수의 카피를 단리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제7 구성에서
복수의 표적 박테리아 세포를 사멸시키거나 그의 성장 또는 증식을 감소시키는 방법으로서, 방법은 하기 단계를 포함하며:
(a) 본 발명에 따른 또는 제6 구성의 방법에 의해 수득가능한 담체 세포의 샘플을 수득하는 단계;
(b) 담체 세포의 샘플을 복수의 표적 박테리아 세포와 접촉시켜 담체 세포 및 표적 세포 사이의 접합을 허용하는 단계; 및
(c) 제1 DNA의 카피가 담체 세포로부터 표적 세포로의 접합 전달에 의해 전달되도록 허용하는 단계로서, 여기서 항박테리아제가 표적 세포에 제공되고 표적 세포가 사멸되거나 표적 세포의 성장 또는 증식이 감소되는 것인 단계;
(d) 여기서 제1 DNA는 표적 세포에서 복제가능하지 않은 (또는 실질적으로 그러하지 않은) 것인
방법.
제8 구성에서
본 발명에 따른 복수의 담체 세포를 포함하는, 제약 조성물, 가축 성장 촉진 조성물, 인수공통전염병 제어제, 가축 투여용 살생물제, 토양 개량제, 제초제, 식물 비료, 식품 또는 식품 성분 멸균 조성물, 치과용 조성물, 개인 위생 조성물 또는 소독제 조성물 (예를 들어, 가정용 또는 산업용).
제9 구성에서
제1 측면에서:-
동물 (예를 들어, 가축 동물, 예를 들어 가금류 동물)의 성장을 촉진하는 방법으로서, 방법은 동물에게 가이드된 뉴클레아제 시스템 또는 그의 성분을 투여하는 단계, 및 시스템 또는 성분을 동물에 의해 포함된 표적 박테리아에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 가이드된 뉴클레아제는 표적 박테리아에 의해 포함된 표적 뉴클레오티드 서열을 인식 및 변형 (예를 들어, 절단)시킬 수 있어, 이에 의해 표적 박테리아가 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 동물의 성장이 촉진되는 것인 방법.
방법은 비의학적 방법이고, 동물에서의 표적 박테리아의 존재는 동물의 성장을 억제할 수 있다. 그러므로, 방법은 동물에서 이러한 박테리아의 부담을 감소시키고 성장을 촉진한다.
제2 측면에서:-
동물 (예를 들어, 가축 동물, 예를 들어 가금류 동물)에서 사료 전환율 (FCR)을 증진시키는 방법으로서, 방법은 동물에게 가이드된 뉴클레아제 시스템 또는 그의 성분을 투여하는 단계, 및 시스템 또는 성분을 동물에 의해 포함된 표적 박테리아에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 가이드된 뉴클레아제는 표적 박테리아에 의해 포함된 표적 뉴클레오티드 서열을 인식 및 변형 (예를 들어, 절단)시킬 수 있어, 이에 의해 표적 박테리아가 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 동물의 FCR이 증가되는 것인 방법.
방법은 비의학적 방법이고, 동물에서의 표적 박테리아의 존재는 동물의 FCR을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 방법은 동물에서 이러한 박테리아의 부담을 감소시키고 FCR을 증진시킨다 (즉, FCR 수를 감소시킴).
제3 측면에서:-
동물 (예를 들어, 가축 동물, 예를 들어 가금류 동물)의 성장을 촉진하는 방법으로서, 방법은 동물에게 살모넬라 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 동물에 의해 포함된 살모넬라 표적 박테리아가 작용제에 노출되고 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 동물의 성장이 촉진되는 것인 방법.
방법은 비의학적 방법이고, 동물에서의 표적 박테리아의 존재는 동물의 성장을 억제할 수 있다. 그러므로, 방법은 동물에서 이러한 박테리아의 부담을 감소시키고 성장을 촉진한다.
제4 측면에서:-
동물 (예를 들어, 가축 동물, 예를 들어 가금류 동물)에서 사료 전환율 (FCR)을 증진시키는 방법으로서, 방법은 동물에게 살모넬라 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 동물에 의해 포함된 살모넬라 표적 박테리아가 작용제에 노출되고 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 동물의 FCR이 증진되는 것인 방법.
방법은 비의학적 방법이고, 동물에서의 표적 박테리아의 존재는 동물의 FCR을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 방법은 동물에서 이러한 박테리아의 부담을 감소시키고 FCR을 증진시킨다 (즉, FCR 수를 감소시킴).
제10 구성에서
제1 측면에서:-
식물의 성장, 건조 중량, 습윤 중량 또는 작물 생산을 촉진하는 방법으로서, 식물은 표적 박테리아를 포함하는 미생물총을 포함하고, 방법은 미생물총을 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 표적 박테리아가 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 식물의 성장, 건조 중량, 습윤 중량 또는 작물 생산이 증가되는 것인 방법.
제2 측면에서:-
식물의 성장, 건조 중량, 습윤 중량 또는 작물 생산을 촉진하기 위한, 식물의 미생물총에 의해 포함된 표적 박테리아를 작용제와 접촉시켜, 이에 의해 표적 박테리아를 사멸시키거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식을 억제하는 방법에서 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제의 용도.
제3 측면에서:-
식물의 작물 수율을 증가시키는 방법으로서, 식물은 표적 박테리아를 포함하는 미생물총을 포함하고, 방법은 미생물총을 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 표적 박테리아가 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 식물의 성장, 건조 중량, 습윤 중량 또는 작물 생산이 증가되는 것인 방법.
제4 측면에서:-
식물의 작물 수율을 증가시키기 위한, 식물의 미생물총에 의해 포함된 표적 박테리아를 작용제와 접촉시켜, 이에 의해 표적 박테리아를 사멸시키거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식을 억제하는 방법에서 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제의 용도.
제5 측면에서:-
식물의 잎 엽록소를 증가시키는 방법으로서, 식물은 표적 박테리아를 포함하는 미생물총을 포함하고, 방법은 미생물총을 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 표적 박테리아가 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 식물의 잎 엽록소가 증가되는 것인 방법.
제6 측면에서:-
식물의 잎 엽록소를 증가시키기 위한, 식물의 미생물총에 의해 포함된 표적 박테리아를 작용제와 접촉시켜, 이에 의해 표적 박테리아를 사멸시키거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식을 억제하는 방법에서 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제의 용도.
제7 측면에서:-
식물의 녹화를 증가시키는 방법으로서, 식물은 표적 박테리아를 포함하는 미생물총을 포함하고, 방법은 미생물총을 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 표적 박테리아가 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 식물의 녹화가 증가되는 것인 방법.
제8 측면에서:-
식물의 녹화를 증가시키기 위한, 식물의 미생물총에 의해 포함된 표적 박테리아를 작용제와 접촉시켜, 이에 의해 표적 박테리아를 사멸시키거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식을 억제하는 방법에서 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제의 용도.
제9 측면에서:-
식물에 의해 포함된 생물막 (예를 들어, 잎 생물막)을 감소시키는 방법으로서, 식물은 표적 박테리아를 포함하는 생물막을 포함하고, 방법은 미생물총을 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 표적 박테리아가 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 식물의 생물막이 감소되는 것인 방법.
제10 측면에서:-
식물의 생물막을 억제하기 위한, 식물의 생물막 (예를 들어, 잎 생물막)에 의해 포함된 표적 박테리아를 작용제와 접촉시켜, 이에 의해 표적 박테리아를 사멸시키거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식을 억제하는 방법에서 표적 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제의 용도.
임의로, 표적 박테리아는 슈도모나스 박테리아, 예컨대 피 시린가에(P syringae) 또는 피 아에루기노사(P aeruginosa) 박테리아 또는 본원에 개시된 임의의 다른 슈도모나스 박테리아이다.
임의로, 작용제는 가이드된 뉴클레아제 시스템 또는 그의 성분, 예를 들어 표적 박테리아에 의해 포함된 표적 핵산 서열을 변형 (예를 들어, 절단)하기 위한 본원에 개시된 임의의 이러한 시스템 또는 성분이다.
임의로, 식물은 본원에 개시된 임의의 식물이다.
임의로, 엽록소는 엽록소 a 및/또는 엽록소 b이다.
임의로, 작용제는 본 발명의 담체 세포에 의해 포함되고, 상기 접촉은 세포를 담체 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
도 1. 수용자 콜로니에 대해 수행된 PCR. 왼쪽에서 오른쪽으로: 1) 플라스미드 pFSMobC* (대조군). 2) S17에서 플라스미드 pFSMobC* (대조군). 3) 트랜스접합체(transconjugant) 플레이트로부터의 콜로니 (Cm30+ Nal25). 4) 트랜스접합체 플레이트로부터의 콜로니 n°2 (Cm30+ Nal25);
도 2: 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) FS26에 대한 접합에 의해 전달된 pFSMobSal7의 생존성의 효과;
도 3. 감염 후 7일에 맹장 내 살모넬라의 수. 그룹당 N=15마리의 조류;
도 4. 감염 후 7일에 맹장 내 살모넬라의 검출 빈도. 그룹당 N=15마리의 조류; 및
도 5. 6주령의 조류의 사후 사체 중량.
도 6. 챌린지 후 7일에 작물 소화물 내 살모넬라의 수 (CFU/g); N=9마리의 조류; P=0.03.
본 발명은 박테리아 사이의 접합을 수행하기 위한 수단에 관한 것이고, 특히 본 발명은 항미생물제를 포함하는 담체 박테리아 및 사용 방법에 관한 것이다. 담체 박테리아는 표적 세포로의 작용제를 코딩하는 DNA의 접합 전달이 가능하다.
본 발명은 추가로 동물에서 성장, 중량 또는 사료 전환율 (FCR) 촉진에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 살모넬라를 사멸시키거나 살모넬라의 성장 또는 증식을 억제하는 것에 관한 것이다.
그러므로, 하기가 제공된다:
대상체의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 방법 (예를 들어, 비의학적 또는 의학적)으로서, 여기서 대상체는 박테리아 표적 세포를 포함하고, 방법은 표적 세포에 독성이 있는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제1 DNA는 표적 세포로 전달되고 작용제가 발현되어, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키고 대상체의 성장 또는 중량을 증진시키는 것인 방법.
유리하게는, FCR은 대상체에서 증진된다. 임의로, FCR은 작용제 또는 담체 세포의 투여 전의 대상체의 FCR과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%, 예를 들어 2 내지 6% 또는 2 내지 5% (예컨대 2, 3, 4, 5 또는 6%)만큼 증진된다 (즉, 저하된다). 임의로, FCR은 작용제 또는 담체 세포의 투여를 받지 않은 동일한 종 및 성별의 대조군 대상체의 FCR과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%, 예를 들어 2-5% (예컨대 2, 3, 4, 또는 5%)만큼 증진된다. 한 실시양태에서, 대상체는 조류, 가금류 조류, 닭, 칠면조, 거위 또는 오리 (바람직하게는 닭)이고, FCR 수는 0.03 내지 0.07, 예를 들어 0.04 내지 0.06, 예를 들어 0.04, 0.05 또는 0.06의 양만큼 저하된다. 그러므로, 예를 들어 대조군 조류와 비교하여, 대조군 조류의 FCR은 1.7 (g 사료/g 조류)이고, 본 발명을 사용하여 처리된 대상체 조류는 1.64 내지 1.66의 FCR을 갖는다. 본 발명의 대상체와 동일한 종, 성별 및 연령의 대조군 조류 (예를 들어, 닭)는 동일한 식이 (사료)를 먹였지만, 본 발명의 처리를 받지 않는다. 조류는 동일한 무리로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 따라서, 조류 (예를 들어, 닭)는 1.64 내지 1.66의 FCR을 가지며, 여기서 대상체는 본 발명의 방법에 의해 처리되었다.
한 예에서, 방법은 대상체 그룹 (예를 들어, 동일한 종의 대상체, 예컨대 가축 동물 그룹, 예를 들어 가금류 무리 또는 소 또는 양의 떼)에 대해 수행된다. 이 예에서, 그룹의 평균 FCR은 동일한 종, 아종 또는 유형의 동물의 대조군 그룹과 비교하여, 또는 방법으로 처리 전의 그룹의 평균 FCR과 비교하여 방법에 의해 증진된다 (즉, FCR 수가 저하된다). 대조군 그룹은 동일한 평균 연령, 수컷 및 암컷의 동일한 비율을 갖고 본 발명의 그룹과 동일한 식이를 섭취한 동일한 종의 동물 그룹일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 그룹 및 대조군 그룹은 둘 다 가금류 (예를 들어, 닭) 무리이며, 예를 들어 공통 조상이 1 또는 2 또는 3 세대 전으로 거슬러 올라간다. 무리는 육용계 또는 알을 낳는 암탉의 무리일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 그룹 및 대조군 그룹은 둘 다 육우 떼 또는 젖소 떼이고, 예를 들어 공통 조상이 1 또는 2 또는 3 세대 전으로 거슬러 올라간다.
FCR, FE & ECI
축산에서, 사료 전환율 (FCR)은 가축의 몸이 동물 사료를 원하는 산출량으로 전환시키는 효율을 측정하는 비율이다. 젖소의 경우, 예를 들어 산출량은 우유인 반면, 육류용으로 키운 동물 (예컨대 육우, 돼지, 닭, 및 어류)에서, 산출량은 살, 즉 동물의 최종 질량 또는 손질된 산출량의 질량으로 표시된 동물이 얻은 체질량이다. FCR은 투입량의 질량을 산출량으로 나눈 값이다 (그러므로 우유 또는 고기의 질량당 사료 질량). 일부 부문에서, 산출량을 투입량으로 나눈 값인 사료 효율 (FE) (즉, FCR의 역)이 사용된다. 이들 개념은 또한 섭취된 식품의 전환 효율 (ECI)과 밀접하게 관련된다. FCR은 돼지 및 가금류 생산에 널리 사용되는 반면, FE는 소에 더 일반적으로 사용된다. 비율 FCR은 무차원이기 때문에, 즉, FCR을 결정하는데 사용된 측정 단위의 영향을 받지 않는다. 낮은 FCR을 갖는 동물은 효율적인 사료 사용자로 간주된다.
바람직하게는, 본 발명에 의해 생성된 증진은 대상체의 체질량의 증가이다. FCR의 증진 대신에, 본 발명은 대상체에서 사료 효율 (FE)을 증진시키는 방법, 또는 대상체에서 섭취된 식품의 전환 효율 (ECI)을 증진시키는 방법일 수 있다.
FCR은 사료 건조 질량을 사용하여 계산될 수 있거나, 급여 상태의 습윤 질량 기준으로 계산될 수 있다.
한 실시양태에서, FCR, FE 또는 ECI 수는 0.2, 0.5, 1, 1.5 또는 2만큼 변화된다. 예를 들어, FCR은 1, 1.5 또는 2만큼 감소된다.
가축에 대한 전환율
육우
미국에서 2013년 현재, 4.5-7.5의 생 중량 증가에 대해 계산된 FCR은 정상 범위 내에 있었고, 6 초과의 FCR이 전형적이다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 육우이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 6 미만으로 (동물의 생 중량을 사용하여 계산됨), 예를 들어 5.5, 5, 4.5, 4 또는 3.5 미만으로 감소된다 (임의로, 상기 FCR 또는 평균 FCR은 3.5 내지 5.9, 예를 들어 4 내지 5.5의 FCR로 감소된다).
젖소
미국에서, 우유 가격이 단백질 및 지방 함량을 기준으로 하므로, FCR은 종종 이를 고려하여 계산된다. 동물(들)로부터 수득된 우유 내의 단백질 및 지방의 중량만으로 계산된 FCR을 사용하여, 2011년 현재 13의 FCR은 불량하고, 8의 FCR은 매우 양호하다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 젖소이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 11, 10, 9 또는 8 미만으로 (및 임의로 5 또는 6 초과로) 감소되며, 여기서 FCR은 본 발명의 방법에 의해 처리된 동물(들)로부터 수득된 우유의 FCR이고, FCR은 우유 내의 단백질 및 지방의 조합된 중량을 사용하여 계산된다.
단백질 및 지방을 기준으로 가격을 책정하는 또 다른 방법은 에너지-수정 우유 (ECM)를 사용하는 것이며, 이는 최종 우유 제품 내의 지방 및 단백질의 특정 양을 가정하여 정규화하는 인자를 추가하며; 그 공식은 (0.327 x 우유 질량) + (12.95 x 지방 질량) + (7.2 x 단백질 질량)이다. 낙농 산업에서, FCR (섭취/ECM) 대신에 사료 효율 (ECM/섭취)이 종종 사용되고; 1.3 미만의 FE는 문제가 있는 것으로 간주된다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 젖소이고, 동물의 FE 수 (또는 동물의 평균 FE)는 방법에 의해 1.3, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5 또는 3 초과로 (및 임의로 4 또는 5 이하로) 증가된다. 임의로, FE는 1.3, 1.5, 1.6 초과 및 1.7 이하로 증가된다.
단순히 우유 중량을 기준으로 한 FE가 또한 사용되고; 1.30 내지 1.70의 FE가 정상이다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 젖소이고, 동물의 FE 수 (또는 동물의 평균 FE)는 방법에 의해 1.3, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5 또는 3 초과로 (및 임의로 4 또는 5 이하로) 증가된다. 임의로, FE는 1.3, 1.5, 1.6 초과 및 1.7 이하로 증가된다.
돼지
2011년 현재, 영국 및 유럽에서 상업적으로 사용되는 돼지는 새끼 돼지로서 약 1 및 도축 시 약 3으로 끝나는, 중량 증가를 사용하여 계산된 FCR을 갖는다. 호주에서 2012년 현재 및 산출량을 위한 손질된 중량을 사용하여, 손질된 고기의 중량을 사용하여 계산된 FCR은 4.5가 보통, 4.0이 "양호한", 및 3.8이 "매우 양호한"으로 간주되었다. 미국에서 2012년 현재, 상업용 돼지는 중량 증가를 사용하여 계산된 FCR이 240 내지 250 파운드 사이에 3.46, 250 내지 260 파운드 사이에 3.65, 260 내지 270 lbs 사이에 3.87, 및 280 내지 270 lbs 사이에 4.09였다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 새끼 돼지이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 1 이하로 감소되고, FCR은 동물(들)의 중량 증가를 사용하여 계산된다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 3개월 이하의 돼지이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 1 이하로 감소되고, FCR은 동물(들)의 중량 증가를 사용하여 계산된다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 3개월 이상, 그러나 6 또는 7개월 이하의 돼지이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 3 이하로 감소되고 (예를 들어, 1 내지 3), FCR은 동물(들)의 중량 증가를 사용하여 계산된다. 새끼 돼지는 1.5 내지 3월령일 수 있고; 도축용 돼지는 3월령 초과, 그러나 6월령 이하일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 중량이 240 내지 250 파운드인 돼지이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 3.5 이하 (예를 들어, 3.4 이하, 그러나 임의로 3 또는 2.5 이상)로 감소되고, FCR은 동물(들)의 중량 증가를 사용하여 계산된다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 중량이 250 내지 260 파운드인 돼지이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 3.7 이하 (예를 들어, 3.65 이하, 그러나 임의로 3 또는 3.5 이상)로 감소되고, FCR은 동물(들)의 중량 증가를 사용하여 계산된다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 중량이 260 내지 270 파운드인 돼지이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 3.9 이하 (예를 들어, 3.8 이하, 그러나 임의로 3.7 또는 3.5 이상)로 감소되고, FCR은 동물(들)의 중량 증가를 사용하여 계산된다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 중량이 280 내지 270 파운드인 돼지이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 4.1 이하 (예를 들어, 4 이하, 그러나 임의로 3.8 또는 3.9 이상)로 감소되고, FCR은 동물(들)의 중량 증가를 사용하여 계산된다.
양
양에 대한 일부 데이터는 FCR의 변동을 예시한다. 새끼 양에 대한 FCR (생 질량 증가 kg당 사료 건조물 섭취 kg)은 종종 약 4 내지 6의 범위 내에 있다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 양이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 6 이하 (예를 들어, 4 내지 6)로 감소되고, FCR은 동물(들)의 생 질량 증가 kg당 사료 건조물 섭취 kg을 사용하여 계산된다.
가금류
미국에서 2011년 현재, 육용계는 전형적으로 체중 증가를 기준으로 1.6의 FCR을 갖고, 39일에 성숙한다. 거의 동시에 브라질에서 육용계에 대한 중량 증가를 기준으로 한 FCR은 1.8이었다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 가금류 조류 (예를 들어, 육용계)이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 1.9, 1.8, 1.7, 1.6 이하 (예를 들어, 1.9 내지 1.5; 또는 1.8 내지 1.6)로 감소되고, FCR은 체중 증가를 기준으로 계산된다. 임의로, FCR은 각 동물이 35-40, 예를 들어 39일령일 때 계산된다.
미국에서 계란 생산에 사용되는 암탉의 경우, 2011년 현재 FCR은 약 2였고, 각 암탉은 연간 약 330개의 계란을 낳는다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 가금류 조류 (예를 들어, 알을 낳는 암탉, 예를 들어 닭)이고, 동물의 FCR 수 (또는 동물의 평균 FCR)는 방법에 의해 2 이하 (예를 들어, 2 내지 1.5)로 감소되고, FCR은 체중 증가를 기준으로 계산된다. 그러므로, 본 발명의 한 예에서 또는 각 동물은 가금류 조류 (예를 들어, 알을 낳는 암탉, 예를 들어 닭)이고, 동물이 낳는 계란의 수 (또는 동물이 낳는 계란의 평균 수)는 연간 (또는 상이한 기간 동안 비례 배분) 330개 초과의 계란, 예를 들어 연간 (또는 비례 배분 기간) 340, 350 또는 400개 초과의 계란이다.
육식성 어류
FIFO 비율 (또는 어류 투입량 - 어류 산출량 비율)은 수산양식에 적용되는 전환율이며, 여기서 첫 번째 숫자는 양식 어류를 먹이기 위해 사용되는 수확된 어류의 질량이고, 두 번째 숫자는 얻어진 양식 어류의 질량이다. FIFO는 식용 양식 어류의 양과 비교하여 수산사료에 사용되는 수확된 야생 어류로부터 기여도를 비율로 표현한 방식이다. 수산양식이 성장하고 더 많은 사료가 생산됨에 따라 수산사료 중 어분 및 어유 포함 비율은 시간이 지남에 따라 지속적으로 감소했지만 어분 및 어유의 연간 공급은 유한하다. 계산은 전반 사육 수산양식 FIFO는 2000년에 0.63에서 2010년에 0.33, 및 2015년에 0.22로 감소한 것으로 나타났다. 2015년에, 수확되고 사료에서 사용되는 야생 어류 1 kg당 대략 4.55 kg의 양식 어류가 생산되었다. 어분 및 어유 생산에 사용되는 어류는 인간 소비에 사용되지 않지만, 수산사료에 어분 및 어유로서 사용함으로써 세계 식품 생산에 기여한다. 그러므로, 한 예에서 본 발명의 방법은 동물이 어류 (예를 들어, 연어, 틸라피아 또는 메기)인 경우 FIFO 비율을 증진 (즉, 증가)시킨다. 예를 들어, FIFO는 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 1, 1.5 또는 2 이상으로 증가된다. 예를 들어, 어류는 연어 또는 메기이고, FIFO는 1, 1.5 또는 2 초과 (및 임의로 2 또는 2.5 이하)로 상승된다. 예를 들어, 어류는 틸라피아이고, FIFO는 1.5 또는 2 초과 (및 임의로 2 또는 2.5 이하)로 상승된다.
성장 또는 중량의 증진은 우유 생산 또는 수율의 증진 (증가), 예를 들어 대조군 그룹과 비교하여 본 발명의 그룹에 대한 평균 증가일 수 있다. 대조군 그룹은 동일한 평균 연령, 수컷 및 암컷의 동일한 비율을 갖고 본 발명의 그룹과 동일한 식이를 섭취한 동일한 종의 동물 그룹일 수 있다. 예를 들어, 여기서 대상체는 젖소일 수 있다.
성장 또는 중량의 증진은 계란 생산 또는 수율의 증진 (증가), 예를 들어 대조군 그룹과 비교하여 본 발명의 그룹에 대한 평균 증가일 수 있다. 대조군 그룹은 동일한 평균 연령, 수컷 및 암컷의 동일한 비율을 갖고 본 발명의 그룹과 동일한 식이를 섭취한 동일한 종의 동물 그룹일 수 있다. 예를 들어, 여기서 대상체는 알을 낳는 닭일 수 있다.
성장 또는 중량의 증진은 고기 생산 또는 수율의 증진 (증가), 예를 들어 대조군 그룹과 비교하여 본 발명의 그룹에 대한 평균 증가일 수 있다. 대조군 그룹은 동일한 평균 연령, 수컷 및 암컷의 동일한 비율을 갖고 본 발명의 그룹과 동일한 식이를 섭취한 동일한 종의 동물 그룹일 수 있다. 예를 들어, 여기서 대상체는 젖소, 가금류 (예를 들어, 닭), 어류, 조개류, 양 또는 돼지일 수 있다.
성장 또는 중량의 증진은 지방 생산 또는 수율의 증진 (증가), 예를 들어 대조군 그룹과 비교하여 본 발명의 그룹에 대한 평균 증가일 수 있다. 대조군 그룹은 동일한 평균 연령, 수컷 및 암컷의 동일한 비율을 갖고 본 발명의 그룹과 동일한 식이를 섭취한 동일한 종의 동물 그룹일 수 있다. 예를 들어, 여기서 대상체는 젖소, 가금류 (예를 들어, 닭), 어류 (예를 들어, 연어, 틸라피아 또는 메기), 조개류, 양 또는 돼지일 수 있다.
성장 또는 중량의 증진은 모피 또는 가죽 생산 또는 수율의 증진 (증가), 예를 들어 대조군 그룹과 비교하여 본 발명의 그룹에 대한 평균 증가일 수 있다. 대조군 그룹은 동일한 평균 연령, 수컷 및 암컷의 동일한 비율을 갖고 본 발명의 그룹과 동일한 식이를 섭취한 동일한 종의 동물 그룹일 수 있다. 예를 들어, 여기서 대상체는 소일 수 있다.
한 예에서, 대상체는 조개류이다. 조개류는 새우, 가재, 게, 랍스터, 조개, 가리비, 굴, 프론 및 홍합으로부터 선택될 수 있다.
대상체는 본원에 개시된 임의의 대상체일 수 있다. 대상체는 동물, 예컨대 가축 동물, 예를 들어 조류 (예컨대 가금류 조류; 또는 닭 또는 칠면조) 또는 돼지일 수 있다. 대안적으로, 대상체는 인간, 예를 들어 섭식 장애 (예컨대 식욕부진)를 앓고 있거나 저체중인 인간일 수 있으며, 예를 들어 여기서 인간은 18.5, 18, 17, 16 또는 15 미만의 체질량 지수 (BMI)를 갖는다. 예를 들어, 인간은 경증 식욕부진 (즉, 인간은 BMI<17.5를 갖음), 중등도 식욕부진 (즉, 인간은 16 내지 16.99의 BMI를 갖음), 중증 식욕부진 (즉, 인간은 15 내지 15.99의 BMI를 갖음) 또는 극심한 식욕부진 (즉, 인간은 BMI <15를 갖음)을 갖는다.
한 대안에서, 대상체는 예를 들어 식물이고, 표적 박테리아는 식물 병원체 박테리아이다. 한 예에서, 표적 박테리아는 슈도모나스, 예를 들어 피 시린가에 또는 피 아에루기노사이다.
한 대안에서, 표적 세포는 고세균 세포이다. 예를 들어 표적 세포는 메타노박테리움 세포이다.
예를 들어 표적 세포는 메타노겐 세포이다. 예를 들어, 표적 세포는 하기로부터 선택된 하나 이상의 종의 세포를 포함한다:
· 메타노박테리움 브리안티이
· 메타노박테리움 포르미쿰
· 메타노브레비박터 아르보리필리쿠스
· 메타노브레비박터 고트샬키이
· 메타노브레비박터 루미난티움
· 메타노브레비박터 스미티이
· 메타노코쿠스 충싱엔시스
· 메타노코쿠스 부르토니이
· 메타노코쿠스 아에올리쿠스
· 메타노코쿠스 델타에
· 메타노코쿠스 자나쉬이
· 메타노코쿠스 마리팔루디스
· 메타노코쿠스 바니엘리이
· 메타노코르푸스쿨룸 라브레아눔
· 메타노쿨레우스 보우르겐시스 (메타노게니움 올렌탕이이 & 메타노게니움 보우르겐세)
· 메타노쿨레우스 마리스니그리
· 메타노플로렌스 스토르달렌미렌시스[34]
· 메타노폴리스 리미나탄스
· 메타노게니움 카리아시
· 메타노게니움 프리기둠
· 메타노게니움 오르가노필룸
· 메타노게니움 울페이
· 메타노미크로비움 모빌레
· 메타노피루스 칸들레리
· 메타노레굴라 보오네이
· 메타노사에타 콘실리이
· 메타노사에타 써모필라
· 메타노사르시나 아세티보란스
· 메타노사르시나 바르케리
· 메타노사르시나 마제이
· 메타노스파에라 스타드트마나에
· 메타노스피릴리움 훈가테이
· 메타노써모박터 데플루비이 (메타노박테리움 데플루비이)
· 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스 (메타노박테리움 써모오토트로피쿰)
· 메타노써모박터 써모플렉수스 (메타노박테리움 써모플렉숨)
· 메타노써모박터 울페이 (메타노박테리움 울페이)
· 메타노트릭스 소큰게니이
임의로, 표적 세포는 예를 들어 방법이 비의학적 방법인 경우 대상체에 병원성이 없다. 한 예에서, 방법은 미용 방법이다.
예를 들어 표적 세포는 메탄-생산 세포이고, 임의로 대상체는 가축 동물, 바람직하게는 반추동물, 또는 소 (예를 들어, 육우 또는 젖소)이다. 이러한 동물에서 메탄-생산 세포를 감소시킴으로써, 본 발명은 한 실시양태에서 동물의 중량을 증진시키고/거나 (예를 들어, 동물로부터의 고기의 수율을 증진시킴) 우유 또는 동물의 또 다른 산물, 예컨대 모피 또는 지방의 수율을 증진시킬 수 있다.
한 예에서, 표적 세포는 이 콜라이, 살모넬라 및 캄필로박터 세포로부터 선택된다. 한 예에서, 표적 세포는 이 콜라이, 살모넬라 또는 캄필로박터 세포이다. 한 예에서, 각 동물은 닭 (예를 들어, 육용계 또는 알을 낳는 암탉)이고, 표적 세포는 살모넬라 또는 캄필로박터 세포이다. 한 예에서, 각 동물은 소 (예를 들어, 육우 또는 젖소)이고, 표적 세포는 메타노겐 세포이다.
한 예에서, 표적 세포는 미코플라스마 (예를 들어, 미코플라스마 미코이데스 (예를 들어, 미코플라스마 미코이데스 아종 미코이데스), 미코플라스마 레아치이 또는 미코플라스마 보비스), 브루셀라 아보르투스, 리스테리아 모노시토게네스, 클로스트리디움 (예를 들어, 클로스트리디움 차우보에이 또는 클로스트리디움 셉티쿰), 렙토스피라 (예를 들어, 엘. 카니콜라, 엘. 익테로헤모라기아에, 엘. 그리포티포사, 엘. 하르드조 또는 엘. 포모나), 만헤이미아 헤몰리티카, 트루에페렐라 피오게네스, 미코박테리움 보비스, 캄필로박터 종 (예를 들어, 캄필로박터 제주니 또는 캄필로박터 콜라이), 바실루스 안트라시스, 이. 콜라이 (예를 들어, 이. 콜라이 O157:H7) 또는 파스테우렐라 물토시다 (예를 들어, 파스테우렐라 물토시다 B:2, E:2, A:1 또는 A:3)로부터 선택된다. 그 예에서, 임의로 대상체 또는 동물은 가축 동물, 예컨대 소, 양, 염소 또는 닭 (바람직하게는 소)이다.
임의로, 예를 들어 여기서 대상체는 동물 (예를 들어, 가축 동물 또는 야생 동물)이고, 표적 세포는 인수공통전염성 박테리아 세포, 예컨대 바실루스 안트라시스, 미코박테리움 보비스 (예를 들어, 여기서 동물은 소임), 캄필로박터 종 (예를 들어, 여기서 동물은 가금류 동물임), 미코박테리움 마리눔 (예를 들어, 여기서 동물은 어류임), 시가 독소-생성 이. 콜라이 (예를 들어, 여기서 동물은 반추동물임), 리스테리아 종 (예를 들어, 여기서 동물은 소 또는 양임), 클라미디아 아보르투스 (예를 들어, 여기서 동물은 양임), 콕시엘라 부르네티이 (예를 들어, 여기서 동물은 소, 양 또는 염소임), 살모넬라 종 (예를 들어, 여기서 동물은 가금류 동물임), 스트렙토코쿠스 수이스 (예를 들어, 여기서 동물은 돼지임) 및 코리네박테리움 (예를 들어, 씨 울세란스) (예를 들어, 여기서 동물은 소임)으로부터 선택된 종의 세포이다.
한 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 복수의 담체 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 구성, 측면, 예 또는 실시양태의 담체 세포)가 대상체에게 투여되며, 여기서 담체 세포는 작용제를 코딩하는 DNA를 포함한다.
한 예에서, 각 동물은 닭 (예를 들어, 육용계 또는 알을 낳는 암탉)이고, 표적 세포는 살모넬라 또는 캄필로박터 세포이다. 한 예에서, 각 동물은 소 (예를 들어, 육우 또는 젖소)이고, 표적 세포는 메타노겐 세포이다.
한 실시양태에서, 따라서, 하기가 제공된다:
대상체의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 방법 (예를 들어, 비의학적 또는 의학적)으로서, 여기서 방법은 복수의 담체 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 박테리아 표적 세포를 포함하고, 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키고 대상체의 성장 또는 중량을 증진시키는 것인 방법.
임의로, 표적 세포는 살모넬라 세포이다. 한 예에서, 표적 세포는 에스 엔테리카(S enterica) 및/또는 에스 티피뮤리움(S typhimurium) 세포를 포함하며; 임의로 여기서 에스 엔테리카는 에스 엔테리카 아종 엔테리카이다. 임의로, 방법은 복수의 상이한 에스 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형을 사멸시키며; 임의로 여기서 각 혈청형은 티피뮤리움(Typhimurium), 엔테리티디스(Enteritidis), 비르효(Virchow), 몬테비데오(Montevideo), 하이델베르크(Heidelberg), 하다르(Hadar), 빈자(Binza), 브레데니(Bredeney), 인판티스(Infantis), 켄터키(Kentucky), 세프텐베르크(Seftenberg), 엠반다카(Mbandaka), 아나툼(Anatum), 아고나(Agona) 및 더블린(Dublin)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의로, 방법은 에스 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피뮤리움, 인판티스 및 엔테리티디스를 사멸시킨다. 임의로, 방법은 에스 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 및 엔테리티디스를 사멸시킨다. 임의로, 방법은 에스 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 및 인판티스를 사멸시킨다. 임의로, 방법은 에스 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 엔테리티디스 및 인판티스를 사멸시킨다. 닭에서 가장 우세한 혈청형은 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 인판티스 및 살모넬라 티피뮤리움이다. 일반적으로, 살모넬라의 유사한 혈청형이 감염된 인간 및 닭 (에스. 엔테리티디스 및 에스. 티피뮤리움)에서 발견된다. 가축 동물에서 살모넬라를 사멸시킴으로써, 본 발명은 인간에게 전송될 수 있는 인수공통전염성 박테리아 풀을 감소시키는데 유용하다 (예컨대 가축 또는 이로부터 만들어진 산물, 예컨대 인간 소비를 위한 고기 또는 유제품을 먹음으로써).
유리하게는, 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포, 임의로 이 콜라이 세포이다. 하기 실시예에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 (i) 항박테리아제가 생체내 및 시험관내 둘 다에서 이러한 세포로부터 살모넬라 표적 세포로 효율적으로 전달될 수 있고; (ii) 엔테로박테리아세아에 세포로부터 살모넬라 세포로의 접합에 의해 작용제가 전달될 때 살모넬라의 100% 사멸이 가능하였음을 밝혀내었다. 더욱이, 놀랍게도 가이드된 뉴클레아제 항박테리아를 코딩하는 DNA는 임상적으로- 및 인수공통전염적으로-중요한 티피뮤리움, 인판티스 및 엔테리티디스를 포함하는 18개의 살모넬라 종 혈청형을 사멸시킬 수 있었다. 임의로, 방법은 에스 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 및 엔테리티디스 혈청형을 사멸시킨다. 임의로, 엔테로박테리아시아에 세포는 표 5에 표시된 엔테로박테리아시아에 종의 세포이다.
중요하게는, 대상체의 GI 관에서 표적 세포의 감소가 관찰되었다. 그러므로, 임의로 방법은 동물의 위장관에서 표적 세포를 감소시키며; 임의로 방법은 동물의 공장, 회장, 결장, 간, 비장 또는 맹장에서 표적 세포를 감소시키며; 임의로 여기서 동물은 조류이고, 방법은 조류의 맹장에서 표적 세포를 감소시킨다. 이는 대상체, 예컨대 가축 동물의 분변에서 인수공통전염성 또는 다른 유해한 표적 균주의 확산을 감소시키는데 중요할 수 있다. 그러므로, 한 예에서 방법은 대상체 그룹 (예를 들어, 떼 또는 무리, 예컨대 돼지 떼 또는 조류 무리)에 대해 수행되며, 여기서 표적 종의 세포의 확산이 그룹에서 감소된다. 본 발명자들은 또한 본 발명을 사용하여 살모넬라가 사멸된 가금류 무리에서 이를 입증하였으며, 여기서 가이드된 뉴클레아제를 사용하여 표적 세포에서 복수의 프로토스페이서 서열을 절단하며, 이에 의해 세포를 사멸시키고 무리에서 그의 확산을 감소시켰다.
그러므로, 한 예에서 방법은 동물의 그룹 (임의로 무리 또는 떼)에 대해 수행되며, 여기서 동물의 일부 또는 전부는 표적 세포를 포함하며, 여기서 표적 종의 세포의 확산이 그룹에서 감소되거나; 여기서 동물의 그룹으로부터 제2 그룹으로 확산이 감소된다.
임의로, 제1 DNA는 플라스미드에 의해 포함되고, 예를 들어 여기서 플라스미드는 RP4 전달 기점 (oriT)을 포함한다. 플라스미드는 본원에 개시된 임의의 유형의 플라스미드일 수 있다.
작용제는 본원에 개시된 임의의 항박테리아제, 바람직하게는 표적 세포에서 하나 이상의 표적 서열을 절단하도록 프로그래밍된 가이드된 뉴클레아제일 수 있다. 적합한 뉴클레아제는 TALEN, 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제일 수 있다. 예를 들어, 작용제는 표적 세포에 의해 포함된 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 작동가능한 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분 (예를 들어, Cas 뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA 또는 crRNA)을 포함하며, 임의로 여기서 표적 세포는 박테리아 종의 제1 및 제2 균주를 포함하고, 각 균주는 프로토스페이서 서열을 포함하며, 여기서 균주의 세포는 사멸된다. 예를 들어, 시스템은 세포 게놈에 의해 포함된 적어도 3개의 상이한 프로토스페이서 서열을 절단하도록 작동가능하다. 임의로, 상기 프로토스페이서 서열의 각각 또는 일부는 세포에 의해 포함된 병원성 섬에 의해 포함된다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 이는 표적 세포 사멸에 고도로 효과적이다. 임의로, 작용제는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 복수의 상이한 프로토스페이서 서열을 절단하도록 작동가능하다. 임의로, 작용제는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 (예를 들어, 표적 세포 염색체에 의해 포함된) 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 작동가능한 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 포함한다.
한 실시양태에서, 작용제는
(a) 표적 핵산 서열을 인식 및 변형할 수 있는 가이드된 뉴클레아제를 포함하며, 여기서 표적 서열이 표적 세포의 내인성 염색체 또는 에피솜에 의해 포함되지만 담체 세포에 의해 포함되지 않으며, 여기서 뉴클레아제가 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위해 염색체 또는 에피솜을 변형하고/거나;
(b) 표적 세포에 의해 포함된 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동하는 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩한다.
또한 하기가 제공된다:
담체 세포 (임의로 본 발명의 방법에서 사용하기 위한)로서, 여기서 세포는 박테리아 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 항박테리아제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 이에 의해 표적 세포를 사멸시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 담체 세포.
또한 하기가 제공된다:
병원성 박테리아 표적 세포에 의한 감염을 치료하기 위해 대상체에게 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법에서 사용하기 위한 복수의 담체 세포를 포함하는 조성물로서, 여기서 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 조성물. 한 대안에서, 방법은 병원성 표적 세포에 의한 감염의 증상을 치료하거나 감소시킨다.
본원에서 대상체로의 임의의 세포 투여는 경구 투여에 의한 것일 수 있다. 본원에서 대상체로의 임의의 세포 투여는 바람직하게는 GI 관으로의 투여에 의한 것일 수 있다. 본원에서 대상체로의 임의의 세포 투여는 전신, 비강내 또는 흡입 투여에 의한 것일 수 있다.
또한 하기가 제공된다:
동물에서 인수공통전염성 박테리아 표적 세포를 사멸시키는 비의학적 방법으로서, 방법은 동물에게 복수의 담체 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 임의로 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 방법.
동물은 본원에 개시된 임의의 동물, 예를 들어 가축 동물, 길들인 동물 또는 야생 동물 (예를 들어, 박쥐 또는 조류)일 수 있다.
임의로, 본원의 임의의 방법은 대상체의 위장관에서 살모넬라를 감소시킨다. 임의로, 표적 세포는 사멸된 상이한 살모넬라 종 유형을 포함한다.
임의의 측면, 구성, 예, 개념 또는 실시양태에서, 담체 세포, 표적 세포(들) 또는 DNA는 각각 임의의 다른 측면, 구성, 예, 개념 또는 실시양태에 정의된 바와 같은 담체 세포, 표적 세포(들) 또는 DNA이다.
본 발명은 또한 하기를 제공한다:
DNA로서, 여기서 DNA는 표적 세포에 도입될 수 있으며, 여기서 DNA는 CRISPR/Cas 시스템의 복수의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하며, 여기서 가이드 RNA 또는 crRNA는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 복수의 프로토스페이서 서열을 인식하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동가능하며, 임의로 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포 또는 표 5에 개시된 종의 세포이고;
(a) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 병원성 섬 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
(b) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 침입 유전자 서열을 포함하고/거나;
(c) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 분비 시스템 유전자 서열을 포함하고/거나;
(d) 프로토스페이서 서열은 살모넬라 (예를 들어, 에스 엔테리카)의 avrA, sptP, sicP, sipA, sipD, sipC, sipB, sicA, invB, ssaE, sseA, sseB, sscA, sseC, sseD, sseE, sscB, sseF, sseG, mgtC, cigR, pipA, pipB, pipC, sopB 및 pipD (임의로 invB, sicP, sseE, pipA, pipB, pipC, hilA, marT 및 sopB로부터 선택됨) 또는 상기 유전자의 오르토로그 또는 상동체로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
DNA.
상동체: 공통 조상 DNA 또는 단백질 서열로부터의 자손에 의한 제2 유전자, 뉴클레오티드 또는 단백질 서열과 관련된 유전자, 뉴클레오티드 또는 단백질 서열. 용어 상동체는 유전적 중복의 사건에 의해 분리된 유전자 사이의 관계 또는 그의 사건에 의해 분리된 유전자 사이의 관계에 적용될 수 있다.
오르토로그: 오르토로그는 공통 조상 유전자, 뉴클레오티드 또는 단백질 서열로부터 종분화에 의해 진화한 상이한 종의 유전자, 뉴클레오티드 또는 단백질 서열이다. 정상적으로, 오르토로그는 진화 과정에서 동일한 기능을 유지한다.
"상기 유전자의 오르토로그 또는 상동체"는 프로토스페이서가 표적 세포 게놈의 유전자에 의해 포함된 서열일 수 있음을 의미하며, 여기서 유전자는 avrA, sptP, sicP, sipA, sipD, sipC, sipB, sicA, invB, ssaE, sseA, sseB, sscA, sseC, sseD, sseE, sscB, sseF, sseG, mgtC, cigR, pipA, pipB, pipC, sopB 및 pipD (임의로 invB, sicP, sseE, pipA, pipB, pipC, hilA, marT 및 sopB로부터 선택됨)로부터 선택된 살모넬라 유전자의 오르토로그 또는 상동체이다.
임의로 DNA는 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 제1 DNA이다. 바람직하게는, 표적 세포는 살모넬라 세포, 예를 들어 에스 엔테리카 세포, 예컨대 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 엔테리티디스 세포이다.
임의로 본원에서 임의의 살모넬라는 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 str. LT2이다.
임의로, 표적 세포는 살모넬라 종 이외의 표 5에 개시된 종의 세포이고, (d)의 서열은 살모넬라 (예를 들어, 에스 엔테리카)의 avrA, sptP, sicP, sipA, sipD, sipC, sipB, sicA, invB, ssaE, sseA, sseB, sscA, sseC, sseD, sseE, sscB, sseF, sseG, mgtC, cigR, pipA, pipB, pipC, sopB 및 pipD (임의로 invB, sicP, sseE, pipA, pipB, pipC, hilA, marT 및 sopB로부터 선택됨)의 오르토로그 또는 상동체로부터 선택된 유전자의 서열이다.
DNA는 하나 이상의 CRISPR 스페이서를 포함할 수 있으며, 여기서 각 스페이서는 분비 시스템 유전자의 뉴클레오티드 서열 (임의로 유형 III 단백질 분비 시스템 또는 살모넬라의 SPI-1 또는 SPI-2의 분비 시스템); 또는 T3SS 로커스 유전자로 이루어거나; 또는 그로부터 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오티드 차이가 있다.
임의로, DNA (예를 들어, 담체 세포의 DNA)는 CRISPR/Cas 시스템의 복수의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하며, 여기서 가이드 RNA 또는 crRNA는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 복수의 프로토스페이서 서열을 인식하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동가능하며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 프로토스페이서 서열은 invB, sicP 및 sseE로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 프로토스페이서 서열은 유전자 invB, sicP 및 sseE의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 예에서, DNA는 또한 Cas, 예를 들어 Cas9, Cas3, Cpf1, Cas12, Cas13, CasX 또는 CasY를 코딩한다. 한 실시양태에서, Cas는 유형 I, II, III, IV, V 또는 VI Cas, 바람직하게는 유형 I 또는 II Cas이다. 한 예에서, DNA는 또한 Cas3 및 동족 캐스케이드 단백질 (예를 들어, CasA, B, C, D 및 E)을 코딩한다. 임의로, Cas (및 현재의 캐스케이드)는 이 콜라이 Cas (및 캐스케이드)이다.
임의로, 표적 세포의 유전자는 샤페론 또는 분비된 이펙터 단백질, 예를 들어 병원성 섬 또는 유형 III 단백질 분비 시스템 (임의로 T3SS 로커스, 예컨대 살모넬라의 SPI-1 및 SPI-2의 분비 시스템)에 의해 코딩되는 이러한 단백질을 코딩한다.
DNA는 하나 이상의 CRISPR 스페이서를 포함할 수 있으며, 여기서 각 스페이서는 표적 세포의 게놈에 의해 포함된 유전자의 20-40, 25-35, 또는 30-35개의 연속 뉴클레오티드로 이루어지고; 예를 들어,
(a) 살모넬라의 avrA, sptP, sicP, sipA, sipD, sipC, sipB, sicA, invB, ssaE, sseA, sseB, sscA, sseC, sseD, sseE, sscB, sseF, sseG, mgtC, cigR, pipA, pipB, pipC, sopB 및 pipD로부터 선택된 유전자 또는 그의 상동체 또는 오르토로그;
(b) 표적 세포 게놈에 의해 포함된 병원성 섬에 의해 포함된 유전자;
(c) 표적 세포 게놈에 의해 포함된 분비 시스템 (예를 들어, 유형 III 단백질 분비 시스템) 유전자.
임의로, DNA는 박테리아 숙주 세포에서 DNA의 복제를 위해 작동가능한 전달 기점 (oriT) 및 복제 기점 (oriV)을 포함하는 플라스미드에 의해 포함된다. 임의로, 제1 DNA가 플라스미드에 의해 포함되며, 여기서 플라스미드는 RP4 전달 기점 (oriT) 및/또는 p15A 복제 기점을 포함한다.
임의로, DNA는 서열식별번호(SEQ ID NO): 15를 포함하고, 임의로 여기서 DNA는 살모넬라 표적 세포에의 접합을 위해 담체 박테리아 세포 내의 플라스미드에 의해 포함된다. 한 예에서, 본 발명의 DNA는 접합성 플라스미드 또는 파지미드에 의해 포함된다.
한 예에서, DNA는 CRISPR 반복부 및 스페이서 서열을 포함하며, 여기서
(e) 반복부 서열은 각각 서열식별번호: 16을 포함하고/거나;
(f) 스페이서 서열은 서열식별번호: 17-19 및 이의 상보체 서열로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 서열을 포함하고;
임의로 여기서 DNA는 살모넬라 표적 세포에의 접합을 위해 담체 박테리아 세포 내의 플라스미드에 의해 포함된다.
임의로, DNA는 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18 및 서열식별번호: 19를 (임의로 5'에서 3' 순서로) 포함한다. 임의로, DNA는 표 6에 표시된 하나 이상 (예를 들어, 적어도 3개)의 스페이서 서열을 포함한다.
한 예에서, DNA는 Cas3 및 임의로 하나 이상의 캐스케이드 단백질 (예를 들어, CasA, B, C, D 및 E 중 하나 이상)을 코딩한다. 한 실시양태에서, 제1 DNA는 Cas3 및 CasA, B, C, D 및 E를 코딩한다. 한 실시양태에서, 제1 DNA는 이 콜라이 Cas3 및 CasA, B, C, D 및 E를 코딩한다. 임의로, 가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, Cas3)는 유형 I-A, -B, -C, -D, -E, -F 또는 -U Cas이다.
한 예에서, 본원에서 임의의 구성, 예, 옵션 또는 실시양태에서 작용제는 표적 세포에 의해 포함된 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 작동가능한 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 포함한다.
한 예에서, 시스템은 표적 세포 게놈에 의해 포함된 적어도 3개의 상이한 프로토스페이서 서열을 절단하도록 작동가능하다. 한 실시양태에서, 상기 프로토스페이서 서열의 각각 또는 일부는 표적 세포에 의해 포함된 병원성 섬에 의해 포함된다.
한 예에서, 본원에서 임의의 구성, 예, 옵션 또는 실시양태에서 작용제는
(a) 표적 핵산 서열을 인식 및 변형할 수 있는 가이드된 뉴클레아제를 포함하며, 여기서 표적 서열이 표적 세포의 내인성 염색체 또는 에피솜에 의해 포함되지만 담체 세포에 의해 포함되지 않으며, 여기서 뉴클레아제가 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위해 염색체 또는 에피솜을 변형하고/거나;
(b) 표적 세포에 의해 포함된 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동하는 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩한다.
임의로, DNA는 가이드 RNA 또는 crRNA의 발현을 위한 구성적 프로모터를 포함한다. 임의로, DNA는 표적 세포 게놈의 프로토스페이서 서열을 변형 (예를 들어, 절단)하도록 가이드 RNA 또는 crRNA와 표적 세포에서 작동가능한 Cas 뉴클레아제의 발현을 위한 구성적 프로모터를 포함한다.
임의로, Cas, 캐스케이드 단백질, gRNA 및 crRNA는 각각 이. 콜라이 K12 (MG1655) Cas, 캐스케이드 단백질, gRNA 및 crRNA이다. 임의로, DNA는 Cas1 및 Cas2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 결여되어 있다.
본 발명은 또한 원하는 단백질 또는 RNA (예를 들어, 항미생물제를 코딩하는)를 코딩하는 담체 박테리아 및 사용 방법에 관한 것이다. 실시양태에서, 작용제는 담체 세포 (여기에 작용제가 독성이 없음) 및 표적 세포 사이의 접합에 의해 표적 세포로 전달될 수 있으며, 이에 의해 작용제는 표적 세포에 독성이 있고 표적 세포를 사멸시킨다. 다른 실시양태에서, 표적 세포의 성장 또는 증식은 감소된다 (예를 들어, 작용제의 부재 하에 성장과 비교하여 적어도 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90%만큼). 각 담체 세포는 표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 (또는 덜 독성인) 항박테리아제를 코딩하는 에피솜 DNA를 포함한다. 본 발명은 예를 들어 인간, 동물 또는 식물에 병원성인 표적 박테리아를 제어 또는 사멸시키는 적용을 발견한다. 본 발명은 예를 들어 동물 (예를 들어, 가축 동물)에 의해 포함된 인수공통전염성 표적 박테리아를 제어 또는 사멸시키는 적용을 발견한다. 예를 들어, 담체 세포는 인간 또는 동물에서 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제; 그의 성장을 촉진하기 위해 동물에게 투여하기 위한 성장 촉진제; 동물에서 인수공통전염병성 박테리아를 사멸시키는 것; 살충제로서 가축 투여용; 식물에 적용되는 살충제; 또는 식물 비료에 의해 포함될 수 있다.
본 발명의 장점은 담체 세포가 항박테리아제를 코딩하는 DNA가 복제될 수 있는 생산자 세포로서 사용될 수 있다는 것이다. 본 발명의 예의 또 다른 장점은 이러한 복제에 필요한 하나 이상의 인자를 포함하지 않는 표적 세포에서 DNA의 추가 복제가 회피될 수 있다는 점이다. 그러므로, 인자(들)가 담체 세포에 존재하고 (및 작용제를 코딩하는 DNA가 표적 세포로의 후속 접합 전달을 위한 많은 카피를 제공하기 위해 복제됨) 표적 세포에서 DNA가 추가로 복제되지 않는 방식이 구상될 수 있으며, 이는 환경 또는 인간 또는 동물 신체 또는 식물 내부 (또는 위)에서와 같이 항박테리아제의 작용을 방지하는데 유용하다. 비표적 세포의 원치않는 사멸을 회피하거나 일반적으로 투여 및/또는 사멸 활성 요법의 투여에 대한 제어를 제공하기 위해 방지가 필요할 수 있다.
제1 DNA는 담체 세포에서 복제가능하고 (그러나 표적 세포에서는 그렇지 않음), 이 경우 작용제가 표적 세포에 독성이 있는 반면 담체 세포에 독성이 없는 것이 중요하다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 이러한 선택성을 달성하기 위해 표적 세포의 서열-특이적 사멸을 사용한다. 이를 위해, 한 예에서 제1 DNA는 표적 세포 염색체의 표적 서열을 인식하고 절단하도록 표적 세포에서 작동가능한 가이드된 뉴클레아제를 코딩하여, 이에 의해 세포를 사멸시키거나 여기서 세포의 성장 또는 증식이 감소된다. 이는 여러 종 또는 균주를 사멸시킬 수 있는 (예를 들어, 잠재적으로 또한 어느 정도 담체 세포에 독성이 있음) 작용이 덜 차별적인 다른 유형의 독성제의 사용에 비해 유리하다. 가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, TALEN 또는 Cas 뉴클레아제)를 사용하여, 이들은 표적 세포 게놈 (예를 들어, 표적 세포의 염색체 또는 에피솜에 의해 포함됨)에 존재하지만 담체 세포의 게놈에 부재하는 표적 서열을 인식하도록 프로그래밍될 수 있다.
그러므로, 이 경우에 제1 DNA의 복제는 코딩된 작용제 및 작용제를 코딩하는 서열의 복제로 인해 세포를 사멸시키거나 이의 성장 또는 증식을 감소시킬 위험 없이 담체 세포에서 자유롭게 발생할 수 있다. 그러므로, 한 예에서, 제1 DNA가 가이드된 뉴클레아제를 코딩하는 경우, 가이드된 뉴클레아제는 표적 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체)에 의해 포함된 표적 핵산 서열을 인식하고 절단할 수 있으며, 여기서 표적 세포는 담체 세포에 부재한다.
특히 유용한 예는 제1 DNA가 표적 세포에서 가이드 RNA 또는 crRNA와 작동가능한 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 또는 Cas3)를 코딩하는 경우이며, 여기서 RNA는 Cas를 표적 서열로 가이드하도록 작동가능하며, 여기서 Cas는 표적 서열을 변형 (예를 들어, 절단)하고, 표적 세포가 사멸되거나 표적 세포 성장 또는 증식이 억제된다. 한 실시양태에서, 제1 DNA는 Cas 및 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 DNA는 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하지만, 동족 Cas를 코딩하지 않는다. 이 실시양태에서, RNA는 표적 세포 게놈에 의해 코딩된 내인성 Cas와 표적 세포에서 작동가능하며, 여기서 RNA는 Cas를 표적 서열로 가이드하도록 작동가능하며, 여기서 Cas는 표적 서열을 변형 (예를 들어, 절단)하고, 표적 세포가 사멸되거나 표적 세포 성장 또는 증식이 억제된다. 이러한 의미에서, 작용제는 CRISPR/Cas 시스템의 성분 (예를 들어, Cas 뉴클레아제, 캐스케이드 Cas, crRNA, 가이드 RNA 또는 tracrRNA)을 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 표적 세포에서 표적 인식에 의해 작용하지만 담체 세포에서는 작용하지 않는 항박테리아제를 사용하는 이점을 유용하게 인식하고, 이는 제1 DNA가 담체 세포에 대한 유의한 독성 없이 담체 세포에서 자유롭게 복제되는 능력을 가능하게 한다.
예시적인 플라스미드
임의의 작용제, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 (또는 그의 성분)의 전달 방법은 공여자 박테리아가 DNA를 그 자체로부터 수용자 박테리아로 전달하는 자연적 프로세스인 박테리아 접합에 의한 것일 수 있다. 공여자 박테리아는 DNA를 전달하는 주사기 또는 빨대와 같은 것으로 간주될 수 있는 표면 구조인 선모를 정교하게 만든다. 공여자 선모는 수용적인 수용자의 표면에 결합하고, 이 사건은 DNA 전달 프로세스를 촉발한다. 플라스미드는 플라스미드가 본 발명의 작용제를 코딩하는 DNA를 포함하는 이러한 접합 프로세스에 적합하다.
접합에 의한 DNA 전달은 '감수성 수용자'에서만 발생할 수 있지만, 일반적으로 유사한 유형의 플라스미드를 운반하는 수용자에서는 발생하지 않는다. 접합은 선모 브릿지를 통해 이루어지기 때문에, 해당 브릿지가 수용자가 아니라 공여자 박테리아에 부착될 수 있다. 이는 플라스미드 DNA를 그 자체에게 전달하는 무익 회로를 초래할 수 있다. 그러므로 플라스미드는 자연적으로 비호환성 인자를 코딩한다. 하나는 동일한 플라스미드를 운반하는 임의의 다른 박테리아 또는 그 자체와 같은 표면 단백질을 표시하는 박테리아에의 선모 결합을 방지하는 표면 어레이된 단백질이다. 또한, 플라스미드는 박테리아 내부의 플라스미드의 카피 수를 밀접하게 조절하는 또 다른 비호환성 시스템을 자연적으로 코딩한다. 그러므로, 접합 사건이 표면 배제를 피하고 접합에 의해 DNA를 전달하기 시작하도록 관리하는 경우, 수용자는 현재 카피 수를 이미 유지하고 더 이상 원치않는 추가 카피를 허용 및 유지하지 않기 때문에 해당 플라스미드 확립을 방지할 것이다.
본 발명의 한 예에서, 작용제를 코딩하는 DNA는 플라스미드에 의해 포함된다. 한 실시양태에서, 플라스미드는 플라스미드 비호환성 그룹의 구성원이며, 여기서 표적 세포는 상기 그룹의 플라스미드를 포함하지 않는다. 임의로, 본 발명의 플라스미드는 비호환성 그룹 P의 구성원이다 (즉, 플라스미드는 incP 플라스미드임). 살모넬라는 매우 드물게 incP 플라스미드를 운반하므로, 이 incP 플라스미드는 표적 세포가 살모넬라 세포인 경우에 유용하다. 예를 들어, 엔테로박테리아세아에 내에서, 하기는 전달에 사용될 수 있는 잠재적인 플라스미드의 비독점적 목록이다: IncFI, IncFII, IncFIll, IncFIV, IncFV, IncM, Inc9, InclO, Incl, IncA, IncB, IncC, IncH, IncIa, InclIc, IncI2, IncIy, IncJ, IncL, IncN, Inc2e, IncO, IncP, IncS, IncT 및/또는 IncW. 그러므로, 임의로, 표적 세포는 엔테로박테리아세아에 세포이고, 본 발명의 DNA는 플라스미드에 의해 포함되며, 여기서 플라스미드는 IncFI, IncFII, IncFIll, IncFIV, IncFV, IncM, Inc9, InclO, Incl, IncA, IncB, IncC, IncH, IncIa, InclIc, IncI2, IncIy, IncJ, IncL, IncN, Inc2e, IncO, IncP, IncS, IncT 및 IncW 플라스미드로부터 선택된다.
한 예에서, 본 발명의 담체 세포는 2개 이상의 플라스미드를 포함하고, 각 플라스미드는 항박테리아제를 코딩하는 본 발명의 DNA를 포함하며, 여기서 상기 플라스미드 중 첫 번째는 제1 비호환성 그룹의 구성원이며, 여기서 표적 세포는 상기 제1 그룹의 플라스미드를 포함하지 않으며, 여기서 상기 플라스미드 중 두 번째는 제2 비호환성 그룹의 구성원이며, 여기서 표적 세포는 상기 제2 그룹의 플라스미드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 담체 세포는 항-표적 세포 CRISPR-Cas 시스템 또는 그의 성분 (예를 들어, 표적 세포 게놈의 제1 프로토스페이서 서열을 표적화하는 제1 crRNA 또는 가이드 RNA를 코딩함)을 코딩하는 incP 플라스미드를 포함할 수 있으며, 여기서 담체 세포는 항-표적 세포 CRISPR-Cas 시스템 또는 그의 성분 (예를 들어, 표적 세포 게놈의 제2 프로토스페이서 서열을 표적화하는 제2 crRNA 또는 가이드 RNA를 코딩함)을 코딩하는 incF1 플라스미드를 추가로 포함하고, 프로토스페이서는 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 프로토스페이서는 표적 세포 게놈의 상이한 유전자에 의해 포함된다. 예를 들어 프로토스페이서는 표적 세포 게놈의 하나 이상의 병원성 섬에 의해 포함된다. 임의로, 표적 세포는 엔테로박테리아세아에 세포이다. 임의로, 담체 세포는 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 상이한 유형의 플라스미드를 포함하는 플라스미드 그룹을 포함하며, 여기서 각 플라스미드는 표적 세포로 접합적으로 전달될 수 있으며, 여기서 플라스미드는 상이한 작용제 또는 항박테리아제의 상이한 성분을 코딩한다. 예를 들어, 플라스미드는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 상이한 프로토스페이서를 표적화하는 상이한 cRNA 또는 gRNA를 코딩한다. 예를 들어, 플라스미드 그룹은 최대 n개의 상이한 유형의 플라스미드를 포함하며, 여기서 플라스미드는 최대 n개의 상이한 비호환성 그룹, 예를 들어 IncFI, IncFII, IncFIll, IncFIV, IncFV, IncM, Inc9, InclO, Incl, IncA, IncB, IncC, IncH, IncIa, InclIc, IncI2, IncIy, IncJ, IncL, IncN, Inc2e, IncO, IncP, IncS, IncT 및 IncW로부터 선택된 그룹의 구성원이다. 예를 들어, n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10.
예를 들어, 담체 세포는 (i) 표적 세포 게놈에 의해 포함된 제1 프로토스페이서를 표적화하는 제1 유형의 CRISPR/Cas 시스템을 코딩하거나 상기 시스템의 성분을 코딩하는 제1 플라스미드; 및 (ii) 표적 세포 게놈에 의해 포함된 제2 프로토스페이서를 표적화하는 제2 유형의 CRISPR/Cas 시스템을 코딩하거나 상기 시스템의 성분을 코딩하는 제2 플라스미드를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 유형은 상이하다. 예를 들어, 제1 유형은 유형 I 시스템이고, 및 제2 유형은 유형 II 시스템이다 (예를 들어, 제1 플라스미드는 제1 프로토스페이서를 변형하도록 표적 세포에서 Cas3 및 캐스케이드와 작동가능한 Cas3, 캐스케이드 및 crRNA 또는 가이드 RNA를 코딩하고; 제2 플라스미드는 제2 프로토스페이서를 변형하도록 표적 세포에서 Cas9와 작동가능한 Cas9 및 crRNA 또는 가이드 RNA를 코딩함). 한 대안에서, Cas3 및 캐스케이드는 내인성 표적 세포 유전자에 의해 코딩되며, 여기서 제1 플라스미드는 제1 프로토스페이서를 변형하도록 표적 세포에서 내인성 Cas3 및 캐스케이드와 작동가능한 crRNA 또는 가이드 RNA를 코딩한다. 한 대안에서, Cas9는 내인성 표적 세포 유전자에 의해 코딩되며, 여기서 제2 플라스미드는 제2 프로토스페이서를 변형하도록 표적 세포에서 내인성 Cas9와 작동가능한 crRNA 또는 가이드 RNA를 코딩한다. 임의로, Cas3 및 캐스케이드는 표적 세포의 내인성 유전자에 의해 코딩되고, Cas9는 제2 플라스미드에 의해 코딩된다.
유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 I CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분, 예를 들어 Cas3 또는 crRNA 또는 gRNA)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 III CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 I CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 IV CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 I CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 V CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 I CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 VI CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다.
유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 II CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분, 예를 들어 Cas9 또는 crRNA 또는 gRNA)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 III CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 II CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 IV CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 II CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 V CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 II CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 VI CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다.
유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 V CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분, 예를 들어 Cas12a 또는 crRNA)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 III CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 V CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 IV CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 V CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 V CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 유형 V CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 플라스미드 및 유형 VI CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제2 플라스미드를 제공한다.
유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 각각 유형 I CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 및 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 각각 유형 II CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 및 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 각각 유형 III CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 및 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 각각 유형 IV CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 및 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 각각 유형 V CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 및 제2 플라스미드를 제공한다. 유형 I 및 유형 II 시스템 대신에, 본 발명은 대안적으로 한 실시양태에서 각각 유형 VI CRISPR/Cas 시스템 (또는 그의 성분)을 코딩하는 제1 및 제2 플라스미드를 제공한다.
임의로, 플라스미드는 상이한 비호환성 그룹, 예를 들어 IncFI, IncFII, IncFIll, IncFIV, IncFV, IncM, Inc9, InclO, Incl, IncA, IncB, IncC, IncH, IncIa, InclIc, IncI2, IncIy, IncJ, IncL, IncN, Inc2e, IncO, IncP, IncS, IncT 및 IncW로부터 선택된 그룹의 구성원이다. 본원의 한 예에서, 표적 세포는 엔테로박테리아세아에 세포이다.
실시양태
그러므로, 예로서 본 발명은 하기 실시양태를 제공한다.
1. 제1 에피솜 DNA를 포함하는 담체 박테리아 세포로서, DNA는 표적 박테리아 세포에서 POI 또는 ROI를 발현하기 위해 관심 단백질 (POI) 또는 관심 RNA (ROI)를 코딩하는 관심 핵산 (NSI)을 포함하고, 담체 세포는 그 내에서의 POI, ROI 또는 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서
(a) 담체 세포는 제1 DNA와 상이한 제2 DNA를 포함하며, 여기서 제2 DNA는 제1 DNA의 복제에 필요한 제1 인자를 포함하거나 코딩하고;
(b) 제1 DNA는 상기 제1 인자를 포함하거나 코딩하지 않으며, 여기서 제1 DNA는 제1 인자의 부재 하에 자기-복제적이지 않지만, 제2 DNA에 의해 제공된 제1 인자의 존재 하에 담체 세포에서 복제할 수 있고;
(c) 여기서 담체 세포는 표적 박테리아 세포로의 제1 DNA의 접합 전달을 수행하기에 충분한 하나 이상의 접합 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인
담체 박테리아 세포.
제1 대안에서, 실시양태 1은 하기를 제공한다:-
제1 에피솜 DNA를 포함하는 담체 박테리아 세포로서, DNA는 표적 박테리아 세포에서 POI 또는 ROI를 발현하기 위해 관심 단백질 (POI) 또는 관심 RNA (ROI)를 코딩하는 관심 핵산 (NSI)을 포함하고, 담체 세포는 그 내에서의 POI 또는 ROI의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능한 것인 담체 박테리아 세포.
제2 대안에서, 실시양태 1은 하기를 제공한다:-
제1 에피솜 DNA를 포함하는 담체 박테리아 세포로서, DNA는 표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능한 것인 담체 박테리아 세포.
한 예에서, 작용제는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 표적 핵산 서열을 인식하고 절단할 수 있는 가이드된 뉴클레아제를 포함하며, 여기서 표적 서열은 담체 세포에 의해 포함되지 않는다. 이러한 의미에서, 따라서, 항박테리아제는 표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없다.
예를 들어, 하기가 제공된다:-
제1 에피솜 DNA를 포함하는 담체 박테리아 세포로서, DNA는 표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 작용제는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 (예를 들어, 표적 세포 염색체에 의해 포함된) 표적 핵산 서열을 변형하도록 표적 세포에서 작동가능한 CRISPR/Cas 시스템의 성분인 담체 박테리아 세포.
또 다른 예는 하기를 제공한다:-
제1 에피솜 DNA를 포함하는 담체 박테리아 세포로서, DNA는 표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서
(a) 담체 세포는 제1 DNA와 상이한 제2 DNA를 포함하며, 여기서 제2 DNA는 제1 DNA의 복제에 필요한 제1 인자를 포함하거나 코딩하고;
(b) 제1 DNA는 상기 제1 인자를 포함하거나 코딩하지 않으며, 여기서 제1 DNA는 제1 인자의 부재 하에 자기-복제적이지 않지만, 제2 DNA에 의해 제공된 제1 인자의 존재 하에 담체 세포에서 복제할 수 있고;
(c) 여기서 담체 세포는 표적 박테리아 세포로의 제1 DNA의 접합 전달을 수행하기에 충분한 하나 이상의 접합 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인
담체 박테리아 세포.
예는 또한 하기를 제공한다:-
제1 DNA를 포함하는 플라스미드를 포함하는 담체 박테리아 세포로서, DNA는 표적 핵산 서열을 인식 및 변형할 수 있는 가이드된 뉴클레아제를 코딩하고, 담체 세포는 그 내에서의 뉴클레아제의 발현을 위해 표적 세포로의 플라스미드의 접합 전달이 가능하며, 여기서 표적 서열은 표적 세포의 내인성 염색체 또는 에피솜에 의해 포함되지만 담체 세포에 의해 포함되지 않으며, 여기서 뉴클레아제는 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위해 염색체 또는 에피솜을 변형 (예를 들어, 절단)할 수 있는 것인 담체 박테리아 세포.
임의로, 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 TALEN이다.
임의로, 뉴클레아제는 유형 I, II, III, IV 또는 V CRISPR 시스템의 Cas 뉴클레아제이다.
예는 또한 하기를 제공한다:-
제1 DNA를 포함하는 플라스미드를 포함하는 담체 박테리아 세포로서, DNA는 표적 핵산 서열을 인식 및 변형할 수 있는 CRISPR/Cas 시스템의 성분을 코딩하고, 담체 세포는 그 내에서의 성분의 발현을 위해 표적 세포로의 플라스미드의 접합 전달이 가능하고, 이에 의해 발현된 성분은 표적 세포에서 상기 시스템의 일부를 형성하며, 여기서 표적 서열은 표적 세포의 내인성 염색체 또는 에피솜에 의해 포함되지만 담체 세포에 의해 포함되지 않으며, 여기서 시스템은 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위해 염색체 또는 에피솜을 변형 (예를 들어, 절단)할 수 있다.
한 측면에서, 성분은 표적 세포의 표적 서열을 혼성화할 수 있는 가이드 RNA 또는 crRNA이다. 시스템은 유형 I, II, III, IV 또는 V CRISPR 시스템일 수 있다.
임의로,
(a) 담체 세포는 제1 DNA와 상이한 제2 DNA를 포함하며, 여기서 제2 DNA는 제1 DNA의 복제에 필요한 제1 인자를 포함하거나 코딩하고;
(b) 제1 DNA는 상기 제1 인자를 포함하거나 코딩하지 않으며, 여기서 제1 DNA는 제1 인자의 부재 하에 자기-복제적이지 않지만, 제2 DNA에 의해 제공된 제1 인자의 존재 하에 담체 세포에서 복제할 수 있고;
(c) 여기서 담체 세포는 표적 박테리아 세포로의 제1 DNA의 접합 전달을 수행하기에 충분한 하나 이상의 접합 인자를 코딩하는 유전자를 포함한다.
제2 DNA는 담체 세포의 염색체 또는 에피솜 (예를 들어, 플라스미드)에 의해 포함될 수 있다.
본 발명의 임의의 방법은 이들 예 중 임의의 것의 담체 세포(들)를 사용할 수 있다.
유리하게는, 세포는 인간 또는 동물 대상체 (예를 들어, 닭, 소, 돼지, 어류 또는 조개류)에서 표적 세포 감염을 치료 또는 예방하기 위한 것이다. 유리하게는, 담체 세포는 상기 대상체에 대해 프로바이오틱이거나 인간 또는 동물 (예를 들어, 닭)에 대해 프로바이오틱인 종의 세포이다. 예를 들어, 담체 세포는 프로바이오틱 이 콜라이 세포이다. 예를 들어, 담체 세포는 프로바이오틱 바실루스 세포이다. 한 예에서, 표적 세포는 상기 대상체에 병원성이거나 인간 또는 동물 (예를 들어, 닭)에 병원성인 종의 세포이다. 유리하게는, 제1 DNA는 표적 세포에서 각각의 표적 핵산 서열(들)에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA 또는 하나 이상의 crRNA를 코딩하며, 여기서 표적 서열(들)은 표적 세포의 내인성 염색체 및/또는 내인성 에피솜에 의해 포함된다. 예를 들어, 제1 DNA는 각각의 표적 서열에 혼성화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7, 9 또는 10개 (또는 10개 초과)의 상이한 gRNA 또는 상이한 crRNA를 코딩하며, 여기서 표적 서열은 서로 상이하다. 예를 들어, 3개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 2개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 3개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 4개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 3개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 5개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 6개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 7개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 8개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 9개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 10개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 11개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 12개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 예를 들어, 13개의 상이한 gRNA 또는 crRNA는 제1 DNA에 의해 코딩된다. 한 예에서, 표적 세포는 살모넬라 세포이다 (예를 들어, 여기서 대상체는 닭임). 한 예에서, 표적 세포는 이 콜라이 세포이다. 한 예에서, 표적 세포는 캄필로박터 세포이다 (예를 들어, 여기서 대상체는 닭임). 한 예에서, 표적 세포는 에드워드시엘라 세포이다 (예를 들어, 여기서 대상체는 어류 또는 조개류, 예를 들어 메기 또는 새우 또는 프론임). 한 예에서, 표적 세포는 이 콜라이 세포이다.
본원에서 한 대안에서, 담체 및 표적 세포는 고세균 세포이다. 본원에서 한 대안에서, 담체 및 표적 세포는 효모 세포이고, "접합"은 대신 효모 "교배"를 지칭하는 것으로 해석되어야 하고, 예를 들어 제2 DNA는 담체 효모 세포의 염색체에 의해 포함된다.
바람직한 예에서, NOI는 표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩한다. 한 예에서, POI는 항생제, 항체, 항체 쇄 또는 항체 가변 도메인이다. 한 예에서, ROI는 표적 세포에서 동족 Cas (예를 들어, 표적 세포의 염색체 또는 에피솜에 의해 포함된 프로토스페이서 서열을 표적화하고 절단하기 위한 Cas 뉴클레아제)와 작동가능한 가이드 RNA 또는 crRNA이다. 한 예에서 RNA는 표적 세포의 내인성 표적 핵산 서열을 혼성화하여 그의 전사 및/또는 번역을 침묵시킬 수 있는 siRNA이다.
담체 세포는 제1 DNA와 상이한 염색체 또는 제2 에피솜 DNA를 포함한다. 그러므로, 예를 들어 제2 DNA는 담체 세포의 염색체에 의해 포함된다. 다른 예에서, 제2 DNA는 담체 세포의 플라스미드에 의해 포함된다.
2. 실시양태 1에 있어서,
(d) 제1 DNA는 표적 박테리아 세포로의 제1 DNA의 접합 전달에 필요한 성분이 결여되어 있고;
(e) 담체 세포는 상기 성분을 포함하며, 여기서 성분은 담체 세포에 의해 포함된 제2 DNA 또는 제3 DNA에 의해 포함되거나 이에 의해 코딩되는 것인
담체 세포.
제3 DNA는 염색체 또는 에피솜 (예를 들어, 플라스미드)에 의해 포함될 수 있다. 이후에 실시양태 2에서 명시적으로 언급되는 경우, 성분은 문맥이 명확하게 하는 바와 같이 접합 전달에 필요한 성분을 지칭한다.
3. 실시양태 2에 있어서, 성분이 Mpf 또는 Dtr 모듈에 의해 포함되는 것인 담체 세포.
예를 들어, 모듈은 RK2, RP4 또는 R6K tra 모듈이다. 임의로, 성분은 Mpf (교배 쌍 형성) 모듈, 예를 들어 RK2 또는 RP4 tra1 모듈 또는 이의 상동체에 의해 포함된다. 임의로, 성분은 Dtr (DNA-전달 복제) 모듈, 예를 들어 RK2 또는 RP4 tra2 모듈 또는 이의 상동체에 의해 포함된다.
4. 실시양태 2에 있어서, 성분이 Mpf (예를 들어, tra1) 또는 Dtr (예를 들어, tra2) 모듈의 오페론에 의해 코딩되는 것인 담체 세포.
예를 들어, 모듈은 RK2, RP4 또는 R6K tra 모듈이다. 임의로, 모듈은 Mpf (교배 쌍 형성) 모듈, 예를 들어 RK2 또는 RP4 tra1 모듈 또는 이의 상동체이다. 임의로, 모듈은 Dtr (DNA-전달 복제) 모듈, 예를 들어 RK2 또는 RP4 tra2 모듈 또는 이의 상동체이다.
RP4 또는 RK2의 Mpf 오페론은 유전자 traF와 함께 tra2 오페론 (trb 유전자 trbBCDEFGHIJKL 포함)이다. 유전자 traF는 tra1 오페론 (traJXIHG와 함께)의 RK2 또는 RP4에 포함된다. 그러므로, 한 실시양태에서, 성분은 trbB, trbC, trbD, trbE, trbF, trbG, trbH, trbI, trbJ, trbK, trbL 및 traF로부터 선택된 유전자이다. 한 실시양태에서 제1 DNA는 RP4 trbB, trbC, trbD, trbE, trbF, trbG, trbH, trbI, trbJ, trbK, trbL 및 traF 또는 이의 상동체로부터 선택된 2개 이상의 유전자가 결여되어 있다. 한 실시양태에서 제1 DNA는 RK2 trbB, trbC, trbD, trbE, trbF, trbG, trbH, trbI, trbJ, trbK, trbL 및 traF 또는 이의 상동체로부터 선택된 2개 이상의 유전자가 결여되어 있다. 한 예에서, 성분은 traK, traL 또는 traM 유전자이다. 한 실시양태에서 제1 DNA는 RP4 traK, traL 및 traM 또는 이의 상동체로부터 선택된 2개 이상의 유전자가 결여되어 있다. 한 실시양태에서 제1 DNA는 RK2 traK, traL 및 traM 또는 이의 상동체로부터 선택된 2개 이상의 유전자가 결여되어 있다. 임의로, 이들 실시양태에서 제1 DNA는 RP4 또는 RK2-유형 플라스미드에 의해 포함된다.
R6K Mpf는 Dtr 모듈의 clpX1을 또한 포함하는 sltX1tivB1B2B3-4B5B6B7B8B9B10B11 오페론에 의해 코딩된다. 그러므로, 한 실시양태에서, 성분은 RK6 sltX1tivB1B2B3-4B5B6B7B8B9B10B11 오페론에 의해 포함된 유전자이다. 한 실시양태에서, 성분은 RK6 Dtr 모듈의 clpX1이다. 한 실시양태에서, 성분은 clpX1 및 dtrX1rlxX1로부터 선택된 유전자이다. 한 실시양태에서, 성분은 RK6 clpX1 및 dtrX1rlxX1 또는 이의 상동체로부터 선택된 유전자이다. 임의로, 이들 실시양태에서 제1 DNA는 RK6-유형 플라스미드에 의해 포함된다.
임의의 선행 실시양태에 있어서, 담체 세포 염색체 및/또는 담체 세포의 에피솜 (제1 DNA를 포함하는 에피솜 제외)이 발현가능한 tra1 및/또는 tra2 모듈 또는 이의 상동체를 포함하는 것인 담체 세포.
본원에서 임의의 에피솜은 플라스미드일 수 있다.
5. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 담체 세포 염색체 및/또는 담체 세포의 에피솜 (제1 DNA를 포함하는 에피솜 제외)이 tra1 및/또는 tra2 모듈 또는 이의 상동체의 발현가능한 오페론을 포함하는 것인 담체 세포.
6. 실시양태 3 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 성분이 tra1 성분인 담체 세포.
7. 실시양태 3 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 성분이 tra2 성분인 담체 세포.
8. 실시양태 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 담체 세포 염색체가 제1 인자를 코딩하고 상기 성분을 포함하는 것인 담체 세포.
9. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 제1 인자가 rep 단백질이고, 임의로 단백질이 pir 또는 trfA 또는 이의 상동체에 의해 코딩되는 것인 담체 세포.
10. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 제1 DNA가 RK2 또는 R6K 플라스미드에 의해 포함되는 것인 담체 세포.
11. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 제1 DNA가 RK2 또는 R6K 플라스미드의 oriV, 또는 이의 상동체를 포함하는 것인 담체 세포.
12. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 제1 DNA가 RK2 또는 R6K 플라스미드의 oriT, 또는 이의 상동체를 포함하는 것인 담체 세포.
13. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 제1 DNA가 플라스미드에 의해 포함되는 것인 담체 세포.
14. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 제2 DNA가 플라스미드에 의해 포함되거나 담체 세포의 염색체에 의해 포함되는 것인 담체 세포.
15. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 작용제가 표적 세포에 의해 포함된 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 작동가능한 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 포함하고, 예를 들어 여기서 프로토스페이서 서열이 세포 염색체에 의해 포함되는 것인 담체 세포.
한 실시양태에서, 본원에서 절단은 표적 세포를 사멸시킨다. 또 다른 실시양태에서, 절단은 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제한다.
16. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 작용제가 표적 세포에 의해 포함된 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동가능한 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하고, 예를 들어 여기서 프로토스페이서 서열이 세포 염색체에 의해 포함되는 것인 담체 세포.
한 예에서, 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 프로토스페이서는 pipA, pipB, pipC, hilA, sicP, mart 또는 sopB 유전자에 의해 포함된다. 한 예에서, 프로토스페이서는 살모넬라 sicP, sseF, pipA, pipB, pipC, hilA, sicP, mart 또는 sopB 유전자의 상동체 또는 오르토로그인 유전자에 의해 포함된다.
17. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 제1 DNA가 산물을 코딩하는 유전자를 포함하며, 여기서 산물은 산물이 결여되어 있는 환경에서 담체 세포의 생존 또는 증식에 필수적이며, 여기서 담체 세포 염색체가 산물을 코딩하는 발현가능한 유전자를 포함하지 않고, 임의로 제1 DNA가 산물을 코딩하는 담체 세포에 의해 포함된 유일한 에피솜 DNA인 담체 세포.
18. 실시양태 17에 있어서, 유전자가 aroA, argH, hisD, leuB, lysA, metB, proC, thrC, pheA, tyrA, trpC 및 pflA 유전자로부터 선택되거나; 유전자가 항-독소 유전자이고, 임의로 제1 DNA가 동족 독소를 코딩하는 것인 담체 세포.
19. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 담체 세포가 이 콜라이 (예를 들어, 니슬(Nissle), F18 또는 S17 이 콜라이 균주), 바실루스 (예를 들어, 비 서브틸리스), 엔테로코쿠스 또는 락토바실루스 세포인 담체 세포.
임의로, 담체 세포는 인간, 닭, 돼지, 양, 소, 어류 (예를 들어, 메기 또는 연어) 또는 조개류 (예를 들어, 새우 또는 랍스터) 공생 박테리아 균주 (예를 들어, 공생 이 콜라이 균주)의 세포이다.
20. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 담체 세포가 의학적 용도를 위해 인간 또는 동물 대상체의 미생물총에 투여하기 위한 것인 담체 세포.
예를 들어, 의학적 용도는 본원에 개시된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 것이다. 예를 들어, 의학적 용도는 본원에 개시된 상태를 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
21. 실시양태 20에 있어서, 의학적 용도가 상기 표적 세포에 의해 매개되는 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 것인 담체.
22. 실시양태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 동물의 성장 또는 중량을 증진시키기 위해 동물에 투여하기 위한 담체.
대안에서, 인간에게 투여는 인간의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 것이다. 임의로, 증진은 의학적 요법이 아니다. 임의로, 증진은 의학적 요법이다.
23. 실시양태 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 용어가 대상체의 미생물총 (예를 들어, 장내 미생물총)에 복수의 담체 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 미생물총이 표적 세포를 포함하고, 제1 DNA가 그 내에서의 발현을 위해 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키는 것인 담체.
24. 표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 DNA로서, 여기서 제1 DNA는 복제 기점을 포함하지만 제1 DNA의 복제에 필요한 제1 인자를 포함하거나 코딩하지 않고, 제1 DNA는 전달 기점을 포함하지만 표적 박테리아 세포로의 제1 DNA의 접합 전달에 필요한 성분이 결여되어 있으며, 여기서 성분의 존재 하에 DNA는 표적 세포로의 접합 전달이 가능한 것인 DNA.
그러므로, DNA가 담체 세포 내에 있을 때, DNA는 표적 세포로의 접합 전달이 가능하다.
25. 실시양태 24에 있어서, DNA가 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 인용된 DNA에 따른 것인 DNA.
26. 실시양태 24 또는 25에 있어서, 여기서 세포가 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 인용된 세포에 따른 것인 DNA.
27. 동물 대상체 (예를 들어, 닭)의 성장 또는 중량을 증진시키는 방법으로서, 여기서 방법은 대상체의 미생물총에 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 복수의 담체 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 미생물총은 표적 세포를 포함하고, 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포 (예를 들어, 살모넬라 세포)를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키는 것인 방법.
대안에서, 인간에게 투여는 인간의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 것이다. 임의로, 증진은 의학적 요법이 아니다. 임의로, 증진은 의학적 요법이다.
28. 식물 (예를 들어, 토마토 식물)의 성장 또는 중량을 증진시키는 방법으로서, 여기서 방법은 식물의 미생물총에 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 복수의 담체 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 미생물총은 표적 세포를 포함하고, 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 식물에서 표적 세포 (예를 들어, 슈도모나스 세포)를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키는 것인 방법.
식물은 본원에 개시된 임의의 식물일 수 있다. 예를 들어 본 발명의 임의의 구성 또는 실시양태에서 본원에서 식물은 토마토 식물, 감자 식물, 밀 식물, 옥수수 식물, 메이즈 식물, 사과 나무, 콩-생산 식물, 완두콩 식물, 비트 뿌리 식물, 핵과 식물, 보리 식물, 홉 식물 및 잔디로부터 선택된다. 예를 들어, 식물은 나무, 예를 들어 야자수, 칠엽수, 소나무, 오크 나무 또는 활엽수이다. 예를 들어 식물은 딸기, 라즈베리, 블랙베리, 레드커런트, 키위 과일, 바나나, 사과, 살구, 아보카도, 체리, 오렌지, 클레멘타인, 사츠마, 자몽, 플러스, 대추야자, 무화과, 라임, 레몬, 멜론, 망고, 배, 올리브 또는 포도로부터 선택된 과일을 생산하는 식물이다. 임의로, 식물은 쌍떡잎식물이다. 임의로, 식물은 현화 식물이다. 임의로, 식물은 외떡잎식물이다.
본원의 임의의 구성, 실시양태 또는 예에서, 표적 박테리아는 피 시린가에 박테리아 (예를 들어, 식물에 의해 포함됨)이다. 슈도모나스 시린가에 pv. 시린가에는 전 세계적으로 단자엽 및 쌍자엽 식물 둘 다의 질환을 일으키는 흔한 식물-연관 박테리아이다. 한 예에서 표적 박테리아는 P. s. pv. 아세리스, P. s. pv. 압타타, P. s. pv. 아트로파시엔스, P. s. pv. 디스옥실리스, P. s. pv. 자포니카, P. s. pv. 랍사, P. s. pv. 파니시, P. s. pv. 파풀란스, P. s. pv. 피시, P. s. pv. 시린가에 및 P. s. pv. 모르스프루노룸으로부터 선택된 병원체변종의 피 시린가에 박테리아이다.
· P. s. pv. 아세리스는 단풍나무 에이서 종을 공격한다.
· P. s. pv. 악티니디아에는 키위 과일 악티니디아 델리시오사를 공격한다.
· P. s. pv. 아에스쿨리는 칠엽수 아에스쿨루스 히포카스타눔을 공격하여 출혈성 동고병을 일으킨다.
· P. s. pv. 압타타는 비트 베타 불가리스를 공격한다.
· P. s. pv. 아트로파시엔스는 밀 트리티쿰 아에스티붐을 공격한다.
· P. s. pv. 디스옥실리스는 코헤코헤 나무 디스옥실룸 스펙타빌레를 공격한다.
· P. s. pv. 자포니카는 보리 호르데움 불가레를 공격한다.
· P. s. pv. 랍사는 밀 트리티쿰 아에스티붐을 공격한다.
· P. s. pv. 파니시는 파니쿰 잔디 종을 공격한다.
· P. s. pv. 파풀란스는 크랩애플 말루스 실베스트리스 종을 공격한다.
· P. s. pv. 파세올리콜라는 콩의 달무리무늬병을 일으킨다.
· P. s. pv. 피시는 완두콩 피숨 사티붐을 공격한다.
· P. s. pv. 시린가에는 시린가, 프루누스, 및 파세올루스 종을 공격한다.
· P. s. pv. 글리시네아는 대두를 공격하여 대두의 박테리아성 마름병을 일으킨다.
한 예에서, 표적 박테리아는 직전 단락의 글머리 기호에 인용된 혈청형으로부터 선택된 피 시린가에이고, 박테리아는 해당 글머리 기호에도 언급된 식물에 의해 포함된다.
한 예에서, 중량은 건조 중량이다. 예를 들어, 방법은 건조 중량을 증가시키기 위한 것이다 (예를 들어, 상기 투여의 1 또는 2주 이내). 임의로, 증가는 담체 세포가 투여되지 않은 동일한 종 또는 균주의 대조군 식물과 비교하여 적어도 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20%의 증가이며, 여기서 모든 식물은 동일한 환경 조건 하에 유지된다. 예를 들어, 이러한 증가는 담체 세포의 제1 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 8주 이내이다. 한 예에서, 방법은 식물, 예컨대 토마토 식물의 잎 및/또는 과일의 건조 중량을 증가시키기 위한 것이다.
한 예에서, 중량은 습윤 중량이다. 예를 들어, 방법은 습윤 중량을 증가시키기 위한 것이다 (예를 들어, 상기 투여의 1 또는 2주 이내). 임의로, 증가는 담체 세포가 투여되지 않은 동일한 종 또는 균주의 대조군 식물과 비교하여 적어도 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20%의 증가이며, 여기서 모든 식물은 동일한 환경 조건 하에 유지된다. 예를 들어, 이러한 증가는 담체 세포의 제1 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 8주 이내이다. 한 예에서, 방법은 식물, 예컨대 토마토 식물의 잎 및/또는 과일의 건조 중량을 증가시키기 위한 것이다.
29. 실시양태 28에 있어서, 미생물총이 식물의 잎, 몸통, 뿌리 또는 줄기에 의해 포함되는 것인 방법.
한 예에서, 본원의 임의의 구성 또는 실시양태에서 표적 박테리아 (또는 표적 세포)는 식물의 미생물총에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 잎에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 목질부에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 체관부에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 뿌리에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 괴경에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 구근에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 종자에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 겉열매껍질, 외과피, 중과피 또는 내과피에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 과일, 예를 들어 단과; 집합과; 또는 복합과에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 종자 또는 배아, 예를 들어 종피; 자엽; 떡잎; 또는 유근에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 꽃에 의해 포함되고, 예를 들어 꽃자루; 꽃받침: 꽃잎; 수술; 화사; 꽃밥 또는 암술에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 뿌리; 예를 들어, 직근 시스템, 또는 수염뿌리 시스템에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 잎 또는 잎들에 의해 포함되고, 예를 들어 잎사귀, 잎자루 또는 탁엽에 의해 포함된다. 한 예에서, 미생물총은 줄기에 의해 포함되고, 예를 들어 껍질, 표피, 체관부, 형성층, 목질부 또는 속에 의해 포함된다.
30. 대상체에 의해 포함되거나 표면에 포함된 생물막을 감소시키는 방법으로서, 여기서 생물막은 표적 세포 (예를 들어, 슈도모나스 세포)를 포함하며, 여기서 방법은 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 복수의 담체 세포를 생물막에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 생물막에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키는 것인 방법.
한 예에서 "생물막 감소"는 생물막의 커버리지 영역을 감소시키는 것을 포함한다. 한 예에서 "생물막 감소"는 생물막의 증식을 감소시키는 것을 포함한다. 한 예에서 "생물막 감소"는 생물막의 내구성을 감소시키는 것을 포함한다. 한 예에서 "생물막 감소"는 생물막의 확산을 감소시키는 것을 포함한다 (예를 들어, 대상체 내에 또는 위에, 예를 들어 대상체를 함유하는 환경으로의 확산).
31. 실시양태 30에 있어서, 대상체가 인간 또는 동물인 방법.
예를 들어, 생물막은 대상체의 폐에 의해 포함되고, 예를 들어 여기서 표적 세포는 슈도모나스 (예를 들어, 피 아에루기노사) 세포이다. 이는 대상체가 폐 질환 또는 상태, 예컨대 폐렴 또는 낭포성 섬유증을 앓고 있는 인간인 경우에 유용할 수 있다.
예를 들어, 생물막은 본원에 개시된 동물 또는 인간 장기에 의해 포함된다. 예를 들어, 생물막은 본원에 개시된 인간 또는 동물의 미생물총에 의해 포함된다.
32. 실시양태 30에 있어서, 대상체가 식물 (예를 들어, 본원에 개시된 임의의 식물)인 방법.
임의로, 이 실시양태에서 표적 세포는 슈도모나스 시린가에 세포이다.
33. 실시양태 31 또는 32에 있어서, 생물막이 식물의 잎, 몸통, 뿌리 또는 줄기에 의해 포함되는 것인 방법.
한 예에서, 본원의 임의의 구성 또는 실시양태에서 표적 박테리아 (또는 표적 세포)는 식물의 생물막에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 잎에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 목질부에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 체관부에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 뿌리에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 괴경에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 구근에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 종자에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 겉열매껍질, 외과피, 중과피 또는 내과피에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 과일, 예를 들어 단과; 집합과; 또는 복합과에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 종자 또는 배아, 예를 들어 종피; 자엽; 떡잎; 또는 유근에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 꽃에 의해 포함되고, 예를 들어 꽃자루; 꽃받침: 꽃잎; 수술; 화사; 꽃밥 또는 암술에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 뿌리; 예를 들어, 직근 시스템, 또는 수염뿌리 시스템에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 잎 또는 잎들에 의해 포함되고, 예를 들어 잎사귀, 잎자루 또는 탁엽에 의해 포함된다. 한 예에서, 생물막은 줄기에 의해 포함되고, 예를 들어 껍질, 표피, 체관부, 형성층, 목질부 또는 속에 의해 포함된다.
34. 실시양태 30 내지 33 중 어느 하나 (예를 들어, 30)에 있어서, 표면이 생체외 표면, 예컨대 가정용 또는 산업용 장치 또는 컨테이너에 의해 포함된 표면인 방법.
35. 제1 DNA를 복제하여 상기 DNA의 복수의 카피를 생성하는 방법으로서, 방법은 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 복수의 담체 박테리아 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 DNA는 세포에서 복제되는 것인 방법.
임의로, 방법은 상기 배양 후 제1 DNA를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 통상의 기술자는 사용될 수 있는 세포를 배양하기 위한 기술 및 조건에 친숙하다.
36. 실시양태 35에 있어서, 하기 단계를 포함하며:
(a) 배양 후 담체 세포의 샘플을 수득하는 단계;
(b) 담체 세포의 샘플을 복수의 표적 박테리아 세포와 접촉시켜 담체 세포 및 표적 세포 사이의 접합을 허용하는 단계; 및
(c) 제1 DNA의 카피가 담체 세포로부터 표적 세포로의 접합 전달에 의해 전달되도록 허용하는 단계로서, 여기서 항박테리아제가 표적 세포에 제공되고 표적 세포가 사멸되거나 표적 세포의 성장 또는 증식이 감소되는 것인 단계;
(d) 여기서 제1 DNA는 표적 세포에서 복제가능하지 않은 것인
방법.
예를 들어, 제1 DNA는 표적 세포에서 실질적으로 복제가능하지 않다 (예를 들어 10, 5, 4, 3, 2 또는 1% 미만의 복제).
제1 DNA는 표적 세포에서 이를 코딩하는 제1 인자 또는 서열의 부재로 인해 표적 세포에서 복제가능하지 않다 (또는 실질적으로 그러하지 않다).
37. 복수의 표적 박테리아 세포를 사멸시키거나 그의 성장 또는 증식을 감소시키는 방법으로서, 방법은 하기 단계를 포함하며:
(a) 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 또는 실시양태 35의 방법에 의해 수득가능한 담체 세포의 샘플을 수득하는 단계;
(b) 담체 세포의 샘플을 복수의 표적 박테리아 세포와 접촉시켜 담체 세포 및 표적 세포 사이의 접합을 허용하는 단계; 및
(c) 제1 DNA의 카피가 담체 세포로부터 표적 세포로의 접합 전달에 의해 전달되도록 허용하는 단계로서, 여기서 항박테리아제가 표적 세포에 제공되고 표적 세포가 사멸되거나 표적 세포의 성장 또는 증식이 감소되는 것인 단계;
(d) 여기서 제1 DNA는 표적 세포에서 복제가능하지 않은 (또는 실질적으로 그러하지 않은) 것인
방법.
38. 실시양태 36 또는 37에 있어서, 표적 세포가 생물막, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 생물막에 의해 포함되는 것인 방법.
39. 환경에서 항박테리아제의 작용을 방지하는 방법으로서, 여기서 작용제는 표적 박테리아 세포에 독성이 있고, 방법은 실시양태 37 또는 38의 방법을 수행하는 것을 포함하고, 작용제는 상기 실시양태에서 인용된 작용제인 방법.
40. 실시양태 39에 있어서, 환경이 인간 또는 동물 대상체에 의해 포함되고, 표적 세포가 대상체의 생물막에 의해 포함되며, 여기서 방법이 담체 세포의 샘플을 대상체의 생물막에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 담체 세포가 단계 (b)에서 표적 세포와 접촉되며, 여기서 방법이 대상체에서 표적 세포에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 함유된 방법인 방법.
41. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 표적 박테리아가 살모넬라, 슈도모나스, 에스케리키아, 클레브시엘라, 캄필로박터, 헬리코박터, 아시네토박터, 엔테로박테리아세아, 클로스트리디움, 스타필로코쿠스 또는 스트렙토코쿠스 박테리아인 담체 세포, DNA 또는 방법.
42. 임의의 선행 실시양태에 있어서, 표적 박테리아가 살모넬라 엔테리카 박테리아인 담체 세포, DNA 또는 방법.
예를 들어, 표적 박테리아는 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카, 혈청형 티피뮤리움, 엔테리티디스, 비르효, 몬테비데오, 하다르 및 빈자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
43. 실시양태 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 표적 박테리아가 슈도모나스 (예를 들어, 피 시린가에 또는 피 아에루기노사) 박테리아인 담체 세포, DNA 또는 방법.
44. 실시양태 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 표적 박테리아가 이 콜라이 박테리아인 담체 세포 또는 방법.
임의로, 표적 박테리아는 장출혈성 이. 콜라이 (EHEC), 이. 콜라이 혈청형 O157:H7 또는 시가-독소 생성 이. 콜라이 (STEC))이다. 한 예에서, 표적 박테리아는 하기로부터 선택된다:
· 시가 독소-생성 이. 콜라이 (STEC) (STEC는 베로세포독소-생성 이. 콜라이 (VTEC)로도 지칭될 수 있음);
· 장출혈성 이. 콜라이 (EHEC) (이 병원형은 식인성 발생과 연관하여 뉴스에서 가장 흔히 듣게 되는 것임);
· 장독소생성 이. 콜라이 (ETEC);
· 장병원성 이. 콜라이 (EPEC);
· 장응집성 이. 콜라이 (EAEC);
· 장침습성 이. 콜라이 (EIEC); 및
· 확산성 접착성 이. 콜라이 (DAEC).
장출혈성 에스케리키아 콜라이 (EHEC) 혈청형 O157:H7은 전 세계적으로 혈성 설사 및 용혈성 요독 증후군 (HUS)의 발생의 원인이 되는 인간 병원체이다. 기존 항미생물제는 EHEC 감염과 연관된 이환율 및 사망률의 대부분의 원인이 되는 강력한 시가 독소의 방출을 촉진하는 EHEC에서 SOS 반응을 촉발한다. 소는 EHEC의 천연 저장소이고, EHEC 발생의 대략 75%는 오염된 소-유래 제품의 소비와 관련이 있다. EHEC는 인간에서 질환을 유발하지만, 성체 반추동물에서는 무증상이다. 이. 콜라이 혈청형 O157:H7 (EHEC) 감염의 특징은 복부 경련 및 혈성 설사, 뿐만 아니라 생명을 위협하는 합병증 용혈성 요독 증후군 (HUS)을 포함한다. 현재 EHEC 감염에 대한 치료가 필요하다 (Goldwater and Bettelheim, 2012). 기존 항생제의 사용은 시가 독소-매개 세포독성을 악화시킨다. 질병 통제 예방 센터에 의해 수행된 역학 연구에서, EHEC 장염에 대한 항생제로 치료된 환자는 HUS를 발병할 더 높은 위험을 가졌다 (Slutsker et al., 1998). 추가 연구는 EHEC 감염에서 항생제의 금기를 지지하고; EHEC와 연관된 출혈성 결장염에 대한 항생제 요법을 받는 어린이는 HUS를 발병할 증가된 가능성을 가졌다 (Wong et al., 2000; Zimmerhackl, 2000; Safdar et al., 2002; Tarr et al., 2005). 기존 항생제는 염색체로 통합된 람도이드 프로파지 게놈 내에 코딩된 stx 유전자의 복제 및 발현을 증진시킴으로써 시가 독소 생성을 촉진한다. 본 발명의 일부 구성의 접근법은 뉴클레아제 절단에 의존한다. Stx 유도는 또한 EHEC 세포 외피의 파지-매개 용해를 촉진하여 환경으로의 시가 독소의 방출 및 전파를 허용한다 (Karch et al., 1999; Matsushiro et al., 1999; Wagner et al., 2002). 그러므로, 유리하게는, 본 발명의 이들 구성은 인간 및 동물 대상체에서 EHEC를 치료하기 위한 대안적인 수단을 제공한다. 이는 뉴클레아제 작용에 의해 생성된 항-EHEC 작용의 속도 및 지속기간에 대한 놀라운 결과로 아래에 예시된다 (기존 항생제 작용과 반대).
한 예에서, 대상체 (예를 들어, 인간 또는 동물)는 용혈성 요독 증후군 (HUS)을 앓고 있거나 이의 위험이 있고, 예를 들어 대상체는 이 콜라이 감염, 예컨대 EHEC 이 콜라이 감염을 앓고 있다.
45. 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 복수의 담체 세포를 포함하는, 제약 조성물, 가축 성장 촉진 조성물, 토양 개량제, 제초제, 식물 비료, 식품 또는 식품 성분 멸균 조성물, 치과용 조성물, 개인 위생 조성물 또는 소독제 조성물 (예를 들어, 가정용 또는 산업용).
본원에서, 담체 세포는 예를 들어 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한 프로바이오틱 세포이다. 예를 들어, 담체 세포는 인간 또는 동물 대상체의 마이크로바이옴 (예를 들어, 장 또는 혈액 마이크로바이옴)에 공생하며, 여기서 담체는 대상체에 투여하기 위한 것이다. 한 예에서, 담체 세포는 박테리아 세포이다 (그리고 임의로 표적 세포는 박테리아 세포임). 한 예에서, 담체 세포는 고세균 세포이다 (그리고 임의로 표적 세포는 고세균 세포임).
임의로, 담체 세포는 그람-양성 박테리아 세포이고, 표적 세포는 그람-양성 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 그람-양성 박테리아 세포이고, 표적 세포는 그람-음성 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 그람-음성 박테리아 세포이고, 표적 세포는 그람-양성 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 그람-음성 박테리아 세포이고, 표적 세포는 그람-음성 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 바실루스 박테리아 세포이고, 표적 세포는 그람-양성 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 바실루스 박테리아 세포이고, 표적 세포는 그람-음성 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 바실루스 박테리아 세포이고, 표적 세포는 살모넬라 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 바실루스 박테리아 세포이고, 표적 세포는 이 콜라이 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 이 콜라이 박테리아 세포이고, 표적 세포는 슈도모나스 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 이 콜라이 박테리아 세포이고, 표적 세포는 그람-양성 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 이 콜라이 박테리아 세포이고, 표적 세포는 그람-음성 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 이 콜라이 박테리아 세포이고, 표적 세포는 살모넬라 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 이 콜라이 박테리아 세포이고, 표적 세포는 이 콜라이 박테리아 세포이다.
임의로, 담체 세포는 이 콜라이 박테리아 세포이고, 표적 세포는 슈도모나스 박테리아 세포이다.
본원에서 바실루스 세포는 임의로 비 서브틸리스 세포이다.
임의로, 담체 세포는 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한 프로바이오틱 또는 공생 이 콜라이 박테리아 세포이다. 임의로, 담체 세포는 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한 프로바이오틱 또는 공생 바실루스 박테리아 세포이다.
본원에서, 임의로 제1 DNA는 플라스미드, 예를 들어 폐쇄 원형 DNA에 의해 포함된다.
한 실시양태에서, 한 예에서 제1 DNA는 dsDNA이다. 한 실시양태에서, 한 예에서 제1 DNA는 ssDNA이다.
대안적인 구성에서, 제1 DNA는 대신 제1 RNA이다.
임의로, 표적 세포는 살모넬라 세포 (예를 들어, 여기서 담체 세포는 이 콜라이 세포임), 예를 들어 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카, 예를 들어 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피뮤리움, 엔테리티디스, 비르효, 몬테비데오, 하다르 또는 빈자이다.
예를 들어, 표적 박테리아는 에스 엔테리카; 에스 티피뮤리움; 피 아에루기노사; 이 콜라이; 케이 뉴모니아에; 씨 주제니; 에이치 필로리; 에이 바우만니이; 씨 디피실레; 에스 아우레우스; 에스 피오게네스 또는 에스 써모필루스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 예에서, 표적 세포는 인간에서 병원내 감염을 유발하는 종의 세포이다.
임의로, 표적 세포는 동물 (예를 들어, 가금류 동물 (예컨대 닭), 돼지, 소, 어류 (예를 들어, 메기 또는 연어) 또는 조개류 (예를 들어, 프론 또는 랍스터)) 마이크로바이옴에 의해 포함된다. 임의로, 마이크로바이옴은 장내 마이크로바이옴이다. 예를 들어, 표적 세포는 닭 장 생물막에 의해 포함된 살모넬라 세포이다. 예를 들어, 표적 세포는 생체외 닭 장 생물막 샘플에 의해 포함된 살모넬라 세포이다.
한 실시양태에서, 제1 DNA는 박테리아 oriV 및/또는 oriT를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 DNA는 플라스미드에 의해 포함되며, 여기서 플라스미드는 oriV 및/또는 oriT를 포함한다.
제1 인자는 단백질 또는 RNA일 수 있다. 예를 들어, 제1 인자는 pir 또는 trfA이다. 한 예에서 제1 인자는 그의 복제를 위해 제1 DNA에 의해 포함된 oriV와 작동가능하다.
한 실시양태에서, 제1 DNA는 플라스미드에 의해 포함되며, 여기서 플라스미드는 oriV를 포함하고, 플라스미드의 복제를 개시하기 위해 oriV와 작동가능한 임의의 복제 단백질 (예를 들어, pir 또는 trfA)을 코딩하지 않는다.
한 실시양태에서, 제1 DNA는 표적 박테리아 세포로의 제1 DNA의 접합 전달에 필요한 성분이 결여되어 있다. 임의로, 성분은 단백질이다. 임의로, 성분은 RNA이다. 임의로, 성분은 tra1 성분이다. 임의로, 성분은 tra2 성분이다. 한 예에서, 담체 세포는 상기 성분을 포함하며, 여기서 성분은 담체 세포 염색체, 담체 세포 내의 제2 DNA 또는 제3 DNA에 의해 포함되거나 이에 의해 코딩된다. 바람직하게는, 성분은 담체 세포 염색체에 의해 포함되거나 이에 의해 코딩된다.
임의로, 접합 전달에 필요한 성분은 RP4 플라스미드 성분, 예를 들어 RP4 tra 모듈의 성분 (예를 들어, tra1 또는 tra2 모듈)이다.
임의로, 접합 전달에 필요한 성분은 RK2 플라스미드 성분, 예를 들어 RK2 tra 모듈의 성분 (예를 들어, tra1 또는 tra2 모듈)이다.
임의로, 접합 전달에 필요한 성분은 R6K 플라스미드 성분, 예를 들어 R6K tra 모듈의 성분 (예를 들어, tra1 또는 tra2 모듈)이다.
임의로, 제1 DNA는 항생제 내성 마커 유전자 및/또는 플라스미드 중독 시스템 유전자를 포함하지 않는 플라스미드에 의해 포함된다. 실시예 섹션에서 설명된 바와 같이, 이는 trfA (또는 해당 성분이 제1 DNA를 포함하는 플라스미드에 의해 코딩되지 않는 접합에 필요한 다른 성분)를 제공할 표적 세포에 존재하는 동일한 IncP 플라스미드의 드문 경우에 유리할 수 있으며, 플라스미드 둘 다는 이용가능한 TrfA (또는 다른 성분)에 대해 경쟁하여, 하나의 플라스미드의 손실을 초래하며, 그러므로 임의의 자손 표적 세포로부터 빠르게 손실될 것이다.
임의로, 제1 DNA를 포함하는 플라스미드는 표적 세포의 제한 효소 (예를 들어, 유형 I 제한 효소)를 억제하기 위한 산물을 코딩하는 항-제한 유전자를 추가로 포함한다. 유형 I 제한 효소를 억제하는 항-제한 유전자로서 (예를 들어, 항-제한 유전자 산물은 T7의 ocr, RK2의 klcA, ard 또는 ardB임).
추가적으로 또는 대안적으로, 플라스미드는 유형 IV 분비 시스템의 필수 성분을 코딩하는 유전자를 포함하며, 여기서 담체 세포의 염색체는 분비 시스템의 나머지를 코딩하는 유전자를 포함하며, 여기서 필수 성분은 담체 세포로부터 표적 세포로의 플라스미드의 접합 전달에 필요하다. 예를 들어, 필수 성분을 코딩하는 tra1 또는 tra2 유전자를 제외하고는, 염색체는 RK2 tra1의 traKLM, traJXIHGF 유전자의 나머지 모두 및 RK2 tra2의 trbBCEFGHJL 유전자의 나머지 모두를 포함한다 (바람직하게는 플라스미드가 RK2-유형 플라스미드인 경우). 대안적인 예에서, 필수 성분을 코딩하는 유전자를 제외하고는, 염색체는 RK2 tra1의 traKLM, traJXIHGF 유전자의 RK6 상동체의 나머지 모두 및 RK2 tra2의 trbBCEFGHJL 유전자의 RK6 상동체의 나머지 모두를 포함한다 (바람직하게는 플라스미드가 RK6-유형 플라스미드인 경우). 대안적인 예에서, 필수 성분을 코딩하는 유전자를 제외하고는, 염색체는 RK2 tra1의 traKLM, traJXIHGF 유전자의 RP4 상동체의 나머지 모두 및 RK2 tra2의 trbBCEFGHJL 유전자의 RP4 상동체의 나머지 모두를 포함한다 (바람직하게는 플라스미드가 RP4-유형 플라스미드인 경우).
예를 들어, 필수 성분을 코딩하는 tra1 또는 tra2 유전자를 제외하고는, 염색체는 traF로부터 traM까지의 RK2 플라스미드의 DNA 단편의 나머지 모두 및 trbB로부터 trK까지의 RK2 플라스미드의 DNA 단편의 나머지 모두를 포함한다 (바람직하게는 플라스미드가 RK2-유형 플라스미드인 경우). 예를 들어, 필수 성분을 코딩하는 tra1 또는 tra2 유전자를 제외하고는, 염색체는 traF로부터 traM까지의 RK2 플라스미드 유전자의 나머지 모두 및 trbB로부터 trK까지의 RK2 플라스미드 유전자의 나머지 모두를 포함한다 (바람직하게는 플라스미드가 RK2-유형 플라스미드인 경우). 예를 들어, 염색체는 하기 RK2 tra1 유전자: traFGHIXJKLM, 또는 traKLM, 또는 traJXIHGF를 포함한다 (하기 순서로 5'에서 3'로, 또는 3'에서 5'로). 예를 들어, 염색체는 하기 RK2 tra2 유전자: trbBCDEFGHIJKL 또는 trbBCEFGHJL를 포함한다 (하기 순서로 5'에서 3'로, 또는 3'에서 5'로).
예를 들어, 필수 성분을 코딩하는 유전자를 제외하고는, 염색체는 RK2 traF의 상동체로부터 RK2 traM의 상동체까지의 RK6 플라스미드의 DNA 단편의 나머지 모두 및 RK2 trbB의 상동체로부터 RK2 trK의 상동체까지의 RK6 플라스미드의 DNA 단편의 나머지 모두를 포함한다 (바람직하게는 플라스미드가 RK6-유형 플라스미드인 경우). 예를 들어, 필수 성분을 코딩하는 유전자를 제외하고는, 염색체는 RK2 traF의 상동체로부터 RK2 traM의 상동체까지의 RK6 플라스미드 유전자의 나머지 모두 및 RK2 trbB의 상동체로부터 RK2 trK의 상동체까지의 RK6 플라스미드 유전자의 나머지 모두를 포함한다 (바람직하게는 플라스미드가 RK6-유형 플라스미드인 경우). 예를 들어, 염색체는 하기 RK2 tra1 유전자의 RK6 상동체: traFGHIXJKLM, 또는 traKLM, 또는 traJXIHGF를 포함한다 (하기 순서로 5'에서 3'로, 또는 3'에서 5'로). 예를 들어, 염색체는 하기 RK2 tra2 유전자의 RK6 상동체: trbBCDEFGHIJKL 또는 trbBCEFGHJL을 포함한다 (하기 순서로 5'에서 3'로, 또는 3'에서 5'로).
예를 들어, 필수 성분을 코딩하는 유전자를 제외하고는, 염색체는 RK2 traF의 상동체로부터 RK2 traM의 상동체까지의 RP4 플라스미드의 DNA 단편의 나머지 모두 및 RK2 trbB의 상동체로부터 RK2 trK의 상동체까지의 RP4 플라스미드의 DNA 단편의 나머지 모두를 포함한다 (바람직하게는 플라스미드가 RP4-유형 플라스미드인 경우). 예를 들어, 필수 성분을 코딩하는 유전자를 제외하고는, 염색체는 RK2 traF의 상동체로부터 RK2 traM의 상동체까지의 RP4 플라스미드 유전자의 나머지 모두 및 RK2 trbB의 상동체로부터 RK2 trK의 상동체까지의 RP4 플라스미드 유전자의 나머지 모두를 포함한다 (바람직하게는 플라스미드가 RP4-유형 플라스미드인 경우). 예를 들어, 염색체는 하기 RK2 tra1 유전자의 RP4 상동체: traFGHIXJKLM, 또는 traKLM, 또는 traJXIHGF를 포함한다 (하기 순서로 5'에서 3'로, 또는 3'에서 5'로). 예를 들어, 염색체는 하기 RK2 tra2 유전자의 RP4 상동체: trbBCDEFGHIJKL 또는 trbBCEFGHJL을 포함한다 (하기 순서로 5'에서 3'로, 또는 3'에서 5'로).
바람직하게는, 제2 DNA 또는 제2 DNA를 포함하는 염색체는 oriT가 결여되어 있다. 바람직하게는, 제3 DNA 또는 제3 DNA를 포함하는 염색체는 oriT가 결여되어 있다.
예를 들어, oriT는 제1 DNA (또는 이를 포함하는 플라스미드)에 의해서만 포함되고, 담체 세포에서 임의의 다른 DNA에 의해 포함되지 않는다. 그러므로, 전달은 제1 DNA 또는 그의 플라스미드에만 국한된다.
모든 실시양태 및 구성에서 제1 DNA는 바람직하게는 폭주 복제 플라스미드에 의해 포함되지 않을 수 있다. 자연 발생 플라스미드는 특징적인 농도 (본원에서 특정 플라스미드 "카피 수"로 지칭됨)로 숙주 세포 내에 존재한다. 대조군의 요소를 파괴하는 돌연변이는 플라스미드 카피 수의 증가에 의해 그 자체로 표시되는 과다-복제 표현형 ("카피-업" 표현형)을 유발한다. 카피-업 돌연변이의 극단적인 경우에 카피 제어 메커니즘의 손실로 인해 플라스미드 복제가 완전히 점검되지 않는다. 이는 "폭주 플라스미드 복제" 또는 단순히 "폭주 복제"로 지칭되고, 이러한 폭주 복제에 관여하는 플라스미드는 "폭주 복제 플라스미드"이다.
한 예에서, 본 발명은 본 발명의 복수의 담체 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다 (예를 들어, 여기서 제1 DNA의 카피는 각각의 플라스미드에 의해 포함됨). 임의로, 담체 세포 모두는 동일한 상기 제1 및 제2 DNA를 포함한다. 임의로, 복수는 담체 세포의 제1 하위집단 (제1 세포) 및 담체 세포의 제2 하위집단 (제2 세포)을 포함하며, 여기서 제1 세포는 동일한 제1 DNA를 포함하고, 제2 세포는 동일한 제1 DNA (이는 제1 세포의 제1 DNA와 상이함)를 포함한다. 예를 들어, 전자의 DNA는 다른 DNA에 의해 포함된 NSI와 상이한 NSI를 포함한다. 예를 들어, 제1 DNA는 제1 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하고, 제2 DNA는 제2 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하며, 여기서 제1 가이드 RNA/crRNA는 제1 표적 세포에서 제1 프로토스페이서 서열에 혼성화할 수 있고; 제2 가이드 RNA/crRNA는 제2 표적 세포에서 제2 프로토스페이서 서열에 혼성화할 수 있으며, 여기서 프로토스페이서는 상이하다. 임의로, 제1 표적 세포는 제2 표적 세포와 상이하다. 임의로, 제1 표적 세포는 제2 표적 세포와 동일한 종 또는 균주의 것이다. 대안적으로, 제1 표적 세포는 제2 표적 세포의 종 또는 균주와 상이한 종 또는 균주의 것이다 (이러한 방식으로 예를 들어 인간 또는 동물 또는 식물에 투여하기 위한 담체 세포의 칵테일이 상이한 종 또는 균주의 복수의 표적 세포를 표적화 및 사멸시키기 위해 제공된다).
한 예에서, 상기 또는 각각의 제1 DNA는 복수 (예를 들어, 제1 및 제2)의 NSI를 포함하며, 여기서 제1 NSI는 제2 NSI와 상이하다 (예를 들어, 이들은 상이한 단백질 또는 RNA, 예컨대 상이한 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩함). 한 예에서, 상기 또는 각각의 제1 DNA는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 상이한 유형의 NSI를 포함한다. 한 예에서, 상기 또는 각각의 제1 DNA는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 상이한 가이드 RNA를 코딩하는 NSI를 포함한다. 한 예에서, 상기 또는 각각의 제1 DNA는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 상이한 crRNA를 코딩하는 NSI를 포함한다. 한 예에서, 상기 또는 각각의 제1 DNA는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 상이한 가이드 RNA를 코딩하는 NSI를 포함한다. 한 예에서, 상기 또는 각각의 제1 DNA는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 상이한 crRNA를 코딩하는 NSI를 포함한다.
임의로, 조성물은 액체에 의해 포함되고 (예를 들어, 수성 액체 또는 수중), 조성물은 담체 세포를 1 x 103 내지 1 x 1010 (예를 들어, 1 x 104 내지 1 x 1010 ; 1 x 104 내지 1 x 109 ; 1 x 104 내지 1 x 108 ; 1 x 104 내지 1 x 107 ; 1 x 103 내지 1 x 1010 ; 1 x 103 내지 1 x 109 ; 1 x 103 내지 1 x 108 ; 1 x 103 내지 1 x 107 ; 1 x 105 내지 1 x 1010 ; 1 x 105 내지 1 x 109 ; 1 x 105 내지 1 x 108; 1 x 105 내지 1 x 107 ; 1 x 106 내지 1 x 1010 ; 1 x 106 내지 1 x 109 ; 1 x 106 내지 1 x 108 ; 또는 1 x 106 내지 1 x 107) cfu/ml의 양으로 포함한다. 예를 들어, 액체는 음료, 예컨대 인간 또는 동물 소비용 음료이다. 예를 들어, 음료는 가축 음료, 예를 들어 가금류 음료 (즉, 가금류, 예컨대 닭에 의한 소비를 위한 음료)이다.
한 예에서, 조성물은 인간 또는 동물에 의한 소비를 위한 식이 (예를 들어, 식이 보충제) 조성물이다. 한 예에서, 조성물은 인간 또는 동물에 의한 소비를 위한 슬리밍 조성물이다. 한 예에서, 조성물은 인간 또는 동물에 의한 소비를 위한 성장 촉진 조성물이다. 한 예에서, 조성물은 인간에 의한 소비를 위한 신체 빌딩 조성물이다. 한 예에서, 조성물은 인간 또는 동물에 의한 소비를 위한 프로바이오틱 조성물이다. 한 예에서, 조성물은 인간 또는 동물에 의한 소비를 위한 살생물 조성물이다. 한 예에서, 조성물은 인간 또는 동물에 의한 소비를 위한 살충 조성물이다. 한 예에서, 조성물은 동물에 의한 소비를 위한 인수공통전염병 방제 조성물이다.
한 예에서, 조성물은 담체 세포에 더하여 비타민을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 담체 세포에 더하여 비타민 A, B (예를 들어, B12), C, D, E 및/또는 K를 포함한다. 한 예에서, 조성물은 담체 세포에 더하여 지질을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 담체 세포에 더하여 탄수화물을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 담체 세포에 더하여 단백질 및/또는 아미노산을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 담체 세포에 더하여 미네랄을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 담체 세포에 더하여 금속 이온 (예를 들어, Mg2+, Cu2+ 및/또는 Zn2+)을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 망간 이온, 철 이온, 코발트 이온, 구리 이온, 아연 이온 및/또는 몰리브데넘 이온을 포함한다.
한 예에서, 조성물은 식물 비료 조성물이다. 한 예에서, 조성물은 제초제이다. 한 예에서, 조성물은 식물에 적용하기 위한 살충제 조성물이다.
임의의 실시양태 또는 예에서, 적절한 경우: 식물은 예를 들어 작물 식물이다. 식물은 예를 들어 밀이다. 식물은 예를 들어 옥수수이다. 식물은 예를 들어 메이즈이다. 식물은 예를 들어 결실 식물이다. 식물은 예를 들어 채소 식물이다. 식물은 예를 들어 토마토 식물이다. 식물은 예를 들어 감자 식물이다. 식물은 예를 들어 잔디 식물이다. 식물은 예를 들어 현화 식물이다. 식물은 예를 들어 나무이다. 식물은 예를 들어 관목이다.
한 예에서, 조성물은 환경 적용을 위한 것이며, 여기서 환경은 옥외 환경이다 (예를 들어, 들판 또는 수로 또는 저장소에 적용).
한 예에서, 조성물은 식품 또는 식품 성분 (예를 들어, 인간 또는 동물 소비용)에 의해 포함된다. 한 예에서, 조성물은 음료 또는 음료 성분 (예를 들어, 인간 또는 동물 소비용)에 의해 포함된다.
한 예에서 표적 세포(들)는 인간 생물막 세포이고, 예를 들어 여기서 생물막은 장, 피부, 폐, 눈, 코, 귀, 위장관 (GI 관), 위, 모발, 신장, 요도, 세기관지, 구강, 입, 간, 심장, 항문, 직장, 항문, 직장, 방광, 장, 창자, 음경, 질 또는 음낭 생물막이다. 한 예에서 표적 세포(들)는 동물 생물막 세포이고, 예를 들어 여기서 생물막은 장, 피부, 폐, 눈, 코, 귀, 위장관 (GI 관), 맹장, 공장, 회장, 결장, 위, 모발, 깃털, 비늘, 신장, 요도, 세기관지, 구강, 입, 간, 비장, 심장, 항문, 직장, 방광, 장, 창자, 음경, 질 또는 음낭 생물막이다. 예를 들어, 생물막은 조류 (예를 들어, 닭) 맹장 생물막이다. 예를 들어, 생물막은 조류 (예를 들어, 닭) 위장관 (GI 관), 맹장, 공장, 회장, 결장 또는 위 생물막이다.
한 예에서, 본원의 임의의 방법은 생체외이다. 한 예에서, 본원의 방법은 생체내이다. 한 예에서, 본원의 방법은 시험관내이다. 한 예에서, 본원의 방법은 환경, 예를 들어 가정 (예컨대 집), 산업 (예컨대 공장) 또는 농업 환경 (예컨대 팥)에서 수행된다. 한 예에서, 본원의 방법은 컨테이너 내에서 또는 상에서; 또는 표면 상에서 수행된다.
한 예에서, NSI (또는 이의 RNA 산물)는 표적 세포 염색체 또는 표적 세포에 의해 포함된 에피솜과 재조합하여 염색체 또는 에피솜을 변형할 수 있다. 임의로, 이는 염색체 또는 에피솜이 절단되고 (예를 들어, 가이드된 뉴클레아제, 예컨대 Cas, TALEN, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 사용하여 미리 결정된 부위에서), 제1 DNA가 동시에 또는 순차적으로 담체 세포와의 접합에 의해 표적 세포에 도입되고, NSI 또는 이의 서열이 절단 부위에서 또는 인접하여 염색체 또는 에피솜으로 삽입되는 방법으로 수행된다.
한 예에서 제1 DNA는 표적 세포에서 프로토스페이서 절단을 수행하도록 작동가능한 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 포함한다 (예를 들어, 여기서 프로토스페이서는 표적 세포에서 NSI에 의해 코딩된 crRNA 또는 gRNA와 혼성화할 수 있는 10-20, 10-30, 10-40, 10-100, 12-15 또는 12-20개의 연속 뉴클레오티드를 포함함).
예를 들어, 시스템은 유형 I, II, III, IV 또는 V CRISPR/Cas 시스템이다.
한 예에서, NSI는 Cas9 (및 임의로 제2의 상이한 Cas, 예컨대 Cas3, Cas9, Cpf1, Cas13a, Cas13b 또는 Cas10)을 코딩한다. 한 예에서, NSI는 Cas3 (및 임의로 제2의 상이한 Cas, 예컨대 Cas3, Cas9, Cpf1, Cas13a, Cas13b 또는 Cas10)을 코딩한다. 한 예에서, NSI는 Cas3, Cas9, Cpf1, Cas13a, Cas13b 및 Cas10으로부터 선택된 Cas를 코딩한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 제1 DNA (예를 들어, NSI)는 가이드 RNA 또는 crRNA 또는 tracrRNA를 코딩한다. 예를 들어, 가이드 RNA 또는 crRNA 또는 tracrRNA는 제1 Cas와 동족이다 (즉, 표적 세포에서 작동가능함).
한 예에서, 본원에서 Cas는 Cas9이다. 한 예에서, 본원에서 Cas는 Cas3이다. Cas는 표적 박테리아에 의해 코딩된 Cas와 동일할 수 있다.
한 실시양태에서, NSI 또는 그의 코딩된 단백질 또는 RNA의 표적 박테리아 내의 존재는 표적 세포 사멸, 또는 표적 세포의 성장 또는 증식의 하향조절을 매개한다. 한 실시양태에서, NSI 또는 그의 코딩된 단백질 또는 RNA의 표적 박테리아 내의 존재는 표적 세포 게놈에 의해 코딩된 하나 이상의 RNA 또는 단백질의 발현의 스위칭 오프, 또는 그의 하향조절을 매개한다.
한 실시양태에서, NSI 또는 그의 코딩된 단백질 또는 RNA의 표적 박테리아 내의 존재는 표적 세포의 성장 또는 증식의 상향조절을 매개한다. 한 실시양태에서, NSI 또는 그의 코딩된 단백질 또는 RNA의 표적 박테리아 내의 존재는 표적 세포 게놈에 의해 코딩된 하나 이상의 RNA 또는 단백질의 발현의 스위칭 온, 또는 그의 상향조절을 매개한다.
한 실시양태에서, NSI는 표적 박테리아에 독성이 있는 CRISPR/Cas 시스템의 성분을 코딩한다.
한 실시양태에서, 제1 DNA는 플라스미드 또는 셔틀 벡터에 의해 포함된다. 한 실시양태에서, 제2 DNA는 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 셔틀 벡터), 헬퍼 파지 (예를 들어, 헬퍼 파지미드)에 의해 포함되거나 숙주 박테리아 세포의 게놈에 통합된다.
임의로, 표적 세포는 제1 DNA, 예를 들어 표적 세포에서 기능적이고 표적 세포에 독성이 있는 외인성 CRISPR/Cas 시스템의 성분을 포함하는 제1 DNA가 내부로 전달되기 전에 기능적 내인성 CRISPR/Cas 시스템이 결여되어 있다. 한 실시양태는 의학적 용도를 위해 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한, 본 발명의 복수의 담체 세포를 포함하는 항박테리아 조성물을 제공하며, 여기서 각 표적 세포는 임의로 이 단락에 따른다.
한 예에서, 본 발명의 조성물은 제초제, 살충제, 살곤충제, 식물 비료 또는 세정제이다.
임의로, 본원에서 표적 박테리아는 대상체의 마이크로바이옴, 예를 들어 장내 마이크로바이옴에 의해 포함된다. 대안적으로, 마이크로바이옴은 피부, 두피, 모발, 눈, 귀, 구강, 인후, 폐, 혈액, 직장, 항문, 질, 음낭, 음경, 코 또는 혀 마이크로바이옴이다.
한 예에서 대상체 (예를 들어, 인간 또는 동물)는 담체 세포 투여와 동시에 또는 순차적으로 약제를 추가로 투여받는다. 한 예에서, 약제는 항생제, 항체, 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, 항-PD-1, 항-PD-L1 또는 항-CTLA4 항체), 입양 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 요법) 또는 백신이다.
한 실시양태에서, NSI는 가이드된 뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제, TALEN, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 코딩한다. 그러므로, 독성제는 가이드된 뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제, TALEN, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 포함할 수 있다. 임의로, NSI는 표적 세포의 염색체를 절단할 수 있는 제한 뉴클레아제를 코딩한다.
임의로, 조성물은 인간 또는 동물 대상체에 대해 시행되는 의약에 사용하기 위한 제약 조성물이다.
한 예에서, 동물은 가축 또는 반려 애완 동물 (예를 들어, 소, 돼지, 염소, 양, 말, 개, 고양이 또는 토끼)이다. 한 예에서, 동물은 곤충 (그의 수명 주기의 임의의 단계에 있는 곤충, 예를 들어 알, 유충 또는 번데기)이다. 한 예에서, 동물은 원생동물이다. 한 예에서, 동물은 두족류이다.
임의로, 조성물은 제초제, 살충제, 식품 또는 음료 가공제, 식품 또는 음료 첨가제, 석유화학 또는 연료 가공제, 정수제, 화장품 첨가제, 세제 첨가제 또는 환경 (예를 들어, 토양) 첨가제 또는 세정제이다.
본 발명은 또한 하기를 제공한다: 각각 상기 제1 DNA를 포함하는 표적 박테리아 세포 또는 복수의 표적 박테리아 세포.
예를 들어 담체 박테리아는 락토바실루스 (예를 들어, 엘 레우테리 또는 엘 락티스), 이 콜라이, 바실루스 또는 스트렙토코쿠스 (예를 들어, 에스 써모필루스) 박테리아이다. 유용하게, 담체는 주변 환경으로부터 제1 DNA의 보호를 제공할 수 있다. 담체의 사용은 경구 투여, 또는 담체가 대상체의 산성 위 또는 다른 가혹한 환경으로부터 제1 DNA의 보호를 제공할 수 있는 다른 경로에 유용할 수 있다. 더욱이, 담체는 음료, 예를 들어 프로바이오틱 드링크, 예를 들어 개조된 야쿠르트 (상표), 액티멜 (상표), 케비타 (상표), 액티비아 (상표), 자로우 (상표) 또는 인간 소비용 유사한 드링크로 제형화될 수 있다.
임의로, 담체 세포(들) 또는 조성물은 NSI의 작용제 또는 발현 산물을 사용하여 표적 박테리아를 사멸시키는 것을 포함하는 의학적 용도를 위해 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한 것이며, 여기서 표적 박테리아는 대상체에서 질환 또는 상태를 매개한다. 한 예에서, 대상체가 인간인 경우, 대상체는 배아가 아니다. 한 예에서, 담체 세포는 대상체에서 프로바이오틱이다.
본 발명은 또한 하기를 제공한다: 환경에서 표적 박테리아 세포를 사멸시키는 방법으로서, 임의로 여기서 방법은 인간 또는 동물 신체에 대해 실행되지 않으며, 여기서 방법은 환경을 본 발명의 담체 세포(들) 또는 조성물에 노출시키는 단계 및 NSI의 산물이 표적 세포에서 발현되도록 허용하는 단계를 포함하며, 여기서 표적 박테리아는 상기 산물의 존재 하에 사멸된다. 예를 들어, 산물은 CRISPR/Cas 시스템 또는 그의 성분, 예컨대 본원에 개시된 시스템 또는 성분을 코딩한다. 그러므로, 시스템은 표적 세포의 염색체 프로토스페이서 서열을 인식하고 절단할 수 있으며, 이에 의해 표적 세포가 사멸된다. 임의로, 추가 단계에서 사멸된 표적 세포가 단리된다.
본 발명은 또한 하기를 제공한다: 표적 박테리아를 포함하는 인간 또는 동물 대상체에서 질환 또는 상태의 치료를 위한, 표적 박테리아를 사멸시키는 항박테리아제의 제조에서 본 발명의 조성물 또는 세포(들)의 용도.
임의로, 환경은 토양의 마이크로바이옴; 식물, 부분의 일부 (예를 들어, 잎, 과일, 채소 또는 꽃) 또는 식물 산물 (예를 들어, 과육); 물; 수로; 유체; 식료품 또는 그의 성분; 음료 또는 그의 성분; 의학적 디바이스; 화장품; 세제; 혈액; 체액; 의학적 장치; 산업용 장치; 석유 굴착 장치; 석유화학 공정, 저장 또는 운송 장치; 비히클 또는 컨테이너이다.
임의로, 환경은 조성물을 투여받은 인간 또는 동물 대상체의 생체외 체액 (예를 들어, 소변, 혈액, 혈액 산물, 땀, 눈물, 가래 또는 침), 신체 고형물 (예를 들어, 분변) 또는 조직이다.
임의로, 환경은 조성물을 투여받은 인간 또는 동물 대상체의 생체내 체액 (예를 들어, 소변, 혈액, 혈액 산물, 땀, 눈물, 가래 또는 침), 신체 고형물 (예를 들어, 분변) 또는 조직이다.
한 실시양태에서, 제1 DNA는 파지미드 또는 클로닝 벡터 (예를 들어, 셔틀 벡터, 예를 들어 pUC 벡터)에 의해 포함된다.
한 실시양태에서, 제2 DNA는 박테리아 담체 세포 염색체에 의해 포함된다.
임의로, 독성제는 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분, 예를 들어 유형 I 캐스케이드 (예를 들어, CasA)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
임의로, 독성제는 가이드된 뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제, TALEN, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 의료 컨테이너, 예를 들어 주사기, 바이알, IV 백, 흡입기, 점안기 또는 네뷸라이저에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 멸균 컨테이너에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 의학적으로-호환성인 컨테이너에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 발효 용기, 예를 들어 금속, 유리 또는 플라스틱 용기에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 농업 장치에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 식품 생산 또는 가공 장치에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 원예 장치에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 사육 장치에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 석유화학제품 회수 또는 가공 장치에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 증류 장치에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 세포 배양 용기 (예를 들어, 적어도 50, 100, 1000, 10000 또는 100000 리터의 용량을 가짐)에 의해 포함된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 표적 세포(들)는 이들 장치 등 중 임의의 것에 의해 포함된다.
한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 예를 들어 약제를 경구, IV, 피하, 비강내, 안내, 질, 국소, 직장 또는 흡입 투여에 의해 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한 사용설명서를 갖는 패키징 라벨 또는 지침과 조합하여 약제에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 경구 약제 제형에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 비강내 또는 안구 약제 제형에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 개인 위생 조성물 (예를 들어, 샴푸, 비누 또는 탈취제) 또는 화장품 제형에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 세제 제형에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 예를 들어 의료용 또는 산업용 디바이스 또는 기구를 세정하기 위한 세정 제형에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 식료품, 식료품 성분 또는 식료품 가공제에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 음료, 음료 성분 또는 음료 가공제에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 의료용 붕대, 직물, 석고 또는 면봉에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 제초제 또는 살충제에 의해 포함된다. 한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 살곤충제에 의해 포함된다.
한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 유형 I CRISPR/Cas 시스템의 성분(들)이다. 한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 유형 II CRISPR/Cas 시스템의 성분(들)이다. 한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 유형 III CRISPR/Cas 시스템의 성분(들)이다. 한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 유형 IV CRISPR/Cas 시스템의 성분(들)이다. 한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 유형 V CRISPR/Cas 시스템의 성분(들)이다. 한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 Cas9-코딩 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 에스 피오게네스 Cas9, 에스 아우레우스 Cas9 또는 에스 써모필루스 Cas9)을 포함한다. 한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 Cas3-코딩 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 이 콜라이 Cas3, 씨 디피실레 Cas3 또는 살모넬라 Cas3)을 포함한다. 한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 Cpf-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 CasX-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 예에서, CRISPR/Cas 성분(들)은 CasY-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 예에서, 각 담체 세포는 표적 박테리아에서 작동가능한 프로모터를 포함하는 뉴클레오티드 서열 (NSI)로부터 관심있는 CRISPR/Cas 성분 또는 단백질을 코딩한다.
임의로, 표적 박테리아는 그람 음성 박테리아 (예를 들어, 스피릴라 또는 비브리오)이다. 임의로, 표적 박테리아는 그람 양성 박테리아이다. 임의로, 표적 박테리아는 미코플라스마, 클라미디아에, 스피로헤타 또는 미코박테리움 박테리아이다. 임의로, 표적 박테리아는 스트렙토코쿠스 (예를 들어, 피오게네스 또는 써모필루스)이다. 임의로, 표적 박테리아는 스타필로코쿠스 (예를 들어, 아우레우스, 예를 들어 MRSA)이다. 임의로, 표적 박테리아는 이. 콜라이 (예를 들어, O157: H7)이고, 예를 들어 여기서 Cas는 벡터에 의해 코딩되거나, 내인성 표적 세포 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas3) 활성은 활성화된다. 임의로, 표적 박테리아는 슈도모나스 (예를 들어, 시린가에 또는 아에루기노사)이다. 임의로, 표적 박테리아는 비브리오 (예를 들어, 콜레라에 (예를 들어, O139) 또는 불니피쿠스)이다. 임의로, 표적 박테리아는 네이세리아 (예를 들어, 고노레아에 또는 메닝기티디스)이다. 임의로, 표적 박테리아는 보르데텔라 (예를 들어, 페르투시스)이다. 임의로, 표적 박테리아는 헤모필루스 (예를 들어, 인플루엔자에)이다. 임의로, 표적 박테리아는 시겔라 (예를 들어, 디센테리아에)이다. 임의로, 표적 박테리아는 브루셀라 (예를 들어, 아보르투스)이다. 임의로, 표적 박테리아는 프란시셀라 숙주이다. 임의로, 표적 박테리아는 크산토모나스이다. 임의로, 표적 박테리아는 아그로박테리움이다. 임의로, 표적 박테리아는 에르위니아이다. 임의로, 표적 박테리아는 레지오넬라 (예를 들어, 뉴모필라)이다. 임의로, 표적 박테리아는 리스테리아 (예를 들어, 모노시토게네스)이다. 임의로, 표적 박테리아는 캄필로박터 (예를 들어, 제주니)이다. 임의로, 표적 박테리아는 예르시니아 (예를 들어, 페스티스)이다. 임의로, 표적 박테리아는 보렐리아 (예를 들어, 부르그도르페리)이다. 임의로, 표적 박테리아는 헬리코박터 (예를 들어, 필로리)이다. 임의로, 표적 박테리아는 클로스트리디움 (예를 들어, 디피실레 또는 보툴리눔)이다. 임의로, 표적 박테리아는 에를리키아 (예를 들어, 차페엔시스)이다. 임의로, 표적 박테리아는 살모넬라 (예를 들어, 티피 또는 엔테리카, 예를 들어 혈청형 티피뮤리움, 예를 들어 DT 104)이다. 임의로, 표적 박테리아는 클라미디아 (예를 들어, 뉴모니아에)이다. 임의로, 표적 박테리아는 파라클라미디아 숙주이다. 임의로, 표적 박테리아는 코리네박테리움 (예를 들어, 아미코라툼)이다. 임의로, 표적 박테리아는 클레브시엘라 (예를 들어, 뉴모니아에)이다. 임의로, 표적 박테리아는 엔테로코쿠스 (예를 들어, 파에칼리스 또는 파에심, 예를 들어 리네졸리드-내성)이다. 임의로, 표적 박테리아는 아시네토박터 (예를 들어, 바우만니이, 예를 들어 다중 약물 내성)이다.
표적 세포의 추가 예는 하기와 같다:-
1. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 메티실린, 반코마이신, 리네졸리드, 답토마이신, 퀴누프리스틴, 달포프리스틴 및 테이코플라닌으로부터 선택된 항생제에 내성인 스타필로코쿠스 아우레우스 세포이다.
2. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 세팔로스포린 (예를 들어, 세프타지딤), 카르바페넴 (예를 들어, 이미페넴 또는 메로페넴), 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드 (예를 들어, 겐타마이신 또는 토브라마이신) 및 콜리스틴으로부터 선택된 항생제에 내성인 슈도모나스 아에루기노사 세포이다.
3. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 카르바페넴에 내성인 클레브시엘라 (예를 들어, 뉴모니아에) 세포이다.
4. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 에리트로마이신, 클린다마이신, 베타-락탐, 마크롤라이드, 아목시실린, 아지트로마이신 및 페니실린으로부터 선택된 항생제에 내성인 스트렙토코쿠스 (예를 들어, 써모필루스, 뉴모니아에 또는 피오게네스) 세포이다.
5. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 세프트리악손, 아지트로마이신 및 시프로플록사신으로부터 선택된 항생제에 내성인 살모넬라 (예를 들어, 혈청형 티피) 세포이다.
6. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택된 항생제에 내성인 시겔라 세포이다.
7. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 이소니아지드 (INH), 리팜피신 (RMP), 플루오로퀴놀론, 아미카신, 카나마이신 및 카프레오마이신 및 아지트로마이신으로부터 선택된 항생제에 내성인 미코박테리움 투베르쿨로시스 세포이다.
8. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 반코마이신에 내성인 엔테로코쿠스 세포이다.
9. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 세팔로스포린 및 카르바페넴으로부터 선택된 항생제에 내성인 엔테로박테리아세아에 세포이다.
10. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 트리메토프림, 이트로푸란토인, 세팔렉신 및 아목시실린으로부터 선택된 항생제에 내성인 이. 콜라이 세포이다.
11. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 플루오로퀴놀론 항생제 및 카르바페넴으로부터 선택된 항생제에 내성인 클로스트리디움 (예를 들어, 디피실레) 세포이다.
12. 임의로 표적 박테리아는 세픽심 (예를 들어, 경구 세팔로스포린), 세프트리악손 (주사가능한 세팔로스포린), 아지트로마이신 및 테트라사이클린으로부터 선택된 항생제에 내성인 네이세리아 고노레아 세포이다.
13. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 베타-락탐, 메로페넴 및 카르바페넴으로부터 선택된 항생제에 내성인 아시네토박터 바우만니이 세포이다.
14. 임의로 표적 박테리아는 예를 들어 시프로플록사신 및 아지트로마이신으로부터 선택된 항생제에 내성인 캄필로박터 (예를 들어, 제주니) 세포이다.
15. 임의로, 표적 세포(들)는 베타 (β)-락타마제 (예를 들어, ESBL-생산 이. 콜라이 또는 ESBL-생산 클레브시엘라)를 생산한다.
16. 임의로, 표적 세포(들)는 예 1 내지 14 중 어느 하나에 인용된 항생제에 내성인 박테리아 세포이다.
한 예에서, 표적 세포(들)는 시겔라, 이 콜라이, 살모넬라, 세라티아, 클레브시엘라, 예르시니아, 슈도모나스 및 엔테로박터로부터 선택된 종의 세포이다.
임의로, 조성물은 각각 또는 조합하여 시겔라, 이 콜라이, 살모넬라, 세라티아, 클레브시엘라, 예르시니아, 슈도모나스 및 엔테로박터 중 둘 이상으로부터 선택된 종의 표적 세포로의 제1 DNA의 접합 전달이 가능한 담체 세포를 포함한다.
한 예에서, 담체 세포의 성장 또는 증식의 감소는 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%이다. 임의로, 조성물 또는 담체 세포(들)는 표적 세포에 독성이 있는 항생제와 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 예를 들어, 항생제는 본원에 개시된 임의의 항생제일 수 있다.
임의로, NSI의 발현은 표적 세포에서 작동가능한 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 임의로, NSI의 발현은 표적 세포에서 작동가능한 구성적 프로모터의 제어 하에 있다.
실시양태에서, 제1 DNA (예를 들어, 플라스미드에 의해 포함됨)는 스크리닝가능한 또는 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 예를 들어, 선택가능한 마커 유전자는 항생제 내성 유전자이다.
담체 박테리아는 표 5에 표시된 것들로부터 선택된 종 또는 속의 박테리아일 수 있다. 예를 들어, 종은 온혈 동물 (예를 들어, 가축 척추동물)에서 발견된다. 예를 들어, 종은 인간에서 발견된다. 예를 들어, 종은 식물에서 발견된다. 바람직하게는, 인간 또는 동물 신체의 비멸균 부분 (예를 들어, 피부, 소화관, 비뇨생식기 영역, 입, 비강, 인후 및 상기도, 귀 및 눈)을 콜로니화하는 비병원성 박테리아가 담체 세포로 사용되고, 한 예에서 본 발명의 방법론은 인간 또는 동물의 신체의 이러한 일부의 표적 세포 박테리아 감염을 퇴치하는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 감염은 전신 감염이다. 특히 바람직한 담체 박테리아 종의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 에스케리키아 콜라이의 비병원성 균주 (이. 콜라이 F18, S17 및 이. 콜라이 균주 니슬), 락토바실루스의 다양한 종 (예컨대 엘. 카세이, 엘. 플란타룸, 엘. 파라카세이, 엘. 아시도필루스, 엘. 퍼멘툼, 엘. 제아에 및 엘. 가세리), 또는 다른 비병원성 또는 프로바이오틱 피부- 또는 GI 콜로니화 박테리아, 예컨대 락토코쿠스, 비피도박테리아, 유박테리아, 및 박테리아 미니-세포 (사멸될 운명이지만 여전히 플라스미드를 전달할 수 있는 비뉴클레오이드 세포) (참조; 예를 들어, 문헌 [Adler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57; 321-326, 1970]; [Frazer and Curtiss III, Current Topics in Microbiology and Immunology 69: 1-84, 1975]; 미국 특허 번호 4,968,619 (Curtiss III)). 일부 실시양태에서, 표적 수용자 세포는 인간, 동물 또는 식물 (예를 들어 피부 상에서 또는 소화관, 비뇨생식기 영역, 입, 비강, 인후 및 상기도, 눈(들) 및 귀(들) 내에서)에 의해 포함된 병원성 박테리아이다. 표적화 및 박멸에 대한 특히 관심 대상은 슈도모나스 아에루기노사, 에스케리키아 콜라이, 스타필로코쿠스 뉴모니아에 및 다른 종, 엔테로박터 종, 엔테로코쿠스 종 및 미코박테리움 투베르쿨로시스의 병원성 균주이다. 한 예에서, 표적 세포 속 또는 종은 표 5에 나열된 임의의 속 또는 종이다.
본 발명은 광범위한 설정 또는 환경, 예를 들어 미국 특허 6,271,359, 6,261,842, 6,221,582, 6,153,381, 6,106,854, 및 5,627,275에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 치료, 농업 또는 다른 설정에서의 용도를 발견한다. 다른 것들은 또한 본원에서 논의되고, 또 다른 것들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
제1 DNA를 포함하는 수많은 유형의 플라스미드가 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 이러한 관점에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단일 담체 박테리아 균주가 하나 초과의 유형의 이러한 플라스미드를 보유할 수 있음을 이해할 것이다 (예를 들어, 이들이 코딩하는 항박테리아제가 상이함). 또한, 또 다른 예에서, 각각 하나 이상의 이러한 플라스미드를 함유하는 2개 이상의 상이한 담체 박테리아 균주는 다중-표적 효과를 위해, 즉, 2개 이상의 상이한 표적 종 또는 균주를 사멸시키기 위해, 또는 표적 세포의 동일한 종 또는 균주의 세포를 사멸시키기 위해 조합될 수 있다.
본 발명은 인간의 치료 및 다양한 수의학, 농경학, 원예 및 식품 가공 적용에 대한 유용성을 발견한다. 인간 및 수의학적 사용을 위해, 그리고 보호를 위해 표적화된 세포 집단 또는 조직에 따라, 본 발명의 담체 박테리아의 하기 투여 방식이 고려된다: 국소, 경구, 코, 안구, 귀, 폐 (예를 들어, 흡입기를 통해), 안과, 직장, 비뇨생식기, 피하, 복강내 및 정맥내. 박테리아는 치료될 환자에 대해 선택된 투여 방식에 적합한 전달 비히클에서 제약 조성물로서 공급될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "환자" 또는 "대상체"는 인간 또는 동물 (예를 들어 특정 공여자 균주의 임상적 효능에 대한 모델로서 특히 유용한 동물 또는 사육된 또는 가축 동물)을 지칭한다. 상업적으로 관련된 동물은 닭, 칠면조, 오리, 메기, 연어, 대구, 청어, 랍스터, 새우, 프론, 소, 양, 염소, 돼지, 염소, 거위 또는 토끼이다.
예를 들어, 담체 박테리아를 위장관 또는 비강으로 전달하기 위해, 바람직한 투여 방식은 경구 섭취 또는 비강 에어로졸, 또는 섭식에 의한 것일 수 있다 (단독으로 또는 대상체의 사료 또는 식품 및/또는 음료, 예컨대 식수에 혼입됨). 이와 관련하여, 담체 세포는 가축 (또는 사육된 또는 반려 동물)의 식품에 의해 포함될 수 있고, 예를 들어 담체 박테리아는 가축용 사료 첨가제에 의해 포함된다. 대안적으로, 첨가제는 가축용 음료 (예를 들어, 물) 첨가제이다. 프로바이오틱 박테리아, 예컨대 락토바실루스 아시도필루스는 박테리아 세포의 동결건조된 혼합물 및 고체 지지체, 예컨대 만니톨을 함유하는 젤 캡슐로 판매된다는 점에 유의해야 한다. 젤 캡슐이 액체와 함께 섭취되는 경우, 동결건조된 세포가 재수화되고 생존가능한 결장생성 박테리아가 된다. 그러므로, 유사한 방식으로, 본 발명의 담체 박테리아 세포는 젤 캡슐 내의 분말화된 동결건조된 제제로서, 또는 예를 들어 식품 또는 음료에 살포하기 위한 벌크로 공급될 수 있다. 그 후, 재수화된 생존가능한 박테리아 세포는 상부 및/또는 하부 위장 시스템 전체에 걸쳐 부위를 집단화 및/또는 콜로니화할 것이고, 그 후 표적 박테리아와 접촉하게 된다.
국소 적용을 위해, 담체 박테리아는 영향을 받는 피부 표면에 확산될 연고 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 연고 또는 크림 제형은 또한 다른 표준 제형, 예컨대 좌약과 함께 직장 또는 질 전달에 적합하다. 국소, 질 또는 직장 투여를 위한 적절한 제형은 의약 화학자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명은 다양한 박테리아 감염 또는 박테리아와 관련된 바람직하지 않은 상태를 치료하기 위한 국소 또는 점막 투여에 특히 유용할 것이다. 이들 용도의 일부 대표적인 예는 (1) 헤모필루스 종에 의해 유발된 결막염, 및 슈도모나스 아에루기노사에 의해 유발된 각막 궤양; (2) 슈도모나스 아에루기노사에 의해 유발된 외이도염; (3) 많은 그람-양성 구균 및 그람-음성 간균에 의해 유발된 만성 부비동염, 또는 기관지의 일반적인 오염제거; (4) 슈도모나스 아에루기노사와 연관된 낭포성 섬유증; (5) 헬리코박터 필로리 (예를 들어, 위 궤양 치료 또는 예방을 위해), 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 티피뮤리움, 캄필로박터 또는 시겔라 종에 의해 유발된 장염; (6) 예를 들어 예방적 조치로서 외과적 또는 비-외과적 개방 상처; (7) 슈도모나스 아에루기노사 또는 다른 그람-음성 병원체를 제거하기 위한 화상; (8) 여드름, 예를 들어 프로피오노박터 아크네스에 의해 유발된 여드름; (9) 코 또는 피부 감염 (예를 들어, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MSRA)에 의해 유발됨); (10) 체취 (예를 들어, 그람-양성 혐기성 박테리아에 의해 유발됨) (즉, 탈취제에서 담체 세포의 사용); (11) 박테리아성 질증 (예를 들어, 가르드네렐라 바기날리스 또는 다른 혐기성 생물과 연관됨); 및 (12) 다양한 유기체에 의해 유발된 치은염 및/또는 충치의 치료를 포함한다.
한 예에서, 표적 세포는 이 콜라이 세포이고, 인간에서 치료될 질환 또는 상태는 자궁관 감염 또는 인공호흡기 연관 감염, 예를 들어 폐렴이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 담체 세포는 원치않는 표적 박테리아의 제거 또는 약독화를 위한 표면 처리에서의 적용, 예를 들어 표적 박테리아를 포함하는 이러한 표면 또는 환경을 처리하는 방법에서의 용도를 발견하며, 여기서 방법은 표면 또는 환경을 본 발명의 담체 박테리아와 접촉시키는 단계, 담체로부터 표적 박테리아로의 본 발명의 제1 DNA의 접합 전달을 허용하는 단계, 및 항박테리아제가 표적 세포를 사멸시키도록 허용하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 침습적 치료, 예컨대 수술, 카테터삽입 등에 사용될 수 있는 표면은 표면 상의 박테리아 오염물질에 의한 대상체의 감염을 예방하기 위해 처리될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 수많은 표면, 물체, 물질 등 (예를 들어, 의료용 또는 응급 처치 장비, 보육 및 주방 장비 및 표면)을 처리하여 그 위의 박테리아 오염을 제어하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
담체 박테리아를 포함하는 제약 제제 또는 다른 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 투여량 단위 형태는 환자 또는 식물 또는 처리를 받는 환경 또는 표면에 적절한 제약 제제의 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다. 각 투여량은 선택된 담체와 연관하여 원하는 항박테리아 효과를 생성하도록 계산된 담체 박테리아의 양을 함유해야 한다. 적절한 투여량 단위를 결정하기 위한 절차는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 투여량 단위는 환자, 식물, 표면 또는 환경의 중량을 기준으로 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다. 병원성 표적 세포 (예를 들어, 환자의 조직에 의해 포함됨)의 박멸을 달성하기 위한 적절한 농도는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 투여량 농도 곡선 계산에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 담체 박테리아에 대한 다른 용도가 또한 고려된다. 이들은 다양한 농업, 원예, 환경 및 식품 가공 적용을 포함한다. 예를 들어, 농업 및 원예에서, 다양한 식물 병원성 박테리아는 식물 질환을 최소화하기 위해 표적화될 수 있다. 표적화에 적합한 식물 병원체의 한 예는 에르위니아 (예를 들어, 불 마름병의 원인 인자인 이 아밀로보라)이다. 절화의 시듦을 감소시키거나 방지하기 위해 유사한 전략이 사용될 수 있다. 수의학 또는 동물 사육의 경우, 본 발명의 담체 세포는 생물-부담을 감소시키거나 특정 병원성 유기체 (예를 들어, 살모넬라, 예컨대 닭, 칠면조 또는 다른 가금류에서)를 제거하기 위해 동물 사료 (닭, 돼지, 가금류, 염소, 양, 어류, 조개류 또는 소 사료)에 혼입될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 원치않는 또는 병원성 박테리아 (예를 들어, 고기 상의 이. 콜라이 O157:H7, 또는 해산물 상의 "비린내 냄새"의 한 원인인 프로테우스 종)를 제거하기 위해 고기 또는 다른 식품에 적용될 수 있다.
환경 유틸리티는 항박테리아제 (예를 들어, 말라리아 또는 웨스트 나일 바이러스를 전파하는 모기 방제용)에 추가로 또는 대신에 살곤충제를 전달하고 조건부로 발현하는 예를 들어 엔지니어링 담체 박테리아, 예를 들어 바실루스 투렌기엔시스 및 그의 접합성 플라스미드 중 하나를 포함한다. 이러한 적용에서, 뿐만 아니라 농업 및 원예 또는 상기 기재된 다른 적용에서, 용액, 에어로졸, 또는 젤 캡슐로서의 담체 박테리아의 제형화가 고려된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 환경에서 조작된 DNA 또는 유전적으로 변형된 유기체의 사용과 연관된 잠재적인 위험을 최소화하기 위해 특정 특징이 본 발명의 DNA, 플라스미드 및 담체 세포에 사용된다. 예를 들어, 환경적으로 민감한 상황에서, 자기-전송불가능한 DNA 또는 플라스미드를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 대신에, DNA 또는 플라스미드는 접합 기구에 의해 동원가능할 것이지만, 자기-전송가능하지 않을 것이다. 이는 일부 실시양태에서 접합 기구의 어셈블리에 필요한 산물을 갖는 tra 유전자의 전부 또는 일부를 담체 세포 염색체에 통합함으로써 성취될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본 발명의 DNA 또는 플라스미드는 세포의 염색체에 제공되는 tra 유전자가 아닌 전달 기점 (oriT)을 보유하도록 구성된다. 이 특징은 수용자 살해 세포가 사멸하기 전에 또는 후에도 살해 DNA 또는 플라스미드를 더 이상 전달하는 것을 방지한다. 또 다른 생물안전성 특징은 미리 결정된 숙주-범위를 갖는 접합 시스템을 활용하는 것을 포함한다. 특정 요소는 소수의 관련된 박테리아 (좁은-숙주-범위)에서만 기능하는 것으로 공지되어 있고, 다른 요소는 많은 비관련된 박테리아 (광범위한-숙주-범위 또는 무차별)에서 기능하는 것으로 공지되어 있다 (del Solar et al., Mol. Microbiol. 32: 661-666, 1996; Zatyka and Thomas, FEMS Microbiol. Rev. 21: 291-319, 1998). 또한, 이러한 접합 시스템 중 많은 것들이 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아에서 기능할 수 있지만 일반적으로 둘 다에서는 기능하지 않을 수 있다 (del Solar, 1996, supra; Zatyka and Thomas, 1998).
항생제 내성의 부주의한 증식은 표적 세포 내로 접합적으로 전달되는 본 발명의 DNA 또는 플라스미드 상의 항생제 내성 마커의 사용을 회피함으로써 실시양태에서 최소화될 수 있다. 대안적인 접근법에서, 아미노산 (즉, 세린)의 합성을 담당하는 유전자가 돌연변이되어, 공여자에서 이 아미노산에 대한 요구사항을 생성할 수 있다. 이러한 돌연변이체 박테리아는 산물이 성장에 필요한 ser 유전자를 갖는 플라스미드를 함유한다면 세린이 결여된 배지에서 번성할 것이다. 그러므로, 본 발명은 ser 유전자 또는 또 다른 영양성 유전적 마커를 함유하는 플라스미드의 유리한 사용을 고려한다. 이들 마커는 담체 세포에서 DNA 또는 플라스미드의 선택 및 유지를 허용할 것이다. 또 다른 생물안전성 접근법은 DNA 또는 플라스미드의 숙주 범위를 조정하기 위한 제한-변형 시스템의 사용을 포함한다. 접합 및 플라스미드 확립은 플라스미드가 제한 시스템을 회피하고 복제할 수 있는 분류학적으로 관련된 종 사이에서 더 빈번하게 발생할 것으로 예상된다. 유형 II 제한 엔도뉴클레아제는 듀플렉스 DNA의 특이적 인식 서열 내에서 또는 근처에서 이중-가닥 파단을 만든다. 동족 변형 효소는 동일한 서열을 메틸화하고 이를 절단으로부터 보호할 수 있다. 제한-변형 시스템 (RM)은 박테리아 및 고세균에 편재하지만 진핵생물에는 부재한다. 일부 RM 시스템은 플라스미드-코딩되는 반면, 다른 시스템은 박테리아 염색체 상에 있다 (Roberts and Macelis, Nucl. Acids Res. 24: 223-235, 1998). 제한 효소는 외래 DNA, 예컨대 바이러스 또는 플라스미드 DNA가 적절한 변형 효소에 의해 변형되지 않은 경우 이 DNA를 절단한다. 이러한 방식으로, 세포는 외래 DNA의 침입으로부터 보호된다. 그러므로, 하나 이상의 메틸라제를 생산하는 담체 균주를 사용함으로써, 하나 이상의 제한 효소에 의한 절단을 회피할 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발은 특이적 제한 부위가 결여되어 있거나 새로운 부위를 포함하는 플라스미드 DNA를 생산하는데 사용되어, 플라스미드 DNA를 엔도뉴클레아제에 대해 각각 보호하거나 취약하게 만든다. 광범위한-숙주 범위 플라스미드 (예를 들어, RP4)는 전형적으로 좁은-숙주 플라스미드에 존재하는 많은 제한 절단 부위를 갖지 않음으로써 단순히 제한 시스템을 회피할 수 있다 (Willkins et al., 1996, J. Mol. Biol 258, 447-456).
본 발명의 바람직한 실시양태는 또한 환경적으로 안전한 박테리아를 담체로서 활용한다. 예를 들어, 약독화된 세포내 그람-양성 및 그람-음성 박테리아에 의한 DNA 백신의 전달이 보고되었다 (Dietrich et al., 2001 Vaccine 19, 2506-2512; Grillot-Courvalin et al., 1999 Current Opinion in Biotech. 10, 477-481). 또한, 공여자 균주는 신체의 비멸균 부분 (예를 들어, 피부, 위장, 비뇨생식기, 입, 비강, 인후 및 상기도 시스템)을 콜로니화하는 수 천개의 무해한 박테리아 중 하나일 수 있다. 바람직한 공여자 (즉, 담체) 박테리아 종의 예는 상기 본원에 제시되어 있다.
또 다른 전략에서, 비분열, 비성장 담체 세포가 살아있는 세포 대신 활용된다. 미니세포 및 맥시세포는 대사적으로 활성이지만 생존불가능한 박테리아 세포의 잘 연구된 모델 시스템이다. 미니세포는 염색체 DNA가 결여되어 있고, DNA 복제 없이 세포 분열을 겪는 특별한 돌연변이체 세포에 의해 생성된다. 세포가 멀티카피 플라스미드를 함유하는 경우, 많은 미니세포는 플라스미드를 함유할 것이다. 미니세포는 분열하지도 성장하지도 않는다. 그러나, 접합성 플라스미드를 보유하는 미니세포는 플라스미드 DNA를 살아있는 수용자 세포에 접합 복제 및 전달할 수 있다. (상기 문헌 [Adler et al., 1970]; 상기 문헌 [Frazer and Curtiss, 1975; 상기 미국 특허 번호 4,968,619). 맥시세포는 핵심 DNA 복구 경로 (recA, uvrA 및 phr)에서 돌연변이를 운반하는 이. 콜라이의 균주로부터 수득될 수 있다. 맥시세포는 너무 많은 DNA 복구 기능이 결여되어 있기 때문에 낮은 용량의 UV에 노출시 사멸한다. 중요하게는, UV 히트를 수신하지 않는 플라스미드 분자 (예를 들어, pBR322)는 계속 복제한다. 전사 및 번역 (플라스미드-지정)은 이러한 조건 하에 효율적으로 발생할 수 있고 (Sancar et al., J. Bacteriol. 137: 692-693, 1979), 조사 전에 만들어진 단백질은 접합을 지속시키기에 충분해야 한다. 이는 하기 두 가지 관찰에 의해 뒷받침된다: i) 스트렙토마이신-사멸된 세포가 활성 공여자로 남아 있음, 및 ii) 드노보 유전자 발현을 방지하는 항생제의 존재 하에 접합성 플라스미드의 전달이 발생할 수 있음 (Heineman and Ankenbauer, 1993, J. Bacteriol. 175, 583-588;Cooper and Heineman, 2000. Plasmid 43, 171-175). 따라서, UV-처리된 맥시세포는 플라스미드 DNA를 살아있는 수용자에게 전달할 수 있을 것이다. 또한, 박테리아 중 recA 및 uvrA 유전자의 보존은 이. 콜라이 이외의 공여자 균주의 맥시세포를 수득할 수 있도록 해야 한다는 점에 유의해야 한다.
또한, 필수 세포 기능 (예를 들어, 세포벽, 단백질 합성, RNA 합성, 예를 들어 상기 미국 특허 4,968,619에 기재된 바와 같음)을 코딩하는 유전자에 온도-민감성 돌연변이(들)를 함유하기 때문에 기능할 수 없는 변형된 박테리아 중 임의의 것이 본 발명에 사용하기 위해 고려된다.
한 대안에서, 담체 세포를 위해 박테리아 대신 고세균이 사용된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 표적 세포는 고세균 세포이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "담체 세포"는 분열 및/또는 비분열 박테리아 세포 (미니세포 및 맥시세포), 또는 조건부로 비기능적 세포를 포함한다.
한 예에서 제1 DNA는 조작된 RK2 플라스미드 (즉, 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 RK2 플라스미드 또는 이러한 변형된 플라스미드의 자손)에 의해 포함된다. 플라스미드 RK2는 29개 (및 아마도 더 많은) 그람-음성 종에서 복제할 수 있는 무차별 플라스미드이다 (Guiney and Lanka, 1989, p 27-54. In C. M. Thomas (ed) Promiscous plasmids in gram-negative bacteria. London, Ltd London United Kingdom.). 플라스미드 RK2는 공지된 완전한 뉴클레오티드 서열을 갖는 60-kb 자기-전송가능한 플라스미드이다 (Pansegrau et al., 1994, J. Mol. Biol. 239, 623-663). TrfA라고 하는 플라스미드의 Rep 단백질을 코딩하는 trfA 유전자, 및 무성생식 복제 oriV의 기원을 제외한 그의 모든 유전자가 결여되어 있는 이 큰 플라스미드로부터 유래된 최소 레플리콘이 수득되었다. RK2 복제 및 TrfA 단백질에 의한 그의 제어에 대한 검토를 위해, 문헌 [Helinski et al., 1996 (In Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Vol. 2 (ed. F. Neidhardt, et al., 2295-2324, ASM Press, Washington D.C.)]을 참조한다.
한 예에서 제1 DNA는 조작된 R6K 플라스미드 (즉, 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 R6K 플라스미드 또는 이러한 변형된 플라스미드의 자손)에 의해 포함된다.
본 발명은 임의로 산업용 또는 가정용이거나, 이러한 용도를 위한 방법에서 사용된다. 예를 들어, 이는 농업, 오일 또는 석유 산업, 식품 또는 음료 산업, 의류 산업, 포장 산업, 전자장치 산업, 컴퓨터 산업, 환경 산업, 화학 산업, 항공우주 산업, 자동차 산업, 생명공학 산업, 의료 산업, 보건 산업, 치과학 산업, 에너지 산업, 소비재 산업, 제약 산업, 광업, 청소 산업, 임업, 어업, 레저 산업, 재활용 산업, 화장품 산업, 플라스틱 산업, 펄프 또는 제지 산업, 섬유 산업, 의류 산업, 가죽 또는 스웨이드 또는 동물 가죽 산업, 담배 산업 또는 철강 산업에서 사용되거나 이를 위한 것이다.
본 발명은 임의로 산업에서 사용하기 위한 것이거나, 환경은 산업용 환경이며, 여기서 산업은 의료 및 보건; 제약; 인간 식품; 동물 식품; 식물 비료; 음료; 낙농; 육류 가공; 농업; 가축 사육; 가금류 사육; 어패류 양식업; 수의학; 오일; 가스; 석유화학; 물 처리; 하수 처리; 포장; 전자장치 및 컴퓨터; 개인 보건 및 세면도구; 화장품; 치과; 비의료 치과; 안과; 비의료 안과; 광물 채광 및 가공; 금속 채광 및 가공; 채석; 항공; 자동차; 기차; 선박; 우주; 환경; 토양 처리; 펄프 및 제지; 의류 제조; 염료; 인쇄; 접착제; 공기 처리; 용매; 생물 방어; 비타민 보충제; 저온 저장; 섬유 레팅 및 생산; 생명공학; 화학물질; 산업용 청소 제품; 가정용 청소 제품; 비누 및 세제; 소비재; 임학; 어업; 레저; 재활용; 플라스틱; 가죽(hide), 가죽(leather) 및 스웨이드; 폐기물 관리; 장례 및 장의사업; 연료; 건물; 에너지; 철강; 및 담배 산업 분야로 이루어진 군으로부터 선택된 분야의 산업이다.
한 예에서, 제1 DNA는 표적 박테리아를 표적화하는 CRISPR 어레이를 포함하며, 여기서 어레이는 표적 박테리아의 게놈을 표적화하기 위한 1 또는 2개 또는 그 이상의 상이한 스페이서 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 20, 30, 40, 50개 또는 그 이상의 스페이서)를 포함한다.
한 예에서, 표적 박테리아는 하기와 같은 환경에 의해 포함된다. 한 예에서, 환경은 인간의 마이크로바이옴, 예를 들어 구강 마이크로바이옴 또는 장내 마이크로바이옴 또는 혈류이다. 한 예에서, 환경은 인간 내의 또는 위의 환경이 아니다. 한 예에서, 환경은 비인간 동물 내의 또는 위의 환경이 아니다. 한 실시양태에서, 환경은 공기 환경이다. 한 실시양태에서, 환경은 농업 환경이다. 한 실시양태에서, 환경은 오일 또는 석유 회수 환경, 예를 들어 오일 또는 석유 필드 또는 유정이다. 한 예에서, 환경은 인간 또는 비인간 동물 소비를 위한 식료품 또는 음료 내의 또는 위의 환경이다. 한 예에서, 환경은 예를 들어 해수 내의 또는 보트 상의 해양 환경이다 (예를 들어, 선박 또는 보트 평형수).
한 예에서, 환경은 인간 또는 동물 마이크로바이옴 (예를 들어, 장, 질, 두피, 겨드랑이, 피부 또는 구강 마이크로바이옴)이다. 한 예에서, 표적 박테리아는 인간 또는 동물 마이크로바이옴 (예를 들어, 장, 질, 두피, 겨드랑이, 피부 또는 구강 마이크로바이옴)에 의해 포함된다.
한 예에서, 본 발명의 담체 박테리아 또는 조성물은 인간 또는 비인간 동물에게 비강내로, 국소로 또는 경구로 투여되거나, 이러한 투여를 위한 것이다. 인간 또는 동물의 마이크로바이옴을 치료하는 것을 목표로 하는 통상의 기술자는 관심 마이크로바이옴에 따라 최선의 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 마이크로바이옴이 장내 마이크로바이옴인 경우, 투여는 비강내로 또는 경구로 수행될 수 있다. 마이크로바이옴이 두피 또는 겨드랑이 마이크로바이옴인 경우, 투여는 국소로 수행될 수 있다. 마이크로바이옴이 입 또는 인후에 있는 경우, 투여는 경구로 수행될 수 있다.
한 예에서, 환경은 음료 또는 물 (예를 들어, 수로 또는 인간 소비용 식수) 또는 토양에 의해 보유된다. 물은 임의로 가열, 냉각 또는 산업용 시스템, 또는 식수 저장 컨테이너에 있다.
한 예에서, 담체 및/또는 표적 박테리아는 아나에로트룬쿠스, 아세타나에로박테리움, 아세티토마쿨룸, 아세티비브리오, 아나에로코쿠스, 아나에로필룸, 아나에로시누스, 아나에로스티페스, 아나에로보락스, 부티리비브리오, 클로스트리디움, 카프라코쿠스, 데할로박터, 디알리스터, 도레아, 엔테로코쿠스, 에탄올리게넨스, 파에칼리박테리움, 푸소박테리움, 그라실리박터, 구겐하이멜라, 헤스펠리아, 라크노박테리움, 라크노스피라, 락토바실루스, 류코노스톡, 메가모나스, 모리엘라, 미츠오켈라, 오리박테리움, 옥소박터, 파필리박터, 프로프리오니스피라, 슈도부티리비브리오, 슈도라미박터, 로세부리아, 루미노코쿠스, 사르시나, 세이노넬라, 셔틀워르티아, 스포로박터, 스포로박테리움, 스트렙토코쿠스, 서브돌리그라눌룸, 신트로포코쿠스, 써모바실루스, 투리박터 및 웨이셀라로부터 선택된 피르미쿠테스이다.
한 예에서, 담체 박테리아, 조성물, 용도 또는 방법은 병원성 감염을 감소시키기 위한, 또는 장 또는 경구 생물막을 재균형화하기 위한, 예를 들어, 인간 또는 동물에서 비만 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한; 또는 GI 상태 (예컨대 크론병, IBD 또는 결장염)를 치료 또는 예방하기 위한 것이다. 예를 들어, DNA, 담체 박테리아, 조성물, 용도 또는 방법은 인간 또는 동물의 장 생물막 또는 식물에서, 바람직하게는 인간 또는 동물에서 살모넬라, 캄필로박터, 에르위니아, 크산토모너스, 에드워드시엘라, 슈도모나스, 클레브시엘라, 펙토박테리움, 클로스트리디움 디피실레 또는 이 콜라이 박테리아를 녹다운하기 위한 것이다.
한 예에서, 동물은 닭이고, 예를 들어 표적 박테리아는 살모넬라 또는 캄필로박터이다. 한 예에서, 동물은 어류 (예를 들어, 메기 또는 연어) 또는 조개류 (예를 들어, 프론 또는 랍스터)이고, 예를 들어 표적 박테리아는 에드워드시엘라이다. 한 예에서, 식물은 감자 식물이고, 예를 들어 표적 박테리아는 펙토박테리움이다. 한 예에서, 식물은 양배추 식물이고, 예를 들어 표적 박테리아는 크산토모너스 (예를 들어, 엑스 캄페스트리스)이다. 한 예에서, 식물은 마리화나 식물이고, 예를 들어 표적 박테리아는 슈도모나스 (예를 들어, 피 칸나비나 또는 피 아미그달리), 아그로박테리움 (예를 들어, 에이 투메파시엔스) 또는 크산토모나스 (예를 들어, 엑스 캄페스트리스)이다. 한 예에서, 식물은 대마 식물이고, 예를 들어 표적 박테리아는 슈도모나스 (예를 들어, 피 칸나비나 또는 피 아미그달리), 아그로박테리움 (예를 들어, 에이 투메파시엔스) 또는 크산토모나스 (예를 들어, 엑스 캄페스트리스)이다.
한 예에서, 질환 또는 상태는 암, 염증성 또는 자가면역 질환 또는 상태, 예를 들어 비만, 당뇨병 IBD, GI 관 상태 또는 구강 상태이다.
임의로, 환경 또는 표적 박테리아는 장 생물막, 피부 생물막, 구강 생물막, 인후 생물막, 모발 생물막, 겨드랑이 생물막, 질 생물막, 직장 생물막, 항문 생물막, 안구 생물막, 코 생물막, 혀 생물막, 폐 생물막, 간 생물막, 신장 생물막, 생식기 생물막, 음경 생물막, 음낭 생물막, 유선 생물막, 귀 생물막, 요도 생물막, 음순 생물막, 장기 생물막 또는 치과 생물막에 의해 포함된다. 임의로, 환경 또는 표적 박테리아는 식물 (예를 들어, 담배, 작물 식물, 과일 식물, 채소 식물 또는 담배, 예를 들어 식물의 표면 상에 있거나 식물에 함유됨) 또는 환경 (예를 들어, 토양 또는 물 또는 수로 또는 수성 액체)에 의해 포함된다.
한 예에서, 담체 세포(들) 또는 조성물은 동물 또는 인간에서 질환 또는 상태를 치료하기 위한 것이다 (여기서, 질환 또는 상태). 한 예에서, 질환 또는 상태는 대상체 또는 환자에 의해 포함된 표적 세포의 감염에 의해 유발 또는 매개된다. 한 예에서, 질환 또는 상태는 대상체 또는 환자에 의해 포함된 표적 세포의 감염과 연관된다. 한 예에서, 질환 또는 상태의 증상은 대상체 또는 환자에 의해 포함된 표적 세포의 감염이다.
임의로, 인간 또는 동물 대상체의 질환 또는 상태는 하기로부터 선택된다:
(a) 신경퇴행성 질환 또는 상태;
(b) 뇌 질환 또는 상태;
(c) CNS 질환 또는 상태;
(d) 기억 상실 또는 손상;
(e) 심장 또는 심혈관 질환 또는 상태, 예를 들어 심장마비, 뇌졸중 또는 심방 세동;
(f) 간 질환 또는 상태;
(g) 신장 질환 또는 상태, 예를 들어 만성 신장 질환 (CKD);
(h) 췌장 질환 또는 상태;
(i) 폐 질환 또는 상태, 예를 들어 낭포성 섬유증 또는 COPD;
(j) 위장 질환 또는 상태;
(k) 인후 또는 구강 질환 또는 상태;
(l) 안구 질환 또는 상태;
(m) 생식기 질환 또는 상태, 예를 들어 질, 음순, 음경 또는 음낭 질환 또는 상태;
(n) 성-전염성 질환 또는 상태, 예를 들어 임질, HIV 감염, 매독 또는 클라미디아 감염;
(o) 귀 질환 또는 상태;
(p) 피부 질환 또는 상태;
(q) 심장 질환 또는 상태;
(r) 코 질환 또는 상태
(s) 혈액학적 질환 또는 상태, 예를 들어 빈혈, 예를 들어 만성 질환 또는 암의 빈혈;
(t) 바이러스 감염;
(u) 병원성 박테리아 감염;
(v) 암;
(w) 자가면역 질환 또는 상태, 예를 들어 SLE;
(x) 염증성 질환 또는 상태, 예를 들어 류마티스 관절염, 건선, 습진, 천식, 궤양성 결장염, 결장염, 크론병 또는 IBD;
(y) 자폐증;
(z) ADHD;
(aa) 양극성 장애;
(bb) ALS [근위축성 측삭 경화증];
(cc) 골관절염;
(dd) 선천적 또는 발달적 결함 또는 상태;
(ee) 유산;
(ff) 혈액 응고 상태;
(gg) 기관지염;
(hh) 건성 또는 습성 AMD;
(ii) 신생혈관증식 (예를 들어, 종양의 또는 눈에서);
(jj) 감기;
(kk) 간질;
(ll) 섬유증, 예를 들어 간 또는 폐 섬유증;
(mm) 진균 질환 또는 상태, 예를 들어 아구창;
(nn) 대사 질환 또는 상태, 예를 들어 비만, 식욕부진, 당뇨병, I형 또는 II형 당뇨병.
(oo) 궤양(들), 예를 들어 위 궤양화 또는 피부 궤양화;
(pp) 건성 피부;
(qq) 쇼그렌 증후군;
(rr) 시토카인 폭풍;
(ss) 난청, 청력 상실 또는 손상;
(tt) 느리거나 빠른 신진대사 (즉, 대상체의 중량, 성별 및 연령에 대한 평균보다 느리거나 빠름);
(uu) 임신 장애, 예를 들어 불임증 또는 저출산력;
(vv) 황달;
(ww) 피부 발진;
(xx) 가와사키병;
(yy) 라임병;
(zz) 알레르기, 예를 들어 견과류, 잔디, 꽃가루, 집먼지 진드기, 고양이 또는 개 털 또는 비듬 알레르기;
(aaa) 말라리아, 장티푸스, 결핵 또는 콜레라;
(bbb) 우울증;
(ccc) 정신 지체;
(ddd) 소두증;
(eee) 영양실조;
(fff) 결막염;
(ggg) 폐렴;
(hhh) 폐 색전증;
(iii) 폐 고혈압;
(jjj) 골 장애;
(kkk) 패혈증 또는 패혈성 쇼크;
(lll) 부비동;
(mmm) 스트레스 (예를 들어, 직업적 스트레스);
(nnn) 지중해빈혈, 빈혈, 폰 빌레브란트병, 또는 혈우병;
(ooo) 대상포진 또는 구순포진;
(ppp) 월경;
(qqq) 낮은 정자 카운트.
본 발명에 의한 치료 또는 예방을 위한 신경퇴행성 또는 CNS 질환 또는 상태
한 예에서, 신경퇴행성 또는 CNS 질환 또는 상태는 알츠하이머병, 노인성 정신병, 다운 증후군, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병, 당뇨병성 신경병증, 파킨슨 증후군, 헌팅턴병, 마카도-조셉병, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병성 신경병증, 및 크로이츠펠트 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 질환은 알츠하이머병이다. 예를 들어, 질환은 파킨슨 증후군이다.
한 예에서, 여기서 본 발명의 방법은 CNS 또는 신경퇴행성 질환 또는 상태를 치료하기 위해 인간 또는 동물 대상체에서 실행되고, 방법은 대상체에서 Treg 세포의 하향조절을 유발하며, 이에 의해 맥락총을 가로질러 대상체의 뇌로의 전신 단핵구-유래 대식세포 및/또는 Treg 세포의 유입을 촉진하며, 이에 의해 질환 또는 상태 (예를 들어, 알츠하이머병)가 치료, 예방되거나 또는 그 진행이 감소된다. 한 실시양태에서 방법은 대상체의 CNS 시스템 (예를 들어, 뇌 및/또는 CSF)에서 IFN-감마의 증가를 유발한다. 한 예에서, 방법은 신경 섬유를 회복시키고/거나 신경 섬유 손상의 진행을 감소시킨다. 한 예에서, 방법은 신경 수초를 회복시키고/거나 신경 수초 손상의 진행을 감소시킨다. 한 예에서, 본 발명의 방법은 WO2015136541에 개시된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하고/거나, 방법은 WO2015136541에 개시된 임의의 방법과 함께 사용될 수 있다 (이 문서의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨, 예를 들어 CNS 및 신경퇴행성 질환 및 상태의 치료 및/또는 예방을 수행하기 위해 대상체에게 투여될 수 있는 이러한 방법, 질환, 상태 및 잠재적인 치료제, 예를 들어 작용제, 예컨대 면역 체크포인트 억제제, 예를 들어 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-TIM3 또는 여기에 개시된 다른 항체의 개시를 제공하기 위해).
방법에 의한 치료 또는 예방을 위한 암
치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않거나 실질적으로 혈관화되지 않은 종양, 뿐만 아니라 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 비-고형 종양 (예컨대 혈액학적 종양, 예를 들어 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나, 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명으로 치료될 암의 유형은 암종, 모세포종 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림프성 악성종양, 양성 및 악성 종양, 및 악성종양 예를 들어, 육종, 암종, 및 흑색종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
혈액학적 암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적 (또는 조혈성) 암의 예는 급성 백혈병 (예컨대 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수혈성 백혈병 및 골수모세포, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 에리트로백혈병), 만성 백혈병 (예컨대 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 만성 골수혈성 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병)을 포함하는 백혈병, 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종 (무통성 및 고급형), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄 질환, 골수이형성 증후군, 모발 세포 백혈병 및 골수이형성증을 포함한다.
고형 종양은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 이를 형성하는 세포 유형에 따라 명명된다 (예컨대, 육종, 암종 및 림프종). 고형 종양, 예컨대 육종 및 암종의 예는 섬유육종, 믹소육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프성 악성종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 갑상선 수질 암종, 유두 갑상선 암종, 크롬친화성세포종 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광 암종, 흑색종, 및 CNS 종양 (예컨대, 신경교종 (예컨대 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교모세포종 (다형성 교모세포종으로도 공지됨) 성상세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 신경초종 두개인두종, 뇌실막종, 송과종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍돌기신경교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종 및 뇌 전이)을 포함한다.
방법에 의한 치료 또는 예방을 위한 자가면역 질환
1. 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM)
2. 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염
3. 애디슨병
4. 무감마글로불린혈증
5. 원형 탈모증
6. 아밀로이드증
7. 강직성 척추염
8. 항-GBM/항-TBM 신염
9. 항인지질 증후군 (APS)
10. 자가면역 혈관부종
11. 자가면역 재생불량성 빈혈
12. 자가면역 자율신경실조증
13. 자가면역 간염
14. 자가면역 고지혈증
15. 자가면역 면역결핍
16. 자가면역 내이 질환 (AIED)
17. 자가면역 심근염
18. 자가면역 난소염
19. 자가면역 췌장염
20. 자가면역 망막병증
21. 자가면역 혈소판감소성 자반증 (ATP)
22. 자가면역 갑상선 질환
23. 자가면역 두드러기
24. 축삭 & 뉴런 신경병증
25. 발로병
26. 베체트병
27. 수포성 유천포창
28. 심근병증
29. 캐슬만병
30. 셀리악병
31. 샤가스병
32. 만성 피로 증후군
33. 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP)
34. 만성 재발성 다초점성 골수염 (CRMO)
35. 처그-스트라우스 증후군
36. 반흔성 유천포창/양성 점막 유천포창
37. 크론병
38. 코간 증후군
39. 저온 응집소 질환
40. 선천적 심장 차단
41. 콕사키 심근염
42. 크레스트병
43. 본태성 혼합 한랭글로불린혈증
44. 탈수초성 신경병증
45. 포진성 피부염
46. 피부근염
47. 데빅병 (시신경척수염)
48. 원판성 루푸스
49. 드레슬러 증후군
50. 자궁내막증
51. 호산구성 식도염
52. 호산구성 근막염
53. 결절성 홍반
54. 실험적 알레르기성 뇌척수염
55. 에반스 증후군
56. 섬유근육통
57. 섬유화성 폐포염
58. 거대 세포 동맥염 (측두 동맥염)
59. 거대 세포 심근염
60. 사구체신염
61. 굿패스쳐 증후군
62. 다발혈관염 동반 육아종증 (GPA) (이전에는 베게너 육아종증이라고 함)
63. 그레이브스병
64. 길랑-바레 증후군
65. 하시모토 뇌염
66. 하시모토 갑상선염
67. 용혈성 빈혈
68. 헤노흐-쉔라인 자반증
69. 임신성 헤르페스
70. 저감마글로불린혈증
71. 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP)
72. IgA 신병증
73. IgG4-관련 경화성 질환
74. 면역조절 지단백질
75. 봉입체 근염
76. 간질성 방광염
77. 소아 관절염
78. 소아 당뇨병 (1형 당뇨병)
79. 소아 근염
80. 가와사키 증후군
81. 램버트-이튼 증후군
82. 백혈구파괴성 혈관염
83. 편평 태선
84. 경화성 태선
85. 목질 결막염
86. 선형 IgA 질환 (LAD)
87. 루푸스 (SLE)
88. 라임병, 만성
89. 메니에르병
90. 현미경적 다발혈관염
91. 혼합 결합 조직 질환 (MCTD)
92. 무렌 궤양
93. 뮈샤-하버만병
94. 다발성 경화증
95. 중증 근무력증
96. 근염
97. 기면증
98. 시신경척수염 (데빅)
99. 호중구감소증
100. 안구 반흔성 유천포창
101. 시신경염
102. 재발성 류마티즘
103. PANDAS (스트렙토코쿠스와 연관된 소아 자가면역 신경정신병 장애)
104. 부신생물 소뇌 변성
105. 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH)
106. 패리 롬버그 증후군
107. 파소나지-터너 증후군
108. 주변 포도막염 (말초 포도막염)
109. 천포창
110. 말초 신경병증
111. 정맥주위성 뇌척수염
112. 악성 빈혈
113. POEMS 증후군
114. 결절성 다발동맥염
115. I, II, & III형 자가면역 다선성 증후군
116. 류마티스성 다발성 근육통
117. 다발성 근염
118. 심근경색후 증후군
119. 심막절개후 증후군
120. 프로게스테론 피부염
121. 원발성 담즙성 간경변증
122. 원발성 경화성 담관염
123. 건선
124. 건선성 관절염
125. 특발성 폐 섬유증
126. 괴저성 농피증
127. 진성 적혈구 무형성증
128. 레이노 현상
129. 반응성 관절염
130. 반사 교감신경 이영양증
131. 라이터 증후군
132. 재발성 다발연골염
133. 하지 불안 증후군
134. 후복막 섬유증
135. 류마티스 열
136. 류마티스 관절염
137. 유육종증
138. 슈미트 증후군
139. 공막염
140. 피부경화증
141. 쇼그렌 증후군
142. 정자 & 고환 자가면역
143. 강직 인간 증후군
144. 아급성 박테리아성 심내막염 (SBE)
145. 수삭 증후군
146. 교감성 안염
147. 다카야스 동맥염
148. 측두 동맥염/거대 세포 동맥염
149. 혈소판감소성 자반증 (TTP)
150. 톨로사-헌트 증후군
151. 횡단 척수염
152. 1형 당뇨병
153. 궤양성 결장염
154. 미분화 결합 조직 질환 (UCTD)
155. 포도막염
156. 혈관염
157. 수포성 피부병
158. 백반증
159. 베게너 육아종증 (지금은 다발혈관염 동반 육아종증 (GPA)이라고 함).
방법에 의한 치료 또는 예방을 위한 염증성 질환
1. 알츠하이머
2. 강직성 척추염
3. 관절염 (골관절염, 류마티스 관절염 (RA), 건선성 관절염)
4. 천식
5. 아테롬성동맥경화증
6. 크론병
7. 결장염
8. 피부염
9. 게실염
10. 섬유근육통
11. 간염
12. 과민성 장 증후군 (IBS)
13. 전신 홍반성 루푸스 (SLE)
14. 신염
15. 파킨슨병
16. 궤양성 결장염.
성장 촉진제 & 식품 전환율 저하
실시예는 표적 박테리아가 가금류에서 성장을 촉진하고 FCR을 증진시키기 위해 항박테리아제를 사용하여 표적화될 수 있음을 입증한다. 실시예에서, 가이드된 뉴클레아제 시스템은 가금류에서 살모넬라를 특이적으로 표적화하는데 사용되었다.
제1 측면에서, 하기가 제공된다:-
동물 (예를 들어, 가축 동물, 예를 들어 가금류 동물)의 성장을 촉진하는 방법으로서, 방법은 동물에게 가이드된 뉴클레아제 시스템 또는 그의 성분을 투여하는 단계, 및 시스템 또는 성분을 동물에 의해 포함된 표적 박테리아에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 가이드된 뉴클레아제는 표적 박테리아에 의해 포함된 표적 뉴클레오티드 서열을 인식 및 변형 (예를 들어, 절단)시킬 수 있어, 이에 의해 표적 박테리아가 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 동물의 성장이 촉진되는 것인 방법.
방법은 비의학적 방법이고, 동물에서의 표적 박테리아의 존재는 동물의 성장을 억제할 수 있다. 그러므로, 방법은 동물에서 이러한 박테리아의 부담을 감소시키고 성장을 촉진한다.
제2 측면에서 하기가 제공된다:-
동물 (예를 들어, 가축 동물, 예를 들어 가금류 동물)에서 사료 전환율 (FCR)을 증진시키는 방법으로서, 방법은 동물에게 가이드된 뉴클레아제 시스템 또는 그의 성분을 투여하는 단계, 및 시스템 또는 성분을 동물에 의해 포함된 표적 박테리아에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 가이드된 뉴클레아제는 표적 박테리아에 의해 포함된 표적 뉴클레오티드 서열을 인식 및 변형 (예를 들어, 절단)시킬 수 있어, 이에 의해 표적 박테리아가 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 동물의 FCR이 증진되는 것인 방법.
방법은 비의학적 방법이고, 동물에서의 표적 박테리아의 존재는 동물의 FCR을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 방법은 동물에서 이러한 박테리아의 부담을 감소시키고 FCR을 증진시킨다 (즉, FCR 수를 감소시킴).
제3 측면에서 하기가 제공된다:-
동물 (예를 들어, 가축 동물, 예를 들어 가금류 동물)의 성장을 촉진하는 방법으로서, 방법은 동물에게 살모넬라 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 동물에 의해 포함된 살모넬라 표적 박테리아가 작용제에 노출되고 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 동물의 성장이 촉진되는 것인 방법.
방법은 비의학적 방법이고, 동물에서의 표적 박테리아의 존재는 동물의 성장을 억제할 수 있다. 그러므로, 방법은 동물에서 이러한 박테리아의 부담을 감소시키고 성장을 촉진한다.
제4 측면에서 하기가 제공된다:-
동물 (예를 들어, 가축 동물, 예를 들어 가금류 동물)에서 사료 전환율 (FCR)을 증진시키는 방법으로서, 방법은 동물에게 살모넬라 박테리아에 독성이 있는 항박테리아제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 동물에 의해 포함된 살모넬라 표적 박테리아가 작용제에 노출되고 사멸되거나 표적 박테리아의 성장 또는 증식이 억제되고 동물의 FCR이 증진되는 것인 방법.
방법은 비의학적 방법이고, 동물에서의 표적 박테리아의 존재는 동물의 FCR을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 방법은 동물에서 이러한 박테리아의 부담을 감소시키고 FCR을 증진시킨다 (즉, FCR 수를 감소시킴).
임의의 이들 측면에서, 임의로 동물은 가축 동물이다. 임의로, 동물은 조류, 예를 들어 가금류 조류, 예를 들어 닭, 칠면조, 거위 또는 오리이다. 바람직하게는, 동물은 닭이다.
임의의 이들 측면에서, 임의로 박테리아는 엔테로박테리아시아에 박테리아, 예를 들어 살모넬라이다. 예를 들어, 박테리아는 살모넬라 엔테리카, 티피뮤리움 또는 엔테리티디스이다. 예를 들어, 살모넬라는 본원에 개시된 임의의 살모넬라 종 또는 균주이다.
예를 들어, 시스템, 성분 또는 작용제는 동물 사료 및/또는 음료 (예를 들어, 식수에 혼합됨)로 동물에게 공급된다. 음료로 공급되는 경우, 시스템, 성분 또는 작용제는 담체 박테리아에 의해 포함될 수 있으며, 여기서 담체 박테리아는 1 x 103 내지 1 x 1010 (예를 들어, 1 x 104 내지 1 x 1010 ; 1 x 104 내지 1 x 109 ; 1 x 104 내지 1 x 108 ; 1 x 104 내지 1 x 107 ; 1 x 103 내지 1 x 1010 ; 1 x 103 내지 1 x 109 ; 1 x 103 내지 1 x 108 ; 1 x 103 내지 1 x 107 ; 1 x 105 내지 1 x 1010 ; 1 x 105 내지 1 x 109 ; 1 x 105 내지 1 x 108; 1 x 105 내지 1 x 107 ; 1 x 106 내지 1 x 1010 ; 1 x 106 내지 1 x 109 ; 1 x 106 내지 1 x 108 ; 또는 1 x 106 내지 1 x 107) cfu/ml의 양으로 음료에 포함된다. 음료로 공급되는 경우, 시스템, 성분 또는 작용제는 담체 박테리아에 의해 포함될 수 있으며, 여기서 담체 박테리아는 적어도 1 x 108 cfu/ml의 양으로 음료에 포함되고, 예를 들어 여기서 동물은 가금류 조류, 예컨대 닭이다.
임의로, 가이드된 뉴클레아제는 본원에 개시된 임의의 가이드된 뉴클레아제, 예를 들어 Cas, TALEN, 메가뉴클레아제 또는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 한 예에서, 성분은 동족 Cas 뉴클레아제와 표적 세포에서 작동가능한 crRNA 또는 가이드 RNA이다. Cas 뉴클레아제는 본원에 개시된 임의의 Cas 뉴클레아제일 수 있다. Cas 뉴클레아제는 표적 세포의 내인성 Cas일 수 있거나, 동물에게 투여되는 외인성 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 시스템, 성분 및 작용제는 박테리아 접합 (예를 들어, 담체 세포로부터 표적 세포로의 접합 전달)에 의해 또는 파지에 의해 표적 박테리아에 도입될 수 있으며, 여기서 파지는 시스템, 성분 또는 작용제를 코딩하는 핵산을 표적 세포에 형질도입한다.
임의로, 표적 박테리아는 동물에서 발견되는 본원에 개시된 임의의 미생물총에 의해 포함된다. 바람직하게는, 미생물총은 장내 미생물총 (예를 들어, 닭의 장내 미생물총)이다.
가축 동물은 본원에 개시된 임의의 가축 동물, 예를 들어 닭, 돼지, 소, 양, 양식 어류 (예컨대 연어 또는 메기) 또는 양식 조개류 (예를 들어, 랍스터, 프론 또는 새우)일 수 있다.
본원에 기재된 특정 실시양태는 본 발명의 제한이 아니라 예시의 방식으로 표시된 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 실시양태에서 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 특정 절차에 대한 수많은 등가물을 인식하거나, 단지 일상적인 연구를 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려되며, 청구범위에 포함된다. 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허 출원 및 모든 미국 동등 특허 출원 및 특허는 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 때 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상," "적어도 하나," 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다. 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 지칭하거나 대안이 상호 배타적임을 명시적으로 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용되지만, 본 개시내용은 대안 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 뒷받침한다. 본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 디바이스에 대한 고유한 오차 변동, 값을 결정하기 위해 사용되는 방법, 또는 연구 대상체 중에 존재하는 변동을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구항(들)에서 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함한다"), "갖는" (및 갖는의 임의의 형태, 예컨대 "갖다" 및 "갖는다"), "수반하는" (및 수반하는의 임의의 형태, 예컨대 "수반한다" 및 "포함하다" 또는 "함유하는" (및 함유하는의 임의의 형태, 예컨대 "함유한다" 및 "함유하다")은 포괄적 또는 개방적이고, 인용되지 않은 추가 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "또는 이들의 조합" 또는 유사한 용어는 용어 앞에 나열된 항목의 모든 순열 및 조합을 지칭한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이들의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC 또는 ABC 중 적어도 하나, 및 특정 문맥에서 순서가 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB를 포함하는 것으로 의도된다. 이 예에 계속하여, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 함유하는 조합, 예컨대 BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등이 명시적으로 포함된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 문맥에서 달리 명백하지 않는 한, 전형적으로 임의의 조합에서 항목 또는 용어의 수에 제한이 없음을 이해할 것이다.
본 개시내용의 임의의 부분은 문맥에서 달리 명백하지 않는 한, 본 개시내용의 임의의 다른 부분과 조합하여 판독될 수 있다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 제조 및 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시양태의 면에서 설명되었지만, 변동이 본 발명의 개념, 사상 및 범위에서 벗어나지 않으면서 조성물 및/또는 방법에 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 적용될 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 이러한 모든 유사한 치환물 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
실시예
실시예 1: 표적 유전자 서열 평가 & crRNA 어레이 설계
살모넬라에서 추정 표적 유전자의 목록
신중한 분석 및 의사 결정을 통해, 본 발명에 따라 담체 세포로부터 접합성 플라스미드에 의해 전달된 CRISPR/Cas 성분을 사용하여 절단함으로써 평가를 위해 하기 표적 유전자를 컴파일하였다.
1) pipA 병원성 섬 코딩된 단백질: SPI5
2) mViM 추정 균력 인자
3) mViN 추정 균력 인자
4) phoP 낮은 Mg+ 농도 (OmpR 패밀리) 하에 발현된 유전자를 전사시킴; 균력 전사 조절 단백질 PHOP
5) hilA 침입 유전자 전사 활성화제
6) BigA 추정 표면-노출 균력 단백질
7) sugR ATP 결합 단백질; 병원성 섬 코딩된 단백질: SPI3
8) rhuM 병원성 섬 코딩된 단백질: SPI3
9) pipC 침입 유전자 E 단백질/ 병원성 섬 코딩된 단백질: SPI5
10) pipB 병원성 섬 코딩된 단백질: SPI5
11) sicP 균력과 관련된 샤페론
12) sopB 침입 유전자 D 단백질/병원성 섬 코딩된 단백질: SPI5
13) marT 추정 전사 조절 단백질/병원성 섬 코딩된 단백질: SPI3
표적 선택
살모넬라-특이적 유전자의 초기 표적 선택은 거의 독점적으로 살모넬라 병원성 섬 (이 실시예의 시작 부분에 나열됨)에 위치된 13개의 추정 후보를 식별하였다. 정밀 점검 후, 표적 목록은 7개의 유전자, 즉 pipA, pipB, pipC, hilA, marT, sicP 및 sopB로 감소되었으며, 중요하게는 엔테로박테리아로부터의 다른 유전자와 유의한 서열 상동성을 나타내지 않으며, 그러므로 생체내 및 상이한 (비-살모넬라) 종의 비표적 엔테로박테리아를 함유하는 마이크로바이옴에서 살모넬라 세포의 표적화의 높은 특이성을 가능하게 한다는 것을 밝혀내었다. PAM 모티프 (NGG)의 존재에 의해 정의된 에스. 피오게네스 Cas9에 대한 표적 부위는 분자 생물학 소프트웨어에서 이용가능한 각각의 기능을 사용하여 추출하였다. 7개의 선택된 유전자 각각에서 다수의 6 내지 14개의 추정 표적 부위가 식별되었다.
crRNA 설계 및 합성
dsDNA의 효율적인 제한을 초래할 가능성이 가장 큰 표적 부위를 선택하기 위해, 이용가능한 문헌에서 Cas9에 의해 도입된 이중 가닥 절단의 효율에 대한 양성 또는 음성 효과를 갖는 것으로 기재된 핵심 위치에 뉴클레오티드의 존재에 대해 모든 잠재적인 서열을 스크리닝하였다. 3개의 간행물이 sgRNA에 대한 이러한 데이터를 보고하였다:
(1) Doench et al. 2014, Nature Biotechnology
(2) Gagnon et al. 2014, PLoS One
(3) Liu et al. 2016, Scientific Reports
3개의 간행물 각각에서 제한 효율에 영향을 미치는 것으로 기재된 대부분의 파라미터에 접착된 각 유전자에 대한 하나의 표적 서열이 crRNA 어레이에 혼입되도록 선택되었으며, 이는 3개의 어레이가 시험되도록 하였다. crRNA 어레이는 에스. 피오게네스로부터의 서열 데이터에 기초하여 설계되었다 (문헌 [Deltcheva et al. 2011, Nature]에 공개됨). 하기 서열을 구축하였다: 서열식별번호: 1-3.
crRNA를 코딩하는 이들 서열 중 2개는 동족 tracrRNA 및 Cas9를 코딩하는 서열과 어셈블리되었다.
Cas9 구축물 (tracrRNA-Cas9-crRNA)
crRNA를 코딩하는 선택된 서열은 상이한 버전의 tracrRNA-Cas9 모듈과 조합되어, 다양한 세트의 플라스미드를 초래하였다.
모든 성분 (tracrRNA, Cas9 및 crRNA)의 구성적 발현을 위해, 플라스미드 pCas9에 기초한 tracr-Cas 단편 (Jiang et al. 2013, Nature Biotechnology; 서열식별번호: 4로 제시된 서열)을 에스. 피오게네스 gDNA로부터 증폭하였다. 이 단편을 이용가능한 crRNA-코딩 단편과 연결하고, 높은 카피 수의 일반적인 클로닝 플라스미드 pJet1.2로 클로닝하였다. 이 일련의 구축물을 pFS1이라고 하였다.
낮은 카피 수 배경에서 이 구성적 CRISPR/Cas 구축물의 발현이 효율적으로 작동하는지 여부를 결정하기 위해, 상기 기재된 시스템을 낮은 카피 수 플라스미드로 이동시켰다. 따라서 pFS2 구축물은 pZS21MCS (익스프레시스(Expressys))로부터의 낮은 카피 수 pSC101 기원에 기초한다.
유도성 프로모터에 의해 CRISPR/Cas 성분 중 적어도 하나의 발현을 제어하기 위해, 구성적 Cas9 프로모터를 TetR 조절된 프로모터 PLtetO-1로 대체하였다. pFS3의 생성된 플라스미드는 또한 pZS21MCS의 낮은 카피 수 pSC101 기원에 기초한다. 도입된 변경은 하기와 같다:
· RBS 및 시작 ATG 사이의 간격은 7 bp로 단축되었다 (TAAATAC).
· 정지 코돈은 덜 효과적인 TGAC로부터 탠덤 TAATAAT 서열로 변경되었다.
마지막으로, 상기 언급된 pFS1 및 pFS2와 같은 구성적으로 발현된 플라스미드의 동원가능한 버전을 생산하였다. 이를 위해, 플라스미드 RP4의 전달 기점 (oriT)을 클로람페니콜 내성을 갖는 중간 카피 수 플라스미드 (p15A 기원)로 클로닝하였다. 이 구축물은 RP4 및 다른 동원가능한 플라스미드에 존재하는 염색체로 통합된 접합 기구에 의해 동원 및 전달될 수 있어야 한다.
추가 구축물
최종 선택 및 살모넬라로의 형질전환 전에 선택된 crRNA에 의한 dsDNA 제한의 효율을 결정하기 위해, 표적 유전자 (또는 그의 실질적인 부분)를 호환성 플라스미드에 클로닝하는 것을 목표로 하였다. 선택된 플라스미드는 상기 기재된 pFS1/pFS2/pFS3 구축물과 호환가능한 p15A 기원을 갖는 pZA31MCS (익스프레시스)이다. 그 후, 클로람페니콜 내성 손실 (또는 yfp 유도체가 리포터로서 존재하는 경우 형광 손실)에 의해 이. 콜라이에서 효율을 시험할 수 있었다. 그 후, 최선의 성능의 표적 서열을 미래의 더 많은 표적화된 플라스미드에서 사용할 수 있다.
하기 플라스미드를 제조하였다:-
pFSmob-C tracrRNA/Cas9 - mob - pZA31MCS
pFSmobSal7 tracrRNA/Cas9 - Salcr7-3 - mob - pZA31MCS
pFSmobSal3 tracrRNA/Cas9 - Salcr3.2 - mob - pZA31MCS
pFSmob-C* Salcr7-3 - mob - pZA31MCS에 기초한 대조군
플라스미드 세부사항
플라스미드 명칭: pFSmob-C
설명: 4768 bp 삽입물 (tracrRNA-Cas9-oriT/mob)을 보유한 pZA31MCS (익스프레시스)에 기초한 p15A 기원 플라스미드
플라스미드 길이: 6685 bp
확인된 서열: 예; 프라이머 워킹 시퀀싱에 의해 확인된 삽입물 서열
추가 참고사항: 존재하는 crRNA 어레이 없음; 대조군 플라스미드
플라스미드 세부사항
플라스미드 명칭: pFSmobSal7
설명: 5598 bp 삽입물 (tracrRNA-Cas9-crRNA-oriT/mob)을 보유한 pZA31MCS (익스프레시스)에 기초한 p15A 기원 플라스미드
플라스미드 길이: 7515 bp
확인된 서열: 예; 프라이머 워킹 시퀀싱에 의해 확인된 삽입물 서열
플라스미드 세부사항
플라스미드 명칭: pFSmobSal3
설명: 5341 bp 삽입물 (tracrRNA-Cas9-crRNA-oriT/mob)을 보유한 pZA31MCS (익스프레시스)에 기초한 p15A 기원 플라스미드
플라스미드 길이: 7258 bp
확인된 서열: 예; 프라이머 워킹 시퀀싱에 의해 확인된 삽입물 서열
플라스미드 세부사항
플라스미드 명칭: pFSmob-C*
설명: pZA31MCS (익스프레시스)에 기초한 p15A 기원 플라스미드
플라스미드 길이: 7348 bp
확인된 서열: 예; 프라이머 워킹 시퀀싱에 의해 확인된 삽입물 서열
실시예 2: 가이드된 뉴클레아제를 사용한 접합에 의한 원치않는 살모넬라 균주의 선택적인 제거
연구 목적
본 연구의 목표는 접합 실험에 의해 원치않는 살모넬라 균주를 선택적으로 제거하는 것이었다. 이.콜라이 S17로부터 살모넬라 종으로 pFSMobSal7 플라스미드를 동원하였다. 이 플라스미드는 tracr-Cas9, crRNA-코딩 어레이 (Sal7-3) 및 전달 기점 (oriT)을 함유한다.
요약
개념의 증거로서, 살모넬라 종으로 동원하기 전에, 접합 실험을 이.콜라이로부터 이.콜라이로 먼저 수행하였다. 플라스미드 pFSMobSal7 (클로람페니콜 내성, CmR)은 먼저 동원을 허용하는 담체 균주로 형질전환되었다. 본 실험에서, 선모를 생성한 균주는 이.콜라이 S17 (ATCC® 47055TM)이었다. 접합 기능은 염색체로 통합된 RP4 플라스미드에 의해 제공된다. 수용자 세포는 날리딕스산 내성 (25 μg/ml)이어야 하며, 여기서 이.콜라이 JM109 (ATCC® 53323TM)를 사용하였다. 표적화된 살모넬라는 살모넬라 종 컬렉션으로부터의 FS26이었다. 결과는 이.콜라이 S17로부터 이.콜라이 JM109로 및 이.콜라이 S17로부터 살모넬라 엔테리티디스 (FS26)로의 양호한 접합 효율을 나타내었다. 수용자로서 살모넬라로의 접합 후, pFSMob-3을 사용한 사멸은 효율적이었다.
도입
pFSmobSal7 플라스미드는 중간 카피 수 pZA31MCS (익스프레시스)로부터 유래되었다. tracr-Cas9 및 crRNA 어레이 단편 외에 어셈블리 방법에 의해 전달 기점 (OriT) 서열을 합성하고 (mob2라고 함) pZA31MCS에 클로닝하였다.
접합 실험을 시작하기 전에, 이.콜라이 S17 균주를 표준 프로토콜 (O'Challahan and Charbit, 1990)에 의해 전기-적격으로 만들었다. 그 후, 플라스미드 pFSMobsal7 및 pFSMobC*는 전기천공에 의해 이.콜라이 S17로 형질전환되고, 클로람페니콜 (Cm30, 30 μg/mL)에서 선택되었다.
pFSMobSal7 및 pFSMobC*는 필터 상의 교배 후 37℃에서 인큐베이션에 의해 공여자 이.콜라이 S17로부터 수용자 이.콜라이 JM109로 및 날리딕스산 내성 (NalR) 및 클로람페니콜 민감성 (CmS)인 살모넬라 종으로 동원되었다. 그 후, 혼합물을 Cm30, Nal25 및 Cm30+Nal25에 플레이팅하였다. 트랜스접합체는 이중 항생제 Cm30+ Nal25에서 선택되었다 (Phornphisutthimas et al., 2007).
접합 실험을 시작하기 전에, pFSMob 플라스미드의 사멸 효율이 먼저 살모넬라에서의 형질전환에 의해 시험되었다는 점에 주목한다.
방법론
재료:
· 공여자 균주: pFSMobSal7 / pFSMobC*로 형질전환된 이.콜라이 S17
· 수용자 균주: JM109 / 살모넬라 엔테리티디스 FS26
· 루리아 베르타니(Luria Bertani) 브로쓰 (LB) (제품 번호 L3522, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), LB Cm30 μg/ml
· LB 한천 1%의 플레이트
· LB 한천 1% Cm30 μg/ml의 플레이트
· LB 한천 1% NaL25 μg/ml의 플레이트
· LB 한천 1% Cm30+ NaL25의 플레이트
· 와트만(Whatman)® 멤브레인 필터 나일론, 기공 크기 0.45 μm 내지 1 μm, 직경 25 mm. 시그마-알드리치에 의해 공급된 참조 번호 28420770
실험 1 : 이.콜라이 S17로부터 이.콜라이 JM109로의 pFSMobC*의 동원
개념의 증거로서, 대조군 플라스미드 (pFSMobC*)를 함유하는 이.콜라이 S17로부터 이.콜라이 JM109로의 접합 실험을 먼저 수행하였다. 본 실험은 폰피수트히마스(Phornphisutthimas) (Phornphisutthimas et al., 2007)의 프로토콜을 따랐다:
1. LB +Cm30 중 본 발명자들의 컬렉션으로부터의 공여자 pFSMobC*(S17) 및 LB 브로쓰 중 수용자 균주 JM109의 배양물을 밤새 성장시킴.
2. 아침에 실험을 시작하기 전에 적어도 30분 동안 LB 한천 (1%)의 플레이트를 예열함
3. 하기와 같이 공여자 균주와 수용자를 1:1의 비율로 혼합함:
4. 50 μl의 pFSMobC*(S17)+ 50 μl의 JM109
5. 50 μl의 pFSMobC*(S17) + 50 μl의 LB
6. 50 μl의 LB + 50 μl의 JM109
7. 각 반응에 대해, 예열된 LB 한천 플레이트 (1%)의 상단에 필터 멤브레인 (0,45 μM 내지 1 μM)을 놓음
8. 필터 상에 각 교배 샘플을 로딩함
9. 플레이트를 진탕 없이 37℃에서 3시간 방치하면, LB는 흡수될 것이고, 박테리아는 필터 상에 체류해야 한다.
10. 인큐베이션 후, 각 필터를 1 ml LB 브로쓰를 갖는 범용 튜브에 넣고 잘 볼텍싱함
11. Cm30, Nal25 및 Cm30+ Nal25 상에 100 μl (및 연속 희석)를 플레이팅하고, O.N을 37℃에서 방치함.
Cm30의 플레이트는 공여자의 수를 제공한다. Nal25의 플레이트는 수용자의 수를 제공하고, Nal25+Cm30의 플레이트는 트랜스접합체의 수를 제공한다 (즉, 공여자로부터 수용자로 동원된 플라스미드). 공여자 및 수용자를 단독으로 갖는 플레이트 (교배 없음)는 음성 대조군이다.
결과
1) 37℃에서 18시간 후, 콜로니를 카운팅가능할 때 상이한 희석물에서 개별적으로 카운팅하고, 콜로니 수를 cfu/mL로 표현하였다. 예상된 바와 같이 음성 대조군 플레이트에서 콜로니가 회수되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 결과 (표 1)는 이. 콜라이 S17로부터의 이.콜라이 JM109로의 양호한 접합 효율을 보여준다.
Figure pct00001
표 1. 이. 콜라이 S17로부터 이.콜라이 JM109로의 pFSMobC*의 접합. 37℃에서 3시간 인큐베이션 후 필터 상의 교배로부터 수득된 결과. a: 모든 대조군이 점검되었다. b: 접합 효율은 공여자 세포당 트랜스접합체의 수이다.
2) 수용자 균주에서 pFSmobC* 플라스미드의 동원을 PCR에 의해 확인하였다.
프라이머 spCas9-6 정방향 (5'-ATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGC)(서열식별번호: 8) 및 mob2 역방향 (5'-GCCTCTAGCACGCGTACCATGGGAT) (서열식별번호: 9)을 50℃의 어닐링 온도와 함께 사용하였다. 트랜스접합체를 갖는 플레이트로부터의 2개의 콜로니를 PCR에 의해 시험하였다. 양성 대조군이 또한 포함되었다 (도 1).
결론 1:
이.콜라이로부터 이.콜라이로의 접합 실험은 양호한 동원 효율을 보여주었다. 이.콜라이 접합에 대한 추가 최적화 시험은 교배가 1:4의 비율로 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션될 때 더 높은 접합 효율을 보여주었다.
실험 2 : 이.콜라이 S17로부터 살모넬라 종으로의 pFSMobSal7의 접합
본 실험은 폰피수트히마스 (Phornphisutthimas et al., 2007) 및 일부 변형을 갖는 문헌 [Carraro et al., 2017]의 프로토콜을 따랐다:
1. LB +Cm30 중 본 발명자들의 컬렉션으로부터의 pFSMobSal7 (S17) 및 대조군 pFSMobC*(S17) 및 LB 브로쓰 중 수용자 균주 살모넬라 엔테리티디스 FS26의 배양물을 밤새 성장시킴.
2. 아침에 실험을 시작하기 전에 적어도 30분 동안 LB 한천 (1%)의 플레이트를 예열함
3. 하기와 같이 공여자 균주와 수용자를 1:4의 비율로 혼합함:
4. 100 μl의 pFSMobC*(S17)+ 400 μl의 살모넬라 FS26
5. 100 μl의 pFSMobSal7(S17)+ 400 μl의 살모넬라 FS26
6. 100 μl의 pFSMobC*(S17)+ 400 μl의 LB
7. 100 μl의 pFSMobSal7 (S17)+ 400 μl의 LB
8. 100 μl의 LB + 400 μl의 살모넬라
9. 2000xg에서 3분 동안 스핀함
10. 200 μl의 LB에 재현탁함
11. 2000xg에서 3분 동안 스핀함
12. 25 μl의 LB에 재현탁함
13. 각 반응에 대해, 예열된 LB 한천 플레이트 (1%)의 상단에 필터 멤브레인 (0,45 μM 내지 1 μM)을 놓음
14. 필터 상에 각 교배 샘플을 로딩함
15. 플레이트를 진탕 없이 37℃에서 6시간 방치하면, LB는 흡수될 것이고, 박테리아는 필터 상에 체류해야 한다.
16. 인큐베이션 후, 각 필터를 1 ml LB 브로쓰를 갖는 범용 튜브에 넣고 잘 볼텍싱함
17. Cm30, Nal25 및 Cm30+ Nal25 상에 100 μl (및 연속 희석)를 플레이팅하고, O.N을 37℃에서 방치함.
Cm30 플레이트의 플레이트는 공여자의 수를 제공한다. Nal25의 플레이트는 수용자의 수를 제공하고, Nal25+Cm30의 플레이트는 트랜스접합체의 수를 제공한다 (즉, 공여자로부터 수용자로 동원된 플라스미드).
결과
- 37℃에서 18시간 후, 콜로니를 희석 -3에서 개별적으로 카운팅하고, 콜로니 수를 cfu/mL로 표현하였다 (표 2). 예상된 바와 같이 음성 대조군 플레이트에서 콜로니가 회수되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음).
Figure pct00002
표 2: 이.콜라이 S17로부터 살모넬라 엔테리티디스 FS26으로의 pFSMob 플라스미드의 접합 실험 결과. 37℃에서 6시간 동안 필터의 교배로부터 수득된 결과.
- 플라스미드 대조군 pFSMobC*와 비교하여, 이들 데이터는 접합에 의해 표적 균주로 전달된 플라스미드 pFSMobSal7이 균주 살모넬라 엔테리티디스 (FS26)를 100% 제거할 수 있음을 보여준다 (도 2).
결론
연구는 접합이 이.콜라이 S17로부터 살모넬라 엔테리티디스 (FS26)로의 양호한 전달 방법이고, 접합에 의해 수용자에게 전달될 때 pFSMobSal7이 여전히 효율적으로 사멸시킨다는 것을 보여주었다. 접합은 살모넬라를 100% 제거 (사멸)할 수 있었다.
참고문헌
Carraro N, Durand R, Rivard N, Anquetil C, Barrette C, Humbert M, Burrus V. (2017). Salmonella genomic island 1 (SGI1) reshapes the mating apparatus of IncC conjugative plasmids to promote self-propagation. PLOS Gen.
O'Challahan D, Charbit A. (1990). High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation. Mol. Gen. Genet., 223;156-8.
Phornphisutthimas S, Thamchaipenet A, and Panijpan B. (2007). Conjugation in Escherichia coli. Biochem and Mol Bio Education Vol. 35, No. 6, 440-445
실시예 3: 살모넬라의 범-혈청형 접합 전달 및 사멸
연구 목적
본 연구의 목적은 접합에 의해 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형을 선택적으로 제거하는 pFSmobSal7 및 pFSmobSal3 플라스미드의 시험관내 능력을 시험하는 것이었다.
요약
살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카, 혈청형 티피뮤리움 (4), 엔테리티디스 (1), 비르효 (1), 몬테비데오 (1), 하이델베르크 (1), 하다르 (1), 빈자 (1), 브레데니 (1), 인판티스 (1), 켄터키 (1), 세프텐베르크 (1), 엠반다카 (1), 아나툼 (1), 아고나 (1) 및 더블린 (1)의 18개 균주를 본 발명자들의 살모넬라 종 컬렉션으로부터 선택하였다 (표 3). 두 가지 버전의 pFSmob 플라스미드, 즉 pFSmobSal7 및 pFSmobSal3, 두 가지 버전의 pFSmob 대조군 플라스미드, 즉 pFSmob-C* 및 pFSmob-C, 및 추가 대조군으로서 pZA31MCS (익스프레시스)로 박테리아를 적격으로 만들고 형질전환시켰다. 전기천공 및 37℃에서 SOC 생장 배지 (NEB, B90205, LOT-10019857)에서 2시간 인큐베이션 후, 원래 용액의 상이한 희석물을 클로람페니콜에 의해 보충된 1% LB 한천에 플레이팅하였다 (Cm30, 30μg/mL). 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 결과는 콜로니 형성 단위/mL (CFU/mL)로 해석되었다.
도입
pFSmobSal7 및 pFSmobSal3 플라스미드는 crRNA 어레이에 각각 7개의 표적 유전자 (pipA, pipB, pipC, hilA, sicP, mart, sopB) 및 3개의 표적 유전자 (pipC, hilA, mart)를 보유한다. pFSmobSal7 플라스미드로부터 유래된 양성 대조군 pFSmob-C를 사용하였으며, 특히 pFSmob-C는 crRNA 어레이를 함유하지 않는다. 중간 카피 수 pZA31MCS (익스프레시스)로부터 유래된 대조군 pFSmob-C를 추가 대조군으로서 사용하였다. 클로람페니콜에서 양성 콜로니의 선택을 수행하였다 (Cm30, 30μg/mL). 이전에 형질전환에 의해 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움, 엔테리티디스, 비르효, 몬테비데오, 하다르 및 빈자를 선택적으로 제거하는 pFSmobSal7의 시험관내 능력이 나타났다. 본 연구의 목적은 원치않는 박테리아를 선택적으로 제거하는 pFSmobSal7 및 pFSmobSal3 플라스미드 둘 다의 시험관내 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들의 컬렉션에 존재하는 모든 살모넬라 종 혈청형을 평가하는 것이었으며; 유의한 결과를 수집하기 위해, 18개의 상이한 혈청형을 본 발명자들의 컬렉션으로부터 선택하고 전기천공에 의해 시험하였다 (표 3). 플라스미드 pFSmob-C, pFSmob-C* 및 pZA31MCS (익스프레시스)를 대조군으로서 사용하였다.
방법론
박테리아 균주를 -80℃에서 유지된 동결 스톡으로부터 회수하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다 (Edwards and Ewing, 1986). EUCAST 임상 중단점 표에 따라 한천 희석 방법을 사용하여 Cm30 (30μg/mL)에 대한 감수성을 시험하였다. 오'찰라한(O'Challahan) 및 샤르비트(Charbit) 프로토콜 (O'Challahan and Charbit, 1990)을 사용하여 박테리아를 적격으로 만들었다. 모든 선택된 균주는 100ng의 pFSmobSal7, pFSmobSal3, pFSmob-C, pFSmob-C*, 및 pZA31MCS (익스프레시스)로 형질전환되었으며; 음성 대조군이 또한 포함되었다 (DNA가 첨가되지 않은 적격 세포) (표 4). 18시간 인큐베이션 후, 카운팅가능한 콜로니 (30 내지 300의 콜로니 수)를 mL당 콜로니 수로 표현하였다 (CFU/mL) (표 4).
Figure pct00003
표 3. 살모넬라 종 컬렉션. 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카, 혈청형 티피뮤리움 (4), 엔테리티디스 (1), 비르효 (1), 몬테비데오 (1), 하이델베르크 (1), 하다르 (1), 빈자 (1), 브레데니 (1), 인판티스 (1), 켄터키 (1), 세프텐베르크 (1), 엠반다카 (1), 아나툼 (1), 아고나 (1) 및 더블린 (1)의 18개 균주를 본 발명자들의 살모넬라 종 컬렉션으로부터 선택하였다.
결과
모든 선택된 박테리아는 EUCAST 중단점 (EUCAST, 2013)에 따라 Cm30에 감수성인 것으로 밝혀졌다. Cm30 (30μg/mL) (시그마)으로 보충된 LB 한천 플레이트 (피셔 바이오리에이전츠(Fisher Bioreagents), BP1425-500, LOT-171784) 상에 상이한 희석물 (희석되지 않음, 10-1, 10-2)의 전기천공 및 플레이팅 후, 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 박테리아는 Cm30 (30μg/mL) 한천 플레이트 상에서 성장할 때 형질전환된 것으로 간주되었다. 카운팅가능한 콜로니 (30 내지 300)는 CFU/ml로 표현되었다 (표 4). 예상된 바와 같이, 음성 대조군 플레이트에서 콜로니가 회수되지 않았다. 하나 (FS67, 에스. 더블린)를 제외한 모든 혈청형은 pZA31MCS (익스프레시스)로 효율적으로 형질전환되었다. 거의 모든 혈청형은 102 내지 106 CFU/mL의 콜로니 수를 갖는 2개의 대조군 플라스미드 (pFSmob-C* 및 pFSmob-C)로 효율적으로 형질전환되었다.
pFSmobSal7 및 pFSmobSal3과 관련하여, 모든 혈청형에서 사멸 효과가 발생하였고, 유사한 것으로 밝혀졌다. 대부분의 혈청형에서, 콜로니 수의 감소는 대조군 플라스미드로 형질전환된 것과 비교하여 상대적으로 분명하였다. 한 가지 균주 (FS38, 에스. 몬테비데오)를 제외하고는 pFSmobSal7 및 pFSmobSal3 사이에서 사멸 효과의 유의한 차이가 발견되지 않았다.
Figure pct00004
표 4. 18개의 살모넬라 종 혈청형의 형질전환. 18개의 살모넬라 종 혈청형은 pZA31MCS (익스프레시스), pFSmob-C*, pFSmob-C, pFSmobSal7 및 pFSmobSal3으로 형질전환되었다. 거의 모든 혈청형은 일부 예외를 제외하고는 pZA31MCS (익스프레시스), pFSmob-C* 및 pFSmob-C로 효율적으로 형질전환되었다. pFSmobSal7 및 pFSmobSal3을 사용한 형질전환에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 균주 FS67, 에스. 더블린은 본 연구에 사용된 모든 플라스미드로 형질전환가능하지 않은 것 (NT*)으로 밝혀졌다.
결론
본 실험에서 사용된 모든 살모넬라 종 혈청형은 효율적으로 적격으로 만들어지고, 대조군으로서 사용된 pZA31MCS (익스프레시스), pFSmob-C 및 pFSmob-C*로 형질전환되었다. 살모넬라 티피뮤리움 혈청형은 이전에 관찰된 바와 같이 pFSmob-C*에 의해 항상 형질전환가능한 것은 아닌 것으로 보인다. 보다 일반적으로, 본 연구에서 사용된 2개의 pFSmob-유래 대조군 플라스미드 사이에서 특정 차이가 발생하지 않았다 (102 내지 106 CFU/mL). 한편, pFSmobSal7 및 pFSmobSal3의 사멸 효과는 유사한 것으로 밝혀졌다 (101 내지 103). 결론적으로, 본 연구에서, pFSmobSal7 및 pFSmobSal3이 대조군 플라스미드와 비교하여 상이한 살모넬라 종 혈청형을 선택적으로 제거할 수 있음이 입증되었다.
참고문헌
Edwards PR, Ewing WH. (1986). Identification of Enterobateriaceae (4th ed.). Elsevier, New York.
EUCAST, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. (2013). Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Available at: http://www.eucast.org (last accessed August 16, 2013., Version 3.1.
O'ChallahanD, Charbit A.(1990). High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation. Mol. Gen. Genet., 223;156-8.
실시예 4: 닭의 사료 전환율 개선. 조합된 제2 2주 효능, 2주 안전성 및 6주 생산성 시험.
연구 목적
· 6주에 걸쳐 닭의 건강, 복지 및 생산성에 대한 항박테리아 접합성 플라스미드 (pFSmobSal7)의 효과를 결정하기 위해.
방법론
로스(Ross) 308 조류를 제어된 생물학적 보안 조건 하에 수용하였고, 물 및 표준 상업적 배급을 임의 제공하였다.
조류는 하기 중 하나를 지속적으로 투여받았다:
1. 물에 첨가 없음 (60마리 조류)
2. 균주 S17 @ 108 cfu/ml 식수 (30마리 조류)
3. pFSmob-C*를 함유하는 균주 S17 @ 108 cfu/ml 식수 (30마리 조류)
4. pFSmobSal7을 함유하는 균주 S17 @ 108 cfu/ml 식수 (60마리 조류)
5. pFSmobSal7을 함유하는 균주 S17 @ 109 cfu/ml 식수 (30마리 조류)
6. pFSmobSal7을 함유하는 균주 S17 @ 1010 cfu/ml 식수 (30마리 조류)
박테리아 균주를 -78℃에서 유지된 동결 스톡으로부터 회수하고, 37℃에서 24시간 동안 LB 한천 상에서 배양하였다. 37℃에서 16시간 동안 180 rpm에서 진탕하면서 플라스미드의 손실을 방지하기 위해 항생제를 함유하는 LB 브로쓰에서 매일 배양물을 제조한 후, 4000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 배지를 제거하고, 펠릿을 PBS에 재현탁한 후, PBS에 희석하여 닭에 투여하기 위한 용액을 제공하였다.
동시에, 30마리 조류 그룹은 1일차에 0.5 ml 105CFU/mL 살모넬라 엔테리티디스 균주 FS26 (폴리움(Folium))을 경구로 투여받았다. ISO 6759 방법 (1)을 사용하여 배설강 면봉에 의해 실험 3일차에 살모넬라 콜로니화에 대해 조류를 점검하였다. 실험 5일차에, 이들 확인된 살모넬라-콜로니화된 조류 (시더 조류) 중 3마리를 마킹하고, 그룹 1-6 각각에 첨가하였다. 조류를 매주 중량 측정하고, 사료 소비 및 사망률을 기록하였다.
각 그룹으로부터의 15마리 조류를 12일차 및 19일차 (시더 조류와 혼합 후 7일 및 14일)에 안락사시켰다. ISO 6759에 의한 살모넬라에 대한 검사를 위해 맹장을 제거하였다. 비절 및 패드 마크를 기록하였다. 1g 간 및 맹장 내용물의 샘플을 급속 동결하였다.
그 후, 그룹 1 및 4 각각으로부터의 30마리 조류를 안락사되는 42일차까지 매주 행동 및 중량에 대해 모니터링하고, 상기 조류와 같이 검사하였다.
결과는 종이에 기록되거나, 생물학적 보안 시설에서 전화 또는 라디오를 통해 구술되고 마이크로소프트 엑셀™로 전사되었다. 데이터 변환의 목적을 위해, 박테리아가 검출되지 않은 조류에 g당 1 박테리아 카운트가 할당되었다. 카운트 및 중량을 로그 변환하고, 그래프패드 프리즘™을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 데이터를 다고스티노(D'Agostino) 및 피어슨(Pearson) 옴니버스 정규성 검정을 사용하여 분포의 정규성에 대해 평가하였고, 비정규로서 던(Dunn)의 다중 비교 사후 검정과 함께 크루스칼-왈리스(Kruskall-Wallis) 검정을 사용하여 분석하였다. 조류 비율의 차이를 피셔(Fisher)의 정확 검정을 사용하여 분석하였다.
결과
모든 시더 조류는 3일차까지 살모넬라로 콜로니화되었다. 시험 그룹에서 감염을 시딩하는데 사용된 것들은 >105 cfu/g 분변의 카운트를 가졌다.
7일차에, 그룹당 15마리의 조류를 안락사시키고, 맹장 내 살모넬라를 열거하였다 (도 3). 도 4는 살모넬라에 대해 양성/음성인 조류를 나타낸 데이터를 보여준다.
S17-pFSmobSal7 (최저 용량) 및 pFSmob-C*를 투여받은 조류는 대조군보다 맹장 내 살모넬라의 수를 유의하게 저하시켰고 (도 3), 시더 조류와 혼합 후 7일차에 맹장 내 검출가능한 살모넬라를 가질 가능성이 유의하게 낮았다.
어떠한 그룹에서도 사망률이 보이지 않았고; 이환율이 관찰되지 않았고, 높은 투여량의 S17-mobSal7이 잘 관용되었다. 조류는 양성 및 음성 행동에 대해 스코어링되었지만, 그룹 사이에 차이가 보이지 않았다.
그룹 1 및 4 각각으로부터의 30마리 조류를 42일령까지 추가로 모니터링하였다. 이 기간 동안 다시, 행동의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 그룹 사이의 사료 소비는 유의하게 상이하지 않았고, 중량은 생활에서 측정된 그룹 사이에 유의하게 상이하지 않았다. 사후에 살모넬라는 맹장에서 직접 카운트에 의해 검출가능하지 않았고; 비절 또는 패드 마크가 관찰되지 않았다. S17-pFSmobSal7 그룹에서 조류의 중위수 사체 중량은 대조군에서보다 205 g 더 컸으며, 이는 유의한 증가였다 (도 5). 이는 그룹 사이에 동등한 사료 소비와 연관되었기 때문에, S17-pFSmobSal7 그룹은 유의하게 개선된 사료 전환율 (FCR)을 가졌다.
참고문헌
ISO. 2007. ISO 6579:2007: Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp. (ISO 6579:2002+Amd 1:2007). Geneva, Switzerland
실시예 5: 조건부 필수 유전자 마커를 갖는 비복제성 접합성 플라스미드
규제 요건을 충족시키기 위해, 사용된 임의의 플라스미드는 바람직하게는 항생제 선택 마커가 결여되어 있을 것이고, 숙주 세포 (즉, 담체 세포)를 제외한 대다수의 세포 (전부는 아닐지라도)에서 비복제성일 것이다. 플라스미드에 비복제성을 부여하기 위해, 상당히 낮은 카피 수 플라스미드인 광범위한 숙주 범위 플라스미드 RK2의 복제 시스템을 활용할 것이다. RK2 복제는 RK2 상의 trfA에 의해 코딩된 TrfA 복제 단백질의 존재, 및 플라스미드의 무성생식 기원 (oriV)에 대한 TrfA의 결합에 의존하고, 복제 개시를 위해 숙주 기구를 활용하지 않는다. 플라스미드로부터 trfA의 물리적 분리 및 이 유전자의 염색체로의 혼입은 RK2 oriV를 보유한 생성된 플라스미드를 숙주 코딩된 기능에 의존하게 만들 것이다. 이는 플라스미드가 접합을 통한 전달 후 표적 균주에서 활발히 복제하는 것을 방지할 것이다. trfA를 제공할 표적 세포에 동일한 IncP 플라스미드가 존재하는 드문 경우에, 두 플라스미드 둘 다는 이용가능한 TrfA에 대해 경쟁하여 하나의 플라스미드의 손실을 초래할 것이다. 이 실시예에서 본 발명자들의 플라스미드는 유리한 항생제 내성 마커 또는 이와 유사한 것을 더 이상 보유하지 않고 플라스미드 중독 시스템이 결여되기 때문에, 자손에서 빠르게 손실될 것이다.
항생제 내성의 부재 하에 선택 마커로서, 방향족 아미노산의 생합성 경로에 있는 효소를 코딩하는 aroA 유전자가 사용될 것이다. 이는 aroA에 의해 촉매되는 반응으로부터의 중간체 또는 이용가능한 방향족 아미노산의 부재 하에 숙주 세포가 성장될 때 필수적인 조건부 필수 유전자이다. aroA 유전자를 숙주 게놈으로부터 플라스미드 백본으로 이동시키는 것은 이 선택 마커를 제공할 것이다. 염색체의 aroA 유전자는 숙주 (담체 세포) 균주에서 trfA 카피에 의해 대체될 것이다.
이. 콜라이 lab 균주 DH10B에서 trfA 발현 카세트에 의한 aroA 녹아웃 및 염색체 카피의 대체는 플라스미드를 시험하기 위한 박테리아의 시험 균주를 생성하기 위해 만들어질 것이다. 사용될 trfA 발현 카세트는 서열식별번호: 10의 서열을 갖는다.
닭으로부터 단리된 공생 이. 콜라이인 최종 숙주 (담체) 균주는 동일한 균주 구축 절차를 거칠 것이다.
aroA 코딩 서열 (서열식별번호: 11)은 유사한 프로모터 및 종결인자 영역으로 증폭되고, RK2의 Cas9, tracrRNA, crRNA 및 oriV에 대한 모듈과 함께 플라스미드로 어셈블리될 것이다.
또한, 대안적인 모듈은 표적 세포로의 전달 후 DNA 안정성을 개선시키기 위해 이 플라스미드 구성, 예컨대 유형 I 제한 효소를 억제하는 항-제한 유전자 (T7의 ocr, RK2의 klcA, 접합성 플라스미드/트랜스포존으로부터의 ardA, 접합성 플라스미드로부터의 ardB)에서 시험될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 접합을 위해 존재하는 유형 IV 분비 시스템의 필수 부분을 코딩하는 모듈은 플라스미드 상에 위치할 것이며, 이는 플라스미드가 존재하지 않는 경우 세포에 존재하는 비기능적 전달 시스템으로 이어질 것이기 때문이다. 숙주 세포에 의한 접합을 용이하게 하기 위해, 플라스미드 RK2 상에 존재하는 유형 IV 분비 시스템은 숙주 게놈로 통합되어야 할 것이다. 이 시스템의 필수 성분은 플라스미드의 두 위치인 tra1 및 tra2 상의 3개의 오페론 내에서 코딩된다. Tra1은 traKLM 및 traJXIHGF 오페론을 코딩하고, tra2는 trbBCEFGHJL 유전자를 코딩한다. 통합 프로세스 동안, traKLM 및 traJXIHGF 오페론 사이에 위치된 tra1에 존재하는 조절 영역이 변형될 것이다. 이 서열은 DNA의 전달 개시를 담당하는 TraJ 단백질에 대한 결합 부위를 보유하는 전달 기점 (oriT)을 함유한다. TraJ 결합을 방지하기 위해 돌연변이유발에 의해 이 결합 부위가 변경되지 않으면, 접합 프로세스 동안 염색체 DNA 단편의 전달이 개시되어, 원치않는 유전 정보의 전달을 유발할 것이다.
사용될 RK2 tra1 및 tra2 모듈의 서열은 서열식별번호 13 및 14에 있다.
실시예 6 : 항-살모넬라 플라스미드 구축 & 시험
요약
이. 콜라이 K12 (MG1655)로부터의 유형 I-E Cas 시스템은 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문형 반복부 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat; CRISPR) 및 CRISPR-연관 단백질 시스템 (CRISPR-Cas)로 공지된 RNA 가이드-지정 DNase 기구이며, 이는 분해를 위해 침입 외래 유전 물질을 표적화하는 원핵생물을 위한 적응 면역 시스템을 나타낸다. 에스케리키아 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 시스템은 상이한 Cas 단백질 (casABCDE12 및 cas3)로 구성되고, 다양한 정도의 효능으로 다양한 PAM 서열을 인식한다. 주요 PAM 서열은 5'-AAG, AGG, ATG, GAG-3'이다. 살모넬라 종을 선택적으로 제거하기 위해 이. 콜라이 K12로부터의 유형 I-E Cas 시스템을 사용하였다. 시스템은 이. 콜라이 MG1655에서와 같이 변형되었으며, cas 단백질 복합체의 주요 성분은 두 가지 전사 단위, cas3 및 casABCDE12로부터 각각 발현된다. 플라스미드 구축 프로세스 동안 도입된 변형은 casABCDE 오페론의 천연 조절된 프로모터 요소를 구성적 J23114 프로모터로 교환하고, cas1 및 cas2 유전자를 그의 천연 리보솜 결합 부위를 포함하는 cas3 유전자로 대체하는 것을 포함하였다. 이들 변화는 사실상 살모넬라 종의 특이적 표적화를 위한 crRNA 어레이의 첨가에 의해 기능성에 대해 후속적으로 시험된 구성적으로 발현된 CRISPR-Cas 모듈을 생성하였다.
두 가지 버전의 가이드된 바이오틱(Biotic)® 플라스미드는 복제 기점 (oriV) 및 항생제 선택 마커가 상이하게 구축되었다. 생성된 플라스미드는 pFS-Sal-08-rm 및 pFS-Sal-09-rm으로 명명되었고, 접합 DNA 전달에 의해 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 엔테리티디스의 성장을 선택적으로 억제하기 위해 시험관내에서 시험되었다. 접합 실험에서, pFS-EcoCas3-01-rm 및 pFS-EcoCas3-03-rm은 살모넬라-특이적 성장 억제에 대한 대조군 플라스미드로서 사용되었다.
플라스미드가 구축되었으며, 각각은 유형 I-E 이 콜라이 Cas3 및 동족 casA, B, C, D 및 E를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; Cas3으로 작동가능하고 에스 엔테리카의 invB 유전자의 서열에 상보적인 제1 스페이서, 에스 엔테리카의 sicP 유전자의 서열에 상보적인 제2 스페이서, 및 에스 엔테리카의 sseE 유전자의 서열에 상보적인 제3 스페이서를 포함하는 CRISPR 어레이; RP4 oriT; p15A ori; 이 콜라이 proA 유전자; 및 이 콜라이 proB 유전자를 포함한다. 보다 세부사항에 대해서는 표 7을 참조한다.
방법론
crRNA 어레이 설계
CRISPR 스페이서를 설계하기 위한 표적 유전자 선택은 살모넬라에 대한 주요 균력 인자인 살모넬라-특이적 병원성 섬 (SPI)에 초점을 맞추었다. 선택 기준은 살모넬라 엔테리카 내 보존 및 낮은 내지 매우 낮은 발생 및 다른 박테리아의 각 유전자의 보존이었다. 이들 분석을 기본 국소 정렬 검색 도구 (Basic Local Alignment Search Tool; BLAST)를 사용하여 수행하였다. 비-살모넬라 종의 히트 수에 대한 컷오프는 1000으로 설정되었다. 보존 수준은 검색이 >1000 히트를 생성한 경우 높은 것으로 간주되었다. 100 내지 1000은 중간, 20 내지 100은 낮음, <20 히트인 경우 매우 낮음이었다. 구체적으로, SPI-1 및 SPI-2의 유형 III 단백질 분비 시스템, T3SS와 연관된 유전자를 표적으로 탐색하였으며, 살모넬라 종에 걸쳐 보존된 유전자 후보를 포함하지만 다른 박테리아 종에 걸쳐 보존된 것들을 배제한다. 초기에, 검색은 T3SS의 조절인자 및 기능적 성분을 회피하는 분비된 이펙터 및 샤페론에 초점을 맞추었다.
3개의 선택된 고도로 보존된 유전자 표적 sicP, invB 및 sseE는 모두 살모넬라 병원성 섬 (SPI), sicP 및 invB (둘 다 샤페론)의 경우 SPI-1 및 sseE (분비된 이펙터)의 경우 SPI-2에 의해 코딩된 T3SS 로커스의 부분이다. 그들은 모두 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 str. LT2에서 오직 하나의 카피에서 발생하고, 이는 모든 살모넬라 엔테리카에 대한 사례이지만, 일부 균주에서 이들의 중복을 제외할 수 없다.
살모넬라에 특이적인지 확인하고 오프타겟을 최소화하기 위해 후보 표적 유전자 (a) 및 후속적으로 스페이서 (b)를 Blast에서 검색하였다. 대략 10600개의 살모넬라 엔테리카 게놈을 함유하는 RefSeq 데이터베이스를 사용하여 검색을 수행하였다:
a) 유전자 선택에 대한 Blast 검색 파라미터:
- 살모넬라 보존: 살모넬라 엔테리카 (taxid:28901)로 제한된 RefSeq DB, megablast, 최대 히트: 20000, 표준 파라미터
- 살모넬라 외부 발생: 살모넬라 (taxid:590)를 배제한 박테리아 (taxid:2)로 제한된 RefSeq DB, Blastn, 최대 히트 1000, 표준 파라미터
b) 스페이서 서열에 대한 Blast 검색 파라미터 (PAM 포함):
- 살모넬라 보존: 살모넬라 엔테리카 (taxid:28901)로 제한된 RefSeq DB, blastn, 최대 히트:20000, 표준 파라미터
- 살모넬라 외부 발생: 살모넬라 엔테리카 (taxid:28901)를 배제한 박테리아 (taxid:2)로 제한된 RefSeq DB, Blastn, 최대 히트 1000, 표준 파라미터, 그러나 값이 100으로 설정되어 낮지만 여전히 유의한 상동성을 갖는 서열을 잡을 것으로 예상됨
상이한 살모넬라 엔테리카 유전자를 표적화하는 다수의 스페이서를 초기에 인실리코에서 스크리닝하고, 선택하고, 클로닝하고, 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 엔테리티디스 FS26을 표적화하는 이들의 효능에 대해 시험관내에서 개별적으로 시험하였다 (표적 유전자 및 스페이서 선택 및 Rep-21: 스페이서 리포터 시스템의 구축 및 시험관내 시험에 대한 요약 참조). 살모넬라 종에 대해 활성인 3개의 최선의 성능 스페이서 서열을 선택하고, 짧은 crRNA 어레이로 조합하였다.
스페이서 서열은 살모넬라 병원성 섬 (SPI)에 존재하는 3개의 고도로 보존된 유전자인 invB, sicP 및 sseE로부터 유래되었다. 간단히 말해서, DNA 제한을 개시할 수 있는 강한 컨센서스 5'-PAM 서열의 존재를 특징으로 하는 제한된 잠재적 스페이서 서열을 선택하고, 효율적인 표적 DNA 제한, 살모넬라 단리주 내의 보존 및 살모넬라 엔테리카 외부의 DNA 상동성의 결여와 연관된 서열 특징에 따라 순위를 매겼다. 이들 기준을 충족하는 3개의 스페이서 서열이 최종적으로 선택되고 기능적 crRNA 어레이에 혼입되었다. 완성된 crRNA 어레이는 표준 클로닝 플라스미드 (진아트(GeneArt), 써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific))에 삽입된 합성 유전자 서열로 주문되었다.
선택된 유전자의 서열은 서열식별번호: 20-22에 표시된다. 각 유전자에서, 스페이서는 볼드체로 강조 표시되고, 각각의 PAM은 이탤릭체로 강조 표시된다 (invB의 경우, 스페이서는 음성 DNA 가닥 (안티센스)에서 선택되어 PAM이 스페이서에 대한 3'에 표시되었음). 스페이서 선택을 위해 사용된 PAM 서열은 AAG, ATG, AGG 및 GAG였다. 각각의 PAM을 갖는 스페이서에 대한 Blast 검색을 수행하였다 (표 10).
비-살모넬라 히트를 보존 수준에 대해 추가로 분석하였다 (오프타겟의 보존 수준이 <75%일 때 허용된 스페이서). 서열 선택은 또한 미스매치가 오프타겟 히트에서 어디에 위치했는지에 따라 달라지며, 보존된 PAM 및 종자 (스페이서의 첫 번째 8pb)를 보여주는 것을 제외하였다. 본 발명자들의 선택에 대한 한 가지 추가 기준은 또한 히트가 존재하는 박테리아 유형을 포함하였으며, 병원체에 존재하는 경우, 스페이서는 여전히 가능한 후보로서 간주되었다.
각 스페이서는 플라스미드 pFS-Sal-09-rm에 존재하는 어레이에서 함께 조합하기 전에 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 엔테리티디스 FS26을 표적화하는 효능에 대해 시험관내에서 개별적으로 시험되었다.
플라스미드 어셈블리
상동성-기반 DNA 어셈블리의 경우, 개별 DNA 모듈은 인접한 모듈과 정확한 상동성을 갖는 5' 및/또는 3' 연장을 수행하였다. 연장은 모듈의 PCR 증폭 단계 동안 도입되었거나, 합성 DNA 모듈의 설계 동안 혼입되었다. 구성적 J23114 프로모터가 도입되었다.
CasA-E : 4464 bp casA-casB-casC-casD-casE 모듈이 이. 콜라이 K12 (MG1655) 게놈 DNA로부터 증폭되었다.
Cas3 : 2709 bp Cas3 모듈이 증폭되었다.
crRNA : crRNA 어레이 모듈 Sal-crRNA 1 (546 bp)은 Cas3 모듈의 3'-말단으로의 25 bp 상동성 연장을 수행한다. Sal-crRNA 어레이1의 서열은 서열식별번호: 15에 표시되며, 프로모터의 -10 영역은 이탤릭체로, 직접 반복부는 밑줄로, 및 invB, sicP 및 seeE의 선택된 살모넬라 표적 서열에 상응하는 스페이서 영역은 볼드체로 표시된다.
접합에 의한 pFS-Sal-08-rm 및 pFS-Sal-09-rm 검증 및 시험관내 시험
구축물 둘 다의 서열을 확인한 후, Sal-crRNA 어레이 1의 존재 하에 살모넬라를 선택적으로 사멸시키는 Cas3 시스템의 효능을 평가하기 위해, 플라스미드를 접합을 통한 플라스미드 동원을 허용한 담체 균주에 형질전환시켰다. 본 연구에서, 이. 콜라이 균주 S17-1 ΔTn7을 사용하였다. 100 ng의 pFS-Sal-08-rm 및 pFS-Sal-09-rm을 전기천공에 의한 이. 콜라이 S17-1 ΔTn7의 50 μl 전기적격 세포의 형질전환에 사용하고, 각각 카나마이신 및 클로람페니콜에서 선택하였다. 플라스미드 둘 다를 사용한 형질전환은 이. 콜라이 S17-1 ΔTN7의 양호한 형질전환 효율을 초래하였다 (105 -106 형질전환된 CFU/mL). crRNA 어레이가 결여된 대조군 플라스미드, pFS-EcoCas3-01-rm 및 pFS-EcoCas3-03은 또한 pFS-Sal-09-rm 및 pFS-Sal-08-rm에 대한 FS26 형질전환에서 대조군으로서 사용되는 S17-1 ΔTn7 담체 균주에서 형질전환되었다. 새로운 플라스미드의 동원 능력을 확인하기 위해, S17-1 담체 세포를 먼저 사용하여 이. 콜라이 JM109 세포 (날리딕스산, Nal, 내성)를 접합하였다. 표 8에 보고된 결과는 이. 콜라이 JM109에서 pFS-EcoCas3-01과 pFS-Sal-09-rm 사이 및 pFS-EcoCas3-03과 pFS-Sal-08-rm 사이에서 유사한 접합 효율을 보여준다. 접합 효율은 트랜스접합체 (이중 항생제를 갖는 플레이트에서 선택됨)의 수 (CFU/mL)를 수용자 (Nal을 갖는 플레이트에서 선택됨)의 수로 나눔으로써 계산된다.
후속적으로, 이전에 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 담체 균주 S17-1 ΔTn7을 사용하여, 대조군 플라스미드 pFS-EcoCas3-03-rm과 비교하여 pFS-Sal-08-rm의 접합 및 pFS-EcoCas3-01-rm과 비교하여 pFS-Sal-09-rm의 접합에 의해 살모넬라 엔테리티디스 FS26의 유의한 성장 억제가 있는지 여부를 평가하였다. 이. 콜라이 S17-1 ΔTn7로부터 날리딕스산 (Nal) 내성 살모넬라 엔테리티디스 FS26으로의 접합을 수행하였다. 결과는 각각의 대조군 플라스미드와 비교하여 pFS-Sal-08-rm 및 pFS-Sal-09-rm 둘 다와 접합된 에스. 엔테리티디스 균주 FS26의 유의한 감소 (CFU/mL)를 보여주었다 (표 9).
결론적으로, 본 연구에서 생성된 Sal-crRNA 어레이 1을 보유한 플라스미드 둘 다에 의한 살모넬라 성장의 억제는 변형된 Cas 모듈이 기능적이고, 비표적 이. 콜라이 숙주 균주 S17-1 및 JM109의 성장에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 유형 I-E 캐스케이드 복합체, Cas3 뉴클레아제 및 crRNA 어레이의 개별 성분 모두를 발현할 수 있었음을 나타내었다. 이. 콜라이 S17-1 담체 균주로부터 에스. 엔테리티디스 균주 FS26으로의 접합에 의해 전달되는 이. 콜라이 유형 I-E Cas 시스템-기반 플라스미드의 능력을 입증하였다. 사용된 대조군과 비교하여 pFS-Sal-08-rm 및 pFS-Sal-09-rm 둘 다의 접합을 통해 선택된 균주의 살모넬라 트랜스접합체에서 성장의 유의한 억제 (>99.9%)를 관찰하였다. 따라서, 이들 데이터는 원치않는 박테리아의 제거, 예컨대 인수공통전염성 통제를 위한 이들 이. 콜라이 유형 I-E 캐스케이드 기반 구축물의 잠재성을 강조 표시하였다.
실시예 7: 살모넬라를 함유한 식이로 사육된 닭에서 폴리움 이. 콜라이-기반 산물의 안정성 및 효능의 시험
실시예 4에서, S17 균주의 이 콜라이 담체 세포에 함유된 가이드된 바이오틱® 플라스미드를 시험하였다. 본 실시예 7에서, 이 콜라이 담체의 상이한 균주 (균주 X)에 함유된 가이드된 바이오틱® 플라스미드 (GB 플라스미드 pFS-Sal-09-proAB-rm, 실시예 6 & 표 7)를 대신 시험하였다. 헬퍼 플라스미드 pCon_aroA는 플라스미드 RP4 (traJXIHGF-traKLM-trbBCDEFGHIJKL)의 접합 기구의 기능적 카피를 보유하였으며, 이는 시험관내에서 숙주 세포로부터 수용자 세포로의 oriT-함유 플라스미드의 동원을 촉진하는 것으로 밝혀졌다.
연구 목적
· 24시간에 걸쳐 식수에서 가이드된 바이오틱®을 사용한 이. 콜라이 균주 X의 안정성을 결정하기 위해.
· 사료로 제공된 살모넬라에 의한 장 및 장기 오염을 열거하기 위해.
· 사료 내에서 살모넬라에 챌린지된 닭에서 활성 GB 플라스미드를 함유한 이. 콜라이 균주 X의 효능을 결정하기 위해.
요약
· 이. 콜라이 균주 X는 안정화제를 함유한 탈이온수에 투여 직후 5 x log-8 CFU/mL의 예상 수준에서 발견되었으며, 24시간 후에 8 x log-7 CFU/mL로 강하되었다.
· 24시간 동안 사료 (104 CFU/g 사료)에서 챌린지 후, 낮은 수준 (~log-2-5 CFU/g)의 살모넬라가 챌린지 후 1, 3 및 7일차에 소낭 및 맹장에서 발견되었다. 더 낮은 수준 (~log-1 CFU/g)이 또한 챌린지 후 7일에 회장 내용물, 간 및 비장에서 발견되었다.
· 활성 GB 플라스미드를 함유한 활성 가이드된 바이오틱®, 이. 콜라이 균주 X는 챌린지 후 7일에 소낭에서 살모넬라 카운트를 ~log-1 CFU/g만큼 감소시켰다 (P<0.03).
방법론
로스 308 조류 (30마리)를 제어된 생물학적 보안 조건 하에 수용하였고, 물 및 표준 상업적 배급을 임의 제공하였다. 각 실험 그룹은 나무 대패질 침구가 있는 별도의 펜에서 유지되었다. 조류는 18시간 밝은 / 6시간 어두운 조명 체제를 가졌다. 온도 및 습도는 표 11에 표시된 표준 수준 사이에서 유지되었다.
치료 그룹:
· 낮은 제어 - 물에 첨가 없음, 7일차에 24시간 동안 사료 그램당 104 CFU 살모넬라 (15마리의 조류)
· GB-Sal - 1-14일차로부터 식수에 활성 GB 플라스미드 (pFS-Sal-09-proAB-rm)를 108 CFU/mL으로 함유하는 이. 콜라이 균주 X 가이드된 바이오틱®, 7일차에 24시간 동안 사료 그램당 104 CFU 살모넬라 (15마리의 조류)
가이드된 바이오틱® 균주를 -78℃에서 유지된 동결 스톡으로부터 매일 회수하고, LB 한천 + 클로람페니콜 (30μg/mL)에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 활성 GB 플라스미드 균주를 갖는 균주 X를 37℃에서 16시간 동안 180 rpm에서 진탕하면서 성장된 테리픽(Terrific) 브로쓰에서 제조하였다. 세포 수를 추정하기 위해 OD600을 측정한 후, 세포를 원심분리하고, 안정화제를 함유하는 탈이온수에 재현탁하여 닭에게 투여하기 위한 용액을 제공하였다 (식수 중 108CFU/mL). 물 및 GB 섭취를 확인하기 위해 샘플링일에 수집 3시간 전에 청색 염료를 함유하는 백 팩(Vac Pac)을 포함시켰다. 보충된 물 샘플은 GB에 대한 열거를 위해 시험의 4-14일차에 GB 첨가시 및 24시간 후에 수집되었다. 물 샘플을 PBS에 10진수로 희석한 후, 맥콘키(MacConkey) 한천 번호 3 (옥소이드(Oxoid) CM0115)에 플레이팅한 다음, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
살모넬라 균주 (FS26, 날리딕스산 마커 포함)를 -78℃에서 유지된 동결 스톡으로부터 회수하고, LB 한천에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 시험 배양물을 37℃에서 16시간 동안 180 rpm에서 진탕하면서 성장된 LB 브로쓰에서 매일 제조하였다. 세포 수를 추정하기 위해 OD600을 측정한 후, 세포를 원심분리하고, 포스페이트-완충된 염수에 재현탁 및 희석하여 1x107 CFU/ml의 용액을 제공하였으며, 이를 사료를 완전히 혼합하면서 100 g 사료에 대해 1 ml 박테리아 현탁액의 비율로 사료에 떨어뜨렸다. 살모넬라 함량의 열거를 위해 4개의 사료 샘플을 수집하였다.
동물 샘플 수집 및 플레이팅
조류 사망률은 기록되지 않았다. 조명 수준, 침구 추가, 온도, 습도 및 스톡킹 밀도가 기록되었으며, 처리 사이에 상이하지 않았다. 1 & 3일차에 각 그룹으로부터의 3마리의 조류 및 챌린지 후 7일차에 9마리의 조류를 안락사시키고, 소낭, 회장, 맹장, 간 및 비장에서 샘플을 취하였다. 안락사, 사후 및 해부 시간이 기록되었다. 깃털을 물로 분무하여 적셨다. 조류를 일회용 메스로 열고, 이를 개봉 후 폐기하고 글로브를 교체하였다. 1g 간 및 소낭, 회장 및 맹장 내용물의 샘플을 취하고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 각 장기를 채취할 때 메스를 폐기하였다. 샘플을 9 부피의 포스페이트-완충된 염수로 균질화하고, 포스페이트-완충된 염수에 10진수로 희석하고, 37℃에서 16-18시간 동안 인큐베이션된 한천으로 검사하였다. 직접 플레이팅에서 음성인 샘플을 37℃에서 16-18시간 동안 9 부피의 셀레나이트 시스틴 브로쓰 (옥소이드 CM0699)에서 농축에 의해 살모넬라에 대해 검사하였다. 농축된 브로쓰를 후속적으로 표 12와 같이 항생제를 함유하는 XLD 한천 (CM0469)에 스트리킹하고, 37℃에서 16-18시간 동안 인큐베이션하였다.
직접 카운트에서 박테리아가 검출되지 않은 조류에는 g당 0 박테리아 카운트가 할당된 반면, 직접 카운트에서 음성이지만 증진된 방법에서 양성인 조류에는 50 CFU/g이 할당되었다. 결과는 종이에 기록되거나, 생물학적 보안 시설에서 전화 또는 라디오를 통해 구술되고 마이크로소프트 엑셀로 전사되었다. 데이터를 그래프패드 프리즘에서 분석하였다. 데이터를 다고스티노 및 피어슨 옴니버스 정규성 검정을 사용하여 분포의 정규성에 대해 평가하였고, 비정규로서 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 사용하여 분석하였다. 쌍체 T-검정을 사용하여 쌍체 데이터를 분석하였다.
결과
1. 사료 내 살모넬라
· 사료 내 살모넬라의 존재 (평균 9 x log-4 CFU/g)는 예상된 바와 같았다.
2. 식수 내 가이드된 바이오틱® 수준
· 혼합 직후 식수 내 분석된 GB 수준 (평균 5 x log-8 CFU/mL)은 계획된 바와 같았다. 24시간 후에 채취된 샘플은 평균 8 x log-7 CFU/mL로의 강하를 확인하였다.
3. 살모넬라 용량의 효과
· 전반적으로, 챌린지 후 1 및 3일차에 소낭 (~log 1-3 CFU/g) 및 맹장 (~log 4-5 CFU/g)에서 낮은 수준의 살모넬라가 발견되었다. 이 시간에 회장, 간 또는 비장 샘플에서 살모넬라가 발견되지 않았다.
· 챌린지 후 7일차에 소낭 및 맹장에서 유사한 수준의 살모넬라가 다시 발견되었고, 뿐만 아니라 회장, 간 및 비장에서 더 낮은 수준 (~log 1)이 발견되었다.
4. 활성 가이드된 바이오틱®의 효과 (대조군 vs GB)
· GB는 챌린지 후 7일에 소낭에서 살모넬라 카운트를 감소시켰다 (P<0.03) (도 6).
· GB는 3일차에 소낭 (P=0.40) 및 맹장 (P=0.50)에서 및 7일차에 회장 (P=0.58) 및 맹장 (P=0.60)에서 살모넬라를 감소시키는 약한 경향이 있었다.
표 5: 박테리아 예
임의로, 담체 세포는 이 표로부터 선택되고/거나, 표적 세포는 이 표로부터 선택된다 (예를 들어, 여기서 담체 및 표적 세포는 상이한 종의 것; 또는 동일한 종이지만 상이한 균주이거나, 또는 담체 세포는 조작되지만, 표적 세포는 야생형이거나 그 반대도 또한 마찬가지임). 예를 들어 담체 세포는 이 콜라이 세포이고, 표적 세포는 씨 디피실레, 이 콜라이, 악케르만시아, 엔테로박테리아세아, 루미노코쿠스, 파에칼리박테리움, 피르미쿠테스, 박테로이데스, 살모넬라, 클레브시엘라, 슈도모나스, 아시네토박터 또는 스트렙토코쿠스 세포이다.
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표 6: 서열:
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표 7: 유형 I CRISPR/Cas 시스템을 함유하는 pFS-Sal-09-proAB-rm 플라스미드의 각 유전적 요소의 기능 및 기원.
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표 8. JM109에서의 접합 결과. 이. 콜라이 JM109 균주에서 S17-1::pFS-EcoCas3-01-rm, S17-1::pFS-Sal-09-rm, S17-1::pFS-EcoCas3-03-rm 및 S17-1::pFS-Sal-08-rm으로부터의 접합은 두 구축물 및 각각의 대조군 플라스미드 사이에 비교가능한 효율을 나타내었다. 접합 효율은 트랜스접합체의 수 (CFU/mL)를 수용자의 수로 나눔으로써 계산된다.
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표 9. FS26에서의 접합 결과. 에스. 엔테리티디스 균주 FS26에서 S17-1::pFS-EcoCas3-01-rm, S17-1::pFS-Sal-09-rm, S17-1::pFS-EcoCas3-03-rm 및 S17-1::pFS-Sal-08-rm으로부터의 접합은 2개의 생물학적 복제물에서 수행되었다. 결과는 각각의 대조군 플라스미드와 비교할 때 활성 구축물과의 접합에 의한 에스. 엔테리티디스 균주 FS26의 유의한 감소를 나타내었다. 접합 효율은 트랜스접합체의 수 (CFU/mL)를 수용자의 수로 나눔으로써 계산된다.
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표 10. 살모넬라에서의 선택된 스페이서 보존
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표 11
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표 12. 플레이팅 프로토콜
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SEQUENCE LISTING <110> FOLIUM FOOD SCIENCE LIMITED <120> ANTIBACTERIAL AGENTS & METHODS <130> FFS0001-1 WO <150> GB1906668.7 <151> 2019-05-12 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 1 tgaaacacgc attgatttga gtcagctagg aggtgactga agtatatttt agatgaagat 60 tatttcttaa taactaaaaa tatggtataa tactcttaat aaatgcagta atacaggggc 120 ttttcaagac tgaagtctag ctgagacaaa tagtgcgatt acgaaatttt ttagacaaaa 180 atagtctacg aggttttaga gctatgctgt tttgaatggt cccaaaaccg ctttgggtat 240 acgcattttg aagtacgggt tttagagcta tgctgttttg aatggtccca aaactgtcaa 300 cgggtgtact atatgtctgt catggtttta gagctatgct gttttgaatg gtcccaaaac 360 gcaaaccagt accgaagaag aggcgctcac gttttagagc tatgctgttt tgaatggtcc 420 caaaactgcc gttctggtca tcctgctcga agccgcgttt tagagctatg ctgttttgaa 480 tggtcccaaa acccagaaat gaatcgcctg gcttcattat cggttttaga gctatgctgt 540 tttgaatggt cccaaaacat cagcaggaag cgctcaaaaa catactgcgt tttagagcta 600 tgctgttttg aatggtccca 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Claims (25)

  1. 동물 (임의로 가축 동물)의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 비의학적 방법으로서, 여기서 방법은 복수의 담체 세포를 동물에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 동물은 박테리아 표적 세포를 포함하고, 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 동물에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키고 동물의 성장 또는 중량을 증진시키는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 방법이 동물에서 사료 전환율 (FCR)을 개선시키는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 세포가 살모넬라(Salmonella) 세포인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 표적 세포가 에스 엔테리카(S enterica) 및/또는 에스 티피뮤리움(S typhimurium) 세포를 포함하며; 임의로 여기서 에스 엔테리카가 에스 엔테리카 아종 엔테리카인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 복수의 상이한 에스 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형을 사멸시키며; 임의로 여기서 각 혈청형이 티피뮤리움(Typhimurium), 엔테리티디스(Enteritidis), 비르효(Virchow), 몬테비데오(Montevideo), 하이델베르크(Heidelberg), 하다르(Hadar), 빈자(Binza), 브레데니(Bredeney), 인판티스(Infantis), 켄터키(Kentucky), 세프텐베르크(Seftenberg), 엠반다카(Mbandaka), 아나툼(Anatum), 아고나(Agona) 및 더블린(Dublin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 세포가 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 세포, 임의로 이 콜라이(E coli) 세포 (예컨대 F18, 니슬(Nissle) 또는 S17 이 콜라이 세포)인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 동물의 위장관에서 표적 세포를 감소시키며; 임의로 여기서 동물이 조류이고, 방법이 조류의 맹장, 소낭, 간, 비장 및/또는 회장에서 표적 세포를 감소시키는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA가 플라스미드에 의해 포함되며, 여기서 플라스미드가 RP4 전달 기점 (oriT) 및/또는 p15A ori를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 표적 세포에 의해 포함된 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 작동가능한 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 포함하며, 임의로 여기서 표적 세포가 박테리아 종의 제1 및 제2 균주를 포함하고, 각 균주가 프로토스페이서 서열을 포함하며, 여기서 균주의 세포가 사멸되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 시스템이 표적 세포 게놈에 의해 포함된 적어도 3개의 상이한 프로토스페이서 서열을 절단하도록 작동가능한 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 프로토스페이서 서열의 각각 또는 일부가 표적 세포에 의해 포함된 병원성 섬에 의해 포함되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가
    (a) 표적 핵산 서열을 인식 및 변형할 수 있는 가이드된 뉴클레아제를 포함하며, 여기서 표적 서열이 표적 세포의 내인성 염색체 또는 에피솜에 의해 포함되지만 담체 세포에 의해 포함되지 않으며, 여기서 뉴클레아제가 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위해 염색체 또는 에피솜을 변형하고/거나;
    (b) 표적 세포에 의해 포함된 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동하는 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하는 것인
    방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 담체 세포로서, 여기서 세포는 박테리아 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 항박테리아제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 이에 의해 표적 세포를 사멸시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 담체 세포.
  14. 병원성 박테리아 표적 세포에 의한 감염을 치료하기 위해 대상체에게 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법에서 사용하기 위한 복수의 담체 세포를 포함하는 조성물로서, 여기서 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 조성물.
  15. 동물 (임의로 가축 동물)에서 인수공통전염성 박테리아 표적 세포를 사멸시키는 비의학적 방법으로서, 방법은 동물에게 복수의 담체 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 임의로 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 방법이 대상체의 위장관에서 살모넬라를 감소시키는 것인 조성물 또는 방법.
  17. 제14항 또는 제16항에 있어서, 방법이 동물의 그룹 (임의로 무리 또는 떼)에 대해 수행되며, 여기서 동물의 일부 또는 전부가 표적 세포를 포함하며, 여기서 표적 종의 세포의 확산이 그룹에서 감소되거나; 여기서 동물의 그룹으로부터 제2 그룹으로 확산이 감소되는 것인 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 사멸된 상이한 살모넬라 종 유형을 포함하는 것인 조성물 또는 방법.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 세포, 표적 세포(들) 또는 DNA가 각각 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 담체 세포, 표적 세포(들) 또는 DNA인 세포, 조성물 또는 방법.
  20. 제12항의 방법에서 사용하기 위한 DNA로서, 여기서 DNA는 표적 세포에 도입될 수 있으며, 여기서 DNA는 CRISPR/Cas 시스템의 복수의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하며, 여기서 가이드 RNA 또는 crRNA는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 복수의 프로토스페이서 서열을 인식하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동가능하며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고,
    (a) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 병원성 섬 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나;
    (b) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 침입 유전자 서열을 포함하고/거나;
    (c) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 분비 시스템 유전자 서열을 포함하고/거나;
    (d) 프로토스페이서 서열은 avrA, sptP, sicP, sipA, sipD, sipC, sipB, sicA, invB, ssaE, sseA, sseB, sscA, sseC, sseD, sseE, sscB, sseF, sseG, mgtC, cigR, pipA, pipB, pipC, sopB 및 pipD (임의로 invB, sicP, sseE, pipA, pipB, pipC, hilA, marT 및 sopB로부터 선택됨)로부터 선택된 A 유전자로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
    DNA.
  21. 제20항에 있어서, DNA가 박테리아 숙주 세포에서 DNA의 복제를 위해 작동가능한 전달 기점 (oriT) 및 복제 기점 (oriV)을 포함하는 플라스미드에 의해 포함되는 것인 DNA.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, DNA가 서열식별번호: 15를 포함하며, 임의로 여기서 DNA가 살모넬라 표적 세포에의 접합을 위해 담체 박테리아 세포 내의 플라스미드에 의해 포함되는 것인 DNA.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, DNA가 CRISPR 반복부 및 스페이서 서열을 포함하며, 여기서
    (a) 반복부 서열이 각각 서열식별번호: 16을 포함하고/거나;
    (b) 스페이서 서열이 서열식별번호: 17-19 및 이의 상보체 서열로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 서열을 포함하고;
    임의로 여기서 DNA가 살모넬라 표적 세포에의 접합을 위해 담체 박테리아 세포 내의 플라스미드에 의해 포함되는 것인
    DNA.
  24. 제23항에 있어서, DNA가 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18 및 서열식별번호: 19를 (임의로 5'에서 3' 순서로) 포함하는 것인 DNA.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 엔테로박테리아세아에 세포 (임의로 살모넬라 세포)이고, 상기 DNA가 플라스미드에 의해 포함되며, 여기서 플라스미드가 IncFI, IncFII, IncFIll, IncFIV, IncFV, IncM, Inc9, InclO, Incl, IncA, IncB, IncC, IncH, IncIa, InclIc, IncI2, IncIy, IncJ, IncL, IncN, Inc2e, IncO, IncP, IncS, IncT 및 IncW 플라스미드로부터 선택되는 것인 방법, 세포, 조성물 또는 DNA.
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