KR20210141548A - 산란 현미경 검사 - Google Patents

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필립 쿠쿠라
산리 파에즈
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옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드
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Abstract

산란 현미경 장치는 표면을 포함하는 물체를 이미징하기 위해 현미경을 사용한다. 광원은 조명 광을 조사하고 광 검출기는 물체에서 탄성적으로 산란된 빛을 감지한다. 이미징하는 동안 물체의 전기 화학적 특성에 영향을 미치는 전위가 표면에 인가된다. 전위는 이미징을 개선하고 대상 및/또는 주변 환경의 특성화를 허용하는 대조 메커니즘을 제공한다.

Description

산란 현미경 검사
본 발명은 산란 현미경 검사(scattering microscopy)에 관한 것이다.
물체에 조명 광을 비추어 물체로부터 탄성적으로 산란된 광을 광 디텍터로 검출하는 산란 현미경 검사의 여러 종류가 알려져 있다. 산란 현미경 검사 검사법의 예는 (a) 간섭계 산란 현미경 검사(interferometric scattering microscopy, iSCAT)와 - 예를 들어 Kukura 외, "High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus", Nature Methods 2009 6:923-935; Ortega-Arroyo 외, " Interferometric scattering microscopy (iSCAT): new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy", Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14: 15625-15636; 및 Cole 외, "Label-Free Single-Molecule Imaging with Single-Molecule Imaging with Numerical-Aperture-Shaped Interferometric Scattering Microscopy”ACS Photonics 2017, 4, 2, 211-216에 개시됨-, (b) 암시야 산란 현미경(dark field scattering microscopy), - 예를 들어, review article Jing 외., "Nanoscale electrochemistry in the "dark-field", Current Opinion in Electrochemistry, Vol. 6, 1호, 2017년 12월, pp 10-16에 개시됨 -를 포함한다.
본 발명은 공지된 기술에 대한 개선에 관한 것이다. 본 발명의 제 1 양태에 따르면, 산란 현미경 검사를 수행하는 방법이 제공되며, 방법은 조명 광을 조사하도록 배치된 광원 및 광 디텍터를 구비하는 산란 현미경을 통해 표면을 갖는 물체를 이미징하는 단계를 포함하고, 상기 현미경은 상기 광 디텍터로 상기 물체로부터 탄성적으로 산란된 광을 검출하고, 상기 조명 광으로 상기 물체를 조사하도록 배치되고, 상기 방법은 상기 물체를 이미징하는 동안 상기 물체의 전기 화학적 특성에 영향을 미치는 전위를 표면에 인가하는 단계를 더 포함하고, 상기 물체는 상기 조명 광의 파장 및 인가된 상기 전위에서 플라즈몬 공명 주파수를 갖지 않도록 선택된다.
표면에 전위를 적용함으로써 물체의 산란 현미경 검사를 수행하는 동안 이점을 제공하는 방식으로 물체의 전기 화학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 전기 화학적 특성의 변화는 물체의 산란 대조(scattering contrast)에 영향을 미친다. 여기에서 이를 전위 역학적 대조(potentiodynamic contrast)라고 지칭한다. 이것은 물체의 특징이 더 명확하게 이미지화 될 수 있도록 하고 및/또는 물체의 특성화를 제공하는 대조 메커니즘을 제공한다. 예를 들어, 전위 역학적 대조는 표면에 있는 입자(particles)의 전기 화학적 상태를 시각화하기에 충분하다. 유사하게, 전기 화학적 특성의 변화는 국부적 지형(local topography) 및 재료 구성에 따라 달라지므로 전위 역학적 대조는 배경 스펙클(speckle)에서 인식할 수 없는 깊은 서브-파장(sub -wavelength)에 있는 입자 및/또는 표면 특징을 식별하는데 도움이 된다. 또한, 물체의 전기 화학적 상태 및/또는 물체 주변 환경이 특성화될 수 있다. 유사하게, 표면에 대한 입자들의 결합 속도를 제어하고 모니터링할 수 있다.
표면은 전기 이중 층(electric double layer, EDL)이 형성되는 표면일 수 있으며, 이 경우 표면에 인가된 전위는 예를 들어 재구조화(restructuring)를 야기함으로써 전기 이중 층의 전기 화학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 표면 전위를 변경함으로써, EDL의 구성(물리적 구조 및/또는 조성)이 변경된다. 즉, 표면 전위의 변화는 표면의 화학적 활성을 변화시켜 물체와 주변 환경의 구성 요소들(예: 분자 또는 이온) 간의 상호 작용을 변화시킨다. 이로 인해 탄성적으로 산란된 광의 양이 변경된다.
물체는 조사되는 광의 파장과 인가된 전위에서 공명 주파수에 대한 플라즘(plasm)을 갖지 않는다. 조사되는 광의 파장은 물체의 플라즈몬 주파수(plasmon frequency)가 아니다. 따라서 이 방법은 플라즈몬, 예를 들어 플라즈몬 나노 입자 또는 표면 플라즈몬을 사용하는 현미경 검사와 상당히 다른 작동 원리를 사용한다. 대조적으로, 본 방법은 전위 역학적 대조를 제공하기 위해 전기 화학적 특성의 변화를 사용하여 이미징을 제공한다. 실제로 물체가 플라즈몬 공명을 가지지 않기 때문에 물체 종류 및 연구될 수 있는 속성이 증가한다.
본 방법은 또한 예를 들어 다음과 같이 다른 현미경 검사 기술 및 분석에 비해 이점을 제공한다.
단일 입자 전기화학(single-particle electrochemistry)과 관련하여, 본 방법은 다른 광학 방법으로 검출하기에는 너무 작은 생체 분자를 식별하기 위한 간섭계 산란 현미경 검사의 성능을 제공한다.
순환 전압전류법(cyclic voltammetry)과 관련하여, 본 방법은 단일(나노스코픽) (앙상블 또는 확장된 표면 대신에) 엔티티에 대한 전위차 측정을 허용한다. 이 기능은 표면 불균일성의 모든 불리한 점을 줄이고 표면의 여러 인접한 위치에서 동시 측정을 허용한다. 전도성 원자력 현미경(atomic force microscopy)에 비해, 본 방법은 표면의 물체에 대한 평행(영상화) 측정을 허용하고 덜 침습적(less invasive)이다.
일 실시 예에서, 표면은 전도성 물질의 표면일 수 있다. 이 경우, 전도성 물질에 전위를 인가하여 표면에 전위를 인가할 수 있다. 일반적으로 전도성 물질은 조사되는 광의 파장에서 플라즈몬 공명 주파수를 피할 수 있는 금속이 아니다.
다른 예에서, 표면은 유전체 물질(dielectric material)의 표면이다. 이 실시 예에서, 유전체 물질을 통해 용량적으로(capacitively) 전위를 인가함으로써 전위가 표면에 인가될 수 있다.
일 실시 유형의 실험에서 표면 자체는 다른 어떤 것도 포함하지 않는 대상 없이 이미지화 될 수 있다. 이 경우 거칠기 및/또는 화학적 조성과 같은 표면 특성의 변화를 연구할 수 있다.
다른 유형의 실험에서, 물체는 표면 상에 적어도 하나의 입자를 추가로 포함할 수 있다. 인가된 전위에 의한 EDL의 재구조화에 의해 야기되는 전위 역학적 대조는 표면에 대한 입자의 대조를 향상시키고 표면 상의 입자의 전기 화학적 상태를 가시화하기에 충분하여 표면 상의 입자의 장기간 연속 측정을 가능하게 한다. 입자는 표면과 다른 전위차 반응을 가지므로 입자의 위치를 식별하고 서브-파장 정확도로 지속적으로 모니터링할 수 있다. 유사하게, 입자의 전기 화학적 상태 및/또는 입자 주변 환경의 전기 화학적 상태를 특성화하고 모니터링할 수 있다.
전위는 그에 의해 영향을 받는 물체의 전기 화학적 특성의 응답 기간 동안 일정한 진폭을 가질 수 있다.
대안적으로, 전위는 그에 의해 영향을 받는 물체의 전기 화학적 특성의 응답 기간보다 짧은 기간에 걸쳐 예를 들어 교번적으로 변화하는 진폭을 가질 수 있다.
표면에 여러 다른 전위가 적용될 수 있다. 이 경우, 각각의 전위와 관련하여 물체의 일부에서 탄성적으로 산란된 광의 검출은 예를 들어 프로파일의 유사성 정도를 결정함으로써 물체의 해당 부분 및/또는 주변 환경의 특성화를 허용하며, 예를 들어, 기준 프로파일을 사용하여 각각의 전위에 대해 물체의 일부에서 탄성적으로 산란된 광의 프로파일의 유사도를 결정한다. 일반적으로 대조의 전위 역학적 응답(인가된 전위 및 히스테리시스의 함수로서의 대조의 변화)은 비선형적이며, 이는 물체(예: 표면 또는 표면의 물체) 및/또는 주변 환경을 특성화 하는데 사용된다.
이 방법은 광 디텍터에 의해 검출된 신호가 물체로부터 탄성적으로 산란된 광의 진폭에 민감하도록 배치된 모든 현미경, 예를 들어 전반사 산란 현미경(total internal reflection scattering microscope), 간섭계 산란 현미경(interferometric scattering microscope) 또는 암시야 산란 현미경(dark field scattering microscope)에 적용될 수 있다.
현미경은 물체의 2차원 이미지를 출력할 수 있다.
광은 자외선, 가시광선 또는 적외선일 수 있다.
본 발명의 제 2 양상에 따르면, 현미경 검사 장치(microscopy arrangement)가 제공되고, 이는 표면을 갖는 물체; 조명 광을 조사하도록 배치된 광원 및 광 디텍터를 구비하는 현미경 -상기 현미경은 상기 광 디텍터로 상기 물체로부터 탄성적으로 산란된 광을 검출하고, 상기 조명 광으로 상기 물체를 조사하도록 배치되고, 상기 물체는 상기 조명 광의 파장에서 플라즈몬 공명 주파수를 갖지 않도록 선택됨 -; 및 상기 물체의 전기 화학적 특성에 영향을 미치는 전위를 표면에 인가하도록 배치되는 전압 소스를 포함한다.
이 현미경 장치는 상기 방법에 따라 작동하며 유사한 이점을 제공한다.
더 나은 이해를 위해, 본 발명의 실시 예는 첨부된 도면을 참조하여 비 제한적인 예로서 설명될 것이다.
도 l은 내부 전반사 산란 현미경의 도면이다.
도 2는 간섭계 산란 현미경의 도면이다.
도 3은 제 1 유형의 물체의 개략도이다.
도 4는 제 2 유형의 물체의 개략도이다.
도 5는 인듐 주석 산화물(ITO) 표면의 산란 이미지이다.
도 6은 원자력 현미경(AFM)로 측정한 ITO의 표면 프로파일이다.
도 7은 도 5의 확대된 버전이다.
도 8은 인가된 전위가 삼각파형으로 변화하는 단일 지점의 산란 강도 그래프이다.
도 9는 도 6의 선을 따라 AFM으로 측정한 표면 프로파일이다.
도 10 내지 13은 각각 상이한 용액에 노출된 단일 지점에서 ITO의 표면으로부터 탄성적으로 산란된 인가 전위 및 검출된 광의 시간 플롯 및 산점도(scatter plot)이며, 시간 플롯은 시간(s)에 대한 인가 전압 V(볼트)의 플롯이고, 산점도는 인가된 전압(V)에 대한 상대적인 미분 강도(dl/I)의 플롯이다.
도 14는 평균 강도의 로그를 플로팅한 ITO 표면의 TiO2 입자의 산란 현미경 검사 이미지이다.
도 15는 전위 역학적 대조를 나타내기 위해 처리된 도 14의 이미지이다.
도 16 및 17은 각각 TiO2 입자 및 ITO 표면으로부터 각각 탄성 산란된 인가된 전위 및 검출된 광의 시간 플롯 및 산점도이다.
도 1은 내부 전반사(total internal reflection, TIR) 산란 현미경(20)을 포함하는 제 1 현미경 장치(10, first microscopy arrangement)를 나타내고, 도 2는 본 기술이 적용될 수 있는 간섭계 산란(iSCAT) 현미경(40)을 포함하는 제 2 현미경 장치(20, second microscopy arrangement)를 나타내며, 이들은 본 기술이 적용될 수 있는 현미경 장치의 예시들이다. 제 1 및 제 2 현미경 장치들(10, 20) 각각은 이하에서 후술되는 물체(50)를 더 포함하고, 두 경우에서 모두 동일하다.
iSCAT 현미경은 출력 광을 필터링하도록 배치된 공간 필터(spatial filter)를 추가로 포함할 수 있으며, 공간 필터는 출력 광을 통과시키도록 배치되지만 더 큰 개구수(numerical apertures, NA)에서 미리 결정된 개구수에서 보다 더 큰 강도 감소(reduction in intensity)를 갖는다. 나노 크기의 물체에서 산란되는 대부분의 광은 높은 개구수에서 산란되므로 나노 물체에서 산란되는 광의 세기를 줄이지 않고도 낮은 NA 광의 세기를 줄일 수 있다. 반사광의 강도를 줄이면서 산란광을 상대적으로 약화시키지 않으면 대조와 감도가 향상되어 이미지가 향상된다.
TIR 산란 현미경(20) 및 iSCAT 현미경(40)은 각각 물체(50)를 이미징하는 데 사용되며 공통으로 광원(30), 대물 렌즈(31) 및 광 디텍터(32)를 포함한다. 각각의 경우에, 광원(30)은 조명 광(illuminating light)을 조사하고 광 디텍터(32)는 물체(50)로부터 탄성적으로 산란된 광을 검출한다.
일반적으로, 여기에 설명된 모든 기술에서 조명 광은 가시광선(400nm 내지 700nm 사이의 파장 범위), 자외선(400nm 미만에서 10nm의 하한까지의 파장 범위) 또는 적외선(700nm 이상에서 1mm의 상한까지의 파장 범위)일 수 있다.
TIR 산란 현미경(20) 및 iSCAT 현미경(40)은 광-시야 모드(wide-field mode)에서 작동할 수 있으며, 이 경우 광 디텍터(32)는 물체(50)의 2차원 이미지를 캡처하는 이미지 센서, 예를 들어 CMOS(상보성 금속산화물 반도체) 이미지 센서일 수 있다. 반대로, TIR 산란 현미경(20) 및 iSCAT 현미경(40)은 공초점 모드에서 작동하도록 구성될 수 있으며, 이 경우 광 디텍터(32)는 단순한 광 다이오드일 수 있다. 이 경우, 물체(50)를 스캐닝하여 물체(50)의 2차원 영상을 획득할 수 있다.
TIR 산란 현미경(20) 및 iSCAT 현미경(40)은 각각 조명 광으로 물체(50)를 조명하고 탄성적으로 산란된 광을 광 디텍터(32)로 지향시키도록 배치된다.
TIR 산란 현미경(20)과 iSCAT현미경(40)은 광 디텍터(32)에서 검출된 신호가 물체(50)에서 탄성적으로 산란되는 광의 진폭에 민감하도록 구성되지만 이를 달성하기 위해 다음과 같이 서로 다른 구성을 갖는다.
도 1에 도시된 TIR 산란 현미경(20)은 다음과 같이 배치된 유형의 암시야 산란 현미경(dark field scattering microscope)이다.
이 경우, 광원(30)은 대물렌즈(31)의 광축(O)에 수직인 조명 광을 방출한다. 제 1 반사 표면(21)은 광축(O)에 평행하지만 그로부터 오프셋된 대물 렌즈(31)를 통해 광원(30)으로부터의 조명 광을 편향시킨다. 따라서, 대물 렌즈는 임계축보다 큰 입사각으로 물체(50)에 조명 광을 지향시키고, 그에 따라 광은 대응하는 반사 각도에서 TIR에 의해 물체(50)로부터 반사된다.
반사광은 대물렌즈(50)를 다시 통과하여 광축(O)에 평행하게 방출되지만 그로부터 오프셋된다. 이와 같이 조명 광과 반사광은 광축(O)을 따라 대물렌즈(31)를 통과하지 못한다.
제 2 반사 표면(22)은 초점 안정화를 위한 위치 감지 장치(PSD, position sensitive device)로 사용되는 사분면 포토다이오드(QPD, quadrant photodiode)(23) 상으로 광축(O)으로부터 수직으로 반사광을 편향시킨다.
TIR 산란 현미경(20)에서, 광 디텍터(32)는 광축(O)을 따라 정렬된다. 그 결과, 광 디텍터(32)는 물체(50)로부터 탄성적으로 산란된 광을 전달받지만, 광축(O)을 따라 대물렌즈(31)를 통과하지 못한 반사광은 전달받지 않는다. 따라서, TIR 산란 현미경(20)의 구성은, 암시야 모드에서 광 디텍터(32)가 탄성 산란된 광의 진폭에 민감한 신호로 물체(50)로부터 탄성적으로 산란된 광을 검출하도록 한다.
TIR 산란 현미경(20)은 암시야 산란 현미경 검사의 예시로서 설명되지만, 여기에 설명된 기술은 예를 들어, review article Jing et al, "Nanoscale electrochemistry in the “dark-field”Current Opinion in Electrochemistry, vol, 6, Issue 1, December 2017, pp.10-16."에 개시된 바와 같이 임의의 암시야 산란 현미경 검사로 수행될 수 있다.
도 2에 도시된 iSCAT 현미경(40)은 다음과 같이 배치된다.
이 경우, 광원(30)은 대물렌즈(31)의 광축(O)에 수직인 조명 광을 빔 스플리터(41)에 조사하는 레이저와 같은 간섭성 광원(coherent source)이다. 이 예시에서, 빔 스플리터(41)는 금속 또는 유전체(dielectric)일 수 있는 반사 필름(43)이 제공된 플레이트(42)이며, 빔 스플리터(41)는 그 사이의 계면에서 부분적으로 반사되는 필름을 갖는 정합된 프리즘 쌍에 의해 형성된 큐브 빔 스플리터와 같은 다른 형태를 가질 수 있다는 점을 밝혀둔다.
광원(30)과 빔 스플리터(41) 사이에는 조명 광을 집광하기 위한 집광 렌즈(42, condenser lens)가 구비된다.
빔 스플리터(41)는 광축(O)을 따라 대물 렌즈(31)로 조명 광을 편향시키도록 배치된다. 그 다음 대물 렌즈(31)는 조명 광을 물체(50)에 집속시킨다.
대물 렌즈(31)는 또한 물체로부터 출력된 광을 수집하고 그것을 빔 스플리터(41)를 통해 튜브 렌즈(43) 및 선택적으로 한 쌍의 망원경 렌즈를 통해 광 디텍터(32)로 향하게 하여 출력 광을 광 디텍터(32)에 초점을 맞춘다. 출력 광은 (a)물체(50)로부터 반사된 광 및 (b)물체(50)로부터 탄성적으로 산란된 광을 모두 포함한다. 그 결과, 탄성적으로 산란된 광은 반사된 광과 보강 간섭하므로, 광 디텍터(32)에 의해 검출된 신호는 물체(50)로부터 탄성적으로 산란된 광의 진폭에 민감해진다.
iSCAT 현미경(40)이 예시로서 설명되어 있지만, 여기에 설명된 기술은 다음에 개시되는 바와 같이 임의의 iSCAT 현미경으로 수행할 수 있다. -예를 들어 Kukura 외, "High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus", Nature Methods 2009 6:923-935; Ortega-Arroyo 외, "Interferometric scattering microscopy (iSCAT): new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy", Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14: 15625-15636; 및 Cole 외, "Label-Free Single-Molecule Imaging with Single-Molecule Imaging with Numerical-Aperture-Shaped Interferometric Scattering Microscopy”ACS Photonics 2017, 4, 2, 211-216의 개시-
TIR 산란 현미경(20) 및 iSCAT 현미경(40)이 예시 로서 제공되지만, 여기에 설명된 기술은 다른 형태의 산란 현미경을 통해 수행될 수 있다는 점을 밝혀둔다.
이제 물체(50)가 설명될 것이다. 물체(50)의 두 가지 대안적인 형태가 도 3 및 4에 도시되어 있다. 모든 경우에, 물체(50)는 전위가 인가될 표면(51)을 포함한다. 전위는 또한 상대 전극(54, counter electrode)에 연결된 전압 소스(53)에 의해 인가된다.
유체(52)는 표면(51) 주변의 환경에 제공될 수 있다. 유체(52)는 수용액(aqueous solution)일 수 있는 용액일 수 있다. 유체(52)는 용해된 이온(dissolved ions)을 포함할 수 있다.
도 3에 도시된 형태에서, 물체(50)는 전도성 재료로 만들어진 전도성 층(60, conductive layer)을 포함하고, 표면(51)은 그 전도성 층(60)의 표면이다.
이 경우, 전위는 전압 소스(53)가 연결된 전도성 층(60)에 인가되어 표면(51)에 직접 인가된다. 전도성 층(60)의 전도성 재료는 임의의 적합한 재료, 예를 들어 인듐 주석 산화물(ITO, Indium Tin Oxide)일 수 있다. 전도성 층(60)은 특히 금, 그래핀, ITO, 은, 백금 및 산화 그래핀과 같이 광학 이미징에 일반적으로 사용되는 임의의 재료로 제조될 수 있다. 이상적으로, 아래에서 논의되는 바와 같이 플라즈몬의 형성을 피하기 위해, 전도성 층(60)의 전도성 재료는 금속이 아닐 수 있다. 전도성 층은 그 플라즈몬 주파수가 조명 광의 파장이 아니도록 구성된다. 이것은 재료 선택을 통하거나 특정 기하학적 구조를 통해서일 수 있다. 대안적으로, 조명 주파수는 물체(50) 또는 전도성 층의 플라즈몬 주파수가 아니도록 선택된다.
도 4에 도시된 형태에서, 물체(50)는 유전체 재료의 유전체 층(70, dielectric layer)을 포함하고, 표면(51)은 그 유전체 층(70)의 표면이다. 유전체 층(70)은 도전성 물질로 이루어진 전극 층(71, electrode layer) 상에 배치된다. 전극 층(71)의 전도성 재료는 임의의 적절한 재료, 예를 들어 ITO(Indium Tin Oxide)일 수 있다. 이상적으로, 전극 층(71)의 전도성 재료는 아래에서 논의되는 바와 같이 플라즈몬의 형성을 피하기 위해서, 금속이 아니다.
이 경우, 전압 소스(53)이 연결된 전극 층(71)에 전위가 인가되어 표면(51)에 용량적으로 인가된다.
도 3 및 도 4는 물체(50)의 예를 도시하지만, 보다 일반적으로, 여기에 개시된 기술은 전위가 적용될 수 있는 표면(51)을 포함하는 임의의 형태를 갖는 물체(50)에 적용될 수 있다. 몇 가지 다른 예시들은 다음과 같다.
표면(51)은 고체, 액체 또는 기체인 물질의 표면일 수 있다. 한 유형의 물체(50)에서, 표면(51)은 재료 층의 표면일 수 있다. 물질은 고체, 액체 또는 기체일 수 있다.
다른 유형의 물체(50)에서 표면(51)은 3차원 형상의 구조의 표면일 수 있다. 일 실시 예에서, 상기 구조는 액적(liquid droplet)일 수 있고, 이 경우 표면은 액체의 표면 또는 액체 주위의 계면활성제의 표면일 수 있다. 다른 예에서, 상기 구조는 기포(gas bubble)일 수 있고, 이 경우 표면은 기체의 표면 또는 기체 주위의 계면활성제의 표면일 수 있다.
상대 전극(54)은 도 3 및 4에 개략적으로 도시되어 있지만, 예를 들어 물체(50)에 인접하게 배치된 별도의 요소이거나 표면(51)이 형성되는 구조로 통합되는 임의의 적합한 형태를 취할 수 있다. 물체(50)는 예를 들어 도 3 및 도 4에 개략적으로 도시된 바와 같이 표면(51) 상의 적어도 하나의 입자(55, particle)를 더 포함할 수 있다. 본 기술은 예를 들어 표면(50)을 이미지화하거나 특성화하기 위해 또는 주변을 특성화하기 위해 표면(51)에만 동일하게 적용될 수 있기 때문에, 표면(51)과 함께 물체(50)의 일부로서 입자(55)의 존재는 필수적인 것은 아니라는 점을 밝혀둔다.
입자(55)는 일반적으로 표면(51)과 상이한 산란 효과를 가지며, 입자(55)와 표면(51) 사이에 대조를 제공하여 입자(55)가 2차원 이미지에서 식별되도록 한다. 또한, 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 전위의 인가는 입자(55)와 표면(51) 사이의 대조를 증가시키는 전위 역학적 대조를 제공한다. 아래에서 또한 논의되는 바와 같이, 전위의 적용은 또한 입자(55)가 입자(55)로부터의 신호 연구에 의해 특성화될 수 있게 한다.
입자(55)는 일반적으로 조명 광에 대해 산란 단면(scattering cross- section)을 갖는 임의의 유형의 입자일 수 있다. 일부 비제한적인 예는 다음과 같다.
입자(55)는 유전체 입자일 수 있다.
입자(55)는 단백질 또는 단백질의 집합체일 수 있다.
입자(55)는 금속 입자일 수 있다.
입자(55)는 RNA(리보핵산) 또는 DNA(데옥시리보핵산)와 같은 핵산 분자, 또는 인공 핵산 분자, 또는 이들의 임의의 응집체일 수 있다.
입자(55)는 폴리펩타이드(polypeptide), 당폴리펩타이드(glycopolypeptide) 또는 당단백질(glycoprotein), 리포폴리펩타이드(lipopolypeptide) 또는 지방 단백질(lipoprotein) 또는 이들의 임의의 응집체일 수 있다.
입자(55)는 지질(lipid), 프로테오글리칸(proteoglycan), 또는 당 중합체(sugar polymer)일 수 있다.
입자(55)는 임의의 바이오폴리머(biopolymer)일 수 있다.
입자(55)는 본원에 열거된 상이한 입자의 응집체, 예를 들어 단백질과 핵산의 응집체, 당단백질(예를 들어, 항체) 및 단백질 또는 폴리펩티드의 응집체일 수 있다.
입자(55)는 자연 유래(naturally derived)의, 인공 또는 천연과 인공의 하이브리드일 수 있다.
입자(55)는 무기 입자(inorganic particle) 또는 무기 응집체(inorganic aggregate)일 수 있다. 이러한 입자는 생명체로 구성되거나 생명체에서 유래되지 않을 수 있다.
입자(55)는 임의의 나노물질(nanomaterials), 특히 공학적 나노물질(engineered nanomaterials)일 수 있다. 많은 바이오폴리머가 자연적으로 대전되기 때문에 입자(55)는 대전된 입자일 수 있다. 예를 들어 천연 핵산은 인산 골격(phosphate backbone)으로 인해 전하를 띠고 있다.
통상적으로, 입자(55)는 조명 광에 대한 산란 단면적(scattering cross section)이 10-17 m2 이하, 및/또는 조명 광에 대한 산란 단면적이 10-26 m2 이상일 수 있다. 산란 단면적(scattering cross section)은 측정에 사용된 기술과 관계없이 특정 파장의 입사 광에 대한 물체의 유효 크기와 관련된 측정 가능한 기본 속성에 해당한다. 산란 단면(scattering cross section)은 예를 들어 암시야 현미경으로 측정할 수 있다.
입자(55)는 10kDa 이상의 질량을 가질 수 있다.
일부 적용에서, 입자(55)는 5000 kDa 이하의 질량을 가질 수 있다.
전형적으로, 본 발명은 10kDa 이상의 질량을 갖는 입자(55), 예를 들어 10kDa 내지 5000kDa 범위 내의 질량을 갖는 물체에 적용될 수 있다.
그러나, 입자(55)는 더 클 수 있고 일반적으로 시야 내에 맞는 임의의 입자(또는 입자의 일부)일 수 있다. 이러한 더 큰 입자는 위에서 논의한 유형의 선형 바이오폴리머(linear biopolymers)로 구성될 수 있다. 5000 kDa 이상의 질량을 가질 수 있는 비교적 큰 입자의 예로는 피브릴(fibrils), 섬유(fibres) 또는 실린더(cylinders)가 있다. 더 큰 입자는 생물학적으로 파생될 수 있다. 예를 들어 피브릴은 거의 모든 살아있는 유기체에서 발견되는 구조적 생물학적 물질이다. 피브릴을 포함할 수 있는 예시적인 더 큰 입자는 콜라겐, 액틴, 미오신, 엘라스틴, 케라틴, 레실린, 스파이더(spider) 또는 곤충 실크, 셀룰로스, 아밀로스 또는 목재를 포함한다. 섬유는 식물성 조직, 광물성 물질 또는 직물을 형성하는 실 또는 필라멘트로 설명될 수 있다. 섬유는 또한 인간이나 동물의 신체에서 근육, 신경계, 결합 또는 기타 조직의 일부를 형성하는 구조이다. 예시적인 생물학적 또는 인공적인 더 큰 입자의 다른 유형은 단백질 필라멘트(protein filaments), 단백질 케이지(protein cages), 단백질 응집체(protein aggregates) 및 단백질 채널(protein channels), 예를 들어, 막 채널(membrane channels)을 포함한다. 큰 핵산 종이접기 구조(nucleic acid origami structures)는 또한 더 큰 입자로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 큰 입자는 탄소 기반 나노입자(예를 들어, 막대, 튜브, 구, 플러린(fullerenes))와 같은 무기물일 수 있다. 유사하게, 물체(50)는 입자 사슬(chain of particles)을 포함할 수 있다. 따라서 "입자(particle)"라는 용어는 구형과 같은 특정 모양을 의미하지 않으며 표면(51)에 있는 임의의 개체를 나타낼 수 있다.
인가된 전위 하에서 물체(50)의 전기 화학적 특성의 변화에 의해 제공되는 전위 역학적 대조가 이제 설명될 것이다.
표면(51)에 인가된 전위는 물체의 전기 화학적 특성에 영향을 미친다. 주요 실시 예에서, 표면(51)은 전기 이중 층(EDL, electric double layer)이 형성되는 표면이다. 이 경우, 표면(51)에 인가된 전위는 EDL의 전기 화학적 특성에 영향을 미친다. 액체 내부의 나노구조의 대전된 표면 주위에 형성된 EDL은 광학 산란 강도(optical scattering strength)에 영향을 미친다. EDL의 형성은 거의 모든 동전기적 과정(electrokinetic processes)의 중심 요소이다. 예를 들어, 배터리의 에너지 저장, 분자의 용매, 막의 여과 과정, 액체 환경에서의 대부분의 수송에 대한 설명은 EDL을 고려해야 한다.
EDL은 예를 들어 도 3 및 4에 개략적으로 도시된 바와 같이 표면(51)에 형성되는 전하의 제 1 및 제 2 층(56, 57)을 포함한다. 제 1 층(56)은 표면 상에 직접 형성되고 화학적 상호작용으로 인해 표면(51) 상에 흡착된 이온을 포함한다. 제 1 층(56)은 양 또는 음일 수 있는 표면 전하를 제공한다. 제 2 층(57)은 제 1 층(56) 상에 형성되고 쿨롱 힘(Coulomb force)을 통해 제 1 층(56)의 표면 전하에 끌리는 이온을 포함한다. 따라서, 제 2 층(57)은 제 1 층(55)을 전기적으로 차단한다. 그러나, 제 2 층(57)은 제 1 층(56)보다 표면(51)과 더 느슨하게 결합되는데, 그 이유는 쿨롱 힘이 제 1 층(56)을 유지하는 화학적 상호작용보다 약하기 때문이다. 제 2 층(57)의 이온은 제 1 층(56)의 전기적 인력 및 열 여기(thermal excitation)의 영향으로 표면(51)에 인접한 유체(52) 내에서 이동하는 자유 이온이며, 때때로 "확산 층(diffuse layer)"으로 지칭된다.
EDL의 두께는 일반적으로 인접한 유체(52)의 이온 강도에 따라 1 나노미터에서 수십 나노미터까지 다양할 수 있다.
EDL의 형성은 여러 시간 척도를 포함하며, 가장 빠른 것은 분자 확산 시간 척도(molecular diffusion timescale), D/λ D 2 여기서 D는 확산 상수이고 λD는 Debye 길이이며 EDL의 두께를 측정한 것이다. EDL의 형성과 관련된 적은 양과 빠른 시간 척도로 인해 로컬 역학에 직접 액세스할 수 있어서 실험적인 도전 과제가 된다. 스캐닝 프로브 방법 또는 울트라미 크로엘 엑트로드(ultrami croel ectrodes)를 사용하여 고주파에서 국부 전류를 측정함으로써 이 영역에서의 많은 관찰이 얻어졌다.
전위의 인가는 EDL의 구성을 변경함으로써 물체(50)의 전기 화학적 특성에 영향을 미친다. 특히 EDL의 물리적 구조 및/또는 조성(composition)이 변경될 수 있다. EDL 구성의 이러한 변경은 감지되는 산란 신호의 변화을 초래한다. 즉, 표면 전위의 변화는 표면의 화학적 활성을 변화시켜 물체와 주변 환경의 구성 요소(예: 분자 또는 이온) 간의 상호 작용을 변화시킨다. 이것은 탄성적으로 산란된 광의 양의 변화를 초래하여 물체의 산란 대조에 영향을 미치며, 이를 전위 역학적 대조(potentiodynamic contrast)라 한다. 이것은 다양한 방법으로 활용될 수 있는 현미경에 대한 대조 메커니즘을 제공한다.
실제로, EDL의 광학 대조를 시각화하면 공간 이송(spatial transport)을 연구하고 광학 현미경의 성능을 전기화학 분석과 결합하기 위한 광-시야(wide field) 측정에 직접 액세스할 수 있다. EDL의 형성으로 인한 표면의 광 반사 변화는 수십 년 동안 지속되어 왔지만, 나노 입자로부터의 탄성 광 산란(elastic light scattering)에 대한 영향은 매우 작다.
일부 응용에서, 전위 역학적 대조는 예를 들어 표면(51) 자체의 표면 특징, 예를 들어 구조적 특징 및/또는 화학적 조성의 특징 및/또는 존재할 수 있는 임의의 입자(55)를 이미지화하기 위해 물체의 특징이 보다 명확하게 이미지화될 수 있도록 하는 대조 메커니즘으로 사용된다. 유사하게, 전기 화학적 특성의 변화는 국부적 지형 및 재료 조성에 따라 달라지므로 전위 역학적 대조는 배경 스펙클(background speckle)에서 인식할 수 없는 깊은 서브 파장(sub -wavelength) 산란체인 표면 특징 및/또는 입자를 식별하는 데에도 유용하다.
전위 역학적 대조의 원리는 다음과 같이 고려된다.
첫째, 예상 전위 역학적 대조의 추정치(estimate of the expected potentiodynamic contrast)는 전도성 나노구(conducting nanosphere)의 표면 전위의 함수로 파생된다. 우리는 주로 EDL에 관심이 있기 때문에, 여기서는 입자 외부의 이온의 재구조화(reconfiguration)으로 인한 변화를 고려한다. 입자 내부의 전하 주입으로 인한 분극성 변화(Change of the polarizability)도 이전에 플라즈몬 나노입자에서 관찰된 바와 같이 발생할 수 있지만, ITO와 같은 유전체 입자 및 반도체에는 훨씬 덜 영향을 미칠 것으로 예상된다. EDL의 광학적 대조는 조사하는 광의 주파수로부터 먼 플라즈몬 공명 주파수를 갖는 금속 산란 입자 또는 유전체인 입자를 연구하는 데 사용할 수 있다. EDL의 매우 단순화된 모델은 입자 표면에 반대 전하를 갖는 스크리닝 이온이 λS << a 두께의 층에 균일하게 분포되어 있다고 가정한다. 여기서 a는 나노구 반경(nanosphere radius)이다. 이 모델은 전하 스크리닝이 주로 줄기 층(stem layer)으로 인해 특성 전위 k B T/e ≒ 25 mV 보다 훨씬 큰 표면 전위에 대한 물리적 조건에 적합하다.(여기서 k B 는 볼츠만 상수, T는 온도, e는 전자의 전하)
확산 층(diffuse layer)도 포함하는 EDL의 보다 현실적인 모델을 고려하면 광학 대조의 스케일링 동작이 변경되지 않으므로 현재 추정(current estimation)에 필요하지 않다.
전위 V에서 나노구(nanosphere)를 스크리닝하는 데 필요한 초과 반대 이온(excess counter ions) N의 총 수는 Vea/ k B T λB를 통해 얻어지며, 여기서 lb는 Bjerrum 길이이다. Rayleigh 산란 체제(scattering regime)에서 나노구와 EDL이 결합된 시스템의 분극성은 구성 요소의 체적 합(volumetric sum)이다. Rayleigh polarizability와 굴절률과 염 농도 사이의 현상학적 관계를 사용하여, n mix = n solvent + Kx S, 여기서 x S는 소금 이온과 용매 분자의 개수 밀도(number density ) 사이의 비율이고, 입자 αP의 산란에 대한 EDL의 산란 αEDL의 비율에 대한 최종 스케일링 경과는 다음과 같이 나타난다.
αEDL /αP = C(Ve/ k B T )/(4πa 2 λB ρ w )
여기서 ρ w 는 물 분자의 개수 밀도이고(수용액으로 고려), C는 전인자(prefactor)이다. 일반적인 유전체 물질과 알칼리 할로겐 염(alkali-halogen salt)의 경우, 전인자(C)는 1차이다.
물에 대해 ρ w = 55 nm-3 및 λB = 0.7 nm 를 사용하면 V = 1 볼트의 표면 전위에서 NaCl 염 용액의 10 nm(직경) 이산화티타늄 입자에 대해 αEDL/αp = 0.008이 된다. 이 작은 비율은 그러한 변화가 간섭계 방법으로만 측정될 수 있음을 암시한다.
이 결과는 인가된 전위(V) 및 입자 크기의 감소(즉, 나노구 반경의 제곱에 반비례)에 따라 증가하는 대조 메커니즘의 존재를 나타낸다.
반지름이 r인 실린더에 대해 유사한 추정을 반복하면 다음과 같이 나타낼수 있다.
αEDL /αP = C' (Ve/ k B T )/(4πr λS λB ρ w )
여기서 s는 전하 중화(charge neutralization)가 발생하는 EDL의 특성 두께이다.
이 결과 역시, 인가된 전위(V) 및 실린더 크기 감소(즉, 나노구 반경의 제곱에 반비례)에 따라 증가하는 대조 메커니즘의 존재를 나타낸다. 또한 전위 역학적 대조가 표면의 나노 입자보다 융기 부분(ridges)에서 더 쉽게 관찰될 수 있음을 보여준다.
이러한 결과는 구체적으로 구와 실린더에 관련이 있지만,
전위 역학적 대조는 표면(51)의 만곡된 특징 또는 표면(51) 상의 입자(55)의 임의의 형상에 의해 유사하게 제공될 수 있다. 이는 그러한 만곡된 특징 또는 입자(55)의 직접적인 시각화를 제공한다. 따라서, 본 기술은 표면(51) 및 선택적으로 입자(55)를 포함하는 물체의 광 시야 이미징(wide-field imaging)을 제공하기 위해 적용될 수 있다. 이를 통해 다양한 시스템의 전기 화학적 특성을 연구할 수 있다.
위의 분석은 표면(51) 및 표면(51) 상의 입자(55)의 구조적 특징에 대한 대조 메커니즘을 설명하지만, 인가된 전위에 의해 영향을 받는 표면(51)의 화학적 조성의 변화에 대해서도 대조 메커니즘이 유사하게 적용될 수 있다.
이전에 인가된 전위는 표면 플라즈몬(surface plasmons) 또는 플라즈몬 입자(plasmonic particles)를 포함하는 플라즈몬 공명 현미경(plasmonic resonance microscopy)에 사용되었으며, 조명 광에 의해 접근 가능한 플라즈몬 공명을 갖는 표면 및 입자에 제한이 있지만 입자 연구를 위해 사용되어 왔다. 그러나, 본 기술은 플라즈몬의 공명이 생성되지 않는 상당히 다른 작동 원리를 사용한다. 대신에, 본 기술은 전기 화학적 특성의 변화를 사용하여 전술한 바와 같은 전위 역학적 대조를 제공한다.
따라서, 모든 예에서, 물체(50)(표면(51) 및 입자(55)가 존재하는 경우 포함)는 조명 광의 파장 및 인가된 전위에서 플라즈몬 공명 주파수를 갖지 않도록 선택된다. 이것은 전기 화학적 특성의 변화에 의해 영향을 받는 탄성적으로 산란된 광으로부터 원하는 신호를 가려내는 신호를 야기하는 플라즈몬 공명을 방지한다.
다른 응용에서, 전위 역학적 대조는 물체(50) 및/또는 물체(50) 주면 환경의 특성화를 제공하는 데 사용된다. EDL의 재구조화에 의해 야기된 전위 역학적 대조는 표면(51) 및 그 환경에 의해 영향을 받는 표면(51)의 전기 화학적 상태를 특성화하기에 충분하고, 이는 이는 표면(51) 및 그 환경에 의해 영향을 받고, 유사하게 표면(51) 상의 입자(55)의 전기 화학적 상태를 특성화하기에 충분하다. 현재 기술은 초고속 및 장기간의 광학 측정에 이용가능한 시간 척도에서 EDL의 역학에 대한 직접 액세스(direct access)를 제공한다. 표면을 가로지르는 이온 수송 및 기타 전기 화학적 활동의 광시야 영상은, 모니터링과 전기 화학적 현미경 경관의 피드백 제어 생성을 제공하는 데 사용할 수 있다.
표면(51)의 전기 화학적 상태를 변경함으로써, 표면(51)에 대한 입자(55)의 결합 속도(rate of binding)가 제어되고 모니터링될 수 있다. 표면 전위를 제어하여 측정 평면이 너무 빨리 붐비는 것을 방지하기 위해 속도를 낮추거나 측정 프로세스의 속도를 높이기 위해 속도를 높일 수 있다. 표면 전위의 함수로서 흡착 속도(adsorption rate)의 예상(chance)은 흡착제(adsorbents)의 특성을 나타내는 중요한 지표이기도 한다.
인가된 전위의 특성에 따라 다양한 전기 화학적 특성을 연구할 수 있다.
일부 응용에서, 인가된 전위는 그에 의해 영향을 받는 물체(50)의 전기 화학적 특성의 응답 기간에 걸쳐 일정한 진폭을 갖는다. 이것은 물체(50)의 정전기적 전기 화학적(static electrochemical) 특성에 의존하는 신호를 제공한다.
다른 응용에서, 인가된 전위는 그에 의해 영향을 받는 물체(50)의 전기 화학적 특성의 응답 기간보다 짧은 기간에 걸쳐 변화하는 진폭을 갖는다. 예를 들어, 인가된 전위의 진폭은 영향을 받는 물체의 전기 화학적 특성의 응답 주기보다 짧은 주기에 걸쳐 교번하는 진폭을 가지거나 단계적 변화를 겪는 진폭을 가질 수 있다. 이것은 물체(50)의 동적 전기 화학적(dynamic electrochemical) 특성에 의존하는 신호를 제공한다.
다른 전위에서 전기 화학적 특성이 연구될 수 있다.
예를 들어, 복수의 다른 전위가 표면에 적용될 수 있다. 이 경우, 물체의 일부로부터 탄성적으로 산란된 광은 물체의 부분 및/또는 주변 환경의 특성화에 따른 각각의 전위에 대해 각각 검출된다. 각 전위에 대한 물체의 일부에서 탄성적으로 산란된 광의 프로파일의 유사도는 기준 프로파일로 비교될 수 있다.
전위 역학적 대조를 나타내는 실험 결과는 다음과 같이 얻어졌다.
물체(50)는 도 3에 도시된 유형이고, 유리 슬라이드 상에 두께 50 nm의 코팅으로서 제공되고 전위가 인가된 인듐 주석 산화물(ITO)의 전도층(60)의 표면(51)을 포함한다.
물체(50)의 현미경 검사는 도 1에 도시된 유형의 TIR 산란 현미경(20)을 사용하여 수행되었다. 1.45의 개구수를 갖는 침유형(oil-immersion type) 대물렌즈(31)를 통해 물체(50)의 50pm 정사각형 크기의 영역이 조명되었다.
기판 표면과 나노 입자에서 산란되는 광의 교차 간섭 기간(cross-interference term)은 입자 분극성(particle polarisability)의 변화에 비례하며, 이는 EDL 재구조화를 시각화하는 데 사용된다. 배경 산란 신호(background scattering signal)는 1% 정도의 전위 역학적 대조보다 훨씬 작은 변동으로 안정적으로 유지된다.
이 일정한 수준은 현미경의 기계적 안정성과 샘플 스테이지의 kHz 대역폭 안정화에 특별한 주의를 기울임으로써 달성된다.
상대 전극(54)은 100pm의 거리를 유지하는 또 다른 ITO 슬라이드 또는 플로팅 Pt 전극으로 제공되었다. Ag/AgCl과 같은 별도의 기준 전극의 사용은 작은 나노 입자 증착으로 ITO 표면의 오염을 방지하기 위해 피해왔다.
달리 명시된 경우를 제외하고 산란 이미지를 기록하는 동안 전위는 균형 삼각파형(balanced triangular waveform)으로 인가되었다.
도 5는 ITO 표면이 10-100배 더 낮은 산란의 비교적 매끄러운 영역에서 분리된 날카로운 가장자리(edge)와 모서리(corner)가 있는 평행사변형 형태의 높은 산란 영역을 가지고 있음을 보여주는 ITO의 산란 이미지이다. 도 6 및 도 9에서 도시된 ITO 표면의 원자력 현미경은 이 영역에서 대략 20nm의 희박한 입자의 존재를 감지할 수 있다. 이러한 결정립을 가두는 날카로운 경계는 ITO의 어닐링 처리 중 화학양론적 과잉(stoichiometric excess)의 주석 또는 인듐과 관련된 형성의 결정학적 기원(crystallographic origin)을 나타낸다.
상대 전극에 대한 ITO 기판의 전위를 변경하면서 산란 이미지를 기록되었다. 각각에서 전체 주기의 평균 산란 신호를 빼면 도 7과 같이 전위 역학적 대조 이미지가 얻어진다. 먼저 거친 표면과 매끄러운 표면이 모두 보이는 영역에서 베어 ITO 기판(bare ITO )을 측정한다. ITO 거친 영역에서 입자의 상대적으로 균일한 크기 분포로 인해 다른 유형의 나노 입자의 전위 역학적 대조에 대한 참조로 사용할 수 있다.
EDL의 재구조화가 측정된 전위 역학적 대조에 대한 주요 기여임을 입증하기 위해 동일한 농도의 3가지 다른 1가 염(monovalent salts) 및 탈이온수(de-ionized water)에 대한 ITO의 동일한 영역을 조사하였다. 인가된 전위는 표면(54)의 전기화학적 특성의 응답 주기에 비해 천천히 변화하였다. 따라서, 효과적으로 인가된 전위는 그 응답 기간 동안 일정한 진폭을 가졌지만, 그와 상이한 전위에서 탄성적으로 산란된 광은 광 디텍터(32)의 샘플링 레이트에서 검출되었다.
도 8은 삼각형 파형(triangular waveform)으로 인가된 전위의 변화에 따라 단일 지점의 산란 강도(intensity of a single point)가 어떻게 변하는지 나타낸다.
도 10 내지 도 13은 인가된 전위 및 검출된 광이 표면(51)으로부터 탄성적으로 산란되는 것을 도시한다. 수십 사이클에 걸쳐 평균화된 단일 스펙클(single speckle) 대 인가된 전위의 강도 변화가 도시된다. 이것은 전위 역학적 대조를 사용하여 10-18 암페어(Amperes)의 국부 전류 수준에서 순환 전압 전류법(cyclic voltammetry)을 수행하며, 이는 몇 가지 기본 전하(elementary charges)의 교환에 해당한다.
결과는 표면(51)의 환경에서의 용액(solution)을 특성화한다. 예를 들어, 이 실험 조건에서 2mM Nal 및 NaCl에 대한 전위 역학적 대조는 NaBr 및 탈이온수(DI water)보다 4배 더 높았다. 유사하게, 인가된 각각의 전위와 관련하여 탄성적으로 산란된 광의 프로파일은 다른 용액에 대해서 다양하다.
다음으로, 직경 19nm의 단일 티타니아(TiO2) 입자의 광학적 대조의 변화를 연구하였다. ITO 표면에 착지하는 티타니아 입자를 관찰하면서 입자 현탁액(suspension of the particle)을 측정 셀(measurement cell)에 삽입하였다. 과량의 비-증착 입자(non-deposited particles)는 2mM Nal 용액으로 대체되었다.
도 14는 TiO2입자의 산란 현미경 검사 이미지를 보여준다. 이에 비해 도 15는 전위 역학적 대조, 즉 각 픽셀의 평균에 대한 전위를 적용하는 동안 강도 진동(intensity oscillations)의 진폭을 도시한다(예: 도 8과 유사한 곡선에서 측정된 신호의 진폭 대 평균 강도).
인가된 전위는 표면(54)의 전기 화학적 특성의 응답 주기에 비해 느리게 변화하였다. 따라서, 효과적으로, 인가된 전위는 그 응답 기간 동안 일정한 진폭을 가졌지만, 상이한 전위에서 탄성적으로 산란된 광은 광 디텍터(32)의 샘플링 레이트에서 검출되었다.
도 16 및 17은 각각 TiO2입자 및 표면(51) 상의 거친 지점(rough spot)으로부터 탄성적으로 산란되어 검출된 광 및 인가된 전위를 나타낸다. 이것은 전위 역학적 대조를 사용하여 10-18 암페어(Amperes)의 국부 전류 수준에서 단일 19 nm 이산화티타늄에 대한 순환 전압 전류법(cyclic voltammetry)을 수행하며, 이는 몇 가지 기본 전하의 교환에 해당한다. 이 비교는 전위 역학 현미경의 재료 특이성을 명확하게 보여준다.
요약하면, 이러한 결과는 광학 대조의 변화로부터 직접 EDL 재구조화의 실험적 측정을 보여준다. 간섭계 산란이 수십 kD까지 단일 생체 분자를 조사하는 감도를 갖는다는 점을 감안할 때, 전위 역학적 대조 측정은 장기간 동안 단일 단백질에 대한 산화 및 환원 과정 및 기타 반응을 측정하는 방법을 제시한다.
전기 화학적 반응 전위에 비해 상대적으로 낮은 전위와 완전히 분극 가능한 전극을 사용하는 경우, 전위 역학적 산란 대조는 대부분 EDL의 재구조화로 인한 것이다. 즉, 탄성 광 산란(elastic light scattering)은 용매와 다른 광학 편광도(polarizability)(굴절률)를 갖는 반대 이온(counter-ions)의 물리적 흡착에 의해 대부분 영향을 받는다. 염의 유형에 대한 전위 역학적 대조의 의존성이 나타나고 염의 특성화를 허용한다.
더 높은 전위에서 흡착된 나노 입자의 전위 역학적 대조는 전기 화학적 활성화로 인해 기본 ITO 기판과 다른 패턴을 나타낸다. 이 차이는 단일 19nm 이산화티타늄 나노입자에 대한 순환 전압계의 광학적 등가를 수행하는 데 사용된다. 전위역학적 대조의 재료 및 표면 지형 의존성(surface topography dependence)은 단일 거대분자의 화학적 특정 광학 현미경 검사에 대한 이전에는 미개척된 대조 메커니즘을 생성한다. 유사하게 물 분해와 같은 반응이 시작되는 더 높은 전위의 경우 이 대조를 사용하여 생성물 형성을 측정할 수 있다.
이러한 프로세스의 시작은 인가된 전위에 대한 대조 신호(contrast signal)의 비선형성을 통해 가장 잘 식별할 수 있다. 이 영역에서 전위 역학적 대조 현미경은 전류 측정 대신 변위된 전하(displaced charge)를 나타내는 광학 대조와 함께 순환 전압 전류법에 유사한 정보를 제공할 수 있다.
본 기술은 다음과 같은 몇 가지 비제한적인 예시들을 포함하여 수많은 응용을 가지고 있다.
● 전위를 인가하여 표면 전하를 가진 입자를 선택적으로 거부하거나 끌어당긴다.
이것은 예를 들어 질량 광도계(mass photometry)를 사용하여 다양한 입자를 표면에 끌어당겨 측정할 수 있다.
이러한 기능은 단백질 및 핵산이 포함된 생물학적 샘플과 같은 혼합 입자를 포함하는 물체에서 특히 유용할 수 있다.
●중성, 음성 및/또는 양성에서 측정하여 측정 표면과의 상호 작용 바이어스를 확인한다. 즉, 전위에서 끌어당기는 다른 종료가 존재하지 않는지 확인한다.
● 다른 전위에서의 측정값을 비교한다(예: 특정 전위에서의 측정과 중립 상태에서의 측정).
또는 다른 전위에서 측정을 비교한다.
전위에서의 표면과의 상호 작용은 전하 상호 작용(charge interactions)을 기반으로 한 입자 결합과 경쟁한다.
● 전위가 결합된 복합체 내에서 상호 작용을 선택적으로 분리할 수 있는지 여부를 조사한다.
● 단일 나노 물체의 특성 및 (전기) 화학적 상태의 모니터링, 예를 들어, 단일 단백질의 산화/환원, 단일 입자의 촉매 활성(catalytic activities) 진행, "검출된(detected)" 생체 분자 주변의 "보이지 않는(invisible)" 이온의 존재비의 변화, 또는 생체 분자의 화학적 상태의 변화;
● 이러한 물체들과 다른 분자의 상호작용의 모니터링, 예를 들어, 다른 분자의 결합/분리, 근처 물체 또는 표면과의 이온 교환, 용매 내 특정 분자에 대한 친화성,
● 표면 불균일성 및 특정 결함 또는 표면 구조의 식별 및 모니터링한다.
● 표면에서 화합물의 핵 생성, 형성 및 분리(dissociation)의 연구
● 간섭계 산란 질량 분석(interferometric scattering mass spectrometry)을 위해 표면에 대한 용액 내 분자의 결합(binding) 속도/해제(unbinding) 속도 조정;
● (연속적으로) 조정 가능한 표면 전위를 갖는 전도성 표면 또는 표면에서 간섭계 산란 수행;
● 반사율 대조의 헤테로다인(Heterodyne) 측정;
● 재료 특성을 추론하기 위해 단일 입자 수준에서 표면 전위의 변화에 대한 반사도 대조의 비선형 응답의 측정;
● (금속 입자에 대한 이전 작업과 반대되는)유전체 물체에 대한 광학 대조 전기 화학적 측정 수행;
● 용매 특성 및 반응성 화학물질의 존재 감지;
● 표면에서 혼합 상(기포, 폴리머)의 역학(dynamics) 조사;
● 광학 산란 신호로 나노포어(nanopores)를 통과하는 물체의 역학 모니터링;
● 기본적으로 표면에 대한 순환 전압 측정법에 의해 수행되는 대부분의 실험은, 이제 단일 입자에 대해서 수행할 수 있다.
● 표면 상단, 가장자리 또는 릿지(ridge)를 따라 이온 전류 및 이온 농도의 특별한 변화의 측정.
● 이상의 모든 것의 일시적 역학(temporal dynamics) 측정.

Claims (20)

  1. 산란 현미경 검사를 수행하는 방법에 있어서,
    조명 광을 조사하도록 배치된 광원 및 광 디텍터를 구비하는 산란 현미경을 통해 표면을 갖는 물체를 이미징하는 단계를 포함하고,
    상기 현미경은 상기 광 디텍터로 상기 물체로부터 탄성적으로 산란된 광을 검출하고, 상기 조명 광으로 상기 물체를 조사하도록 배치되고,
    상기 방법은 상기 물체를 이미징하는 동안 상기 물체의 전기 화학적 특성에 영향을 미치는 전위를 표면에 인가하는 단계를 더 포함하고,
    상기 물체는, 상기 조명 광의 파장 및 인가된 상기 전위에서 플라즈몬 공명 주파수를 갖지 않도록 선택되는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    전기 이중 층은 상기 물체에 형성되고, 상기 표면에 대한 전위는 상기 전기 이중 층의 전기 화학적 특성에 영향을 미치는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 표면은 전도성 재료의 표면이고, 상기 전위를 표면에 인가하는 단계는, 전위를 상기 전도성 재료에 인가하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 전도성 재료는 금속이 아닌 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 표면은 유전체 재료의 표면이고, 상기 전위를 표면에 인가하는 단계는, 상기 유전체 재료를 통해 전위를 용량성으로 인가하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물체는 상기 표면에 적어도 하나의 입자를 더 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 입자는 5000 kDa 이하의 질량을 갖는 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 입자는 10 kDa 이상의 질량을 갖는 방법.
  9. 제 7 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 입자는 상기 조명 광에 대해 10-17 m2 이하의 산란 단면적을 갖는 방법.
  10. 제 7 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 입자는 상기 조명 광에 대해 10-17 m2 이상의 산란 단면적을 갖는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전위는, 상기 전위에 영향을 받는 상기 물체의 전기 화학적 특성의 응답 기간에 걸쳐 일정한 진폭을 갖는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전위는, 상기 전위에 영향을 받는 상기 물체의 전기 화학적 특성의 응답 기간보다 짧은 기간에 걸쳐 변화하는 진폭을 갖는 방법.
  13. 제 13 항에 있어서,
    상기 전위는, 상기 전위에 영향을 받는 상기 물체의 전기 화학적 특성의 응답 기간보다 짧은 기간에 걸쳐 교번하는 진폭을 갖는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은, 상기 표면에 복수의 상이한 전위를 인가하는 단계; 및
    상기 물체의 일부 및/또는 주변 환경의 특성에 따른 각각의 전위에 대해 상기 물체의 일부로부터 탄성적으로 산란된 광을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제 15 항에 있어서,
    기준 프로파일과 각각의 전위에 대해 물체의 일부로부터 탄성적으로 산란된 광의 프로파일의 유사도를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현미경은 상기 광 디텍터에 의해 검출된 신호가 상기 물체로부터 탄성적으로 산란된 광의 진폭에 민감하도록 배치되는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현미경은, 간섭계 산란 현미경 또는 암 시야 산란 현미경인 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현미경은 상기 물체의 2차원 이미지를 출력하도록 배치되는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광은 자외선, 가시 광선 또는 적외선인 방법.
  20. 산란 현미경 검사 장치에 있어서,
    상기 현미경 검사 장치는,
    표면을 갖는 물체;
    조명 광을 조사하도록 배치된 광원 및 광 디텍터를 구비하는 현미경 -상기 현미경은 상기 광 디텍터로 상기 물체로부터 탄성적으로 산란된 광을 검출하고, 상기 조명 광으로 상기 물체를 조사하도록 배치됨-; 및
    상기 물체를 이미징하는 동안 상기 물체의 전기 화학적 특성에 영향을 미치는 전위를 표면에 인가하도록 배치되는 전압 소스를 포함하고,
    상기 물체는 상기 조명 광의 파장 및 인가된 상기 전위에서 플라즈몬 공명 주파수를 갖지 않도록 선택되는 산란 현미경 검사 장치.
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