KR20220003562A - Anti-CD38 Antibodies and Formulations - Google Patents

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Abstract

인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항체, 항체를 포함하는 제형 및 단위 투약 형태, 항체 제조 방법, 및 항체 사용 방법이 본원에 제공된다.Provided herein are antibodies that specifically bind human CD38, formulations and unit dosage forms comprising the antibodies, methods of making the antibodies, and methods of using the antibodies.

Description

항-CD38 항체 및 제형Anti-CD38 Antibodies and Formulations

관련 출원Related applications

본 출원은 2019년 4월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/837,518호; 2019년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 제62/859,699호; 2020년 2월 17에 출원된 유럽 특허 출원 20305145.3호; 및 2020년 2월 17일에 출원된 유럽 특허 출원 20305146.6호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.This application is filed on April 23, 2019 in U.S. Provisional Application Nos. 62/837,518; U.S. Provisional Application No. 62/859,699, filed on June 10, 2019; European Patent Application No. 20305145.3, filed 17 February 2020; and European Patent Application No. 2030146.6, filed on February 17, 2020, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

서열 목록sequence list

본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2020년 4월 17일에 생성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 704023_SA9-289PC_ST25.txt이고, 용량은 44,783 바이트이다.This application includes a Sequence Listing, filed electronically in ASCII format and incorporated herein by reference in its entirety. The ASCII copy created on April 17, 2020 has a file name of 704023_SA9-289PC_ST25.txt and a capacity of 44,783 bytes.

기술분야technical field

개선된 세포독성 활성을 갖는 항-CD38 항체 및 이의 안정한 제형이 본원에 제공된다.Provided herein are anti-CD38 antibodies and stable formulations thereof having improved cytotoxic activity.

CD38은 림프구 마커로 확인된 II형 글리코실화된 45 킬로달톤(kDa) 막 단백질이다. CD38은 조혈 세포 생존 및 분화의 조절을 통해 백혈구 항상성에 작용한다(문헌[Richards JO, et al., Mol Cancer Ther. 2008; 7(8):2517-27]). CD38은 CD31에 결합하는 수용체로 기능하며 세포 부착 및 신호 전달에 관여한다. 신호 전달에서 CD38은 세포 계통, 분화 단계, 및 아마도, 다른 공동 수용체와의 연관성에 따라 다양한 기능이 있는 것으로 보인다(문헌[Richards JO, et al., 2008]). CD38은 또한 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)에서 ADP-리보스로의 고리형 아데노신-디포스페이트-리보스(cADPR)의 합성 및 가수분해를 촉매하는 외효소이다(문헌[DiLillo DJ, Ravetch JV., Cell. 2015; 161(5):1035-45]). 이러한 반응 생성물은 칼슘 동원 및 세포내 신호전달과 관련이 있다(문헌[Derer S, et al., MAbs. 2014; 6(2):409-21]).CD38 is a type II glycosylated 45 kilodalton (kDa) membrane protein identified as a lymphocyte marker. CD38 acts on leukocyte homeostasis through regulation of hematopoietic cell survival and differentiation (Richards JO, et al., Mol Cancer Ther. 2008; 7(8):2517-27). CD38 functions as a receptor that binds to CD31 and is involved in cell adhesion and signal transduction. In signal transduction, CD38 appears to have multiple functions depending on cell lineage, stage of differentiation, and possibly association with other co-receptors (Richards JO, et al., 2008). CD38 is also an exenzyme that catalyzes the synthesis and hydrolysis of cyclic adenosine-diphosphate-ribose (cADPR) from nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to ADP-ribose (DiLillo DJ, Ravetch JV., Cell 2015; 161(5):1035-45]). These reaction products are involved in calcium mobilization and intracellular signaling (Derer S, et al., MAbs. 2014; 6(2):409-21).

건강한 인간에서 CD38의 발현은 NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식세포, 과립구, 활성화된 T 및 B 세포, 및 형질 세포에서 검출될 수 있다. 반면, 조혈 줄기 세포, 휴지기 T 및 B 세포, 또는 조직 대식세포에서는 발현이 검출된 적이 없다. 또한, 형질 세포 이상증(예를 들어, 다발성 골수종(MM), 아밀로이드증) 및 조혈 기원의 기타 암(예를 들어, 발덴스트롬병, 비호지킨 림프종(NHL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 및 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함)과 같은 여러 혈액 악성 종양이 CD38을 발현한다.In healthy humans, expression of CD38 can be detected in NK cells, monocytes, dendritic cells, macrophages, granulocytes, activated T and B cells, and plasma cells. In contrast, no expression was detected in hematopoietic stem cells, resting T and B cells, or tissue macrophages. In addition, plasma cell dystrophy (eg, multiple myeloma (MM), amyloidosis) and other cancers of hematopoietic origin (eg, Waldenstrom's disease, non-Hodgkin's lymphoma (NHL), acute lymphocytic leukemia (ALL), and acute Several hematological malignancies, such as myeloid leukemia (AML), express CD38.

CD38의 발현은 98%가 넘는 환자가 이 단백질에 대해 양성이기 때문에 MM에서 특히 두드러진다(문헌[Reinherz EL, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1980; 77(3):1588-92, Lin P, et al., Am J Clin Pathol. 2004; 121(4):482-8]). 악성 클론성 MM 세포에 대한 CD38의 강력하고 균일한 발현은 정상 세포에 대한 제한된 발현 패턴과 대조되어 이 항원이 종양 세포의 특이적 표적화에 유용할 수 있음을 시사한다.Expression of CD38 is particularly pronounced in MM as more than 98% of patients are positive for this protein (Reinherz EL, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1980; 77(3): 1588-92, Lin P , et al., Am J Clin Pathol. 2004; 121(4):482-8]. The robust and uniform expression of CD38 on malignant clonal MM cells contrasted with the restricted expression pattern on normal cells, suggesting that this antigen may be useful for specific targeting of tumor cells.

MM은 세포 표면 상의 CD38 발현, 골수(BM)에서 형질 세포의 클론 증식, 및 과량의 단일클론 면역글로불린(일반적으로 IgG 또는 IgA 유형 또는 유리 요 경쇄(파라단백질, M-단백질, 또는 M-성분으로도 지칭됨)) 생성을 특징으로 하는 악성 형질 세포 질환이다. 이는 60세 이상 환자가 80%가 넘는, 주로 노화 진행과 관련된 질환이다.MM is characterized by CD38 expression on the cell surface, clonal proliferation of plasma cells in the bone marrow (BM), and excess monoclonal immunoglobulins (usually of the IgG or IgA type or free urine light chain (paraprotein, M-protein, or M-component). also referred to))) is a malignant plasma cell disease characterized by the production of It is a disease mainly associated with the aging process, with more than 80% of patients over 60 years old.

MM의 질환 경과는 질환의 공격성 및 관련 예후 인자에 따라 다르다. 다발성 골수종의 특정 염색체 이상은 좋지 않은 임상 결과와 관련이 있는 것으로 나타났다. 고위험 세포유전학적 변화로는 del(17p), t(4;14), t(14;16), 및 1q 획득 등이 포함된다. 지난 20년 동안 중위 생존 기간은 3년에서 6년으로 높아졌으나, 일부 환자의 경우 10년 넘게 살 수 있다(문헌[Ocio EM, et al., Expert Rev Hematol. 2014; 7(1):127-41]). 치료 옵션과 생존 기간은 환자의 연령, 건강 및 질환 상태에 근거한다. 신체적으로 건강한 상태에서 증상이 있는 활동성 질환을 나타내는 약 65세 미만의 환자는 일반적으로 자가 줄기 세포 이식(ASCT)을 통한 초기 치료를 받을 것이다. 줄기 세포를 수집하기 전 질환의 세포수감소를 위해 유도 화학 요법을 시행한다. 유도 치료 요법에는 알킬화제, 덱사메타손 단독, 탈리도마이드 + 덱사메타손, 빈크리스틴, Adriamycin®(독소루비신), 및 덱사메타손(VAD 또는 이 요법의 변형)이 포함되나, 후자의 두 요법은 보다 높은 독성과 관련이 있다(문헌[Richardson PG, et al., Blood. 2010; 116(5):679-86, Arnulf B, et al., Haematologica. 2012; 97:1925-8]). Velcade®(보르테조밉) 단독, 보르테조밉 조합, Revlimid®(레날리도마이드) + 덱사메타손을 사용한 치료는 유도 요법으로서 개선된 결과를 보여주었고, 이러한 제제는 보다 높은 반응률과 보다 낮은 독성을 나타낸다(문헌[Richardson PG 2010, Kumar S, et al., Blood. 2012; 119(19):4375-82; Roussel M, et al., J Clin Oncol. 2014; 32:2712-7; Durie BGM, et al., Lancet. 2017; 389:519-27]). 추가로 승인된 약물로는 포말리도마이드(레날리도마이드와 동일한 IMiD® 계열에 속함)와 카르필조밉 및 익사조밉(보르테조밉과 동일한 프로테아좀 억제제 계열에 속함)이 있다. 이러한 신 치료법 외에도, 단일클론 항체, 특히 항-CD38 항체가 골수종 환자의 치료에 주요한 역할을 하기 시작했다. 항-CD38 항체인 다라투무맙은 단일 제제로서 및 MM에 대한 다른 치료법과의 조합으로 MM 치료에 대해 승인되었다(문헌[Touzeau C, Moreau P., Expert Opin Biol Ther. 2017; 17(7):887-93; Tzogani K., et al., Oncologist. 2018; 23:1-11]). 항-CD38 항체인 이사툭시맙은 재발성 또는 불응성 다발성 골수종에서 단일 제제로서 25~29%의 반응률을 유도하고 조합 요법에서 60%의 반응률을 유도하는 것으로 보고되었으며(문헌[Martin T, et al., Blood. 2017; 129(25):3294-303]); 최근 3상 연구 결과에 따르면 이사툭시맙의 추가는 재발성 및 불응성 다발성 골수종에서 포말리도마이드-덱사메타손에 의한 무진행 생존 기간을 높일 수 있는 것으로 나타났다(문헌[J Clin Oncol 37, 2019 (suppl; abstr 8004)]). 또한, 항-Slam-F7 항체인 엘로투주맙은 이전에 1~3가지의 요법으로 치료를 받은 적이 있는 성인 MM 환자의 치료를 위해 레날리도마이드 및 덱사메타손과의 조합으로 승인되었고, 이전에 최소 2가지(레날리도마이드 및 프로테아좀 억제제 포함)의 요법으로 치료를 받은 적이 있는 성인 MM 환자의 치료를 위해 포말리도마이드 및 덱사메타손과의 조합으로 승인되었다(Bristol-Myers Squibb Company. EMPLICITI® (엘로투주맙) [패키지 삽입물]. 미국 식품의약국 웹사이트. www-dot-accessdata-dot-fda.gov/drugsatfda_docs/label/2018/761035s008lbl.pdf. 2018년 11월 개정).The disease course of MM depends on the aggressiveness of the disease and associated prognostic factors. Certain chromosomal abnormalities in multiple myeloma have been shown to be associated with poor clinical outcomes. High-risk cytogenetic changes include del(17p), t(4;14), t(14;16), and 1q acquisition. During the past 20 years, the median survival has increased from 3 to 6 years, but some patients can live more than 10 years (Ocio EM, et al., Expert Rev Hematol. 2014; 7(1):127- 41]). Treatment options and survival times are based on the patient's age, health and disease status. Patients younger than about 65 years of age who are physically healthy and present with symptomatic active disease will usually receive initial treatment through autologous stem cell transplantation (ASCT). Before stem cells are collected, induction chemotherapy is performed to reduce the number of cells in the disease. Induction treatment regimens include alkylating agents, dexamethasone alone, thalidomide + dexamethasone, vincristine, Adriamycin® (doxorubicin), and dexamethasone (VAD or a variant of this regimen), although the latter two regimens are associated with higher toxicity (see [Richardson PG, et al., Blood. 2010; 116(5):679-86, Arnulf B, et al., Haematologica. 2012; 97:1925-8). Treatment with Velcade® (bortezomib) alone, in combination with bortezomib, or Revlimid® (lenalidomide) + dexamethasone showed improved outcomes as induction therapy, with these agents showing higher response rates and lower toxicity. [Richardson PG 2010, Kumar S, et al., Blood. 2012; 119(19):4375-82; Roussel M, et al., J Clin Oncol. 2014; 32:2712-7; Durie BGM, et al. , Lancet. 2017; 389:519-27]). Additional approved drugs include pomalidomide (in the same class of IMiD ® as lenalidomide) and carfilzomib and ixazomib (in the same class of proteasome inhibitors as bortezomib). In addition to these new therapies, monoclonal antibodies, particularly anti-CD38 antibodies, are beginning to play a major role in the treatment of patients with myeloma. An anti-CD38 antibody, daratumumab, has been approved for the treatment of MM as a single agent and in combination with other therapies for MM (Touzeau C, Moreau P., Expert Opin Biol Ther. 2017; 17(7): 887-93; Tzogani K., et al., Oncologist. 2018; 23:1-11]). It has been reported that the anti-CD38 antibody, isatuximab, induces a response rate of 25-29% as a single agent and 60% in combination therapy in relapsed or refractory multiple myeloma (Martin T, et al. al., Blood. 2017;129(25):3294-303]); According to the results of a recent phase 3 study, the addition of isatuximab could increase the pomalidomide-dexamethasone-induced progression-free survival in relapsed and refractory multiple myeloma (J Clin Oncol 37, 2019 (suppl) ; abstr 8004)]). In addition, elotuzumab, an anti-Slam-F7 antibody, has been previously approved in combination with lenalidomide and dexamethasone for the treatment of adult MM patients who have been previously treated with 1 to 3 regimens, and has previously been It is approved in combination with pomalidomide and dexamethasone (Bristol-Myers Squibb Company. EMPLICITI® (Bristol-Myers Squibb Company. EMPLICITI® ( elotuzumab) [package insert] U.S. Food and Drug Administration website www-dot-accessdata-dot-fda.gov/drugsatfda_docs/label/2018/761035s008lbl.pdf ( revised November 2018).

이러한 CD38-발현 질환에 대한 치료의 현재 목표는 질환을 가능한 한 효과적으로 제어하고, 삶의 질을 최대화하며, 생존 기간을 연장하는 것이다. 예를 들어, MM 환자는 일생 동안 평균 4~8가지 다른 요법을 받게 될 것이다. 따라서, 신 치료법으로 환자에 대한 결과가 개선되었음에도 불구하고 MM은 여전히 치명적인 질환이다. 때문에, 항체 요법을 포함하여 현재 요법을 적용받았고 진행 중인 환자의 치료에 있어서, 충족되지 않은 의학적 요구가 상당한 도전 과제로 남아 있다.Current goals of treatment for these CD38-expressing diseases are to control the disease as effectively as possible, maximize quality of life, and prolong survival. For example, a patient with MM will receive an average of 4 to 8 different therapies over their lifetime. Thus, despite improved outcomes for patients with new therapies, MM remains a fatal disease. As such, unmet medical needs remain a significant challenge in the treatment of patients undergoing and on-going therapy, including antibody therapy.

항체 치료를 포함하는 CD38-발현 질환에 대해 현재 가용한 치료에 비하여, 본원에 제공되는 항체, 용도, 및 치료 방법은 이러한 질환에 대해 월등한 임상 반응 또는 치료를 제공할 수 있을 것으로 보인다. 인간 CD38에 특이적으로 결합하고 CD38 발현 세포의 사멸을 더 우세하게 매개하는 항체, 해당 항체를 포함하는 제형 및 단위 투약 형태, 해당 항체의 제조 방법, 및 해당 항체의 사용 방법이 본원에 제공된다.Compared to currently available treatments for CD38-expressing diseases, including antibody therapy, the antibodies, uses, and methods of treatment provided herein appear to be able to provide superior clinical responses or treatments for such diseases. Provided herein are antibodies that specifically bind human CD38 and more predominantly mediate the death of CD38 expressing cells, formulations and unit dosage forms comprising such antibodies, methods of making such antibodies, and methods of using such antibodies.

일 양태에서, 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 7, 8, 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 및 서열번호 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC)를 포함한다.In one aspect, an antibody that specifically binds to human CD38 is provided. In some embodiments, an antibody provided herein comprises a light chain (LC) having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, and from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, and 6 a heavy chain (HC) having a selected amino acid sequence.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC, 및 서열번호 2, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다.In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and an HC having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 3, and 4. In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO:7 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO:3. In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LC, 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LC 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LC 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다.In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and an HC having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6. In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO:8 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO:5. In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO:8 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO:6.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 LC, 및 서열번호 6 및 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 LC 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 LC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 HC를 포함한다.In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and an HC having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 and 7. In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, an antibody provided herein comprises an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

다른 양태에서, 제형화된 항체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 약학적 조성물의 일부 구현예에서, 항체는 수크로스, L-히스티딘, 및 폴리소르베이트 80과 조합하여, 상기 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 50 mg/mL의 농도로 존재하고, 수크로스는 8%(w/v)의 농도로 존재하고, L-히스티딘은 10 mM의 농도로 존재하고, 폴리소르베이트 80(PS80)은 0.05%(v/v)의 농도로 존재하고, 제형의 pH는 6.2이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 동결건조된다.In another aspect, provided herein is a pharmaceutical composition comprising a formulated antibody. In some embodiments of the pharmaceutical composition, the antibody comprises HC and LC having the amino acid sequence as described above in combination with sucrose, L-histidine, and polysorbate 80. In some embodiments, the antibody is present at a concentration of 50 mg/mL, sucrose is present at a concentration of 8% (w/v), L-histidine is present at a concentration of 10 mM, and polysorbate 80 ( PS80) is present at a concentration of 0.05% (v/v) and the pH of the formulation is 6.2. In some embodiments, the pharmaceutical composition is lyophilized.

다른 양태에서, 제형화된 항체를 포함하는 단위 투약 형태가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체는 상기 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함하고, 단위 투약 형태는 215 mg의 항체, 6.21 mg의 L-히스티딘, 344 mg의 수크로스, 및 2.15 mg의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체의 단위 투약 형태는 동결건조된다.In another aspect, provided herein is a unit dosage form comprising the formulated antibody. In some embodiments, the antibody comprises HC and LC having the amino acid sequence as described above, wherein the unit dosage form is 215 mg of antibody, 6.21 mg of L-histidine, 344 mg of sucrose, and 2.15 mg of polysorbate. Includes bait 80. In some embodiments, the unit dosage form of the antibody is lyophilized.

다른 양태에서, 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체는 상기 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함하고, 상기 방법은 세포 배양물에서 항체를 발현시키는 단계, 항체를 크로마토그래피 정제 단계 및 한외여과 단계 중 적어도 하나의 단계에 적용하여 정제된 항체 용액을 생성하는 단계, 및 정제된 항체 용액을 조정하여 항체 제형을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 제형은 정제된 항체, 수크로스, L-히스티딘, 및 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 제형은 50 mg/mL 농도의 항체, 8% w/v 농도의 수크로스, 10 mM 농도의 L-히스티딘, 및 0.05% v/v 농도의 폴리소르베이트 80(PS80)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 제형은 pH가 6.2가 되도록 제조된다. 항체 제형을 제조하는 방법의 일부 구현예에서, 항체 제형은 동결건조된다.In another aspect, provided herein is a method for preparing a pharmaceutical composition comprising an antibody that specifically binds to human CD38. In some embodiments, the antibody comprises HC and LC having an amino acid sequence as described above, wherein the method comprises at least one of expressing the antibody in cell culture, chromatographic purification of the antibody, and ultrafiltration. to produce a purified antibody solution, and adjusting the purified antibody solution to produce an antibody formulation. In some embodiments, the antibody formulation comprises purified antibody, sucrose, L-histidine, and polysorbate 80. In some embodiments, the antibody formulation comprises an antibody at a concentration of 50 mg/mL, sucrose at a concentration of 8% w/v, L-histidine at a concentration of 10 mM, and polysorbate 80 (PS80) at a concentration of 0.05% v/v. include In some embodiments, the antibody formulation is prepared to have a pH of 6.2. In some embodiments of the method of making the antibody formulation, the antibody formulation is lyophilized.

다른 양태에서, 재구성된 항체 제형을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 동결건조된 항체 제형은 수크로스, L-히스티딘, PS80, 및 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 상기 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결건조된 항체 제형을 희석제에서 재구성하여 재구성된 항체 제형을 제조한다. 일부 구현예에서, 재구성된 항체 제형은 50 mg/mL 농도의 항체, 8% w/v 농도의 수크로스, 10 mM 농도의 L-히스티딘, 및 0.05% v/v 농도의 PS80을 포함한다. 일부 구현예에서, 재구성된 항체 제형의 pH는 6.2이다.In another aspect, a method of making a reconstituted antibody formulation is provided. In some embodiments, the lyophilized antibody formulation comprises an antibody that specifically binds to sucrose, L-histidine, PS80, and human CD38. In some embodiments, the antibody comprises HC and LC having an amino acid sequence as described above. In some embodiments, the lyophilized antibody formulation is reconstituted in a diluent to prepare a reconstituted antibody formulation. In some embodiments, the reconstituted antibody formulation comprises antibody at a concentration of 50 mg/mL, sucrose at a concentration of 8% w/v, L-histidine at a concentration of 10 mM, and PS80 at a concentration of 0.05% v/v. In some embodiments, the pH of the reconstituted antibody formulation is 6.2.

다른 양태에서, 다발성 골수종 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항체의 1회 이상의 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항체는 상기 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함한다.In another aspect, a method of treating a patient with multiple myeloma is provided. In some embodiments, the method comprises administering to the patient one or more doses of an antibody that specifically binds human CD38, wherein the antibody comprises HCs and LCs having an amino acid sequence as described above.

다른 양태에서, 다발성 골수종 치료 방법에 사용하기 위한 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 CD38에 특이적으로 결합하고, 상기 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함한다.In another aspect, an antibody for use in a method of treating multiple myeloma is provided. In some embodiments, the antibody specifically binds human CD38 and comprises HCs and LCs having an amino acid sequence as described above.

도 1은 mAb 1, 2, 3, 5, 6, 7, 및 8에 대한 풀림의 개시를 나타내는 그래프이다.
도 2는 mAb 1, 3, 5, 6, 7, 및 8에 대한 등전점(pI)을 나타내는 그래프이다.1 is a graph showing the onset of unwinding for mAbs 1, 2, 3, 5, 6, 7, and 8.
2 is a graph showing isoelectric points (pI) for mAbs 1, 3, 5, 6, 7, and 8;

세포 표면에서 높은 수준, 중간 수준, 및 낮은 수준의 CD38을 발현하는 세포에 대해 우수한 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 갖는 항-CD38 항체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-CD38 항체는 또한 세포 표면에서 CD38을 발현하는 세포에 대해 우수한 항체 의존성 세포매개 식균작용(ADCP) 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 예상보다 낮은 등전점(pI)을 갖는다. 특히 상업적 생산 공정에서 항체의 안정성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 예상보다 낮은 pI 및 더 낮은 온도에서의 단백질 풀림의 개시에도 불구하고, 본원에 제공된 항체는 인간 환자에게 투여하기에 안정하고 적합한 형태로 제공된다.Provided herein are anti-CD38 antibodies that have superior antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) to cells expressing high, moderate, and low levels of CD38 on the cell surface. In some embodiments, the anti-CD38 antibodies provided herein also have superior antibody dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) activity against cells expressing CD38 on the cell surface. In some embodiments, an antibody provided herein has an isoelectric point (pI) that is lower than expected. Notwithstanding the onset of protein unwinding at lower pi and lower temperatures than expected, which may adversely affect the stability of the antibody, particularly in commercial production processes, the antibodies provided herein are provided in a form that is stable and suitable for administration to human patients. do.

항체antibody

인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항-CD38 항체가 본원에 제공된다. 본원에 제공된 항-CD38 항체는 재조합 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생성을 위해, 항체를 암호화하는 핵산이 단리되고 추가 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터에 삽입된다. 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여), 항체를 암호화하는 DNA가 용이하게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 다수의 벡터를 사용할 수 있다. 벡터 구성요소는 일반적으로 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 일반적으로 핵산의 발현에 적합한 숙주 세포로 형질전환된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 진핵 숙주 세포는 포유류 세포이다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)가 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예로는 DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 및 NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주가 있다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268]을 참조한다. 세포로부터 제조된 항-CD38 항체는 예를 들어 수산화인회석 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 일반적으로 바람직한 정제 단계 중 하나이다. 일반적으로, 연구, 시험, 및 임상 적용에 사용하기 위한 항체 제조의 다양한 방법론은 상기 기술된 방법론과 일치하고/하거나 당업자에 의해 적절한 것으로 간주되어 당업계에 잘 확립되어 있다.Provided herein are anti-CD38 antibodies that specifically bind human CD38. The anti-CD38 antibodies provided herein can be generated using recombinant methods. For recombinant production of an anti-antigen antibody, the nucleic acid encoding the antibody is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (DNA amplification) or expression. DNA encoding the antibody can be readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., using oligonucleotide probes capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of the antibody) . Multiple vectors can be used. Vector elements generally include, but are not limited to, one or more of a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. The vector is generally transformed into a host cell suitable for expression of the nucleic acid. In some embodiments, the host cell is a eukaryotic cell or a prokaryotic cell. In some embodiments, the eukaryotic host cell is a mammalian cell. Examples of useful mammalian host cell lines include the monkey kidney CV1 cell line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonic kidney cell line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo rat hepatocytes (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 cells; FS4 cells; and a human liver cancer cell line (Hep G2). Other examples of useful mammalian host cell lines include Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, including DHFR-CHO cells (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)), and NS0 and Sp2/ There are myeloma cell lines such as 0. For a review of specific mammalian host cell lines suitable for antibody production, see, eg, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N. J., 2003), pp. 255-268]. Anti-CD38 antibodies prepared from cells can be purified using, for example, hydroxyapatite chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel electrophoresis, dialysis, and affinity chromatography, with affinity chromatography being generally preferred. One of the purification steps. In general, various methodologies of preparing antibodies for use in research, testing, and clinical applications are well established in the art as consistent with the methodologies described above and/or deemed appropriate by one of ordinary skill in the art.

일부 구현예에서, 항체는 유가식 방식으로 작동되는 500 L 일회용 생물반응기를 사용하여 CHO 8D6 숙주 세포주(DXB11 유도체)에 의해 발현된다. 세포 배양 과정은 마스터 세포 은행 바이알을 해동하고 일련의 시드 트레인 세포 증식 단계를 거쳐 개시된다. 이어서 세포를 생물 반응기로 옮기고 무혈청의 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 사용하여 성장시킨다. 배양은 10~14일 후 항체의 수확을 위해 종료된다. 세포와 세포 배양 파편은 심층 여과에 의해, 수확된 세포 배양에서 제거될 수 있다.In some embodiments, the antibody is expressed by the CHO 8D6 host cell line (DXB11 derivative) using a 500 L disposable bioreactor operated in a fed-batch mode. The cell culture process is initiated by thawing a master cell bank vial and going through a series of seed train cell proliferation steps. Cells are then transferred to a bioreactor and grown using serum-free, chemically defined cell culture medium. Incubation is terminated for harvesting of antibodies after 10-14 days. Cells and cell culture debris can be removed from the harvested cell culture by depth filtration.

수확된 물질은 정제된 항체를 생성하기 위해 크로마토그래피 및 여과 단계를 거쳐 추가 처리된다. 정제된 항체는 액체 용액으로 제형화되고 -30℃ 이하에서 보관된다.The harvested material is further processed through chromatography and filtration steps to produce purified antibodies. Purified antibody is formulated as a liquid solution and stored at -30°C or lower.

제형화된 항체를 적합한 바이알에 분배하기 전에, 액체 용액을 해동하고 0.2 μm 여과 장치를 사용하여 멸균 여과한다. 제형화된 항체는 USP 유형 1 유리 바이알과 같은 적절한 용기에 분배된다(4.3 mL/바이알). 일부 구현예에서, 충전된 바이알은 제형화된 항체의 0.3 mL 초과량을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형화된 항체는 바이알에 동결건조된다.Before dispensing the formulated antibody into suitable vials, the liquid solution is thawed and sterile filtered using a 0.2 μm filtration device. The formulated antibody is dispensed into an appropriate container, such as a USP Type 1 glass vial (4.3 mL/vial). In some embodiments, the filled vial contains greater than 0.3 mL of the formulated antibody. In some embodiments, the formulated antibody is lyophilized in a vial.

용어 "항체"는 일반적으로 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)를 포함하는 사량체 단백질을 지칭한다. 이러한 각각의 사량체는 일반적으로 동일한 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 (일반적으로 약 25 kDa의 분자량을 갖는) 하나의 LC 및 (일반적으로 약 50~70 kDa의 분자량을 갖는) 하나의 HC를 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "HC" 및 "LC"는 표적 항원에 대한 특이성을 부여하기에 충분한 가변 도메인 서열을 갖는 임의의 면역글로불린 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로 각각의 경쇄 및 중쇄의 아미노-말단 부분은, 일반적으로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 도메인을 포함한다. 일반적으로 각 사슬의 카복시-말단 부분은 효과기 기능을 담당하는 불변 도메인을 정의한다. 따라서, 일반적인 항체에서, 전장 HC 면역글로불린 폴리펩티드는 하나의 가변 도메인(VH)과 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 포함하고, VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고 CH3 도메인은 카복시-말단에 있으며, 전장 LC 면역글로불린 폴리펩티드는 하나의 가변 도메인(VL)과 하나의 불변 도메인(CL)을 포함하고, VL 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고 CL 도메인은 카복시-말단에 있다.The term “antibody” generally refers to a tetrameric protein comprising two heavy (HC) chains and two light (LC) chains. Each of these tetramers is usually composed of two identical pairs of polypeptide chains, each pair consisting of one LC (typically having a molecular weight of about 25 kDa) and one (typically having a molecular weight of about 50-70 kDa). has a HC of As used herein, the terms “HC” and “LC” refer to any immunoglobulin polypeptide having sufficient variable domain sequence to confer specificity for a target antigen. In general, the amino-terminal portion of each light and heavy chain comprises a variable domain of about 100 to 110 or more amino acids, which is generally responsible for antigen recognition. In general, the carboxy-terminal portion of each chain defines a constant domain responsible for effector functions. Thus, in a typical antibody, a full-length HC immunoglobulin polypeptide comprises one variable domain (VH) and three constant domains (CH1, CH2, and CH3), the VH domain being at the amino-terminus of the polypeptide and the CH3 domain being the carboxyl domain. -terminal, a full-length LC immunoglobulin polypeptide comprises one variable domain (VL) and one constant domain (CL), wherein the VL domain is amino-terminus and the CL domain is carboxy-terminus of the polypeptide.

본원에서 용어 "항체"는 최광의 개념으로 사용되고, 구체적으로 단일클론 항체, 및 다중특이적 항체(예를 들어, CD38 표적에 대한 특이적 결합 및 ADCC 및 ADCP를 유발하는 능력을 포함하여 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이중 및 삼중 특이적 항체)를 포함하는 상기 기재된 바와 같은 일반적인 항체를 포함한다.The term "antibody" herein is used in its broadest sense, specifically monoclonal antibodies, and multispecific antibodies (eg, specific binding to a CD38 target and the ability to elicit ADCC and ADCP, including the desired biological general antibodies as described above, including bi- and tri-specific antibodies), so long as they exhibit activity.

본원에서 사용되는 용어 "Fc"는 단량체 형태이든 다량체 형태이든 항체의 분해로부터 또는 다른 수단에 의해 생성된 비항원결합 단편의 서열을 포함하는 분자를 지칭하며, 힌지 영역을 포함할 수 있다. Fc 분자는 공유(즉, 이황화 결합) 및 비공유 결합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩티드로 이루어진다. 전형적인 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 이황화 결합의 수는 클래스(예를 들어, IgG, IgA, 및 IgE) 또는 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2, 및 IgG4)에 따라 1 내지 4이다. Fc의 일례는 IgG의 파파인 분해로부터 생성되는 이황화 결합된 이량체이다.The term “Fc,” as used herein, refers to a molecule comprising the sequence of a non-antigen-binding fragment generated from degradation of an antibody or by other means, whether in monomeric or multimeric form, and may include a hinge region. Fc molecules consist of monomeric polypeptides that can be linked in dimeric or multimeric form by covalent (ie, disulfide bonds) and non-covalent bonds. The number of intermolecular disulfide bonds between monomeric subunits of a typical Fc molecule is dependent on class (eg, IgG, IgA, and IgE) or subclass (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2, and IgG4). 1 to 4 depending on An example of an Fc is a disulfide linked dimer resulting from papain degradation of IgG.

본원에 기재된 항체는 단리될 수 있다. 용어 "단리된 단백질", "단리된 폴리펩티드" 또는 "단리된 항체"는 기원 또는 유래 원천으로 인해, (1) 원상태에서 수반되는 자연적으로 연관된 성분과 연관되지 않고/않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 실질적으로 없고/없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되고/되거나, (4) 자연에서 발생하지 않는 단백질, 폴리펩티드, 또는 항체를 지칭한다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 자연적으로 유래되는 세포와 상이한 세포계에서 합성되는 폴리펩티드는 이의 자연적으로 연관된 성분으로부터 "단리될" 것이다. 단백질은 또한 당업계에 널리 알려진 단백질 정제 기법을 사용하여, 단리에 의해 자연적으로 연관된 성분이 실질적으로 없도록 제공될 수 있다.Antibodies described herein can be isolated. The terms "isolated protein," "isolated polypeptide," or "isolated antibody" refer to, by reason of origin or source of origin, (1) not associated with a naturally associated component in its native state, and/or (2) from the same species. refers to a protein, polypeptide, or antibody that is substantially free of, (3) is expressed by cells from a different species, and/or (4) does not occur in nature. Thus, a polypeptide that is chemically synthesized or synthesized in a cell system different from the cell from which it is naturally derived will be "isolated" from its naturally associated component. Proteins can also be provided substantially free of naturally associated components by isolation, using protein purification techniques well known in the art.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 표 1에 제공된 바와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열을 포함한다.In some embodiments, an antibody provided herein comprises HC and LC amino acid sequences as provided in Table 1.

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결합 특성bonding properties

용어 "친화도"는 예를 들어, 수용체/리간드 또는 항원/항체와 같은 두 폴리펩티드 사이의 인력의 척도를 지칭한다. 두 폴리펩티드 사이의 고유 인력은 특정 상호작용의 결합 친화도 평형 상수(KD)로 표현될 수 있다. KD가 1 μM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하인 경우 항체가 항원에 특이적으로 결합한다고 말한다. KD 결합 친화도 상수는, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR)(BIAcore®) 또는 Bio-Layer Interferometry로 측정될 수 있다.The term “affinity” refers to a measure of attraction between two polypeptides, such as, for example, a receptor/ligand or antigen/antibody. The intrinsic attraction between two polypeptides can be expressed as the binding affinity equilibrium constant (KD) of a particular interaction. An antibody is said to specifically bind antigen when the KD is 1 μM or less, preferably 100 nM or less. The KD binding affinity constant can be measured, for example, by surface plasmon resonance (SPR) (BIAcore®) or Bio-Layer Interferometry.

용어 "koff"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. koff 해리 속도 상수는, 예를 들어, Bio-Layer Interferometry로 측정될 수 있다.The term “koff” refers to the dissociation rate constant of a particular antibody-antigen interaction. The koff dissociation rate constant can be measured, for example, by Bio-Layer Interferometry.

CD38에 대한 결합Binding to CD38

일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 2개의 HC 및 2개의 LC를 포함하는 사량체 단백질을 포함하고, 하기 기재된 바와 같은 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 측정 시 약 1.91 x 10-10 M 내지 약 6.7 x 10-10 M의 친화도 또는 KD로 인간 CD38에 결합한다. 일부 구현예에서, HC 및 LC는 각각 서열번호 2 및 7(mAb 2), 3 및 7(mAb 3), 4 및 7(mAb 4), 5 및 8(mAb 5), 5 및 9(mAb 6), 6 및 8(mAb 7), 또는 6 및 9(mAb 8)의 아미노산 서열을 갖는다.In some embodiments, an antibody provided herein comprises a tetrameric protein comprising two HCs and two LCs, and from about 1.91 x 10 -10 M to about 1.91 x 10 -10 M as measured by surface plasmon resonance (SPR) as described below. Binds to human CD38 with an affinity or KD of 6.7 x 10 -10 M. In some embodiments, the HC and LC are SEQ ID NOs: 2 and 7 (mAb 2), 3 and 7 (mAb 3), 4 and 7 (mAb 4), 5 and 8 (mAb 5), 5 and 9 (mAb 6, respectively) ), 6 and 8 (mAb 7), or 6 and 9 (mAb 8).

일부 구현예에서, 항체는 각각 서열번호 3 및 7의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함하고, 항체는 약 2 x 10-10 M의 친화도 또는 KD로 인간 CD38에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 각각 서열번호 5 및 8의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함하고, 항체는 약 6.7 x 10-10 M의 친화도 또는 KD로 인간 CD38에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 각각 서열번호 5 및 9의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함하고, 항체는 약 4.15 x 10-10 M의 친화도 또는 KD로 인간 CD38에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 각각 서열번호 6 및 8의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함하고, 항체는 약 3.85 x 10-10 M의 친화도 또는 KD로 인간 CD38에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 각각 서열번호 6 및 9의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 LC를 포함하고, 항체는 약 1.91 x 10-10 M의 친화도 또는 KD로 인간 CD38에 결합한다.In some embodiments, the antibody comprises HC and LC having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 and 7, respectively, and the antibody binds human CD38 with an affinity or KD of about 2×10 −10 M. In some embodiments, the antibody comprises HC and LC having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5 and 8, respectively, and the antibody binds human CD38 with an affinity or KD of about 6.7 x 10 -10 M. In some embodiments, the antibody comprises HC and LC having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5 and 9, respectively, and the antibody binds human CD38 with an affinity or KD of about 4.15 x 10 -10 M. In some embodiments, the antibody comprises HC and LC having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8, respectively, and the antibody binds human CD38 with an affinity or KD of about 3.85 x 10 -10 M. In some embodiments, the antibody comprises HC and LC having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 9, respectively, and the antibody binds human CD38 with an affinity or KD of about 1.91 x 10 -10 M.

FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIa(CD32a)에 대한 결합Binding to FcγRIIIa (CD16a) and FcγRIIa (CD32a)

본원에 제공된 항체는, 또한 각각 1차수 미만의 KD 및 SPR로 측정 시 100 nM 미만의 KD로 아미노산 위치 158에 페닐알라닌(F)을 갖는 저친화성 FcγRIIIa(CD16a) 변이체(158F)에 결합할 수 있고, 아미노산 위치 158에 발린(V)을 갖는 고친화성 FcγRIIIa(CD16a) 변이체(158V)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 SPR로 측정 시 100 nM 미만의 KD로 FcγRIIIa(CD16a)의 158F 변이체 및 158V 변이체에 결합하고, 158F 및 158V 변이체에 대한 결합은 2배 미만만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 예를 들어 SPR로 측정 시 약 59 nM 이하의 KD로 FcγRIIIa(CD16a) 변이체(158F)에 결합한다.An antibody provided herein is also capable of binding to a low affinity FcγRIIIa (CD16a) variant (158F) having a phenylalanine (F) at amino acid position 158 with a KD of less than 100 nM as measured by a KD of less than one order and an SPR, respectively, It can bind to the high affinity FcγRIIIa (CD16a) variant (158V) having a valine (V) at amino acid position 158. In some embodiments, an antibody provided herein binds to the 158F variant and 158V variant of FcγRIIIa (CD16a) with a KD of less than 100 nM as measured by SPR, and the binding to the 158F and 158V variants differs by less than a 2-fold. In some embodiments, an antibody provided herein binds FcγRIIIa (CD16a) variant (158F) with a KD of about 59 nM or less, eg, as measured by SPR.

일부 구현예에서, 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하고, 예를 들어 SPR로 측정 시 약 53 nM의 KD로 FcγRIIIa(158F)에 결합할 수 있고, 약 47 nM의 KD로 FcγRIIIa(158V)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하고, 예를 들어 SPR로 측정 시 약 59 nM의 KD로 FcγRIIIa(158F)에 결합할 수 있고, 약 75 nM의 KD로 FcγRIIIa(158V)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하고, 예를 들어 SPR로 측정 시 약 51 nM의 KD로 FcγRIIIa(158F)에 결합할 수 있고, 약 47 nM의 KD로 FcγRIIIa(158V)에 결합할 수 있다.In some embodiments, the antibody comprises an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, which will bind FcγRIIIa (158F) with a KD of about 53 nM, e.g., as measured by SPR. and can bind FcγRIIIa (158V) with a KD of about 47 nM. In some embodiments, the antibody comprises an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, which will bind FcγRIIIa (158F) with a KD of about 59 nM, e.g., as measured by SPR. and can bind FcγRIIIa (158V) with a KD of about 75 nM. In some embodiments, the antibody comprises a HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, which will bind FcγRIIIa (158F) with a KD of about 51 nM, e.g., as measured by SPR. and can bind FcγRIIIa (158V) with a KD of about 47 nM.

본원에 제공된 항체는, 또한 예를 들어 SPR로 측정 시, 690 nM 이하의 KD로 아미노산 위치 131에 아르기닌을 갖는 저친화성 FcγRIIa(CD32a) 변이체(131R)에 결합할 수 있고, 약 270 nM 미만의 KD로 위치 131에 히스티딘을 갖는 고친화성 FcγRIIa(CD32a) 변이체(131H)에 결합할 수 있다.An antibody provided herein is also capable of binding to a low affinity FcγRIIa (CD32a) variant (131R) having an arginine at amino acid position 131 with a KD of 690 nM or less, e.g., as measured by SPR, and having a KD of less than about 270 nM It can bind to the high-affinity FcγRIIa (CD32a) mutant (131H) having histidine at position 131.

일부 구현예에서, 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하고, 예를 들어 SPR로 측정 시 약 690 nM의 KD로 FcγRIIa(CD32a)(131R)에 결합할 수 있고, 약 120 nM의 KD로 FcγRIIa(CD32a)(131H)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하고, 예를 들어 SPR로 측정 시 약 125 nM 이하 또는 100 nM 이하의 KD로 FcγRIIa(CD32a)(131R)에 결합할 수 있고, 약 220 nm의 KD로 FcγRIIa(CD32a)(131H)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하고, 예를 들어 SPR로 측정 시 약 510 nM의 KD로 FcγRIIa(CD32a)(131R)에 결합할 수 있고, 약 60 nM의 KD로 FcγRIIa(CD32a)(131H)에 결합할 수 있다.In some embodiments, the antibody comprises an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, e.g., FcγRIIa (CD32a) (131R) with a KD of about 690 nM as measured by SPR. and can bind to FcγRIIa (CD32a) (131H) with a KD of about 120 nM. In some embodiments, the antibody comprises an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, e.g., FcγRIIa ( CD32a) (131R) and FcγRIIa (CD32a) (131H) with a KD of about 220 nm. In some embodiments, the antibody comprises an HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, e.g., FcγRIIa (CD32a) (131R) with a KD of about 510 nM as measured by SPR. and can bind to FcγRIIa (CD32a) (131H) with a KD of about 60 nM.

일부 구현예에서, 항체는 또한 각각 FcγRIIIa(CD16a) 158F- 또는 158V-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 약 70 nM 이하의 겉보기 KD로 FcγRIIIa(CD16a) 158F에 결합할 수 있고, 약 32 nM 이하의 겉보기 KD로 FcγRIIIa(CD16a) 158V에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하는 항체는 또한 각각 FcγRIIIa(CD16a) 158F- 또는 158V-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 약 70 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIIa(CD16a) 158F에 결합할 수 있고, 약 18 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIIa(CD16a) 158V에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하는 항체는 또한 각각 FcγRIIIa(CD16a) 158F- 또는 158V-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 약 60 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIIa(CD16a) 158F에 결합할 수 있고, 약 32 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIIa(CD16a) 158V에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하는 항체는 또한 각각 FcγRIIIa(CD16a) 158F- 또는 158V-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 약 44 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIIa(CD16a) 158F에 결합할 수 있고, 약 28 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIIa(CD16a) 158V에 결합할 수 있다.In some embodiments, the antibody is also capable of binding FcγRIIIa (CD16a) 158F with an apparent KD of about 70 nM or less, as measured by binding to FcγRIIIa (CD16a) 158F- or 158V-expressing HEK cells, respectively, and about 32 nM or less, respectively. It can bind to FcγRIIIa (CD16a) 158V with an apparent KD of In some embodiments, an antibody comprising a HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and an LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is also a reagent as measured by binding to FcγRIIIa (CD16a) 158F- or 158V-expressing HEK cells, respectively It can bind FcγRIIIa(CD16a) 158F with an apparent KD of 70 nM and bind FcγRIIIa(CD16a) 158V with an apparent KD of about 18 nM. In some embodiments, the antibody comprising the HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is also a reagent as measured by binding to FcγRIIIa (CD16a) 158F- or 158V-expressing HEK cells, respectively It can bind FcγRIIIa(CD16a) 158F with an apparent KD of 60 nM and bind FcγRIIIa(CD16a) 158V with an apparent KD of about 32 nM. In some embodiments, the antibody comprising the HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and the LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is also a reagent as measured by binding to FcγRIIIa (CD16a) 158F- or 158V-expressing HEK cells, respectively It can bind FcγRIIIa(CD16a) 158F with an apparent KD of 44 nM and bind FcγRIIIa(CD16a) 158V with an apparent KD of about 28 nM.

일부 구현예에서, 항체는 또한 각각 FcγRIIa(CD32a) 131R- 또는 131H-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 약 890 nM 이하의 겉보기 KD로 아미노산 위치 131에 아르기닌을 갖는 FcγRIIa(CD32a) 변이체(131R)에 결합할 수 있고, 약 840 nM 이하의 겉보기 KD로 FcγRIIa(CD32a) 변이체(131H)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하는 항체는 또한 각각 FcγRIIa(CD32a) 131R- 또는 131H-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 약 890 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIa(CD32a) 131R에 결합할 수 있고, 약 840 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIa(CD32a) 131H에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하는 항체는 또한 각각 FcγRIIa(CD32a) 131R- 또는 131H-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 약 87 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIa(CD32a) 131R에 결합할 수 있고, 약 222 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIa(CD32a) 131H에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하는 항체는 또한 각각 FcγRIIa(CD32a) 131R- 또는 131H-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 약 467 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIa(CD32a) 131R에 결합할 수 있고, 약 544 nM의 겉보기 KD로 FcγRIIa(CD32a) 131H에 결합할 수 있다.In some embodiments, the antibody also comprises an FcγRIIa (CD32a) variant (131R) having an arginine at amino acid position 131 with an apparent KD of about 890 nM or less, as measured by binding to FcγRIIa (CD32a) 131R- or 131H-expressing HEK cells, respectively. and can bind to the FcγRIIa (CD32a) variant (131H) with an apparent KD of about 840 nM or less. In some embodiments, the antibody comprising the HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is also a reagent as measured by binding to FcγRIIa (CD32a) 131R- or 131H-expressing HEK cells, respectively It can bind to FcγRIIa(CD32a) 131R with an apparent KD of 890 nM, and bind to FcγRIIa(CD32a) 131H with an apparent KD of about 840 nM. In some embodiments, the antibody comprising the HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is also a reagent as measured by binding to FcγRIIa (CD32a) 131R- or 131H-expressing HEK cells, respectively It can bind FcγRIIa(CD32a) 131R with an apparent KD of 87 nM and bind FcγRIIa(CD32a) 131H with an apparent KD of about 222 nM. In some embodiments, the antibody comprising the HC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and the LC having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is also a reagent as measured by binding to FcγRIIa (CD32a) 131R- or 131H-expressing HEK cells, respectively It can bind to FcγRIIa(CD32a) 131R with an apparent KD of 467 nM, and bind to FcγRIIa(CD32a) 131H with an apparent KD of about 544 nM.

작용 기전mechanism of action

본원에 제공된 항체는 세포 표면에서 높은(약 400,000/세포), 중간(약 100,000/세포), 및 낮은(약 13,000/세포) 수준의 CD38 분자를 발현하는 세포의 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)에 의해 CD38-발현 세포를 사멸할 수 있다. 본원에 제공된 항체는 저친화성 FcγIIIa(CD16a) 수용체 변이체(158F)를 발현하고/하거나 고친화성 FcγIIIa(CD16a) 수용체 변이체(158V)를 발현하는 자연 살해(NK) 세포의 존재 하에 이러한 ADCC를 유발한다. ADCC는 예를 들어 세포 기반 효능 분석에서 항체 및 효과기 세포의 존재 하에 표적 세포 용해를 측정하는 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 표적 세포는 예를 들어, KMS12-BM, RPMI-8226, 또는 MOLP-8과 같은 CD38 발현 세포일 수 있다. 또한, 효과기 세포는 예를 들어, ADCC에 의해 표적 세포를 사멸하도록 유도될 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 일부 구현예에서 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 PBMC로부터 정제된 인간 NK 세포와 같은 인간 혈액으로부터 단리된 1차 세포이다. 다른 구현예에서, 세포는 세포의 표면에서 FcγRIIIa(158V) 또는 FcγRIIIa(158F)를 발현하는 NK-92 세포와 같은 자연 살해 세포주이다(WO 06/023148 참조). 또 다른 구현예에서, NK 세포주는 FcγIIIa(CD16a) 158F 또는 158V를 발현하도록 조작된 Jurkat 세포주와 같은 세포주이다(예를 들어 Promega, G701A 참조).Antibodies provided herein have antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of cells expressing high (about 400,000/cell), moderate (about 100,000/cell), and low (about 13,000/cell) levels of the CD38 molecule at the cell surface. can kill CD38-expressing cells. The antibodies provided herein induce such ADCC in the presence of natural killer (NK) cells expressing a low affinity FcγIIIa (CD16a) receptor variant (158F) and/or expressing a high affinity FcγIIIa (CD16a) receptor variant (158V). ADCC can be measured using methods known in the art, such as, for example, measuring target cell lysis in the presence of antibody and effector cells in a cell-based potency assay. The target cell may be, for example, a CD38 expressing cell such as KMS12-BM, RPMI-8226, or MOLP-8. In addition, an effector cell can be any cell that can be induced to kill a target cell, for example by ADCC. In some embodiments the effector cell is a primary cell isolated from human blood, such as peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or human NK cells purified from PBMC. In another embodiment, the cell is a natural killer cell line such as NK-92 cells expressing FcγRIIIa (158V) or FcγRIIIa (158F) on the surface of the cell (see WO 06/023148). In another embodiment, the NK cell line is a cell line such as the Jurkat cell line engineered to express FcγIIIa (CD16a) 158F or 158V (see eg Promega, G701A).

본원에 제공된 항체는 세포 표면에서 높은 수준의 CD38을 발현하는 세포를 항체 의존성 세포매개 식균작용(ADCP)에 의해 사멸할 수 있다. 본원에 제공된 항체는 인간 PBMC의 존재 하에 이러한 ADCP를 유발한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 212.6 pM의 상대적 EC50으로 FcγRIIIa(158V)를 발현하는 인간 PMBC에 의해 CD38-발현 세포의 약 41%의 식균작용을 유발한다.The antibodies provided herein are capable of killing cells expressing high levels of CD38 on their cell surface by antibody dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP). Antibodies provided herein elicit such ADCP in the presence of human PBMCs. In one embodiment, an antibody provided herein induces phagocytosis of about 41% of CD38-expressing cells by human PMBCs expressing FcγRIIIa (158V) with a relative EC50 of 212.6 pM.

약학적 조성물 및 제형화된 항체Pharmaceutical Compositions and Formulated Antibodies

용어 "약학적 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태의 제제로, 제형이 투여되는 대상체에게 허용할 수 없는 독성을 나타내는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형은 일반적으로 멸균 상태이다. "약학적으로 허용 가능한" 부형제(비히클, 첨가제)는 사용되는 활성 성분 유효량의 제공을 위해 대상 포유류에게 투여하기에 타당한 것이다.The term "pharmaceutical composition" refers to a preparation in a form such that the biological activity of the active ingredient is effective, and which does not contain additional ingredients that exhibit unacceptable toxicity to the subject to which the dosage form is administered. Such formulations are generally sterile. "Pharmaceutically acceptable" excipients (vehicles, excipients) are those suitable for administration to a subject mammal to provide an effective amount of the active ingredient employed.

본원에 제공된 항체의 약학적 조성물 및 제형은 목적하는 수준의 순도를 갖는 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 제조될 수 있고(문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]), 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제공될 수 있다.Pharmaceutical compositions and formulations of the antibodies provided herein can be prepared by mixing an antibody having a desired level of purity with one or more optional pharmaceutically acceptable carriers (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]), a lyophilized formulation or in the form of an aqueous solution.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 항체, 및 수크로스, L-히스티딘, 및 폴리소르베이트 80(PS80)과 같은 부형제 중 하나 이상을 포함하는 제형화된 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 표 1에 제공된 단일클론 항체 중 어느 하나의 HC 및 LC 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 약학적 조성물에 5 mg/mL 내지 50 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 항체는 약학적 조성물에 5 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 항체는 약학적 조성물에 10 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 항체는 약학적 조성물에 20 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 항체는 약학적 조성물에 50 mg/mL의 농도로 존재한다. 각 부형제의 농도는 약학적 조성물이 주입에 의한 투여를 위해 희석될 수 있도록 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 수크로스는 8%(w/v) 내지 10%(w/v)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 수크로스는 8%(w/v)의 농도로 존재한다. 다른 구현예에서, 수크로스는 10%(w/v)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, L-히스티딘은 10 mM 내지 20 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, L-히스티딘은 10 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, L-히스티딘은 20 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, PS80은 0.005%(v/v) 내지 0.05%(v/v)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, PS80은 0.005%(v/v)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, PS80은 0.02%(v/v)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, PS80은 0.05%(v/v)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물의 pH는 예를 들어 약학적 조성물이 액체 형태인 경우 항체의 안정성을 유지하도록 최적화된다. 일부 구현예에서, 제형화된 항체의 pH는 약 6.0 내지 약 6.5이다. 일부 구현예에서, 제형화된 항체의 pH는 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 제형화된 항체의 pH는 약 6.2이다. 일부 구현예에서, 제형화된 항체의 pH는 약 6.5이다. 일부 구현예에서, 제형화된 항체의 pH는 6.0이다. 일부 구현예에서, 제형화된 항체의 pH는 6.2이다. 일부 구현예에서, 제형화된 항체의 pH는 6.5이다.In some embodiments, the pharmaceutical compositions provided herein comprise an antibody formulated with an antibody and one or more of excipients such as sucrose, L-histidine, and polysorbate 80 (PS80). In some embodiments, the antibody comprises the HC and LC amino acid sequences of any one of the monoclonal antibodies provided in Table 1. In some embodiments, the antibody is present in the pharmaceutical composition at a concentration of 5 mg/mL to 50 mg/mL. In some embodiments, the antibody is present in the pharmaceutical composition at a concentration of 5 mg/mL. In some embodiments, the antibody is present in the pharmaceutical composition at a concentration of 10 mg/mL. In some embodiments, the antibody is present in the pharmaceutical composition at a concentration of 20 mg/mL. In some embodiments, the antibody is present in the pharmaceutical composition at a concentration of 50 mg/mL. The concentration of each excipient is selected such that the pharmaceutical composition can be diluted for administration by infusion. For example, in some embodiments, sucrose is present at a concentration of 8% (w/v) to 10% (w/v). In some embodiments, sucrose is present at a concentration of 8% (w/v). In another embodiment, sucrose is present at a concentration of 10% (w/v). In some embodiments, L-histidine is present at a concentration of 10 mM to 20 mM. In some embodiments, L-histidine is present at a concentration of 10 mM. In some embodiments, L-histidine is present at a concentration of 20 mM. In some embodiments, PS80 is present at a concentration of 0.005% (v/v) to 0.05% (v/v). In some embodiments, PS80 is present at a concentration of 0.005% (v/v). In some embodiments, PS80 is present at a concentration of 0.02% (v/v). In some embodiments, PS80 is present at a concentration of 0.05% (v/v). In some embodiments, the pH of the pharmaceutical composition is optimized to maintain stability of the antibody, for example when the pharmaceutical composition is in liquid form. In some embodiments, the pH of the formulated antibody is between about 6.0 and about 6.5. In some embodiments, the pH of the formulated antibody is about 6.0. In some embodiments, the pH of the formulated antibody is about 6.2. In some embodiments, the pH of the formulated antibody is about 6.5. In some embodiments, the pH of the formulated antibody is 6.0. In some embodiments, the pH of the formulated antibody is 6.2. In some embodiments, the pH of the formulated antibody is 6.5.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물의 항체 및/또는 제형화된 항체는 하나 이상의 하전 이소형을 포함한다. 하전 이소형은 일반적으로 주 이소형, 산성 이소형, 및 염기성 이소형으로 기술된다. 주 이소형은 주어진 항체 집단에서 가장 우세한 이소형을 지칭한다. 산성 이소형은 주요 이소형에 비해 등전점(pI)이 낮고 염기성 이소형은 주 이소형에 비해 pH가 높다. 하전 이소형은 HC 및/또는 LC의 아미노산 서열에 대한 번역 후 변형에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 탈아미드화, 당화, 및 시알릴화의 증가는 항체의 pI를 감소시킬 수 있다. N-말단 글루탐산이 피로글루(또는 피로Q)로 전환되면 하나의 양전하가 손실되어 pI가 감소할 수 있다. 또한, C-말단 라이신의 존재는 항체의 pI를 증가시킬 수 있다. 또한, C-말단 프롤린의 아미드화는 항체의 pI를 증가시킬 수 있다.In some embodiments, the antibody and/or the formulated antibody of the pharmaceutical compositions provided herein comprise one or more charged isotypes. Charged isoforms are generally described as major isoforms, acidic isoforms, and basic isoforms. The major isotype refers to the most prevalent isotype in a given antibody population. The acidic isoform has a lower isoelectric point (pI) than the main isoform, and the basic isoform has a higher pH than the main isoform. Charged isoforms may result from post-translational modifications to the amino acid sequence of HC and/or LC. For example, increased deamidation, glycosylation, and sialylation can decrease the pI of an antibody. When the N-terminal glutamic acid is converted to pyroglue (or pyroQ), one positive charge may be lost, resulting in a decrease in pI. In addition, the presence of a C-terminal lysine can increase the pI of the antibody. In addition, amidation of the C-terminal proline can increase the pI of the antibody.

본원에 제공된 항체(약학적 조성물 중의 항체 및 제형화된 항체 포함)의 일부 구현예에서, HC 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산은 피로글루타민이다. 본원에 제공된 항체의 일부 구현예에서, HC는 글리신으로 구성된 C-말단 아미노산을 갖는다.In some embodiments of the antibodies provided herein (including antibodies in pharmaceutical compositions and formulated antibodies), the amino acid at position 1 of the HC amino acid sequence is pyroglutamine. In some embodiments of the antibodies provided herein, the HC has a C-terminal amino acid consisting of glycine.

본원에 제공된 항체의 하전 이소형은 전하를 기반으로 하여 폴리펩티드를 분리하는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 분리 및 정량화할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 약한 양이온 교환 컬럼은 인산염/염화나트륨 구배 완충액이 있는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에서 사용될 수 있다. 이 시스템에서는, 컬럼 상에 항체를 로딩한 후, 항체의 산성 이소형이 먼저 용리되고, 주 이소형이 용리된 다음 항체의 염기성 이소형이 용리된다. 다른 구현예에서, 모세관 등전 집중법(cIEF)이 사용될 수 있다. 모세관 등전 집중법은 등전점(pI) 값으로 단백질을 분리하는 방법이다. cIEF에서 항체 샘플은 모세관 내 pH 구배 상의 등전점으로 이동하여 모세관 길이를 따라 상이한 하전 이소형을 분해한다. cIEF 변이체를 식별하고 특성화하기 위해, 하전 이소형을 강력한 양이온 교환 크로마토그래피(SCX)로 단리하고 cIEF로 분석할 수 있다. 모세관에서 분해된 하전 이소형의 이미지는, 전체 컬럼 검출을 사용하고 280 nm에서 흡광도를 측정하는 전하 결합 장치 카메라를 사용하여 촬영된다. cIEF를 사용하여 테스트 샘플의 하전 이소형 분포를 기준 표준과 비교하여 항체의 하전 이소형을 확인한다. 일부 구현예에서, cIEF는 상업적 생산 과정에서 항체를 확인하고, 기준 표준(예를 들어, 사전 정의된 분포 패턴 내에서 또는 기준 표준의 분포 패턴과 비교되는 하전 이소형 분포 패턴을 갖는 시험 항체)과 비교하여 항체의 하전 이소형 분포를 결정하는 품질 관리 수단으로 사용된다.Charged isoforms of the antibodies provided herein can be isolated and quantified using methods known in the art for isolating polypeptides based on charge. For example, in some embodiments, a weak cation exchange column can be used in a high performance liquid chromatography (HPLC) system with a phosphate/sodium chloride gradient buffer. In this system, after loading the antibody onto the column, the acidic isoform of the antibody is eluted first, the main isoform is eluted, and then the basic isoform of the antibody is eluted. In another embodiment, capillary isoelectric focusing (cIEF) may be used. The capillary isoelectric focusing method is a method of separating proteins by their isoelectric point (pI) values. In cIEF, the antibody sample migrates to the isoelectric point on the pH gradient within the capillary, resolving the different charged isoforms along the capillary length. To identify and characterize cIEF variants, charged isoforms can be isolated by robust cation exchange chromatography (SCX) and analyzed by cIEF. Images of charged isoforms resolved in the capillary are taken using a charge-coupled device camera using full column detection and measuring absorbance at 280 nm. The charged isotype distribution of the test sample is compared to a reference standard using cIEF to determine the charged isotype of the antibody. In some embodiments, the cIEF identifies the antibody in commercial production, and combines it with a reference standard (e.g., a test antibody having a charged isotype distribution pattern within a predefined distribution pattern or compared to a distribution pattern of a reference standard) It is used as a quality control measure to determine the distribution of charged isoforms of an antibody by comparison.

일부 구현예에서, 항체(약학적 조성물 중의 항체 및 제형화된 항체 포함)는 표 1에 제공된 단일클론 항체 중 어느 하나의 HC 및 LC 아미노산 서열을 포함하고, 약 70% 이상의 주 이소형, 약 30% 이하의 산성 이소형, 및 4% 미만의 염기성 이소형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 하전 이소형 매개변수를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 71%의 주 이소형, 28%의 산성 이소형, 및 4% 미만의 염기성 이소형을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 5.8 내지 약 9.0 범위의 등전점을 갖는 하전 이소형을 함유한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 5.85 내지 약 8.97 범위의 등전점을 갖는 하전 이소형을 함유한다.In some embodiments, the antibody (including antibodies in pharmaceutical compositions and formulated antibodies) comprises the HC and LC amino acid sequences of any one of the monoclonal antibodies provided in Table 1, and comprises at least about 70% of the major isotype, about 30 % or less of an acidic isoform, and less than 4% of a basic isoform; and at least one charged isoform parameter selected from the group consisting of. In some embodiments, the antibody comprises 71% of the major isoform, 28% of the acidic isoform, and less than 4% of the basic isoform. In some embodiments, the antibody contains a charged isoform having an isoelectric point in the range of about 5.8 to about 9.0. In some embodiments, the antibody contains a charged isoform having an isoelectric point in the range of about 5.85 to about 8.97.

일부 구현예에서, 항체(약학적 조성물 중의 항체 및 제형화된 항체 포함)는 동결건조된다. 항체(약학적 조성물 중의 항체 및 제형화된 항체 포함)는 환자에게 투여하기 위해 용기로부터 항체의 처방 투약량이 제거될 수 있도록 용기(예를 들어, 바이알)에 담길 수 있다.In some embodiments, antibodies (including antibodies in pharmaceutical compositions and formulated antibodies) are lyophilized. Antibodies (including antibodies in pharmaceutical compositions and formulated antibodies) can be contained in a container (eg, a vial) such that a prescribed dosage of the antibody can be removed from the container for administration to a patient.

CD38에 특이적으로 결합하는 제형화된 항체의 단위 투약 형태가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체는 표 1에 제공된 단일클론 항체 중 어느 하나의 HC 및 LC 아미노산 서열을 포함하고, 단위 투약 형태는 항체, 및 수크로스, L-히스티딘, 및 폴리소르베이트 80의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 투약 형태는 약 215 mg의 항체, 약 6.21 mg의 L-히스티딘, 약 344 mg의 수크로스, 및 약 2.15 mg의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 투약 형태는 215 mg의 항체, 6.21 mg의 L-히스티딘, 344 mg의 수크로스, 및 2.15 mg의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 투약 형태는 동결건조된다. 단위 투약 형태는 환자에게 투여하기 위해 용기로부터 항체의 처방 투약량이 제거될 수 있도록 용기(예를 들어, 바이알)에 담길 수 있다. 일부 구현예에서, 항체, 약학적 제형, 및/또는 제형화된 항체는 엘라스토머 마개가 끼워진 유리 바이알에 담긴다. 일부 구현예에서, 바이알에는 약 215 mg의 항체가 담긴다. 일부 구현예에서, 바이알에는 215 mg의 항체가 담긴다. 일부 구현예에서, 바이알의 충전 부피는 약 4 mL를 제거할 수 있도록 설정되었다. 일부 구현예에서, 바이알의 충전 부피는 4 mL를 제거할 수 있도록 설정되었다.Provided herein are unit dosage forms of formulated antibodies that specifically bind CD38. In some embodiments, the antibody comprises the HC and LC amino acid sequences of any one of the monoclonal antibodies provided in Table 1, wherein the unit dosage form is selected from the group of antibodies and sucrose, L-histidine, and polysorbate 80 one or more excipients. In some embodiments, the unit dosage form comprises about 215 mg of antibody, about 6.21 mg of L-histidine, about 344 mg of sucrose, and about 2.15 mg of polysorbate 80. In some embodiments, the unit dosage form comprises 215 mg of antibody, 6.21 mg of L-histidine, 344 mg of sucrose, and 2.15 mg of polysorbate 80. In some embodiments, the unit dosage form is lyophilized. The unit dosage form may be contained in a container (eg, a vial) such that a prescribed dosage of the antibody can be removed from the container for administration to a patient. In some embodiments, the antibody, pharmaceutical formulation, and/or formulated antibody is contained in a glass vial fitted with an elastomeric stopper. In some embodiments, the vial contains about 215 mg of antibody. In some embodiments, the vial contains 215 mg of antibody. In some embodiments, the fill volume of the vial is set to remove about 4 mL. In some embodiments, the fill volume of the vial is set to remove 4 mL.

제조 방법manufacturing method

항체, 약학적 조성물, 및 단위 투약 형태의 제조 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체는 표 1에 제공된 단일클론 항체 중 어느 하나의 HC 및 LC 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 적합한 세포 배양물에서 항체를 발현시키는 단계를 포함한다. 항체를 크로마토그래피 단계 및 하나 이상의 한외여과 단계 중 적어도 하나에 적용하여, 정제된 항체 용액을 생성한다. 정제된 항체 용액을 조정하여 항체를 농축하고 부형제를 첨가하고 pH를 조정한다. 일 구현예에서, 항체의 농도를 약 50 mg/ml로 조정하고, 수크로스, L-히스티딘, 및 폴리소르베이트 80을 첨가하고, pH를 약 6.0 이상이 되도록 조정한다. 일 구현예에서, 항체의 농도를 50 mg/ml로 조정하고, 수크로스, L-히스티딘, 및 폴리소르베이트 80을 첨가하고, pH를 6.0 이상이 되도록 조정한다. 일부 구현예에서, pH는 약 6.2이다. 일부 구현예에서, pH는 6.2이다. 일부 구현예에서, 수크로스의 농도는 약 8% w/v이고, L-히스티딘의 농도는 약 10 mM이고, 폴리소르베이트 80의 농도는 약 0.05% v/v이다. 일부 구현예에서, 수크로스의 농도는 8% w/v이고, L-히스티딘의 농도는 10 mM이고, 폴리소르베이트 80의 농도는 0.05% v/v이다. 일부 구현예에서, 항체, 약학적 조성물, 및/또는 제형화된 항체는 동결건조된다.Antibodies, pharmaceutical compositions, and methods of making unit dosage forms are provided herein. In some embodiments, the antibody comprises the HC and LC amino acid sequences of any one of the monoclonal antibodies provided in Table 1. In one embodiment, the method comprises expressing the antibody in a suitable cell culture. The antibody is subjected to at least one of a chromatography step and one or more ultrafiltration steps to produce a purified antibody solution. Adjust the purified antibody solution to concentrate the antibody, add excipients, and adjust the pH. In one embodiment, the concentration of the antibody is adjusted to about 50 mg/ml, sucrose, L-histidine, and polysorbate 80 are added, and the pH is adjusted to about 6.0 or higher. In one embodiment, the concentration of the antibody is adjusted to 50 mg/ml, sucrose, L-histidine, and polysorbate 80 are added, and the pH is adjusted to be 6.0 or higher. In some embodiments, the pH is about 6.2. In some embodiments, the pH is 6.2. In some embodiments, the concentration of sucrose is about 8% w/v, the concentration of L-histidine is about 10 mM, and the concentration of polysorbate 80 is about 0.05% v/v. In some embodiments, the concentration of sucrose is 8% w/v, the concentration of L-histidine is 10 mM, and the concentration of polysorbate 80 is 0.05% v/v. In some embodiments, the antibody, pharmaceutical composition, and/or formulated antibody is lyophilized.

일부 구현예에서, 재구성된 제형화된 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 제형화된 항체는 동결건조된 형태로 제공되고, 표 1에 제공된 단일클론 항체 중 어느 하나의 HC 및 LC 아미노산 서열, 약 8% w/v 농도의 수크로스, 약 10 mM 농도의 L-히스티딘, 및 약 0.05% v/v 농도의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 구현예에서, 재구성된 제형화된 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 제형화된 항체는 동결건조된 형태로 제공되고, 표 1에 제공된 단일클론 항체 중 어느 하나의 HC 및 LC 아미노산 서열, 8% w/v 농도의 수크로스, 10 mM 농도의 L-히스티딘, 및 0.05% v/v 농도의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 구현예에서, 사용 전, 제형화된 항체를 적절한 부피의 주사용수에 재구성하여, 약 50 mg/mL 농도의 항체, 약 8% w/v 농도의 수크로스, 약 10 mM 농도의 L-히스티딘, 및 약 0.05% v/v 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하는 용액으로서, 재구성된 항체의 pH가 약 6.2인 용액을 생성한다. 일부 구현예에서, 사용 전, 제형화된 항체를 적절한 부피의 주사용수에 재구성하여, 50 mg/mL 농도의 항체, 8% w/v 농도의 수크로스, 10 mM 농도의 L-히스티딘, 및 0.05% v/v 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하는 용액으로서, 재구성된 항체의 pH가 6.2인 용액을 생성한다.In some embodiments, a method of making a reconstituted formulated antibody is provided, wherein the formulated antibody is provided in lyophilized form, the HC and LC amino acid sequences of any one of the monoclonal antibodies provided in Table 1, about sucrose at a concentration of 8% w/v, L-histidine at a concentration of about 10 mM, and polysorbate 80 at a concentration of about 0.05% v/v. In some embodiments, a method of making a reconstituted formulated antibody is provided, wherein the formulated antibody is provided in lyophilized form, the HC and LC amino acid sequences of any one of the monoclonal antibodies provided in Table 1, 8 sucrose at a concentration of % w/v, L-histidine at a concentration of 10 mM, and polysorbate 80 at a concentration of 0.05% v/v. In some embodiments, prior to use, the formulated antibody is reconstituted in an appropriate volume of water for injection, antibody at a concentration of about 50 mg/mL, sucrose at a concentration of about 8% w/v, L-histidine at a concentration of about 10 mM , and polysorbate 80 at a concentration of about 0.05% v/v, resulting in a solution wherein the pH of the reconstituted antibody is about 6.2. In some embodiments, prior to use, the formulated antibody is reconstituted in an appropriate volume of water for injection, antibody at a concentration of 50 mg/mL, sucrose at a concentration of 8% w/v, L-histidine at a concentration of 10 mM, and 0.05 A solution comprising polysorbate 80 at a % v/v concentration, resulting in a solution with a pH of 6.2 of the reconstituted antibody.

본원에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 임상 병리 과정 동안 치료 중인 개체 또는 세포의 자연 경과를 변경시키도록 설계되는 임상적 개입을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과로는 질환 진행 속도의 감소, 병태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 예를 들어, 암과 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 제거되는 경우(암 세포의 증식 감소, 암 세포 파괴, 질병으로 인한 증상 감소, 질병으로 고통받는 대상의 삶의 질 증가, 질병 치료에 필요한 다른 약물 용량 감소, 및/또는 개체의 생존 연장을 포함하나 이에 한정되지 않음) 개체는 성공적으로 "치료"된다.As used herein, the term “treatment” or “treating” refers to a clinical intervention designed to alter the natural course of an individual or cell being treated during the course of a clinical pathology. Desirable effects of treatment include reducing the rate of disease progression, amelioration or amelioration of the condition, and remission or improved prognosis. For example, if one or more symptoms associated with cancer are alleviated or eliminated (reducing the proliferation of cancer cells, destroying cancer cells, reducing symptoms caused by the disease, increasing the quality of life of a subject suffering from the disease, or other drugs needed to treat the disease) (including but not limited to, dose reduction, and/or prolonging survival of the subject) is successfully "treated" by the subject.

본원에 제공된 유효량의 항-CD38 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 다발성 골수종(예컨대, 재발성 다발성 골수종, 또는 재발성 및 불응성 다발성 골수종)을 치료하거나 그 진행을 지연시키는 방법을 본원에서 제공한다. 일부 구현예에서, 항체는 표 1에 제공된 단일클론 항체 중 어느 하나의 HC 및 LC 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 뮤린 MM 모델에서 마우스의 생존을 높일 수 있고, 모델의 마우스는 인간 CD16a의 저친화성 변이체(158F)를 발현하고, 마우스에는 인간 CD38을 발현하는 500,000개의 EL4 세포를 주입하였다. 일부 구현예에서, 항-CD38 항체의 1회 이상의 용량은 동결건조된 제형으로 제공되고, 투여 전, 동결건조된 제형은 재구성되어, 약 10 mM의 L-히스티딘, 약 8% w/v의 수크로스, 및 약 0.05% v/v의 폴리소르베이트 80을 포함하는 액체에 약 50 mg/mL 농도의 항체를 포함하고 6.2의 pH를 갖는 재구성된 항체 제형을 형성한다. 일부 구현예에서, 항-CD38 항체의 1회 이상의 용량은 동결건조된 제형으로 제공되고, 투여 전, 동결건조된 제형은 재구성되어, 10 mM의 L-히스티딘, 8% w/v의 수크로스, 및 0.05% v/v의 폴리소르베이트 80을 포함하는 액체에 50 mg/mL 농도의 항체를 포함하고 6.2의 pH를 갖는 재구성된 항체 제형을 형성한다.treating or preventing the progression of multiple myeloma (eg, relapsed multiple myeloma, or relapsed and refractory multiple myeloma) in an individual comprising administering to the subject in need thereof an effective amount of an anti-CD38 antibody provided herein Methods of delaying are provided herein. In some embodiments, the antibody comprises the HC and LC amino acid sequences of any one of the monoclonal antibodies provided in Table 1. In some embodiments, the antibody is capable of enhancing the survival of mice in a murine MM model, wherein the mice in the model express a low-affinity variant of human CD16a (158F), and the mice were injected with 500,000 EL4 cells expressing human CD38 . In some embodiments, one or more doses of the anti-CD38 antibody are provided in a lyophilized formulation, wherein prior to administration, the lyophilized formulation is reconstituted to about 10 mM L-histidine, about 8% w/v water Cross, and a reconstituted antibody formulation comprising the antibody at a concentration of about 50 mg/mL in a liquid comprising about 0.05% v/v of polysorbate 80 and having a pH of 6.2. In some embodiments, one or more doses of the anti-CD38 antibody are provided in a lyophilized formulation, wherein prior to administration, the lyophilized formulation is reconstituted, comprising 10 mM L-histidine, 8% w/v sucrose, and 0.05% v/v of polysorbate 80 to form a reconstituted antibody formulation comprising the antibody at a concentration of 50 mg/mL and having a pH of 6.2.

일부 구현예에서, 1회 이상 용량의 항체가 환자에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 항체 kg당 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.5, 약 1.0, 약 2.5, 약 5, 약 10, 또는 약 20 mg일 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 항체 kg당 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 및 20 mg일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 피하 투여된다.In some embodiments, one or more doses of the antibody are administered to the patient. In some embodiments, the dose may be about 0.1, about 0.2, about 0.3, about 0.5, about 1.0, about 2.5, about 5, about 10, or about 20 mg/kg of antibody. In some embodiments, the dose may be 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, and 20 mg/kg antibody. In some embodiments, the antibody is administered intravenously. In some embodiments, the antibody is administered subcutaneously.

정의Justice

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥에서 명백히 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "분자"에 대한 언급은 선택적으로 2개 이상의 이러한 분자의 조합 등을 포함한다.As used in this specification and the appended claims, the singular includes plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a molecule” optionally includes combinations of two or more such molecules, and the like.

용어 "약"은 본원에 사용된 바와 같이 이 기술 분야의 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 일반 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약"이 붙은 값 또는 매개변수에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수 자체에 관한 구현예를 포함(및 설명)한다. 일부 구현예에서, 용어 "약"은 명시된 값 +/- 그 값의 10%를 나타내고, 예를 들어, "약 10 mg/kg"은 9 내지 11 mg/kg을 포괄할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "약"은 명시된 값 +/- 그 값의 5%를 나타내고, 예를 들어, "약 20 mg/kg"은 19 내지 21 mg/kg을 포괄할 수 있다.The term “about” as used herein refers to the general error range for each value readily known to one of ordinary skill in the art. Reference herein to a value or parameter marked with “about” includes (and describes) embodiments directed to that value or parameter per se. In some embodiments, the term “about” refers to a specified value +/- 10% of that value, eg, “about 10 mg/kg” may encompass 9 to 11 mg/kg. In some embodiments, the term “about” refers to a specified value +/- 5% of that value, eg, “about 20 mg/kg” may encompass 19 to 21 mg/kg.

치료 목적을 위한 "대상체" 또는"개체"는 인간, 가축 및 농장 동물과 개, 말, 고양이, 소 등과 같은 동물원, 스포츠, 또는 애완용 동물을 포함하여 포유류로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게, 포유류는 인간이다."Subject" or "individual" for therapeutic purposes refers to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, and zoo, sports, or pet animals such as dogs, horses, cats, cattle, and the like. Preferably, the mammal is a human.

예시 및 본 발명의 특정한 구체적인 구현예의 설명을 위해 실시예를 후술하였다. 그러나 청구범위는 본원에 제시된 실시예에 의해 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다.Examples are set forth below for purposes of illustration and description of certain specific embodiments of the invention. However, the claims are not in any way limited by the examples presented herein.

실시예Example

1. 항체 설계:1. Antibody Design:

효과기 세포 상의 활성화 FcγRIIIa 및 FcγRIIa 수용체에 대한 친화도를 향상시키기 위해 항체의 Fc 부분에 돌연변이를 갖는 Fc-조작된 항-CD38 항체를 생성하였다.An Fc-engineered anti-CD38 antibody with mutations in the Fc portion of the antibody was generated to enhance affinity for the activating FcγRIIIa and FcγRIIa receptors on effector cells.

2개의 인간화 중쇄(HC)(서열번호 5 및 6)는 프레임워크 영역에서 (서열번호 1과 비교하여) 14개 및 10개의 돌연변이를 보유하여 호모 사피엔스 생식성 점수가 74.49%에서 각각 88.78% 및 84.69%로 증가하였다. 2개의 인간화 경쇄(LC)(서열번호 8 및 9)는 프레임워크 영역에서 (서열번호 7과 비교하여) 17개 및 15개의 돌연변이를 보유하여 호모 사피엔스 생식성 점수가 64.36%에서 각각 81.19 % 및 79.21%로 증가하였다. 또한, LC 2 및 3에서 잠재적 문제 유발성 메티오닌 산화를 피하기 위해 위치 11의 메티오닌을 류신으로 대체하였다. HC 및 LC 서열은 표 2에 제공되고, mAb HC 및 LC 쌍은 표 3에 제공된다.The two humanized heavy chains (HCs) (SEQ ID NOs: 5 and 6) harbor 14 and 10 mutations (compared to SEQ ID NO: 1) in the framework regions, resulting in a Homo sapiens fertility score of 74.49% to 88.78% and 84.69, respectively. % was increased. The two humanized light chains (LCs) (SEQ ID NOs: 8 and 9) harbor 17 and 15 mutations (compared to SEQ ID NO: 7) in the framework regions, resulting in a Homo sapiens fertility score of 81.19% and 79.21 at 64.36%, respectively. % was increased. In addition, the methionine at position 11 was replaced with a leucine to avoid potentially problematic methionine oxidation in LC 2 and 3. The HC and LC sequences are provided in Table 2, and the mAb HC and LC pairs are provided in Table 3.

Figure pct00002
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2. 생화학적 특성화:2. Biochemical characterization:

A: CD38에 대한 결합A: Binding to CD38

일 실험에서, 인간 CD38에 대한 mAb 1 내지 8의 결합 친화도 및 속도 상수를 Biacore® 기기를 사용하여 SPR로 측정하였다. 간략하게, 항-CD38 항체를 항-Fc 항체가 공유 결합된 CM5 칩에 포획하였다. 여러 농도의 huCD38을 시험 중인 포획된 항체를 대상으로 주사하였다. 결합 곡선(센서그램)을 생성하고 Biacore Evaluation 소프트웨어를 사용하여 속도론적 분석을 수행하였다.In one experiment, the binding affinity and rate constants of mAbs 1-8 to human CD38 were determined by SPR using a Biacore® instrument. Briefly, anti-CD38 antibody was captured on a CM5 chip to which anti-Fc antibody was covalently attached. Different concentrations of huCD38 were injected into the captured antibody under test. Binding curves (sensorgrams) were generated and kinetic analysis was performed using Biacore Evaluation software.

표 4에 나타낸 바와 같이, mAb 3 및 8이 인간 CD38에 대해 가장 높은 친화도를 보였다(각 변이체에 대한 T-검정: p-값은 2보다 큼).As shown in Table 4, mAbs 3 and 8 showed the highest affinity for human CD38 (T-test for each variant: p-value greater than 2).

Figure pct00007
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다른 실험에서, 인간 CD38에 대한 mAb 1 내지 3의 결합 친화도를 상기 기재된 바와 같이 Biacore® 기기를 사용하여 SPR로 측정하였다. mAb 1의 Kd는 0.22 nM이고 mAb 3의 Kd는 0.20 nM이다.In another experiment, the binding affinity of mAbs 1 to 3 for human CD38 was determined by SPR using a Biacore® instrument as described above. The Kd of mAb 1 is 0.22 nM and the Kd of mAb 3 is 0.20 nM.

인간 CD38에 대한 결합 친화도에 미치는 열 응력의 영향: mAb에 (10 mM의 히스티딘, pH 6, 8%의 수크로스, 0.02%의 PS80으로 40℃에서 14일 동안) 열 응력을 가한 후, 인간 CD38에 대한 mAb 1 내지 8의 결합 친화도 및 속도 상수를 Biacore® 기기를 사용하여 SPR로 측정하였다. 상기 단락에서 기재한 것과 동일한 프로토콜을 사용하였다.Effect of thermal stress on binding affinity to human CD38: mAbs were subjected to thermal stress (with 10 mM histidine, pH 6, 8% sucrose, 0.02% PS80 at 40°C for 14 days), followed by human The binding affinity and rate constants of mAbs 1-8 to CD38 were determined by SPR using a Biacore® instrument. The same protocol as described in the paragraph above was used.

표 5에 나타낸 바와 같이, 열 응력을 가한 샘플은 대응하는 열 응력을 가하지 않은 샘플 CD38과 상당히 유사한 친화도 및 속도 상수를 나타냈다(표 4)(각 변이체에 대한 T-검정: p-값은 2보다 큼).As shown in Table 5, the thermally stressed sample exhibited affinity and rate constants significantly similar to the corresponding unstressed sample CD38 (Table 4) (T-test for each variant: p-value was 2 greater than).

Figure pct00008
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B: B: 인실리코 FcγRIIa, FcγRIIIa 및 FcγRIIb에 대한 친화도 측정Affinity measurement for in silico FcγRIIa, FcγRIIIa and FcγRIIb

일 실험에서, FcγRIIIa 158V 수용체 또는 FcγRIIIa 158F 수용체에 대한 mAb의 친화도를 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 측정하였다. mAb를 공급업체(ThermoFisher Scientific)에 따라 일시적 형질감염으로 HEK293 세포에서 생성하고, 공급업체(GE Healthcare)에 따라 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. V158 또는 F158을 포함하는 FcγRIIIa(CD16a) 세포외 도메인을 일시적 발현에 의해 HEK293 세포에서 C-말단 히스태그와 함께 생성하고, 공급업체(Ni-Sepharose GE, Healthcare)에 따라 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 정제하였다. BIACore 2000(GE Healthcare)에 대한 SPR에 의한 친화도는 CM5 칩에 고정된 항-His IgG를 사용하여 캡처 분석에 의해 수행되었다. 이어서 FcγRIIIa-히스태그를 실행 완충액에 첨가한 후, 8 내지 256 nM 범위의 농도로 항-CD38 mAb를 첨가하였다. BIAevaluation Software 4_1(GE Healthcare)을 사용하여 5 미만의 허용 가능한 χ2 값(최대 테스트 농도의 2%를 의미함) 및 25보다 큰 최대 이론 공명 단위 백분율(¼ 초과의 생산적 상호작용을 의미함)로 2상태 반응을 사용하여 분석을 수행하였다.In one experiment, the affinity of a mAb for either the FcγRIIIa 158V receptor or the FcγRIIIa 158F receptor was determined using surface plasmon resonance (SPR). mAbs were generated in HEK293 cells by transient transfection according to the supplier (ThermoFisher Scientific) and purified by protein A affinity chromatography according to the supplier (GE Healthcare). The FcγRIIIa (CD16a) extracellular domain comprising V158 or F158 was generated with a C-terminal histag in HEK293 cells by transient expression and immobilized metal affinity chromatography (Ni-Sepharose GE, Healthcare) according to the supplier (Ni-Sepharose GE, Healthcare). IMAC). Affinity by SPR to BIACore 2000 (GE Healthcare) was performed by capture analysis using anti-His IgG immobilized on a CM5 chip. FcγRIIIa-Histag was then added to the running buffer followed by addition of anti-CD38 mAb at concentrations ranging from 8 to 256 nM. With an acceptable χ 2 value of less than 5 (meaning 2% of the maximum tested concentration) and a percentage of maximum theoretical resonance units greater than 25 (meaning a productive interaction greater than ¼) using BIAevaluation Software 4_1 (GE Healthcare) The analysis was performed using a two-state reaction.

표 6에 나타낸 바와 같이, mAb 2 내지 4는 mAb 1보다 FcγRIIIa 158V에 대한 친화도가 9배 더 높고 mAb 1보다 FcγRIIIa 158F 수용체에 대한 친화도가 27배 이상 더 높다.As shown in Table 6, mAbs 2 to 4 have 9-fold higher affinity for FcγRIIIa 158V than mAb 1 and at least 27-fold higher affinity for FcγRIIIa 158F receptor than mAb 1.

Figure pct00009
Figure pct00009

다른 실험에서, FcγRIIIa 158V 수용체 또는 FcγRIIIa 158F 수용체에 대한 mAb 1 및 3의 친화도를 상기 기재된 바와 같이 SPR을 사용하여 측정하였다. mAb 3은 75 nM의 KD로 FcγRIIIa 158V에 결합하였고, 59 nM의 KD로 FcγRIIIa 158F에 결합하였다.In another experiment, the affinity of mAbs 1 and 3 for either the FcγRIIIa 158V receptor or the FcγRIIIa 158F receptor was determined using SPR as described above. mAb 3 bound to FcγRIIIa 158V with a KD of 75 nM and to FcγRIIIa 158F with a KD of 59 nM.

아미노산 위치 131에 아르기닌이 있거나(FcγRIIa 131R) 아미노산 위치 131에 히스티딘이 있는(FcγRIIa 131H) FcγRIIa 수용체에 대한 mAb의 친화도를 AlphaScreen 근접 분석을 사용하여 측정하였다.The affinity of mAbs for FcγRIIa receptors with an arginine at amino acid position 131 (FcγRIIa 131R) or with a histidine at amino acid position 131 (FcγRIIa 131H) was determined using AlphaScreen proximity analysis.

R131 또는 H131이 있는 FcγRIIa 세포외 도메인은 각각 R&D System(배치 1330-CD) 또는 Biorbyt(배치 ORB138408)에서 제공받았다. 분석은 공급업체(Perkin Elmer)에 의해 기술된 비드 기반 근접 분석으로, 천연 IgG1을 포함하는 항-CD38에 대한 경쟁에 의해 항-CD38 Fc 변이체의 순위를 매길 수 있었다. 천연 IgG1을 갖는 비오틴화 항-CD38을 공여체 비드에 포획하고 FcγRIIa 히스태그-단백질을 수용체 비드에 포획하였다. 항-CD38과 FcγRIIa가 상호작용하면 비드가 근접하게 된다. 680 nm에서 공여체 비드의 여기는 단일항 산소의 방출을 야기하고, 이는 확산하여 근접 시 수용체 비드로부터 520~620 nm에서 광의 방출을 유발한다. 광량은 상호 작용의 정도에 정비례하며 EnVision 다중 모드 플레이트 판독기(Perkin Elmer)로 측정된다. 경쟁 분석 시, 태깅되지 않은 경쟁 mAb 항-CD38 Fc-변이체 DE(S239D/I332E, Eu 넘버링), ADE(G236A/S239D/I332E, Eu 넘버링), 또는 ADLE(G236A/S239D/F243L/I332E, Eu 넘버링)를 사용하여 천연 IgG1을 포함하는 비오틴화 항-CD38과 FcγRIIa-히스태그 단백질 간의 상호작용을 경쟁시켰다. 비오틴화 항-CD38의 농도는 사전 수행된 보정 곡선에서 설정하였다. 태깅되지 않은 mAb의 농도가 증가하면 비오틴화 항-CD38을 대체하고 신호를 감소시킬 수 있도록 태깅되지 않은 경쟁 mAb를 다양한 수준으로 사용하였다. 데이터는 최대 신호에 대해 정규화되었다. 두 실험을 수행하고, BIOST@T-SPEED-LTS 2.1.0로 IC50을 평가하였다.The FcγRIIa extracellular domain with R131 or H131 was provided by R&D System (batch 1330-CD) or Biorbyt (batch ORB138408), respectively. The assay was a bead-based proximity assay described by the supplier (Perkin Elmer), which made it possible to rank anti-CD38 Fc variants by competition for anti-CD38 containing native IgG1. Biotinylated anti-CD38 with native IgG1 was captured on donor beads and FcγRIIa histag-protein was captured on acceptor beads. When anti-CD38 interacts with FcγRIIa, the beads come into proximity. Excitation of the donor bead at 680 nm causes the emission of singlet oxygen, which diffuses and causes the emission of light at 520-620 nm from the acceptor bead upon proximity. The amount of light is directly proportional to the degree of interaction and is measured with an EnVision multi-mode plate reader (Perkin Elmer). In competition analysis, untagged competing mAb anti-CD38 Fc-variant DE (S239D/I332E, Eu numbering), ADE (G236A/S239D/I332E, Eu numbering), or ADLE (G236A/S239D/F243L/I332E, Eu numbering) ) was used to compete for the interaction between biotinylated anti-CD38 containing native IgG1 and FcγRIIa-histag protein. The concentration of biotinylated anti-CD38 was established in a calibration curve previously performed. Various levels of untagged competitive mAb were used to displace biotinylated anti-CD38 and reduce the signal when the concentration of untagged mAb increased. Data were normalized to the maximum signal. Two experiments were performed and the IC50 was evaluated with BIOST@T-SPEED-LTS 2.1.0.

표 7에 나타낸 바와 같이, mAb 3은 mAb 1에 비해, FcγRIIa 131R 및 FcγRIIa 131H에 대해 각각 14배 및 18배 높은 친화도를 나타내었다.As shown in Table 7, compared to mAb 1, mAb 3 exhibited 14-fold and 18-fold higher affinity for FcγRIIa 131R and FcγRIIa 131H, respectively.

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C: C: 시험관내 FcγRIIa, FcγRIIIa 및 FcγRIIb에 대한 친화도 측정Affinity determination for FcγRIIa, FcγRIIIa and FcγRIIb in vitro

HEK293T-FcγRIIIa-158F, HEK293T-FcγRIIIa-158V, HEK293T-FcγRIIa-131H, HEK293T-FcγRIIa-131R, HEK293T-FcγRI, 또는 HEK293T-FcγRIIb를 96-웰 마이크로플레이트에 105개 세포/웰로 시딩하였다. 플레이트를 800 g에서 1분 동안 원심분리하고, 4℃에서 30분 동안 상이한 농도의 항체를 함유하는 50 μL PBS에 재현탁하였다. 이어서 200 μL PBS 1% FBS를 첨가하여 세포를 세척한 후 1분 동안 800 g 원심분리를 수행하였다. 세척 단계를 총 3회 반복한 후 4℃에서 30분 동안 FITC(Fragment Goat Anti-human IgG (H+L) FITC, ref 109-546-088 Jackson ImmunoResearch, 10 μg/mL 최종)가 접합된 이차 항체로 세포를 염색하였다. 세포를 200 μL PBS 1% FBS로 3회 세척하고 MACSVYB(B1 채널)에서 획득하기 전에 100 μL PBS에 재현탁하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, mAb 2, 3, 및 4는 각각 mAb 1에 비해, HEK 세포에서 발현된 FcγRIIIa 158F에 대해 32배, 38배, 및 51배 높은 친화도를 나타내었고, HEK 세포에서 발현된 FcγRIIIa 158V에 대해 9배, 5배, 및 6배 높은 친화도를 나타내었다.HEK293T-FcγRIIIa-158F, HEK293T-FcγRIIIa-158V, HEK293T-FcγRIIa-131H, HEK293T-FcγRIIa-131R, HEK293T-FcγRI, or HEK293T-FcγRIIb were seeded in 96-well microplates at 10 5 cells/well. Plates were centrifuged at 800 g for 1 min and resuspended in 50 μL PBS containing different concentrations of antibody at 4° C. for 30 min. Then, 200 μL PBS 1% FBS was added to wash the cells, followed by centrifugation at 800 g for 1 minute. After repeating the washing step a total of 3 times, the secondary antibody conjugated with FITC (Fragment Goat Anti-human IgG (H+L) FITC, ref 109-546-088 Jackson ImmunoResearch, 10 μg/mL final) at 4°C for 30 min. cells were stained with Cells were washed 3 times with 200 μL PBS 1% FBS and resuspended in 100 μL PBS prior to acquisition in MACSVYB (B1 channel). As shown in Table 8, mAbs 2, 3, and 4 exhibited 32-fold, 38-fold, and 51-fold higher affinity for FcγRIIIa 158F expressed in HEK cells, respectively, compared to mAb 1, and expressed in HEK cells It exhibited 9-fold, 5-fold, and 6-fold higher affinity for FcγRIIIa 158V.

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Figure pct00011

표 9에 나타낸 바와 같이, mAb 3은 mAb 1에 비해, HEK 세포에서 발현된 FcγRIIa 131H에 대해 약 5배 높은 친화도를 나타내었고, HEK 세포에서 발현된 FcγRIIa 131R에 대해 약 16배 높은 친화도를 나타내었다.As shown in Table 9, compared with mAb 1, mAb 3 exhibited about 5-fold higher affinity for FcγRIIa 131H expressed in HEK cells, and about 16-fold higher affinity for FcγRIIa 131R expressed in HEK cells. indicated.

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Figure pct00012

표 10에 나타낸 바와 같이, mAb 2, 3, 및 4는 mAb 1에 비해, FcγRI에 대해 유사한 수준의 결합 친화도를 나타내었고, HEK 세포에서 발현된 FcγRIIb에 대해 1.8 내지 3.9배 낮은 친화도를 나타내었다.As shown in Table 10, compared with mAb 1, mAb 2, 3, and 4 showed a similar level of binding affinity for FcγRI, and 1.8 to 3.9-fold lower affinity for FcγRIIb expressed in HEK cells. it was

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Figure pct00013

D: D: 시험관내 세포독성 활성 측정Determination of In Vitro Cytotoxic Activity

항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC):Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC):

효과기 세포로서 FcγRIIIa 수용체를 과발현하도록 조작된 NK92 세포주를 사용한 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 분석을 칼세인-아세티옥시메틸(Calcein-AM, Invitrogen) 방출 분석을 사용하여 검토하였다. 살아있는 세포에서 비형광 칼세인 AM은 녹색 형광 칼세인으로 전환된다. 표지된 표적 세포는 SAR442085 항체 및 NK-92 효과기 세포와 함께 인큐베이션된다. ADCC를 통한 표적 세포의 용해는 형광 칼세인의 방출로 이어진다. 형광 강도는 존재하는 ADCC 활성 수준에 비례한다.An antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) assay using the NK92 cell line engineered to overexpress the FcγRIIIa receptor as effector cells was reviewed using a calcein-acetioxymethyl (Calcein-AM, Invitrogen) release assay. In living cells, non-fluorescent calcein AM is converted to green fluorescent calcein. Labeled target cells are incubated with SAR442085 antibody and NK-92 effector cells. Lysis of target cells via ADCC leads to the release of fluorescent calcein. Fluorescence intensity is proportional to the level of ADCC activity present.

다발성 골수종 표적 세포(MOLP-8, RPMI 8226, MM1R, 또는 KMS12-BM)를 30분 동안 Calcein-AM(25 μL DMSO에 50 μg 희석한 후 4 mL RPMI 1640 + 1% FBS + 1% Probenecid에 10 μL 칼세인 희석하여 4×106개 세포 염색)으로 표지한 후 세척하고 2×104개 세포/웰의 밀도로 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 표시된 테스트 mAb 또는 대조군 이소형 mAb를 30분 동안 10 μg/mL 내지 0.01 pg/mL의 다양한 농도로 첨가하여 옵소닌화를 허용한 후, 표시된 FcγRIIIa 변이체로 형질도입된 자연 살해(NK) 세포를 첨가하였다. 158F 또는 158V를 발현하는 NK 세포를 5:1(2×104개 표적 세포에 대해 1×105개 NK 세포)의 E:T 비율로 효과기 세포로서 첨가하였다. 이어서 플레이트를 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고 100 μL의 상청액을 수확하여 불투명한 96-웰 마이크로플레이트에 옮겨, 칼세인 방출(여기 필터: 492 nm, 방출: 515 nm) 측정을 위해 Tecan Infinite M1000에서 형광측정법을 사용하여 분석하였다. 최대 방출을 위해 세포를 2% Triton X-100으로 용해시켰다. 실험 방출(A), 표적 세포 자발적 방출(B), 및 표적 세포 최대 방출(C)의 형광 값에서 배양 배지 백그라운드의 형광 값을 제하였다. 각 플레이트(중복)에 대한 세포독성 및 ADCC 백분율을 다음과 같은 공식을 사용하여 계산하였다.Multiple myeloma target cells (MOLP-8, RPMI 8226, MM1R, or KMS12-BM) were diluted with Calcein-AM (50 µg in 25 µL DMSO) for 30 min, followed by 10 in 4 mL RPMI 1640 + 1% FBS + 1% Probenecid. Diluted with µL calcein, stained with 4×10 6 cells), washed, and plated in 96-well round bottom plates at a density of 2×10 4 cells/well. The indicated test mAbs or control isotype mAbs were added at various concentrations from 10 μg/mL to 0.01 pg/mL for 30 min to allow opsonization, followed by addition of natural killer (NK) cells transduced with the indicated FcγRIIIa variants. did To 158F or NK cells expressing 158V 5: 1 E of the (2 × 10 4 1 × 10 5 gae gae NK cells against target cells) was added at a rate as T effector cells. Plates were then incubated at 37° C. for 1 h in a humidified incubator with 5% CO 2 , harvested 100 μL of supernatant and transferred to opaque 96-well microplates to release calcein (excitation filter: 492 nm, emission: 515 nm) were analyzed using fluorometry on a Tecan Infinite M1000. Cells were lysed with 2% Triton X-100 for maximal release. The fluorescence values of the culture medium background were subtracted from the fluorescence values of experimental release (A), target cell spontaneous release (B), and target cell maximal release (C). Cytotoxicity and ADCC percentages for each plate (duplicate) were calculated using the following formulas.

세포독성(%) = (A - B)/(C - B)×100%Cytotoxicity (%) = (A - B)/(C - B) × 100%

각 실험을 최소 3회 반복하였다. GraphPad Prism 5(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 데이터 포인트를 4-매개변수 방정식에 넣어 반치 최대 유효 농도(EC50) 값을 계산하였다.Each experiment was repeated at least 3 times. Half maximum effective concentration (EC50) values were calculated using GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) by putting the data points into a four-parameter equation.

높은 CD38 수용체 밀도의 표적 세포Target cells with high CD38 receptor density

다발성 골수종 세포주 MOLP-8의 ADCC를 상기 기재된 바와 같이 시험관내에서 평가하였다. MOLP-8 세포는 세포 표면에서 높은 CD38 수용체 밀도(약 400,000/세포)를 나타낸다.ADCC of the multiple myeloma cell line MOLP-8 was assessed in vitro as described above. MOLP-8 cells display a high CD38 receptor density (about 400,000/cell) on the cell surface.

표 11은 158V를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 MOLP-8 세포에 대해 각각 시험된 항체의 EC50을 보여준다. 표 11에 나타낸 바와 같이, FcγRIIIa의 고친화성 변이체(158V)를 발현하는 NK 세포의 존재 하에, mAb 2, 3, 및 4는 mAb 1에 비해, 24 내지 33배 낮은 EC50으로 MOLP-8 세포의 ADCC를 유발하였다.Table 11 shows the EC50 of the antibodies tested respectively against MOLP-8 cells in the presence of NK cells expressing 158V. As shown in Table 11, in the presence of NK cells expressing the high-affinity variant (158V) of FcγRIIIa, mAbs 2, 3, and 4 compared to mAb 1, ADCC of MOLP-8 cells with 24-33-fold lower EC50. induced.

Figure pct00014
Figure pct00014

표 12는 158F를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 MOLP-8 세포에 대해 각각 시험된 항체의 EC50을 보여준다. 표 12에 나타낸 바와 같이, mAb 4는 저친화성 FcγRIIIa 변이체(158F)를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 mAb 1에 비해, 약 97배 낮은 EC50으로 MOLP-8 세포에 대해 가장 강력한 ADCC 활성을 나타내었다. mAb 2 및 3은 저친화성 FcγRIIIa 변이체(158F)를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 mAb 1보다 약 59~69배 낮은 EC50으로 MOLP-8 세포의 ADCC를 유발하였다.Table 12 shows the EC50 of the antibodies tested respectively against MOLP-8 cells in the presence of NK cells expressing 158F. As shown in Table 12, mAb 4 showed the most potent ADCC activity against MOLP-8 cells with an EC50 about 97-fold lower than that of mAb 1 in the presence of NK cells expressing the low-affinity FcγRIIIa variant (158F). mAb 2 and 3 induced ADCC of MOLP-8 cells with an EC50 about 59-69-fold lower than that of mAb 1 in the presence of NK cells expressing the low affinity FcγRIIIa variant (158F).

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Figure pct00015

중간 CD38 수용체 밀도의 표적 세포Target cells of medium CD38 receptor density

다발성 골수종 세포주 RPMI-8226의 ADCC를 상기 기재된 바와 같이 시험관내에서 평가하였다. RPMI-8226 세포는 세포 표면에서 중간 CD38 수용체 밀도(약 70,000/세포)를 나타낸다.ADCC of the multiple myeloma cell line RPMI-8226 was assessed in vitro as described above. RPMI-8226 cells exhibit a median CD38 receptor density (about 70,000/cell) at the cell surface.

표 13은 158V를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 RPMI-8226 세포에 대해 각각 시험된 항체의 EC50을 보여준다. 표 13에 나타낸 바와 같이, mAb 2 내지 4는 mAb 1에 비해 약 27배 낮은 EC50으로 유사한 수준의 향상된 능력을 나타내어 FcγRIIIa의 고친화성 변이체(158V)를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 중간 CD38 수용체 밀도를 발현하는 MM 세포에 대한 ADCC를 유발하였다.Table 13 shows the EC50 of the antibodies tested respectively against RPMI-8226 cells in the presence of NK cells expressing 158V. As shown in Table 13, mAbs 2 to 4 exhibited a similar level of enhanced ability with an EC50 about 27-fold lower than that of mAb 1, resulting in a median CD38 receptor density in the presence of NK cells expressing the high-affinity variant (158V) of FcγRIIIa. ADCC was induced against expressing MM cells.

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Figure pct00016

표 14는 158F를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 RPMI-8226 세포에 대해 각각 시험된 항체의 EC50을 보여준다. mAb 4는 mAb 1에 비해 약 73배 향상된 능력을 나타내어 FcγRIIIa의 저친화성 변이체를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 중간 CD38 수용체 밀도를 발현하는 MM 세포에 대한 ADCC를 유발한 반면, mAb 3과 mAb 2는 mAb 1에 비해 각각 약 65배 및 약 49배 향상된 능력을 나타내어 FcγRIIIa의 저친화성 변이체를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 중간 CD38 수용체 밀도를 발현하는 MM 세포에 대한 ADCC를 유발하였다.Table 14 shows the EC50 of the antibodies tested respectively against RPMI-8226 cells in the presence of NK cells expressing 158F. mAb 4 exhibited an approximately 73-fold enhanced ability compared to mAb 1, resulting in ADCC against MM cells expressing an intermediate CD38 receptor density in the presence of NK cells expressing a low-affinity variant of FcγRIIIa, whereas mAb 3 and mAb 2 It exhibited about 65-fold and about 49-fold enhanced ability, respectively, compared to mAb 1, resulting in ADCC against MM cells expressing an intermediate CD38 receptor density in the presence of NK cells expressing a low-affinity variant of FcγRIIIa.

Figure pct00017
Figure pct00017

낮은 CD38 수용체 밀도의 표적 세포Target cells with low CD38 receptor density

다발성 골수종 세포주 KMS-12BM의 ADCC를 상기 기재된 바와 같이 시험관내에서 평가하였다. KMS-12BM 세포는 세포 표면에서 낮은 CD38 수용체 밀도(약 13,000/세포)를 나타낸다.ADCC of the multiple myeloma cell line KMS-12BM was assessed in vitro as described above. KMS-12BM cells exhibit a low CD38 receptor density (approximately 13,000/cell) at the cell surface.

표 15는 FcγRIIIa의 고친화성 변이체(158V)를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 KMS-12BM 세포에 대해 각각 시험된 항체의 EC50을 보여준다. 흥미롭게도, 표 15에 나타낸 바와 같이, mAb 2, 3, 및 4는 mAb 1에 비해 향상된 능력을 나타내어 FcγRIIIa의 고친화성 변이체(158V)를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 낮은 CD38 수용체 밀도를 발현하는 MM 세포에 대한 ADCC를 유발하였다. mAb 3의 EC50은 mAb 1보다 약 69배 낮았고, mAb 4의 EC50은 mAb 1보다 약 91배 낮았다.Table 15 shows the EC50 of antibodies tested respectively against KMS-12BM cells in the presence of NK cells expressing a high affinity variant of FcγRIIIa (158V). Interestingly, as shown in Table 15, mAbs 2, 3, and 4 showed enhanced capacity compared to mAb 1, resulting in MM expressing low CD38 receptor density in the presence of NK cells expressing the high-affinity variant (158V) of FcγRIIIa. ADCC on the cells was induced. The EC50 of mAb 3 was about 69-fold lower than that of mAb 1, and the EC50 of mAb 4 was about 91-fold lower than that of mAb 1.

Figure pct00018
Figure pct00018

표 16은 FcγRIIIa의 저친화성 변이체(158F)를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 KMS-12BM 세포에 대해 각각 시험된 항체의 EC50을 보여준다. 놀랍게도, 표 16에 나타낸 바와 같이, mAb 2, 3, 및 4는 mAb 1에 비해 향상된 능력을 나타내어 FcγRIIIa의 저친화성 변이체(158F)를 발현하는 NK 세포의 존재 하에 낮은 CD38 수용체 밀도를 발현하는 MM 세포에 대한 ADCC를 유발하였다. mAb 3의 EC50은 mAb 1보다 약 145배 낮았고, mAb 4의 EC50은 mAb 1보다 약 269배 낮았다.Table 16 shows the EC50 of the antibodies tested respectively against KMS-12BM cells in the presence of NK cells expressing the low affinity variant of FcγRIIIa (158F). Surprisingly, as shown in Table 16, mAbs 2, 3, and 4 showed enhanced capacity compared to mAb 1, resulting in MM cells expressing low CD38 receptor density in the presence of NK cells expressing the low affinity variant of FcγRIIIa (158F). ADCC was induced. The EC50 of mAb 3 was about 145-fold lower than that of mAb 1, and the EC50 of mAb 4 was about 269-fold lower than that of mAb 1.

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Figure pct00019

항체 의존성 세포매개 식균작용(ADCP):Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP):

인간 PBMC를

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의 건강한 기증자 7명의 버피 코트에서 먼저 단리하였다. 이들 모든 공여자는 동일한 FCGR3A 및 FCGR2A 유전자형(FcγRIIIa- 158V/V 및 FcγRIIa- 131H/H)을 나타냈다. 혈액을 먼저 50 mL 팔콘 튜브에 수집하였다. Ficoll-PlaqueTM PLUS 96% 15 mL를 Sepmate 튜브 바닥에 매우 천천히 첨가한 후, 혈액을 튜브에 천천히 첨가하고 1,300 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이어서 PBMC 링을 수집하고 50 mL PBS로 세척하고 5분 동안 300 g에서 한 번 더 원심분리하였다. 제조업체의 지침(Miltenyi; ref 130-050-201: 기본적으로 AutoMACS pro(Posseld 선택)를 통한 양성 선택 전 4℃에서 15분의 인큐베이션 시간)에 따라 항-CD14 자기 비드로 PBMC 염색하기 전에 세척 과정을 2회 반복하였다. 단핵구를 수집한 후 50 mL PBS로 세척하였다. 단핵구를 37℃, 5% CO2의 T75 플라스크에서 RPMI1640, 10% FBS, 2% 인간 불활성화 혈청, 50 ng/ml GM-CSF로 5일 동안 배양하였다. 5일 배양 후, 단핵구는 대식세포로 분화되었다. 대식세포를 수집하기 위해, 아큐타제(ThermoFisher, ref: A1110501)를 37℃에서 15분 동안 플라스크에 넣어 세포를 분리한 후, 20 mL RPMI 10% FBS 1% 글루타민을 첨가하여 아큐타제 활성을 정지시켰다. 수집된 세포를 350 g에서 10분 동안 원심분리한 후, 20 mL PBS로 세척하고, 300 g에서 10분 동안 한 번 더 원심분리하였다. 두 실험에서 사용된 대식세포는 액체 질소에서 동결된 대식세포 배치에서 가져왔다.human PBMCs
Figure pct00020
was first isolated from the buffy coats of 7 healthy donors of All these donors displayed the same FCGR3A and FCGR2A genotypes (FcγRIIIa-158V/V and FcγRIIa-131H/H). Blood was first collected in 50 mL falcon tubes. 15 mL of Ficoll-Plaque ™ PLUS 96% was added very slowly to the bottom of the Sepmate tube, then blood was slowly added to the tube and centrifuged at 1,300 g for 10 minutes. PBMC rings were then collected, washed with 50 mL PBS and centrifuged once more at 300 g for 5 min. Follow the manufacturer's instructions (Miltenyi; ref 130-050-201: basically an incubation time of 15 min at 4 °C prior to positive selection via AutoMACS pro (Posseld selection)) prior to staining of PBMCs with anti-CD14 magnetic beads. This was repeated twice. After collecting monocytes, they were washed with 50 mL PBS. Monocytes were cultured in a T75 flask at 37° C., 5% CO 2 with RPMI1640, 10% FBS, 2% human inactivated serum, 50 ng/ml GM-CSF for 5 days. After 5 days of culture, monocytes were differentiated into macrophages. To collect macrophages, accutase (ThermoFisher, ref: A1110501) was placed in a flask at 37° C. for 15 minutes to separate cells, and then, 20 mL RPMI 10% FBS 1% glutamine was added to stop accutase activity. . The collected cells were centrifuged at 350 g for 10 min, washed with 20 mL PBS, and centrifuged once more at 300 g for 10 min. The macrophages used in both experiments were taken from batches of macrophages frozen in liquid nitrogen.

대식세포를 20x106개 세포/mL로 희석제 C에 재현탁하였다(Sigma Aldrich의 제조업체 염색 키트 # PKH26GL-1KT에서 제공). 1부피의 대식세포의 경우, 1부피의 PKH26(1 mL 희석제 C에 희석된 20 μL)을 암실에서 5분 인큐베이션 동안 세포에 첨가하였다. 이어서 RPMI1640 10% FBS로 50 mL까지 완료하기 전에, 5 mL FBS를 첨가하여 1분 동안 염색 과정을 비활성화하였다. CD38을 발현하는 MOLP-8 세포를 PKH67 형광색소로 염색하고 정제된 단핵구에서 유래한 대식세포를 PKH26으로 염색하여 유세포 분석을 통해 구별할 수 있게 하였다. 이어서 MOLP-8 세포와 대식세포를 mAb 1 또는 mAb 3의 존재 하에 밤새 배양한 후, 유세포 분석을 통해 이중 양성 집단(MOLP-8 세포를 식균하는 대식세포)을 분석하였다.Macrophages were resuspended in diluent C at 20x10 6 cells/mL (provided by Sigma Aldrich's manufacturer's staining kit # PKH26GL-1KT). For 1 volume of macrophages, 1 volume of PKH26 (20 µL diluted in 1 mL diluent C) was added to the cells during a 5 min incubation in the dark. 5 mL FBS was then added to inactivate the staining process for 1 min before completion to 50 mL with RPMI1640 10% FBS. MOLP-8 cells expressing CD38 were stained with PKH67 fluorochrome, and macrophages derived from purified monocytes were stained with PKH26 to distinguish them through flow cytometry. Then, MOLP-8 cells and macrophages were cultured overnight in the presence of mAb 1 or mAb 3, and then the double positive population (macrophages phagocytosing MOLP-8 cells) was analyzed by flow cytometry.

mAb 3은 모든 실험에서 달성된 총 식균작용의 더 높은 백분율(%) 및 더 낮은 EC50(상대적) 값(EC50rel)으로 입증된 바와 같이 MOLP-8 세포주에 대해 mAb 1보다 향상된 ADCP 활성을 나타내었다. 총 식균 작용 %의 기하 평균은 mAb 3의 경우 40.85% 대 mAb 1의 경우 18.57%였고, EC50rel의 기하 평균은 mAb 3의 경우 31.87 ng/mL(또는 212.57 pM) 대 mAb 1의 경우 64.86 ng/mL를 초과한 값(또는 432.62 pM을 초과) 이었다. EC50rel 값에 근거하면, mAb 3은 ADCP 활성에 대해 mAb 1보다 2.035배 이상 더 우수한 것으로 나타났다.mAb 3 showed enhanced ADCP activity over mAb 1 against the MOLP-8 cell line as evidenced by a higher percentage (%) of total phagocytosis and lower EC50 (relative) values (EC50rel) in all experiments. The geometric mean of % total phagocytosis was 40.85% for mAb 3 versus 18.57% for mAb 1, and the geometric mean of EC50rel was 31.87 ng/mL (or 212.57 pM) for mAb 3 versus 64.86 ng/mL for mAb 1. was greater than (or greater than 432.62 pM). Based on the EC50rel values, mAb 3 was found to be at least 2.035-fold superior to mAb 1 for ADCP activity.

생체 내 효능In vivo efficacy

mAb 3의 생체내 효능을 평가하였다. 인간화 FcγR C57BL/6 마우스(문헌[Smith P, DiLillo DJ, Bournazos S, Li F, Ravetch JV; Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109(16):6181-6])에 0일차에 500,000개의 EL4-huCD38 종양 세포를 정맥내 주사하였다. 인간화 FcγR C57BL/6 마우스는 FcγR을 암호화하는 모든 뮤린 유전자가 결실되었고 이식유전자로 암호화된 인간 FcγR이 마우스 게놈에 삽입되었다. 인간화 FcγR C57BL/6 마우스는 huFcγR 발현 패턴 및 발현 수준을 재현하고 염증, 세포독성, 및 종양 제거의 다양한 huIgG 매개 모델에서 기능적이다. 활성화 FcγRIIIa 및 FcγRIIa 수용체의 경우, 마우스 모델에 삽입된 인간 변이체는 각각 huFcγRIIIa 158F 및 huFcγRIIa 131R(수용체의 저친화성 변이체)이었다. 인간 FcγR 발현 패턴 및 발현 수준의 프로파일을 마우스에서 재현하였다.The in vivo efficacy of mAb 3 was evaluated. 500,000 EL4- on day 0 in humanized FcγR C57BL/6 mice (Smith P, DiLillo DJ, Bournazos S, Li F, Ravetch JV; Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109(16):6181-6). huCD38 tumor cells were injected intravenously. Humanized FcγR C57BL/6 mice had all murine genes encoding FcγR deleted and a transgene-encoded human FcγR was inserted into the mouse genome. Humanized FcγR C57BL/6 mice reproduce huFcγR expression patterns and levels and are functional in various huIgG-mediated models of inflammation, cytotoxicity, and tumor clearance. For activating FcγRIIIa and FcγRIIa receptors, the human variants inserted into the mouse model were huFcγRIIIa 158F and huFcγRIIa 131R (low affinity variants of the receptor), respectively. Profiles of human FcγR expression patterns and expression levels were reproduced in mice.

종양 세포 주입 후 1일차에 시작하여, 시험 또는 대조군 mAb를 1일차, 4일차, 7일차, 및 14일차에 복강내 투여하였다. 이소형 대조군 mAb는 10 mg/kg으로 투여하였다. mAb 1, 3, 및 10은 10 및 1.25 mg/kg으로 투여하였다. 이 생존 모델에서 일차 효능 매개변수는 중위 생존 시간(MST), 수명 연장 비율(ILS%), 및 장기 생존자(생존 기간이 대조군의 MST의 2배 이상인 마우스로 정의됨)였다. 그룹 간의 생존 차이는 Cox 모델로 평가하였다.Starting on day 1 after tumor cell injection, test or control mAbs were administered intraperitoneally on days 1, 4, 7, and 14. The isotype control mAb was administered at 10 mg/kg. mAbs 1, 3, and 10 were administered at 10 and 1.25 mg/kg. The primary efficacy parameters in this survival model were median survival time (MST), percentage of lifespan extension (ILS%), and long-term survivors (defined as mice with a survival period of at least twice the MST of the control group). Differences in survival between groups were evaluated using the Cox model.

표 17에 나타낸 바와 같이, 이소형 대조군의 MST는 39일이었다. 이소형 대조군의 20%가 이 모델에서 장기 생존을 보였다. 10 mg/kg의 mAb 1로 처리된 군은 MST가 82.5일이 넘었고 수명이 112% 넘게 증가하였다. 10 mg/kg의 mAb 1로 처리된 군의 50%가 장기 생존을 보였다. 1.25 mg/kg의 mAb 1로 처리된 마우스는 MST가 46.5일이 넘었고 수명이 19% 넘게 증가하였다. 1.25 mg/kg의 mAb 1로 처리된 군의 30%가 장기 생존을 보였다.As shown in Table 17, the MST of the isotype control was 39 days. Twenty percent of the isotype controls showed long-term survival in this model. The group treated with 10 mg/kg of mAb 1 had an MST of more than 82.5 days and an increase in lifespan by more than 112%. 50% of the group treated with 10 mg/kg of mAb 1 showed long-term survival. Mice treated with 1.25 mg/kg of mAb 1 had an MST of >46.5 days and a >19% increase in lifespan. 30% of the group treated with 1.25 mg/kg of mAb 1 showed long-term survival.

10 mg/kg의 mAb 10으로 처리된 군은 MST가 70일이 넘었고 수명이 70% 증가하였다. 10 mg/kg의 mAb 10으로 처리된 군의 50%가 장기 생존을 보였다. 1.25 mg/kg의 mAb 10으로 처리된 마우스는 MST가 42일이 넘었고 수명이 8% 증가하였다. 1.25 mg/kg의 mAb 10으로 처리된 군의 단지 10%만이 장기 생존을 보였다.The group treated with 10 mg/kg of mAb 10 had more than 70 days of MST and a 70% increase in lifespan. 50% of the group treated with 10 mg/kg of mAb 10 showed long-term survival. Mice treated with 1.25 mg/kg of mAb 10 had more than 42 days of MST and an 8% increase in lifespan. Only 10% of the group treated with 1.25 mg/kg of mAb 10 showed long-term survival.

10 mg/kg의 mAb 3으로 처리된 군은 MST가 90일이 넘었고 수명이 131% 넘게 증가하였다. 놀랍게도, 10 mg/kg의 mAb 3으로 처리된 군의 90%가 장기 생존을 보였다. 10 mg/kg의 mAb 3은 이소형 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 보다 높은 활성을 보였다(p=0.0351). 더욱 놀랍게도, 1.25 mg/kg의 mAb 3으로 처리된 마우스는 또한 MST가 90일이 넘었고 수명이 131% 넘게 증가하였다. 또한, 1.25 mg/kg의 mAb 3으로 처리된 군의 90%가 장기 생존을 보였다. 1.25 mg/kg의 mAb 3은 이소형 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 보다 높은 활성을 보였고(p=0.0380), 동일한 용량의 mAb 10보다 통계적으로 유의하게 더 우수하였다(p=0.0380).The group treated with 10 mg/kg of mAb 3 had an MST of over 90 days and an increase in lifespan by over 131%. Surprisingly, 90% of the group treated with 10 mg/kg of mAb 3 showed long-term survival. mAb 3 at 10 mg/kg showed a statistically significantly higher activity compared to the isotype control (p=0.0351). More surprisingly, mice treated with 1.25 mg/kg of mAb 3 also had more than 90 days of MST and an increase in lifespan by more than 131%. In addition, 90% of the group treated with 1.25 mg/kg of mAb 3 showed long-term survival. mAb 3 at 1.25 mg/kg showed statistically significantly higher activity compared to the isotype control (p=0.0380) and was statistically significantly superior to mAb 10 at the same dose (p=0.0380).

저친화성 huFcγRIIIa(F158/F158)를 보유하는 마우스에서 이 종양 모델을 10 mg/kg의 용량의 mAb 1, mAb 3, 및 mAb 10으로 치료한 결과, 수명 및 장기 생존자의 수에서 통계적으로 유의한 개선을 보였다. 그러나 놀랍게도, 1.25 mg/kg의 용량에서 mAb 3은 수명과 장기 생존자의 수에서 통계적으로 유의한 개선을 나타낸 반면 mAb 1 및 mAb 10은 비활성이었다.Treatment of this tumor model with mAb 1, mAb 3, and mAb 10 at a dose of 10 mg/kg in mice bearing the low affinity huFcγRIIIa (F158/F158) resulted in statistically significant improvement in lifespan and number of long-term survivors. showed Surprisingly, however, at a dose of 1.25 mg/kg, mAb 3 showed statistically significant improvements in lifespan and number of long-term survivors, whereas mAb 1 and mAb 10 were inactive.

Figure pct00021
Figure pct00021

E. 안정성 연구E. Stability Study

열안정성thermal stability

mAb 1, 3, 5, 6, 7, 및 8의 열안정성은 Malvern MicroCal VP 열량계를 사용하여 시차 주사 열량계(DSC)로 측정하였다. pH 6.0의 10 mM 히스티딘 HCl을 포함하는 완충액에서 샘플을 테스트하였다. 준비된 샘플을 Wheaton 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 웰에 기준 완충제와 함께 3중으로 로딩하였다. 1℃/분의 승온 속도 및 20~120℃의 범위를 사용하여, 열 스캔을 수집하고 origin 소프트웨어 2.0으로 처리하였다.The thermal stability of mAbs 1, 3, 5, 6, 7, and 8 was determined by differential scanning calorimetry (DSC) using a Malvern MicroCal VP calorimeter. Samples were tested in a buffer containing 10 mM histidine HCl, pH 6.0. Prepared samples were loaded in triplicate with reference buffer into the wells of a Wheaton 96-well round bottom plate. Thermal scans were collected and processed with origin software 2.0, using a heating rate of 1°C/min and a range of 20-120°C.

표 18에 나타낸 바와 같이, mAb 3, 5, 6, 7, 및 8은, mAb 1의 개시 온도보다 약 17℃ 낮고 mAb에 대해 일반적인 것보다 15~20℃ 낮은 온도인, 약 40℃에서 단백질 형태 변화의 개시를 보였다. 또한, mAb 3, 5, 6, 7, 및 8의 CH2 도메인 풀림은 70℃에 비해, 약 50℃에서 mAb 1에 대한 것보다 훨씬 전에 시작되었다.As shown in Table 18, mAbs 3, 5, 6, 7, and 8 form the protein at about 40°C, about 17°C below the onset temperature of mAb 1 and 15-20°C below that typical for mAbs. showed the onset of change. In addition, CH2 domain unwinding of mAbs 3, 5, 6, 7, and 8 started well before that for mAb 1 at about 50°C, compared to 70°C.

Figure pct00022
Figure pct00022

등전점isoelectric point

mAb 1, 3, 5, 6, 7, 및 8 각각의 등전점(pI)은 모세관 등전 집중법(cIEF)으로 측정하였다. 이론적인 pI는 분석 플랫폼 SEDNTERP를 사용하고 아미노산 pKa 값(즉, Arg = 12, Asp = 4.5, Glu = 4.6, His = 6.2, Lys = 10.4, 및 Tyr = 9.7)을 가정하여 조성으로부터 결정하였다. Cys 잔기의 모든 설프히드릴 측쇄는 pKa에 기여하지 않고 이황화 결합된 것으로 가정하였다(문헌[Laue TM, Shah BD, Ridgeway TM, and Pelletier SL. Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for protein. In Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science. Harding SE, Rowe AJ, and Horton JC Eds. pp 90-124. Royal Society of Chemistry, 1991]).The isoelectric point (pI) of each of mAbs 1, 3, 5, 6, 7, and 8 was measured by capillary isoelectric focusing (cIEF). Theoretical pI was determined from composition using the analytical platform SEDTERP and assuming amino acid pKa values (ie, Arg = 12, Asp = 4.5, Glu = 4.6, His = 6.2, Lys = 10.4, and Tyr = 9.7). All sulfhydryl side chains of Cys residues do not contribute to pKa and are assumed to be disulfide bonds (Laue TM, Shah BD, Ridgeway TM, and Pelletier SL. Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for protein. In Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science. Harding SE, Rowe AJ, and Horton JC Eds. pp 90-124. Royal Society of Chemistry, 1991).

놀랍게도, 표 19에 나타낸 바와 같이, 측정된 pI는 서열에 근거하여 mAb 3에 대해 계산된 pI보다 낮았다.Surprisingly, as shown in Table 19, the measured pI was lower than the calculated pI for mAb 3 based on the sequence.

Figure pct00023
Figure pct00023

mAb 3의 제형 개발Formulation development of mAb 3

열안정성 결과에 근거하여, mAb를 -30℃ 이하에서 보관하기에 적합하고 동결건조된 mAb를 2~8℃에서 보관하기에 적합하였던 mAb 3의 적절한 안정성을 보장하기 위해 동결건조된 제형을 개발하였다. 다양한 완충 시스템을 사용하여 다양한 pH에서 mAb 3 제형을 동결-해동 사이클링, 교반 연구, 40℃, 25℃, 5℃, -30℃, 및 -80℃의 응력, 가속, 및 의도된 보관 조건 하의 단기(12주) 인큐베이션으로 구성된 안정성 연구에서 테스트하였다. 이 실험에서 입자 형성(육안 검사, 빛 차단 기반 입자 계수, 및 미세 흐름 이미징)과 더불어 단백질의 응집 및 화학적 분해를 평가하였다.Based on the thermal stability results, a lyophilized formulation was developed to ensure adequate stability of mAb 3, which was suitable for storage at -30°C or lower and lyophilized mAb at 2-8°C. . Freeze-thaw cycling, agitation studies, stress, acceleration, and short term under intended storage conditions of 40°C, 25°C, 5°C, -30°C, and -80°C of mAb 3 formulations at various pH using various buffer systems. It was tested in a stability study consisting of (12 weeks) incubation. In this experiment, particle formation (visual inspection, light blocking-based particle counting, and micro-flow imaging) as well as protein aggregation and chemical degradation were evaluated.

제형 개발 연구의 결과에 근거하여, 10 mM의 L-히스티딘-HCl, 8% w/v의 수크로스, 및 0.05% w/v의 폴리소르베이트 80를 함유하고, pH가 6.2인 제형을 선택하였다.Based on the results of the formulation development study, a formulation containing 10 mM L-histidine-HCl, 8% w/v sucrose, and 0.05% w/v polysorbate 80, and having a pH of 6.2 was selected. .

동결건조 공정 개발Freeze-drying process development

제형화된 항체가 동결건조 후 허용 가능한 안정성 및 케이크 속성을 갖도록 하기 위해 mAb 3에 대한 동결건조 공정을 개발하였다. 동결건조 사이클의 공정 매개변수(건조 온도, 챔버 압력 등)는 실험실 규모의 동결건조기를 사용하여 다수의 개발 실행을 기반으로 결정하였다(Genesis EL35, 제조사: SP Scientific). 동결 속도, 건조 온도, 및 챔버 진공 압력의 제어된 편차로 일련의 동결 건조 실행을 수행하여 사이클의 견고성을 확립하였다. 동결 건조된 제형화된 항체에 대한 안정성 연구는 40℃, 25℃, 및 5℃의 응력, 가속, 및 의도된 보관 조건 하의 단기(12주) 배양으로 구성된다. 이 실험에서, 응집, 화학적 분해, 및 입자 형성 외에도 동결 건조된 분말 속성(케이크 외관, 재구성 시간, 산소 헤드스페이스, 수분 함량)을 평가하였다. 제형 및 동결건조 개발 연구에 근거하여, mAb 3의 조성은 50 mg/mL의 mAb 3, 10 mM의 L-히스티딘-HCl, 8% w/v의 수크로스, 0.05% w/v의 폴리소르베이트 80, 및 pH 6.2로 선택하였다. 제형화된 항체는 -30℃ 이하에서 보관되고 동결건조된 제형화된 항체는 2~8℃에서 보관된다.A lyophilization process for mAb 3 was developed to ensure that the formulated antibody had acceptable stability and cake properties after lyophilization. The process parameters of the lyophilization cycle (drying temperature, chamber pressure, etc.) were determined based on a number of development runs using a laboratory-scale lyophilizer (Genesis EL35, manufacturer: SP Scientific). A series of freeze drying runs were performed with controlled variations of the freezing rate, drying temperature, and chamber vacuum pressure to establish the robustness of the cycle. Stability studies for lyophilized formulated antibodies consisted of short-term (12 weeks) incubation under stress, acceleration, and intended storage conditions of 40° C., 25° C., and 5° C. In this experiment, lyophilized powder properties (cake appearance, reconstitution time, oxygen headspace, moisture content) were evaluated in addition to agglomeration, chemical degradation, and particle formation. Based on formulation and lyophilization development studies, the composition of mAb 3 was 50 mg/mL mAb 3, 10 mM L-histidine-HCl, 8% w/v sucrose, 0.05% w/v polysorbate. 80, and pH 6.2. The formulated antibody is stored at -30°C or lower, and the lyophilized formulated antibody is stored at 2-8°C.

SEQUENCE LISTING <110> SANOFI Genzyme Corporation <120> ANTI-CD38 ANTIBODIES AND FORMULATIONS <130> 704023: SA9-289PC <150> US 62/837,518 <151> 2019-04-23 <150> US 62/859,699 <151> 2019-06-10 <150> EP 20305145.3 <151> 2020-02-17 <150> EP 20305146.1 <151> 2020-02-17 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 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Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 10 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 11 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 11 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 12 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 12 Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp 20 25 30 Ser Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro 35 40 45 Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly 50 55 60 Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn 65 70 75 80 Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn 85 90 95 Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser 100 105 110 Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr 115 120 125 Pro His Leu Glu Phe Gin Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His 130 135 140 Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln 165 170 175 Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly 180 185 190 Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro 195 200 205 Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Ile Val Ala Val Val Ile 210 215 220 Ala Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr 225 230 235 240 Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala 245 250 255 Ala Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg 260 265 270 Gln Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr 275 280 285 Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr 290 295 300 Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn 305 310 315 <210> 13 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 14 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 14 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (26)

인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항체로서,
a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
g) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하는 항체.An antibody that specifically binds to human CD38, comprising:
a) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
b) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
c) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
d) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
e) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or
f) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
g) an antibody comprising a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. 제형화된 항체를 포함하는 약학적 조성물로서, 제형화된 항체는 항체, 수크로스, L-히스티딘, 및 폴리소르베이트 80(PS80)을 포함하고, 항체는 인간 CD38에 특이적으로 결합하고 50 mg/mL의 농도로 존재하고, 수크로스는 8%(w/v)의 농도로 존재하고, L-히스티딘은 10 mM의 농도로 존재하고, PS80은 0.05%(v/v)의 농도로 존재하고, 제형의 pH는 6.2이고, 항체는
a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
g) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하는, 약학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising a formulated antibody, wherein the formulated antibody comprises an antibody, sucrose, L-histidine, and polysorbate 80 (PS80), wherein the antibody specifically binds to human CD38 and 50 mg /mL, sucrose is present at a concentration of 8% (w/v), L-histidine is present at a concentration of 10 mM, PS80 is present at a concentration of 0.05% (v/v), and , the pH of the formulation is 6.2, and the antibody is
a) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
b) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
c) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
d) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
e) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or
f) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
g) a pharmaceutical composition comprising a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 제형화된 항체의 단위 투약 형태로서, 제형화된 항체는 215 mg의 항체, 6.21 mg의 L-히스티딘, 344 mg의 수크로스, 및 2.15 mg의 폴리소르베이트 80을 포함하고, 동결건조된 것이며, 항체는
a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
g) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하는, 단위 투약 형태.As a unit dosage form of a formulated antibody that specifically binds to human CD38, the formulated antibody comprises 215 mg of antibody, 6.21 mg of L-histidine, 344 mg of sucrose, and 2.15 mg of polysorbate 80. comprising, lyophilized, and wherein the antibody is
a) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
b) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
c) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
d) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
e) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or
f) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
g) a unit dosage form comprising a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 제형화된 항체는 동결건조된 것인, 약학적 조성물 또는 단위 투약 형태.4. The pharmaceutical composition or unit dosage form of claim 2 or 3, wherein the formulated antibody is lyophilized. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, HC 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산은 피로글루타민인, 항체, 약학적 조성물, 또는 단위 투약 형태.5. The antibody, pharmaceutical composition, or unit dosage form according to any one of claims 1 to 4, wherein the amino acid at position 1 of the HC amino acid sequence is pyroglutamine. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 모세관 등전 집중법(cIEF)으로 측정 시 5.8 내지 9.0의 등전점(pI)을 갖는, 항체, 약학적 조성물, 또는 단위 투약 형태.6. The antibody, pharmaceutical composition, or unit dosage form of any one of claims 1-5, wherein the antibody has an isoelectric point (pI) of 5.8 to 9.0 as measured by capillary isoelectric focusing (cIEF). 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 주 하전 변이체 및 적어도 하나의 산성 하전 변이체를 포함하고, 항체는
a) 적어도 하나의 하전 변이체의 HC가 서열번호 1에 따라 넘버링된 N289, N318, N387, 및 N392로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 탈아미드화 아스파라긴을 포함하는 것, 또는
b) 항체가 주 하전 변이체 및 적어도 하나의 산성 하전 변이체를 포함하고, 주 하전 변이체는 항체의 71% 이상을 차지하고, 산성 하전 변이체는 항체의 30% 이하를 차지하는 것, 또는
c) 모세관 등전 집중법(cIEF)으로 측정 시 주 하전 변이체의 등전점(pI)이 7.5이고, 하나 이상의 산성 하전 변이체의 pI가 5.8인 것
중 적어도 하나를 포함하는, 항체, 약학적 조성물, 또는 단위 투약 형태.7. The method of any one of claims 1 to 6, wherein the antibody comprises a majorly charged variant and at least one acidic charged variant, wherein the antibody comprises:
a) the HC of the at least one charged variant comprises at least one deamidated asparagine selected from the group consisting of N289, N318, N387, and N392 numbered according to SEQ ID NO: 1, or
b) the antibody comprises a majorly charged variant and at least one acidic charged variant, wherein the majorly charged variant comprises at least 71% of the antibody and the acidic charged variant comprises no more than 30% of the antibody, or
c) the main charged variant has an isoelectric point (pI) of 7.5 and at least one acidic charged variant has a pI of 5.8 as measured by capillary isoelectric focusing (cIEF)
An antibody, pharmaceutical composition, or unit dosage form comprising at least one of 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 적어도 하나의 염기성 하전 변이체를 포함하고, 항체는
a) 염기성 하전 변이체가 항체의 4% 이하를 차지하는 것, 또는
b) 모세관 등전 집중법(cIEF)으로 측정 시 하나 이상의 염기성 하전 변이체의 pI가 9.0인 것
중 적어도 하나를 포함하는, 항체, 약학적 조성물, 또는 단위 투약 형태.8. The antibody of any one of claims 1-7, wherein the antibody comprises at least one basic charged variant, wherein the antibody
a) the basic charged variants account for no more than 4% of the antibody, or
b) at least one basic charged variant having a pI of 9.0 as measured by capillary isoelectric focusing (cIEF);
An antibody, pharmaceutical composition, or unit dosage form comprising at least one of 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
a) CD16a(FcγRIIIa)의 변이체 158F, 158V, 또는 158F 및 158V 둘 다를 발현하는 자연 살해 세포의 존재 하에 세포 표면 상의 CD38 부위가 13,000개 이하인 CD38 수용체 밀도를 갖는 CD38-발현 세포를 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)에 의해 사멸할 수 있고/있거나,
b) 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 측정 시 59 nM의 KD로 아미노산 위치 158에 페닐알라닌을 갖는 CD16a(FcγRIIIa)(158F)에 결합하고, SPR로 측정 시 75 nM의 KD로 아미노산 위치 158에 발린을 갖는 CD16a(158V)에 결합하고/하거나,
c) FcγRIIIa 158F-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 96 nM의 KD로 아미노산 위치 158에 페닐알라닌을 갖는 CD16a(FcγRIIIa)(158F)에 결합하고, FcγRIIIa 158V-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 40 nM의 KD로 아미노산 위치 158에 발린을 갖는 FcγRIIIa(158V)에 결합하고/하거나,
d) FcγRIIa 131R-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 94 nM의 KD로 아미노산 위치 131에 아르기닌을 갖는 CD32a(FcγRIIa)(131R)에 결합하고, FcγRIIa 131H-발현 HEK 세포에 대한 결합으로 측정 시 222 nM의 KD로 아미노산 위치 131에 히스티딘을 갖는 FcγRIIa(131H)에 결합하는, 항체, 약학적 조성물, 또는 단위 투약 형태.9. The method of any one of claims 1 to 8, wherein the antibody is
a) CD38-expressing cells having a CD38 receptor density of 13,000 or less CD38 sites on the cell surface in the presence of natural killer cells expressing variant 158F, 158V, or both 158F and 158V of CD16a (FcγRIIIa) antibody-dependent cell-mediated cells be killed by toxicity (ADCC), and/or
b) binds CD16a(FcγRIIIa)(158F) with phenylalanine at amino acid position 158 with a K D of 59 nM as determined by surface plasmon resonance (SPR) and at amino acid position 158 with a K D of 75 nM as determined by SPR binds to CD16a (158V) with valine and/or;
c) binds to CD16a (FcγRIIIa) (158F) having phenylalanine at amino acid position 158 with a K D of 96 nM as measured by binding to FcγRIIIa 158F-expressing HEK cells, as measured by binding to FcγRIIIa 158V-expressing HEK cells binds FcγRIIIa (158V) having a valine at amino acid position 158 with a K D of 40 nM;
d) binding to CD32a (FcγRIIa) (131R) having an arginine at amino acid position 131 with a K D of 94 nM as measured by binding to FcγRIIa 131R-expressing HEK cells, as measured by binding to FcγRIIa 131H-expressing HEK cells An antibody, pharmaceutical composition, or unit dosage form that binds FcγRIIa (131H) having histidine at amino acid position 131 with a K D of 222 nM. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 항체는, CD16a(FcγRIIIa)의 변이체 158F, 158V, 또는 158F 및 158V 둘 다를 발현하는 자연 살해 세포의 존재 하에, 세포 표면 상에서 400,000 초과인 CD38 수용체 밀도를 갖는 CD38-발현 세포를 ADCC에 의해 사멸할 수 있고, 세포 표면 상에서 100,000 이상인 CD38 수용체 밀도를 갖는 CD38-발현 세포를 ADCC에 의해 사멸할 수 있고, 세포 표면 상에서 13,000 이하인 CD38 수용체 밀도를 갖는 CD38-발현 세포를 ADCC에 의해 사멸할 수 있고/있거나,
b) 항체는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)의 존재 하에, 세포 표면 상에서 400,000 초과인 CD38 수용체 밀도를 갖는 CD38-발현 세포를 항체 의존성 세포매개 식균작용(ADCP)에 의해 사멸할 수 있는, 항체, 약학적 조성물, 또는 단위 투약 형태.9. The method according to any one of claims 1 to 8,
a) the antibody kills by ADCC CD38-expressing cells having a CD38 receptor density greater than 400,000 on the cell surface in the presence of natural killer cells expressing variant 158F, 158V, or both 158F and 158V of CD16a (FcγRIIIa) and CD38-expressing cells having a CD38 receptor density of 100,000 or more on the cell surface can be killed by ADCC, and CD38-expressing cells having a CD38 receptor density of 13,000 or less on the cell surface can be killed by ADCC/ or
b) the antibody is capable of killing, by antibody dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP), CD38-expressing cells having a CD38 receptor density greater than 400,000 on the cell surface in the presence of human peripheral blood mononuclear cells (PMBC); A pharmaceutical composition, or unit dosage form. 제9항 또는 제10항에 있어서,
a) CD16a(FcγRIIIa)의 고친화성 변이체(158V)를 발현하는 자연 살해 세포의 존재 하에, 항체는 약 0.6 ng/mL의 EC 50으로 ADCC에 의해 KMS-12BM 세포를 사멸할 수 있고/있거나,
b) CD16a(FcγRIIIa)의 저친화성 변이체(158F)를 발현하는 자연 살해 세포의 존재 하에, 항체는 약 0.65 ng/mL의 EC 50으로 ADCC에 의해 KMS-12BM 세포를 사멸할 수 있고/있거나,
c) CD16a(FcγRIIIa)의 고친화성 변이체(158V)를 발현하는 자연 살해 세포의 존재 하에, 항체는 약 0.09 ng/mL의 EC 50으로 ADCC에 의해 RPMI-8226 세포를 사멸할 수 있고/있거나,
d) CD16a(FcγRIIIa)의 저친화성 변이체(158F)를 발현하는 자연 살해 세포의 존재 하에, 항체는 약 0.09 ng/mL의 EC 50으로 ADCC에 의해 RPMI-8226 세포를 사멸할 수 있고/있거나,
e) CD16a(FcγRIIIa)의 고친화성 변이체(158V)를 발현하는 자연 살해 세포의 존재 하에, 항체는 약 0.14 ng/mL의 EC 50으로 ADCC에 의해 MOLP-8 세포를 사멸할 수 있고/있거나,
f) CD16a(FcγRIIIa)의 저친화성 변이체(158F)를 발현하는 자연 살해 세포의 존재 하에, 항체는 약 0.28 ng/mL의 EC 50으로 ADCC에 의해 MOLP-8 세포를 사멸할 수 있는, 항체, 약학적 조성물, 또는 단위 투약 형태.11. The method of claim 9 or 10,
a) in the presence of natural killer cells expressing the high affinity variant (158V) of CD16a (FcγRIIIa), the antibody is capable of killing KMS-12BM cells by ADCC with an EC 50 of about 0.6 ng/mL and/or;
b) in the presence of natural killer cells expressing the low affinity variant (158F) of CD16a (FcγRIIIa), the antibody is capable of killing KMS-12BM cells by ADCC with an EC 50 of about 0.65 ng/mL and/or;
c) in the presence of natural killer cells expressing the high affinity variant (158V) of CD16a (FcγRIIIa), the antibody is capable of killing RPMI-8226 cells by ADCC with an EC 50 of about 0.09 ng/mL and/or;
d) in the presence of natural killer cells expressing the low affinity variant (158F) of CD16a (FcγRIIIa), the antibody is capable of killing RPMI-8226 cells by ADCC with an EC 50 of about 0.09 ng/mL and/or;
e) in the presence of natural killer cells expressing the high affinity variant (158V) of CD16a (FcγRIIIa), the antibody is capable of killing MOLP-8 cells by ADCC with an EC 50 of about 0.14 ng/mL and/or;
f) in the presence of natural killer cells expressing the low affinity variant (158F) of CD16a (FcγRIIIa), the antibody is capable of killing MOLP-8 cells by ADCC with an EC 50 of about 0.28 ng/mL. single composition, or unit dosage form. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CD16a(FcγRIIIa)의 고친화성 변이체(158V)를 발현하는 인간 PMBC의 존재 하에, 항체는 약 31.87 ng/mL의 EC 50으로 ADCP에 의해 MOLP-8 세포를 사멸할 수 있는, 항체, 약학적 조성물, 또는 단위 투약 형태.12. The antibody according to any one of claims 9 to 11, wherein in the presence of human PMBC expressing a high affinity variant (158V) of CD16a (FcγRIIIa), the antibody is MOLP- by ADCP with an EC 50 of about 31.87 ng/mL. 8 An antibody, pharmaceutical composition, or unit dosage form capable of killing cells. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 뮤린 종양 모델에서 마우스의 생존을 높일 수 있고, 모델의 마우스는 인간 CD16a(158F)를 발현하고, 마우스는 인간 CD38을 발현하는 500,000개의 EL4 세포가 주사된, 항체, 약학적 조성물, 또는 단위 투약 형태.13. The antibody according to any one of claims 1 to 12, wherein the antibody is capable of enhancing the survival of mice in a murine tumor model, wherein the mice express human CD16a(158F) and the mice express human CD38. An antibody, pharmaceutical composition, or unit dosage form into which EL4 cells are injected. 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법으로서, 항체는
a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
g) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하고,
상기 방법은
i) 세포 배양물에서 항체를 발현시키는 단계;
ii) 항체를 크로마토그래피 및 한외여과로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 정제 단계에 적용하여 정제된 항체 용액을 생성하는 단계;
iii) 정제된 항체 용액을 조정하여,
- 50 mg/mL 농도의 정제된 항체,
- 8% w/v 농도의 수크로스,
- 10 mM 농도의 L-히스티딘, 및
- 0.05% v/v 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하는,
pH 6.2의 제형화된 항체를 생성하는 단계; 및
iv) 제형화된 항체를 동결건조하는 단계를 포함하여,
약학적 조성물을 제조하는 방법.A method for preparing a pharmaceutical composition comprising an antibody that specifically binds to human CD38, the antibody comprising:
a) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
b) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
c) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
d) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
e) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or
f) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
g) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
the method
i) expressing the antibody in cell culture;
ii) subjecting the antibody to at least one purification step selected from the group consisting of chromatography and ultrafiltration to produce a purified antibody solution;
iii) adjusting the purified antibody solution,
- purified antibody at a concentration of 50 mg/mL,
- sucrose at a concentration of 8% w/v,
- L-histidine at a concentration of 10 mM, and
- comprising polysorbate 80 at a concentration of 0.05% v/v,
generating a formulated antibody having a pH of 6.2; and
iv) lyophilizing the formulated antibody;
A method for preparing a pharmaceutical composition. 재구성된 제형화된 항체의 제조 방법으로서,
a) 수크로스, L-히스티딘, 폴리소르베이트 80, 및 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 동결건조된 항체 제형을 제공하는 단계; 및
b) 동결건조된 항체 제형을 희석제에서 재구성하는 단계(재구성된 항체 제형은
- 50 mg/mL 농도의 항체,
- 8% w/v 농도의 수크로스,
- 10 mM 농도의 L-히스티딘, 및
- 0.05% v/v 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하고,
6.2의 pH를 가짐)를 포함하되,
항체는
i) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
ii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
iii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
iv) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
v) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
vi) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
vii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하는, 방법.A method of making a reconstituted formulated antibody comprising:
a) providing a lyophilized antibody formulation comprising sucrose, L-histidine, polysorbate 80, and an antibody that specifically binds to human CD38; and
b) reconstituting the lyophilized antibody formulation in a diluent (the reconstituted antibody formulation is
- antibody at a concentration of 50 mg/mL,
- sucrose at a concentration of 8% w/v,
- L-histidine at a concentration of 10 mM, and
- comprising polysorbate 80 at a concentration of 0.05% v/v,
having a pH of 6.2);
the antibody
i) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
ii) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
iii) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
iv) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
v) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or
vi) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
vii) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 항체의 1회 이상의 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 환자는 CD38-발현 세포를 포함하는 질환이 있고, 항체는
a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
g) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하는, 방법.A method of treating a patient in need thereof, comprising administering to the patient one or more doses of an antibody that specifically binds to human CD38, wherein the patient has a disease comprising CD38-expressing cells, the antibody Is
a) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
b) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
c) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
d) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
e) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or
f) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
g) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. CD38-발현 세포를 포함하는 질환의 치료에 사용하기 위한 항체로서, 인간 CD38에 특이적으로 결합하고,
a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC), 또는
g) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(HC) 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하는 항체.An antibody for use in the treatment of a disease comprising CD38-expressing cells, which specifically binds to human CD38,
a) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
b) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
c) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or
d) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
e) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or
f) a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or
g) an antibody comprising a heavy chain (HC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (LC) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. 제16항 또는 제17항에 있어서, 질환은 혈액 기원 질환인, 방법 또는 항체.18. The method or antibody of claim 16 or 17, wherein the disease is a disease of blood origin. 제18항에 있어서, 혈액 기원 질환은 아밀로이드증, 비호지킨 림프종(NHL), 발덴스트롬병, 다발성 골수종(MM), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 및 급성 골수성 백혈병(AML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 항체.19. The method of claim 18, wherein the disease of blood origin is selected from the group consisting of amyloidosis, non-Hodgkin's lymphoma (NHL), Waldenstrom's disease, multiple myeloma (MM), acute lymphocytic leukemia (ALL), and acute myeloid leukemia (AML). , methods or antibodies. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 1회 이상의 용량은 동결건조된 항체 제형으로 제공되고, 투여 전, 동결건조된 항체 제형은 재구성되어, 10 mM의 L-히스티딘, 8%(w/v)의 수크로스, 및 0.05%(v/v)의 폴리소르베이트 80을 포함하는 액체에 50 mg/mL 농도의 항체를 포함하고 6.2의 pH를 갖는 재구성된 항체 제형을 형성하는, 방법 또는 항체.20. The method according to any one of claims 16 to 19, wherein the one or more doses of the antibody are provided in a lyophilized antibody formulation, and prior to administration, the lyophilized antibody formulation is reconstituted, such that 10 mM L-histidine, 8 % (w/v) of sucrose, and 0.05% (v/v) of polysorbate 80 to form a reconstituted antibody formulation comprising the antibody at a concentration of 50 mg/mL and having a pH of 6.2 , methods or antibodies. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 20 mg/kg, 10 mg/kg, 5 mg/kg, 3 mg/kg, 또는 1.5 mg/kg의 용량으로 투여되는, 방법 또는 항체.21. The method or antibody of any one of claims 16-20, wherein the antibody is administered at a dose of 20 mg/kg, 10 mg/kg, 5 mg/kg, 3 mg/kg, or 1.5 mg/kg. . 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 제형화된 항체를 포함하고, 제형화된 항체는 50 mg/mL의 농도로 존재하는 항체, 8%(w/v) 농도의 수크로스, 10 mM 농도의 L-히스티딘, 0.05%(v/v) 농도의 폴리소르베이트 80(PS80)을 포함하고, 6.2의 pH를 갖는, 방법 또는 항체.22. The method according to any one of claims 16 to 21, wherein the pharmaceutical composition comprises a formulated antibody, wherein the formulated antibody is present at a concentration of 50 mg/mL, 8% (w/v) concentration. of sucrose, L-histidine at a concentration of 10 mM, polysorbate 80 (PS80) at a concentration of 0.05% (v/v), and having a pH of 6.2. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 모세관 등전 집중법(cIEF)으로 측정 시 5.8 내지 9.0의 등전점(pI)을 갖는, 방법 또는 항체.23. The method or antibody of any one of claims 16 to 22, wherein the antibody has an isoelectric point (pI) of 5.8 to 9.0 as measured by capillary isoelectric focusing (cIEF). 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, HC 아미노산 서열의 1번 위치의 아미노산은 피로글루타민인, 방법 또는 항체.24. The method or antibody of any one of claims 16-23, wherein the amino acid at position 1 of the HC amino acid sequence is pyroglutamine. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 주 하전 변이체 및 적어도 하나의 산성 하전 변이체를 포함하고, 항체는
a) 적어도 하나의 하전 변이체의 HC가 서열번호 1에 따라 넘버링된 N289, N318, N387, 및 N392로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 탈아미드화 아스파라긴을 포함하는 것, 또는
b) 항체가 주 하전 변이체 및 적어도 하나의 산성 하전 변이체를 포함하고, 주 하전 변이체는 항체의 71% 이상을 차지하고, 산성 하전 변이체는 항체의 30% 이하를 차지하는 것, 또는
c) 모세관 등전 집중법(cIEF)으로 측정 시 주 하전 변이체의 등전점(pI)이 7.5이고, 하나 이상의 산성 하전 변이체의 pI가 5.8인 것
중 적어도 하나를 포함하는, 방법 또는 항체.26. The method of any one of claims 16 to 25, wherein the antibody comprises a majorly charged variant and at least one acidic charged variant, wherein the antibody comprises
a) the HC of the at least one charged variant comprises at least one deamidated asparagine selected from the group consisting of N289, N318, N387, and N392 numbered according to SEQ ID NO: 1, or
b) the antibody comprises a majorly charged variant and at least one acidic charged variant, wherein the majorly charged variant comprises at least 71% of the antibody and the acidic charged variant comprises no more than 30% of the antibody, or
c) the main charged variant has an isoelectric point (pI) of 7.5 and at least one acidic charged variant has a pI of 5.8 as measured by capillary isoelectric focusing (cIEF)
A method or antibody comprising at least one of 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 적어도 하나의 염기성 하전 변이체를 포함하고, 항체는
a) 염기성 하전 변이체가 항체의 4% 이하를 차지하는 것, 또는
b) 모세관 등전 집중법(cIEF)으로 측정 시 하나 이상의 염기성 하전 변이체의 pI가 9.0인 것
중 적어도 하나를 포함하는, 방법 또는 항체.26. The method of any one of claims 16-25, wherein the antibody comprises at least one basic charged variant, wherein the antibody
a) the basic charged variants account for no more than 4% of the antibody, or
b) at least one basic charged variant having a pI of 9.0 as measured by capillary isoelectric focusing (cIEF);
A method or antibody comprising at least one of
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