KR20210145972A - 크리스퍼 진단법을 이용한 디지털 검출 방법 및 이의 장치 - Google Patents

크리스퍼 진단법을 이용한 디지털 검출 방법 및 이의 장치 Download PDF

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KR20210145972A
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신승식
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Abstract

본 발명은 디지털 검출 방법 및 이의 장치에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 대상 시료에 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 CRISPR-Cas 단백질 및 상기 CRISPR-Cas 단백질이 활성화되는지 여부를 확인할 수 있는 리포터를 혼합하는 단계; 상기 혼합된 시료를 디지털 검출용 카트리지의 복수 개의 마이크로 웰을 포함하는 웰 어레이에 로딩하는 단계; 및 상기 디지털 검출용 카트리지를 이용하여 상기 각 마이크로 웰 내의 리포터의 변화를 감지함으로써 상기 혼합된 시료 내의 상기 타겟 유전자를 검출하는 단계를 포함한다.

Description

크리스퍼 진단법을 이용한 디지털 검출 방법 및 이의 장치{A METHOD OF DIGITAL DETECTING USING CRISPR DIAGNOSITCS AND AN APPARATUS HAVING THE SAME}
본 발명은 시료 내의 타겟 물질의 디지털 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 크리스퍼(CRISPR) 진단법을 이용하여 타겟 물질을 디지털 검출하는 방법 및 이의 장치에 관한 것이다.
유전자 증폭기술은 분자진단에 있어서 필수적인 과정으로서 시료 내 미량의 디옥시리보핵산(Deoxyribonucleic Acid; DNA) 또는 리보핵산(Ribonucleic Acid; RNA)의 특정 염기서열을 반복적으로 복제하여 증폭하는 기술이다. 그 중 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)은 대표적인 유전자 증폭 기술로서 DNA 변성단계(denaturation), 프라이머(Primer) 결합단계(annealing), DNA 복제단계(extension)의 3단계로 구성되어 있으며 각 단계는 시료의 온도에 의존되어 있으므로 시료의 온도를 반복적으로 변하게 함으로서 DNA를 증폭할 수 있다.
이전에 PCR은 일반적으로 96 또는 384-우물 미소판들(well microplates)에서 수행되었다. 더 높은 처리량을 요구하는 경우, 종래의 미소판들에서의 PCR 방법은 비용에 있어 효과적 또는 효율적이지 않다. 그러나 만일 PCR 반응 용적을 감소시키면 시약의 소비를 줄이고 반응 용적의 감소된 열 질량에서 증폭 시간을 줄일 수도 있다. 이 전략은 배열 형식(m x n)으로 구현할 수도 있으므로, 그 결과 다수의 더 작은 반응 용적을 구현할 수도 있다. 또한 어떤 배열을 사용하면 증가된 정량 감도, 동적 범위와 특이성을 갖는 확장가능 고 처리량 분석을 허용한다.
이러한 기존의 단점을 해소하기 위하여 배열 형식들을 사용한 디지털 중합 효소 연쇄 반응(디지털 PCR)에 대한 연구가 활발하게 진행되었다. 디지털 PCR로부터의 결과들을 사용하여 희귀 대립 유전자(rare alleles)의 농도를 검출 및 정량화하고, 핵산 시료들의 절대 정량화를 제공하고, 또한 핵산 농도가 낮은 접이식 변화를 측정할 수 있다. 일반적으로, 복제의 수를 증가시키면 디지털 PCR 결과들의 정확도 및 재현성이 증가한다.
디지털 PCR에서는, 타겟 폴리 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열의 상대적으로 적은 수를 포함하는 용액을 작은 테스트 시료들로 분할할 수도 있으며, 그에 의해 각각의 시료는 일반적으로 타겟 뉴클레오타이드 서열의 한 분자를 포함하거나 또는 타겟 뉴클레오타이드 서열의 분자를 포함하지 않는다. 이어서 시료들이 PCR 프로토콜, 절차, 또는 실험에서 열적으로 순환되는 경우, 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료는 증폭되어, 양성 검출 신호를 생성하는 한편 어떠한 타겟 뉴클레오타이드 서열도 포함하지 않는 시료들은 증폭되지 않고 검출 신호를 생성하지 않는다.
기존의 주된 디지털 PCR 방식은 시료를 반응공간으로 투입하는 과정과 염기서열을 증폭하는 과정이 나누어지는 엔드-포인트(end-point) PCR을 사용하므로 각 반응공간에서 실시간으로 염기서열이 증폭되는 반응을 측정하지 못한다.
또한, 최근에 개발된 유전자가위(RNA-guided CRISPR)(clustered regularly interspaced short palindrome repeats)-연관된 뉴클레아제 Cas 단백질에 기반된 유전체 교정(genome editing)은 표적 넉-아웃, 전사 활성화 및 single guide RNA(sgRNA)(즉, crRNA-tracrRNA 융합 전사체)를 이용한 억제에 대한 획기적인 기술을 제공하며, 이 기술은 수많은 유전자 위치를 표적함으로써 확장성을 입증하였다. CRISPR-Cas 시스템은 표적하는 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지는 guide RNA(gRNA)와 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있는 뉴클레아제인 CRISPR 효소로 구성되며, gRNA와 CRISPR 효소는 CRISPR 복합체를 형성하고, 형성된 CRISPR 복합체에 의해 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킨다. CRISPR 시스템은 원핵 생물, 고세균의 면역 시스템으로서 최근 유전자 가위의 하나로 그 활용성에 대한 연구가 급증하고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 적은 양의 시료로부터 타겟 물질을 정확하게 분석할 수 있는 진단 또는 분석 효율을 향상시키는 디지털 검출 방법 및 이의 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 분석을 위한 시간을 단축시키고 검사 프로세스를 간소하게 함으로써 시약 가격의 경쟁력을 향상시키고 분석 및 진단 장치의 생산 비용도 감소시킬 수 있는 디지털 검출 방법 및 이의 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또다른 과제는 시료 내의 타겟 물질을 절대적으로 정량화할 수 있는 디지털 검출 방법 및 이의 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 대상 시료와 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 CRISPR-Cas 단백질 및 상기 CRISPR-Cas 단백질이 활성화되는지 여부를 확인할 수 있는 리포터를 혼합하는 단계; 상기 혼합된 시료를 디지털 검출용 카트리지의 복수 개의 마이크로 웰을 포함하는 웰 어레이에 로딩하는 단계; 및 상기 디지털 검출용 카트리지를 이용하여 상기 각 마이크로 웰 내의 리포터의 변화를 감지함으로써 상기 혼합된 시료 내의 상기 타겟 유전자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다
일 실시예에서, 상기 CRISPR-Cas 단백질은 Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9) Prevotella 및 Francisella 1(Cpf1) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 마이크로 웰들의 피치는 150um 미만일 수 있으며, 상기 디지털 검출용 카트리지가 리더시스템에 장착됨으로써 상기 혼합된 시료 내의 상기 타겟 유전자를 정량할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 리포터는 형광 물질을 포함하고, 상기 활성화된 CRISPR-Cas 단백질에 의하여 절단됨으로써 상기 형광 물질이 나타낼 수 있다.
상기 타겟 유전자를 검출하는 단계는 각 웰에서 나타내는 형광을 실시간으로 측정할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 디지털 검출 방법은 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는 시료의 증폭 단계를 필요로 하지 아니할 수 있다.
또한, 상기 진단 대상 시료는 가열 없이 채취된 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계만을 수행하여 획득되거나, 가열 및 핵산 추출단계를 수행하지 아니하고 채취된 샘플 자체일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, CRISPR-Cas 단백질 및 타겟 물질의 정량 분석을 위한 디지털 기기를 이용하여 적은 양의 진단 대상 시료로부터 타겟 물질의 분석 효율 및 분석 정확도를 향상시키는 디지털 검출 방법 및 이의 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 시료의 증폭 단계를 수행하지 아니함으로써 시료 분석을 위한 시간을 단축시키고 검사 프로세스를 간소하게 함으로써 시약 가격의 경쟁력을 향상시키고 분석 및 진단 장치의 생산 비용도 감소시킬 수 있는 디지털 검출 방법 및 이의 장치를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 실시예에 따르면, CMOS 센서를 포함하는 디지털 검출용 카트리지 및 디지털 검출용 기기를 이용하여 시료를 분석함으로써 시료 내의 타겟 물질을 절대적으로 정량화할 수 있는 디지털 검출 방법 및 이의 장치를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시료 내에서의 CRISPR-Cas 단백질의 활성화를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출 방법을 나타내는 순서도이다.
도 3 내지 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출 방법을 나타내는 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출용 카트리지의 사시도이고, 도 7은 도 6에 도시된 디지털 검출용 카트리지의 분해 사시도이다.
도 8은 도 7에 도시된 웰 어레이 형상의 일례를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 디지털 검출 방법을 나타내는 것이다.
도 10은 일반적인 CRISPR-Cas 단백질을 이용한 시료 내의 타겟 물질 검출 방법을 나타내는 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR-Cas 단백질을 이용한 시료 내의 타겟 물질의 디지털 검출 방법을 나타내는 것이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR-Cas 단백질을 이용한 시료 내의 타겟 물질의 디지털 검출 방법을 나타내는 것이다.
도 13 내지 도 15는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 분석 대상 시료의 준비 방법을 나타내는 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 대상 시료 채취 단계를 간략하게 설명한 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 대상 시료의 준비 단계를 설명한 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합 시료의 디지털 검출을 위한 단계를 설명한 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 대상 시료를 준비하기 위한 장치를 나타내는 것이고, 도 20a 내지 도 20c는 상기 장치를 이용하여 분석 대상 시료를 준비하기 위한 방법을 나타내는 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 발명을 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.
또한, 이하의 도면에서 각 층의 두께나 크기는 설명의 편의 및 명확성을 위해 과장된 것이며, 도면상에서 동일 부호는 동일한 요소를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"는 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 설명하고자 한다. 도면상의 동일한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 사용하고 동일한 구성요소에 대해서 중복된 설명은 생략한다.
본 발명의 디지털 검출을 위하여 이용되는 디지털 검출용 카트리지는 기판에 일정 배열로 시료들, 시료 용적들 또는 반응 용적들을 탑재하기 위한 구조를 가지며, 기판 내의 각각의 반응 위치들의 일정한 배열로 시료들을 탑재하는 구조를 포함한다.
다양한 실시예들에서, 대량의 작은 용적 시료들에서 타겟 물질들을 검출하기 위해 사용되는 물품 내에 시료들을 탑재하기 위한 장치, 기기, 시스템, 및 방법들이 제공된다. 이러한 타겟 물질들은 임의의 적절한 생물학적 타겟일 수 있지만, DNA 서열(무 세포 DNA를 포함함), RNA 서열, 유전자, 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotides), 분자, 단백질, 생체표식(biomarkers), 세포(예, 순환 종양 세포), 또는 다른 적당한 타겟 생체 분자를 포함하는 것들로서, 이것으로 한정되지 않는다. 다양한 실시예들에서, 이러한 생물학적 성분들은 태아 진단, 다중화 dPCR, 바이러스 검출, 및 정량 표준화, 유전자형(genotyping), 서열 검증, 돌연변이 검출, 유전자 생물, 희귀 대립 유전자 검출, 및 복제 수 변화 검출 등의 응용들에서 다양한 분석 방법 및 시스템과 연관하여 사용될 수도 있다.
또한, 디지털 PCR용 카트리지, 디지털 PCR 모듈 또는 시스템의 구성요소, 정의, 동작 방법에 대한 상세한 사항은 본 출원인의 대한민국 등록특허 제10-0822672호, 제10-0825087호, 제10-0801448호, 제10-0808114호, 제10-1803497호, 제10-1753644호, 및 제10-1904506호에 개시되어 있으며, 상기 등록특허 문헌들은 그 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시료 내에서의 CRIPSPR-Cas 단백질의 활성화를 나타내는 것이다.
도 1을 참조하면, 튜브(Tube) 내에는 타겟 물질에 특이적으로 결합하는 CRISPR-Cas 단백질와 상기 CRISPR-Cas 단백질이 활성화되는지 여부를 확인할 수 있는 리포터(Reporter)를 포함시킬 수 있다. 상기 CRISPR-Cas 단백질은 활성화되면 주변의 단일 가닥의 물질을 절단하는 특성을 가지고 있다. 또한, 상기 리포터는 형광 물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광 물질은 상기 리포터가 절단되는 경우 형광을 나타낼 수 있다.
만일 튜브(Tube)에 분석하고자 하는 분석 대상 시료 내에 타겟 물질(Target)이 존재하는 경우, 튜브 내의 CRISPR-Cas 단백질은 상기 타겟 물질과 결합하여 활성화(Activated CRISPR CAS)될 수 있다. 상기 활성화된 CRISPR-Cas 단백질은 도 1에서 붉은 색으로 도시되며, 상기 활성화된 CRISPR-Cas 단백질은 그 주변의 리포터(Reporter, 파란색으로 도시)들을 절단할 수 있다. 상기 절단된 리포터(Cleaved reporters, 빨간색으로 도시)들은 형광을 나타낼 수 있으므로, 상기 형광을 감지함으로써 튜브 내의 타겟 물질을 검출할 수 있다.
그러나, 도 1에서 도시된 바와 같이, 활성화된 CRISPR-Cas 단백질은 주변의 리포터들을 절단할 수 있는 절단능에 한계가 있기 때문에, 진단 시료 내에 타겟 물질이 미량으로 포함되는 경우에는 검출되는 형광의 양도 미량일 수 밖에 없다. 이러한 경우, 진단 시료 내의 타겟 물질을 정확하게 검출하기 어려운 한계를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출 방법 및 이의 장치는 상기 문제점을 해소하기 위한 방법을 이하 도 2 내지 도 16c를 참조하여 제안할 것이다.
도 2 내지 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출 방법을 나타내는 순서도이고, 도 3 내지 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출 방법을 나타내는 것이다.
도 2를 참조하면, 먼저 타겟 물질의 존재 여부를 분석하고자 하는 분석 대상 시료에 상기 타겟 물질과 결합하는 효소(enzyme)를 포함하는 CRISPR-Cas 단백질과 형광 물질을 포함하는 리포터를 혼합할 수 있다(S10). 이 경우, 분석 대상 시료에 상기 타겟 물질이 존재하는 경우, CRISPR-Cas 단백질이 활성화되어 주변의 리포터를 절단함으로써 형광 물질이 검출될 수 있다. 한편, 분석 대상 시료에 상기 타겟 물질이 존재하지 아니하는 경우에는, CRISPR-Cas 단백질이 활성화되지 아니하므로 형광 물질이 검출되지 아니할 것이다.
일반적으로 분석 대상 시료 내에 타겟 물질은 적은 양으로 존재하기 때문에, 활성화되는 CRISPR-Cas 단백질의 양도 적을 수밖에 없고, 리포터에 의하여 검출되는 형광 물질의 양도 적을 수 없다. 따라서, 타겟 물질을 정확하고 신속하게 검출하기 위하여는, 검출되는 형광 물질의 양을 증가시키기 위하여 분석 대상 시료를 증폭시키거나(검체의 증가), 분석 대상 시료를 적은 양 단위로 나눠 분석하는 방법이 필요할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출 방법은 분석 대상 시료를 적은 양 단위로 나누어 분석하는 방법을 포함한다. 상기 S10 단계에서 혼합된 시료는 디지털 검출용 카트리지의 웰 어레이에 포함되는 복수 개의 마이크로 웰에 로딩될 수 있고(S20), 분석 대상 시료가 로딩된 각각의 마이크로 웰 내에서의 리포터의 변화를 감지함으로써 타겟 물질을 검출할 수 있다(S30). 상기 S20 및 S30 단계는 도 3 이하의 도면들을 참조하여 설명한다.
도 3 내지 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출 방법을 나타내는 것이다.
도 3을 참조하면, 혼합된 시료는 디지털 검출용 카트리지의 복수 개의 마이크로 웰에 로딩될 수 있으며, 타겟 물질이 존재하는 마이크로 웰(Positives)에서는 타겟 물질과 결합하여 활성화된 CRISPR-CAS 단백질(Positive Reaction에서의 Activated CRISPR CAS)에 의해 리포터가 절단됨(Cleaved reporters)으로써 형광 물질을 검출할 수 있고, 타겟 물질이 존재하지 아니하는 마이크로 웰(Negatives)에서는 형광 물질이 검출되지 아니할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 아주 적은 양의 시료로부터 형광이 검출 가능하므로 분석 대상 시료의 증폭 단계없이 정확하게 타겟 물질의 디지털 검출이 가능하게 된다. 또한, 일 실시예에서는, 타겟 물질의 유무를 실시간으로 확인할 수 있고, 또는, 종말점 검출(End-point detection)로 타겟 물질의 유무를 판단하는 것도 가능하다.
도 4의 오른쪽 하단에 도시된 바와 같이, 종말점 검출(End-point detection) 방법으로 타겟 물질을 확인하는 경우에는 중간값을 정확히 확인하기 어려우므로 실질적으로 타겟 물질이 존재하는지 여부(양성/음성)을 확실하게 구분하기 어려울 수 있다. 만일 시료 내에 초기 백그라운드 형광이 많다면 종말점 검출에서 양성으로 판단된 경우라도 실질적으로는 양성이 아닌 음성일 수 있다. 그러므로, 분석 대상 시료 내의 타겟 물질 검출의 정확도가 낮아진다.
도 5의 오른쪽 하단에 도시된 바와 같이, 실시간 검출(Real-time detection) 방법으로 분석 대상 시료 내의 타겟 물질을 확인할 수 있다. 이 경우, 시간별 신호의 차이를 검지하고 그 크기의 추이를 표시하게 되므로 양성 또는 음성이 확실하게 구분될 수 있다. 일 실시예에서는, 초기 백그라운드 형광 신호가 크더라도 이후 신호 크기의 변화가 없으면 음성, 변화가 지속적으로 일어나면 양성으로 정확하게 판단할 수 있다. 또한, 마이크로 웰 각각에서의 신호 변화를 실시간으로 확인할 수 있으므로, 타겟 물질의 정량 분석 및 존재 여부 분석을 할 수 있을 뿐만 아니라, 어느 마이크로 웰에 타겟 물질이 존재하는지 알 수 있으므로, 타겟 물질을 추출하여 향후 다양한 실험에 이용하는 것도 가능할 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출용 카트리지를 대략적으로 설명하기 위한 사시도이고, 도 7은 도 6에 도시된 디지털 검출용 카트리지의 분해 사시도이다.
도 6 및 도 7을 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 디지털 검출용 카트리지는 카트리지 타입의 검사 모듈로서 어퍼 케이스(110), 바텀 케이스(120), 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(160)를 포함한다. 일 실시예에서, 디지털 검출용 카트리지는, 예를 들어, 디지털 실시간 PCR 장비와 같은 디지털 실시간 검출 장비의 리더 시스템에 탈착 가능하도록 결합될 수 있다.
어퍼 케이스(110)는 중심 영역에 형성된 어퍼홀을 포함하는 도우넛 형상의 커버 몸체와 상기 어퍼홀에 배치된 윈도우 부재를 포함할 수 있다. 어퍼 케이스(110)는 바텀 케이스(120)에 체결된다. 본 실시예에서, 어퍼 케이스(110) 및 바텀 케이스(120)는 납작한 원통 형상인 것을 도시하였으나, 다양한 형상이 가능하다. 상기 윈도우 부재는 투명 재질을 포함할 수 있다. 상기 윈도우 부재는 PDMS 재질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바텀 케이스(120)는 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(160)를 수용하고, 어퍼 케이스(110)에 체결될 수 있다. 예를 들어, 바텀 케이스(120)와 어퍼 케이스(110)는 후크 방식으로 체결될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 체결 방식은 제한되지 아니한다.
미소유체 챔버(130)는 상향으로 돌출된 멤브레인 스위치, 상기 멤브레인 스위치의 일측에 형성되어 액체시료의 주입을 위한 인렛을 포함할 수 있다. 미소유체 챔버(130)의 하부 에지 영역은 PCB(160)의 에지 영역에 접할 수 있다. 미소유체 챔버(130)의 하부 중앙 영역에는 PCB(160)에 탑재된 CMOS 포토센서 어레이(150) 및 웰 어레이(140)를 수용하기 위해 후퇴된 형상의 공간이 형성될 수 있다. 미소유체 챔버(130)는 PDMS와 같은 재질로 구성될 수 있다. 미소유체 챔버(130)는 유연성, 투명성, PCR 호환성 및 낮은 자가 형광성을 갖고서, 사출 성형이 가능한 재료이면 어떤 재료를 이용하여 형성되어도 무방하다.
웰 어레이(140)는 미소유체 챔버(130)의 하부 면에 부착되고, CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치될 수 있다. 웰 어레이(140)는 에칭된 실리콘 재질로 구성될 수 있다. 일 실시예에서, 웰 어레이(140)는 복수의 마이크로 웰들(142)을 포함한다. 마이크로 웰들(142)의 형상이나, 치수, 개수 등은 다양할 수 있다. 일 실시예에서, 웰 어레이(140)는 CRISPR-Cas 단백질을 이용한 디지털 검출 반응 위치의 역할을 수행하는 복수의 마이크로 웰들(대략 1,000개~100,000개)을 포함할 수 있다.
마이크로 웰들(142) 각각에는 분말시료 또는 액체시료와 같은 분석시료가 수용될 수 있다. 상기 분석시료는 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분이다. 즉, 상기 분석시료란 특정한 생물학적 물질, 예를 들어 단백질, DNA, RNA 등의 정량 또는 정성 분석을 위한 성분으로서, 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, DNA 또는 RNA 중합효소 등을 의미하며, 특히 실시간 중합효소연쇄반응, 정온 효소반응 또는 LCR(Ligase Chain Reaction) 등을 수행하기 위해 필요한 성분을 의미한다. 일 실시예에서는, 마이크로 웰들(142) 각각에 도 2의 S10 단계에서 준비된 혼합 시료를 로딩할 수 있다.
CMOS 포토센서 어레이(150)는 웰 어레이(140)의 아래에 배치되고, 웰 어레이(140)의 마이크로 웰들(142)에서 수행되는 CRISPR-Cas 반응 산물의 영상을 실시간으로 촬영한다. CMOS 포토센서 어레이(150)는 PCB(150)에 형성된 기판홀에 삽입되어 배치된다. CMOS 포토센서 어레이(150)는 여기 광선에 의하여 다수의 프로브에서 발생하는 형광(emission light)을 검출한다. 상기한 형광의 검출은 시간 분리 방식에 의해 이루어질 수도 있고, 파장 분리 방식에 의해 이루어질 수도 있다.
상기한 시간 분리 방식의 경우, 형광물질이 여기광에 응답하여 방출광을 발현함에 따라, 형광센서 어레이 또는 어레이를 구성하는 단일 센서는 이미션 필터를 통과하는 방출광을 검출하고 검출된 방출광의 시상수를 구하여 형광을 감지한다.
상기한 파장 분리 방식의 경우, 형광물질이 여기광에 응답하여 방출광을 발현함에 따라, 형광센서 어레이 또는 어레이를 구성하는 단일 센서는 이미션 필터를 통과하는 방출광을 검출하고 검출된 방출광의 스펙트럼 분석을 통해 형광을 감지한다.
PCB(150)는 미소유체 챔버(130) 아래에 배치되고, 탑재되는 CMOS 포토센서 어레이(150)를 수납할 수 있다. PCB(150)는 미소유체 챔버(130)의 바닥 에지 영역에 접하도록 배치될 수 있다. 미소유체 챔버(130)의 바닥 에지 영역에 접하는 PCB(150)의 일부 영역에는 통풍구(vent hole)(152)가 형성될 수 있으며, 통풍구(152)는 CMOS 포토센서 어레이(150)와 웰 어레이(140) 간의 공간과 도통될 수 있다.
도 8은 도 7에 도시된 웰 어레이 형상의 일례를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다. 도 8에서는 마이크로 웰의 형상이 원형상인 것을 도시하였으나, 육각형, 사각형 등과 같이 다양한 형상이 가능하다.
도 8을 참조하면, 상기 마이크로 웰들의 형태, 크기 및 부피는 조절이 가능하다. 상기 마이크로 웰들은 상하부가 관통된 형상을 갖는다. 본 실시예에서, 상기 마이크로 웰은 700 ㎛ 미만의 두께와 150 ㎛ 미만의 피치를 가질 수 있다. 상기 마이크로 웰은 육각 형상, 원형상 등과 같은 다양한 형상을 가질 수 있다. 웰 어레이(140)는 친수성 코팅으로 처리될 수 있다. 웰 어레이(140)는 플라즈마 또는 열 또는 UV 경화 접착제에 의해 미소유체 챔버(130)에 부착될 수 있다.
도 6 및 도 7을 다시 참조하면, CMOS 포토센서 어레이(150)는 웰 어레이(140) 아래에 배치되고, 웰 어레이(140)의 마이크로 웰들에서 CRISPR 단백질 활성화에 의해 발생하는 형광을 실시간으로 촬영한다. 바람직하게는, CMOS 포토센서 어레이(150)가 PCB(160)에 형성된 기판홀에 대응하도록 배치되어 웰 어레이(140)에서 방출되는 형광을 측정할 수 있으며, 이 경우, 웰 어레이(140) 전체에서 방출되는 형광을 측정할 수 있고, 각각의 마이크로 웰에서 방출되는 형광을 별개로 측정할 수도 있다. 측정된 형광은 앞서 도 4 및 도 5의 오른쪽 하단에 도시된 그래프 등의 방식으로 분석될 수 있다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 디지털 검출 방법을 나타내는 것이다. 본 발명의 디지털 검출 방법은 CRISPR-Cas 단백질과 디지털 검출용 카트리지를 이용함으로써 분석 대상 시료의 증폭없이 간단한 방법으로 미량의 시료로부터 타겟 물질을 검출할 수 있다. 도 9를 참조하면, 본 발명의 디지털 검출 방법은 실시간으로 타겟 물질의 검출할 수도 있으며, 또는, 선택적으로 엔드 포엔트(end-point)에서 타겟 물질을 검출할 수 있다. 또한, 분석 대상 시료를 준비하기 위하여 일반적인 경우와 같이 핵산 추출(Nucleic Acid Extraction) 및 가열(Heating) 단계를 수행할 수 있고, 핵산 추출 단계 및 가열 단계를 선택적으로 수행하지 아니하거나, 두 개의 단계 모두 수행하지 않고 채취된 샘플 자체를 전처리 없이 분석 대상 시료로 이용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출은 등온 PCR 을 수행할 필요가 없으므로 검사를 위한 시간이 단축되고 작업이 간소화되며, PCR을 위하여 필요한 시약을 사용하지 아니하므로 타겟 물질 검출을 위한 시약 가격을 절감할 수 있고, 제품의 생산비용도 감소시킬 수 있다. 또한, 디지털 검출법으로 보다 정확하게 타겟 물질에 대하여 정량할 수 있다.
도 10은 본 발명의 또다른 실시예에 따른 디지털 검출 방법을 나타내는 것이다. 도 10을 참조하면, 도 9의 디지털 검출 방법 중 CRISPR-Cas 단백질을 이용하여 타겟 물질을 검출하기 이전에 PCR 을 수행할 수 있다. 상기 PCR 은 CRISPR-Cas 단백질 처리 이전 또는 이후에 수행될 수 있으며, 등온 PCR(Isothermal PCR)일 수 있다.
이와 같이, CRISPR-Cas 단백질 처리 이외에 PCR도 수행하는 경우에는, PCR 을 통해 타겟 물질을 증폭시켜 민감도를 증가시키고, CRISPR 형광신호 증폭을 통해 gRNA의 특이적 결합으로 인해 특이성을 증가시킬 수 있으므로 소량의 분석 대상 시료로부터 타겟 물질을 민감하게 검출할 수 있다. 또한, 디지털 검출법을 이용하여 타겟 물질을 분석함으로써 타겟 물질의 절대정량이 가능하게 된다.
도 11은 일반적인 CRISPR-Cas 단백질을 이용한 타겟 물질의 분석 방법을 나타내는 순서도이다. 도 11을 참조하면, 샘플로부터 일반적인 프로토콜에 의해 RNA를 추출하고, 추출된 RNA를 포함하는 시료를 약 62℃에서 약 20 분 동안 등온에서 증폭시킨다. 바람직하게는, 상기 PCR은 RT-PCR을 수행할 수 있다(Step 1). 또한, 약 37℃에서 약 30 분 동안 Cas12a 단백질과 gRNA 콤플렉스를 형성할 수 있다(Step 1).
이후, 증폭된 분석 대상 시료에 Cas 12a+gRNA 콤플렉스를 혼합하여 Cas 12 단백질의 활성화를 통한 리포터의 절단 단계가 약 37℃에서 약 10분 동안 수행될 수 있다(Step 2). 이후, 리포터의 절단으로 인한 형광 물질을 측면 흐름 분석(Lateral flow)을 약 2분간 진행하여 타겟 물질의 유무를 분석할 수 있다. 이 경우, PCR을 진행함으로써 분석 대상 시료가 증폭되어 검체의 양이 증가하기 때문에 타겟 물질 검출의 정확도를 향상시킬 수 있으나, PCR 수행 동안의 오염(contamination) 발생 확률의 증가, 검출 시간 및 시약 소비량의 증가, 및 측면 흐름 분석의 정확도가 낮은 단점을 해결해야 한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR-Cas 단백질을 이용한 타겟 물질의 분석 방법을 나타내는 순서도이다. 도 12를 참조하면, 일반적인 프로토콜에 의해 RNA를 추출하고, 추출된 RNA를 포함하는 시료에 대한 추가적인 처리는 필요로 하지 아니한다. 이외에, 약 37℃에서 약 30 분 동안 Cas12a 단백질과 gRNA 콤플렉스를 형성할 수 있으며(Step 0), 상기 콤플렉스는 타겟 물질의 분석을 시작하기 이전에 미리 준비함으로써 타겟 물질의 분석을 위한 소요 시간을 감소시킬 수 있다.
준비된 RNA 추출 시료에 Cas 12a+gRNA 콤플렉스를 혼합하여 Cas 12 단백질의 활성화를 통한 리포터의 절단 단계가 이 약 37℃에서 약 10분 동안 수행될 수 있다(Step 2). 이후, 측면 흐름 분석법을 이용하지 아니하고 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출용 카트리지 및 장치를 이용하여 타겟 물질의 유무를 분석할 수 있다. 이 경우, PCR을 진행이 불필요하므로 도 11을 참조하여 설명한 PCR 의 단점을 해소할 수 있으며, 디지털 검출용 카트리지를 이용하여 디지털 분석을 수행함으로써 실시간으로 타겟 물질을 정확하게 분석하는 효과를 제공할 수 있다.
도 13 내지 도 15는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 분석 대상 시료의 준비 방법을 나타내는 것이다.
도 13을 참조하면, 분석 대상 시료는 핵산 추출 및 가열 과정 없이 채취한 샘플 자체를 증류수에 희석하거나, 인산완층생리식염수(PBS)에 희석하여 이용될 수 있다. 상기 분석 대상 시료를 획득하기 위하여 일반적인 핵산 추출 및 가열 단계는 수행되지 아니할 수 있다. 이후, 분석 대상 시료는 Cas13a 또는 Cas12a 단백질, gRNA, 리포터 물질, 증류수, 및 버퍼와 혼합될 수 있다.
혼합된 시료는 앞서 설명한 디지털 검출용 카트리지에 로딩되어 약 80℃에서 약 1 내지 15분 동안 히팅되며, 이후 약 30 내지 70℃ 에서 5 내지 60분 동안 혼합 시료 내의 타겟 물질을 분석할 수 있다. 이러한 디지털 검출 방법은 열처리 사이클을 필요로 하지 아니하고 타겟 물질의 유무를 나타내는 형광 검출을 간단하게 10 초 내지 10 분 간격으로 확인할 수 있다. 이 경우, 분석 대상 시료를 준비함에 있어서 핵산 추출 및 가열 과정이 불필요하므로, 핵산 추출 과정이 낮은 효율을 갖는 단점 및 오염 발생 문제를 해소할 수 있다.
반면, 일반적인 디지털 PCR 방법은 분석 대상 시료 내의 타겟 물질을 확인하기 위해 드롭플릿(droplet)을 생성하고, 이들을 엔드 포인트(End-point) 검출 방식으로 타겟 물질의 유무를 분석하기 때문에 실시간 검출과 타겟 물질의 추출은 어려울 수 있다.
도 14를 참조하면, 분석 대상 시료는 핵산 추출 과정 없이 채취한 샘플을 약 60 내지 100℃ 에서 1 내지 15 분 동안 인큐베이션 하여 준비할 수 있다. 상기 분석 대상 시료를 획득하기 위하여 핵산 추출(Nucleic Acid Extraction) 단계는 수행되지 아니할 수 있다. 이후, 분석 대상 시료는 Cas13a 또는 Cas12a 단백질, gRNA, 리포터 물질, 증류수, 및 버퍼와 혼합될 수 있다.
혼합된 시료는 분석 대상 시료 준비시 히팅 과정을 거쳤기 때문에 앞서 설명한 디지털 검출용 카트리지에 로딩되어 이후 히팅 단계 없이 약 30 내지 70℃ 에서 5 내지 60분 동안 혼합 시료 내의 타겟 물질을 분석할 수 있다. 이러한 디지털 검출 방법은 열처리 사이클을 필요로 하지 아니하고 타겟 물질의 유무를 나타내는 형광 검출을 간단하게 10 초 내지 10 분 간격으로 확인할 수 있다.
반면, 일반적인 디지털 PCR 방법은 앞서 설명한 바와 같이, 분석 대상 시료 내의 타겟 물질을 확인하기 위해 드롭플릿(droplet)을 생성하고, 이들을 엔드 포인트 검출 방식으로 타겟 물질의 유무를 분석하기 때문에 실시간 검출과 타겟 물질의 추출은 어려울 수 있다.
도 15를 참조하면, 분석 대상 시료는 일반적인 방법으로 채취된 시료샘플로부터 RNA를 추출하고, 추출된 RNA 샘플에 Cas13a 또는 Cas12a 단백질, gRNA, 리포터 물질을 혼합하여 분석 대상 시료를 준비할 수 있다. 혼합된 시료는 앞서 설명한 디지털 검출용 카트리지에 로딩되어 히팅 단계 없이 약 30 내지 70℃ 에서 5 내지 60분 동안 혼합 시료 내의 타겟 물질을 분석할 수 있다. 이러한 디지털 검출 방법은 열처리 사이클을 필요로 하지 아니하고 타겟 물질의 유무를 나타내는 형광 검출을 간단하게 10 초 내지 10 분 간격으로 확인할 수 있다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 대상 시료 채취 단계를 간략하게 설명한 것이다.
도 16을 참조하면, 본 발명에서의 시료는 비인후 표본(Nasopharyngeal swab), 구강인두 표본(Oropharyngeal swab), 객담(Sputum) 100 내지 1000 ㎕, 타액(Saliva) 100 내지 1000 ㎕, 혈액 세럼/플라즈마(Blood serum/plasma) 100 내지 1000 ㎕, 소변 100 내지 1000 ㎕, 뇌척수액(CSF) 100 내지 1000 ㎕, 또는 대변(Stool) 100 내지 1000 ㎕ 일 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고 타겟 물질이 포함되었는지 분석하고 싶은 물질이라면 어느 것이라도 가능하다. Swab Rod를 이용하여 채취된 시료는 샘플 튜브(Sample Tube)에 포함하고, 튜브 내의 시료 100 ㎕ 내지 3 ㎖ 를 증류수 100 내지 1000 ㎕ 또는 인산완층생리식염수(PBS) 100 내지 1000 ㎕에 희석하여 5 내지 60 초 간 보텍싱(vortexing)을 수행할 수 있다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 대상 시료의 준비 단계를 설명한 것이다.
도 17을 참조하면, 도 16을 참조하여 준비된 시료로부터 취한 1 내지 100 ㎕ 의 시료를 PCR 튜브에 첨가하고, 1 내지 15 분 동안 60 내지 100℃로 열을 가할 수 있으며, 이는 PCR 튜브에 첨가된 시료의 혼합, CRISPR-Cas 단백질의 활성화 및 리포터 물질의 절단을 촉진시키기 위한 단계로 PCR 을 수행하는 것과는 구별된다. 또한, 상기 분석 대상 시료의 준비 단계(heating process)는 선택적으로 수행될 수 있다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합된 시료 내에서의 타겟 물질의 디지털 검출을 위한 단계를 설명한 것이다.
도 18을 참조하면, 도 16 및 도 17을 참조하여 혼합된 시료 약 30 ㎕ 을 도 6 내지 도 8을 참조하여 상술한 디지털 검출용 카트리지에 주입할 수 있다. 혼합 시료가 주입된 디지털 검출용 카트리지는 디지털 PCR 시스템과 같은 디지털 검출 시스템을 이용하여 혼합 시료 내의 타겟 물질을 검출할 수 있다. 이 경우, 일반적인 CRISPR-Cas 단백질을 이용하는 타겟 물질의 검출 방법에 비하여 훨씬 적은 양의 시료로부터 타겟 물질을 실시간으로 검출할 수 있으며, PCR 을 이용하지 아니하므로 PCR 저해요인(inhibitor)에 의하여 영향을 받지 아니할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 검출 방법은 마이크로 웰 내에 싱글 카피의 타겟 물질이 포함되는 경우에도 검출이 가능한 높은 민감도를 가질 수 있다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 대상 시료를 준비하기 위한 장치를 나타내는 것이고, 도 20a 내지 도 20c는 상기 장치를 이용하여 진단 대상 시료를 준비하기 위한 방법을 나타내는 것이다.
도 19는 분석 대상 시료 준비 장치는 플런저(10), 벤트 홀(vent hole, 20), PCR 튜브(30a, 30b), 파라핀 플러그(Paraffin plug, 40), 바디부(50), 상부 커버(60), 및 마이크로 채널층(70)를 포함할 수 있다.
플런저(10)는 일단이 PCR 튜브 중 하나(30b)와 연결될 수 있으며, 플런저(10)의 실린더 측벽에는 벤트 홀(20)이 형성될 수 있다. 플런저(10)와 연결된 PCR 튜브(30b)는 마이크로 채널층(70)의 일단과 연결될 수 있다. 마이크로 채널층(70)은 미세유체가 이동할 수 있는 유체 통로일 수 있다. 상기 마이크로 채널층(70)의 내부에는 반응액(80)이 로딩될 수 있으며, 반응액(80)은 PCR 튜브(30a)에 포함된 시료와 반응할 수 있는 물질이면 어느 종류여도 무방하다.
마이크로 채널층(70)은 플런저(10)와 연결된 PCR 튜브(30b)와 일단이 연결되며, 타단은 파라핀 플러그(40)와 결합될 수 있다. 파라핀 플러그(40)는 플런저(10)와 연결되지 아니한 PCR 튜브(30a)와 결합될 수 있다. 플런저(10), PCR 튜브(30a, 30b), 및 파라핀 플러그(40)는 바디부(50)에서 서로 체결될 수 있다. 바디부(50)는 상부 커버(60)가 상측에 형성될 수 있다. 일 실시예에서, 마이크로 채널층(70)은 바디부(50)에 몰딩되어 형성되거나, 또는, 별도의 층으로 형성될 수 있다.
도 20a 내지 도 20c를 참조하면, 먼저 파라핀 플러그(40)와 연결된 PCR 튜브(30a)를 분리하고 채취한 시료를 PCR 튜브(30a)에 채운다(도 20a). 이후, 시료를 채운 PCR 튜브(30a)를 다시 바디부(50)에 결합시키고, PCR 튜브(30a)에 약 2분간 열을 가하면 PCR 튜브(30a) 내의 파라핀 플러그(40)의 파라핀이 녹을 수 있다(도 20b).
파라핀이 녹는 경우, 파라핀 플러그(40)는 유체의 통로로서 PCR 튜브(30a) 내의 시료를 이동시킬 수 있다. 플런지(10)의 피스톤을 잡아당기면 플런지(10) 내부에 진공에 의한 음압이 형성되며, 형성된 음압에 의하여 PCR 튜브(30a) 내의 시료가 파라핀 플러그(40)를 통해 마이크로 채널층(70)으로 이동하며, 마이크로 채널층(70) 내의 반응액(80)이 플런지(10)와 연결된 PCR 튜브(30b)로 흘러 들어간 후, 마이크로 채널층(70)으로 이동한 시료도 플런지(10)와 연결된 PCR 튜브(30b)로 흘러 들어갈 수 있다.
이 경우, PCR 튜브(30b)로 흘러 들어가는 시료 용액의 부피는 플런지(10)의 측벽에 형성되는 벤트 홀(20)의 위치에 의하여 제어될 수 있다. 이후, 시료 및 반응액이 포함된 PCR 튜브(30b)를 분리하여 PCR 반응을 수행할 수 있다. 그러나, 이와 같이 준비된 PCR 튜브(30b) 내의 분석 대상 시료는 PCR 반응이 아닌 타겟 물질의 검출을 위한 다양한 반응을 위하여 이용될 수 있다. 예를 들어, 마이크로 채널층(70)에 미리 로딩된 반응액(80)이 CRISPR-Cas 단백질 및 활성화된 CRISPR-Cas 단백질에 의하여 절단되는 형광 물질을 포함하는 리포터인 경우에는 PCR 튜브(30b)는 PCR 수행을 위해 이용되는 것이 아니라, 디지털 검출용 카트리지를 이용하여 실시간 디지털 검출을 수행할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명이 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

Claims (9)

  1. 분석 대상 시료에 타겟 물질에 특이적으로 결합하는 CRISPR-Cas 단백질 및 상기 CRISPR-Cas 단백질이 활성화되는지 여부를 확인할 수 있는 리포터를 혼합하는 단계;
    상기 혼합된 시료를 디지털 검출용 카트리지의 복수 개의 마이크로 웰을 포함하는 웰 어레이에 로딩하는 단계; 및
    상기 디지털 검출용 카트리지를 이용하여 상기 각 마이크로 웰 내의 리포터의 변화를 감지함으로써 상기 혼합된 시료 내의 상기 타겟 물질을 검출하는 단계를 포함하는 디지털 검출 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 CRISPR-Cas 단백질은 Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9) Prevotella 및 Francisella 1(Cpf1) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 디지털 검출 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 마이크로 웰들의 피치는 150um 미만인 것을 특징으로 하는 디지털 검출 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 디지털 검출용 카트리지가 리더시스템에 장착됨으로써 상기 혼합된 시료 내의 상기 타겟 유전자를 정량할 수 있는 것을 특징으로 하는 디지털 검출 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 리포터는 형광 물질을 포함하고, 상기 활성화된 CRISPR-Cas 단백질에 의하여 절단됨으로써 상기 형광 물질이 나타내는 것을 특징으로 하는 디지털 검출 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 타겟 유전자를 검출하는 단계는 각 웰에서 나타내는 형광을 실시간으로 측정하는 것을 특징으로 하는 디지털 검출 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 디지털 검출 방법은 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는 시료의 증폭 단계를 필요로 하지 않는 것을 특징으로 하는 디지털 검출 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 진단 대상 시료는 가열 없이 채취된 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계만을 수행하여 획득된 것을 특징으로 하는 디지털 검출 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 진단 대상 시료는 가열 및 핵산 추출단계를 수행하지 아니하고 채취된 샘플 자체인 것을 특징으로 하는 디지털 검출 방법.
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