KR20210151766A - Biomarker composition for diagnosing Deafness comprising MT1A and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
난청 진단용 바이오마커, 이를 이용한 난청을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법, 이를 이용한 난청 진단용 조성물 및 이를 이용한 난청 진단용 키트에 관한 것이다.A biomarker for diagnosing hearing loss, a method of providing information for diagnosing hearing loss using the same, a composition for diagnosing hearing loss using the same, and a kit for diagnosing hearing loss using the same.
원인과 정도는 여러 가지인데, 귀머거리는 그 정도가 가장 심한 상태이다. 청각의 전도경로에 장애가 있을 때 난청이 일어나고, 그 병변이 외이도나 중이에 있는 것을 전음난청, 내이에 있는 것을 감음난청이라 하여 구분한다. 또 병변의 자리를 명시하여 중이성 난청이나 미로성 난청 등으로 세분하기도 하며, 외상성난청, 유전성난청 등 원인별로 분류한 명칭도 있다.There are many causes and severity, but deafness is the most severe condition. Hearing loss occurs when there is a disturbance in the conduction path of hearing, and when the lesion is located in the outer or middle ear, it is called conductive hearing loss, and when the lesion is in the inner ear, it is classified as attenuated hearing loss. In addition, by specifying the location of the lesion, it is subdivided into middle ear hearing loss or labyrinth-related hearing loss, and there are names classified by causes such as traumatic hearing loss and hereditary hearing loss.
난청의 진단이나 예방 ·예후는 청력검사에 의하여 실시된다. 전음난청은 귀지가 낀 이구색전을 비롯하여 이관협착증, 중이염, 아데노이드(adenoid) 등에서 볼 수 있는데, 이는 각각 원인질환을 치료함으로써 치유된다. 고막이 찢어진 중이성 난청에는 보청기가 효과적이다. 그러나 감음난청에서는 내이보다도 더 깊숙이 있는 청신경의 경로나 중추가 뇌출혈이나 뇌종양에 의하여 침해되어 발생한 것이기 때문에 보청기가 전혀 효과가 없는 경우가 많다. 직업성 난청이란 조선소나 비행장 등 소음이 심한 직장에서 오래 근무한 사람에게서 볼 수 있는 직업병인데, 난청의 정도가 점점 심해져서 나중에는 전혀 소리를 듣지 못하게 되는 경우가 있다. 이에 대한 근본적인 치료방법은 없고, 귀마개를 착용하여 예방을 하는 방법밖에 없다. 난청이 발견되면 소음으로부터 멀리 떨어져 있는 방법을 취하는 것이 좋다. 스토미 난청은 스트렙토마이신의 부작용으로 알려진 것인데, 카나마이신에서도 그런 부작용을 볼 수 있다. 결핵 등으로 항생물질을 장기간 복용할 때에는 가끔 청력검사를 받아서 조기에 발견을 해야 한다.Diagnosis, prevention and prognosis of hearing loss is carried out by hearing test. Conductive hearing loss can be seen in earwax-covered earwax embolism, ear canal stenosis, otitis media, and adenoids, which are cured by treating the cause of each disease. Hearing aids are effective for middle ear hearing loss with a torn eardrum. However, in attenuated hearing loss, hearing aids are often ineffective because the pathway or center of the auditory nerve, which is deeper than the inner ear, is damaged by cerebral hemorrhage or brain tumor. Occupational hearing loss is an occupational disease that can be seen in people who have worked for a long time in noisy workplaces such as shipyards or airfields. There is no fundamental treatment for this, and there is only one way to prevent it by wearing earplugs. If hearing loss is discovered, it is best to take a method away from the noise. Stormy hearing loss is a known side effect of streptomycin, and such side effects can also be seen with kanamycin. If you are taking antibiotics for a long time for tuberculosis, etc., you should occasionally get a hearing test for early detection.
노인성 난청은 청력의 쇠퇴에서 오는 생리적인 현상인데, 부모가 노인성 난청일 경우에는 자식도 그렇게 될 가능성이 있으므로 노화현상의 진행에 특히 주의해야 한다. 보통 40~50세부터 나타나는데 개인차가 심하다. 난청이 한쪽 귀에만 생기는 경우에는 일상생활에 거의 지장이 없어 본인이 자각하지 못하는 경우가 많다. 그러나 양이성이고 초등학교 입학 전후에 발견되는 경우에는 특수학교 교육을 받아야 하며, 언어습득 이전에 나타나는 경우에는 농아교육을 받아야 한다.Age-related hearing loss is a physiological phenomenon that comes from hearing loss, and if the parents have senile hearing loss, there is a possibility that their children will also be affected. It usually appears from the age of 40 to 50, but there are significant individual differences. When hearing loss occurs in only one ear, it hardly interferes with daily life and is often not recognized by the person himself/herself. However, if they are bisexual and found before or after entering elementary school, they should receive special school education, and if they appear before language acquisition, they should receive education for the deaf.
난청 진단용 바이오마커, 이를 이용한 난청을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법, 이를 이용한 난청 진단용 조성물 및 이를 이용한 난청 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a biomarker for diagnosing hearing loss, a method for providing information for diagnosing hearing loss using the same, a composition for diagnosing hearing loss using the same, and a kit for diagnosing hearing loss using the same.
일 양태로서, 난청이 의심되는 개체와 이의 대조군 개체의 해마(hippocampus)조직 내에서 SLPI(secretory leukocyte peptidase inhibitor), MT2A(metallothionein 2A), MT1A(metallothionein 1A), FOS(FBJ osteosarcoma oncogene), NFKBIA(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha), MT1M(metallothionein 1M), EGR1(early growth response 1), CHRNA3(cholinergic receptor, nicotinic, alpha 3), IGF2(insulin-like growth factor 2), KCNJ16(potassium channel, inwardly rectifying subfamily J, member 16), KL(Klotho), SLC40A1(solute carrier family 40, member 1), SLC4A5(solute carrier family 4, member 5), SLC5A7(solute carrier family 5, member 7), SLITRK6(SLIT and NTRK-like family, member 6) 및 SYT9(synaptotagmin IX)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현수준을 각각 측정하는 단계를 포함하는, 난청을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In one aspect, SLPI (secretory leukocyte peptidase inhibitor), MT2A (metallothionein 2A), MT1A (metallothionein 1A), FOS (FBJ osteosarcoma oncogene), NFKBIA ( nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha), MT1M (metallothionein 1M), EGR1 (early growth response 1), CHRNA3 (cholinergic receptor, nicotinic, alpha 3), IGF2 (insulin-like growth factor 2) ), KCNJ16 (potassium channel, inwardly rectifying subfamily J, member 16), KL (Klotho), SLC40A1 (
상기 유전자는 대조군 대비 난청환자의 해마조직 내에서 특이적으로 발현수준의 차이가 존재하는 것으로서, 이들의 발현수준을 측정하여 난청을 진단하는 데에 정보를 제공할 수 있다.The gene has a specific expression level difference in the hippocampal tissue of a patient with hearing loss compared to the control group, and can provide information for diagnosing hearing loss by measuring their expression level.
상기 개체는 인간을 포함한 포유류일 수 있고, 예를 들면 마우스, 쥐, 고양이, 기니피그, 햄스터, 개, 원숭이, 침팬지, 인간 등일 수 있으며, 구체적으로는 인간일 수 있다.The subject may be a mammal including a human, for example, a mouse, a rat, a cat, a guinea pig, a hamster, a dog, a monkey, a chimpanzee, a human, etc., and specifically may be a human.
상기 대조군은 난청이 아닌 개체를 의미하는 것일 수 있고, 이는 난청이 의심되는 개체에서의 상기 유전자의 발현수준을 비교하기 위한 대조 개체로서 역할 할 수 있다.The control group may refer to an individual other than hearing loss, which may serve as a control individual to compare the expression level of the gene in an individual suspected of having hearing loss.
상기 발현수준은 구체적으로 대조군 및 실험군 각각의 해마조직으로부터 수득한 시료로부터 측정된 것일 수 있고, 상기 시료는 대조군 및 실험군 각각의 해마조직으로부터 수득한 생검(biopsy) 등일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 아니하고, 당업계 통상의 기술자가 사용하는 방법에 의해 준비될 수 있다.The expression level may be specifically measured from a sample obtained from the hippocampal tissue of each of the control and experimental groups, and the sample may be a biopsy obtained from the hippocampal tissue of each of the control and experimental groups, but is not necessarily limited thereto No, it may be prepared by a method used by a person skilled in the art.
상기 발현수준을 측정하는 방법으로서, 상기 유전자의 전사물질인 mRNA의 시료 내 농도 또는 상기 지표인자의 최종 번역물질인 단백질의 시료 내 농도를 측정하는 방법을 택할 수 있으나, 이에 제한되지 아니하고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 택하여 수행할 수 있다.As a method of measuring the expression level, a method of measuring the concentration in a sample of the mRNA, which is the transcription material of the gene, or the concentration in the sample, of the protein, which is the final translation material of the index factor, may be selected, but the present invention is not limited thereto. It can be carried out by taking a method commonly used in the technical field of
상기 mRNA의 시료 내 농도를 측정하는 방법으로서 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As a method for measuring the concentration of the mRNA in the sample, reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcriptase polymerase reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting, and DNA chip, but is not limited thereto.
상기 단백질의 시료 내 농도를 측정하는 방법으로서 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 면역탁본검사, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색(immunohistochemistry), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(fluorescence-activated cell sorting) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As a method of measuring the concentration of the protein in the sample, the amount of the protein can be confirmed using an antibody that specifically binds to the protein. Analysis methods for this include immunostaining assay, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and rocket immunoelectrolysis. Electrophoresis, tissue immunohistochemistry, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, FACS (fluorescence-activated cell sorting), protein chip, etc., but are not limited thereto .
상기 유전자에 관련된 구체적인 정보는 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소의 데이터베이스에 게시된 인간 유전자 정보 등으로부터 명확하게 특정될 수 있음은 당업계 통상의 기술자에 자명한 것이다.It is apparent to those skilled in the art that the specific information related to the gene can be clearly specified from human genetic information posted in the database of the National Institute of Biotechnology Information under the National Institutes of Health.
상기 방법에 있어서, 대조군 개체 대비 난청이 의심되는 개체에서 SLPI, MT2A, MT1A, FOS, NFKBIA, MT1M 및 EGR1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현수준이 높은 경우 난청으로 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.In the above method, when the expression level of one or more genes selected from the group consisting of SLPI, MT2A, MT1A, FOS, NFKBIA, MT1M, and EGR1 in an individual suspected of hearing loss compared to a control individual is high, the step of diagnosing hearing loss may be further included can
상기 방법에 있어서, 대조군 개체 대비 난청이 의심되는 개체에서 CHRNA3, IGF2, KCNJ16, KL, SLC40A1, SLC4A5, SLC5A7, SLITRK6 및 SYT9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현수준이 낮은 경우 난청으로 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.In the above method, when the expression level of one or more genes selected from the group consisting of CHRNA3, IGF2, KCNJ16, KL, SLC40A1, SLC4A5, SLC5A7, SLITRK6 and SYT9 in an individual suspected of hearing loss compared to a control individual is low, diagnosing hearing loss may further include.
상기 난청은 중추성 난청, 소음성 난청, 노인성 난청, 돌발성 난청, 당뇨병으로 인한 청신경병증, 이독성 난청, 외상성 난청, 바이러스성 난청, 일측성 난청 등을 포함할 수 있으나, 청각이 저하 또는 상실된 상태에 해당한다면, 상기 예시한 질환에 제한되지 않고 본 명세서의 난청의 범주에 포함될 수 있으며, 일 실시예에 따를 때 구체적으로는 소음성 난청일 수 있으며, 보다 구체적으로는 급성 소음성 난청일 수 있다.The hearing loss may include central hearing loss, noise-induced deafness, senile deafness, sudden deafness, auditory neuropathy due to diabetes, ototoxicity deafness, traumatic deafness, viral deafness, unilateral hearing loss, etc. If applicable, it is not limited to the diseases exemplified above and may be included in the scope of the present specification for hearing loss, and according to one embodiment, it may be specifically noise-induced hearing loss, and more specifically, it may be acute noise-induced hearing loss. .
일 양태로서, 해마조직 내 SLPI, MT2A, MT1A, FOS, NFKBIA, MT1M, EGR1, CHRNA3, IGF2, KCNJ16, KL, SLC40A1, SLC4A5, SLC5A7, SLITRK6 및 SYT9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난청을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.In one aspect, the expression level of one or more genes selected from the group consisting of SLPI, MT2A, MT1A, FOS, NFKBIA, MT1M, EGR1, CHRNA3, IGF2, KCNJ16, KL, SLC40A1, SLC4A5, SLC5A7, SLITRK6 and SYT9 in hippocampal tissue It provides a composition for diagnosing hearing loss, comprising an agent for measuring.
상기 발현수준을 측정하는 제제는 상기 유전자 또는 이의 전사체에 해당하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있으나, 특정 유전자의 발현수준을 측정함에 있어서 특별한 제한없이 당업계 주지된 제제가 모두 이에 포함될 수 있다.The agent for measuring the expression level may be a substance that specifically binds to a nucleotide sequence corresponding to the gene or transcript thereof, a sequence complementary to the nucleotide sequence, a fragment of the nucleotide, or a protein encoded by the nucleotide sequence. However, all formulations well known in the art may be included therein without any particular limitation in measuring the expression level of a specific gene.
상기 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 구체적으로 항체일 수 있고, 상기 항체는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미하는 것으로서, 상기 항체는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 이로부터 발현된 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편 또한 포함한다. 상기 조성물을 이용한 난청의 진단에 있어, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질과 상기 항체를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 발현량을 측정함으로써 난청을 진단할 수 있다. 적절한 항체의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.The substance specifically binding to the protein may be an antibody, and the antibody refers to a specific immunoglobulin directed against an antigenic site, and the antibody is specific for the protein encoded by the nucleotide sequence. It means an antibody that binds positively, the gene is cloned into an expression vector to obtain an expressed protein therefrom, and the antibody can be prepared from the obtained protein according to a conventional method in the art. The above type of antibody includes polyclonal antibody or monoclonal antibody, and all immunoglobulin antibodies are included. The antibody does not have the structure of a complete antibody having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as a complete form with two light chains and two heavy chains, but is directed against an antigenic site. It also includes a functional fragment of an antibody molecule that has a specific antigen-binding site (binding domain) and possesses an antigen-binding function. In the diagnosis of hearing loss using the composition, hybridization is performed using the antibody and the protein encoded by the nucleotide sequence, and the expression level is measured based on the degree of hybridization to diagnose hearing loss. Suitable antibody selection and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the art.
상기 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 구체적으로 프로브 또는 프라이머일 수 있다.A substance that specifically binds to the nucleotide sequence, a sequence complementary to the nucleotide sequence, or a fragment of the nucleotide may be specifically a probe or a primer.
상기 프로브는 mRNA 등의 뉴클레오티드과 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 뉴클레오티드 단편을 의미하며, 방사성 원소 등으로 표지되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 함량(발현량)을 확인할 수 있다. 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일 가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중 가닥 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 상기 유전자의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현량을 측정함으로써 난청을 진단할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.The probe means a nucleotide fragment, such as RNA or DNA, corresponding to several bases to several hundred bases as long as possible to specifically bind to nucleotides such as mRNA, and is labeled with a radioactive element, so that the presence or absence of specific mRNA , the content (expression amount) can be confirmed. The probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a single strand DNA probe, a double strand DNA probe, an RNA probe, etc., and a probe complementary to the mRNA of the gene Hearing loss can be diagnosed by measuring the mRNA expression level through hybridization. Probe selection and hybridization conditions may be appropriately selected according to techniques known in the art.
상기 프라이머는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 뉴클레오티드 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 뉴클레오티드 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제/중합 효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있고, 상기 mRNA의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 유전자의 발현량의 측정을 통해 난청을 진단할 수 있다. PCR 조건, 및 프라이머 세트의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.The primer is a nucleotide sequence having a short free 3' hydroxyl group. It refers to a short nucleotide sequence capable of base pairing with a complementary template and serving as a starting point for template strand copying. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase/polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates at an appropriate buffer and temperature, and Hearing loss can be diagnosed by measuring the expression level of a desired gene by performing PCR amplification using primers. The PCR conditions and the length of the primer set may be appropriately selected according to techniques known in the art.
상기 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오티드의 단편에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머는, 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 상기 프라이머 또는 프로브를 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 디자인할 수 있다.Since the nucleotide sequence of the gene is known for the probe or primer that specifically binds to the nucleotide sequence, a sequence complementary to the nucleotide sequence, or a fragment of the nucleotide, those skilled in the art can prepare the primer or probe based on the sequence in the art. It can be designed according to a conventional method in the field.
상기 프로브 또는 프라이머는 포스포르아미디트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있고, 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고함), 10 내지 90 nt, 10 내지 80 nt, 10 내지 70 nt, 10 내지 60 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 40 nt, 10 내지 30 nt, 10 내지 25 nt, 20 내지 100 nt, 30 내지 90 nt, 40 내지 80 nt, 50 내지 70 nt, 20 내지 60 nt, 20 내지 50 nt, 30 내지 40 nt, 20 내지 30 nt, 또는 20 내지 25 nt인 것일 수 있다.The probe or primer can be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods, and has a length of 10 to 100 nucleotides (hereinafter referred to as 'nt'), 10 to 90 nt, 10 to 80 nt, 10 to 70 nt, 10 to 60 nt, 10 to 50 nt, 10 to 40 nt, 10 to 30 nt, 10 to 25 nt, 20 to 100 nt, 30 to 90 nt, 40 to 80 nt, 50 to 70 nt, 20 to 60 nt, 20 to 50 nt, 30 to 40 nt, 20 to 30 nt, or 20 to 25 nt.
구체적으로, 상기 제제가 프라이머를 포함하는 경우, 상기 프라이머는 순방향 프라이머 가닥과 역방향 프라이머 가닥으로 이루어진 프라이머 세트 형태일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 3의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 5의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 7의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 8의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 9의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 10의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 11의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 12의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 13의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 14의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 15의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 16의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 17의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 18의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 19의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 20의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 21의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 22의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 23의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 24의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 25의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 26의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 27의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 28의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 29의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 30의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 31의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 32의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.Specifically, when the preparation includes a primer, the primer may be in the form of a primer set consisting of a forward primer strand and a reverse primer strand, and specifically, a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 1 and the sequence of SEQ ID NO: 2 A primer set comprising a reverse primer, a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 4, a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 5, and a sequence of SEQ ID NO: 6 A primer set comprising a reverse primer, a primer set comprising a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 7 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 8, a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 9 and a sequence of SEQ ID NO: 10 A primer set comprising a reverse primer, a primer set comprising a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 11 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 12, a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 13 and a sequence of SEQ ID NO: 14 A primer set comprising a reverse primer, a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 15 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 16, a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 17 and a sequence of SEQ ID NO: 18 A primer set comprising a reverse primer, a primer set comprising a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 20, a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 21 and a sequence of SEQ ID NO: 22 A primer set comprising a reverse primer, a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 23 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 24, a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 25, and a sequence of SEQ ID NO: 26 Programs containing reverse primers A primer set comprising a primer set, a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 28, a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 29 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 30 It may include one or more primer sets selected from the group consisting of a primer set, and a primer set comprising a forward primer consisting of a sequence of SEQ ID NO: 31 and a reverse primer consisting of a sequence of SEQ ID NO: 32.
상기 난청은 소음성 난청, 노인성 난청, 돌발성 난청, 당뇨병으로 인한 청신경병증, 이독성 난청, 외상성 난청, 바이러스성 난청, 일측성 난청 등을 포함할 수 있으나, 청각이 저하 또는 상실된 상태에 해당한다면, 상기 예시한 질환에 제한되지 않고 본 발명의 범주에 포함될 수 있으며, 일 실시예에 따를 때 구체적으로는 소음성 난청일 수 있으며, 보다 구체적으로는 급성 소음성 난청일 수 있다.The hearing loss may include noise-induced deafness, geriatric deafness, sudden deafness, auditory neuropathy due to diabetes, ototoxicity deafness, traumatic deafness, viral deafness, unilateral hearing loss, etc. It may be included in the scope of the present invention without being limited to the diseases exemplified above. According to an embodiment, it may be specifically noise-induced hearing loss, and more specifically, it may be acute noise-induced hearing loss.
일 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 난청을 진단하기 위한 키트를 제공한다.In one aspect, a kit for diagnosing hearing loss comprising the composition is provided.
상기 키트는 상기 유전자의 발현량을 mRNA 또는 단백질의 발현양의 측정을 통해 측정함으로써 난청을 진단할 수 있다. 상기 키트는 상기 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 단백질의 발현량을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. The kit can diagnose hearing loss by measuring the expression level of the gene by measuring the expression level of mRNA or protein. The kit includes the nucleotide sequence, a sequence complementary to the nucleotide sequence, a fragment of the nucleotide, or a substance that specifically binds to a protein encoded by the nucleotide sequence, as well as the expression level of the protein used by the kit. It may include one or more other constituents/compositions, solutions or devices suitable for the analytical method being measured.
상기 키트는 mRNA의 발현양을 측정하기 위한 키트일 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.When the kit is a kit for measuring the expression level of mRNA, the kit may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR. In addition to each primer pair specific for the mRNA of the marker gene, the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxyribonucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water (dEPC-water), sterile water, and the like. In addition, a pair of primers specific to a gene used as a quantitative control may be included.
상기 키트는 상기 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS) 또는 o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸 벤지딘(TMB) 등이 사용될 수 있다.The kit includes a substrate, a suitable buffer, a chromogenic enzyme, or It may include a secondary antibody labeled with a fluorescent substance and a chromogenic substrate. As the substrate, a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from a polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from a polystyrene resin, glass slide glass, etc. may be used, and the chromogenic enzyme is peroxidase, alkaline phosphatase ( alkaline phosphatase) may be used, FITC, RITC, etc. may be used as a fluorescent material, and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) or o- as a chromogenic substrate Phenylenediamine (OPD), tetramethyl benzidine (TMB), and the like can be used.
상기 키트는 단백질 또는 mRNA 발현량을 측정할 수 있는, 난청 진단용 마이크로어레이(microarray)일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상기 유전자를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 일 구체예에 따르면 상기 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 마이크로어레이일 수 있다.The kit may be a microarray for diagnosis of hearing loss, capable of measuring protein or mRNA expression level. The microarray can be easily prepared by a person skilled in the art according to a method known in the art using the gene, and according to one embodiment, cDNA of the sequence corresponding to the mRNA of the gene or a fragment thereof is applied to the substrate as a probe. It may be an attached microarray.
이외, 상기 키트가 포함하는 구성에 관련된 구체적인 설명은 상술한 바와 같다.In addition, specific descriptions related to the components included in the kit are the same as described above.
본 명세서에서 제공하는 해마 특이적 바이오마커를 활용하여 난청 환자에서의 인지기능 손상 가능성을 예측하고, 청각재활 시행 이후 인지기능 회복 효과를 예측, 적절한 재활 프로그램을 선택할 수 있는 기초자료로 활용할 수 있다. 또한, 청각재활 시행 중에 점검함으로써 청각재활 치료의 인지기능 회복 효과를 평가할 수 있는 자료로도 활용할 수 있다. 또한, 향후 난청에 의한 인지기능 손상의 치료적 마커로도 활용할 수 있다.The hippocampus-specific biomarkers provided herein can be used as basic data to predict the potential for cognitive impairment in hearing loss patients, predict the cognitive function recovery effect after auditory rehabilitation, and select an appropriate rehabilitation program. In addition, it can be used as data to evaluate the cognitive function recovery effect of auditory rehabilitation treatment by checking it during auditory rehabilitation. In addition, it can be used as a therapeutic marker for cognitive impairment due to hearing loss in the future.
도 1은 본 실시예의 전체적인 실험 프로토콜의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 실시예의 실험에서 난청 유도 후 청력변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 실시에의 실험 내 난청 군에서 유전자 발현 변화를 보인 군에 대한 생체 내 경로분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4, 5는 본 실시예의 실험 내 난청 군에서 유전자 발현수준이 변화하고, 도 3의 경로분석에 포함된 유전자들에 대한 mRNA qRT-PCR 분석결과를 나타낸 것이다.1 shows a schematic diagram of the overall experimental protocol of this example.
2 shows the results of confirming the change in hearing after induction of hearing loss in the experiment of this embodiment.
3 shows the results of in vivo pathway analysis for the group showing gene expression changes in the hearing loss group in the experiment of this embodiment.
4 and 5 show the mRNA qRT-PCR analysis results for the genes included in the path analysis of FIG. 3 and the gene expression level is changed in the hearing loss group in the experiment of this example.
이하, 보다 구체적인 설명을 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. Hereinafter, examples will be described in detail for a more detailed description.
실시예Example
생후 21일령의 Sprague-Dawley 랫트(rat)를 대조군, 소음성 난청 군으로 구분하였다(도 1). 소음성 난청 군에서 하루 4시간씩 3일 연속 115dB SPL의 백색소음에 노출시켜 난청 모델을 제작하였다. 대조군에서는 소음을 제외하고 소음성 난청 군과 동일한 환경에서 사육하였다. 난청 발생 후 청성뇌간반응검사(auditory brainstem response test)를 통하여 난청이 발생하였음을 확인하였다(도 2). 난청 발생 1일 후 랫트를 희생시키고 해마를 수득하였다. 수득한 해마로부터 mRNA를 정제하였다. 정제된 mRNA를 Affymetrix Rat Gene ST 2.0 array 를 이용하여 마이크로어레이(microarray)를 실시하였다. 그 결과, 대조군과 난청군간에서 fold change ≥ 1.5, P≤ 0.05을 만족하는 16개(7개 상향 조절, 9개 하향조절) 유전자(전사물)을 확인하였다(표 1).Sprague-Dawley rats at the age of 21 days were divided into a control group and a noise-induced hearing loss group (FIG. 1). The noise-induced hearing loss group was exposed to white noise of 115dB SPL for 3 consecutive days for 4 hours a day to produce a hearing loss model. In the control group, except for noise, they were reared in the same environment as the noise-induced hearing loss group. After the occurrence of hearing loss, it was confirmed that hearing loss occurred through an auditory brainstem response test (FIG. 2). One day after the onset of hearing loss, the rats were sacrificed and the hippocampus was obtained. mRNA was purified from the obtained hippocampus. The purified mRNA was microarrayed using an Affymetrix Rat Gene ST 2.0 array. As a result, 16 (7 up-regulated, 9 down-regulated) genes (transcripts) satisfying fold change ≥ 1.5 and P ≤ 0.05 were identified between the control group and the hearing loss group (Table 1).
상기 20개 유전자들 각각에 대하여, 이들 유전자들과 관련된 생물학적 반응과 다양한 표준 경로를 분석하기 위해 ConsensusPathDB 분석을 사용했으며 MAPK 신호전달경로(MAPK signaling), 세포자멸사(apoptosis), 면역시스템(immune system) 등의 경로가 상향 조절되고, 반면 신경전달, 콜린성 시냅스 등의 경로가 하향 조절되는 것으로 나타났다 (도 3).For each of the 20 genes, ConsensusPathDB analysis was used to analyze the biological responses and various standard pathways related to these genes, and the MAPK signaling pathway (MAPK signaling), apoptosis (apoptosis), immune system (immune system) The dorsal pathway was up-regulated, whereas the pathways such as neurotransmission and cholinergic synapses were down-regulated (FIG. 3).
이러한 신경학적 경로에 관련된 유전자 16개를 선택하여 표 2의 프라이머쌍을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 4, 5에서 나타난 바와 같이 대조군 대비, 난청군에서 SLPI, MT2A, MT1A, FOS, NFKBIA, MT1M 및 EGR1 유전자의 발현이 상향 조절 되고, 난청군에서 CHRNA3, IGF2, KCNJ16, KL, SLC40A1, SLC4A5, SLC5A7, SLITRK6 및 SYT9 유전자의 발현이 하향 조절 되었다.16 genes related to these neurological pathways were selected and qRT-PCR was performed using the primer pairs in Table 2. As a result, as shown in FIGS. 4 and 5 , the expression of SLPI, MT2A, MT1A, FOS, NFKBIA, MT1M and EGR1 genes was upregulated in the hearing loss group, and CHRNA3, IGF2, KCNJ16, KL, SLC40A1 in the hearing loss group compared to the control group, as shown in FIGS. 4 and 5 . , the expression of SLC4A5, SLC5A7, SLITRK6 and SYT9 genes was downregulated.
(서열번호 2)AGG GCA ACT CAT CTT CCG TG
(SEQ ID NO: 2)
(서열번호 4)CAA AAG GCT TCT CGC CTG TG
(SEQ ID NO: 4)
(서열번호 6)GCA GCT TTT CTT GCA GGA GG
(SEQ ID NO: 6)
(서열번호 8)ATT TGC AGT TCT TGC AGC CG
(SEQ ID NO: 8)
(서열번호 10)GCA GAC CCC CAG TCA AGT C
(SEQ ID NO: 10)
(서열번호 12)CAG ATG CAG CCC TGG GAG
(SEQ ID NO: 12)
(서열번호 14)CCC ACA CAT ACC CTC ACA ACA
(SEQ ID NO: 14)
(서열번호 16)CCA GCA CAG TTT CCA AGA CAC
(SEQ ID NO: 16)
(서열번호 18)CGC GGC GCA GAA TAC AAT AG
(SEQ ID NO: 18)
(서열번호 20)TTC TTC CGT GAC ACA ACG GT
(SEQ ID NO: 20)
(서열번호 22)TAC GCT GAT GGT AGC CCC TA
(SEQ ID NO: 22)
(서열번호 24)AGC CAC AGG TTG GTT TCC AT
(SEQ ID NO: 24)
(서열번호 26)AAT GTC TGC AAG GGA ACG GT
(SEQ ID NO: 26)
(서열번호 28)AGG CAC AGG TGG GTT CTT G
(SEQ ID NO: 28)
(서열번호 29)ATC TCT TTG GCC TTC GCC TT
(SEQ ID NO: 29)
(서열번호 32)AAA AGC CGG ACT TGG GAA CT
(SEQ ID NO: 32)
<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> Biomarker composition for diagnosing Deafness comprising MT1A and use thereof <130> PN142510KR <150> KR 10-2019-0156129 <151> 2019-11-28 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 1 <400> 1 gaaaatcttc agacgctgcc c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 2 <400> 2 agggcaactc atcttccgtg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 3 <400> 3 tcgctcggat gagcttacac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 4 <400> 4 caaaaggctt ctcgcctgtg 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 5 <400> 5 ccaactgctc ctgtgcca 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 6 <400> 6 gcagcttttc ttgcaggagg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 7 <400> 7 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20
Claims (1)
상기 난청은 소음성 난청 또는 급성 소음성 난청이고,
상기 키트는 상기 유전자의 발현수준을 mRNA 또는 단백질의 발현양의 측정을 통해 측정함으로써 난청을 진단할 수 있는 것인, 키트.A kit for diagnosing hearing loss, comprising a composition for diagnosing hearing loss comprising an agent for measuring the expression level of MT1A gene in hippocampal tissue,
The hearing loss is noise-induced hearing loss or acute noise-induced hearing loss,
The kit is one capable of diagnosing hearing loss by measuring the expression level of the gene by measuring the expression level of mRNA or protein.
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