KR20210101014A - A cell composition comprising retinal cell having characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cell simultaneously and use thereof - Google Patents

A cell composition comprising retinal cell having characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cell simultaneously and use thereof Download PDF

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KR20210101014A
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retinal
pigment epithelial
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photoreceptor
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이주용
정선호
강은주
소성준
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재단법인 아산사회복지재단
울산대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a cell composition including retinal cells showing characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells simultaneously, and a use thereof. Particularly, the present invention relates to a cell composition including retinal cells differentiated from human pluripotent stem cells (embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells) through the treatment with an ROCK inhibitor at a predetermined concentration for a predetermined time, and showing characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells simultaneously, a cell medicine for preventing or treating retinal diseases including the same, a method for preparing retinal cells showing characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells simultaneously, and a composition for differentiation into retinal cells showing characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells simultaneously.

Description

광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 포함하는 세포 조성물 및 이의 용도 {A cell composition comprising retinal cell having characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cell simultaneously and use thereof}A cell composition comprising retinal cells exhibiting characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time, and uses thereof

본 발명은 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 포함하는 세포 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 일정기간 동안 일정한 농도로 ROCK 억제제를 처리하여 인간 전분화능 줄기세포 (배아줄기세포 혹은 역분화줄기세포)로부터 분화시킨, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 포함하는 세포 조성물, 이를 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 세포 치료제, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법 및 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로 분화시키기 위한 분화용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a cell composition comprising retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time and uses thereof, and more particularly, to human pluripotent stem cells by treatment with a ROCK inhibitor at a constant concentration for a certain period of time. Cell composition containing retinal cells differentiated from (embryonic stem cells or dedifferentiated stem cells) and simultaneously exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells, cell therapy for preventing or treating retinal diseases, including photoreceptors The present invention relates to a method for producing retinal cells simultaneously exhibiting the characteristics of cells and retinal pigment epithelial cells, and to a differentiation composition for differentiating into retinal cells simultaneously exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells.

많은 사람들이 망망색소상피세포(retinal pigment epithelium, RPE), 간체시세포 (rod photoreceptor), 추체시세포(cone photoreceptor), 양극세포(bipolar cells), 아마크린세포, 망막절제포, 뮐러세포(muller cells), 및 수평세포를 포함하는 신경 망막의 세포, 부르크막(bruch's membrane) 및/또는 맥락막의 기능장애, 손상, 또는 상실과 관련된 망막 질환으로 고통 받고 있다. 질환의 진행은 종종 광수용체/RPE/부르크막/맥락막 복합체의 불안정화, 및 그에 따른 RPE와 신경 망막층의 기능 장애와 사멸을 수반한다. 노인성황반변성 (age-related macular degeneration, AMD)의 경우, 세포 사멸의 위치가 황반에 있어서, 중심 시력의 손상을 초래한다. 망막 자체와 RPE의 변성 또는 퇴화와 관련된 특정 장애는 AMD, 베스트병(Best disease, 노른자모양 황반 이영양증), 망막색소변성(RP)의 서브타입, 및 스타가르트 질환 및 스타가르트 유사 질환과 같은 황반 이영양증(macular dystrophies)을 포함한 유전성 황반 변성이다.Many people have retinal pigment epithelium (RPE), rod photoreceptor, cone photoreceptor, bipolar cells, amacrine cells, retinectomy cells, muller cells. , and the cells of the neural retina, including horizontal cells, suffer from retinal diseases associated with dysfunction, damage, or loss of the Bruch's membrane and/or choroid. The progression of the disease is often accompanied by destabilization of the photoreceptor/RPE/Brook's membrane/choroid complex and consequent dysfunction and death of the RPE and the neural retinal layer. In the case of age-related macular degeneration (AMD), the location of cell death is in the macula, resulting in impairment of central vision. Certain disorders associated with degeneration or degeneration of the retina itself and of the RPE include AMD, Best disease (yolk-shaped macular dystrophy), subtypes of retinitis pigmentosa (RP), and Stargardt's disease and Stargardt-like diseases. Hereditary macular degeneration, including macular dystrophies.

망막 변성 질환 및 손상의 치료에 사용될 수 있는 인간 줄기세포로부터 망막색소상피세포(RPEC)를 생산할 필요가 있다. 유사하게, 일부 질환 상태에서 RPEC의 생존 및 기능을에 의존하는 광수용체(PhR)를 교체할 필요가 있다. 이러한 질병에 대한 잠재적 치료법은 이들 질병, 장애 또는 상태에 영향을 받는 사람들의 망막에 RPEC를 이식하는 것이다. 대상체의 망막에 건강한 이식된 RPE 세포의 첨가는 현재 변성을 지연, 정지 또는 역전시킬 수 있고, 망막 기증을 개선시키며, 상기 언급된 질환, 질병, 또는 상태에 의해 야기될 수 있는 실명을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다. AMD 또는 광수용체 특이적 변성의 경우, 치료적 이점을 제공하기 위해 RPEC, 광수용체세포, 또는 이 둘 다를 교체해야 할 수도 있다.There is a need to produce retinal pigment epithelial cells (RPECs) from human stem cells that can be used in the treatment of retinal degenerative diseases and injuries. Similarly, in some disease states there is a need to replace the photoreceptors (PhRs), which depend on the survival and function of RPECs. A potential treatment for these diseases is the implantation of RPECs into the retina of people affected by these diseases, disorders or conditions. Addition of healthy transplanted RPE cells to a subject's retina may delay, arrest or reverse current degeneration, improve retinal donation, and prevent blindness that may be caused by the aforementioned diseases, disorders, or conditions. it is known In the case of AMD or photoreceptor specific degeneration, it may be necessary to replace RPECs, photoreceptor cells, or both to provide a therapeutic benefit.

망막의 중요한 부분인 황반은 망막의 중앙에 위차하고 있으며, 세밀한 시각적 부분 및 색 인식을 담당하고, 얼굴 인식 및 읽기와 같은 많은 일상적인 활동에 중요하다. 질병의 진행에서 황반은 망막색소변성(RP), 노인성황반변성 및 베스트병과 같이 유해한 영향을 받을 수 있다. 꽤 자주, RPE는 이들 질환이 강력해진 경우 기능을 잃거나 심지어 불능(fail)이 된다. 이는 RPEC가 망막 재생 및 시력에 결정적인 광수용체 기능을 지원하기 때문에 치명적일 수 있다. 이러한 부전으로 인해 시력이 왜곡되고, 궁극적으로 실명에 이를 수도 있다.The macula, an important part of the retina, is located in the center of the retina, is responsible for the recognition of fine visual parts and colors, and is important for many daily activities such as face recognition and reading. In the course of the disease, the macula can be adversely affected, such as retinitis pigmentosa (RP), age-related macular degeneration and Best's disease. Quite often, RPE loses function or even fails when these diseases become more severe. This could be fatal because RPEC supports photoreceptor function critical for retinal regeneration and vision. This impairment can distort vision and ultimately lead to blindness.

한편, 최초의 인간 배아줄기세포주가 확립된 이후부터, 인간 배아줄기세포 및 역분화줄기세포는 매우 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있으며, 상기 분화된 세포들이 각종 장기에서 발생하는 질환들을 치료할 수 있는 인간 세포 치료법에 적용될 수 있을 것으로 제안되어 왔다. 이에 따라, 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cells, hPSCs)의 분화를 통해 광수용체세포 또는 망막색소상피세포를 수득하기 위한 노력이 있었지만, 이들 세포를 각각 분화시키는 방법만 개발되어 왔을 뿐, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포 및 이의 제조방법에 대해서는 알려진 바가 없다.On the other hand, since the first human embryonic stem cell line was established, human embryonic stem cells and dedifferentiated stem cells have the ability to differentiate into very diverse types of cells, and the differentiated cells are a disease occurring in various organs. It has been proposed to be applicable to human cell therapy that can treat Accordingly, although efforts have been made to obtain photoreceptor cells or retinal pigment epithelial cells through differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs), only methods for differentiating these cells have been developed. There is nothing known about retinal cells exhibiting the characteristics of receptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time, and a manufacturing method thereof.

이에, 본 발명자들은 인간 전분화능 줄기세포로부터 망막상피세포로의 분화 과정 중 일정 기간 동안 ROCK 억제제를 처리하는 경우, 하나의 세포에서 광수용체세포와 망막상피세포의 특성이 동시에 발현되는 신규한 망막세포의 형태가 수득됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have proposed a novel retinal cell in which the characteristics of a photoreceptor cell and a retinal epithelial cell are simultaneously expressed in one cell when the ROCK inhibitor is treated for a certain period of time during the differentiation process from human pluripotent stem cells to retinal epithelial cells. The present invention was completed by confirming that the form of

망막변성의 치료와 관련하여, 국내 공개특허 제10-2017-0049775호는 중간엽 줄기세포에 miR-410 억제제를 처리하여 망막색소상피로 분화시키는 방법 및 이로부터 분화된 망막색소상피를 망막질환 세포 치료제로 사용하는 것을 개시하고 있으나, 하나의 세포에서 광수용체세포와 망막상피세포의 특성이 동시에 발현되는 세포 형태에 대해서는 언급된 바가 없다.In relation to the treatment of retinal degeneration, Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2017-0049775 discloses a method for differentiating mesenchymal stem cells into retinal pigment epithelium by treatment with a miR-410 inhibitor, and the retinal pigment epithelium differentiated therefrom into retinal disease cells. Although disclosed for use as a therapeutic agent, there is no mention of a cell type in which the characteristics of a photoreceptor cell and a retinal epithelial cell are simultaneously expressed in a single cell.

따라서, 본 발명의 목적은 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a retinal cell that simultaneously exhibits the characteristics of a photoreceptor cell and a retinal pigment epithelial cell.

본 발명의 다른 목적은 전술한 특성을 갖는 망막세포를 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cell therapeutic agent for preventing or treating retinal diseases, including retinal cells having the above-described properties.

본 발명의 또 다른 목적은 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing retinal cells that simultaneously exhibit the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 전분화능 줄기세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로 분화시키기 위한 분화용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a differentiation composition for differentiating human pluripotent stem cells into retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 포함하는 세포 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a cell composition comprising retinal cells that are differentiated from human pluripotent stem cells, and simultaneously exhibit the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 인간 전분화능 줄기세포는 배아 또는 체세포 유래일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the human pluripotent stem cells may be derived from embryonic or somatic cells.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 망막세포는 CHX10 및 MITF를 동시에 발현할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the retinal cells may simultaneously express CHX10 and MITF.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 망막세포는 ROCK 억제제 처리에 의해 수득될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the retinal cells may be obtained by treatment with a ROCK inhibitor.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 인간 전분화능 줄기세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로의 분화 기간에 있어서 적어도 12일 동안 처리할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the ROCK inhibitor can be treated for at least 12 days in the differentiation period from human pluripotent stem cells to retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time. .

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, ROCK 억제제는 5 μM/일 내지 15 μM/일로 처리할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the ROCK inhibitor can be treated at 5 μM/day to 15 μM/day.

본 발명은 또한, 전술한 세포 조성물을 포함하는, 망막질환 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.The present invention also provides a cell therapeutic agent for preventing or treating retinal diseases, comprising the cell composition described above.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 막망질환은 망막미형성, 망막변성(retinal degeneration), 노인성황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨병성 망막질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma) 및 시신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the retinal disease is retinal dysplasia, retinal degeneration, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, retinitis. pigmentosa), congenital retinal atrophy, Leber congenital amaurosis, retinal detachment, glaucoma, and optic neuropathy.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포 치료제는 주사제로 투여될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the cell therapeutic agent may be administered by injection.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포 치료제는 망막 하에 투여될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the cell therapeutic agent may be administered under the retina.

본 발명은 또한, (a) ROCK 억제제를 처리하여, 인간 전분화능 줄기세포를 망막색소상피세포로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 수득하는 단계;를 포함하는, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법을 제공한다.The present invention also comprises the steps of (a) treating a ROCK inhibitor to differentiate human pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells; and (b) obtaining retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells from step (a) at the same time; A manufacturing method is provided.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계는 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 배지에 인간 전분화능 줄기세포를 배양하여 망막상피세포로 분화시키는 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the step (a) may be to differentiate into retinal epithelial cells by culturing human pluripotent stem cells in DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) medium. .

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 배지는 N2, B27 및 비필수 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the medium may contain one or more selected from the group consisting of N2, B27 and non-essential amino acids.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 배지는 니코틴아미드, BMP 신호전달 억제제, Wnt 신호전달 억제제, IGF1R 작용제, FGF 신호전달 작용제, 액티빈, SU5402 및 CHIR 99021로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 보충될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the medium is 1 selected from the group consisting of nicotinamide, BMP signaling inhibitor, Wnt signaling inhibitor, IGF1R agonist, FGF signaling agonist, activin, SU5402 and CHIR 99021 It can be supplemented with more than one species.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계는 인간 전분화능 줄기세포를 12일 내지 16일 동안 배양하여 망막색소상피세포로 분화시키는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, step (a) may be culturing human pluripotent stem cells for 12 to 16 days to differentiate them into retinal pigment epithelial cells.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계에서 ROCK 억제제는 적어도 12일 동안 처리될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the ROCK inhibitor in step (a) may be treated for at least 12 days.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계 전에, (a-1) 상기 (a) 단계에서 분화된 망막색소상피세포를 농축 및 팽창시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, before step (b), (a-1) may further include the step of concentrating and expanding the retinal pigment epithelial cells differentiated in step (a).

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a-1) 단계에서 ROCK 억제제는 0일 내지 48일 동안 처리될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the ROCK inhibitor in step (a-1) may be treated for 0 to 48 days.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a-1) 단계는 X-VIVO 10 및 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지에 분화된 망막색소상피세포를 배양하여 농축 및 팽창시키는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the step (a-1) is differentiated in a medium selected from the group consisting of X-VIVO 10 and DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12). It may be concentrated and expanded by culturing retinal pigment epithelial cells.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 5 μM/일 내지 15 μM/일로 처리될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the ROCK inhibitor may be treated at 5 μM/day to 15 μM/day.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포는 CHX10 및 MITF를 동시에 발현하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the retinal cells exhibiting the characteristics of the photoreceptor cells and the retinal pigment epithelial cells at the same time may be those that simultaneously express CHX10 and MITF.

본 발명은 또한, ROCK 억제제를 포함하는, 인간 전분화능 줄기세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로 분화시키기 위한 분화용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for differentiating from human pluripotent stem cells, including a ROCK inhibitor, into retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time.

본 발명에 따른 망막세포는 하나의 세포에서 광수용체세포의 마커인 MITF와 망막색소상피세포의 마커인 CHX10이 동시에 발현되어 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 신규 망막세포의 형태로, 이를 세포 치료제로 사용 시 광수용체세포 또는 망막상피세포를 단독으로 사용하는 것보다 훨씬 더 효과적으로 망막질환을 치료할 수 있다. 또한, 기존에 공지된 인간 전분화능 줄기세포로부터 망막색소상피세포로의 분화방법에 일정 기간 동안 일정 농도로 ROCK 억제제를 처리하는 간단한 방식으로 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 수득이 가능하여, 인간 전분화능 줄기세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포로 각각 분화시키는 기존의 방법에 비해 경제성이 우수하다.The retinal cells according to the present invention simultaneously express MITF, a marker of a photoreceptor cell, and CHX10, a marker of a retinal pigment epithelial cell, in one cell, thereby simultaneously exhibiting the characteristics of a photoreceptor cell and a retinal pigment epithelial cell in the form of a novel retinal cell. , when it is used as a cell therapy, it can treat retinal diseases much more effectively than when photoreceptor cells or retinal epithelial cells are used alone. In addition, in the conventional method for differentiation from human pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells, a simple method of treating a ROCK inhibitor at a certain concentration for a certain period of time is a simple method for simultaneously exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells. It is possible to obtain , so it is more economical than conventional methods for differentiating human pluripotent stem cells into photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells, respectively.

도 1은 인간 전분화능 줄기세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로의 분화 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 2는 도 1의 분화 프로토콜에서 RPEC로의 분화 14일 동안 ROCK 억제제를 처리한 후 수득된 RPEC에서 RPEC 마커인 PAX6와 MIFT의 발현 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 도 1의 분화 프로토콜에서 RPEC로의 분화 및 성숙과정 (농축 및 팽창) 50일 동안 ROCK 억제제인 파수딜을 처리한 후 수득된 망막세포에서 광수용체세포 마커인 CHX10과 RPEC 마커인 MIFT의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 PDE6B 결손 망막변성 실험동물 랫드의 망막 하에 망막세포 현탁액을 주입하는 방법을 나타낸 것이다.
도 5는 PDE6B 결손 망막변성 실험동물 랫드로 투여하기 전 촬영한 망막세포 사진이다.
도 6의 a) 내지 g)는 PDE6B 결손 망막변성 실험동물 랫드의 망막 하에 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포 현탁액을 투여한 후, 시간 경과에 따른 망막세포의 증식 양상을 안저촬영으로 확인한 것이고 h)는 빛간섭단층촬영으로 확인한 것이다.
도 7의 a) 내지 d)는 다른 PDE6B 결손 망막변성 실험동물 랫드의 망막 하에 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포 현탁액을 투여한 후, 시간 경과에 따른 망막세포의 증식 양상을 안저촬영으로 확인한 것이고, e)는 빛간섭단층촬영으로 확인한 것이고.
도 8은 PDE6B 결손 망막변성 실험동물 랫드의 망막 하에 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포 현탁액을 투여한 후, 2주 째에 안구의 H&E 염색 조직 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 PDE6B 결손 망막변성 실험동물 랫드의 망막 하에 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포 현탁액을 투여한 후, 8주 째에 안구의 H&E 염색 조직 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 PDE6B 결손 망막변성 실험동물 랫드의 망막 하에 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포 현탁액을 투여한 후, 23주 째에 전기생리학적검사를 수행한 결과를 나타낸 것으로, 상단은 정상군의 ERG 소견을 나타낸 것이고, 하단은 망막세포 현탁액이 투여된 실험군과 투여되지 않은 대조군 사이의 추세포 (cone cell) 및 간세포 (rod cell)의 진폭 차이를 비교한 것이다.
도 11은 망막세포 현탁액을 투여한 PDE6B 결손 망막변성 실험동물 랫드의 안구 조직 절편에서 망막세포가 증식하는 부위의 망막세포가 인간 기원의 세포인지를 확인하기 위해 미토콘드리아 DNA PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 망막세포 현탁액을 투여한 PDE6B 결손 망막변성 실험동물 랫드의 안구 조직 절편에서 망막세포가 증식하는 부위의 망막세포가 인간 기원의 세포인지를 확인하기 위해 인간 유래 세포에 반응하는 MITF 조직 염색을 수행한 결과를 나타낸 것으로, a)는 전체 안구 단면의 염색 사진이고, 사각형으로 표시된 부분은 확대 부위의 위치를 나타낸다. b)의 왼쪽 상단은 확대 부위의 H&E 조직 염색 사진이고, 왼쪽 하단은 확대 부위를 DAPI 염색한 사진이며, 오른쪽 하단은 망막 하 색소를 가진 이식세포의 MITF 염색 사진이고, 오른쪽 상단은 DAPI와 MITF 염색 결과를 병합한 사진이다.1 shows a differentiation protocol from human pluripotent stem cells into retinal cells that simultaneously exhibit the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells.
FIG. 2 shows the results of confirming the expression and survival rates of RPEC markers PAX6 and MIFT in RPECs obtained after treatment with a ROCK inhibitor for 14 days of differentiation into RPECs in the differentiation protocol of FIG. 1 .
3 shows the expression of CHX10, a photoreceptor cell marker, and MIFT, a marker of RPEC, in retinal cells obtained after treatment with fasudil, a ROCK inhibitor, for 50 days in the differentiation protocol of FIG. shows the results of checking .
4 shows a method for injecting a retinal cell suspension under the retina of a PDE6B-defective retinal degeneration experimental animal rat.
5 is a photograph of retinal cells taken before administration to PDE6B-defective retinal degeneration rats.
6 a) to 6 g) show the proliferation pattern of retinal cells over time after administration of a retinal cell suspension that simultaneously exhibits the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells under the retina of a PDE6B-deficient retinal degeneration experimental animal rat. It was confirmed by fundus imaging, and h) was confirmed by optical coherence tomography.
7 a) to 7 d) are after administration of a retinal cell suspension showing the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells under the retina of another PDE6B-deficient retinal degeneration experimental animal rat, and the proliferation pattern of retinal cells over time is confirmed by fundus imaging, and e) is confirmed by optical coherence tomography.
FIG. 8 shows the results of H&E staining of the eyeball at 2 weeks after administration of a retinal cell suspension exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells under the retina of a PDE6B-deficient retinal degeneration experimental animal rat.
9 shows the H&E staining histological examination results of the eyes at 8 weeks after administration of a retinal cell suspension exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells under the retina of a PDE6B-deficient retinal degeneration experimental animal rat.
Figure 10 shows the results of electrophysiological examination at 23 weeks after administration of a retinal cell suspension exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells under the retina of a PDE6B-deficient retinal degeneration experimental animal rat at the same time; The upper part shows the ERG findings of the normal group, and the lower part compares the difference in amplitude of cone cells and rod cells between the experimental group to which the retinal cell suspension was administered and the control group not administered.
11 shows the results of mitochondrial DNA PCR to confirm whether the retinal cells in the region where the retinal cells proliferate in the eye tissue section of the PDE6B-deficient retinal degeneration experimental animal rat administered with the retinal cell suspension are of human origin. .
12 is MITF tissue staining in response to human-derived cells to confirm whether the retinal cells in the region where the retinal cells proliferate in the eye tissue section of the PDE6B-defective retinal degeneration experimental animal rat administered with the retinal cell suspension are of human origin. The results are shown, and a) is a staining photograph of the entire eyeball cross-section, and the area marked with a rectangle indicates the location of the enlarged area. The upper left of b) is a photograph of H&E tissue staining of the enlarged area, the lower left is a photograph of DAPI staining of the enlarged area, the lower right is a photograph of MITF staining of transplanted cells with subretinal pigment, and the upper right is DAPI and MITF staining. The result is a merged photo.

상술한 바와 같이, 망막질환의 치료를 위해 주로 사용되는 광수용체세포 및 망막색소상피세포는 인간 배아줄기세포로부터 각각 단독으로 분화되어 세포 치료제로 활용되고 있으나, 보다 효과적인 치료를 위해 이들 두 가지 세포의 특성을 모두 나타내는 망막세포의 필요성이 대두되고 있다. 이에, 본 발명자들은 인간 배아줄기세포로부터 망막상피세포로의 분화 과정 중 일정 기간 동안 ROCK 억제제를 처리하는 경우, 하나의 세포에서 광수용체세포와 망막상피세포의 특성이 동시에 발현되는 신규한 망막세포의 형태가 수득됨을 확인함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에 따른 망막세포는 하나의 세포에서 광수용체세포의 마커인 MITF와 망막색소상피세포의 마커인 CHX10이 동시에 발현되어 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 신규 망막세포의 형태로, 이를 세포 치료제로 사용 시 광수용체세포 또는 망막상피세포를 단독으로 사용하는 것보다 훨씬 더 효과적으로 망막질환을 치료할 수 있다. 또한, 기존에 공지된 인간 전분화능 줄기세포로부터 망막색소상피세포로의 분화방법에 일정 기간 동안 일정 농도로 ROCK 억제제를 처리하는 간단한 방식으로 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 수득이 가능하여, 인간 전분화능 줄기세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포로 각각 분화시키는 기존의 방법에 비해 경제성이 우수하다.As described above, photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells, which are mainly used for the treatment of retinal diseases, are independently differentiated from human embryonic stem cells and used as cell therapeutics. The need for retinal cells exhibiting all characteristics is emerging. Accordingly, the present inventors have disclosed that when ROCK inhibitor is treated for a certain period during the differentiation process from human embryonic stem cells to retinal epithelial cells, a novel retinal cell in which the characteristics of photoreceptor cells and retinal epithelial cells are simultaneously expressed in one cell. A solution to the above-described problem was sought by confirming that the form was obtained. The retinal cells according to the present invention simultaneously express MITF, a marker of a photoreceptor cell, and CHX10, a marker of a retinal pigment epithelial cell, in one cell, thereby simultaneously exhibiting the characteristics of a photoreceptor cell and a retinal pigment epithelial cell in the form of a novel retinal cell. , when it is used as a cell therapy, it can treat retinal diseases much more effectively than when photoreceptor cells or retinal epithelial cells are used alone. In addition, in the conventional method for differentiation from human pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells, a simple method of treating a ROCK inhibitor at a certain concentration for a certain period of time is a simple method for simultaneously exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells. It is possible to obtain , so it is more economical than conventional methods for differentiating human pluripotent stem cells into photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells, respectively.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 포함하는 세포 조성물을 제공한다.The present invention provides a cell composition comprising retinal cells that are differentiated from human pluripotent stem cells and exhibit the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time.

본 발명의 세포 조성물에 있어서, 용어 "인간 전분화능 줄기세포"란 내배엽, 중배엽, 및 외배엽의 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (Pluripotency)을 가지는 세포, 또는 인간의 몸을 구성하는 근육, 뼈, 뇌, 피부, 심장 등의 서로 다른 조직 또는 기능에 있어 밀접하게 관련된 세포로 분화할 수 있는 다분화능(Multipotency)을 가지는 세포를 의미한다. 바람직하게 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포는 인간 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPS cell)일 수 있고, 상기 유도만능줄기세포는 섬유아세포 (Fibroblast), 각질형성세포 (Keratinocyte), 간세포 (Hepatocyte), 멜라닌세포 (Melanocyte), 양막세포 (Amniotic cells), 제대혈세포 (Cord blood cells), 지방유래줄기세포 (Adipose derived stem cells), 또는 혈액 (예를 들어, 말초혈액) 또는 소변으로부터 수득된 체세포 유래일 수 있다.In the cell composition of the present invention, the term "human pluripotent stem cells" refers to cells having pluripotency capable of differentiating into cells of endoderm, mesoderm, and ectoderm, or muscle, bone, It refers to a cell having multipotency capable of differentiating into cells closely related to different tissues or functions, such as the brain, skin, and heart. Preferably, the human pluripotent stem cells of the present invention may be human embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the induced pluripotent stem cells are fibroblasts and keratinocytes. ), hepatocytes, melanocytes, amniotic cells, cord blood cells, adipose derived stem cells, or blood (eg, peripheral blood) or It may be derived from somatic cells obtained from urine.

본 발명에서 용어 "인간 유도만능줄기세포"란 인간의 체세포에 역분화 유전자를 삽입하여 배아줄기세포와 유사한 분화능을 가진 미분화 상태의 줄기세포를 확립하는 방식으로 만들어진 것으로, 분화능력이 배아줄기세포와 비슷한 수준인 줄기세포를 의미한다. 또한, 상기 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포는 공지의 방법에 의해 당업자에 의해 용이하게 구축될 수 있다.In the present invention, the term "human induced pluripotent stem cell" refers to a method of establishing undifferentiated stem cells with differentiation ability similar to embryonic stem cells by inserting dedifferentiation genes into human somatic cells, and the differentiation ability is different from that of embryonic stem cells. It means stem cells at a similar level. In addition, the human embryonic stem cells or human induced pluripotent stem cells can be easily constructed by those skilled in the art by a known method.

본 발명에서 용어 "분화"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 각각의 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위해 형태나 기능이 변하는 것을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서는 인간 전분화능 줄세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 모두 나타내는 망막세포로의 분화를 의미한다.In the present invention, the term "differentiation" refers to a phenomenon in which each structure or function is specialized while cells divide and proliferate, that is, a cell, tissue, etc. of an organism changes its form or function to perform a given task. do. Specifically, in the present invention, it refers to the differentiation of human pluripotent stem cells into retinal cells exhibiting both the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells.

본 발명에서 용어 “광수용체세포 (photoreceptor cell)”란 각막과 렌즈를 통해서 들어온 빛 에너지를 세포 내 시각색소를 이용해 전기에너지로 변환시켜 뇌로 전달케하는, 형태와 색채를 인지하게 하는 시각의 가장 중요한 세포를 의미한다. 광수용체세포층에는 밝은 빛을 수용하는 원추체 세포와 약한 빛을 수용하는 간상체 세포가 있다. 원추체 세포는 망막의 중앙부인 황반 부근에 많이 분포하여, 형태와 색채를 인지하는 역할을 하는 반면, 간상체 세포는 망막의 주변부에 주로 분포하며, 형태와 명암을 인지하는 역할을 한다. 본 발명의 세포 조성물에 있어서, 상기 광수용체세포의 특성은 광수용체세포의 마커인 CHX10(VSX2)의 발현 여부로 확인될 수 있다.In the present invention, the term “photoreceptor cell” refers to the most important aspect of vision that allows light energy entering through the cornea and lens to be converted into electrical energy using visual pigments in the cells and delivered to the brain, allowing shape and color recognition. means cells. In the photoreceptor cell layer, there are cone cells that receive bright light and rod cells that receive weak light. Cone cells are widely distributed near the macula, which is the central part of the retina, and play a role in recognizing shape and color, whereas rod cells are mainly distributed in the periphery of the retina and play a role in recognizing shape and contrast. In the cell composition of the present invention, the characteristics of the photoreceptor cells can be confirmed by the expression of CHX10 (VSX2), a marker of the photoreceptor cells.

본 발명에서 용어 본 발명의 용어 "망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE)"란, 외부 혈관 망막 베리어의 일부분을 형성하는 단층의 색소세포들은 의미한다. 이들 세포들은 망막의 기능을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것을 특징으로 하며, 광에너지를 흡수, 시각 사이클의 유지를 위한 광수용체와 상호작용, 광수용체와 맥락모세혈관층의 결합구조를 유지하는 다양한 성장인자들을 분비하고, 이온, 물, 대사 산물을 서브레티날 공간으로부터 혈액으로 이송하는 역할, 광수용체의 외절 (outer segment)의 식세포 작용을 수행할 수 있다고 알려져 있다. 본 발명의 세포 조성물에 있어서, 상기 망막색소상피세포의 특성은 망막색소상피세포의 마커인 PAX6 및 MITF의 발현 여부로 확인될 수 있고, 보다 바람직하게는 MITF의 발현 증가 여부로 확인될 수 있다. As used herein, the term "retinal pigment epithelium (RPE)" as used herein refers to monolayer pigment cells that form a part of the external blood vessel retinal barrier. These cells are characterized in that they play an important role in maintaining the function of the retina. It is known that it can secrete various growth factors, transport ions, water, and metabolites from the subretinal space to the blood, and perform phagocytosis of the outer segment of photoreceptors. In the cell composition of the present invention, the characteristics of the retinal pigment epithelial cells can be confirmed by whether or not the expression of PAX6 and MITF, which are markers of the retinal pigment epithelial cells, more preferably, whether the expression of MITF is increased.

본 발명의 세포 조성물에 있어서, 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된 망막세포는 망막색소상피세포의 마커인 CHX10이 동시에 발현되어 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 신규한 망막세포의 형태로, 종래의 인간 전분화능 줄기세포로부터 망막색소상피세포로의 분화 프로토콜에 ROCK (Rho-associated kinase) 억제제를 처리함으로써 수득될 수 있다.In the cell composition of the present invention, retinal cells differentiated from human pluripotent stem cells simultaneously express CHX10, a marker of retinal pigment epithelial cells, and simultaneously exhibit the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells. As a result, it can be obtained by treating a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor in the conventional differentiation protocol from human pluripotent stem cells to retinal pigment epithelial cells.

본 발명의 세포 조성물에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 파수딜 (Fasudil), Y-27632, HA-1077, Y-39983 및 Wf-536로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종일 수 있다.In the cell composition of the present invention, the ROCK inhibitor may be any one selected from the group consisting of Fasudil, Y-27632, HA-1077, Y-39983 and Wf-536.

본 발명의 세포 조성물에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 인간 전분화능 줄기세포에 적어도 12일 동안 처리할 수 있다. 바람직하게 ROCK 억제제는 종래에 공지된 인간 전분화능 줄기세포로부터 망막색소상피세포로의 전체 분화 프로토콜에서 12일 내지 60일 동안 처리할 수 있으며, 보다 바람직하게는 14일 내지 50일 동안 5 μM/일 내지 15 μM/일의 농도로 처리할 수 있다.In the cell composition of the present invention, the ROCK inhibitor can be treated with human pluripotent stem cells for at least 12 days. Preferably, the ROCK inhibitor can be treated for 12 to 60 days in a conventionally known total differentiation protocol from human pluripotent stem cells to retinal pigment epithelial cells, and more preferably 5 μM/day for 14 to 50 days. to 15 μM/day.

만일 상기 ROCK 억제제가 12일 미만으로 처리되는 경우 종양이 발생하는 문제가 있을 수 있고, 60일을 초과하여 처리되는 경우 광수용체의 발현이 감소하는 문제가 발생할 수 있다. 또한, 상기 ROCK 억제제가 하루에 상기 농도 범위 미만으로 처리되는 경우 분화세포가 자연사멸 (apoptosis)하는 문제가 발생할 수 있고, 상기 농도 범위를 초과하여 처리되는 경우 또한 세포가 약물 중독에 의해 사멸 (death)하는 문제가 발생할 수 있다.If the ROCK inhibitor is treated for less than 12 days, there may be a problem that tumors occur, and if it is treated for more than 60 days, there may be a problem in that photoreceptor expression is reduced. In addition, when the ROCK inhibitor is treated below the concentration range per day, a problem of spontaneous death (apoptosis) of differentiated cells may occur. ) may cause problems.

본 발명은 또한, 전술한 세포 조성물을 포함하는, 망막질환 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.The present invention also provides a cell therapeutic agent for preventing or treating retinal diseases, comprising the cell composition described above.

본 발명에서 용어 "세포 치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.In the present invention, the term "cellular therapeutic agent" refers to cells and tissues prepared through separation, culture, and special manipulation from an individual, and is a drug (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention. Or a drug used for treatment, diagnosis, and prevention purposes through a series of actions, such as proliferating and selecting living autologous, allogeneic or xenogeneic cells in vitro or changing the biological characteristics of cells in other ways to restore tissue function means

본 발명의 세포 치료제에 있어서, 상기 망막질환은 광수용체세포 및 망막색소상피세포의 약화로 발생하는 모든 망막질환을 포함하며, 예를 들어, 망막미형성, 망막변성(retinal degeneration), 노인성황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨병성 망막질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma) 및 시신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.In the cell therapeutic agent of the present invention, the retinal disease includes all retinal diseases caused by weakening of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells, for example, retinal dysplasia, retinal degeneration, age-related macular degeneration. (age-related macular degeneration), diabetic retinopathy, retinitis pigmentosa, congenital retinal atrophy, Leber congenital amaurosis, retinal detachment, glaucoma and optic neuropathy It may be one or more diseases selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

본 발명의 세포 치료제는 체외에서 인간 전분화능 줄기세포로부터 광수용체세포 및 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로의 분화를 유도하여, 이를 상기 질환을 갖는 환자에게 투여하기 위한 것으로서, 당업계에 일반적인 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과수술적으로 망막부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 망막부위로 이동하거나 또는 망막 하에 주입될 수 있다. 바람직하게는 주사제의 형태로 망막 하에 투여될 수 있다.The cell therapeutic agent of the present invention is for inducing differentiation from human pluripotent stem cells into retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time in vitro, and administering them to a patient having the above disease. It may be prepared in the form of a general formulation, for example, an injection, and may be surgically implanted directly into the retinal site, or may be administered intravenously and then transferred to the retinal area or injected under the retina. Preferably, it may be administered under the retina in the form of an injection.

본 발명의 세포 치료제는 하나의 망막세포에서 광수용체세포의 특성 및 망막색소상피세포의 특성이 모두 발현되는바, 이들 두 가지 세포 유형으로 각각 분화된 세포만을 단독으로 사용하는 것보다 망막질환을 효과적으로 치료할 수 있다.Since the cell therapeutic agent of the present invention expresses both the properties of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells in one retinal cell, it can effectively treat retinal diseases than using only cells differentiated into these two cell types alone. can be treated

본 발명의 세포 치료제는 이식 시 면역 거부 반응이 일어나지 않도록 면역반응 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 세포 치료제의 투여량은 환자의 중함 정도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료기간, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으며, 이는 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. The cell therapeutic agent of the present invention may further include an immune response inhibitor to prevent immune rejection during transplantation. The dosage of the cell therapeutic agent of the present invention may vary depending on the severity of the patient, the route of administration, the administration method, the number of administration, the treatment period, the age and sex of the patient, and the severity of the disease, which depends on factors well known in the medical field. Accordingly, it can be easily determined by those skilled in the art.

본 발명은 또한, 전술한 세포 치료제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 망막질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 세포 치료제의 투여는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 마우스, 랫드 및 고양이 등의 가축을 포함할 수 있다.The present invention also provides a method for treating a retinal disease comprising administering the above-described cell therapeutic to a subject. Administration of the cell therapeutic agent of the present invention is applicable to any animal, and the animal may include not only humans and primates, but also domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs, mice, rats and cats.

본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 세포 치료제를 도입하는 것을 의미하며, 분화된 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 세포 치료제의 투여 경로는 눈에 도달할 수 있는 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 바람직하게는 망막 하에 투여될 수 있다.In the present invention, the term "administration" means introducing the cell therapeutic agent of the present invention to an individual by any suitable method, and includes transplantation of differentiated cells. The administration route of the cell therapeutic agent of the present invention may be administered through various routes that can reach the eye, and preferably may be administered under the retina.

본 발명의 세포 치료제는 생리학적으로 양립가능한 담체에 현탁될 수 있다. 본 발명에서 용어 "생리학적으로 양립가능한 담체(physiologically compatible carrier)"는 제형의 다른 성분들과 양립가능하며, 이의 수용자에게 유해하지 않은 담체를 가리킨다. 당해 기술분야의 숙련가는 생리학적으로 양립가능한 담체에 대해 잘 알고 있다. 적합한 담체의 예에는 세포 배양배지(예컨대, 이글의 최소필수배지), 인산완충식염수, 행크 의 균형잡힌 염 용액 +/-글루코오스(Hank's balanced salt solution: HBSS), 및 다중 전해질 용액, 예컨대 Plasma-Lyte™ A (Baxter)가 포함된다.The cell therapeutic agent of the present invention may be suspended in a physiologically compatible carrier. As used herein, the term "physiologically compatible carrier" refers to a carrier that is compatible with the other ingredients of the formulation and is not harmful to the recipient thereof. Those skilled in the art are familiar with physiologically compatible carriers. Examples of suitable carriers include cell culture medium (eg, Eagle's minimal medium), phosphate buffered saline, Hank's balanced salt solution +/-glucose (HBSS), and polyelectrolyte solutions such as Plasma-Lyte. ™ A (Baxter).

본 발명의 세포 치료제는 광수용체세포 및 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 치료학적 유효량으로 포함한다. 본 발명에서 용어 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 특정 장애의 치료에 효과를 발휘하기 위해 즉, 망막질환과 관련된 증상의 양 및/또는 중증도의 감소를 위해 필요한 세포의 개수를 말한다. 치료학적 유효량은 망막질환의 유형 및 범위에 따라 다양하고, 또한 개체의 전체적인 상태에 따라 달라질 수 있다.The cell therapeutic agent of the present invention includes a photoreceptor cell and retinal cells exhibiting the characteristics of retinal pigment epithelial cells in a therapeutically effective amount. As used herein, the term "therapeutically effective amount" refers to the number of cells required to exert an effect in the treatment of a specific disorder, that is, to reduce the amount and/or severity of symptoms associated with retinal disease. The therapeutically effective amount may vary depending on the type and extent of the retinal disease, and may also vary depending on the overall condition of the individual.

본 발명은 또한, (a) ROCK 억제제를 처리하여, 인간 전분화능 줄기세포를 망막색소상피세포로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 수득하는 단계;를 포함하는, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법을 제공한다.The present invention also comprises the steps of (a) treating a ROCK inhibitor to differentiate human pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells; and (b) obtaining retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells from step (a) at the same time; A manufacturing method is provided.

본 발명의 제조방법은 종래에 공지된, 인간 전분화능 줄기세포로부터 망막색소상피세포로의 분화 프로토콜을 기반으로 하되, 전체 분화 프로토콜에서 12일 내지 60일 동안 ROCK 억제제를 처리하는 것을 포함한다.The preparation method of the present invention is based on a conventionally known differentiation protocol from human pluripotent stem cells to retinal pigment epithelial cells, but includes treatment with a ROCK inhibitor for 12 to 60 days in the total differentiation protocol.

본 발명의 제조방법에 있어서, (a) 단계는 인간 전분화능 줄기세포를 망막색소상피세포로 분화시키는 단계로, 상기 (a) 단계의 배지는 인간 전분화능 줄기세포를 망막색소상피세포로 분화시키기 위해 사용되는 것으로 공지된 모든 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 배지를 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.In the production method of the present invention, step (a) is a step of differentiating human pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells, and the medium of step (a) is used to differentiate human pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells. Any medium known to be used for this purpose can be used without limitation. For example, DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) medium may be used, but is not limited thereto.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 인간 전분화능 줄기세포로부터 망막색소상피세포로 분화시키기 위해 배지에 첨가되는 것으로 공지된 모든 물질을 제한 없이 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 (a) 단계의 배지는 N2, B27 및 비필수 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 포함할 수 있으며, 추가로 니코틴아미드, BMP 신호전달 억제제, Wnt 신호전달 억제제, IGF1R 작용제, FGF 신호전달 작용제, 액티빈, SU5402 및 CHIR 99021로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 보충될 수 있다.In the production method of the present invention, the medium of step (a) may include, without limitation, all substances known to be added to the medium for differentiation from human pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells. For example, the medium of step (a) may include one or more selected from the group consisting of N2, B27 and non-essential amino acids, and further, nicotinamide, BMP signaling inhibitor, Wnt signaling inhibitor, IGF1R One or more selected from the group consisting of agonists, FGF signaling agonists, activin, SU5402 and CHIR 99021 may be supplemented.

본 발명에서 용어 본 발명에서 용어, “BMP (bone morphogenetic protein: 골형성단백질) 신호전달 억제제”란 BMP 신호전달을 억제하는 물질군을 의미한다. BMP들은 TGF-β (transforming growth factor-β) 슈퍼 패밀리에 속하는 신호전달계 단백질로서 초기 태생기 분화, 태생기 조직형성 및 성인 조직의 항상성 유지 등을 조절한다. 특히, 초기 태생기에서 BMP의 농도 차이는 배아의 등배 형성과정에서 축 형성에 결정적 작용을 한다. 또한, BMP의 활성화 억제는 태생기의 척추동물과 무척추동물의 신경형성에 필수적이다. 세포 외로 분비된 BMP들은 세포막의 Type I과 Type II 세린/트레오닌 키나제 (serine/threonine kinase) 수용체들에 결합하여 BMP 신호전달을 시작하게 된다. Type II 수용체는 Type I 수용체를 인산화시키고, 인산화된 Type I 수용체는 세포내의 기질인 Smad 단백질을 인산화시켜 세포 내의 신호전달이 이루어진다. 수용체에 의해 조절되는 Smad 단백질을 R-Smad (Receptor regulated Smad)라고 하며, Smad-1, 2, 3, 5 및 8 들이 R-Smad에 속한다. 이들은 세포 내의 파트너인 Co-Smad (Common partner Smad)인 Smad-4와 결합하여 세포핵 내로 이동하여 전사인자와 결합하여 목표 유전자들의 전사를 조절한다 (Yamamoto & Oelgeschlager, Naturwissenschaften, 2004; 91: 519-34). BMP 신호전달 억제제는 세포 외에 존재하는 BMP와 세포표면의 수용체와의 결합을 막는 물질들을 말한다. BMP 신호전달 억제제로는 노긴 (Noggin), 코르딘 (Chordin), 트위스트 낭배형성 인자 (Twisted gastrulation, Tsg), 서버러스 (Cerberus), 코코 (Coco), 그렘린 (Gremlin), PRDC (Protein related to DAN and Cerberus), DAN (differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma), 단테 (dante), 폴리스타틴 (follistatin), USAG-1 (uterine sensitization-associated gene 1), 도조모르핀 (dorsomorphin) 또는 스클레로스틴 (Sclerostin) 등이 있다. 이 중 노긴은 BMP 신호전달의 활성을 억제하여 신경조직을 유도하고 배쪽의 신경 외배엽이나 중배엽을 등쪽화시킨다. 노긴은 BMP 그룹 중 BMP-2, BMP-4, BMP-7과 결합하여, 상기 BMP가 그들의 수용체에 결합하는 것을 방해한다 (Yanagita, Cytokine Growth Factor Rev., 2005; 16: 309-17).As used herein, the term “bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitor” refers to a group of substances that inhibit BMP signaling. BMPs are signaling proteins belonging to the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and regulate early embryonic differentiation, embryonic tissue formation, and maintenance of adult tissue homeostasis. In particular, the difference in the concentration of BMP in the early embryonic period has a decisive effect on the formation of the axis during the embryo's dorsal embryonic formation process. In addition, inhibition of BMP activation is essential for neurogenesis in juvenile vertebrates and invertebrates. Extracellularly secreted BMPs bind to Type I and Type II serine/threonine kinase receptors on the cell membrane and initiate BMP signaling. The Type II receptor phosphorylates the Type I receptor, and the phosphorylated Type I receptor phosphorylates the Smad protein, which is an intracellular substrate, to achieve intracellular signal transduction. The Smad protein regulated by the receptor is called R-Smad (Receptor regulated Smad), and Smad-1, 2, 3, 5 and 8 belong to R-Smad. They bind to the intracellular partner Co-Smad (Common partner Smad), Smad-4, move into the nucleus and bind with transcription factors to regulate the transcription of target genes (Yamamoto & Oelgeschlager, Naturwissenschaften, 2004; 91: 519-34). ). BMP signaling inhibitors are substances that block the binding of extracellular BMPs to receptors on the cell surface. BMP signaling inhibitors include Noggin, Chordin, Twisted gastrulation, Tsg, Cerberus, Coco, Gremlin, PRDC (Protein related to DAN and PRDC). Cerberus), DAN (differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma), Dante, follistatin, USAG-1 (uterine sensitization-associated gene 1), dozomorphin or Sclerostin ), etc. Among them, Noggin induces neural tissue by inhibiting the activity of BMP signaling, and dorsalizes the ventral neuroectoderm or mesoderm. Noggin binds to BMP-2, BMP-4, and BMP-7 of the BMP group and prevents the BMP from binding to their receptor (Yanagita, Cytokine Growth Factor Rev., 2005; 16: 309-17).

본 발명의 제조방법에 있어서, BMP 신호전달 억제제는 BMP 신호전달을 억제시킬 수 있는 물질은 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 노긴, 코르딘, 트위스티드 낭배형성 인자, 서버러스, 코코, 그렘린, PRDC, DAN, 단테 (dante), 폴리스타틴 (follistatin), USAG-1 (uterine sensitization-associated gene 1), 도조모르핀 (dorsomorphin) 또는 스클레로스틴을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 노긴이다.In the preparation method of the present invention, as the BMP signaling inhibitor, any substance capable of inhibiting BMP signaling may be used without limitation, but preferably Noggin, Cordin, Twisted gastrulation factor, Cerberus, Coco, Gremlin, PRDC, DAN, dante, follistatin, USAG-1 (uterine sensitization-associated gene 1), dozomorphin or sclerostin may be used, and most preferably noggin.

본 발명에서 용어 “Wnt 신호전달 억제제”란 세포 외에 존재하는 Wnt 단백질과 세포막에 존재하는 Frizzled 수용체나 보조수용체인 LRP 사이의 결합을 방지하거나 또는 세포 내에서 Wnt에 의해 매개되는 신호전달을 억제하는 물질을 의미한다 (Kawano & Kypta, J Cell Sci. 2003; 116: 2627-34). Wnt 신호전달 억제제는, Wnt 에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. Wnt 신호전달 억제제로서는 예를 들면, 보조수용체인 LRP의 억제제의 일종인 Dkk (Dickkopf) 패밀리 (Dkk-1, Dkk-2, Dkk-3 및 Dkk-4), Wise, Wnt 수용체 억제제 (sFRP: secreted Frizzled-related protein) 패밀리, Frizzled의 CRD 결합 도메인 (Frizzled-CRD domain)，WIF-1 (Wnt inhibitory factor-1), IWP-2, IWP-3, IWP-4, 서버러스, Wnt 항체, 도미넌트 네가티브 Wnt 단백, Axin의 과발현, GSK (글루코겐 합성효소 키나제)의 과발현, 도미넌트 네가티브 TCF, 도미넌트 네가티브 Dishevelled 또는 카제인 키나제 억제제 (CKI-7, D4476 등) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 Dkk-1이다.In the present invention, the term “Wnt signaling inhibitor” refers to a substance that prevents the binding between Wnt protein existing outside the cell and LRP, which is a frizzled receptor or co-receptor present in the cell membrane, or inhibits Wnt-mediated signal transduction in the cell (Kawano & Kypta, J Cell Sci. 2003; 116: 2627-34). The Wnt signaling inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit Wnt-mediated signaling. As the Wnt signaling inhibitor, for example, the Dkk (Dickkopf) family (Dkk-1, Dkk-2, Dkk-3 and Dkk-4), which is a type of inhibitor of the co-receptor LRP, Wise, a Wnt receptor inhibitor (sFRP: secreted Frizzled-related protein) family, Frizzled-CRD domain, WIF-1 (Wnt inhibitory factor-1), IWP-2, IWP-3, IWP-4, Cerberus, Wnt antibody, dominant negative Wnt protein, Axin overexpression, GSK (glucogen synthase kinase) overexpression, dominant negative TCF, dominant negative Dishevelled, or casein kinase inhibitors (CKI-7, D4476, etc.) and the like. Preferably it is Dkk-1.

본 발명에서 용어 "IGF1R (Insulin-like growth factor 1 receptor) 작용제”란 세포막에 존재하는 타이로신 키나제 수용체의 일종인 IGF-1 수용체 (insulin-like grwoth factor-1 receptor: IGF1R)와 결합하여 IGF1R을 활성화시키고, 활성화된 IGF1R을 세포내에서 인슐린 수용체의 기질 (insulin receptor substrate: IRS)들의 결합 장소가 되도록 작용하는 물질을 의미한다. IGF1R에 의해 활성화된 IRS은 다시 PI3K, Akt, mTOR로 이루어진 경로와 Raf, MEK, ERK의 경로를 활성화시킴으로써 세포에 작용하게 된다 (Ryan & Goss, Oncologist. 2008; 13:16-24). IGF1R 작용제에는 IGF-1, IGF-2 등이 있다. IGF-1은 인슐린과 유사한 분자구조를 지니며 세포성장, 세포증식, 분화, 세포사멸 등에 관여한다.In the present invention, the term "IGF1R (Insulin-like growth factor 1 receptor) agonist" refers to IGF-1 receptor (insulin-like grwoth factor-1 receptor: IGF1R), which is a type of tyrosine kinase receptor present in the cell membrane and activates IGF1R. It refers to a substance that acts as a binding site for insulin receptor substrates (IRS) within the cell, and the activated IGF1R is activated by the pathway consisting of PI3K, Akt, mTOR and Raf. , MEK, and ERK act on cells by activating pathways (Ryan & Goss, Oncologist. 2008; 13:16-24) IGF1R agonists include IGF-1, IGF-2, etc. IGF-1 acts on insulin and It has a similar molecular structure and is involved in cell growth, cell proliferation, differentiation, and apoptosis.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 IGF1R 작용제는 IGF1R을 활성화시킬 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 IGF-1 또는 IGF-2이며, 가장 바람직하게는 IGF-1이다.In the preparation method of the present invention, the IGF1R agonist may be used without limitation as long as it is a substance capable of activating IGF1R, but is preferably IGF-1 or IGF-2, and most preferably IGF-1.

본 발명에서 용어 “FGF (fibroblast growth factor) 신호전달 작용제”란 세포증식, 세포분화 등을 비롯해 분열 촉진 인자, 혈관 생성 인자, 뼈 형성 인자 및 신경 영양 인자 등으로 작용하는 물질로서, FGF 패밀리는 지금까지 22 종류가 알려져 있다. 이들은 4 종류의 FGF 수용체들 (FGFR) 각각의 mRNA가 선택적으로 짜깁기된 다양한 (alternatively spliced) 형태의 수용체와 결합하여 FGFR을 활성화시킨다. 활성화된 FGFR은 세포질 내 Ras, Raf, Mek 등의 단계별 반응을 통해 MAP 키나제를 활성화시키고, 활성화된 MAP 키나제가 핵 내로 유입되어 목표 유전자의 전사인자로 작용하게 된다 (Bottcher & Niehrs, Endocr. Rev., 2005; 26: 63-77). FGF 패밀리 중 FGF2는, bFGF(basic FGF)라고도 불리며, 주로 FGFR 1b, FGFR 1c, FGFR 2c, FGFR 3c, FGFR 4Δ를 활성화시키며, 특히 FGFR 1c, FGFR 3c를 강력히 활성화시킨다. FGFR 1c, FGFR 3c를 활성화시키는 작용제와 FGF1, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17, FGF19 등이 대체물질로 사용될 수 있다.As used herein, the term “fibroblast growth factor (FGF) signaling agent” refers to a substance that acts as a mitogenic factor, angiogenic factor, bone-forming factor, and neurotrophic factor, including cell proliferation and differentiation, and the FGF family is now Twenty-two types are known so far. These four types of FGF receptors (FGFR) activate FGFR by binding to the receptors in which each mRNA is selectively spliced. Activated FGFR activates MAP kinase through step-by-step reactions such as Ras, Raf, and Mek in the cytoplasm, and the activated MAP kinase flows into the nucleus and acts as a transcription factor for target genes (Bottcher & Niehrs, Endocr. Rev. , 2005; 26: 63-77). Among the FGF family, FGF2, also called bFGF (basic FGF), mainly activates FGFR 1b, FGFR 1c, FGFR 2c, FGFR 3c, and FGFR 4Δ, and particularly strongly activates FGFR 1c and FGFR 3c. Agents that activate FGFR 1c and FGFR 3c and FGF1, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17, FGF19, etc. can be used as substitutes.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 FGF 신호전달 작용제는 FGF 신호전달을 활성화 시킬 수 있는 물질이라면 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 FGFR 1c 또는 FGFR 3c를 활성화시키는 물질, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17 또는 FGF19를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 FGF2이다.In the preparation method of the present invention, the FGF signaling agent may be used without limitation as long as it is a substance capable of activating FGF signaling, but preferably a substance activating FGFR 1c or FGFR 3c, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8 , FGF9, FGF17 or FGF19 may be used, most preferably FGF2.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 인간 전분화능 줄기세포를 12일 내지 16일 동안, 바람직하게는 13일 내지 15일 동안 배양하여 망막색소상피세포로 분화시키는 것일 수 있다. 이때, ROCK 억제제는 (a) 단계의 전체 배양 기간동안 처리될 수 있으며, 예를 들어, 적어도 12일, 바람직하게는 적어도 14일 동안 처리될 수 있다.In the production method of the present invention, step (a) may be to differentiate into retinal pigment epithelial cells by culturing human pluripotent stem cells for 12 to 16 days, preferably 13 to 15 days. In this case, the ROCK inhibitor may be treated during the entire culture period of step (a), for example, at least 12 days, preferably at least 14 days.

본 발명의 제조방법은 상기 (b) 단계 전에, (a-1) 상기 (a) 단계에서 분화된 망막색소상피세포를 농축 및 팽창시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.The production method of the present invention may further include, before step (b), (a-1) concentrating and expanding the retinal pigment epithelial cells differentiated in step (a).

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 (a-1) 단계에서 ROCK 억제제는 0일 내지 48일, 바람직하게는 0일 내지 38일 동안 5 μM/일 내지 15 μM/일로 처리될 수 있다.In the production method of the present invention, the ROCK inhibitor in step (a-1) may be treated at 5 μM/day to 15 μM/day for 0 to 48 days, preferably 0 to 38 days.

본 발명의 제조방법에 있어서, (a-1) 단계의 배지는 분화된 망막색소상피세포를 농축 및 팽창시키기 위해 사용되는 것으로 공지된 모든 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, X-VIVO 10 및 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.In the preparation method of the present invention, as the medium of step (a-1), any medium known to be used for concentrating and expanding the differentiated retinal pigment epithelial cells may be used without limitation. For example, it may be a medium selected from the group consisting of X-VIVO 10 and DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12), but is not limited thereto.

보다 구체적인 ROCK 억제제의 처리 기간, 농도 및 ROCK 억제제의 종류는 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.A more specific treatment period, concentration, and type of the ROCK inhibitor are the same as those described above, and thus description thereof will be omitted.

본 발명의 제조방법으로 제조되는 망막세포는 광수용체세포의 마커인 MITF와 망막색소상피세포의 마커인 CHX10이 동시에 발현되어 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내므로, 광수용체세포와 망막색소상피세포가 약화된 모든 망막질환의 치료에 유용하다.The retinal cells produced by the production method of the present invention simultaneously express MITF, a marker of photoreceptor cells, and CHX10, a marker of retinal pigment epithelial cells, thereby simultaneously exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells. It is useful in the treatment of all retinal diseases in which retinal pigment epithelial cells are weakened.

본 발명은 또한, ROCK 억제제를 포함하는, 인간 배아줄기세포로부터 광수용체와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로 분화시키기 위한 분화용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for differentiating from human embryonic stem cells, including a ROCK inhibitor, into retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptors and retinal pigment epithelial cells at the same time.

본 발명자들은 종래에 공지된, 인간 배아줄기세포로부터 망막색소상피세포로의 분화 프로토콜을 기반으로 하되, 전체 분화 프로토콜에서 12일 내지 60일 동안, 하루에 5 내지 15 μM로 처리하는 경우 하나의 세포에서 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성이 동시에 나타나는 것을 확인하였는바, ROCK 억제제는 광수용체세포와 망막색소상피세포가 손상된 망막질환을 보다 효과적으로 치료할 수 있는 신규한 망막세포 조성물을 제공하기 위한 분화용 조성물로서 활용될 수 있다.The present inventors are based on the previously known differentiation protocol from human embryonic stem cells to retinal pigment epithelial cells, but in the total differentiation protocol for 12 to 60 days, when treated with 5 to 15 μM per day, one cell It was confirmed that the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells were simultaneously displayed in It can be used as a composition for

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

유도만능줄기세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로의 분화Differentiation from induced pluripotent stem cells into retinal cells that simultaneously exhibit the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells

분화 프로토콜Differentiation protocol

다능성 인간 만능유도줄기세포(hiPSC)로부터 광수용체세포 및 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로의 분화를 위한 프로토콜은 Buchholz et al., 2013 (PLoS One. 2017 Mar 10;12(3):e0173575.)에 개시된 방법을 변형하여 사용하였으며, 구체적인 분화 프로토콜은 도 1에 나타내었다.A protocol for the differentiation of pluripotent human pluripotent induced stem cells (hiPSCs) into retinal cells simultaneously exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells is described in Buchholz et al., 2013 ( PLoS One. 2017 Mar 10;12(3). ):e0173575.) was modified and used, and the specific differentiation protocol is shown in FIG. 1 .

분화를 위해, 1일 차에 배지를 교체하여, 2일 동안 니코틴아미드 (10mM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 노긴 (50ng/ml) (PeproTech), Dkk-1 (10ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN.) 및 IGF-1 (10ng/ml) (R&D Systems)로 보충된 기초신경유도배지 (DMEM/F12+ 1X N2+ 1X B27 + 1X 비필수 아미노산, Thermo Fisher Scientific)에서 1X Matrigel (Corning) 또는 Synthemax (3535XX1 Corning, Corning NY) 또는 비트로넥틴 (PeproTech)으로 코팅된 9.6cm2 웰 상에 iPSC를 70-80%의 컨플루언스로 도말하였다.For differentiation, nicotinamide (10 mM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Noggin (50 ng/ml) (PeproTech), Dkk-1 (10 ng/ml) for 2 days with medium change on day 1 ) (R&D Systems, Minneapolis, MN.) and IGF-1 (10 ng/ml) (R&D Systems) supplemented 1X in basal neural induction medium (DMEM/F12+ 1X N2+ 1X B27 + 1X non-essential amino acids, Thermo Fisher Scientific) iPSCs were plated to a confluence of 70-80% on 9.6 cm 2 wells coated with Matrigel (Corning) or Synthemax (3535XX1 Corning, Corning NY) or Vitronectin (PeproTech).

3일차 및 4일차에 노긴의 농도를 10 ng/ml으로 감소시키고 bFGF를 5ng/ml (R&D Systems) 로 첨가하였다. 5일차에 니코틴아미드, bFGF 및 노긴을 배지로부터 제거하고, 5일차 및 6일차에 기초배지 (basal medium)를 Dkk-1 (10ng/ml), IGF1 (10ng/ml) 및 액티빈 A (100ng/ml) (PeproTech)로 보충하였다. 이어서 DKK 및 IGF1을 제거하고 7일차부터 14일차까지 기초배지에 액티빈 A (100ng/ml), 및 SU5402 (10μm) (Sigma-Aldrich)을 보충하였다. CHIR 99021(3μM) (TOCRIS, Bristol, UK.)를 8일차부터 14일차까지 첨가하였고, 모든 배지 보충물을 iPSC-유래 RPEC의 팽창을 위해 제거하였다.On days 3 and 4, the concentration of Noggin was reduced to 10 ng/ml and bFGF was added at 5 ng/ml (R&D Systems). On day 5, nicotinamide, bFGF and noggin were removed from the medium, and on days 5 and 6, the basal medium was mixed with Dkk-1 (10 ng/ml), IGF1 (10 ng/ml) and activin A (100 ng/ml). ml) (PeproTech). Then, DKK and IGF1 were removed, and the basal medium was supplemented with activin A (100 ng/ml), and SU5402 (10 μm) (Sigma-Aldrich) from day 7 to day 14. CHIR 99021 (3 μM) (TOCRIS, Bristol, UK.) was added from day 8 to day 14, and all media supplements were removed for expansion of iPSC-derived RPECs.

14일차에 세포를 Accumax (A7089, Sigma-Aldrich)를 이용하여 1X Matrigel, Synthemax 또는 비트로넥틴으로 코팅된 디쉬 상의 XVIVO-10 (04-743Q, Lonza, Basel, Swizerland)에 1x105/cm2의 밀도로 7일 동안 계대배양하였고, 각각 1일 후 (day +1) 및 5일 후 (day +5)에 배지를 교체하였다. 이들 세포는 계대 0 (Passage 0, P0)으로 지칭하였다. 7일 후, P0 세포를 XVIVO 10 배지에 35일 동안 배양하였고 주당 2회 배지를 교체하였다. 세포를 Accumax로 분리하고 1x105 세포/cm2로 계대배양하였다. P1 부터 P5까지, RPEC를 각 계대마다 30일 동안 배양하였다.On day 14, cells were transferred to XVIVO-10 (04-743Q, Lonza, Basel, Swizerland) on dishes coated with 1X Matrigel, Synthemax or Vitronectin using Accumax (A7089, Sigma-Aldrich) at a density of 1x10 5 /cm 2 was subcultured for 7 days, and the medium was replaced after 1 day (day +1) and 5 days later (day +5), respectively. These cells were designated as Passage 0 (PO). After 7 days, PO cells were cultured in XVIVO 10 medium for 35 days and the medium was changed twice per week. Cells were separated with Accumax and subcultured at 1x10 5 cells/cm 2 . From P1 to P5, RPECs were cultured for 30 days at each passage.

ROCK 억제제인 파수딜은 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 전체 분화 프로토콜 과정에서 하루에 10μM씩 처리되었다.As shown in FIG. 1 , the ROCK inhibitor fasudil was treated at 10 μM per day during the entire differentiation protocol.

ROCK 억제제 처리에 따른 세포 특성의 분석Analysis of cell characteristics according to ROCK inhibitor treatment

2-1. RPEC 분화 14일 동안 ROCK 억제제 처리에 따른 세포 특성 분석2-1. Cell Characterization Following ROCK Inhibitor Treatment for 14 Days of RPEC Differentiation

상기 실시예 1의 분화 프로토콜에서 RPEC로의 분화 14일 동안 ROCK 억제제를 처리하여 수득된 RPEC의 특성을 유세포분석법 및 면역세포화학법으로 분석하였다.In the differentiation protocol of Example 1, the characteristics of RPECs obtained by treatment with a ROCK inhibitor for 14 days of differentiation into RPECs were analyzed by flow cytometry and immunocytochemistry.

분화 14일째의 RPEC 를 Trypsin/EDTA 를 이용하여 떼어낸 후 10% 포르말린(Formalin)을 이용해 세포를 고정하였다. 그 후 0.1% Triton X-100을 처리해 투과(permeabilization)시킨 후 MITF 및 PAX6의 1차 및 2차 항체를 처리하고 FACS canto2 기계를 이용하여 유세포분석을 수행하였다.The RPECs on the 14th day of differentiation were removed using Trypsin/EDTA, and then the cells were fixed using 10% formalin. Thereafter, 0.1% Triton X-100 was treated and permeabilized, treated with primary and secondary antibodies of MITF and PAX6, and flow cytometry was performed using a FACS canto2 machine.

면연세포화학법은 14일 동안 분화시킨 RPEC 를 배양 접시에 붙은 상태로 10% 포르말린을 처리하여 고정한 다음 0.1% Triton X-100을 처리해 투과 (permeabilization)시킨 후 MITF 및 PAX6 의 1차 및 2차 항체를 처리하고 형광현미경을 이용해 분석하였다.In the immunocytochemistry method, RPECs differentiated for 14 days were fixed on a culture dish by treatment with 10% formalin, and then treated with 0.1% Triton X-100 for permeabilization, and then primary and secondary antibodies of MITF and PAX6. was processed and analyzed using a fluorescence microscope.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 PAX6 발현은 유의한 차이가 없었으나, MITF의 경우 ROCK 억제제를 처리했을 때 유의적으로 높은 값을 나타냈다. MITF는 RPEC 분화의 중요한 마커로 STAT3에 의해 억제되는데, ROCK2가 이러한 STAT3를 활성화시키는 역할을 하므로, ROCK 억제제를 처리하게 되면 STAT3가 억제되고 MITF 발현은 증가하여 RPEC로의 분화가 더 잘 이루어지는 것으로 판단된다. 생존율 또한 ROCK 억제제를 처리하였을 때 유의적으로 증가된다는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 2 , there was no significant difference in PAX6 expression, but in the case of MITF, a significantly high value was shown when the ROCK inhibitor was treated. MITF is inhibited by STAT3 as an important marker of RPEC differentiation. Since ROCK2 plays a role in activating this STAT3, treatment with a ROCK inhibitor inhibits STAT3 and increases MITF expression, suggesting better differentiation into RPEC. . It was confirmed that the survival rate was also significantly increased when the ROCK inhibitor was treated.

2-2. RPEC 분화 및 성숙 50일 동안 ROCK 억제제 처리에 따른 세포 특성 분석2-2. Cell characterization following ROCK inhibitor treatment for 50 days of RPEC differentiation and maturation

상기 실시예 1의 분화 프로토콜에서 RPEC 분화 및 성숙과정 (농축 및 팽창) 50일 동안 ROCK 억제제 처리 후 수득된 망막세포의 특성을 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 분석하였다.In the differentiation protocol of Example 1, the characteristics of retinal cells obtained after ROCK inhibitor treatment for 50 days of RPEC differentiation and maturation (concentration and expansion) were analyzed in the same manner as in Example 2-1.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 광수용체세포의 마커인 CHX10과 RPEC 마커인 MITF가 동시에 발현되어, 하나의 세포에서 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성이 동시에 나타나는 망막세포가 유도되었음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 3 , it was confirmed that the photoreceptor cell marker CHX10 and the RPEC marker MITF were simultaneously expressed, and retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells were induced at the same time in one cell. .

그러나, RPEC의 성숙, 즉 농축 및 팽창이 진행될수록 CHX10과 MITF를 동시에 발현하는 세포가 줄어들기 때문에, 두 가지 세포의 특성을 모두 나타내는 망막세포를 수득하기 위해서는 분화 후 성숙 초기 단계까지 배양하는 것이 바람직하다.However, as the maturation of RPEC, i.e., concentration and expansion proceeds, the cells expressing both CHX10 and MITF decrease. do.

Pde6b 넉아웃 랫드 모델에서의 망막세포 증식 양상 확인Confirmation of retinal cell proliferation in Pde6b knockout rat model

3-1. PDE6B 넉아웃 랫드 모델의 준비3-1. Preparation of the PDE6B knockout rat model

국내공개특허 제10-2019-0132069호에 개시된 바와 같이 제조된 PDE6B 유전자가 넉아웃된 망막변성 랫드 모델을 준비하였으며, 구체적인 제조과정은 상기 공개특허공보에 기재된 실시예 1 내지 2의 내용을 참조한다.A retinal degeneration rat model in which the PDE6B gene is knocked out was prepared as disclosed in Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2019-0132069, and for the specific manufacturing process, refer to the contents of Examples 1 and 2 described in the above publication. .

3-2. 망막세포의 투여 전 관찰3-2. Observation before administration of retinal cells

망막하 투여 전 광학현미경을 통한 iPSC 유도 망막세포의 세포 성상을 관찰한 결과, 도 5에서 확인되는 바와 같이 짙은 색소를 함유한 세포와 색소 함유 정도가 적은 세포들이 혼재한 양상을 보이며 단층의 증식 소견을 보였다.As a result of observing the cellular properties of iPSC-induced retinal cells through an optical microscope before subretinal administration, as shown in FIG. 5 , cells containing a dark pigment and cells with a low pigment content were mixed, and monolayer proliferation was observed. showed

3-3. 망막세포의 투여3-3. Administration of retinal cells

2주령의 PDE6B KO 랫드를 틸레타민 하이포클로라이드(tiletamine hypochloride)와 졸라제팜 하이드로클로라이드(zolazepam hyprochloride) (Zoletil;virbac, Carros, France)의 혼합물 0.6 ml/kg 및 자일라진 하이드로클로라이드(xylazine hydrochloride) (Rompun; Bayer Korea, seoul, Korea) 0.4 ml/kg을 이용하여 마취 후, 상기 실시예 1로부터 제조된 망막세포 현탁액 7.4x105/μl 농도를 33 가우지 해밀턴 시린지(gauge Hamilton syringe)를 이용하여 우측 안구 망막 하에 망막 하에 5 μl 투여하였다.2-week-old PDE6B KO rats were treated with 0.6 ml/kg of a mixture of tiletamine hypochloride and zolazepam hydrochloride (Zoletil; virbac, Carros, France) and xylazine hydrochloride ( Rompun; Bayer Korea, seoul, Korea) After anesthesia using 0.4 ml/kg, 7.4x10 5 /μl concentration of the retinal cell suspension prepared in Example 1 was added to the right using a 33 Gauge Hamilton syringe. 5 μl administered under the retina under the ocular retina.

이후 시간 경과에 따른 망막세포의 증식 양상을 확인하기 위해 안저 촬영 (Fundus photograph), 빛간섭단층촬영 (OCT: Optical coherence tomography) 및 안구 조직을 이용한 H&E 조직 염색 절편을 획득하여 평가를 시행하였다.Then, to confirm the proliferation of retinal cells over time, fundus photograph, optical coherence tomography (OCT), and H&E tissue stained sections using eye tissue were obtained and evaluated.

3-4. 안저촬영3-4. fundus photography

망막세포 현탁액 투여 후, 각 시점에서 안저 촬영을 시행하였다. 구체적으로, PDE6B KO 랫드의 안구를 정막 마취제로 마취하고, 5mg/ml 트로피카마이드(Tropicamide) 및 5mg/ml 페닐레프린 HCl(Phenylephrine HCl)을 점안하여 동공의 산동을 유도하였다. 안저 촬영 중 각막의 건조를 방지하기 위해 안과용 인공누액연고를 사용하였다. 망막 촬영은 수술용 현미경 혹은 Micron IV 안저 카메라를 사용하였다(Phoenix Research Labs, Inc., Pleasanton, CA, USA).After administration of the retinal cell suspension, fundus imaging was performed at each time point. Specifically, the eyes of PDE6B KO rats were anesthetized with a seminal anesthetic, and 5 mg/ml Tropicamide and 5 mg/ml Phenylephrine HCl were instilled to induce mydriasis of the pupil. An ophthalmic artificial tear ointment was used to prevent corneal drying during fundus photography. Retinal imaging was performed using a surgical microscope or Micron IV fundus camera (Phoenix Research Labs, Inc., Pleasanton, CA, USA).

도 6의 a) 내지 g) 및 도 7의 a) 내지 d)에 나타난 바와 같이, 망막 하에 투여한 망막세포 현탁액이 안착 및 증식하면서, 안저 검사를 통해 색소를 가진 세포의 존재를 확인할 수 있었다. 또한, 시간 경과에 따라 투여되었던 세포군의 경계가 주변과 명확해지고, 일정 시간 이후에는 색소의 강도가 감소되는 양상을 보였다.As shown in a) to g) of FIG. 6 and a) to d) of FIG. 7, while the retinal cell suspension administered under the retina settled and proliferated, the presence of pigmented cells could be confirmed through the fundus examination. In addition, with the lapse of time, the boundary of the administered cell group became clear from the surrounding area, and the intensity of the pigment decreased after a certain period of time.

3-5. 빛간섭단층 촬영3-5. optical coherence tomography

망막세포 현탁액 투여 후, 각 시점에서 스펙트럼 빛 간섭 단층 촬영(Spectral-domain optical coherence tomography, SD-OCT)을 통해 망막의 단층 소견을 확인하였다. 구체적으로, 망막세포의 망막 하 투여 후, 23주 또는 29주째에 빛 간섭 단층 촬영(Eyemera OCT, IIScience, Busan, South Korea)을 수행하였다. 6 번 반복하여 망막 단층을 스캔하고, 그 값을 평균화하여 영상을 획득하였다. 획득된 영상은 태그된 이미지 파일(.tif) 형식으로 출력하여, 망막의 두께 및 망막색소상피 (retinal pigment epithelium), 망막의 외핵층 (outer nuclear layer), 외망상층 (outer plexiform layer), 내핵층 (inner nuclear layer) 및 내망막층 (inner plexiform layer) 등의 양상을 비교하였다.After administration of the retinal cell suspension, at each time point, the retinal tomography findings were confirmed through spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT). Specifically, light coherence tomography (Eyemera OCT, IIScience, Busan, South Korea) was performed at 23 or 29 weeks after subretinal administration of retinal cells. The retinal monolayer was scanned repeatedly 6 times, and the values were averaged to obtain an image. The acquired image is output in a tagged image file (.tif) format, and the thickness of the retina and the retinal pigment epithelium, the outer nuclear layer of the retina, the outer plexiform layer, the inner nucleus Aspects of the inner nuclear layer and inner plexiform layer were compared.

그 결과, 도 6의 h) 및 도 7의 e)에 나타난 바와 같이 망막하 이식 세포의 증식 부위에서는 망막하 고반사점의 소견을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 6h) and FIG. 7e), it was confirmed that the subretinal hyperreflex point was observed at the proliferation site of the subretinal transplanted cells.

3-6. H&E 염색 조직 검사3-6. H&E stained biopsy

망막세포 이식 후 시간 경과에 따른 망막조직의 변화 소견을 확인하기 위해, 실험군의 안구를 획득하여 H&E 염색을 시행하고, 이식 망막 세포의 존재, 이식 부위 망막 세포의 변화 소견을 비교하였다.In order to confirm the changes in retinal tissue over time after retinal cell transplantation, the eyes of the experimental group were obtained and H&E staining was performed, and the presence of transplanted retinal cells and changes in the retinal cells at the transplant site were compared.

구체적으로, 망막세포 이식 후 2주 및 8주 후에 랫드의 복강 내에 Zoletil® 0.01 ㎖ (틸레타민 125 ㎎/㎖ 및 졸라제팜 125 ㎎/㎖, Virbac, France)을 주사하여 마취한 다음, 안구를 적출하여 4% 파라포름알데히드 용액(pH 7.4)에서 고정하였다. 고정된 안구는 시신경을 중심으로 절개하여 파라핀에 포매한 후, 4 ㎛ 두께로 잘라 H&E 염색(hematoxylin-eosin staining)을 수행하여, 조직화학적 표본을 제작하였다. 제작된 조직 표본에서 조직 병리적인 소견을 확인하였다.Specifically, 2 and 8 weeks after retinal cell transplantation, anesthetized by injecting Zoletil® 0.01 ml (tiletamine 125 mg/ml and zolazepam 125 mg/ml, Virbac, France) into the abdominal cavity of rats, and then the eyes It was extracted and fixed in 4% paraformaldehyde solution (pH 7.4). The fixed eyeball was incised around the optic nerve, embedded in paraffin, cut to a thickness of 4 μm, and then subjected to H&E staining (hematoxylin-eosin staining) to prepare a histochemical specimen. Histopathological findings were confirmed in the prepared tissue samples.

도 8 및 9에 나타난 바와 같이, 망막세포 이식 후 2주 및 8주 후에, 망막세포를 이식한 우안(R)과 이식하지 않은 좌안(L)을 비교한 결과, 우안에서 전반적인 망막 두께 감소 정도가 적고, 망막 내핵 세포층 (inner nuclear layer)과 광수용체 (photoreceptor)가 존재하는 망막 외핵 세포층 (outer nuclear layer) 두께가 보존되는 양상을 나타냈다 (*: 망막 내핵 세포층 (inner nuclear layer), †: 망막 내핵 세포층 (inner nuclear layer)). As shown in FIGS. 8 and 9 , after 2 weeks and 8 weeks after transplantation of retinal cells, a comparison of the right eye (R) in which the retinal cells were transplanted and the left eye (L) in which the retinal cells were not transplanted were compared. The thickness of the outer nuclear layer, which contains the inner nuclear layer and photoreceptors, was preserved (*: inner nuclear layer, †: inner nuclear layer). cell layer (inner nuclear layer).

3-7. 전기생리학적 검사3-7. electrophysiological examination

상기 실시예 3-3에서 망막세포 이식 후, 이식된 망막세포의 기능적 평가를 위해 시간 경과에 따른 전기생리학적 검사 (ERG: Electroretinogram)를 시행하였다.After the retinal cell transplantation in Example 3-3, an electrophysiological test (ERG: Electroretinogram) was performed over time for functional evaluation of the transplanted retinal cells.

구체적으로, 망막세포 이식 후 23주 후, 랫드에 대해 망막전위도 검사(Electroretinogram)를 수행하여 전기생리학적 검사를 실시하였다. 망막전위도 검사 전 실험군 랫드는 각각 12 시간 이상 암순응을 유도하였고, 조도(λ) 600 nm 미만의 어두운 환경에서 망막 전위도 측정을 준비하였다. 준비 후, 각각의 실험군 랫드에 Zoletil®(틸레타민 125 mg/㎖ 및 졸라제팜 125 mg/㎖, Virbac, France)을 0.01 ㎖씩 복강 내 주사하여 마취하였다. 또한, 미드린-피점안제®(페닐레프린 하이드로클로라이드 5 ㎎/㎖ 및 트로픽아미드 5 ㎎/㎖, Santen, Japan)를 점안하여 동공을 산동시켰다. 또한, 안구 마취를 위해 Alcaine®(프로파라케인 하이드로클로라이드 0.5 %, Alcon Laboratories Inc.)을 점안하였다. 마취된 랫드는 실험동물용 지지대에 안정적으로 고정시켜, 재현성 높은 전기생리학적 검사를 위한 체위를 유지하였다. Specifically, 23 weeks after transplantation of retinal cells, an electroretinogram was performed on the rat to conduct an electrophysiological examination. Before the electroretinogram test, the rats in the experimental group were each induced to dark adaptation for more than 12 hours, and the electroretinogram measurement was prepared in a dark environment with an illuminance (λ) less than 600 nm. After preparation, the rats of each experimental group were anesthetized by intraperitoneally injecting 0.01 ml of Zoletil® (tiletamine 125 mg/ml and zolazepam 125 mg/ml, Virbac, France) intraperitoneally. In addition, the pupils were dilated by instillation of Midrine-eye drops® (phenylephrine hydrochloride 5 mg/ml and tropicamide 5 mg/ml, Santen, Japan). In addition, Alcaine® (proparacaine hydrochloride 0.5%, Alcon Laboratories Inc.) was instilled for ocular anesthesia. Anesthetized rats were stably fixed on a support for experimental animals and maintained in a position for highly reproducible electrophysiological examination.

망막전위도 검사는 간츠펠트 ERG 시스템 (Ganzfeld ERG system) (Phoenix Research Labs)을 이용하여 빛 자극 및 전기 신호 측정으로 시행하였다. 망막전위도 신호는 실험동물 쥐 우안을 활용하였으며, 백색 빛의 강도를 높여가면서 순차적으로 전기 신호를 측정하였다. 빛 노출 시간은 10 msec으로 하였고, 각 빛의 강도에서 10 회의 평균값을 이용해서 전기 신호를 기록하였다. 순금으로 제작된 각막 전극을 각막 주변에 위치하였고, 기준 전극과 접지 전극을 두피와 꼬리 피하에 위치시켰다. 또한, 망막의 간세포 (rod cell)과 추세포 (cone cell) 각각의 기능을 확인하기 위하여, 암순응, 명순응 반응 a, b 파를 확인하였다.Electroretinogram was performed by measuring light stimulation and electrical signals using the Ganzfeld ERG system (Phoenix Research Labs). The electroretinogram signal was used in the right eye of an experimental animal mouse, and electrical signals were sequentially measured while increasing the intensity of white light. The light exposure time was 10 msec, and the electrical signal was recorded using an average value of 10 times at each light intensity. A corneal electrode made of pure gold was placed around the cornea, and a reference electrode and a ground electrode were placed under the scalp and tail. In addition, in order to confirm the function of each retinal hepatocyte (rod cell) and cone cell (cone cell), dark adaptation and light adaptation response a and b waves were confirmed.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 망막 간세포 (rod cell) 반응에서 망막세포를 투여한 치료군과 투여하지 않은 대조군 간에 b파 진폭이 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 10 , it was confirmed that the b-wave amplitude showed a significant difference between the treatment group to which the retinal cells were administered and the control group to which the retinal cells were not administered in the retinal stem cell (rod cell) response.

미토콘드리아 DNA PCRMitochondrial DNA PCR

상기 실시예 3-6에서 수득된 조직 절편을 이용하여, 망막세포가 증식하는 부위를 확인하고 해당 부위의 망막세포를 획득하여 인간 기원의 세포임을 확인하기 위해 미토콘드리아 DNA PCR을 시행하였다. 망막세포 이식 후 2주 및 17주째에 각각 개체에서 인간 기원의 세포를 확인하였다.Using the tissue section obtained in Example 3-6, mitochondrial DNA PCR was performed to confirm the region where retinal cells proliferate, and to obtain retinal cells from the region to confirm that they are cells of human origin. Cells of human origin were identified in each subject at 2 weeks and 17 weeks after retinal cell transplantation.

DNA PCR 검사는 미토콘드리아 DNA (mitochondiral DNA, mtDNA) 추출은 PicoPure® DNA 추출 키트를 사용하여 시행하였고, 주입한 인간 유래 mtDNA를 확인하기 위해 프라이머와 PCR 마스터 믹스 (Master mix)를 이용해 수행했다. 샘플은 인간 iPS RPE를 주입한 안구의 색소가 관찰되는 조직 부분을 채취하여 사용하였고, 주사 후 2, 8, 17주째의 샘플로 시행했다. 양성 대조군은 인간 유래 DNA, 음성 대조군은 뉴클레아제 무첨가 수 (nuclease-free water)이다. 사용한 프라이머 서열은 다음과 같다: F-5'-GCCTTCCCCCGTAAATGATA-3' R-5'-CTTCTGTGGAACGAGGGTTT-3&#39. 최종 PCR 볼륨은 20ug로 2x PCRBIO Taq Mix Red 10ul와 정방향 및 역방향 프라이머(1uM) 각각 1ul, DNA 주형 1ul, 뉴클레아제 무첨가 수 7ul가 포함되어 있다. DNA 주형은 2주 및 8주의 샘플의 경우 500ng/ul 17주 샘플의 경우 5000ng/ul이다. 어닐링 (annealing) 온도는 56℃로 15초, 연장 (extension) 온도는 68℃로 1분, 35사이클이다. 증폭된 샘플은 2% 아가로스 겔 전기영동 (Agarose gel electrophoresis) 100V 시행 후 Geldoc XR+ 이미징 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 mtDNA 존재를 확인했다.DNA PCR test was performed using a PicoPure® DNA extraction kit for mitochondrial DNA (mtDNA) extraction, and primers and PCR master mix were used to confirm the injected human-derived mtDNA. The sample was used by collecting the tissue part where the pigment of the eye was injected with human iPS RPE, and samples were performed at 2, 8, and 17 weeks after injection. A positive control is human-derived DNA, and a negative control is nuclease-free water. The primer sequences used were: F-5'-GCCTTCCCCCGTAAATGATA-3'R-5'-CTTCTGTGGAACGAGGGTTT-3&#39. The final PCR volume is 20ug, containing 10ul of 2x PCRBIO Taq Mix Red, 1ul each of forward and reverse primers (1uM), 1ul of DNA template, and 7ul of nuclease-free water. DNA template is 500 ng/ul for samples at 2 and 8 weeks and 5000 ng/ul for 17 week samples. The annealing temperature was 56° C. for 15 seconds, and the extension temperature was 68° C. for 1 minute, 35 cycles. The amplified sample was subjected to 2% agarose gel electrophoresis at 100V and the presence of mtDNA was confirmed using Geldoc XR+ imaging system (Bio-Rad).

그 결과, 도 11에서 확인되는 바와 같이 인간 iPS RPE 세포 이식 후 각각 2주 및 17주에 적출한 안구에서 주입한 인간 세포의 성질을 갖는 mtDNA 존재 유무를 확인할 수 있는 밴드가 확인되었다. 주입 후 2주 후 샘플은 17주 후 샘플보다 적은 농도를 사용하였지만 밴드의 존재를 확인할 수 있었다. 즉, 주사 후 17주까지 주입한 인간 기원의 세포의 생착을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 11 , a band capable of confirming the presence or absence of the presence or absence of mtDNA having the properties of human cells injected from the eyes extracted 2 weeks and 17 weeks after transplantation of human iPS RPE cells, respectively, was confirmed. The sample 2 weeks after injection used a lower concentration than the sample after 17 weeks, but the presence of a band could be confirmed. That is, it was possible to confirm engraftment of the injected human-derived cells up to 17 weeks after injection.

H&E 염색 및 형광염색분석H&E staining and fluorescence staining analysis

상기 실시예 3-6에서 수득된 조직 절편을 이용하여, 망막세포가 증식하는 부위를 확인하고 해당 부위의 망막세포를 획득하여 인간 기원의 세포임을 확인하기 위해 인간 유래 세포에 반응하는 MITF 조직 염색을 수행하였다. 실험방법은 실시예 2-1과 동일하게 수행하였다.Using the tissue section obtained in Example 3-6, MITF tissue staining in response to human-derived cells was performed to confirm the region where retinal cells proliferate, and to obtain retinal cells in the region to confirm that they are cells of human origin. carried out. The experimental method was performed in the same manner as in Example 2-1.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 망막세포가 증식하는 부위에 MITF 발현이 확인되어 증식하고 있는 부위의 망막세포가 이식된 망막세포, 즉 인간 기원의 세포임을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 12 , MITF expression was confirmed in the region where retinal cells proliferate, and it was confirmed that the retinal cells in the region where the retinal cells were proliferating were transplanted retinal cells, that is, cells of human origin.

SEQUENCE LISTING <110> THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> A cell composition comprising retinal cell having characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cell simultaneously and use thereof <130> 1066546 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> #39 forward primer <400> 1 gccttccccc gtaaatgata 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> #39 reverse primer <400> 2 cttctgtgga acgagggttt 20 SEQUENCE LISTING <110> THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> A cell composition comprising retinal cell having characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cell simultaneously and use it <130> 1066546 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> <220> <223> #39 forward primer <400> 1 gccttccccc gtaaatgata 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> <220> <223> #39 reverse primer <400> 2 cttctgtgga acgagggttt 20

Claims (22)

인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 포함하는 세포 조성물.A cell composition comprising retinal cells differentiated from human pluripotent stem cells and simultaneously exhibiting characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells. 제1항에 있어서, 상기 인간 전분화능 줄기세포는 배아 또는 체세포 유래인, 세포 조성물.According to claim 1, wherein the human pluripotent stem cells are embryonic or somatic cell-derived, cell composition. 제1항에 있어서, 상기 망막세포는 CHX10 및 MITF를 동시에 발현하는, 세포 조성물.The cell composition of claim 1, wherein the retinal cells simultaneously express CHX10 and MITF. 제1항에 있어서, 상기 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포는 ROCK 억제제 처리에 의해 수득되는, 세포 조성물.The cell composition of claim 1, wherein the retinal cells exhibiting the characteristics of the photoreceptor cells and the retinal pigment epithelial cells at the same time are obtained by treatment with a ROCK inhibitor. 제4항에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 인간 전분화능 줄기세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로의 분화 기간에 있어서 적어도 12일 동안 처리하는, 세포 조성물.The cell composition of claim 4, wherein the ROCK inhibitor is treated for at least 12 days in the period of differentiation from human pluripotent stem cells to retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time. 제5항에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 5 μM/일 내지 15 μM/일로 처리하는, 세포 조성물.The cell composition of claim 5, wherein the ROCK inhibitor is treated at 5 μM/day to 15 μM/day. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포 조성물을 포함하는, 망막질환 예방 또는 치료용 세포 치료제.A cell therapeutic agent for preventing or treating retinal diseases, comprising the cell composition of any one of claims 1 to 6. 제7항에 있어서, 상기 막망질환은 망막미형성, 망막변성(retinal degeneration), 노인성황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨병성 망막질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma) 및 시신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인, 망막질환 예방 또는 치료용 세포 치료제.According to claim 7, wherein the retinal disease is retinal dysplasia, retinal degeneration, age-related macular degeneration, diabetic retinal disease (diabetic retinopathy), retinal pigmentosa (retinitis pigmentosa), congenital Retinal atrophy, Leber congenital amaurosis, retinal detachment, glaucoma (glaucoma) and at least one disease selected from the group consisting of optic neuropathy, retinal disease prevention or treatment cell therapeutic. 제7항에 있어서, 상기 세포 치료제는 주사제로 투여되는, 망막질환 예방 또는 치료용 세포 치료제.According to claim 7, wherein the cell therapeutic agent is administered as an injection, retinal disease prevention or treatment cell therapy. 제7항에 있어서, 상기 세포 치료제는 망막 하에 투여되는, 망막질환 예방 또는 치료용 세포 치료제.The cell therapeutic agent for preventing or treating retinal diseases according to claim 7, wherein the cell therapeutic agent is administered under the retina. (a) ROCK 억제제를 처리하여, 인간 전분화능 줄기세포를 망막색소상피세포로 분화시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포를 수득하는 단계;를 포함하는, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.(a) treating the ROCK inhibitor to differentiate human pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells; and
(b) obtaining retinal cells exhibiting the properties of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells simultaneously from step (a); Way. 제11항에 있어서, 상기 (a) 단계는 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 배지에 인간 전분화능 줄기세포를 배양하는 것인, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.According to claim 11, wherein the step (a) is DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12) medium to culture the human pluripotent stem cells, photoreceptor cells and characteristics of retinal pigment epithelial cells A method for producing retinal cells simultaneously showing. 제12항에 있어서, 상기 배지는 N2, B27 및 비필수 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 포함하는, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.The method according to claim 12, wherein the medium contains at least one selected from the group consisting of N2, B27 and non-essential amino acids, which simultaneously exhibits characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells. 제12항에 있어서, 상기 배지는 니코틴아미드, BMP 신호전달 억제제, Wnt 신호전달 억제제, IGF1R 작용제, FGF 신호전달 작용제, 액티빈, SU5402 및 CHIR 99021로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 보충되는, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.13. The method of claim 12, wherein the medium is supplemented with one or more selected from the group consisting of nicotinamide, BMP signaling inhibitor, Wnt signaling inhibitor, IGF1R agonist, FGF signaling agonist, activin, SU5402 and CHIR 99021. A method for producing retinal cells that simultaneously exhibits the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells. 제11항에 있어서, 상기 (a) 단계는 인간 전분화능 줄기세포를 12일 내지 16일 동안 배양하여 망막색소상피세포로 분화시키는 것인, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.According to claim 11, wherein step (a) is to differentiate into retinal pigment epithelial cells by culturing human pluripotent stem cells for 12 to 16 days, retina showing the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time A method for producing cells. 제11항에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 적어도 12일 동안 처리되는, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.According to claim 11, wherein the ROCK inhibitor is treated for at least 12 days, the method for producing retinal cells simultaneously exhibiting the properties of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells. 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계 전에, (a-1) 상기 (a) 단계에서 분화된 망막색소상피세포를 농축 및 팽창시키는 단계를 추가로 포함하는, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.12. The method of claim 11, before the step (b), (a-1) further comprising the step of concentrating and expanding the retinal pigment epithelial cells differentiated in the step (a), photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells A method for producing retinal cells simultaneously exhibiting the characteristics of 제17항에 있어서, 상기 (a-1) 단계에서 ROCK 억제제가 0일 내지 48일 동안 처리되는, 광수용체와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.The method according to claim 17, wherein the ROCK inhibitor is treated for 0 to 48 days in step (a-1), and the method for producing retinal cells simultaneously exhibiting characteristics of photoreceptors and retinal pigment epithelial cells. 제17항에 있어서, 상기 (a-1) 단계는 X-VIVO 10 및 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지에 분화된 망막색소상피세포를 배양하여 농축 및 팽창시키는 것인, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.The method according to claim 17, wherein in step (a-1), the differentiated retinal pigment epithelial cells are cultured in a medium selected from the group consisting of X-VIVO 10 and DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12). A method for producing retinal cells that simultaneously exhibits the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells by concentrating and expanding the cells. 제11항 또는 제18항에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 5 μM/일 내지 15 μM/일로 처리되는, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.The method of claim 11 or 18, wherein the ROCK inhibitor is treated at 5 μM/day to 15 μM/day, and the method for producing retinal cells simultaneously exhibiting characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells. 제11항에 있어서, 상기 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포는 CHX10 및 MITF를 동시에 발현하는 것인, 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포의 제조방법.The method according to claim 11, wherein the retinal cells exhibiting the characteristics of the photoreceptor cells and the retinal pigment epithelial cells simultaneously express CHX10 and MITF simultaneously. Way. ROCK 억제제를 포함하는, 인간 전분화능 줄기세포로부터 광수용체세포와 망막색소상피세포의 특성을 동시에 나타내는 망막세포로 분화시키기 위한 분화용 조성물.A composition for differentiating from human pluripotent stem cells, comprising a ROCK inhibitor, into retinal cells exhibiting the characteristics of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells at the same time.
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