KR20220009971A - 최종당화산물 수용체 알엔에이의 조절인자 및 조절 - Google Patents

최종당화산물 수용체 알엔에이의 조절인자 및 조절 Download PDF

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Abstract

최종당화산물 수용체(RAGE) 유전자 전사물 또는 그의 일부의 스플라이싱을 조절하기 위한 RAGE 중의 pre-mRNA 스플라이싱을 변형시키기 위한 단리되거나 정제된 AON.

Description

최종당화산물 수용체 알엔에이의 조절인자 및 조절
본 발명은 최종당화산물 수용체(Receptor for Advanced Glycation End-product; RAGE) 동형(isoform)의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위해 스플라이스-전환(splice-switching) 안티센스 올리고뉴클레오티드(AON)를 사용하는 RAGE 또는 그의 일부를 암호화하는 pre-mRNA의 대체 스플라이싱(splicing)의 조절 방법, 및 상기 조절인자를 사용하는 RAGE-관련 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
최종당화산물 수용체(RAGE)는 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리에 속하는 다가의 I형 막관통 당단백질이다. 인간 RGAE(Ager) 유전자는 염색체 6상의 주조직적합성 복합체 부류 III 영역내에 있다. 상기는 11개의 엑손 및 10개의 인트론, 및 그의 전사를 조절하는 5' 측면인접 영역을 포함한다. 전사된 RAGE mRNA는 짧은 3'UTR과 함께 ∼1.4 kb이다.
50 내지 55 kDa 글리코실화된 RAGE 단백질은 제한된 범위의 세포(예를 들어 혈관 내피, I형 폐포세포, 백혈구)에서 구성적으로 발현되지만, RAGE 발현은 손상, 스트레스, 저산소증 또는 염증 후의 대부분의 세포 유형과 조직에서 유도되어, 염증-전 및 증식-전 신호전달을 위한 도관을 제공할 수 있다. RAGE 발현은 RAGE가 발생 및 진행에 또한 연루되는 염증 및 대사 장애, 예를 들어 비제한적으로 신경퇴행성 질병(neurodegenerative disease), 암(cancer), 심혈관 질병, 당뇨병, 자가면역 및 허혈성 손상에서 결과적으로 상향조절된다.
RAGE는 알쯔하이머병(Alzheimer's disease); 근위축성 측삭 경화증(amylotrophic lateral sclerosis); 헌팅톤병(Huntington's disease); 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob's disease); 신경퇴행성 상태, 예를 들어 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy), 가족성 아밀로이드 다발신경병증(familial amyloid polyneuropathy), 샤르코 신경관절병증(Charcot neuroarthropathy) 및 혈관성 신경병증(vasculitic neuropathy); 신경병성 통증(neuropathic pain); 신경교종(glioma) 발생 및 진행; 허혈성 뇌 손상/뇌졸중(ischaemic brain injury/stroke) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis)을 포함한 일련의 뇌 장애와 연루되었다.
RAGE는 종양 세포의 성장, 이동 및 침범을 포함하여 종양 생물학의 다수의 측면에 연루되었다. 다수의 암이 보다 높은 수준의 RAGE를 발현한다(예시적인 예는 유방, 결장, 신장 및 위암이다). 예외는, 폐 세포가 분화되고 보다 악성으로 되면서 RAGE가 상실됨에 따라 RAGE 발현이 감소되는 폐암이다.
C6 신경교종 세포에서, RAGE가 차단된 세포를 포함하는 종양에서는 종양 부피가 현저하게 감소된다. 대조적으로, 야생형 RAGE를 과발현하는 종양은 빠르게 성장하고 주변 조직을 매우 효율적으로 침범하였다. 다수의 통상적인 암, 예를 들어 신경교종/다형성 수모세포종(medulloblastoma multiforme); 췌장암(pancreatic cancer); 흑색종(melanoma); 전립선암; 유방암; 간암/간종양; 및 결장암에 대한 암 치료로서 RAGE 신호전달을 차단하는 요법이 바람직할 수 있다.
건강한 상태에서, RAGE의 폐 발현은 모든 조직 중 최고이다. 그러나, 폐에서 RAGE 발현은 통상적으로 I형 폐포세포에서만 관찰된다. 폐의 다른 세포 및 다른 부위에서 RAGE 신호전달의 상향조절은 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD)/폐기종(emphysema); 천식(asthma); 흡연/공해로 인한 손상; 급성 폐 손상/급성 호흡 곤란 증후군(acute lung injury/Acute Respiratory Distress Syndrome); 및 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)을 포함한 일련의 폐 장애(lung disorder)에 연루되었다.
RAGE는 또한 염증성 관절염(inflammatory arthritis); 골관절염(osteoarthritis); 망막 질환(retinal disease); 죽상동맥경화증(atherosclerosis); 혈관 석회화(vascular calcification); 허혈성 심장 질환/심장 재형성/섬유증(ischaemic cardiac disease/cardiac remodelling/fibrosis); 심부전(heart failure); 당뇨성 및 비-당뇨성 신장병(diabetic and non-diabetic kidney disease); 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease); 전-자간증(pre-eclampsia); 다낭성 난소 증후군(polycystic ovarian syndrome); 간 지방증(hepatic steatosis), 섬유증(fibrosis), 허혈성 및 비-허혈성 간 손상(ischemic and non-ischemic liver injury); 근이영양증(muscular dystrophy); 척수 손상(spinal cord injury); 피부 염증 및 노화; 및 각막염(keratitis)과 같은 다수의 염증 상태에 중요하게 관련된다.
인간 RAGE는 면역글로불린-유사 엑토도메인, 단일 막관통 도메인 및 짧은(42 아미노산) 시토솔 꼬리(cytoslic tail)로 구성된다. RAGE의 엑토도메인(또한 세포외 도메인으로서 공지됨)은 3개의 면역글로불린-유사 영역: N-말단 V-형 도메인에 이어서, 2개의 C-형 도메인(C 및 C' 또는 한편으로 C1 및 C2라 지칭됨)을 포함한다.
RAGE의 엑토도메인에 대한 최종당화산물(AGE) 및 비-AGE 리간드의 결합은 염증, 손상 및 세포 증식 및 분화에 연루된 세포내 신호전달 캐스케이드를 활성화한다. RAGE 활성화는 또한 RAGE 리간드-수용체 상호작용이 NFκB 활성화를 통해 RAGE의 발현을 증가시키는 양의 피드백 고리를 촉발시켜, 후속적인 RAGE-유도된 세포 활성화를 증대시킨다. 실제로, RAGE 발현을 강하게 하향조절하기 위해 발명자가 아는 유일한 수단은 RAGE의 활성화를 감소시키는 것이다. 이러한 상황은 리간드의 증가된 수준이 수용체의 발현을 감소시키는 다른 수용체와 대조적이다.
인간에서, RAGE의 시토솔 꼬리는 43 아미노산 길이(잔기 362 내지 잔기 404)이다. 이러한 시토솔 꼬리는, RAGE-의존적인 세포 활성화에 중요하지만 리간드 결합에는 중요하지 않은 모티프(motif)를 함유한다. RAGE의 시토솔 꼬리는 비-AGE 리간드의 AGE가 RAGE 엑토도메인에 결합하지 않으면서(또한 RAGE의 리간드-독립적인 활성화로서 공지됨) 동족 리간드에 의해 같은 위치에 있는 G-단백질 결합 수용체의 활성화 후에 트랜스 활성화될 수 있으며, 이는 동일한 경로의 활성화를 유도한다(Pickering et al. J Clin Invest 2019; 129: 406-421). 몇몇 같은 위치의 활성화된 G-단백질 결합된 수용체에 의한 RAGE 시토솔 꼬리의 RAGE 리간드-독립적인 활성화는 RAGE가 생체 내에서 활성화되는 중요한 경로인 것으로 보인다.
RAGE의 리간드-의존적인 활성화 및 RAGE의 리간드-독립적인 활성화 모두에서, 세포내 신호전달은, 일련의 신호전달 상대와 상호작용하는 RAGE의 시토솔 도메인에 의해 매개된다.
RAGE의 대체 스플라이싱이 또한, 리간드-의존적인 및 리간드-독립적인 신호전달 경로에 의해 활성화되는 변경된 능력을 갖는 RAGE 동형의 생성을 통해, RAGE 활성의 조절에 중요하다. RAGE의 대체 스플라이싱은 암, 당뇨병 및 알쯔하이머병을 포함한 질병 상태에서 변경된다. 그러나 대체 스플라이싱이 RAGE 조절/조절장애에 중요한 것으로 보이지만, 상기 기전을 특이적으로 표적화하는 방법은 없다.
이러한 배경에 대해, 전장(full-length) RAGE에 비해 세포-보호 RAGE 동형의 바람직한 생성을 향한 RAGE 스플라이싱의 조절을 위해 스플라이스 전환 AON을 사용하는 본 방법을 기재한다.
배경 기술에 대한 상기 논의는 단지 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 것이다. 논의는 언급된 자료가 출원 우선일에 통상적인 일반 지식의 일부이거나 일부였다는 것을 인정하거나 시인하는 것이 아니다.
RAGE의 대체 스플라이싱이 또한, 리간드-의존적인 및 리간드-독립적인 신호전달 경로에 의해 활성화되는 변경된 능력을 갖는 RAGE 동형의 생성을 통해, RAGE 활성의 조절에 중요하다. RAGE의 대체 스플라이싱은 암, 당뇨병 및 알쯔하이머병을 포함한 질병 상태에서 변경된다. 그러나 대체 스플라이싱이 RAGE 조절/조절장애에 중요한 것으로 보이지만, 상기 기전을 특이적으로 표적화하는 방법은 없다.
이러한 배경에 대해, 전장(full-length) RAGE에 비해 세포-보호 RAGE 동형의 바람직한 생성을 향한 RAGE 스플라이싱의 조절을 위해 스플라이스 전환 AON을 사용하는 본 방법을 기재한다.
배경 기술에 대한 상기 논의는 단지 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 것이다. 논의는 언급된 자료가 출원 우선일에 통상적인 일반 지식의 일부이거나 일부였다는 것을 인정하거나 시인하는 것이 아니다.
광범위하게, 본 발명의 하나의 형태에 따라, 최종당화산물 수용체(RAGE) 또는 그의 일부를 암호화하는 pre-mRNA 유전자 전사물의 대체 스플라이싱을 조절하는데 사용되는 단리되거나 정제된 AON을 제공한다.
본 발명의 하나의 측면에서, RAGE pre-mRNA의 인트론 부근 또는 그 내부의 영역에 상보성인 표적화 서열을 포함하는 10 내지 50 뉴클레오티드의 AON을 제공한다.
본 발명의 하나의 측면에서, RAGE pre-mRNA의 스플라이스 부위(splice site)에 상보성이거나 인접한 표적화 서열을 포함하는 10 내지 50 뉴클레오티드의 AON을 제공한다.
RNA 2차 구조, AON과 SR 단백질간의 경쟁, 이종 핵 리보핵단백질(hnRNP), 및/또는 스플라이시오솜(spliceosome)을 구성하는 다른 요소와 같은 인자가 AON의 작용에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 중요한 수용자 또는 공여자 스플라이스 부위에 대한 AON이 스플라이싱을 항상 변경시키지는 않을 것이다. 결과적으로, 본 발명의 하나의 측면에서, 스플라이시오좀의 요소(예를 들어 단백질-스플라이싱 인자, uRNA, lncRNA)에 의해 결합시 인근 엑손의 스플라이싱을 조절하는 인헨서(enhancer) 또는 사일런서(silencer)로서 작용하는 RAGE의 pre-mRNA 중의 시스-작용 RNA 요소에 상보성이거나 이에 인접한 표적화 서열을 포함하는 10 내지 50 뉴클레오티드의 AON을 제공한다.
본 발명의 하나의 측면에서, 스플라이스 부위 선택에 영향을 미치는 RAGE pre-mRNA의 2차 구조를 조절하는 상기 mRNA에 상보성인 표적화 서열을 포함하는 10 내지 50 뉴클레오티드의 AON을 제공한다.
본 발명의 하나의 형태에서, RAGE 유전자 전사물 또는 그의 일부 중에 하나 이상의 엑손 서열의 배제(또한 스키핑(skipping)으로서 공지됨)를 유도하기 위한 단리되거나 정제된 AON을 제공한다.
본 발명의 하나의 형태에서, RAGE 유전자 전사물 또는 그의 일부 중에 인트론 서열(intronic sequence)의 유지를 유도하기 위한 단리되거나 정제된 AON을 제공한다.
본 발명의 하나의 형태에서, AON은, 비제한적으로 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), 2' O-메틸 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(2OMe), 및 2'-O-메톡시에틸 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(2OMe), 잠금 핵산(LNA) 변형된 AON, 열안정성 비틀린 끼어들기 핵산(TINA) 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함한, pre-mRNA-AON 복합체의 분해를 방지하도록 화학적으로-변형된다.
본 발명의 하나의 형태에서, AON을, 비제한적으로 세포-침투 펩티드(CPP), 생체(vivo)-모르폴리노(VMO) 또는 펩티드 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PPMO)를 포함한 부분에 접합시켜 그의 전달을 증가시킨다.
바람직하게, AON은 표 3a-3d 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 그룹 중에서 선택된다. 바람직하게, AON은 서열번호 1-31을 포함하는 목록 중에서 선택된다. 보다 바람직하게, AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다.
본 발명의 AON은 선택된 표적 부위에 결합할 수 있는 AON이도록 선택될 수 있으며, 여기에서 상기 표적 부위는 스플라이스 공여자 부위, 스플라이스 수용자 부위, 스플라이스 인헨서 서열 스플라이스 사일런서 서열 또는 pre-mRNA의 2차 구조를 조절하는 부위 중에서 선택된 추정적인 mRNA 스플라이스 부위이다. 상기 표적 부위는 또한 공여자 또는 수용자 스플라이스 부위가 표적화될 때 일부 측면인접 인트론 서열을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, AON은 서열번호 1-31 및/또는 표 3a-3d 중 어느 하나에 제시된 서열, 및 이들의 조합 또는 칵테일(cocktail) 중 임의의 하나 이상을 포함하는 그룹 중에서 선택될 수 있다. 보다 바람직하게, AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다. AON의 조합은 바람직하게는 서열번호 11과 10, 또는 서열번호 11과 13의 조합이다. 여기에는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기와 같은 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열, 이에 상보성인 서열, 변형된 염기, 변형된 골격(backbone), 및 RAGE 유전자 전사물의 pre-mRNA 가공 활성을 갖거나 조절하는 기능성 절두 또는 그의 연장부를 함유하는 서열이 포함된다.
몇몇 구현예에서, AON은 표적 서열에 100% 상보성이거나, 또는 올리고뉴클레오티드와 표적 서열간에 형성된 헤테로-듀플렉스(duplex)가 세포 뉴클레아제의 작용 및 생체내에서 발생할 수 있는 다른 방식의 분해를 견디기에 충분히 안정성일 수 있는 한, 예를 들어 변이체를 수용하기 위해, 불일치를 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드와 표적 서열간에, 약 또는 적어도 약 70% 서열 상보성, 예를 들어 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상보성을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 RAGE pre-mRNA의 대체 스플라이싱을 조절하기 위해 선택된 표적에 결합할 수 있는 2개 이상의 AON의 조합, 예를 들어 2개 이상의 상기와 같은 AON을 포함하는 구조물로 확장된다. 상기 구조물을 병용되는 AON-기반 요법에 함께 사용할 수 있다. AON의 조합은 바람직하게는 서열번호 11과 10, 또는 서열번호 11과 13의 조합이다.
본 발명은 더욱 추가적인 측면에 따라, 본 발명의 AON 서열의 cDNA 또는 클로닝된 사본뿐만 아니라, 본 발명의 AON 서열을 함유하는 벡터(vector)로 확장된다. 본 발명은 또한 상기와 같은 서열 및/또는 벡터를 함유하는 세포로 더욱 확장된다.
RAGE 유전자 전사물의 스플라이싱을 조작하는 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은
a) 본원에 기재된 바와 같은 AON 중 하나 이상을 제공하고 상기 올리고머(들)가 표적 핵산 부위에 결합되게 하는
단계를 포함한다.
환자에서 RAGE 발현과 관련된 질병의 영향을 치료하거나, 예방하거나 개선시키기 위한 약학적, 예방학적 또는 치료학적 조성물을 또한 제공하며, 상기 조성물은
a) 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 AON; 및
b) 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 및/또는 희석제
를 포함한다.
상기 조성물은 약 1 nM 내지 1000 nM의 각각의 본 발명의 목적하는 AON(들)을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 조성물은 약 10 nM 내지 500 nM, 가장 바람직하게는 1 nM 내지 10 nM의 각각의 본 발명의 AON(들)을 포함할 수 있다.
또한, RAGE 발현과 연관된 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 환자에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약학 조성물을 투여하는
단계를 포함한다.
RAGE 발현 및/또는 활성과 연관된 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약제를 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 정제되거나 단리된 AON의 용도를 또한 제공한다.
환자에서 RAGE 발현과 연관된 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 키트(kit)를 또한 제공하며, 상기 키트는 사용 설명서와 함께, 적합한 용기에 패키징된(packaged), 적어도 본원에 기재된 바와 같은 AON 및 그의 조합 또는 칵테일을 포함한다.
바람직하게 환자에서 RAGE 발현과 연관된 질병은 신경퇴행성 질병, 암, 폐 장애, 또는 염증성 질병(inflammatory disease)이다.
RAGE 발현과 연관된 질병이 있는 피실험자는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
이제 본 발명의 추가적인 측면을 첨부되는 비-제한적인 실시예 및 도면을 참조하여 기재할 것이다.
본 발명의 추가적인 특징을 하기의 다수의 비제한적인 구현예의 설명에서 보다 충분히 기재한다. 이러한 설명은 오직 본 발명을 예시하기 위해 포함된다. 상기는 위에서 설명한 바와 같은 본 발명의 광범위한 요약, 개시 또는 설명에 대한 제한으로서 이해되어서는 안 된다. 상기 설명은 첨부되는 도면을 참조할 것이며 도면에서:
도 1a는 RAGE 및 RAGE_v1을 생성시키는 RAGE의 대체 스플라이싱을 도시한다. 엑손은 상자로 도시된다. 암호화 서열은 검은색이고 비-암호화 서열은 흰색이다. 각진 선은 스플라이싱 사건을 나타낸다. S = 조기 종결 코돈
도 1b는 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON으로 처리 후 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은 A579 세포 또는 대조용(스크램블드(scrambled) RNA 처리된) 세포에서 임의의 RAGE mRNA(전체 인간 RAGE) 스플라이싱형태(splicoform) 및 인간 RAGE 9b 서열을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화 배수(fold change)를 도시한다.
도 1c는 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON으로 처리 후 A579 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은, 임의의 RAGE mRNA(전체 인간 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10을 함유하는 인간 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 mRNA 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 1d는 추정적인 hnRNPF 결합 부위에 인접한 엑손 10을 또한 표적화하는 선택된 AON으로 처리 후 A579 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은, 임의의 RAGE mRNA(전체 인간 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10을 함유하는 인간 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 mRNA 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 1e는 엑손 10을 표적화하는 특정한 AON으로 처리 후 A579 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 상이한 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 상대적인 발현을 나타내는 상이한 크기의 엑손 8-11 단편을 함유하는 구조물을 암호화하는 RAGE 클론의 백분율을 도시한다. 예를 들어, 300 밴드는 엑손 8, 9, 10 및 11을 함유하는 스플라이싱형태(즉 신호전달 가능 스플라이싱형태)를 나타내는 반면, 250 밴드는 RAGE 9b를 함유하는 스플라이싱형태를 나타내고, 밴드 없음은 엑손 8의 상실과 연관된 RAGE mRNA 스플라이싱형태를 나타낸다.
도 1f는 상이한 스플라이싱형태의 존재를 나타내는, 상이한 크기의 밴드를 갖거나 밴드가 없는(화살표) 엑손 8-11에 걸쳐있는 DNA PCR 산물의 전형적인 젤 상이다.
도 1g는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포와 비교하여, AON 3779에 의한 A579 세포 처리 후 디지털 PCR에 의해 측정된 바와 같은, 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA의 사본수를 도시한다.
도 1h는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포와 비교하여, 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON에 의한 A579 세포 처리 후 세포 배지에서 검출된 내인성 가용성 RAGE 단백질의 농도를 도시한다.
도 1i는 RAGE 특이 항체를 사용하여 검출된 웨스턴 블럿에 의한, AON3779 또는 AON87 또는 대조용(CTL) RNA의 존재 및 부재하의, 인간 RAGE의 게놈 서열(gRAGE)을 암호화하는 DNA에 의한 CHO 세포의 형질감염 후 세포 배지(좌측) 및 세포 용해물(우측) 중의 RAGE 단백질의 발현을 도시한다. 레인 M은 마커이고, 레인 2는 벡터 대조군(내인성 RAGE가 발현되지 않음)이고, 레인 3은 gRAGE+ 대조용(스크램블드) RNA이고, 레인 3은 gRAGE+AON3779이고, 레인 4는 gRAGE+AON87이다. 화살표는 세포 배지 중의 보다 작은 가용성 RAGE(붉은색) 및 세포 용해물 중의 보다 큰 전장 RAGE(흰색)의 크기를 나타낸다.
도 1j는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, 엑손 10을 표적화하는 AON에 의한 형질감염의 존재 및 부재하의, 인간 RAGE의 게놈 서열(gRAGE)을 암호화하는 DNA에 의한 CHO 세포의 형질감염 후 배지 중의 가용성 RAGE 단백질의 발현을 도시한다.
도 1k는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, AON 3779에 의해 또한 표적화된 부위에 인접하거나 겹치는 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON의 존재 및 부재하의, 인간 RAGE의 게놈 서열(gRAGE)을 암호화하는 DNA에 의한 CHO 세포의 형질감염 후 배지 중의 가용성 RAGE 단백질의 발현을 도시한다.
도 1l은 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, AON 3779의 존재 및 부재하의, 인간 RAGE의 게놈 서열을 암호화하는 DNA에 의한 CHO 세포의 형질감염 후 배지 중의 가용성 RAGE 발현의 용량 의존적인 유도를 도시한다. 점선은 스크램블드 RNA(10 nM)로 형질감염된 CHO 세포에서 가용성 RAGE의 발현을 나타낸다.
도 1m은 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포와 비교된, RAGE 리간드, S100A8/9(0.6 ㎍/㎖)에 의한 A549 세포 처리 후 ICAM-1 유전자 발현의 유도, 및 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON에 의한 예비-형질감염에 의한 그의 조절을 도시한다.
도 1n은 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포와 비교된, RAGE 리간드, S100A8/9(0.6 ㎍/㎖)에 의한 1차 인간 대동맥 내피세포(HAEC) 처리 후 ICAM-1 유전자 발현의 유도, 및 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON에 의한 예비-형질감염에 의한 그의 조절을 도시한다.
도 1o는 RAGE의 전사촉진을 유도할 수 있는 Ang II에 의한 A549 세포 처리 후의 ICAM-1 유전자 발현의 유도를 도시한다. 현저하게 ICAM-1 유전자 발현의 이러한 유도는 또한 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포와 비교하여 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON에 의한 A579 세포의 예비-형질감염에 의해 조절된다.
도 1p는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포와 비교된, 안지오텐신 II(1 μM)에 의한 1차 인간 대동맥 내피세포(HAEC)의 처리 후 ICAM-1 유전자 발현의 유도, 및 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON에 의한 예비-형질감염에 의한 그의 조절을 도시한다.
도 1q는 추정적인 hnRNP-F/H1 결합 부위에 인접한 엑손 10을 특이적으로 표적화하는 AON에 의한 처리 후 HMEC 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은, 임의의 RAGE mRNA(전체 인간 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10을 함유하는 인간 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 1r은 추정적인 hnRNPF 결합 부위에 인접한 엑손 10을 표적화하는 AON에 의한 처리 후 HMEC 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 인간 RAGE 9b 서열을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 mRNA 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 1s는 비-표적 모르폴린 AON 대조군과 비교된, 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현에 대한, AON 3779(0.1 - 1 μM)의 생체-모르폴리노 제형에 의한 1차 인간 대동맥 내피세포(HAEC) 처리의 영향을 도시한다.
도 1t는 비-표적 모르폴린 AON 대조군과 비교된, 배양 배지 중의 가용성 RAGE 단백질의 발현에 대한, AON 3779(0.1 - 1 μM)의 생체-모르폴리노 제형에 의한 1차 인간 대동맥 내피세포(HAEC) 처리의 영향을 도시한다.
도 1u는 비-표적 모르폴린 AON 대조군과 비교된, 배양 배지 중의 가용성 RAGE 단백질의 발현에 대한, AON 3779(1 μM)의 생체-모르폴리노 제형에 의한 게놈 인간 RAGE를 발현하는 CHO 세포 처리의 영향을 도시한다.
도 1v는 상기 실험에 사용된 상이한 AON을 나타내는 엑손 10 및 그의 상보성 표적을 포함하고 이와 결합하는 인간 RAGE DNA의 서열을 도시한다. 보라색 상자는 hnRNPF 결합의 추정적인 폴리G 표적을 나타낸다.
도 1w는 AON 3779에 의한 형질감염에 반응하여 가용성 RAGE의 관찰된 증가에 대한, 발현된 인간 RAEG의 대체 스플라이싱에 대한 hnRNP의 추정적인 폴리G 표적의 돌연변이(돌연변이 gRAGE M3)에 따른 영향의 결여를 도시한다.
도 2a는 엑손 9를 포함하고 이에 결합하는 인간 AGER의 유전자 서열을 도시하며, 이는 하기에 사용되는 상이한 AON 및 RAGE pre-mRNA상의 그의 상보성 표적을 나타낸다.
도 2b는 엑손 9를 표적화하는 선택된 AON으로 처리 후 A579 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은, 임의의 RAGE mRNA(전체 인간 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10을 함유하는 인간 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 도시한다.
도 2c는 상이한 스플라이싱형태의 존재를 나타내는 상이한 크기의 밴드 또는 밴드 없음을 갖는, 엑손 8-11에 걸쳐있는 DNA PCR 산물의 전형적인 젤 상이다.
도 2d는 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON으로 처리 후 A579 세포 또는 스크램블드 RNA 대조군(CTL)에서 상이한 스플라이싱형태 mRNA의 상대적인 발현을 나타내는 상이한 크기의 엑손 8-11 단편을 함유하는 구조물을 암호화하는 RAGE mRNA 클론의 백분율을 나타낸다. 예를 들어, 300 밴드는 엑손 8, 9, 10 및 11을 함유하는 스플라이싱형태(즉 신호전달 가능 스플라이싱형태)를 나타내는 반면, 250 밴드는 RAGE 9b를 함유하는 스플라이싱형태를 나타내고, 밴드 없음은 엑손 8의 상실과 연관된 RAGE mRNA 스플라이싱형태를 나타낸다.
도 2e는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, 엑손 9를 표적화하는 선택된 AON의 존재 및 부재하의 인간 RAGE의 게놈 서열을 암호화하는 DNA에 의한 CHO 세포의 형질감염 후 배지 중의 가용성 RAGE 단백질의 발현을 도시한다. 대조군(스크램블드 RNA 처리된) 세포. ND = 검출 안 됨.
도 2f는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포와 비교된, RAGE 리간드, S100A8/9(0.6 ㎍/㎖)에 의한 처리 후의 TLR-4 유전자 발현의 유도, 및 엑손 9를 표적화하는 선택된 AON에 의한 형질감염 후 그의 조절을 도시한다.
도 2g는 RAGE의 전사촉진을 유도할 수 있는 Ang II(1 μM) 처리 후의 ICAM-1 유전자 발현의 유도를 도시한다. 현저하게 ICAM-1 유전자 발현의 이러한 유도는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포와 비교하여 엑손 9를 표적화하는 선택된 AON에 의한 A579 세포의 형질감염에 이어서 조절된다.
도 2h는 엑손 9를 표적화하는 선택된 AON에 의한 처리 후 HMEC1 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA) 처리된 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은, 임의의 RAGE mRNA(전체 인간 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10을 함유하는 인간 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 3a는 인트론 9를 표적화하는 선택된 AON, AON 3779(양성 대조군으로서)에 의한 처리 후 A579 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은, 임의의 RAGE mRNA(전체 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10을 함유하는 인간 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 3b는 인트론 9를 표적화하는 선택된 AON, AON 3779(양성 대조군으로서)에 의한 처리 후 A549 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은, expn 9b 서열을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 3c는 인트론 9를 표적화하는 선택된 AON, AON 3779(양성 대조군으로서)에 의한 처리 후 HMEC1 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은, 임의의 RAGE mRNA(전체 인간 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10을 함유하는 인간 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 도시한다.
도 3d는 인트론 9를 표적화하는 선택된 AON, AON 3779(양성 대조군으로서)에 의한 처리 후 HMEC1 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같은, 엑손 9를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 3e는 인트론 9를 표적화하는 특정한 AON, AON 3779(양성 대조군으로서)에 의한 처리 후 게놈 인간 RAGE를 발현하는 A579 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포의 배지에서 ELISA에 의해 검출된 바와 같은, 가용성 RAGE의 농도를 도시한다.
도 3f는 AON 및 그의 상보성 표적을 나타내는, 인트론 9를 포함하고 이에 결합하는 인간 RAGE DNA의 서열을 도시한다.
도 4a는 RAGE pre-mRNA를 표적화하는 AON에 의한 처리 후, 게놈 쥐(murine) RAGE를 발현하는 CHO 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포의 배지에서 ELISA에 의해 검출된 바와 같은, 가용성 RAGE의 농도를 도시한다.
도 4b는 쥐 RAGE의 엑손 9를 표적화하는 선택된 AON(50 nM)에 의한 처리 후 PMAEC 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서, 실시간 RT-PCR 상에서, 임의의 RAGE mRNA(전체 쥐 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10 및 11을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 4c는 쥐 RAGE의 엑손 9를 표적화하는 선택된 AON(10 nM)에 의한 처리 후 PMAEC 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 임의의 mRNA RAGE(전체 쥐 RAGE) 및 엑손 10 및 11을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 4d는 쥐 RAGE의 엑손 9를 표적화하는 특정한 AON(10 nM)에 의한 처리 후 PMAEC 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포의 배지 중 가용성 RAGE 단백질의 농도를 도시한다.
도 4e는 AON m3779(10 nM)에 의한 처리 후 PMAEC 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR상에서 임의의 RAGE mRNA(전체 쥐 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10 및 11을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 4f는 AON 3779(10 nM), AON m3779에 의한 처리 후 게놈 쥐 RAGE를 발현하는 CHO 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포의 배지 중 가용성 RAGE 단백질의 농도를 도시한다.
도 4g는 AON 3779(10 nM), AON m3779에 의한 처리 후 게놈 인간 RAGE를 발현하는 CHO 세포 또는 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포의 배지 중 가용성 RAGE 단백질의 농도를 도시한다.
도 4h는 48시간 동안 AON m3779 또는 비-표적 모르폴리노 AON으로 마우스의 정밀 절단 폐 조각을 처리한 후 실시간 RT-PCR상에서의 임의의 RAGE mRNA(전체 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10 및 11을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 도시한다.
도 4i는 AON m3779 또는 비히클(vehicle)(염수)로 마우스의 정밀 절단 폐 조각을 처리한 후 실시간 RT-PCR상에서의 임의의 RAGE mRNA(전체 RAGE) 및 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 시간-의존적인 발현을 도시한다.
도 4j는 비-표적 AON 대조군과 비교된, AON m3779를 C57Bl6 마우스에 매일 피하 주입 후 1주일째에, 실시간 RT-PCR상에서의 임의의 RAGE mRNA(전체 마우스 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 9b 또는 엑손 10을 함유하는 쥐 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 폐 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 4k는 비-표적 AON 대조군과 비교된, AON m3779의 모르폴리노 제형의 C57Bl6 마우스에의 기관지내 점적 후 48시간째에, 실시간 RT-PCR상에서의 임의의 RAGE mRNA(전체 마우스 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10 및 엑손 11을 함유하는 쥐 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 폐 발현의 변화 배수를 도시한다.
도 4l은 비히클 대조군과 비교된, AON m3779의 2-O'Me 제형의 C57Bl6 마우스에의 기관지내 점적 후 48시간째에, 실시간 RT-PCR상에서의 임의의 RAGE mRNA(전체 마우스 RAGE) 스플라이싱형태 및 엑손 10 및 엑손 11을 함유하는 쥐 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 폐 발현의 변화 배수를 도시한다. *는 p = 0.01 대 기준선을 나타낸다.
도 4m은 AON m3779, AON4105 및 멸균수 대조군의 C57Bl6 마우스에의 기관내 주사후 2일째에 기준선 혈액과 비교된 순환하는 가용성 RAGE의 변화 배수(%)를 도시한다.
도 5a는 상이한 영역 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON의 조합의 존재 및 부재하의 인간 RAGE의 게놈 서열(gRAGE)을 암호화하는 DNA로 형질감염 후의 CHO 세포 또는 대조군(스크램블드 RNA 처리된) 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같은, 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 도시한다.
도 5b는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, 엑손 10의 5' 스플라이스 부위를 표적화하는 선택된 AON의 조합의 존재 및 부재하의 인간 RAGE의 게놈 서열(gRAGE)을 암호화하는 DNA로 형질감염 후의 CHO 세포 또는 대조군(스크램블드 RNA 처리된) 세포의 배지에서 가용성 RAGE 단백질의 발현을 도시한다.
도 5c는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, 엑손 10의 3' 및 5' 스플라이스 부위를 표적화하는 선택된 AON의 조합의 존재 및 부재하의 인간 RAGE의 게놈 서열(gRAGE)을 암호화하는 DNA로 형질감염 후의 CHO 세포 또는 대조용 RNA의 배지에서 가용성 RAGE 단백질의 발현을 도시한다. 상자는 AON 3779를 포함하는 처리를 가리킨다.
도 5d는 실시간 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같은, 엑손 10의 인접한 영역을 표적화하는 선택된 AON의 조합의 존재 및 부재하의 인간 RAGE의 게놈 서열을 암호화하는 DNA로 형질감염 후의 CHO 세포 또는 대조군(스크램블드 RNA) 처리된 세포에서 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 도시한다.
도 5e는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, 선택된 AON의 조합의 존재 및 부재하에서 마우스 RAGE의 쥐 게놈 서열을 암호화하는 DNA로 형질감염 후의 CHO 세포 또는 대조군(스크램블드 RNA)의 배지에서 가용성 RAGE 단백질의 발현을 도시한다.
발명의 상세한 설명
안티센스 올리고뉴클레오티드(AON)는 왓슨-크릭 염기 짝짓기(pairing)를 통해 pre-RNA/mRNA에 선택적으로 하이브리드화할 수 있고 표적 RNA의 기능을 선택적으로 조절할 수 있는 DNA 또는 RNA의 짧은 합성의 안티센스 변형 가닥이다.
AON을 사용하여 mRNA의 대체 스플라이싱을 조절하는 경우, AON을 종종 스플라이스-전환 올리고뉴클레오티드(SSO)라 칭한다. 본 발명에서, AON 및 SSO란 용어는 호환 가능하게 사용될 수 있다. SSO는 pre-mRNA와 염기짝을 짓고, RNA-RNA 염기-짝짓기, 또는 스플라이싱 기구의 성분과 pre-RNA 사이에서 발생하는 단백질-RNA 결합 상호작용을 차단함으로써 전사물의 통상적인 스플라이싱 레퍼토리를 방해한다. SSO는 선택된 엑손의 "스키핑" 및/또는 인트론 서열의 유지를 유도하여 번역 산물을 조절할 수 있다. 이는 스플라이스 부위를 직접 표적화하거나 또는 특정 단백질의 결합을 조절하거나 pre mRNA의 2차 구조를 변경시킴으로써 스플라이싱 증대 또는 침묵에 관련된 시스-작용 서열을 표적화함으로써 성취될 수 있다.
치료학적 SSO를, 결함이 있거나 정렬되지 않은 섹션은 스키핑하여 내부적으로는 결실되었지만 이제 치료법으로서 기능하는 단백질을 생성시키는 유전 장애의 치료에 사용할 수 있다.
대체 스플라이싱은 최종당화산물 수용체(RAGE)에 대한 전사-후 유전자 조절의 중요한 층(layer)으로서 인식된다. 대부분의 RAGE는 전장 동형으로 발현되지만, N-말단 절두, C-말단 절두를 갖는 스플라이싱형태, 및 인트론 서열을 유지하는 스플라이싱형태를 포함한 다수의 상이한 암호화 동형이 대체 스플라이싱을 통해 생성된다(스플라이싱형태로서 공지됨). 이러한 상이한 스플라이싱형태는 경쟁 리간드 결합에 의해서 또는 결합 상대로부터 전장 단백질을 대체함으로써 전장 RAGE 수용체의 가능한 조절인자로서 작용할 수 있다. 20개 이상의 스플라이싱형태가 다양한 조직, 예를 들어 폐, 간, 신장, 평활근, 내피세포 및 뇌에서 식별되었다.
상이한 RAGE 유전자 스플라이스 변이체(splice variant)를 인간 유전자 명명법 위원회에 따라 RAGE, RAGE_v1 내지 RAGE_v19라 명명하였다. 예를 들어, 인트론 9(엑손 9b)의 (실행) 유지는 조기 정지, 및 인간에서 순환 RAGE의 ∼5%를 구성하는 C-말단 가용성 스플라이싱형태(RAGE_v1, 내인성 분비성 RAGE 또는 esRAGE)를 생성시키는 막관통 및 세포질 도메인의 완전한 상실을 초래한다. 임의의 신호전달 요소 또는 막관통 도메인의 결여를 고려하면, esRAGE는 미끼 수용체로서 작용하여, 리간드에 대해서 전장 RAGE와 경쟁하거나 리간드 클리어런스(clearance)를 증가시킬 수 있다. esRAGE의 보다 높은 순환 수준은 개선된 건강 결과 및 장수와 연관되지만, 보다 낮은 esRAGE는 다수의 질병 상태, 예를 들어 비제한적으로 죽상동맥경화증, 당뇨병, 대사 증후군, 심혈관 사망률, 빈혈, 자폐증(autism) 및 다양한 종양발생 상태와 연관된다. 재조합 esRAGE에 의한 당뇨병 마우스의 치료는 죽상동맥경화증, 혈관 염증, 신장 및 망막 손상을 감소시킨다.
RAGEΔ(또한 DN RAGE 또는 RAGEv20으로서 공지됨)는 세포내 도메인의 16개 아미노산이 없지만, 리간드 결합 및 막관통 도메인을 유지하며, 따라서 세포 표면 RAGE의 우성-음성 억제제로서 작용한다. 세포외 도메인의 변화를 생성시키는 스플라이싱 사건이 또한 RAGE의 Ig-V 도메인 중 일부 또는 전부의 삽입, 결실 또는 제거에 의해 리간드 결합 도메인에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, N-RAGE는 엑손 3 중의 교번 개시 부위에서 시작하며, 따라서 리간드 결합에 필요한 신호 펩티드 또는 V-도메인이 없다.
RAGE의 이상 스플라이싱(및 따라서 기능장애 RAGE 신호전달)가 당뇨병, 일부 암 및 알쯔하이머병에서 보고되었다.
esRAGE-유형 스플라이싱에서 엑손 10의 스키핑은 고등 진핵생물에서 인트론 길이의 제한에 기인한다. 대략 45 뉴클레오티드가 5' 스플라이스 부위와 분기점을 분리시켜야 하며, 상기 분기점과 3' 스플라이스 부위 사이의 최소 거리는 각각 대략 18 뉴클레오티드인 것으로 보인다. 따라서 70 뉴클레오티드보다 짧은 인트론은 포유동물에서 극히 드물며 효율적으로 스플라이스 아웃(splice out)될 수 없다. 인트론 9의 esRAGE 5' 스플라이스 부위를 선택하면 이 부위와, 엑손 10과 접하는 3' 스플라이스 부위 사이의 거리는 46 뉴클레오티드이며, 이는 인트론 길이의 하한보다 상당히 짧다. 따라서 인트론 9의 하류, esRAGE 5' 스플라이스 부위의 사용과 엑손 10의 포함은 상호 배타적일 수 있다. 분석된 공지된 스플라이스 변이체 중에서, 인트론 9의 하류 esRAGE 5' 스플라이스 부위를 사용한 모든 변이체는 엑손 10을 스키핑하였으며; 대조적으로, 인트론 9에서 상류 RAGE 5' 스플라이스 부위를 사용한 모든 변이체는 엑손 10을 포함하였다. 따라서 입수할 수 있는 증거는 인트론 9의 2개의 대체 5' 스플라이스 부위 중 어느 하나의 선택이 엑손 10의 포함 또는 제외와 결부됨을 가리킨다. 이러한 스플라이싱의 조절 수단 또는 외부 조절 수단은 앞서 알려지지 않았다.
본 발명은 SSO를 사용하여 RAGE pre-mRNA의 대체 스플라이싱 패턴을 선택적으로 조작하여, 비-기능성이거나 또는 전장 RAGE의 리간드 의존적인 활성화 및 리간드-독립적인 전사촉진을 길항하기 위한 미끼 수용체로서 작용하는 어느 한 천연 RAGE mRNA 스플라이싱형태를 생성시킨다.
현저하게, 이들 스플라이스 부위에 공통적인 RAGE 다형성은 존재하지 않는다. RAGE 서열은 고도로 보존된다. 따라서 엑손 스키핑 기술에 의한 유전 장애의 관리와 달리, 개인화 또는 개별화된 서열 변형이 요구하지 않는다.
본 발명은 RAGE pre-mRNA 또는 그의 일부의 대체 스플라이싱을 조절하는 AON의 개발에 의한, RAGE가 발생 또는 진행에 연루되는 질병, 예를 들어 비제한적으로 신경퇴행성 질병, 암, 폐 장애, 또는 염증성 질병의 영향의 대안의 치료, 예방 또는 개선 방법을 제공한다.
광범위하게, 본 발명의 하나의 측면에 따라, 최종당화산물 수용체(RAGE) 유전자 전사물 또는 그의 일부에서 pre-mRNA 스플라이싱을 조절하기 위한 단리되거나 정제된 AON을 제공한다. 바람직하게, RAGE pre mRNA 또는 그의 일부에서 엑손 제외 및/또는 인트론 유지를 유도하기 위한 단리되거나 정제된 AON을 제공한다.
본 발명은 최종당화산물 수용체(RAGE) 유전자 전사물상의 선택된 표적에 결합할 수 있는 AON을 제공하여, 상기 RAGE 유전자 전사물 또는 그의 일부에서의 pre-mRNA 스플라이싱을 조절한다.
예를 들어, 본 발명의 하나의 측면에서, mRNA의 대체 스플라이싱의 조절에 관련된 단백질의 결합과 연관된 RAGE pre-mRNA 또는 그의 일부의 영역에 상보성인 표적화 서열을 포함하는 10 내지 50 뉴클레오티드의 AON을 제공한다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
[표 2]
Figure pct00003
다른 AON 기반 요법과 대조적으로, 본 발명은 RNase H의 모집을 통한 RNA의 증가된 분해를 유도하지 않으며, 여기에서 상기 RNase H는 RAGE 유전자의 DNA에 듀플렉스로 결합된 RNA와 우선적으로 결합하고 이를 분해시킨다. 또한 복제(replication), 전사(transcription), 전위(translocation) 및 번역(translation)과 같은 정상적인 기능을 방해함으로써 생성되는 RAGE 단백질의 양을 조절하기 위해서 RAGE 게놈 DNA에 대한 AON의 하이브리드화 또는 mRNA에 대한 AON의 결합에 의존하지도 않는다. 오히려, AON은 RAGE 유전자 전사물 또는 그의 일부에서 pre-mRNA 스플라이싱을 조절하고 엑손 "스키핑" 또는 인트론 서열의 (실행) 유지를 유도하는데 사용된다. 상기 전략은 바람직하게는 RAGE-의존적인 신호전달을 매개할 수 있는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 감소시키고/시키거나 RAGE-의존적인 신호전달을 매개할 수 있는 기능적 도메인이 없는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 생성을 증가시킨다.
본 발명의 첫 번째 측면에 따라, RAGE 유전자 전사물 또는 그의 일부에서 pre-mRNA 스플라이싱을 조절하기 위해 RAGE 유전자 전사물상의 선택된 표적에 결합할 수 있는 AON을 제공한다. 광범위하게, RAGE 유전자 전사물 또는 그의 일부에서 표적화된 엑손 제외/인트론 유지를 유도하기 위한 단리되거나 정제된 AON을 제공한다.
"단리된"은 고유의 상태에서 일반적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 예를 들어, 본원에 사용된 "단리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "단리된 올리고뉴클레오티드"는 천연 상태에서 측면 인접한 서열로부터 정제되거나 제거된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 게놈 중의 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭할 수 있다. 세포와 관련하여 "단리하는"이란 용어는 공급원 피실험자(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 반복 질병이 있는 피실험자)로부터 세포(예를 들어, 섬유아세포, 림프모구)의 정제를 지칭한다. DNA, mRNA 또는 단백질의 상황에서, "단리"는 공급원, 예를 들어 세포로부터 DNA, mRNA 또는 단백질의 회수를 지칭한다.
AON은 상기가 하이브리드화하는 표적 서열을 "향한다" 또는 "상기 서열에 대해 표적화된다"고 말할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 표적 서열은 예비-가공된 mRNA의 3' 또는 5' 스플라이스 부위, 분기점, 또는 스플라이스 인헨서 및 스플라이스 사일런서 및 스플라이싱에 영향을 미치는 RNA의 2차 구조 결정 부위를 포함한 스플라이스 조절에 관련된 다른 서열을 포함한다. 상기 표적 서열은 엑손 내에 또는 인트론 내에 있거나 인트론/엑손 접합부에 걸쳐 있을 수 있다.
몇몇 구현예에서, AON은 유효한 방식으로 표적 RNA(예를 들어 pre-mRNA)의 영역을 차단하기에 충분한 표적 RNA(즉 스플라이스 부위 선택을 조절하기 위한 RNA)에 대한 서열 상보성을 갖는다. 예시적인 구현예에서, RAGE pre-mRNA의 상기와 같은 차단은 스플라이싱을 달리 조절하는 스플라이시오좀 단백질에 대한 결합 부위를 가리고/가리거나 표적화된 RNA의 구조를 변경시킴으로써, 스플라이싱을 조절하는 작용을 한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 표적 pre-mRNA(예를 들어 RAGE 유전자 pre-mRNA)이다.
표적 RNA의 스플라이싱을 조절하기에 충분한 표적 RNA 서열에 대한 서열 상보성을 갖는 AON은 상기 AON이 스플라이싱을 달리 조절하고/하거나 표적화된 RNA의 3차원 구조를 변경시키는 고유 단백질에 대한 결합 부위의 마스킹(masking)를 촉발하기에 충분한 서열을 가짐을 의미한다.
선택된 AON을 더 짧게, 예를 들어 약 12 염기로, 또는 더 길게, 예를 들어 약 50 염기로 만들 수 있으며, 상기 AON은 서열이 표적 서열에 하이브리드화시 스플라이스 조절(splice modulation)을 수행하기에 충분히 상보성이고 RNA와 함께 45℃ 이상의 Tm을 갖는 헤테로듀플렉스를 임의로 형성하는 한, 소수의 불일치를 포함할 수 있다.
바람직하게, AON은 서열번호 1-31 및/또는 표 3a-3d 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 그룹 중에서 선택된다. 보다 바람직하게, AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다.
몇몇 구현예에서, 표적 서열과 AON간의 상보성 정도는 안정한 듀플렉스를 형성하기에 충분하다. 표적 RNA 서열과의 AON의 상보성 영역은 8-11 염기 정도로 짧을 수 있지만, 12-15 염기 이상, 예를 들어 10-50 염기, 10-40 염기, 12-30 염기, 12-25 염기, 15-25 염기, 12-20 염기, 또는 15-20 염기(이들 범위 사이의 모든 정수 포함)일 수 있다. 약 16-17 염기의 AON이면 일반적으로 특유의 상보성 서열을 갖기에 충분히 길다. 몇몇 구현예에서, 본원에 논의된 바와 같이, 필요한 결합 Tm을 성취하기 위해 최소 길이의 상보성 염기가 요구될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 적어도 최소 수의 염기, 예를 들어 10-12 염기가 표적 서열에 상보성인 경우 50 염기 정도로 긴 올리고뉴클레오티드가 적합할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 세포에서 촉진되거나 활성인 흡수(uptake)는 약 30 염기 미만의 올리고뉴클레오티드 길이에서 최적화된다. 본원에 추가로 기재된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO) AON의 경우, 결합 안정성과 흡수의 최적의 균형은 일반적으로 18-25 염기의 길이에서 존재한다. 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 염기로 이루어지는 AON(예를 들어 PMO, PMO-X, PNA, LNA, TINA, 2'-OMe)이 포함된다.
몇몇 구현예에서, AON은 표적 서열에 100% 상보성이거나, 또는 올리고뉴클레오티드와 표적 서열간에 형성된 헤테로듀플렉스가 생체내에서 발생할 수 있는 세포 뉴클레아제의 작용 및 다른 분해 모드를 견디기에 충분히 안정성인 한, 예를 들어 변이체를 수용하기 위해 불일치를 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드와 표적 서열간에, 약 또는 적어도 약 70% 서열 상보성, 예를 들어 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상보성을 가질 수 있다.
불일치는, 존재하는 경우, 전형적으로는 중간보다는 하이브리드 듀플렉스의 단부 영역을 향해서 덜 불안정화된다. 허용되는 불일치의 수는, 듀플렉스 안정성의 충분히 이해된 원리에 따라, 올리고뉴클레오티드의 길이, 듀플렉스 중 G:C 염기쌍의 백분율 및 듀플렉스 중 불일치(들)의 위치에 따라 변할 것이다. 상기와 같은 AON이 표적 서열에 반드시 100% 상보성일 필요는 없지만, 표적 pre-RNA의 스플라이싱이 조절되도록, 표적 서열에 안정하고 특이적으로 결합하는 것이 유효하다.
AON과 표적 서열간에 형성된 듀플렉스의 안정성은 결합 Tm 및 세포 효소 절단에 대한 듀플렉스의 감수성 작용이다. 상보성-서열 RNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 Tm을 통상적인 방법, 예를 들어 문헌[Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, pp. 107-108]에 기재된 방법 또는 문헌[Miyada C. G. and Wallace R. B., 1987, Oligonucleotide Hybridization Techniques, Methods Enzymol. Vol. 154 pp. 94-107]에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다. 몇몇 구현예에서, AON은 상보성-서열 RNA에 관하여, 체온보다 더 높은, 바람직하게는 약 45℃ 또는 50℃ 초과의 결합 Tm을 가질 수 있다. 60 내지 80℃ 이상 범위의 Tm이 또한 포함된다.
변이체의 추가적인 예는 서열번호 1-31 중 어느 하나 및/또는 표 3a-3d 중 어느 하나에 제시된 서열의 전체 길이에 걸쳐 약 또는 적어도 약 70% 서열 일치성 또는 상동성, 예를 들어 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성 또는 상동성을 갖는 AON을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 AON은 서열번호 11, 18, 19, 또는 20이다.
보다 구체적으로, RAGE 유전자 전사물 또는 그의 일부 중의 pre-mRNA 스플라이싱을 변형시키기 위해 선택된 표적 부위에 결합할 수 있는 AON을 제공한다. 상기 AON은 바람직하게는 서열번호 1-31 및/또는 표 3a-3d 중 어느 하나에 제시된 서열 중에서 선택된다. 보다 바람직하게, 상기 AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다.
pre-mRNA 스플라이싱의 변형은 바람직하게는 mRNA의 하나 이상의 엑손의 "스키핑" 또는 제거 또는 인트론의 유지를 포함한다. 생성된 단백질은 내부 절두 또는 조기 종료로 인해 모 전장 RAGE 단백질과 비교할 때 바람직하게는 더 짧은 길이를 갖는다. 이러한 절두된(truncated) RAGE 단백질을 전장 RAGE 단백질의 스플라이싱형태라 칭할 수 있다.
생성된 mRNA의 남아있는 엑손은 인-프레임일 수 있으며, 원래의 3'과 5' 단부 사이 영역의 내부 절두를 제외하고, 모 전장 단백질의 서열과 유사한 서열을 갖는 보다 짧은 단백질을 생성시킬 수 있다. 또 다른 가능성으로, 엑손 스키핑은 프레임 이동을 유도하여 단백질의 첫 번째 부분이 모 전장 단백질과 실질적으로 동일하지만 상기 단백질의 두 번째 부분이 프레임-이동으로 인해 상이한 서열(예를 들어 넌센스 서열(nonsense sequence))을 갖는 단백질을 생성시킨다. 한편으로, 상기 엑손 스키핑은 판독 프레임의 붕괴 및 번역의 조기 종결의 존재로 인해 조기 종결된 단백질의 생성을 유도할 수 있다. 조기 종결된 단백질은 조기 종결된 mRNA의 결과(예를 들어 엑손 10 및/또는 11의 스키핑)이거나, 또는 인트론으로의 실행(예를 들어 RAGE 9b), 또는 엑손 10 및/또는 11 mRNA를 함유하는 mRNA를 제공하지만 이들 엑손에 의해 암호화된 단백질의 발현은 제공하지 않는 미스센스 스킵(missense skip)의 결과일 수 있다.
엑손 1 내지 9의 개별 엑손의 스키핑은 바람직하게는 RAGE 전사물의 판독 프레임을 붕괴시키는 것이다. 이는 넌센스 매개된 붕괴를 통해 RNA의 증가된 분해로 이어질 것이다.
엑손 1 내지 11의 개별 엑손의 스키핑은 바람직하게는 판독 프레임을 온전하게 유지시킬 것이다. 이는 바람직하게는 내부 절두된 단백질로의 번역으로 이어질 것이다. 절두된 단백질 또는 RAGE mRNA 스플라이싱형태는 완전히 제거된 기능을 갖거나, 감소된 기능을 갖거나, 또는 미끼 수용체로서 작용할 수 있다.
바람직하게, 이들 절두된 넌센스 또는 조기 종결된 단백질은 병치된 GPCR에 의한 RAGE 리간드에 의한 세포내 신호전달 경로의 유도 또는 RAGE의 비-리간드-의존적인 전사촉진과 관련된 하나 이상의 기능성 도메인이 없다. 예를 들어, 엑손 10은 막관통 도메인을 암호화하고 상기 엑손의 제거는 가용성 RAGE 단백질을 생성시킬 수 있으며, 이는 잠재적으로 가용성 미끼 또는 RAGE를 통한 리간드 유도된 신호전달의 경쟁적인 길항제로서 작용할 수 있다. 절두된 넌센스 또는 조기 종결된 단백질은 다른 인자에 대한 부착 또는 결합 부위(이의 제거는 관련된 신호전달 경로와 RAGE 단백질과의 상호작용의 감소로 이어질 수 있다)가 추가로 없을 수 있다.
한편으로, 하나 이상의 엑손의 제거는 RAGE 단백질의 미스폴딩(misfolding) 및 막을 통해 성공적으로 수송되는 단백질의 능력의 감소로 이어질 수 있다.
내부 절두된 단백질(즉 하나 이상의 엑손에 의해 암호화된 아미노산이 없는 단백질)의 존재가 바람직할 수 있다. RAGE 단백질이 억제되는 경우, 신체는 RAGE 단백질 총량의 감소를 보상하고자 하므로 RAGE 전사가 상승한다는 문제가 있을 수 있다. 대조적으로, 내부 절두된 단백질(바람직하게는 완전한 RAGE 단백질의 특징 중 하나 이상이 없는)의 존재는 상승된 전사를 방지하지만 기능성 RAGE 단백질의 총량 감소로 인한 치료 이점을 여전히 제공하기에 충분해야 한다.
본 발명의 AON 유도된 엑손 스키핑은 RAGE 단백질의 기능을 완전히 또는 심지어 실질적으로 제거할 필요는 없다. 바람직하게는, 엑손 스키핑 과정을 통한 대체 스플라이싱의 조절은 RAGE 단백질의 감소된 또는 손상된 기능성을 초래한다.
상이한 스키핑 전략을 사용하여 생성된 RAGE의 상이한 동형들은, 바람직하게는 RAGE 활성과 연관된 다양한 질병, 예를 들어 신경퇴행성 질병, 암, 폐 장애, 또는 염증성 질병의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 신호전달 활성이 제거되거나 감소된 단백질을 생성시킬 수 있다. 대체 스플라이싱 전략은 절두된 단백질 또는 바람직하게는 RAGE 발현 및 활성과 연관된 질병의 특정한 측면, 형태 또는 진행에 대한 치료제로서 사용될 수 있는 감소된 기능을 갖는 단백질을 형성시킬 수 있다.
AON을 사용하는 본 발명의 스키핑 과정은 개별적인 엑손을 제외하거나(스키핑), 또는 2개 이상의 엑손을 한 번에 스키핑할 수 있다.
AON을 사용하는 본 발명의 스키핑 과정은 하나 이상의 엑손의 직접적인 스키핑과 함께 또는 상기 스키핑 없이 인트론 서열의 유지를 포함할 수 있다.
본 발명의 AON은 RAGE 유전자 전사물에서 엑손 제외를 유도하기 위해 선택된 표적에 결합할 수 있는 2개 이상의 AON의 조합일 수 있다. 상기 조합은 2개 이상의 AON의 칵테일 및/또는 2개 이상 또는 2개 이상의 함께 결합된 AON을 포함하는 구조물일 수 있다.
[표 3a]
인간 RAGE 엑손 9에서 대체 스플라이싱의 조절을 위한 AON의 서열
Figure pct00004
[표 3b]
인간 RAGE 엑손 10에서 대체 스플라이싱의 조절을 위한 AON의 서열
Figure pct00005
[표 3c]
인간 RAGE 인트론 9에서 대체 스플라이싱의 조절을 위한 AON의 서열
Figure pct00006
[표 3d]
쥐 RAGE에서 대체 스플라이싱의 조절을 위한 AON의 서열
Figure pct00007
본 발명은 RAGE 유전자 전사물의 대체 스플라이싱을 조절하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은
본원에 기재된 바와 같은 AON 중 하나 이상을 제공하고 상기 올리고머(들)를 표적 핵산 부위에 결합되게 하는
단계를 포함한다.
본 발명의 더욱 또 다른 측면에 따라, 서열번호 1-31 및/또는 표 3a-3d 중 어느 하나에 제시된 서열, 및 상기에 상보성인 서열로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 핵산 서열의 DNA 균등물을 포함하는 RAGE pre mRNA의 대체 스플라이싱을 조절하기 위한 핵산 서열 표적을 제공한다. 보다 바람직하게, 상기 AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다. 상기 AON은 AON의 조합, 바람직하게는 서열번호 11과 10, 또는 서열번호 11과 13의 조합일 수 있다.
일치하는 스플라이스 부위를 완전히 마스킹하기 위한 AON의 설계가, 표적화된 엑손의 스플라이싱의 변화를 반드시 생성시키지 않을 수도 있다. 더욱 또한, 발명자는 상기 AON 자체의 크기 또는 길이가 AON 설계시 항상 1차적인 인자인 것은 아님을 발견하였다. 일부 표적의 경우에, 20 염기 정도로 짧은 AON은 약간의 엑손 포함을, 일부의 경우에 동일한 엑손에 대한 다른 보다 긴(예를 들어 25 염기) 올리고머보다 더 효율적으로 유도할 수 있었다.
발명자는 또한, 스플라이싱을 재지시하기 위해 AON에 의해 차단되거나 마스킹될 수 있는 어떠한 표준 모티프도 존재하지 않는다는 것을 발견하였다. AON이 설계되어야 하고 각각의 유전자 표적에 대한 개별적인 효능이 경험적으로 평가되어야 한다는 것이 밝혀졌다.
보다 구체적으로, AON은 표 3a-3d 중 어느 하나에 제시된 것들 중에서 선택될 수 있다. 상기 서열은 바람직하게는 서열번호 1-31 중 임의의 하나 이상 중 임의의 하나 이상, 및 이들의 조합 또는 칵테일로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 보다 바람직하게, 상기 AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다. 상기 AON의 조합은 바람직하게는 서열번호 11과 10, 또는 서열번호 11과 13의 조합이다. 이는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기와 같은 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열, 상기에 상보성인 서열, 변형된 염기, 변형된 골격, 및 RAGE 유전자 전사물 중의 pre-mRNA 가공 활성을 갖거나 조절하는 기능성 절두 또는 그의 연장부를 함유하는 서열을 포함한다.
상기 올리고머 및 DNA, cDNA 또는 RNA는 각각의 분자 중에 충분한 수의 상응하는 위치가 서로와 수소 결합할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때 서로에 상보성이다. 따라서, "특이적으로 하이브리드화 가능한" 및 "상보성인"은 상기 올리고머와 DNA, cDNA 또는 RNA 표적간에 안정하고 특이적인 결합이 존재하기에 충분한 정도의 상보성 또는 짝짓기를 가리키는데 사용되는 용어이다. 당해 분야에서는 AON의 서열은 특이적으로 하이브리드화할 수 있기 위해 그의 표적 서열에 100% 상보성일 필요는 없는 것으로 이해된다. AON은 표적 DNA 또는 RNA 분자에 대한 상기 화합물의 결합이 표적 DNA 또는 RNA 생성물의 통상적인 기능을 방해하는 경우 특이적으로 하이브리드화 가능하며, 특이적인 결합을 원하는 조건하에서, 즉 생체내 분석 또는 치료학적 치료의 경우에 생리학적 조건하에서, 및 시험관내 분석의 경우에 분석이 수행되는 조건하에서, 비-표적 서열에 대한 AON의 비-특이적 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 존재한다.
선택적인 하이브리드화는 저, 보통 또는 고 엄격성 조건하에서 있을 수 있지만, 고 엄격성하에서 바람직하다. 당업자는 하이브리드화의 엄격성이 염기 조성, 상보성 가닥의 길이 및 하이브리드화 핵산간의 뉴클레오티드 염기 불일치 수 외에, 염 농도, 온도 또는 유기 용매와 같은 조건에 의해 영향을 받음을 알 것이다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 30℃ 초과, 전형적으로 37℃ 초과, 및 바람직하게는 45℃ 초과, 바람직하게는 적어도 50℃ 및 전형적으로 60℃ 내지 80℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 엄격한 염 조건은 통상적으로 1000 mM 미만, 전형적으로는 500 mM 미만, 및 바람직하게는 200 mM 미만일 것이다. 그러나, 매개변수의 조합은 임의의 단일 매개변수의 정도보다 훨씬 더 중요하다. 엄격한 하이브리드화 조건의 일례는 65℃ 및 0.1xSSC(1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 나트륨 시트레이트 pH 7.0)이다. 따라서, 본 발명의 AON은 표 3a-3d 중 어느 하나 또는 서열번호 1-31에 제공된 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 올리고머를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다.
구조 단백질에서 엑손 끝의 코돈 배열은 코돈의 끝에서 항상 파괴될 수 있는 것은 아니며, 결과적으로 mRNA의 인-프레임 판독을 보장하기 위해서 pre-mRNA로부터 하나 초과의 엑손을 결실시킬 필요가 있을 수 있음을 알 것이다. 상기와 같은 상황에서, 다수의 AON을 본 발명의 방법에 의해 선택할 필요가 있으며, 여기에서 각각의 AON은 목적하는 엑손 및/또는 인트론의 포함을 유도하는 역할을 하는 상이한 영역으로 향한다. 주어진 이온 강도 및 pH에서, Tm은 표적 서열의 50%가 상보성 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 온도이다. 상기와 같은 하이브리드화는 표적 서열에 대한 AON의 "거의" 또는 "실질적인" 상보성뿐만 아니라 정확한 상보성으로 발생할 수 있다.
전형적으로, 선택적인 하이브리드화는 적어도 약 14 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 적어도 약 55% 일치성, 바람직하게는 AON의 뉴클레오티드와 적어도 약 65%, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 99% 일치성이 존재할 때 발생할 것이다. 상동성 비교의 길이는 기재된 바와 같이 보다 긴 스트레치(stretch)에 걸쳐 있을 수 있으며 몇몇 구현예에서 종종 적어도 약 9 뉴클레오티드, 대개는 적어도 약 12 뉴클레오티드, 보다 대개는 적어도 약 20, 종종 적어도 약 21, 22, 23 또는 24 뉴클레오티드, 적어도 약 25, 26, 27 또는 28 뉴클레오티드, 적어도 약 29, 30, 31 또는 32 뉴클레오티드, 적어도 약 36 이상의 뉴클레오티드의 신장부에 걸쳐 있을 수 있다.
따라서, 본 발명의 AON 서열은 본원의 서열 목록에 나타낸 서열에 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 86, 87, 88, 89 또는 90% 상동성을 갖는다. 보다 바람직하게는 적어도 91, 92, 93 94, 또는 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96, 97, 98% 또는 99% 상동성이 존재한다. 일반적으로 AON의 길이가 짧을수록, 선택적인 하이브리드화를 획득하는데 필요한 상동성이 커진다. 결과적으로, 본 발명의 AON이 약 30 뉴클레오티드 미만으로 이루어지는 경우, 일치성 백분율은 본원의 서열 목록에 제시된 AON에 비해 75% 초과, 바람직하게는 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95%, 96, 97, 98% 또는 99% 초과인 것이 바람직하다. 뉴클레오티드 상동성 비교를 GCG 위스콘신 베스트핏 프로그램(GCG Wisconsin Bestfit program) 또는 GAP(Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395)와 같은 서열 비교 프로그램에 의해 수행할 수 있다. 이렇게 하여 본원에 인용된 경우와 유사하거나 또는 실질적으로 상이한 길이의 서열을 정렬에 끊김을 삽입하여 비교할 수 있었으며, 상기와 같은 끊김은 예를 들어 GAP에 의해 사용된 비교 알고리즘에 의해 결정된다.
본 발명의 AON은 표적 서열과 감소된 상동성 영역, 및 정확한 상동성 영역을 가질 수 있다. 올리고머는 그의 전체 길이에 대해 정확한 상동성을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 상기 올리고머는 표적 서열에 일치하는 적어도 4 또는 5 염기의 연속적인 신장부, 바람직하게는 표적 서열에 일치하는 적어도 6 또는 7 염기의 연속적인 신장부, 보다 바람직하게는 표적 서열에 일치하는 적어도 8 또는 9 염기의 연속적인 신장부를 가질 수 있다. 상기 올리고머는 표적 서열에 일치하는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 염기의 신장부를 가질 수 있다. 올리고머 서열의 나머지 신장부는 표적 서열과 간헐적으로 일치할 수 있으며; 예를 들어 상기 나머지 서열은 일치하는 염기에 이어서, 일치하지 않는 염기, 이어서 일치하는 염기를 가질 수 있다. 한편으로(또는 또한) 상기 올리고머 서열은 완벽한 상동성 미만의 신장부가 산재된 일치하는 서열(예를 들어 3, 4, 5 또는 6 염기)의 다수의 신장부를 가질 수 있다. 상기와 같은 서열 불일치는 바람직하게는 스플라이스 전환 활성의 손실이 없거나 거의 없을 것이다.
"조절하다"란 용어는 하나 이상의 정량화가능한 매개변수를 임의로 한정되고/되거나 통계학적으로 유의수준인 양까지 "증가시키거나" 또는 "감소시키는" 것을 포함한다. "증가하다" 또는 "증가하는", "증대시키다" 또는 "증대시키는", 또는 "자극하다" 또는 "자극하는"이라는 용어는 일반적으로 AON이 없거나 대조용 화합물에 의해 야기된 반응과 관련하여 세포 또는 피실험자에서 하나 이상의 AON 또는 조성물이 더 큰 생리학적 반응(즉, 하류 효과)을 생성시키거나 야기하는 능력을 지칭한다. "감소하는" 또는 "감소하다"라는 용어는 일반적으로 AON 없이 또는 대조용 화합물에 의해 야기되는 반응에 비해 세포 또는 피실험자에서 감소된 생리학적 반응(즉 하류 효과)을 생성시키거나 야기하는 하나 이상의 AON 또는 조성물의 능력을 지칭한다.
관련된 생리학적 또는 세포 반응(생체내 또는 시험관내)은 당업자에게 명백할 것이며, 상기 반응이 필요한 세포, 조직 또는 피실험자에서 RAGE-암호화 pre-mRNA 중 특정 엑손 배제의 증가, RAGE-암호화 pre-mRNA 양의 감소 또는 기능성 RAGE 단백질 발현의 감소를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "증대된" 양은 전형적으로 통계학적 유의수준의 양이며, AON 없이(작용제의 부재) 또는 대조용 화합물에 의해 생성된 양의 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상(예를 들어 500, 1000배)(상기 사이 또는 1 초과의 모든 정수 및 소숫점, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 포함)의 증가를 포함할 수 있다. "감소시키다" 또는 "억제하다"란 용어는 진단 분야의 통상적인 기법에 따라 측정되는 바와 같이, 일반적으로 하나 이상의 AON 또는 조성물이 관련된 생리학적 또는 세포 반응, 예를 들어 본원에 기재된 질병 또는 상태의 증상을 "감소시키는" 능력에 관한 것일 수 있다. 관련된 생리학적 또는 세포 반응(생체내 또는 시험관내)은 당업자에게 명백할 것이며, 암, 신경퇴행성 질병, 폐 장애, 및 다른 염증성 질병과 같은 질병의 증상 또는 병리의 감소를 포함할 수 있다. 반응의 "감소"는 AON 없이 또는 대조용 조성물에 의해 생성된 반응과 비교하여 통계학적으로 유의수준일 수 있으며, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 감소(이들 사이의 모든 정수 포함)를 포함할 수 있다.
AON의 길이는 상기가 pre-mRNA 분자내의 의도된 위치에 선택적으로 결합할 수 있는 한, 다양할 수 있다. 상기와 같은 서열의 길이를 본원에 기재된 선택 과정에 따라 측정할 수 있다. 일반적으로, AON은 약 10 뉴클레오티드 길이에서부터, 최대 약 50 뉴클레오티드 길이일 것이다. 그러나, 상기 범위내의 뉴클레오티드의 어떠한 길이도 방법에 사용할 수 있음을 알 것이다. 바람직하게, 상기 AON의 길이는 10 내지 40, 10 내지 35, 15 내지 30 뉴클레오티드 길이 또는 20 내지 30 뉴클레오티드 길이, 가장 바람직하게는 약 25 내지 30 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어 상기 올리고머는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "AON"은 핵염기가 와트슨-크리크 염기 짝짓기에 의해 RNA 중의 표적 서열에 하이브리드화하여 상기 표적 서열내에 올리고뉴클레오티드:RNA 헤테로듀플렉스를 형성하게 하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 선형 서열을 지칭한다. "AON", "AON", "올리고머" 및 "안티센스 화합물"이란 용어는 올리고뉴클레오티드를 지칭하기 위해 호환 가능하게 사용될 수 있다. 환상 서브유닛(subunit)은 리보스 또는 또 다른 펜토스 당, 또는 몇몇 구현예에서, 모르폴리노기(하기 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 설명을 참조하시오)에 기반할 수 있다. 또한, 당해 분야에 공지된 다른 안티센스 작용제들 중에서, 펩티드, 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 및 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드가 고려된다.
(i) 변형된 골격 구조, 예를 들어 천연 올리고- 및 폴리뉴클레오티드에서 발견되는 표준 포스포디에스테르 연결 이외의 골격, 및/또는 (ii) 변형된 당 부분(modified sugar moiety), 예를 들어 리보스 또는 데옥시리보스 부분이라기 보다는 모르폴리노 부분을 갖는 AON 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한 비-천연 AON, 또는 "올리고뉴클레오티드 유사체"가 포함된다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 와트슨-크리크 염기 짝짓기에 의해 표준 폴리뉴클레오티드 염기에 수소 결합할 수 있는 염기를 지지하며, 이때 상기 유사체 골격는 올리고뉴클레오티드 유사체 분자와 표준 폴리뉴클레오티드(예를 들어 단일-가닥 RNA 또는 단일-가닥 DNA) 중의 염기간에 서열-특이적인 방식으로 상기와 같은 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 제공한다.
AON의 한 가지 생성 방법은 2' 하이드록시리보스 위치의 메틸화이며 본 발명의 당업자는 본 발명의 목적에 사용될 수 있는 적합한 골격의 다른 형태를 알고 있을 것이지만, 포스포로티오에이트 골격의 통합은 표면적으로 RNA와 유사하나 뉴클레아제 분해에 훨씬 더 내성인 분자를 생성한다.
AON과의 듀플렉스 형성 동안 pre-mRNA의 분해를 피하기 위해, 방법에 사용된 AON을 내인성 RNase H에 의한 절단을 최소화하거나 방지하도록 조정할 수 있다. 이러한 성질은, 세포내 또는 RNase H를 함유하는 조 추출물 중의 메틸화되지 않은 올리고머에 의한 RNA의 처리가 pre-mRNA:AON 듀플렉스의 분해를 유도하기 때문에 대단히 바람직하다. 상기와 같은 분해를 우회하거나 유도하지 않을 수 있는 임의의 형태의 변형된 AON이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 뉴클레아제 내성은 부분적으로 불포화된 지방족 탄화수소 쇄 및 카복실산기, 에스테르기 및 알콜기를 포함하는 하나 이상의 극성 또는 하전된 기를 포함하도록 본 발명의 AON을 변형시킴으로써 성취될 수 있다.
RNA와의 듀플렉스가 세포 RNase H에 의해 절단되지 않는 경우의 AON의 일례는 2'-O-메틸 유도체이다. 상기와 같은 2'-O-메틸-올리고리보뉴클레오티드는 세포 환경 및 동물 조직에서 안정성이며, RNA와의 듀플렉스는 리보- 또는 데옥시리보- 대응물보다 더 높은 Tm 값을 갖는다. 한편으로, 본 발명의 뉴클레아제 내성 AON은 플루오르화된 최종 3'-말단 뉴클레오티드 중 적어도 하나를 가질 수 있다. 더욱 한편으로, 본 발명의 뉴클레아제 내성 AON은 최종 3-말단 뉴클레오티드 염기 중 적어도 2개 사이를 연결하는 포스포로티오에이트 결합을 갖는다, 바람직하게는 최종 4개의 3'-말단 뉴클레오티드 염기 사이를 연결하는 포스포로티오에이트 결합을 갖는다.
증가된 스플라이스-전환은 또한 대안의 올리고뉴클레오티드 화학으로 성취될 수 있다. 예를 들어, AON은 포스포로아미데이트 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO); PMO-X; PPMO; 펩티드 핵산(PNA); 잠금 핵산(LNA) 및 알파-L-LNA, 2'-아미노 LNA, 4'-메틸 LNA 및 4'-O-메틸 LNA를 포함한 유도체; 에틸렌 가교된 핵산(ENA) 및 그의 유도체; 포스포로티오에이트 올리고머; 트리사이클로-DNA 올리고머(tcDNA); 트리사이클로포스포로티오에이트 올리고머; 2'O-메틸-변형된 올리고머(2'-OMe); 2'-O-메톡시 에틸(2'-MOE); 2'-플루오로, 2'-플루오로아라비노(FANA); 풀림 핵산(UNA); 열안정성 비틀린 끼어들기 핵산(TINA), 헥시톨 핵산(HNA); 사이클로헥세닐 핵산(CeNA); 2'-아미노(2'-NH2); 2'-O-에틸렌아민 또는 혼합물로서 또는 갭머(gapmer)로서 상기의 임의의 조합을 포함하는 목록 중에서 선택될 수 있다. 전달 효능을 추가로 개선시키기 위해서, 상기 언급한 변형된 뉴클레오티드를 종종 당 또는 핵염기 부분에 지방산/지질/콜레스테롤/아미노산/탄수화물/다당류/나노입자 등과 접합시킨다. 이들 접합된 뉴클레오티드 유도체를 또한 엑손 스키핑 AON을 구성하는데 사용할 수 있다. 인간 RAGE 유전자 전사물의 안티센스 올리고뉴클레오티드-유도된 스플라이스 변형(splice modification)은 일반적으로 포스포로티오에이트 골격상의 올리고리보뉴클레오티드, PNA, 2OMe 또는 MOE 변형된 염기를 사용하였다. 2OMeAO가 올리고 설계에 사용되지만, 양이온성 리포플렉스로서 전달될 때 시험관내에서 그의 효율적인 흡수로 인해 상기 화합물은 뉴클레아제 분해에 민감하며 생체내 또는 임상 용도에 이상적인 것으로 간주되지 않는다. 대체 화학을 사용하여 본 발명의 AON을 생성시키는 경우, 본원에 제공된 서열의 우라실(U)은 티민(T)으로 대체될 수 있다.
(i) 변형된 골격 구조, 예를 들어 천연 올리고- 및 폴리뉴클레오티드에서 발견되는 표준 포스포디에스테르 연결 이외의 골격, 및/또는 (ii) 변형된 당 부분, 예를 들어 리보스 또는 데옥시리보스 부분이라기 보다는 모르폴리노 부분을 갖는 올리고머를 포함한, 비-천연 올리고머 또는 "올리고뉴클레오티드 유사체"가 본 발명의 AON내에 포함된다. 올리고머 유사체는 와트슨-크리크 염기 짝짓기에 의해 표준 폴리뉴클레오티드 염기에 수소 결합할 수 있는 염기를 지지하며, 이때 상기 유사체 골격는 올리고머 유사체 분자와 표준 폴리뉴클레오티드(예를 들어 단일-가닥 RNA 또는 단일-가닥 DNA) 중의 염기간에 서열-특이적인 방식으로 상기와 같은 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 제공한다. 바람직한 유사체는 실질적으로 하전되지 않은, 인 함유 골격를 갖는 것이다.
RNase H를 활성화하지 않는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 공지된 기법에 따라 제조할 수 있다(예를 들어 미국특허 제 5,149,797 호를 참조하시오). 상기와 같은 AON(데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 서열일 수 있다)은 단순히, 일원으로서 올리고머를 함유하는 듀플렉스 분자에 대한 RNase H의 결합을 입체적으로 방해하거나 방지하는 임의의 구조적 변형을 함유하며, 상기 구조적 변형은 듀플렉스 형성을 실질적으로 방해하거나 저해하지 않는다. 듀플렉스 형성에 관련된 올리고머의 부분은 상기에 대한 RNase H 결합에 관련된 부분과 실질적으로 상이하므로, RNase H를 활성화하지 않는 다수의 AON을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 AON은 뉴클레오티드-간 가교 포스페이트 잔기 중 적어도 하나 또는 전부가 변형된 포스페이트, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포로티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 보라노포스페이트, 아미드 결합 및 포스포아미데이트인 올리고머일 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드간 가교 포스페이트 잔기의 모든 다른 하나는 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 상기와 같은 AON은 뉴클레오티드 중 적어도 하나 또는 전부가 2' 저급 알킬 부분(예를 들어 C1-C4, 선형 또는 분지된, 포화되거나 불포화된 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)인 분자이다. 예를 들어, 상기 뉴클레오티드의 모든 다른 하나는 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
상술한 AON이 본 발명의 AON의 바람직한 형태이지만, 본 발명은 다른 올리고머성 안티센스 분자, 예를 들어 비제한적으로 하기에 기재하는 바와 같은 올리고머 모방물질을 포함한다.
본 발명에 유용한 바람직한 AON의 구체적인 예는 변형된 골격 또는 비-천연 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 올리고머를 포함한다. 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 변형된 골격를 갖는 올리고머는 상기 골격 중에 인 원자를 보유하는 것 및 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해서, 및 때때로 당해 분야에서 참조하는 바와 같이, 뉴클레오시드간 골격 중에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고머가 또한 AON인 것으로 간주될 수 있다.
다른 바람직한 올리고머 모방물질에서, 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 연결, 즉 골격가 모두 새로운 기로 대체된다. 상기 염기 단위는 적합한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 하나의 상기와 같은 올리고머성 화합물, 탁월한 하이브리드화 성질을 갖는 것으로 나타난 올리고머 모방물질을 펩티드 핵산(PNA)이라 칭한다. PNA 화합물에서, 올리고머의 당-골격는 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격로 대체된다. 핵-염기는 유지되며 상기 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접 결합된다.
또 다른 바람직한 화학은 임의의 공지된 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 분해되지 않는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO) 올리고머성 화합물이다. 이들 화합물은 하전되지 않고, RNA 가닥에 결합시 RNase H 활성을 활성화하지 않으며, 생체내 투여후 지속되는 스플라이스 조절을 발휘하는 것으로 나타났다(Summerton and Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-197).
변형된 올리고머는 또한 하나 이상의 치환된 당 부분을 함유할 수 있다. 올리고머는 또한 핵염기(종종 당해 분야에서 간단히 "염기"로서 지칭된다) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 몇몇 핵염기가 본 발명의 올리고머성 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 여기에는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을, 훨씬 더 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 결합시 0.6-1.2℃까지 증가시키는 것으로 나타났다.
본 발명의 올리고머의 또 다른 변형은 상기 올리고머에, 상기 올리고머의 활성, 세포 분배 또는 세포 흡수를 증대시키는 하나 이상의 부분 또는 접합체를 화학적으로 연결시킴을 수반한다. 상기와 같은 부분은 비제한적으로 지질 부분, 예를 들어 콜레스테롤 부분, 콜산, 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 부분, 미리스틸, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부분을 포함한다.
세포 침투 펩티드가 세포 흡수 및 핵 국소화의 증대를 위해 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머에 첨가되었다. 다양한 펩티드 태그가 문헌[Jearawiriyapaisarn et al. (2008), Mol. Ther. 16 9, 1624-1629]에 나타난 바와 같이, 흡수 효율 및 표적 조직 특이성에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
주어진 화합물 중의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 실제로 상기 언급된 변형 중 하나를 초과하는 변형이 단일 화합물 중에 또는 심지어 올리고머내 단일 뉴클레오시드에 통합될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 AON을 포함한다. 본 발명의 상황에서 "키메라" AON 또는 "키메라"는 AON, 특히 2개 이상의 화학적으로 별개의 영역(각각 적어도 하나의 단량체 단위, 즉 올리고머 화합물의 경우 뉴클레오티드를 구성한다)을 함유하는 올리고머이다. 이들 올리고머는 전형적으로, 상기 올리고머가 상기 올리고머 또는 AON에 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수를 부여하도록 변형된 적어도 하나의 영역, 및 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 위한 추가적인 영역을 함유한다.
AON 및 그의 변이체의 활성을 당해 분야의 통상적인 기법에 따라 분석할 수 있다. 예를 들어, 조사된 RNA의 스플라이스 형태 및 발현 수준을 전사된 핵산 또는 단백질의 스플라이스 형태 및/또는 발현의 검출에 대해 주지된 광범위하게 다양한 방법 중 어느 하나에 의해 평가할 수 있다. 상기와 같은 방법의 비제한적인 예는 RNA의 스플라이스된 형태의 RT-PCR에 이은 PCR 산물의 크기 분리, 핵산 하이브리드화 방법, 예를 들어 노던 블럿 및/또는 핵산 배열의 사용; 핵산 증폭 방법; 단백질 검출을 위한 면역학적 방법; 단백질 정제 방법; 및 단백질 기능 또는 활성 분석을 포함한다.
RNA 발현 수준을, 세포, 조직 또는 유기체로부터 mRNA/cDNA(즉 전사된 폴리뉴클레오티드)를 준비하고 상기 mRNA/cDNA를 참조 폴리뉴클레오티드(상기 분석되는 핵산 또는 그의 단편의 보체이다)와 하이브리드화시킴으로써 평가할 수 있다. cDNA를 임의로, 상기 상보성 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화하기 전에 다양한 폴리머라제 쇄 반응 또는 시험관내 전사 방법 중 어느 하나를 사용하여 증폭시킬 수 있다; 바람직하게는 증폭시키지 않는다. 하나 이상의 전사물의 발현을 또한 상기 전사물(들)의 발현 수준을 평가하기 위해서 정량적인 PCR을 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명은 RAGE 유전자 전사물의 AON 유도된 스플라이스-전환, 임상적으로 적합한 올리고머 화학 및 RAGE 스플라이스 조작(splice manipulation)을 치료학적 수준으로 지시하는 전달 시스템을 제공한다. RAGE 유전자 전사로부터 전장 RAGE mRNA, 및 따라서 RAGE 단백질 량의 실질적인 감소는
a) (i) 인트론-인헨서 표적 모티프, (ii) 올리고머 칵테일의 AON 길이 및 발달, (iii) 화학 선택, 및 (iv) 올리고머 전달을 증대시키기 위한 세포-침투 펩티드(CPP) 첨가의 실험적 평가를 통한, 섬유아세포 세포주를 사용하는 시험관내 올리고머 정제; 및
b) 하나 이상의 누락 엑손을 갖는 RAGE 전사물을 생성시키기 위한 새로운 접근법의 상세한 평가
에 의해 성취된다.
이와 같이, RAGE pre-mRNA의 대체 스플라이싱을 특정한 AON으로 조절할 수 있음이 입증된다. 이러하게 하여 전장(신호전달 가능한) RAGE 단백질 량의 기능상 현저한 감소를 획득할 수 있고/있거나 비-신호전달 미끼-수용체 RAGE mRNA 스플라이싱형태(RAGE_v1) 또는 다른 미끼 수용체의 증가가 성취될 수 있으며, 이에 의해 신경퇴행성 질병, 암, 폐 장애, 및 다른 염증성 질병과 같은 질병과 연관된 중증 병리를 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 AON을 편의상 주지된 고상 합성 기법을 통해 제조할 수 있다. 상기와 같은 합성을 위한 장비는 예를 들어 Applied Biosystems(Foster City, Calif.)를 포함한 다수의 판매사에 의해 판매된다. 변형된 고체 지지체상에서 올리고머를 합성하는 한 가지 방법이 미국특허 제 4,458,066 호에 기재되어 있다.
당해 분야에 공지된 상기와 같은 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가로 또는 대안으로 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 올리고머를 제조하기 위한 유사한 기법을 사용하는 것이 공지되어 있다. 하나의 상기와 같은 자동화된 구현예에서, 디에틸-포스포로아미다이트가 출발 물질로서 사용되며 문헌[Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다.
본 발명의 AON을 시험관내에서 합성하며 이는 생물학적 기원의 안티센스 조성물, 또는 AON의 생체내 합성을 지시하도록 설계된 유전자 벡터 구조물을 포함하지 않는다. 본 발명의 분자를 또한 흡수, 분배 및/또는 통합을 지원하기 위해, 예를 들어 리포솜, 수용체 표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제형으로서, 다른 분자, 분자 구조물 또는 화합물들의 혼합물과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 달리 연관시킬 수 있다.
본 발명의 AON을 또한 예방학적 또는 치료학적으로 사용할 수 있으며, 이를 질병 치료 목적으로 이용할 수 있다. 상응하게, 하나의 구현예에서 본 발명은 치료학적으로 유효한 양으로, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합된, 본원에 기재된 바와 같은 효율적이고 일관된 엑손 스키핑을 유도하기 위한 RAGE pre-mRNA 중의 선택된 표적에 결합하는 AON을 제공한다.
따라서 본 발명은 환자에서 RAGE 발현과 연관된 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약학적, 예방학적 또는 치료학적 조성물을 제공하며, 상기 조성물은
a) 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 AON, 및
b) 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제
를 포함한다.
바람직하게 RAGE 발현과 연관된 질병은 신경학적 장애, 암; 심혈관 장애; 소화 장애; 호흡 장애, 근골격근, 결합조직 장애, 신장 장애, 생식기 장애, 피부 장애, 눈 장애 및 내분비 장애를 포함하는 목록 중에서 선택된다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 죽상동맥경화증, 허혈성 심장 질환, 심근염(myocarditis), 심내막염(endocarditis), 심근병증(cardiomyopathy), 급성 류머티스열(acute rheumatic fever), 만성 류머티스성 심장병(chronic rhematic heart disease), 뇌혈관 질환/뇌졸중(cerebrovascular disease/stroke), 심부전(heart failure), 혈관 석회화(vascular calcification), 말초 혈관 질환(peripheral vascular disease) 및 림프관염(lymphangitis) 중에서 선택된 심혈관 장애이다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 치주염(periodontitis), 식도염(oesophagitis), 위염(gastritis), 위-십이지장 궤양(gastro-duodenal ulceration), 크론병(Crohn disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 허혈성 대장염(ischaemic colitis), 장염(enteritis) 및 전장염(enterocolitis), 복막염(peritonitis), 알콜성 간 질환(alcoholic liver disease), 간염(hepatitis), 독성 간 질환(toxic liver disease), 담도 간경변증(biliary cirrhosis), 간 섬유증(hepatic fibrosis)/간경변증(cirrhosis), 비-알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease)/비-알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis)(NAFLD/NASH), 간 외상(liver trauma) 및 간 손상, 외상 또는 수술로부터의 회복 중에서 선택된 소화계 장애이다.
본 발명의 하나의 형태에서, RAGE-관련 장애는 입술, 구강 및 인두의 악성 신생물, 소화 기관의 악성 신생물, 호흡기 및 흉부 기관의 악성 신생물, 뼈 및 관절 연골의 악성 신생물, 흑색종 및 기타 피부의 악성 신생물, 중피 및 연조직의 악성 신생물, 유방의 악성 신생물, 여성 생식기의 악성 신생물, 남성 생식기의 악성 신생물, 요로의 악성 신생물, 눈, 뇌 및 중추신경계의 다른 부분의 악성 신생물, 갑상선 및 기타 내분비선의 악성 신생물, 림프구의 악성 신생물, 조혈 및 관련 조직, 불분명, 이차 및/또는 불특정 부위의 악성 신생물 중에서 선택된 암이다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 신경 장애이며, 중추신경계의 염증성 질환, 주로 중추신경계에 영향을 미치는 전신 위축, 추체외로 및 운동 장애(extrapyramidal and movement disorders), 파킨슨병(Parkinson's disease), 중추신경계 탈수초성 질환(demyelinating diseases of the central nervous system), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 외접뇌위축(circumscribed brain atrophy), 루이소체병(Lewy body disease), 간질(epilepsy), 편두통(migraine), 신경병성 통증(neuropathic pain), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 다발신경병증(polyneuropathies), 신경교종 발생 및 진행(glioma development and progression), 척수외상(spinal cord trauma), 및 허혈성 뇌손상/뇌종줄, 뇌 외상 및 뇌 손상, 외상 또는 수술로부터의 회복 중에서 선택된다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 근골격 장애이며 근이영양증(muscular dystrophy), 선천성 및 저장성 근병증(congenital and storage myopathy), 다발근염(polymyositis), 중증 근무력증(myasthaemic gravis), 피부근염(dermatomyositis), 봉입체 근염(inclusion body myositis), 근육 위축(muscle atrophy) 및 근육 손상 중에서 선택된다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 정신 장애이며 치매(dementia), 알쯔하이머병, 혈관성 치매(vascular dementia), 중독(addiction), 조현병(schizophrenia), 주요 정동 장애(major affective disorder), 우울증(depression), 조증(mania), 양극성 장애(bipolar disorder) 및 불안 장애(anxiety disorder) 중에서 선택된다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 호흡기(폐) 장애이며 급성 상기도 감염(Acute upper respiratory infections), 비염(rhinitis), 비인두염(nasopharyngitis), 부비동염(sinusitis), 후두염(laryngitis), 인플루엔자 및 폐렴(influenza and pneumonia), 급성 기관지염(acute bronchitis), 급성 세기관지염(acute bronchiolitis), 천식(asthma), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD), 기관지확장증(bronchiectasis), 폐기종(emphysema), 외부 인자로 인한 만성 폐 질환, 급성 호흡곤란 증후군(Acute Respiratory Distress Syndrome)(ARDS), 폐 호산구 증가증(pulmonary eosinophilia) 및 흉막염(pleuritic), 폐 외상 및 폐 손상, 외상 또는 수술로부터의 회복 중에서 선택된다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 결합 조직 장애이고, 골관절염(osteoarthritis), 감염성 관절염, 류머티스성 관절염, 건선 및 장병성 관절병증(psoriatic and enteropathic arthropathies), 소아 관절염(juvenile arthritis), 통풍(gout) 및 기타 결정성 관절병증(crystal arthropathies), 당뇨성 관절병증(diabetic arthropathy), 결절 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 쳐그-스트라우스(Churg-Strauss), 점막피부 림프절 증후군(mucocutaneous lymph node syndrome)[Kawasaki], 과민성 혈관염(hypersensitivity angiitis), 굿파스쳐 증후군(Goodpasture syndrome), 혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy), 베게너 육아종증(Wegener granulomatosis), 대동맥궁 증후군(Aortic arch syndrome)[Takayasu], 거대 세포 동맥염(giant cell arteritis), 다발성 류머티스성 관절염(polymyalgia rheumatica), 미세 다발혈관염(microscopic polyangiitis), 저보체혈성 혈관염(hypocomplementaemic vasculitis), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부다발근염(dermatopolymyositis), 다발근염(polymyositis), 전신 경화증(systemic sclerosis), CR(E)ST 증후군, 시카 증후군(Sicca syndrome)[Sj
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gren], 혼합 결합조직 질환(mixed connective tissue disease), 베체트병(Behcet disease), 외상성 근육 손상(traumatic muscle damage), 염좌(sprain), 좌상(strain), 및 골절(fracture) 중에서 선택된다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 신장 장애이며, 사구체신염(glomerulonephritis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장 질환(diabetic kidney disease), 간질성 신장염(interstitial nephritis), 폐쇄성 및 역류성 신병증(obstructive and reflux nephropathy), 급성 신부전(acute renal failure) 및 만성 신장병(chronic kidney disease) 중에서 선택된다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 생식기 장애이고, 전립선염(prostatitis), 전립선 비대(prostatic hypertrophy), 전립선 이형성증(prostatic dysplasia), 난관염(salpingitis), 난소염(oophoritis), 골반 염증성 질환(pelvic inflammatory disease)(PID), 다낭성 난소 증후군(polycystic ovarian syndrome), 자궁경부염(cervicitis), 자궁경부 이형성증(cervical dysplasia), 질염(vaginitis), 외음부염(vulvitis) 중에서 선택된다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 피부염(dermatitis), 습진(eczema), 천포창/유사천포창(pemphigus/pemphygoid), 건선, 장미빗 비강진(pityriasis rosea), 편평태선(lichen planus), 두드러기(urticarial), 다형 홍반(erythrema multiforme), 결절성 홍반(erythema nordosum), 일광화상, 각화증(keratosis), 광노화 피부 궤양(photoageing skin ulceration), 표재성 피부 손상(superficial skin injury) 및 개방 상처 중에서 선택된 피부 장애이다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 각막염(keratitis), 결막염(conjunctivitis), 망막염(retinitis), 녹내장(glaucoma), 공막염(scleritis), 상공막염(episcleritis), 맥락망막 염증(chorioretinal inflammation), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 황반 부종(macular oedema), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 및 시신경염(optic neuritis), 눈 외상 및 눈 부상, 외상 또는 수술로부터의 회복 중에서 선택된 눈 장애이다.
본 발명의 한 형태에서, RAGE-관련 장애는 당뇨병, 인슐린 저항성, 내당능 장애 및 갑상선염(thyroiditis) 중에서 선택된 내분비 장애이다.
상기 조성물은 약 1 nM 내지 1000 nM의 각각의 본 발명의 목적하는 AON(들)을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 조성물은 약 1　nM 내지 500 nM, 10 nM 내지 500 nM, 50 nM 내지 750 nM, 10 nM 내지 500 nM, 1 nM 내지 100 nM, 1 nM 내지 50 nM, 1 nM 내지 40 nM, 1 nM 내지 30 nM, 1 nM 내지 20 nM, 가장 바람직하게는 1 nM 내지 10 nM의 각각의 본 발명의 AON(들)을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약 1 ㎚, 2 ㎚, 3 ㎚, 4 ㎚, 5 ㎚, 6 ㎚, 7 ㎚, 8 ㎚, 9 ㎚, 10 ㎚, 20 ㎚, 50 ㎚, 75 ㎚, 100 ㎚, 150 ㎚, 200 ㎚, 250 ㎚, 300 ㎚, 350 ㎚, 400 ㎚, 450 ㎚, 500 ㎚, 550 ㎚, 600 ㎚, 650 ㎚, 700 ㎚, 750 ㎚, 800 ㎚, 850 ㎚, 900 ㎚, 950 ㎚ 또는 1000 ㎚의 각각의 본 발명의 목적하는 AON(들)을 포함할 수 있다.
본 발명은 환자에게 전달하기에 적합한 형태로 RAGE 발현 관련 질병 또는 병리와 같은 질병의 증상의 예방학적 또는 치료학적 치료, 예방 또는 개선을 돕기에 적합한 하나 이상의 AON을 추가로 제공한다.
"약학적으로 허용가능한"이란 어구는 생리학적으로 허용되고 환자에게 투여될 때 일반적으로 알러지 또는 유사한 부작용, 예를 들어 위장 장애 등을 일으키지 않는 분자 개체 및 조성물을 지칭한다. "담체"란 용어는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약학적 담체는 물과 같은 멸균 액체 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일 및 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등과 같은 무균 액체일 수 있다. 물 또는 염수 용액 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액이 바람직하게는 특히 주사용 용액에 대해 담체로서 사용된다. 적합한 약학적 담체는 문헌[Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990)]에 기재되어 있다.
본 발명의 보다 특정한 형태에서 치료 유효량의 본 발명의 하나 이상의 AON을 약학적으로 허용가능한 희석제, 보존제, 용해제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기와 같은 조성물은 다양한 완충제 함량(예를 들어 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제 및 첨가제, 예를 들어 세제 및 용해제(예를 들어 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 산화방지제(예를 들어 아스코르브산, 나트륨 메타비설파이트), 보존제(예를 들어 티메로살, 벤질 알콜) 및 벌크화 물질(예를 들어 락토스, 만니톨)을 포함한다. 상기 물질을 중합체성 화합물, 예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 미립자 제제 또는 리포솜에 혼입시킬 수 있다. 히알루론산을 또한 사용할 수 있다. 상기와 같은 조성물은 본 발명의 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출속도, 및 생체내 클리어런스 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어 문헌[Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712](본원에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 상기 조성물은 액체 형태로 제조되거나, 또는 건조 분말, 예를 들어 동결건조된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 따라 제공된 약학 조성물을 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 투여할 수 있음을 알 것이다. 바람직하게, 상기 투여를 위한 약학 조성물을 주사에 의해, 경구로, 국소적으로 또는 폐 또는 코 경로에 의해 투여한다. 적합한 경로는 치료 중인 피실험자의 조건에 적합한 대로 당업자에 의해 결정될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 개시내용의 AON을 폐 또는 코 경로(예를 들어 상기 AON을 포함하는 흡입되는 염수를 통해)에 의해 전달할 수 있다. 건강한 인간 조직에서 RAGE mRNA의 최고의 내인성 발현은 폐에서 발견되며 기도를 통해 접근가능하다. 흡입된 올리고뉴클레오티드는 호흡기 질환에 떠오르는 치료 양상이다. 기도는 주로 양쪽 이온성 지질로 구성된 폐 계면활성제로 독특하게 늘어서 있다. 이러한 계면활성제 지질은 기도의 pH에서 양이온 특성을 가지고 있다. 음이온성 올리고뉴클레오티드를 흡입하면 계면활성제에 흡착되는 경향이 있어, 기관지 및 폐포 상피 세포에 의해 폐 세포로 효율적으로 흡수되는 것으로 가정된 재구성된 입자가 생성된다. 참고로 AON은 분무 과정을 견딜 수 있는 것으로 나타났다.
몇몇 구현예에서, AON은 보다 바람직하게는 정맥내, 동맥-내, 복강내, 근육내 또는 피하 투여 경로에 의해 전달된다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계 및 뇌척수액은 AON이 도입될 수 있는 일부 비제한적인 부위이다.
몇몇 구현예에서, 직접적인 CNS 전달이 사용될 수 있으며, 예를 들어 뇌실내 또는 척추강내 투여가 투여 경로로서 사용될 수 있다.
국소 투여용 제형은 본 개시내용의 올리고머가 국소 전달제, 예를 들어 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 혼합된 것들을 포함한다. 지질 및 리포솜은 중성(예를 들어 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜콜린 DMPC, 디스테아롤리포스파티딜콜린), 음성(예를 들어 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들어 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 국소 또는 기타 투여를 위해, 본 개시내용의 올리고머는 리포솜 내에 캡슐화될 수 있거나 이에 대한 복합체, 특히 양이온성 리포솜에 대한 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 올리고머는 지질, 특히 양이온성 지질과 복합체화될 수 있다. 지방산 및 에스테르, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 그의 용도는 미국특허 제 6,287,860 호 및/또는 1999년 5월 20일자로 출원된 미국특허 제09/315,298호에 추가로 기재된다.
몇몇 구현예에서, 본 개시내용의 AON은 경피 방법에 의해 전달될 수 있다(예를 들어, AON을 예를 들어 유화액에 혼입시키는 것을 통해, 이때 상기와 같은 AON은 임의로 리포솜에 패키징된다). 이러한 경피 및 유화액/리포솜-매개 전달 방법은 당해 분야에, 예를 들어 미국특허 제 6,965,025 호에 AON의 전달에 대해서 기재된다.
본원에 기재된 AON은 또한 이식가능한 장치를 통해 전달될 수 있다. 상기와 같은 장치의 설계는 당해 분야에서 인정되는 과정이며, 예를 들어 미국특허 제 6,969,400 호에 기재된 합성 임플란트 설계이다.
경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 미세미립자, 나노미립자, 물 또는 비수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 젤 캡슐, 사쉐, 정제 또는 미니정제를 포함한다. 증점제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 경구 제형은 본 개시내용의 올리고머가 하나 이상의 침투 향상제 계면활성제 및 킬레이트제와 함께 투여되는 제형이다. 계면활성제는 지방산 및/또는 그의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 그의 염을 포함한다. 담즙산/염 및 지방산 및 이들의 용도는 미국특허 제 6,287,860 호에 추가로 기재된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 침투 향상제의 조합, 예를 들어 담즙산/염과 조합된 지방산/염을 제공한다. 예시적인 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 추가적인 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 개시내용의 올리고머는 분무 건조된 입자를 포함하는 과립 형태로 경구로 전달될 수 있거나, 복합체화되어 미세 또는 나노입자를 형성할 수 있다. 올리고머 착화제 및 이들의 용도는 미국특허 제 6,287,860 호에 추가로 기재된다. 올리고머에 대한 경구 제형 및 그의 제조는 1999년 5월 20일자로 출원된 미국 특허 제 6,887,906, 09/315,298 호 및/또는 US20030027780에 상세히 기재되어 있다.
비경구, 경막내 또는 뇌실내 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제, 예를 들어 비제한적으로 침투 향상제, 담체 화합물 및 기타 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
치료학적으로 유용한 양의 AON의 전달은 앞서 공개된 방법에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, AON의 세포내 전달은 AON과 유효량의 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 조성물을 통해 이루어질 수 있다. 상기 방법의 예는 미국특허 출원 US20040248833에 기재되어 있다. AON을 핵으로 전달하는 다른 방법은 문헌[Mann CJ et al. (2001) Proc, Natl. Acad. Science, 98(1) 42-47], 및 문헌[Gebski et al. (2003) Human Molecular Genetics, 12(15): 1801-1811]에 기재되어 있다. 네이키드 DNA로서 또는 지질 운반체에 복합체화된 발현 벡터를 통해 핵산 분자를 세포 내로 도입시키는 방법이 미국특허 제 6,806,084 호에 기재되어 있다.
콜로이드 분산 시스템에서 AON을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 콜로이드 분산 시스템에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드 및 수중유적형 유화액, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜 또는 리포솜 제형을 포함한 지질 기반 시스템이 포함된다. 이들 콜로이드성 분산 시스템은 치료학적 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
리포솜은 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 유용한 인공 막 소포이다. 이러한 제형은 순 양이온, 음이온 또는 중성 전하 특성을 가질 수 있으며 시험관내, 생체내 및 생체외 전달 방법에 유용한 특성을 가질 수 있다. 큰 단일층 소포는 큰 거대분자를 포함하는 상당 비율의 수성 완충액을 캡슐화할 수 있는 것으로 나타났다. RNA 및 DNA는 수성 내부에 캡슐화되어 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981).
리포솜이 효율적인 유전자 전달 비히클이 되기 위해서는 하기의 특성이 있어야 한다: (1) 생물학적 활성을 손상시키지 않으면서 높은 효율로 관심 AON의 캡슐화; (2) 비-표적 세포와 비교하여 표적 세포에 대한 우선적이고 실질적인 결합; (3) 소포의 수성 내용물을 표적 세포 세포질로 고효율로 전달; 및 (4) 유전 정보의 정확하고 효과적인 발현(Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988). 리포솜의 조성은 일반적으로 인지질, 특히 높은 상-전이-온도 인지질의 조합이며, 일반적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 또한 사용될 수 있다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 다르다. 양이온성 리포솜은, 음으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 것으로 여겨지는 양으로 하전된 리포솜이다. pH에 민감하거나 음으로 하전된 리포솜은 DNA와 복합체를 이루기보다는 DNA를 포집하는 것으로 여겨진다. 양이온 및 비양이온 리포솜 모두 DNA를 세포에 전달하는데 사용되었다.
리포솜은 또한 "입체적으로 안정화된" 리포솜을 포함하며, 이 용어는 본원에서 사용되는 바와 같이, 리포솜에 통합될 때 이러한 특수화된 지질이 결여된 리포솜에 비해 순환 수명을 증대시키는 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포솜을 지칭한다. 입체적으로 안정화된 리포솜의 예는 리포솜의 소포-형성 지질 부분의 일부가 하나 이상의 당지질을 포함하거나 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분과 같은 하나 이상의 친수성 중합체를 갖는 유도체인 것들이다. 리포솜 및 그의 용도는 미국특허 제 6,287,860 호에 추가로 기재되어 있다.
본원에 기재된 AON은 또한 이식가능한 장치를 통해 전달될 수 있다. 이러한 장치의 설계는 예를 들어, 미국특허 제 6,969,400 호에 기재된 합성 임플란트 설계와 함께 당업계에 인정된 과정이며, 상기 특허는 내용 전체가 본원에 참고로 인용된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 당해 분야에서 인정되는 기법(예를 들어, 형질감염, 전기천공(electroporation), 융합, 리포솜, 콜로이드성 중합체성 입자 및 바이러스 및 비-바이러스 벡터 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 수단)을 사용하여 세포 내로 도입시킬 수 있다. 선택된 전달 방법은 적어도 치료하고자 하는 세포 및 세포의 위치에 따라 변할 것이며 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 국소화는 리포솜을 지시하기 위해 표면에 특이적 마커를 갖는 리포솜, 표적 세포를 함유하는 조직 내로의 직접 주사, 특정한 수용체-매개된 흡수 등에 의해 성취될 수 있다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, AON은 예를 들어 리포솜-매개된 흡수, 지질 접합체, 폴리리신-매개된 흡수, 나노입자-매개된 흡수, 및 수용체-매개된 세포내이입 뿐만 아니라 추가적인 비-세포내이입 전달 방식, 예를 들어 미세주입, 투과화(예를 들어 스트렙토리신-O 투과화, 음이온성 펩티드 투과화), 일렉트로포레이션, 및 당해 분야에 공지된 다양한 비-침습성 비-세포내이입 전달 방법을 수반하는 방법을 사용하여 전달될 수 있다(문헌[Dokka and Rojanasakul, Advanced Drug Delivery Reviews 44, 35-49](내용 전체가 참고로 인용된다)을 참조하시오).
AON을 또한 다른 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 조합하여 약학 조성물을 생성시킬 수 있다. 적합한 담체 및 희석제는 등장성 염수 용액, 예를 들어 포스페이트-완충된 염수를 포함한다. 상기 조성물은 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 안내, 경구 또는 경피 투여용으로 제형화될 수 있다.
기재된 투여 경로는 숙련된 의사가 최적의 투여 경로 및 임의의 특정 동물 및 상태에 대한 임의의 투여량을 용이하게 결정할 수 있기 때문에 단지 지침만을 의도한다.
시험관내 및 생체내 둘 다에서 기능상 새로운 유전 물질을 세포 내로 도입하기 위한 다수의 접근법이 시도되어 왔다(Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280). 이러한 접근법에는 변형된 레트로바이러스 내로 발현시키고자 하는 유전자의 통합(Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S); 비-레트로바이러스 벡터로의 통합(Rosenfeld, et al.(1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld, et al.(1991) Science, 252:431-434); 또는 리포솜을 통해 이종 프로모터-인헨서 요소에 연결된 트랜스유전자의 전달(Friedmann(1989), supra; Brigham, et al.(1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-311; Nabel, et al. (1990) Science, 249:1285-1288, Hazinski, et al.(1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209, Wang and Huang(1987) Proc. Natl. Acad Sci.(USA), 84:7851-7855); 리간드-특이적인 양이온-기반 수송 시스템에의 결합(Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624) 또는 네이키드 DNA, 발현 벡터의 사용(Nabel et al.(1990), Supra); Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468)이 포함된다. 조직 내로의 트랜스유전자의 직접 주입은 국소화된 발현만을 생성시킨다(Rlosenfeld (1992) supra); Rosenfeld et al. (1991) supra; Brigham et al. (1989) supra; Nabel(1990) supra; 및 Hazinski et al. (1991) supra). Brigham 등의 그룹(Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-311 및 Clinical Research(1991) 39(abstract))은 DNA 리포솜 복합체의 정맥내 또는 기관내 투여 후 오직 마우스 폐에서의 생체내 형질감염을 보고하였다. 인간 유전자 요법 시술에 대한 리뷰 논문의 일례는 하기와 같다: Anderson, Science (1992) 256:808-813; Barteau et al. (2008), Curr Gene Ther; 8(5):313-23; Mueller et al. (2008). Clin Rev Allergy Immunol; 35(3):164-78; Li et al. (2006) Gene Ther., 13(18):1313-9; Simoes et al. (2005) Expert Opin Drug Deliv; 2(2):237-54.
본 발명의 AON은 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 인간을 포함하는 동물에 투여시 생물학적 활성 대사산물 또는 그의 잔사를 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다. 따라서, 일례로서, 본 개시내용은 또한 본 발명의 화합물의 전구약물 및 약학적으로 허용가능한 염, 이러한 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염, 및 기타 생물학적 등가물에 관한 것이다.
"약학적으로 허용가능한 염"이란 용어는 본 발명의 화합물의 생리학적으로 및 약학적으로 허용가능한 염, 즉 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 이에 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 올리고머의 경우, 약학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예는 비제한적으로 (a) 양이온, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예를 들어 스페르민 및 스페르미딘으로 형성된 염; (b) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등으로 형성된 산 부가염; (c) 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌디설폰산, 폴리갈락투론산 등으로 형성된 염; 및 (d) 염소, 브롬 및 요오드와 같은 원소 음이온으로부터 형성된 염을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료하고자 하는 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(안구 및 점막뿐만 아니라 직장 전달 포함), 폐, 예를 들어 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입(분무기, 기관내, 비강내, 표피 및 경피에 의한 투여 포함), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예를 들어, 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다. 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형을 갖는 올리고머가 경구 투여에 특히 유용한 것으로 여겨진다. 바람직하게, AON은 피하 또는 정맥내 경로를 통해 전달된다.
단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있는 본 발명의 약학 제형은 제약 산업에 주지된 통상적인 기법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기법에는 활성 성분을 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)와 회합시키는 단계가 포함된다. 일반적으로 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체와 균일하고 친밀하게 회합시키고, 이어서 필요한 경우 생성물을 성형함으로써 제조된다.
하나의 구현예에서, AON을 적어도 200-400 nM AON의 최대 혈액 농도를 생성시키기에 유효한 양 및 방식으로 투여한다. 전형적으로, AON의 1회 이상의 용량을 일반적으로 약 1 내지 2주의 기간 동안 규칙적인 간격으로 투여한다. 경구 투여에 바람직한 용량은 70 ㎏당 약 1 ㎎ 내지 1000 ㎎의 올리고머이다. 일부의 경우에, 환자당 1000 ㎎을 초과하는 용량의 올리고머가 필요할 수 있다. i.v. 투여의 경우, 바람직한 용량은 70 ㎏당 약 0.5 ㎎ 내지 1000 ㎎의 올리고머이다. 정맥내 또는 피하 투여의 경우, AON을 매일 또는 매주 약 120 ㎎/㎏의 투여량으로 투여할 수 있다.
AON을 단기간 동안 규칙적인 간격으로, 예를 들어 2주 이하 동안 매일 투여할 수 있다. 그러나, 일부의 경우 올리고머를 장기간에 걸쳐 간헐적으로 투여한다. 투여에 이어서, 또는 투여와 동시에 항생제 또는 다른 치료제 치료를 투여할 수 있다. 치료 섭생을 면역 분석, 기타 생화학적 검사 및 치료 중인 피실험자의 생리학적 검사 결과에 따라 지시된 대로 조절할 수 있다(용량, 빈도, 경로 등).
투여는 치료하고자 하는 질병 상태의 중증도 및 반응성에 따라 달라지며, 이때 치료 과정은 수일 내지 수개월 동안 지속되거나, 또는 치유가 이루어지거나 질병 상태의 감소가 달성될 때까지 지속된다. 최적의 투여 일정은 환자의 체내에 축적된 약물을 측정하여 계산될 수 있다. 당업자는 최적의 투여량, 투여 방법 및 반복률을 쉽게 결정할 수 있다. 최적의 투여량은 개별적인 올리고머의 상대적인 효능에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 유효한 것으로 밝혀진 EC50을 기반으로 추정될 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 ㎏ 당 0.01 ㎍ 내지 100 g이며, 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상, 또는 심지어 2 내지 20년마다 1회 제공될 수 있다. 당업자는 체액 또는 조직 내 약물의 측정된 체류 시간 및 농도에 기초하여 투여 반복률을 쉽게 추정할 수 있다. 성공적인 치료 후, 환자가 질병 상태의 재발을 방지하기 위해 유지 요법을 받는 것이 바람직할 수 있으며, 여기에서 상기 올리고머는 체중 ㎏당 0.01 ㎍ 내지 100 g 범위의 유지 용량으로 1일 1회 이상 내지 20년마다 1회 투여된다.
본 발명의 AON을 사용하는 유효한 생체내 치료 요법은 지속기간, 용량, 빈도 및 투여 경로뿐만 아니라 치료 중인 피실험자의 상태에 따라 달라질 수 있다(즉, 예방학적 투여 대 국소 또는 전신 감염에 대한 투여). 따라서, 상기와 같은 생체내 요법은 종종 최적의 치료 결과를 달성하기 위해 치료 중인 특정 유형의 장애에 적합한 시험에 의한 모니터링 및 용량 또는 치료 요법의 상응하는 조정을 필요로 할 것이다.
치료는 예를 들어 당해 분야에 공지된 질병의 일반적인 지표에 의해 모니터링될 수 있다. 본 발명의 생체내 투여된 AON의 효능은 AON의 투여 전, 투여 중 및 투여 후에 피실험자로부터 채취한 생물학적 샘플(조직, 혈액, 소변 등)로부터 측정될 수 있다. 상기와 같은 샘플의 분석은 (1) 당업자에게 공지된 과정, 예를 들어 전기영동 젤 이동성 분석을 사용하여, 표적 및 비-표적 서열과의 헤테로듀플렉스 형성의 존재 또는 부재의 모니터링; (2) RT-PCR, 노던 블럿팅, ELISA 또는 웨스턴 블럿팅과 같은 표준 기법에 의해 측정된 바와 같은 정상적인 참조 mRNA 또는 단백질과 관련된 돌연변이 mRNA의 양의 모니터링을 포함한다.
핵내 올리고머 전달은 AON에 대한 주요 도전이다. 상이한 세포-침투성 펩티드(CPP)는 상이한 조건 및 세포주에서 다양한 정도로 PMO를 국소화하며, 신규의 CPP는 표적 세포에 PMO를 전달하는 능력이 본 발명자들에 의해 평가되었다. CPP 또는 "세포 흡수를 증대시키는 펩티드 부분"이란 용어는 호환 가능하게 사용되며 "수송 펩티드", "담체 펩티드" 또는 "펩티드 전달 도메인"이라고도 하는 양이온성 세포 침투 펩티드를 지칭한다. 본원에 나타낸 바와 같은 펩티드는 주어진 세포 배양 집단의 세포의 약 또는 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 내에서 세포 침투를 유도하는 능력을 가지며, 전신 투여시 생체내 여러 조직 내에서 거대분자 전위를 허용한다. CPP는 당해 분야에 주지되어 있으며, 예를 들어 내용 전체가 참고로 인용된 미국 출원 번호 2010/0016215에 개시되어 있다.
따라서, 본 발명은 치료학적 약학 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 AON과 세포-침투성 펩티드와의 조합을 제공한다.
본 발명의 더욱 추가적인 측면에 따라, AON-기반 요법에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 AON을 제공한다. 바람직하게, 상기 요법은 RAGE 발현과 관련된 상태를 위한 것이다. 보다 바람직하게, RAGE 발현과 관련된 상태를 위한 요법은 암, 신경퇴행성 질병, 폐 장애, 및 염증성 질병 중에서 선택된 질병에 대한 요법이다.
보다 구체적으로, AON은 표 3a-3d 및/또는 서열번호 1-31 중 어느 하나에 나열된 AON 또는 그의 조합 또는 칵테일 중 임의의 하나 이상으로 이루어지는 그룹 중에서 선택될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다. 여기에는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기와 같은 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열, 이에 상보성인 서열, 변형된 염기, 변형된 골격, 및 RAGE 유전자 전사물의 pre-mRNA 가공 활성을 갖거나 조절하는 기능성 절두 또는 그의 연장부를 함유하는 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 RAGE 유전자 전사물에서 엑손 배제를 유도하기 위해 선택된 표적에 결합할 수 있는 2개 이상의 AON의 조합으로 확장된다. 상기 조합은 2개 이상의 AON의 칵테일, AON-기반 요법에 사용하기 위해 함께 결합된 2개 이상 또는 2개 이상의 AON을 포함하는 구조물일 수 있다. AON의 조합은 바람직하게는 서열번호 11과 10, 또는 서열번호 11과 13의 조합이다.
본 발명은 RAGE 발현과 연관된 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 환자에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약학 조성물을 투여하는
단계를 포함한다.
더욱 또한, 본 발명은 암, 신경퇴행성 질병, 폐 장애 및 염증성 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 환자에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약학 조성물을 투여하는
단계를 포함한다.
바람직하게, 상기 요법은 엑손 스키핑 전략을 통해 기능성 RAGE 단백질의 수준을 감소시키는데 사용된다. 상기 RAGE 수준의 감소는 바람직하게는 RAGE 유전자 전사물 또는 그의 일부에서 pre-mRNA 스플라이싱의 변형을 통해 전사물 수준을 감소시킴으로써 달성된다.
상기 RAGE의 감소는 바람직하게는 RAGE-관련된 상태 또는 병리, 예를 들어 신경퇴행성 질병, 암, 폐 장애 및 염증성 질병의 증상의 양, 지속기간 또는 중증도의 감소로 이어질 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 피실험자(예를 들어, 인간과 같은 포유동물) 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경하려는 시도에서 사용되는 임의의 유형의 개입이다. 치료는 약학 조성물의 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 예방학적으로 또는 병리학적 사건의 개시 또는 병인과의 접촉 이후에 수행될 수 있다. 또한 "예방학적" 치료가 포함되며, 이는 치료 중인 질병 또는 상태의 진행 속도를 감소시키거나, 해당 질병 또는 상태의 발병을 지연시키거나, 발병의 중증도를 감소시키는 것에 관한 것일 수 있다. "치료" 또는 "예방"이 반드시 질병이나 상태 또는 그와 관련된 증상의 완전한 근절, 치유 또는 예방을 나타내는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, RAGE 발현과 관련된 질병의 조절 또는 억제를 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 AON의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 RAGE 발현과 관련된 질병의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 정제 및 단리된 AON의 용도를 제공한다.
RAGE 발현과 관련된 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약제를 제조하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 정제 및 단리된 AON의 용도를 제공한다.
바람직하게는, RAGE-관련된 병리 또는 질병은 신경퇴행성 질병, 암, 폐 장애, 또는 염증성 질병이다.
본 발명은 더욱 추가적인 측면에 따라, 본 발명의 AON 서열의 cDNA 또는 복제된 사본뿐만 아니라 본 발명의 AON 서열을 함유하는 벡터까지 확장된다. 본 발명은 또한 이러한 서열 및/또는 벡터를 함유하는 세포로 더욱 확장된다.
본 발명의 AON을 다른 치료 분자와 공-투여할(co-administered) 수 있다. 예를 들어, AON을 RAGE 시토솔 꼬리를 조절할 수 있는 펩티드와 같은 화합물인 제2 치료제와 함께 투여할 수 있다. 상기와 같은 화합물은 IQGAP-1, 투명성-1, 단백질 키나제 C 제타(PKCζ), Dock7, MyD88, TIRAP, ERK1/2, 후각 수용체 2T2, ADP/ATP 트랜스로카제 2, 단백질 포스파타제 1G, IRAK4, 단백질 DJ-1(PARK7), 칼포닌-3, 드레브린, 필라민 B, Ras-관련 단백질 Rab-13, 라딕신/에즈린/모에신, 단백질지질 단백질 2, 코로닌, S100 A11, 숙시닐-CoA 리가제[GDP-형성] 서브유닛 알파, Hsc70-상호작용 단백질, 세포자멸사 억제제 5, 뉴로필린, 절단 자극 인자, 성장인자 수용체-결합된 단백질 2, sec61 베타 서브유닛, 또는 Nck1을 포함한다.
본 발명은 또한 환자에서 RAGE 발현과 연관된 질병 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 사용 설명서와 함께, 적합한 용기 중에 패키징된 RAGE 유전자 전사물 또는 그의 일부에서 pre-mRNA 스플라이싱을 변형시키기 위한 적어도 단리되거나 정제된 AON을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 키트는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 AON, 본원에 기재된 바와 같은 서열번호 1-31 및/또는 표 3a-3d 중 어느 하나에 제시된 서열 중 임의의 하나 이상, 또는 AON의 칵테일을 함유할 것이다. 상기 키트는 또한 완충제, 안정제 등과 같은 지엽적인 시약을 함유할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다.
따라서, 환자에서 RAGE 발현과 연관된 질병 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 사용 설명서와 함께, 적합한 용기 중에 패키징된, 적어도 본원에 기재된 바와 같은 AON, 본원에 기재된 바와 같은 서열번호 1-31 및/또는 표 3a-3d 중 어느 하나에 제시된 서열 중 임의의 하나 이상, 및 그의 조합 또는 칵테일을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 AON은 서열번호 11, 18, 19 또는 20이다. 상기 AON의 조합은 바람직하게는 서열번호 11과 10, 또는 서열번호 11과 13의 조합이다.
바람직하게, 상기 질병 또는 상태는 암, 신경퇴행성 질병, 폐 장애, 또는 염증성 질병을 포함하는 목록 중에서 선택된다.
상기 키트의 내용물을 동결건조할 수 있으며 상기 키트는 상기 동결건조된 성분의 환원(reconstitution)에 적합한 용매를 추가로 함유할 수 있다. 상기 키트의 개별적인 성분을 별도의 용기에 패키징하고, 상기 용기와 연관되어 약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 처방된 형태의 공고문이 있을 수 있으며, 상기 공고문은 인간 투여에 대한 제조, 사용 또는 판매 당국에 의한 승인을 반영한다.
키트의 성분이 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액, 예를 들어 멸균 수용액일 수 있다. 생체내 사용을 위해, 발현 구조물은 약학적으로 허용가능한 주사가능 조성물로 제형화될 수 있다. 이 경우 용기 수단은 그 자체가 흡입제, 주사기, 피펫, 점안기 또는 기타 유사한 기구일 수 있으며, 이로부터 제형이 동물에게 주입되는, 폐와 같은 동물의 환부에 적용되거나, 또는 키트의 다른 성분에 적용되고 혼합될 수 있다.
키트의 성분은 또한 건조되거나 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조된 형태로 제공되는 경우 일반적으로 적합한 용매를 첨가하여 환원시킨다. 용매는 또한 다른 용기 수단에 제공될 수 있는 것으로 구상된다. 용기의 수 또는 유형에 관계없이, 본 발명의 키트는 또한 동물의 신체 내에서 최종적인 복합체 조성물의 주입/투여 또는 배치를 보조하기 위한 장비를 포함하거나 이와 함께 패키징될 수 있다. 이러한 장비는 흡입제, 주사기, 피펫, 집게, 계량 숟가락, 점안기 또는 임의의 상기와 같은 의학적으로 승인된 전달 비히클일 수 있다.
당업자는 상기 방법의 적용이 다수의 다른 질병의 치료에 사용하기에 적합한 AON을 식별하기 위해 광범위한 적용을 가짐을 알아야 한다.
본 발명의 AON을 또한 대체 요법, 예를 들어 약물 요법과 함께 사용할 수 있다.
본 발명은 따라서 RAGE 발현과 연관된 질병 또는 상태의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법을 제공하며, 여기에서 본 발명의 AON은 RAGE 발현과 연관된 질병 또는 상태의 영향의 치료, 예방 또는 개선과 연관된 또 다른 대체 요법과 순차적으로 또는 동시에 투여된다. 바람직하게, 상기 질병 또는 상태는 신경퇴행성 질병, 암, 폐 장애 또는 염증성 질병을 포함하는 목록 중에서 선택된다.
일반적인 내용
당업자는 본원에 기재된 발명이 구체적으로 기재된 것 이외에 변화 및 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 이러한 모든 변화 및 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 또한 개별적으로 또는 집합적으로 명세서에 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 단계 또는 특징 중 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 2개 이상을 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되지 않으며, 단지 예시를 목적으로 의도된다. 기능적으로 균등한 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 분명히 포함된다.
본원에 인용된 모든 간행물(특허, 특허 출원, 저널 기사, 실험실 매뉴얼, 책 또는 기타 문서 포함)의 전체 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다. 참조 중 어느 것도 선행 기술을 구성하거나 본 발명과 관련된 분야에서 일하는 사람들의 통상적인 일반 지식의 일부라는 것을 인정하는 것은 아니다.
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본원에 사용되는 바와 같이 "유도된" 및 "로부터 유도된"이란 용어는 특정 정수가 특정 소스로부터 반드시 직접적으로는 아닐지라도 상기 특정 소스로부터 획득될 수 있음을 나타내는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 단수형 "하나" 및 "그"는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다", 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수들의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 정수들의 그룹의 배제는 포함하지 않는 것으로 이해될 것이다.
실행 실시예 이외에서, 또는 달리 지시된 경우를 제외하고, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 기재된 수치 매개변수는 본 발명에 의해 획득하고자 하는 목적하는 성질에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 따라서 "약 80%"는 "약 80%" 및 또한 "80%"를 의미한다. 최소한, 각 수치 매개변수는 유효 자릿수와 일반적인 반올림 방식에 비추어 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 모든 수치는 그러나 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차에서 필연적으로 발생하는 몇몇 오차를 포함한다.
본원에 사용되는 선택된 용어에 대한 다른 정의는 본 발명의 상세한 설명 내에서 찾을 수 있으며 전체를 통해 적용될 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서에서 사용되는 다른 모든 과학 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 숙련가에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 포함된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 정보를 포함하는 서열 식별 번호("서열 번호")는 설명의 끝에 수집되어 있으며 프로그램 Patentln 버전 3.0을 사용하여 준비되었다. 각각의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 숫자 표시자 <210> 다음에 서열 식별자(예를 들어 <210>1, <210>2 등)가 오는 서열 목록에서 식별된다. 각각의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대한 길이, 서열 유형 및 소스 유기체는 각각 숫자 표시기 필드 <211>, <212> 및 <213>에 제공된 정보에 의해 표시된다.
안티센스 올리고머(antisense oligomer) 명명법 시스템은 상이한 안티센스 올리고머를 구별하기 위해 제안되고 공개되었다(Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654 참조). 이 명명법은 하기와 같이 모두 동일한 표적 영역을 향하는 약간 상이한 여러 안티센스 올리고머를 시험할 때 특히 적합하게 되었다:
H # A/D (x:y)
첫 번째 문자는 종을 나타낸다(예를 들어 H: 인간, M: 쥐)
"#"은 표적 엑손 번호를 지정한다
"A/D"는 각각 엑손의 시작/끝에 있는 수용자 또는 공여자 스플라이스 부위를 나타낸다
(x y)는 "-" 또는 "+"가 각각 인트론 또는 엑손 서열을 나타내는 어닐링(annealing) 좌표를 나타낸다. 일례로서, A(-6+18)는 표적 엑손 앞에 있는 인트론의 마지막 6개 염기와 표적 엑손의 처음 18개 염기를 나타낸다. 가장 가까운 스플라이스 부위는 수용자이므로 이러한 좌표 앞에 "A"가 붙는다. 공여자 스플라이스 부위에서 어닐링 좌표를 기재하는 것은 D(+2-18)일 수 있으며, 여기에서 마지막 2개의 엑손 염기와 처음 18개의 인트론 염기는 안티센스 올리고머의 어닐링 부위에 해당한다. A(+65+85)로 표시되는 완전한 엑손 어닐링 좌표는 해당 엑손의 시작에서부터 65번째와 85번째 뉴클레오티드 사이의 부위이다.
하기의 실시예는 상술한 발명의 사용 방식을 보다 충분히 설명할 뿐만 아니라, 본 발명의 다양한 측면을 수행하기 위한 최상의 방식을 제시한다. 이들 방법은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 설명의 목적으로 제공되는 것으로 이해된다.
실시예
각각의 하기 실시예에서, 하기의 일반적인 물질 및 방법을 문맥상 달리 요구되지 않는 한 적용한다.
인간 미세혈관 내피세포(HMEC1)를 MCDB 131 배지(10 mM 글루타민, EGF 및 하이드로코르티손과 함께 10% FCS)에서 배양하였다. 인간 폐 상피세포(A549)(암종)를 F-12K 배지(2 mM 글루타민과 함께 10% FBS)에서 배양하였다. 1차 대동맥 내피세포(PMAEC)를 (야생형)C57bl6 마우스 및 AGER KO 마우스의 대동맥으로부터 단리하고 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)/F12 내피세포 성장 보충제(ECGS) 보충된 배지에서 배양하였다.
AON에 의한 형질감염을 위해서, 상피 또는 내피세포를 48-웰 플레이트에 24 또는 48시간 동안 시딩하고 이어서 인간 AGER(HMEC1 및 A549의 경우) 및 쥐 AGER(마우스 PMAEC 세포의 경우)의 엑손 9를 표적화하는 AON 또는 각각의 대조군(표 3a-3d)과 함께 리포펙타민 3000 시약(0.15 ul/웰의 리포펙타민 3000; 0.4 ul/웰 P3000/웰)을 사용하여 형질감염시켰다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 AON/양이온성 리포플렉스와 배양하고 그 후에, 세포를 용해시키고, RNA 추출하고, TRIZOL 기법 또는 Cells to CT 방법을 사용하여 cDNA 생성시켰다.
인간 RAGE pre-mRNA의 대체 스플라이싱에 대한 영향을 측정하기 위해서, 발현을 RAGE의 11번째 엑손, 엑손 9b에 대한 또는 엑손 8-10에 걸쳐있는 실시간 RT-PCR 프라이머를 사용하여 측정하였으며, 이는 각각 모든 RAGE mRNA 스플라이스 변이체에에 유지되는 발현(mRNA), 엑손 9b의 유지 또는 막관통-시토솔 꼬리를 암호화하는 RAGEv1 동형의 발현을 나타낸다. 엑손 11에 비해 시토솔 꼬리의 엑손 8-10의 PCR 신호 감소는, 훨씬 적은 RAGE mRNA 스플라이싱형태가 엑손 10을 함유하고 보다 적은 전장 RAGE 단백질 동형(신호전달 가능)이 세포에 의해 생성된다는 것을 나타낸다. 쥐 세포 및 조직에서, 쥐 RAGE mRNA의 엑손 10-11에 걸쳐 있는 프라이머를 사용하여 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 나타내었다.
배지를 또한 수집하고 가용성 RAGE의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 배지(6 ㎖)를 ELISA로 시험하기 전에 분자량 컷오프 필터를 사용하여 농축시켰다.
중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 재조합 단백질을 높은 수준으로 발현하며, 이는 상기 세포를, 종점으로서 변경된 단백질 분비에 의한 pre-mRNA 스플라이싱의 조절에 대한 정보를 얻는데 이상적인 시스템으로 만든다. 세포외 가용성 RAGE의 발현 및 분비를 유도하는 RAGE의 스플라이싱에 대한 AON의 효과를 더 잘 조사하기 위한 모델 시스템으로서, F12 배지(10% FBS가 보충됨)에서 생육한 CHO 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 AON과 함께 인간 게놈 AGER(gRAGE) 서열(고유의 5' 및 3' 비번역 영역 제외)을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 2일 후에 배지를 수집하고 분자량 컷오프 필터를 사용하여 농축시키고 항-hRAGE 항체(R&D systems)를 사용하여 웨스턴 블럿에 의해 검사하였다.
AON 투여 후 검출된 RAGE 변이체의 정확한 서열을 측정하기 위해서, RNA를 트리졸 방법을 사용하여 추출하고 cDNA를 올리고 dT 프라이머를 사용하여 생성시킨 후에 RAGE의 5' 및 3'UTR 서열에 대한 RAGE 특정 프라이머를 사용하는 PCR 및 반-네스티드 PCR을 수행하여 RAGE 서열의 혼합물을 증폭시켰다. 젤 정제된 RAGE 밴드를 TA 클로닝 벡터내에 클로닝한 후에 이 콜라이 Top10 세포내에 형질전환시켰다. 50개 초과의 콜로니를 엑손 8-11에 걸쳐있는 프라이머를 사용하는 MultiNA 서열 분석기를 사용하여 특성화를 위해 선택하여 RAGE 삽입물의 크기를 측정하였다. 각각의 크기의 5개 클론을 상거(sanger) 서열분석을 위해 보내어 밴드 크기에 상응하는 RAGE 서열 스플라이싱형태를 확인하였다.
RAGE의 리간드 의존적인 및 리간드 독립적인 활성화 개입의 기능적 영향을 측정하기 위해서, 세포를 AT1R 동족 리간드, Ang II(1 μM) 또는 RAGE 리간드, S100A8/A9(0.6 ug/㎖) 세포에 4시간 동안 노출시켰다. 이어서 세포를 Cells to Ct 방법을 사용하여 mRNA의 추출이 추출되고 cDNA가 합성될 때까지 동결 보관하였다. NFκB 서브유닛, p65(RelA) 또는 NFκB-활성화된 표적 유전자(예를 들어 ICAM-1)의 유전자 발현의 변화를, 축적된 형광의 실시간 검출에 기반한 TaqMan 시스템(ABI Prism 7700, Perkin-Elmer Inc, PE Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행된 정량적인 실시간 RT-PCR에 의해 평가하였다. 유전자 발현을 18S mRNA에 정규화하고 처리되지 않은 대조용 마우스/세포에서의 발현 수준(1의 임의의 값으로 주어졌다)과 비교된 변화 배수로서 보고하였다.
실시예 1. 엑손 10에서 시스-작용 RNA 요소를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 인간 세포에서 RAGE의 대체 스플라이싱의 조절
본 실시예는 RAGE pre-mRNA의 스플라이싱을 RAGE pre-mRNA의 엑손 10에서 시스-작용 RNA 요소를 표적화하는 AON을 사용하여 조절할 수 있음을 입증한다.
RAGE pre-mRNA는 자연적으로 대체 스플라이싱의 대상이 되어 다양한 mRNA 스플라이싱형태를 생성시킨다. 이러한 RAGE 스플라이싱형태의 대부분은 각각 RAGE의 막관통 및 시토솔 도메인을 암호화하는 엑손 10 및 11을 모두 함유하며, 따라서 생성된 단백질 동형은 RAGE 리간드에 의해 활성화되고 배치된 GPCR에 의해 트랜스활성화되어 염증전 및 증식-전 신호전달을 유도할 수 있다. 엑손 9에서 대안의 5' 스플라이스 부위 선택은 또한 엑손 9(엑손 9B; 도 1a)의 83-뉴클레오티드 연장으로 이어질 수 있다. 상기 대체 스플라이스 부위와 엑손 10의 시작 부분의 3'(수용자) 스플라이스 부위 사이의 거리는 진핵생물의 인트론 길이의 하한보다 훨씬 짧은 단지 46 뉴클레오타이드이기 때문에, 결과적으로 엑손 10은 스키핑되고 대신에 엑손 11 시작의 3'(수용자) 부위가 선택된다. 이러한 대체 스플라이싱은 또한 조기 종결 코돈을 도입하지만 마지막 엑손-엑손 접합부에 근접(29bp)하기 때문에 넌센스 매개된 붕괴가 가해지지 않는다. 따라서 상기 대체 스플라이싱(RAGE_v1, 도 1a)로 인해 생성된 성숙한 mRNA는 각각 엑손 10 및 11에 의해 암호화되는, 막 유지 및 세포질 신호전달에 필요한 요소가 부족한 단백질 동형을 암호화하며, 따라서 상기는 순환계, 기관지-폐포 및 뇌척수액에서 분비되고 자연적으로 발견된다. 이러한 esRAGE는 리간드에 대해 세포-표면 전장 RAGE와 경쟁하거나 또는 리간드 클리어런스를 증가시키는 미끼 수용체로 작용할 수 있다. 엑손 9b에 의해 암호화된 새로운 17-아미노산 C-말단은 또한 RAGE 신호전달 또는 다량체화에 대해 독립적인 작용을 할 수 있다.
엑손 10을 표적화하는 10 nM AON에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화를 생성시켰다(도 1b). 일부 AON, 특히 AON 3779는 실시간 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이, 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에 비해 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 증가시켰다. 엑손 10을 또한 표적화하는 다른 AON, 특히 AON 3777 및 3781은 효과가 없었다.
엑손 10을 표적화하는 10 nM 농도 AON에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 일부 AON, 특히 AON 3779, 3780, 3781, 82, 83 및 87이 실시간 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이, 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에 비해 엑손 10을 함유하는(즉 시토솔 꼬리의 신호전달 요소를 암호화하는) RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 감소시키도록 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화를 또한 생성시켰다(도 1c & 1d). 엑손 10을 또한 표적화하는 다른 AON, 특히 AON 3777, 84 및 85는 효과가 없었다.
이어서 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON의 존재 및 부재하에서 인간 폐 상피세포(A549)에서 발현된 모든 RAGE mRNA 스플라이싱형태를 단리하고 이 콜라이 Top10 세포내에 클로닝하였다. 엑손 8 내지 엑손 11에 걸쳐있는 프라이머를 사용하여, 각각의 RAGE 삽입물의 크기를 측정하였다. 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON, 특히 AON 3779 및 3778에 의한 처리는 250 kB 크기의 단편을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 증가된 발현을 생성시켰으며, 이는 엑손 9b의 유지를 나타낸다.
엑손 10을 표적화하는 모든 AON은 또한 300 kB 밴드를 발현하는 mRNA 클론의 발현 백분율을 감소시켰으며, 이는 엑손 8-10 중에 함유된 신호전달 가능한 요소의 충분한 발현을 나타낸다. 특히, AON 3779는 300 kB 크기의 단편을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 49% 감소를 초래하였다(도 1f).
엑손 10을 표적화하는 모든 AON은 또한 엑손 8이 완전히 누락된 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 드노보 발현을 유도하였다(상거 서열분석에 의해 입증되었으며 젤상의 화살표(도 1f) 및 '밴드 없음' 단편(도 1e)에 의해 표시된 MultiNA 분석기상의 빈 레인에 의해 나타내었다).
엑손 10을 표적화하는 AON, 특히 AON 3777 및 3778에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염이 또한 276 및 430 kB 크기의 단편(도 1e)(이는 각각 엑손 9의 비전형적인 제거, 및 엑손 9, 9b 및 엑손 10의 유지를 나타낸다)을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 드노보 발현을 생성시켰다.
엑손 10을 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3779에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 또한 디지털 PCR상에서 측정된 바와 같이, 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포보다 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 사본수의 변화를 생성시켰다(도 1g).
엑손 10을 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3779에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 배지내로의 내인성 가용성 RAGE의 방출을 증가시켰으며(도 1h), 이는 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 증가된 발현과 일치한다.
인간 RAGE의 게놈 서열(gDNA)을 암호화하는 플라스미드에 의한 CHO 세포의 형질감염은 웨스턴 블럿에 의해 검출된 바와 같이 세포 배지내에 분비된 소량의 내인성 RAGE(붉은색 화살표)를 포함하는 유전자 산물의 대체 스플라이싱을 생성시켰다(도 1i). 상기 배지에 분비된 내인성 가용성 RAGE(esRAGE)의 양은 게놈 인간 RAGE를 발현하는 이들 CHO 세포가 AON 3779 또는 AON 87로 동시-형질감염될 때 증가되었다(도 1i). 동시에, 세포 중에 발현되고 유지된 전장 RAGE(흰색 화살표)는 게놈 인간 RAGE를 발현하는 CHO 세포가 AON 3779 또는 AON 87로 동시-형질감염될 때 감소되었다. 세포는 또한 증가된 양의 C-절두된 RAGE를 세포내에 함유하였다.
ELISA상에서 측정된 바와 같은, 가용성 RAGE의 정량적인 양이 또한, AON 3779, AON 82, 83, 84 및 85를 포함한, 엑손 10을 표적화하는 선택된 AON에 의한 형질감염에 이어서 게놈 인간 RAGE를 발현하는 CHO 세포에서 증가하였다(도 1j). 이들 중에서, AON 3779가 가장 큰 효과를 가졌다.
ELISA상에서 측정된 바와 같이, 가용성 RAGE의 정량적인 양이 또한, AON 90 및 93을 포함하여, AON 3779에 유사한 영역에서 엑손 10을 표적화하는 일부 다른 AON에 의해, AON 3779와 유사한 양(10 nM)까지 증가되었다(도 1k). 게놈 인간 RAGE를 발현하는 CHO 세포로부터 방출된 가용성 RAGE의 정량적인 양이 AON 3779에 의한 형질감염에 이어서 용량 의존적인 방식으로 증가하였다(도 1l).
엑손 10을 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3779에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 또한 RAGE-리간드 S100A8/A9(0.6 ㎍/㎖)에 의한 RAGE의 활성화에 이어서 염증-전 신호전달의 유도를 조절하였으며 이는 ICAM-1 발현의 유도로 이어졌다(도 1m).
엑손 10을 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3779, 3780, 81, 82 및 83에 의한 인간 대동맥 내피세포(HAEC)의 형질감염은 또한 RAGE-리간드 S100A8/A9(0.6 ㎍/㎖; 도 1m)에 의한 RAGE 리간드에의 노출에 따른 ICAM-1 발현의 유도를 방지하였다.
엑손 10을 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3779에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 또한 안지오텐신 II(1 μM)에 의한 AT1 수용체의 활성화에 따른 RAGE의 전사활성화에 이어서 염증-전 신호전달의 유도를 조절하였으며 이는 ICAM-1 발현의 유도로 이어졌다(도 1o).
엑손 10을 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3777, 3779, 3780, 3780, 3782 및 3783에 의한 인간 대동맥 내피세포(HAEC)의 형질감염은 또한 안지오텐신 II(1 μM; 도 1p)에 의한 AT1 수용체의 활성화에 따른 RAGE의 리간드 독립적인 전사활성화에 이어서 ICAM-1 발현의 유도를 포함한 염증-전 신호전달의 유도를 조절하였다. 엑손 10을 표적화하는 다른 AON, 특히 AON 3778 및 84는 효과가 없었다.
엑손 10을 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3779, 3780, 82, 83 및 87에 의한 인간 미세혈관 내피세포(HMEC1)의 형질감염은 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 감소를 포함하여, RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화를 생성시켰다(도 1q). 엑손 10을 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3779 및 87에 의한 인간 미세혈관 내피세포(HMEC1)의 형질감염은 또한 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 증가를 유도하였다(도 1r).
공유적으로 연결된 옥타-구아니딘 덴드리머를 갖는 모르폴리노-올리고뉴클레오티드(생체-모르폴리노로서 공지됨)를 형질감염 시약의 필요 없이 시험관내 및 생체내에서 사용할 수 있다. AON 3779(1 μM)의 생체-모르폴리노 제형에 의한 인간 대동맥 내피세포(HAEC)의 처리는 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이, 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 증가를 포함하여, RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 변화를 생성시켰다(도 1s). 또한, 세포 배지에서 esRAGE의 발현이 또한 대조용 모르폴리노 AON으로 처리된 세포에 비해 증가하였다(도 1t). 형질감염 시약 없이 AON 79에 의한 처리는 효과가 없었다. 형질감염 시약과 함께 AON 3779의 처리는 양성 대조군으로서 도시된다.
AON 3779(1 μM)의 생체-모르폴리노 제형에 의한 게놈 인간 RAGE를 발현하는 CHO 세포의 처리는 또한 ELISA상에서 측정된 바와 같이, 가용성 RAGE의 발현을 증가시켰다(도 1u).
폴리(G) 신장부, 특히 GGGG 모티프가 발현 사일런서로서 작용할 수 있고, 상기는 종종 hnRNP H 및 F에 의해 결합됨이 공지되어 있다(Sohail et al., BMC Genomics. 2014). RAGE 스플라이싱은 인트론 9/엑손 9b(이들은 상류 RAGE 5' 스플라이스 부위의 우선적인 사용에 요구된다)내의 G-풍부 시스-요소 및 이종 핵 리보핵단백질 H에 의해 부분적으로 조절됨이 가정된다. 폴리(G) 신장부는 hnRNP H의 결합이 연속적인 G 신장부를 요구하므로 엑손 스키핑을 촉진한다. AON은 일반적으로 G-풍부 영역에서 불량한 친화성 및 감소된 효능을 갖는다. 엑손 10은 3개의 GGGG 모티프를 함유하며, 이 중 하나는 hnRNPF 결합 표적으로서 인식되고 AON 3779, 3787 및 AON 3782가 측면 인접하고 있다(도 1v). 그러나, 상기 영역의 돌연변이(RAGE 돌연변이 M3)는 AON 3779에 대한 엑손 스플라이싱 또는 반응에 영향을 미치지 않았으며(도 1w), 이는 우리가 이들 영역을 AON으로 표적화하여 RAGE의 스플라이싱을 조절함으로써 RAGE 스플라이싱의 신규 사일런서를 조절함을 암시하며, 이는 종래 기술에서 예측할 수 없었다.
실시예 2. 엑손 9에서 시스-작용 RNA 요소를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 인간 세포에서 RAGE의 대체 스플라이싱의 조절
본 실시예는 RAGE pre-mRNA의 대체 스플라이싱을 RAGE의 pre-mRNA의 엑손 9에서 시스-작용 RNA 요소를 표적화하는 AON을 사용하여 조절할 수 있음을 입증한다(도 2a).
엑손 9를 표적화하는 10 nM 농도의 일부 AON, 특히 AON 3668, 3669, 3670, 4103, 4104, 4105에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 실시간 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이, 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에 비해 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 감소시켰다(도 2b). 엑손 9를 표적화하는 또 다른 AON, 특히 AON 4106은 효과가 없었다. 그러나, RAGE mRNA의 전체적인 발현은 엑손 9를 표적화하는 모든 AON으로 처리 후에 약간 상승하였다.
엑손 9를 표적화하는 선택된 AON의 존재 및 부재하에 인간 폐 상피세포(A549)에서 발현된 모든 RAGE mRNA 스플라이싱형태를 단리하고 이 콜라이 Top10 세포내에 클로닝하였다. 엑손 8-11에 걸쳐있는 프라이머를 사용하여 각각의 RAGE 삽입물의 크기를 측정하였다(도 2c). 엑손 9를 표적화하는 모든 AON이 300 kB 밴드를 발현하는 mRNA 클론의 발현 백분율을 감소시켰으며(도 2d), 이는 엑손 10 및 11 중에 함유된 신호전달 가능한 요소의 충분한 발현을 나타낸다. 특히, AON 3670은 300 kB 크기의 단편을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 감소를 초래하였다(도 2d).
엑손 9를 표적화하는 AON, 특히 AON 3669, 3670, 4103에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 또한 엑손 8이 스키핑된(multiNA 분석기상에서 빈 레인에 의해 나타남; 도 2c) RAGE mRNA 스플라이싱형태의 드노보 발현을 유도하였다.
엑손 9를 표적화하는 AON, 특히 AON 3669, 3670, 4103 및 4105에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 또한 276kB 단편을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 드노보 발현을 초래하였으며, 이는 스플라이싱형태로부터 엑손 9의 제거를 나타낸다(도 2d).
인간 RAGE의 게놈 서열(gRAGE)을 함유하는 플라스미드로 형질감염된 CHO 세포에서, ELISA상에서 측정된 바와 같이, 배지내에 분비된 가용성 RAGE의 양은 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에 비해, 엑손 9 중의 RAGE 스플라이스 부위를 표적화하는 일부 AON, 구체적으로 AON 3669 및 3671에 의해 보통으로 증가되었다(도 2e).
엑손 9를 표적화하는 상이한 농도의 AON, 특히 AON 3669, 3670 및 4103에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 또한 TLR-4 유전자 발현의 유도를 포함하여 RAGE-리간드 S100A8/A9(0.6 ㎍/㎖)에 의한 RAGE의 활성화에 따른 염증전 신호전달의 유도를 억제하였다(도 2f). 엑손 9를 표적화하는 다른 AON, 특히 AON 3668 및 4104는 효과가 없었다.
엑손 9를 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3669, 3670 및 4104에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 또한 안지오텐신 II(1 μM; 도 2g)에 의한 AT1 수용체의 활성화에 따른 RAGE의 리간드-독립적인 전사촉진을 통한 염증전 신호전달의 유도를 조절하였다. 엑손 9를 표적화하는 다른 AON, 특히 AON 3668, 3671 및 4103은 효과가 없었다.
엑손 9를 표적화하는 10 nM AON, 특히 AON 3669 및 3670에 의한 인간 미세혈관 내피세포(HMEC)의 형질감염은 또한 엑손 10을 함유하는 내인성 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 감소시켰다(도 2h).
실시예 3. 엑손 9B에서 시스-작용 RNA 요소를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 인간 세포에서 RAGE의 대체 스플라이싱의 조절
본 실시예는 RAGE의 대체 스플라이싱을 RAGE의 pre-mRNA의 엑손 9b 내의 RNA 요소를 표적화하는 AON을 사용하여 조절할 수 있음을 입증한다.
엑손 9b는 대부분의 RAGE 동형에서 대체 스플라이싱에 의해 제거된다(도 1e). 이러한 제거는 잠재적으로 엑손 9b 중의 모티프와 스플라이싱형태의 상호작용을 요한다. 우리는 AON을 사용하는 이들 결합 요소의 조절이 RAGE pre-mRNA의 대체 스플라이싱을 또한 조절할 수 있음을 가정하였다.
엑손 9b를 표적화하는 10 nM 농도의 AON에 의한 인간 폐 상피세포(A549)의 형질감염은 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 mRNA 발현의 변화를 생성시켰다. RAGE의 전체적인 발현은 엑손 9b를 표적화하는 2개의 AON 모두에 의한 처리 후에 약간 상승되었다(도 3a). 또한, 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현은 실시간 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이, 스크램블드 RNA 처리된 세포에 비해 AON 88에 의한 형질감염 후에 보통으로 감소되었다(도 3a). 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현은 또한 AON 88 및 89에 의해 또한 보통으로 증가되었다(도 3b). 엑손 10을 표적화하는 AON 3779에 의한 형질감염은 양성 대조군으로서 도시되었다.
도 9b를 표적화하는 10 nM 농도의 AON에 의한 인간 미세혈관 내피세포(HMEC)의 형질감염은 또한 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 감소된 발현(도 3c) 및 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 증가된 발현(도 3d)을 생성시켰다. 다시, 상기 RAGE mRNA의 전체적인 발현은 엑손 9b를 표적화하는 2개의 AON 모두에 의한 처리 후에 약간 상승되었다(도 3c). 엑손 10을 표적화하는 AON 3779에 의한 형질감염은 양성 대조군으로서 도시되었다.
인간 RAGE의 게놈 서열(gRAGE)을 함유하는 플라스미드로 형질감염된 CHO 세포에서, ELISA상에서 측정된 바와 같이, 배지내로 분비된 가용성 RAGE의 양은 대조용 RNA와 비교하여, 엑손 9b를 표적화하는 일부 AON, 구체적으로 AON 89에 의해 보통으로 증가되었다(도 3e). 엑손 10을 표적화하는 AON 3779에 의한 형질감염은 양성 대조군으로서 도시되었다.
인트론 9의 인간 RAGE 서열 및 AON 88 및 89에 대한 상보성 표적화를 도 3f에 나타낸다.
실시예 4. RAGE PRE-MRNA에서 시스-작용 RNA 요소를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 쥐 RAGE의 대체 스플라이싱의 조절
본 실시예는 RAGE pre-mRNA의 대체 스플라이싱을 또한 쥐 RAGE의 pre-mRNA의 엑손 9, 9B 및 10 중의 시스-작용 RNA 요소를 표적화하는 몇몇 AON을 사용하여 조절할 수 있으며, 이러한 조절을 시험관내, 생체외 및 생체내에서 입증할 수 있음을 입증한다.
쥐 RAGE의 대체 스플라이싱에 대한 AON의 영향을 시험하기 위해서, CHO 세포를 쥐 RAGE의 게놈 서열을 함유하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 이는 소량의 esRAGE의 분비를 생성시켰다. 쥐 RAGE를 표적화하는 AON, 특히 AON m3779(실시예 1에 상세히 기재된 인간 RAGE 서열 중의 AON 3779에 의해 표적화된 필적하는 서열에서 쥐 RAGE 서열의 엑손 10을 표적화하도록 설계된 AON) 및 AON m101에 의한 형질감염은 세포 배지내에 esRAGE의 분비를 증가시켰다(도 4a).
1차 마우스 대동맥 내피(PMAEC) 세포를 RAGE(표 3d)의 엑손 9를 표적화하는 AON(50 mM)으로 형질감염시켰다. 상기 처리는 각각의 음성-대조군에 비해 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현의 보통의 변화를 생성시켰다. 특히, AON 3674 및 3675는 실시간 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이, 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 감소시킬 수 있었다(도 4b).
그러나, 10 nM로 사용된 상기 AON에 의한 PMAEC의 형질감염은 RAGE mRNA 스플라이싱의 발현에 유의미한 영향을 보이지 않았다(도 4c). 배지내로 분비된 가용성 RAGE의 수준은 50 nM의 AON 3674 및 3675에 의한 배양된 PMAEC의 형질감염 후 24시간째에 보통으로 증가하였다(도 4d).
m3779(10 nM)에 의한 게놈 쥐 RAGE를 발현하는 CHO 세포의 형질감염은 실시간 RT-PCR에 의해 평가된 바와 같이, 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 감소시켰으며(도 4e) 대조용(스크램블드 RNA 처리된) 세포에 비해 esRAGE의 분비를 증가시켰다(도 4f). 인간 RAGE 서열을 표적화하는 AON 3779는 또한 esRAGE 분비를 증가시켰지만, AON m3779만큼은 아니었다.
RAGE의 쥐 서열의 엑손 10을 표적화하도록 설계된 AON이 플라스미드로부터 인간 RAGE의 게놈 서열을 발현하는 CHO 세포에 형질감염될 때, AON m3779(쥐 RAGE 엑손 10을 표적화하도록 설계됨)는 또한 세포 배지에서 가용성 인간 RAGE의 증가를 유도하였다(도 4g). 그러나, AON 3779(인간 RAGE 엑손 10을 특이적으로 표적화함)가 AON m3779보다 게놈 인간 RAGE의 조절에 더 유효하였다. 이러한 데이터는 엑손 10 중의 특정 서열을 표적화하는 AON이 비-일치성의 영역에도 불구하고, RAGE 스플라이싱을 조절하는데 유효할 수 있음을 입증한다.
쥐 조직 중 RAGE를 표적화하는 AON의 영향을 시험하기 위해서, 정밀 절단 폐 조각(PCLS)을 마우스로부터 얻은 다음 생체외에서 배양하였다. 간단히 말해서, 마우스를 인도적으로 죽이고 이식된 폐에 아가로스를 주입하고 원통형 코어를 채취한 다음 조직 슬라이서로 절단하여 균일한 직경과 두께의 폐 조각을 생성시켰다. 그런 다음 PCLS를 조직 배양 조건 하에서 다중 웰 플레이트의 배양 배지에 침지시켰다. 24시간 후, PCLS를 48시간 동안 생체-모르폴리노 AON 3779 또는 비-표적 대조군으로 형질감염시켰다. AON 3779에 의한 처리는 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA의 발현을 유의미하게 증가시켰으며 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 감소시켰고(도 4h), 투여 후 72시간째에 엑손 9b에 가장 큰 영향을 나타내었다(도 4i).
RAGE 스플라이싱을 표적화하는 AON의 생체내 관련성을 검증하기 위해, 수컷 C57bl6 마우스에 AON m3779(1 ㎎/㎏/일)를 7일 동안 피하 주사하였다. 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현은 마우스의 폐에서 증가되었고 엑손 10을 함유하는 스플라이싱형태는 1주일 동안 AON m3779로 피하 처리한 후 감소되었다(도 4j).
흡입 치료제로서의 가능성을 검증하기 위해, 살아있는 마우스를 마취시킨 후 무 RNAse 수에서 30 ㎕의 11 μM 생체-모르폴리노-AON m3779 또는 비-표적 생체-모르폴리노 대조군(음성 대조군)을 캐뉼라 또는 물만을 사용하여 기관을 통해 폐로 전달하였다. 마취를 되돌려 48시간 후에 마우스를 죽였다. m3779를 사용한 기관 내 처리는 수 단독(유의미한 효과가 없었다)과 비교하여 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 폐 발현에서 유의미한 감소를 초래하였다. 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 동형의 발현도 증가하였다. (도 4k). 비히클(멸균수) 단독과 비교할 때 11 uM 2-0'Me-포스포로티오에이트 AON m3779 30 ul의 기관 내 전달 후 엑손 10을 함유하는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현이 유사한 감소가 보였다(도 4l). 또한, 멸균수 또는 인간 RAGE를 표적화하는 비효과적인 AON 4105와 비교할 때 AON m3779로 마우스를 처리한 후에도 순환 가용성 RAGE의 증가가 관찰되었다(도 4m).
실시예 5. RAGE PRE-MRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합을 사용하는 RAGE의 대체 스플라이싱의 조절
본 실시예는 RAGE의 대체 스플라이싱을 RAGE의 pre-mRNA 중의 상이한 시스-작용 RNA 요소를 표적화하는 AON의 조합을 사용하여 조절할 수 있음을 입증한다.
엑손 정의는 표적 유지 또는 배제를 촉진하는 다성분 "교차 엑손" 인식 복합체의 조립에 의해 조절되는 것으로 생각된다. esRAGE의 생성을 증가시키기 위해 RAGE의 pre-mRNA에서 AON 3779를 exon10에 결합시킨 후, 우리는 예측된 스플라이스 부위를 포함하지만 이에 국한되지 않는 엑손 10의 다른 조절 표적이 더 중요해질 수 있다고 추측한다. 더욱이, AON 3779의 존재하에서, 다른 AON을 사용하여 RAGE의 pre-mRNA에서 엑손 10 중의 이러한 시스 작용 RNA 요소를 선택적으로 표적화함으로써, 우리는 엑손 배제로부터의 임의의 이탈을 방지하고 esRAGE의 바람직한 생성을 향한 RAGE 스플라이싱을 추가로 조절할 것이다.
RAGE의 엑손 10의 2차 구조는 중앙 힌지 영역에 의해 연결된 2개의 헤어핀 루프를 포함하는 것으로 예측된다. AON 3779를 사용하여 3' 헤어핀 중의 엑손 인헨서 서열을 표적화하면 엑손 10의 상류 5' 스플라이스 부위를 포함하여 대체 5' 헤어핀 중의 표적의 중요성이 증가할 것으로 추측된다.
이 가설을 검증하기 위해, 게놈 인간 RAGE를 암호화하는 플라스미드를 함유하는 CHO 세포를 엑손 10(또한 10 nM) 중의 5'(수용자) 예측된 스플라이스 부위를 표적으로 하는 다른 AON과 조합하여 AON 3779(10 nM)로 형질감염시켰다. 이 조합 처리는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현을 변화시켜 일부 조합, 특히 AON 3779 + 3777, 3779 + 3778이 AON 3779 단독 또는 대조용 스크램블드 RNA 처리된 세포와 비교할 때, 실시간 RT-PCR로 측정된 바와 같이(도 5a), 엑손 9b를 함유하는 RAGE mRNA 동형의 발현을 유의미하게 증가시켰다. 이 조합은 또한 ELISA에 따르면 배지에서 측정된 esRAGE 단백질의 생성을 증가시켰다(도 5b). AON 3997 및 AON 3778의 조합은 또한 저용량(5 nM + 5 nM)에서 더 효과적이었다. 특히, AON 3777 및 AON 3778은 10 nM에서 자체적으로 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다.
또 다른 실험에서, 게놈 인간 RAGE를 암호화하는 플라스미드를 함유하는 CHO 세포의 형질감염을 엑손 10의 3' 또는 5' 스플라이스 부위를 표적화하는 다른 AON과 조합하여 AON 3779로 형질감염시켰다. 일부 조합은 또한, 일부 조합, 특히 AON 3779 + 3778, 3779 + 3781 및 3779 + 3778 + 3781이 AON 3779 단독 또는 스크램블드 대조군 처리된 세포와 비교할 때, ELISA에 의해 측정된 바와 같이(도 5c) 발현 가용성 RAGE를 유의미하게 증가시키는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현 변화를 생성시켰다. 이러한 증가는 3779 대신 AON 93 또는 AON 87을 사용할 때 유사했지만 AON 3779(상자로 표시)와의 조합이 전반적으로 가장 강력하고 일관되었다.
인간 폐 상피 세포(A549)를 엑손 10의 인접 영역을 표적으로 하는 AON, 특히 AON 3779 + 3782, 3779 + 3784, 3779 + 3785의 다른 조합으로 형질감염시키는 것은 AON 3779 단독 이외에 엑손 9b를 함유하는 RAGE 동형의 발현에 유의미한 영향을 미치지 않았다(도 5d). 특히, 이러한 AON은 또한 5' 헤어핀(AON 3779와 유사) 및/또는 중앙 힌지 영역을 표적화하였으며, 다른 (3') 헤어핀의 엑손 인헨서를 표적화하는, 조합으로 유효한 AON 3777 또는 3778과 구별되었다.
쥐 RAGE의 게놈 서열을 암호화하는 플라스미드를 함유하는 CHO 세포를, 엑손 10의 3' 또는 5' 스플라이스 부위를 표적화하는 AON과 조합하여 AON m3779로 형질감염시켰다. 이러한 조합 처리는 일부 조합, 특히 AON m3779 + m102가, AON m3779와 개별적으로 비교할 때 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 세포 배지내로 가용성 RAGE의 분비를 유의미하게 증가시키는 RAGE mRNA 스플라이싱형태의 발현 변화를 생성시켰다(도 5e).

Claims (17)

  1. 최종당화산물 수용체(Receptor for Advanced Glycation End-product; RAGE) 유전자 전사물 또는 이의 일부의 스플라이싱(splicing)을 조절하기 위한 RAGE 중의 pre-mRNA 스플라이싱을 변형시키기 위한 단리되거나 정제된 AON.
  2. 제1항에 있어서
    a) 서열번호 1-31;
    b) 표 3a-3d; 및/또는
    c) 서열번호 11, 18, 19 또는 20
    을 포함하는 목록 중에서 선택되는 AON.
  3. 제1항에 있어서,
    (i) 변형된 당 부분(modified sugar moiety); (ii) RNase H에 대한 내성; 및/또는 (iii) 올리고머성 모방 화학(oligomeric mimetic chemistry)을 포함하는 목록 중에서 선택된 대체 화학 또는 변형이 가해진 하나 이상의 뉴클레오티드 위치를 함유하는 AON.
  4. 제1항에 있어서,
    (i) 부분에 대한 화학적 접합(chemical conjugation); 및/또는 (ii) 세포 침투 펩티드에 의한 태깅(tagging)에 의해 추가로 변형되는 안티센스 올리고머(antisense oligomer).
  5. 제1항에 있어서,
    우라실이 AON에 존재하는 경우, 상기 AON의 우라실(U)이 티민(T)에 의해 대체되는 AON.
  6. 제1항에 있어서,
    pre-mRNA 스플라이싱의 변형이 RAGE pre-mRNA의 하나 이상의 엑손 서열의 스키핑(skipping)을 생성시키는 AON.
  7. 제1항에 있어서,
    pre-mRNA 스플라이싱의 변형이 RAGE RNA의 하나 이상의 인트론 서열(intronic sequence)의 유지(실행)를 생성시키는 AON.
  8. 환자에서 RAGE 발현과 관련된 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약학적, 예방학적 또는 치료학적 조성물로서,
    a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 AON, 및
    b) 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제
    를 포함하는 조성물.
  9. RAGE 유전자 전사물에서 스플라이싱을 조작하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 AON 중 하나 이상을 제공하고 올리고머(들)가 표적 핵산 부위에 결합되게 하는
    단계를 포함하는 방법.
  10. (a) 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른, 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하는
    단계를 포함하는, RAGE 동형(isoform)의 발현, 농도 또는 활성을 조절하는 방법.
  11. a) 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른, 하나 이상의 AON 또는 하나 이상의 AON을 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하는
    단계를 포함하는, RAGE 발현과 연관된 질병의 영향(effect)을 치료, 예방 또는 개선시키는 방법.
  12. RAGE 발현과 연관된 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 정제되거나 단리된 AON의 용도.
  13. 환자에서 RAGE 발현과 연관된 질병의 영향을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 키트(kit)로서, 사용 설명서와 함께, 적합한 용기 중에 패키징된(packaged), 적어도 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 AON 및 이들의 조합 또는 칵테일(cocktail)을 포함하는 키트.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    RAGE 발현 관련된 질병이 신경퇴행성 질병(neurodegenerative disease), 암(cancer), 폐 장애(lung disorder) 및 염증성 질병(inflammatory disease)을 포함하는 목록 중에서 선택되는 조성물, 방법, 용도 또는 키트.
  15. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    AON을 가용성 RAGE 동형, RAGE 시토솔 꼬리(cytosolic tail)를 조절할 수 있는 화합물을 포함하는 목록 중에서 선택된 제2 치료제와 함께 투여하는 조성물, 방법, 용도 또는 키트.
  16. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    AON이 AON의 조합인 조성물, 방법, 용도 또는 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    AON의 조합이 서열번호 11과 10, 또는 서열번호 11과 13의 조합 중에서 선택되는 조성물, 방법, 용도 또는 키트.
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