KR20210119437A - 미세유체 장치 - Google Patents

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KR20210119437A
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microfluidic device
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metaphase
chromosome
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매튜 다니엘 솔로몬
리차드 월터 두마니
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하플로믹 테크놀로지즈 피티와이 엘티디
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Abstract

본 개시는 개별 중기 염색체들이 장치로부터 이산적으로 분배될 수 있도록 중기 염색체들을 분리하기 위한 미세유체 장치에 관한 것이다. 미세유체 장치는 일련의 확장 영역들과 수축부들을 포함하는 유동 채널을 포함한다. 본 개시는 또한 중기 염색체들을 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

미세유체 장치
본 출원은 2019년 1월 23일자 오스트레일리아 특허출원 제2019900210호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전부를 참조에 의해 본 출원에 포함한다.
본 발명은 염색체의 분리를 위한 미세유체 장치에 관한 것이다.
동물과 식물 종들을 포함하는 많은 진핵 생물들의 세포들은 한 세트 이상의 염색체를 포함하며, 세트들의 수는 배수성으로 알려져 있다. 예를 들어, 인간은 이배체이며, 게놈을 형성하는 쌍으로 짝지어진 염색체 세트들(모계 및 부계 복제본들)을 갖는다. 특정 염색체를 위한 각각의 위치 또는 장소에, 개체는 (유전자 대립 형질(gene allele), 돌연변이, 표지(marker) 또는 후생 성분과 같은) 동일한 서열로 된 2개의 복제본, 또는 염색체 쌍의 각각의 염색체에 하나의 버전을 구비하는 2개의 서로 다른 서열들을 가질 수 있다. 각기 다른 장소들로부터 유전자 대립 형질, 돌연변이, 표지 또는 후생 성분과 같은 서열 요소들이 염색체 쌍의 동일한 멤버 상에서 (시스(cis) 배열로) 함께 또는 염색체 쌍의 반대쪽 멤버 상에서 (트랜스(trans) 배열로) 일어나는지를 결정하는 것은 페이징(phasing)으로 알려져 있다. 2개 이상의 서열들(대립 형질, 돌연변이, 표지 또는 후생 성분)이 시스로 발생할 때, 이는 하플로타입(haplotype)으로 알려져 있다. 이러한 하플로타입들의 서열에서의 변이들은 기능적 유전자 발현, 단백질 기능 및 질병의 차이와 같은 기능적 차이를 초래할 수 있다. 따라서 개체의 페이징 또는 하플로타입을 알면 개선된 진단 방법 및/또는 치료 방법과 같은 생물학적 경로를 이해하고 통제할 수 있다. 불행하게도, 페이징 및 하플로타입 결정을 위한 기존의 프로세스에는 많은 단점이 있다.
Quake 등의 리뷰 기사(Nature Methods, Vol. 11, No. 1, 2014, pp 19-21)에서, Quake는 비록 게놈 "분석이 '평균적인' 인간의 기준 서열을 결정하는 것에서부터 개인의 게놈들의 많은 서열화에 이르기까지 진행되었지만", 게놈 분석의 어떤 측면들은 여전히 어렵다는 것을 확인했다. 특히, Quake는 계속해서 기존의 통상적인 기법들이 하플로타입을 결정하는 데에는 적합하지 않다고 언급하고 있다.
Figure pct00001
등(Funct . Integr . Genomics, 2012, 12:397-416)은 개개의 염색체들을 분리하고 고립시키기 위한 다양한 접근법들을 논의한다.
Figure pct00002
이 논의한 하나의 접근법은 상대 밀도에 기초하여, 예컨대 구배 원심 분리를 통해 염색체들을 분리하는 것을 포함하지만, 이 접근법은 큰 염색체와 작은 염색체를 나누는 것만이 가능하고 특정한 염색체를 분리하는 데에는 적합하지 않기 때문에 많은 단점들이 있다.
Figure pct00003
이 논의한 다른 접근법은 염색체 특이적 프로브로 기능화된 자기 비드들을 사용하는 것이지만, 이 접근법의 단점은 분리된 분획(fraction)의 순도가 낮다는 점이다.
Figure pct00004
은 가장 성공적인 접근법은 유동 세포 분석법(flow cytometry)을 사용하는 것이라고 언급하고 있다. 유동 세포 분석법에서는, 염료로 염색된 염색체들의 액적들이 유동 챔버로부터 방출되어 레이저 빔을 통과하는데, 산란광을 분석하여 광 산란 및 형광에 따라 염색체를 함유하는 액적에서 관심 염색체들을 식별하고 전기장을 이용하여 이 액적들을 수집 챔버로 편향시킨다. 그러나
Figure pct00005
은 유동 세포 분석법이 (인간, 개, 돼지 및 닭을 포함하는) 다양한 동물 종들의 모든 염색체들을 분석할 수 없다고 언급하고 있다.
Figure pct00006
은 다수의 연구 그룹들이 개개의 염색체를 분리하고 고립시키기 위해 유동 세포 분석법을 개선하는 데에 노력을 집중해 왔다고 언급하고 있다.
다른 기법은 Fan 등이 채택한 접근법이다(Nat. Biotechnol., 2011년 1월, 29(1):51-57). Fan 등은 (메이트-페어 샷건 게놈 서열화(mate-pair shotgun genome sequencing), 다양한 형태의 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 탄소 나노튜브를 이용한 원자력 현미경, 포스미드/코스미드 클로닝(fosmid/cosmid cxloning) 및 하이브리드화 프로브들의 사용과 같은) 현재의 기법들 전부가 광범위한 채택을 방해하는 여러 가지 심각한 단점들이 있다는 것을 확인했다. 대신 Fan 등은 단일의 인간 중기 세포(metaphase cell)로부터 각각의 염색체의 상동 복제본들을 나누고 증폭하기 위한 미세유체 장치의 개발을 보고한다. Fan 등의 소자는 그 기능에 따라 5개의 각기 다른 영역들로 나누어진다. 제1 영역은 광학 현미경을 사용하여 단일의 중기 세포를 식별하는 것을 포함한다. 중기 세포가 식별되고 나면, 세포가 소자의 제2 영역으로 도입될 수 있도록 일련의 주변 밸브들이 작동되어 세포를 포획한다. 제2 영역에서, 중기 세포는 펩신과 접촉하여 세포의 세포질을 소화되고 염색체 현탁액을 형성한다. 그런 다음 이 현탁액은 소자 내의 일련의 밸브들의 작동에 의해 48개의 챔버들로 분할되는 제3 영역으로 전달된다. 그런 다음, 제4 영역에서, 48개의 챔버들 각각의 내용물은 트립신, 알칼리를 이용한 처리 및 후속하는 다중 가닥 전위 증폭(multiple strand displacement amplification)을 위한 중화를 거쳐 일련의 상이한 채널들을 통과하면서 소자에서 개별적으로 증폭된다. 소자의 제5 영역은 증폭된 염색체들 각각을 수집하기 위한 별도의 출구 포트들을 포함한다.
특히, 본 발명자들의 최고의 지식에 의하면, Fan 등에 의해 개시된 소자는 채택되지 않았다. 본 발명자들은 Fan 등에 의해 보고된 프로토콜을 복제하려고 시도했지만 성공하지 못했다. 본 발명자들은 Fan 등의 소자와 프로세스의 반복성 부족이 채택을 방해했다고 추측한다. 이와 관련하여,
Figure pct00007
은 "유동 세포 유전학을 적용하는 것은, 단일의 인간 중기로부터의 개개의 염색체들이 별개의 채널들로 나누어지고 증폭되는, 최근 개발된 미세유체 접근법(Fan et al. 2011)의 훌륭한 대안일 수 있다"고 언급하면서 Fan 등의 미세유체 장치로부터 벗어날 것을 제안하고 있다.
직접 페이징을 위해 염색체들을 나누는 기술의 단점들 때문에, (예를 들어, 골수 이식 환자들을 잠재적인 기증자들과 부합시키기 위해) 페이징 또는 하플로타입들을 추정하는 가장 최근의 시도들은 가족 분리 연구(family segregation studies), 연관 불균형(linkage disequilibrium) 또는 서열화된 DNA 단편들로부터의 페이징 확률들을 생성하기 위한 알고리듬들과 같은 간접적인 추정법 또는 가정법들을 사용한다.
중기 상태에서, 염색체들은 단단히 접힌 DNA와 단백질들로 개별 번들들을 구성한다. 이러한 염색체들은 서로 군집을 형성하여 염색체 클러스터의 형태로 존재할 수 있다.
상술한 관점에서, 직접 페이징 및 하플로타입 결정이 가능하도록 염색체들을 분류하고 분리하는 소자 및/또는 프로세스를 개발할 필요가 있다. 그러나 종래 기술의 접근법들에는 심각한 단점들이 있다. 따라서 본 발명의 목적은 종래 기술의 하나 이상의 단점들을 해결하고 그리고/또는 개선하는 데 있다.
본 명세서에서 임의의 종래 기술에 대한 참조는 이 종래 기술이 모든 관할권에서 공통된 일반 지식의 일부를 형성한다는 점 또는 이 종래 기술이 통상의 기술자에 의해 이해되고, 관련이 있는 것으로 간주되고, 그리고/또는 종래 기술의 다른 부분들과 조합될 것으로 합리적으로 예측될 것이라는 점을 시인하거나 혹은 암시하는 것이 아니다.
Quake et al. (Nature Methods, Vol. 11, No. 1, 2014, pp 19-21)
Figure pct00008
et al. (Funct. Integr. Genomics, 2012, 12:397-416) Fan et al. (Nat. Biotechnol., January 2011, 29(1):51-57)
본 발명의 제1 태양에서, 중기 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 미세유체 장치로,
유동 채널을 포함하고,
유동 채널은,
중기 염색체들을 포함하는 유체를 받아들이는 입구,
개개의 중기 염색체들을 개별적으로 분배하는 출구,
일련의 확장 영역들, 및
일련의 확장 영역들 중 연속하는 확장 영역들 사이에 위치된 하나 이상의 수축부들을 포함하되,
수축부들이 중기 염색체들을 서로 분리하기에 충분한 전단 응력을 가하도록 작동 가능하고, 그리고
확장 영역들은 염색체들을 서로 분산시키도록 작동 가능한 미세유체 장치가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에서는, 유체 내의 클러스터화된 중기 염색체들을 분리하기 위한 미세유체 장치로,
유동 채널을 포함하고,
유동 채널은,
유체를 받아들이는 입구,
분리된 중기 염색체들을 분배하는 출구,
하나 이상의 확장 영역, 및
하나 이상의 수축부로, 수축 영역의 하류에 적어도 하나의 확장 영역이 있는 수축부를 포함하고,
수축부들이 클러스터화된 중기 염색체들을 서로 분리하기에 충분한 전단 응력을 가하도록 작동 가능하고, 그리고
확장 영역들은 분리된 중기 염색체들을 분산시키도록 작동 가능한 미세유체 장치가 제공된다.
'작동 가능한'은 염색체들이 수축부들에서 비교적 높은 전단 응력을 받고 그리고/또는 확장 영역들에서는 (유동 채널의 비확장 영역들에서의 유동 속도와 비교하여) 유속이 비교적 낮은 유동 및/또는 압력 조건 하에서 미세유체 장치가 작동하는 것을 의미한다. 예를 들어, 장치는 수축부들 및 확장부들에서의 유속 변화가 각각의 전단 응력 및 분산을 일으키는 일정한 압력에서, 혹은 염색체들이 수축부들을 통해 유동할 때 염색체들이 전단 응력을 받게 하는 압력 펄스가 인가되고 그리고 염색체들이 확장 영역들을 통해 유동할 때에는 속도 감소에 의해 염색체들이 분산되게 하는 가변 압력에서 작동할 수 있다.
본 발명의 하나의 형태에서, 중기 염색체들은 하나 이상의 중기 염색체 클러스터의 형태이고, 미세유체 장치는 하나 이상의 중기 염색체 클러스터를 개개의 중기 염색체들로 분리하기 위한 것이다. 이러한 경우들에서, 수축부들은 하나 이상의 중기 염색체 클러스터에 충분한 전단 응력을 가하여 클러스터로부터 중기 염색체들을 분리하거나 혹은 클러스터를 보다 작은 클러스터들로 파괴하도록 작동 가능하고, 확장 영역들은 분리된 중기 염색체들 및/또는 하나 이상의 중기 염색체 클러스터를 서로 분산시키도록 작동 가능하다.
'클러스터들' 또는 '클러스터화된'은 중기 염색체들이 서로 '달라붙거나' 혹은 밀접하게 결합되는 중기 염색체들의 그룹화 또는 집합화를 의미한다. 이러한 클러스터화는 다수의 물리화학적 상호작용의 결과로 일어날 수 있는데, 예를 들어 클러스터화는 염색체들이 (단백질 또는 DNA 상호 작용을 통해) 직접 또는 세포질 기질과 같은 물질의 존재 때문에 서로 군집을 형성할 수 있을 때 일어날 수 있다. 따라서 유체 중의 염색체들은, 특히 다른 세포 내용물과 결합될 때, 서로 달라붙거나 뭉치는 경향이 있다.
본 발명의 하나의 형태에서, 확장 영역들은 분리된 중기 염색체들을 서로 분산시키도록 작동 가능하다.
이해할 수 있는 바와 같이, 장치의 출구로부터 분배되는 중기 염색체들 중 상당한 비율 또는 바람직하게는 전부가 개별적으로 분배되는 개개의 중기 염색체들이다.
본 발명의 하나의 형태에서, 중기 염색체들을 포함하는 유체는 유체 제제에 포함되는 중기 세포 또는 중기 세포들로부터의 용해물 또는 용해물의 성분이다.
여기서 사용하는 '유체'는 용해된 물질들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유체는 용해 완충액 및/또는 분리 완충액과 같은 완충액의 용해된 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에서, 중기 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 미세유체 장치로,
약 10μm 내지 약 30μm의 폭을 가지는 유동 채널을 포함하고,
유동 채널은,
입구,
출구, 및
일련의 확장 영역들 및 일련의 확장 영역들의 연속하는 확장 영역들 사이에 위치되는 하나 이상의 수축부를 포함하되,
복수의 확장 영역들의 채널 폭이 약 50μm 내지 약 150μm이며, 복수의 수축부들의 각각의 수축부의 최소 폭이 약 1μm 내지 약 3μm인 미세유체 장치가 제공된다.
각각의 수축부의 최소 폭들은 중기 염색체들을 수축부를 통해 추진시키고 중기 염색체들을 서로 분리시키는 전단 응력을 염색체에 가하기에 충분한 압력이 필요하도록 염색체들의 통과를 방해하는 크기로 정해진다.
확장 영역들은 분리된 중기 염색체들을 염색체들이 확장 부분을 빠져 나갈 때 염색체들 사이의 간격을 증가시키는 것을 돕는 확산 및 이류 중 하나 이상을 통해 횡 방향 및 축선 방향 양쪽으로 분산시키는 크기로 정해진다. 확장 영역들은 임의의 적당한 크기와 형상을 취할 수 있다.
본 발명의 하나의 형태에서, 중기 염색체는 하나 이상의 염색체 클러스터의 형태이고, 미세유체 장치는 하나 이상의 염색체 클러스터를 개개의 중기 염색체들로 분리하기 위한 것이다.
본 발명의 상술한 태양의 실시예에서, (선택적으로 확장 영역들 및/또는 수축부들 및/또는 수축부들에 바로 인접한 유동 채널의 영역들 이외의) 유동 채널의 깊이가 약 5μm 내지 최대 약 40μm이다. 바람직하게는, 유동 채널 깊이는 약 12μm부터이다. 보다 바람직하게는, 유동 채널 깊이는 약 14μm부터이다. 훨씬 더 바람직하게는, 유동 채널 깊이는 약 16μm부터이다. 가장 바람직하게는, 유동 채널 깊이는 약 18μm부터이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 유동 채널 깊이는 최대 35μm이다. 더 바람직하게는, 유동 채널 깊이는 최대 30μm이다. 가장 바람직하게는 유동 채널 깊이는 최대 25μm이다. 하나의 비제한적인 예에서, 유동 채널 깊이는 20μm ± 2μm이다.
실시예에서, 수축부들의 깊이는 유동 채널의 깊이보다 작다. 바람직하게는 수축부들의 깊이는 유동 채널의 깊이보다 작은 약 5μm 내지 약 15μm이다. 수축부들의 깊이가 약 5μm 내지 약 15μm일 수 있으면 바람직하다. 유동 채널과 비교하여 수축부들의 깊이가 더 작을수록 수축부들에서 염색체들이 받는 전단력을 증가시키는 데 유용하다.
상술한 실시예의 하나의 형태에서, 유동 채널의 벌크 깊이(bulk depth)와 수축부 깊이 사이에 단계적인 깊이 변화가 있다. 바람직하게는, 단계적 깊이 변화는 약 5μm 내지 약 15μm이며, 예를 들어 유동 채널의 벌크 깊이가 10μm 이상일 때 수축부 깊이는 약 5μm이다.
수축부에 바로 인접한 유동 채널의 영역들은 그 깊이가 수축부와 동일하여 단계적 깊이 변화가 유동 채널 내에서 이루어지는 것이 또한 바람직하다.
상술한 실시예의 하나의 형태에서, (확장 영역들 및/또는 수축부들 및/또는 수축부들에 바로 인접한 유동 채널의 영역들 이외의) 유동 채널의 깊이가 유동 채널의 길이를 따라 일정하다. 즉, 유동 채널의 깊이는 예를 들어 ±2μm 내로 유동 채널의 길이를 따라 실질적으로 변하지 않는다.
본 발명의 상술한 태양의 실시예에서, (확장 영역들과 수축부들 이외의) 유동 채널의 폭이 약 10μm 내지 약 30μm이다. 바람직하게는, 유동 채널 폭은 약 12μm부터이다. 더 바람직하게는, 유동 채널 폭은 약 14μm부터이다. 가장 바람직하게는, 유동 채널 폭은 약 16μm부터이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 유동 채널 폭은 최대 28μm이다. 보다 바람직하게는, 유동 채널 폭은 최대 26μm이다. 가장 바람직하게는, 유동 채널 폭은 최대 24μm이다. 하나의 비제한적인 예에서, 유동 채널 폭은 20μm ± 2μm이다.
이해할 수 있는 바와 같이, 유동 채널의 기하학적 형태는 특정 용도에 적합하도록 선택된다. 예를 들어, 유동 채널의 폭이 유동 채널의 깊이보다 클 수 있고, 반대로 유동 채널의 깊이가 유동 채널의 폭보다 클 수 있다.
본 발명의 상술한 태양의 실시예에서, 유동 채널의 길이가 약 2mm 내지 약 15mm이다. 바람직하게는, 유동 채널 길이는 약 3mm부터이다. 가장 바람직하게는, 유동 채널 길이는 약 4mm부터이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 유동 채널 길이는 최대 12mm이다. 더 바람직하게는, 유동 채널 길이는 최대 약 10mm이다. 가장 바람직하게는, 유동 채널 길이는 최대 약 8mm이다. 하나의 비제한적인 예에서, 유동 채널 길이는 대략 5mm이다.
실시예에서, 하나 이상의 수축부 또는 각각의 수축부의 최소 폭이 약 1.00μm 내지 약 3.00μm이다. 바람직하게는, 최소 폭은 약 1.25μm부터이다. 더 바람직하게는, 최소 폭은 약 1.50μm부터이다. 가장 바람직하게는, 최소 폭은 약 1.75μm부터이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 최소 폭은 최대 약 2.75μm이다. 바람직하게는, 최소 폭은 최대 약 2.50μm이다. 가장 바람직하게는, 최소 폭은 최대 약 2.25μm이다. 하나의 비제한적인 예에서, 최소 폭은 2.00μm ± 0.20μm이다.
실시예에서, 수축부의 최소 폭 부분의 길이가 약 4μm 내지 약 16μm이다. 바람직하게는, 길이는 약 6μm부터이다. 가장 바람직하게는, 길이는 약 8μm부터이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 길이가 최대 14μm인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 최대 12μm이다. 하나의 비제한적인 예에서, 길이는 약 10μm이다.
실시예에서, 입구로부터 출구까지 각각의 연속하는 수축부의 최소 폭 및/또는 깊이가 앞선 수축부의 최소 폭 및/또는 깊이보다 작다. 실시예에서, 연속하는 수축부들 중 적어도 일부는 최소 폭 및/또는 깊이가 동일하다.
실시예에서, 하나 이상의 수축부 중 하나 이상이 확장형으로 테이퍼진 출구를 구비한다. 바람직하게는, 확장형으로 테이퍼진 출구는 유동 채널의 폭의 약 2/3 이하의 폭까지 확장된다. 바람직하게는, 확장형으로 테이퍼진 출구는 유동 채널의 폭의 약 절반 이하의 폭까지 확장된다.
실시예에서, 확장 영역들의 폭이 약 50μm 내지 약 150μm이다. 바람직하게는, 확장 영역의 폭은 약 60μm부터이다. 더 바람직하게는, 확장 영역의 폭은 약 70μm부터이다. 가장 바람직하게는, 확장 영역의 폭은 약 80μm부터이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 확장 영역의 폭은 최대 140μm이다. 더 바람직하게는, 확장 영역의 폭은 최대 130μm이다. 가장 바람직하게는, 확장 영역의 폭은 최대 120μm이다. 하나의 비제한적인 예에서, 확장 영역의 폭은 약 100μm이다.
실시예에서, 확장 영역의 길이가 약 0.2mm 내지 약 0.8mm이다. 바람직하게는, 길이는 약 0.3mm부터이다. 가장 바람직하게는, 길이는 약 0.4mm부터이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 길이가 최대 0.7mm인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 길이는 최대 약 0.6mm이다. 하나의 비제한적인 예에서, 길이는 대략 5mm이다.
실시예에서, 일련의 확장 영역들의 확장 영역들 각각의 폭이 실질적으로 동일하다.
실시예에서, 유동 채널이 일련의 확장 영역들에 적어도 3개의 확장 영역들을 포함한다. 바람직하게는, 적어도 4개의 확장 영역들을 포함한다. 가장 바람직하게는, 적어도 5개의 확장 영역들을 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 유동 채널은 최대 20개의 확장 영역들을 포함한다. 바람직한 형태에서, 유동 채널은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 중에서 선택되는 수의 확장 영역들을 포함한다.
실시예에서, 유동 채널은 일련의 확장 영역들의 각각의 확장 영역 사이에 하나 이상의 수축부를 포함한다.
실시예에서, 유동 채널의 입구의 폭이 2μm 내지 3μm이다. 바람직하게는, 수축부들의 폭은 입구의 폭보다 좁다.
실시예에서, 유동 채널의 출구의 폭이 약 1μm 내지 2μm이다.
실시예에서, 미세유체 장치가 입구의 상류측에 세포 포획 및 용해 구조물을 더 포함하고,
세포 포획 및 용해 구조물은 세포를 포함하는 유체 시료로부터 세포를 포획하여 유지하도록 구성되고 유동 채널 입구에 인접한 세포 트랩 및 세포 트랩에 용해 완충액을 도입하도록 구성된 용해 포트를 포함하고,
세포 트랩은 세포의 검사를 가능하게 하는 관찰 요소, 및 통로를 통해 유동 채널에 연결된 개구를 포함하며, 개구와 통로는 세포가 통과하는 것을 방해하는 크기를 갖는다.
실시예에서, 개구의 크기가 약 10μm 내지 20μm이고, 통로의 폭은 약 2μm 내지 약 3μm이다.
실시예에서, 세포 트랩이 미세유체 장치 내의 직육면체 형상의 중공 형성물이고, 세포가 세포 트랩에 유입되는 것을 허용하는 개방된 면을 구비한다.
바람직하게는, 세포 트랩 개구가 개방된 면의 반대쪽 면에 있다.
바람직하게는, 세포 트랩의 깊이가 유동 채널의 깊이와 실질적으로 동일하다. 더 바람직하게는, 세포트랩의 폭과 길이 치수는 깊이와 동일하다. 바람직한 크기는 20μm × 20μm × 20μm의 (±5μm)이다.
세포 트랩이 유동 채널 입구에 연결된 개구를 유동 채널 입구 및/또는 세포가 세포 트랩으로 유입되게 하는 개구로부터 고립시키는 밸브들 및/또는 펌프들을 포함할 수 있다.
실시예에서, 미세유체 장치가 출구의 하류측에 염색체 분배 구조물을 더 포함하고,
염색체 분배 구조물은 채널 입구와 채널 출구 사이에 획정되는 분배 채널을 구비하며, 분배 채널은 유동 채널의 출구로부터 개개의 염색체를 받아들이는 포트를 구비하고,
채널 출구는 분배 튜브에 연결되고, 분배 튜브는 미세유체 장치로부터의 단일 염색체들을 단일 염색체를 포함하는 유체 액적의 형태로 분배하도록 구성된다. 실시예에서, 분배 채널의 깊이는 유동 채널의 깊이와 동일하다.
실시예에서, 분배 구조가 일련의 확장 부분의 하류측에 염색체 유지 영역을 더 포함하고, 염색체 유지 부분은 하나 이상의 염색체를 하류로 이동하지 않도록 유지하는 반면 상류측 중기 염색체들은 여전히 유동 채널을 통해 이동하게 하는 역할을 하는 확장 영역을 포함한다.
실시예에서, 미세유체 장치가 검출 존을 더 포함하고, 검출 존은 중기 염색체들의 존재를 검출하는 장치를 포함하거나 혹은 이러한 장치와 결합된다. 실시예에서, 검출 장치는 개개의 중기 염색체들을 검출할 수 있다. 검출 장치는 예를 들어 광검출기일 수 있다. 검출을 대한 적합한 출력은 형광을 포함한다.
검출 존에서, 개개의 중기 염색체들이 유동 채널의 출구 하류측에서 검출될 수 있고, 여기서 추가 분석을 위해 슬라이드 또는 웰 플레이트 위에 개별적으로 분배되고 안착될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에서, 중기 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 방법으로,
중기 염색체 함유 유체를 본 발명의 하나 이상의 태양들에서 위에서와 같이 정의된 미세유체 장치를 통과시키되, 수축부들이 중기 염색체들에 충분한 전단 응력을 가하여 중기 염색체들을 서로 분리시키는 압력에서 통과시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 이 태양의 실시예에서, 방법은 염색체들을 출구로부터 개별적으로 분배하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 이 태양의 하나의 형태에서, 중기 염색체들은 하나 이상의 중기 염색체 클러스터의 형태이고, 수축부들은 하나 이상의 중기 염색체 클러스터가 하나 이상의 중기 염색체들을 개개의 중기 염색체들로 분리시키기에 충분한 전단 응력을 받게 하고, 개개의 중기 염색체들은 출구로부터 개별적으로 분배된다.
본 발명의 이 태양의 하나의 형태에서, 압력은 펄스 압력이다. 펄스 압력은 유동 채널을 따라 전방과 후방의 양 방향으로 교대로 인가될 수 있고, 인가되는 전체 압력 균형은 중기 염색체들이 점진적으로 출구를 향해 이동하게 한다. 대안적으로 압력은 일정한 압력일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에서, 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 방법으로,
중기 염색체를 포함하는 염색체 함유 유체를 미세유체 장치를 통과시키는 단계로, 미세유체 장치는 유동 채널을 구비하고, 유동 채널은, 입구와 출구 사이에 위치되는 복수의 확장 영역들 및 확장 영역들 중 하나 이상 사이에 위치되는 하나 이상의 수축부들을 포함하는 단계,
중기 염색체들이 수축부들에서 또는 수축부들 내에서 중기 염색체들을 서로 분리하기에 충분한 전단 응력을 받게 하는 단계, 및
복수의 확장 영역들에서 분리된 중기 염색체들을 서로 분산시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 이 태양의 실시예에서, 방법은 분리된 중기 염색체들을 미세유체 장치로부터 개별적으로 배출하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 이 태양의 하나의 형태에서, 중기 염색체들은 하나 이상의 중기 염색체 클러스터의 형태이고, 수축부들은 하나 이상의 중기 염색체 클러스터가 하나 이상의 중기 염색체들을 개개의 중기 염색체들로 분리시키기에 충분한 전단 응력을 받게 한다.
본 발명의 다른 태양에서, 미세유체 장치를 이용하여 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 방법으로,
유체를 미세유체 장치의 유동 채널을 통과시키는 단계로, 유동 채널은 복수의 교번하는 수축부들과 확장부들을 구비하는 단계를 포함하고,
유체가 수축부를 통과할 때, 방법이 중기 염색체들을 서로 분리하기에 충분한 전단 응력을 중기 염색체들이 받게 하는 압력을 인가하는 단계를 포함하고,
유체가 확장부를 통과할 때, 미세유체 장치는 서로 분리된 염색체들을 분산시키는 압력에서 작동되는 하는 방법이 제공된다.
본 발명의 태양의 실시예에서, 방법이 분리된 염색체들을 미세유체 장치로부터 개별적으로 배출하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 이 태양의 하나의 형태에서, 중기 염색체들은 하나 이상의 중기 염색체 클러스터의 형태이고, 유체가 수축부를 통과할 때, 압력 펄스는 하나 이상의 중기 염색체 클러스터에 하나 이상의 중기 염색체 클러스터로부터 중기 염색체들을 분리하기에 충분한 전단 응력을 가한다.
본 발명의 상술한 여러 태양들에 따르면, 전단 응력이 수축부의 최소 폭의 벽들에서 측정할 때 적어도 약 0.02N/m2 내지 적어도 약 15,000N/m2까지이거나, 또는 그 사이에 있는 임의의 값일 수 있다. 바람직하게는, 전단 응력은 수축부의 최소 폭의 벽들에서 측정할 때 약 0.02N/m2 내지 약 12,500N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 10,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 9,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 8,500N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 8,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 7,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 6,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 5,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 4,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 3,500N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 3,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 2,500N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 2,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 1,500N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 1,000N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 800N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 600N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 500N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 400N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 300N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 250N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 200N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 150N/m2, 약 0.02N/m2 내지 약 100N/m2, 약 0.02N/m2 내지 80N/m2, 약 0.02N/m2 내지 60N/m2, 약 0.02N/m2 내지 50N/m2, 약 0.02N/m2 내지 40N/m2, 약 0.02N/m2 내지 30N/m2, 약 0.02N/m2 내지 25N/m2, 약 0.02N/m2 내지 10N/m2, 약 0.02N/m2 내지 5N/m2, 또는 약 0.02N/m2 내지 1N/m2이다. 바람직하게는, 전단 응력은 수축부의 최소 폭의 벽들에서 측정할 때 약 1N/m2 내지 약 15,000N/m2, 약 2N/m2 내지 약 12,500N/m2, 약 5N/m2 내지 약 10,000N/m2, 약 5N/m2 내지 약 9,000N/m2, 약 10N/m2 내지 약 8,500N/m2, 약 10N/m2 내지 약 8,000N/m2, 약 15N/m2 내지 약 7,000N/m2, 약 15N/m2 내지 약 6,000N/m2, 약 20N/m2 내지 약 5,000N/m2, 약 20N/m2 내지 약 4000N/m2, 약25N/m2 내지 약 4,000N/m2, 약 50N/m2 내지 약 3,000N/m2, 약 100N/m2 내지 약 2,000N/m2, 약 200N/m2 내지 약 1,000N/m2, 약 100N/m2 내지 약 500N/m2, 약 200N/m2 내지 약 400N/m2, 약 5N/m2 내지 약 500N/m2, 약 10N/m2 내지 약 400N/m2, 약 20N/m2 내지 약 100N/m2, 또는 약 30N/m2 내지 약 60N/m2이다. 바람직하게는, 전단 응력은 수축부의 최소 폭의 벽들에서 측정할 때 약 0.2N/m2, 약 1N/m2, 약 5N/m2, 약 10N/m2, 약 25N/m2, 약 30N/m2, 40N/m2, 약 50N/m2, 약 60N/m2, 약 80N/m2, 약 100N/m2, 약 150N/m2, 약 200N/m2, 약 250N/m2, 약 300N/m2, 약 400N/m2, 약 500N/m2, 약 600N/m2, 약 800N/m2, 약 1,000N/m2, 약 1,500N/m2, 약 2,000N/m2, 약 2,500N/m2, 약 3,000N/m2, 약 3,500N/m2, 약 4,000N/m2, 약 5,000N/m2, 약 6,000N/m2, 약 7,000N/m2, 약 8000N/m2, 약 8500N/m2, 약 9000N/m2, 약 10,000N/m2, 또는 약 12,500N/m2보다 클 수 있다. 바람직하게는, 전단 응력은 수축부의 최소 폭의 벽들에서 측정할 때 약 1N/m2, 약 5N/m2, 약 10N/m2, 약 25N/m2, 약 30N/m2, 40N/m2, 약 50N/m2, 약 60N/m2, 약 80N/m2, 약 100N/m2, 약 150N/m2, 약 200N/m2, 약 250N/m2, 약 300N/m2, 약 400N/m2, 약 500N/m2, 약 600N/m2, 약 800N/m2, 약 1,000N/m2, 약 1,500N/m2, 약 2,000N/m2, 약 2,500N/m2, 약 3,000N/m2, 약 3,500N/m2, 약 4,000N/m2, 약 5,000N/m2, 약 6,000N/m2, 약 7,000N/m2, 약 8000N/m2, 약 8500N/m2, 약 9000N/m2, 약 10,000N/m2, 약 12,500N/m2, 또는 약 12,500N/m2보다 작을 수 있다.
본 발명의 상술한 여러 태양들에 따르면, 압력이 바람직하게는 유동 채널을 가로질러 인가된다. 유동 채널에 인가되는 압력은 약 0mBar 내지 약 10,000mBar까지, 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 바람직하게, 인가되는 압력은 약 2mBar 내지 약 7,000mBar, 약 30mBar 내지 약 5,000mBar, 약 50mBar 내지 약 2,500mBar, 약 100mBar 내지 약 1,000mBar, 약 250mBar 내지 약 1,000mBar, 약 300mBar 내지 약 1,000mBar, 또는 약 400mBar 내지 약 700mBar이다. 바람직하게는, 인가되는 압력은 약 0mBar, 약 2mBar, 약 30mBar, 약 50mBar, 약 100mBar, 약 250mBar, 약 300mBar, 약 400mBar, 약 700mBar, 약 1,000mBar, 약 2,500mBar, 약 5,000mBar, 또는 약 7,000mBar보다 클 수 있다. 바람직하게는 인가되는 압력은 약 2mBar, 약 30mBar, 약 50mBar, 약 100mBar, 약 250mBar, 약 300mBar, 약 400mBar, 약 700mBar, 약 1,000mBar, 약 2,500mBar, 약 5,000mBar, 약 7,000mBar, 또는 약 10,000mBar보다 작을 수 있다.
본 발명의 상술한 여러 태양들에 따르면, 방법이,
미세유체 장치의 세포 트랩에 중기 세포를 포획하는 단계, 및
용해 완충액을 중기 세포에 도입하고, 압력 펄스를 인가하여 세포를 용해시키고 염색체 함유 유체에 염색체들을 제공하기에 충분한 전단 응력 하에서 중기 세포를 세포 트랩으로부터 유동 채널로 추진시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상술한 여러 태양들에서, 방법이,
미세유체 장치의 유동 채널의 출구로부터 분배 채널로 분배되는 개개의 염색체들을 받아들이는 단계,
개개의 염색체들을 분배 튜브로 운반하는 단계, 및
단일 염색체를 단일 염색체를 포함하는 유체 액적의 형태로 분배하는 미세유체 장치로부터 분배 튜브를 통해 분배하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 유체 액적의 체적은 약 100nL 내지 약 500nL일 수 있다. 더 바람직하게는, 약 100nL 내지 약 400nL이다. 훨씬 더 바람직하게는, 약 100nL 내지 약 300nL이다.
위에서 설명한 본 발명의 태양들 및 그 실시예들 중 하나 이상에서, 염색체 함유 유체가 용해 완충액을 포함하고, 이에 따라 방법은 중기 염색체들의 화학적으로 보조되는 전단 분리 방법이다.
이해할 수 있는 바와 같이, 용해 완충액은 세포의 용해를 돕는 완충액이다. 분리 완충액은 염색체들의 분리를 돕는 완충액이다. 용해 완충액은 분리 완충액을 포함할 수 있고, 반대로 분리 완충액이 용해 완충액을 포함할 수도 있다.
위에서 설명한 본 발명의 태양들 및 그 실시예들 중 하나 이상에서, 용해 완충액이 도입되고, 이에 따라 용해 완충액의 화학 작용을 통해 또는 화학 작용과 물리 작용의 조합을 통해 세포가 용해된다. 용해 완충액에 통합되거나 혹은 용해 완충액에 이어서, 염색체 함유 유체 중의 중기 염색체들을 유동 채널의 입구로 도입하기 전에 혹은 그러한 도입과 함께 분리 완충액이 도입된다.
위에서 설명한 본 발명의 태양들 및 그 실시예들 중 하나 이상에서, 세포를 장치의 입구로 도입하기 전에 염색체 특이적 라벨 및/또는 DNA 착색제가 부가될 수 있다. 위에서 설명한 본 발명의 태양들 및 그 실시예들 중 하나 이상에서, 세포를 장치의 입구로 도입하기 전에 염색체 특이적 라벨 및/또는 DNA 착색제의 혼성화(hybridisation)를 용이하게 하도록 중기 세포들이 고정되고 투과성이 될 수 있다.
본 발명의 다른 태양들 및 앞선 단락들에서 설명한 태양의 다른 실시예들은 예시로 주어진 아래의 설명을 첨부 도면을 참조하여 읽으면 명확하게 알 것이다.
도 1: 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 장치의 개략도
도 2: 수축부를 도시하는 미세유체 장치의 개략도
도 3: 세포들이 통과하여 미세유체 장치로 도입되게 하는 시료 포트를 도시하는 미세유체 장치의 개략도
도 4: 상류측 세포 트랩 및 용해 구조물을 도시하는 미세유체 장치의 개략도
도 5: 세포의 화학적 보조 전단 용해 및 세포 트랩으로부터 유동 채널로의 압력 펄스 하에서의 전달을 도시하는 미세유체 장치의 개략도
도 6: 유동 채널과 확장 영역을 도시하는 미세유체 장치의 개략도
도 7: 유동 채널 출구 및 염색체 검출을 도시하는 미세유체 장치의 개략도
도 8: 개개의 염색체 분배를 위한 하류측 염색체 고립을 도시하는 미세유체 장치의 개략도
도 9: 단일 염색체를 함유하는 액적을 미세유체 장치로부터 웰 플레이트로 분배하는 것을 도시하는 개략도
도 10 : 미세유체 장치의 펌프 배열 형태를 도시하는 개략도
도 11: 미세 유체 장치의 유동 채널 내에서 수축부의 세부 사항을 나타내는 확대도
본 발명은 중기 염색체들을 서로 분리하기 위한 미세유체 장치 및 방법에 관한 것이다.
바람직한 형태에서, 미세유체 장치는 단일 중기 세포를 포획하여 용해시키고, 방출된 염색체들을 개별화된 염색체들로 현탁시키고, 각각의 개별화된 염색체를 검출하고 나서, 후처리를 위해 각각의 염색체를 미세유체 장치로부터 리셉터클(예를 들어 유리 슬라이드 또는 웰 플레이트)로 분배하도록 구성된다.
광의로, 세포는 미세유체 장치로 도입되고, 이 미세유체 장치에서 (예컨대 광학 현미경을 통해) 세포가 분석되어 중기 세포인지 여부가 결정된다. 세포가 중기 세포이면, 세포는 포획되며, 그런 다음 고압 펄스를 동반한 용해 완충액이 미세유체 장치로 도입되어 세포 및 그 내용물들을 채널 리스트릭션(channel restriction)을 통해 세포 트랩으로부터 미세유체 장치의 유동 채널로 추진시키면서 세포가 채널 리스트릭션을 통과할 때 세포막을 깎아내는 것을 통해 세포를 용해시킨다. 그런 다음 전형적으로 하나 이상의 클러스터의 형태로 된 염색체들이 미세유체 유동 채널로 들어간다. 미세유체 유동 채널에서, 하나 이상의 염색체 클러스터는 일련의 수축부들 및 확장부들을 교대로 통과한다.
수축부들은 유동 채널을 통과하는 하나 이상의 염색체 클러스터의 유동에 장애물을 제공한다. 압력 펄스는 수축부들을 통과하는 하나 이상의 염색체 클러스터를 추진시키고, 동시에 하나 이상의 염색체 클러스터에 상당한 전단 응력을 가하여 하나 이상의 클러스터를 분해시킨다.
확장부들에서는, 염색체들이 낮은 유동 속도 및 가변 유동 프로파일을 겪게 되고, 이에 따라 염색체들은 분산되어 서로 분리된다. 확장부들은 개개의 염색체들과 혼합되어 이 염색체들을 안정화시키고 그리고 하나 이상의 염색체 클러스터와 혼합되어 후속하는 수축부들에서 염색체들의 전단 분리를 화학적으로 보조하는 용해 완충액을 또한 제공한다.
하나 이상의 염색체 클러스터는 하나 이상의 염색체 클러스터가 분리된 개개의 염색체들로 파괴될 때까지 다수의 서로 교대하는 수축부들과 확장부들을 통과한다. 이러한 개개의 염색체들은 유동 채널의 출구에서 검출되고, 추가적인 분석을 위해 슬라이드 또는 웰 플레이트에 개별적으로 분배되어 안착된다.
이러한 방식으로, 본 발명의 장치 및 방법은 후속하는 하플로타입 결정을 위해 개개의 염색체들을 분리하는 메커니즘을 제공한다.
본 발명의 실시예를 아래에서 설명한다.
도 1은 염색체 현탁액으로부터 단일 염색체들을 분리하여 분배하기 위한 미세유체 장치(100)의 개략도이다. 이 경우, 미세유체 장치(100)는 웨이퍼 공구 위에 폴리디메틸실록산(PDMS: polydimethilsiloxane) 캐스팅으로 형성된다. 통상의 기술자는 다수의 각기 다른 소재들이 사용될 수 있음을 알 것이다. PDMS 캐스팅은 유리 커버 슬립으로 캐핑된다. 다시 말하지만, 다른 소재들이 사용될 수 있다. 그러나 미세유체 장치(100)의 성분들을 용이하게 관찰할 수 있게 하는 광학적 특성(예컨대, 광학적 투명도 및 자가형광 없음) 및 플라즈마 활성화를 통해 PDMS와 결합하는 능력으로 인해 유리를 캐핑 소재로 선택했다.
미세유체 장치(100)는 입구(104)와 출구(106)를 구비하는 미세유체 유동 채널(102)을 포함한다. 이 실시예에서, 유동 채널(102)은 길이가 5mm이다. 그러나 3mm 내지 15mm와 같은 다른 길이도 사용될 수 있다. 유동 채널(102)은 5개의 존들(도 1에서 1 내지 5로 표시됨)로 분할되어 있다. 이 존들 각각은 제1 유동 채널 부분(108) 및 확장 부분(100)을 나타내는 제2 유동 채널 부분을 포함한다. 제1 유동 채널 부분(108)은 유동 방향에 대해 횡인 방향으로 그 단면적이 확장 부분(110)의 단면적보다 작다. 이러한 특정 경우에, 유동 채널(102)의 깊이는 20㎛이고, 제1 채널 부분(108)의 폭은 20㎛(예컨대, 유동 단면적이 400㎛2)이고, 확장 부분(110)의 폭은 100㎛(예컨대 유동 단면적이 2000㎛2)이다. 따라서, 본 실시예에서, 제1 채널 부분(108)의 확장 부분(110)에 대한 유동 단면적의 비는 1:5이다. 이 실시예에서는 비가 1:5이지만, 발명자들은 1:2 내지 1:10의 비가 적절하다고 생각한다.
제1 유동 채널 부분들(108) 각각은 수축부(202)(도 2 및 도 11, 확대도 참조)를 포함한다. 제1 유동 채널 부분들(108) 각각이 다수의 수축부들(202)을 포함할 수 있음을 알 것이다. 본 실시예에서, 수축부들(202)은 그 폭이 약 1μm 내지 2μm이다. 또한, 입구(104)로부터 출구(106)까지 연속하는 제1 유동 채널 부분들(108) 각각에서 수축부들(202)의 폭은 앞에 있는 제1 유동 채널 부분들(108)의 수축부들(202)의 폭보다 작다.
도 11은 유동 채널 부분들(1102, 1104) 사이의 수축부(1100)의 실시예를 도시한다. 수축부(1100)는 유동 채널의 폭의 대략 절반인 폭까지 넓어지게 테이퍼지는 출구(1106)를 구비한다. 도 11에서, 수축부의 깊이는 유동 채널 부분들(1102, 1104)보다 작다. 이러한 특정 실시예에서, 수축부의 깊이가 5μm인 반면, 유동 채널 부분들(1102, 1104)의 벌크 깊이는 약 20μm이다. 1108 및 1110으로 표시된, 수축부(1100)에 바로 인접한 유동 채널의 영역들은 그 깊이가 수축부(1100)의 깊이(예컨대, 약 5μm)와 동일하고, 이에 따라 유동 채널 내에서 깊이가 수축부(1100)의 깊이(예컨대, 약 5μm)로부터 유동 채널의 벌크 깊이(예컨대, 약 20μm)까지 단계적으로 변한다.
이제 유동 채널(102)의 컴포넌트들의 작동을 간략하게 설명한다. 작동 중에, 하나 이상의 염색체 클러스터를 포함하는 유체는 압력 하에서 입구(104)를 통해 유동 채널(102)로 도입된다. 유체는 존(1)의 제1 유동 채널 부분(108)을 통해 유동하고, 여기서 유체는 수축부(202)를 통과한다. 수축부(202)는 하나 이상의 염색체 클러스터가 수축부를 통과하는 것을 방해한다. 단일 중기 염색체의 대략적인 크기가 약 0.5μm로부터 약 3μm인 반면, 염색체 클러스터는 단일 중기 염색체보다 약간 큰 크기로부터 중기 세포의 크기(약 10μm 내지 15μm)보다 약간 작은 크기까지의 범위에 있다. 어떤 경우에도, 수축부의 유체는 좁은 유동 면적 때문에 유동 채널(102)과 비교하여 유동 속도가 증가되고, 이렇게 증가된 유동 속도는 수축부의 치수, 가해지는 압력(이는 다시 속도에 영향을 미침) 및 유체 특성에 따라 하나 이상의 염색체 클러스터가 벽들에서 약 0.02N/m2 내지 약 1N/m2과 같은 상당한 전단 응력을 받으면서 수축부를 통과하게 만든다. 이러한 전단 응력은 하나 이상의 염색체들을 단편화시키기에 충분하여, 단일 염색체들이 하나 이상의 염색체 클러스터로부터 떨어져 나가 보다 작은 염색체 클러스터들로 분해되게 한다. 그런 다음 단일 염색체들(203) 및/또는 보다 작은 염색체 클러스터들(204)이 유동 채널(102)의 제1 유동 채널 부분(108)의 수축부(202)의 점차 확대되는 테이퍼진 출구를 통해 수축부(202)의 하류로 빠져나가서 제2 채널 부분, 예컨대 존(1)의 확장 부분(110)으로 간다. 확장 부분(110)에서, 단일 염색체들 및/또는 보다 작은 염색체 클러스터들의 유동 속도는 보다 넓은 유동 면적 때문에 제1 채널 부분(108)과 비교하여 감소된다. 이 확장 부분(110)에서, 단일 염색체들 및/또는 보다 작은 염색체 클러스터들은 확산 및 이류(advection)의 조합을 통해 반경 방향 및 축선 방향 양쪽으로 분산되고, 이에 따라 확장 부분을 빠져나가서 존(2)의 보다 좁은 제1 유동 채널 부분(108)로 갈 때 염색체들 간의 간격이 증가할 수 있다. 또한, 확장 영역(110)에서 염색체들 및/또는 보다 작은 염색체 클러스터들이 분산되면, 염색체 함유 유체 내에 존재할 수 있는 시약들이 염색체들 및/또는 보다 작은 염색체 클러스터들의 표면 주변에서 혼합되고 확산되게 한다(예컨대, 안정화제 또는 염색체들의 분리를 촉진하고 그리고/또는 응집을 방지하거나 최소화하는 기타 시약들).
존(2)에서, 단일 염색체들(203) 및/또는 보다 작은 염색체 클러스터들(204)은 수축부(202)를 구비하는 제1 유동 채널 부분(108)을 통과한다는 점에서 유사한 프로세스를 거친다. 그러나, 이 경우, 존(2)의 수축부(202)는 존(1)의 수축부(202)보다 좁다. 그 이유는 보다 작은 염색체 클러스터들의 통과를 방해하고 유동 속도를 보다 높여 보다 작은 염색체 클러스터들이 보다 높은 전단 응력을 받게 함으로써, 염색체 클러스터들을 추가로 파괴하고 그리고/또는 염색체 클러스터들로부터 단일 염색체들을 분리하기 위한 것이다. 다시, 이 수축부를 통과한 후에, 염색체들은 유사하게 존(2)의 제1 유동 채널 부분(108)으로 빠져 나오고, 추가 분산을 위해 존(2)의 확장 영역(110)으로 간다.
상술한 프로세스는 존들(3, 4, 5)을 통과하면서 반복되고, 이에 의해 이 존들의 제1 유동 부분(110)에 있는 각각의 수축부(202)는 그 폭이 감소하여 보다 작은 염색체 클러스터들(204)의 통과를 방해하고 파괴하며, 이 존들의 각각의 확장 영역(110)은 단일 염색체들(203) 및/또는 염색체 클러스터들(204)을 추가로 서로 분산시킨다.
유동 채널(102)의 존들 각각을 통과한 후에, 염색체들은 축선 방향으로 서로 이격된 단일 염색체들로 유동 채널의 출구(106)를 통과한다. 단일 염색체들이 축선 방향으로 서로 이격되어 있기 때문에, 단일 염색체들은 하류측에서의 목적을 위해 서로 고립될 수 있다.
도 1에 도시된 실시예에서, 미세유체 장치(100)는 유동 채널(102)의 상류측에 세포 포획 및 용해 구조물(112)을 포함한다. 세포 포획 및 용해 구조물(112)은 세포들을 함유하는 유체를 도입하기 위한 시료 포트(114), 세포를 포착하여 세포의 질의(interrogation)를 가능하게 하는 세포 트랩(402)(도 4, 확대도 참조), 세포가 적합한 것으로 판단되면 용해 완충액을 도입하여 세포를 용해시키고 세포 안에 함유된 염색체들을 방출하기 위한 용해 포트(116), 및 폐기 시약들과 부적합한 것으로 판단되는 세포들을 배출하기 위한 폐기 포트(118)를 포함한다. 유동 채널의 출구에서, 장치는 개별 중기 염색체들을 검출하여 이 염색체들이 분배되는 것을 보장하기 위한 검출 존(119)(도 7, 확대도 참조)을 포함한다. 유동 채널(102)의 하류측에서, 미세유체 장치는 분배 포트(122), 추출 포트(124) 및 분배 채널(704)을 포함하는 분배 구조물(120)을 포함한다. 세포 트랩(402)의 치수는 20μm × 20μm × 20μm이며, 이는 단일 중기 세포를 보유하기에 충분히 작다. 세포 트랩(402)은 유동 채널(102)의 입구로 이어지는 개구(404)를 포함한다. 개구(404)의 폭은 약 2μm 내지 약 3μm이어서, 세포가 세포 트랩(402)을 통과하여 유동 채널(102)로 가는 것을 방지한다.
작동 중에, 세포 시료가 시료 포트(114)를 통해 미세유체 장치에 제공될 수 있다.
도 3은 세포(403)를 포함하는 유체 시료의 시료 포트(114)를 통한 추가를 도시한다. 도 3에서, 시료 포트(114)는 고압에서 작동하고, 폐기 포트(118)는 저압에서 작동하며, 용해 포트(116)와 분배 포트(122)는 기준 압력(datum pressure)에서 작동하고, 추출 포트(124)는 폐쇄되어 있다. 이러한 배열 형태를 고려하면, 시료는 시료 전달 채널(126)을 통해 폐기 포트(118)로 유동한다.
도 4는 질의를 위한 세포 트랩(402)에서의 세포(403)의 포획을 도시한다. 도 4에서, 시료 포트(114), 용해 포트(116) 및 폐기 포트(118)가 기준 압력에서 작동하고, 분배 포트(122)는 저압에서 작동하고, 추출 포트(124)는 폐쇄되어 있다. 이러한 배열 형태의 효과는 세포(403)를 세포 트랩에 유지시키는 차압을 제공한다는 것인데, 예컨대 세포 트랩(402) 내의 세포를 개구(404) 쪽으로 바이어스시키는 흡입 효과가 있다. 그러나 세포(403)는 개구(404)를 통과할 수 없다. 세포(403)가 세포 트랩(402)에 유지되고 나면, 유리 커버슬립을 통한 육안 검사가 가능하다. 육안 검사의 목적은 세포(403)가 중기 세포이고 이에 따라 염색체 현탁액을 얻기에 적합하다는 것을 확인하는 것이다.
만일 세포(403)가 중기 세포가 아니면, 예컨대 분배 포트(122)를 통해 배압을 인가하고 폐기 포트(118)를 통해 세포를 배출하는 것에 의해, 세포(403)는 세포 트랩(402)으로부터 비워진다. 즉, 분배 포트(122)는 고압에서 작동하고, 폐기 포트(118)는 저압에서 작동하고, 시료 포트(114)와 용해 포트(116)는 기준 압력에서 작동하고, 추출 포트(124)는 폐쇄되어 있다.
만일 세포가 중기 세포이면, 세포는 세포막을 파열시키고 세포 내로부터 염색체를 방출시키는 용해 프로세스를 거친다. 이 프로세스는 도 5에 도시되어 있다. 도 5에서,
용해 포트(116)를 고압(예컨대, 40 내지 45mBar)에서 작동시키는 것에 의해 용해 완충액(405)이 가해지고, 분배 포트(122)는 저압(예컨대, 35mBar의 기준 압력 이하, 예컨대 30mBar 미만)에서 작동하고, 시료 포트(114)와 폐기 포트(118)는 기준 압력(예컨대, 35mBar)에서 작동하고, 추출 포트(124)는 폐쇄되어 있다. 이 배열 형태의 효과는 용해 완충액(405)이 용해 포트(116)로부터 용해될 세포와 접촉하는 용해 채널(502)을 통해 유동한다는 것이다.
그러면 압력 펄스는 세포를 개구를 통해 그리고 세포막을 전단시키는 것에 의해 세포를 용해시키는 수축부를 따라 밀어 넣고, 그리고 세포의 (하나 이상의 염색체 클러스터를 포함하는) 내용물을 입구(104)를 통해 유동 채널(102)로 전달하는 데 사용된다. 이러한 압력 배열 형태에서는, 시료 포트(114), 폐기 포트(118) 및 용해 포트(116)가 펄스 압력 하에서 작동하고, 분배 포트(122)는 저압에서 작동하며, 추출 포트(124)는 폐쇄되어 있다.
용해 완충액은 타입 1 초순수, 2v/v% 아세트산, 폴리에틸렌글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르(친수성 폴리에틸렌 옥사이드 사슬(평균적으로 9.5개의 에틸렌 옥사이드 단위를 가짐) 및 친유성 또는 소수성 방향족 탄화수소 그룹들을 갖는 비이온성 계면활성제)이라고도 하는 5w/v% 트리톤 X-100, 0.1w/v% 펩신, 75mM 포타슘 클로라이드를 포함할 수 있는 수용액이다. 이 완충액에서, 아세트산은 염색체 형태를 고정시키고 보존하고, 트리톤 X-100은 세포막 성분들 및 소수성 단백질들을 가용화/용해시키며 염색체들을 해제시키는 2차적 역할을 하고, 펩신은 개개의 염색체들을 클러스터들로부터 해제하며 세포 분해를 돕고 세포 단백질들을 제거하고, 포타슘 클로라이드는 삼투압을 통해 세포들을 팽창시키고 펩신 용해도를 향상시키는 데 사용되는 염이다. 대안적으로, 완충액은 0.1w/v% 펩신, 1mM EDTA, 73mM 포타슘 아세테이트 완충액, 2mM 마그네슘 설페이트를 포함할 수 있으며, 아세트산을 이용하여 pH5로 완충될 수 있다. 대안적으로, 이 완충액들 중 어느 것에서도 아세트산의 고정 역할은 정착성 포름알데히드에 의해 수행될 수 있다. 통상의 기술자는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 다른 완충액 조성물이 또한 용해 및/또는 분리 완충액으로 사용되기에 적합할 것임을 이해할 것이다.
도 2는 압력 펄스를 사용하여 수축부(202)를 통해 염색체 클러스터들을 추진시키는 것을 도시한다. 이는 용해 포트(116)를 통해 고압 펄스(예컨대 300 내지 1000mBar)를 인가하는 것에 의해 달성된다. 이 작동 모드 하에서, 시료 포트(114)와 폐기 포트(118)는 기준 압력(예컨대, 35mBar)에서 작동하고, 분배 포트(122)는 저압(예컨대, <30mBar)에서 작동하고, 추출 포트(124)는 폐쇄되어 있다. 용해 포트(118)로부터의 추가 압력은 막혀 있는 클러스터 염색체들(204)(예컨대, 수축부(202)의 좁은 개구에서 포획되었을 수 있는 하나 이상의 염색체 클러스터)을 수축부(202)를 통해 추진시킴으로써 하나 이상의 염색체 클러스터가 높은 전단 응력 조건을 거치게 하여 하나 이상의 염색체 클러스터(204)를 단일 염색체들(203) 및/또는 보다 작은 염색체 클러스터들로 파괴한다. 이 프로세스는 여러 존들에 대해 반복된다.
대안적인 접근법은 고압 펄스를 시료 포트(114)(예컨대, 250 내지 950mBar 또는 250 내지 1,000mBar), 폐기 포트(예컨대, 250 내지 950mBar 또는 250 내지 1,000mBar), 및 용해 포트(116)(예컨대, 300 내지 1,000mBar)를 통해 인가하는 것인데, 분배 포트(122)는 저압(예컨대, 0mBar)이고, 추출 포트(124)는 폐쇄된다.
위에서 설명한 압력 체제 하에서, 수축부 존들을 통한 전단 응력은 수축부의 치수와 인가되는 압력에 따라 약 0.02N/m2 내지 15,000N/m2 범위에 있다.
용해 완충액과 용해 포트(116)와 분배 포트(122) 간의 차압의 조합은 세포막을 파열시키고 세포 내용물을 개구(404)를 통해 유동 채널(102)로 추진시키는 화학적으로 보조되는 전단 용해 프로세스를 유도한다. 세포의 내용물은 하나 이상의 염색체 클러스터(204)(및 잠재적으로 단일 염색체들(203))를 포함한다. 그러면 하나 이상의 염색체 클러스터는 염색체들을 분리하는 위에서 설명한 바와 같은 채널(102) 내에서의 전단력 처리 프로세스를 거치게 된다.
도 6은 세포가 용해되고 염색체들(105)이 유동 채널(102)로 배출되고 난 후에 존들 중 하나의 확장 영역(110)을 통해 이동하는 미세유체 장치(100)의 작동을 도시한다. 도 6에서, 시료 포트(114), 용해 포트(116), 폐기 포트(118)는 용해 완충액 설정을 유지하며, 분배 포트(122)는 기준 압력에서 작동하고, 추출 포트(124)는 폐쇄되어 있다. 따라서 염색체들을 유동 채널(102)의 입구(104)로부터 유동 채널의 출구(106)를 향해 추진시키는 차압이 유동 채널을 가로질러 존재한다. 확장 영역은 존(1)의 확장 영역(110)을 통해 분산되고 분리되는 단일 염색체들(203)을 보이고 있다. 확장 영역(110)은 단일 염색체들의 분산을 보조하는 예컨대 헤링본 믹서(herringbone mixer)와 같은 혼합 장치를 포함할 수 있다.
염색체들이 분리되고 나면, 예컨대 형광 신호들의 실시간 기록에 의해 염색체들이 출구(106)에서 검출된다. 각각의 검출 이벤트는 분배 시스템이 활성화되게 트리거한다. 도 7과 도 8은 염색체들의 검출 및 카운트, 그리고 추출 포트(124)를 통한 단일 염색체들의 미세유체 장치(100) 외부로의 전달을 도시한다. 도 7은 광검출기(702)를 이용하여 출구(106)에서 단일 염색체들(203)을 검출하는 것을 도시한다. 검출 리스트릭션(703)은 염색체들이 단일 파일(single file)로 있는 것을 보장한다. 염색체의 검출시, 분배 시스템에 활성화된다. (만일 있다면, 펩신 작용에 의해 염색체 형태가 붕괴되는 것을 중지시키는) 중화 완충액의 유동이 분배 포트(122)를 통해 제공됨으로써 검출된 염색체를 포획하여 미세유체 장치(100)로부터 분배한다. 각각의 염색체는 미세유체 장치로부터 액적의 형태로 배출된다. 액적은 리셉터클(예컨대, 유리 슬라이드 또는 특수 웰 플레이트) 위에 분배된다. 구체적으로, 염색체가 검출되고 나면, 추출 포트(124)의 밸브가 (도 7에 도시된) 폐쇄 위치로부터 개방 위치로 전환되고, 분배 포트(122)의 압력이 증가하여 중화제를 제공한다. (도 8에 도시된) 증가한 유동은 단일 염색체(203)가 출구(106)로부터 분배 채널(704)로 분배되게 하고, 단일 염색체는 후속해서 웰 플레이트 또는 유리 슬라이드 상에 안착된다. 증가한 유동(709)은 또한 유동 채널(102)에서의 유동 역전을 일으켜서 염색체들이 분리된 상태로 유지되는 것을 돕는다.
예를 들어, 검출 중에 시료 포트(116)와 폐기 포트(118)는 0mBar에서 작동하고, 용해 포트(116)는 2 내지 5mBar에서 작동하며, 분배 포트(122)는 2mBar에서 작동한다. 대안적인 예로, 검출 중에 시료 포트(116)와 폐기 포트(118)는 10mBar에서 작동하고, 용해 포트(116)는 20mBar에서 작동하며, 분배 포트(122)는 2mBar에서 작동한다. 이러한 낮은 차압은 유동 채널(102)을 통과하는 유동을 느리게 함으로써 출구(106)에서 염색체들을 검출할 수 있게 한다. 염색체가 검출되고 나면, 분배 포트(122)의 압력이 15mBar로 증가하여 염색체를 출구(106)로부터 분배 채널(704)로 분배한다.
도 9는 단일 염색체(203)를 포함하는 200nL 액적(900)이 분배 채널(704)의 출구로부터 분배 튜브(705)를 통한 이동 중인 웰 플레이트 상에 안착하는 것을 도시한다. 이 프로세스는 각각의 염색체가 웰 플레이트(902) 상에 어레이로 안착될 때까지 반복될 수 있는데, 예컨대 인간 세포로부터 채취된 염색체들의 경우 각각이 단일 염색체를 포함하는 46개의 개별 액적들이 있을 것이다. 분배 튜브의 소수성 코팅(706)은 액적들이 분배 튜브(705)에 달라붙지 않는 것을 보장한다. 도 9는 또한 분배 채널(704)을 카트리지(707)와 유리 커버슬립(708)과의 관계에서 도시한다
도 10은 기준 압력을 갖는 본 발명의 일 실시예에 따른 펌프 장치를 도시한다. 이 실시예에서, 시료 포트(114)는 기준 압력이 35mBar로 설정된 69mBar 압력 펌프를 사용하도록 구성되고, 용해 포트(116)는 기준 압력이 35mBar로 설정된 1000mBar 압력 펌프를 사용하도록 구성되고, 폐기 포트(118)는 기준 압력이 35mBar로 설정된 70mBar 압력 펌프를 사용하도록 구성되고, 분배 포트(122)는 기준 압력이 35mBar로 설정된 345mBar 압력 펌프를 사용하도록 구성되고, 추출 포트(124)는 보통 폐쇄되어 있다.
위에서 개괄적으로 설명한 바와 같이, 미세유체 장치(100)는 미세유체 장치의 여러 유체 포트들을 압력/유동 제어기들에 연결하는 것에 의해 실시된다. 345mBar 압력 펌프들은 시료 포트(114) 및 폐기 포트(118)에 연결되는데, 이는 이들이 낮은 유속을 생성하고 유지시키는 압력 변화 시에 높은 분해능을 필요로 하는 세포 선별 및 포획 중에 세포 운동을 제어하는 데 사용되기 때문이다. 하나의 1000mBar 압력 펌프가 용해 포트(116)에 연결되어 트랩에 유지되는 세포에 전단력을 유도하는 고압 펄스를 제공한다. 69mBar는 분배 포트(122)에 연결되어 염색체 전달을 위한 분배 채널 내의 압력 강하를 허용한다. 분배 채널(704)은 액적들을 분배할 때를 제외하고는 작동 중에 보통은 폐쇄되어 있을 추출 포트(124)에 밸브(개스킷 상의 착좌 튜브)를 구비할 것이다. 모든 압력 제어기들은 초기에는 35mBar의 기준 압력으로 설정되고, 미세유체 장치(100) 내에서 필요로 하는 유동 방향에 따라 각각의 압력 라인이 이 기준 압력으로부터 상승하거나 하강할 수 있다.
대안적으로, 이 실시예에서, 시료 포트(114)는 기준 압력이 35mBar로 설정된 1000mBar 압력 펌프를 사용하도록 구성되고, 용해 포트(116)는 기준 압력이 35mBar로 설정된 1000mBar 압력 펌프를 사용하도록 구성되고, 폐기 포트(118)는 기준 압력이 35mBar로 설정된 1000mBar 압력 펌프를 사용하도록 구성되고, 분배 포트(122)는 기준 압력이 35mBar로 설정된 345mBar 압력 펌프를 사용하도록 구성되고, 추출 포트(124)는 보통 폐쇄되어 있다.
위에서 개괄적으로 설명한 바와 같이, 미세유체 장치(100)는 미세유체 장치의 여러 유체 포트들을 압력/유동 제어기들에 연결하는 것에 의해 실시된다. 1000mBar 압력 펌프들은 시료 포트(114) 및 폐기 포트(118)에 연결되는데, 이는 이들이 낮은 유속을 생성하고 유지시키는 압력 변화 시에 높은 분해능을 필요로 하는 세포 선별 및 포획 중에 세포 운동을 제어하는 데 사용되기 때문이다. 하나의 1000mBar 압력 펌프가 용해 포트(116)에 연결되어 트랩에 유지되는 세포에 전단력을 유도하는 고압 펄스를 제공한다. 345mBar는 분배 포트(122)에 연결되어 염색체 전달을 위한 분배 채널 내의 압력 강하를 허용한다. 분배 채널(704)은 액적들을 분배할 때를 제외하고는 작동 중에 보통은 폐쇄되어 있을 추출 포트(124)에 밸브(개스킷 상의 착좌 튜브)를 구비할 것이다. 모든 압력 제어기들은 초기에는 35mBar의 기준 압력으로 설정되고, 미세유체 장치(100) 내에서 필요로 하는 유동 방향에 따라 각각의 압력 라인이 이 기준 압력으로부터 상승하거나 하강할 수 있다.
분배는 분배 튜브(705)(예를 들어, 본 실시예의 분배 튜브는 외경이 0.79mm이고, 내경이 0.15mm이고 길이가 7mm임)를 통해 미세유체 장치(100)로부터 액적들을 분배하는 것에 의해 수행되는데, 각각의 액적은 염색체를 함유한다. 이는 분배 포트(122)에 더 높은 압력을 생성하고 추출 포트(124)의 밸브를 개방하는 것에 의해 실시된다. 그러면, 압력 강하로 인해 유체가 유동 채널(704)을 통과하여, 분배 튜브를 통과하여 그리고 분배 튜브 팁 밖으로 이동한다. 정확한 액적 크기(액적 크기는 압력 강하의 변화에 따라 변화하지만 예시적인 크기는 200nL임)가 생성되면, 각각의 액적이 유리 슬라이드 또는 특수하게 설계된 웰 플레이트 상에 분배될 것이다. 그런 다음 분배 포트(122)로부터의 압력 기준 압력으로 복귀할 것이다. 액적은 형성된 액적의 표면 장력에 의해 리셉터클에 부착된다. 각각의 액적을 어레이로 그리고 리셉터클 위에 분배하기 위해, 리셉터클을 유지하는 자동화된 기구가 사용된다. 기구는 카트리지와 독립적으로 3개의 축선으로 이동하는데, 예를 들어 x축선 및 y 축선을 따라 이동하여 리셉터클 위에 액적 어레이를 생성하고 z축선으로는 각각의 액적을 리셉터클에 부착시킨다.
본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명이 발명의 설명 또는 도면에 언급되거나 혹은 그로부터 명백하게 알 수 있는 개별 피처들 중 둘 이상의 모든 대안적인 조합들에까지 확장된다는 점을 이해할 것이다. 이러한 각기 다른 조합들 전부가 본 발명의 여러 대안적인 태양들을 구성한다. 예를 들어, 위에서 설명한 개별 피처들의 대안적인 구성 형태(topologies)가 본 발명의 대안적인 태양들을 구성한다는 점을 이해할 것이다.

Claims (20)

  1. 중기 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 미세유체 장치로,
    유동 채널을 포함하고,
    유동 채널은,
    중기 염색체들을 포함하는 유체를 받아들이는 입구,
    개별 중기 염색체들을 개별적으로 분배하는 출구,
    일련의 확장 영역들, 및
    일련의 확장 영역들 중 연속하는 확장 영역들 사이에 위치된 하나 이상의 수축부들을 포함하되,
    수축부들이 중기 염색체들을 서로 분리하기에 충분한 전단 응력을 가하도록 작동 가능하고, 그리고
    확장 영역들은 염색체들을 서로 분산시키도록 작동 가능한 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  2. 중기 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 미세유체 장치로,
    약 10μm 내지 약 30μm의 폭을 가지는 유동 채널을 포함하고,
    유동 채널은,
    입구,
    출구, 및
    일련의 확장 영역들 및 일련의 확장 영역들의 연속하는 확장 영역들 사이에 위치되는 하나 이상의 수축부를 포함하되,
    복수의 확장 영역들의 채널 폭이 약 50μm 내지 약 150μm이며, 복수의 수축부들의 각각의 수축부의 최소 폭이 약 1μm 내지 약 3μm인 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    유동 채널의 깊이가 약 5μm 내지 최대 약 40μm인 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  4. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    유동 채널의 길이가 약 2mm 내지 약 15mm인 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  5. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    입구로부터 출구까지 각각의 연속하는 수축부의 최소 폭이 앞선 수축부의 최소 폭보다 작은 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  6. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    하나 이상의 수축부 중 하나 이상이 확장형으로 테이퍼진 출구를 구비하는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  7. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    일련의 확장 영역들의 확장 영역들 각각의 폭이 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  8. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    일련의 확장 영역들이 적어도 3개의 확장 영역들 및 최대 20개의 확장 영역들을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  9. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    유동 채널이 일련의 확장 영역들의 각각의 확장 영역들 사이에 하나 이상의 수축부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  10. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    입구의 폭이 2μm 내지 3μm인 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  11. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    미세유체 장치가 입구의 상류측에 세포 포획 및 용해 구조물을 더 포함하고,
    세포 포획 및 용해 구조물은 세포를 포함하는 유체 시료로부터 세포를 포획하여 유지하도록 구성되고 유동 채널 입구에 인접한 세포 트랩 및 세포 트랩에 용해 완충액을 도입하도록 구성된 용해 포트를 포함하고,
    세포 트랩은 세포의 검사를 가능하게 하는 관찰 요소, 및 통로를 통해 유동 채널에 연결된 개구를 포함하며, 개구와 통로는 세포가 통과하는 것을 방해하는 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  12. 청구항 11에 있어서,
    개구의 크기가 약 10μm 내지 20μm이고, 통로의 폭은 약 2μm 내지 약 3μm인 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  13. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    세포 트랩이 미세유체 장치 내의 직육면체 형상의 중공 형성물이고, 세포가 세포 트랩에 유입되는 것을 허용하는 개방된 면을 구비하는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  14. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    출구의 하류측에 염색체 분배 구조물을 더 포함하고,
    염색체 분배 구조물은 채널 입구와 채널 출구 사이에 획정되는 분배 채널을 구비하며, 분배 채널은 유동 채널의 출구로부터 개개의 염색체를 받아들이는 포트를 구비하고,
    채널 출구는 분배 튜브에 연결되고, 분배 튜브는 미세유체 장치로부터의 단일 염색체들을 단일 염색체를 포함하는 유체 액적의 형태로 분배하도록 구성된 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  15. 중기 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 방법으로,
    중기 염색체 함유 유체를 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 따른 미세유체 장치를 통과시키되, 수축부들이 중기 염색체들에 충분한 전단 응력을 가하여 중기 염색체들을 서로 분리시키는 압력에서 통과시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 방법으로,
    중기 염색체를 포함하는 염색체 함유 유체를 미세유체 장치를 통과시키는 단계로, 미세유체 장치는 유동 채널을 구비하고, 유동 채널은, 입구와 출구 사이에 위치되는 복수의 확장 영역들 및 확장 영역들 중 하나 이상 사이에 위치되는 하나 이상의 수축부들을 포함하는 단계,
    중기 염색체들이 수축부들에서 또는 수축부들 내에서 중기 염색체들을 서로 분리하기에 충분한 전단 응력을 받게 하는 단계, 및
    복수의 확장 영역들에서 분리된 중기 염색체들을 서로 분산시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 미세유체 장치를 이용하여 염색체 함유 유체에서 중기 염색체들을 분리하기 위한 방법으로,
    유체를 미세유체 장치의 유동 채널을 통과시키는 단계로, 유동 채널은 복수의 교번하는 수축부들과 확장부들을 구비하는 단계를 포함하고,
    유체가 수축부를 통과할 때, 방법이 중기 염색체들을 서로 분리하기에 충분한 전단 응력을 중기 염색체들이 받게 하는 압력을 인가하는 단계를 포함하고,
    유체가 확장부를 통과할 때, 미세유체 장치는 서로 분리된 염색체들을 분산시키는 압력에서 작동되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 15 내지 청구항 17 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전단 응력이 수축부의 최소 폭의 벽에서 측정할 때 적어도 약 0.02N/m2 내지 적어도 약 15,000N/m2인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 15 내지 청구항 18 중 어느 한 청구항에 있어서,
    방법이, 초기에,
    미세유체 장치의 세포 트랩에 중기 세포를 포획하는 단계, 및
    용해 완충액을 중기 세포에 도입하고, 압력 펄스를 인가하여 세포를 용해시키고 염색체 함유 유체에 염색체들을 제공하기에 충분한 전단 응력 하에서 중기 세포를 세포 트랩으로부터 유동 채널로 추진시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 15 내지 청구항 19 중 어느 한 청구항에 있어서,
    미세유체 장치의 유동 채널의 출구로부터 분배 채널로 분배되는 개개의 염색체들을 받아들이는 단계,
    개개의 염색체들을 분배 튜브로 운반하는 단계, 및
    단일 염색체를 단일 염색체를 포함하는 유체 액적의 형태로 분배하는 미세유체 장치로부터 분배 튜브를 통해 분배하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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