KR20210138043A

KR20210138043A - 고 결합 활성 wt1 t 세포 수용체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210138043A
Application number: KR1020217032466A
Authority: KR
Inventors: 토마스 엠. 슈미트; 오드 지. 샤푸이스; 필립 디. 그린버그
Original assignee: 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2021-11-18
Also published as: EA202192252A1; WO2020185796A9; US20220160764A1; BR112021017703A8; AU2020237043A1; JP2022525099A; CA3132845A1; CN113784978A; EP3938386A1; BR112021017703A2; MX2021010837A; SG11202109745PA; WO2020185796A1; IL286202A

Abstract

본 개시내용은 암에서와 같이 세포가 WT1을 과발현하고/하거나 p37 항원을 생성하는 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 빌름스 종양 단백질 1(WT1)로부터의 종양 관련 항원 p37에 대해 높은 기능적 결합 활성을 갖는 T 세포 수용체(TCR) 및 관련 결합 단백질, 이러한 고친화성 WT1 특이적 TCR을 발현하는 T 세포, 이를 코딩하는 핵산, 및 조성물을 제공한다.

Description

고 결합 활성 WT1 T 세포 수용체 및 이의 용도

서열 목록에 관한 진술

본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 카피 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일명은 360056_466WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 243KB로 2020년 3월 8일에 생성되었으며 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다.

유전적으로 조작된 T 세포로의 입양 T 세포 면역요법은 종양 관련 항원을 표적화하기 위해 항체 기반 키메라 수용체^1-3 및 고친화성 TCR^4-8을 비롯한 충분한 친화도의 항원 수용체가 사용된 여러 시험에서 가능성을 보여주었다. 흉선에서 다양성 생성의 자연적인 과정은 RAG 매개 TCR 유전자 재배열을 사용하여 길이와 아미노산 조성이 상이한 매우 다양한 CDR3를 생성하지만, 중심성 관용성에 의해 부과된 친화도 한계 내에서 효과적인 고친화성 TCR을 단리하는 것은 후보 세포내 자가/종양 항원이 확인된 다양한 악성 종양에 대해 입양 T 세포 면역요법을 시행하는 데 있어 실질적인 장애물로 남아 있다^9,10. 또한, TCR 입양 면역 요법은 MHC 클래스 I에 의해 세포 표면에 제시되는 세포내 항원을 검출하는 능력이 있다.

WT1 단백질은 면역 특성(Cheever et al., Clin. Cancer Res. 15:5323, 2009) 및 불량한 예후와 관련된 많은 공격적인 종양 유형에서의 이의 발현으로 인해 임상 개발에서 매력적인 표적이다. WT1은 증식 및 발암성을 촉진하는 유전자 발현의 조절에 관여하며(Oji et al., Jpn. J. Cancer Res. 90:194, 1999), 대부분의 고위험 백혈병(Menssen et al., Leukemia 9:1060, 1995), NSCLC의 최대 80%(Oji et al., Int. J. Cancer 100:297, 2002), 중피종의 100%(Tsuta et al., App. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17:126, 2009) 및 부인과 악성 종양의 ≥80%(Coosemans and Van Gool, Expert Rev. Clin. Immunol. 10:705, 2014)에서 과발현된다. WT1 단백질의 여러 펩티드는 HLA-A^*0201-제한 항원인 종양 관련 항원 펩티드인 것으로 알려져 있다.

백혈병 및 종양과 같은 다양한 암에 대한 대안적인 고 WT1 항원 특이적 TCR 면역요법이 분명히 필요하다. 본원에 개시된 실시양태는 이러한 요구를 해결하고 다른 관련 이점을 제공한다.

도 1A 및 1B는 WT1₃₇ 특이적 TCR이 고속 대량 처리 시퀀싱 기반 전략에 의해 식별되는 방법을 보여준다. (A) 고 WT1_37-45 펩티드/MHC 사량체 결합과 관련된 TCR 클론형을 식별하기 위한 초기 시퀀싱 기반 전략의 개략도. (B) 분류 집단 대 총 집단 비율의 농축이 표시된다 - 선택된 TCR이 강조 표시됨. 검은색 원으로 표시된 모든 TCR을 합성하고 항원 특이성에 대해 평가하였다(총 27개).
도 2는 높은 수준의 CD8 비의존성(CD8i) 사량체에 결합하는 TCR의 기능 평가 결과를 보여준다. TCR 작제물을 내인성 TCRα/β 쇄가 없는 Jurkat 세포에서 발현시켰다. 각 TCR에 대한 사량체 염색 대 CD3 발현이 표시된다(CD3 발현은 트랜스제닉 TCR 표면 발현과 직접적으로 상관됨).
도 3A 내지 3C는 CD8 비의존성(CD8i) 사량체를 사용하여 변형된 고속 대량 처리 시퀀싱 기반 전략에 의해 추가 WT1₃₇특이적 TCR이 식별되었음을 보여준다. (A) 고 CD8-비의존성 WT1₃₇ 펩티드/MHC 사량체 결합과 관련된 TCR 클론형을 식별하기 위한 변형된 시퀀싱 기반 전략의 개략도. (B) CD8i 사량체를 사용한 경우 유사한 분석 (C)과 비교한 원래 분류 집단의 농축 대 총 집단의 백분율이 표시된다. 감소된 표면 CD3 수준 및 CD8i 사량체 결합을 기반으로 추가 14개의 TCR이 선택되었다. 음영 처리된(대각선 패턴) 원으로 표시된 모든 TCR을 합성하고 항원 특이성에 대해 평가하였다.
도 4는 선택된 WT1₃₇ TCR의 CD8i 사량체 결합을 보여준다. TCR 작제물을 내인성 TCR 쇄가 없는 Jurkat 세포에서 발현시켰다. 각 TCR에 대한 사량체 염색 대 CD3 발현이 표시된다(CD3 발현은 트랜스제닉 TCR 표면 발현과 직접적으로 상관됨).
도 5A 및 5B는 일차 CD8⁺ PBMC로 형질도입시 IFNγ 검정에서 선택된 TCR에 대한 펩티드 EC₅₀의 계산을 보여준다. (A) 선별된 TCR을 공여자 PMBC로부터 단리된 CD8⁺T 세포로 형질도입하였다. 1주 후, 세포를 사량체⁺ CD8⁺T 세포에 대해 분류하고 확장하였다. 확장된 항원-특이적 세포를 펩티드-펄스된 T2 표적 세포와 함께 4-6시간 동안 배양하고 IFNγ 생성을 유세포 분석에 의해 결정하였다. (B) IFNγ 생성 세포의 백분율을 각 TCR에 대한 펩티드 EC₅₀을 계산하기 위해 비선형 회귀에 의해 용량-반응 곡선에 피팅하였다.
도 6은 WT1₃₇-특이적 TCR을 발현하는 일차 CD8⁺ T 세포가 WT1⁺ HLA-A2⁺ 유방암 세포주 MDA-MB-468을 효율적으로 사멸시킴을 보여준다. 고 사량체 결합을 위해 분류 정제된 CD8⁺일차 T 세포를 TCR로 형질도입하고 CytoLight® Rapid Red 염료로 염색한 유방암 세포주 MDA-MB-468과 8:1 비율로 혼합하였다(삼중으로). 총 적색 물체 면적(살아 있는 표적 세포의 총 수와 상관관계가 있음)을 72 시간에 걸쳐 각 TCR 형질도입된 T 세포 집단에 대해 표시된 시점에서 계산하였다. 지속 항원에 대한 TCR-형질도입된 T 세포의 지속적인 반응성을 평가하기 위해, 추가 MDA-MB-468 세포를 48시간에 첨가하였다.
도 7은 TCR 10.1을 발현하는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 모두가 시험관 내 반복 챌린지 후 WT1⁺ A2⁺ 췌장 선암종 세포주 PANC-1을 제거할 수 있음을 보여준다. CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 둘 모두를 WT137 TCR 10.1을 발현하도록 형질도입하였다. CD4⁺T 세포를 추가로 형질도입하여 CD8α 및 CD8β 유전자를 발현시켰다. 8일 후, 형질도입된 세포를 분류하여 CD8⁺사량체⁺ 및 CD4⁺/CD8⁺ 사량체⁺T 세포를 정제하였다. CD4⁺/CD8⁺, CD8⁺또는 이 두 집단(CD4 및 CD8)의 혼합물인 항원 특이적 세포를 사전에 NucLight® Red 염료를 발현하도록 형질도입된 췌장 선암 세포주 PANC-1와 8:1 비율로 혼합하였다(삼중으로). 각 TCR 형질도입 T 세포 집단에 대해 표시된 시점에서 총 적색 물체 면적(살아 있는 표적 세포의 총 수와 상관관계가 있음)을 계산하였다. 지속 항원에 대한 TCR 형질도입된 T 세포의 지속적인 반응성을 평가하기 위해, 추가 PANC-1 세포를 48시간에 첨가하였다.
도 8A 내지 8D는 Schmitt 등(Nat. Biotechnol. 35:1188, 2017)으로부터의 WT1 p126 펩티드 특이적 C4 TCR로 형질도입된 T 세포에 의한 종양 세포주 사멸을 본 개시내용의 WT1 p37 펩티드-특이적 TCR로 형질도입된 T 세포(WT1_37-45TCR15.1)에 의한 사멸과 비교하여 보여준다. C4 TCR은 본 개시내용의 WT1 p37 펩티드-특이적 TCR과 비교하여 이의 펩티드::MHC 복합체에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다는 점에 주목하기 바란다.

상세한 설명

본 개시내용은 주요 조직적합성 복합체(MHC)(예: 인간 백혈구 항원, HLA)와 관련이 있는 아미노산 37-45(WT1_37-45 펩티드 또는 p37 펩티드 항원으로도 지칭됨; 예를 들어, VLDFAPPGA, 서열 번호 59)로 구성된 WT1로부터의 항원성 펩티드에 대해 높은 기능적 결합 활성(functional avidity)을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다. 이러한 p37 펩티드 항원 특이적 TCR은 예를 들어 WT1을 과발현하는 암과 같은 암을 치료하기 위한 입양 면역요법에 유용하다.

배경으로, T 세포 기반 면역 요법에 대한 대부분의 종양 표적은 종양이 이전에 정상이었던 조직에서 발생하기 때문에 자가-항원이다. 예를 들어, 이러한 종양 관련 항원(TAA)은 암세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있지만, 다른 세포에서는 발현되지 않거나 최소로 발현될 수 있다. 흉선에서 T 세포가 발달하는 동안 자기 항원에 약하게 결합하는 T 세포는 흉선에서 생존하여 더 발달하고 성숙할 수 있는 반면, 자기 항원에 강하게 결합하는 T 세포는 바람직하지 않은 자가면역 반응을 일으킬 것이기 때문에 면역계에 의해 제거된다. 따라서, T 세포는 항원에 결합하는 상대적 능력에 따라 분류되어 면역계가 외부 침입자에 대해 반응하도록 준비(즉, 비-자가 항원의 인식)하는 동시에, 자가면역 반응을 방지(즉, 자가 항원의 인식)한다. 이러한 저항성 메커니즘은 높은 친화도로 종양(자체) 항원을 인식할 수 있는 자연 발생 T 세포를 제한하므로 종양 세포를 효과적으로 제거할 T 세포를 제거한다. 결과적으로, 종양 항원에 특이적인 고친화성 TCR을 갖는 T 세포를 단리하는 것은 대부분의 그러한 세포가 본질적으로 면역계에 의해 제거되기 때문에 어렵다.

본 개시내용에서, p37:MHC 복합체에 대한 높은 기능적 결합 활성을 갖는 TCR을 식별하기 위해 약 15명의 건강한 공여자로부터의 면역 세포에 고속 대량 처리 시퀀싱 기반 접근법을 적용하였다. 이 전략은 또한 T 세포 표면에서 낮은 수준의 TCR로 발현되는 경우에도 TCR의 선택을 허용한다. 전체 집단의 백분율에 대한 분류 집단의 농축을 사용하여 본 개시내용의 p37 및 이의 조성물에 특이적인 높은 친화도 및 높은 기능적 결합 활성의 TCR(즉, 가장 큰 항종양 효능을 갖는 것)을 선택하였다. p37에 특이적인 이러한 고기능 결합 활성 TCR은 T 세포에서 (a) CD8 비의존성 p37 펩티드/MHC 사량체에 결합하고, (b) 시험관 내 펩티드 구동 확장을 덜 겪으며, (c) 일부 경우에 이러한 특성을 갖지 않는 T 세포에서의 다른 TCR에 비해 T 세포 표면에서 상대적으로 낮은 수준으로 이러한 TCR을 발현하는 것으로 확인되었다. 총 27개의 TCR을 합성하고 p37 항원 특이성에 대해 평가하였다(도 1B 참조).

특정 실시양태에서, WT1 펩티드에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)는 TCR α 쇄 및 TCR β 쇄를 포함하고, 여기서 TCR α 쇄는 서열 번호 253 내지 263 및 34 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 V_α 도메인 및 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖는 α 쇄 불변 도메인을 포함하고, TCR β 쇄는 서열 번호 253 내지 263 및 23 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 V_β 도메인 및 서열 번호 45 또는 46의 아미노산 서열을 갖는 β 쇄 불변 도메인을 포함하며, 이러한 TCR은 T 세포 표면상의 VLDFAPPGA(서열 번호 59):인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 특이적으로 결합하고, 8.5 이상의 pEC₅₀으로 IFNγ 생성을 촉진한다. 특정 실시양태에서, 선택된 TCR은 약 10^-8 M 이하의 K_D로 VLDFAPPGA(서열 번호 59):인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 특이적으로 결합하거나, 고친화성 TCR은 슈미트 등에 의해 개시된 TCR(Schmitt et al., Nat. Biotechnol. 35:1188, 2017)에 비해 감소된 k_off 속도로 VLDFAPPGA(서열 번호 59):HLA 복합체로부터 해리된다.

본원에 기재된 조성물 및 방법은 특정 실시양태에서 WT1 발현 또는 과발현(예를 들어, 정상 또는 무질환 세포에서 검출가능한 WT1 발현 수준보다 통계적으로 유의미한 방식으로 더 큰 수준에서 검출가능한 WT1 발현)과 관련된 질환 및 병태의 치료를 위한 치료적 유용성을 가질 것이다. 이러한 질환은 혈액 악성 종양 및 고형암과 같은 다양한 형태의 과증식성 장애 또는 증식성 장애를 포함한다. 이들 및 관련 용도의 비제한적인 예가 본원에 기재되어 있으며 WT1 펩티드(예를 들어, VLDFAPPGA, 서열 번호 59, WT1_37-45 펩티드 또는 p37 펩티드로도 알려짐)에 특이적인 향상된 친화성 TCR을 발현하는 재조합 T 세포의 사용에 의한 것과 같이 WT1 항원 특이적 T 세포 반응의 시험관 내, 생체외 및 생체내 자극을 포함한다.

본 개시 내용을 보다 상세하게 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 이의 이해에 도움이 될 수 있다. 추가적인 정의는 본 개시 전체에 설명되어 있다.

본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한 기재된 범위 내의 임의의 정수값 및 적절한 경우 이의 분수(예컨대, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 물리적 특성, 예컨대 중합체 소단위, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에 기재된 임의의 수치 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 기재된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은, 달리 표시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±10%를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "하나"는 열거된 성분의 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "포함하다"는 동의적으로 사용되고, 이의 용어 및 변형은 비제한적인 것으로 해석되도록 의도된다.

또한, 본원에서 기술된 구조 및 치환기의 다양한 조합으로부터 유도된, 개별 화합물, 또는 화합물의 군은 본원에 의해 각각의 화합물 또는 화합물의 군이 개별적으로 열거된 것과 동일한 범위로 기술된 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 특정 구조 또는 특정 치환기의 선택은 본 개시내용의 범위 내에 있다.

용어 "본질적으로 이루어지는"은 "포함하는"과 동등하지 않고, 청구항의 명시된 물질 또는 단계, 또는 청구된 대상의 기본 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 것을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역 또는 모듈(예를 들어, 결합 도메인, 힌지 영역, 링커 모듈) 또는(하나 이상의 도메인, 영역 또는 모듈을 가질 수 있는) 단백질은 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질의 아미노산 서열이 조합해서 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질 길이의 최대 20%(예를 들어, 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고 도메인(들), 영역(들), 모듈(들) 또는 단백질의 결합 활성(예를 들어, 결합 단백질의 표적 결합 친화도)에 실질적으로 영향을 미치지 않는(즉, 50%를 초과하여 활성도를 감소하지 않는, 예컨대 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하) 연장, 결실, 돌연변이, 또는 이들의 조합(예를 들어, 아미노- 또는 카복시-말단 또는 도메인 사이의 아미노산)을 포함할 경우 특정한 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진다".

본원에서 사용되는 "면역계 세포"는 일부 측면에서 (단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵세포 및 과립구와 같은 골수 세포에서 발생하는) 골수 전구 세포 및 (T 세포, B 세포 및 연 살해(NK) 세포와 같은 림프계 세포에서 발생하는) 림프계 전구 세포의 두 가지 주요 계통에서 발생하는 골수 내 조혈 줄기세포로부터 기원한 면역계의 임의의 세포를 의미한다. 예시적인 면역계 세포는 CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, CD4^- CD8^- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 자연 살해 세포(예: NK 세포 또는 NK-T 세포), B 세포 및 수지상 세포를 포함한다. 대식세포 및 수지상 세포는 펩티드와 복합체화된 APC 표면 상의 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)(MHC) 수용체가 T 세포 표면 상의 TCR과 상호작용하는 경우 T 세포를 활성화시킬 수 있는 특수화 세포인 "항원 제시 세포" 또는 "APC"로 지칭될 수 있다.

"주요 조직적합성 복합체"(MHC)는 일부 측면에서 세포 표면에 펩티드 항원을 전달하는 당단백질을 지칭할 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 막 스패닝(spanning) α 쇄(3개의 α 도메인을 가짐) 및 비공유적으로 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는 이형이량체이다. MHC 클래스 II 분자는 2개의 막관통 당단백질, 즉, α와 β로 구성되는데, 이들 둘 다 막에 걸쳐있다. 각각의 쇄는 2개의 도메인을 가진다. MHC 클래스 I 분자는 시토졸에서 유래하는 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD8⁺ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 유래된 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, CD4⁺T 세포에 의해 인식된다. 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지칭된다.

"T 세포" 또는 "T 림프구"는 흉선에서 성숙하고 T 세포 수용체(TCR)를 생성하는 면역계 세포이다. T 세포는 나이브 T 세포(예를 들어 항원에 노출되지 않음; T_CM에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 및 CD45RA의 증가된 발현, 및 CD45RO의 감소된 발현), 기억 T 세포(T_M)(예를 들어 항원-경험 및 장기간 생존), 및 이펙터 세포(항원-경험, 세포독성)와 관련된 표현형 또는 마커를 나타낼 수 있다. T_M은 중심 기억 T 세포(T_CM, 예를 들어 나이브 T 세포에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO 및 CD95의 증가된 발현, 및 CD54RA의 감소된 발현) 및 이펙터 기억 T 세포(T_EM, 예를 들어 나이브 T 세포 또는 T_CM에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD45RA의 감소된 발현, 및 CD127의 증가된 발현)와 관련된 표현형 또는 마커를 나타내는 서브세트로 추가로 분화될 수 있다. 이펙터 T 세포(T_E)는 T_CM에 비해 CD62L, CCR7, CD28의 발현이 감소되고, 그랜자임 및 퍼포린에 대해 양성인 항원-경험 CD8⁺세포독성 T 림프구를 지칭할 수 있다. 헬퍼 T 세포(T_H)는 사이토카인을 방출함으로써 다른 면역 세포의 활성에 영향을 미치는 CD4⁺ 세포를 포함할 수 있다. CD4⁺ T 세포는 적응성 면역 반응을 활성화 및 억제할 수 있고, 이들 두 기능 중 어느 것이 유도되는지는 다른 세포 및 신호의 존재에 의존할 것이다. T 세포는 공지된 기술을 사용하여 수집될 수 있고, 다양한 하위 집단 또는 이의 조합은 공지된 기술, 예를 들어 항체에 대한 친화성 결합, 유세포 분석 또는 면역 자기 선택에 의해 풍부화되거나 고갈될 수 있다. 다른 예시적인 T 세포는 조절 T 세포, 예컨대 CD4⁺ CD25⁺(Foxp3⁺) 조절 T 세포 및 Treg17 세포뿐만 아니라 Tr1, Th3, CD8⁺CD28^-, 및 Qa-1 제한 T 세포를 포함한다.

"T 세포 수용체"(TCR)는 일부 측면에서 MHC 수용체에 결합된 항원 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원(가변 결합 도메인, 불변 도메인, 막관통 영역, 및 짧은 세포질 꼬리를 가짐; 예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3^rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조)을 지칭한다. 일부 측면에서, TCR은 본 개시내용의 2개의 TCR 가변 도메인(Vα 및 Vβ)을 포함하는 결합 단백질을 지칭한다. 일부 측면에서, TCR은 단일쇄 TCR(즉, 본 개시내용의 TCR 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 융합 단백질, 또는 본 개시내용의 TCR 가변 도메인을 포함하는 CAR(본원에서 논의됨)을 포함한다. 일부 측면에서, TCR은 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있고, 일반적으로 α 및 β 쇄(또한 각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐), 또한 γ및 δ쇄(또한 각각 TCRγ및 TCRδ로도 알려짐)를 갖는 이형이량체로 구성된다.

면역글로불린과 같이, TCR 쇄(예를 들어, α 쇄, β 쇄)의 세포외 부분은 2개의 면역글로불린 도메인, 즉, N-말단에서의 가변 도메인(예를 들어, α 쇄 가변 도메인 또는 V_α, β 쇄 가변 도메인 또는 V_β; 전형적으로 카바트 넘버링(Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5^th ed.)에 기초한 아미노산 1 내지 116, 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인(예를 들어, α 쇄 불변 도메인 또는 C_α, 전형적으로 카바트에 기초한 아미노산 81 내지 259, β 쇄 불변 도메인 또는 C_β, 전형적으로 카바트에 기초한 아미노산 81 내지 295)을 함유한다. 또한 면역글로불린과 같이, 가변 도메인은 프레임워크 영역(framework region: FR)에 의해 분리되는 상보성 결정 영역(complementary determining region: CDR)을 함유한다(예를 들어, 문헌[Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988] 참조; 또한 문헌[Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003] 참조). 특정 실시양태에서, TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견되고 CD3 복합체와 회합된다. 본 개시에 사용된 TCR의 공급원은 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼 또는 다른 포유동물로부터 유래될 수 있다.

"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 단백질(예: TCR)의 결합에 관여하는 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 단백질의 도메인(예: TCR α 쇄 또는 β 쇄(또는 γδ TCR의 경우 γ-쇄 및 δ-쇄)의 도메인을 의미한다. 천연 TCR의 α 쇄 및 β 쇄의 가변 도메인(각각 Vα 및 Vβ)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 일반적으로 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. Vα 도메인은 2개의 분리된 DNA 세그먼트, 가변 유전자 세그먼트 및 결합 유전자 세그먼트(V-J)에 의해 코딩되고; Vβ 도메인은 3개의 분리된 DNA 세그먼트, 가변 유전자 세그먼트, 다양성 유전자 세그먼트 및 결합 유전자 세그먼트(V-D-J)에 의해 코딩된다. 항원 결합 특이성을 부여하는데 단일 Vα 또는 Vβ 도메인이 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 TCR은 각각 상보적 Vα 또는 Vβ 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 TCR로부터 Vα 또는 Vβ 도메인을 사용하여 단리될 수 있다.

용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 "초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어이고, 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하고 프레임워크 영역에 의해 일차 ㅇ아미노산 서열에 의해 분리되는, 면역글로불린(예: TCR) 가변 영역 내의 아미노산을 지칭하는 것으로 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 α 쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(αCDRl, αCDR2, αCDR3)이 존재하고, 각각의 β 쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(βCDR1, βCDR2, βCDR3)이 존재한다. TCR에서, CDR3은 처리된 항원을 인식하는데 관여하는 주요 CDR인 것으로 생각된다. 일반적으로, CDR1 및 CDR2는 주로 MHC와 배타적으로 상호작용한다.

CDR1 및 CDR2는 TCR 가변 영역 코딩 서열의 가변 유전자 세그먼트 내에서 코딩되는 반면, CDR3은 Vα에 대한 가변 및 연결 세그먼트에 걸쳐 있는 영역, 또는 Vβ에 대한 가변, 다양성 및 연결 세그먼트에 걸쳐 있는 영역에 의해 코딩된다. 따라서, Vα 또는 Vβ의 가변 유전자 세그먼트의 동일성이 알려져 있다면, 예를 들어, 본원에 설명된 넘버링 방식에 따라 그의 상응하는 CDR1 및 CDR2의 서열이 추론될 수 있고다. CDR1 및 CDR2와 비교하여 CDR3은 전형적으로 재조합 과정에서 뉴클레오티드의 추가 및 손실로 인해 훨씬 더 다양하다.

TCR 가변 도메인 서열은 넘버링 방식(예: Kabat, Chothia, EU, IMGT, Enhanced Chothia 및 Aho)에 맞춰 정렬할 수 있으므로 등가 잔기 위치에 주석을 달고 예를 들어 ANARCI 소프트웨어 도구(2016, Bioinformatics 15:298-300)를 사용하여 서로 다른 분자를 비교할 수 있다. 넘버링 방식은 TCR 가변 도메인에서 프레임워크 영역 및 CDR의 표준화된 설명을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 CDR은 IMGT 넘버링 방식에 따라 확인된다(Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003; imgt.org/IMGTindex/V-QUEST.php). 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 CDR3 아미노산 서열은 하나 이상의 접합 아미노산을 포함하며; 예를 들어, 본원에서 논의된 (RAG) 매개 재배열 동안 발생할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "CD8 공-수용체" 또는 "CD8"은 알파-알파 동종이량체 또는 알파-베타 이종이량체로서의 세포 표면 당단백질 CD8을 의미한다. CD8 공-수용체는 세포독성 T 세포(CD8⁺)의 기능을 보조하고, 이의 세포질 티로신 포스포릴화 경로를 통한 신호전달을 통해서 기능한다(Gao and Jakobsen, Immunol. Today 21:630-636, 2000; Cole and Gao, Cell. Mol. Immunol. 1:81-88, 2004). 다섯(5) 종의 공지된 인간 CD8 베타 쇄 동형(UniProtKB 식별인자 P10966 참조) 및 단일 공지 인간 CD8 알파 쇄 동형(UniProtKB 식별인자 P01732 참조)이 존재한다.

"CD4"는 항원-제시 세포와 소통하는 데 있어서 TCR을 보조하는 면역글로불린 공-수용체 당단백질이다(Campbell & Reece, Biology 909(Benjamin Cummings, Sixth Ed., 2002)); UniProtKB P01730 참조). CD4는 면역 세포, 예컨대, T 헬퍼 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포의 표면 상에서 발견되며, 세포 표면에서 발현되는 4개의 면역글로불린 도메인(D1 내지 D4)을 포함한다. 항원 제시 동안, CD4는 TCR 복합체와 함께 동원되어 MHCII 분자의 상이한 영역에 결합한다(CD4는 MHCII β2에 결합하는 반면, TCR 복합체는 MHCII α1/β1에 결합함). 이론에 구애없이, TCR 복합체에 대한 인접은 CD4-회합된 키나제 분자가 CD3의 세포질 도메인 상에 존재하는 면역수용체 티로신 활성 모티프(ITAM)를 포스포릴화시킬 수 있게 한다고 여겨진다. 이러한 활성은 면역 반응 및 T 헬퍼 세포를 포함한 다양한 유형의 면역계 세포를 생성하거나 동원하기 위해서 활성화된 TCR에 의해서 생성된 신호를 증폭시킨다고 생각된다.

본원에 사용되는 "D/N/P 영역"은 일부 측면에서, T 세포 수용체의 다양성으로 이어지는 V(D)J 재조합 과정 동안 삽입(또는 결실)되는 비주형(N) 뉴클레오티드 및 회문(P) 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 다양성(D) 유전자 세그먼트 내에 위치할 것으로 예측되는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 뉴클레오티드 또는 아미노산을 지칭한다. 가변성(V), 다양성(D) 및 연결(J) 유전자 세그먼트의 재조합 활성화 유전자(RAG) 매개 재배열은 뉴클레오티드(회문 또는 P 뉴클레오티드라고 함)의 가변적인 첨가 또는 삭제를 초래한 후 무작위 비주형(N) 뉴클레오티드를 추가하는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT) 활성이 뒤르는 부정확한 과정이다. 마지막으로, 엑소뉴클레아제는 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드를 제거하고 틈은 DNA 합성 및 수리 효소에 의해 채워진다. 이러한 트림 및 복구 메커니즘은 다양한 TCR에 의한 다양한 항원의 효율적이고 특이적 인식을 뒷받침하는 접합부 다양성으로 이어진다. D 유전자 세그먼트는 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템(IMGT, imgt.org)의 주석 시스템을 사용하여 식별할 수 있다.

일부 측면에서, "CD3"은 6개 쇄의 다중 단백질 복합체이다(Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p172 and 178, 1999 참조). 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄 및 CD3ζ쇄의 동종이량체를 포함한다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε쇄는 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 고도로 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε쇄의 막관통 영역은 음으로 하전되는데, 이는 이들 쇄가 T 세포 수용체 쇄의 양으로 하전된 영역과 회합되도록 허용하는 특징이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 쇄의 세포내 꼬리는 각각 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면, 각각의 CD3ζ쇄는 3개를 가진다. 이론에 구애없이, ITAM은 TCR 복합체의 신호전달 능력에 중요한 것으로 여겨진다. 본 개시에서 사용되는 바와 같은 CD3은 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물를 포함하는 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다.

본원에서 사용되는 "TCR 복합체"는 일부 측면에서, TCR과 CD3의 회합에 의해 형성되는 복합체를 지칭한다. 예를 들어, TCR 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄, CD3ζ 쇄의 동종이량체, TCRα 쇄 및 TCRβ 쇄로 구성될 수 있다. 대안적으로, TCR 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄, CD3ζ 쇄의 동종이량체, TCRγ 쇄, 및 TCRδ 쇄로 구성될 수 있다.

일부 측면에서, 본원에서 사용되는 "TCR 복합체의 성분"은 TCR 쇄(즉, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ), CD3 쇄(즉, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ζ), 또는 2 이상의 TCR 쇄 또는 CD3 쇄에 의해 형성된 복합체(예를 들어, TCRα와 TCRβ의 복합체, TCRγ와 TCRδ의 복합체, CD3ε과 CD3δ의 복합체, CD3γ과 CD3ε의 복합체, 또는 TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, 및 2개의 CD3ε 쇄의 서브-TCR 복합체)를 지칭한다.

본원에 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 면역원성 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생성, 특이적인 면역학적-수용성 세포(예를 들어, T 세포)의 활성화, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 항원(면역원성 분자)은 예를 들어, 펩티드, 글리코펩티드, 폴리펩티드, 글리코폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 지질 등일 수 있다. 항원은 합성되거나, 재조합 방식으로 생성되거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것이 자명하다. 하나 이상의 항원을 함유할 수 있는 예시적인 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포, 생물학적 유체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 항원은 항원을 발현하도록 변형되거나 유전적으로 조작된 세포에 의해 생성될 수 있거나, 내인적으로(예를 들어, 인간 개입에 의한 변형 또는 유전 공학 없이) 면역원성인 돌연변이 또는 다형성을 발현하는 세포에 의해 생성될 수 있다.

본원에 사용된 "신생항원"은 대상의 게놈(즉, 대상으로부터의 건강한 조직 샘플)에서 이전에 관찰되지 않은 새로운 항원 또는 항원성 에피토프를 생성하거나, (a) 세포의 항원 처리 및 수송 기작에 의해 처리되고 MHC(예: HLA) 분자와 관련하여 세포 표면에 제시되고; (b) 면역 반응(예를 들어, 세포(T 세포) 반응)을 유도하는 숙주의 면역계에 의해 "보여지거나" 인식되는 구조적 변화, 변경 또는 돌연변이를 포함하는 숙주 세포 생성물을 지칭한다. 신생항원은 예를 들어 변경되거나 돌연변이된 산물을 초래하는 변경(치환, 추가, 결실)을 갖는 코딩 폴리뉴클레오티드, 또는 세포 내로 외인성 핵산 분자 또는 단백질의 삽입, 또는 유전적 변화를 초래하는 환경 요인에 대한 노출(예: 화학적, 방사선학적)로부터 유래할 수 있다. 신생항원은 종양 항원과 별도로 발생하거나 종양 항원으로부터 발생하거나 종양 항원과 연관될 수 있다. "종양 신생항원"(또는 "종양 특이적 신생항원")은 종양 세포 또는 종양 내 다수의 세포와 연관되거나, 그로부터 발생하거나, 그 내에서 발생하는 신생항원 결정인자를 포함하는 단백질을 지칭한다. 종양 신생항원 결정인자는 예를 들어, 종양 세포(예: 췌장암, 폐암, 결장직장암)의 DNA에 의해 코딩되는 하나 이상의 체세포 돌연변이 또는 염색체 재배열을 포함하는 항원성 종양 단백질 또는 펩티드 및 바이러스 관련 종양과 관련된 바이러스 오픈 리딩 프레임으로부터의 단백질 또는 펩티드 상에서 발견된다.

용어 "에피토프" 또는 "항원성 에피토프"는 동족 결합 분자, 예컨대, 면역글로불린, T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체, 또는 다른 결합 분자, 도메인 또는 단백질에 의해서 인식되거나 특이적으로 결합되는 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열 또는 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면기, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄를 함유하고, 특정 3차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특정 전하 특성을 가질 수 있다.

본원에 사용된 "특이적으로 결합한다" 또는 "에 대해서 특이적"은 일부 실시양태에서, 샘플 내 임의의 다른 분자 또는 성분과 유의하게 회합 또는 통합되지 않고, 10⁹M^-1(이것은 이러한 회합 반응에 대한 오프-레이트 [k_off]에 대한 온-레이트 [k_on]의 비와 동일함) 이상의 친화도 또는 K_A(즉, 1/M을 단위로 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수) 또는 10^-9M 이상의 기능적 결합 활성 또는 EC₅₀으로 표적 분자에 TCR 세포 수용체(TCR) 또는 이의 결합 도메인(예를 들어 scTCR 또는 이의 융합 단백질)이 회합 또는 통합하는 것을 지칭한다. TCR은 "고 친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인(또는 이의 융합 단백질) 또는 "저 친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인(또는 이의 융합 단백질)으로 분류될 수 있다. "고 친화도" TCR 또는 결합 도메인은 적어도 10⁹　M^-1, 적어도 10¹⁰ M^-1, 적어도 10¹¹ M^-1, 적어도 10¹² M^-1, 또는 적어도 10¹³ M^-1의 K_A를 갖는 TCR 또는 이의 결합 도메인을 지칭한다. "저 친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인은 최대 10⁷M^-1, 최대 10⁶M^-1, 최대 10⁵M^-1의 K_A를 갖는 결합 단백질 또는 결합 도메인을 지칭한다. 대안적으로, 친화도는 M(예를 들어, 10^-5M 내지 10^-13M 또는 그 미만) 단위로 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(K_D)로서 정의될 수 있다.

"기능적 결합 활성"이라는 용어는 리간드의 주어진 농도에 대한 시험관 내 T 세포 반응의 생물학적 측정 또는 활성화 역치를 지칭하며, 여기서 생물학적 측정은 사이토카인 생성(예: IFNγ 생성, IL-2 생성 등), 세포독성 활성 및 증식을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사이토카인을 생성하거나, 세포독성이거나, 증식함으로써 매우 낮은 항원 용량에 대해 시험관 내에서 생물학적으로(면역학적으로) 반응하는 T 세포는 높은 기능적 결합 활성을 갖는 것으로 간주되는 반면, 더 낮은 기능적 결합 활성을 갖는 T 세포는 높은 결합 활성 T 세포와 유사한 면역 반응이 유도되기 전에 더 많은 양의 항원을 필요로 한다. 기능적 결합 활성은 친화성 및 결합 활성과는 다른 것으로 이해될 것이다. 친화도는 결합 단백질과 항원/리간드 사이의 주어진 결합의 강도를 나타낸다. 일부 결합 단백질은 다가이고 여러 항원에 결합한다. 이 경우 전체 연결의 강도가 결합 활성이다.

본원에 사용된 "기능적 결합 활성"은 T 세포에 의해 발현되는 TCR의 활성화 역치의 정량적 결정인자를 지칭한다. 생체 내에서, T 세포는 TCR 결합 활성(높거나 낮음)에 관계없이 유사한 항원 용량에 노출되지만, 기능적 결합 활성과 면역 반응의 효과 사이에는 수많은 상관관계가 존재한다. 일부 생체 외 연구는 별개의 T 세포 기능(예: 증식, 사이토카인 생성 등)이 다른 역치에서 촉발될 수 있음을 보여주었다(예를 들어, Betts et al., J. Immunol. 172:6407, 2004; Langenkamp et al., Eur. J. Immunol. 32:2046, 2002 참조). 기능적 결합 활성에 영향을 미치는 요인에는 (a) pMHC-복합체에 대한 TCR의 친화성, 즉 TCR과 pMHC 사이의 상호작용 강도(Cawthon et al., J. Immunol. 167:2577, 2001), (b) TCR 및 CD4 또는 CD8 공-수용체의 발현 수준, 및 (c) 신호전달 분자의 분포 및 조성(Viola and Lanzavecchia, Science 273:104, 1996)뿐만 아니라, T 세포 기능 및 TCR 신호 전달을 약화시키는 분자의 발현 수준이 포함된다.

기준선과 특정 노출 시간 후 최대 반응 사이에서 최대 반응의 절반을 유도하는 데 필요한 항원의 농도를 "절반 최대 유효 농도" 또는 "EC₅₀"이라고 한다. EC₅₀ 값은 일반적으로 몰농도(몰/리터) 양으로 표시되지만 S자형 그래프를 제공하는 log₁₀(EC₅₀)과 같이 종종 로그값으로 변환된다(예: 도 5A 참조). 예를 들어, EC₅₀이 1 μM(10^-6M)인 경우 log₁₀(EC₅₀) 값은 -6이다. 사용된 또 다른 값은 EC₅₀(-log₁₀(EC₅₀))의 음의 로그로 정의되는 pEC₅₀이다. 상기 예에서, 1 μM에 해당하는 EC₅₀은 6의 pEC₅₀ 값을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR의 기능적 결합 활성은 T 세포에 의한 IFNγ 생성을 촉진하는 능력의 척도가 될 것이며, 이는 본원에 설명된 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. "고기능 결합 활성" TCR 또는 이의 결합 도메인은 적어도 10^-9　M, 적어도 약 10^-10 M, 적어도 약 10^-11 M, 적어도 약 10^-12 M, 또는 적어도 약 10^-13 M의 EC₅₀을 갖는 TCR 또는 이의 결합 도메인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 반응은 IFN-γ 생성; 예를 들어, 항원에 반응하여 TCR을 발현하는 면역 세포(예: T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포)에 의한 IFN-γ의 생성을 포함한다.

일부 측면에서, "WT1_37-45 항원" 또는 "WT1_37-45 펩티드" 또는 "WT1_37-45 펩티드 항원" 또는 "p37 펩티드" 또는 "p37 항원" 또는 "p37 펩티드 항원"은 각각 길이가 약 9개 아미노산 내지 약 15개 아미노산 범위이고 MHC(예를 들어, HLA) 분자와 복합체를 형성할 수 있는 VLDFAPPGA(서열 번호 59)의 아미노산 서열을 포함하는 WT1 단백질의 천연 또는 합성적으로 생성된, MHC(예: HLA) 분자와 복합체를 형성할 수 있는 부분을 지칭하며, 상기 복합체는 WT1 펩티드:MHC(예: HLA) 복합체에 특이적인 TCR과 결합할 수 있다. WT1은 내부 숙주 단백질이기 때문에, WT1 항원 펩티드는 클래스 I MHC의 맥락에서 제시될 것이다. 특정 실시양태에서, WT1 펩티드 VLDFAPPGA(서열 번호 59)는 인간 클래스 I HLA 대립유전자 HLA-A^*201과 연관될 수 있다.

일부 측면에서, 본원에서 상호교환가능한 어구 "WT1_37-45 펩티드-특이적 결합 단백질" 또는 "WT1_37-45 펩티드-특이적 TCR" 또는 "WT1_37-45 항원-특이적 TCR" 또는 "WT1_37-45 펩티드 항원-특이적 TCR" 또는 "WT1 p37 펩티드-특이적 결합 단백질" 또는 "WT1 p37 펩티드-특이적 TCR" 또는 "WT1 p37 항원-특이적 TCR" 또는 "WT1 p37 펩티드 항원-특이적 TCR"은 예를 들어, 세포 표면에서 약 또는 적어도 약 특정 친화성 또는 기능적 결합 활성, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 높은 기능적 결합 활성으로 MHC 또는 HLA 분자와 복합된 WT1 p37 펩티드에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 결합 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 제공된 바와 같은 TCR 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, WT1-특이적 결합 단백질은 약 -2.5 μM 내지 약 -3.75 μM 범위(-8.5M 내지 약 -9.8M에 해당)의 기능적 결합 활성 log[EC₅₀]으로 WT1 유래 펩티드:HLA 복합체(또는 WT1 유래 펩티드:MHC 복합체)에 결합한다. 이들 값에 대한 EC₅₀ 범위는 예를 들어 하기 단락 및 본원의 실시예 1에 기재된 검정에 의해 측정시 약 3.16×10^-9 M 내지 약 1.58×10^-10 M 범위이다.

친화도, 겉보기 친화도, 상대 친화도 또는 기능적 결합 활성을 평가하기 위한 분석은 알려져 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 TCR의 겉보기 친화도 또는 기능적 결합 활성은 p37 펩티드와 관련된 다양한 농도의 사량체에 대한 결합을, 예를 들어 표지된 사량체를 사용하는 유세포 분석에 의해 평가함으로써 측정된다. 일부 예에서, TCR의 겉보기 K_D또는 EC₅₀을 농도 범위에서 표지된 사량체의 2배 희석액을 사용하여 측정한 후 비선형 회귀에 의해 결합 곡선을 결정한다. 예를 들어, 겉보기 K_D는 최대 결합의 절반을 생성하는 리간드의 농도로 결정되는 반면, EC₅₀은 예를 들어 사이토카인(예: IFNγ, IL-2)의 최대 절반 생성을 생성하는 리간드의 농도로 결정된다.

"MHC-펩티드 사량체 염색"은 일부 측면에서, 적어도 하나의 항원(예를 들어, WT1)에 동족인(예를 들어, 이와 동일하거나 또는 관련된) 아미노산 서열을 갖는 동일한 펩티드를 각각 포함하는 MHC 분자의 사량체를 특징으로 하는 항원-특이적 T 세포를 검출하기 위해 사용되는 검정을 지칭하되, 복합체는 동족 항원에 특이적인 T 세포 수용체에 결합할 수 있다. 각각의 MHC 분자는 비오틴 분자로 태그될 수 있다. 비오티닐화된 MHC/펩티드는 형광적으로 표지될 수 있는 스트렙타비딘의 첨가에 의해 사량체화된다. 사량체는 형광 표지를 통해 유세포 분석에 의해 검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, MHC-펩티드 사량체 검정은 본 개시내용의 향상된 친화도 TCR을 검출하거나 또는 선택하기 위해 사용된다.

사이토카인 수준은, 예를 들어, ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 염색, 및 유세포 분석 및 이들의 조합(예를 들어, 세포내 사이토카인 염색 및 유세포 분석)을 포함하여 본 명세서에 기재되고 당업계에서 실행되는 방법에 따라 결정될 수 있다. 면역 반응의 항원-특이적 유발 또는 자극으로부터 초래되는 면역 세포 증식 및 클론 확장은 림프구를 단리시키는 것, 예컨대 말초 혈액 세포 또는 림프절로부터의 세포의 샘플에서 림프구를 순환시키는 것, 항원으로 세포를 자극하는 것 및 사이토카인 생성, 세포 증식 및/또는 세포 생존도를, 예컨대 삼중수소 티미딘의 혼입 또는 비방사성 분석, 예컨대 MTT 분석 등에 의해 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다. Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응 사이의 균형에 대한 본원에 기재된 면역원의 효과는, 예를 들어, Th1 사이토카인, 예컨대 IFN-γ, IL-12, IL-2 및 TNF-β 및 2형 사이토카인, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13 수준을 결정함으로써 조사할 수 있다.

일부 측면에서, 용어 "WT1 p37-특이적 결합 도메인" 또는 "WT1_37-45-특이적 결합 도메인" 또는 "WT1 p37-특이적 결합 단편" 또는 ""WT1_37-45-특이적 결합 단편"은 MHC 또는 HLA 분자와 복합화된 WT1 p37 항원에 대한 특이적 결합을 담당하는 WT1 특이적 TCR의 도메인 또는 부분을 지칭한다. TCR 단독(즉, WT1 특이적 TCR의 다른 부분 없이)의 WT1 p37 항원 특이적 결합 도메인은 가용성이고 10^-9M 미만, 약 10^-10M 미만, 약 10^-11M 미만, 약 10^-12M 미만, 또는 약 10_-13M 미만의 K_D로 WT1 p37 펩티드:MHC 복합체에 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, WT1 p37 펩티드-특이적 TCR은 높은 기능적 결합 활성을 가지며, 8.5 이상(예를 들어, 약 9 이하, 약 9.5 이하, 약 10 이하, 약 10.5, 약 11, 약 11.5, 약 12, 약 12.5, 또는 약 12.5 이하 또는 약 13)의 pEC₅₀에서 T 세포 표면 상의 VLDFAPPGA(서열 번호 59):인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 특이적으로 결합하고 IFNγ 생성을 촉진한다. 예시적인 WT1 p37 펩티드-특이적 결합 도메인은 본 개시내용의 항 WT1 p37 펩티드 TCR이거나 유래될 수 있는 WT1 p37 펩티드-특이적 scTCR(예를 들어, Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vα, 또는 Vα-L-Vβ-Cβ와 같은 단쇄 αβTCR 단백질, 여기서 Vα 및 Vβ는 각각 TCRα 및 β 가변 도메인이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCRα 및 β 불변 도메인이고, L은 링커임)을 포함한다.

항원 제시 세포(APC)(예컨대, 수지상 세포, 대식세포, 림프구 또는 다른 세포 유형)에 의한 항원 처리의 원리, 및 면역상용성(예를 들어, 항원 제시에 관련된 MHC 유전자의 적어도 하나의 대립유전자 형태를 공유함) APC와 T 세포 간의 주요 조직적합성 복합체(MHC)-제한 제시를 비롯한, APC에 의한 T 세포에 대한 항원 제시의 원리는 널리 확립되어 있다(예를 들어, 문헌[Murphy, Janeway's Immunobiology(8^th Ed.) 2011 Garland Science, NY; chapters 6, 9 and 16] 참조). 예를 들어, 사이토졸(예를 들어, 종양 항원, 세포내 병원균)에서 기원한 처리된 항원 펩티드는 일반적으로 약 7개의 아미노산 내지 약 11개의 아미노산 길이이고, 클래스 I MHC 분자와 회합할 것이지만, 혈관계에서 처리되는 펩티드(예를 들어, 박테리아, 바이러스)는 약 10개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산의 길이에서 달라질 것이고, 클래스 II MHC(HLA) 분자와 회합한다.

본원에 사용된 "막관통 도메인"은 세포막에서 열역학적으로 안정하고 일반적으로 길이가 약 15개 아미노산 내지 약 30개 아미노산인 3차원 구조를 갖는 임의의 아미노산 서열을 의미한다. 소수성 막관통 도메인의 구조는 알파 나선, 베타 배럴, 베타 시트, 베타 나선, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예시적인 막관통 도메인은 CD4, CD8, CD28, 또는 CD27로부터의 막관통 도메인이다.

본원에 사용된 "면역 이펙터 도메인"은 적절한 신호를 수신할 때 세포에서 면역학적 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진할 수 있는 scTCR 또는 CAR 융합 단백질의 세포내 부분이다. 특정 실시양태에서, 면역 이펙터 도메인은 결합될 때 신호를 수신하는 단백질 또는 단백질 복합체의 일부이거나, 면역 이펙터 도메인으로부터 신호를 촉발하는 표적 분자에 직접 결합한다. 면역 이펙터 도메인은 세포 내 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)와 같은 하나 이상의 신호 전달 도메인 또는 모티프를 함유하는 경우 면역 세포 반응을 직접 촉진할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이펙터 도메인은 세포 반응을 직접적으로 촉진하는 하나 이상의 다른 단백질과 결합함으로써 세포 반응을 간접적으로 촉진할 것이다. 예시적인 면역 이펙터 도메인은 4-1BB, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NOTCH1, Wnt, NKG2D, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, 또는 이러한 도메인 중 2개 또는 3개의 임의의 조합으로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.

일부 측면에서 "링커"는 2개의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 도메인, 영역 또는 모티프를 연결하는 아미노산 서열을 지칭한다. 예시적인 링커는 T 세포 수용체 V_α/β와 C_α/β 쇄(예를 들어, V_α-C_α, V_β-C_β, V_α-V_β)을 연결하거나, 각각의 V_α-C_α, V_β-C_β, V_α-V_β 쌍을 힌지 또는 막관통 도메인에 연결하여, 생성된 단일 쇄 폴리펩티드가 T 세포 수용체와 동일한 표적 분자에 대해 특이적 결합 친화도 또는 기능적 결합 활성을 유지하도록 2개의 하위 결합 도메인의 상호작용에 충분한 스페이서 기능 및 유연성을 제공하는 5 내지 약 35개의 아미노산 서열을 구체적으로 지칭하는 "가변 도메인 링커"이다. 특정 실시양태에서, 가변 도메인 링커는 약 10 내지 약 30개의 아미노산 또는 약 15 내지 약 25개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 가변 도메인 링커 펩티드는 1 내지 10개의 Gly_xSer_y 반복 (여기서 x 및 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 단 x 및 y는 둘 다 0은 아니다)(예를 들어, Gly₄Ser(서열 번호 171), Gly₃Ser(서열 번호 172), Gly₂Ser, 또는 (Gly₃Ser)_n(Gly₄Ser)₁(서열 번호 173), (Gly₃Ser)_n(Gly₂Ser)_n(서열 번호 174) (Gly₃Ser)_n(Gly₄Ser)_n(서열 번호 175), 또는 (Gly₄Ser)_n(서열 번호 171), 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수임)을 포함하고, 연결된 가변 도메인은 기능적 결합 도메인(예: scTCR)을 형성한다.

일부 측면에서, "접합 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 두 인접한 모티프, 영역 또는 도메인 사이, 예컨대 결합 도메인과 인접한 불변 도메인 사이 또는 TCR 쇄와 인접한 자기 절단 펩티드 사이의 하나 이상의(예를 들어, 약 2 내지 10개의) 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 융합 단백질의 작제물 설계(예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 작제 동안 제한 효소 부위의 사용으로부터 초래된 아미노산 잔기)로부터, 또는 유전적 재조합 과정 또는 재배열 이벤트(예: RAG 매개 재배열)에서 초래될 수 있다.

일부 측면에서, "변경된 도메인" 또는 "변경된 단백질"은 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%)의 야생형 모티프, 영역, 도메인, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질(예를 들어, 야생형 TCRα 쇄, TCRβ 쇄, TCRα 불변 도메인, TCRβ 불변 도메인)에 대해 비동일 서열 동일성을 가지며 바람직하게는 TCRα 및 β 가변 도메인으로부터의 CDR3은 변경되지 않은 모티프, 영역, 도메인, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에서, TCR 불변 도메인은 원하는 TCR 쇄의 쌍화를 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형으로 인한 이종 TCR α 쇄와 이종 TCR β 쇄 사이의 숙주 T 세포에서의 쌍화 향상은 이종 TCR 쇄와 내인성 TCR 쇄의 바람직하지 않은 잘못된 쌍화에 비해 두 이종 쇄를 포함하는 TCR의 우선적인 조립으로 이어진다(예를 들어, TCR 변형이 본원에 참고로 포함되는 Govers et al., Trends Mol. Med. 16(2):77(2010) 참조). 이종 TCR 쇄의 쌍화를 향상시키기 위한 예시적인 변형은 이종 TCR α 쇄 및 β 쇄 각각에 상보적 시스테인 잔기의 도입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 TCR α 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 위치 48(전장, 성숙한 인간 TCR α 쇄 서열에 상응)에서 시스테인을 코딩하고, 이종성 TCR β 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 위치 57(전장 성숙 인간 TCR β 쇄 서열에 상응)에서 시스테인을 코딩한다.

"키메라 항원 수용체"(CAR)는, 세포의 표면 상에 제시될 때 융합 단백질이 수용체로서 기능할 수 있는, 자연적으로 발생하지 않거나 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2개 이상의 자연 발생 아미노산 서열을 함유하도록 조작된 융합 단백질을 지칭한다. CAR은 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(임의로 공동 자극성 도메인(들)을 함유함)에 연결된 항원 결합 도메인(예를 들어, 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자, 예컨대, 암 항원에 대해 특이적인 TCR로부터 유래되거나 수득된 TCR 결합 도메인, 항체로부터 유래되거나 수득된 scFv, 또는 NK 세포로부터의 살해 면역수용체로부터 유래되거나 수득된 항원 결합 도메인으로부터 수득되거나 유래됨)을 포함하는 세포외 부분을 포함한다(예를 들어, CAR 작제물 및 이의 제조 방법이 본원에 참고로 포함되는 Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388(2013); see also Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220(2016), Stone et al., Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163(2014), 및 Walseng et al., Scientific Reports 7:10713(2017) 참조). (예를 들어, 펩티드:HLA 복합체와 관련하여) WT1 항원에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 CAR은 TCR Vα 도메인 및 Vβ 도메인을 포함한다.

본원에서 사용되는, "핵산" 또는 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 일부 측면에서, 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 또는 시험관 내 번역에 의해 생성된 임의의 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오티드, 이의 단편뿐 아니라 임의의 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 또는 엑소뉴클레아제 작용에 의해 생성된 단편을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 PCR에 의해 생성된다. 핵산은 천연 유래 뉴클레오티드(예컨대 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드), 천연 유래 뉴클레오티드의 유사체(예를 들어, 천연 유래 뉴클레오티드의 α-거울상체 형태), 또는 이들 둘의 조합물인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티, 또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에서의 변형 또는 대체를 가질 수 있다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 결합의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 등을 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 하나일 수 있다.

일부 측면에서, 용어 "단리된"은 물질이 이의 본래의 환경(예를 들어, 천연 유래라면 천연 환경)으로부터 제거된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 천연 유래 핵산 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 천연 시스템에서 공동 존재하는 물질 중 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 핵산 또는 폴리펩티드가 단리된다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 핵산 또는 폴리펩티드는 조성물(예를 들어, 세포 용해물)의 부분일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물은 핵산 또는 폴리펩티드에 대한 천연 환경의 부분이 아니도록 여전히 단리된다. 용어 "유전자"는 폴리펩티드 쇄를 생성하는 데 수반되는 DNA 세그먼트를 의미하며; 이는 코딩 영역 앞과 뒤의 영역("리더 및 트레일러 (trailer)")뿐만 아니라 개개 코딩 세그먼트 사이의(엑손) 개재 서열(인트론)을 포함한다.

일부 측면에서, 본원에서 사용되는 용어 "재조합"은 외인성 또는 동종 핵산 분자의 도입에 의해 변형되는, 인간 개입에 의해 유전자 조작된 세포, 미생물, 핵산 분자 또는 벡터를 지칭하거나, 또는 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현이 제어되거나, 하향조절되거나, 구성적이되도록 변경된 세포 또는 미생물을 지칭한다. 인간-발생 유전자 변경은, 예를 들어, (프로모터와 같은 발현 제어 요소를 포함할 수 있는) 하나 이상의 단백질 또는 효소를 코딩하는 핵산 분자를 도입하는 변형, 또는 세포의 유전자 물질에 대한 다른 핵산 분자 첨가, 결실, 치환 또는 다른 기능성 파괴 또는 첨가를 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 참조 또는 모 분자로부터의 이종 또는 상동성 폴리펩티드의 암호 영역 또는 이의 기능성 단편에서의 변형을 포함한다.

본원에서 사용되는, "돌연변이" 또는 "돌연변이화"는 일부 측면에서, 참조 또는 야생형 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자에 비해 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자에서의 변화를 각각 지칭한다. 돌연변이는 뉴클레오티드(들) 또는 아미노산(들)의 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열에서의 몇몇 상이한 유형의 변화를 초래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 돌연변이는 1 또는 3개의 코돈 또는 아미노산의 치환, 1 내지 약 5개의 코돈 또는 아미노산의 결실, 또는 이들의 조합이다.

"보존적 치환"은 일부 측면에서, 하나의 아미노산의 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환으로서 당업계에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 당 업계에 이미 알려졌다(예를 들어: WO 97/09433의 10 페이지; 문헌[Lehninger, Biochemistry, 2^nd Edition; Worth Publishers, Inc. NY, NY, pp.71-77, 1975; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, p. 8, 1990] 참조).

용어 "작제물"은 일부 측면에서, 재조합 핵산 분자를 함유하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 작제물은 벡터(예를 들어, 박테리아 벡터, 바이러스 벡터)에 존재할 수 있거나 또는 게놈에 통합될 수 있다. "벡터"는 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는, 예를 들어, 염색체, 비-염색체, 반-합성 또는 합성 핵산 분자를 포함할 수 있는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, RNA 벡터 또는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 예시적인 벡터는 그들이 연결된 핵산 분자(발현 벡터)의 자율적 복제(에피솜 벡터) 또는 발현을 가능하게 하는 것이다.

예시적인 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스(예를 들어, 아데노-연관 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 오르토-믹소바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스(예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어, 홍역 및 센다이(Sendai)), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 피코르나바이러스 및 알파바이러스, 및 이중-가닥 DNA 바이러스(아데노바이러스, 헤르페스(예를 들어, 단순포진 바이러스 1형 및 2형, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스) 및 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아, 계두 및 카나리아두창)를 포함)를 포함한다. 다른 바이러스는, 예를 들어, 노워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파보바이러스, 헤파드나바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈증-육종, 포유동물 C-형, B-형 바이러스, D-형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

일부 측면에서, 본원에서 사용되는 "렌티바이러스 벡터"는 통합 또는 비통합일 수 있고, 상대적으로 거대한 패키징 능력을 가지며, 다양한 상이한 세포 유형을 형질도입할 수 있는, 유전자 전달을 위한 HIV-기반 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 렌티바이러스 벡터는 보통 셋(패키징, 외피 및 전달) 이상의 플라스미드의 생성자 세포 내로의 일시적 형질감염 후에 생성된다. HIV와 같이, 렌티바이러스 벡터는 세포 표면 상에서 수용체와 바이러스 표면 당단백질의 상호작용을 통해 표적 세포에 유입된다. 유입 시, 바이러스 RNA는 바이러스 역전사효소 복합체에 의해 매개되는 역전사를 겪는다. 역전사 산물은 감염 세포의 DNA 내로의 바이러스 통합을 위한 기질인, 이중 가닥 선형 바이러스 DNA이다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 일부 측면에서, 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서의 2 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 해당 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된다(즉, 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있다). "연결되지 않은"은 회합된 유전자 요소가 서로 가깝게 회합되지 않고 하나의 기능은 다른 것에 영향을 미치지 않는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는, "발현 벡터"는 일부 측면에서, 적합한 숙주에서 핵산 분자의 발현을 달성할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 함유하는 DNA 작제물을 지칭한다. 이러한 제어 서열은 전사를 달성하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 제어하기 위한 선택적 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 바이러스 또는 단순히 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제하고 작용할 수 있거나, 또는 일부 예에서, 게놈 자체에 통합될 수 있다. 본 명세서에서, "플라스미드", "발현 플라스미드", "바이러스" 및 "벡터"는 종종 상호 호환 가능하게 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "발현"은 일부 측면에서, 핵산 분자, 예컨대 유전자의 코딩 서열에 기반하여 폴리펩티드가 생성되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 전사, 전사후 제어, 전사후 변형, 번역, 번역후 제어, 번역후 변형 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다.

세포내에 핵산 분자를 삽입하는 것과 관련하여 용어 "도입된"은 일부 측면에서, "형질감염", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하며, 진핵 또는 원핵 세포 내로 핵산 분자의 도입에 대한 언급을 포함하되, 핵산 분자는 세포의 게놈(예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)에 도입되거나, 자율 복제로 전환되거나 또는 일시적으로 발현될 수 있다(예를 들어, 형질감염된 mRNA).

본원에서 사용되는 "이종성" 또는 "외인성" 핵산 분자, 작제물 또는 서열은 일부 측면에서, 숙주 세포에 천연이 아니지만, 숙주 세포로부터의 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부에 대해 상동성일 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부를 지칭한다. 이종 또는 외인성 핵산 분자, 작제물 또는 서열의 공급원은 상이한 속 또는 종으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이종 또는 외인성 핵산 분자는, 예를 들어, 접합, 형질전환, 형질감염, 전기천공법 등에 의해 숙주 세포 또는 숙주 게놈에 첨가되며(즉, 내인성 또는 천연이 아님), 이때 첨가된 분자는 숙주 게놈에 통합될 수 있거나 또는 염색체외 유전자 물질로서(예를 들어, 플라스미드 또는 자기-복제 벡터의 다른 형태로서) 존재할 수 있고, 다중 카피물에 존재할 수 있다. 또한, "이종성"은 숙주 세포가 상동 단백질 또는 활성을 코딩하더라도, 숙주 세포 내로 도입된 외인성 핵산 분자에 의해 코딩되는 비천연 효소, 단백질 또는 기타 활성을 지칭한다. 또한, "변형" 또는 "이종" 폴리뉴클레오티드 또는 결합 단백질을 포함하는 세포는 자손 자체가 형질도입, 형질감염, 또는 달리 조작 또는 변경되었는지 여부에 관계없이 해당 세포의 자손을 포함한다.

본원에 기재된 바와 같이, 복수의 이종 또는 외인성 핵산 분자는 별개의 핵산 분자로서, 복수의 개별 제어된 유전자로서, 다시스트론성(polycistronic) 핵산 분자로서, 융합 단백질을 코딩하는 단일 핵산 분자로서 또는 이들의 임의 조합으로서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 숙주 세포는 WT1 항원 펩티드(예를 들어, TCRα 및 TCRβ)에 특이적인 원하는 TCR을 코딩하는 2 이상의 이종 또는 외인성 핵산 분자를 발현하도록 변형될 수 있다. 2 이상의 외인성 핵산 분자가 숙주 세포에 도입될 때, 2 이상의 외인성 핵산 분자가 단일 핵산 분자로서(예를 들어, 단일 벡터 상에서) 도입될 수 있거나, 별개의 벡터 상에서 단일 부위 또는 다중 부위에서 숙주 염색체에 통합될 수 있거나, 또는 이들의 임의 조합인 것이 이해된다. 언급된 이종 핵산 분자 또는 단백질 활성의 수는 코딩 핵산 분자의 수 또는 단백질 활성의 수(숙주 세포에 도입된 별개의 핵산 분자의 수는 아님)를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "내인성" 또는 "천연"은 일부 측면에서, 숙주 세포에 정상적으로 존재하는 유전자, 단백질 또는 활성을 지칭한다. 또한, 모 유전자, 단백질 또는 활성에 비해 돌연변이되거나, 과발현되거나, 셔플링되거나, 중복되거나 또는 달리 변경된 유전자, 단백질 또는 활성은 해당 특정 숙주 세포에 대해 내인성 또는 천연인 것으로 여전히 고려된다. 예를 들어, 제1 유전자로부터의 내인성 제어 서열(예를 들어, 프로모터, 번역 감쇠 서열)은 제2 천연 유전자 또는 핵산 분자의 발현을 변경시키거나 또는 조절하기 위해 사용될 수 있되, 제2 천연 유전자 또는 핵산 분자의 발현 또는 조절은 모 세포에서의 정상 발현 또는 조절과 상이하다.

일부 측면에서, 용어 "상동성" 또는 "상동체"는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 또는 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종 또는 외인성 핵산 분자는 천연 숙주 세포 유전자에 대해 상동성일 수 있고, 선택적으로 변경된 발현 수준, 상이한 서열, 변경된 활성 또는 이들의 임의 조합을 가질 수 있다.

일부 측면에서, 본원에서 사용되는 "서열 동일성"은, 필요하다면, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 다른 참조 폴리펩티드 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 하나의 서열 내 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 서열 동일성 값의 백분율은 문헌[Altschul et al.(1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에서 정의된 바와 같이 NCBI BLAST2.0 소프트웨어를 이용하여 생성될 수 있으며, 파라미터는 디폴트 값으로 설정한다.

본원에서 사용되는 "조혈 전구 세포"는 일부 측면에서, 조혈 줄기 세포 또는 태아 조직으로부터 유래될 수 있고, 성숙 세포 유형(예를 들어, 면역계 세포)으로 추가로 분화될 수 있는 세포이다. 예시적인 조혈 전구체 세포는 CD24^Lo Lin^- CD81⁺ 표현형 또는 흉선에서 발견되는 것을 갖는 것(전구체 흉선세포로서 지칭됨)을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "숙주"는 일부 측면에서, 관심 대상의 폴리펩티드(예를 들어, 높거나 향상된 친화성의 항-WT1TCR)를 생성하기 위해 이종 또는 외인성 핵산 분자로 유전자 변형에 대해 표적화된 세포(예를 들어, T 세포) 또는 미생물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 임의로 이종 또는 외인성 단백질의 생합성과 관련되거나 관련없는 목적하는 특성을 부여하는 다른 유전자 변형(예를 들어, 검출 가능한 마커; 결실, 변경 또는 절단된 내인성 TCR; 또는 증가된 공자극 인자 발현의 포함)을 이미 갖거나 또는 이들을 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 예를 들어, 변형된 세포에 대한 생존 및/또는 확장 이점을 촉진하기 위해 숙주 세포에서 면역 신호전달을 조절하는 단백질 또는 융합 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된다(예를 들어, WO 2016/141357의 면역조절 융합 단백질 참조, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에 제공된 바와 같은 TCR을 도입하거나 세포에서 면역억제 신호(예를 들어, 관문 억제제)를 녹다운 또는 최소화하도록 유전적으로 변형되며, 이러한 변형은 예를 들어 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 이룰 수 있다(예를 들어, US 2014/0068797, 미국 특허 번호 8,697,359; WO 2015/071474 참조). 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 WT1 항원 펩티드에 특이적인 TCRα 쇄를 코딩하는 이종 또는 외인성 핵산 분자로 형질도입된 인간 조혈 전구 세포이다.

본원에서 사용되는, "과증식성 장애"는 일부 측면에서, 정상 또는 질환이 없는 세포와 비교하여 과도한 성장 또는 증식을 지칭한다. 예시적인 과증식성 장애는 종양, 암, 신생물 조직, 암종, 육종, 악성 세포, 전암성 세포뿐만 아니라 비-신생물 또는 비악성 종양 과증식성 장애(예를 들어, 선종, 섬유종, 지방종, 평활근종, 혈관종, 섬유증, 재협착증뿐만 아니라 자가면역질환, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 염증성 장 질환 등)를 포함한다. 과증식성 질환의 맥락에서 보다 더 천천히 발생하는 비정상적이거나 과도한 성장을 수반하는 특정 질환은 "증식성 질환"으로 지칭될 수 있으며 특정 종양, 암, 신생물 조직, 암종, 육종, 악성 세포, 전악성 세포뿐만 아니라 비종양성 또는 비악성 장애도 포함한다.

또한, "암"은 고형 종양, 복수 종양, 혈액 또는 림프 또는 기타 악성 종양; 결합 조직 악성 종양; 전이성 질환; 장기 또는 줄기 세포 이식 후 최소 잔류 질병; 다약제 내성 암, 일차 또는 이차 악성 종양, 악성 종양과 관련된 혈관신생, 또는 다른 형태의 암을 포함하는 세포의 임의의 가속화된 증식을 지칭할 수 있다.

WT1 p37 항원 펩티드에 특이적인 TCR

특정 측면에서, 본 개시내용은 (a) T 세포 수용체(TCR) α 쇄 가변(V_α) 도메인 및 서열 번호 1 내지 11, 181, 187, 193, 199, 205, 211, 217, 223, 229, 235, 및 241 중 어느 하나에 나타낸 CDR3 아미노산 서열을 갖는 TCR β 쇄 가변(V_β) 도메인; (b) 서열 번호 12 내지 22, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 및 238 중 어느 하나에 나타낸 CDR3 아미노산 서열을 갖는 TCR V_α 도메인 및 TCR V_β 도메인; 또는 (c) 서열 번호 12 내지 22, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 및 238 중 어느 하나에 나타낸 CDR3 아미노산 서열을 갖는 TCR V_α 도메인 및 서열 번호 11-11, 181, 187, 193, 199, 205, 211, 217, 223, 229, 235, 및 241 중 어느 하나에 나타낸 CDR3 아미노산 서열을 갖는 TCR V_β 도메인을 포함하는 WT1 p37 펩티드-특이적 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 임의의 TCR 또는 이의 결합 도메인은 세포(예를 들어, T 세포) 표면 상에서 WT1 p37 펩티드:HLA 복합체에 특이적으로 결합할 수 있고/거나, 8.5 이상(예를 들어, 최대 약 8.6, 최대 약 8.65, 최대 약 8.7, 최대 약 8.72, 최대 약 8.75, 최대 약 8.8, 최대 약 9, 최대 약 9.1, 최대 약 9.2, 최대 최대 약 9.3, 최대 약 9.4, 약 9.5, 최대 약 9.6, 최대 약 9.68 최대 약 9.7, 최대 약 9.75, 최대 약 10, 최대 약 10.5, 최대 약 11, 최대 약 11.5, 최대 약 12, 최대 약 12.5, 또는 최대 약 13)의 pEC₅₀으로 IFNγ 생성을 촉진할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR은 9.0 이상의 pEC₅₀으로 IFNγ 생성과 함께, 또는 9.0 이상의 IFNγ 생성 pEC₅₀으로 VLDFAPPGA(서열 번호 59):인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR, 또는 이의 결합 도메인(예를 들어, scTCR 또는 이의 융합 단백질)은 WT1 p37 펩티드:HLA 복합체에 특이적으로 결합하고 8.5 내지 약 9.9, 또는 8.6 내지 약 9.8, 또는 8.7 내지 약 9.7, 또는 8.75 내지 약 9.65 등의 pEC₅₀ 범위에서 IFNγ 생성을 촉진할 수 있다. EC₅₀은 약 1.1×10^-9 M 내지 약 3.0×10^-10 M 또는 그 사이의 임의의 값 범위일 수 있다. 추가 예에서, 본 개시내용의 임의의 TCR은 CD8과 독립적으로 또는 이의 부재하에 세포 표면 상의 WT1 펩티드:HLA 복합체에 특이적으로 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, TCR은 약 10^-9M 이하의 K_D로 VLDFAPPGA(서열 번호 59):인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, HLA는 HLA-A^*201을 포함한다. 펩티드 항원 VLDFAPPGA(서열 번호 59)는 WT1 펩티드 항원이고 WT1 단백질의 아미노산 37-45에 상응한다.

본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 본 개시내용은 α 쇄 및 β 쇄를 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 제공하며, 여기서 TCR은 T 세포 표면 상의 WT1:HLA-A^*201 복합체에 결합하고, (a) 8.5 이상(예를 들어, 최대 약 9, 최대 약 9.5, 최대 약 10, 약 10.5, 약 11, 약 11.5, 약 12, 약 12.5, 또는 약 13)의 pEC₅₀으로 IFNγ 생성을 촉진하거나; (b) CD8과 독립적으로 또는 이의 부재하에 세포 표면에 결합한다.

특정 실시양태에서, V_β 도메인은 TRBV7-6*01 / TRBJ2-7*01, TRBV20-1*02 / TRBJ2-7*01, TRBV15*02 / TRBJ1-5*01, TRBV13*01 / TRBJ2-5*01, TRAJ50*01 / TRBJ2-7*01, TRBV11-3*01 / TRBJ1-1*01, TRBV19*01 / TRBJ1-6*02, TRBV27*01 / TRBJ2-7*01, TRBV13*01 / TRBJ2-7*01, TRBV11-1*01 / TRBJ1 4*01, 또는 TRBV4-3*01 / TRBJ1-3*01을 포함하거나 이로부터 유래된다. 추가 실시양태에서, V_α 도메인은 TRAV21*02 / TRAJ58*01, TRAV38-1*01 / TRAJ40*01, TRAV29/DV5*01 / TRAJ6*01, TRAV29/DV5*01 / TRAJ20*01, TRAV41*01 / TRAJ50*01, TRAV12-2*01 / TRAJ11*01, TRAV1-2*01 / TRAJ20*01, TRAV20*02 / TRAJ8*01, TRAV26-1*02 / TRAJ26*01, TRAV24*01 / TRAJ48*01, 또는 TRAV20*02 / TRAJ37*02를 포함하거나 이로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, TCR은 (a) TRBV7-6^*01/TRBJ2-7^*01을 포함하거나 그로부터 유래된 V_β 도메인 및 TRAV21^*02/TRAJ58^*01을 포함하거나 그로부터 유래된 V_α 도메인; (b) TRBV27^*01/TRBJ2-7*01을 포함하거나 그로부터 유래된 V_β 도메인 및 TRV20^*02/TRAJ8^*01을 포함하거나 그로부터 유래된 V_α 도메인; 또는 (c) TRBV13^*01/TRBJ2-5^*01을 포함하거나 그로부터 유래된 V_β 도메인 및 TRV29/DV5^*01/TRAJ20^*01을 포함하거나 유래된 V_α 도메인을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR은 (i) 서열 번호 194, 176, 182, 188, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 및 236 중 어느 하나에 기재된 CDR1α 아미노산 서열, 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체(여기서 임의로, 1 또는 2개의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함함); 및/또는 (ii) 서열 번호 195, 177, 183, 189, 201, 207, 213, 219, 225, 231, 및 237 중 어느 하나에 기재된 CDR2α 아미노산 서열, 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환(여기서 임의로, 1 또는 2개의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함함)을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR은 (i) 서열 번호 197, 179, 185, 191, 197, 203, 209, 215, 221, 227, 233, 및 239 중 어느 하나에 기재된 CDR1β 아미노산 서열 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체(여기서 임의로, 1 또는 2개의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함함); 및/또는 (ii) 서열 번호 198, 180, 186, 192, 204, 210, 216, 222, 228, 234, 및 240 중 어느 하나에 기재된 CDR2β 아미노산 서열, 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체(여기서 임의로, 1 또는 2개의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함함)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR은 (i) 각각 서열 번호 194, 195, 196 또는 12, 197, 198, 및 199 또는 1; (ii) 각각 서열 번호 176, 177, 178 또는 18, 179, 180, 및 181 또는 7; 각각 (iii) 각각 서열 번호 182, 183, 184 또는 20, 185, 186, 및 187 또는 9; (iv) 각각 서열 번호 188, 189, 190 또는 21, 191, 192, 및 193 또는 10; (v) 각각 서열 번호 200, 201, 202 또는 13, 203, 204, 및 205 또는 2; (vi) 각각 서열 번호 206, 207, 208 또는 14, 209, 210, 및 211 또는 3; (vii) 각각 서열 번호 212, 213, 214 또는 15, 215, 216, 및 217 또는 4; (viii) 각각 서열 번호 218, 219, 220 또는 17, 221, 222, 및 223 또는 6; (ix) 각각 서열 번호 224, 225, 226 또는 19, 227, 228, 및 229 또는 8; (x) 각각 서열 번호 230, 231, 232 또는 22, 233, 234, 및 235 또는 11; 또는 (xi) 각각 서열 번호 236, 237, 238 또는 16, 238, 240, 및 241 또는 5에 기재된, CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β, 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함한다.

본 개시내용의 임의의 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 바와 같이 "신호 펩티드"(리더 서열, 리더 펩티드 또는 전이 펩티드로도 알려짐)를 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 새로 합성된 폴리펩티드를 세포 내부 또는 외부의 적절한 위치로 표적화한다. 신호 펩티드는 국재화 또는 분비 도증 또는 이의 완료시 폴리펩티드로부터 제거될 수 있다. 신호 펩티드를 갖는 폴리펩티드는 본원에서 "전단백질"로 지칭되고, 이의 신호 펩티드가 제거된 폴리펩티드는 본원에서 "성숙" 단백질 또는 폴리펩티드로 지칭된다. 본원에 개시된 임의의 실시양태에서, 결합 단백질 또는 융합 단백질은 성숙 단백질을 포함하거나, 성숙 단백질이거나, 또는 전단백질이거나 이를 포함한다.

특정 실시양태에서, 서열 번호 23의 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 23의 아미노산 잔기 1-19가 제거된 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 242에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 24의 아미노산 잔기 1-15는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 24의 아미노산 잔기 1-15가 제거된 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 243에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 25의 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 25의 아미노산 잔기 1-15가 제거된 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 244에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 26의 아미노산 잔기 1-29는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 26의 아미노산 잔기 1-29가 제거된 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 245에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 27의 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 27의 아미노산 잔기 1-19가 제거된 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 246에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 28의 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 28의 아미노산 잔기 1-19가 제거된 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 247에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 29의 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 29의 아미노산 잔기 1-19가 제거된 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 248에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 30의 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 30의 아미노산 잔기 1-19가 제거된 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 249에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 31의 아미노산 잔기 1-29는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 31의 아미노산 잔기 1-29가 제거된 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 250에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 32의 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 32의 아미노산 잔기 1-19가 제거된 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 251에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 33의 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 성숙한 TCR Vβ 도메인이고 서열 번호 33의 아미노산 잔기 1-19가 제거된 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 252에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 34의 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 34의 아미노산 잔기 1-19가 제거된 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 253에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 35의 아미노산 잔기 1-20은 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 35의 아미노산 잔기 1-20이 제거된 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 254에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 36의 아미노산 잔기 1-26은 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 36의 아미노산 잔기 1-26이 제거된 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 255에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 37의 아미노산 잔기 1-26은 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 37의 아미노산 잔기 1-26이 제거된 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 256에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 38의 아미노산 잔기 1-22는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 38의 아미노산 잔기 1-22가 제거된 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 257에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 39의 아미노산 잔기 1-21은 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 39의 아미노산 잔기 1-21이 제거된 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 258에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 40의 아미노산 잔기 1-17은 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 40의 아미노산 잔기 1-17이 제거된 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 259에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 41의 아미노산 잔기 1-21은 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 41의 아미노산 잔기 1-21이 제거된 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 260에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 42의 아미노산 잔기 1-17은 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 42의 아미노산 잔기 1-17이 제거된 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 261에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 43의 아미노산 잔기 1-22는 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 43의 아미노산 잔기 1-22가 제거된 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 262에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 서열 번호 44의 아미노산 잔기 1-21은 신호 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 성숙한 TCR Vα 도메인이고 서열 번호 44의 아미노산 잔기 1-21이 제거된 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(즉, TCR Vα 도메인은 서열 번호 263에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다).

특정 실시양태에서, WT1 펩티드:HLA 복합체에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)는 서열 번호 253 내지 263 및 34 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 V_α 도메인을 갖고, 서열 번호 242 내지 252 및 23 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 이루어진 V_β 도메인을 갖는다. 특정 실시양태에서, V_α 도메인은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, V_β 도메인은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 특정 실시양태에서, (a) V_α 도메인은 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, V_β 도메인은 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나; (b) V_α 도메인은 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 V_β 도메인은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나; (c) V_α 도메인은 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 V_β 도메인은 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 특정 실시양태에서, V_α 도메인은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, V_β 도메인은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

일부 실시양태에서, Vα 도메인 및 Vβ 도메인은 서열 번호 (i) 각각 253 및 242; (ii) 각각 259 및 248; (iii) 각각 261 및 250; (iv) 각각 262 및 251; (v) 각각 257 및 246; (vi) 각각 254 및 243; (vii) 각각 255 및 244; (viii) 각각 256 및 245; (ix) 각각 258 및 247; (x) 각각 260 및 249; (xi) 각각 263 및 252; (xii) 각각 34 및 23; (xiii) 각각 40 및 29; (xiv) 각각 42 및 31; (xv) 각각 43 및 32; (xvi) 각각 35 및 24; (xvii) 각각 36 및 25; (xviii) 각각 37 및 26; (xix) 각각 39 및 28; (xx) 각각 41 및 30; (xxi) 각각 44 및 33; 또는 (xxii) 각각 38 및 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 WT1 p37 펩티드에 특이적인 고기능 결합 활성 재조합 TCR은 본원에 제시된 바와 같은 서열 번호 48 내지 58 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실을 갖는 변이 폴리펩티드 종을 포함하되, 단, CDR3은 변경되지 않고 TCR은 이의 특이적 WT1 p37 결합 기능을 보유하거나 실질적으로 보유한다.

아미노산의 보존적 치환은 익히 공지되었고, 자연적으로 발생하거나, TCR이 재조합적으로 생성될 때 도입될 수 있다. 아미노산 치환, 결실 및 첨가는 업계에 공지된 방법을 사용하여 단백질에 도입될 수 있다(예를 들어, Sambrook et　al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001 참조). 올리고뉴클레오티드-지정 부위-특이적(또는 세그먼트-특이적) 돌연변이 유발 절차는 원하는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변형된 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발, 오류가 발생하기 쉬운 중합효소 연쇄 반응 돌연변이 유발, 및 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 유발과 같은 무작위 또는 포화 돌연변이 유발 기술을 사용하여 면역원 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다(예를 들어, 상기 문헌(Sambrook et al., 참조).

당업자에 공지된 다양한 기준은 펩티드 또는 폴리펩티드의 특정 위치에서 치환된 아미노산이 보존적(또는 유사한)인지를 나타낸다. 예를 들어, 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 아미노산은 하기 카테고리에 포함될 수 있다: 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산); 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘); 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 베타-분지 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판). 분류하기가 다소 어려운 것으로 생각되는 프롤린은 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 류신, 발린, 이소류신 및 알라닌)과 특성을 공유한다. 특정 상황에서, 글루탐산의 글루타민 치환 또는 아스파르트산의 아스파라긴 치환은 글루타민 및 아스파라긴이 각각 글루탐산 및 아스파르트산의 아미드 유도체라는 점에서 유사한 치환으로 간주될 수 있다. 당 업계에서 이해되는 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 대체물을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써(예를 들어, GENEWORKS, Align, BLAST 알고리즘 또는 본원에 기술되고 당 업계에서 실시되는 다른 알고리즘을 사용하여) 결정된다.

WT1 p37 항원:MHC 복합체에 특이적인 야생형 TCR 또는 이의 결합 도메인의 변이체는 본원에 개시된 예시적인 임의의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 23 내지 58)과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖되, 단, V_β 도메인의 CDR3도 V_α 도메인의 CDR3도 변경을 포함하지 않으며, 다른 부분에 대한 변경은 기능적 결합 활성(또는 상대 친화도)을 야생형 TCR과 비교하여 10%, 15% 또는 20% 이상 감소시키지 않는 TCR을 포함할 수 있다. 일부 선택적인 실시양태에서, 변이체 TCR은 추가로 서열 번호 34 내지 44(모 V_α 도메인) 중 어느 하나 또는 서열 번호 23 내지 33(모 V_β 도메인) 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 V_α 도메인 CDR1, V_α 도메인 CDR2, V_β 도메인 CDR1, V_β 도메인 CDR2, 또는 이들의 임의 조합의 아미노산 서열에 변화가 없는 것을 포함한다. 이들 각각의 실시양태에서, TCR은 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 이상의 pEC₅₀에서 IFNγ 생성을 특이적으로 유도하는 능력을 유지하거나, 또는 TCR은 약 10^-9M 이하의 K_D로 펩티드 항원:HLA 복합체(예를 들어, VLDFAPPGA(서열 번호 59):HLA 복합체)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하고, 서열 번호 48 내지 58 중 어느 하나로 이루어진 야생형 TCR보다 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.3배, 3.5배, 최대 5배 이하로 특이적으로 결합한다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 34 내지 35 및 38 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 TCR α 쇄 가변(V_α) 도메인, 및 서열 번호 23 내지 25, 27, 28, 30, 32, 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 TCR β 쇄 가변(V_β) 도메인; (b) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 92%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 23 내지 25, 27, 28 30, 32, 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_β 도메인; 또는 (c) 서열 번호 34 내지 44의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 23 내지 25, 27, 28 30, 32, 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_β 도메인을 포함하는 p37 특이적 TCR 또는 이의 결합 도메인을 제공한다.

또 다른 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 34 내지 35 및 38 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 V_β 도메인; (b) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 92%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 92%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_β 도메인; 또는 (c) 서열 번호 34 내지 44의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 92%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_β 도메인을 포함하는 p37 특이적 TCR 또는 이의 결합 도메인을 제공한다.

또 다른 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 34 내지 35 및 38 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 31에 기재된 아미노산 서열과 적어도 93%의 서열 동일성을 갖는 V_β 도메인; (b) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 92%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 31에 기재된 아미노산 서열과 적어도 93%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_β 도메인; 또는 (c) 서열 번호 34 내지 44의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 31에 기재된 아미노산 서열과 적어도 93%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_β 도메인을 포함하는 p37 특이적 TCR 또는 이의 결합 도메인을 제공한다.

다른 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 34 내지 35 및 38 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 V_β 도메인; (b) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 92%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_β 도메인; 또는 (c) 서열 번호 34 내지 44의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_β 도메인을 포함하는 p37 특이적 TCR 또는 이의 결합 도메인을 제공한다.

또 다른 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 34 내지 35 및 38 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 23 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 V_β 도메인; (b) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 92%의 서열 동일성을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 23 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 TCR V_β 도메인; 또는 (c) 서열 번호 34 내지 44의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 23 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 TCR V_β 도메인을 포함하는 p37 특이적 TCR 또는 이의 결합 도메인을 제공한다.

상기 언급된 임의의 실시양태에서, TCR은 세포(예를 들어, T 세포) 표면 WT1 p37 펩티드 VLDFAPPGA(서열 번호 59):HLA 복합체에 결합하고 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 또는 그 이상의 pEC₅₀에서 IFNγ 생성을 특이적으로 유도하는 능력을 갖고/거나, TCR은 CD8과 독립적으로 또는 그의 부재하에 WT1 펩티드 VLDFAPPGA(서열 번호 59):HLA 세포 표면 복합체에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 언급된 임의의 실시양태에서, V_β 도메인은 서열 번호 23 내지 33 중 어느 하나에 각각 존재하는 CDR1 및/또는 CDR2와 비교하여 CDR1 및/또는 CDR2의 아미노산 서열에 변화를 포함하지 않는다.

특정 실시양태에서, 상기 언급된 임의의 WT1 p37 펩티드-특이적 T 세포 수용체(TCR)는 TCR의 항원-결합 단편일 수 있다. 추가 실시양태에서, TCR의 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)에 포함될 수 있는 단일쇄 TCR(scTCR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, WT1 p37 펩티드 특이적 TCR은 예를 들어 V_α도메인 및 α 쇄 불변 도메인을 포함하는 TCR α 쇄(여기서 TCR α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 가짐); V_β 도메인 및 β 쇄 불변 도메인을 포함하는 TCR β 쇄(여기서 TCR β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45 또는 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 서열 동일성을 가짐)를 포함하는 다중-쇄 결합 단백질이다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖는 α 쇄 불변 도메인, 및/또는 서열 번호 45 또는 46의 아미노산 서열을 갖는 β 쇄 불변 도메인을 포함하거나 이로 이루어진 WT1 p37 펩티드 특이적 TCR을 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용은 V_α 도메인 및 α 쇄 불변 도메인을 포함하는 TCR α 쇄를 포함하는 WT1 p37 펩티드 특이적 TCR을 제공하며, 여기서 (a) V_α 도메인은 서열 번호 34 내지 35 및 38 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖고, α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖거나; (b) V_α 도메인은 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 92%의 서열 동일성을 갖고, α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는다.

일부 실시양태에서, TCR은 V_α 도메인 및 α 쇄 불변 도메인을 포함하는 TCR α 쇄를 포함하고, 여기서 (a) V_α 도메인은 서열 번호 242 내지 252 및 34 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) V_α 도메인은 서열 번호 242 내지 252 및 34 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하거나 로 이루어진 것에 대해 적어도 90%(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는다.

일부 실시양태에서, α 쇄 불변 도메인이 존재하고 Vα 도메인과 α 쇄 불변 도메인은 함께 TCR α 쇄를 형성한다. 일부 실시양태에서, β 쇄 불변 도메인이 존재하고 Vβ 도메인과 β 쇄 불변 도메인은 함께 TCR β 쇄를 형성한다.

일부 실시양태에서, TCR은 scTCR을 포함하거나, 본원에 개시된 TCR로부터 유래된 scTCR이 제공된다. 일부 실시양태에서, TCR은 CAR을 포함하거나, 본원에 개시된 TCR로부터 유래된(예를 들어, 이로부터의 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는) CAR이 제공된다.

추가 실시양태에서, 상기 언급된 실시양태 중 어느 하나에 따른 WT1 특이적 고기능 결합 활성 재조합 TCR, 또는 이의 결합 도메인 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.

예로서 재조합적으로 생성된 가용성 TCR을 단리시키고 정제하는 데 유용한 방법은 재조합 가용성 TCR을 배양 배지에 분비하는 적합한 숙주 세포/벡터로부터 상등액을 얻는 단계 및 이어서 상업적으로 입수 가능한 필터를 이용하여 배지를 농축시키는 단계를 포함할 수 있다. 농축 후에, 농축물은 단일의 적합한 정제 기질에 또는 일련의 적합한 기질, 예컨대 친화도 기질 또는 이온 교환 수지에 적용될 수 있다. 하나 이상의 역상 HPLC 단계가 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제하기 위해 사용될 수 있다. 이들 정제 방법은 또한 면역원을 그의 천연 환경으로부터 단리시킬 때 사용될 수 있다. 본원에 기재된 단리된/재조합 가용성 TCR 중 하나 이상의 대규모 생성 방법은 회분식 세포 배양(batch cell culture)을 포함하는데, 이는 적절한 배양 조건을 유지하기 위해 모니터링되고 수집된다. 가용성 TCR의 정제는 본원에 기재되고 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 국내 및 외국 규제기관의 법 및 가이드라인을 따른다.

특정 실시양태에서, MHC와 복합체화된 WT1 p37 펩티드에 특이적인 고친화성 또는 고기능 결합 활성 TCR을 코딩하는 핵산 분자는 입양 전달 요법에서 사용하기 위해 숙주 세포(예를 들어, T 세포)를 형질감염/형질도입하기 위해 사용된다. 최신 TCR 시퀀싱이 기재되어 있고(예를 들어, 문헌[Robins et al., Blood 114:4099, 2009; Robins et al., Sci. Translat. Med. 2:47ra64, 2010; Robins et al.,(Sept. 10) J. Imm. Meth. Epub ahead of print, 2011; Warren et al., Genome Res. 21:790, 2011]), 본 개시에 따른 실시양태를 실행하는 과정에서 사용될 수 있다. 유사하게, T 세포에 목적하는 핵산을 형질감염/형질도입하기 위한 방법은, HLA 수용체와 복합체화된 WT1 펩티드 항원에 특이적인 고친화성 TCR로 지향된 것을 비롯하여, 본원의 교시에 기반하여, 본 명세서에 개시된 실시양태에 대한 이들 방법의 적용이 고려되도록, 목적하는 항원-특이성의 T 세포를 이용하는 입양 전달 절차(예를 들어, 문헌[Schmitt et al., Hum. Gen. 20:1240, 2009; Dossett et al., Mol. Ther. 17:742, 2009; Till et al., Blood 112:2261, 2008; Wang et al., Hum. Gene Ther. 18:712, 2007; Kuball et al., Blood 109:2331, 2007; US　2011/0243972; US 2011/0189141; Leen et al., Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007])를 갖는 것으로 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0087025호).

본원에 기재된 바와 같은 WT1-특이적 TCR 또는 이의 결합 도메인(예를 들어, 서열 번호 23 내지 58 및 이의 비-CD3 변이체)은 T　세포 결합, 활성화 또는 유도의 결정을 포함하고 또한 항원-특이적인 T 세포 반응의 결정을 포함하는, T 세포 활성을 검정하기 위한 임의의 다수의 당업계에 허용되는 방법에 따라 기능적으로 특성규명될 수 있다. 예는 T 세포 증식, T 세포 사이토카인 방출, 항원-특이적 T 세포 자극, MHC 제한된 T　세포 자극, 세포독성 T 림프구(CTL) 활성(예를 들어, 사전 부하된 표적 세포로부터 ⁵¹Cr 방출을 검출함으로써), T 세포 표현형 마커 발현의 변화 및 T-세포 기능의 다른 측정의 결정을 포함한다. 이들 및 유사한 검정을 수행하는 절차는, 예를 들어, 문헌[Lefkovits(Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998)]에서 찾을 수 있다. 또한 문헌[Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA(1986); Mishell and Shigii(eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA(1979); Green and Reed, Science 281:1309(1998)] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조한다.

WT1 p37 항원 펩티드에 특이적인 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

본원에 기재된 바와 같은 WT1 p37 펩티드에 특이적인 고친화성 또는 고기능 결합 활성 재조합 T 세포 수용체(TCR), 또는 이의 결합 도메인(예를 들어, scTCR 또는 이의 융합 단백질)을 코딩하는 이종, 단리 또는 재조합 핵산 분자는 본원에 기술된 다양한 방법 및 기술에 따라 생성 및 제조될 수 있다(실시예 참조). 대상 WT1 p37 펩티드에 대해 특이적인 고친화성 또는 고기능 결합 활성의 조작된 TCR 또는 이의 결합 도메인을 재조합적으로 생성하기 위해 사용되는 발현 벡터의 작제는 제한 엔도뉴클레아제 소화, 결찰, 형질전환, 플라스미드 정제 및 예를 들어 Sambrook et al. (1989 및 2001 editions; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) 및 Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 2003)에 기술된 바와 같은 DNA 시퀀싱의 사용을 비롯해 당업계에 공지된 임의의 적합한 분자 생물 공학 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 효율적인 전사 및 번역을 얻기 위해, 각 재조합 발현 작제물의 폴리뉴클레오티드는 리더 서열 및 특히 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게(즉, 작동적으로) 연결된 프로모터와 같은 적어도 하나의 적절한 발현 제어 서열(조절 서열이라고도 함)을 포함한다.

특정 실시양태는 본원에서 고려되는 폴리펩티드, 예를 들어 WT1 p37 펩티드::MHC 복합체에 특이적인 고친화성 또는 고기능 결합 활성의 조작된 TCR 또는 이의 결합 도메인을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 핵산은 임의의 형태의 단일 또는 이중 가닥 DNA, cDNA 또는 RNA를 지칭할 수 있고, 안티센스 DNA, cDNA 및 RNA를 포함하여 서로에 상보적인 핵산의 양성 및 음성 가닥을 포함할 수 있다. 또한 siRNA, microRNA, RNA-DNA 하이브리드, 리보자임 및 기타 다양한 자연 발생 또는 합성 형태의 DNA 또는 RNA도 포함된다.

특정 실시양태에서, WT1 p37 펩티드에 특이적인 본 개시내용의 조작된(예를 들어, 코돈 최적화된) 고기능 결합 활성 TCR 또는 이의 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공되며, 여기서 V_α 도메인은 서열 번호 97, 98 및 101 내지 107 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 97 내지 107 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 V_α 도메인을 코딩한다. 추가 실시양태에서, WT1 p37 펩티드에 특이적인 본 개시내용의 고기능 결합 활성의 조작된 TCR 또는 이의 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공되며, 여기서, V_β 도메인은 서열 번호 75 내지 77, 79, 82, 84, 및 85 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 동일성인 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, V_β 도메인은 서열 번호 75 내지 85 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 TCR 또는 이의 결합 도메인은 서열 번호 97, 98 및 101 내지 107 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 75%(75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 V_α 도메인 또는 서열 번호 99 또는 100의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 V_α 도메인, 또는 서열 번호 97 내지 107 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 V_α 도메인; 및 서열 번호 75 내지 77, 79, 82, 84 및 85 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 V_β 도메인, 또는 서열 번호 78, 80, 81 및 83 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 V_β 도메인, 또는 서열 번호 75 내지 85 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 V_β 도메인을 포함한다.

상기 언급된 임의의 실시양태에서, V_α 도메인, V_β 도메인, 또는 이 둘다를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 α 쇄 불변 도메인 또는 β 쇄 불변 도메인을 추가로 코딩할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR은 TCR α 쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서 α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 110에 대해 적어도 98% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, α 쇄 불변 도메인은 서열 110의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 추가 실시양태에서, 서열 번호 108 또는 109에 대해 적어도 99.9% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 β 쇄 불변 도메인이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 108 또는 109의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

상기 언급된 임의의 실시양태에서, TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 또는 둘 다를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR은 TCR α 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 TCR β 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 예시적인 자가 절단 펩티드는 서열 번호 60 내지 63 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 서열 번호 60 내지 63 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다. 이러한 자가 절단 펩티드는 서열 166 내지 170 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되거나; 또는 서열 번호 166 내지 170 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

특정 실시양태에서, TCR α 쇄, 자가 절단 펩티드, 및 TCR β 쇄는 서열 번호 155 내지 165 중 어느 하나에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 추가 실시양태에서, TCR α 쇄, 자가 절단 펩티드, 및 TCR β 쇄는 서열 번호 155 내지 165 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되거나 서열 번호 155 내지 165의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 또 다른 실시양태에서, 코딩된 TCR α 쇄, 자가 절단 펩티드, 및 TCR β 쇄는 서열 번호 48 내지 58의 폴리펩티드 중 어느 하나에 대해 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 코딩된 TCR α 쇄, 자가 절단 펩티드 및 TCR β 쇄는 서열 번호 48 내지 58 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에서, 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 추가로 (i) CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 임의로 코딩된 폴리펩티드는 CD8 공-수용체 α 쇄이거나 이를 포함함); (ii) CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티(임의로, 코딩된 폴리펩티드는 CD8 공-수용체 β 쇄이거나 이를 포함함); 또는 (iii) (i)의 폴리뉴클레오티드 및 (ii)의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이론에 구애없이, 특정 실시양태에서, HLA 분자에 결합하도록 작용하는 결합 단백질 및 CD8 공-수용체 단백질 또는 이의 일부의 공발현 또는 동시 발현은 결합 단백질 단독의 발현과 비교하여 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포, 예컨대 T 세포, 임의로 CD4⁺T 세포)의 하나 이상의 원하는 활성을 향상시킬 수 있다. 결합 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드 및 CD8 공-수용체 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드는 단일 핵산 분자(예를 들어, 동일한 발현 벡터에)에 존재할 수 있거나, 숙주 세포내에서 분리된 핵산 분자상에 존재할 수 있다.

특정 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (b) CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a)의 폴리뉴클레오티드와 (b)의 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (1) 결합 단백질(예를 들어, 본 개시내용의 TCR)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및/또는 (2) 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된다.

추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인-프레임으로 작동가능하게 연결된 (i) (pnCD8α)-(pnSCP₁)-(pnCD8β)-(pnSCP₂)-(pnTCR); (ii) (pnCD8β)-(pnSCP₁)-(pnCD8α)-(pnSCP₂)-(pnTCR); (iii) (pnTCR)-(pnSCP₁)-(pnCD8α)-(pnSCP₂)-(pnCD8β); (iv) (pnTCR)-(pnSCP₁)-(pnCD8β)-(pnSCP₂)-(pnCD8α); (v) (pnCD8α)-(pnSCP₁)-(pnTCR)-(pnSCP₂)-(pnCD8β); 또는 (vi) (pnCD8β)-(pnSCP₁)-(pnTCR)-(pnSCP₂)-(pnCD8α)를 포함할 수 있으며, 여기서 pnCD8α는 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, pnCD8β는 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, pnTCR은 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, pnSCP₁및 pnSCP₂는 각각 독립적으로 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 폴리뉴클레오티드 및/또는 또는 코딩된 자가-절단 펩티드는 임의로 동일하거나 상이하다(예를 들어, P2A, T2A, F2A, E2A).

일부 실시양태에서, 코딩된 TCR은 TCRα 쇄 및 TCRβ 쇄를 포함하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 TCRα 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 TCRβ 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인-프레임으로 작동가능하게 연결된 (i) (pnCD8α)-(pnSCP₁)-(pnCD8β)-(pnSCP₂)-(pnTCRβ)-(pnSCP₃)-(pnTCRα); (ii) (pnCD8β)-(pnSCP₁)-(pnCD8α)-(pnSCP₂)-(pnTCRβ)-(pnSCP₃)-(pnTCRα); (iii) (pnCD8α)-(pnSCP₁)-(pnCD8β)-(pnSCP₂)-(pnTCRα)-(pnSCP₃)-(pnTCRβ); (iv) (pnCD8β)-(pnSCP₁)-(pnCD8α)-(pnSCP₂)-(pnTCRα)-(pnSCP₃)-(pnTCRβ); (v) (pnTCRβ)-(pnSCP₁)-(pnTCRα)-(pnSCP₂)-(pnCD8α)-(pnSCP₃)-(pnCD8β); (vi) (pnTCRβ)-(pnSCP₁)-(pnTCRα)-(pnSCP₂)-(pnCD8β)-(pnSCP₃)-(pnCD8α); (vii) (pnTCRα)-(pnSCP₁)-(pnTCRβ)-(pnSCP₂)-(pnCD8α)-(pnSCP₃)-(pnCD8β); 또는 (viii) (pnTCRα)-(pnSCP₁)-(pnTCRβ)-(pnSCP₂)-(pnCD8β)-(pnSCP₃)-(pnCD8α)를 포함하며, 여기서 pnCD8α는 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, pnCD8β는 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, pnTCRα는 TCR α 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, pnTCRβ는 TCR β 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, pnSCP₁, pnSCP₂, pnSCP₃은 각각 독립적으로 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 폴리뉴클레오티드 및/또는 코딩된 자가 절단 펩티드는 임의로 동일하거나 상이하다.

추가 실시양태에서, 결합 단백질은 다음을 코딩하는 전이 유전자 작제물의 일부로서 발현되고/거나 본 개시내용의 숙주 세포는 다음을 코딩할 수 있다: 하나 이상의 추가 보조 단백질, 예컨대 안전 스위치 단백질; 태그, 선택 마커; CD8 공-수용체 β 쇄; CD8 공-수용체 α 쇄 또는 둘 다; 또는 이들의 임의의 조합. 결합 단백질 및 보조 성분(예를 들어, 하나 이상의 안전 스위치 단백질, 선택 마커, CD8 공-수용체 β-쇄 또는 CD8 공-수용체 α-쇄)을 코딩하고 발현하는 데 유용한 폴리뉴클레오티드 및 전이 유전자 작제물이 PCT 출원 PCT/US2017/053112에 기술되어 있으며, 여기서의 폴리뉴클레오티드, 전이 유전자 작제물, 및 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 포함하는 보조 성분은 본원에 참조로 포함된다. 본 개시 내용의 결합 단백질, 안전 스위치 단백질, 태그, 선택 마커, CD8 공-수용체 β 쇄, 또는 CD8 공-수용체 α-쇄의 일부 또는 전부가 단일 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있거나 별도의 핵산 분자이거나 그에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있음이 이해될 것이다.

예시적인 안전 스위치 단백질은 예를 들어, 세포 외 N 말단 리간드 결합 도메인 및 세포 내 수용체 티로신 키나제 활성이 결여되나, 천연 아미노산 서열을 보유하고 I 형 막관통 세포 표면 국재화를 갖고, 제약 등급 항-EGFR 단일 클론 항체, 세툭시맙(Erbitux) tEGF 수용체(tEGFr; Wang et al., Blood 118:1255-1263, 2011); 카스파제 폴리펩티드(예를 들면, iCasp9; Straathof et al., Blood 105:4247-4254, 2005; Di Stasi et al., N. Engl. J. Med. 365:1673-1683, 2011; Zhou and Brenner, Exp. Hematol. pii:S0301-472X(16)30513-6. doi:10.1016/j.exphem.2016.07.011), RQR8(Philip et al., Blood 124:1277-1287, 2014); 인간 c-myc 단백질(Myc)에서 유래된 10-아미노산 태그(Kieback et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:623-628, 2008); 및 마커/안전 스위치 폴리펩티드, 예컨대 RQR(CD20 + CD34; Philip et al., 2014)에 대해 형태적으로 온전한 결합 에피토프를 가지는 절두된 EGF 수용체 폴리펩티드(huEGFRt)를 포함한다.

본 개시 내용의 변형된 숙주 세포에 유용한 다른 보조 성분은 세포를 동정, 분류, 단리, 농축 또는 추적할 수 있게 하는 태그 또는 선택 마커를 포함한다. 예를 들어, 원하는 특성을 갖는 표지된 숙주 세포(예를 들면, 항원 특이적 TCR 및 안전 스위치 단백질)는 샘플 중의 표지되지 않은 세포로부터 분류될 수 있고 원하는 순도의 산물에 포함시키기 위해 보다 효율적으로 활성화 및 확장될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "선택 마커"는 선택 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 면역 세포의 검출 및 양성 선택을 허용하는 세포에 식별 가능한 변화를 부여하는 핵산 작제물 (및 코딩된 유전자 산물)을 포함한다. RQR은 CD20의 주요 세포 외 루프와 2 개의 최소 CD34 결합 부위를 포함하는 선택 마커이다. 일부 실시양태에서, RQR 코딩 폴리뉴클레오티드는 16-아미노산 CD34 최소 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD34 최소 에피토프는 CD8 공-수용체 줄기 도메인(Q8)의 아미노 말단 위치에 포함된다. 추가 실시양태에서, CD34 최소 결합 부위 서열은 CD20에 대한 표적 에피토프와 조합되어 T 세포(RQR8)에 대한 컴팩트 마커/자살 유전자를 형성할 수 있다(Philip et al., 2014, 본원에 참조로 포함됨). 이 작제물은 예를 들어 자기 비드(Miltenyi)에 결합된 CD34 특이적 항체와 함께 작제물을 발현하고 조작된 T 세포를 발현하는 이식 유전자의 선택적인 결실을 허용하는 임상적으로 허용되는 약학 항체인 리툭시맙을 사용하는 숙주 세포의 선택을 허용한다(Philip et al., 2014).

추가의 예시적인 선택 마커는 또한 T 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 몇몇 절두된 I 형 막관통 단백질을 포함한다: 절두된 저친화성 신경 성장 인자, 절두된 CD19 및 절두된 CD34(예를 들어, Di Stasi et al., N. Engl. J. Med. 365:1673-1683, 2011; Mavilio et al., Blood 83:1988-1997, 1994; Fehse et al., Mol. Ther. 1:448-456, 2000 참조; 각각 그 전체가 본원에 원용됨). CD19 및 CD34의 유용한 기능은 임상 등급 분류를 위해 이들 마커를 표적화할 수 있는 기성 Miltenyi CliniMACs^TM 선택 시스템의 이용 가능성이다. 그러나, CD19와 CD34는 벡터 패키징 능력과 통합 벡터의 전사 효율에 부담을 줄 수 있는 상대적으로 큰 표면 단백질이다. 세포 외, 비신호 전달 도메인 또는 다양한 단백질(예를 들면, CD19, CD34, LNGFR)을 포함하는 표면 마커도 사용할 수 있다. 모든 선택 마커를 사용할 수 있으며 우수 제조 관리 기준(Good Manufacturing Practices)을 만족하여야 한다. 특정 실시양태에서, 선택 마커는 관심 유전자 산물(예를 들어, TCR 또는 CAR과 같은 본 개시 내용의 결합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 발현된다. 선택 마커의 추가 예는 예를 들어 GFP, EGFP, β-gal 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 리포터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 CD34와 같은 선택 마커는 세포에 의해 발현되고 CD34는 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 관심 형질도입된 세포를 풍부하게 선택하거나 단리하는 데(예를 들어, 면역 자기 선택에 의해) 사용될 수 있다. 본원에 사용된 CD34 마커는 항-CD34 항체, 또는 예를 들어, scFv, TCR 또는 CD34에 결합하는 다른 항원 인식 모이어티와 구별된다.

특정 실시양태에서, 선택 마커는 RQR 폴리펩티드, 절두된 저친화성 신경 성장 인자(tNGFR), 절두된 CD19(tCD19), 절두된 CD34(tCD34) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

RQR 폴리펩티드와 관련하여, 이론에 구애없이, 숙주 세포 표면으로부터 에피토프 또는 표적 서열의 거리는 RQR 폴리펩티드가 선택 마커/안전 스위치로서 기능하는 데 중요한 것으로 여겨진다(Philip et al., 2010(상동)). 일부 실시양태에서, 코딩된 RQR 폴리펩티드는 코딩된 CD8 공-수용체의 β-쇄, α-쇄, 또는 둘 다, 또는 둘 중 하나 또는 둘 모두의 단편 또는 변이체에 함유된다. 특정 실시양태에서, 변형된 숙주 세포는 iCasp9를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 및 RQR 폴리펩티드를 함유하는 β 쇄를 포함하고 CD8 α-쇄를 추가로 포함하는 재조합 CD8 공-수용체 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

상기 언급된 임의의 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR, 또는 이의 결합 도메인, 또는 이의 CD8 공-수용체 또는 세포외 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 표적 숙주 세포에서의 효율적인 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포와 같은 인간 면역계 세포를 포함한다(Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135, 2006). 코돈 최적화는 알려진 기술 및 도구, 예를 들어 GenScript® OptimumGene^TM 도구 또는 GeneArt(Life Technologies)를 사용하여 수행할 수 있다. 코돈 최적화된 서열은 부분적으로 코돈 최적화된 서열(즉, 하나 이상의 코돈이지만 모든 코돈보다 적은 코돈이 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화됨) 및 완전 코돈 최적화된 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 복수의 폴리펩티드(예를 들어, TCR α 쇄, TCR β 쇄, CD8 공-수용체 α 쇄, CD8 공-수용체 β 쇄, 및 하나 이상의 자가-절단 펩티드)를 코딩하는 실시양태에서, 각 폴리펩티드는 독립적으로 완전히 코돈 최적화되거나, 부분적으로 코돈 최적화되거나, 코돈 최적화되지 않을 수 있음이 이해될 것이다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 어느 하나 이상의 TCR, 또는 이의 결합 도메인을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서 변형된 또는 재조합 숙주 세포는 이의 세포 표면 상에서 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 TCR, 또는 이의 결합 도메인을 코딩한다.

다양한 기술이 재조합(즉, 조작된) DNA, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드 합성, 면역분석 및 조직 배양 및 형질전환(예: 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 이들 및 관련 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용 및 논의되는 미생물학, 분자 생물학, 생화학, 분자 유전학, 세포 생물학, 바이러스학 및 면역학 기술에서의 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985); Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Edited by Julie Logan, Kirstin Edwards and Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand,　Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink,　Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3^rd Edition, 2010 Humana Press); Immobilized Cells And Enzymes 　(IRL Press, 1986); the treatise,　Methods In Enzymology 　(Academic Press, Inc., N.Y.);　Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells 　(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);　Harlow and Lane,　Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology 　(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987);　Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir andCC Blackwell, eds., 1986); Roitt,　Essential Immunology, 　6th Edition, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2002); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed., 2006); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, and Bruce A. Bunnell Eds., 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, and Craig T. Jordan Eds., 2001); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting Ed., 2008) Neural Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. Weiner Ed., 2008) 참조.

상기 언급된 임의의 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 함유되거나, 특정 실시양태에서 벡터에 함유되고 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 숙주 세포에 있을 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 본원에 개시된 특정 실시양태와 함께 사용하기에 적합한 벡터는 공지되어 있으며 특정 목적 또는 세포에 대해 선택될 수 있다. 예시적인 벡터는 연결된 다른 핵산 분자를 수송할 수 있거나 숙주 유기체에서 복제할 수 있는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 벡터의 일부 예에는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 등이 포함된다. 일부 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있는 반면(예: 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터), 다른 벡터는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 폴리뉴클레오티드의 통합을 촉진하여 숙주 게놈(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)과 함께 복제될 수 있다. 추가로, 일부 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다(이러한 벡터는 "발현 벡터"로 지칭될 수 있음). 관련 실시양태에 따르면, 하나 이상의 작용제(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 WT1 p37에 특이적인 고친화성 또는 고기능 결합 활성 재조합 TCR, 또는 이의 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)가 대상에게 공동 투여되는 경우, 각각의 제제는 별개 또는 동일한 벡터에 존재할 수 있고, 다수의 벡터(각각 다른 제제 또는 동일한 제제를 함유함)가 세포 또는 세포 집단에 도입되거나 대상에게 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 WT1 p37 펩티드::MHC에 특이적인 고친화성 또는 고기능 결합 활성 재조합 TCR, 또는 이의 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터의 특정 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열이 결찰된 코딩 서열의 발현 및 처리를 달성하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열은 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역을 효율적으로 향상시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 가능하게는 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은, 관심 유전자 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스에서 또는 일정 거리에서 작용하는 발현 제어 서열과 인접한 경우 작동 가능하게 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TCR 또는 이의 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 벡터 또는 γ 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터인 발현 벡터에 함유된다.

특정 실시양태에서, 재조합 발현 벡터는 적절한 세포, 예를 들어 T 세포 또는 항원-제시 세포, 즉 이의 세포 표면 상에 펩티드/MHC 복합체를 나타내나 CD8은 결여된 세포(예를 들어, 수지상 세포)에 전달된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포이다. 예를 들어, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있으며, 여기서, 임의로, 조합은 존재하는 경우 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. T 세포가 숙주인 특정 실시양태에서, T 세포는 나이브, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 따라서, 재조합 발현 벡터는 또한 예를 들어 B 림프구, T 림프구 또는 수지상 세포 특이적 TRE와 같은 림프 조직 특이적 전사 조절 요소(TRE)를 포함할 수 있다. 림프 조직 특이적 TRE는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12:1043, 1992); Todd et al., J. Exp. Med. 177:1663, 1993); Penix et al., J. Exp. Med. 178:1483, 1993 참조).

벡터 외에, 특정 실시양태는 본원에 개시된 바와 같은 이종 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 이의 세포 표면 상에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 TCR을 발현하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대해 이종성이다. 당업자라면 다수의 적합한 숙주 세포가 당해 분야에서 이용가능하다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다. 숙주 세포는 벡터 또는 핵산 및/또는 단백질의 혼입뿐만 아니라 임의의 자손 세포를 수용할 수 있는 임의의 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 유전적으로 또는 표현형적으로 동일하든, 상이하든지 간에 숙주 세포의 자손을 포함한다. 적합한 숙주 세포는 벡터에 좌우될 수 있고 포유동물 세포, 동물 세포, 인간 세포, 원숭이 세포, 곤충 세포, 효모 세포 및 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 이들 세포는 바이러스 벡터, 인산칼슘 침전을 통한 형질전환, DEAE-덱스트란, 전기천공, 미세주입 또는 기타 방법의 사용에 의해 벡터 또는 기타 물질을 통합하도록 유도될 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 참조.

특정 실시양태에서, 숙주 세포에 의해 발현된 TCR의 V_α도메인은 서열 번호 97, 98, 및 101 내지 107의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 대해 적어도 75%(예를 들어, 775%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 서열 동일성, 또는 서열 번호 99 또는 100에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, V_α 도메인은 (a) 서열 번호 97 내지 107의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열을 포함하거나; (b) 서열 번호 97 내지 107의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

특정 실시양태에서, 숙주 세포의 V_β 도메인은 서열 번호 75 내지 77, 79, 82, 84 및 85 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 75%의 서열 동일성, 또는 서열 번호 78, 80, 81, 및 83 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, V_β 도메인은 (a) 서열 번호 75 내지 85 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나; (b) 서열 번호 75 내지 85 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다

특정 실시양태에서, TCR α 쇄는 서열 110에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α 쇄 불변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, TCR α 쇄는 (a) 서열 110의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나; (b) 서열 번호 110의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α 쇄 불변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, TCR β 쇄는 서열 번호 108 또는 109에 대해 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 β 쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR β 쇄는 (a) 서열 번호 108 또는 109의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나; (b) 서열 번호 108 또는 109의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 β 쇄 불변 도메인을 포함한다.

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 TCR α 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 TCR β 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 코딩된 자가 절단 펩티드는 (a) 서열 번호 60 내지 63의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 서열 번호 60 내지 63의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드의 아미노산 서열로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 (a) 서열 166 내지 170의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 서열 번호 166 내지 170의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드의 아미노산 서열로 이루어진다.

일부 실시양태에서, TCR α 쇄, 자가-절단 펩티드, 및 TCR β 쇄는 서열 155 내지 165 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

일부 실시양태에서, TCR α 쇄, 자가 절단 펩티드, 및 TCR β 쇄는 (a) 서열 155 내지 165의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나; (b) 서열 번호 155 내지 165의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 코딩된 TCR α 쇄, 자가 절단 펩티드, 및 TCR β 쇄는 서열 번호 48 내지 58의 폴리펩티드 중 어느 하나에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.5%, 99.9% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코딩된 TCR α 쇄, 자가 절단 펩티드 및 TCR β 쇄는 (a) 서열 번호 48 내지 58의 어느 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 서열 번호 48 내지 58의 어느 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합이고, 여기서 선택적으로 조합은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다.

일부 실시양태에서, 숙주 면역계 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합이다.

특정 실시양태에서, TCR은 내인성 TCR과 비교하여(예를 들어, 내인성 TCR이 인공적으로 억제되거나 발현이 방지되지 않는 경우) T 세포 상에서 더 높은 표면 발현을 갖는다.

특정 실시양태에서, 숙주 세포는 (i) CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드(여기서 임의로, 코딩된 폴리펩티드는 CD8 공-수용체 α 쇄이거나 이를 포함함); (ii) CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드(여기서, 임의로 코딩된 폴리펩티드는 CD8 공-수용체 β 쇄이거나 이를 포함함); 또는 (iii) (i)의 폴리뉴클레오티드 및 (ii)의 폴리뉴클레오티드(여기서 임의로, 숙주 세포는 CD4+ T 세포를 포함함)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 (a) CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드; (b) CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (a)의 폴리뉴클레오티드와 (b)의 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에서, 숙주 세포(예를 들어, 인간 T 세포와 같은 면역 세포)는 숙주 세포와 종양 세포가 모두 샘플에 존재하는 경우, (i) 유방암 세포주 MDA-MB-468의 종양 세포; (ii) 췌장 선암종 세포주 PANC-1의 종양 세포; (iii) 유방암 세포주 MDA-MB-231의 종양 세포; (iv) HLA-A2를 발현하는 골수성 백혈병 세포주 K562의 종양 세포(여기서, 임의로 HLA-A2는 HLA-A^*201을 포함함); (v) HLA-A2를 발현하는 결장암종 세포주 RKO의 종양 세포(여기서, 임의로 HLA-A2는 HLA-A^*201을 포함함); 또는 (vi) (i) 내지 (v)의 종양 세포의 임의의 조합을 사멸시킬 수 있다.

특정 실시양태에서, 숙주 세포는 숙주 세포 및 종양 세포가 32:1, 16:1, 8:1, 4:1, 2:1 또는 1.5:1 숙주 세포:종양 세포의 비율로 샘플에 존재할 경우 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 표적 세포의 사멸은 예를 들어 Incucyte® 바이오이미징 플랫폼(Essen Bioscience)으로 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이 플랫폼은 활성화된 카스파제 및 표지된(예를 들어, RapidRed 또는 NucRed) 종양 세포 신호를 이용하며, 여기서 중첩이 측정되고 증가된 중첩 면적은 세포자멸사에 의한 종양 세포 사멸에 상응한다. 사멸은 또한 표적 세포에 표지된 크롬(⁵¹Cr)을 로딩하고 상등액의 ⁵¹Cr을 본 발명의 결합 단백질을 발현하는 면역 세포와 4 시간동안 공동 인큐베이션한 후 측정하는 4 시간 분석법을 사용하여 결정할 수 있다.

임의의 상기 실시양태에서, 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)는 면역 신호전달 또는 기타 관련 활성에 관여하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 감소 또는 제거하도록 변형될 수 있다. 예시적인 유전자 녹아웃은 PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, TIGIT, FasL, HLA 분자, TCR 분자 등을 코딩하는 것들을 포함한다. 이론에 구애없이, 특정의 내인적으로 발현된 면역 세포 단백질은 변형된 면역 세포를 수용하는 동종이계 숙주에 의해 외래 단백질로 인식될 수 있으며, 이는 변형된 면역 세포(예: HLA 대립유전자)의 제거로 이어질 수 있거나, 변형된 면역 세포(예를 들어, PD-1, LAG-3, CTLA4, FasL, TIGIT, TIM3)의 면역 활성을 하향조절할 수 있거나, 또는 본 개시내용의 이종 발현된 결합 단백질(예를 들어, 비-Ras 항원에 결합하여 Ras 항원을 발현하는 세포에 결합하는 변형된 면역 세포를 방해하는 변형된 T 세포의 내인성 TCR)의 결합 활성을 방해할 수 있다.

따라서, 이러한 내인성 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거는 자가 또는 동종이계 숙주 환경에서 변형된 세포의 활성, 내성 또는 지속성을 개선시킬 수 있고, 세포의 보편적 투여(예를 들어, HLA 유형에 무관하게 임의의 수용자에게)를 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 변형된 세포는 공여자 세포(예를 들어, 동종이계) 또는 자가 세포이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, TIGIT, FasL, HLA 성분(예를 들어, α1 마크로글로불린, α2 마크로글로불린, α3 마크로글로불린, β1 마이크로글로불린 또는 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 유전자), 또는 TCR 성분(예를 들어, TCR 가변 영역 또는 TCR 불변 영역을 코딩하는 유전자)을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 염색체 유전자 녹아웃을 포함한다(예를 들어, 문헌[Torikai et al., Nature Sci. Rep. 6:21757 (2016); Torikai et al., Blood 119(24):5697 (2012); 및 Torikai et al., Blood 122(8):1341 (2013) 참조], 이의 유전자 편집 기법, 조성물 및 입양 세포 요법은 본원에 그 전체가 참조로 포함됨).

본원에 사용된 용어 "염색체 유전자 녹아웃"은 숙주 세포에 의한 기능적 활성 내인성 폴리펩티드 산물의 생성을 방지(예를 들어, 감소, 지연, 억제 또는 폐지)하는 숙주 세포에 도입된 억제제 또는 유전자 변경을 지칭한다. 염색체 유전자 녹아웃을 초래하는 변경은 예를 들어 도입된 넌센스 돌연변이(조기 정지 코돈의 형성 포함), 미스센스 돌연변이, 유전자 결실 및 가닥 파손뿐만 아니라 숙주 세포에서 내인성 유전자 발현을 억제하는 억제 핵산 분자의 이종 발현을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 염색체 유전자 녹아웃 또는 유전자 녹인은 숙주 세포의 염색체 편집에 의해 만들어진다. 예를 들어, 엔도뉴클레아제를 사용하여 염색체 편집을 수행할 수 있다. 본원에 사용된 "엔도뉴클레아제"는 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 포스포디에스테르 결합의 절단을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 표적화된 유전자를 절단함으로써 표적화된 유전자를 불활성화 또는 "녹아웃"시킬 수 있다. 엔도뉴클레아제는 자연 발생, 재조합, 유전자 변형 또는 융합 엔도뉴클레아제일 수 있다. 엔도뉴클레아제로 인한 핵산 가닥 파손은 일반적으로 상동 재조합 또는 비상동 말단 결합(NHEJ)의 특징적인 메커니즘을 통해 복구된다. 상동성 재조합 동안, 공여자 핵산 분자는 공여자 유전자 "녹-인", 표적 유전자 "녹아웃" 및 임의적으로 공여자 유전자 녹인 또는 표적 유전자 녹아웃 이벤트를 통해 표적 유전자를 비활성화하는 데 사용될 수 있다. NHEJ는 절단 부위에서 DNA 서열의 변화, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가를 종종 초래하는 오류가 발생하기 쉬운 복구 과정이다. NHEJ는 표적 유전자를 "녹아웃"하는데 사용될 수 있다. 엔도뉴클레아제의 예에는 징크 핑거 뉴클레아제, TALE-뉴클레아제, CRISPR-Cas 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및 메가TAL이 포함된다.

본원에 사용된 "아연 핑거 뉴클레아제"(ZFN)는 Fokl 엔도뉴클레아제와 같은 비특이적 DNA 절단 도메인에 융합된 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 약 30 개 아미노산의 각 징크 핑거 모티프가 약 3 개 염기쌍의 DNA에 결합하고, 특정 잔기의 아미노산이 삼중 서열 특이성을 변경하도록 변화될 수 있다(예를 들어, Desjarlais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:2256-2260, 1993; Wolfe et al., J. Mol. Biol. 285:1917-1934, 1999 참조). 다수의 징크 핑거 모티프가 약 9 내지 약 18 개 염기쌍 범위의 길이를 갖는 영역과 같은 원하는 DNA 서열에 대한 결합 특이성을 생성하기 위해 순차으로 연결될 수 있다. 배경으로, ZFN은 게놈에서 부위 특이적 DNA 이중 가닥 파손(DSB)의 형성을 촉매함으로써 게놈 편집을 매개하고, DSB 부위에서 게놈과 상동성인 측면 서열을 포함하는 이식유전자의 표적화된 통합이 상동성 지정 복구에 의해 촉진된다. 대안적으로, ZFN에 의해 생성된 DSB는 절단 부위에서 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 초래하는 오류가 발생하기 쉬운 세포 복구 경로인 NHEJ(비상동성 말단 결합(non-homologous end joining))에 의한 복구를 통해 표적 유전자를 녹아웃시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 녹아웃은 ZFN 분자를 사용하여 만들어진 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함한다.

본원에 사용된 "전사 활성 인자-유사 이펙터 뉴클레아제"(TALEN)는 TALE DNA 결합 도메인 및 DNA 절단 도메인, 예컨대 FokI 엔도뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. "TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위로 구성되며, 각각은 일반적으로 분기된 12 번째 및 13 번째 아미노산을 갖는 고도로 보존된 33-35 아미노산 서열을 갖는다. TALE 반복 도메인은 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. RVD(Repeat Variable Diresidue)라고 하는 분기 아미노산 잔기는 특정 뉴클레오티드 인식과 관련이 있다. 이러한 TALE의 DNA 인식을 위한 자연(정규) 코드는 TALE의 위치 12 및 13에 있는 HD(히스틴-아스파르트산) 서열이 시토신(C)에 TALE 결합, T 뉴클레오티드에 NG(아스파라긴-글리신) 결합, A에 NI(아스파라긴-이소류신) 결합, G 또는 A 뉴클레오티드에 NN(아스파라긴-아스파라긴) 결합, T 뉴클레오티드에 NG(아스파라긴-글리신) 결합에 이르도록 결정되었다. 비정규(비정형) RVD가 또한 알려져 있다(예를 들어, 비정형 RVD가 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 US 2011/0301073 참조). TALEN은 T 세포의 게놈에서 부위 특이적 이중 가닥 파손(DSB)을 지시하는 데 사용할 수 있다. 비상동성 말단 결합(NHEJ)은 어닐링을 위한 서열 중첩이 거의 또는 전혀 없는 이중 가닥 파손의 양쪽에서 DNA를 결찰시켜 유전자 발현을 녹아웃시키는 오류를 유발한다. 대안적으로, 상동성 지정 복구는 DSB의 부위에 이식유전자를 도입할 수 있으며, 이는 상동 측면 서열이 이식유전자에 존재하도록 제공한다. 특정 실시양태에서, 유전자 녹아웃은 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하고 TALEN 분자를 사용하여 제조된다.

본원에 사용된 "CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas)" 뉴클레아제 시스템은 염기쌍 상보성을 통해 게놈 내 표적 부위(프로토스페이서로서 알려짐)를 인식한 후, 짧은, 보존된 프로토스페이서 관련 모티프(PAM)가 상보성 표적 서열의 3' 바로 뒤에 오는 경우 DNA를 절단하기 위해 CRISPR RNA(crRNA) 유도 Cas 뉴클레아제를 사용하는 시스템을 지칭한다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 뉴클레아제의 서열과 구조에 따라 세 가지 유형(즉, 유형 I, 유형 II 및 유형 III)으로 분류된다. 유형 I 및 III의 crRNA 유도 감시 복합체에는 여러 Cas 서브 유닛이 필요하다. 가장 많이 연구된 유형 II 시스템은 RNA 유도 Cas9 뉴클레아제, crRNA 및 트랜스-작용 crRNA(tracrRNA)의 적어도 세 구성 요소로 구성된다. tracrRNA는 이중체 형성 영역을 포함한다. crRNA 및 tracrRNA는 Cas9 뉴클레아제와 상호 작용하고 Cas9/crRNA:tracrRNA 복합체를 crRNA 상의 스페이서와 PAM으로부터 표적 DNA 상류상의 프로토스페이서 사이의 Watson-Crick 염기 쌍을 통해 표적 DNA의 특정 부위로 안내할 수 있는 이중체를 형성한다. Cas9 뉴클레아제는 crRNA 스페이서에 의해 정의된 영역 내에서 이중 가닥 절단을 절단한다. NHEJ에 의한 복구는 표적 유전자좌의 발현을 방해하는 삽입 및/또는 결실을 초래한다. 대안적으로, 상동성 측면 서열을 갖는 이식유전자는 상동성 지정 복구를 통해 DSB의 부위에 도입될 수 있다. crRNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA 또는 gRNA)로 조작될 수 있다(예를 들어, Jinek et al., Science 337:816-21, 2012 참조). 또한, 표적 부위에 상보성인 가이드 RNA의 영역은 원하는 서열을 표적으로 하기 위해 변경되거나 프로그래밍될 수 있다(Xie et al., PLOS One 9:e100448, 2014; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0068797, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0186843; 미국 특허 번호 8,697,359 및 PCT 공개 번호 WO 2015/071474; 각각본원에 참조로 포함됨). 특정 실시양태에서, 유전자 녹아웃은 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하고 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템을 사용하여 제조된다. 예시적인 gRNA 서열 및 이를 사용하여 면역 세포 단백질을 코딩하는 내인성 유전자를 녹아웃시키는 방법은 문헌 [Ren et al., Clin. Cancer Res. 23(9):2255-2266 (2017) 참조, 그의 gRNA, CAS9 DNA, 벡터 및 유전자 녹아웃 기술은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다]에 기술되어 있다.

본원에 사용된, "호밍 엔도뉴클레아제"로도 지칭되는 "메가뉴클레아제"는 큰 인식 부위(약 12 개 내지 약 40 개 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열)를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제를 지칭한다. 메가뉴클레아제는 서열 및 구조 모티프를 기반으로 5 개의 패밀리로 나눌 수 있다: LAGLIDADG, GIY-YIG, HNH, His-Cys box 및 PD-(D/E)XK. 예시적인 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함하며, 그 인식 서열은 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,420,032 및 6,833,252; Belfort et al., Nucleic Acids Res. 25:3379-3388, 1997; Dujon et al., Gene 82:115-118, 1989; Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127, 1994; Jasin, Trends Genet. 12:224-228, 1996; Gimble et al., J. Mol. Biol. 263:163-180, 1996; Argast et al., J. Mol. Biol. 280:345-353, 1998 참조).

특정 실시양태에서, 자연 발생 메가뉴클레아제는 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA4, TIGIT, FasL, HLA-코딩 유전자, 또는 TCR 성분-코딩 유전자로부터 선택된 표적의 부위-특이적 게놈 변형을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적 유전자에 대한 새로운 결합 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제가 부위-특이적 게놈 변형에 사용된다(예를 들어, Porteus et al., Nat. Biotechnol. 23:967-73, 2005; Sussman et al., J. Mol. Biol. 342:31-41, 2004; Epinat et al., Nucleic Acids Res. 31:2952-62, 2003; Chevalier et al., Molec. Cell 10:895-905, 2002; Ashworth et al., Nature 441:656-659, 2006; Paques et al., Curr. Gene Ther. 7:49-66, 2007; 미국 특허 공개 번호 US 2007/0117128; US 2006/0206949; US 2006/0153826; US 2006/0078552; 및 US 2004/0002092 참조). 추가 실시양태에서, 염색체 유전자 녹아웃은 megaTAL로 알려진 융합 단백질을 만들기 위해 TALEN의 모듈형 DNA 결합 도메인으로 변형된 호밍 엔도뉴클레아제를 사용하여 생성된다. MegaTAL은 하나 이상의 표적 유전자를 녹아웃시킬뿐만 아니라 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 공여자 템플릿과 함께 사용되는 경우 이종 또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입(녹인)하는 데 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 염색체 유전자 녹아웃은 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 수용체를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)로 도입되는 억제 핵산 분자를 포함하고, 여기서 억제 핵산 분자는 표적 특이적 억제제를 코딩하고, 코딩된 표적 특이적 억제제는 숙주 면역 세포에서 내인성 유전자 발현(예를 들어, PD-1, TIM3, LAG3, CTLA4, TIGIT, FasL, HLA 성분 또는 TCR 성분, 또는 이들의 임의의 조합의)을 억제한다.

염색체 유전자 녹아웃은 녹아웃 절차 또는 제제를 사용한 후 숙주 면역 세포의 DNA 시퀀싱에 의해 직접 확인할 수 있다. 염색체 유전자 녹아웃은 또한 녹아웃 후 유전자 발현의 부재(예를 들어, 유전자에 의해 코딩되는 mRNA 또는 폴리펩티드 산물의 부재)로부터 추론될 수 있다.

특정 실시양태에서, 염색체 유전자 녹아웃은 α1 마크로글로불린 유전자, α2 마크로글로불린 유전자, α3 마크로글로불린 유전자, β1 마이크로글로불린 유전자, 또는 β2 마이크로글로불린 유전자로부터 선택된 HLA 성분 유전자의 녹아웃을 포함한다.

특정 실시양태에서, 염색체 유전자 녹아웃은 TCR α 가변 영역 유전자, TCR β 가변 영역 유전자, TCR 불변 영역 유전자, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 TCR 성분 유전자의 녹아웃을 포함한다.

또한, 본원에 개시된 임의의 유전자 편집 기술 및 도구가 본 개시내용의 TCR-코딩 및/또는 CD8 공-수용체-코딩 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 게놈 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용의 변형된 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물 및 단위 용량이 본원에 제공된다.

특정 실시양태에서, 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 (i) 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다(즉, 유사한 수의 PBMC를 갖는 환자 샘플과 비교하여 단위 용량에 존재하는 나이브 T 세포 집단의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5 미만%, 또는 약 1% 미만).

일부 실시양태에서, 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 (i) 적어도 약 50% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 50% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 (i) 적어도 약 60% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 60% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 (i) 적어도 약 70% 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 70% 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 (i) 적어도 약 80% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 80% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 (i) 적어도 약 85% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 85% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 (i) 적어도 약 90% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 90% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다.

본 개시내용의 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량이 본원에 기재된 바와 같은 임의의 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 임의의 조합을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 변형된 CD8+ T 세포, 변형된 CD4+ T 세포, 또는 둘 모두를 포함하고, 여기서 이들 T 세포는 Ras 펩티드:HLA-A^*02:01 복합체에 특이적인 결합 단백질을 코딩하도록 변형되고, 변형된 CD8+ T 세포, 변형된 CD4+ T 세포, 또는 둘 모두를 추가로 포함하며, 여기서 이들 T 세포는 WT1 펩티드:HLA-A^*02:01 복합체에 특이적인 결합 단백질을 코딩하도록 변형된다. 추가로 또는 대안적으로, 본 개시내용의 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 본원에 기재된 임의의 숙주 세포 또는 숙주 세포의 조합을 포함할 수 있고, 상이한 항원(예를 들어, 상이한 WT1 항원, 또는 상이한 단백질 또는 표적으로부터의 항원, 예를 들어 BCMA, CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-아세틸 GD2, O-아세틸 GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gp130, 루이스 A, 루이스 Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A(예를 들어 MAGE-A1, MAGE-A3, 및 MAGE-A4 포함), 메소텔린, NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, HLA에 결합된 종양 또는 병원체 관련 펩티드, HLA에 결합된 hTERT 펩티드, HLA에 결합된 티로시나제 펩티드, HLA에 결합된 WT-1 펩티드, LTβR, LIFRβ, LRP5, MUC1, OSMRβ, TCRα, TCRβ, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, WT-1, HA¹-H, Robo1, α-태아단백질(AFP), 프리즐드, OX40, PRAME 및 SSX-2 등)에 특이적인 결합 단백질을 발현하는 변형된 세포(예를 들어, T 세포와 같은 면역 세포)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 단위 용량은 WT1-HLA 복합체에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 발현하는 변형된 CD8⁺T 세포 및 HER2 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질(예를 들어 CAR)을 발현하는 변형된 CD4+ T 세포(및/또는 변형된 CD8+ T 세포)를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 임의의 숙주 세포가 조합 요법으로 투여될 수 있음이 또한 이해될 것이다.

본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 숙주 세포 조성물 또는 단위 용량은 동일하거나 대략 동일한 수의 조작된 CD45RA- CD3+ CD8+ 및 변형된 CD45RA- CD3+ CD4+ TM 세포를 포함한다.

치료 용도 및 방법

특정 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 상기 언급된 임의의 TCR 또는 임의의 결합 도메인에 따른, 인간 WT1에 특이적인 고친화성 또는 고기능 결합 활성 재조합 TCR 또는 이의 결합 도메인을 포함하는 조성물, 또는 이를 발현하도록 조작된 숙주 세포, 예컨대 T 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 TCR, 또는 이의 결합 도메인, 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상에게 투여함으로써 빌름스(Wilms) 종양 단백질 1(WT1) 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 과증식성 또는 증식성 장애 또는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, TCR은 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포와 같은 숙주 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합이다.

대상에서 과증식성 장애 또는 증식성 장애 또는 악성 상태의 존재는 예를 들어 신생물, 종양, 비접촉 억제되거나 또는 종양발생적으로 형질전환된 세포 등(예를 들어, 고형암, 림프종 및 백혈병, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 등을 포함하는 혈액 암)을 포함하는, 대상에서 이형성, 암성 및/또는 형질전환된 세포의 존재를 지칭하며, 이들은 당업계에 공지되어 있고, 이의 진단 및 분류를 위한 기준은 확립되어 있다(예를 들어, 문헌[Hanahan and Weinberg, Cell 144:646, 2011; Hanahan and Weinberg, Cell 100:57, 2000; Cavallo et al., Canc. Immunol. Immunother. 60:319, 2011; Kyrigideis et al., J. Carcinog. 9:3, 2010] 참조). 특정 실시양태에서, 이러한 암 세포는 임의의 이러한 유형의 암을 개시하고 연속해서 옮길 수 있는 암 줄기 세포를 포함하는 급성 골수성 백혈병, B-세포 림프모구 백혈병, T-세포 림프모구 백혈병, 또는 골수종의 세포일 수 있다(참조: 예를 들어, Park et al., Molec. Therap. 17:219, 2009 참조).

특정 실시양태에서, 혈액 악성 종양 또는 고형암과 같은 과증식성 또는 증식성 장애를 치료하는 방법이 제공된다(예를 들어, Nakatsuka et al., Modern Pathology 19:804-714 (2006) 참조). 예시적인 혈액 악성 종양은 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 호산구성 백혈병(CEL), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 다발성 골수종(MM)을 포함한다.

추가 실시양태에서, 과증식성 또는 증식성 장애, 예컨대 담도암, 방광암, 골 및 연조직 암종, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장 선암종, 결장직장암, 데스모이드 종양, 배아암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 위선암종, 다형성교모세포종, 부인과 종양, 두경부 편평세포 암종, 간암, 폐암, 중피종, 악성 흑색종, 골육종, 난소암(예를 들어, Hylander et al., Gynecologic Oncology 101:12-17 (2006)참조), 췌장암, 췌장관 선암종, 원발성 성상세포 종양, 원발성 갑상선암, 전립선암, 신장암, 신세포 암종, 횡문근육종, 피부암, 연조직 육종, 고환 생식 세포 종양, 요로상피암, 자궁 육종 또는 자궁암으로부터 선택되는 고형암을 치료하는 방법이 제공된다.

일부 실시양태에서, TCR은 클래스 I HLA-제한 방식으로 인간 WT1에 대한 항원-특이적 T 세포 반응을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 클래스 I HLA-제한 반응은 항원 처리 관련 수송체(TAP)에 비의존성이다. 일부 실시양태에서, 항원-특이적 T 세포 반응은 CD4+ 헬퍼 T 림프구(Th) 반응 및 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL) 반응 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTL 반응은 WT1-과발현 세포에 대한 것이다.

또한 빌름스 종양 단백질 1(WT1) 발현 또는 과발현과 관련된 증식성 또는 과증식성 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 임의의 TCR, 폴리뉴클레오티드, 조성물, 벡터 및 숙주 세포(임의의 조합 포함)가 제공된다.

또한 빌름스 종양 단백질 1(WT1) 발현 또는 과발현과 관련된 증식성 또는 과증식성 장애 치료용 약제의 제조 방법에 사용하기 위한 임의의 TCR, 폴리뉴클레오티드, 조성물, 벡터 및 숙주 세포(임의의 조합 포함)가 제공된다.

의학 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "치료한다" 및 "치료"는 대상(즉, 인간 또는 인간이 아닌 동물일 수 있는 환자, 숙주)의 질환, 장애 또는 상태의 의학적 관리를 지칭한다(예를 들어 Stedman 's Medical Dictionary 참조). 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 인간 WT1에 특이적인 고기능 결합 활성 재조합 TCR 또는 이의 결합 도메인(예를 들어 본원에 제공된 서열 번호 23 내지 58 및 이의 변이체) 또는 이를 발현하는 숙주 세포, 및 임의로 보조 요법(예를 들어, 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-15, IL-21 또는 이들의 임의의 조합)을 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양으로 투여한다. 치료적 치료 또는 예방적 또는 방지적 방법으로부터 초래되는 치료적 또는 예방적 이점은, 예를 들어 개선된 임상 결과를 포함하되, 목적은 목적하는 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 또는 지연시키거나 또는 달리 감소시키거나(예를 들어, 비처리 대조군에 비해 통계적으로 유의한 방식으로 감소), 또는 이러한 질환 또는 장애의 확장 또는 중증도를 지연시키거나 또는 달리 감소시키는 것이다. 대상을 치료하는 것으로부터의 유리한 또는 목적하는 임상적 결과는 치료될 질환 또는 장애로부터 초래되거나 또는 이와 관련된 증상의 경감, 감소 또는 완화; 증상의 감소된 발생; 개선된 삶의 질; 더 긴 무 질환 상태(즉, 대상이 질환의 진단이 만들어진 것에 기반하여 증상을 제공하는 가능성 또는 경향의 감소); 질환 정도의 감소; 안정화된(즉, 악화되지 않은) 질환 상태; 질환 진행의 지연 또는 늦춤; 질환 상태의 개선 또는 완화; 및 검출 가능하든 또는 검출 가능하지 않든 관해(부분적이든 또는 전체적이든); 또는 전반적 생존을 포함한다.

"치료"는 또한 대상이 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존에 비교할 때 연장된 생존을 의미할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물이 필요한 대상은 이미 질환 또는 장애를 갖는 대상체뿐만 아니라 질환 또는 장애를 갖거나 또는 발생할 위험의 경향이 있는 대상을 포함한다. 예방적 치료가 필요한 대상은 질환, 상태 또는 장애가 예방될(즉, 질환 또는 장애의 발생 또는 재발 가능성이 감소되는) 대상을 포함한다. 본원에 기재된 조성물(및 조성물을 포함하는 제제) 및 방법에 의해 제공되는 임상적 이점은 실시예에 기재된 바와 같이 조성물의 투여가 유리하게 의도되는 시험관 내 분석, 전임상 연구 및 임상 연구의 설계 및 실행에 의해 평가될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상기 언급된 임의의 코딩 TCR 또는 이의 결합 도메인에 따른, 인간 WT1에 특이적인 고친화성 또는 고기능 결합 활성 재조합 TCR 또는 이의 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 또는 이를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 T 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 TCR, 또는 이의 결합 도메인, 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상에게 투여함으로써 과증식성 또는 증식성 장애 또는 빌름스 종양 단백질 1(WT1) 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 인간 WT1 p37 펩티드::MHC에 특이적인 TCR 또는 이의 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 숙주 세포에 대해 코돈 최적화된다. 추가 실시양태에서, 상기 언급된 임의의 폴리뉴클레오티드는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되고 임의로 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터에 함유된다. 예시적인 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 및 γ-레트로바이러스 벡터를 포함한다. 관련 실시양태에서, 벡터는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포, 예컨대 조혈 전구 세포 또는 면역계 세포(예를 들어, 인간 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포)에 전달할 수 있다. 예시적인 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, 인간)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역계 세포는 T 세포, 예컨대 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합이고, 이들 모두는 임의로 인간이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 조작 또는 재조합 숙주 세포가 인간 WT1 p37::MHC에 특이적인 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 TCR을 세포 표면에서 발현하는, 상기 언급된 임의의 실시양태 또는 본원에 기재된 임의의 것에 따른 이종 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 인간 대상에게 투여함으로써 빌름스 종양 단백질 1(WT1) 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 과증식성 또는 증식성 장애 또는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 조작 또는 재조합 숙주 세포가 인간 WT1 p37::MHC에 특이적인 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 TCR을 세포 표면에서 발현하는, 상기 언급된 임의의 실시양태 또는 본원에 기재된 임의의 것에 따른 이종 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 인간 대상에게 투여함으로써 빌름스 종양 단백질 1(WT1) p37 펩티드 생성 또는 WT1 p37 펩티드::MHC 복합체의 존재를 특징으로 하는 과증식성 또는 증식성 장애 또는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.

또한 유효량의 본 개시내용의 숙주 세포 또는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 과증식성 또는 증식성 장애를 갖는 대상의 세포에서 WT1 과발현을 특징으로 하는 상태를 치료하기 위한 입양 면역요법 방법이 제공된다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 생체외에서 변형된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 대상에 대한 동종이계 세포, 동계 세포, 또는 자가 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합이다.

일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합이다.

일부 실시양태에서, 과증식성 또는 증식성 장애는 혈액 악성 종양 또는 고형암이다.

일부 실시양태에서, 혈액 악성 종양은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 호산구성 백혈병(CEL), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 다발성 골수종(MM)으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 고형암은 유방암, 난소암, 폐암, 담도암, 방광암, 골 및 연조직 암종, 뇌종양, 자궁경부암, 결장암, 결장직장 선암종, 결장직장암, 데스모이드 종양, 배아암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 위선암종, 다형성 교모세포종, 부인과 종양, 두경부 편평세포 암종, 간암, 중피종, 악성 흑색종, 골육종, 췌장암, 췌장관 선암종, 원발성 성상세포 종양, 원발성 갑상선암, 전립선암, 신장암, 신세포 암종, 횡문근육종, 피부암, 연조직 육종, 고환 생식 세포 종양, 요로상피암, 자궁 육종 또는 자궁암으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 비경구적으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 방법은 복수 용량의 숙주 세포를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수 용량은 약 2 내지 약 4주의 투여 간격으로 투여된다.

본원에 기재된 바와 같은 인간 WT1 p37 펩티드에 특이적인 재조합 TCR(예를 들어, 고친화성 또는 고기능 결합 활성), 또는 이의 결합 도메인을 발현하는 세포는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되거나 적합한 부형제 또는 담체 중에 대상에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는 인간 또는 다른 비인간 포유동물 대상에 투여하기에 적합한 생물학적으로 적합한 비히클, 예를 들어 생리 식염수로서, 본원에서 보다 상세히 설명된다.

치료적 유효 용량은 치료되는 인간 또는 비인간 포유동물에서 임상적으로 바람직한 결과를 생성할 수 있는 입양 전달에 사용되는 (인간 WT1 p37 펩티드::MHC에 특이적인 고친화성 또는 고기능 결합 활성 재조합 TCR 또는 이의 결합 도메인을 발현하는) 숙주 세포의 양(즉, WT1을 과발현하거나 WT1 p37 펩티드를 생성하는 세포에 대해 특이적인 T 세포 면역 반응(예를 들어, 세포 독성 T 세포 반응)을 통계적으로 유의한 방식으로 유도하거나 향상시키기에 충분항 양)이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체중, 체 표면적, 연령, 투여될 특정 요법, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 상태 및 기타 동시에 투여되는 약물을 비롯한 많은 요인에 의존한다. 용량은 다양하지만, 본원에 기재된 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 투여를 위한 바람직한 용량은 약 10⁴ 세포/m²,약 5 x 10⁴ 세포/m², 약 10⁵ 세포/m²,약 5 x 10⁵ 세포/m², 약 10⁶ 세포/m²,약 5 x 10⁶ 세포/m²,약10⁷ 세포/m², 약 5 x 10⁷ 세포/m², 약 10⁸ 세포/m², 약 5 x 10⁸ 세포/m², 약 10⁹ 세포/m², 약 5 x 10⁹ 세포/m², 약 10¹⁰ 세포/m², 약 5 x 10¹⁰ 세포/m², 또는 약 10¹¹ 세포/m²이다. 일부 실시양태에서, 용량은 약 10⁷ 세포/m², 약 5 x 10⁷ 세포/m², 약 10⁸ 세포/m², 약 5 x 10⁸ 세포/m², 약 10⁹ 세포/m², 약 5 x 10⁹ 세포/m², 약 10¹⁰ 세포/m², 약 5 x 10¹⁰ 세포/m², 또는 약 10¹¹ 세포/m²이다.

약학적 조성물은 의학 분야 업자에 의해 결정되는 바와 같이 치료(또는 예방)될 질환 또는 상태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 용량 및 적합한 지속 기간 및 투여 빈도는 환자의 건강 상태, 환자의 크기(즉, 체중, 질량 또는 체표면적), 환자 질환의 유형 및 중증도, 활성 성분의 특정 형태 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 이점(예컨대 개선된 임상 결과, 이를테면 더 빈번한 완전 또는 부분적 관해, 또는 더 긴 무 질환 및/또는 전반적 생존, 또는 증상 중증도의 감소를 포함하여, 본원에 기재된 바와 같이)을 제공하기에 충분한 양으로 조성물(들)을 제공한다. 예방적 사용을 위해, 용량은 질환 또는 장애와 관련된 질환을 예방하거나, 질환의 개시를 지연시키거나 또는 질환의 중증도를 감소시키는데 충분하여야 한다. 본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 조성물의 예방적 이점은 전임상(시험관 내 및 생체 내 동물 연구를 포함) 및 임상 연구를 수행함으로써 그리고 적절한 통계적, 생물학적 및 임상적 방법 및 기법으로부터 얻은 데이터를 분석함으로써 결정될 수 있으며, 이들 모두는 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있다.

WT1 과발현(또는, 일부 실시양태에서, 발현)과 관련된 상태는 WT1 세포 또는 분자 사건의 저활성, 과활성 또는 부적절한 활성이 존재하고 전형적으로는 정상 세포와 비교하여 질환 세포(예를 들어, 백혈병 세포)에서 WT1의 발현 수준이 상당히 높아(통계적으로 유의함) 일어나는 임의의 장애 또는 상태를 포함한다. 이러한 장애 또는 상태를 갖는 대상은 본원에 기재된 실시양태의 조성물 또는 방법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 것이다. 따라서 WT1 과발현과 관련된 일부 상태는 특정 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태와 같은 급성 및 만성 장애 및 질환을 포함할 수 있다.

WT1 발현과 관련된 상태의 일부 예는 과증식성 장애를 포함하며, 이는 일부 측면에서 종양, 신생물, 암, 악성 종양 등을 포함해 대상에서 활성화 및/또는 증식성 세포의 상태(전사적으로 과활성일 수 있음)를 지칭한다. 활성화 또는 증식성 세포 외에, 과증식성 장애는 또한 괴사 또는 아폽토시스에 의한 세포 사멸 과정의 변조 또는 조절 이상을 포함할 수 있다. 이러한 세포 사멸 과정의 변조는 암(일차, 이차 악성 종양 및 전이 포함) 또는 다른 상태를 포함하는 다양한 상태와 관련될 수 있다.

특정 실시양태에 따르면, 혈액암(예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함하는 백혈병, T 또는 B 세포 림프종, 골수종 및 기타)을 비롯해 WT1 과발현을 특징으로 하는 거의 모든 유형의 암이 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용함으로써 치료될 수 있다. 또한, "암"은 고형 종양, 복수 종양, 혈액 또는 림프 또는 다른 악성 종양을 비롯한 세포의 임의의 가속화된 증식; 결합 조직 악성 종양; 전이성 질환; 장기 또는 줄기 세포의 이식 후 최소 잔류 질환; 다제 내성 암, 원발성 또는 이차성 악성 종양, 악성 종양과 관련된 혈관신생 또는 다른 형태의 암을 지칭할 수 있다. 또한, 상기 개시된 유형의 질환 중 하나만이 포함되거나, 또는 이들이 WT1 발현을 특징으로 하는지의 여부에 관계없이 특정 상태가 배제될 수 있는 특정 실시양태가 본 개시된 실시양태 내에서 고려된다.

본원에서 고려되는 특정 치료 또는 예방 방법은 세포의 염색체에 안정적으로 통합된 본원에 기재된 바와 같은 목적하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포(자가, 동종 또는 동계일 수 있음)를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 세포 조성물은 원하는 WT1-표적화된 T-세포 조성물을 입양 면역요법으로 대상에게 투여하기 위해 자가, 동종 또는 동계 면역계 세포(예를 들어, T 세포, 항원-제시 세포, 자연 살해 세포)를 사용하여 생체 외에서 생성될 수 있다.

본원에서 사용되는 조성물의 투여는 일부 측면에서, 전달 경로 또는 전달 모드에 관계없이, 대상에게 이를 전달하는 것을 지칭한다. 투여는 연속적으로 또는 간헐적으로 그리고 비경구로 실시될 수 있다. 투여는 인식된 상태, 질환 또는 질환 상태를 갖는 것으로 이미 확인된 대상의 치료 또는 이러한 상태, 질환 또는 질환 상태의 발생에 취약하거나 발생 위험이 있는 대상의 치료를 위한 것일 수 있다. 보조 요법과의 공동 투여는 임의의 순서 및 임의의 투여 계획으로 다수의 작용제의 동시 및/또는 순차적 전달을 포함할 수 있다(예를 들어, WT1-특이적 변형된(또는 조작된) 숙주 세포와 하나 이상의 사이토카인; 면역억제 치료제, 예컨대 칼시뉴린 억제제, 코티코스테로이드, 미세소관 억제제, 저용량 마이코페놀산 전구약물 또는 이들의 임의 조합물). 예를 들어, 본 개시내용의 요법은 면역 관문 분자(예를 들어, 항-PD-1, 항 PD-L1, 또는 항-CTLA-4 항체, 예를 들어 Pardol, Nature Rev. Cancer 12:252, 2012; Chen and Mellman, Immunity 39:1, 2013 참조)의 억제제 또는 조절제와 같은 면역억제 성분의 특정 억제제 또는 조절제와 조합될 수 있다

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 약 10⁷ 세포/㎡ 내지 약 10¹¹ 세포/㎡의 용량으로 대상에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 사이토카인을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 IL-2, IL 15, IL 21 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 IL-2이고 숙주 세포와 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 순차적으로 투여되되, 단 사이토카인 투여 전에 대상에게 숙주 세포가 적어도 3 또는 4회 투여되었어야 한다.

일부 실시양태에서, 사이토카인은 IL-2이고 피하 투여된다.

일부 실시양태에서, 대상은 면역억제 요법을 추가로 받고 있다.

일부 실시양태에서, 면역억제 요법은 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, 미세소관 억제제, 저용량의 미코페놀산 전구약물, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 대상은 비-골수파괴성 또는 골수성 조혈 세포 이식을 받았다.

일부 실시양태에서, 대상은 비-골수파괴성 조혈 세포 이식 후 적어도 3개월 후에 숙주 세포를 투여받는다.

일부 실시양태에서, 대상은 골수파괴성 조혈 세포 이식 후 적어도 2개월 후에 숙주 세포를 투여받는다. HCT를 수행하기 위한 기술 및 요법은 당업계에 공지되어 있으며 제대혈, 골수 또는 말초혈로부터 유래된 세포, 조혈 줄기 세포, 동원 줄기 세포 또는 양수로부터의 세포와 같이 임의의 적합한 공여자 세포의 이식을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 면역 세포는 변형된 HCT 요법에서 조혈 줄기 세포와 함께 또는 그 직후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, HCT는 HLA 성분을 코딩하는 유전자의 염색체 녹아웃, TCR 성분을 코딩하는 유전자의 염색체 녹아웃, 또는 둘 다를 포함하는 공여자 조혈 세포를 포함한다.

추가 실시양태에서, 대상은 조성물 또는 HCT를 받기 전에 림프구고갈 화학요법을 이전에 받았다. 특정 실시양태에서, 림프구고갈 화학요법은 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 항흉선세포 글로불린, 또는 이들의 조합을 포함하는 컨디셔닝 요법을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 복수 용량의 재조합 숙주 세포가 대상에게 투여되며, 이는 약 2주 내지 약 4주의 투여 간격으로 투여될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 사이토카인이 순차적으로 투여되되, 단 대상은 사이토카인 투여 전에 적어도 3회 또는 4회 재조합 숙주 세포가 투여되어야 한다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 피하 투여된다(예를 들어, IL-2, IL-15, IL-21).

또 다른 실시양태에서, 치료되는 대상은 면역억제 요법, 예컨대 PD-1에 특이적인 항체(예를 들어, 피딜리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙), PD-L1에 특이적인 항체(예를 들어, MDX-1105, BMS-936559, MEDI4736, MPDL3280A 또는 MSB0010718C), CTLA4에 특이적인 항체(예를 들어, 트레멜리무맙 또는 이필리무맙), 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, 미세소관 억제제, 저용량의 미코페놀산 프로드럭, 또는 이들의 임의 조합과 같은 면역 억제 요법을 추가로 받고 있다. 또 다른 실시양태에서, 치료되는 대상은 비골수증식성 또는 골수증식성 조혈 세포 이식을 받았으며, 여기서 치료는 비골수증식성 조혈 세포 이식 후 적어도 2개월에서 적어도 3개월에 투여될 수 있다.

유효량의 치료 또는 약학적 조성물은 일부 측면에서, 본원에 기술된 바와 같이, 목적하는 임상 결과 또는 이로운 치료를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안에서의 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다. 투여가 질환 또는 질환 상태를 갖는 것으로 이미 알려졌거나 확인된 대상에 대한 것인 경우, 용어 "치료량"은 치료와 관련하여 사용될 수 있고, 반면에 "예방적 유효량"은 예방적 과정으로서 질환 또는 질환 상태의 발생(예를 들어, 재발)에 취약하거나 발생 위험이 있는 대상에 대한 유효량의 투여를 기술하기 위해 사용될 수 있다.

세포독성 T 림프구(CTL) 면역 반응의 수준은 본원에 기재되고 당업계에서 일상적으로 실행되는 많은 면역학적 방법 중 어느 하나에 의해 결정될 수 있다. CTL 면역 반응의 수준은, 예를 들어, T 세포에 의해 발현된 본원에 기재된 WT1-특이적 TCR 중 어느 하나의 투여 전, 후에 결정될 수 있다. CTL 활성을 결정하기 위한 세포독성 분석은 당업계에서 일상적으로 실행되는 몇몇 기법 및 방법 중 어느 하나를 이용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Henkart et al., "Cytotoxic T-Lymphocytes" in Fundamental Immunology, Paul(ed.)(2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA), 페이지 1127-50, 및 이에 인용된 참고문헌 참조).

항원-특이적 T 세포 반응은 적절한 상황에서 동족 항원(예를 들어, 면역적합성 항원-제시 세포에 의해 제시될 때 T 세포를 프라이밍하거나 또는 활성화하기 위해 사용되는 항원)에 노출되는 T 세포와 구조적으로 상이하거나 비관련 대조군 항원 대신에 노출되는 동일한 공급원 집단으로부터의 T 세포 사이에 만들어질 수 있는 본원에 기재된 임의의 T 세포 기능성 파라미터(예를 들어, 증식, 사이토카인 방출, CTL 활성, 변경된 세포 표면 마커 표현형 등)에 따라 관찰된 T 세포 반응의 비교에 의해 전형적으로 결정된다. 대조군 항원에 대한 반응보다 통계학적 유의도가 더 큰 동족 항원에 대한 반응은 항원-특이성을 의미한다.

본원에 기재된 WT1-유래 항원 펩티드에 대한 면역 반응의 존재 및 수준을 결정하기 위해 생물학적 샘플을 대상으로부터 얻을 수 있다. 본원에서 사용되는 "생물학적 샘플"은 혈액 샘플(이로부터 혈청 또는 혈장이 준비될 수 있음), 생검 표본, 체액(예를 들어, 폐 세척액, 복수, 점막 세척액, 활액), 골수, 림프절, 조직 외식편, 기관 배양물 또는 대상 또는 생물학적 공급원으로부터의 임의의 다른 조직 또는 세포 제제일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 임의의 면역원성 조성물을 받기 전에 대상으로부터 얻을 수 있는데, 이의 생물학적 샘플은 기준선(즉, 사전 면역화) 데이터를 확립하기 위한 대조군으로서 유용하다.

본원에 기술된 약학적 조성물은 단위 용량 또는 다회-용량 용기, 예컨대, 밀봉 앰플 또는 바이알에 제공될 수 있다. 이러한 용기는 제형의 안정성을 유지하기 위해 환자에게 주입될 때까지 냉동될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단위 용량은 본원에 기재된 바와 같은 재조합 면역 세포를 약 10⁷개 세포/㎡ 내지 약 10¹¹개 세포/㎡의 용량으로 포함한다. 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기에 적합한 투여 및 치료 요법의 개발은 예를 들어, 비경구 또는 정맥내 투여 또는 제형을 포함한다.

대상 조성물이 비경구로 투여되는 경우, 조성물은 또한 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 적합한 비경구적으로 허용 가능한 비독성 희석제 또는 용매는 물, 링거액, 등장성 염 용액, 1,3-부탄디올, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 물과의 혼합물로의 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 용액 또는 현탁액은 또한 하나 이상의 완충제, 예컨대, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨 또는 타르트산나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 제형을 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 약학적으로 순수하고, 사용된 양에서 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제제 및 제형에 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 대상에 대해서 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 적절한 약학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 재조합 세포 또는 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유할 수 있다.

일반적으로, 적절한 투여량 및 치료 요법은 치료 또는 예방적 이익을 제공하기에 충분한 양의 활성 분자 또는 세포를 제공한다. 이러한 반응은 비치료 대상과 비교할 때 치료 대상에서 개선된 임상적 결과(예를 들어, 더 빈번한 완전 또는 부분적인 차도, 또는 장기간 무질환 생존)를 확립함으로써 모니터링될 수 있다. 종양 단백질에 대한 기존 면역 반응의 증가는 일반적으로 개선된 임상 결과와 상관 관계가 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 당 업계에서 일상적이며 처리 전 후 대상으로부터 수득한 샘플을 사용하여 수행될 수 있는 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 검정을 사용하여 평가될 수 있다.

본 개시에 따른 방법은 조합 요법에서 질환 또는 장애를 치료하기 위해 하나 이상의 추가 제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 조합 요법은 면역 관문 억제제와 (동시에, 동반하여, 또는 순차적으로) 본 개시내용의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 본 개시내용의 조성물(예를 들어, TCR, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 이의 조합)을 자극성 면역 관문제의 작용제와 투여하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 조합 요법은 본 개시내용의 조성물을 화학요법제, 방사선 요법, 수술, 항체, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 2차 요법과 함께 투여하는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "면역 억제 약제" 또는 "면역 억제제"는 면역 반응을 제어하거나 억제하는 데 도움을 주기 위한 억제 신호를 제공하는 하나 이상의 세포, 단백질, 분자, 화합물 또는 복합체를 지칭한다. 예를 들어, 면역 억제제는 면역 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나; 면역 활성화를 감소, 예방 또는 지연시키거나; 면역 억제를 증가, 활성화 또는 상향조절하는 분자를 포함한다. (예를 들어, 면역 관문 억제제와 함께) 표적에 대한 예시적인 면역 억제 약제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CTLA4, B7-H3, B7-H4, CD244/2B4, HVEM, BTLA, CD160, TIM3, GAL9, KIR, PVR1G(CD112R), PVRL2, 아데노신, A2aR, 면역억제성 사이토카인(예를 들어, IL-10, IL-4, IL-1RA, IL-35), IDO, 아르기나제, VISTA, TIGIT, LAIR1, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, Treg 세포 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.

HCT를 수행하기 위한 기술 및 요법은 당업계에 공지되어 있으며 제대혈, 골수, 또는 말초 혈액으로부터 유래된 세포, 조혈 줄기 세포, 동원 줄기 세포, 또는 양수로부터의 세포와 같은 임의의 적합한 공여자 세포 이식을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 면역 세포는 변형된 HCT 요법에서 조혈 줄기 세포와 함께 또는 직후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, HCT는 HLA 성분을 코딩하는 유전자의 염색체 녹아웃, TCR 성분을 코딩하는 유전자의 염색체 녹아웃, 또는 둘 다를 포함하는 공여자 조혈 세포를 포함한다.

추가 실시양태에서, 대상은 조성물 또는 HCT를 받기 전에 림프구고갈 화학요법을 이전에 받았다. 특정 실시양태에서, 림프구 고갈 화학요법은 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 항흉선세포 글로불린, 또는 이들의 조합을 포함하는 컨디셔닝 요법을 포함한다.

본 개시에 따른 방법은 조합 요법에서 질환 또는 장애를 치료하기 위해 하나 이상의 추가 제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 조합 요법은 면역 관문 억제제와 (동시에, 동반하여, 또는 순차적으로) 본 개시내용의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 본 개시내용의 조성물을 자극성 면역 관문제의 작용제와 투여하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 조합 요법은 본 개시내용의 조성물을 화학요법제, 방사선 요법, 수술, 항체, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 2차 요법과 함께 투여하는 것을 포함한다.

면역 억제제 저해제(면역 관문 억제제라고도 지칭됨)는 화합물, 항체, 항체 단편 또는 융합 폴리펩티드(예를 들어, Fc 융합체, 예컨대, CTLA4-Fc 또는 LAG3-Fc), 안티센스분자, 리보자임 또는 RNAi 분자 또는 저분자량 유기 분자일 수 있다. 본원에 개시된 임의의 실시양태에서, 방법은 단독으로 또는 임의의 조합으로 하기 면역 억제 성분 중 어느 하나의 하나 이상의 억제제와 함께 본 개시내용의 조성물을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 PD-1 억제제, 예를 들어 PD-1-특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 피딜리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, MEDI0680(이전의 AMP-514), AMP-224, BMS-936558 또는 이들의 조합과 조합하여 사용된다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 PD-L1 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 BMS-936559, 더발루맙(MEDI4736), 아테졸리주맙(RG7446), 아벨루맙(MSB0010718C), MPDL3280A, 또는 이들의 임의의 조합과 조합하여 사용된다. 세미플리맙; IBI-308; 니볼루맙 + 렐라틀리맙; BCD-100; 캠렐리주맙; JS-001; 스파르탈리주맙; 티스렐리주맙; AGEN-2034; BGBA-333 + 티스렐리주맙; CBT-501; 도스타리맙; 두르발루맙 + MEDI-0680; JNJ-3283; 파조파닙 하이드로클로라이드 + 펨브롤리주맙; 피딜리주맙; REGN-1979 + 세미플리맙; ABBV-181; ADUS-100 + 스파르탈리주맙; AK-104; AK-105; AMP-224; BAT-1306; BI-754091; CC-90006; 세미플리맙 + REGN-3767; CS-1003; GLS-010; LZM-009; MEDI-5752; MGD-013; PF-06801591; Sym-021; 티스렐리주맙 + 파미파립; XmAb-20717; AK-112; ALPN-202; AM-0001; 알츠하이머 병에 대한 PD-1 길항 항체; BH-2922; BH-2941; BH-2950; BH-2954; 고형 종양에 대해 CTLA-4 및 PD-1을 길항하는 생물학적 제제; 종양학상 PD-1 및 LAG-3을 표적으로 하는 이중 특이적 단일 클론 항체; BLSM-101; CB-201; CB-213; CBT-103; CBT-107; 세포 면역요법 + PD-1 억제제; CX-188; HAB-21; HEISCOIII-003; IKT-202; JTX-4014; MCLA-134; MD-402; mDX-400; MGD-019; 종양학상 PDCD1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 종양 용해성 바이러스; OT-2; PD-1 길항제 + 로페그인터페론 알파-2b; PEGMP-7; PRS-332; RXI-762; STIA-1110; TSR-075; 종양학상 HER2 및 PD-1을 표적으로 하는 백신; 종양학 및 자가 면역 질환상 PD-1을 표적으로 하는 백신; XmAb-23104; 종양학상 PD-1을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드; AT-16201; 종양학상 PD-1을 억제하는 이중 특이적 단일 클론 항체; IMM-1802; 고형 종양 및 혈액 종양에 대한 PD-1 및 CTLA-4를 길항하는 단일 클론 항체; 니볼루맙 바이오시밀러; 종양학상 CD278 및 CD28에 작용하고 PD-1을 길항하는 재조합 단백질; 자가 면역 장애 및 염증성 장애에 대한 PD-1에 작용하는 재조합 단백질; SNA-01; SSI-361; YBL-006; AK-103; JY-034; AUR-012; BGB-108; 고형 종양에 대한 PD-1, Gal-9 및 TIM-3을 억제하는 약물; ENUM-244C8; ENUM-388D4; MEDI-0680; 전이성 흑색종 및 전이성 폐암에 대한 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 종양학상 CTLA-4 및 PD-1을 표적으로 하는 단일 클론 항체; NSCLC에 대한 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1 및 TIM-3을 억제하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 혈액암 및 고형 종양에 대한 PD-1 및 VEGF-A를 억제하는 재조합 단백질; 종양학상 PD-1을 길항하는 소분자; Sym-016; 이네빌리주맙 + MEDI-0680; 전이성 흑색종에 대한 PDL-1 및 IDO를 표적으로 하는 백신; 교모세포종에 대한 항-PD-1 단일 클론 항체 + 세포 면역요법; 종양학상 PD-1을 길항하는 항체; 혈액 악성 종양 및 세균 감염에 대한 PD-1/PD-L1을 억제하는 단일 클론 항체; HIV에 대한 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 또는 고형 종양에 대한 PD-1을 억제하는 소분자가 또한 고려된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 LAG3 억제제, 예컨대 LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016, 또는 이들의 임의의 조합과 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 CTLA4의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 이필리무맙, 트레멜리무맙, CTLA4-Ig 융합 단백질(예를 들어, 아바타셉트, 벨라타셉트) 또는 이들의 임의의 조합과 같은 CTLA4 특이적 항체 또는 이의 결합 단편과 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 B7-H3 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 에노블리투주맙(MGA271), 376.96, 또는 둘 모두와 조합하여 사용된다. B7-H4 항체 결합 단편은 예를 들어 Dangaj et al., Cancer Res. 73:4820, 2013 및 미국 특허 번호 9,574,000 및 PCT 특허 공개 번호 WO/201640724A1 및 WO 2013/025779A1에 설명된 scFv 또는 이의 융합 단백질일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 CD244의 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 BLTA, HVEM, CD160 또는 이들의 임의의 조합의 억제제와 조합하여 사용된다. 항CD-160 항체는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2010/084158에 설명되어 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시 세포의 조성물은 TIM3의 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 Gal9의 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 디코이 아데노신 수용체와 같은 아데노신 신호 전달 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 A2aR의 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 리릴루맙(BMS-986015)과 같은 KIR의 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 억제성 사이토카인(전형적으로, TGFβ 이외의 사이토카인) 또는 Treg 발달 또는 활성의 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 IDO 억제제, 예컨대 레보-1-메틸 트립토판, 에파카도스타트(INCB024360; Liu et al., Blood 115:3520-30, 2010), 엡셀렌(Terentis et al., Biochem. 49:591-600, 2010), 인독시모드, NLG919(Mautino et al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; 2013 년 4 월 6-10 일), 1-메틸-트립토판(1-MT)-티라-파자민, 또는 이들의 조합과 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 아르기나제 억제제, 예컨대 N(오메가)-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME), N-오메가-하이드록시-노르-1-아르기닌(nor-NOHA), L-NOHA, 2(S)-아미노-6-보로노헥사노산(ABH), S-(2-보로노에틸)-L-시스테인(BEC) 또는 이들의 조합과 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 CA-170(Curis, Lexington, Mass)과 같은 VISTA 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 TIGIT의 억제제, 예를 들어 COM902(Compugen, Toronto, Ontario Canada), CD155의 억제제, 예를 들어 COM701(Compugen) 또는 둘 다와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 PVRIG, PVRL2 또는 둘 모두의 억제제와 조합하여 사용된다. 항-PVRIG 항체는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2016/134333에 설명되어 있다. 항-PVRL2 항체는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2017/021526에 설명되어 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 LAIR1 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5 또는 이들의 임의의 조합의 억제제와 조합하여 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 자극성 면역 관문 분자의 활성을 증가시키는 제제(즉, 작용제)와 조합하여 사용된다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 CD137(4-1BB) 작용제(예를 들어, 우렐루맙 등), CD134(OX-40) 작용제(예를 들어, MEDI6469, MEDI6383, 또는 MEDI0562 등), 레날리도미드, 포말리도미드, CD27 작용제(예를 들어, CDX-1127 등), CD28 작용제(예를 들어, TGN1412, CD80, 또는 CD86 등), CD40 작용제(예를 들어, CP-870,893, rhuCD40L, 또는 SGN-40 등), CD122 작용제(예를 들어, IL-2 등), GITR의 작용제(예를 들어, PCT 특허 공개 번호 WO 2016/054638호에 기술된 인간화된 단일 클론 항체), ICOS의 작용제(CD278)(예를 들어, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8 또는 이들의 임의 조합 등)와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 실시양태에서, 방법은 전술한 임의의 것을 포함하는 자극성 면역 관문 분자의 하나 이상의 작용제를 단독으로 또는 임의의 조합으로 본 개시내용의 조성물과 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 조합 요법은 본 개시내용의 조성물 및 다음 중 하나 이상을 포함하는 2 차 요법을 포함한다: 비염증성 고형 종양에 의해 발현되는 암 항원에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 방사선 치료, 수술, 화학요법제, 사이토카인, RNAi, 또는 이들의 임의의 조합.

특정 실시양태에서, 조합 요법 방법은 본 개시내용의 조성물을 투여하고 방사선 치료 또는 수술을 추가로 투여하는 것을 포함한다. 방사선 요법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 감마선 조사와 같은 X 선 요법 및 방사성 의약품 요법을 포함한다. 대상에서 주어진 암을 치료하는 데 적절한 수술 및 수술 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

특정 실시양태에서, 조합 요법 방법은 본 개시내용의 조성물을 투여하고 화학요법제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 화학요법제는 크로마틴 기능 억제제, 토포이소머라제 억제제, 미세소관 억제 약물, DNA 손상제, 항대사물질(예컨대, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 당-변형된 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용제(예컨대, 인터칼레이팅제), 및 DNA 수선 억제제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 화학요법제는 하기 군을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 항대사물질/항암제, 예컨대, 피리미딘 유사체(5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈, 시타라빈) 및 퓨린 유사체, 폴레이트 길항제 및 관련 억제제(머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈)); 항증식성/세포분열 방지제, 예컨대, 자연 산물, 이를테면, 빈카 알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈), 미세소관 파괴제, 예컨대, 탁산(파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신(에토포시드, 테니포시드), DNA 손상제(악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 머클로로에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소테레, 테모졸아미드, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 에토포사이드(VP 16)); 항생제, 예컨대, 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신) 및 미토마이신; 효소(L-아스파라긴을 전신에서 대사시키고 그 자체의 아스파라긴을 합성하는 능력이 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나제); 항혈소판 작용제; 항증식성/세포분열방지 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드(메클로에타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민(헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬설포네이트-부설판, 니트로소우레아(카르무스틴(BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카바지닌(DTIC); 항증식성/세포분열방지 항대사물질, 예컨대, 엽산 유사체(메토트렉세이트); 백금 배위 복합체(시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체(에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제(aromatase) 억제제(레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제(헤파린, 합성 헤파린 염 및 기타 트롬빈 억제제); 섬유소 용해제(예컨대, 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator), 스트렙토키나제 및 우로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 이동방지제; 분비억제제(브레벨딘); 면역 억제제(사이클로스포린, 타크롤리무스(FK-506), 시롤리무스(라파마이신), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 항-혈관신생 화합물(TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 억제제(혈관 내피세포 성장 인자(VEGF) 억제제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여체; 안티-센스 올리고뉴클레오티드; 항체(트라스투주맙, 리툭시맙); 키메라 항원 수용체; 세포 주기 억제제 및 분화 유도인자(트레티노인); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제(독소루비신(아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신, 이리노테칸(CPT-11) 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드(코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능장애 유도인자, 및 독소, 예컨대, 콜레라 독소, 리신, 슈도모나스 엑소톡신, 보데텔라 백일해 아데닐레이트 사이클라제 독소 또는 디프테리아 독소 및 카스파제 활성인자; 및 염색질 파괴인자.

사이토카인이 숙주 면역 반응을 항암 활성 쪽으로 조작하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Floros & Tarhini, Semin. Oncol. 42(4):539-548, 2015] 참조). 단독으로 또는 본 개시내용의 조성물과 조합하여, 면역 항암 또는 항종양 반응을 촉진시키기에 유용한 사이토카인은 예를 들어, IFN-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL- 21, IL-24, 및 GM-CSF를 포함한다.

또한 입양 면역요법을 조절하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 안전 스위치 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 개시내용의 변형된 숙주 세포를 이전에 받은 대상에게 안전 스위치 단백질의 동족 화합물을 대상에서 이전에 투여된 변형된 숙주 세포를 절제하기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다.

특정 실시양태에서, 안전 스위치 단백질은 tEGFR을 포함하고 동족 화합물은 세툭시맙이거나, 안전 스위치 단백질은 iCasp9를 포함하고 동족 화합물은 AP1903(예를 들어, 이량체화된 AP1903)이거나, 또는 안전 스위치 단백질은 RQR 폴리펩티드를 포함하고 동족 화합물은 리툭시맙이거나, 안전 스위치 단백질은 myc 결합 도메인을 포함하고 동족 화합물은 myc 결합 도메인에 특이적인 항쇄이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용의 조성물 또는 단위 용량을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 (i) 본 개시내용의 벡터로 형질도입된 숙주 세포의 분취량을 (ii) 약학적으로 허용되는 담체와 조합하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 벡터는 입양 전달 요법(예를 들어, 암 항원을 표적화)에 사용하기 위해 숙주 세포(예를 들어, T 세포)를 형질감염/형질도입하는 데 사용된다.

일부 실시양태에서, 방법은 분취하기 전에 형질도입된 숙주 세포를 배양하고 벡터를 도입(즉, 발현)시킨 형질도입된 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 방법은 배양 및 선택 후, 분취하기 전에 형질도입된 숙주 세포를 확장하는 것을 포함한다. 본 방법의 임의의 실시양태에서, 제조된 조성물 또는 단위 용량은 추후 사용을 위해 동결될 수 있다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포, T 세포, 일차 T 세포, T 세포주, NK 세포, 또는 NK-T 세포를 포함하는 본 방법에 따른 조성물 또는 단위 용량에 임의의 적절한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 CD8⁺ T 세포, CD4⁺T 세포, 또는 둘 모두인 숙주 세포를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 IDO 억제제, 예컨대 레보-1-메틸 트립토판, 에파카도스타트(INCB024360; Liu et al., Blood 115:3520-30, 2010), 엡셀렌(Terentis et al., Biochem. 49:591-600, 2010), 인독시모드, NLG919(Mautino et al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; 2013 년 4 월 6-10 일), 1-메틸-트립토판(1-MT)-티라-파자민, 또는 이들의 조합과 조합하여 사용된다.

사이토카인이 숙주 면역 반응을 항암 활성 쪽으로 조작하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Floros & Tarhini, Semin. Oncol. 42(4):539-548, 2015]). 단독으로 또는 본 개시내용의 결합 단백질 또는 이의 발현 세포와 조합하여, 면역 항암 또는 항종양 반응을 촉진시키기에 유용한 사이토카인은 예를 들어, IFN-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL- 21, IL-24, 및 GM-CSF를 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 분취하기 전에 형질도입된 숙주 세포를 배양하고 벡터를 도입(즉, 발현)시킨 형질도입된 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 방법은 배양 및 선택 후, 분취하기 전에 형질도입된 숙주 세포를 확장하는 것을 포함한다. 본 방법의 임의의 실시양태에서, 제조된 조성물 또는 단위 용량은 추후 사용을 위해 동결될 수 있다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포, T 세포, 일차 T 세포, T 세포주, NK 세포, 또는 NK-T 세포를 포함하는 본 방법에 따른 조성물 또는 단위 용량에 임의의 적절한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 CD8⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포, 또는 둘 모두인 숙주 세포를 포함한다.

실시예

실시예 1

방법

세포주

T2는 HLA A^*02:01만을 발현하는 TAP-결여 T 세포 백혈병/B-LCL 하이브리드 세포주이고¹¹, 293T/17은 ATCC에서 구입한 고도로 형질감염가능한 세포주이다. Jurkat76 세포는 모 Jurkat 세포주의 TCRα/TCRβ 결여 유도체이며 자연적으로 CD8를 발현하지 않는다¹². Jurkat76 세포를 CD8αβ Jurkat-CD8을 발현하도록 사전 형질도입하였다. 세포주를 10% 열 불활성화 FBS(Hyclone, GE Healthcare Life Sciences), 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 HEPES(Invitrogen, GIBCO)가 포함된 RPMI 1640 배지에서 유지하였다.

인간 T 세포 배양:

헬싱키 선언에 따라 서면 동의를 받고 프로토콜 868.01에 따라 기관 검토 위원회의 승인을 받은 후 시애틀 암 치료 센터(Seattle Cancer Care Alliance)의 건강한 기증자로부터 백혈구성분 채집술 샘플을 수집하였다. PBMC를 HLA 유형 기증자로부터 단리하고, 이전에 설명된 바와 같이^13,14, 기증자당 펩티드 WT1_37-45, VLDFAPPGA(총 10명의 기증자)에 대해 특이적인 10개의 HLA-A^*02:01-제한 T 세포주를 생성하였다. 요약하면, EasySep^TM 인간 CD8⁺ T 세포 단리 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 CD8⁺ T 세포를 정제하고, 플라스틱에 부착하여 자가 PBMC로부터 DC를 생성한 뒤, 수확 전 마지막 날에 숙성 사이토카인 칵테일을 첨가하여 1000 U/ml IL-4 및 800 U/ml GMCSF와 2일간 배양하였다. DC에 1 ㎍/ml 펩티드를 90분 동안 로딩한 다음 세척하여 과량의 펩티드를 제거하고, 4000 Rad에서 조사하였다. 약 5×10⁶CD8⁺ T 세포를 펩티드-펄스 DC + 30 ng/ml IL-21과 함께 2.5:1 비율로 공동 배양하였다. T 세포를 5% 열 불활성화 풀링 인간 혈청(Bloodworks Northwest), 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 55 μM 2-β-머캅토에탄올이 보충된 HEPES(Invitrogen, GIBCO)가 포함된 RPMI 1640 배지에서 유지하였다. 배지의 절반을 교환하고 12.5 U/ml IL-2, 2250 U/ml IL-7 및 IL-15를 첨가하여 배양물을 2-3일마다 공급하였다. T 세포를 조사된 펩티드 펄스화 자가 PBMC와 1:2 비율로 배양함으로써 10일마다 재자극하였다.

유세포 분석 기반 세포 분류

항원 특이적 확장을 마치고 모든 기증자로부터의 T 세포주를 얼음 위에서 합쳤다. 풀링된 샘플을 분할하고 다음 3가지 조건에서 펩티드/HLA-A2 사량체로 염색하였다: (1) '사량체 결합 및 친화도 측정' 섹션에 설명된 바와 같이 양성 및 음성 집단의 최대 분리를 제공하도록 경험적으로 결정된 야생형 사량체 농도; (2) 최적의 사량체 용량의 100배 희석; 및 (3) CD8와 상호작용하는 α-도메인의 위치 D227K 및 T228A에서 HLA-A2 분자를 돌연변이시켜 만든 별도의 변형된 사량체¹⁵. 이 사량체는 고친화성 CD8 비의존성 TCR에 선택적으로 결합하는 것으로 나타났다^16,17. 각각의 사량체 염색된 샘플에 대해, 사량체 결합 수준이 가장 높은 세포(표지된 세포의 상위 ~2%)를 유세포 분석법으로 분류하였다. 분류된 집단을 Adaptive Biotechnologies immunoseq 어세이로 분석하여 각 클론형의 상대적 존재비를 정량화하였다. 전체 사량체 양성 집단을 포함하는 추가 샘플을 또한 최적의 사량체 염색 샘플과 Adaptive Biotechnologies pairSeq Assay¹⁸에 의해 결정된 TCRαβ 페어링 정보로부터 분류하였다.

데이터 분석

농축 계산

각 클론형에 대한 농축 점수를 (분류된 사량체⁺ 집단에서의 빈도)/(분류되지 않은 풀링 샘플에서의 빈도)로 계산하였다. 풀링 샘플에서 검출되지 않은 클론형은 농축 계산을 위해 1 세포에 해당하는 풀링 샘플에서의 빈도를 할당하였다.

TCR 시퀀싱 및 알파/베타 페어링:

Adaptive Biotechnologies ImmunoSeq 어세이에 의해 TCR 레퍼토리 분석을 수행하였다. 10x 지노믹스에 의한 크롬 단일 세포 면역 프로파일링을 사용하여 단일 세포 V(D)J 분석(TCR 알파/베타 페어링)을 수행하였다.

TCR 형질도입

TCRδ-p2a-TCRα 배향의 코돈 최적화된 TCR 작제물을 BioXp^TM 3200(SGI-DNA)에서 합성하고 깁슨 어셈블리에 의해 pRRLSIN.cPPT.MSCV.WPRE 렌티바이러스 발현 플라스미드(Dr. Richard Morgan(NCI)이 제공)에 클로닝하였다. 그런 다음 발현 벡터를 3세대 렌티바이러스 패키징 시스템을 사용하여 293T 세포에 패키징하였다. 48시간 후 렌티바이러스 상등액을 수확하고 여과하여 세포 파편을 제거하였다. 약 5×10⁵ Jurkat76 세포를 2 ml의 렌티바이러스 상등액 + 5 ug/ml의 폴리브렌과 조합하였다. 세포를 30 ℃에서 90분 동안 1000 g으로 원심분리하여 형질도입을 촉진하였다. 일차 CD8⁺ T 세포의 TCR-형질전환을 위해, EasySep^TM 인간 CD8⁺T 세포 단리 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 HLA-A2⁺ PBMC를 CD8⁺ T 세포에 대해 농축하고, Dynabeads^TM Human T-Expander CD3/CD28(Gibco)로 4시간 동안 활성화하였다. 약 2×10⁶ CD8⁺ T 세포를 2 ml 렌티바이러스 상등액 + 5 ㎍/ml 프로타민 설페이트 및 50 U/ml IL-2와 조합하였다. 펩티드/HLA-A^*02:01 사량체를 사용하여 트랜스제닉 TCR⁺ 세포를 FACSort하여 다운스트림 분석을 위한 순수한 항원 특이적 세포 집단을 얻었다.

TCR 결합 데이터

정확한 TCR 페어링 평가

Jurkat76 세포를 각 TCR 작제물로 형질도입하고 CD3 표면 발현과 관련된 사량체 결합에 대해 분석하였는데, 이는 내인성 TCR이 결여된 이들 세포에서 전체 트랜스제닉 TCR 표면 발현을 반영한다.

사량체 결합 및 친화도 측정

양성 T 세포 집단에 대해 사량체 적정을 수행하고 음성 집단의 배경 염색의 증가없이 양성 및 음성 집단을 가장 잘 분리하는 농도를 선택하여 최적의 사량체 용량을 결정하였다.

TCR 기능성 데이터

IFN-γ 생성

일차 CD8⁺T 세포를 각 TCR 발현 작제물로 렌티바이러스로 형질도입하고 균일하게 사량체 양성 세포 집단을 생성하도록 분류한 다음, 감소하는 용량의 펩티드(1-10^-5 μM)로 펄스화된 T2 표적 세포와 1:1 비율로 혼합하였다. 제시된 경우 자가 PBMC를 APC로 대안적으로 사용하였다. 골지 억제제(BD GolgiPlug and GolgiStop)의 존재하에 4시간 인큐베이션한 후, 세포를 항-CD8로 표면 염색한 다음, BD Perm/세척 버퍼에서 항-IFN-γ로 세포내 표지하기 전에 고정시켰다(BD Cytofix/Cytoperm). 세포를 유세포 분석법으로 분석하여 각 샘플에 대한 IFN-γ⁺세포의 백분율을 결정하였다. 이들 데이터를 Graphpad Prism(곡선의 하단과 상단이 각각 0과 100으로 제한되는 4 파라미터 변수 기울기)을 사용한 비선형 회귀에 의해 용량-반응 곡선에 피팅하였다.

도 1(A) 및 1(B)는 WT1_37-45 펩티드 특이적 TCR이 고속 대량 처리 시퀀싱 기반 전략에 의해 식별되는 방법을 보여준다. 전체 사량체 양성 집단에 대한 고 사량체 결합 분류로 농축된 TCR 클론형은 펩티드/HLA A2 리간드에 대해 높은 친화도 또는 높은 기능적 결합 활성을 가질 가능성이 있는 것으로 확인되었다. (A) 높은 WT1_37-45 펩티드/MHC 사량체 결합과 관련된 TCR 클론형을 식별하기 위한 초기 시퀀싱 기반 전략의 개략도. (B) 선택된 TCR이 강조 표시된, 분류 집단 농축 대 총 집단 비율이 표시된다. 검은색 원으로 표시된 모든 TCR을 합성하고 항원 특이성에 대해 평가하였다(총 27개).

도 2는 선택된 TCR의 특이성과 상대적인 사량체 결합 친화성을 평가하는 사량체 결합 연구의 결과를 보여준다. 내인성 TCRα/β 쇄가 결여된 Jurkat 세포에서 TCR 작제물이 발현되었다. 각 TCR에 대한 사량체 염색 대 CD3 발현이 표시된다(CD3 발현은 트랜스제닉 TCR 표면 발현과 직접적으로 상관됨).

실시예 2

고기능 결합 활성 TCR의 식별

일부 고친화성 TCR은 CD8과 독립적으로 사량체에 결합하는 것으로 나타났기 때문에, CD8 비의존성(CD8i) 사량체를 사용한 경우, 고 사량체 결합 분류 집단이 특히 풍부한 추가 TCR을 확인하기 위해 이차 실험을 수행하였다. 도 3A 내지 3C는 CD8 비의존성 (CD8i) 사량체를 사용하여 변형된 고속 대량 처리 시퀀싱 기반 전략에 의해 추가 WT1_37-45 펩티드 특이적 TCR을 식별하는 방법을 보여준다. 고 CD8 비의존성 WT1₃₇펩티드/MHC 사량체 결합과 관련된 TCR 클론형을 식별하기 위한 변형된 시퀀싱 기반 전략의 개략도가 도 3A에 도시되었다. CD8i 사량체를 사용한 경우 유사한 분석과 비교하여 원래 분류 집단의 농축 대 총 집단의 백분율을 도 3B 및 3C에 나타내었다. 표면 CD3 수준 및 CD8i 사량체 결합을 기반으로 추가 14개의 TCR을 선택하였다. 도 3B 및 3C에서 명시된 모든 TCR 클론형을 합성하고 항원 특이성에 대해 평가하였다. 도 3C에서 음영(대각선 패턴) 원으로 표시된 모든 TCR은 CD8i 사량체를 사용하여 식별된 추가 TCR을 나타낸다.

실시예 3

사량체 염색 대 CD3 발현

추가 CD8i 사량체로 선택된 WT1_37-45 펩티드 특이적 TCR의 CD8i 사량체 결합이 도 4에 도시되었다. 내인성 TCRα/β 쇄가 결여된(CD8 발현도 없음) Jurkat 세포에서 TCR 작제물을 발현시켰다. 각 TCR에 대한 사량체 염색 대 CD3 발현이 도 4에 도시되었다(CD3 발현은 트랜스제닉 TCR 표면 발현과 직접적으로 상관됨). 사량체에 가장 강하게 결합하여 항-CD3 염색에 비해 높은 수준의 사량체 염색을 초래하는 TCR을 추가 분석을 위해 선택하였다.

실시예 4

기능 결합 활성(EC ₅₀ ) 측정을 위한 IFNγ 분석

표적 세포가 본 TCR로 형질도입된 T 세포의 50%로부터 T 세포 반응(예: IFNγ 생성)을 유도하기 위해 펄스해야 하는 펩티드의 양인 펩티드 EC₅₀에 의해, 제한된 항원 농도에서 T 세포 활성화를 신호하는 TCR의 능력을 측정하였다. 이 값은 항원-발현 표적 세포를 사멸시키기 위해 주어진 TCR을 발현하는 T 세포의 능력과 직접적으로 상관된다. 선택된 TCR에 대한 펩티드 EC₅₀을 결정하기 위해, 각 TCR을 기증자 PMBC에서 단리한 CD8⁺T 세포로 형질도입하였다(도 5A). 1주 후, 세포를 사량체⁺ CD8⁺ T 세포에 대해 분류하고 확장시켰다. 확장된 항원 특이적 세포를 펩티드-펄스화 T2 표적 세포와 함께 4-6시간 동안 배양하고 IFNγ 생성을 유세포 분석법으로 결정하였다(도 5A). IFNγ 생성 세포의 백분율을 각 TCR에 대한 펩티드 EC₅₀을 계산하기 위해 비선형 회귀에 의해 용량-반응 곡선에 피팅하였다(도 5B).

실시예 5

WT1 _37-45 펩티드 특이적 TCR을 발현하는 일차 CD8+ T 세포에 의한 HLA-A2 ⁺ WT1 ⁺ MDA-MB-468 세포의 시험관 내 사멸

HLA-A2에서 WT1 p37 항원을 자연적으로 발현하고 제시하는 종양 세포의 TCR-형질도입된 CD8⁺ T 세포-매개 용해를 직접 평가하기 위해, 기증자 유래 CD8⁺ T 세포를 선택된 각 TCR 중 하나로 형질도입하고 고 사량체 결합을 위해 분류 정제하였다. 그런 다음 TCR-형질도입된 T 세포를 CytoLight® Rapid Red 염료로 염색한 유방암 세포주 MDA-MB-468과 8:1 비율로 혼합하였다(삼중으로). 총 적색 물체 면적(살아 있는 표적 세포의 총 수와 상관관계가 있음)을 72 시간에 걸쳐 각 TCR 형질도입된 T 세포 집단에 대해 표시된 시점에서 계산하였다. 가장 강력한 종양 반응성 T 세포는 생체 내에서 환자에게 전달된 후에도 오랜 기간 동안 종양 항원에 대한 반응성을 유지할 것이다. 따라서, 지속 항원에 대한 TCR-형질도입된 T 세포의 지속적인 반응성을 평가하기 위해, 추가 MDA-MB-468 세포를 48시간에 첨가하였다. 도 6을 참조한다.

실시예 6

WT1 _37-45 펩티드 특이적 TCR을 발현하는 일차 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T 세포에 의한 HLA-A2 ⁺ WT1 ⁺ PANC-1 세포의 시험관 내 사멸

CD4⁺ 및 CD8⁺T 세포 모두 생체 내에서 종양 제거에 역할을 할 수 있다. 따라서, CD4⁺ T 세포에서 항원 특이적 반응을 신호할 수도 있는 MHC 클래스 I 제한 TCR이 CD8⁺ T 세포만 활성화할 수 있는 TCR보다 바람직하다. CD4⁺T 세포에서 기능하는 MHC 클래스 I 제한 TCR의 능력은 부분적으로 펩티드 MHC에 대한 TCR의 친화도에 의존하는 것으로 보인다. 많은 경우에, CD8α 및 CD8β를 코딩하는 유전자로 CD4+ T 세포를 형질도입하면 항원 특이적 반응을 효율적으로 유도하는 데 도움이 된다. 따라서, HLA-A2⁺WT1⁺종양 세포를 표적화하기 위해 TCR10.1을 발현하는 CD8 T 세포에 대한 CD4(CD8α/CD8β로 형질도입됨) 능력을 평가하기 위해, CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 둘 다를 WT1_37-45 TCR10.1을 발현하도록 형질도입하였다. CD4⁺ T 세포를 CD8α 및 CD8β 유전자가 발현되도록 추가로 형질도입하였다. 8일 후, 형질도입된 세포를 분류하여 CD8⁺ 사량체⁺ 및 CD4⁺/CD8⁺ 사량체⁺ T 세포를 정제하였다. CD4⁺, CD8⁺ 또는 이 두 집단(CD4 및 CD8)의 혼합물인 항원 특이적 세포를 NucLight® 적색 염료를 발현하도록 사전에 형질도입된 췌장 선암종 세포주 PANC-1과 8:1로 혼합하였다(삼중으로). 각 TCR 형질도입 T 세포 집단에 대해 제시된 시점에서 총 적색 물체 면적(살아 있는 표적 세포의 총 수와 상관관계가 있음)을 계산하였다. 지속성 항원에 대한 TCR 형질도입된 T 세포의 지속적인 반응성을 평가하기 위해, 추가 PANC-1 세포를 48시간에 첨가하였다. 도 7은 WT1_37-45 TCR10.1을 발현하는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포가 시험관 내 반복 챌린지 후 WT1⁺A2⁺ 췌장 선암종 세포주 PANC-1을 제거할 수 있음을 보여준다.

WT1 p126 에피토프는 WT1 및 HLA-A2를 발현하는 세포에 의해 항상 효율적으로 처리/제시되는 것은 아니다(Jaigirdar et al., J. Immunother. 39:105, 2017). 특히, WT1 및 HLA-A2를 발현하는 여러 고형 종양 유래 세포주는 면역프로테아좀 발현을 상향 조절하기 위한 IFNγ와의 사전 배양 유무에 관계없이 WT1-p126 특이적 TCR에 의해 효율적으로 표적화되지 않는다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 부분적으로 WT1-p37 에피토프가 WT1-p126 에피토프와 비교하여 보다 광범위하게 처리되고 다양한 종양 유형에 의해 제시된다는 발견에 관한 것이다. 도 8A 내지 8D는 WT1 p37 펩티드-특이적 TCR과 비교하여 WT1-p126 펩티드-특이적 TCR에 의한 다양한 WT1⁺A2⁺종양 세포주의 용해를 보여준다. 이러한 데이터는 WT1 p-37 펩티드 특이적 TCR이 일반적으로 광범위한 WT1+A2+ 종양을 표적화화는데 보다 신뢰적으로 보인다는 사실을 강조한다.

본원에 기재된 다양한 실시양태는 추가 실시양태를 제공하도록 조합될 수 있다. 2019년 3월 11일에 출원된 미국 가출원 제62/816,746호를 포함해 본 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물 모두는 이들의 전문이 참고로 본원에 포함된다. 일반적으로, 하기 청구범위에서 사용된 용어는 청구범위가 본 명세서에 개시된 특정 실시양태로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 이러한 청구범위로 주어지는 동등한 전 범위와 함께 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Fred Hutchinson Cancer Research Center Schmitt, Thomas M. Chapuis, Aude G. Greenberg, Philip D. <120> HIGH AVIDITY WT1 T CELL RECEPTORS AND USES THEREOF <130> 360056.466WO <140> PCT <141> 2020-03-10 <150> US 62/816,746 <151> 2019-03-11 <160> 263 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR10.1 - beta CDR3 (IMGT junction) <400> 1 Cys Ala Ser Ser Leu Thr Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR11.2 - beta CDR3 (IMGT junction) <400> 2 Cys Ser Ala Thr Pro Glu Ala Ser Ser Pro Tyr Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR12.1 - beta CDR3 (IMGT junction) <400> 3 Cys Ala Thr Ser Asn Leu Gln Gly Arg Gln Pro Gln His Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.1 - beta CDR3 (IMGT junction) <400> 4 Cys Ala Ser Ser Leu Arg Leu Gly Arg Glu Thr Gln Tyr 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Cys Ala Ala Ser Gly Thr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.1 - alpha CDR3 (IMGT junction) <400> 15 Cys Ala Ala Ser Gly Ile Gly Asp Tyr Lys Leu Ser Phe 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 - alpha CDR3 (IMGT junction) <400> 16 Cys Ala Val Arg Thr Ser Tyr Asp Lys Val Ile Phe 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR14.1 - alpha CDR3 (IMGT junction) <400> 17 Cys Ala Val Asn Leu Leu Gly Ala Thr Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe 1 5 10 15 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 - alpha CDR3 (IMGT junction) <400> 18 Cys Ala Val Arg Gly Ile Asn Asp Tyr Lys Leu Ser Phe 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 - alpha CDR3 (IMGT junction) <400> 19 Cys Ala Val Ile Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 - alpha CDR3 (IMGT junction) <400> 20 Cys Ile Ala Gly Val Gly Arg Gly Gln Asn Phe Val Phe 1 5 10 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR18.1 - alpha CDR3 (IMGT junction) <400> 21 Cys Ala Phe His Pro Asn Phe Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 - alpha CDR3 (IMGT junction) <400> 22 Cys Ala Val Gln Pro Arg Gly Asp Gly Ser Ser Asn Thr Gly Lys Leu 1 5 10 15 Ile Phe <210> 23 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR10.1 - Vbeta <400> 23 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Val Val Leu Gly Phe Leu Gly Thr 1 5 10 15 Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Thr 20 25 30 Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His 35 40 45 Val Ser Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe 50 55 60 Leu Thr Tyr Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Asp Lys Ser Gly Leu Pro 65 70 75 80 Asn Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Ile Ser Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Gln Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr Arg Cys Ala 100 105 110 Ser Ser Leu Thr Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Thr Glu 130 <210> 24 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR11.2 - Vbeta <400> 24 Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Ala Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr 20 25 30 Ser Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met 35 40 45 Phe Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr 50 55 60 Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp 65 70 75 80 Lys Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val 85 90 95 Thr Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Thr 100 105 110 Pro Glu Ala Ser Ser Pro Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Thr Glu 130 <210> 25 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR12.1 - Vbeta <400> 25 Met Gly Pro Gly Leu Leu His Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Thr 1 5 10 15 Gly His Gly Asp Ala Met Val Ile Gln Asn Pro Arg Tyr Gln Val Thr 20 25 30 Gln Phe Gly Lys Pro Val Thr Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His 35 40 45 Asn Val Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu 50 55 60 Leu Phe His Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro 65 70 75 80 Asp Asn Phe Gln Ser Arg Arg Pro Asn Thr Ser Phe Cys Phe Leu Asp 85 90 95 Ile Arg Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr 100 105 110 Ser Asn Leu Gln Gly Arg Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Ser Ile Leu Glu 130 <210> 26 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.1 - Vbeta <400> 26 Met Leu Ser Pro Asp Leu Pro Asp Ser Ala Trp Asn Thr Arg Leu Leu 1 5 10 15 Cys His Val Met Leu Cys Leu Leu Gly Ala Val Ser Val Ala Ala Gly 20 25 30 Val Ile Gln Ser Pro Arg His Leu Ile Lys Glu Lys Arg Glu Thr Ala 35 40 45 Thr Leu Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg His Asp Thr Val Tyr Trp Tyr 50 55 60 Gln Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Leu Ile Ser Phe Tyr Glu 65 70 75 80 Lys Met Gln Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Gln 85 90 95 Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser Leu Glu Leu 100 105 110 Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Arg Leu Gly Arg 115 120 125 Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu 130 135 140 <210> 27 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 - Vbeta <400> 27 Met Gly Thr Arg Leu Leu Cys Trp Val Val Leu Gly Phe Leu Gly Thr 1 5 10 15 Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala 20 25 30 Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His 35 40 45 Val Ser Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe 50 55 60 Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro 65 70 75 80 Ser Asp Arg Phe Phe Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu 85 90 95 Lys Ile Gln Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Ser Ser Leu Gly Gln Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Thr Glu 130 <210> 28 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR14.1 - Vbeta <400> 28 Met Gly Thr Arg Leu Leu Cys Trp Val Ala Phe Cys Leu Leu Val Glu 1 5 10 15 Glu Leu Ile Glu Ala Gly Val Val Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Ile 20 25 30 Glu Lys Lys Gln Pro Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ile Ser Gly His 35 40 45 Asn Thr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Asn Leu Gly Gln Gly Pro Glu Leu 50 55 60 Leu Ile Arg Tyr Glu Asn Glu Glu Ala Val Asp Asp Ser Gln Leu Pro 65 70 75 80 Lys Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Leu Lys Gly Val Asp Ser Thr Leu 85 90 95 Lys Ile Gln Pro Ala Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Ser Ser Leu Thr Arg Gly Ala Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Thr Val Val Glu 130 <210> 29 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 - Vbeta <400> 29 Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg 20 25 30 Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His 35 40 45 Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Arg Asp Arg Glu Gln Glu Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr 115 120 125 Arg Leu Thr Val Thr Glu 130 <210> 30 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 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Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp 35 40 45 Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser 50 55 60 Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu 85 90 95 Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val 100 105 110 Asn Leu Leu Gly Ala Thr Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly Lys Gly 115 120 125 Thr Met Leu Leu Val Ser Pro 130 135 <210> 40 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 Valpha <400> 40 Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr 1 5 10 15 Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly 20 25 30 Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly 35 40 45 Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser 50 55 60 Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe 65 70 75 80 Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys 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gtaatgactt taaatgggga tgaaaagaag 240 aaaggacgaa taagtgccac tcttaatacc aaggagggtt acagctattt gtacatcaaa 300 ggatcccagc ctgaagactc agccacatac ctctgtgcct ttcatcctaa ctttggaaat 360 gagaaattaa cctttgggac tggaacaaga ctcaccatca tacccaat 408 <210> 96 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 Wild-type Valpha <400> 96 atggagaaaa tgttggagtg tgcattcata gtcttgtggc ttcagcttgg ctggttgagt 60 ggagaagacc aggtgacgca gagtcccgag gccctgagac tccaggaggg agagagtagc 120 agtctcaact gcagttacac agtcagcggt ttaagagggc tgttctggta taggcaagat 180 cctgggaaag gccctgaatt cctcttcacc ctgtattcag ctggggaaga aaaggagaaa 240 gaaaggctaa aagccacatt aacaaagaag gaaagctttc tgcacatcac agcccctaaa 300 cctgaagact cagccactta tctctgtgct gtgcagccgc ggggggatgg gtctagcaac 360 acaggcaaac taatctttgg gcaagggaca actttacaag taaaaccaga t 411 <210> 97 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR10.1 - Valpha Codon Optimized <400> 97 atggagacac 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ttcttatctg ctgctgaagg agctgcagat gaaggattcc 300 gccagctacc tgtgtgccgt taggggcatc aatgattaca agctgagctt tggagccgga 360 acaacagtga ccgtgagagc caac 384 <210> 104 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 - Valpha Codon Optimized <400> 104 atggagaaga tgctggagtg tgcgttcatc gttctgtggc tgcaacttgg atggctgtct 60 ggagaggatc aggttacaca gtctcctgaa gccctgagac tgcaagaagg agaaagctct 120 agcctgaact gcagctacac agtgtctgga ctgagaggcc tgttctggta cagacaggat 180 cctggaaaag gcccagagtt cctgtttacc ctgtattctg ccggcgagga gaaggagaaa 240 gagagactga aagctaccct gaccaagaag gagagcttcc tgcacattac cgcccccaaa 300 cctgaggatt ctgccacata tctgtgtgcc gtgattaccg gctttcagaa gctggtgttt 360 ggcacaggca ccagactgct ggtttctccc aat 393 <210> 105 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 - Valpha Codon Optimized <400> 105 atgagactgg tggcacgcgt aactgtgttt ctgacctttg gcaccatcat cgatgccaag 60 acaacccagc ctacaagcat ggactgtgcc gagggaagag 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taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 300 cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgtgaacc tcctaggggc tacaggatac 360 agcaccctca cctttgggaa ggggactatg cttctagtct ctccagatat ccagaaccct 420 gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480 accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540 gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600 agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660 accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 720 acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 780 aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a 831 <210> 139 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 Wild-type alpha-Chain (TRAV1-2 01 / TRAJ20 01) <400> 139 atgtggggag ttttccttct ttatgtttcc atgaagatgg gaggcactac aggacaaaac 60 attgaccagc ccactgagat gacagctacg gaaggtgcca ttgtccagat caactgcacg 120 taccagacat ctgggttcaa 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cagctga 807 <210> 142 <211> 831 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR18.1 Wild-type alpha-Chain (TRAV24 01 / TRAJ48 01) <400> 142 atggagaaga atcctttggc agccccatta ctaatcctct ggtttcatct tgactgcgtg 60 agcagcatac tgaacgtgga acaaagtcct cagtcactgc atgttcagga gggagacagc 120 accaatttca cctgcagctt cccttccagc aatttttatg ccttacactg gtacagatgg 180 gaaactgcaa aaagccccga ggccttgttt gtaatgactt taaatgggga tgaaaagaag 240 aaaggacgaa taagtgccac tcttaatacc aaggagggtt acagctattt gtacatcaaa 300 ggatcccagc ctgaagactc agccacatac ctctgtgcct ttcatcctaa ctttggaaat 360 gagaaattaa cctttgggac tggaacaaga ctcaccatca tacccaatat ccagaaccct 420 gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480 accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540 gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600 agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660 accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa 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acgtgtccca gagcaaggac agcgacgtgt acatcaccga taagtgcgtg 540 ctggacatgc ggagcatgga cttcaagagc aacagcgccg tggcctggtc caacaagagc 600 gacttcgcct gcgccaacgc cttcaacaac agcattatcc ccgaggacac attcttccca 660 agccccgaga gcagctgcga cgtgaagctg gtggaaaaga gcttcgagac agacaccaac 720 ctgaacttcc agaacctcag cgtgatcggc ttccggatcc tgctgctgaa ggtggccggc 780 ttcaacctgc tgatgaccct gcggctgtgg tccagctga 819 <210> 145 <211> 840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR11.2 - Codon Optimized alpha-Chain <400> 145 atgaccagag ttagcctgtt atgggctgtg gtggtgagca catgtctgga atctggaatg 60 gcccagacag tgacacagtc tcagcctgaa atgtctgtgc aggaagccga aaccgttaca 120 ctgagctgca cctacgatac aagcgagaac aactactacc tgttctggta caagcagccc 180 ccctctaggc agatgatcct ggtgatcaga caggaggcct ataaacagca gaatgccaca 240 gagaaccggt tcagcgtgaa cttccagaaa gccgccaaga gcttcagcct gaagatctct 300 gattctcagc tgggcgatac agccatgtac ttttgcgcct tcatctaccc cagctacaca 360 agcggcacat acaagtacat cttcggcacc ggcacaagac 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tggtggaaaa gagcttcgag acagacacca acctgaactt ccagaacctc agcgtgatcg 1800 gcttccggat cctgctgctg aaggtggccg gcttcaacct gctgatgacc ctgcggctgt 1860 ggtccagctg a 1871 <210> 165 <211> 1877 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 Codon-optimized TCRbeta-P2A-TCRalpha <400> 165 ctcaataaaa gagcccacaa cccctcactc ggcgcgccac catgggctgt agactgttgt 60 gttgtgctgt gctgtgtctg ttgggagctg tgcctatgga aacaggcgtt acccagacac 120 ctagacatct ggttatgggc atgaccaaca agaagagcct gaagtgcgag cagcatctgg 180 gccataacgc catgtactgg tataagcaga gcgccaagaa accactggaa ctgatgttcg 240 tgtacagcct ggaggagagg gtggagaata atagcgtgcc cagcagattt agccctgagt 300 gcccaaattc ttctcacctg ttcctgcacc tgcacacatt acagcccgag gattctgccc 360 tgtacctgtg tgcttcttct caagaccctt acaagctgag cggcaatacc atctacttcg 420 gcgaaggctc ttggctgaca gtggttgaag atctgaacaa ggtgttcccc ccagaggtgg 480 ccgtgttcga gccttctgag gccgagatct cccacaccca gaaagccacc ctcgtgtgcc 540 tggccaccgg ctttttcccc gaccacgtgg aactgtcttg gtgggtcaac ggcaaagagg 600 tgcactccgg cgtgtgcacc gatccccagc ctctgaaaga acagcccgcc ctgaacgaca 660 gccggtactg cctgagcagc agactgagag tgtccgccac cttctggcag aacccccgga 720 accacttcag atgccaggtg cagttctacg gcctgagcga gaacgacgag tggacccagg 780 acagagccaa gcccgtgaca cagatcgtgt ctgccgaagc ctggggcaga gccgattgcg 840 gctttacctc cgtgtcctat cagcagggcg tgctgagcgc cacaatcctg tacgagatcc 900 tgctgggcaa ggccaccctg tacgccgtgc tggtgtctgc cctggtgctg atggccatgg 960 tcaagcggaa ggacttcggt tccggagcca cgaacttctc tctgttaaag caagcaggag 1020 acgtggaaga aaaccccggt cccatggaga agatgctgga gtgtgcgttc atcgttctgt 1080 ggctgcaact tggatggctg tctggagagg atcaggttac acagtctcct gaagccctga 1140 gactgcaaga aggagaaagc tctagcctga actgcagcta cacagtgtct ggactgagag 1200 gcctgttctg gtacagacag gatcctggaa aaggcccaga gttcctgttt accctgtatt 1260 ctgccggcga ggagaaggag aaagagagac tgaaagctac cctgaccaag aaggagagct 1320 tcctgcacat taccgccccc aaacctgagg attctgccac atatctgtgt gctgttcagc 1380 ctagaggaga tggctctagc aataccggca agctgatctt tggccaggga acaacactgc 1440 aggtgaagcc tgatatccag aaccccgatc ctgctgtgta ccagctgcgg gacagcaaga 1500 gcagcgacaa gagcgtgtgc ctgttcaccg acttcgacag ccagaccaac gtgtcccaga 1560 gcaaggacag cgacgtgtac atcaccgata agtgcgtgct ggacatgcgg agcatggact 1620 tcaagagcaa cagcgccgtg gcctggtcca acaagagcga cttcgcctgc gccaacgcct 1680 tcaacaacag cattatcccc gaggacacat tcttcccaag ccccgagagc agctgcgacg 1740 tgaagctggt ggaaaagagc ttcgagacag acaccaacct gaacttccag aacctcagcg 1800 tgatcggctt ccggatcctg ctgctgaagg tggccggctt caacctgctg atgaccctgc 1860 ggctgtggtc cagctga 1877 <210> 166 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Porcine teschovirus-1 2A (P2A) <400> 166 ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60 ggacct 66 <210> 167 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Porcine teschovirus-1 2A (P2A) peptide - Codon Optimized <400> 167 ggttccggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagacgtgga agaaaacccc 60 ggtccc 66 <210> 168 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Thoseaasigna virus 2A (T2A) <400> 168 ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60 cct 63 <210> 169 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Equine rhinitis A virus (ERAV) 2A (E2A) <400> 169 ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60 cctggacct 69 <210> 170 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Foot-and-Mouth disease virus 2A (F2A) <400> 170 ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60 tccaaccctg gacct 75 <210> 171 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly-Ser linker <400> 171 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 172 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly-Ser linker <400> 172 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 173 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly-Ser linker <220> <221> VARIANT <222> (5)...(40) <223> Any one or all of amino acids 5-40 can either be present or absent. <400> 173 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 174 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly-Ser linker <220> <221> VARIANT <222> (5)...(40) <223> Any one or all of amino acids 5-40 can either be present or absent. <220> <221> VARIANT <222> (44)...(70) <223> Any one or all of amino acids 44-70 can either be present or absent. <400> 174 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 65 70 <210> 175 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly-Ser linker <220> <221> VARIANT <222> (5)...(40) <223> Any one or all of amino acids 5-40 can either be present or absent. <220> <221> VARIANT <222> (46)...(90) <223> Any one or all of amino acids 46-90 can either be present or absent. <400> 175 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 85 90 <210> 176 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 - alpha CDR1 <400> 176 Thr Ser Gly Phe Asn Gly 1 5 <210> 177 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 - alpha CDR2 <400> 177 Asn Val Leu Asp Gly Leu 1 5 <210> 178 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 - alpha CDR3 <400> 178 Ala Val Arg Gly Ile Asn Asp Tyr Lys Leu Ser 1 5 10 <210> 179 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 - beta CDR1 <400> 179 Leu Asn His Asp Ala 1 5 <210> 180 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 - beta CDR2 <400> 180 Ser Gln Ile Val Asn Asp 1 5 <210> 181 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 - beta CDR3 <400> 181 Ala Ser Ser Arg Asp Arg Glu Gln Glu Ser Pro Leu His 1 5 10 <210> 182 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 - alpha CDR1 <400> 182 Thr Ile Ser Gly Asn Glu Tyr 1 5 <210> 183 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 - alpha CDR2 <400> 183 Gly Leu Lys Asn Asn 1 5 <210> 184 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 - alpha CDR3 <400> 184 Ile Ala Gly Val Gly Arg Gly Gln Asn Phe Val 1 5 10 <210> 185 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 - beta CDR1 <400> 185 Pro Arg His Asp Thr 1 5 <210> 186 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 - beta CDR2 <400> 186 Phe Tyr Glu Lys Met Gln 1 5 <210> 187 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 - beta CDR3 <400> 187 Ala Ser Ser Tyr Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Glu Gln Tyr 1 5 10 <210> 188 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR18.1 - alpha CDR1 <400> 188 Ser Ser Asn Phe Tyr Ala 1 5 <210> 189 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR18.1 - alpha CDR2 <400> 189 Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu 1 5 <210> 190 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR18.1 - alpha CDR3 <400> 190 Ala Phe His 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<223> Synthetic sequence WT137-45 TCR14.1 - beta CDR1 <400> 221 Ser Gly His Asn Thr 1 5 <210> 222 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR14.1 - beta CDR2 <400> 222 Tyr Glu Asn Glu Glu Ala 1 5 <210> 223 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR14.1 - beta CDR3 <400> 223 Ala Ser Ser Leu Thr Arg Gly Ala Glu Ala Phe 1 5 10 <210> 224 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 - alpha CDR1 <400> 224 Val Ser Gly Leu Arg Gly 1 5 <210> 225 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 - alpha CDR2 <400> 225 Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu 1 5 <210> 226 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 - alpha CDR3 <400> 226 Ala Val Ile Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val 1 5 10 <210> 227 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 - beta CDR1 <400> 227 Met Asn His Glu Tyr 1 5 <210> 228 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 - beta CDR2 <400> 228 Ser Met Asn Val Glu Val 1 5 <210> 229 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 - beta CDR3 <400> 229 Ala Ser Ser Phe Ser Gly Gly Thr Tyr Glu Gln Tyr 1 5 10 <210> 230 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 - alpha CDR1 <400> 230 Val Ser Gly Leu Arg Gly 1 5 <210> 231 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 - alpha CDR2 <400> 231 Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu 1 5 <210> 232 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 - alpha CDR3 <400> 232 Ala Val Gln Pro Arg Gly Asp Gly Ser Ser Asn Thr Gly Lys Leu Ile 1 5 10 15 <210> 233 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 - beta CDR1 <400> 233 Leu Gly His Asn Ala 1 5 <210> 234 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 - beta CDR2 <400> 234 Tyr Ser Leu Glu Glu Arg 1 5 <210> 235 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 - beta CDR3 <400> 235 Ala Ser Ser Gln Asp Pro Tyr Lys Leu Ser Gly Asn Thr Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 236 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 - alpha CDR1 <400> 236 Val Gly Ile Ser Ala 1 5 <210> 237 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 - alpha CDR2 <400> 237 Leu Ser Ser Gly Lys 1 5 <210> 238 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 - alpha CDR3 <400> 238 Ala Val Arg Thr Ser Tyr Asp Lys Val Ile 1 5 10 <210> 239 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 - beta CDR1 <400> 239 Ser Gly His Val Ser 1 5 <210> 240 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 - beta CDR2 <400> 240 Phe Gln Asn Glu Ala Gln 1 5 <210> 241 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 - beta CDR3 <400> 241 Ala Ser Ser Leu Gly Gln Ala Tyr Glu Gln Tyr 1 5 10 <210> 242 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR10.1 - Vbeta (mature) <400> 242 Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Asp Lys Ser Gly Leu Pro Asn Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Ile Ser Thr Leu Thr Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr Arg Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Thr Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val 100 105 110 Thr Glu <210> 243 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR11.2 - Vbeta (mature) <400> 243 Gly Ala Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly 1 5 10 15 Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr 20 25 30 Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala 35 40 45 Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys 50 55 60 Asp Lys Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr 65 70 75 80 Val Thr Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Glu Ala Ser Ser Pro Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Arg Leu Thr Val Thr Glu 115 <210> 244 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR12.1 - Vbeta (mature) <400> 244 Asp Ala Met Val Ile Gln Asn Pro Arg Tyr Gln Val Thr Gln Phe Gly 1 5 10 15 Lys Pro Val Thr Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His Asn Val Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe His 35 40 45 Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Ser Arg Arg Pro Asn Thr Ser Phe Cys Phe Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Pro Gly Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr Ser Asn Leu 85 90 95 Gln Gly Arg Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile 100 105 110 Leu Glu <210> 245 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.1 - Vbeta (mature <400> 245 Ala Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Leu Ile Lys Glu Lys Arg 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg His Asp Thr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Leu Ile Ser 35 40 45 Phe Tyr Glu Lys Met Gln Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Ala Gln Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser 65 70 75 80 Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Arg 85 90 95 Leu Gly Arg Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val 100 105 110 Leu Glu <210> 246 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 - Vbeta (mature) <400> 246 Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Phe Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Gln Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val 100 105 110 Thr Glu <210> 247 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR14.1 - Vbeta (mature) <400> 247 Glu Ala Gly Val Val Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Lys 1 5 10 15 Gln Pro Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ile Ser Gly His Asn Thr Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Leu Gln Asn Leu Gly Gln Gly Pro Glu Leu Leu Ile Arg 35 40 45 Tyr Glu Asn Glu Glu Ala Val Asp Asp Ser Gln Leu Pro Lys Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Leu Lys Gly Val Asp Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ala Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Thr Arg Gly Ala Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Thr Val 100 105 110 Val Glu <210> 248 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 - Vbeta (mature) <400> 248 Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr 35 40 45 Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr 50 55 60 Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser 65 70 75 80 Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Arg Asp 85 90 95 Arg Glu Gln Glu Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Thr Glu 115 <210> 249 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 - Vbeta (mature) <400> 249 Glu Ala Gln Val Thr Gln Asn Pro Arg Tyr Leu Ile Thr Val Thr Gly 1 5 10 15 Lys Lys Leu Thr Val Thr Cys Ser Gln Asn Met Asn His Glu Tyr Met 20 25 30 Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Gln Ile Tyr Tyr 35 40 45 Ser Met Asn Val Glu Val Thr Asp Lys Gly Asp Val Pro Glu Gly Tyr 50 55 60 Lys Val Ser Arg Lys Glu Lys Arg Asn Phe Pro Leu Ile Leu Glu Ser 65 70 75 80 Pro Ser Pro Asn Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Phe Ser 85 90 95 Gly Gly Thr Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val 100 105 110 Thr Glu <210> 250 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 - Vbeta (mature) <400> 250 Ala Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Leu Ile Lys Glu Lys Arg 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg His Asp Thr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Leu Ile Ser 35 40 45 Phe Tyr Glu Lys Met Gln Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Ala Gln Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser 65 70 75 80 Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Arg 85 90 95 Gly Gly Ser Thr Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Thr Glu 115 <210> 251 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR18.1 - Vbeta (mature) <400> 251 Glu Ala Glu Val Ala Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Thr Glu Lys Ser 1 5 10 15 Gln Ala Val Ala Phe Trp Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Ala Thr Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Ile Leu Gly Gln Gly Pro Glu Leu Leu Val Gln 35 40 45 Phe Gln Asp Glu Ser Val Val Asp Asp Ser Gln Leu Pro Lys Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Leu Lys Gly Val Asp Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ala Glu Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Gln 85 90 95 Arg Asp Ser Pro Asn Glu Lys Leu Phe Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Ser Val Leu Glu 115 <210> 252 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 - Vbeta (mature) <400> 252 Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg His Leu Val Met Gly Met Thr 1 5 10 15 Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Leu Gly His Asn Ala Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Leu Met Phe Val 35 40 45 Tyr Ser Leu Glu Glu Arg Val Glu Asn Asn Ser Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser His Leu Phe Leu His Leu His Thr 65 70 75 80 Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Gln Asp 85 90 95 Pro Tyr Lys Leu Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu Gly Ser Trp 100 105 110 Leu Thr Val Val Glu 115 <210> 253 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR10.1 Valpha (mature) <400> 253 Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 35 40 45 Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 50 55 60 Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser 65 70 75 80 Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Lys Glu Thr Ser 85 90 95 Gly Ser Arg Leu Thr Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu Thr Val Asn Pro 100 105 110 <210> 254 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR11.2 Valpha (mature) <400> 254 Ala Gln Thr Val Thr Gln Ser Gln Pro Glu Met Ser Val Gln Glu Ala 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Thr Tyr Asp Thr Ser Glu Asn Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Arg Gln Met Ile Leu Val 35 40 45 Ile Arg Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn Ala Thr Glu Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Val Asn Phe Gln Lys Ala Ala Lys Ser Phe Ser Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Asp Ser Gln Leu Gly Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Phe Ile Tyr 85 90 95 Pro Ser Tyr Thr Ser Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe Gly Thr Gly Thr 100 105 110 Arg Leu Lys Val Leu Ala Asn 115 <210> 255 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR12.1 Valpha (mature) <400> 255 Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly 1 5 10 15 Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr 20 25 30 Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile 35 40 45 Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val 50 55 60 Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser 65 70 75 80 Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Gly Thr Gly 85 90 95 Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His 100 105 110 Pro Tyr <210> 256 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.1 Valpha (mature) <400> 256 Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly 1 5 10 15 Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr 20 25 30 Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile 35 40 45 Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val 50 55 60 Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser 65 70 75 80 Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Gly Ile Gly 85 90 95 Asp Tyr Lys Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Arg Ala 100 105 110 Asn <210> 257 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR13.2 Valpha (mature) <400> 257 Lys Asn Glu Val Glu Gln Ser Pro Gln Asn Leu Thr Ala Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Phe Ile Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Ser Val Gly Ile Ser Ala Leu 20 25 30 His Trp Leu Gln Gln His Pro Gly Gly Gly Ile Val Ser Leu Phe Met 35 40 45 Leu Ser Ser Gly Lys Lys Lys His Gly Arg Leu Ile Ala Thr Ile Asn 50 55 60 Ile Gln Glu Lys His Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ser His Pro Arg 65 70 75 80 Asp Ser Ala Val Tyr Ile Cys Ala Val Arg Thr Ser Tyr Asp Lys Val 85 90 95 Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Leu Ser Val Ile Pro Asn 100 105 <210> 258 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR14.1 Valpha (mature) <400> 258 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Leu Leu Gly Ala 85 90 95 Thr Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Met Leu Leu Val 100 105 110 Ser Pro <210> 259 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR15.1 Valpha (mature) <400> 259 Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala 1 5 10 15 Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr 35 40 45 Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu 50 55 60 Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met 65 70 75 80 Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Gly Ile Asn Asp Tyr 85 90 95 Lys Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Arg Ala Asn 100 105 110 <210> 260 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.1 Valpha (mature) <400> 260 Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu Arg Leu Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val Ser Gly Leu Arg Gly 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Pro Glu Phe Leu Phe 35 40 45 Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys Glu Arg Leu Lys Ala 50 55 60 Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile Thr Ala Pro Lys Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Ile Thr Gly Phe Gln Lys 85 90 95 Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asn 100 105 110 <210> 261 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR16.2 Valpha (mature) <400> 261 Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Thr Ser Met Asp Cys Ala Glu Gly Arg 1 5 10 15 Ala Ala Asn Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Asn Glu Tyr 20 25 30 Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Ile His Ser Gln Gly Pro Gln Tyr Ile Ile 35 40 45 His Gly Leu Lys Asn Asn Glu Thr Asn Glu Met Ala Ser Leu Ile Ile 50 55 60 Thr Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Ile Leu Pro His Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Ala Gly Val Gly Arg Gly Gln 85 90 95 Asn Phe Val Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Ser Val Leu Pro Tyr 100 105 110 <210> 262 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR18.1 Valpha (mature) <400> 262 Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu Gly 1 5 10 15 Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr Ala 20 25 30 Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu Phe 35 40 45 Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser Ala 50 55 60 Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Gly Ser 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe His Pro Asn Phe 85 90 95 Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Ile Ile 100 105 110 Pro Asn <210> 263 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence WT137-45 TCR19.1 Valpha (mature) <400> 263 Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu Arg Leu Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val Ser Gly Leu Arg Gly 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Pro Glu Phe Leu Phe 35 40 45 Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys Glu Arg Leu Lys Ala 50 55 60 Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile Thr Ala Pro Lys Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Gln Pro Arg Gly Asp Gly 85 90 95 Ser Ser Asn Thr Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln Gly Thr Thr Leu Gln 100 105 110 Val Lys Pro 115

Claims

(a) TCR α 쇄 가변(V_α) 도메인, 및 서열 번호 199, 1 내지 11, 181, 187, 193, 205, 211, 217, 223, 229, 235, 및 241 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 갖는 TCR β 쇄 가변(V_β) 도메인;
(b) 서열 번호 196, 12 내지 22, 178,184, 190, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 및 238 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 TCR V_β 도메인; 또는
(c) 서열 번호 199, 1 내지 11, 181, 187, 193, 205, 211, 217, 223, 229, 235, 및 241 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 갖는 TCR V_α 도메인, 및 서열 번호 196, 12 내지 22, 178, 184, 190, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 및 238 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V_β 도메인을 포함하고;
8.5 이상의 IFNγ생성 pEC₅₀으로 VLDFAPPGA(서열 번호 59):인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 특이적으로 결합하는,
T 세포 수용체(TCR).
제1항에 있어서, 9.0 이상의 IFNγ생성 pEC₅₀으로 VLDFAPPGA(서열 번호 59):인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR.
제1항 또는 제2항에 있어서, 9.5 이상의 IFNγ생성 pEC₅₀으로 VLDFAPPGA(서열 번호 59):인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CD8과 독립적으로 또는 이의 부재하에 세포 표면 상의 VLDFAPPGA(서열 번호 59):인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 특이적으로 추가 결합하는 TCR.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, HLA는 HLA-A^*201을 포함하는, TCR.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, V_α 도메인은 적어도 다음을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR:
(a) 서열 번호 34 내지 35 및 38 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 약 90% 서열 동일성; 또는
(b) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열에 대한 92% 서열 동일성.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, V_α 도메인은 서열 번호 34 내지 44 중 어느 하나에 각각 존재하는 CDR1 및/또는 CDR2와 비교하여 CDR1 및/또는 CDR2의 아미노산 서열에 변화를 포함하지 않는, TCR.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 서열 번호 194, 176, 182, 188, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 및 236 중 어느 하나에 기재된 CDR1α 아미노산 서열, 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체(여기서 임의로, 1 또는 2개의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함함); 및/또는
(ii) 서열 번호 195, 177, 183, 189, 201, 207, 213, 219, 225, 231, 및 237 중 어느 하나에 기재된 CDR2α 아미노산 서열, 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체(여기서 임의로, 1 또는 2개의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함함)를 추가로 포함하는
TCR.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, V_β 도메인은 적어도 다음을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR:
(a) 서열 번호 23 내지 25, 27, 28, 30, 32, 및 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 90% 서열 동일성;
(b) 서열 번호 29의 아미노산 서열에 대해 92% 서열 동일성;
(c) 서열 번호 31의 아미노산 서열에 대해 93% 서열 동일성; 또는
(d) 서열 번호 26의 아미노산 서열에 대해 95% 서열 동일성.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, V_β 도메인은 서열 번호 23 내지 33 중 어느 하나에 각각 존재하는 CDR1 및/또는 CDR2와 비교하여 CDR1 및/또는 CDR2의 아미노산 서열에 변화를 포함하지 않는, TCR.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 서열 번호 197, 179, 185, 191, 197, 203, 209, 215, 221, 227, 233, 및 239 중 어느 하나에 기재된 CDR1β 아미노산 서열, 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체(여기서 임의로, 1 또는 2개의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함함); 및/또는
(ii) 서열 번호 198, 180, 186, 192, 204, 210, 216, 222, 228, 234, 및 240 중 어느 하나에 기재된 CDR2β 아미노산 서열, 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체(여기서 임의로, 1 또는 2개의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함함)를 추가로 포함하는
TCR.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 다음에 기재된 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β, 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함하는 TCR:
(i) 각각 서열 번호 194, 195, 196 또는 12, 197, 198, 및 199 또는 1;
(ii) 각각 서열 번호 176, 177, 178 또는 18, 179, 180, 및 181 또는 7;
(iii) 각각 서열 번호 182, 183, 184 또는 20, 185, 186, 및 187 또는 9;
(iv) 각각 서열 번호 188, 189, 190 또는 21, 191, 192, 및 193 또는 10;
(v) 각각 서열 번호 200, 201, 202 또는 13, 203, 204, 및 205 또는 2;
(vi) 각각 서열 번호 206, 207, 208 또는 14, 209, 210, 및 211 또는 3;
(vii) 각각 서열 번호 212, 213, 214 또는 15, 215, 216, 및 217 또는 4;
(viii) 각각 서열 번호 218, 219, 220 또는 17, 221, 222, 및 223 또는 6;
(ix) 각각 서열 번호 224, 225, 226 또는 19, 227, 228, 및 229 또는 8;
(x) 각각 서열 번호 230, 231, 232 또는 22, 233, 234, 및 235 또는 11; 또는
(xi) 각각 서열 번호 236, 237, 238 또는 16, 238, 240, 및 241 또는 5.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, V_α 도메인은 서열 번호 253 내지 263 및 34 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, TCR.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, V_α 도메인은 서열 번호 253 내지 263 및 34 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진, TCR.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, V_β 도메인은 서열 번호 242 내지 252 및 23 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, TCR.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, V_β 도메인은 서열 번호 242 내지 252 및 23 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진, TCR.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 TCR α 쇄 불변 도메인을 포함하는 TCR.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 45 또는 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 TCR β 쇄 불변 도메인을 포함하는, TCR.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, V_α 도메인 및 α 쇄 불변 도메인을 포함하는 TCR α 쇄를 포함하고, 여기서,
(a) V_α 도메인은 서열 번호 34 내지 35 및 38 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖고, α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 98%의 동일성을 갖거나;
(b) V_α 도메인은 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열에 대해 92% 서열 동일성을 갖고, α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는,
TCR.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, V_α 도메인 및 α 쇄 불변 도메인을 포함하는 TCR α 쇄를 포함하고, 여기서,
(a) V_α 도메인은 서열 번호 242 내지 252 및 34 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(b) V_α 도메인은 서열 번호 242 내지 252 및 34 내지 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47의 아미노산 서열로 이루어진,
TCR.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, V_β 도메인 및 β 쇄 불변 도메인을 포함하는 TCR β 쇄를 포함하고, 여기서,
(a) V_β 도메인은 서열 번호 23 내지 25, 27, 28, 30, 32, 및 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖거나;
(b) V_β 도메인은 서열 번호 29의 아미노산 서열에 대해 92% 서열 동일성을 갖고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열 번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖거나;
(c) V_β 도메인은 서열 번호 31의 아미노산 서열에 대해 93% 서열 동일성을 갖고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열 번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖거나;
(c) V_β 도메인은 서열 번호 26의 아미노산 서열에 대해 95% 서열 동일성을 갖고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열 번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는,
TCR.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, V_β 도메인 및 β 쇄 불변 도메인을 포함하는 TCR β 쇄를 포함하고, 여기서,
(a) V_β 도메인은 서열 번호 253 내지 263 및 23 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45 또는 46의 아미노산 서열을 포함하거나;
(b) V_β 도메인은 서열 번호 253 내지 263 및 23 내지 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45 또는 46의 아미노산 서열로 이루어지거나;
(c) V_β 도메인은 서열 번호 25, 28, 29, 32 및 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나;
(d) V_β 도메인은 서열 번호 25, 28, 29, 32 및 33 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45의 아미노산 서열로 이루어지거나;
(e) V_β 도메인은 서열 번호 23, 24, 26, 27, 30 및 31 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하거나;
(f) V_β 도메인은 서열 번호 23, 24, 26, 27, 30 및 31 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 46의 아미노산 서열로 이루어진,
TCR.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, Vα 도메인 및 Vβ 도메인은 다음 서열 번호에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 TCR:
(i) 각각 253 및 242;
(ii) 각각 259 및 248;
(iii) 각각 261 및 250;
(iv) 각각 262 및 251;
(v) 각각 257 및 246;
(vi) 각각 254 및 243;
(vii) 각각 255 및 244;
(viii) 각각 256 및 245;
(ix) 각각 258 및 247;
(x) 각각 260 및 249;
(xi) 각각 263 및 252;
(xii) 각각 34 및 23;
(xiii) 각각 40 및 29;
(xiv) 각각 42 및 31;
(xv) 각각 43 및 32;
(xvi) 각각 35 및 24;
(xvii) 각각 36 및 25;
(xviii) 각각 37 및 26;
(xix) 각각 39 및 28;
(xx) 각각 41 및 30;
(xxi) 각각 44 및 33; 또는
(xxii) 각각 38 및 27.
제23항에 있어서, α 쇄 불변 도메인 및/또는 β 쇄 불변 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 α 쇄 불변 도메인은 서열 번호 47에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, β 쇄 불변 도메인은 서열 번호 45 또는 46에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR.
제24항에 있어서, α 쇄 불변 도메인이 존재하고 Vα 도메인 및 α 쇄 불변 도메인은 함께 TCR α 쇄를 형성하는 TCR.
제24항 또는 제25항에 있어서, β 쇄 불변 도메인이 존재하고 Vα 도메인과 β 쇄 불변 도메인은 함께 TCR β 쇄를 형성하는 TCR.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, scTCR을 포함하는 TCR.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, CAR을 포함하는 TCR.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 TCR을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제29항에 있어서, TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 숙주 세포에 대해 코돈 최적화된, 폴리뉴클레오티드.
제29항 또는 제30항에 있어서, 서열 번호 48 내지 58 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 64 내지 165 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 임의로, 코딩된 폴리펩티드는 CD8 공-수용체 α 쇄이거나 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드;
(ii) CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 임의로, 코딩된 폴리펩티드는 CD8 공-수용체 β 쇄이거나 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(iii) (i)의 폴리뉴클레오티드 및 (ii)의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는,
폴리뉴클레오티드.
제33항에 있어서,
(a) CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(b) CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
(c) (a)의 폴리뉴클레오티드와 (b)의 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는,
폴리뉴클레오티드.
제33항 또는 제34항에 있어서, 자가-절단 펩티드를 코딩하고 하기 사이에 배치된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드:
(1) 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및/또는
(2) 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임내에서 작동가능하게 연결된 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
(i) (pnCD8α)-(pnSCP₁)-(pnCD8β)-(pnSCP₂)-(pnTCR);
(ii) (pnCD8β)-(pnSCP₁)-(pnCD8α)-(pnSCP₂)-(pnTCR);
(iii) (pnTCR)-(pnSCP₁)-(pnCD8α)-(pnSCP₂)-(pnCD8β);
(iv) (pnTCR)-(pnSCP₁)-(pnCD8β)-(pnSCP₂)-(pnCD8α);
(v) (pnCD8α)-(pnSCP₁)-(pnTCR)-(pnSCP₂)-(pnCD8β); 또는
(vi) (pnCD8β)-(pnSCP₁)-(pnTCR)-(pnSCP₂)-(pnCD8α),
여기서, pnCD8α는 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고,
pnCD8β는 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며,
pnTCR은 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고,
pnSCP₁ 및 pnSCP₂는 각각 독립적으로 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 폴리뉴클레오티드 및/또는 코딩된 자가-절단 펩티드는 임의로 동일하거나 상이하다.
제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 TCR은 TCRα 쇄 및 TCRβ 쇄를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 TCRα 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 TCRβ 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
제37항에 있어서, 프레임 내에서 작동가능하게 연결된 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
(i) (pnCD8α)-(pnSCP₁)-(pnCD8β)-(pnSCP₂)-(pnTCRβ)-(pnSCP₃)-(pnTCRα);
(ii) (pnCD8β)-(pnSCP₁)-(pnCD8α)-(pnSCP₂)-(pnTCRβ)-(pnSCP₃)-(pnTCRα);
(iii) (pnCD8α)-(pnSCP₁)-(pnCD8β)-(pnSCP₂)-(pnTCRα)-(pnSCP₃)-(pnTCRβ);
(iv) (pnCD8β)-(pnSCP₁)-(pnCD8α)-(pnSCP₂)-(pnTCRα)-(pnSCP₃)-(pnTCRβ);
(v) (pnTCRβ)-(pnSCP₁)-(pnTCRα)-(pnSCP₂)-(pnCD8α)-(pnSCP₃)-(pnCD8β);
(vi) (pnTCRβ)-(pnSCP₁)-(pnTCRα)-(pnSCP₂)-(pnCD8β)-(pnSCP₃)-(pnCD8α);
(vii) (pnTCRα)-(pnSCP₁)-(pnTCRβ)-(pnSCP₂)-(pnCD8α)-(pnSCP₃)-(pnCD8β); 또는
(viii)(pnTCRα)-(pnSCP₁)-(pnTCRβ)-(pnSCP₂)-(pnCD8β)-(pnSCP₃)-(pnCD8α),
여기서, pnCD8α는 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고,
pnCD8β는 CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며,
pnTCRα는 TCR α 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고,
pnTCRβ는 TCR β 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며,
pnSCP₁, pnSCP₂, 및 pnSCP₃은 각각 독립적으로 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 폴리뉴클레오티드 및/또는 코딩된 자가 절단 펩티드는 임의로 동일하거나 상이하다.
발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제39항에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 전달할 수 있는 발현 벡터.
제39항에 있어서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포인, 발현 벡터.
제41항에 있어서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 발현 벡터.
제42항에 있어서, T 세포는 나이브
T 세포, 중심 기억(central memory) T 세포, 이펙터 기억(effector memory) T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 발현 벡터.
제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터인 발현 벡터.
제44항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 γ-레트로바이러스 벡터인, 발현 벡터.
제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 여기서 숙주 세포는 이의 세포 표면 상에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 TCR을 발현하고, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대해 이종성인, 숙주 세포.
제46항에 있어서, V_α 도메인은 서열 번호 97, 98, 및 101 내지 107의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 대해 적어도 75% 서열 동일성, 또는 서열 번호 99 또는 100에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, 숙주 세포.
제46항 또는 제47항에 있어서, V_α 도메인은
(a) 서열 번호 97 내지 107의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열을 포함하거나;
(b) 서열 번호 97 내지 107의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는,
숙주 세포.
제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, V_β 도메인은 서열 번호 75 내지 77, 79, 82, 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 대해 적어도 75%의 서열 동일성, 또는 서열 번호 78, 80, 81 및 83의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, 숙주 세포.
제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, V_β 도메인은
(a) 서열 번호 75 내지 85의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열을 포함하거나;
(b) 서열 번호 75 내지 85의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는,
숙주 세포.
제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, TCR α 쇄는 서열 번호 110에 대해 적어도 98% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α 쇄 불변 도메인을 포함하는, 숙주 세포.
제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, TCR α 쇄는
(a) 서열 번호 110의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나;
(b) 서열 번호 110의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 α 쇄 불변 도메인을 포함하는,
숙주 세포.
제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, TCR β 쇄는 서열 번호 108 또는 109에 대해 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 β 쇄 불변 도메인을 포함하는, 숙주 세포.
제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, TCR β 쇄는
(a) 서열 번호 108 또는 109의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나;
(b) 서열 번호 108 또는 109의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 β 쇄 불변 도메인을 포함하는,
숙주 세포.
제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 TCR α 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 TCR β 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 숙주 세포.
제55항에 있어서, 코딩된 자가 절단 펩티드는
(a) 서열 번호 60 내지 63의 폴리펩티드 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나;
(b) 서열 번호 60 내지 63의 폴리펩티드 중 어느 하나의 서열로 이루어진,
숙주 세포.
제55항 또는 제56항에 있어서, 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는
(a) 서열 번호 166 내지 170의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열을 포함하거나;
(b) 서열 번호 166 내지 170의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열로 이루어진,
숙주 세포.
제46항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, TCR α 쇄, 자가-절단 펩티드, 및 TCR β 쇄는 서열 155 내지 165 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, 숙주 세포.
제46항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, TCR α 쇄, 자가-절단 펩티드, 및 TCR β 쇄는
(a) 서열 번호 155 내지 165의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열을 포함하거나;
(b) 서열 번호 155 내지 165의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는,
숙주 세포.
제58항 또는 제59항에 있어서, 코딩된 TCR α 쇄, 자가 절단 펩티드, 및 TCR β 쇄는 서열 번호 48 내지 58의 폴리펩티드 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포.
제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 TCR α 쇄, 자가 절단 펩티드 및 TCR β 쇄는
(a) 서열 번호 48 내지 58의 폴리펩티드 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나;
(b) 서열 번호 48 내지 58의 폴리펩티드 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진,
숙주 세포.
제46항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포인 숙주 세포.
제62항에 있어서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합이고, 여기서 임의로, 조합은 존재하는 경우 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 숙주 세포.
제62항에 있어서, 면역계 세포는 T 세포인 숙주 세포.
제64항에 있어서, T 세포는 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 숙주 세포.
제46항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, TCR은 내인성 TCR에 비해 T 세포 상에서 표면 발현이 더 높은, 숙주 세포.
제46항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드(여기서, 임의로, 코딩된 폴리펩티드는 CD8 공-수용체 α 쇄이거나 이를 포함함);
(ii) CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드(여기서, 임의로 코딩된 폴리펩티드는 CD8 공-수용체 β 쇄이거나 이를 포함함); 또는
(iii) (i)의 폴리뉴클레오티드 및 (ii)의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고,
임의로 CD4+ T 세포를 포함하는,
숙주 세포.
제67항에 있어서,
(a) CD8 공-수용체 α 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드;
(b) CD8 공-수용체 β 쇄의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드; 및
(c) (a)의 폴리뉴클레오티드와 (b)의 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된 자가-절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는,
숙주 세포.
제46항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포와 종양 세포 모두 샘플에 존재하는 경우,
(i) 유방암 세포주 MDA-MB-468의 종양 세포;
(ii) 췌장 선암종 세포주 PANC-1의 종양 세포;
(iii) 유방암 세포주 MDA-MB-231의 종양 세포;
(iv) HLA-A2를 발현하는 골수성 백혈병 세포주 K562의 종양 세포(여기서, 임의로, HLA-A2는 HLA-A^*201을 포함함);
(v) HLA-A2를 발현하는 결장암종 세포주 RKO의 종양 세포(여기서, 임의로, HLA-A2는 HLA-A^*201을 포함함); 또는
(vi) (i) 내지 (v)의 종양 세포의 임의의 조합을 사멸시킬 수 있는,
숙주 세포.
제69항에 있어서, 숙주 세포 및 종양 세포가 32:1, 16:1, 8:1, 4:1, 2:1 또는 1.5:1 숙주 세포:종양 세포의 비로 샘플에 존재하는 경우 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 숙주 세포.
제46항 내지 제70항 중 어느 한 항의 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
제71항에 있어서, 숙주 CD4+ T 세포 및 숙주 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 인간 빌름스 종양 단백질 1(WT1)에 특이적인 TCR을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 과증식성 또는 증식성 장애의 치료 방법.
제73항에 있어서, TCR이 숙주 세포의 표면 상에서 발현되고, 임의로, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포이며, 추가로 임의로, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
제74항에 있어서, 숙주 세포는 제46항 내지 제70항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는, 방법.
제73항에 있어서, 과증식성 또는 증식성 장애는 혈액 악성 종양 또는 고형암인, 방법.
제76항에 있어서, 혈액 악성 종양은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 호산구성 백혈병(CEL), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 다발성 골수종(MM)으로부터 선택되는, 방법.
제77항에 있어서, 고형암은 유방암, 난소암, 폐암, 담도암, 방광암, 골 및 연조직 암종, 뇌종양, 자궁경부암, 결장암, 결장직장 선암종, 결장직장암, 데스모이드 종양, 배아암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 위선암종, 다형성 교모세포종, 부인과 종양, 두경부 편평세포 암종, 간암, 중피종, 악성 흑색종, 골육종, 췌장암, 췌장관 선암종, 원발성 성상세포 종양, 원발성 갑상선암, 전립선암, 신장암, 신세포 암종, 횡문근육종, 피부암, 연조직 육종, 고환 생식 세포 종양, 요로상피암, 자궁 육종 또는 자궁암으로부터 선택되는, 방법.
제73항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, TCR은 클래스 I HLA-제한 방식으로 인간 WT1에 대한 항원-특이적 T 세포 반응을 촉진할 수 있는, 방법.
제79항에 있어서, 클래스 I HLA-제한 반응은 항원 처리 관련 수송체(TAP)에 비의존성인, 방법.
제79항 또는 제80항에 있어서, 항원-특이적 T 세포 반응은 CD4+ 헬퍼 T 림프구(Th) 반응 및 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL) 반응 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
제81항에 있어서, CTL 반응은 WT1-과발현 세포에 대한 것인, 방법.
제46항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 또는 제71항 또는 제72항의 조성물의 유효량을 과증식성 또는 증식성 장애가 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 세포에서 WT1 과발현을 특징으로 하는 상태를 치료하기 위한 입양 면역요법 방법.
제83항에 있어서, 숙주 세포는 생체외에서 변형된, 방법.
제83항 또는 제84항에 있어서, 숙주 세포는 대상에 대한 동종이계(allogeneic) 세포, 동계(syngeneic) 세포, 또는 자가(autologous) 세포인, 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포인, 방법.
제86항에 있어서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
제87항에 있어서, T 세포는 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
제83항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 과증식성 또는 증식성 장애는 혈액 악성 종양 또는 고형암인, 방법.
제89항에 있어서, 혈액 악성 종양은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 호산구성 백혈병(CEL), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 다발성 골수종(MM)으로부터 선택되는, 방법.
제89항에 있어서, 고형암은 유방암, 난소암, 폐암, 담도암, 방광암, 골 및 연조직 암종, 뇌종양, 자궁경부암, 결장암, 결장직장 선암종, 결장직장암, 데스모이드 종양, 배아암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 위선암종, 다형성 교모세포종, 부인과 종양, 두경부 편평세포 암종, 간암, 중피종, 악성 흑색종, 골육종, 췌장암, 췌장관 선암종, 원발성 성상세포 종양, 원발성 갑상선암, 전립선암, 신장암, 신세포 암종, 횡문근육종, 피부암, 연조직 육종, 고환 생식 세포 종양, 요로상피암, 자궁 육종 또는 자궁암으로부터 선택되는, 방법.
제83항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 비경구적으로 투여되는, 방법.
제83항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 복수 용량의 숙주 세포를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제93항에 있어서, 복수 용량이 약 2 내지 약 4주의 투여 간격으로 투여되는, 방법.
제83항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 약 10⁷ 세포/㎡ 내지 약 10¹¹세포/㎡의 용량으로 대상에게 투여되는, 방법.
제83항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제96항에 있어서, 사이토카인은 IL-2, IL15, IL21 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
제97항에 있어서, 사이토카인은 IL-2이고 숙주 세포와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
제98항에 있어서, 사이토카인을 순차적으로 투여하되, 사이토카인을 투여하기 전에 숙주 세포가 적어도 3회 또는 4회 대상에 투여되는, 방법.
제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 IL-2이고 피하 투여되는, 방법.
제83항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 면역억제 요법을 추가로 받고 있는, 방법.
제101항에 있어서, 면역억제 요법은 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, 미세소관 억제제, 저용량의 미코페놀산 전구약물, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 방법.
제83항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 비-골수파괴성(non-myeloablative) 또는 골수파괴성 조혈 세포 이식(myeloablative hematopoietic cell transplant)을 받은, 방법.
제103항에 있어서, 대상은 비-골수파괴성 조혈 세포 이식 후 적어도 3개월 후에 숙주 세포가 투여되는, 방법.
제103항에 있어서, 대상은 골수파괴 조혈 세포 이식 후 적어도 2개월 후에 숙주 세포가 투여되는, 방법.
제73항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor) 및/또는 자극성 면역 관문제의 작용제를 투여받았거나 투여받고 있는, 방법.
제46항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 또는 제72항의 조성물을 포함하는 단위 용량 형태.
제107항에 있어서, 숙주 세포는 약 10⁷ 세포/㎡ 내지 약 10¹¹ 세포/㎡의 용량인, 단위 용량 형태.
빌름스 종양 단백질 1(WT1) 발현 또는 과발현과 관련된 증식성 또는 과증식성 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 TCR, 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항의 벡터, 제46항 내지 제70항 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 제71항 또는 제72항의 조성물, 또는 이들의 임의의 조합.
빌름스 종양 단백질 1(WT1) 발현 또는 과발현과 관련된 증식성 또는 과증식성 장애 치료용 의약의 제조 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 TCR, 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항의 벡터, 제46항 내지 제70항 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 제71항 또는 제72항의 조성물, 또는 이들의 임의의 조합.