KR20210110184A - Biomarker composition for diagnosing diffuse type gastric cancer and medical use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 TINAGL1 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 미만형 위암 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker composition for diagnosis of diffuse gastric cancer comprising TINAGL1 protein or a gene encoding the protein as an active ingredient, and a medical use thereof.
위암은 우리나라에서 가장 많이 발생하는 암이지만, 위 내시경 검사가 보편화되고, 위암이 조기에 발견되면서 위암 환자의 5년 생존율(암 진단을 받고 5년 이상 생존하는 환자의 비율)은 75.4%까지 향상되었다. 이와 같이 위암 조기발견율은 높아지고 있지만 예후가 나쁜 미만형 위암 (diffuse type gastric cancer)은 전체 위암의 40%에 달하는 것으로 나타났다. Gastric cancer is the most common cancer in Korea, but as gastroscopy became common and gastric cancer was detected at an early stage, the 5-year survival rate of gastric cancer patients (the proportion of patients surviving more than 5 years after being diagnosed with cancer) improved to 75.4%. . As such, although the early detection rate of gastric cancer is increasing, diffuse type gastric cancer with a poor prognosis accounts for 40% of all gastric cancers.
위암은 장형 위암과 미만형 위암으로 구분되는 데, 장형 위암은 암이 점막표면에서 덩어리 형태로 자라고, 증식 속도가 미만형에 비해 느리다. 반면, 미만형 위암은 눈에 보이지 않을 정도로 작은 암세포가 위벽을 파고들며 점막 아래로 자라기 때문에 점막 표면의 변화가 뚜렷하게 나타나지 않고, 선종처럼 전암성 병변이 잘 확인되지 않는다. 그러면서도 증식 속도는 빨라 암이 발견되면 이미 진행되어 있는 경우가 많아 대부분이 3~4기로 발견되어 예후도 좋지 않다. 또한, 원격 전이의 가능성이 높고, 식도나 십이지장 등 인접한 부위로 쉽게 전이된다.Gastric cancer is divided into enteric gastric cancer and diffuse gastric cancer. In intestinal gastric cancer, the cancer grows in the form of a lump on the mucosal surface, and the growth rate is slower than that of the diffuse type. On the other hand, in diffuse gastric cancer, small cancer cells that are invisible to the naked eye penetrate the stomach wall and grow under the mucous membrane, so changes in the mucosal surface are not clearly seen, and precancerous lesions like adenomas are not well identified. However, the proliferation rate is fast, and when cancer is discovered, the prognosis is poor as most of the cancers are found in stages 3-4. In addition, the possibility of distant metastasis is high, and it easily metastasizes to adjacent sites such as the esophagus or duodenum.
특히, 젊은 연령에서 발생하는 위암은 진행 및 전이속도가 빠른 미만형 위암이 60~70%를 차지하고 있어, 미만형 위암에 대한 젊은층의 각별한 관심과 주의가 요구된다.In particular, as for gastric cancer occurring at a young age, diffuse-type gastric cancer, which progresses and metastasizes quickly, accounts for 60-70% of gastric cancer.
미만형 위암의 치료법은 장형 위암과 큰 차이 없이, 환자의 상태, 병의 진행 정도 등을 고려하여 결정되며, 조기에 발견된 미만형 위암 중 림프절 전이가 없고 국소적으로 치료 가능한 병변의 경우에는 내시경 점막하 박리술을 시행하여 위를 절제하지 않고 암세포만 제거할 수 있어, 합병증과 후유증을 최소할 수 있으며, 수술과 비슷한 완치율을 기대할 수 있어 미만형 위암의 조기 발견이 무엇보다 중요하다.The treatment of diffuse gastric cancer is not significantly different from intestinal gastric cancer, and is determined by considering the patient's condition and disease progression. By performing submucosal dissection, only cancer cells can be removed without resection of the stomach, so complications and sequelae can be minimized, and a cure rate similar to that of surgery can be expected.
현재 우리나라의 위암검진 권고안에 따르면 40세 이상은 2년 주기로 위내시경 검사를 권장하고 있으나, 미만형 위암은 내시경 검사만으로 진단이 쉽지 않아 복부 CT 촬영 및 내시경 초음파 같은 추가적이 검진이 필요한 상황이다.According to the current gastric cancer screening recommendations in Korea, gastroscopy is recommended every two years for those over 40 years of age.
앞서 전술한 바와 같이 미만형 위암은 조기 발견을 통하여 높은 완치율을 기대할 수 있으나, 일반적인 내시경 초음파로는 진단이 어려운 문제점이 있으며, 이를 해결하기 위해 본 발명은 위암 조직 내 암관련섬유모세포 (cancer-associated fibroblast, CAF)에서 분비 및 발현이 증가되는 TINAGL1을 미만형 위암 진단용 바이오마커 조성물로 제공하고자 한다.As described above, diffuse gastric cancer can be expected to have a high cure rate through early detection, but there is a problem in that it is difficult to diagnose with general endoscopic ultrasound. To provide TINAGL1, which is secreted and expressed in fibroblast, CAF), as a biomarker composition for diagnosing diffuse gastric cancer.
본 발명은 TINAGL1 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 미만형 위암 진단용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.The present invention may provide a biomarker composition for diagnosing diffuse gastric cancer comprising TINAGL1 protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
본 발명은 TINAGL1 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 미만형 위암 진단용 키트를 제공할 수 있다.The present invention may provide a kit for diagnosing diffuse gastric cancer containing, as an active ingredient, an agent capable of detecting the expression or activity level of TINAGL1 protein or the expression level of a gene encoding the protein.
본 발명은 검체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 TINAGL1 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 미만형 위암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.The present invention provides a method for providing information for diagnosing diffuse gastric cancer, comprising comparing the expression or activity level of TINAGL1 protein, or the expression level of a gene encoding the protein, from a sample isolated from a sample and a normal control. can provide
본 발명은 TINAGL1을 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 미만형 위암 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.The present invention can provide a biomarker composition for predicting the prognosis of diffuse gastric cancer comprising TINAGL1 protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
본 발명은 TINAGL1 억제제를 유효성분으로 함유하는 미만형 위암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.The present invention may provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diffuse gastric cancer containing a TINAGL1 inhibitor as an active ingredient.
본 발명은 TINAGL1 억제제 및 항암제를 유효성분으로 함유하는 미만형 위암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.The present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diffuse gastric cancer containing a TINAGL1 inhibitor and an anticancer agent as active ingredients.
또한, 본 발명은 미만형 위암 조직으로부터 분리된 암관련섬유모세포 (CAF)를 배양하여 TINAGL1 발현 수준을 확인하는 단계(제1단계); In addition, the present invention includes the steps of culturing cancer-associated fibroblasts (CAF) isolated from diffuse gastric cancer tissue to determine the TINAGL1 expression level (step 1);
상기 TINAGL1이 발현된 암관련섬유모세포에 후보물질을 처리하여 TINAGL1 발현 수준을 확인하는 단계(제2단계); 및Checking the TINAGL1 expression level by treating the TINAGL1-expressed cancer-associated fibroblasts with a candidate material (second step); and
상기 제1단계의 TINAGL1 발현 수준과 제2단계의 TINAGL1 발현 수준을 비교하는 단계(제3단계)를 포함하는 미만형 위암 치료용 약물 스크리닝방법을 제공할 수 있다.It is possible to provide a drug screening method for treating diffuse gastric cancer, comprising comparing the TINAGL1 expression level of the first step with the TINAGL1 expression level of the second step (third step).
본 발명에 따르면, 미만형 위암 조직에서 분리된 암관련섬유모세포에서 TINAGL1 분비가 증가되는 것을 확인하였으며, 상기 TINAGL1은 암세포의 FAK 신호를 활성화시켜 미만형 위암의 전이 및 종양 형성을 향상시키는 것을 확인하였으며, TINAGL1 발현 증가 여부가 미만형 위암 환자의 예후와 관련성이 있는 것을 확인함에 따라, 상기 TINAGL1은 미만형 위암 진단 및 예후예측용 바이오마커로 제공될 수 있으며, TINAGL1 발현 또는 활성 억제제는 효과적인 미만형 위암 치료제로 제공될 수 있다.According to the present invention, it was confirmed that TINAGL1 secretion was increased in cancer-related fibroblasts isolated from diffuse gastric cancer tissue, and it was confirmed that TINAGL1 improved metastasis and tumor formation of diffuse gastric cancer by activating the FAK signal of cancer cells. , as it was confirmed that the increase in TINAGL1 expression is correlated with the prognosis of patients with diffuse gastric cancer, the TINAGL1 can be provided as a biomarker for the diagnosis and prognosis of diffuse gastric cancer, and TINAGL1 expression or activity inhibitors are effective diffuse gastric cancer It may be provided as a therapeutic agent.
도 1은 암관련섬유모세포 (CAF)와 정상섬유모세포 (NAF)가 암세포에 미치는 영향을 확인한 결과로, CAF 또는 NAF가 처리된 SNU668 세포에서 암세포의 이동능 및 전이능을 확인한 결과이다.
도 2는 암관련섬유모세포 (CAF)와 정상섬유모세포 (NAF)가 암세포에 미치는 영향을 확인한 결과로, CAF 또는 NAF가 처리된 SNU601 세포에서 암세포의 종양 형성능 및 이동능을 확인한 결과이다.
도 3은 암관련섬유모세포 (CAF)와 정상섬유모세포 (NAF)간의 전사체 분석 (Transcriptome analysis) 및 단백체 분석 (Proteomics analysis) 결과이다.
도 4는 미만형 위암 환자에서 분리된 CAF 및 NAF에서 TINAGL1 발현 수준 차이를 확인한 정량적 RT-PCR, 웨스턴 블롯, 실시간 PCR 및 ELISA 분석 결과이다.
도 5는 암관련섬유모세포 (CAF)와 정상섬유모세포 (NAF)가 미만형 위암세포 내 FAK 신호 활성화에 미치는 영향을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 6은 재조합 TINAGL1이 처리된 미만형 위암 세포주 FAK 신호 활성을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 7은 재조합 TINAGL1이 처리된 위암 세포주 SNU601의 종양형성능력을 확인한 결과이다.
도 8은 TINAGL1 siRNA로 형질감염시켜 TINAGL1 발현을 억제시킨 암관련섬유모세포 (CAF)를 확인한 웨스턴블롯 및 RT-PCR 분석 결과이다.
도 9는 TINAGL1 siRNA로 형질감염시켜 TINAGL1 발현을 억제시킨 암관련섬유모세포 (CAF)를 확인한 면역세포화학 염색 결과이다.
도 10은 TINAGL1 발현을 억제시킨 암관련섬유모세포 (CAF)를 위암세포와 공동 배양한 후 TINAGL1 발현억제가 위암세포의 이동능력에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 11은 TINAGL1 발현을 억제시킨 암관련섬유모세포 (CAF)를 위암세포와 공동 배양한 후 TINAGL1 발현억제가 위암세포 내 신호전달에 미치는 영향을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 12는 미만형 위암 환자에서 분리된 암조직과 정상 위조직에서 TINAGL1 발현량을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 13은 미만형 위암 환자에서 분리된 암조직과 정상 위조직에서 TINAGL1 및 COL1A1의 발현량을 확인한 결과로, 미만성 위암 환자의 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직에서 COL1A1 (빨간색, 섬유모세포 마커) 및 TINAGL1 (녹색)의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 14는 TINAGL1 발현 수준에 따라 미만형 위암 환자의 예후를 확인한 결과이다.1 is a result of confirming the effect of cancer-associated fibroblasts (CAF) and normal fibroblasts (NAF) on cancer cells, the results of confirming the migration and metastatic ability of cancer cells in SNU668 cells treated with CAF or NAF.
2 is a result of confirming the effect of cancer-associated fibroblasts (CAF) and normal fibroblasts (NAF) on cancer cells, the results of confirming the tumorigenicity and migration ability of cancer cells in SNU601 cells treated with CAF or NAF.
3 is a transcriptome analysis and proteomics analysis results between cancer-associated fibroblasts (CAF) and normal fibroblasts (NAF).
4 is a quantitative RT-PCR, Western blot, real-time PCR and ELISA analysis results confirming the difference in TINAGL1 expression levels in CAF and NAF isolated from diffuse gastric cancer patients.
5 is a Western blot analysis result confirming the effect of cancer-associated fibroblasts (CAF) and normal fibroblasts (NAF) on FAK signal activation in diffuse gastric cancer cells.
6 is a Western blot analysis result confirming the FAK signaling activity of a diffuse type gastric cancer cell line treated with recombinant TINAGL1.
7 is a result confirming the tumorigenicity of the gastric cancer cell line SNU601 treated with recombinant TINAGL1.
FIG. 8 is a Western blot and RT-PCR analysis result confirming cancer-associated fibroblasts (CAFs) in which TINAGL1 expression was inhibited by transfection with TINAGL1 siRNA.
9 is an immunocytochemical staining result confirming cancer-associated fibroblasts (CAFs) in which TINAGL1 expression is suppressed by transfection with TINAGL1 siRNA.
10 is a result confirming the effect of TINAGL1 expression inhibition on the migratory ability of gastric cancer cells after co-culturing cancer-associated fibroblasts (CAFs) in which TINAGL1 expression is suppressed with gastric cancer cells.
11 is a western blot analysis result confirming the effect of TINAGL1 expression inhibition on gastric cancer cell signaling after co-culturing cancer-associated fibroblasts (CAFs) in which TINAGL1 expression is suppressed with gastric cancer cells.
12 is a Western blot analysis result confirming the expression level of TINAGL1 in cancer tissues and normal gastric tissues isolated from diffuse gastric cancer patients.
13 is a result of confirming the expression levels of TINAGL1 and COL1A1 in cancer tissues and normal gastric tissues isolated from patients with diffuse gastric cancer, and COL1A1 (red, fibroblast marker) and It is the result of confirming the mRNA expression level of TINAGL1 (green).
14 is a result confirming the prognosis of patients with diffuse gastric cancer according to the TINAGL1 expression level.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
위암의 다양한 조직학적 아형 중 미만형 위암은 예후가 불량한 것으로 알려져 있으며, 미만형 위암 내 축적된 암관련섬유모세포가 환자들의 예후와 관련있는 것으로 보고됨에 따라, 본 발명의 발명자들은 미만형 위암 조직에서 분리한 암관련섬유모세포에서 TINAGL1 분비가 증가되는 것을 확인하였으며, 상기 TINAGL1가 암세포의 FAK 신호를 활성화시켜 미만형 위암의 전이 및 종양 형성을 향상시키는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Among various histological subtypes of gastric cancer, diffuse gastric cancer is known to have a poor prognosis, and as cancer-associated fibroblasts accumulated in diffuse gastric cancer are reported to be related to the prognosis of patients, the inventors of the present invention have It was confirmed that TINAGL1 secretion was increased in the isolated cancer-associated fibroblasts, and it was confirmed that the TINAGL1 activates the FAK signal of cancer cells to improve metastasis and tumor formation of diffuse gastric cancer, thereby completing the present invention.
본 발명은 TINAGL1 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 미만형 위암 진단용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.The present invention may provide a biomarker composition for diagnosing diffuse gastric cancer comprising TINAGL1 protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
보다 상세하게 상기 "TINAGL1"은 "Tubulointerstitial nephritis antigen-like 1" 로 (Gene ID : 64129; GenBank : AAH09048.1)이다.In more detail, the "TINAGL1" is "Tubulointerstitial nephritis antigen-like 1" (Gene ID: 64129; GenBank: AAH09048.1).
상기 TINAGL1은 위암 조직 내 암관련섬유모세포 (cancer-associated fibroblast, CAF)에서 분비 및 발현이 증가되는 것일 수 있다.The TINAGL1 may have increased secretion and expression in cancer-associated fibroblasts (CAF) in gastric cancer tissue.
본 발명은 TINAGL1 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 미만형 위암 진단용 키트를 제공할 수 있다.The present invention may provide a kit for diagnosing diffuse gastric cancer containing, as an active ingredient, an agent capable of detecting the expression or activity level of TINAGL1 protein or the expression level of a gene encoding the protein.
상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 펩타이드 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.The agent may be selected from the group consisting of primers, probes, antibodies, peptides and aptamers.
본 발명은 검체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 TINAGL1 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 미만형 위암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.The present invention provides a method for providing information for diagnosing diffuse gastric cancer, comprising comparing the expression or activity level of TINAGL1 protein, or the expression level of a gene encoding the protein, from a sample isolated from a sample and a normal control. can provide
본 발명의 "바이오마커"는 위암이 발생한 대상체의 조직 또는 세포를 정상 대조군의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.The "biomarker" of the present invention is a substance capable of diagnosing by distinguishing the tissue or cell of a subject with gastric cancer from the tissue or cell of a normal control, and increases or decreases in the tissue or cell of the subject with the disease compared to the normal control. and organic biomolecules such as proteins or nucleic acids, lipids, glycolipids, glycoproteins, and the like.
본 발명은 TINAGL1을 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 미만형 위암 예후예측용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.The present invention can provide a biomarker composition for predicting the prognosis of diffuse gastric cancer comprising TINAGL1 protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
본 발명의 "진단 (diagnosis)"은 넓은 의미는 환자의 병의 실태를 모든면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태 및 합병증의 유무 등이다."Diagnosis" of the present invention means to judge the actual condition of a patient's disease in a broad sense in all aspects. The content of the judgment is the name of the disease, etiology, type, severity, detailed mode of the disease, and the presence or absence of complications.
본 발명의 "예후"는 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자가 질환을 차후에 가지게 될지의 여부를 판단하거나 치료에 대한 검사 대상자의 반응성을 판단하는 것을 포함한다."Prognosis" of the present invention includes determining whether a subject, ie, a test subject, will have a disease in the future for a specific disease or disorder, or determining the responsiveness of a test subject to treatment.
본 발명은 TINAGL1 억제제를 유효성분으로 함유하는 미만형 위암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.The present invention may provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diffuse gastric cancer containing a TINAGL1 inhibitor as an active ingredient.
상기 TINAGL1 억제제는 미만형 위암 조직 내 암관련섬유모세포 (CAF)에서 TINAGL1 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 분비 및 발현을 억제시키는 것일 수 있다.The TINAGL1 inhibitor may inhibit the secretion and expression of TINAGL1 protein or a gene encoding the protein in cancer-associated fibroblasts (CAF) in diffuse gastric cancer tissue.
상기 TINAGL1 억제제는 TINAGL1 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 펩티드, 앱타머, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.The TINAGL1 inhibitor may be any one selected from the group consisting of TINAGL1 protein or a peptide, aptamer, antibody, antisense nucleotide, siRNA, shRNA, and miRNA that specifically binds to a gene encoding the protein.
본 발명은 TINAGL1 억제제 및 항암제를 유효성분으로 함유하는 미만형 위암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.The present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diffuse gastric cancer containing a TINAGL1 inhibitor and an anticancer agent as active ingredients.
상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 이마티닙(imatinib), 시스플라틴(cisplatin) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.The anticancer agent is doxorubicin, paclitaxel, vincristine, daunorubicin, vinblastine, actinomycin-D, docetaxel, eto It may be selected from the group consisting of etoposide, teniposide, bisantrene, imatinib, cisplatin and 5-fluorouracil.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 TINAGL1 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition containing the TINAGL1 inhibitor as an active ingredient may be prepared as an injection, granule, powder, tablet, pill, capsule, suppository, gel, suspension, emulsion, drop or drop according to a conventional method. Any one formulation selected from the group consisting of liquid formulations may be used.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 TINAGL1 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition containing the TINAGL1 inhibitor as an active ingredient includes a suitable carrier, excipient, disintegrant, sweetener, coating agent, swelling agent, lubricant, flavoring agent, and a suitable carrier, excipient, disintegrant, commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions; It may further include one or more additives selected from the group consisting of antioxidants, buffers, bacteriostats, diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.Specifically, carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil can be used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, and capsules. agent and the like, and such a solid preparation may be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like in the composition. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc can also be used. Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, and the like, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin may be included. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like. Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As the base material for the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition is administered in a conventional manner via intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, intranasal, inhalation, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal routes. can be administered to the subject.
상기 TINAGL1 억제제의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.The preferred dosage of the TINAGL1 inhibitor may vary depending on the condition and weight of the subject, the type and extent of the disease, the drug form, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. According to an embodiment of the present invention, although not limited thereto, the daily dose may be 0.01 to 200 mg/kg, specifically 0.1 to 200 mg/kg, and more specifically 0.1 to 100 mg/kg. Administration may be administered once a day or may be administered in several divided doses, thereby not limiting the scope of the present invention.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the 'subject' may be a mammal including a human, but is not limited to these examples.
또한, 본 발명은 미만형 위암 조직으로부터 분리된 암관련섬유모세포 (CAF)를 배양하여 TINAGL1 발현 수준을 확인하는 단계(제1단계); 상기 TINAGL1이 발현된 암관련섬유모세포에 후보물질을 처리하여 TINAGL1 발현 수준을 확인하는 단계(제2단계); 및 상기 제1단계의 TINAGL1 발현 수준과 제2단계의 TINAGL1 발현 수준을 비교하는 단계(제3단계)를 포함하는 미만형 위암 치료용 약물 스크리닝방법을 제공할 수 있다.In addition, the present invention includes the steps of culturing cancer-associated fibroblasts (CAF) isolated from diffuse gastric cancer tissue to determine the TINAGL1 expression level (step 1); Checking the TINAGL1 expression level by treating the TINAGL1-expressed cancer-associated fibroblasts with a candidate material (second step); and comparing the TINAGL1 expression level of the first step with the TINAGL1 expression level of the second step (third step).
상기 TINAGL1 발현 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석(radioimmunoassay), 면역조직화학 (immunohistochemistry), 마이크로어레이(microarray), 웨스턴 블랏(western blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 측정하는 것일 수 있다.The TINAGL1 expression level is reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (radioimmunoassay), immunohistochemistry (immunohistochemistry), It may be measured by any one or more selected from the group consisting of microarray, western blotting, and flow cytometry (FACS).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, to help the understanding of the present invention, examples will be described in detail. However, the following examples are merely illustrative of the contents of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those of ordinary skill in the art.
<실시예 1> 암관련섬유모세포 (CAF) 및 정상섬유모세포 (NAF) 간의 유전자 발현 차이 확인<Example 1> Confirmation of gene expression difference between cancer-associated fibroblasts (CAF) and normal fibroblasts (NAF)
위암은 조직학적 하위 유형에 따라 심각한 종양 간 이종성을 가지고 있다.Gastric cancer has severe intertumoral heterogeneity according to histological subtypes.
미만형 위암 내 축적된 암관련섬유모세포가 환자들의 예후와 관련되어 있다고 보고되었다. 앞선 연구결과에서 특이적 하위 유형인 반지세포암종 (signet ring cell carcinoma)에서 암관련섬유모세포 (cancer-associated fibroblast: CAF) 축적의 의학적 의미를 확인하기 위해, 175명 환자의 반지세포암종에서 기질 콜라겐 또는 섬유아세포 마커 염색을 수행하여 두 그룹으로 분류하였다.It has been reported that cancer-associated fibroblasts accumulated in diffuse gastric cancer are associated with the prognosis of patients. To confirm the medical significance of cancer-associated fibroblast (CAF) accumulation in a specific subtype, signet ring cell carcinoma, from the previous study results, stromal collagen in 175 patients Alternatively, fibroblast marker staining was performed to classify them into two groups.
그 결과, 다량의 섬유증 기질을 가진 환자군이 다른 환자군보다 좋지 않은 예후를 나타내는 것이 확인되었다.As a result, it was confirmed that the patient group with a large amount of fibrotic matrix showed a poorer prognosis than other patient groups.
상기 연구결과로부터 암관련섬유모세포 (cancer-associated fibroblast: CAF) 및 정상섬유모세포 (normal gastric tissue-associated fibroblast: NAF)가 암세포에 미치는 영향의 차이를 확인하고, CAF 및 NAF의 전사체 및 단백체 분석을 수행하였다.From the above study results, the difference in the effect of cancer-associated fibroblast (CAF) and normal gastric tissue-associated fibroblast (NAF) on cancer cells was confirmed, and transcriptome and proteomic analysis of CAF and NAF was performed.
24-웰 플레이트에 NAF 또는 CAF를 분주하고 미만형 위암 세포주 SNU668을 pore size 8μm 트랜스웰 챔버에 분주하였다. 이후에 상부 챔버에는 serum-free DMEM, 하부 챔버에는 10% FBS가 첨가된 DMEM을 넣고 NAF 또는 CAF와 공동 배양하거나 암세포 단독으로 배양하였다.NAF or CAF was dispensed in a 24-well plate, and the diffuse gastric cancer cell line SNU668 was dispensed in a transwell chamber with a pore size of 8 μm. Afterwards, serum-free DMEM was added to the upper chamber and DMEM supplemented with 10% FBS was added to the lower chamber, and then co-cultured with NAF or CAF or cancer cells were cultured alone.
48시간 후에 메탄올로 세포를 고정하고 H&E 염색을 수행하였다. 상부 챔버의 막 위쪽에 존재하는 세포들을 제거한 다음 막을 챔버에서 분리해 슬라이드 글라스 위에 아래쪽 면이 위로 올라오게 놓고 mounting 하였다. 100 배율로 각 웰당 무작위로 세 군데의 사진을 찍어 막을 통과한 세포를 계수한 후 평균을 비교하였다.After 48 hours, cells were fixed with methanol and H&E staining was performed. After removing the cells present on the top of the membrane in the upper chamber, the membrane was separated from the chamber and mounted with the bottom side up on a slide glass. Cells passing through the membrane were counted by taking three random pictures per well at 100 magnification, and then the averages were compared.
아가로스 (low gelling temperature)를 이용해 24-웰 플레이트의 바닥에 1.0% 아가로스 겔을 만들고, 바닥의 겔이 굳으면 0.5% 아가로스 겔에 SNU668 암세포와 NAF 또는 CAF를 함께 섞어 그 위에 분주하여 굳혔다.A 1.0% agarose gel was made at the bottom of the 24-well plate using agarose (low gelling temperature), and when the gel at the bottom was hardened, SNU668 cancer cells and NAF or CAF were mixed together in a 0.5% agarose gel and dispensed on it to harden. .
상부의 겔까지 굳으면 10% FBS가 첨가된 RPMI를 300 μl씩 분주하였다. 이후 3일에 한 번씩 새 배지로 교체하며 20일 동안 관찰하였다.When the gel at the top was hardened, 300 μl of RPMI with 10% FBS was dispensed. Thereafter, the medium was replaced with a new medium once every 3 days and observation was made for 20 days.
각 그룹당 4개의 웰을 사용했으며, 20일째 되는 날 모든 웰에서 콜로니의 직경을 측정하였다. 웰당 상위 5개 크기의 스페로이드(spheroid)의 평균 직경으로 두 그룹간의 종양형성 정도를 비교하였다.Four wells were used in each group, and the diameter of colonies was measured in all wells on the 20th day. The degree of tumorigenesis between the two groups was compared with the average diameter of the top five spheroids per well.
또한, 앞선 실험과 동일한 방법으로 SUN601 세포에 NAF 및 CAF를 각각 처리하여 함께 배양한 후 종양 형성능 및 이동능을 확인하였다.In addition, in the same manner as in the previous experiment, SUN601 cells were treated with NAF and CAF, respectively, and cultured together to confirm tumorigenicity and migration ability.
그 결과, 도 1 및 도 2와 같이 NAF와 비교하여 CAF를 공동배양한 그룹에서 암세포의 이동능력이 더 많이 증가하고 형성된 종양 스페로이드의 평균 크기가 더 큰 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIGS. 1 and 2 , it was confirmed that in the group co-cultured with CAF compared to NAF, the migrating ability of cancer cells increased more and the average size of the formed tumor spheroids was larger.
또한, 도 3의 전사체 분석결과를 참고하면, 13개의 유전자가 NAF 보다 CAF에 일반적으로 증가하였으며, 이중 6개의 유전자는 세포외 영역과 관련된 유전자로 확인되었으며, 특히 TINAGL1이 가장 높은 비율을 나타내는 것으로 확인되었다.In addition, referring to the transcript analysis result of FIG. 3 , 13 genes were generally increased in CAF than in NAF, and 6 genes were identified as genes related to the extracellular region, and TINAGL1 showed the highest ratio. Confirmed.
또한, 질량분석 결과를 참고하면, NAF와 비교하여 CAF 조절 배지에서 유의하게 증가된 96개의 단백질을 확인하였으며, 96개의 단백질에 대한 IPA 기능 분석 결과, 27개의 단백질이 세포외 영역과 관련된 그룹으로 분류되었으며, 이중 TINAGL1이 확인되었다.In addition, referring to the mass spectrometry results, 96 proteins were identified that were significantly increased in the CAF-conditioned medium compared to NAF. As a result of IPA function analysis for 96 proteins, 27 proteins were classified into groups related to the extracellular region. and TINAGL1 was identified.
상기 발현 수준 변화가 확인된 TINAGL1이 미만형 위암 환자의 CAF 및 NAF에서 발현 차이를 나타내는 지를 확인하기 위해, 정량적 RT-PCR, 웨스턴 블롯, 실시간 PCR 및 ELISA를 수행하였다.In order to confirm whether TINAGL1, whose expression level was changed, exhibits an expression difference in CAF and NAF of patients with diffuse gastric cancer, quantitative RT-PCR, Western blot, real-time PCR, and ELISA were performed.
그 결과, 도 4와 같이 미만형 위암 환자의 NAF 보다 CAF에서 TINAGL1 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 4 , it was confirmed that TINAGL1 expression was increased in CAF than in NAF of diffuse gastric cancer patients.
상기 결과로부터 확인된 CAF에서 분비되는 TINAGL1과 위암 진행에 대한 관련성을 확인하기 위해 추가 실험을 수행하였다.Additional experiments were performed to confirm the relationship between TINAGL1 secreted from CAF confirmed from the above results and gastric cancer progression.
<실시예 2> 암관련섬유모세포 (CAF) 및 정상섬유모세포 (NAF)가 미만형 위암 세포주에 미치는 영향 확인<Example 2> Confirmation of the effect of cancer-associated fibroblasts (CAF) and normal fibroblasts (NAF) on diffuse gastric cancer cell lines
암관련섬유모세포 (CAF) 및 정상섬유모세포 (NAF)가 미만형 위암 세포주에 미치는 영향을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.To determine the effect of cancer-associated fibroblasts (CAF) and normal fibroblasts (NAF) on diffuse gastric cancer cell lines, Western blot analysis was performed.
먼저, NAF 또는 CAF를 10cm 배양접시에서 serum-free DMEM으로 48시간 배양하였다. 배양한 배지를 새 튜브에 옮겨 담고 4℃에서 2000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 새 튜브에 수집하였다.First, NAF or CAF was cultured in a 10 cm culture dish with serum-free DMEM for 48 hours. The cultured medium was transferred to a new tube, centrifuged at 4°C at 2000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected in a new tube.
미만형 위암 세포주 SNU601 (5.5×105) 및 AGS (3.0×105)를 6-웰 플레이트에 분주하고 serum-free DMEM으로 하룻밤동안 starvation 시켰다. Starvation 종료 후 각각의 암세포를 5% FBS가 첨가된 DMEM, NAF 또는 CAF 조건배지로 배양하였다.Diffuse gastric cancer cell lines SNU601 (5.5×10 5 ) and AGS (3.0×10 5 ) were aliquoted into 6-well plates and starvated overnight with serum-free DMEM. After starvation, each cancer cell was cultured in DMEM, NAF or CAF conditioned medium supplemented with 5% FBS.
또한, serum-free DMEM으로 하룻밤동안 starvation 시킨 암세포와 NAF 또는 CAF를 각각 6-웰 플레이트와 pore size 0.4μm 트랜스웰 챔버에 분주하고 5% FBS가 첨가된 DMEM로 공동 배양하였다.In addition, the cancer cells and NAF or CAF starvated overnight with serum-free DMEM were dispensed into a 6-well plate and a transwell chamber with a pore size of 0.4 μm, respectively, and co-cultured with DMEM supplemented with 5% FBS.
각 시간 포인트마다 세포를 수집하여 단백질을 추출하고, SDS-PAGE로 전기영동한 후, PVDF 막으로 옮겼다. 상기 PVDF 막을 5% 탈지우유로 상온에서 1시간 동안 블로킹처리 하였다.At each time point, cells were collected, proteins were extracted, electrophoresed by SDS-PAGE, and transferred to PVDF membrane. The PVDF membrane was blocked with 5% skim milk at room temperature for 1 hour.
타겟 단백질에 대한 1차 항체를 4℃에서 하룻밤동안 동안 반응시키고, 1차 항체에 대한 HRP-결합된 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL 용액을 이용해 시각화하고, β-액틴으로 타겟 단백질의 발현을 표준화하였다.The primary antibody against the target protein was reacted at 4° C. overnight, and the HRP-conjugated secondary antibody against the primary antibody was reacted for 1 hour at room temperature, visualized using an ECL solution, and targeted with β-actin. Protein expression was normalized.
그 결과, 도 5와 같이 NAF 또는 CAF의 조건 배지로 배양되거나 NAF 또는 CAF 와 함께 배양된 암세포에서 FAK 신호가 활성화되었으며, FAK 신호전달 활성화 정도가 NAF보다 CAF에 의해서 더 향상된 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 SNU601 및 AGS 2가지 세포주에서 동일하게 나타났다.As a result, as shown in FIG. 5, FAK signaling was activated in cancer cells cultured with NAF or CAF conditioned medium or cultured with NAF or CAF, and it was confirmed that the degree of FAK signaling activation was improved more by CAF than by NAF. The results were identical in the two cell lines SNU601 and AGS.
<실시예 3> TINAGL1에 의한 FAK 신호 활성 확인<Example 3> Confirmation of FAK signal activity by TINAGL1
앞선 실험에서 확인된 바와 같이 CAF가 미만형 암세포의 FAK 신호를 활성화시키는 것으로 확인됨에 따라, CAF에서 분비되는 TINAGL1 역시 미만형 암세포 내 FAK 신호를 조절할 수 있는지 확인하였다.As confirmed in the previous experiment, as it was confirmed that CAF activates the FAK signal in diffuse cancer cells, it was confirmed whether TINAGL1 secreted from CAF could also regulate the FAK signal in diffuse cancer cells.
피브로넥틴 용액 (Fibronectin solution, 10 μg/ml in PBS)으로 37℃에서 3시간 인큐베이션하면서 배양 접시를 코팅하였다. The culture dish was coated with a fibronectin solution (Fibronectin solution, 10 μg/ml in PBS) while incubating at 37° C. for 3 hours.
SNU601 (5.5×105) 및 AGS (3.0×105) 암세포를 피브로넥틴이 코팅되거나 되지 않은 6-웰 플레이트에 분주하고, 암세포를 serum-free DMEM으로 하룻밤동안 starvation 시켰다. Starvation이 끝나면 5% FBS가 첨가된 배지로 배양하였으며, 이때 각각의 조건에 맞춰 피브로넥틴 또는 재조합 TINAGL1(100ng/ml 또는 200ng/ml)을 배지에 직접 첨가하였다.SNU601 (5.5×10 5 ) and AGS (3.0×10 5 ) cancer cells were aliquoted into 6-well plates coated with or without fibronectin, and the cancer cells were starvated overnight with serum-free DMEM. After starvation, culture was performed in a medium supplemented with 5% FBS, and fibronectin or recombinant TINAGL1 (100ng/ml or 200ng/ml) was directly added to the medium according to each condition.
이후 각 시간 포인트마다 세포를 수집하고 단백질을 추출하여 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 FAK 신호전달의 upstream에 있다고 알려진 인테그린(integrin)의 리간드(ligand) 중 하나인 피브로넥틴에 의한 FAK 신호 활성 정도를 확인했다.Thereafter, cells were collected at each time point, proteins were extracted, and Western blot was performed in the same manner as in Example 2, FAK signal by fibronectin, one of the ligands of integrin known to be upstream of FAK signaling. The degree of activity was confirmed.
그 결과, 도 6과 같이 피브로넥틴이 처리된 실험군에서 FAK가 활성화되었으며, TINAGL1 첨가에 의해 FAK 신호 활성이 더욱 향상된 것을 확인할 수 있었다. 또한, TINAGL1을 단독 처리 했을 때도 FAK 신호전달이 활성화되는 것을 확인할 수 있었다 (오른쪽 그림 마지막 샘플).As a result, as shown in FIG. 6 , FAK was activated in the fibronectin-treated experimental group, and it was confirmed that the FAK signaling activity was further improved by the addition of TINAGL1. In addition, it was confirmed that FAK signaling was activated even when TINAGL1 was treated alone (last sample on the right).
<실시예 4> TINAGL1의 종양형성능 확인<Example 4> Confirmation of tumorigenicity of TINAGL1
아가로스 (low gelling temperature)를 이용해 6-웰 플레이트의 바닥에 1.0% 아가로스 겔을 만들고, 바닥의 겔이 굳으면 0.5% 아가로스 겔에 SNU601 암세포를 섞어 그 위에 분주하여 굳혔다.Agarose (low gelling temperature) was used to make a 1.0% agarose gel at the bottom of the 6-well plate, and when the gel at the bottom hardened, SNU601 cancer cells were mixed with 0.5% agarose gel and dispensed thereon to harden.
상부의 겔까지 굳으면 rhTINAGL1이 존재하거나 존재하지 않는 10% FBS가 첨가된 RPMI (100ng/ml)를 500 μl씩 분주하였다. 이후 3일에 한 번씩 각각에 맞는 새 배지로 교체하며 20일 동안 관찰하였다.When the upper gel was hardened, 500 μl of RPMI (100 ng/ml) supplemented with 10% FBS with or without rhTINAGL1 was dispensed. After that, it was observed for 20 days by replacing it with a new medium suitable for each once every 3 days.
각 그룹당 3개의 웰을 사용했으며, 20일째 되는 날 모든 웰에서 콜로니의 직경을 측정하였다. 웰당 상위 5개 크기의 스페로이드(spheroid)의 평균 직경으로 두 그룹간의 종양형성 정도를 비교하였다.Three wells were used in each group, and the diameter of colonies was measured in all wells on the 20th day. The degree of tumorigenesis between the two groups was compared with the average diameter of the top five spheroids per well.
그 결과, 도 7과 같이 대조군과 비교하여 TINAGL1을 처리한 그룹에 형성된 종양 스페로이드의 평균 크기가 더 큰 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the average size of the tumor spheroids formed in the group treated with TINAGL1 was larger than that of the control group as shown in FIG. 7 .
<실시예 5> TINAGL1이 발현 억제된 CAF가 위암세포에 미치는 영향 확인<Example 5> Confirmation of the effect of TINAGL1 expression-inhibited CAF on gastric cancer cells
1. TINAGL1 발현 억제된 CAF 제작1. Preparation of CAF with TINAGL1 Expression Inhibited
리포펙타민 RNAiMAX를 이용해 30 nM TINAGL1 또는 NC siRNA를 48 시간동안 CAF 세포에 형질감염시켰다. 48시간 후 각각 RNA와 단백질을 준비하였다.Lipofectamine RNAiMAX was used to transfect CAF cells with 30 nM TINAGL1 or NC siRNA for 48 hours. After 48 hours, RNA and protein were prepared, respectively.
준비된 RNA로부터 cDNA를 합성한 후 타겟 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하고, 2% 아가로스 겔, 100V 에서 20분 전기영동하여 PCR 산물을 확인하였다.After synthesizing cDNA from the prepared RNA, RT-PCR was performed using a primer for the target gene, and the PCR product was confirmed by electrophoresis in 2% agarose gel, 100V for 20 minutes.
또한, 단백질은 SDS-PAGE로 전기영동한 후, PVDF 막으로 옮겼다. 이후 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴블롯 분석을 수행하였다.In addition, the protein was electrophoresed by SDS-PAGE, and then transferred to a PVDF membrane. Thereafter, Western blot analysis was performed in the same manner as in Example 2.
그 결과, 도 8과 같이 siTINAGL1 (30nM)을 형질감염시킨 CAF에서 TINAGL1 유전자 및 단백질의 발현 감소가 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 8 , it was confirmed that the expression of TINAGL1 gene and protein was decreased in CAF transfected with siTINAGL1 (30 nM).
한편, 24웰-플레이트에 NAF 및 CAF를 각각 3×103 cells/well로 분주하고, 리포펙타민 RNAiMAX를 이용해 30nM siRNA를 48시간 동안 형질감염시켰다.Meanwhile, NAF and CAF were each dispensed in a 24-well plate at 3×10 3 cells/well, and 30 nM siRNA was transfected using Lipofectamine RNAiMAX for 48 hours.
48시간 후, 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정시키고, 2% BSA로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체로 TINAGL1(CUSABIO, 1:100)을 4℃에서 하룻밤동안 결합시키고, 1차 항체에 대한 형광이 부착된 2차 항체 Cy3-Rabbit (1:500)을 상온에서 2시간 동안 결합시켰다. 이후 DAPI와 함께 Mounting solution을 처리한 후, 현미경으로 관찰하였다.After 48 hours, cells were fixed with 4% paraformaldehyde and blocked with 2% BSA at room temperature for 1 hour. As a primary antibody, TINAGL1 (CUSABIO, 1:100) was bound at 4° C. overnight, and a secondary antibody Cy3-Rabbit (1:500) with fluorescence attached to the primary antibody was bound at room temperature for 2 hours. After treating the mounting solution with DAPI, it was observed under a microscope.
그 결과, 도 9와 같이 NAF보다 CAF에서 더 많은 TINAGL1 (red) 발현이 확인되었으며, siTINAGL1이 형질변형된 CAF에서는 TINAGL1 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 9 , more TINAGL1 (red) expression was confirmed in CAF than in NAF, and it was confirmed that TINAGL1 expression was decreased in CAF transformed with siTINAGL1.
2. TINAGL1 발현 억제된 CAF에 의한 위암세포 이동능 확인2. Confirmation of gastric cancer cell migration ability by TINAGL1 expression-inhibited CAF
24-웰 플레이트에 CAF를 분주하고, 리포펙타민 RNAiMAX를 이용해 30nM TINAGL1 또는 NC siRNA를 3일 동안 형질변형시켰다.CAF was aliquoted in 24-well plates, and 30 nM TINAGL1 or NC siRNA was transformed using Lipofectamine RNAiMAX for 3 days.
SNU601 (2×104)을 8μm pored 트랜스웰 챔버에 분주하고, serum-free DMEM으로 하룻밤동안 starvation 시켰다. 이후에 상부 챔버에는 serum-free DMEM, 하부 챔버에는 10% FBS가 첨가된 DMEM을 넣고 형질변형된 NAF 또는 CAF와 공동 배양하였다. 48시간 후에 메탄올로 세포를 고정하고 H&E 염색을 수행하였다. 상부 챔버의 막 위쪽에 존재하는 세포들을 제거한 다음 막을 챔버에서 분리해 슬라이드 글라스 위에 아래쪽 면이 위로 올라오게 놓고 mounting 하였다. 200 배율로 각 웰당 무작위로 세 부위의 사진을 찍어 막을 통과한 세포를 계수한 후 평균을 비교하였다.SNU601 (2×10 4 ) was dispensed into an 8 μm pored transwell chamber and starvated overnight with serum-free DMEM. Thereafter, serum-free DMEM was added to the upper chamber and DMEM supplemented with 10% FBS was added to the lower chamber, and co-cultured with the transformed NAF or CAF. After 48 hours, cells were fixed with methanol and H&E staining was performed. After removing the cells present on the top of the membrane in the upper chamber, the membrane was separated from the chamber and mounted with the bottom side up on a slide glass. Cells passing through the membrane were counted by taking pictures of three sites at random per well at 200 magnification, and then the averages were compared.
그 결과, 도 10과 같이 SNU601을 단독으로 배양한 대조군에서는 세포들의 이동이 거의 확인되지 않다. NAF와 공동 배양한 실험군에서는 암세포 이동이 확인되었으나 CAF와 공동 배양한 실험군에서 암세포 이동이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 10 , in the control group culturing SNU601 alone, the migration of cells was hardly confirmed. In the experimental group co-cultured with NAF, cancer cell migration was confirmed, but it was confirmed that cancer cell migration was significantly increased in the experimental group co-cultured with CAF.
또한, siRNA 형질변형을 통하여 TINAGL1 발현이 억제된 CAF와 공동 배양된 실험군에서는 음성 대조군에 비해 암세포의 이동이 감소된 것을 확인할 수 있었다.In addition, it was confirmed that cancer cell migration was reduced in the experimental group co-cultured with CAF, in which TINAGL1 expression was suppressed through siRNA transformation, compared to the negative control group.
3. TINAGL1 발현 억제된 CAF가 위암세포 내 신호기전에 미치는 영향 확인3. Confirmation of Effect of TINAGL1 Expression-Inhibited CAF on Signaling Mechanism in Gastric Cancer Cells
CAF을 pore size 0.4μm 트랜스웰 챔버에 분주하고, 리포펙타민 RNAiMAX를 이용해 30nM TINAGL1 또는 NC siRNA를 3일 동안 형질변형시켰다.CAF was dispensed into a transwell chamber with a pore size of 0.4 μm, and 30 nM TINAGL1 or NC siRNA was transformed using Lipofectamine RNAiMAX for 3 days.
SNU601은 6-웰 플레이트에 분주하고, serum-free DMEM으로 하룻밤동안 starvation 시켰다. 이후에 5% FBS가 첨가된 DMEM으로 NAF 또는 형질변형된 CAF 세포와 24시간 공동 배양하였다.SNU601 was aliquoted into 6-well plates and incubated overnight with serum-free DMEM. Thereafter, the cells were co-cultured with NAF or transformed CAF cells in DMEM supplemented with 5% FBS for 24 hours.
이후 SNU601 세포를 수집하여 단백질을 추출하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.Thereafter, SNU601 cells were collected, proteins were extracted, and Western blot analysis was performed in the same manner as in Example 2.
그 결과, 도 11A와 같이 CAF 공동 배양에 의해 증가된 FAK 신호전달이 CAF의 TINAGL1 넉다운에 의해 감소되었다. 또한, 도 11B와 같이 TINAGL1 넉다운에 의해 FAK 신호 활성화가 감소될 경우, CAF 공동 배양에 의해 증가했던 EMT 마커 Twist가 함께 감소하는 것으로 확인되었다.As a result, FAK signaling increased by CAF co-culture was reduced by TINAGL1 knockdown of CAF as shown in FIG. 11A . In addition, as shown in FIG. 11B , when FAK signal activation was reduced by TINAGL1 knockdown, it was confirmed that the EMT marker Twist increased by CAF co-culture decreased together.
<실시예 6> 미만형 위암 조직에서 TINAGL1의 발현 수준 확인<Example 6> Confirmation of expression level of TINAGL1 in diffuse gastric cancer tissue
미만형 위암 환자에게서 쌍으로 얻은 정상 위조직과 위암조직에서 TINAGL1 단백질 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. The expression level of TINAGL1 protein was confirmed by Western blot in normal gastric and gastric cancer tissues obtained in pairs from diffuse gastric cancer patients.
그 결과, 도 12와 같이 대부분의 미만형 위암 환자들의 암조직에서 정상조직보다 높은 TINAGL1 단백질 발현이 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 12 , it was confirmed that TINAGL1 protein expression was higher than that of normal tissues in cancer tissues of most diffuse gastric cancer patients.
또한, double-staining RNA-in situ hybridization을 수행하여 미만성 위암 환자의 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직에서 COL1A1 (빨간색, 섬유모세포 마커) 및 TINAGL1 (녹색)의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.In addition, by performing double-staining RNA-in situ hybridization, the mRNA expression levels of COL1A1 (red, fibroblast marker) and TINAGL1 (green) were confirmed in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues of patients with diffuse gastric cancer.
그 결과, 도 13과 같이 TINAGL1 mRNA 발현이 종양 조직에서 증가하였으며, COL1A1과 공동 발현된 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 13 , TINAGL1 mRNA expression was increased in the tumor tissue, and it was confirmed that it was co-expressed with COL1A1.
상기 결과들로부터 TINAGL1의 발현은 정상 위조직보다 암조직에서 증가를 나타내는 것이 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the expression of TINAGL1 was increased in cancer tissues than in normal gastric tissues.
한편, 위암의 공개된 전사체 데이터를 이용하여 TINAGL1 발현 수준과 위암환자 예후의 연관성을 확인하였다.Meanwhile, the association between the TINAGL1 expression level and the prognosis of gastric cancer patients was confirmed using published transcriptome data of gastric cancer.
도 14를 참고하면, TINAGL1의 고발현은 모든 환자 및 장형 환자의 예후와는 관련성이 없었으나, 높은 기질 비율을 나타내는 미만형 위암에서는 TINAGL1의 고발현이 나쁜 예후와 상당히 관련성 있는 것으로 나타났다.Referring to FIG. 14 , high expression of TINAGL1 was not correlated with the prognosis of all patients and intestinal patients, but it was found that high expression of TINAGL1 was significantly associated with poor prognosis in diffuse gastric cancer with a high substrate ratio.
상기 결과로부터 기질 부분에서 TINAGL1 유전자 발현은 미만형 위암의 예후예측에 매우 의미있는 것으로 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the expression of the TINAGL1 gene in the stroma is very meaningful in the prognosis of diffuse gastric cancer.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those of ordinary skill in the art, it is clear that this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (13)
상기 TINAGL1이 발현된 암관련섬유모세포에 후보물질을 처리하여 TINAGL1 발현 수준을 확인하는 단계(제2단계); 및
상기 제1단계의 TINAGL1 발현 수준과 제2단계의 TINAGL1 발현 수준을 비교하는 단계(제3단계)를 포함하는 미만형 위암 치료용 약물 스크리닝방법.Culturing cancer-associated fibroblasts (CAF) isolated from diffuse gastric cancer tissue to determine the TINAGL1 expression level (step 1);
Checking the TINAGL1 expression level by treating the TINAGL1-expressed cancer-associated fibroblasts with a candidate material (second step); and
and comparing the TINAGL1 expression level of the first step with the TINAGL1 expression level of the second step (third step).
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