KR20210132644A - 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 예방 또는 치료를 위한 항-CCR7 mAb의 용도 - Google Patents

이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 예방 또는 치료를 위한 항-CCR7 mAb의 용도 Download PDF

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마테오스 카를로스 쿠에스타
칼레하 세실리아 무뇨즈
세인즈 잇사소 포르테로
가르시아 데 소리아 마리아 델 발레 고메즈
마리아 루이사 토리비오
페르난데즈 페르난도 테론
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캐터펄트 테라퓨틱스 비.브이.
유니버시다드 오토노마 데 마드리드
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Abstract

본 발명은, 바람직하게는 조혈 줄기 세포에서 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 예방 및/또는 치료, 바람직하게는 조혈 줄기 세포 이식(HSCT), 보다 바람직하게는 동종이계 조혈 줄기 세포 이식에서 신규 치료제로서 사용하기 위한 CCR7 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 신규 용도 및 방법을 제공한다. 본 발명의 GVHD는 급성(aGVHD) 및/또는 만성(cGVHD), 바람직하게는 급성일 수 있다. 항체 및 항원-결합 단편은, CCR7을 발현하는 생체외 또는 시험관내 면역 세포를 선택적으로 고갈시킬 수 있고, CCR7 수용체를 발현하는 면역 세포를 생체내에서 선택적으로 사멸시킬 수 있고, GVHD의 발달 및 진전에 관여하는 상기 면역 세포의 이동 및 활성화를 손상/차단할 수 있다. CCR7 세포를 발현하는 면역 세포의 이동 및 활성화를 고갈시키고, 사멸시키고, 손상/차단하기 위한 상기 항체의 용도가 개시되고, 따라서 급성 및 만성 양 유형의 GVHD를 예방 및 치료하기 위한 대체 요법을 제공한다.

Description

이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 예방 또는 치료를 위한 항-CCR7 mAb의 용도
본 발명은 일반적으로 의학 및 약학의 분야, 특히 기관, 조직 또는 세포 이식(transplantation) 및 이식(grafting)에 사용하기 위한 바이오의약품의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이식편 대 숙주 질환(graft versus host disease)의 예방 및 치료에 유용한 항-CCR7 수용체 항체에 관한 것이다.
최근, 조혈 기관 종양(hematopoietic organ tumor), 백혈병(leukaemia), 재생불량성 빈혈(hypoplastic anaemia) 등의 다양한 혈액 질환의 치료를 목적으로 하여, 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)이 광범위하게 수행되고 있다. 더욱이, 세포 이식은 의료 분야에서 유용한 치료 방법이다. HSCT는 줄기 세포의 공급원 또는 공여체(donor) 선택의 차이에 따라 분류된다. 일반적인 줄기 세포 공급원에는 장골 능선에서 채취한 골수[참조: Aschan. J.Br Med Bull. 2006;77-78:23-36], 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)- 또는 플레릭사포르 고정된 말초혈 줄기 세포[참조: Bacigalupo et al., Haematologica. 2002 Aug;87 (8 Suppl):4-8] 및 제대혈[참조: Kestendjieva et al., Cell Biol Int. 2008 Jul;32(7):724-32]이 포함된다. HSCT는 줄기 세포가 환자 자신에서 유래된 경우에는 자가(autologous) 또는, 줄기 세포가 건강한 사람에서 유래된 경우에는 동종이계(allogeneic)일 수 있으며, 주요 및 마이너 조직적합성 동일성을 공유하는 개개 유전자형이 동일한 관련 공여체, 인간 백혈구 항원(HLA)-동일 형제 공여체, 확장 가족 멤버 사이의 HLA-정합 공여체, HLA-동일 무관계 공여체, 부정합 관련 공여체, 부정합 무관계 공여체, 부정합 제대혈 공여체 및 반수체-부정합 관련 공여체를 포함한다.
그러나, 고도로 정교한 치료 접근법의 사용에도 불구하고, HSCT는, 이식편 대 숙주 질환(GvHD), 감염성 질환, 정맥 폐쇄성 질환, 공여체 이식 숙주편 거부 및 기저 질환의 재발 등의 다수의 합병증에 의해 유발되는 상당한 사망률과 여전히 관련이 있고, 이 중 GvHD는 동종이계 HSCT 후의 가장 빈번하고 심각한 합병증이고, 환자의 최대 30 내지 70%에 영향을 미치고 상당한 나환률 및 사망률과 관련되기 때문에, 대처할 필요가 있다.
GVHD는 고전적으로 급성형 및 만성형으로 분류된다. 급성 GVHD(aGVHD)는 통상 이식후 100일까지의 생착시 및 HSCT후 100일 이내의 만성 GVHD(cGVHD)의 사이에 발생한다. 양쪽 유형의 GVHD는 질환의 임상적 중증도에 따른 정도로 추가로 세분된다. 그러나, 이 시간적 구별은, 새로운 치료 접근법에서는 모호하고, 양쪽 특징을 공유하는 오버랩 증후군이 포함되어 있다[참조: Ferrara, J.L., et al., Lancet, 2009. 373(9674): p. 1550-61; Filipovich, A.H., et al., Biol Blood Marrow Transplant, 2005. 11(12): p. 945-56]. 추가로, GVHD는 단일 질환으로 종종 간주되고, HSCT의 초기에 발생하는 GVHD의 급성기 및 이식의 후반에 GVHD가 나타나는 만성기의 2개 단계로 나누어진다[참조: MacDonald et al. Blood. 2017; 129(1):13-21].
급성 GVHD는 주로, 피부, 위장관, 간장에 영향을 미친다. 피부 병변은 통상 황반구진 발진으로 구성되고, 가장 극심한 경우에는 수포 및 궤양을 일으키고, 스티븐슨-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome)을 모방한 수포 및 중독성 표피 괴사를 수반한다. 위장의 증상에는, 복부 경련 및 통증, 설사, 혈변, 장폐색, 식욕부진, 오심, 구토 등이 있다. 간 질환은, 담즙 정체(cholestasis), 따라서 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia) 및 알칼리 포스파타제 상승을 야기하는 모세 담관(bile canaliculi)의 손상에 기인한다.
만성 GVHD는 통상, 전신성 경화증 등의 자가면역 질환과 유사하고, 경화증 및 섬유증은 통상 피부, 눈, 입, 장, 간, 폐, 관절 및 비뇨생기계에 영향을 미친다. 전형적 피부 증상은 경화증, 다형피부위축증(poikiloderma) 및 이끼형 병변(lichen-type lesion)이다. 폐의 경우, 폐쇄성 세기관지는 세기관지의 손상 및 폐쇄의 결과이고, 높은 사망률로 이어진다.
조혈계는 또한 흉선 손상 및 혈구감소증을 수반하는 급성 및 만성 둘 다에서 일반적으로 영향을 받는다.
GVHD를 예방, 치료 또는 억제하기 위한 몇몇 방법은, 칼시뉴린 억제제(사이클로스포린 A 및 타크롤리무스(FK506)), 항증식제(메토트렉세이트 및 마이코페놀레이트 모페틸), mTOR 억제제(시롤리무스 및 라파마이신) 및 프레드니손 등의 스테로이드 등의 면역억제 약물의 사용에 의한 것이다. 최근의 접근법은, 사이클로포스파미드 또는 항-흉선세포 글로불린(ATG), 체외 광성분채집술(extracorporeal photoapheresis), 리툭시맙 등의 모노클로날 항체, B-세포 신호전달을 저해하는 키나제 억제제, 조절성 T 세포의 증식 등의 다른 치료를 사용한 이식 세포 모집단(이식편)으로부터의 성숙 T 세포의 생체내 제거를 포함하는 자가반응성 T 또는 B 림프구의 활성화 및/또는 증식을 방지 또는 제한하는 것을 목적으로 하고 있다. 그러나, 이들 개발은 유망하지만, 글루코코르티코이드는 비특이적이고 광범위한 면역억제 효과를 갖고 있기 때문에, 장기간 사용의 실질적 부작용에도 불구하고, 여전히 표준적 최전선의 치료법을 구성하고, 이들의 독성은 높고, 따라서 면역계의 저하 또는 종양의 재발에 기인하는 감염성 질환이 문제가 되고 있다[참조: Zeiser and Blazard. N Engl J Med 2017; 377: 2565-79. DOI: 10.1056/NEJMra1703472]. 따라서, GVHD를 보다 선택적으로 회피하기 위한 효과적 치료 또는 예방 방법 및 약물의 개발이 현재 여전히 기다려지고 있다. 따라서, 종래 기술의 방법론의 심각한 단점을 겪지 않는 대체의 개선된 치료 접근법에 대한 당해 기술분야의 필요성이 여전히 존재한다.
인간 CC 모티프 수용체 7(이하 "CCR7"이라 함)은 EBV 감염에 의해 림프구 선택적 방식으로 발현되는 것으로 최초 발견된 7개 막관통 도메인(transmembrane-spanning domain) G 단백질 연결 수용체(G-protein coupled receptor; GPCR)이다[참조: Birkenbach et al., 1993, J.Virol. 67: 2209-2220]. CCR7은 CCL19 및 CCL21로서 불리는 2개 케모카인에 선택적으로 결합한다. 호메오스태시스 및 염증에서, CCR7은 나이브 T 및 B 림프구, 중앙 기억 T 세포(TCM), 천연 킬러 세포(NK 세포)의 일부 서브세트, 반성숙 및 성숙 DC 및 플라스모사이토이드 DC에서 발현된다[참조: Forster R, et al,. Cell 1999; 99: 23?33.; Comerford I, et al. Cytokine Growth Factor Rev. 2013 Jun;24(3):269-83]. 이들 백혈구 서브세트에는 CCR7이 이동, 조직화 및 활성화를 조절한다.
일부 간행물은, CCR7을 발현하는 공여체 T 세포가 GVDH의 병인과 관련될 수 있다고 보고한다[참조: Portero et al., 2014, Blood 124:3930; Portero-Sainz et al. 2017, Bone Marrow Transplant. 52, pg: 745?752; Coghill et al., 2010, Blood. 115(23):4914-22]. 그러나, 이 문헌 중의 어느 것도, CCR7의 표적화가, 종래 기술의 방법론의 부작용의 단점 없이, GVHD의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 개시하지 않는다.
따라서, 본 발명의 목적은 GVHD를 예방 및 치료하기 위한 종래 기술 접근법의 단점을 극복하는 약제 및 치료 접근법을 제공하는 것이다. 특히, 동종이계 HSCT에서 생존율을 개선시키는 것이 본 발명의 목적이다.
제1 측면에서, 본 발명은, 공여체 세포를 포함하는 이식편(transplant) 수용체(recipient)에서 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 항-CCR7 항체는 CCL19 및 CCL21로부터 선택된 적어도 하나의 CCR7-리간드에 의해, CCR7-의존성 세포내 신호전달 및 CCR7 수용체 내재화 중의 적어도 하나를 억제하기 위해 100nM 이하의 IC50을 갖는다. 보다 바람직하게는, 항-CCR7 항체는, 실질적 작용 효과(agonistic effect) 없이, CCR7-의존성 세포내 신호전달을 억제한다. 가장 바람직하게는, 항-CCR7 항체는, 참조 항-CCR7 항체의 Kd보다 20배 이하로 높은 인간 CCR7의 N-말단 세포외 도메인의 Kd를 갖고, 이에 의해 참조 항-CCR7 항체는, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 1이고 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 2인 마우스 항-CCR7 항체이다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 바람직하게는, 항-CCR7 항체는, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 1이고 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 2인 항-인간 CCR7 항체의 HVR을 갖는 항체이다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 수용체에서 CCR7 발현 세포의 사멸, 세포자멸사(apoptosis)의 유도, 이동의 차단, 활성화의 차단, 증식의 차단 및 확산의 차단 중 적어도 하나에 영향을 미치는 항-CCR7 항체이다.
수용체에서 GVHD를 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 방법 또는 용도에서, 공여체 세포를 포함하는 이식편은, 바람직하게는, 기관, 조직, 전구세포(progenitor) 세포, 줄기 세포 및 조혈 세포 중 하나 이상을 포함하는 이식편이다. 보다 바람직하게는, 공여체 세포를 포함하는 이식편은 조혈 줄기 세포 또는 전구세포 세포를 포함하는 이식편이다. 가장 바람직하게는, 수용체는 악성 장애를 앓고 있고, 바람직하게는, GHVD의 예방 또는 치료는 이식편 대 종양 효과 또는 이식편 대 백혈병 효과를 유지 또는 촉진한다.
수용체에서 GVHD를 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 방법 또는 용도에서, 바람직하게는, GHVD의 예방 또는 치료는, a) 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받기 전에, 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여; b) 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받은 후, 및 바람직하게는 수용체가 GHVD의 증상을 나타내기 전, 또는 수용체가 GHVD로 진단되기 전에, 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여; c) 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받은 후, 및 바람직하게는 GHVD의 증상을 나타낸 후, 또는 수용체가 GHVD로 진단된 후에, 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여; d) 공여체 세포를 포함하는 이식편으로서, 상기 정의된 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 생체외 인큐베이션(incubation)에 의한 이식 전에 제조된 이식편의 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여; 및 e) GHVD의 재발 후의 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여 중의 적어도 하나를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 수용체로의 이식을 위해 공여체로부터 기관, 조직 또는 세포 제제(preparation)를 제조하는 생체외 방법에 관한 것이고, 상기 방법은, a) 상기 정의된 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 함께 기관, 조직 또는 세포 제제를 인큐베이팅하는 단계로서, 이에 의해 항-CCR7 항체는 기관, 조직 또는 세포 제제에서 CCR7 발현 공여체 세포의 i) 수의 감소 및 ii) 활성의 억제 중 적어도 하나에 영향을 미치는, 단계; 및 b) 임의로, 기관, 조직 또는 세포 제제로부터 항-CCR7 항체 및 CCR7 발현 공여체 세포 중 적어도 하나를 제거하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 이 방법에서, 항-CCR7 항체는, 이식 전에 기관, 조직 또는 세포의 제제를 보존하기 위해 사용되는 보존액(preservation solution)에 포함되어 있다. 보다 바람직하게는, 이 방법에서, 기관 또는 조직은 항-CCR7 항체를 포함하는 보존액으로 관류 또는 세척된다. 가장 바람직하게는, 이 방법에서, 항-CCR7 항체 및 CCR7 발현 공여체 세포는, 항-CCR7 항체 및 이에 결합된 CCR7 발현 공여체 세포의 친화성 정제에 의해 세포 제제로부터 제거된다.
본 발명에 따른 생체외 방법은, 바람직하게는, 상기 본 발명에 따른 사용 방법의 단계 d)에서 사용되는 이식편을 조제할 때에 사용된다.
발명의 설명
정의
본 명세서에서, "GVHD"는, 숙주에 이식된 이식편 중의 림프구 등이 숙주 조직을 이물질로서 인식하고, 이들 조직을 공격하는 질환으로서 정의된다. 이 경우, 본원에서 사용되는 용어 "수용체" 또는 "숙주"는 이식 또는 이식된 세포, 조직 또는 기관을 제공받는 대상체(이식 환자)를 지칭한다. 이러한 용어는, 예를 들면, 공여체 골수, 공여체 정제된 조혈 전구세포, 공여체 말초혈, 공여체 제대혈, 공여체 T 세포 또는 췌도 이식편의 투여를 제공받는 대상체를 지칭할 수 있다. 이식된 조직은 동계 또는 동종이계 공여체로부터 유래할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "공여체"는, 수용체 또는 숙주에 이식 또는 이식하기 위해 조직이 수득되는 대상체를 지칭한다. 예를 들면, 공여체는 골수, 말초혈, 제대혈, T 세포 또는 수용체 또는 숙주에게 투여되는 기타 조직이 유래하는 대상체일 수 있다. 본 발명은, 주로 인간을 대상으로 하고, 인간 환자에게 적합하게 사용된다. 그러나, 본 발명은, 적어도 면역 반응에 의한 항체 형성이 관찰되는 비인간 동물에 사용될 수 있다. 용어 인간은, 모든 대상을 성인 대상 및 소아 모집단으로서 식별하고, 용어 소아 모집단은 출생으로부터 18세까지의 모집단의 일부를 의미한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 예를 들면, 이들이 목적하는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 나타내는 한, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체, 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-CCR7 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 다가 항체, 일본쇄 항-CCR7 항체, 및 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함하는 항-CCR7 항체의 단편을 포함하는 단일 항-CCR7 모노클로날 항체(하기 참조), 디아바디, 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 항체와 상호 교환적으로 사용된다. 항체는 인간 및/또는 인간화될 수 있다.
용어 "항-CCR7 항체" 또는 "CCR7에 결합하는 항체"는, 항체가 CCR7을 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록, 충분한 친화성으로 CCR7에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 관련되지 않은 비-CCR7 단백질에 대한 항-CCR7 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사성 면역분석(RIA) 또는 ELISA에 의해 측정되는 경우, CCR7에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태에서, CCR7에 결합하는 항체는 ≤ 1mM, ≤ 100nM, ≤ 10nM, ≤ 1nM 또는 ≤ 0.1nM의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 실시형태에서, 항-CCR7 항체는 상이한 종으로부터의 CCR7 사이에 보존되어 있는 CCR7의 에피토프에 결합한다.
"단리된 항체"는 자연 환경의 구성으로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 항체이다.
기본적 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 헤테로사량체 당단백질이다(IgM 항체는 J 쇄로 불리는 추가 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적 헤테로사량체 단위로 구성되며, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 반면, 분비된 IgA 항체는 중합되어 J 쇄와 함께 2-5개의 기본적 4-쇄 단위를 포함하는 다가 어셈블리를 형성할 수 있다). IgG의 경우, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각 L 쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 이소형에 따라 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 각 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖고 있다. 각 H 쇄는 N-말단에 가변 도메인(VH)을 갖고, 그 후에 α 쇄 및 γ 쇄의 각각에 대해 3개의 불변 도메인(CH)이 있고, μ 및 ε 이소형에 대해 4개의 CH 도메인이 있다. 각 L 쇄는 N-말단에 가변 도메인(VL)과 다른 말단에 불변 도메인(CL)이 있다. VL은 VH와 정렬하고, CL은 중쇄의 최초의 불변 도메인(CH1)과 정렬한다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다. 이 VH 및 VL의 페어링은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 다양한 종류의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.
임의의 척추동물 종의 L 쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파와 람다로 불리우는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중의 하나에 할당될 수 있다. 이들의 중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 다른 부류 또는 이소형에 할당될 수 있다. 면역글로불린에는, 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 부류가 있다. γ 및 α 부류는 CH 서열 및 기능의 비교적 작은 차이를 기준으로 추가로 하위부류로 분류된다. 예를 들면, 인간은 하기 서브클레스: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적 부분이고, 항원 결합 부위를 포함한다.
용어 "가변"은, 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 범위 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은, 각각 9-12개의 아미노산 길이인 "초가변 영역"(HVR)이라고 불리는 극단적 가변성의 짧은 영역으로 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)이라고 불리우는 비교적 불변 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하고, 주로 β-시트 구성을 채택하고, 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고, 이는 루프 결합을 형성하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 결합되어 있고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 불변 도메인은, 항체와 항원의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 보체 의존성 세포독성(CDC) 및 항체 의존성 세포 식작용(ADCP)에서 항체의 관여 등의 다양한 효과기(effector) 기능을 나타낸다.
"무손상" 항체는, 항원 결합 부위, 게다가 CL 및 적어도 중쇄의 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은, 천연 서열 불변 도메인(예: 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다.
본원의 목적을 위한 "네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 접합되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995] 참조); 일본쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다.
Fc 단편은 디설파이드에 의해 함께 결합된 양쪽 H 쇄의 카복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역의 서열에 의해 결정되고, 이 영역은 또한 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는, 실질적으로 균질한 항체 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 모집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 가능성이 있는 천연 존재 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 모노클로날 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 유용한 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분이 또 다른 종에서 유래하거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 게다가 이러한 항체의 단편을 포함한다(미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]. 본원에서 목적의 키메라 항체에는, 비인간 영장류(예를 들면, 올드 월드 몽키, 유인원 등)로부터 유래하는 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화 항체"가 포함된다.
비-인간(예를 들면, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는, 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수용체 항체)이고, 여기서 수용체의 초가변 영역으로부터의 잔기는 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 랫트, 래빗 또는 비인간 영장류 등의 비-인간 종(공여체 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 치환된다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 몇몇 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 것이다. 상세에 대해서는 문헌[참조: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 하기 리뷰 기사 및 그 안에 인용된 참조문헌[참조: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994)]을 참조한다.
용어 "초가변 영역", "HVR"은, 본원에서 사용되는 경우, 서열이 초가변이고/이거나 항원 결합에 관여하는 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함한다: VH(H1, H2, H3)에 3개, VL(L1, L2, L3)에 3개. 다수의 초가변 영역의 묘사가 사용되고 있고, 본원에 포함된다. 초가변 영역은, 일반적으로, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들면, 카뱃 넘버링 시스템[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따라 넘버링되는 경우, VL의 약 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 VH의 약 잔기 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)); 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기(예를 들면, 초티아 넘버링 시스템[참조: Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 따라 넘버링되는 경우, VL의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH의 26-32(H1), 52-56(H2) 및 95-101(H3); 및/또는 "초가변 루프"/CDR로부터의 잔기(예를 들면, IMGT 넘버링 시스템[참조: Lefranc, M. P. et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M. et al. Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000)]에 따라 넘버링되는 경우, VL의 잔기 27-38(L1), 56-65(L2) 및 105-120(L3), 및 VH의 27-38(H1), 56-65(H2) 및 105-120(H3))를 포함한다. 임의로, 항체는, 문헌[참조: Honneger, A. and Plunkthun, A. J. (Mol. Biol. 309:657-670 (2001)]에 따라 넘버링되는 경우, VL의 하기 지점 28, 36(L1), 63, 74-75(L2) 및 123(L3) 및 VH의 28, 36(H1), 63, 74-75(H2) 및 123(H3) 중의 하나 이상에서 대칭적 삽입체를 갖는다. 본 발명의 항체의 초가변 영역/CDR은 바람직하게는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의 및 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 이들 가변 도메인 잔기이다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는, 이들이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에 사용된 "작용제 항체"는 목적 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 합계의 강도를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 멤버(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd)로 표시될 수 있다. 친화성은, 본원에 기재된 것을 포함하여 당해 기술분야에 공지된 일반적 방법에 의해 측정될 수 있다. 저친화성 항체는 일반적으로 항원에 서서히 결합하고, 용이하게 해리되는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 신속하게 결합하고 보다 장기간 결합되는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정 예시적 실시형태가 하기에 설명된다.
"Kd" 또는 "Kd 값"은, 약 10 내지 50 반응 유닛(RU)에서 BIAcoreTM-2000 또는 BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 25℃에서 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 표면 플라스몬 공명 검정을 사용함으로써 측정할 수 있다. 간단히 설명하면, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIAcore Inc.)은, 공급업자의 지시에 따라, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화된다. 항원을 10mM 아세트산나트륨(pH 4.8)으로 5μg/ml(~ 0.2μM)로 희석한 후, 5μl/분의 유속으로 주입하여 약 10 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원 주입 후, 1M 에탄올아민을 주입하여 미반응 그룹을 차단한다. 동역학 측정을 위해, 항체 또는 Fab의 2배 연속 희석액(0.78nM ~ 500nM)을, 0.05% 트윈 20(PBST)을 포함하는 PBS에 25℃에서 약 25μl/분의 유속으로 주입한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, 단순한 1:1 랑뮈어 결합 모델(BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여, 결합 및 해리 센소그램을 동시에 피팅함으로써 계산한다. 평형 해리 상수(Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다[참조: Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]. 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 온-레이트가 106M-1S-1을 초과하는 경우, 온-레이트는, 스톱-플로우 장착 분광계(Aviv Instruments) 또는 교반 적색 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광계(ThermoSpectronic) 등의 분광계로 측정한 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS(pH 7.2) 중의 20nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 발광 강도의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 사용하여 측정한다(여기 = 295nm; 발광 = 340nm, 16nm 밴드-패스).
본 발명에 따르는 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한, 상기 기재된 BIAcoreTM-2000 또는 BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 상기 기재된 바와 동일한 표면 플라스몬 공명 기술로 측정할 수 있다.
목적의 항원, 예를 들면, 폴리펩티드 CCR7 항원 표적에 "결합하는" 항체는, 항체가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는 치료제로서 유용하고 다른 단백질과 유의적으로 교차-반응하지 않도록, 충분한 친화성으로 항원에 결합하는 것이다. 이러한 실시형태에서, "비-표적" 단백질에 대한 항체의 결합의 정도는, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 또는 방사면역침강(RIA)에 의해 결정된 바와 같이, 이의 특정 표적 단백질에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만일 것이다. 항체의 표적 분자에 대한 결합과 관련하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적"은 비-특이적 상호작용과는 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들면, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 동일한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교한 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들면, 특이적 결합은, 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들면, 과량의 비-표지된 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우, 특이적 결합이 제시된다. 본원에 사용되는 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적"은, 예를 들면, 적어도 약 10-4M, 또는 적어도 약 10-5M, 또는 적어도 약 10-6M, 또는 적어도 약 10-7M, 또는 적어도 약 10-8M, 또는 적어도 약 10-9M, 또는 적어도 약 10-10M, 또는 적어도 약 10-11M, 또는 적어도 약 10-12M 또는 그 이상의 표적에 대해 Kd를 갖는 분자에 의해 제시될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 용어 "특이적 결합"은, 분자가 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고서, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 지칭한다.
항체의 "효과기 기능"은, 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체의 이소형에 따라 달라진다. 항체 효과기 기능의 예에는 다음의 것이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 항체-의존성 세포-매개 식작용(ADCP); 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상 위치 Cys226의 아미노산 잔기 또는 Pro230에서 이의 카복실-말단까지 연장되도록 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들면, 항체의 생산 또는 정제 중에, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 모집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 모집단, 및 K447 잔기가 있거나 없는 경우의 항체의 혼합물을 갖는 항체 모집단을 포함할 수 있다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적 "효과기 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들면, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 하고, 예를 들면, 본원의 정의에 개시된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 분비된 Ig가 특정 세포독성 세포(예: 천연 킬러(NK) 세포, 호중구, 마크로파지)에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 세포독성의 형태를 지칭하고, 이들 세포독성 효과기 세포는 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 세포독성으로 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키고, 이러한 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은, 문헌[참조: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 목적 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 검정을 실시할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포에는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 목적 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 문헌[참조: Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. WO 제2000/42072호(Presta)는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체를 기재한다[예를 들면, Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001)].
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고, ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 천연 킬러(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되고; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 천연 공급원, 예를 들면, 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 최초의 구성요소(C1q)가 동족 항원에 결합된 항체(적절한 하위부류의)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면, 문헌[참조: Gazzano-Santoro et al. (1996, J. Immunol. Methods 202: 163]에 기재된 CDC 검정이 수행될 수 있다. Fc 영역의 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소한 항체 변이체(예를 들면, 변이체 Fc 영역을 갖는 항체)는, 예를 들면, 미국 특허 제6,194,551 B1호 및 WO 제1999/51642호에 기재되어 있다[참조: 예를 들면, Idusogie et al. (2000, J. Immunol. 164: 4178-4184]. C1q 결합을 증가시키고 이에 따라 CDC 활성을 증가시키는 이러한 치환 중 하나는 E333A 치환이고, 이는 본 발명의 항체에 유리하게 적용될 수 있다.
본 명세서에서 "서열 동일성"은, 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이, 2개 이상의 아미노산(폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오티드) 서열 사이의 관계로서 정의된다. 당해 기술분야에서, "동일성"은 또한, 경우에 따라, 이러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정될 수 있는 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 2개 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 아미노산 서열 및 1개 폴리펩티드의 보존된 아미노산 치환물을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은, 공지된 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있다. 용어 "서열 동일성" 또는 "서열 유사성"은, 바람직하게는 전체 길이에 걸쳐(적어도 비교에서 가장 짧은 서열) 및 디폴트(default) 파라미터를 사용하여 프로그램 ClustaIW(1.83), GAP 또는 BESTFIT 등에 의해 정합 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화하여 최적으로 정렬되는 경우, 2개의 (폴리)펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열이, 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같이, 특정 비율의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. GAP는 니들맨 및 운쉬(Needleman and Wunsch) 글로벌 정렬 알고리즘을 사용하여, 2개의 서열을 전장에 걸쳐 정렬하고, 정합 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화한다. 일반적으로, 갭 작성 페널티 = 50(뉴클레오티드)/8(단백질) 및 갭 확장 페널티 = 3(뉴클레오티드)/2(단백질)의 GAP 디폴트 파라미터가 사용된다. 뉴클레오티드의 경우, 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 nwsgapdna이고, 단백질의 경우, 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62이다[참조: Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919]. 본 발명의 단백질 서열을 정렬하기 위한 바람직한 다중 정렬은 blosum 매트릭스 및 디폴트 설정(갭 개구 페널티: 10; 갭 확장 페널티: 0.05)를 사용하는 ClustaIW(1.83)이다. 서열 정렬 및 서열 동일성의 백분율의 스코어는, 악셀리스 인코포레이티드(Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA)로부터 입수가능한 GCGWisconsis Package 버젼 10.3 등의 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 또는 오픈 소스 소프트웨어, 예를 들면, 상기 GAP와 동일한 파라미터를 사용하거나 디폴트 설정을 사용하는 EmbossWIN 버젼 2.10.0에서 프로그램 "needle"(글로벌 니들맨 운쉬 알고리즘을 사용) 또는 "water"(로컬 스미스 워터맨 알고리즘을 사용)를 사용하여 결정할 수 있다("need" 및 "water" 둘 다, 및 단백질 및 DNA 정렬의 둘 다에서, 디폴트 갭 개구 페널티는 10.0이고, 디폴트 갭 확장 페널티는 0.5이고; 디폴트 스코어링 매트릭스는 단백질의 경우에는 Blossum62 및 DNA의 경우에는 DNAFull이다). 서열의 전장이 실질적으로 상이한 경우, SmithWaterman 알고리즘을 사용하는 것 등의 로컬 알고리즘이 바람직하다. 또는, 백분율 유사성 또는 동일성은 FASTA, BLAST 등의 알고리즘을 사용하여 공개 데이터베이스에 대하여 검색함으로써 결정될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 CCR7 수용체가 일부 림프구 세포 및 항원-제시 세포(APC)에서 고도로 발현된다는 발견에 기초한다. 상기 세포에서, CCR7은 GVHD의 발달 및 진전의 기초가 되는 프로세스인 림프절(LN)을 포함하는 림프 조직으로의 침입에서 주요 역할을 한다. 본 발명자들은, 놀랍게도, 항-CCR7 항체가 마우스의 GVHD 모델에서 현저한 치료 효과를 생성한다는 것을 발견했다. GVHD는, 이식편의 수용체에게 항-CCR7 항체를 투여함으로써 현저한 부작용없이 억제될 수 있다. 생체내 모델은, 항체를 사용한 CCR7 표적화가 어떻게 질환을 예방하고 일단 발증된 GVHD를 개선하는지를 나타내고, 따라서 CCR7 수용체를 급성 및 만성 GVHD 모두에서 mAb 치료에 대한 흥미로운 표적으로 되게 한다. CCR7에 대한 모노클로날 항체(mAb), 즉 CCR7 수용체의 에피토프를 인식하고, 바람직하게는 CCR7 의존적 세포내 신호전달을 억제할 수 있는 항체는, 생체내에서, CCR7+ 공여체 및 수용체 면역 세포의 이동, 활성화 및/또는 증식, 및/또는 확산을 사멸 및/또는 차단할 수 있는 반면, CCR7- 면역 세포는 영향을 받지 않고, 따라서, 예를 들면, GVL을 유지하고 GVHD 증상 및 생체내 생존을 개선시킨다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은, 공여체 세포를 포함하는 이식의 수용체에서 GVHD의 예방 및 치료 중 적어도 하나에 사용하기 위한 항-CCR7 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 수용체 및 공여체 세포 중 적어도 하나는 인간이다. 이식은 바람직하게는 면역 세포를 포함하는 공여체 세포, 보다 바람직하게는 수용체 조직에 대한 면역 반응을 유발하여 GVHD를 매개하는 면역적격 세포(예를 들면, 성숙 T 세포)를 포함한다. GVDH는 급성 또는 만성 GVHD일 수 있다. 바람직하게는, GVDH는 급성 GVHD이다. 본원에 사용된 GVHD의 "치료"는 GVHD의 억제, GVHD 발생 %의 감소, GVHD의 치료, GVHD의 하나 이상의 임상 증상의 개선 또는 약화 및 치료 대상의 생존율의 개선을 의미하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 GVHD의 "예방(preventing)"은 "예방법(prophylaxis)"을 의미하는 것으로 이해된다. 생체내 예방법은 GVHD 발생의 억제, GVHD 발증의 지연, GVHD 발생 %의 감소, GVHD 발생 후의 하나 이상의 임상 증상의 감소 등을 의미한다.
본 발명에서 사용하기 위한 항-CCR7 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합하는 임의의 항원 결합 단백질일 수 있다. CCR7에 결합하는 본 발명의 항원 결합 단백질은 바람직하게는, 본원에서 상기 정의되는 가장 넓은 의미에서의 항-CCR7 항체이고, 예를 들면, 항-CCR7 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 항체 뮤테인 및 항체 변이체를 포함한다. 본 발명의 항-CCR7 항체는 바람직하게는 단리된 항체이다. 바람직하게는, 본 발명의 항-CCR7 항체는 영장류 CCR7, 보다 바람직하게는 인간 CCR7에 결합한다. 인간 CCR7의 참조 아미노산 서열은, 예를 들면, NP_001288643, NP_001288645, NP_001288646, NP_001288647, NP_001829, NP_001288642 및 NP_031745이다. 이 서열의 아미노산 1 내지 24는 발현 동안 절단되는 막 전좌 신호 펩티드를 포함한다. 인간 CCR7의 아미노산 25 내지 59는 N-말단 세포외 도메인을 구성하고, 이 도메인은 위치 Y32 및 Y41에 황산화 티로신 잔기를 포함한다. 상기에서 언급한 참조 서열과 비교하여, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 인간 CCR7에 대하여 다양한 대립유전자 변이체가 공지되어 있다. 본 발명에서 "인간 CCR7"은, 적어도 변이체가 세포외 도메인 및 CCR7의 기능을 갖는 한, 이러한 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 항-CCR7 항체는 바람직하게는 CCR7, 바람직하게는 인간 CCR7의 N-말단 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 사용하기 위한 항-CCR7 항체는 바람직하게는 CCL19 및 CCL21로부터 선택된 적어도 하나의 CCR7 리간드에 의해 CCR7 의존성 세포내 신호전달, CCR7 의존성 기능 및/또는 CCR7 수용체 내재화를 억제하는 중화 항체이다. 항-CCR7 항체는 바람직하게는, 예를 들면, 본원의 실시예에 기재된 검정에서 결정될 수 있는 바와 같이, CCL19 및 CCL21로부터 선택된 적어도 하나의 CCR7 리간드에 의한 CCR7-의존성 세포내 신호전달 및/또는 CCR7 수용체 내재화를 억제하기 위해 150, 100, 80, 50, 30, 25, 20, 15, 10, 5 또는 3nM 이하의 IC50을 갖는다. 대안적으로, 항체의 최대 IC50은 동일한 검정에서 시험된 경우의 참조 항-CCR7 항체의 IC50을 참조하여 정의된다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 항-CCR7 항체는 참조 항-CCR7 항체의 IC50보다 10, 5, 2, 1.5, 1.2, 1.1 또는 1.05배 이하로 높은 IC50을 갖고, 이에 의해 참조 항-CCR7 항체는, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 1이고 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 2인 마우스 항-CCR7 항체이다.
본 발명의 항-CCR7 항체는, 예를 들면, 본원의 실시예에 기재된 검정으로 결정될 수 있는 바와 같이, 바람직하게는, 실질적 작용 효과 없이, 보다 바람직하게는, 예를 들면, 검출가능한 작용 효과 없이, 상기한 바와 같이 CCR7 의존성 세포내 신호전달 CCR7을 억제한다.
본 발명에서 사용하기 위한 항-CCR7 항체는, 바람직하게는, CCR7, 바람직하게는 인간 CCR7의 N-말단 세포외 도메인에 대해 최소 친화성을 갖는다. 항체의 최소 친화성은, 본원에서는, 동일한 검정으로 시험된 경우의 참조 항-CCR7 항체의 Kd를 참조함으로써 정의되는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 항-CCR7 항체는, 인간 CCR7의 N-말단 세포외 도메인에 대해 참조 항-CCR7 항체의 Kd보다 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1.5, 1.2, 1.1배 또는 1.05배 이하로 높은 인간 CCR7의 N-말단 세포외 도메인에 대한 Kd를 갖고, 여기서 참조 항-CCR7 항체는, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 1이고 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 2인 마우스 항-CCR7 항체이다. 본원에서, 참조 Kd보다 10배 이하로 높은 Kd를 갖는 항체는, 참조 항체의 친화성보다 10배 이상 낮은 친화성을 갖는 항체인 것으로 이해된다. 따라서, 참조 항체의 Kd가 1×10-9M인 경우, 해당 항체의 Kd는 1×10-8M 이하이다.
상기 정의된 특성 중 하나 이상을 갖고 본 발명에서의 사용에 적합한 항-CCR7 항체의 예는, 예를 들면, US 제8,865,170호, WO 제2009/139853호, WO 제2014/151834호 및 WO 제2017/025569호에 기재된 모노클로날 항체를 포함하고, 이들은 모두 참조에 의해 본원에 포함된다.
본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 항-CCR7 항체는, 아미노산 서열 "ZxLFE"(여기서, Z는 설페이트화 티로신이고, x는 임의의 아미노산일 수 있고, F는 소수성 아미노산에 의해 치환될 수 있다)를 포함하거나 이들로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다. 따라서, 본 발명의 항체는, 바람직하게는, 인간 CCR7의 N-말단 세포외 도메인의 위치 41 내지 45의 아미노산 서열 "ZTLFE"를 포함하거나 이들로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항체는 바람직하게는 인간 CCR7에 특이적이다. 이러한 바람직한 항-CCR7 항체는, 바람직하게는, 인간 CCR7 또는 "ZTLFE" 에피토프를 포함하는 합성 항원에 대하여, 바람직하게는 본원의 실시예에 기재된 합성 항원 SYM1899에 대하여 최소 친화성을 갖는다. 따라서, 바람직하게는, 항-CCR7 항체는 바람직하게는 합성 항원 SYM1899에 대해 1×10-8M, 5×10-9M, 2×10-9M, 1.8×10-9M, 1×10-9M, 1×10-10M 또는 1×10-11M 이하의 Kd를 갖는다. 또는, 항체의 최소 친화성은 동일한 검정으로 시험된 경우의 참조 항-CCR7 항체의 Kd를 참조함으로써 정의된다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 항-CCR7는, 인간 CCR7 또는 "ZTLFE" 에피토프를 포함하는 합성 항원(바람직하게는, 본원의 실시예에 기재되는 합성 항원 SYM1899)에 대하여, 항원에 대한 참조 항-CCR7 항체의 Kd보다도 10, 5, 2, 1.5, 1.2, 1.1 또는 1.05배 이하로 높은 Kd를 갖고, 여기서 참조 항-CCR7 항체는, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 1이고 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 2인 마우스 항-CCR7 항체이다. 본원에서, 참조 Kd보다 10배 이하로 높은 Kd를 갖는 항체는, 참조 항체의 친화성보다도 10배 이하로 낮은 친화성을 갖는 항체인 것으로 이해된다. 그러나, 참조 항체의 Kd가 1×10-9M인 경우, 해당 항체의 Kd는 1×10-8M 이하이다.
본 발명에서 사용하기 위한 항-CCR7 항체는, 바람직하게는, 최대 koff 속도 상수로, 인간 CCR7 또는 "ZTLFE" 에피토프를 포함하는 합성 항원(바람직하게는, 본원의 실시예에 기재된 합성 항원 SYM1899; 서열번호 3)에 결합한다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 항-CCR7 항체는, 1×10-3, 1×10-4 또는 1×10-5 s-1 이하의 koff 속도 상수를 갖는다. 또는, 항체의 최대 koff 속도 상수는, 동일한 검정으로 시험할 때의 참조 항-CCR7 항체의 koff 속도 상수를 참조함으로써 정의된다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 항-CCR7 항체는, 인간 CCR7 또는 "ZTLFE" 에피토프를 포함하는 합성 항원(바람직하게는, 본원의 실시예에 기재되는 합성 항원 SYM1899)에 결합하고, 이는, 항원에 대한 참조 항-CCR7 항체의 koff 속도 상수보다 10, 5, 2, 1.5. 1.2, 1.1 또는 1.05배 이하로 높고, 이에 의해 참조 항-CCR7 항체는, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 1이고 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 2인 마우스 항-CCR7 항체이다.
본 발명에서 사용하기 위한 이러한 바람직한 항체 중 하나는 참조 마우스 항-인간 CCR7 항체의 HVR을 갖는 항체이고, 이의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 1이고, 이의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 2이고, HVR이 참조에 의해 본원에 도입되는 WO 제2017/025569호에 정의되어 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 항-CCR7 항체는 키메라 항체, 예를 들면, 마우스-인간 항체일 수 있다. 그러나, 바람직하게 항체는 인간화 또는 인간 항체이다.
본 발명에서 사용하기 위한 인간화 항체는, 바람직하게는, 항체가 투여되는 대상체에서, 항체에 대한 면역원성 반응을 거의 또는 전혀 유발하지 않는다. 예를 들면, 본 발명에서 사용하기 위한 인간화 항체는, 예를 들면, 숙주 대상체에서 서열번호 1 및 2의 서열을 포함하는, 원래 마우스 항체와 비교하여 실질적으로 감소된 수준에서 인간 항-마우스 항체 반응(HAMA)을 유발하고/하거나 유발할 것으로 예상된다. 바람직하게는, 인간화 항체는 인간 항-마우스 항체 반응(HAMA)을 최소로 유발하거나 유발하지 않는 것으로 예상된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 임상적으로 허용가능한 수준 이하인 항-마우스 항체 반응을 유발한다.
인간화는, 인간 항체의 대응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 및 동료(Winter and co-workers)(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))의 방법에 따라 수행될 수 있다. 실제로는, 인간화 항체는, 전형적으로, 몇몇 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 이의 몇몇 프레임워크 영역(FR) 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기에 의해 치환되어 있는 인간 항체이다. 인간화 항체의 작제에 사용되는, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은, 항원에 대한 특이성 및 친화성을 보유하는 면역원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 스크리닝된다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접하는 인간 서열이, 인간화 항체의 인간 프레임워크 영역(FR)로서 수용된다[참조: Suns et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)]. 또 다른 방법은, 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래하는 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크를 몇몇 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다[참조: Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)].
항체가 인간화되고, 항원에 대한 높은 친화성 및 기타 바람직한 생물학적 특성을 보유하는 것이 추가로 중요하다. 이 목표를 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는, 양친 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여, 양친 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 프로세스에 의해 제조된다. 본 발명의 상기 실시형태 중의 어느 하나에 따르는 인간화 항-CCR7 항체는, 바람직하게는, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 영역인 중쇄 불변 영역을 포함한다. 본 발명의 상기 임의의 실시형태에 따른 인간화 항-CCR7 항체는, 바람직하게는, C1q 결합, 보체 의존성 세포독성; Fc 영역 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 및 식작용으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 효과기 기능을 갖는 기능적 Fc 영역을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 인간화 항체는, 예를 들면, WO 제2017/025569호에 기재되어 있는 바와 같이, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 4이고 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 5인 항체이다.
인간화의 대안으로서, 인간 항체를 생성할 수 있다. "인간 항체"는, 공지된 임의의 표준 방법에 의해 생성된, 완전히 인간 경쇄 및 중쇄, 게다가 불변 영역을 함유하는 항체를 의미한다. 예를 들면, 면역화할 때에, 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에서 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자도입 동물(예를 들면, 마우스)를 이용할 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 PH 유전자의 호모접합성 결손은, 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 초래하는 것이 기재되어 있다. 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 면역화 후에 인간 항체의 생성을 초래한다[참조: Jakobovits et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90:255 1 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]. 또는, 파지 디스플레이 기술[참조: McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 사용하여, 공여체로부터 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 프레임워크를 생성할 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는, M13 또는 fd 등의 섬유상 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 코팅 단백질 유전자 중 어느 하나에 프레임워크 내에서 클로닝되고, 파지 입자의 표면에 기능적 항체 단편으로서 표시된다. 섬유상 입자는 파지 게놈의 일본쇄 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능 특성에 기초한 선택은, 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택도 초래한다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 실행할 수 있고; 이들의 검토에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-57 1 (1993)]을 참조한다. 인간 항체는 또한, 시험관내에서 활성화된 B 세포 또는 이의 면역계가 인간 세포로 재구성되는 SCID 마우스에 의해 생성될 수 있다. 인간 항체가 수득되면, 이의 코딩 DNA 서열을 단리하고, 클로닝하고, 적절한 발현 시스템, 즉 세포주, 바람직하게는 포유동물로부터 도입하고, 이어서 항체를 단리할 수 있는 배양 배지로 이들을 발현 및 유리시킨다.
본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 인간 항체는, 예를 들면, WO 제2014/151834호에 기재된 바와 같이, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 6이고, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 7 또는 8인 항체이다.
본 발명 내에서 사용하기 위해 포함되는 CCR7 수용체에 결합하는 항체의 기능적 단편은, 각각이 유래하는 전장 항체의 적어도 하나의 결합 기능 및/또는 조절 기능을 보유한다. 바람직한 기능적 단편은, 대응하는 전장 항체의 항원 결합 기능(예를 들면, 포유동물의 CCR7 수용체에 결합하는 능력)을 보유한다. 특히 바람직한 기능적 단편은, 결합 활성 및/또는 신호전달 활성의 차단, 및/또는 세포 반응의 자극 등의 포유동물 CCR7 수용체의 하나 이상의 기능 특징을 억제하는 능력을 보유한다. 예를 들면, 한 가지 실시형태에서, 기능적 단편은, CCR7과 이의 리간드 중 하나 이상과의 상호작용을 억제할 수 있고/있거나, 하나 이상의 수용체 매개 기능을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-CCR7 항체는 경쇄 및/또는 중쇄 항체 불변 영역을 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 임의의 항체 불변 영역을 사용할 수 있다. 경쇄 불변 영역은, 예를 들면, 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역, 예를 들면, 인간 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은, 예를 들면, 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마- 또는 뮤-형 중쇄 불변 영역, 예를 들면, 인간 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마- 또는 뮤형 중쇄 불변 영역일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CCR7 항체는 이소형의 불변 영역, 즉 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역, 게다가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역을 가질 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 경쇄 또는 중쇄 불변 영역은, 천연 존재 불변 영역의 단편, 유도체, 변이체 또는 뮤테인이다. 목적의 항체로부터 상이한 하위부류 또는 이소형의 항체를 유도하기 위한 기술, 즉 하위부류 스위칭은 공지되어 있다. 따라서, IgG 항체는, 예를 들면, IgM 항체로부터 유래할 수 있고, 그 반대도 동일하다. 이러한 기술은, 소정 항체(양친 항체)의 항원 결합 특성을 갖지만, 양친 항체의 것과는 상이한 항체 이소형 또는 하위부류와 관련된 생물학적 특성도 나타내는 신규 항체의 제조를 가능하게 한다. 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 특정 항체 폴리펩티드를 코딩하는 클로닝된 DNA는, 이러한 절차, 예를 들면, 목적하는 이소형의 항체의 불변 도메인을 코딩하는 DNA에 사용할 수 있다[참조: Lantto et al. (2002, Methods Mol. Bio1.178:303-16)]. 따라서, 본 발명의 항-CCR7 항체에는, 예를 들면, 본원에 개시된 하나 이상의 가변 도메인 서열을 포함하고, 목적하는 이소형(예를 들면, IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE 및 IgD), 게다가 이의 Fab 또는 F(ab')2 단편을 갖는 것들을 포함한다. 추가로, IgG4가 필요한 경우, 문헌[참조: Bloom et al. (1997, Protein Science 6:407]에 기재된 바와 같이, 힌지 영역에 점 돌연변이(CPSCP→CPPCP)를 도입하여, IgG4 항체의 불균일성으로 되게 할 수 있는 H 쇄내 디설파이드 결합을 형성하는 경향을 완화시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 항-CCR7 항체는, 바람직하게는, C1q 결합, 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 및 식작용으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효과기 기능을 갖는 기능적 Fc 영역을 포함한다.
본 발명의 항-CCR7 항체는, 예를 들면, 항체의 ADCC 및/또는 CDC를 향상시키기 위해, 효과기 기능을 개선하도록 변형될 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 항체의 Fc 영역에서의 바람직한 치환은, 예를 들면, 문헌[참조: Idusogie et al. (2000, J. Immunol. 164: 4178-4184]에 기재된 바와 같이, C1q 결합을 증가시키고, 이에 의해 CDC 활성을 증가시키는 치환이다. C1q 결합을 증가시키는 Fc 영역의 바람직한 치환은 E333A 치환이다.
당단백질의 아미노산 골격에 추가된 글리코실 그룹, 예를 들면, 항체는 몇몇 단당류 또는 단당류 유도체에 의해 형성되어, 다른 포유동물 또는 조직으로부터의 세포에서 생산된 동일한 항체에서 상이할 수 있는 조성을 초래한다. 또한, 이는 글리코실 그룹의 상이한 조성이, 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)를 매개하는 효력에 영향을 미칠 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상이한 공급원으로부터의 항체의 글리코실화의 패턴을 연구함으로써, 이들 특성을 개선시킬 수 있다. 이러한 접근법의 예는 문헌[참조: Niwa et al. (2004, Cancer Res, 64(6):2127-33)]이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기는 Fc 영역에 도입될 수 있고, 이에 의해 이 영역에서의 쇄간 디설파이드 결합의 형성이 가능해진다. 이렇게 생성된 호모이량체 항체는, 개선된 내재화 능력 및/또는 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)의 증가를 가질 수 있다[참조: Caron et al. (1992, J. Exp Med. 176:1191-1195) and Shopes, (1992, Immunol. 148:2918-2922)]. 항-종양 활성이 증강된 호모이량체 항체는, 문헌[참조: Wolff et al. (1993, Cancer Research 53:2560-2565)]에 기재된 바와 같이, 헤테로이관능성 가교결합제를 사용하여 제조할 수 있다. 또는, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작할 수 있고, 이에 의해 보체 용해 및 ADCC 능력을 증강시킬 수 있다[참조: Stevenson et al. (1989, Anti-Cancer Drug Design 3:2 19-230)]. 항체의 혈청 반감기를 연장하기 위해, 예를 들면, 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이, 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체(특히 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 경우, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는, IgG 분자의 생체내 혈청 반감기의 증가에 관여하는 IgG 분자(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
본 발명의 바람직한 항-CCR7 항체는, 인간 동종이형 G1m17.1의 중쇄 불변 영역을 포함하고[참조: Jefferis and Lefranc (2009) MAbs Vol. 1 Issue 4, pp 1-7], 이 중쇄 불변 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체에서 인간 동종이형 G1m17,1의 중쇄 불변 영역은 E333A 치환을 포함하고, 이의 중쇄 불변 영역은 서열번호 10을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 항-CCR7 항체는, 다수의 종래 기술 중 어느 하나에 의해 제조할 수 있다. 이들은 통상, 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 기술을 사용하여, 재조합 발현 시스템에서 생산할 수 있다[참조: Shukla and Thommes (2010, "Recent advances in large-scale production of monoclonal antibodies and related proteins", Trends in Biotechnol. 28(5):253-261), Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, and Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY]. 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 발현 시스템을 사용하여, 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환시킨다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은, 공여체 세포를 포함하는 이식편의 수용체에서 GVHD를 치료 및/또는 예방하기 위한, 본원에서 상기 정의된 항-CCR7 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도에 관한 것이고, 바람직하게는 항-CCR7 항체 효과는, 바람직하게는 수용체에서, CCR7 발현 세포의 사멸, 세포자멸사의 유도, 이동의 차단 및/또는 확산의 차단, CCR7 발현 세포의 활성화의 차단, CCR7 발현 세포의 성숙 및 분화의 차단 중 적어도 하나를 포함한다. 항-CCR 항체가 이들 효과 중 하나 이상을 발휘하는 CCR7 발현 세포는, 바람직하게는, 공여체 유래의 이식 면역 세포 또는 숙주 유래의 면역 세포, 즉 수용체 유래일 수 있는 CCR7 발현 면역 세포이다. 공여체 또는 숙주 유래의 CCR7 발현 면역 세포의 예에는, 예를 들면, CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다의 T 세포, 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 조절성 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포, B 세포, 예컨대, 예를 들면, 나이브 B 세포 및 여포성 B 세포, 항원 제시 세포(APC), 예컨대, 예를 들면, 성숙 수지상 세포(mDC) 및 형질세포양 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포가 포함된다. CCR7 수용체를 발현하는 이러한 세포는, 종래의 방법으로 동정될 수 있고, 예를 들면, CCR7 수용체의 표면 발현은, 당해 기술분야에서 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이, 유세포 분석에 의해 분석할 수 있다. CCR7 수용체를 발현하는 세포의 사멸은, 임의의 종래의 방법에 따라, 예를 들면, 수용체로부터의 CCR7+ 세포의 부재 또는 클리어런스를 결정함으로써 결정할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 항-CCR7 항체의 사용은, 림프절, 말초혈, 비장, 흉선 및 골수 중 적어도 하나, 그 중에서도 수용체의 림프 기관 또는 수용체의 GVHD의 임의의 상피 표적 조직 내로 CD45+ 공여체 세포의 침윤을 방지 또는 감소시키고, 보다 바람직하게는 항-CCR7 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 수용체의 림프절, 말초혈, 비장, 흉선 및 골수 중 적어도 하나, 그 중에서도 수용체의 림프 기관 또는 수용체에서 GVHD의 임의의 상피 표적 조직 내로 CCR7+, CD45+ 공여체 세포의 침윤을 방지 또는 감소시킨다.
이론에 구속되는 것을 바라지 않지만, 본 발명에 따르는 항-CCR7 항체의 치료적 용도는, 유리하게는, 예를 들면, CCR7+ 세포 및 APC의 사멸 및/또는 CCR7+ T 세포 및 APC의 이동의 손상 및/또는 확산의 차단, 및/또는 수용체에서 CCR7+ T 세포 및 APC의 활성화 또는 분화 또는 성숙의 손상 또는 차단에 의해 생체내에서 GVHD의 특정한 예방 또는 치료를 가능하게 해야 한다. 대부분의 경우, 보체 의존성 세포 용해(CDC), 항체-의존성 세포-매개 식작용(ADCP) 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)은, 세포자멸사 또는 세포 주기 정지의 유도가 또한 실질적 역할을 담당할 수 있지만, 비접합된 항-CCR7 항체의 임상적 유용성에 기여하는 것으로 생각된다. 항-CCR7 항체의 적용의 경우, 이동의 손상 및/또는 차단 및/또는 면역 세포의 활성화, 분화, 증식 또는 성숙의 손상 또는 차단은 추가의 관련 작용 메카니즘이다.
따라서, 바람직하게는, 한 가지 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-CCR7 항체의 용도에 관한 것이고, 여기서 항-CCR7 항체는, CCR7 수용체를 발현하는 공여체 및/또는 수용체 세포의 이차 림프 조직으로의 이동을 손상시키고/시키거나, 페이어(Peyer) 패치 등의 림프절, 비장 및 점액-관련 림프 조직(MALT)을 포함하는 이차 림프 조직으로 공여체 세포의 확산(dissemination)을 차단한다.
본 발명에 따르는 GVHD가 예방 또는 치료되는 이식편의 수용체는, 바람직하게는, 기관, 전구세포 세포, 줄기 세포, 조혈 세포, 조혈 전구세포 세포또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식편 또는 이식체의 수용체이다. 이식편 또는 이식체는, 동계 또는 동종이계 이식편일 수 있지만, 바람직하게는 동종이계 공여체 세포를 포함하는 이식편 또는 이식체이다. 이식편은, 예를 들면, 심장, 폐, 신장, 간장, 췌장, 장, 안면(또는 이의 일부), 각막, 피부, 손, 다리, 페니스, 골, 자궁, 흉선 등을 포함하는 임의 유형의 기관 또는 조직을 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항-CCR7 항체 또는 항원-결합 단편은 조혈 세포 이식편의 수용체에서 GVHD를 예방 또는 치료하기 위해 사용된다. 보다 구체적으로는, 동종이계 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 후의 GVHD를 예방 또는 치료한다.
본 발명의 방법에 사용되는 공여체 세포는, 전 골수 세포 또는 정제된 골수 세포, 골수로부터의 정제된 조혈 전구세포 또는 줄기 세포, 말초혈로부터의 정제된 조혈 전구세포 세포 또는 줄기 세포; G-CSF 등의 성장 인자 또는 플레릭사포르 등의 항-CXCR4 제제를 사용하여 골수로부터 조혈 전구 세포를 동원한 후, 조혈 전구세포 또는 줄기 세포가 농후화된 성분채집술(apheresis) 생성물로부터의 (정제된) 제대혈 세포 또는 말초혈 세포일 수 있다. 공여체 T 세포가 도입되는 본 발명의 방법에서, 세포 이식편은 T 세포의 보충과 함께 전체 또는 정제된 골수 세포, 제대혈 세포 또는 정제된 줄기 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 한 가지 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 공여체 세포는, T 세포, 비장, 제대혈, 양막액, 및 와튼 젤리 유래의 치수 세포, 태반 유래 세포, 모근 유래 세포 및/또는 지방-조직 유래 세포, 림프구, 단핵구 및/또는 마크로파지, 줄기 세포 함유 조직, 줄기 세포 함유 기관, 면역 세포 함유 조직 및 면역 세포 함유 기관을 포함하는 세포 현탁액 중 적어도 하나를 포함하거나 이들로부터 유래한다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 공여체 세포는, 골수 줄기 세포, 말초혈 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 비접착성 골수 유래 세포(NA-BMC), 배성 줄기 세포 및/또는 재프로그램된 성체 줄기 세포 등의 골수의 성체 줄기 세포(즉, 유도된 만능 세포)를 포함하거나 이들로부터 유래하는 조혈 줄기 세포(조혈 전구세포 세포로서 공지되어 있음)이다.
조혈(줄기) 세포 이식편의 수용체는 혈액학적 장애 또는 비혈액학적 장애를 가질 수 있다. 조혈계 질환은 비종양성의 조혈계 질환 또는 조혈계 악성종양일 수 있다. 비악성 조혈 장애, 특히 조혈 세포 결핍 질환은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: 선천성 또는 후천성 면역 결핍증(congenital or acquired immune deficiency), 헤모글로빈혈증을 유발하는 유전성 질환, 효소 결핍 질환, 또는 자가면역 질환, 중증 재생불량성 빈혈(severe aplastic anemia), 탈라세미아(thalassemia), 겸상적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 면역학적 결함(immunological defects), 중증 복합 면역결핍증(severe combined immunodeficiency; SCID), 위스콧-알드리히 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome; WAS), 혈구식세포성 림프조직구증(hemophagocytic lymphohistiocytosis; HLH), 선천성 대사이상증(inborn errors of metabolism), 리소좀 저장 장애(lysosomal storage disorders), 과산화소체 기능 장애(disorders of peroxisomal function), 자가면역 질환, 류마티스 질환, 및 상기 임의의 재발. 혈액 악성종양은 백혈병(leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML), 전골수구성 백혈병(promyelocytic leukemia; PML), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia; ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia; CLL), 맨틀 세포 림프종(mantle cell lymphoma; MCL), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia; CML), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome; MDS), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin´s lymphoma; NHL), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma; HL), 다발성 골수종(multiple myeloma; MM) 및 신경아세포종(neuroblastoma)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 조혈(줄기) 세포 이식편의 수용체는, 비혈액학적 고형 종양(예를 들면, 신장 세포암, 결장직장암 등)을 가질 수 있다.
조혈(줄기) 세포 이식편의 수용체는, 골수파괴적 컨디셔닝 섭생, 비-골수파괴적 컨디셔닝 섭생 또는 강도 저하 컨디셔닝으로, 바람직하게는 조혈(줄기) 세포 이식편을 수용하기 전에 치료되거나 치료되지 않을 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은, GHVD의 예방 또는 치료가, 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받기 전에, (대략) 동시에 및/또는 후에, 수용체에 대한 항-CCR7 항체의 투여를 포함하는, 본 발명에 따르는 항-CCR7 항체의 용도에 관한 것이다. 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받는 것과 (대략) 동시에 항-CCR7 항체가 투여되는 경우, 바람직하게는, 항-CCR7 항체가 각각 서로 96, 72, 24, 12, 6 또는 3시간 이내에 투여되는 것을 의미한다. 바람직하게는, GHVD의 예방 또는 치료는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: a) 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받기 전에, 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여; b) 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받은 48, 72 또는 96시간 후, 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여; c) 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공반응 후 및 바람직하게는 수용체가 GHVD의 징후를 나타낸 후 또는 GHVD가 수용체에서 진단된 후에, 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여; 및 d) GHVD의 재발 후에 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여.
수용체가 이식편을 제공받기 전에 항-CCR7 항체의 투여가, 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받기 위해 수용체를 조정하고, 따라서 GHVD를 예방하거나 적어도 GHVD의 발생 위험을 감소시키는 것을 가능하게 한다는 점에서 바람직한 것으로 생각된다. 따라서, 바람직하게는, 항-CCR7 항체는, 적어도 수용체가 이식편을 제공받기 전에, 보다 바람직하게는 수용체가 이식편을 제공받기 적어도 5, 10, 20 또는 40분 또는 1, 2, 4, 8, 12, 24 또는 48시간 전에 투여된다.
수용체가 이식편을 제공받은 후의 항-CCR7 항체의 투여는, 수용체 숙주에 대한 공여체 면역 공격을 감소시키고, 공여체의 이식편 및/또는 세포의 수용체에 의한 수용을 추가로 촉진시킨다는 점에서 바람직한 것으로 생각된다. 바람직하게는, 항-CCR7 항체는, 수용체가 이식편을 제공받은 후, GVHD의 발생을 감소시키기 위해 및/또는 GVHD의 하나 이상의 증상을 개선 또는 경감시키기 위해 필요한 한, 필요한 빈도로 투여된다. 투여 빈도 및 투여량은, 항-CCR7 항체의 혈청 반감기에도 의존하고, 이에 따라 적응시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항-CCR7 항체는 수용체가 이식편을 제공받기 전후의 둘 다에서 투여된다.
그러나, 본 발명의 실시예가 나타내는 바와 같이, 이식편을 제공받은 수용체에서 동종-반응성 반응이 발생한 후의 수용체에 대한 항-CCR7 항체의 투여는 적어도 생존율의 개선과 관련하여 GHVD의 치료에서 여전히 효과적이다. 따라서, 본 발명의 한 가지 실시형태에서, 항-CCR7 항체는, 수용체가 GHVD 및/또는 검출가능한 동종반응성 반응의 임상 증상을 나타낸 후에 및/또는 바람직하게는 GHVD가 수용체에서 진단된 후에, 공여체 세포를 포함하는 이식편을 갖는 수용체에게 투여된다. 이러한 경우, 수용체는 항-CCR7 항체에 의한 이전의 치료 또는 투여를 제공받지 않을 수 있다.
수용체가 이식편을 제공받은 후에 수용체에게 투여되는 항-CCR7 항체는 하기 중 적어도 하나로부터 적어도 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21 및 28일 후에 투여될 수 있다: i) 수용체에 의한 이식편 또는 이식체의 수용; ii) 수용체에서 GHVD의 증상의 발생; iii) 수용체에서 동종-반응성 반응의 검출 및 iv) GHVD로 진단된 수용체.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항-CCR7 항체는 공여체 세포를 포함하는 이식편의 수용체에게 투여되고, 이 이식편은, 이식 전에, 항-CCR7 항체와의 생체외 인큐베이션에 의해, 바람직하게는 하기 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조된다. 수용체에게 투여되는 항-CCR7 항체는, 이식전에 이식편을 제조하기 위한 생체외 방법에서 사용되는 항-CCR7 항체와 동일할 수 있지만, 반드시 동일할 필요는 없다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이식편과는 별도로 적어도 1회, 바람직하게는 이식편을 투여하기 직전 또는 직후에 투여된다. 이 문맥에서 "단시간"이란, 24시간 이내, 바람직하게는 8시간 이내, 보다 바람직하게는 6시간 이내, 보다 바람직하게는 4시간 이내, 보다 바람직하게는 2시간 이내, 가장 바람직하게는 1시간 이내를 의미한다. "~와는 별도로"란, CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 이식편과는 별도의 용기, 예를 들면, 시린지에 포함되는 것을 의미한다. 바람직하게는, CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 이식편의 투여의 적어도 10초 전, 보다 바람직하게는 적어도 1분 전, 보다 바람직하게는 적어도 10분 전, 가장 바람직하게는 적어도 1시간 전에 투여된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 이식편은, CCR7 항체 또는 이의 항원-결핍 단편의 투여의 적어도 10초 전, 보다 바람직하게는 적어도 1분 전, 보다 바람직하게는 적어도 10분 전, 가장 바람직하게는 적어도 1시간 전에 투여된다.
따라서, 바람직하게는, 치료는, 이식편과는 별도로, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 수용체로의 적어도 1회의 투여를 포함한다.
본 발명의 여전히 또 다른 실시형태에서, 항-CCR7 항체는, GHVD의 재발 후에 수용체에게 투여되고, 이에 의해 수용체는 항-CCR7 항체에 의한 이전의 치료 또는 투여를 제공받지 않을 수도 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 의한 사용을 위해, 본원에 정의된 바와 같은 항-CCR7 항체(또는 이의 항원-결합 단편)을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은, 바람직하게는, 대상체에 대한 투여를 위해, 항-CCR7 항체 또는 이의 약제학적 유도체 또는 프로드러그를, 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 또는 비히클과 함께 포함한다. 상기 약제학적 조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 조성물을 투여함으로써, 본원에 기재된 치료 방법에서 사용할 수 있다. 용어 "대상체"는, 본원에서 "수용체"라는 용어와 상호 교환가능하게 사용되고, 본원에서 사용되는 경우, 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 지칭하고, 영장류 및 인간을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 대상체는, 임의의 연령 또는 인종의 남성 또는 여성의 인간인 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제 투여와 호환성이 있는, 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다[참조: 예를 들면, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", Rowe et al eds. 7th edition, 2012, www.pharmpress.com]. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 약제의 사용은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 종래의 매질 또는 약제가 활성 화합물과 적합하지 않는 경우를 제외하고, 조성물에서 이들의 사용이 고려된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 무독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산 등의 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린 등의 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 수크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 솔비톨 등의 당; 나트륨 등의 염-형성 카운터이온; 금속 착물(예: Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 항체는, 동일한 제형일 수 있거나, 상이한 제형으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 또는 순차로 수행될 수 있고, 임의의 순서에서도 효과적일 수 있다.
보충 활성 화합물은 또한, 본 발명의 약제학적 조성물에 도입될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 또한, 치료되는 특정 적응증에 필요한 2개 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 화학요법제, 사이토카인, 진통제 또는 면역조절제, 예를 들면, 면역억제제 또는 면역자극제를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 기타 활성제의 유효량은, 그 중에서도, 약제학적 조성물에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 질환 또는 장애 또는 치료의 종류 등에 의존한다.
GVHD의 단일제 치료 또는 예방에서의 사용에 추가하여, 본 발명의 항체 및 약제학적 조성물은 병용 요법을 제공하기 위해 다른 약물과 함께 사용될 수 있다. 다른 약물은, 동일한 조성물의 일부를 형성하거나, 동시 또는 상이한 시간에 투여하기 위해 별개의 조성물로서 제공될 수 있다. 병용 요법은, 환자에게 상승적 치료 효과를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 본원에 기재된 의학 상태의 다른 치료와 조합할 수 있다. 다른 치료제는 알킬화제(예: 질소 머스타드[예컨대: 메클로레타민], 사이클로포스파미드, 멜팔란 및 클로암부실), 알킬 설포네이트(예: 부설판), 니트로소우레아(예: 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴 및 스트렙톡소신), 트리아젠(예: 다카르바진), 항대사물질(예: 엽산 유사체, 예컨대, 메토트렉세이트), 피리미딘 유사체(예: 플루오로우라실 및 사이타라빈), 푸린 유사체(예: 플루다라빈, 이다루비신, 사이토신 아라비노사이드, 머캅토퓨린 및 티오구아닌), 빈카 알칼로이드(예: 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 벤데신), 에피도필로톡신(에토포사이드 및 테니포사이드), 항생물질(닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리카마이신 및 미토마이신), 디브로모만니톨, 데옥시스페르구알린, 디메틸 마일레란 및 티오테파, 프로테아좀 억제제(보르테조밉), 펜토스타틴, 스테로이드(예: 프로드니손 및 메틸프레드니솔론) 등의 면역억제제, 칼시뉴린 억제제(예: 사이클로스포린 A, 타크로리무스 또는 FK506), 포유동물의 라파마이신 표적(mTOR) 억제제(시로리무스 또는 라파마이신), 마이코페놀레이트 모페틸, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 아자티오프린, 모노클로날 항체(예: 다클리주맙(항-인터류킨(IL)-2), 인플리시맙(항-종양 괴사 인자), 에타네르셉트, MEDI-205(항-CD2), abx-cbl(항-CD147)), 알렘투주맙(항-CD52), 리툭시맙(항-CD20), 및 폴리클로날 항체(예: ATG(항-흉선세포 글로불린), 항히스타민제, 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 수술, 알킬화제, 항대사물질, 항호르몬, 다양한 증상을 위한 치료제, 예를 들면, 진통제, 이뇨제, 항이뇨제, 항바이러스제, 항생물질, 사이토카인, 영양 보조 식품, 빈혈 치료제, 혈액 응고 치료제, 골 치료제, 정신의학적 및 심리학적 치료제 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 항체 및 약제학적 조성물은, 이식 전 또는 이식과 동시에, GVHD의 예방법으로서 기타 유형의 치료와 조합하여 사용할 수 있고, 면역억제제, 예컨대, 칼시뉴린 억제제(예: 사이클로스포린 A, 타크로리무스 또는 FK506), 포유동물의 라파마이신 표적(mTOR) 억제제(시롤리무스 또는 라파마이신), 또는 항증식제(예: 마이코페놀레이트 모페틸, 메토트렉세이트), 흉선 조사, 광선요법, 멜팔란, 사이클로포스파미드 또는 ATG에 의한 T 세포의 생체내 고갈, 또는 GVHD의 발증을 방지하기 위한 항체(예: 항-CD3)에 의한 T 세포의 생체외 고갈을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 본 발명의 항체 및 약제학적 조성물은, GVHD의 치료로서 다른 유형의 치료와 조합하여 사용될 수 있고, 스테로이드(예: 프레드니손 및 메틸프레드니솔론), 체외 포스페레시스, 펜토스타틴, 키나제 억제제(예: 룰로시티닙, 이브루티닙), 프로테아좀 억제제(보르테조밉), NK 세포 또는 조절성 T 세포 또는 중간엽계 줄기 세포에 의한 세포 치료, 모노클로날 항체(예: 리툭시맙, 알렘투주맙, 토실리주맙 등) 또는 융합 단백질(예: 아바타셉트, 알레파셉트), T 세포 이동의 억제제(예: 마라비로크) 등에 의한 면역요법을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 항체를 투여하기 전에, 표적 세포의 표면 상의 CCR7 또는 기타 표적 단백질의 발현을 상향-조절하기 위해, 사이토카인으로 환자를 치료하는 것도 또한 유용할 수 있다. 사이토카인은 또한, 면역 효과기 기능을 모방하기 위해, 고갈 항체 또는 방사성 표지 항체의 투여와 동시에, 또는 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 GVHD의 치료 또는 예방을 위한 항-CCR7 항체의 사용은, 이식 전에, 골수파괴적, 비골수파괴적, 또는 강도 저하 컨디셔닝 치료를 포함하는 치료의 수용체에게 컨디셔닝 섭생의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 이들 치료법은, 주요 질환을 근절하고, 이식편 거부의 위험성 없이 공여체 줄기 세포가 골수로 귀소하는 것을 가능하게 하는 숙주 면역 시스템을 억제 및 근절한다. 골수파괴적 또는 강도 저하 또는 비-골수파괴적 치료의 투여는 혼합 조혈 키메라현상 또는 완전 조혈 키메라현상을 유발하기 위해 사용될 수 있다. 부설판 및/또는 사이클로포스파미드에 의한 전신 조사(TBI) 및/또는 화학요법 섭생은 골수파괴적 섭생의 예이다. 본원에 사용된 바와 같이, "비-골수파괴적"이란, 골수 세포를 사멸하지만, 상당한 수의 수용체에서 골수 부전에 의한 사멸을 유도하지 않는 치료를 지칭한다. 이에 의해, 공여체 줄기 세포는, 적어도 공여체/수용체의 혼합 키메라현상으로 생착할 수 있다. 숙주 조혈의 최종적 제거는, 면역 공여체 세포의 이식편 대 숙주 효과에 의해 달성되고, 이는 최종적으로 완전한 공여체 키메라현상을 초래한다. 저용량의 TBI, 플루다라빈, ATG, 부설판의 감량, 또는 이들의 조합은 비-골수파괴적 섭생으로서 사용된다. RIC 섭생은, 골수파괴적 섭생의 높은 독성을 방지하지만, 주요 질환의 충분한 조절과 이식편 거부를 방지하기에 충분한 면역 억제를 제공하는 중간적 접근법이다. 일반적 RIC 섭생에는 플루다라빈 및 멜팔란이 포함되지만, RIC 치료에는 기타 다수의 약제가 도입되어 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템, 예를 들면, 리포좀을 포함하는 조절 방출 제형 등, 신체로부터의 급속한 제거로부터 상기 화합물을 보호하는 담체를 사용하여 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등의 생분해성, 생체적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 표적화 리포좀을 포함하는 리포좀 현탁액도 또한, 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,522,811호, WO 제2010/095940호에 기재된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 항체(또는 단편)의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입에 의한 또는 국소적일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 동맥내, 림프내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질내 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내 형태가 바람직하다. "전신 투여"란, 경구, 정맥내, 복강내 및 근육내 투여를 의미한다. 물론, 치료 효과 또는 예방 효과에 필요한 항체의 양은, 선택된 항체, 치료 중의 상태의 성질 및 중증도, 및 환자에 따라 상이할 수 있다. 추가로, 항체는, 예를 들면, 항체의 용량을 감소시켜, 펄스 주입에 의해 적절하게 투여할 수 있다. 바람직하게는, 투여는, 투여가 단시간 또는 만성인지에 부분적으로 의존하여, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은, 적절한 단위 제형의 멸균 용액, 현탁액 또는 동결건조 제품 등의 비경구 투여에 적합한 형태일 수 있다. 주사가능한 사용에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 정맥내 투여의 경우, 적절한 담체는 식염수, 정균 물, CremophorEM(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충 생리식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 무균이어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 보관의 조건하에서 안정할 필요가 있고, 세균 및 진균 등의 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 이들의 적절한 혼합물 등의 약제학적으로 허용되는 폴리올을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴 등의 코팅의 사용, 분산의 경우에 필요한 입자 사이즈의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다. 미생물의 작용의 방지는, 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성할 수 있다. 다수의 경우, 등장제, 예를 들면, 당, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨 등의 다가 알콜을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다.
주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 발생할 수 있다.
멸균 주사액은, 필요에 따라, 상기 열거된 성분의 하나 또는 조합을 포함하는 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물(예를 들면, 폴리펩티드 또는 항체)를 도입시키고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 활성 화합물을, 기본적 분산매 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 기타 성분을 포함하는 멸균 비히클에 도입함으로써 제조할 수 있다. 무균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은, 진공 건조 및 동결 건조이고, 이는, 유효 성분의 분말에 추가하여, 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가 목적하는 성분을 수득할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은, 정맥내(IV) 또는 피하(SC)를 통해 투여된다. 증량제, 완충제 또는 계면활성제 등의 부형제를 사용할 수 있다. 언급된 제형은, 당해 기술분야에 공지되어 있고 문헌[참조: 예를 들면, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (Ed. Allen, L. V. 22nd edition, 2012, www.pharmpress.com)]을 포함하는 다양한 공급원에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 표준 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
투여를 용이하게 하고 투약량을 균일하게 하기 위해, 약제학적 조성물, 즉 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용되는 투약 단위 형태는, 치료되는 대상체의 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물(본 발명의 항체)를 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태의 명세는, 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 대상체의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 고유한 제한에 의해 결정되고 직접 의존한다.
일반적으로, 본 발명의 항체의 유효한 투여량은, 선택된 화합물의 상대적 유효성, 치료되는 장애의 중증도, 및 환자의 체중에 의존한다. 그러나, 활성 화합물은, 전형적으로 1일 1회 이상, 예를 들면, 1일 1, 2, 3 또는 4회 투여되고, 전형적 1일 총 투여량은 0.001 내지 1,000mg/kg 체중/일의 범위, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 100mg/kg 체중/1일, 가장 바람직하게는 약 0.05 내지 10mg/kg 체중/일의 용량으로 투여된다. 보다 구제적으로는, 본 발명에 따라 사용하기 위해, 항-CCR7 항체는 바람직하게는 1 내지 1000, 2 내지 500, 5 내지 200, 10 내지 100, 20 내지 50 또는 25 내지 35mg/kg 체중의 용량으로 투여되고, 바람직하게는 1, 2, 4, 7, 14 또는 28일마다의 용량으로 투여된다.
환자에 대한 항체의 투여와는 별도로, 본 출원은, 유전자 치료에 의한 항체의 투여를 고려한다. WO 제96/07321호는, 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 치료의 사용에 관한 것이다.
약제학적 조성물은, 투여 설명서와 함께, 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본 발명의 항체 및 약제학적 조성물은, 병용 요법을 제공하기 위해 다른 약물과 함께 사용될 수 있다. 다른 약물은 동일한 조성물의 일부를 형성할 수 있거나, 동시 또는 상이한 시간에 투여하기 위한 별개의 조성물로서 제공될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 수용체에 대한 이식을 위해 공여체로부터 기관, 조직 또는 세포 제제를 제조하기 위한 생체외 또는 시험관내 방법에 관한 것이다. 이 방법은 바람직하게는 하기 단계를 포함한다: a) 기관, 조직 또는 세포 제제를, 본원에 정의되는 항-CCR7 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 인큐베이팅하고, 이에 의해, 바람직하게는, 항-CCR7 항체는 기관, 조직 또는 세포 제제에서 CCR7 발현 공여체 세포의 i) 수의 감소 및 ii) 활성의 억제 중 적어도 하나에 영향을 미치는, 단계; 및 b) 임의로, 기관, 조직 또는 세포 제제로부터 항-CCR7 항체 및 CCR7 발현 공여체 세포 중 적어도 하나를 제거하는 단계. 바람직하게는, 항-CCR7 항체는, 공여체 기관, 조직 또는 세포 제제와 함께, 수의 감소 및/또는 CCR7 발현 공여체 세포의 활성을 억제하기에 충분한/효과적인 양 및 시간에서, GHVD의 발생 위험을 감소시키기에 및/또는 기관, 조직 또는 세포 제제의 수용체에서 GHVD의 중증도를 감소시키기에 충분한 정도까지 인큐베이팅된다. 예를 들면, 항-CCR7 항체는, 공여체 기관, 조직 또는 세포 모집단과 함께, 바람직하게는 활성의 적어도 40% 감소, 보다 바람직하게는 활성의 적어도 80% 감소, 및 가장 바람직하게는 활성의 적어도 90% 감소에 의해, 이식편에서 CCR7 발현 공여체 세포의 활성을 실질적으로 억제하기에 충분한/효과적인 양 및 시간 동안 인큐베이팅된다. 또는, 예를 들면, 항-CCR7 항체는, 공여체 기관, 조직 또는 세포 모집단과 함께, 수의 적어도 40% 감소, 보다 바람직하게는 수의 적어도 80% 감소, 및 가장 바람직하게는 수의 적어도 90% 감소에 의해, 이식편에서 CCR7 발현 공여체 세포의 수를 실질적으로 감소시키기에 충분한/효과적인 양 및 시간 동안 인큐베이팅된다. 이에 의해, 공여체 기관, 조직 또는 세포 제제 중의 CCR7 발현 공여체 세포는 바람직하게는 CCR7 발현 면역 세포이고, 보다 바람직하게는 T-림프구, B-림프구, NK 세포 또는 APC의 적어도 하나 이상을 포함하는 것으로 이해된다.
수용체로의 이식을 위해 공여체로부터 기관, 조직 또는 세포 제제를 제조하는 본 발명의 방법은, 바람직하게는, 시험관내 또는 생체외 환경에서 실시되는 방법이고, 이에 의해, 생체외는, 공여체 기관, 조직 또는 세포 제제가 항-CCR7 항체로 처리되고, 공여체의 신체에 항-CCR7 항체를 투여함으로써, 뇌사 공여체 또는 순환기 사멸에 의해 사망한 공여체의 체내에 여전히 존재하는 것을 배제하지 않는다.
시험관내 또는 생체외 환경과 관련되는 GVHD의 임상 치료 또는 예방에 관한 상기 모든 개시는 이러한 관행에 적용된다. 따라서, 항-CCR7 항체는 이식 전에 기관, 조직 또는 세포 제제를 보존하기 위해 사용되는 보존 용액에 포함될 수 있다. 예를 들면, 항-CCR7 항체는 기관의 면역 세포에 결합하여 이의 활성을 억제하기에 충분한 양으로, 기관 이식을 위한 보존 용액에 첨가될 수 있다. 또한, 항-CCR7 항체는, 기관의 면역 세포에 결합하여 이의 수를 감소시키기에 충분한 양으로, 기관 이식을 위한 보존 용액에 첨가될 수 있다. 이러한 보존 용액은, 심장, 신장, 간장 등의 상이한 종류의 기관, 및 이들로부터의 조직의 보존에 적합할 수 있다. 시판되는 보존 용액의 예는 Plegisol(Abbott)이고, 이의 기원과 관련하여 명명된 기타 보존 용액은 UW-용액(University of Wisconsin), 스탠포드 용액(Stanford solution), 수정 콜린 용액(Modified Collins solution)(J. Heart Transplant (1988) Vol. 7(6):456 4467)을 포함한다. 보존 용액은 또한, 종래의 공용매, 부형제, 안정제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 항-CCR7 항체를 포함하는 보존 용액 또는 완충액을 사용하여, 이식 또는 보존의 전에 장기 이식을 세척 또는 세정할 수 있다. 따라서, 이식되는 기관 또는 조직은 바람직하게는 이식의 전에 항-CCR7 항체를 포함하는 보존 용액으로 관류될 수 있다. 예를 들면, 항-CCR7 항체를 포함하는 보존 용액을 사용하여, 단리된 심장을 세척 관류하고, 이어서 보존 용액 중에서 4℃로 보존할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 실시는 이식 전에 기관 또는 조직 이식편을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 이식 전에, 항-CCR7 항체 또는 단편을 세척 완충제에 첨가하여, 활성 T 림프구, B 림프구, NK 세포 또는 APC의 이식을 제거할 수 있다.
보존 용액 또는 세척 완충액 중의 항-CCR7 항체 또는 단편의 농도는 이식의 종류에 따라 상이할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 인큐베이팅은, 예를 들면, 1분 내지 7일간 실시할 수 있다. 본 발명의 방법 및 용도에 따라, 기관, 조직 또는 세포 제제로부터의 항-CCR7 항체(예를 들면, 비결합된 항-CCR7 항체) 및 CCR7 발현 공여체 세포 중의 적어도 하나의 제거와 관련하여, 상기 단계를 실행하는 다수의 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 이식편으로부터 항체를 제거하는 한 가지 예시적 방법은 이식편을 세척하는 것이다. 세척은, 예를 들면, 이식편이 세포 현탁액을 포함하거나 세포 현탁액인 원심분리를 사용함으로써 발생할 수 있다. 또는, 항-CCR7 항체 및 CCR7 발현 공여체 세포는, 항-CCR7 항체 및 바람직하게는 이에 결합된 CCR7 발현 공여체 세포의 친화성 정제에 의해, 이식되는 세포 제제(예를 들면, 골수 세포, 말초혈 세포, 또는 제대혈 세포)로부터 제거될 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 정제에 사용되는 친화성 리간드는, 항-CCR7 항체에 대한 CCR7 발현 공여체 세포가 세포 제제로부터 동시 정제될 수 있도록, 항-CCR7 항체의 항원 결합 능력에 영향을 미치지 않는다. 친화성 정제의 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 친화성(컬럼) 크로마토그래피에서 사용되는, 자기 비드 또는 고상 담체 물질 등의 고상 담체 물질에 친화성-리간드를 고정화시키는 방법을 포함한다.
상기 인큐베이팅 단계에서 사용되는 항체의 양은 특별히 제한되지 않는다. 적절한 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 예를 들면, 사용되는 이식편의 종류에 따라 상이할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 상기 인큐베이팅은 0.1㎍ 내지 100mg의 항체 양으로 실시된다. 적절한 양의 항체의 선택은 충분히 당업자의 전문 지식의 범위 내이다. 일반적으로, 이식편이 조직 또는 기관을 포함하거나 조직 또는 기관인 경우, 각각 보다 높은 양 또는 농도의 항체가 바람직하다. 추가로, 사용되는 항체의 정확한 양 또는 농도의 선택은 각각 이러한 조직 또는 기관의 사이즈에도 의존할 것이다.
본 문서 및 이의 특허청구범위에서, 동사 "포함하다" 및 이의 활용은 그 단어에 후속하는 항목이 포함되거나, 특히 언급되지 않은 항목이 제외되지 않는 것을 의미하는 비한정적 의미로 사용된다. 또한, 부정관사 단수형("a" 또는 "an")에 의한 요소에 대한 언급은, 문맥이 요소의 1개만이 존재하는 것을 명확히 요구하지 않는 한, 요소가 복수 존재할 가능성을 배제하는 것은 아니다. 따라서, 부정관사 ㄷ단수형("a" 또는 "an")은 통상 "적어도 하나"를 의미한다.
수치(예를 들면, 약 10)와 관련하여 사용되는 경우의 단어 "약" 또는 "대략"은 바람직하게는 값이 0.1% 많거나 적은 소정 값(10의)일 수 있음을 의미한다.
본원에서 인용되는 모든 특허 및 문헌의 참조문헌은 참조에 의해 그 전체가 본원에 포함된다.
본 발명은, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되지 않는 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
도 1. 항-CCR7 항체는 GVHD 발증의 예방에 효과적이다.
A) 3개의 시험 그룹에서 상대적 체중 감소. 마우스를 PBS로 치료한 대조군(n=4), 마우스를 무관계 항체로 치료한 이소형 대조군(IC) 그룹(n=5), 및 마우스를 CCR7을 표적화하는 항체로 치료한 항CCR7 그룹(n=5). 0일차의 체중은 100%로 간주했다. P 값은, 항-CCR7 그룹과 다른 그룹의 비교 분석을 나타낸다.
B) 모든 실험 그룹의 카플란-마이어 생존 곡선.
C) 각 실험 그룹으로부터 수득된 말초혈(PB)의 연속 샘플에서 발견된 인간 CD45+ 세포의 백분율.
D) 동물을 안락사시킬 때에 수집된 림프 조직(골수 및 비장)에서 발견된 인간 CD45+ 세포의 백분율.
도 2. 항-CCR7 항체는 초기 단계에서 GVHD 치료에 효과적이다.
A) 실험 그룹의 상대적 체중 감소. 마우스를 무관계 항체로 치료한 이소형 대조군(IC) 그룹(n=5), 및 마우스를 CCR7을 표적화하는 항체로 치료한 항-CCR7 그룹(n=5). 0일차의 체중은 100%로 간주했다. P 값은 항-CCR7 그룹과 다른 그룹의 비교 분석을 나타낸다.
B) 각 실험 그룹의 카플란-마이어 생존 곡선.
C) 각 실험 그룹으로부터 수득된 말초혈(PB)의 연속 샘플에서 발견된 인간 CD45+ 세포의 백분율.
D) 동물을 안락사시킬 때에 수집된 림프 조직(골수 및 비장)에서 발견되는 인간 CD45+ 세포의 백분율.
도 3. 항-CCR7 항체는 초기 및 후기의 GVHD의 치료에 효과적이다.
A) 실험 그룹의 상대적 체중 감소. +3일차(n=1), +7일차(n=2), 또는 +10일차(n=1)에 마우스를 최초로 무관계 항체로 치료한 이소형 대조군(IC) 그룹. +7일차(n=5), 또는 +10일차(n=5)에 마우스를 최초로 CCR7을 표적화하는 항체로 치료한 항-CCR7 그룹(n=5). 0일차의 체중은 100%로 간주했다. P 값은 항-CCR7 그룹과 다른 그룹의 비교 분석을 나타낸다.
B) 각 실험 그룹의 카플란-마이어 생존 곡선. 각 IC 그룹으로부터 모든 동물은 1개의 단일 그룹으로 그룹화했다.
도 4. 항-CCR7 mAb의 선택. CCR7을 표적화하는 몇몇 시판의 항체 클론은, CCL19 및 CCL21로의 CCR7-매개된 이동을 차단하는 능력(A), 및 보체(CDC)에 의해 매개된 표적 세포의 사멸을 유도하는 능력(B)에 기초하여 특성화했다. 이동(입력의 %, 기저, CK, 150503 및 2H4에서 n=2; 6B3, 3D12, H60에서 n=1) 및 CDC(% 특이적 용해, n=2) 모두를 재료 및 방법 섹션에 설명된 절차를 따라 CCR7 발현 만성 림프구성 백혈병 세포에서 테스트했다. 막대는 평균±SD를 나타낸다. 이러한 결과에 기초하여, 클론 150503은, GVHD에서 시험관내 및 생체내 개념의 증명을 실행하기 위해 선택되었다.
도 5. 중화 항-CCR7 항체의 작용 메카니즘.
A) CCR7을 차단하면, 성분채집술로부터의 TN 및 TCM 세포의 표적-매개 세포 이동이 중화된다. CD4+ 및 CD8+ T-세포 서브세트에 대해, 이동하는 입력 세포 %의 감소로서 나타내는, CCR7-리간드 상호작용에 대한 특정 길항작용이 제시되어 있다. 두 경우에, 성분채집술로부터 단리된 혈청-고갈 PBMC(n=3)은 10㎍/ml의 항-CCR7 또는 각각의 이소형 대조군(IC)과 30분 동안 사전-인큐베이팅했다. 이어서, 1㎍/ml의 CCL19 또는 CCL21에 의해 유발된 주화성을, 누드 트랜스웰 챔버에서 검정했다(4시간). 기본 이동은, 주화성 자극이 없는 자발적 이동을 나타낸다. 하부 챔버로 이동한 세포를 염색하고, 유세포 분석에 의해 계수했다. 이동된 세포의 백분율(% 입력)은 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 계산했다.
B) 항-CCR7 mAb는, TN 및 TCM을 특이적으로 고갈시킨다. 보체 활성화(CDC)에 의해 매개되는 특이적 용해의 %로서 표시되는 CCR7 양성 세포의 특이적 고갈은, CD4+ 및 CD8+ T-세포 서브세트에 대해 제시되어 있다. 두 경우에, 성분채집술의 표적 세포(n=3)를 10㎍/ml의 항-CCR7 또는 각각의 이소형 대조군(IC)과 30분 동안 인큐베이팅하고, 래빗 보체에 1.5시간 동안 노출시켰다. 세포 용해는, 유세포 분석에 의해 각 서브세트로의 7-AAD 도입의 정량화에 의해 결정되었다. 특이적 용해의 백분율은, 재료 및 방법에 제시되어 있는 식에 따라 계산했다. 막대는 평균±SD를 나타낸다. ns, 유의하지 않음; *, p<0.05; **, p<0.01; *** p<0.001.
도 6. 성분채집술에서 주입된 CCR7+ T-세포 아집단의 비율은 CMV 또는 재발율과는 상관하지 않는다.
A-B) 이식후 최초의 6개월 이내의 수용체의 CMV 감염 상태를 비교한 성분채집술에서 주입된 CCR7+ T-세포 아집단의 비율. 성분채집술 샘플은 유세포 분석에 의해 분석하고, 이식후에 CMV DNA를 나타내는 환자(n=60) 및 나타내지 않는 환자(n=43)에 주입된 샘플로 분할했다. CMV의 유무에 따라 환자에 주입된 CD4+ CCR7+(A) 및 CD8+ CCR7+(B) 아집단의 백분율이 제시되어 있다. CMV의 재활성화를 결정하기 위해, 57 카피/ml를 초과하는 바이러스 양의 컷-오프 값을 사용했다.
C-D) 재발성 질환의 유무에 따라 환자를 비교하는 성분채집술에서 주입된 CCR7+ T-세포 아집단의 비율. 성분채집술 샘플은 유세포 분석에 의해 분석하고, 이식후에 재발된 환자(n=25) 및 재발되지 않은 환자(n=78)에 주입된 샘플로 분할했다. 재발성 질환의 유무에 따라 환자에 주입된 CD4+ CCR7+(C) 및 CD8+ CCR7+(D) 아집단의 백분율이 제시되어 있다.
도 7. 성분채집술에서 주입된 CCR7+ T-세포 아집단의 비율은 재발성 질환과는 상관하지 않는다. 성분채집술 샘플은 유세포 분석에 의해 분석하고, 이식후에 재발된 환자(예) 및 재발되지 않은 환자(아니오)에 주입된 샘플로 분할했다.
재발성 질환의 유무에 따라 환자를 비교하는 성분채집술에서 CCR7+ T-세포(CD4+ 또는 CD8+) 아집단의 비율은 하기를 포함하는 상이한 혈액 장애에 대해 제시되어 있다:
A) 골수이형성 증후군(MDS); "예" ns CD4+ p = 0.4199; CD8+ p = 0.2117;
B) 급성 림프구성 백혈병(ALL); "예" ns CD4+ p = 0.5758; CD8+ p = 0.1908;
C) 급성 골수성 백혈병(AML); "예" ns CD4+ p = 0.1638; CD8+ p = 0.4126;
D) 호지킨 림프종(HD); "예" ns CD4+ p = 0.5106; CD8+ p = 0.8873;
E) 비-호지킨 림프종(NHL); "예" ns CD4+ p = 0.9926; CD8+ p = 0.7369;
F) 다발성 골수종(MM).
실시예
실시예 1: GVHD를 치료하기 위한 도구로서의 CCR7에 대한 항체
재료 및 방법
샘플, 시약 및 유세포 분석(FCM)
건강한 지원자로부터의 말초혈 샘플은, 사전 동의 후에 수득되었다. 이어서, CCR7 발현의 분석을 정상 T 및 B 림프구에서 실시했다. 피코에리트린(PE) 접합 마우스 항-인간 CCR7은 R&D 시스템(McKinley Place, MN)으로부터 구입했다. 모든 경우에서, 적절한 이소형 대조군(IC)가 포함되었다. 면역형광 염색은, DIVA 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 FACS CANTO II 유세포 분석으로 분석했다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)는 피콜 구배 원심분리(Histopaque-1077, Sigma-Aldrich, Madrid, Spain)에 의해 단리했다.
GVHD의 이종 마우스 모델
GVHD 생체내 모델은 NOD/SCID-IL2Rγnull 마우스에서 개발했다. 이 목적을 위해, 모든 모델에서 동물에게 2Gy를 아치사량적(sub-lethally)으로 조사(irradiating)하고, 4시간 후, 건강한 지원자로부터의 8×106 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)(200μL의 PBS 중)을 각 조사 마우스에게 정맥내 접종했다. 6 내지 10주령의 수컷 및 암컷 마우스 둘 다를 생체내의 개념 실증에 사용했다. 실험은, 스페인의 법률과 CBMSO 윤리위원회의 가이드라인에 따라 센트로 드 바이올로지아 몰큘러 세베로 오초아(Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa; CBMSO)의 동물 시설에서 실시했다.
마우스에서 평가된 임상 파라미터는, 체중 감소, 구부린 자세(후만증), 피부의 변화, 뒷다리 마비(또는 운동성 저하), 및 빈호흡이 포함되었다. 말초혈(PB)의 침윤을 연구하기 위해, 실험 동안 상이한 시간에 혈액 샘플을 수집했다. 다양한 조직으로의 침윤을 분석하기 위해, 마우스를 안락사키기고, 비장 및 골수(BM)을 포함하는 기관/조직을 수집하여 분해(disaggregating)했다. 두 경우에서, 세포를 인간 특이적 항-CD45 FITC-mAb(Clone HI30, BD Biosciences, www.bdbiosciences.com)로 표지하고, 유세포 분석에 의해 분석했다.
마우스에서 항-CCR7 항체의 예방적 사용
공여체 세포에서 CCR7을 차단하는 유효성을 평가하기 위해, 예방적 설정으로 마우스를 사용했다. 이 목적을 위해, 마우스를 최초로 정제된 뮤린 항-인간-CCR7 mAb(n=5 마우스; 클론 150503, 이소형 IgG2a, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 또는 무관계 이소형 대조군(IC) 항체(n=5 마우스; IgG2a, Biolegent, San Diego, CA, USA) 또는 PBS(n=4 마우스)로 처리했다. 항-CCR7 mAb 및 IC 둘 다는 약 10mg/kg(약 200㎍/마우스)로 복강내 주사했다. 2시간 후, 각 동물에게 1인의 건강한 공여체로부터의 PBMC를 접종했다. 동물은, 4일마다 추가로 4회의 항-CCR7, IC 또는 PBS를 제공했다. PB 샘플은 이식후 10일차, +13일차, +18일차, +21일차에 분석했다. 동물을 안락사시킨 후, BM 및 비장을 분석했다.
GVHD 피크 동안 항-CCR7 항체의 치료적 사용
항-CCR7 mAb의 치료 효과를 연구하기 위해, 항-CCR7 mAb가 PB에서 발견된 동종 반응성 모집단에 영향을 미쳤는지, 또는 이 접근법이 GVHD 증상을 경감시켰는지를 평가하기 위한 모델이 개발되었다. 이 모델에서, PBMC 보유 마우스는, 생착후 +5일차에, 항-CCR7(n=5) 또는 상응하는 IC(n=5)로 약 10mg/kg(약 200㎍/마우스)로 먼저 치료되었다. 치료는 3일마다 반복했다. PB 샘플링은 이식후 +10, +13, +18, +25일차에 실시했다. 동물을 안락사시켰을 때에 비장 및 BM의 샘플링을 수행했다. 실험은 PBMC의 생착으로부터 33일 후에 종료했다.
또 다른 모델을 사용하여, 동종 반응성 피크 중 또는 피크 후의 상이한 시점에서 항-CCR7을 사용한 것의 유효성을 평가했다. 이 목적을 위해, 항-CCR7(n=15) 또는 IC(n=5)로 치료한 20마리 인간 PBMC-보유 마우스. 항-CCR7 치료 그룹에서는, 5마리의 마우스가 +3일차에 최초 투여를 제공받았고; 5마리 마우스가 +7일차에 최초 투여를 제공받았고; 5마리의 마우스가 +10일차에 최초 투여를 제공받았다. IC 치료 그룹에서는, 2마리의 마우스가 최초로 +3일차에 치료되었고; 생착후 +7일차에 2마리의 마우스 및 +10일차에 1마리의 마우스가 치료되었다. 실험은 +26일에서 종료되었다.
CCR7-의존성 세포내 신호전달의 억제를 결정하기 위한 검정
챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 과발현하는 인간 CCR7에서 CCL19 및/또는 CCL21-매개 세포내 신호전달을 억제하는 항-CCR7 항체의 능력은, 확립된 표준 β-아레스틴 동원 검정(β-arrestin recruitment assay)[참조: PathHunterTM, DiscoverX, Fremont, CA, USA; Southern et al., 2013, J Biomol Screen. 18(5):599-609]에 의해 결정했다.
세포 이동의 억제를 결정하기 위한 검정
리간드 CCL19 및 CCL21에 의해 유도된 인간 CCR7 수용체를 내인적으로 발현하는 인간 T 세포 림프종 세포의 이동(주화성)을 억제하는 항-CCR7 항체의 능력을 세포 이동 검정에서 결정했다.
세포 이동 검정은, 8㎛의 기공 크기의 삽입체를 갖는 트랜스웰 이중 챔버(Costar, Cambridge, MA, USA)를 사용하여 실시했다. 하부 챔버에는, 0.5% BSA가 보충된 HamF12 배지에서 희석한 리간드(CCL19 또는 CCL21)가 포함되었다. 항-CCL7 모노클로날 항체로 사전-인큐베이팅한 CCR7 내인성 발현 세포(T-세포 림프종(UuT-78))을 삽입체에 배치하고, 챔버 어셈블리를 37℃에서 인큐베이팅했다. 하부 챔버 내의 막관통 이동 세포의 양은, 세포 용해 후, DNA 염색(Cyquant GR 염료 용액, Life Technologies Ltd, UK)에 의해 결정했다.
보체-의존성 세포독성(CDC)에 대한 검정
CDC 분석은 쿠에스타-마토에스 등[참조: Cuesta-Mateos et al (Cancer Immunol Immunother. 2015, 64: 665-76]에 기재된 바와 같이 실시했다. 간단히 설명하면, 2×105개의 PBMC 표적 세포를, 제시된 농도의 정제된 항-CCR7, 알렘투주맙(항-CD52) 또는 IC 항체와 함께 96 웰 환저 플레이트에 파종했다. 37℃에서 30분 후, 세포를 세척하고, 사전의 열불활성화(56℃, 30분)의 유무에 따라 25% 래빗 보체(Serotec, Oxford, UK)를 포함하는 완전 RPMI 1640 배지를 첨가했다. 1.5시간 후, 세포를 항-CD19-FITC, 항-CD3-PE, 및 항-CD5-APC mAb로 염색하여, CLL 세포 및 T 세포 모집단을 구별했다. 7-AAD를 생존율 배제 염료로서 사용했다. 특이적 용해의 백분율(% SL)은, 식: 100×(활성화된 보체를 갖는 사멸 세포 % - 불활성화된 보체를 갖는 사멸 세포 %)/(100 - 불활성화된 보체를 갖는 사멸 세포 % )로 계산했다.
작용 효과의 부재를 결정하기 위한 검정
고농도(267nM)에서 테스트한 경우, 확립된 표준 β-아레스틴 동원 검정(PathHunterTM, DiscoverX, Fremont, CA, USA; Southern et al., 2013, J Biomol Screen. 18(5):599-609)을 사용하여, 항-인간 CCR7 결합 모노클로날 항체를 인간 CCR7 과발현 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 유도된 검출가능한 세포내 작용 효과(의 부재)에 대해 테스트했다(데이터는 제시되지 않음). 무관계 IgG2a를 음성 대조군으로 사용하고, CCR7의 천연 리간드인 CCL21을 양성 대조군으로 사용했다. 항-인간 CCR7 결합 항체는, 항체가 음성 대조군보다도 많은 세포내 작용 효과를 유발하지 않는 경우, 검출가능한 세포내 작용 효과를 결여하는 것으로 밝혀졌다.
비아코어 친화성 측정
모노클로날 항체의 친화성은, 표준 조건하에서의 비아코어 측정에 의해 결정했다. 모노클로날 항체는 적절한 센서 표면에 고정시키고, 인간 CCR7의 N-말단으로부터 유래하는 잔기 19-49를 포함하는 설페이트화 항원 SYM1899 ((pyroGlu)DEVTDDZIGDNTTVDZTLFESLCSKKDVRNK; 서열번호 3); 여기서 Z는 설페이트화 티로신을 나타낸다)은 센서 표면을 통과했다.
결과
항-CCR7의 예방적 투여는 GVHD의 발증을 차단한다.
hPBMC의 생착 전에 항-CCR7의 최초의 예방 용량을 투여하고 생착 후에 4회 연속하여 투여한 마우스는 GVHD의 임상 징후를 발증하지 않았다. 대조적으로, IC 또는 PBS를 투여한 마우스는 체중 감소를 포함하는 임상적 징후를 나타냈다(도 1A). 이식후 +9일차 및 +12일차의 사이에 체중 차이가 관찰되었다(IC 대 항-CCR7, p=0.045; 및 PBS 대 항-CCR7, p=0.0134). 특히, 항-CCR7을 투여한 동물은 실험 전체에서 체중이 증가했다. 따라서, 항-CCR7 항체는 전체 생존 기간을 연장시켰다(도 1B). 항-CCR7 mAb로 치료된 동물은 임상 증상을 발증하지 않았고, 동물이 희생되는 시점인 32일까지 생존했으며, 이는 진정한 무병 기간(bona fide disease-free period)으로 간주되었다. 대조적으로, 중증 임상 징후를 나타내는 대조군 마우스는 +11, +13, +14 및 +18일차에 안락사시켰다. +13, +14 및 +18일차에, 기관 침윤의 비교 분석을 수행하기 위해, 항-CCR7 치료 그룹의 1마리 동물을 희생시켰다. 항-CCR7 항체를 투여한 동물은 어느 것도 임상 증상을 나타내지 않았고, 순수하게 실험 목적으로 희생시켰다. 따라서, 이들 일자 동안, 항-CCR7 치료 마우스는 임상 징후를 발증하지 않았고, 체중이 증가했고, 따라서, 항-CCR7 치료 마우스로부터의 PB에서 반응성 공여체 세포의 존재는 검출되지 않았다(도 1C). 대조적으로, 대조군의 PB에서 프로-GVHD 세포의 존재는 시간에 걸쳐 증가했다. 희생 시점에서, 침윤은 BM 및 비장에서 분석했다(도 1D). PB의 소견과 일치하여, 항-CCR7 mAb로 치료한 동물의 림프구 조직에서 프로-GVHD 조직은 발견되지 않았다. 역으로, 대조군에서는 이들 조직에 일정한 침윤이 있었다(BM 대조군 대 BM 항-CCR7: 34.6% 대 0.57%, p=0.002; BM IC 대 BM 항-CCR7: 41.7% 대 0.57%, p=0.003/비장 대조군 대 비장 항-CCR7: 70.1% 대 0.17%, p≤0.001; 비장 IC 대 비장 항-CCR7 71.3% 대 0.17%, p≤0.001). 대조군 사이에서 차이는 관찰되지 않았다(PBS 대 IC: BM, p=0.57/비장, p=0.86).
항-CCR7의 치료적 투여는 GVHD를 개선한다
생체내에서의 항-CCR7 항체의 치료 효과를 실증하기 위해, 동종 반응성 반응이 발현된 후에 동물을 치료한 모델을 사용했다. +3 내지 +5일에 발생된 이들 반응은 GVHD 병원성의 주요 원인이다. 즉, 하나의 모델에서, 인간 PBMC가 면역-결핍 마우스에 이식되었다. 동물은, IC(n=5) 또는 항-CCR7 항체(n=5)의 어느 하나로 치료되었다. 항체의 초회 투여는 +5일차에 투여되었고, 연속 투여는 2일마다 수행되었다. 이 모델에서는, 항-CCR7 항체가 동물의 체중에 플러스의 영향을 미쳤다(도 2A). 대조적으로, 대조군 동물은 체중이 감소했다. 차이는 +12일에 최초로 관찰되었다. 추가로, 항-CCR7 요법은 전체 생존 기간을 연장시켰다(도 2B).
항-CCR7 mAb로 치료된 동물은 임상적 징후를 나타내지 않았고, 동물이 희생되는 시점인 33일까지 생존했으며, 이는 진정한 무병 기간으로 간주되었다. 대조적으로, 중증의 임상 징후를 나타내는 대조군 마우스는 +12, +20 및 +28일에 안락사시켰다. +12일차 및 +28일차에, 기관 침윤의 비교 분석을 수행하기 위해, 항-CCR7 치료 그룹의 1마리 동물을 희생시켰다. 항-CCR7 항체를 투여한 이들 동물은 어느 것도 임상적 징후를 나타내지 않았고, 희생은 실험 목적이었다. 따라서, 이들 일자 동안, 항-CCR7 치료 마우스는 임상 징후를 나타내지 않고, 체중이 증가했고, 따라서, 항-CCR7 치료 마우스로부터의 PB에서 반응성 공여체 세포의 존재는 검출되지 않았다(도 2C). 대조적으로, 대조군의 PB에서 프로-GVHD 세포의 존재는 시간에 따라 증가했다. 특히, PB 침윤의 유의차는 +10일차로부터 관찰되었다(대조군 대 항-CCR7 그룹: 12.6% 대 2.6%; p=0.01). 이들 차이는 +12일차에 증가했고, 실험이 종료할 때까지 상이했다(47.3% 대 6.5%; p<0.001)(도 2C). 희생 시점에서, 침윤은 BM 및 비장에서 분석했다(도 2D). PB의 소견과 일치하여, 항-CCR7 mAb로 치료한 동물의 림프구 조직(BM 및 비장)에서 프로-GVHD 세포의 작은 비율이 관찰되었다(도 2D). 역으로, 대조군에서는 이들 조직의 일정한 침윤이 있었다(BM 대조군 대 BM 항-CCR7: 27.3% 대 3.5%; p=0.005/비장 대조군 대 비장 항-CCR7: 59.2% 대 8.4%; p=0.006).
또 다른 모델에서는, 질환의 발증 후의 상이한 시점에서 GVHD의 치료에서 항-CCR7 항체의 유효성을 평가하는 것을 목적으로 했다. 이 목적을 위해, 항-CCR7 항체는 생착 후의 상이한 시점에서 투여했다. 동물은 공여체 PBMC의 생착후 +3, +7 및 +10일에 치료되었다. 15마리의 마우스를 항-CCR7 항체로 치료하고(+3일차에 5마리; +7일차에 5마리; +10일차에 5마리), 5마리의 마우스를 IC로 치료했다(+3일차에 2마리; +7일차에 2마리; 따라서 +10일차에 1마리). 모든 마우스는 실험이 종료하는 때까지 2일마다 연속 투여를 제공받았다. +3일차에 항-CCR7 항체의 초회 투여를 제공받은 마우스는, 체중의 증가 및 전체 생존 기간의 연장을 나타냈다(도 3A 및 3B). 항-CCR7 mAb로 치료된 동물은 임상적 징후를 나타내지 않고, 26일까지 생존했고, 이 시점에 희생되었으며, 이는 진정한 무병 기간으로 간주되었다. 대조적으로, 대조군 마우스는 전체 생존 기간의 중앙치가 14일이었다. 특히, +7일 또는 +10일 이전에 항-CCR7 항체로 치료된 동물은 치료가 +3일에서 개시된 마우스보다 최악의 결과를 나타냈다. 그러나, 치료가 +7일 또는 10일에서만 개시된 동물은 여전히 각각의 대조군보다 양호한 결과를 나타냈다. +7일 또는 +10일에 초회 투여를 제공받은 일부 동물은 +19일까지 생존하였지만, 각각의 대조군 동물은 +12일 이상 생존하지 못했다.
항-CCR7 항체는 CCL19 및 CCL21에 대한 인간 T N 및 T CM 세포의 시험관내 주화성을 손상시킨다.
이들 결과는, 적절한 이식편을 선택하기 위한 바이오마커가 아니라, 항체 기반 치료를 위한 표적가능한 수용체로서의 CCR7의 유용성을 평가하도록 유도했다. 이를 위해, CCR7-리간드 상호작용을 차단하고, CDC 또는 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 통해 표적 세포를 사멸시키는 능력을 특징으로 하는 항체를 선택하고 사용했다(도 4).
이어서, 먼저, 선택된 mAb가 성분채집술로부터 hPBMC의 리간드 유도 주화성을 억제하는 능력을 평가했다. 예상된 바와 같이, PBMC를 IC와 함께 인큐베이팅하는 경우, 배지에 CCL19 또는 CCL21을 첨가하면, CCR7+ TN 및 TCM 서브세트의 이동이 유발되었고(도 5A), TN 구획에서 보다 현저한 효과가 있었다. 그러나, 10㎍/ml의 항-CCR7 mAb의 결합에 의해, 이들 세포의 기저 수준으로의 이동이 감소했다. 역으로, TEM 및 TEMRA는 CCR7 리간드에 반응하여 이동하지 않았고, 따라서 항-CCR7은 이들 거동에 영향을 미치지 않았다.
항-CCR7 항체는 CDC를 통해 CCR7 + 인간 T N 및 T CM 세포를 특이적으로 고갈시킨다
이전에 서술된 바와 같이[참조: Cuesta-Mateos C. Targeting CCR7 in T-cell Prolymphocytic Leukemia. CONTROL-T: International Conference April 2016 Mature T-cell lymphomas - molecular pathology, modeling of cellular dynamics, and therapeutic approaches. 2016], 선택된 항체는 CDC를 통해 종양 T-세포를 사멸시키기에 충분한 강도였지만, 건강한 CCR7+ T-세포 서브세트에 대한 이의 영향은 이전에 해소되지 않았다. 따라서, 성분채집술로부터의 신선한 hPBMC를 사용하여 시험관내 CDC 검정을 실시했다. CD4+ TN 또는 TCM 세포에 결합하면, 10㎍/ml의 항-CCR7가 강력한 CDC 활성을 매개했다(도 5B). CD8+ TN 세포에서도 동일한 결과가 관찰되었다. 역으로, 항-CCR7 mAb는 CCR7-음성 TEM 및 TEMRA를 면하게 하고, 이는 항-CCR7 요법이 효과기 세포를 유지하고, 그 결과, 병원체에 대한 보호 및 GVL 효과를 유지하는 것을 나타낸다. 이 고찰을 추가로 탐구하기 위해, 이식편의 CCR7+ 세포의 수가 이식후 최초 6개월 이내의 CMV 재활성화와 상관하는지를 연구했지만, CMV 재활성화가 존재하는 환자 또는 부재하는 환자 사이에서, CD4+CCR7+ 또는 CD8+CCR7+ 세포의 비율(도 6A 및 6B) 또는 절대 수(데이터는 제시되지 않음)에 명확한 차이는 발견되지 않았다. 추가로, 다변량 로지스틱 회귀 분석(표 1)에 의해, 이식편 내의 CCR7+ 세포의 비율이 CMV 재활성화의 위험 인자에서는 없는 것이 확인되었다.
다변량 분석
OR p-값a 95% CI
CMV 재활성화 (예/아니오)CD4+CCR7+ (%) 0.95 0.144 0.889-1.0173
CMV 재활성화 (예/아니오)CD8+CCR7+ (%) 0.88 0.092 0.772-1.019
재발된 질환 (예/아니오)CD4+CCR7+ (%) 1.01 0.702 0.942-1.092
재발된 질환 (예/아니오)CD8+CCR7+ (%) 0.92 0.362 0.779-1.095
약어: CMV, 사이토메갈로바이러스; CI, 신뢰 구간; OR, 오즈 비율; a 유의한 교락 변수에 의해 조정됨.
[CD4+ (p=0.144); CD8+ (p=0.092)]. 유사하게는, 이식편 중의 CCR7+ 세포의 비율 또는 절대 수는 이식 후의 재발된 질환의 비율과 상관하지 않았고, 또한, 재발된 환자와 그렇지 않은 환자와의 사이에 명확한 차이는 발견되지 않았다(도 6C 및 6D 및 데이터는 제시되지 않음). 따라서, 다변량 로지스틱 회귀 분석(표 1)에 의해, 이식편 내의 CCR7+ 세포의 비율이 재발된 질환의 위험 인자가 아닌 것으로 확인되었다[CD4+ (p=0.702); CD8+ (p=0.362)]. 최후로, 기저 질환의 진단에 따라 환자를 그룹화한 경우, 이식편 중의 CCR7+ 세포의 비율과 재발 빈도와의 사이에 관련성이 없는 것이 추가로 확인되었다(도 7). 이와 더불어, 이들 결과는, CMV 감염 또는 재발된 질환을 예측하기 위한 바이오마커로서의 CCR7(성분채집술 중)의 사용을 배제하지만, 부가물(add-on) 판독으로서, 이식편 내의 CCR7+ 세포의 비율을 감소시키는 것을 목적으로 하는 접근법은 감염의 위험 및 재발 빈도의 상승과는 관련이 없다는 것을 시사했다.
항-CCR7 mAb는 작용 효과 없이 CCR7 신호전달을 차단한다.
고농도(267nM)에서 테스트한 경우, 서열번호 1 및 2의 HVR을 갖는 모노클로날 항체는, 확립된 표준 B-아레스틴 동원 검정[참조: PathHunter™, Disco verX, Fremont, CA, USA; Southern et al, 2013, J Biomol Screen. 18(5):599-609]에 의해 결정된 바와 같이, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 과발현하는 인간 CCR7에서 검출가능한 작용 효과를 나타내지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
토론
GVHD는, 치명적일 수 있는 동종이계 이식 후에 발생하는 빈번한 합병증이다. 최근, 공여체 세포에서의 CCR7의 발현이 높을수록, 수용체의 이차 림프 기관(SLO)의 침윤의 등급이 높아지고, 동종이계 면역 반응을 유도할 수 있는 동종 항원을 발견할 가능성이 높아지는 것으로 입증되었다. 본 발명자들로부터의 이전의 데이터는, SLO로의 이동이 CCR7에 의존하고, CCR7 리간드로의 이동과 GVHD의 발증 및 등급과의 관련이 확립되어 있는 것을 입증했다[참조: Portero-Sainz,I et al., Bone Marrow Transplantation (2017), 1-8]. 유사하게는, 다른 출판물은, 나이브 T 세포 및 TCM이 aGVHD와 cGVHD 둘 다의 발증에서 주요한 플레이어인 것을 제안했지만[참조: Yakoub-Agha, I., et al., Leukemia, 2006. 20(9): p. 1557-65; Distler, E., et al., Haematologica, 2011. 96(7): p. 1024-32; Cherel, M., et al., Eur J Haematol, 2014. 92(6): p.491-6.], 나이브 T 세포는 TCM보다 수용체 항원에 대하여 반응하는 능력이 높다. 이들 데이터는, 나이브 T 세포 TMC 및 몇몇 APC에서의 고밀도 뿐만 아니라, 또한 질환의 진행 및 병원성에서 이의 중요한 역할 때문에, 면역요법의 치료 표적으로서 CCR7을 사용할 가능성을 시사한다. 이러한 의미에서, NHP에 대한 항-CCR7 항체의 투여가 나이브 T 세포 및 TCM 세포의 선택적 감소를 유도했음을 생체내에서 실증했다(데이터는 제시되지 않음). 더욱이, 항-CCR7 항체는, CCR7을 발현하는 T 세포의 CCR7 리간드로의 이동을 차단하기 위해 효과적인 것으로 밝혀졌다(데이터는 제시되지 않음). 마지막으로, 항-CCR7 항체는, 시험관내 마우스 모델에서 실증된 바와 같이, GVHD의 예방 및 치료에 효과적이다. 특히, 가장 유효한 치료 접근법은, +3 내지 +5일차에 항-CCR7 항체를 투여하는 것이고, 따라서 HSCT의 동종 반응성을 방지하기 위해 사이클로포스파미드가 사용되는 치료 윈도우를 반영한다[참조: Luznik, L., et al., Biol Blood Marrow Transplant, 2002. 8(3): p. 131-8]. 요컨대, 항-CCR7 항체의 전임상 사용의 결과는, SLO로의 CCR7 발현 세포(나이브 T 세포 및 TCM을 포함)의 고갈 및/또는 중화 이동이 GVHD를 예방 및/또는 치료하기 위한 합리적 접근법인 것을 확인한다. 따라서, CCR7 발현 세포를 고갈시킴으로써 및/또는 SLO로의 이동을 차단함으로써, 동종 반응성 CCR7 발현 세포는 활성화되지 않을 것이고, GVHD의 발증을 손상시킬 것이다.
따라서, 문헌[참조: Sasaki et al. (2003, J Immunol, 170(1): p. 588-96.]은, CCL21 길항제의 조기 사용이 림프절로의 공여체 T 세포의 침입, 따라서 GVHD의 발증을 방지했다. 듀트 등(Dutt et al.)은 나이브 CD62L 세포의 고갈이 전임상 생체내 모델에서 GVHD의 발병을 지연시키고 OS를 연장시켰음을 밝혀냈다[참조: Dutt, S., et al., Blood, 2005.106(12): p. 4009-15]. 유사하게는, 임상 현장에서는, 성분채집술로부터 CD45RA-발현 나이브 T 세포의 고갈이 GVHD의 발생율 및 발증에 영향을 미쳤다[참조: Touzot, F., et al., J Allergy Clin Immunol, 2015.135(5): p. 1303-9 e1-3.; Shook, D.R., et al., Pediatr Blood Cancer, 2015. 62(4): p.666-73; Triplett, B.M., et al., Bone Marrow Transplant,2015. 50(7): p. 1012.]. 그러나, 이들 모든 연구에서, 항-CCR7 요법과는 대조적으로, TCM 세포는 표적화되지 않는다. 결론적으로, 최근의 증거는, 감염에 대한 면역이 CCR7+ 세포에 의존하지 않는다고 말할 수 있고[참조: Choufi, B., et al., Bone Marrow Transplant, 2014. 49(5): p. 611-5.], 따라서 CCR7 발현 세포의 고갈 및/또는 차단은 수용체 환자에 대한 안전한 접근법인 것 같다.
실시예 2: GVHD의 위험이 낮은 환자의 동정
재료 및 방법
스페인, 마드리드의 라 프린세사 대학병원(Portero-Sainz et al, 2017)에서 동종-HSCT를 받은 103명의 공여체-수용체 페어(표 2 참조)의 코호트를 분석했다. 연구 프로토콜은 윤리위원회(Reference PI-624)에 의해 승인되었고, 헬싱키 선언에 따라 실시되었다.
이식편 특징
이식편 특징 환자의 수 (%)
수용체 연령(세)
0-20 2 (2%)
21-30 13 (13%)
31-40 21 (20%)
41-50 26 (25%)
51-60 25 (25%)
>60 16 (15%)
기저 질환의 진단 [재발율]
골수이형성 증후군 (MS) 28 (27%) [5/28 (17%)]
급성 림프구성 백혈병 (ALL) 9 (9%) [3/9 (33%)]
급성 골수성 백혈병 (AML) 45 (44%) [10/45 (22%)]
호지킨 림프종 (HL) 9 (9%) [3/9 (33%)]
비-호지킨 림프종 (NHL) 8 (8%) [2/8 (25%)]
만성 림프구성 백혈병 (CLL) 2 (2%) [0/2 (0%)]
다발성 골수종 (MM) 2 (2%) [1/2 (50%)]
공여체 연령, 세
17-30 33 (32%)
31-40 32 (31%)
41-50 19 (19%)
51-60 13(12%)
>60 6 (6%)
성별 매칭
D 남성 - R 남성 36 (35%)
D 남성 - R 남성 26 (25%)
D 여성 - R 여성 18 (18%)
D 여성 - R 남성 23 (22%)
공여체 유형
HLA-동일 형제 31 (30%)
HLA-동일 (10/10) 무관계 47 (46%)
HLA- Cw 미스매칭 (9/10) 무관계 25 (24%)
CMV 혈청학 (I)
D 양성 - R 음성 12 (12%)
D 양성 - R 양성/D 음성 - R 양성 77 (75%)
D 음성 - R 음성 14 (13%)
CMV 혈청학 (II)
재활성화 59 (57%)
이식편의 공급원
BMSC 5 (5%)
PBSC 98 (95%)
주입된 CD34+_106/kg 수용체 체중 5.23 (1.4-8.2)
주입된 CD3+_106/kg 수용체 체중 22.07 (25.3-468.1)
컨디셔닝 섭생
골수파괴적 70 (68%)
골수파괴적 표준 없음 33 (32%)
GVHD 예방법
Cs A 및 MTX 90 (87%)
Cs A 및 MMF 11 (11%)
Cs A 2 (2%)
약어: D, 공여체; R, 수용체; CMV, 사이토메갈로바이러스; BMSC, 골수 줄기 세포; PBSC, 말초혈 줄기 세포; CsA, 사이클로포스파미드; MTX, 메토트렉세이트; MMF, 마이코페놀레이트 모페틸.
표현형
성분채집술 샘플은, 이전에 기재된 바와 같이[참조: Portero-Sainz et al, 2017], 7색의 항체 패널(표 3)로 염색시켰다. T 세포 서브세트의 상대 수 및 절대 수는 백혈구의 총수를 나타낸다. TN, TCM, TEM 및 TEMRA 서브세트는, 하기 항체로 동정했다: CD45RA-FITC, CD62L-PE, CD3-APC, CD4-PB (BD Biosciences, San Jose, CA).
연구에 사용된 항체 클론.
표적 클론 형광색소 공급원
CD8 SK1 FITC BD
CD4 RPA-T4 PB BD
CD62L SK11 PE BD
CD3 SK7 PerCP BD
CD3 SK7 APC BD
CD19 SJ25C1 PECy7 BD
CD45 2D1 PO BD
CD45RA HI100 FITC BD
CCR7 150503 APC R&D
CCR7 150503 없음 (정제됨) R&D
IgG2a MOPC-173 없음 (정제됨) BIOLEGEND
치료용 항체
정제된 마우스 항-인간 CCR7 mAb(IgG2a 이소형)는 R&D Systems(MN, USA)에서 구입했고, 매칭된 이소형 대조군(IC)은 Biolegend(CA, USA)에서 구입했다.
통계 분석
질적 변수는, 상대(백분율, %) 및 절대(수, n) 빈도로서 표시된다. 양적 변수는 중심 경향(평균) 및 분산(SD 또는 SEM)의 척도로서 표시된다. 그룹 사이의 정량적 데이터는, 필요에 따라, 피어슨의 χ2 검정 또는 피셔 직접 확률검정에 의해 비교되었다. 분산이 동등한 정량적 변수(르벤 검정)은 t 검정 또는 일원배치 분산분석(ANOVA)을 사용하여 분석했다. 만-휘트니 U 또는 크루스칼-왈리스 검정이 이질성 검정에 사용되었다.
포르테로-사인즈 등(Portero-Sainz et al(2017))에 기재된 환자의 코호트에서, 교락 변수에 의해 조정된 GVHD 및 CMV의 재활성화(또는 재발된 질환)의 예측 인자를 특정하기 위해, 바이너리 로지스틱 회귀 분석이 적절히 실행되었다: 연령, HLA 및 CMV의 상태, 성별, 컨디셔닝 섭생, 주입된 CD3+ 및 CD34+의 수, 동종-감작, HSCT 후의 재발, 기저 질환, 이식편의 공급원 및 예방법.
탐색적 단변량 분석을 실행하여, 종속 변수 aGVHD, cGVHD 및 CMV 감염 또는 재발된 질환과 관련되는 변수를 검색했다(P<0.05). 다변량 로지스틱 회귀 모델에는, 단변량 분석으로 확률 역치(P<0.10)에 도달하는 교락 변수가 포함되었다. 이전의 모델(Portero-Sainz et al, 2017)의 aGVHD 위험 스코어로부터의 감도±95% CI는 ROC 곡선을 사용하여 평가되었다. CMV 감염 위험 스코어로부터의 감도는 동일한 방법으로 계산된다. 유의성은 P<0.05의 값으로 설정되었다. CMV의 재활성화를 설정하기 위해, 57 카피/ml를 초과하는 바이러스 양의 컷-오프를 사용했다. 통계 분석은, Stata 버젼 13.0(Colleg Station, TX, USA)를 사용하여 실행되었다.
결과
CCR7 + 세포의 비율에 기초하여 성분채집술 선택은 GVHD를 예방 또는 지연시키지 않는다
GVHD를 발증할 위험이 낮은 성분채집술을 선택하기 위한 잠재적 컷-오프 지점을 확립하기 위해, 코호트에서 감도 분석(ROC 곡선)을 실행하고, 제25 퍼센타일(<3.6%)을 임의로 선택하여, 낮은 비율의 CCR7+ T 세포로 이식된 환자를 동정했다. 표 4에서 보는 바와 같이, 제25 퍼센타일(<3.6%) 내의 CD4+CCR7+ 세포의 비율로 이식편을 제공받은 87.88%(75.23%-100%)의 환자는 aGVHD를 발증하지 않았다. CD8+CCR7+의 경우, 성분채집술(제25 퍼센타일)에서의 <2.2%의 세포의 선택은 cGVHD에 대한 88.57%(76.60%-100%)의 감도와 연관되어 있었다.
성분채집술 및 aGVHD(또는 cGVHD)의 %CD4+CCR7+(또는 %CD8+CCR7+) 세포의 ROC 분석(25퍼센타일로 컷-오프 설정)
aGVHD (환자 수)
% CD4+CCR7+ 아니오 예 합계
<3.6 21 4 25
≥3.6 49 29 78
합계 70 33 103
% CD4+CCR7+ 값 CI (95%)
감도 (%) 87.88 72.23 - 100
특이성 (%) 30.00 18.55 - 41.45
TPR 37.18 25.81 - 48.55
TNR 84.00 67.63 - 100
유병률 32.04 22.54 - 41.54
cGVHD (환자 수)
% CD8+CCR7+ 아니오 예 합계
<2.2 18 4 22
≥2.2 35 31 66
합계 53 35 88
% CD8+CCR7+ 값 CI (95%)
감도 (%) 88.57 76.60 - 100
특이성 (%) 33.96 20.27 - 47.66
TPR 46.97 34.17 - 59.77
TNR 81.82 63.43 - 100
유병률 39.77 28.98 - 50.57
SEQUENCE LISTING <110> Catapult Therapeutics B.V. Universidad Autonoma de Madrid <120> The use of anti-CCR7 mabs for the prevention or treatment of GVHD <130> IPA210981-NL <140> PCT/EP2019/085991 <141> 2019-12-18 <150> EP 19215366.6 <151> 2019-12-11 <150> EP 18213727.3 <151> 2018-12-18 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Pro Gly Leu Thr Phe Arg Asp Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Arg Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Phe Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Arg Ala Tyr Arg Tyr Asp Gly Thr Gly Asp Tyr Ser Ala Leu 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Pro Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ala Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SYM1899: synthetic sulfated peptide corresponding to amino acids 19-49 of human CCR7 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> SULFATATION <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> SULFATATION <400> 3 Glu Asp Glu Val Thr Asp Asp Tyr Ile Gly Asp Asn Thr Thr Val Asp 1 5 10 15 Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Leu Cys Ser Lys Lys Asp Val Arg Asn Lys 20 25 30 <210> 4 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized VH1 domain <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Leu Thr Phe Arg Asp Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Val Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Phe Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Ile Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Arg Ala Tyr Arg Tyr Asp Gly Thr Gly Asp Tyr Ser Ala Leu 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized VK1 domain <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Pro Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ala Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic human antibody <400> 6 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Gly Ser Ser Thr Val Ile 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 7 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic human antibody <400> 7 Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Arg 1 5 10 15 Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys 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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (15)

  1. 공여체 세포(donor cell)를 포함하는 이식편의 수용체(recipient)에서 이식편 대 숙주 질환(Graft Versus Host Disease; GVHD)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 항-CCR7 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항-CCR7 항체가, CCL19 및 CCL21로부터 선택된 적어도 하나의 CCR7-리간드에 의해, CCR7-의존성 세포내 신호전달 및 CCR7 수용체 내재화 중의 적어도 하나를 억제하기 위해 100nM 이하의 IC50을 갖는, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항-CCR7 항체가 실질적 작용 효과(agonistic effect) 없이 CCR7-의존성 세포내 신호전달을 억제하는, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR7 항체가, 참조 항-CCR7 항체의 Kd보다 20배 이하로 높은 인간 CCR7의 N-말단 세포외 도메인의 Kd를 갖고, 이에 의해 참조 항-CCR7 항체는, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 1이고 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 2인 마우스 항-CCR7 항체인, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR7 항체가 키메라, 인간화 또는 인간 항체인, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항-CCR7 항체는, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 1이고 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 2인 항-인간 CCR7 항체의 HVR을 갖는 항체인, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR7 항체는, 수용체에서 CCR7 발현 세포의 사멸, 세포자멸사(apoptosis)의 유도, 이동의 차단, 활성화의 차단, 증식의 차단 및 확산의 차단 중 적어도 하나에 영향을 미치는, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 공여체 세포를 포함하는 이식편이, 기관, 조직, 전구세포(progenitor cell) 세포, 줄기 세포 및 조혈 세포 중 하나 이상을 포함하는 이식편인, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 공여체 세포를 포함하는 이식편이 조혈 줄기 세포 또는 전구세포 세포를 포함하는 이식편인, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 수용체는 악성 장애를 앓고 있고, 바람직하게는, GHVD의 예방 또는 치료는 이식편 대 종양 효과 또는 이식편 대 백혈병 효과를 유지 또는 촉진하는, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, GHVD의 예방 또는 치료는
    a) 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받기 전에, 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여;
    b) 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받은 후, 및 바람직하게는 수용체가 GHVD의 증상을 나타내기 전, 또는 수용체가 GHVD로 진단되기 전에, 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여;
    c) 수용체가 공여체 세포를 포함하는 이식편을 제공받은 후, 및 바람직하게는 GHVD의 증상을 나타낸 후, 또는 수용체가 GHVD로 진단된 후에, 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여;
    d) 공여체 세포를 포함하는 이식편으로서, 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 생체외 인큐베이션(incubation)에 의해 이식 전에 제조된 이식편의 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여; 및
    e) GHVD의 재발 후의 수용체에게 항-CCR7 항체의 투여
    중의 적어도 하나를 포함하는, 항-CCR7 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 수용체로의 이식을 위해 공여체로부터 기관, 조직 또는 세포 제제(preparation)를 제조하는 생체외 방법으로서, 상기 방법은
    a) 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 항-CCR7 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 함께 기관, 조직 또는 세포 제제를 인큐베이팅(incubating)하는 단계로서, 이에 의해 항-CCR7 항체는 기관, 조직 또는 세포 제제에서 CCR7 발현 공여체 세포의 i) 수의 감소 및 ii) 활성의 억제 중 적어도 하나에 영향을 미치는, 단계; 및
    b) 임의로, 기관, 조직 또는 세포 제제로부터 항-CCR7 항체 및 CCR7 발현 공여체 세포 중 적어도 하나를 제거하는 단계
    를 포함하는, 생체외 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항-CCR7 항체가, 이식 전에 기관, 조직 또는 세포의 제제를 보존하기 위해 사용되는 보존액(preservation solution)에 포함되어 있는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 기관 또는 조직이 항-CCR7 항체를 포함하는 보존액으로 관류 또는 세척되는, 방법.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 항-CCR7 항체 및 CCR7 발현 공여체 세포가, 항-CCR7 항체 및 이에 결합된 CCR7 발현 공여체 세포의 친화성 정제에 의해 세포 제제로부터 제거되는, 방법.
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