KR20210096792A - Micro-fluidic device for preparing alginate beads encapsulating cells and method for preparing alginate beads encapsulating cells using the same - Google Patents

Micro-fluidic device for preparing alginate beads encapsulating cells and method for preparing alginate beads encapsulating cells using the same Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a microfluidic device for preparing alginate beads including cells encapsulated therein. The microfluidic device according to the present invention includes: a substrate; a first inlet for injecting a bead-forming agent; a first channel through which the bead-forming agent is transported; a second inlet for injecting cells and alginate; a second channel through which the cells and alginate are transported; a bead-forming portion which is a space for forming alginate beads including the cells encapsulated therein by the ejected materials; a third channel through which the alginate beads including the cells encapsulated therein are transported; and a bead outlet through which the alginate beads including the cells encapsulated therein are discharged. The microfluidic device for preparing alginate beads including cells encapsulated therein according to the present invention has a channel section having a cylindrical structure, not a quadrangular structure of the conventional PDMS microfluidic chip, and thus facilitates formation of beads, minimizes the frictional force generated during the flow of a fluid, realizes stable flow of a fluid, allows mass production of alginate beads including cells encapsulated therein with a uniform size through the hydrophilic treatment of a plastic material, and enables stable discharge of the beads after production.

Description

세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 및 이를 이용한 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법{MICRO-FLUIDIC DEVICE FOR PREPARING ALGINATE BEADS ENCAPSULATING CELLS AND METHOD FOR PREPARING ALGINATE BEADS ENCAPSULATING CELLS USING THE SAME}Microfluidic device for manufacturing alginate beads encapsulated in cells and a method for manufacturing alginate beads encapsulated in cells using the same

본 발명은 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 및 이를 이용한 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 균일한 크기로 대량으로 생산하며 생산된 비드가 안정적으로 배출될 수 있는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 및 이를 이용한 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a microfluidic device for manufacturing alginate beads encapsulated in cells and a method for manufacturing alginate beads encapsulated in cells using the same, and more particularly, to alginate beads encapsulated in cells in a uniform size and mass-produced It relates to a microfluidic device for producing alginate beads encapsulated in cells from which beads can be stably discharged, and to a method for producing alginate beads encapsulated in cells using the same.

알지네이트 하이드로젤은 갈조류에 많이 함유되어 있는 다당류 고분자 전해질로서 알지네이트를 지지체 기반으로 하고, 칼슘 이온(Ca2+)과 같은 다가 이온을 투입하면 정전기적 인력으로 젤이 형성되는 물질이다. 인체에 무해한 천연물 소재이기 때문에 치과에서 사용되는 지지체나 아이스크림, 시럽 등 점조한 식품의 안정제로 사용되기도 한다.Alginate hydrogel is a polysaccharide polymer electrolyte contained in brown algae, which is based on alginate as a support, and is a material that forms a gel by electrostatic attraction when polyvalent ions such as calcium ions (Ca 2+ ) are added. Because it is a natural material that is harmless to the human body, it is also used as a stabilizer for viscous foods such as dental supports, ice cream, and syrup.

이와 같은 성질을 이용하여 의료용 약물을 전달하는 목적의 약품을 알지네이트와 섞는 제조방법이 사용되고 있으며, 최근에는 알지네이트와 세포를 섞은 물질을 이용하여 치료용 세포를 인체 내부에 전달하는 목적으로 사용하려는 시장의 니즈가 있다.Using these properties, a manufacturing method of mixing alginate and a drug for the purpose of delivering medical drugs is being used, and recently, the market for using a substance mixed with alginate and cells for the purpose of delivering therapeutic cells to the inside of the human body. there is a need

이와 같은 알지네이트 비드를 만드는 방법은 주사기 및 분무 장치를 이용한 분사 방법, 초음파 믹싱 방법 및 에멀젼 형성 방법 등이 있지만 최근에는 미세유체칩을 이용하여 크기가 일정한 비드를 만드는 방법이 대두되고 있다. 기존의 미세유체칩을 이용한 방법은 반도체 공정을 이용해서 마이크로 몰드를 만들고 PDMS (polydimethylsiloxane) 소재로 성형하여 알지네이트 비드를 제조하는 것을 특징으로 한다. Methods for making such alginate beads include a spraying method using a syringe and a spraying device, an ultrasonic mixing method, and an emulsion forming method. The conventional method using a microfluidic chip is characterized in that the alginate bead is manufactured by making a micro mold using a semiconductor process and molding it with a PDMS (polydimethylsiloxane) material.

그러나 이와 같은 종래의 알지네이트 비드의 제조방법은 주로 연구용 목적으로 적용이 가능하고 칩을 대량생산 할 수 없는 방법적 한계를 가지고 있다. 뿐만 아니라 PDMS 소재가 소수성을 띠어 비드를 만들기 위해 제작된 마이크로 채널이 비드, 오일 성분, 공기 방울 등에 쉽게 달라 붙고 막혀버리는 문제점이 있다.However, such a conventional method for producing alginate beads can be mainly applied for research purposes and has methodological limitations that cannot mass-produce chips. In addition, since the PDMS material is hydrophobic, there is a problem that the microchannels made to make beads easily stick to and clog the beads, oil components, and air bubbles.

이에 따라, 마이크로 채널이 막히는 문제, 마찰력에 따라 유체의 흐름이 원활하지 못한 문제점을 해결하고, 알지네이트 비드를 대량으로 생산할 수 있는 제조방법의 개발이 필요한 실정이다.Accordingly, there is a need to develop a manufacturing method capable of solving the problem of microchannel clogging and fluid flow due to frictional force, and mass production of alginate beads.

한국등록특허공보 제10-1142159호Korean Patent Publication No. 10-1142159

본 발명의 목적은 채널 단면을 종래 PDMS 미세유체칩이 가지고 있는 사각형 구조가 아니라 원통형 구조로 만들어서 비드의 형성을 용이하게 하며 유체가 흐르면서 발생하는 마찰력을 최소화하면서도 안정적인 유체 흐름을 구현하고, 플라스틱 재질의 친수성 처리를 통해 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 균일한 크기로 대량으로 생산할 수 있으며, 생산된 비드가 안정적으로 배출될 수 있는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자를 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to facilitate the formation of beads by making the channel cross-section into a cylindrical structure rather than the rectangular structure that the conventional PDMS microfluidic chip has, and to minimize frictional force generated while the fluid flows and realize a stable fluid flow, An object of the present invention is to provide a microfluidic device for producing alginate beads encapsulated in cells, in which cells encapsulated alginate beads can be mass-produced in a uniform size through hydrophilic treatment, and the produced beads can be stably discharged.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자에 비드의 원료 공급을 제어하는 마이크로 펌프를 도입하여 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 연속적으로 대량 생산할 수 있는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to introduce a micro-pump that controls the supply of raw materials of the beads to the microfluidic device for producing alginate beads encapsulated in cells, and cells are encapsulated for producing alginate beads capable of continuously mass-producing cell-encapsulated alginate beads To provide a microfluidic device system.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 또는 이를 포함하는 시스템을 이용하여 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 효율적으로 대량생산할 수 있는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법이 제공된다.Another object of the present invention is to provide a method for producing alginate beads in which cells are encapsulated, which can efficiently mass-produce cells-encapsulated alginate beads using a microfluidic device or a system comprising the same for producing alginate beads encapsulated in cells do.

본 발명의 일 측면에 따르면,According to one aspect of the present invention,

기판;Board;

상기 기판 상에 형성되고 비드형성제를 주입하기 위한 제1 주입구;a first injection hole formed on the substrate and for injecting a bead forming agent;

상기 제1 주입구와 연통되고, 기판 내부를 따라 원통형 채널로 형성되며, 상기 비드형성제가 수송되는 제1 채널;a first channel communicating with the first inlet, formed as a cylindrical channel along the inside of the substrate, and through which the bead forming agent is transported;

상기 기판 상에 형성되고 세포 및 알지네이트를 주입하기 위한 제2 주입구;a second inlet formed on the substrate and for injecting cells and alginate;

상기 제2 주입구와 연통되고, 기판 내부를 따라 원통형 채널로 형성되며, 상기 세포 및 알지네이트가 수송되는 제2 채널;a second channel communicating with the second inlet, formed as a cylindrical channel along the inside of the substrate, and through which the cells and alginate are transported;

상기 제1 채널의 말단과 제2 채널의 말단이 서로 근접하고, 상기 제1 채널의 말단에서 비드형성제가 토출되고, 상기 제2 채널의 말단에서 세포 및 알지네이트가 토출되어 토출된 물질들에 의해 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 형성하는 공간인 비드형성부;The end of the first channel and the end of the second channel are close to each other, the bead forming agent is discharged from the end of the first channel, and the cells and alginate are discharged from the end of the second channel. Bead forming part is a space for forming the encapsulated alginate beads;

상기 비드형성부와 연통되고, 상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드가 수송되는 제3 채널;a third channel communicating with the bead forming part and transporting the alginate beads encapsulated in the cells;

상기 제3 채널의 말단과 연통되고 상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드가 배출되는 비드배출구;를 포함하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자가 제공된다.There is provided a microfluidic device for producing alginate beads in which cells are encapsulated, including; a bead outlet communicating with the end of the third channel and discharging the alginate beads encapsulated in the cells.

상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자는 플라스틱 소재일 수 있다.The microfluidic device for manufacturing alginate beads in which the cells are encapsulated may be made of a plastic material.

상기 플라스틱 소재는 PC(Polycarbonate), PS(Polystyrene), PMMA(Poly(methyl methacrylate)), PET(polyethylene terephthalate), PE(polyethylene), COC(Cyclic Olefin Copolymer), 및 PDMS(Polydimethylsiloxane) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.The plastic material is any one selected from PC (Polycarbonate), PS (Polystyrene), PMMA (Poly (methyl methacrylate)), PET (polyethylene terephthalate), PE (polyethylene), COC (Cyclic Olefin Copolymer), and PDMS (Polydimethylsiloxane) can be

상기 플라스틱 소재는 친수성 표면처리된 것일 수 있다.The plastic material may be a hydrophilic surface treatment.

상기 친수성 표면처리는 도파(DOPA, 3,4-dihydroxyphenylalanine), 도파민, N-아세틸도파민, NBAD(N-p-alanyldopamine), 카테콜, 메틸-카테콜， 니트로-도파, 카테킨, 하이드록시도파민， 하이드록시피론, 하이드록시피리딘, 하이드톡시도파, 토파 (TOPA, 2,4,5- trihydroxyphenylalanine), 폴리페놀, 및 이소프로판올 중에서 선택된 어느 하나에 의해 수행된 것일 수 있다.The hydrophilic surface treatment is dopa (DOPA, 3,4-dihydroxyphenylalanine), dopamine, N-acetyl dopamine, NBAD (Np-alanyldopamine), catechol, methyl-catechol, nitro-dopa, catechin, hydroxydopamine, hydroxy It may be carried out by any one selected from pyrone, hydroxypyridine, hydroxydopa, topa (TOPA, 2,4,5-trihydroxyphenylalanine), polyphenol, and isopropanol.

상기 친수성 처리는 상기 플라스틱 소재의 표면에 아민기(-NH2)가 도입된 것일 수 있다.In the hydrophilic treatment, an amine group (-NH 2 ) may be introduced on the surface of the plastic material.

상기 친수성 표면처리는 자기조립단분자막(Self-Assembled Monolayer, SAM) 형성에 따라 수행된 것일 수 있다.The hydrophilic surface treatment may be performed according to the formation of a self-assembled monolayer (SAM).

상기 비드형성제는 계면활성제 또는 오일류일 수 있다.The bead forming agent may be a surfactant or oil.

상기 비드형성제는 올레산(oleic acid), 미네랄 오일(Mineral oil), 스테아르산(stearic acid), 폴리불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids), 소르빈산(sorbic acid), 메타크릴산 아연(Zn methacrylate), 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 아연, 및 테트라데실 포스폰산(tetradecyl phosphonic acid (TDPA)) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.The bead forming agent is oleic acid, mineral oil, stearic acid, polyunsaturated fatty acids, sorbic acid, zinc methacrylate, stearic acid It may be any one selected from magnesium, zinc stearate, and tetradecyl phosphonic acid (TDPA).

상기 원통형 채널은 직경이 100 내지 500㎛ 일 수 있다.The cylindrical channel may have a diameter of 100 to 500 μm.

상기 제1 채널은 제1 주입구로부터 2개의 채널로 분기되고, 상기 비드형성부에서 만나는 구조로 형성될 수 있다.The first channel may be formed in a structure that branches into two channels from the first injection hole and meets at the bead forming part.

상기 비드형성부에서 상기 제1 채널과 상기 제2 채널이 이루는 각(Θ)은 45 내지 90°일 수 있다.An angle Θ formed between the first channel and the second channel in the bead forming part may be 45 to 90°.

상기 제2 채널의 말단은 점차로 좁아지는 구조인 토출구가 형성될 수 있다.An outlet having a structure that is gradually narrowed may be formed at an end of the second channel.

상기 토출구의 직경은 10 내지 100㎛ 일 수 있다.The discharge hole may have a diameter of 10 to 100 μm.

상기 제1 채널과 제2 채널의 유체 속도(flow rate)를 각각 제어함으로써 제조되는 비드의 크기가 조절될 수 있다.By controlling the flow rate of the first channel and the second channel, respectively, the size of the manufactured bead can be adjusted.

상기 제1 채널의 유체 속도는 0.6 내지 1.8 ㎖/h이고, 상기 제2 채널의 유체 속도는 5.0 내지 35.0 ㎖/h 일 수 있다.The fluid velocity of the first channel may be 0.6 to 1.8 ml/h, and the fluid velocity of the second channel may be 5.0 to 35.0 ml/h.

상기 비드배출구의 직경은 상기 제3 채널의 직경의 3 내지 10배 일 수 있다.The diameter of the bead outlet may be 3 to 10 times the diameter of the third channel.

상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자는 상기 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널을 포함하는 원통형 채널에 상응하는 반원통형의 채널이 형성된 두 기판이 상판과 하판으로 서로 결합되어 원통형 채널을 형성하는 것일 수 있다.The cell-encapsulated microfluidic device for manufacturing alginate beads includes two substrates having semi-cylindrical channels corresponding to the cylindrical channels including the first channel, the second channel, and the third channel are coupled to each other by an upper plate and a lower plate to form a cylindrical channel. may be to form

상기 상판과 하판은 상기 채널들과 주입구들의 둘레에 융착 라인을 포함할 수 있다.The upper plate and the lower plate may include fusion lines around the channels and the injection holes.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,According to another aspect of the present invention,

상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자; 및a microfluidic device for manufacturing alginate beads in which the cells are encapsulated; and

상기 미세유체소자의 제1 주입구에 비드형성제의 공급을 조절하고, 제2 주입구에 세포 및 알지네이트의 공급을 조절하는 마이크로 펌프;를 포함하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템이 제공된다.A microfluidic device system for manufacturing alginate beads in which cells are encapsulated, including; a micropump for controlling the supply of the bead forming agent to the first inlet of the microfluidic device, and controlling the supply of cells and alginate to the second inlet is provided .

상기 마이크로 펌프는 비드형성제 공급부 및 세포/알지네이트 공급부를 포함하고,The micropump includes a bead forming agent supply unit and a cell/alginate supply unit,

상기 비드형성제 공급부는 비드형성제 수용부, 비드형성제 공급제어부 및 비드형성제 공급채널을 포함하고,The bead forming agent supply unit includes a bead forming agent receiving unit, a bead forming agent supply control unit and a bead forming agent supply channel,

상기 세포/알지네이트 공급부는 세포/알지네이트 수용부, 세포/알지네이트 공급제어부 및 세포/알지네이트 공급채널을 포함할 수 있다.The cell/alginate supply unit may include a cell/alginate receiving unit, a cell/alginate supply control unit, and a cell/alginate supply channel.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,According to another aspect of the present invention,

상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자를 이용한 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법이 제공된다.There is provided a method for producing alginate beads encapsulated in cells using a microfluidic device for producing alginate beads encapsulated in the cells.

상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법에서,In the method for producing alginate beads encapsulated in the cells,

상기 제2 주입구로 주입되는 세포 및 알지네이트에서 상기 세포는 배양된 세포를 포함하는 배양액의 형태로 주입되고, In the cells and alginate injected into the second inlet, the cells are injected in the form of a culture solution containing cultured cells,

상기 알지네이트는 1 내지 2%의 알지네이트 용액으로 주입될 수 있다.The alginate may be injected with 1 to 2% alginate solution.

상기 알지네이트 용액에 가교제를 추가로 투입할 수 있다.A crosslinking agent may be additionally added to the alginate solution.

상기 가교제는 염화칼슘(CaCl2) 용액일 수 있다.The crosslinking agent may be a calcium chloride (CaCl 2 ) solution.

본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자는 채널 단면을 종래 PDMS 미세유체칩이 가지고 있는 사각형 구조가 아니라 원통형 구조로 만들어서 비드의 형성을 용이하게 하며 유체가 흐르면서 발생하는 마찰력을 최소화하면서도 안정적인 유체 흐름을 구현하고, 플라스틱 재질의 친수성 처리를 통해 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 균일한 크기로 대량으로 생산할 수 있으며, 생산된 비드가 안정적으로 배출될 수 있다.The cell-encapsulated microfluidic device for manufacturing alginate beads of the present invention makes the channel cross-section in a cylindrical structure instead of the rectangular structure that the conventional PDMS microfluidic chip has, thereby facilitating the formation of beads and minimizing frictional force generated while the fluid flows and is stable By implementing fluid flow and hydrophilic treatment of plastic materials, alginate beads encapsulated in cells can be mass-produced in a uniform size, and the produced beads can be stably discharged.

또한, 본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템은 상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자에 비드의 원료 공급을 제어하는 마이크로 펌프를 도입하여 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 연속적으로 대량 생산할 수 있다.In addition, the cell-encapsulated microfluidic device system for producing alginate beads of the present invention introduces a micro-pump that controls the supply of raw materials of beads to the microfluidic device for producing alginate beads encapsulated in cells, thereby continuously producing alginate beads encapsulated in cells. can be mass-produced.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자(100)와 마이크로 펌프(200)을 포함하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템의 사시도이다.
도 2는 본 발명의 미세유체소자(100)의 평면도이다.
도 3은 본 발명의 미세유체소자(100)의 단면도이다.
도 4는 본 발명의 미세유체소자(100)의 비드형성부(44)를 중심으로 본 구조를 나타낸 평면도이다.
도 5는 본 발명의 미세유체소자(100)의 융착라인을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 미세유체소자(100)의 주입구 및 배출구에 연결할 수 있는 밸브 및 튜빙, 플라스틱 주사기를 예시한 도면이다.
도 7은 본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템에 포함되는 마이크로 펌프(200)의 계략적 구조와 측면 사진이다.
도 8은 알지네이트 비드의 제조과정 및 그에 대한 사진이다.
도 9는 실험예 1에 따른 채널의 유세속도와 알지네이트 비드 크기의 변화 그래프이다.
도 10은 실험예 2의 친수화 표면처리에 따른 접촉각(contact angle) 측정 결과이다.
도 11은 실험예 3에 따른 비드 내 캡슐화된 세포의 광학 현미경 사진이다.
도 12는 실험예 3에 따른 비드 내 캡슐화된 세포의 형광 현미경 사진이다.1 is a perspective view of a microfluidic device system for producing alginate beads in which cells are encapsulated, including a microfluidic device 100 and a micropump 200 for producing alginate beads in which cells are encapsulated according to an embodiment of the present invention.
2 is a plan view of the microfluidic device 100 of the present invention.
3 is a cross-sectional view of the microfluidic device 100 of the present invention.
4 is a plan view showing the structure of the microfluidic device 100 of the present invention, with the bead forming part 44 as the center.
5 schematically shows a fusion line of the microfluidic device 100 of the present invention.
6 is a view illustrating a valve, tubing, and a plastic syringe that can be connected to the inlet and outlet of the microfluidic device 100 of the present invention.
7 is a schematic structure and side photograph of the micropump 200 included in the microfluidic device system for manufacturing alginate beads encapsulated in cells of the present invention.
8 is a photograph of the manufacturing process of alginate beads and the same.
9 is a graph showing changes in flow rate and alginate bead size of a channel according to Experimental Example 1. FIG.
10 is a contact angle measurement result according to the hydrophilization surface treatment of Experimental Example 2.
11 is an optical micrograph of cells encapsulated in beads according to Experimental Example 3.
12 is a fluorescence micrograph of cells encapsulated in beads according to Experimental Example 3.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.Since the present invention can apply various transformations and can have various embodiments, specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the detailed description. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, and it should be understood to include all modifications, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention. In describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자(100)와 마이크로 펌프(200)을 포함하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템의 사시도이고, 도 2는 본 발명의 미세유체소자(100)의 평면도이고, 도 3은 본 발명의 미세유체소자(100)의 단면도이고, 도 4는 본 발명의 미세유체소자(100)의 비드형성부(44)를 중심으로 본 구조를 나타낸 평면도이고, 도 5는 본 발명의 미세유체소자(100)의 융착라인을 개략적으로 나타낸 것이고, 도 6은 본 발명의 미세유체소자(100)의 주입구 및 배출구에 연결할 수 있는 밸브 및 튜빙, 플라스틱 주사기를 예시한 도면이고, 도 7은 본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템에 포함되는 마이크로 펌프(200)의 계략적 구조와 측면 사진이다.1 is a perspective view of a cell-encapsulated microfluidic device system for producing alginate beads including a microfluidic device 100 and a micropump 200 for producing alginate beads encapsulated in cells according to an embodiment of the present invention, FIG. 2 is a plan view of the microfluidic device 100 of the present invention, Figure 3 is a cross-sectional view of the microfluidic device 100 of the present invention, Figure 4 is a bead forming portion 44 of the microfluidic device 100 of the present invention It is a plan view showing the structure as a center, and FIG. 5 schematically shows a fusion line of the microfluidic device 100 of the present invention, and FIG. 6 is a microfluidic device 100 of the present invention that can be connected to the inlet and outlet It is a view illustrating a valve, tubing, and a plastic syringe, and FIG. 7 is a schematic structure and side photograph of the micropump 200 included in the microfluidic device system for manufacturing alginate beads encapsulated in cells of the present invention.

이하, 도 1 내지 도 7을 참조하여 본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자(100)에 대해 설명하도록 한다.Hereinafter, the microfluidic device 100 for manufacturing alginate beads encapsulated in cells of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 to 7 .

본 발명의 본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자(100)는 기판(10)과 기판(10)에 형성된 제1 주입구(20), 제1 채널(22), 제2 주입구(30), 제2 채널(32), 비드형성부(44), 제2 채널(42) 및 비드배출구(40)를 포함하는 것을 특징으로 한다.The microfluidic device 100 for manufacturing alginate beads encapsulated in cells of the present invention includes a substrate 10 and a first injection hole 20, a first channel 22, and a second injection hole 30 formed in the substrate 10. ), a second channel 32 , a bead forming part 44 , a second channel 42 and a bead outlet 40 .

구체적으로, 제1 주입구(20)는 기판(10) 상에 형성되고 비드형성제를 주입하기 위한 것이고, 제1 채널(22)은 제1 주입구(20)와 연통되고, 기판(10) 내부를 따라 원통형 채널로 형성되며, 이를 통해 상기 비드형성제가 수송될 수 있다.Specifically, the first injection hole 20 is formed on the substrate 10 and is for injecting the bead forming agent, and the first channel 22 communicates with the first injection hole 20 , and passes through the inside of the substrate 10 . Accordingly, it is formed into a cylindrical channel, through which the bead forming agent can be transported.

제2 주입구(30)는 기판(10) 상에 형성되고 세포 및 알지네이트를 주입하기 위한 것이고, 제2 채널(32)은 제2 주입구(30)와 연통되고, 기판(10) 내부를 따라 원통형 채널로 형성되며, 상기 세포 및 알지네이트가 이를 통해 수송될 수 있다.The second inlet 30 is formed on the substrate 10 and for injecting cells and alginate, the second channel 32 communicates with the second inlet 30 , and a cylindrical channel along the inside of the substrate 10 . is formed, and the cells and alginate can be transported therethrough.

비드형성부(44)는 제1 채널(22)의 말단과 제2 채널(32)의 말단이 서로 근접하고, 제1 채널(22)의 말단에서 비드형성제가 토출되고, 제2 채널(32)의 말단에서 세포 및 알지네이트가 토출되어 토출된 물질들에 의해 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 형성하는 공간이다.In the bead forming unit 44 , the end of the first channel 22 and the end of the second channel 32 are close to each other, the bead forming agent is discharged from the end of the first channel 22 , and the second channel 32 . It is a space in which cells and alginate are discharged at the end of the to form alginate beads in which cells are encapsulated by the discharged materials.

제3 채널(42)은 비드형성부(44)와 연통되고, 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드가 이를 통해 수송될 수 있다.The third channel 42 communicates with the bead forming part 44, and alginate beads encapsulated in cells may be transported therethrough.

비드배출구(40)는 제3 채널(42)의 말단과 연통되고 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드가 이를 통해 배출된다.The bead outlet 40 communicates with the end of the third channel 42 and alginate beads encapsulated in cells are discharged therethrough.

상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자는 플라스틱 소재일 수 있다.The microfluidic device for manufacturing alginate beads in which the cells are encapsulated may be made of a plastic material.

상기 플라스틱 소재는 PC(Polycarbonate), PS(Polystyrene), PMMA(Poly(methyl methacrylate)), PET(polyethylene terephthalate), PE(polyethylene), COC(Cyclic Olefin Copolymer), 및 PDMS(Polydimethylsiloxane) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않는다.The plastic material is any one selected from PC (Polycarbonate), PS (Polystyrene), PMMA (Poly (methyl methacrylate)), PET (polyethylene terephthalate), PE (polyethylene), COC (Cyclic Olefin Copolymer), and PDMS (Polydimethylsiloxane) may be, but the scope of the present invention is not limited thereto.

상기 플라스틱 소재는 친수성 표면처리된 것을 사용하는 것이 바람직하다.As the plastic material, it is preferable to use a hydrophilic surface treatment.

친수성 표면처리를 통하여 채널이 막히거나 유체의 흐름이 원활하지 못하는 문제가 발생하지 않으며, 연속적으로 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드가 제조될 수 있도록 한다.Through the hydrophilic surface treatment, there is no problem that the channel is clogged or the fluid does not flow smoothly, and alginate beads in which cells are continuously encapsulated can be manufactured.

상기 친수성 표면처리는 도파(DOPA, 3,4-dihydroxyphenylalanine), 도파민, N-아세틸도파민, NBAD(N-p-alanyldopamine), 카테콜, 메틸-카테콜， 니트로-도파, 카테킨, 하이드록시도파민， 하이드록시피론, 하이드록시피리딘, 하이드톡시도파, 토파 (TOPA, 2,4,5- trihydroxyphenylalanine), 폴리페놀, 및 이소프로판올 중에서 선택된 어느 하나에 의해 수행될 수 있으나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않으며 친수성으로 표면처리가 가능한 다양한 물질이 코팅처리될 수 있다.The hydrophilic surface treatment is dopa (DOPA, 3,4-dihydroxyphenylalanine), dopamine, N-acetyl dopamine, NBAD (Np-alanyldopamine), catechol, methyl-catechol, nitro-dopa, catechin, hydroxydopamine, hydroxy It may be carried out by any one selected from pyrone, hydroxypyridine, hydroxydopa, TOPA, 2,4,5-trihydroxyphenylalanine, polyphenol, and isopropanol, but the scope of the present invention is not limited thereto. Various materials capable of surface treatment can be coated.

바람직하게는 상기 친수성 처리에 의해 상기 플라스틱 소재의 표면에 아민기(-NH2)가 도입될 수 있다. Preferably, an amine group (-NH 2 ) may be introduced to the surface of the plastic material by the hydrophilic treatment.

상기 친수성 표면처리는 자기조립단분자막(Self-Assembled Monolayer, SAM) 형성에 따라 수행될 수 있다.The hydrophilic surface treatment may be performed according to the formation of a self-assembled monolayer (SAM).

상기 비드형성제는 계면활성제 또는 오일류 일 수 있다.The bead forming agent may be a surfactant or oil.

구체적으로, 상기 비드형성제는 올레산(oleic acid), 미네랄 오일(Mineral oil), 스테아르산(stearic acid), 폴리불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids), 소르빈산(sorbic acid), 메타크릴산 아연(Zn methacrylate), 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 아연, 및 테트라데실 포스폰산(tetradecyl phosphonic acid (TDPA)) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 올레산 또는 미네랄 오일을 사용할 수 있다.Specifically, the bead forming agent is oleic acid, mineral oil, stearic acid, polyunsaturated fatty acids, sorbic acid, zinc methacrylate ), magnesium stearate, zinc stearate, and tetradecyl phosphonic acid (TDPA) may be any one selected from, preferably oleic acid or mineral oil.

원통형 채널인 제1 채널(22), 제2 채널(32) 및 제3 채널(42)는 채널의 직경이 100 내지 500㎛ 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 150 내지 400㎛, 더욱 더 바람직하게는 200 내지 300㎛ 일 수 있다. 원통형 채널의 직경이 100㎛ 보다 작은 경우에는 유체의 흐름이 원활하지 않아 속도의 조절이 어려울 수 있고, 500㎛ 보다 큰 경우에는 단면적을 기준으로 단위시간당 흐르는 유체의 양이 많아져 유체의 속도 조절이 어려울 수 있다. The first channel 22, the second channel 32, and the third channel 42, which are cylindrical channels, preferably have a channel diameter of 100 to 500 μm, more preferably 150 to 400 μm, even more preferably may be 200 to 300 μm. If the diameter of the cylindrical channel is less than 100㎛, the flow of the fluid is not smooth, so it may be difficult to control the speed. It can be difficult.

제1 채널(22)은 제1 주입구(20)로부터 2개의 채널로 분기되고, 상기 비드형성부(44)에서 만나는 구조로 형성되는 것이 바람직하다. 이와 같은 구조로 인하여 제2 채널(32)을 따라 수송되어 말단으로 토출되는 세포 및 알지네이트 성분이 코어(core)에 위치하게 되고 2개의 제1 채널(22)의 두 말단에서 각각 토출되는 올레산 등의 비드형성제가 코어를 감싸는 시스(sheath)를 형성하여 코어-시스형 비드의 형성이 원활하게 이루어질 수 있다.The first channel 22 is branched into two channels from the first injection hole 20 , and is preferably formed in a structure that meets at the bead forming part 44 . Due to this structure, cells and alginate components transported along the second channel 32 and discharged to the ends are located in the core, and oleic acid etc. discharged from both ends of the two first channels 22, respectively. The bead forming agent forms a sheath surrounding the core, so that the core-sheath type bead can be smoothly formed.

도 4에 도시된 바와 같이 비드형성부(44)에서 제1 채널(22)과 제2 채널(32)이 이루는 각(Θ)은 45 내지 90°일 수 있다. 45°미만의 각을 이루는 경우에는 상기 비드형성제의 토출각도와 세포 및 알지네이트 성분의 토출되는 각도가 작아 비슷한 방향으로 토출되기 때문에 비드형성제가 세포 및 알지네이트 성분을 충분히 커버할 수 없어 코어-시스형 비드의 형성이 원활하지 않을 수 있고, 90°를 초과하는 경우에는 비드형성제의 유동거리가 길어지고 세포 및 알지네이트 성분의 유동방향과 역행할 수 있어 토출이 원활히 일어날 수 없고 그에 따라 코어-시스형 비드의 형성이 적절히 이루어질 수 없다.As shown in FIG. 4 , the angle Θ formed between the first channel 22 and the second channel 32 in the bead forming unit 44 may be 45 to 90°. When the angle is less than 45°, the discharge angle of the bead forming agent and the discharge angle of the cells and alginate components are small and are discharged in a similar direction, so the bead forming agent cannot sufficiently cover the cells and the alginate component. The formation of beads may not be smooth, and if it exceeds 90°, the flow distance of the bead forming agent becomes longer and may go counter to the flow direction of cells and alginate components, so discharge cannot occur smoothly, and accordingly, the core-sheath type The formation of beads cannot be done properly.

제2 채널(32)의 말단은 점차로 좁아지는 구조인 토출구(34)가 형성된 것이 바람직하다. 즉, 제2 채널(32)의 원통형 채널의 직경보다 더 작은 토출구(34)를 통해 세포 및 알지네이트 성분이 토출되어 비드 크기의 조절을 용이하게 할 수 있다.The distal end of the second channel 32 is preferably formed with a discharge port 34 having a structure that is gradually narrowed. That is, the cells and the alginate component are discharged through the discharge port 34 smaller than the diameter of the cylindrical channel of the second channel 32 to facilitate control of the bead size.

상기 토출구(34)의 직경은 10 내지 100㎛ 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 15 내지 50㎛, 더욱 더 바람직하게는 20 내지 40㎛ 일 수 있다. 토출구(34)의 직경이 작을수록 더 작은 비드를 형성할 수 있다.The diameter of the discharge port 34 is preferably 10 to 100 μm, more preferably 15 to 50 μm, and even more preferably 20 to 40 μm. A smaller bead may be formed as the diameter of the discharge port 34 is smaller.

한편, 제1 채널(22)과 제2 채널(32)의 유체 속도(flow rate)를 각각 제어함으로써 제조되는 비드의 크기가 조절될 수 있다.Meanwhile, the size of the manufactured beads may be adjusted by controlling the flow rates of the first channel 22 and the second channel 32 , respectively.

바람직하게는, 상기 제1 채널(22)의 유체 속도는 0.6 내지 1.8 ㎖/h이고, 상기 제2 채널(32)의 유체 속도는 5.0 내지 35.0 ㎖/h 일 수 있다. 제1 채널(22)의 비드형성제의 유체 속도가 빠를수록 최종 제조되는 비드는 더 작아질 수 있다. 비드형성제의 유체 속도가 빠를수록 제2 채널(32)의 토출구(34)로부터 토출되는 코어 성분을 커버하는 비드형성제의 양이 작아지기 때문이다.Preferably, the fluid velocity of the first channel 22 may be 0.6 to 1.8 ml/h, and the fluid velocity of the second channel 32 may be 5.0 to 35.0 ml/h. The higher the fluid velocity of the bead former in the first channel 22, the smaller the final produced bead can be. This is because, as the fluid velocity of the bead forming agent increases, the amount of the bead forming agent that covers the core component discharged from the outlet 34 of the second channel 32 decreases.

한편, 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자는 상기 제1 채널(22), 제2 채널(32) 및 제3 채널(42)을 포함하는 원통형 채널에 상응하는 반원통형의 채널이 형성된 두 기판이 상판과 하판으로 서로 결합되어 원통형 채널을 형성하도록 하는 것이 바람직하다.On the other hand, the microfluidic device for manufacturing alginate beads encapsulated in cells is formed on two substrates having semi-cylindrical channels corresponding to the cylindrical channels including the first channel 22 , the second channel 32 and the third channel 42 . Preferably, the upper and lower plates are coupled to each other to form a cylindrical channel.

도 5에 도시된 바와 같이, 상기 상판과 하판은 상기 채널들과 주입구들의 둘레에 융착 라인을 포함할 수 있다. 상기 융착 라인은 상기 상판과 하판 중 어느 하나에 양각의 본딩 구조가 형성되고, 다른 하나에 음각의 본딩 구조가 형성될 수 있다. 상기 융착 라인은 초음파 처리에 의해 융착될 수 있으나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않는다. 이와 같은 본딩 구조는 하나의 예시에 불과하며 상판과 하판의 본딩 구조는 다양한 방법에 따라 형성할 수 있다.As shown in FIG. 5 , the upper plate and the lower plate may include fusion lines around the channels and the injection holes. In the fusion line, an embossed bonding structure may be formed on one of the upper and lower plates, and an engraved bonding structure may be formed on the other. The welding line may be fused by ultrasonic treatment, but the scope of the present invention is not limited thereto. Such a bonding structure is only an example, and the bonding structure of the upper plate and the lower plate may be formed according to various methods.

도 6에 도시된 바와 같이 상기 제1 주입구(20), 제2 주입구(30) 또는 비드배출구(40)는 밸브 및 튜빙, 또는 주사기와 체결되는 구조일 수 있다. 따라서 마이크로 펌프(200)와 연결하여 연속으로 비드를 제조할 수도 있지만, 필요에 따라 주사기 실린지, 튜빙과 직접 체결하여 편리하게 사용할 수 있다.As shown in FIG. 6 , the first inlet 20 , the second inlet 30 or the bead outlet 40 may have a structure coupled to a valve and tubing, or a syringe. Therefore, it is also possible to continuously manufacture beads by connecting with the micropump 200, but it can be conveniently used by directly connecting with a syringe syringe or tubing if necessary.

비드배출구(40)의 직경은 상기 제3 채널(42)의 직경의 3 내지 10배 일 수 있다. 이에 따라, 제조된 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드가 제3 채널(42)의 유체 흐름과 채널 직경 변화에 영향을 받지 않고 용이하게 배출구를 통해 수득될 수 있다The diameter of the bead outlet 40 may be 3 to 10 times the diameter of the third channel 42 . Accordingly, the prepared cell encapsulated alginate beads can be easily obtained through the outlet without being affected by the fluid flow of the third channel 42 and the change in the channel diameter.

이하, 도 1을 참조하여 본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템에 대해 설명하도록 한다.Hereinafter, a microfluidic device system for manufacturing alginate beads encapsulated in cells of the present invention will be described with reference to FIG. 1 .

본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템은 미세유체소자(100)와 마이크로 펌프(200)를 포함한다.The microfluidic device system for manufacturing alginate beads encapsulated in cells of the present invention includes a microfluidic device 100 and a micropump 200 .

마이크로 펌프(200)는 상기 미세유체소자(100)의 제1 주입구(20)에 비드형성제의 공급을 조절하고, 제2 주입구(30)에 세포 및 알지네이트의 공급을 조절하는 것을 특징으로 하고, 마이크로 펌프(200)는 비드형성제 공급부(210) 및 세포/알지네이트 공급부(220)를 포함한다.The micropump 200 controls the supply of the bead forming agent to the first inlet 20 of the microfluidic device 100, and controls the supply of cells and alginate to the second inlet 30, The micropump 200 includes a bead forming agent supply unit 210 and a cell/alginate supply unit 220 .

비드형성제 공급부(210)는 비드형성제 수용부(212), 비드형성제 공급제어부(214) 및 비드형성제 공급채널(216)을 포함한다.The bead forming agent supply unit 210 includes a bead forming agent receiving unit 212 , a bead forming agent supply controlling unit 214 , and a bead forming agent supply channel 216 .

또한, 세포/알지네이트 공급부(220)는 세포/알지네이트 수용부(222), 세포/알지네이트 공급제어부(224) 및 세포/알지네이트 공급채널(226)을 포함한다.In addition, the cell/alginate supply unit 220 includes a cell/alginate receiving unit 222 , a cell/alginate supply control unit 224 , and a cell/alginate supply channel 226 .

이에 따라, 미세유체소자(100)에 공급되는 비드의 재료인 비드형성제, 세포/알지네이트 성분의 공급이 자동 조절됨에 따라 대량의 알지네이트 비드를 균일한 크기로 연속적으로 제조할 수 있다. Accordingly, as the supply of the bead forming agent and the cell/alginate component, which is a material of the beads supplied to the microfluidic device 100, is automatically controlled, a large amount of alginate beads can be continuously manufactured in a uniform size.

이하, 본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.Hereinafter, a method for producing alginate beads encapsulated in cells of the present invention will be described.

본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자를 이용하거나, 본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템을 이용하는 방법에 따라 수행될 수 있다.The preparation of the cell-encapsulated alginate beads of the present invention may be carried out according to a method using a microfluidic device for preparing alginate beads encapsulated in cells or a microfluidic device system for preparing alginate beads encapsulating cells of the present invention.

본 발명의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법에서, 제2 주입구(30)로 주입되는 세포 및 알지네이트에서 상기 세포는 배양된 세포를 포함하는 배양액의 형태로 주입될 수 있고, 상기 알지네이트는 1 내지 2%의 알지네이트 용액으로 주입되는 것이 바람직하다. 상기 알지네이트 농도 범위를 벗어나는 경우 세포의 캡슐화가 적절히 이루어질 수 없다.In the method for producing alginate beads encapsulated in cells of the present invention, the cells and the alginate injected into the second inlet 30 may be injected in the form of a culture solution containing the cultured cells, and the alginate is 1 to It is preferred to inject with a 2% alginate solution. If the alginate concentration is out of the range, the encapsulation of the cells cannot be performed properly.

상기 알지네이트 용액에 가교제를 추가로 투입하는 것이 바람직하고, 상기 가교제는 염화칼슘(CaCl2) 용액인 것이 바람직하다.It is preferable to additionally add a crosslinking agent to the alginate solution, and the crosslinking agent is preferably a calcium chloride (CaCl 2 ) solution.

상기 염화칼슘 용액은 0.5 내지 1.5%의 알코올 용액일 수 있다.The calcium chloride solution may be a 0.5 to 1.5% alcohol solution.

[실시예] [Example]

실시예 1: 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조Example 1: Preparation of Cell Encapsulated Alginate Beads

(1) 세포 배양(1) cell culture

UCMSC 세포(umbilical cord matrix stem cell)가 얼려진 바이알을 꺼내 37℃ 에서 3분 이내로 녹였다. 다음으로, 15㎖ 튜브에 세포와 배양배지를(CEFOgro™UCMSC) 섞어 1,500rpm으로 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. PBS로 세척한 후 한번 더 1,500rpm으로 3분간 원심분리하였다. UCMSC cells (umbilical cord matrix stem cells) were taken out of the frozen vial and thawed at 37 ℃ within 3 minutes. Next, the cells and culture medium (CEFOgro™ UCMSC) were mixed in a 15 ml tube and centrifuged at 1,500 rpm for 3 minutes to remove the supernatant. After washing with PBS, centrifugation was performed once more at 1,500 rpm for 3 minutes.

100∮ 배양 접시 또는 T75 배양 플라스크에서 세포를 배양하였고, 배양 조건은 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 세포밀집도(cell confluence) 70~90% 가 되면 실험에 이용하였다.Cells were cultured in a 100∮ culture dish or T75 culture flask, and the culture conditions were 37° C., 5% CO 2 When the cell confluence reached 70-90% in an incubator, it was used for the experiment.

(2) 알지네이트 용액 제조(2) Preparation of alginate solution

배지 25㎖와 0.5g의 알긴산나트륨(sodium alginate)을 혼합한 후 60 내지 70℃에서 교반시켜 2% 알긴산 용액을 제조하였다.A 2% alginic acid solution was prepared by mixing 25 ml of the medium and 0.5 g of sodium alginate, followed by stirring at 60 to 70°C.

(3) CaCl(3) CaCl 22 용액 제조 solution preparation

2-methyl-1-propanol 100㎖와 CaCl2 1g을 혼합하여 1% CaCl2 용액을 제조하였다.100 ml of 2-methyl-1-propanol and 1 g of CaCl 2 were mixed to prepare a 1% CaCl 2 solution.

(4) 미세유체소자를 이용한 세포 캡슐화된 알지네이트 비드 제조(4) Preparation of cell-encapsulated alginate beads using microfluidic devices

도 1에 도시된 본 발명의 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자(채널 직경 250㎛, 제1 주입구 및 제2 주입구 직경 1.000㎛, 비드배출구 직경 1,000㎛, 제1 채널과 제2 채널간 각도 = 45°)를 P100 (hydrophilic coating) 제품을 이용하여 친수성 표면처리한 후, 제1 주입구에 올레산을 주입하여 유속이 약 20㎖/h가 되도록 조절하고, 제2 주입구에 (1)의 세포를 포함하는 배양액에서 UCMSC 세포수가 약 2.5ⅹ105 / 10 ㎖가 되도록 하고, (2)의 알지네이트 용액, (3)의 CaCl2 용액 함량을 투입하고 유속이 약 1.0 ㎖/h가 되도록 조절하였다. 제조된 세포 캡슐화된 알지네이트 비드는 배출구와 연결시킨 튜빙장치에 의해 수득하였다.The microfluidic device for manufacturing alginate beads of the present invention shown in FIG. 1 (channel diameter 250 μm, first inlet and second inlet diameter 1.000 μm, bead outlet diameter 1,000 μm, first channel and second channel angle = 45°) After hydrophilic surface treatment using a P100 (hydrophilic coating) product, oleic acid was injected into the first inlet to adjust the flow rate to about 20 ml/h, and the second inlet in the culture medium containing the cells of (1). The UCMSC cell number was about 2.5× 10 5 / 10 ㎖, and the content of the alginate solution of (2) and the CaCl 2 solution of (3) was added, and the flow rate was adjusted to about 1.0 ㎖/h. The prepared cell-encapsulated alginate beads were obtained by a tubing device connected to the outlet.

[실험예][Experimental example]

실험예 1: 채널의 유체속도에 따른 비드 크기의 조절Experimental Example 1: Control of the bead size according to the fluid velocity of the channel

실시예 1에 따라 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 제조하면서 제2 채널의 유체 속도는 20 ㎕/min로 고정하고, 제1 채널의 유체 속도를 50 내지 300 ㎕/min로 변화시키면서, 제조된 알지네이트 비드의 크기 변화를 관찰하였다. 이때, 제2 주입구 말단의 토출구의 크기를 20㎛, 30㎛, 40㎛으로 하여 이에 대한 비드 크기 변화를 비교하였다. 이에 따른 알지네이트 비드의 제조과정 및 그에 대한 사진을 도 8에 나타내었으며, 채널의 유세속도와 알지네이트 비드 크기의 변화 그래프를 도 9에 나타내었다. According to Example 1, while preparing the cell-encapsulated alginate beads, the fluid velocity of the second channel was fixed at 20 μl/min, and the fluid velocity of the first channel was changed from 50 to 300 μl/min, the prepared alginate beads size change was observed. At this time, the size of the outlet at the end of the second inlet was set to 20 μm, 30 μm, and 40 μm, and the change in the bead size was compared. Accordingly, the manufacturing process of the alginate beads and a photograph thereof are shown in FIG. 8, and a graph of changes in channel flow rate and alginate bead size is shown in FIG.

이에 따르면, 균일한 크기의 알지네이트 비드가 제조되는 것을 확인할 수 있으며, 제1 채널의 유체 속도 즉, 올레산의 유체 속도가 빠를수록 비드의 크기가 작아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 제2 채널 말단의 토출구의 크기가 작을수록 비드의 크기가 작아짐을 확인할 수 있엇따.According to this, it can be confirmed that alginate beads of uniform size are produced, and it can be confirmed that the faster the fluid velocity of the first channel, that is, the fluid velocity of oleic acid, the smaller the size of the beads. In addition, it was confirmed that the smaller the size of the outlet at the end of the second channel, the smaller the size of the bead.

실험예 2: 친수화 표면처리에 따른 접촉각(contact angle) 측정Experimental Example 2: Measurement of contact angle according to hydrophilization surface treatment

실시예 1의 미세유세소자에 대하여 P100 (hydrophilic coating) 제품을 이용해서 다음 방법으로 표면처리를 진행하였다. P100 성분은 40-49% 이소프로판올(Isopropanol), 물(water), 1% 이소프로필 알코올(Isopropyl Alcohol)(CAS RN:67-63-0)이다.The microfluidic device of Example 1 was subjected to surface treatment in the following manner using a hydrophilic coating (P100) product. P100 component is 40-49% isopropanol (Isopropanol), water (water), 1% isopropyl alcohol (Isopropyl Alcohol) (CAS RN: 67-63-0).

먼저 P100을 미세유체소자가 완벽하게 담길 수 있도록 준비하고, 세척 후 건조한 미세유세소자를 준비한 P100에 3~4초 동안 완전히 침지시킨 후 꺼냈다. 이후, 미세유체소자의 채널에 건조한 용액이 두껍게 형성되지 않도록 질소가스(N2)를 약하게 분사하면서 완전히 건조시켰다. 이에 따라 친수성 표면처리한 미세유체소자의 표면의 물에 대한 접촉각(contact angle)을 측정하여 그 결과를 도 10에 나타내었다. 이에 따르면 미세유세소자의 표면이 성공적으로 친수화됨을 확인할 수 있었다.First, the P100 was prepared so that the microfluidic device could be completely contained, and after washing, the dried microfluidic device was completely immersed in the prepared P100 for 3 to 4 seconds and then taken out. Thereafter, nitrogen gas (N 2 ) was lightly sprayed to prevent the dry solution from forming thickly in the channel of the microfluidic device, and the result was completely dried. Accordingly, the contact angle of the surface of the hydrophilic surface-treated microfluidic device with respect to water was measured, and the results are shown in FIG. 10 . According to this, it was confirmed that the surface of the microfluidic device was successfully hydrophilized.

실험예 3: 비드 내 캡슐화된 세포의 관찰Experimental Example 3: Observation of encapsulated cells in beads

실시예 1에 따라 알지네이트 비드 내 캡슐화된 UCMSC 세포에 대하여 캡슐화 후 10일 간 세포의 변화를 살펴본 광학 현미경 사진을 도 11에 나타내었으며, 10일 후의 형광 현미경 사진을 도 12에 나타내었다. 또한, 실시예 1의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조를 3회 반복 시험하여 10일 후 30개 비드(spheroid)의 셀의 개수, 비드 당 셀의 개수 및 세포의 생존율(%)을 아래의 표 1에 나타내었다.According to Example 1, with respect to UCMSC cells encapsulated in alginate beads, an optical micrograph showing the change of cells for 10 days after encapsulation is shown in FIG. 11 , and a fluorescence micrograph after 10 days is shown in FIG. 12 . In addition, the preparation of the cell-encapsulated alginate beads of Example 1 was tested three times and after 10 days, the number of cells in 30 beads (spheroid), the number of cells per bead, and the viability (%) of cells are shown in the table below. 1 is shown.

Figure pat00001
Figure pat00001

이에 따르면, 세포 캡슐화 이후 세포의 성장이 이루어짐을 확인하였으며, 세포의 생존율 또한 95% 이상의 높은 수준으로 나타남을 확인하였다.According to this, it was confirmed that the growth of the cells was made after the cell encapsulation, and it was confirmed that the cell viability was also shown at a high level of 95% or more.

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.In the above, although embodiments of the present invention have been described, those of ordinary skill in the art can add, change, delete or add components within the scope that does not depart from the spirit of the present invention described in the claims. The present invention may be variously modified and changed by, etc., and this will also be included within the scope of the present invention.

기판(10)
제1 주입구(20)
제1 채널(22)
제2 주입구(30)
제2 채널(32)
토출구(34)
비드배출구(40)
제3 채널(42)
비드형성부(44)
미세유체소자(100)
마이크로 펌프(200)
비드형성제 공급부(210)
비드형성제 수용부(212)
비드형성제 공급제어부(214)
비드형성제 공급채널(216)
세포/알지네이트 공급부(220)
세포/알지네이트 수용부(222)
세포/알지네이트 공급제어부(224)
세포/알지네이트 공급채널(226)Substrate (10)
first inlet (20)
first channel (22)
second inlet (30)
second channel (32)
outlet (34)
Bead outlet (40)
third channel (42)
Bead forming part (44)
Microfluidic Device (100)
Micro Pump(200)
Bead forming agent supply unit 210
Bead forming agent receiving part (212)
Bead forming agent supply control unit (214)
Bead former supply channel (216)
Cell/Alginate Supply (220)
Cell/alginate receptor (222)
Cell/alginate supply control unit (224)
Cell/Alginate Supply Channel (226)

Claims (15)

기판;
상기 기판 상에 형성되고 비드형성제를 주입하기 위한 제1 주입구;
상기 제1 주입구와 연통되고, 기판 내부를 따라 원통형 채널로 형성되며, 상기 비드형성제가 수송되는 제1 채널;
상기 기판 상에 형성되고 세포 및 알지네이트를 주입하기 위한 제2 주입구;
상기 제2 주입구와 연통되고, 기판 내부를 따라 원통형 채널로 형성되며, 상기 세포 및 알지네이트가 수송되는 제2 채널;
상기 제1 채널의 말단과 제2 채널의 말단이 서로 근접하고, 상기 제1 채널의 말단에서 비드형성제가 토출되고, 상기 제2 채널의 말단에서 세포 및 알지네이트가 토출되어 토출된 물질들에 의해 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드를 형성하는 공간인 비드형성부;
상기 비드형성부와 연통되고, 상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드가 수송되는 제3 채널;
상기 제3 채널의 말단과 연통되고 상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드가 배출되는 비드배출구;를 포함하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.Board;
a first injection hole formed on the substrate and for injecting a bead forming agent;
a first channel communicating with the first inlet, formed as a cylindrical channel along the inside of the substrate, and through which the bead forming agent is transported;
a second inlet formed on the substrate and for injecting cells and alginate;
a second channel communicating with the second inlet, formed as a cylindrical channel along the inside of the substrate, and through which the cells and alginate are transported;
The end of the first channel and the end of the second channel are close to each other, the bead forming agent is discharged from the end of the first channel, and the cells and alginate are discharged from the end of the second channel. Bead forming part is a space for forming the encapsulated alginate beads;
a third channel communicating with the bead forming part and transporting the alginate beads encapsulated in the cells;
A microfluidic device for producing alginate beads encapsulated in cells, comprising a; bead outlet communicating with the end of the third channel and discharging the alginate beads encapsulated in the cells. 제1항에 있어서,
상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자는 플라스틱 소재인 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.According to claim 1,
The cell-encapsulated microfluidic device for producing alginate beads is a microfluidic device for producing alginate beads encapsulated in cells, characterized in that the plastic material. 제2항에 있어서,
상기 플라스틱 소재는 친수성 표면처리된 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.3. The method of claim 2,
The plastic material is a microfluidic device for manufacturing cells encapsulated alginate beads, characterized in that the hydrophilic surface treatment. 제1항에 있어서,
상기 비드형성제는 계면활성제 또는 오일류인 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.According to claim 1,
The bead forming agent is a microfluidic device for producing alginate beads encapsulated in cells, characterized in that the surfactant or oil. 제1항에 있어서,
상기 원통형 채널은 직경이 100 내지 500㎛ 인 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.According to claim 1,
The cylindrical channel is a microfluidic device for manufacturing cells encapsulated alginate beads, characterized in that the diameter of 100 to 500㎛. 제1항에 있어서,
상기 제1 채널은 제1 주입구로부터 2개의 채널로 분기되고, 상기 비드형성부에서 만나는 구조로 형성되는 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.According to claim 1,
The first channel is branched into two channels from the first inlet, and a cell encapsulated microfluidic device for manufacturing alginate beads, characterized in that it is formed in a structure that meets at the bead forming part. 제6항에 있어서,
상기 비드형성부에서 상기 제1 채널과 상기 제2 채널이 이루는 각(Θ)은 45 내지 90°인 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.7. The method of claim 6,
An angle (Θ) formed by the first channel and the second channel in the bead forming part is a cell-encapsulated microfluidic device for producing alginate beads, characterized in that 45 to 90°. 제1항에 있어서,
상기 제2 채널의 말단은 점차로 좁아지는 구조인 토출구가 형성된 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.According to claim 1,
The end of the second channel is a cell-encapsulated microfluidic device for producing alginate beads, characterized in that the discharge port is formed with a structure that is gradually narrowed. 제1항에 있어서,
상기 제1 채널과 제2 채널의 유체 속도(flow rate)를 각각 제어함으로써 제조되는 비드의 크기가 조절되는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.According to claim 1,
A microfluidic device for manufacturing alginate beads in which the size of the bead is adjusted by controlling the flow rate of the first channel and the second channel, respectively. 제1항에 있어서,
상기 제1 채널의 유체 속도는 0.6 내지 1.8 ㎖/h이고, 상기 제2 채널의 유체 속도는 5.0 내지 35.0 ㎖/h 인 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자. According to claim 1,
The fluid velocity of the first channel is 0.6 to 1.8 ml/h, and the fluid velocity of the second channel is 5.0 to 35.0 ml/h. 제1항에 있어서,
상기 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자는 상기 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널을 포함하는 원통형 채널에 상응하는 반원통형의 채널이 형성된 두 기판이 상판과 하판으로 서로 결합되어 원통형 채널을 형성하는 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.According to claim 1,
The cell-encapsulated microfluidic device for manufacturing alginate beads includes two substrates having semi-cylindrical channels corresponding to the cylindrical channels including the first channel, the second channel, and the third channel are coupled to each other by an upper plate and a lower plate to form a cylindrical channel. A microfluidic device for manufacturing alginate beads encapsulated in cells, characterized in that to form a. 제11항에 있어서,
상기 상판과 하판은 상기 채널들과 주입구들의 둘레에 융착 라인을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자.12. The method of claim 11,
The upper plate and the lower plate is a microfluidic device for manufacturing alginate beads encapsulated in cells, characterized in that it comprises a fusion line around the channels and injection holes. 제1항 내지 제12항 중에서 선택된 어느 한 항의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자; 및
상기 미세유체소자의 제1 주입구에 비드형성제의 공급을 조절하고, 제2 주입구에 세포 및 알지네이트의 공급을 조절하는 마이크로 펌프;를 포함하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템.A microfluidic device for manufacturing alginate beads encapsulated in any one of claims 1 to 12; and
A microfluidic device system for manufacturing alginate beads encapsulated in cells, comprising a; micropump for controlling the supply of the bead forming agent to the first inlet of the microfluidic device and controlling the supply of cells and alginate to the second inlet. 제13항에 있어서,
상기 마이크로 펌프는 비드형성제 공급부 및 세포/알지네이트 공급부를 포함하고,
상기 비드형성제 공급부는 비드형성제 수용부, 비드형성제 공급제어부 및 비드형성제 공급채널을 포함하고,
상기 세포/알지네이트 공급부는 세포/알지네이트 수용부, 세포/알지네이트 공급제어부 및 세포/알지네이트 공급채널을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 시스템.14. The method of claim 13,
The micropump includes a bead forming agent supply unit and a cell/alginate supply unit,
The bead forming agent supply unit includes a bead forming agent receiving unit, a bead forming agent supply control unit and a bead forming agent supply channel,
The cell/alginate supply unit is a cell/alginate receiving unit, a cell/alginate supply control unit, and a cell/alginate supply channel microfluidic device system for manufacturing alginate beads encapsulated in cells, characterized in that it comprises a supply channel. 제1항 내지 제12항 중에서 선택된 어느 한 항의 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자를 이용한 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법.13. A method for producing alginate beads encapsulated in cells using a microfluidic device for producing alginate beads encapsulated in any one of claims 1 to 12.
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