KR20210110277A - Pharmaceutical composition for preventing or treating muscle weakness diseases comprising Nitrendipine - Google Patents

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KR20210110277A
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박성섭
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Abstract

The present invention relates to a composition for promoting differentiation of myoblasts comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle weakness-related diseases, a food composition for preventing or alleviating muscle weakness-related diseases, a composition for muscle strengthening, a feed or feed additive for muscle strengthening, and a composition for alleviating wrinkles due to muscle weakness. In addition, the present invention relates to a method for promoting differentiation of myoblasts using nitrendipine or the pharmaceutically acceptable salt thereof, a method for manufacturing differentiated myoblasts, and a method for treating muscle weakness-related diseases.

Description

니트렌디핀 (Nitrendipine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating muscle weakness diseases comprising Nitrendipine}Pharmaceutical composition for preventing or treating muscle weakness-related diseases, comprising Nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof

본 발명은 니트렌디핀 (Nitrendipine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근원세포의 분화 촉진용 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 근력강화용 조성물 및 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제, 근력 약화에 의한 주름의 개선용 조성물에 관한 것이다.The present invention provides a composition for promoting differentiation of myoblasts comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle weakness-related diseases, preventing or improving muscle weakness-related diseases It relates to a food composition, a composition for muscle strengthening, and a feed or feed additive for muscle strengthening, and a composition for improving wrinkles due to muscle weakness.

또한, 본 발명은 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이용한 근원세포의 분화 촉진 방법, 분화된 근원세포의 제조방법 및 근력 약화 관련 질환의 치료방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for promoting differentiation of myoblasts using nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a method for producing differentiated myoblasts, and a method for treating muscle weakness-related diseases.

근력의 약화를 유발하는 질환은 노화와 함께 진행되는 근감소증 (sarcopenia), 단백질 대사의 불균형이나 근육사용 감소에서 유발되는 근위축증 (muscle atrophy), 기아, 소모성질환 (암 등), 노화와 함께 진행되는 심위축증 (acardiotrophy)등이 있다. Diseases that cause muscle weakness include sarcopenia that progresses with aging, muscle atrophy caused by imbalance in protein metabolism or decreased muscle use, starvation, wasting disease (cancer, etc.), and diseases that progress with aging. and acardiotrophy.

근감소증 (sarcopenia)은 노화가 진행되는 동안 근육량 (skletal muscle mass) 감소에 따른 근력의 저하를 일컫는다. 근감소증에서는 가장 큰 특징인 근육량의 감소뿐만 아니라, 근섬유의 종류 변화도 관찰된다. 나이가 들어가면 타입 1과 타입 2가 비슷한 비율로 감소하는데 반해, 근감소증이 오면 타입 2의 근섬유 두께에는 큰 변화가 없지만 타입 1 근섬유 두께는 눈에 띄게 감소한다. 이러한 근감소증은 노인들 사이에서 일어나는 노쇠와 기능 장애를 유발한다고 보고되고 있다 (Roubenoff R., Can. J. Appl. Physiol. 26, 78-89, 2001).Sarcopenia refers to a decrease in muscle strength due to a decrease in skletal muscle mass during aging. In sarcopenia, not only a decrease in muscle mass, which is the biggest characteristic, but also a change in the type of muscle fibers is observed. Type 1 and type 2 decrease at a similar rate with age, whereas with sarcopenia, there is no significant change in the thickness of the type 2 muscle fiber, but the thickness of the type 1 muscle fiber decreases remarkably. It has been reported that such sarcopenia causes senility and dysfunction among the elderly (Roubenoff R., Can. J. Appl. Physiol. 26, 78-89, 2001).

근감소증은 다양한 요인에 의해 유발되나, 각각의 요인들에 대한 연구는 아직 미진하다. 성장 호르몬의 감소 또는 신경학적 변화 (neurological change), 생리활성 (physical activity)의 변화, 대사의 변화, 성호르몬의 양 또는 지방이나 카타볼릭 싸이토카인 (catabolic cytokines)의 증가와 단백질의 합성과 분화의 균형 변화에 의해 유도된다 (Roubenoff R. and Hughes V.A., J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 55, M716-M724, 2000). 근감소증의 가장 큰 특징인 근육량 감소의 원인으로는 위성 세포의 활성 (satellite cell activation) 감소가 중요한 원인으로 손꼽힌다. 위성 세포란, 기저막 (basement membrane)과 근섬유의 근 (sarcolemma) 사이에 위치하고 있는 작은 단핵 세포이다. 이들은 부상 또는 운동과 같은 자극에 의해 활성화되어 근원세포 (myoblast)로 증식하며, 분화가 진행되면 다른 세포와 융합되어 다핵의 근섬유를 형성한다. 따라서 위성 세포의 활성이 감소함에 따라 손상된 근육을 재생하는 능력이나 분화 신호에 대한 반응이 떨어지게 되고 그 결과 근육 형성이 저하된다.Sarcopenia is caused by various factors, but studies on each factor are still insufficient. A decrease in growth hormone or neurological change, a change in physiological activity, a change in metabolism, an increase in the amount of sex hormone or fat or catabolic cytokines, and the balance of protein synthesis and differentiation induced by changes (Roubenoff R. and Hughes VA, J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 55, M716-M724, 2000). As the cause of the decrease in muscle mass, which is the biggest characteristic of sarcopenia, a decrease in satellite cell activation is considered an important cause. The satellite cell is a small mononuclear cell located between the basement membrane and the muscle of the muscle fiber (sarcolemma). They are activated by stimuli such as injury or exercise to proliferate into myoblasts, and when differentiation progresses, they fuse with other cells to form multinucleated muscle fibers. Therefore, as the activity of the satellite cells decreases, the ability to regenerate damaged muscles or the response to differentiation signals decreases, resulting in decreased muscle formation.

근위축증 (Muscle atrophy)은 영양결핍이나 장기간 근육을 사용하지 않은 경우에 유발되는데 정상적인 단백질의 합성과 분해의 균형이 붕괴되어 단백질이 분해됨으로서 나타나게 된다. Muscle atrophy (Muscle atrophy) is caused by nutritional deficiencies or when muscles have not been used for a long period of time.

한편, 심위축증 (acardiotrophy)은 기아, 소모성질환 (암 등), 또는 노쇠했을 때 유발되는데 심근섬유는 마르고 가늘어 지고 핵은 농축되어 대소부동이 된다. 따라서 근속 (muscle fascicle)도 용적이 줄고 심장 전체가 작아지며 심외막하의 지방조직은 뚜렷하게 감소하고 관상동맥은 굽어진다. 심근섬유의 핵 양단에 갈색의 색소로서 소모성 색소 (리포푸스친)가 나타나고 지방조직의 감소와 함께 심장 전체가 갈색조를 나타낸다.On the other hand, acardiotrophy is caused by starvation, wasting disease (cancer, etc.), or senility. Therefore, the volume of the muscle fascicle is also reduced, the whole heart becomes smaller, the subepithelial adipose tissue is clearly reduced, and the coronary arteries are curved. Consumable pigment (lipofuscin) appears as a brown pigment at both ends of the nucleus of myocardial fibers, and the whole heart exhibits a brownish tint along with a decrease in adipose tissue.

근감소증과 같은 근력 약화 관련 질환의 치료방법으로는 크게 3 가지 방법이 알려져 왔다. 첫 번째는 운동이다. 운동은 단기적으로 골격근의 단백질 합성 능력을 증가시키며, 노인들의 근육의 힘이나 운동성을 증가시킨다고 보고되고 있다. 그러나 장기적 치료방법에 부적절하다 (Timothy J. Doherty, J. Appl. Physiol. 95, 1717-1727, 2003). 두 번째는 약물치료로서 테스토스테론 (Testosterone) 또는 아나볼릭 스테로이드 (anabolic steroid)의 사용이 가능하나 이는 여성에게는 남성화를 유도하며, 남성의 경우 전립선 증상 (prostate symptoms) 등 부작용을 나타낸다. 다른 승인된 처방법으로 DHEA (dehydroepiandrosterone)와 성장 호르몬이 있는데 SARMs (Selective Androgen Receptor Modulators)을 포함하는 부위에서 치료법으로 가능하다는 연구가 보고된 바 있다 (D.D. Thompson, J. Musculoskelet Neuronal Interact 7, 344-345, 2007). 또한 식이요법이 치료법으로 알려져 있지만 영양평가에 의하면 영양실조나, 현대 식습관은 적당한 총체질량 (total body mass)을 유지하기 위해 부적절하다.As a treatment method for muscle weakness-related diseases such as sarcopenia, three major methods have been known. The first is exercise. It has been reported that exercise increases the protein synthesis ability of skeletal muscle in the short term, and increases muscle strength and mobility of the elderly. However, it is not suitable for long-term treatment (Timothy J. Doherty, J. Appl. Physiol. 95, 1717-1727, 2003). Second, testosterone or anabolic steroid can be used as drug treatment, but this induces masculinization in women, and in men, it exhibits side effects such as prostate symptoms. Other approved regimens include DHEA (dehydroepiandrosterone) and growth hormone, which has been reported to be therapeutic at sites containing SARMs (Selective Androgen Receptor Modulators) (DD Thompson, J. Musculoskelet Neuronal Interact 7, 344-345). , 2007). In addition, although diet is known as a cure, nutritional evaluation has shown that malnutrition or modern eating habits are inadequate to maintain adequate total body mass.

최근에는 위성 세포를 분리하여 체외에서 분화시킨 후 체내에 도입시키는 줄기세포치료법 (stem cell therapy)과 직접 체내의 위성 세포를 활성화하여 근육 분화 (myogenesis)를 촉진시켜 근육을 유지하거나 강화시키는 방법이 근감소증과 같은 근력약화를 치료할 수 있는 방법으로 대두되고 있다 (Shihuan Kuang, and Michael A. Rudnicki, Trends in Molecular Medicine 14, 82-31, 2008). 따라서 근육의 근력약화 관련 질환을 치료하기 위해 보다 근본적이며 부작용이 없는 치료방법으로 근원세포를 분화하는 방법이 요구되며, 이에 따라 근원세포의 분화를 촉진할 수 있는 물질의 개발이 필요한 실정이다.Recently, stem cell therapy, which separates satellite cells, differentiates them outside the body, and introduces them into the body, and a method for maintaining or strengthening muscles by directly activating satellite cells in the body to promote muscle differentiation (myogenesis). It is emerging as a method to treat muscle weakness such as sarcopenia (Shihuan Kuang, and Michael A. Rudnicki, Trends in Molecular Medicine 14, 82-31, 2008). Therefore, in order to treat diseases related to muscle weakness, a method for differentiating myoblasts is required as a more fundamental and no side effect treatment method, and accordingly, it is necessary to develop a substance that can promote the differentiation of myoblasts.

이에, 본 발명자들은 근원세포의 분화를 촉진함으로써 근육량을 증가시키고, 근육기능을 효과적으로 회복시키는 근육의 근력 약화 관련 질환 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물이 근원세포의 분화를 촉진하여 근력약화 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to develop a therapeutic agent for muscle weakness related diseases that increase muscle mass by promoting differentiation of myoblasts and effectively restore muscle function, and as a result, nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof The present invention was completed by confirming that the composition comprising the composition can be used for the prevention or treatment of muscle weakness related diseases by promoting the differentiation of myoblasts.

본 발명의 하나의 목적은 근원세포 (myoblast)의 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a composition for promoting differentiation of myoblasts.

본 발명의 다른 목적은 근원세포의 분화 촉진 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for promoting differentiation of myoblasts.

본 발명의 또 다른 목적은 분화된 근원세포의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing differentiated myoblasts.

본 발명의 또 다른 목적은 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of muscle weakness related diseases.

본 발명의 또 다른 목적은 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving muscle weakness related diseases.

본 발명의 또 다른 목적은 근력강화용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for strengthening muscles.

본 발명의 또 다른 목적은 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a feed or feed additive for muscle strengthening.

본 발명의 또 다른 목적은 근력 약화에 의한 주름의 개선용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for improving wrinkles due to muscle weakness.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.This will be described in detail as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present invention may be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed herein fall within the scope of the present invention. In addition, it cannot be considered that the scope of the present invention is limited by the specific descriptions described below.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일구현예는 니트렌디핀 (Nitrendipine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근원세포 (myoblast)의 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.One embodiment of the present invention for achieving the above object relates to a composition for promoting differentiation of myoblasts comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명에서, "니트렌디핀"은 IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)의 명칭이 (RS)-3-Ethyl 5-methyl 2,6-dimethyl-4-(m-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate인 화합물을 말하며, 근원세포의 분화촉진 효과가 있는 한 이의 유도체 역시 본 발명의 범주에 포함된다. 그 예로, 본 발명의 실시예에서 사용한 니트렌디핀은 화학식은 C18H20N2O6 이고 분자량이 360.36인 화합물이나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 니트렌디핀은 다이하이드로피리딘 칼슘 통로 차단제 (dihydropyridine calcium channel blocker)로 고혈압 치료의 용도로 사용되고 있으나, 근원세포 분화와의 연관성에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다. 본 발명자들은 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 근원세포 분화 용도가 있음을 최초로 규명하여 본 발명을 완성하였으며, 니트렌디핀의 구조는 하기 화학식 1에 나타난 바와 같다.In the present invention, "nitrendipine" is the name of IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) (RS)-3-Ethyl 5-methyl 2,6-dimethyl-4-(m-nitrophenyl)-1,4 -dihydropyridine-3,5-dicarboxylate refers to a compound, and derivatives thereof are also included in the scope of the present invention as long as they have an effect of promoting differentiation of myoblasts. For example, nitrendipine used in Examples of the present invention has a chemical formula of C 18 H 20 N 2 O 6 and a molecular weight of 360.36, but is not limited thereto. In general, nitrendipine is used as a dihydropyridine calcium channel blocker for the treatment of hypertension, but nothing is known about its association with myoblast differentiation. The present inventors have completed the present invention by first finding out that nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof has the use for myoblast differentiation, and the structure of nitrendipine is as shown in Formula 1 below.

[화학식 1][Formula 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함될 수 있다.As used herein, the term "pharmaceutically acceptable salt" refers to a formulation of a compound that does not cause serious irritation to an organism to which the compound is administered and does not impair the biological activity and properties of the compound. The pharmaceutical salt is an acid that forms a non-toxic acid addition salt containing a pharmaceutically acceptable anion, for example, an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, etc., tartaric acid, formic acid, citric acid , organic carbonic acids such as acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicylic acid, etc., sulfonic acid such as methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc. Acid addition salts formed by phonic acid and the like may be included. For example, pharmaceutically acceptable salts of carboxylic acids include metal salts or alkaline earth metal salts formed with lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, etc., amino acid salts such as lysine, arginine, and guanidine, dicyclohexylamine, N organic salts such as -methyl-D-glucamine, tris(hydroxymethyl)methylamine, diethanolamine, choline and triethylamine, and the like may be included.

본 발명에서 사용되는 용어, "근원세포 분화"란, 단핵인 근원세포 (myoblast)가 융합을 통해 다핵의 근관 (myotube)를 형성하는 과정을 말하며, 분화가 거의 끝나는 후기에는 마이오신 중쇄 (MyHC, Myosin Heavy Chain)의 발현이 증가한다. 근원세포 분화와 관련하여, 근육 전구체 세포에 해당하는 근원세포는 자기복제 (self-renewal) 하는 경우에는 주로 Pax7+ 마커를 나타내며, 증식하는 경우 Pax7+/MyoD+를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 근관을 형성하는 분화단계의 세포는 예컨대 Pax7- MyoD+ MyoG+ 마커를 이용하여 구분할 수 있다. 상기 근관을 형성하는 분화 초기단계의 세포는 마이오신 D (MyoD)와 같은 근원성 전사인자 (myogenic transcription factor)의 발현이 증가할 수 있고, 중기에는 마이오신 G (MyoG)가 증가할 수 있다.As used herein, the term "myoblast differentiation" refers to a process in which mononuclear myoblasts form multinuclear myotubes through fusion, and at the late stage when differentiation is almost completed, myosin heavy chain (MyHC, Myosin Heavy Chain) expression is increased. With respect to myoblast differentiation, myoblasts corresponding to muscle precursor cells are known to mainly represent Pax7 + markers when self-renewing, and Pax7 + /MyoD + when proliferating. In addition, cells in the differentiation stage forming myotubes can be distinguished using, for example, Pax7 - MyoD + MyoG + markers. In the early stage of differentiation cells forming the myosin D (MyoD), the expression of a myogenic transcription factor such as myogenic transcription factor may increase, and in the middle stage, myosin G (MyoG) may increase.

상기 조성물은 혈청이 포함된 DMEM 분화용 배지일 수 있으나, 근원세포의 분화를 촉진할 수 있는 배지 또는 조성물이면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 조성물에 있어서, 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 일례로 0.01 μM 내지 2.0 μM의 농도로 포함될 수 있고, 0.05 μM 내지 1.5 μM의 농도로 포함될 수 있으며, 또는 0.1 μM 내지 1.0 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 조성물은 세포배양 또는 분화에 필요한 부가적인 물질을 더욱 포함할 수 있다.The composition may be a serum-containing medium for DMEM differentiation, but any medium or composition capable of promoting differentiation of myoblasts may be included without limitation. In the composition, nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be included at a concentration of, for example, 0.01 μM to 2.0 μM, 0.05 μM to 1.5 μM, or 0.1 μM to 1.0 μM. It may be included in the concentration, but is not limited thereto. In addition, the composition may further include additional substances necessary for cell culture or differentiation.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 분화용 배지 (DM)에 니트렌디핀을 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 및 2 μM의 농도별로 각각 처리한 후 세포 독성을 측정하였을 때, 니트렌디핀을 2.0 μM로 처리한 경우에도 1.0 mM H2O2를 처리한 값에 비하여 사멸 세포의 비율이 5 % 이내로 근세포 분화에 따른 독성이 매우 미미함을 확인하였는바 (도 3), 니트렌디핀은 세포에 미치는 독성이 거의 없이 분화를 촉진할 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, when cytotoxicity was measured after each treatment with nitrendipine in the differentiation medium (DM) at concentrations of 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 and 2 μM, Even when Trendipine was treated with 2.0 μM, it was confirmed that the ratio of apoptotic cells was within 5% of the value treated with 1.0 mM H 2 O 2 , confirming that the toxicity due to myocyte differentiation was very insignificant (FIG. 3), Nitrendi Fins can promote differentiation with little to no toxicity to cells.

본 발명의 또 다른 일구현예는 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 근원세포에 처리하는 단계를 포함하는, 근원세포의 분화 촉진 방법에 관한 것이다. 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 상기에서 설명한 바와 같다. 구체적으로, 상기 근원세포의 분화 촉진 방법은 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 체외 또는 체내 근원세포에 처리하여 분화를 촉진할 수 있다.Another embodiment of the present invention relates to a method for promoting differentiation of myoblasts, comprising treating the myoblasts with nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof is as described above. Specifically, in the method for promoting differentiation of myoblasts, nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be treated in vitro or in vivo to promote differentiation of myoblasts.

본 발명의 또 다른 일구현예는 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 근원세포에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함하는 분화된 근원세포의 제조방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a method for producing a differentiated myoblast comprising the step of differentiating the myoblast by treating the myoblast with nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 상기 제조방법은 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 체외 또는 체내 근원세포에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함하는 분화된 근원세포를 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.Nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof is as described above. The production method of the present invention may be characterized in that it comprises the step of differentiating the myoblasts by treating the myoblasts in vitro or in vivo with nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof to prepare differentiated myoblasts.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 니트렌디핀을 근원세포에 0.2 μM의 농도로 처리한 후, 근원세포의 분화정도를 위상차 현미경 (Phase Contrast microscopy)으로 관찰한 결과, 음성 대조군 (DMSO)에 비해 분화가 촉진되어 근관이 다수 형성되는 것을 확인하였으며 (도 4), 면역세포화학법 및 웨스턴 블랏을 통해서도 근세포 분화 촉진 효과가 매우 높음을 확인하였다 (도 5 및 도 6). In a specific embodiment of the present invention, after treating myoblasts with nitrendipine at a concentration of 0.2 μM, the degree of differentiation of myoblasts was observed with a phase contrast microscopy, as a result of which the differentiation was compared to the negative control (DMSO). It was confirmed that a large number of myotubes were formed by promoting , (FIG. 4), and it was confirmed that the myocyte differentiation promoting effect was very high through immunocytochemistry and Western blot (FIG. 5 and FIG. 6).

따라서, 본 발명은 근관을 형성할 수 있으며 MYH3 단백질을 발현하는 분화된 근원세포를 체외 또는 체내에서 제조할 수 있다.Accordingly, the present invention can form myotubes and can produce differentiated myoblasts expressing MYH3 protein in vitro or in vivo.

본 발명의 또 다른 일구현예는 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 농도는 상기에서 설명한 바와 같다.Another embodiment of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle weakness-related diseases, including nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The concentration of nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof is as described above.

본 발명에서 사용된 용어 "근력 약화"란 한 개 또는 그 이상의 근육의 힘이 감소된 상태를 의미한다. 상기 근력 약화는 어느 한 근육이나, 몸의 한쪽, 상지나 하지 등에 국한될 수도 있고, 전신에 걸쳐 나타날 수도 있다. 또한 근피로나 근육통을 포함하는 주관적인 근력 약화 증상은 이학적 검진을 통해 객관적인 방법으로 정량화될 수 있다.As used herein, the term “weakened muscle strength” refers to a state in which the strength of one or more muscles is reduced. The muscle weakness may be limited to any one muscle, one side of the body, upper or lower extremities, or the like, or may appear throughout the body. In addition, subjective muscle weakness symptoms including muscle fatigue and muscle pain can be quantified objectively through physical examination.

본 발명에서 근력 약화 관련 질환이란 근력약화로 인해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미하며, 구체적으로 체내 근세포 수가 감소하거나 위성세포 활성이 감소되어 근원세포의 분화능력이 감소 혹은 약화된 질환으로 근원세포 분화 촉진을 통해 예방, 개선 혹은 치료를 기대할 수 있는 질환을 말한다. 본 발명에서 근력 약화 질환은 예를 들어 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy), 또는 심위축증을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, muscle weakness-related disease refers to any disease that can occur due to muscle weakness, specifically, a disease in which the differentiation ability of myoblasts is reduced or weakened due to a decrease in the number of myocytes in the body or a decrease in the activity of satellite cells. Diseases that can be prevented, improved, or treated through In the present invention, the muscle weakness disease may include, for example, sarcopenia, muscular atrophy, muscle dystrophy, or cardiac atrophy, but is not limited thereto.

따라서, 본 발명의 조성물은 근원세포의 분화 촉진을 통해 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축 (muscle dystrophy), 또는 심위축증의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.Therefore, the composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of sarcopenia, muscular atrophy, muscle dystrophy, or cardiac atrophy by promoting differentiation of myoblasts.

구체적으로, 본 발명의 근감소증이란, 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소를 의미하는 것으로서, 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종신체기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다.Specifically, the sarcopenia of the present invention refers to a gradual decrease in skeletal muscle mass with aging, which directly causes a decrease in muscle strength, and as a result, refers to a state that can cause a decrease in various bodily functions and disorders.

또한 근위축증은 사지의 근육이 거의 좌우대칭적으로 점점 위축되어 가는 것으로서, 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성을 유발하여 근위축성 측삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 척수성 진행성 근위축증 (Spinal progressive muscular atrophy, SPMA)을 일으킬 수 있다.In addition, amyotrophic muscle is almost symmetrically atrophying the muscles of the extremities, and it causes progressive degeneration of motor nerve fibers and cells in the spinal cord, resulting in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and progressive spinal cord progressive muscle atrophy (Spinal). progressive muscular atrophy (SPMA).

근육 퇴행 위축 (muscle dystrophy)이란, 점진적인 근위축과 근쇠약이 나타나는 질환으로서, 병리학적으로 근육섬유의 괴사를 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 의미한다. 근세포막의 손상으로 근육섬유의 괴사와 퇴행과정을 거쳐 근력저하 및 위축이 발생하게 된다.Muscle dystrophy (muscle dystrophy) is a disease in which progressive muscle atrophy and muscle weakness appear, and pathologically refers to degenerative myopathy characterized by necrosis of muscle fibers. Damage to the muscle cell membrane leads to necrosis and degeneration of muscle fibers, resulting in muscle weakness and atrophy.

본 발명의 심위축증은 심장이 외부적이거나 내부적인 요인에 의해서 위축되어 가는 것으로서, 기아, 소모성질환, 노쇠했을때 심근섬유가 마르고 가늘어져 지방조직의 감소를 유발하는 심장의 갈색위축 증세를 일으킬 수 있다.Cardiac atrophy of the present invention is that the heart is atrophy due to external or internal factors, and when starvation, wasting disease, or old age, myocardial fibers dry and thin, which can cause brown atrophy of the heart that causes a decrease in adipose tissue. have.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 근육 약화 관련 질환의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "prevention" refers to any action that inhibits or delays the onset of muscle weakness-related diseases by administration of the composition.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 상기 조성물의 투여에 의해 근육 약화 관련질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “treatment” refers to any action in which symptoms caused by muscle weakness-related diseases are improved or beneficially changed by administration of the composition.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여, 상기 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.For administration, the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

본 발명의 약학적 조성물은 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared into a pharmaceutical formulation using methods well known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof. In the preparation of formulations, it is preferable to mix or dilute the active ingredient with a carrier, or to enclose the active ingredient in a carrier in the form of a container.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 일 예로 비경구용으로 제조할 수 있다. 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형일 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be applied in any formulation, for example, it can be prepared for parenteral use. Formulations for parenteral use may be in the form of injections, coatings, sprays, such as aerosols.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories. Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.

주사형 제형으로 제제화하기 위해서는 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제할 수 있다.In order to formulate an injectable formulation, nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof is mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, and it may be formulated for unit administration in ampoules or vials.

본 발명의 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물은 근력 약화 관련 질환이 발병한 개체 또는 발병 가능성이 있는 개체의 근력 강화가 필요한 부위에 직접 주입될 수 있으며, 체외 또는 체내 근원세포에 적용하여 분화된 근원세포를 제조한 후, 분화된 근원세포를 근력 약화 관련 질환이 발병한 개체 또는 발병 가능성이 있는 개체의 근력 강화가 필요한 부위에 주입할 수 있다.The pharmaceutical composition comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention can be directly injected into a site requiring muscle strength enhancement of an individual who has or is likely to develop a muscle weakness-related disease, and After the differentiated myoblasts are prepared by applying them to the myoblasts in the body, the differentiated myoblasts can be injected into the area where muscle strength enhancement is needed in an individual with or likely to develop a muscle weakness-related disease.

또한, 상기 조성물에는 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료에 방해가 되지 않는 한, 추가 성분 예를 들어, 근력 약화 관련 질환의 치료제로 알려져 있는 물질들이 포함될 수 있다.In addition, as long as nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof does not interfere with the prevention or treatment of muscle weakness-related diseases, the composition may contain additional ingredients, for example, substances known as therapeutic agents for muscle weakness-related diseases. can

구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 근원세포의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 니트렌디핀을 근원세포에 0.2 μM의 농도로 처리한 후, 근원세포의 분화정도를 위상차 현미경 (Phase Contrast microscopy)으로 관찰한 결과, 음성 대조군 (DMSO)에 비해 분화가 촉진되어 근관이 다수 형성되는 것을 확인하였으며 (도 4), 면역세포화학법 및 웨스턴 블랏을 통해서도 근세포 분화 촉진 효과가 매우 높음을 확인하였다 (도 5 및 도 6). 이러한 결과를 통하여, 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 근원세포의 분화를 촉진하는데 효과적이며 근육 약화 관련 질환의 예방 및 치료에 유용할 수 있음을 알 수 있었다.Specifically, the pharmaceutical composition of the present invention may be characterized in that it promotes differentiation of myoblasts. In an embodiment of the present invention, after treating myoblasts with nitrendipine at a concentration of 0.2 μM, the degree of differentiation of myoblasts was observed with phase contrast microscopy. It was confirmed that a large number of myotubes were formed by promoting it (FIG. 4), and it was also confirmed that the myocyte differentiation promoting effect was very high through immunocytochemistry and Western blot (FIGS. 5 and 6). Through these results, it was found that nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof is effective in promoting the differentiation of myoblasts and may be useful in the prevention and treatment of muscle weakness-related diseases.

본 발명의 또 다른 일구현예는 니트렌디핀 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 근육 약화 관련 질환을 예방 또는 개선하기 위하여 근육 약화 관련 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 질환 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다. 니트렌디핀 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염 및 근력 약화 관련 질환은 상기에서 설명한 바와 같다.Another embodiment of the present invention relates to a food composition for preventing or improving muscle weakness-related diseases, including nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The composition of the present invention may be used before or after the onset of a muscle weakness-related disease, simultaneously with or separately from a medicament for treating the disease, in order to prevent or ameliorate the muscle weakness-related disease. Nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof and muscle weakness-related diseases are as described above.

구체적으로, 상기 식품 조성물은 근원세포의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 한다.Specifically, the food composition is characterized in that it promotes differentiation of myoblasts.

본 발명에서 사용되는 용어 "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “improvement” refers to any action that at least reduces a parameter related to the condition being treated, for example, the severity of symptoms.

또한, 본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 예컨대 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.In addition, when the food composition of the present invention is used as a food additive, the composition may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. In general, in the production of food or beverage, the composition of the present invention may be added in an amount of, for example, 15% by weight or less, or 10% by weight or less with respect to the raw material. However, in the case of long-term intake for health and hygiene or health control, it may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount greater than the above range.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함 한다.There is no particular limitation on the type of the food. Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and it includes all health foods in the ordinary sense.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.The health beverage composition of the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as an additional component like a conventional beverage. As the above-mentioned natural carbohydrates, monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used. . The ratio of the natural carbohydrate can be appropriately determined by the selection of those skilled in the art.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.In addition to the above, the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, Carbonating agents used in carbonated beverages, etc. may be contained. In addition, the composition of the present invention may contain the pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, and vegetable beverage. These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 근력강화용 조성물에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention relates to a composition for strengthening muscles, comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

또한, 본 발명의 또 다른 일구현예는, 니트렌디핀 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 근력강화용 조성물에 관한 것이다.In addition, another embodiment of the present invention relates to a composition for strengthening muscles, comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 용어, "근력강화"란 신체 수행의 강화, 최대 지구력의 강화, 근육량의 증가, 근육 회복의 강화, 근육 피로의 감소, 에너지 수지의 개선 또는 이들의 조합 효과를 말한다.As used herein, the term “strengthening” refers to the effects of strengthening physical performance, enhancing maximum endurance, increasing muscle mass, enhancing muscle recovery, reducing muscle fatigue, improving energy balance, or a combination thereof.

본 발명의 니트렌디핀 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근력강화용 조성물은 근원세포를 근육 세포로 분화시키는 능력을 통하여 근육량을 증가시켜 전체 근육량을 증가시킬 수 있으며, 최대 지구력이 강화되고, 이에 따라 신체 수행이 강화되고 근육 피로도 감소할 수 있다. 또한, 근육 세포가 빠르게 대체될 수 있기 때문에 근육의 손상에 대하여 빠르게 치유될 수 있다.The composition for strength enhancement comprising nitrendipine or a pharmaceutically or pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention can increase muscle mass through the ability to differentiate myoblasts into muscle cells, thereby increasing total muscle mass, and maximal endurance This can be strengthened, thereby enhancing physical performance and reducing muscle fatigue. In addition, because muscle cells can be replaced quickly, it can heal quickly for muscle damage.

본 발명의 근력강화용 조성물은 투여를 위하여, 상기 니트렌디핀 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 상기 설명한 바와 같다.For administration, the composition for muscle strengthening of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent in addition to the nitrendipine or a pharmaceutically or pharmaceutically acceptable salt thereof. The pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent is as described above.

또한, 본 발명의 근력강화용 조성물은 식품조성물 또는 식품첨가제 형태로 제조될 수 있으며, 특히 건강식품 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 상기 식품조성물은 상기 설명한 바와 같다. 따라서, 본 발명의 근력 강화용 조성물은 노화에 의한 근육 감소뿐 아니라 일반인의 근육 생성, 근력 강화에 대한 보조제 등의 형태로 이용될 수 있다.In addition, the muscle strengthening composition of the present invention may be prepared in the form of a food composition or food additive, in particular, may be prepared in the form of a health food composition. The food composition is as described above. Therefore, the composition for strengthening the muscle of the present invention can be used in the form of an auxiliary agent for muscle generation and strength enhancement of the general public as well as muscle reduction due to aging.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention relates to a muscle-strengthening feed or feed additive comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명에서, "사료"란, 동물의 생명을 유지하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다. 상기 사료는 가축 등의 동물이 필요로 하는 에너지, 단백질, 지질, 비타민, 광물질 등의 영양소를 포함하며, 곡물류, 근과류, 식품가공부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등의 식물성 사료 또는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질 등의 동물성 사료가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "feed" means a material that supplies organic or inorganic nutrients necessary for maintaining the life of an animal. The feed contains nutrients such as energy, protein, lipid, vitamins, and minerals required by animals such as livestock, grains, root fruits, food processing by-products, algae, fibers, oils and fats, starches, gourds, It may be vegetable feed such as grain by-products or animal feed such as proteins, inorganic materials, oils and fats, minerals, oils and fats, and single-cell proteins, but is not limited thereto.

본 발명에서, "사료 첨가제"란, 동물의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위해 사료에 첨가되는 물질을 의미하며, 특별히 이에 제한되지 않으나 성장촉진, 질병 예방 등을 위한 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 더욱 포함될 수 있다.In the present invention, "feed additive" means a material added to feed to improve productivity or health of animals, and is not particularly limited thereto, but amino acid agent, vitamin agent, enzyme agent, flavor for growth promotion, disease prevention, etc. Agents, silicate agents, buffers, extractants, oligosaccharides and the like may be further included.

상기 본 발명의 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제에 포함되는 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일례로 0.001 내지 1 %(w/w), 0.005 내지 0.9 %(w/w), 또는 0.01 내지 0.5 %(w/w)일 수 있다.The content of nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof included in the muscle strengthening feed or feed additive of the present invention is not particularly limited thereto, but for example, 0.001 to 1% (w/w), 0.005 to 0.9% ( w/w), or 0.01 to 0.5% (w/w).

본 발명의 또 다른 일구현예는, 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육의 근력 약화 관련 질환의 치료방법에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention relates to a method for treating a muscle weakness-related disease, comprising administering nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual in need thereof.

근력 약화 관련 질환에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.Muscle weakness-related diseases are the same as described above.

본 발명에서 용어, "개체"란 근력 약화 관련 질환이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫트, 닭 또는 인간을 포함하는 포유류 전체를 의미하나, 상기 예에 의해 본 발명의 포유류가 한정되는 것은 아니다. 상기 개체는 인간을 제외한 개체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term "individual" refers to all animals, including humans, that have already developed or may develop muscle weakness-related diseases, and by administering a composition comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof to the individual, The disease can be effectively prevented and treated. The subject refers to all mammals, including dogs, cattle, horses, rabbits, mice, rats, chickens, or humans, but the mammals of the present invention are not limited by the above examples. The subject may be a subject other than a human, but is not limited thereto.

본 발명 조성물의 개별적인 투약의 최적량 및 투약 간격은 치료되고 있는 병의 성질 및 정도, 투여 제형, 경로 및 부위, 그리고 치료되고 있는 특정 환자의 나이와 건강상태에 의해 결정될 것이고, 의사가 궁극적으로 사용될 적절한 투약을 결정할 것이라는 것은 당해 분야의 통상의 기술자가 알 수 있을 것이다. 이러한 투약은 적절할 정도로 자주 반복될 수 있다. 부작용이 생긴다면, 보통의 임상 진료에 따라서 투여량 및 빈도를 변경하거나 또는 감소시킬 수 있다.The optimal amount and dosing interval for individual dosing of the composition of the present invention will be determined by the nature and extent of the disease being treated, the dosage form, route and site, and the age and health condition of the particular patient being treated, and will ultimately be used by the physician. It will be appreciated by those of ordinary skill in the art that appropriate dosing will be determined. Such dosing may be repeated as often as appropriate. If side effects occur, the dosage and frequency may be changed or reduced according to normal clinical practice.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.The administration route of the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. The composition of the present invention may be administered intraperitoneally, intravenously, subcutaneously, intradermally, orally, as desired, but is not limited thereto. The composition may also be administered by any device capable of transporting the active agent to a target cell.

본 발명의 또 다른 일 구현예는, 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 근력 약화에 의한 주름의 개선용 조성물에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention relates to a composition for improving wrinkles due to muscle weakness, comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 또 다른 일 구현예는, 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 개체에 투여 또는 도포하는 단계를 포함하는, 근력 약화에 의한 주름 개선방법에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention relates to a method for improving wrinkles due to muscle weakness, comprising administering or applying a composition comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.

본 발명에서, "근력 약화"는 상기 설명한 바와 같다.In the present invention, "muscle weakness" is as described above.

본 발명에서, "주름"이란, 피부 노화, 근육량 감소 등에 의해 피부 탄력이 떨어져 피부에 굴곡이 생기거나 접히는 현상을 의미한다. 주름을 형성하는 피부 굴곡은 근육의 움직임에 의해 영향을 받으며, 구체적으로는 얼굴의 경우 눈가와 코를 중심으로 입 양쪽으로 내려오는 굴곡이 생기게 되는데, 이는 안면 근육의 움직임에 의해 반복되는 표정에 의해 생길 뿐만 아니라, 안면 근육을 잘 사용하지 않거나 노화로 인해 안면의 근육량 또는 근력이 감소할 경우에도 중력에 의해 피부가 아래로 쳐져 주름이 생기게 된다.In the present invention, the term "wrinkle" refers to a phenomenon in which skin elasticity is reduced due to skin aging, decreased muscle mass, etc., resulting in flexion or folding of the skin. The flexion of the skin that forms the wrinkles is affected by the movement of the muscles, and specifically, in the case of the face, the flexion that goes down to both sides of the mouth centering on the eyes and nose occurs. In addition, when facial muscles are not used well or facial muscle mass or muscle strength decreases due to aging, the skin sags down due to gravity and wrinkles are formed.

본 발명의, 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 주름 개선용 조성물은 근육 세포의 분화를 촉진하므로, 안면 근육의 세포 분화, 근력 향상 및 탄력 회복을 유도하여, 이와 밀접하게 관련된 피부 주름을 개선할 수 있다.The composition for improving wrinkles comprising nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention promotes the differentiation of muscle cells, and thus induces cell differentiation of facial muscles, improvement of muscle strength and recovery of elasticity, and is closely related thereto It can improve skin wrinkles.

구체적으로, 상기 조성물은 약학 조성물, 건강기능식품 조성물, 또는 화장료 조성물일 수 있으며, 상기 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.Specifically, the composition may be a pharmaceutical composition, a health functional food composition, or a cosmetic composition, and the pharmaceutical composition and the health functional food composition are as described above.

본 발명에 따른 피부 주름 개선용 화장료 조성물은 크림, 로션, 에센스, 젤, 연고, 폼, 화장수, 팩, 유연수, 유액, 파운데이션, 메이크업베이스, 비누, 액체세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 또는 선오일 등의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition for improving skin wrinkles according to the present invention is a cream, lotion, essence, gel, ointment, foam, lotion, pack, soft water, emulsion, foundation, makeup base, soap, liquid detergent, bath agent, sunscreen cream, or sunscreen It may be prepared in a formulation such as oil.

본 발명에 따른 피부 주름 개선용 화장료 조성물은 물, 계면활성제, 보습제, 16-4 저급 알코올, 킬레이트제, 살균제, 산화방지제, 방부제, 색소 및 향료로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 첨가제를 더 포함할 수 있다.The cosmetic composition for improving skin wrinkles according to the present invention further comprises one or more additives selected from the group consisting of water, surfactant, moisturizer, 16-4 lower alcohol, chelating agent, bactericide, antioxidant, preservative, color and fragrance. can do.

본 발명에 따른 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 근원세포의 분화를 촉진하여 근관을 형성할 수 있으므로 근육 약화를 방지할 뿐만 아니라, 효과적으로 근육 기능을 개선할 수 있다. 따라서 이를 포함하는 약학적 조성물은 근육 약화 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention can form a root canal by promoting differentiation of myoblasts, thereby preventing muscle weakness and effectively improving muscle function. Therefore, a pharmaceutical composition comprising the same can be usefully used for the prevention or treatment of muscle weakness-related diseases.

도 1은 니트렌디핀을 처리하였을 때 음성 대조군인 DMSO에 비해 마이오신 중쇄 3 (MYH3) 단백질의 배수변화 값이 높은 것을 In-Cell ELISA 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 2는 니트렌디핀을 일차 근원세포에 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 및 2 μM의 농도로 각각 처리한 후 농도별 근세포 분화촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 니트렌디핀의 분화 배지 (DM)에서의 근세포 분화에 따른 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 니트렌디핀을 처리한 근원세포주 C2C12의 분화를 위상차현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 니트렌디핀을 처리한 근원세포주 C2C12의 분화를 면역세포화학법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 니트렌디핀을 처리한 근원세포주 C2C12에서의 마이오신 중쇄 3 (MYH3)의 발현을 웨스턴 블랏 (western blot)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.1 is a graph confirming through In-Cell ELISA analysis that the fold change value of myosin heavy chain 3 (MYH3) protein is higher than that of DMSO, a negative control, when nitrendipine is treated.
2 is a graph showing the myocyte differentiation promoting effect by concentration after nitrendipine was treated with nitrendipine at concentrations of 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 and 2 μM, respectively.
3 shows the results of measuring the toxicity of nitrendipine according to myocyte differentiation in the differentiation medium (DM).
4 shows the results of confirming the differentiation of the myoblast cell line C2C12 treated with nitrendipine by a phase-contrast microscope.
5 shows the results of confirming the differentiation of the myoblast cell line C2C12 treated with nitrendipine by immunocytochemistry.
6 shows the results of confirming the expression of myosin heavy chain 3 (MYH3) in myoblast cell line C2C12 treated with nitrendipine by western blot.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1: 근원세포의 배양Example 1: Culture of myoblasts

1-1. 일차 근원세포 분리 및 배양1-1. Primary myoblast isolation and culture

일차 근원세포를 분리하기 위하여 1 내지 5 일 된 생쥐를 70 % 에탄올로 세척한 후 CO2를 사용하여 질식시켰다. 상기 실험쥐의 뒷다리 발목 윗부분과 무릎을 절단하여 1 X 인산완충용액 (phate-buffered saline, PBS)에 담그고, 멸균 상태의 핀셋으로 피부와 뼈를 제거하여 근육조직을 모았다. 모아진 근육조직을 1 X PBS로 3 번 세척한 후 잘게 조각을 내었다. 상기 조각난 근육조직에 1 ㎖ 콜라게나제 (1.5 U/㎖), 1 ㎖ 디스파제 (dispase, 2.4 U/㎖), 5 ㎕ CaCl2 (1 M)를 혼합한 효소용액을 첨가한 후 37 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 효소와 반응시킨 근육조직을 나일론 그물 (Nylon mesh, 80 μM)로 필터링하여 뼈 등을 걸러내고, 800 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다. To isolate primary myoblasts, 1 to 5 day old mice were washed with 70% ethanol and then choked with CO 2 . The upper part of the ankle and knee of the hind leg of the experimental rat was cut, immersed in 1 X phosphate-buffered saline (PBS), and the skin and bones were removed with sterile tweezers to collect muscle tissue. The collected muscle tissue was washed 3 times with 1 X PBS and then cut into small pieces. To the fragmented muscle tissue, 1 ㎖ collagenase (1.5 U / ㎖), 1 ㎖ dispase (dispase, 2.4 U / ㎖), 5 ㎕ CaCl 2 (1 M) was added to the enzyme solution mixed at 37 ℃ The reaction was carried out for 30 minutes. The muscle tissue reacted with the enzyme was filtered through a nylon mesh (Nylon mesh, 80 μM) to filter out bones, etc., and centrifuged at 800 rpm for 5 minutes to obtain cells.

상기에서 수득한 세포 (일차 근원세포)를 2 ㎖ F10 배지 (Invitrogen)에 다시 풀어 100 mm 일반 배양용기로 옮긴 것을 P1이라 하였으며, 1 시간 간격으로 0.1 % 젤라틴이 코팅된 배양용기로 옮기는 과정을 P5까지 반복하였다. 상기 세포들은 37 ℃에서 5 % CO2가 포함된 배양기에서 배양하였으며, 2 일에 한 번씩 새로운 F10 배지로 교체해 주었다. 세포를 계대할 때는 0.005 % 트립신을 사용하여 세포를 배양용기에서 분리시켰고, 근육세포로 분화를 유도할 때에는 5 % 말 혈청 (horse serum)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen)을 사용하였다.The cells obtained above (primary myoblasts) were re-dissolved in 2 ml F10 medium (Invitrogen) and transferred to a 100 mm general culture vessel was referred to as P1. was repeated until The cells were cultured in an incubator containing 5% CO 2 at 37 ° C., and replaced with fresh F10 medium once every 2 days. When the cells were passaged, 0.005% trypsin was used to separate the cells from the culture vessel, and to induce differentiation into muscle cells, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen) supplemented with 5% horse serum was used. .

1-2. 근원세포주 C2Cl2의1-2. of the myoblast line C2Cl2 배양culture

C2Cl2는 C3H 종의 생마우스에서 얻은 근원세포주로서, 근세포 분화 연구에 널리 사용되고 있다.C2Cl2 is a myoblast cell line obtained from live mice of the C3H species, and is widely used in myocyte differentiation studies.

상기 C2C12 세포는 일반적인 세포 배양용 배지와 분화용 배지에서 각각 배양하였다. 정상적인 세포 배양용 배지 (GM, growth media)로는 10 % 어린 소혈청 (fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM을 사용하였으며, 분화용 배지 (DM, differentiation media)로는 2 % 말 혈청이 포함된 DMEM을 사용하였다. The C2C12 cells were cultured in a normal cell culture medium and a differentiation medium, respectively. DMEM containing 10% fetal bovine serum was used as a normal cell culture medium (GM, growth media), and DMEM containing 2% horse serum was used as a differentiation medium (DM). did.

실시예 2: 근원세포(myoblast)의 분화촉진 유도Example 2: Induction of promotion of differentiation of myoblasts

2-1. In-Cell ELISA를 이용한 분화 촉진 탐색2-1. Exploring differentiation promotion using In-Cell ELISA

일차 근원세포 (Primary myoblast)에서 발현되는 마이오신 중쇄 3 (myosin heavy 3, MYH3)의 단백질 양을 비교하기 위하여 In-Cell ELISA 방법을 실시하였다. In-Cell ELISA method was performed to compare the protein amount of myosin heavy chain 3 (myosin heavy 3, MYH3) expressed in primary myoblasts.

0.1 % 젤라틴으로 코팅되어 있는 96-웰 플레이트에 웰당 5 x 103 개의 일차 근원세포를 접종하였고, 24 시간 후에 5 % 말 혈청이 첨가된 DMEM으로 바꿔 분화를 유도하였다. 24 시간 마다 DMSO (5 %) 또는 처리 농도의 화합물 (chemicals), 또는 인슐린이 포함된 DMSO (5 %)를 첨가한 새로운 배지로 교체하였다. 분화 후 3 일째에 배지를 제거하고, 100 ㎕ 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde, 3.7 %)를 상온에서 15 분 처리하여 세포를 고정시켰다. 인산완충용액 (1X PBS)으로 세척을 한 후, 0.1 % 사포닌, 3 % triton X-100, 0.009 % 소듐 아자이드 (sodium azide)가 포함된 100 ㎕ 투과용 버퍼 (permeabilization buffer)를 상온에서 15 분간 처리하여 세포막에 구멍을 뚫었다. 상기 세포를 다시 1X PBS로 세척한 후, 0.1 % 알부민 (bovine serum albumin)이 포함된 100 ㎕ 블로킹 버퍼 (blocking buffer)로 상온에서 1 시간 처리하였다. 상기 세포를 1X PBS로 3 번 세척한 후, 1 : 500으로 희석된 1 차 항체 (SC-20641, Santa Cruz Biotechnology) 100 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 반응시켰다. 반응시킨 세포를 다시 1X PBS로 3 번 세척한 후, 1 : 10,000으로 희석한 2 차 항체 (Goat anti-Rabbit IgG-HRP) 100 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. 상기 세포를 1X PBS로 3 번 세척한 후, 50 ㎕ TMB 용액 (Gen Depot #T3551)을 첨가하여 20 분 동안 반응시켰고, 50 ㎕ 정지용액 (stop solution, Gen Depot #T3552)을 첨가하여 반응을 멈추게 하였다. 상기 세포의 MYH3 단백질 수준을 분석하기 위하여 485 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 결과를 분석하였다.In a 96-well plate coated with 0.1% gelatin, 5 x 10 3 primary myoblasts per well were inoculated, and after 24 hours, they were replaced with DMEM supplemented with 5% horse serum to induce differentiation. The medium was replaced with fresh medium containing DMSO (5%) or treated concentration of chemicals, or DMSO (5%) containing insulin every 24 hours. On the third day after differentiation, the medium was removed, and cells were fixed by treatment with 100 μl of paraformaldehyde (paraformaldehyde, 3.7%) at room temperature for 15 minutes. After washing with phosphate buffer solution (1X PBS), 100 μl permeabilization buffer containing 0.1% saponin, 3% triton X-100, and 0.009% sodium azide was added at room temperature for 15 minutes. treatment to puncture the cell membrane. The cells were washed again with 1X PBS, and then treated with 100 μl blocking buffer containing 0.1% bovine serum albumin at room temperature for 1 hour. After washing the cells 3 times with 1X PBS, 100 μl of a primary antibody (SC-20641, Santa Cruz Biotechnology) diluted at 1:500 was added and reacted at 37° C. for 2 hours. After the reacted cells were washed 3 times with 1X PBS again, 100 μl of a secondary antibody (Goat anti-Rabbit IgG-HRP) diluted at 1:10,000 was added and reacted at 37° C. for 1 hour. After washing the cells 3 times with 1X PBS, 50 μl TMB solution (Gen Depot #T3551) was added to react for 20 minutes, and 50 μl stop solution (Gen Depot #T3552) was added to stop the reaction. did. In order to analyze the MYH3 protein level in the cells, absorbance was measured at a wavelength of 485 nm and the results were analyzed.

특히, 분화과정은 구체적으로 일차 근원세포를 분화배지로 교체한 후 3 일 동안 매일 새 분화배지로 배지를 교환함으로써 근육세포로의 분화를 유도하였다. 3 일 후 In-Cell ELISA 실험을 통해 MYH3 단백질 수준을 비교하였다. In particular, the differentiation process induced differentiation into muscle cells by exchanging the medium with a new differentiation medium every day for 3 days after replacing the primary myoblasts with the differentiation medium. After 3 days, MYH3 protein levels were compared through In-Cell ELISA experiments.

그 결과, 0.2 μM 니트렌디핀의 분화촉진 효과는 MYH 배수변화 (fold change) 값이 1.228 (n = 2)로, DMSO 처리군 (음성 대조군)과 비교하였을 때 현저히 증가하였고, 0.6 ㎍/㎖ 인슐린 처리군 (양성 대조군)과 유사한 수준으로 확인되었다 (도 1).As a result, the differentiation-promoting effect of 0.2 μM nitrendipine was significantly increased when the MYH fold change value was 1.228 (n = 2), compared with the DMSO-treated group (negative control), and 0.6 μg/ml insulin It was confirmed at a level similar to that of the treatment group (positive control) ( FIG. 1 ).

이러한 In-Cell ELISA 분석 결과를 통하여 니트렌디핀이 약물 운반체인 DMSO보다 MYH 배수변화 값이 높아 분화를 촉진하며, 그 촉진 정도는 근육세포 분화 유도 약물로 이미 보고된 인슐린의 촉진 정도와 유사함을 확인할 수 있었다.Through these in-cell ELISA analysis results, it was found that nitrendipine promotes differentiation due to a higher MYH fold change than DMSO, a drug carrier, and that the degree of promotion is similar to that of insulin previously reported as a muscle cell differentiation-inducing drug. could check

2-2. 니트렌디핀의 농도에 따른 분화 유도 효과 확인2-2. Confirmation of differentiation induction effect according to the concentration of nitrendipine

상기 2-1에서 니트렌디핀의 근원세포 분화 촉진 효과를 확인함에 따라, 니트렌디핀을 일차 근원세포에 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 및 2 μM의 농도로 각각 처리한 후 MYH3의 양을 측정하였다(n = 2). After confirming the myoblast differentiation promoting effect of nitrendipine in 2-1 above, nitrendipine was treated with nitrendipine at concentrations of 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 and 2 μM in primary myoblasts, respectively. The amount of MYH3 was measured (n = 2).

니트렌디핀 처리 방법은 상기 2-1에 기재된 방식과 동일하게 처리하였다. The nitrendipine treatment method was the same as the method described in 2-1 above.

그 결과, 니트렌디핀은 0.01 μM 농도에서 급격한 분화촉진 증가효과를 보였으며 1.0 μM까지 분화촉진 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 2).As a result, nitrendipine showed a sharp differentiation-promoting effect at a concentration of 0.01 μM, and it was confirmed that the differentiation-promoting effect increased up to 1.0 μM ( FIG. 2 ).

실시예 3. 니트렌디핀의 근원세포에 대한 세포독성 측정Example 3. Measurement of cytotoxicity of nitrendipine on myoblasts

니트렌디핀의 세포독성을 측정하기 위해 세포 사멸시 분비되는 효소인 LDH (lactate dehydrogenase)를 측정하는 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega) 키트를 사용하였다.To measure the cytotoxicity of nitrendipine, a CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega) kit that measures lactate dehydrogenase (LDH), an enzyme secreted during apoptosis, was used.

세포 배양용 배지 (GM)를 사용하여 96-웰 플레이트에 웰당 5 x 103 개의 일차 근원세포를 접종하였고, 24 시간 후 분화용 배지 (DM)에서 니트렌디핀을 농도별 (0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 및 2 μM)로 각각 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 각각의 시료가 포함된 50 ㎕의 배지를 96-웰 flat bottom plate로 옮겨준 후 50 ㎕ 기질용액 (reconstituted substrate mix)을 첨가하여 상온에서 30 분간 반응시켰다. 완전한 세포사멸을 위한 대조군으로서 1 mM H2O2를 처리하였다. 반응 30 분 후 50 ㎕ 정지용액 (stop solution)을 상기 세포에 첨가한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 라이시스 버퍼 (lysis buffer)에 의한 세포 사멸시에 나타나는 LDH 값에 대한 비율로 표시하였다. 5 x 10 3 primary myoblasts per well were inoculated in a 96-well plate using a cell culture medium (GM), and after 24 hours, nitrendipine was added by concentration (0.01, 0.02, 0.05) in the differentiation medium (DM). , 0.1, 0.2, 0.5, 1 and 2 μM), respectively, and incubated for 24 hours. After transferring 50 μl of the medium containing each sample to a 96-well flat bottom plate, 50 μl of the reconstituted substrate mix was added and reacted at room temperature for 30 minutes. 1 mM H 2 O 2 was treated as a control for complete apoptosis. After 30 minutes of reaction, 50 μl of a stop solution was added to the cells, and absorbance was measured at 490 nm, which was expressed as a ratio to the LDH value displayed during cell death by lysis buffer.

그 결과, 일차 근원세포 세포의 분화 배지 (DM)에서 측정된 니트렌디핀의 농도별 세포 독성은 별 차이가 없었으며, 니트렌디핀을 2.0 μM로 처리한 경우에도 완전한 세포사멸에 이르는 1 mM H2O2를 처리한 값에 비하여 사멸 세포의 비율이 5% 이내로 근세포 분화에 따른 독성이 매우 미미함을 확인하였다 (도 3).As a result, there was no significant difference in cytotoxicity by concentration of nitrendipine measured in the differentiation medium (DM) of primary myoblast cells, and even when nitrendipine was treated with 2.0 μM, 1 mM H leading to complete apoptosis 2 O 2 Compared to the treated value, the ratio of apoptotic cells was within 5%, confirming that the toxicity according to myocyte differentiation was very insignificant (FIG. 3).

실시예 4: 니트렌디핀의 근원세포 분화 촉진 효과 확인Example 4: Confirmation of the myoblast differentiation promoting effect of nitrendipine

4-1. 위상차현미경 (Phase contrast microscopy)4-1. Phase contrast microscopy

니트렌디핀에 의한 근원세포에서 다량의 근관 (myotube) 형성을 확인하기 위하여, 0.1 % 젤라틴이 코팅된 덮개 유리에 C2Cl2 세포를 약물전달체인 DMSO 및 니트렌디핀을 각각 0.2 μM씩 처리하면서 3 일 동안 분화시킨 후 위상차 현미경으로 관찰하였다. 이와 같은 실험결과 대조군인 DMSO에 비해 니트렌디핀을 처리하였을 때 근관이 많이 형성되는 것으로 보아 니트렌디핀의 근원세포 분화 촉진 효과를 확인할 수 있었다 (x 100)(도 4). In order to confirm the formation of a large amount of myotubes in myoblasts by nitrendipine, C2Cl2 cells were treated with 0.1% gelatin-coated cover glass with DMSO and nitrendipine 0.2 μM each for 3 days. After differentiation, it was observed with a phase contrast microscope. As a result of this experiment, it was confirmed that the myoblast differentiation promoting effect of nitrendipine was confirmed by seeing that more root canals were formed when nitrendipine was treated compared to DMSO, a control (x 100) (FIG. 4).

4-2. 면역세포화학염색법 (Immunocytochemistry)4-2. Immunocytochemistry

DMSO (음성 대조군) 및 니트렌디핀을 각각 처리하면서 C2Cl2 세포주의 분화를 유도시킨 후, 3 일째 되는 날 근세포 분화 정도를 비교하기 위해 MYH3에 대한 항체로 염색하여 단백질 발현을 확인하였다.After inducing differentiation of the C2Cl2 cell line by treatment with DMSO (negative control) and nitrendipine, respectively, on the third day, to compare the degree of myocyte differentiation, protein expression was confirmed by staining with an antibody against MYH3.

구체적으로, 0.1 % 젤라틴이 코팅된 덮개 유리에서 C2Cl2 세포를 3 일 동안 분화시켰다. 세포를 1X PBS로 세척한 후, 3.7 % 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 상온에서 15 분간 고정 시키고, 1X PBS로 3 번 세척한 후, 투과용 버퍼 (permeabilization buffer)를 넣고 상온에서 15 분간 반응시켰다. 다시 1X PBS로 3 번 세척한 후 1 % BSA가 들어있는 PBST (blocking buffer, 0.5 % Tween 20이 포함된 PBS)로 30 분간 반응시켜 불특정한 항체 결합을 억제하였다. MYH3에 대한 1 차 항체 (SC-20641, Santa Cruz Biotechnology)를 블로킹 버퍼 (blocking buffer)에 1 : 500으로 희석하여 첨가한 후, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 1X PBS로 3 번 세척한 후 블로킹 버퍼 (blocking buffer)에 1 : 5000으로 희석한 2 차 항체 (Goat anti-Rabbit IgG-HRP)를 첨가하여 상온에서 1 시간 동안 반응 시킨 후, 1X PBS로 3 번 세척하였다. 덮개 유리를 슬라이드 유리에 올리고 형광 현미경으로 사진을 찍어 결과를 분석하였다.Specifically, C2Cl2 cells were differentiated for 3 days on cover glass coated with 0.1% gelatin. After washing the cells with 1X PBS, fixed with 3.7% paraformaldehyde at room temperature for 15 minutes, washed 3 times with 1X PBS, permeabilization buffer was added, and reacted at room temperature for 15 minutes. After washing 3 times with 1X PBS again, unspecific antibody binding was inhibited by reacting with PBST (blocking buffer, PBS containing 0.5% Tween 20) containing 1% BSA for 30 minutes. A primary antibody against MYH3 (SC-20641, Santa Cruz Biotechnology) was diluted 1:500 in blocking buffer and added, followed by reaction at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with 1X PBS, a secondary antibody (Goat anti-Rabbit IgG-HRP) diluted 1:5000 in blocking buffer was added and reacted at room temperature for 1 hour, then 3 times with 1X PBS washed. A cover glass was placed on a slide glass, and pictures were taken under a fluorescence microscope to analyze the results.

그 결과, DMSO 처리군에 비해 니트렌디핀 0.2 μM을 처리하였을 때 MYH3의 발현이 매우 높음을 확인할 수 있었다 (도 5).As a result, it was confirmed that the expression of MYH3 was very high when 0.2 μM of nitrendipine was treated compared to the DMSO-treated group ( FIG. 5 ).

4-3. 웨스턴 블랏 (Western blot) 4-3. Western blot

배양용 배지에 C2C12 세포를 분주하여 24 시간 배양한 후 분화 배지에 각각 DMSO 및 니트렌디핀을 각각 0.2 μM씩 매일 처리하면서 분화를 유도하였다. 분화 유도 3 일째에 세포를 수득하여 1200 rpm에서 3 분간 원심분리하였다. 상기 세포에 100 ㎕ 라이시스 버퍼를 첨가한 후 초음파 분해 (sonication)시키고, 3000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 수용성 단백질을 얻었고, 4X 샘플버퍼 (sample buffer)를 첨가하여 끓는 물에서 5 분간 반응시켰다. 10 ㎍의 단백질을 12 % SDS-PAGE 겔에 로딩하여 전개한 후 와트맨 멤브레인 (Watman membrane)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5 % 탈지유 (skim milk)로 1 시간 동안 상온에서 블로킹해주고, TTBS (0.03 % Tween20, Tris 2.42 g, NaCl 9 g, pH 7.4, 1 L)로 5 분씩 5 번 세척하였다. 5 % 탈지유가 포함된 TTBS에 1 차 항체를 1 : 500으로 희석하여 첨가한 후 상온에서 2 시간 반응시킨 다음, 다시 TTBS로 5 분씩 5 번 세척하였다. 다시 5 % 탈지유가 포함된 TTBS에 2 차 항체를 1 : 5000으로 희석하여 첨가한 후 상온에서 2 시간 반응시키고 TTBS로 5 분씩 5 번 세척한 후 ECL (Enhanced Chemiluminescent solution, Pierce)을 첨가하였다. 이후, 상기 멤브레인을 X-ray 필름에 노출시켜 단백질의 양을 확인하였다.After dividing C2C12 cells in the culture medium and culturing for 24 hours, the differentiation medium was treated with DMSO and nitrendipine at 0.2 μM each daily to induce differentiation. On day 3 of differentiation induction, cells were harvested and centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes. After adding 100 μl lysis buffer to the cells, the cells were subjected to sonication, centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to obtain a water-soluble protein, and 4X sample buffer was added and reacted in boiling water for 5 minutes. 10 μg of protein was loaded onto a 12% SDS-PAGE gel and developed, and then transferred to a Watman membrane. The membrane was blocked with 5% skim milk at room temperature for 1 hour, and washed 5 times with TTBS (0.03% Tween20, Tris 2.42 g, NaCl 9 g, pH 7.4, 1 L) for 5 minutes each. The primary antibody was diluted 1:500 in TTBS containing 5% skim milk, and then reacted at room temperature for 2 hours, and then washed 5 times with TTBS for 5 minutes each. Again, a secondary antibody was diluted 1:5000 in TTBS containing 5% skim milk, reacted at room temperature for 2 hours, washed 5 times with TTBS for 5 minutes, and then ECL (Enhanced Chemiluminescent solution, Pierce) was added. Thereafter, the membrane was exposed to an X-ray film to confirm the amount of protein.

상기 실험결과, 니트렌디핀을 처리하였을 때, 대조군인 DMSO 처리에 비하여 동량의 단백질에 포함된 MYH3 단백질의 양이 매우 증가하였음을 확인하였다 (도 6).As a result of the above experiment, it was confirmed that when nitrendipine was treated, the amount of MYH3 protein contained in the same amount of protein was significantly increased compared to DMSO treatment as a control ( FIG. 6 ).

상기와 같은 실험결과를 통하여 니트렌디핀에 의한 근세포 분화촉진 효과가 매우 높음을 알 수 있었으며, 이를 이용하여 근력 약화관련 질환의 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. Through the above experimental results, it was found that the myocyte differentiation promoting effect by nitrendipine was very high, and it was confirmed that it could be used to prevent or treat muscle weakness related diseases.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing the technical spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention, rather than the above detailed description, all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims described below and their equivalents.

Claims (4)

니트렌디핀 (Nitrendipine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근원세포 (myoblast)의 분화 촉진용 조성물.
A composition for promoting differentiation of myoblasts, comprising Nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
 제1항에 있어서, 상기 니트렌디핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 농도는 0.01 내지 2 μM인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the concentration of nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 0.01 to 2 μM.
 니트렌디핀 (Nitrendipine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 체외 근원세포에 처리하는 단계를 포함하는 근원세포의 분화 촉진 방법.
A method for promoting differentiation of myoblasts comprising the step of treating the myoblasts in vitro with nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
 니트렌디핀 (Nitrendipine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 체외 근원세포에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함하는 분화된 근원세포의 제조방법.A method for producing differentiated myoblasts, comprising the step of differentiating the myoblasts by treating the myoblasts in vitro with nitrendipine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
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