KR20210087891A

KR20210087891A - Pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infection

Info

Publication number: KR20210087891A
Application number: KR1020207007128A
Authority: KR
Inventors: 전영진
Original assignee: 경상국립대학교병원
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-07-13
Also published as: WO2021137305A1

Abstract

본 발명은 박테리아 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 항균 조성물에 관한 것으로 박테리아의 사이드로포어 활성 저해효과가 우수하여 박테리아를 효과적으로 사멸시킬 수 있으며, 박테리아 감염증 예방 또는 치료용 탁월한 효과가 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition and an antibacterial composition for preventing or treating a bacterial infection, and has an excellent inhibitory effect on the siderophore activity of the bacteria to effectively kill the bacteria, and has an excellent effect for preventing or treating a bacterial infection.

Description

박테리아 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물Pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infection

본 발명은 박테리아 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infections.

항생물질은 미생물은 죽이면서 인체 또는 동물에게는 독성이 낮고 체내의 효소 등에 의해 비활성화되지 않는 선택적 독성작용(selective toxicity)을 갖는 물질로서, 이는 주로 DNA의 복제, 유전정보의 전사 및 해독, 전자에너지의 수송, 세포벽의 생합성 등을 저해함으로써 미생물의 증식을 억제하는 기전을 통해 효과를 나타낸다.Antibiotics kill microorganisms, but have low toxicity to humans or animals and have selective toxicity that are not inactivated by enzymes in the body. By inhibiting transport, cell wall biosynthesis, etc., the effect is shown through the mechanism of inhibiting the proliferation of microorganisms.

항생물질은 플레밍(Sir Alexandor Fleming)이 1929년에 페니실린을 처음 발견하고, 플로리(Flory) 등이 1939년에 페니실리움 크리소제늄(penicillium chrysogenum)의 배양액에서 페니실린을 최초로 분리, 정제하여 감염성질환을 가진 수많은 환자의 생명을 구함으로써 기적의 약으로 알려져 왔다. 이후 1959년까지 본격적으로 연구가 이루어지면서 현재까지 항생 치료제로 유용하게 사용되고 있는 벤질페니실린(benzylpenicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracyclin) 및 마크로라이드계의 에리트로마이신(erythromycin) 등이 개발되었다. 이후 페니실린류(penicillin)가 1965년에 처음 합성방법에 의해 개발되어서 반합성 페니실린인 메티실린 등이 개발되었고, 1973년에는 세팔로스포린계인 세파졸린이 개발되었다.As an antibiotic, penicillin was first discovered by Sir Alexandor Fleming in 1929, and by Flory et al. in 1939 by isolating and purifying penicillin from the culture medium of penicillium chrysogenum for the first time to infect infectious diseases. It has been known as a miracle drug by saving the lives of countless patients with Since then, research has been carried out in earnest until 1959, and benzylpenicillin, streptomycin, tetracyclin, and macrolide erythromycin, which are usefully used as antibiotics to date, have been developed. . Afterwards, penicillins were first developed by a synthetic method in 1965, and methicillin, a semi-synthetic penicillin, was developed, and in 1973, a cephalosporin-based cefazolin was developed.

비록, 박테리아의 감염을 조절하는데 사용되는 항생물질이 다양하게 존재하지만, 항생물질에 대한 저항성이 부득이하게 발생할 수 있기 때문에 종종 그 항생 물질은 효과적이지 못할 수 있다. 박테리아들 간의 고유한 또는 획득한 항생물질에 대한 저항성 기작의 선택 및 보급은 지금까지 밝혀진 다양한 항생 물질을 포함한 화학적 치료 방법을 방해하고, 다수의 항생 물질 저항성을 갖는 박테리아 종의 발생을 증진시킨다. 이러한 이유로 최근 박테리아에 의한 감염 환자의 사망률이 증가하고 있다. 따라서 박테리아에 의한 감염을 조절할 수 있는 새로운 치료 및 예방 전략의 개발이 강력하게 요구된다.Although there are a variety of antibiotics used to control bacterial infections, often antibiotics may not be effective because resistance to antibiotics can inevitably develop. Selection and dissemination of mechanisms of resistance to intrinsic or acquired antibiotics among bacteria hamper chemotherapeutic methods including various antibiotics that have been discovered so far, and promote the development of multiple antibiotic-resistant bacterial species. For this reason, the mortality rate of patients infected by bacteria is increasing recently. Therefore, there is a strong need for the development of novel therapeutic and prophylactic strategies that can control bacterial infection.

본 발명은 박테리아 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infections.

본 발명은 항균용 조성물을 제공한다.The present invention provides an antibacterial composition.

1. 인터루킨-17C(Interleukin-17C); 또는 인터루킨-17C로 처리된 세포를 포함하는 박테리아 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.1. Interleukin-17C; Or a pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infection comprising cells treated with interleukin-17C.

2. 위 1에 있어서, 상기 세포는 비강 상피세포인, 조성물.2. The composition of 1 above, wherein the cells are nasal epithelial cells.

3. 위 1에 있어서, 상기 세포는 상기 세포 배양액의 상층액에 포함된 것인, 조성물.3. The composition of 1 above, wherein the cells are contained in the supernatant of the cell culture solution.

4. 위 1에 있어서, 상기 박테리아는 녹농균인, 조성물.4. The composition of 1 above, wherein the bacterium is Pseudomonas aeruginosa.

5. 위 1에 있어서, 상기 감염증은 만성 폐쇄성 폐질환, 축농증, 낭포성 섬유증, 중이염, 각막염, 내안구염, 균혈증, 화상 상처 감염, 폐렴, 뇌막염, 요로염, 복막염 또는 패혈증을 포함하는, 조성물.5. The composition of the above 1, wherein the infectious disease includes chronic obstructive pulmonary disease, sinusitis, cystic fibrosis, otitis media, keratitis, endophthalmitis, bacteremia, burn wound infection, pneumonia, meningitis, urolithiasis, peritonitis or sepsis.

6. 인터루킨-17C(Interleukin-17C); 또는 상기 인터루킨-17C를 처리한 세포를 포함하는 항균용 조성물.6. Interleukin-17C; Or an antibacterial composition comprising the cells treated with the interleukin-17C.

7. 위 6에 있어서, 상기 균은 녹농균인, 조성물.7. The composition of 6 above, wherein the bacteria is Pseudomonas aeruginosa.

본 발명의 약학 조성물 또는 항균 조성물은 박테리아의 사이드로포어(siderophore) 활성 저해효과가 우수하여 박테리아를 효과적으로 사멸시킬 수 있으며, 박테리아 감염증 예방 또는 치료용 탁월한 효과가 있다.The pharmaceutical composition or antibacterial composition of the present invention has an excellent effect of inhibiting siderophore activity of bacteria and thus can effectively kill bacteria, and has an excellent effect for preventing or treating bacterial infections.

도 1A는 정상 인간 비강상피(normal human nasal epithelial, NHNE) 세포에서 PAO1 균주 감염에 따른 PAO1 균주 유전자(PA4834) mRNA의 발현 수준을 측정한 것이고, 도 1B 및 1C는 PAO1 균주의 콜로니 수를 나타낸 것이다.
도 2는 PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포의 transepithelial electrical resistance(TEER)를 측정한 것이다.
도 3은 PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포에서 인터루킨-17C의 발현 및 분비된 단백질 수준을 분석한 것이다.
도 4는 NHNE 세포를 처리하기 위해 사용된 인간 재조합 인터루킨-17C(rhIL-17C, recombinant human IL-17C)의 농도에 따른 세포 증식을 확인한 것이다.
도 5는 인터루킨-17C 또는 인터루킨-17C 처리된 세포에서 PAO1 균주 감염 후 시간에 따른 PAO1 균주의 콜로니 수를 확인한 것이다.
도 6은 PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포에서 인터루킨-17C의 처리에 따른 LCN2(lipocalin-2) mRNA 또는 단백질의 발현 수준, 및 PAO1 균주의 사이드로포어 활성을 측정한 것이다.1A is a measurement of the expression level of PAO1 strain gene (PA4834) mRNA according to PAO1 strain infection in normal human nasal epithelial (NHNE) cells, and FIGS. 1B and 1C show the number of colonies of the PAO1 strain. .
2 is a measurement of transepithelial electrical resistance (TEER) of NHNE cells infected with PAO1 strain.
3 is an analysis of the expression and secreted protein levels of interleukin-17C in NHNE cells infected with the PAO1 strain.
Figure 4 confirms the cell proliferation according to the concentration of human recombinant interleukin-17C (rhIL-17C, recombinant human IL-17C) used to treat NHNE cells.
FIG. 5 shows the number of colonies of the PAO1 strain according to time after infection with the PAO1 strain in interleukin-17C or interleukin-17C-treated cells.
FIG. 6 shows the measurement of LCN2 (lipocalin-2) mRNA or protein expression levels and siderophore activity of the PAO1 strain according to the treatment of interleukin-17C in NHNE cells infected with the PAO1 strain.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 인터루킨-17C(Interleukin-17C); 또는 인터루킨-17C로 처리된 세포를 포함하는 박테리아 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention interleukin-17C (Interleukin-17C); Or it relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infection comprising cells treated with interleukin-17C.

본 발명의 약학 조성물은 박테리아를 사멸시켜 박테리아 감염증을 예방 또는 치료하는 데 우수한 효과가 있다. 이는 인터루킨-17C가 박테리아 감염된 세포에서 LCN2(Lipocalin-2) mRNA 또는 단백질의 발현을 유도하고, LNC2는 박테리아의 사이드로포어(sideropore) 활성을 저해하기 때문인 것으로 판단된다. 또한, 인터루킨-17C로 처리된 세포는 박테리아를 사멸시키는 데 우수한 효과가 있는데, 이는 인터루킨-17C로 처리된 세포에서도 LCN2 mRNA 또는 단백질의 발현이 증가되기 때문인 것으로 판단된다.The pharmaceutical composition of the present invention has an excellent effect in preventing or treating bacterial infection by killing bacteria. This is thought to be because interleukin-17C induces expression of LCN2 (Lipocalin-2) mRNA or protein in bacterially-infected cells, and LNC2 inhibits bacterial sideropore activity. In addition, the cells treated with interleukin-17C have an excellent effect in killing bacteria, which is thought to be because the expression of LCN2 mRNA or protein is increased even in cells treated with interleukin-17C.

인터루킨-17C(Interleukin-17C)의 단백질 서열은 NCBI genbank 등에 공지된 서열을 활용할 수 있다. 예를 들어, 인간의 경우, 서열번호 1의 단백질 서열일 수 있다. 서열은 이에 한정되지 않고, 예방 또는 치료 대상이 되는 개체 종의 것을 사용할 수 있다.For the protein sequence of Interleukin-17C, a sequence known from NCBI genbank and the like may be used. For example, in the case of a human, it may be the protein sequence of SEQ ID NO: 1. The sequence is not limited thereto, and those of the individual species to be prevented or treated may be used.

예방 또는 치료 대상이 되는 개체는 현재 박테리아 감염증을 보유하고 있거나, 박테리아 감염증의 보유가 의심되거나, 박테리아 감염증을 보유한 경험이 있는 동물 등으로서, 상기 동물은 인간을 포함하는 포유류를 포함할 수 있다.The subject to be prevented or treated is an animal that currently has a bacterial infection, is suspected of having a bacterial infection, or has an experience with a bacterial infection, and the animal may include mammals including humans.

인터루킨-17C로 처리된 세포는 인터루킨-17C의 처리에 따른 면역 인자를 생성하는 세포로서, 구체적으로, 인터루킨-17C의 처리에 따른 면역 인자로 LCN2를 생성할 수 있는 세포를 포함할 수 있다.The cells treated with interleukin-17C are cells that produce an immune factor following the treatment of interleukin-17C, specifically, cells capable of producing LCN2 with the immune factor following the treatment of interleukin-17C.

예를 들어, 호중구, 간 세포, 상피세포, 중간엽 세포 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 구체적으로, 상피세포일 수 있고, 더욱 구체적으로 비강 상피세포 일 수 있다.For example, it may include, but is not limited to, neutrophils, liver cells, epithelial cells, mesenchymal cells, and the like, and specifically, may be epithelial cells, and more specifically may be nasal epithelial cells.

인터루킨-17C는 세포에 10 내지 200 ng/㎖, 구체적으로 50 내지 150 ng/㎖, 더욱 구체적으로 80 내지 120 ng/㎖ 농도로 처리될 수 있다. 상기 농도 범위로 세포에 처리되는 경우, 세포 독성을 나타내지 않으면서 면역 인자를 최대로 생성할 수 있다.Interleukin-17C may be treated with cells at a concentration of 10-200 ng/ml, specifically 50-150 ng/ml, more specifically 80-120 ng/ml. When cells are treated in the above concentration range, immune factors can be maximally produced without exhibiting cytotoxicity.

상기 세포는 상기 세포 배양액의 상층액에 포함된 것일 수 있다. 상기 세포 배양액의 상층액은 인터루킨-17C, 인터루킨-17C 처리된 세포 또는 그 세포에 의해 분비된 면역 인자를 포함할 수 있다. 면역인자는 예를 들어, LCN2일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The cells may be contained in the supernatant of the cell culture solution. The supernatant of the cell culture solution may contain interleukin-17C, interleukin-17C-treated cells or immune factors secreted by the cells. The immune factor may be, for example, LCN2, but is not limited thereto.

대상 박테리아는 사이드로포어를 생성하는 모든 박테리아가 제한 없이 적용될 수 있다. 박테리아는 철을 생존의 필수요소로 하는데, 숙주로부터 철을 흡수하여 자신의 증식에 이용하기 위해 사이드로포어라는 철의 킬레이트화제를 생성한다. 박테리아는 예를 들어, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 근두암종병(Agrobacterium tumefaciens), 시노르히조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti) 또는 대장균(Escherichia coli) 등을 포함할 수 있고, 구체적으로, 녹농균일 수 있다.As the target bacteria, any bacteria that produce sideropores may be applied without limitation. Bacteria make iron an essential element for survival, and to absorb iron from the host and use it for their own growth, they produce iron chelating agents called siderophores. Bacteria include, for example, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Agrobacterium tumefaciens, E. coli) and the like, and specifically, may be Pseudomonas aeruginosa.

박테리아 감염증은 박테리아에 의한 감염 그 자체, 박테리아 감염에 의해 유발되거나 악화되는 질환 및 상기 질환에 의한 증상을 모두 포함할 수 있다. Bacterial infection may include infection by bacteria itself, diseases caused or exacerbated by bacterial infection, and symptoms caused by the diseases.

대상 감염증은 사이드로포어 활성을 억제하는 경우, 사멸되는 박테리아가 일으키는 모든 감염증이 제한없이 적용될 수 있다. 구체적인 예를 들어서 상기 박테리아가 녹농균인 경우는 그 감염증은 만성 폐쇄성 폐질환, 축농증, 낭포성 섬유증, 중이염, 각막염, 내안구염, 균혈증, 화상 상처 감염, 폐렴, 뇌막염, 요로염, 복막염, 패혈증 등을 포함할 수 있다.As for the target infection, if the siderophore activity is inhibited, any infection caused by the killed bacteria may be applied without limitation. As a specific example, when the bacterium is Pseudomonas aeruginosa, the infection is chronic obstructive pulmonary disease, sinusitis, cystic fibrosis, otitis media, keratitis, endophthalmitis, bacteremia, burn wound infection, pneumonia, meningitis, uritis, peritonitis, sepsis, etc. may include

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively. , but not limited thereto.

조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, dextrin, maltodextrin, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In the case of formulation, it is usually prepared using a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, and a surfactant, but is not limited thereto.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., but these solid preparations include at least one or more excipients in the compound, for example, starch, calcium carbonate , sucrose or lactose, gelatin, etc. are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.Liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, activity of the drug, and the type of disease in the patient; Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including concomitant drugs, and other factors well known in the medical field. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art.

본 발명의 약학적 조성물에서 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏당 1 내지 6000 mg, 바람직하게는 60 내지 600 mg을 1회 또는 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The effective amount in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and generally 1 to 6000 mg per kg of body weight, preferably 60 to 600 mg per kg of body weight, may be administered once or divided into three doses. have. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, disease severity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.

또한, 본 발명은 인터루킨-17C(Interleukin-17C); 또는 상기 인터루킨-17C를 처리한 세포를 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention interleukin-17C (Interleukin-17C); Or it relates to an antibacterial composition comprising the cells treated with the interleukin-17C.

항균용 조성물은 식료품, 건강기능식품, 화장료, 사료, 세정제 등의 제조 시 포함될 수 있으며, 박테리아를 사멸시키는 용도로 사용될 수 있다.The antibacterial composition may be included in the manufacture of foodstuffs, health functional foods, cosmetics, feeds, detergents, and the like, and may be used for the purpose of killing bacteria.

본 발명의 항균용 조성물은 사용 형태에 따라서 등장화제, 부형제, 희석제, 증점제, 안정화제, 완충제, 보존제 등의 여러가지 첨가제를 함유할 수 있다. 이들 첨가제의 배합량은 조성물의 사용 형태에 따라서 적절히 설정할 수 있다.The antibacterial composition of the present invention may contain various additives such as isotonic agents, excipients, diluents, thickeners, stabilizers, buffers, and preservatives, depending on the type of use. The compounding quantity of these additives can be suitably set according to the use form of a composition.

본 발명의 조성물은 다양한 형태 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여형 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 가능하고, 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌제의 형태를 가질 수 있다. 바람직한 형태는 의도로 하는 사용 방식에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 현탁액, 용액 또는 유질 또는 수성 비이클 중 유액의 형태를 취할 수 있으며, 제형화 제제 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전, 적당한 비이클 예를 들어, 멸균 무 발열원물과 함께 사용될 분말형으로 존재할 수 있다.The compositions of the present invention may be formulated in a variety of forms, including liquid, semi-solid and solid dosage forms, including liquid solutions (eg, injectable, infusible solutions), dispersions or suspensions, tablets, pills, powders, liposomes and It may take the form of a suppository. The preferred form depends on the intended mode of use. The compositions of the present invention may take the form of suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous vehicles, and may contain formulating agents such as suspending, stabilizing and/or dispersing agents. Alternatively, the active ingredient may be presented in powder form for use with a suitable vehicle, eg, sterile, pyrogen-free, prior to use.

본 발명의 항균 조성물이 사료 제조 시 사용되는 경우, 가축의 종류에 따라 급여되는 일반적인 기초사료들을 포함할 수 있다. 이러한 기초사료들은 가축의 종류에 따라서 그 필요한 성분 및 조성 그리고 적합한 조성 비율이 모두 당업계에 공지되어 있으며, 또한 시판되고 있기 때문에 당업자라면 누구나 매우 용이하게 이를 제조 또는 구입하여 사용할 수 있을 것이다. 구체적으로 기초사료로는 가축의 종류에 따라 적합한 전분함유 물질, 단백질 함유 물질, 지방 함유 물질, 비타민 함유 물질, 무기질 함유 물질, 산화 방지 물질, 항생제 등의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. When the antimicrobial composition of the present invention is used in the production of feed, it may include general basic feeds fed according to the type of livestock. These basic feeds are all known in the art, and all of the necessary components and compositions and suitable composition ratios according to the type of livestock are commercially available, so anyone skilled in the art will be able to very easily manufacture or purchase them. Specifically, the basic feed may include some or all of a starch-containing material, a protein-containing material, a fat-containing material, a vitamin-containing material, a mineral-containing material, an antioxidant material, an antibiotic, etc. suitable for the type of livestock.

그 외 인터루킨-17C(Interleukin-17C), 상기 인터루킨-17C를 처리한 세포, 대상 박테리아에 관하여는 전술한 바와 같다.Other interleukin-17C (Interleukin-17C), the cells treated with the interleukin-17C, and the target bacteria are the same as described above.

본 발명은 인터루킨-17C(Interleukin-17C); 또는 인터루킨-17C로 처리된 세포하는 조성물을 개체에 투여하는 박테리아 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.The present invention interleukin-17C (Interleukin-17C); Or it relates to a method for preventing or treating a bacterial infection by administering to a subject a cell-treated composition with interleukin-17C.

인터루킨-17C 또는 인터루킨-17C가 처리된 세포가 분비하는 면역 인자는 박테리아의 사이드로포어 활성을 억제함으로써 박테리아를 사멸시켜 박테리아 감염증을 효과적으로 치료할 수 있다.Immune factors secreted by interleukin-17C or interleukin-17C-treated cells kill bacteria by inhibiting the siderophore activity of the bacteria, thereby effectively treating bacterial infections.

또한 본 발명의 약학 조성물은 박테리아 감염에 예방하기 위해 박테리아 감염 전에 투여될 수 있으며, 이 경우, 인터루킨-17C 또는 인터루킨-17C로 처리된 세포가 면역 반응을 사전에 유도하여 박테리아 감염을 사전에 예방하거나 박테리아 감염증을 보다 빠르게 치료할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered before bacterial infection in order to prevent bacterial infection. In this case, interleukin-17C or interleukin-17C-treated cells induce an immune response in advance to prevent bacterial infection or Bacterial infections can be treated faster.

개체 및 조성물은 전술한 범위 내의 것일 수 있다.The entities and compositions may be within the ranges described above.

본 발명은 박테리아 감염증의 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 있어서 인터루킨-17C 또는 인터루킨-17C로 처리된 세포의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of interleukin-17C or cells treated with interleukin-17C in the preparation of a composition for the prevention or treatment of bacterial infections.

전술한 바와 같이 본 발명의 박테리아 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 인터루킨-17C 또는 인터루킨-17C로 처리된 세포를 포함하는 것으로 대상 개체에 투여하는 경우, 박테리아의 사이드로포어 활성을 억제하여 박테리아를 사멸시킬 수 있는 바, 상기 물질은 박테리아 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조에 사용할 수 있다.As described above, the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bacterial infection of the present invention contains interleukin-17C or interleukin-17C-treated cells and, when administered to a subject, inhibits bacterial siderophore activity to kill bacteria. It can be killed, the substance can be used in the preparation of a pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infection.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.Hereinafter, examples will be given to describe the present invention in detail.

실험재료 및 방법Experimental materials and methods

1. 세포 배양1. Cell Culture

이 연구는 서울대학교 의과대학 의학연구윤리심의위원회(IRB 번호 : 1709-049-883) 및 경상대학교병원 기관생명윤리위원회(IRB 번호 : 2019-05-004)에 의해 승인되고 모니터링 되었으며, 비강 점막 샘플링에 참여한 모든 피험자는 서면 동의서를 제공하였다. 정상 인간 비강상피(normal human nasal epithelial, NHNE) 세포를 하기와 같이 배양하였다.This study was approved and monitored by the Medical Research Ethics Review Committee (IRB No.: 1709-049-883) and Gyeongsang National University Hospital Institutional Bioethics Committee (IRB No.: 2019-05-004), Seoul National University College of Medicine, Nasal Mucosal Sampling All subjects who participated in the study provided written informed consent. Normal human nasal epithelial (NHNE) cells were cultured as follows.

피험자의 중비갑개 비강 점막에서 분리된 비강 상피세포를 bronchialepithelialgrowth media(BEGM) 배양액으로 플라스틱 용기에 계대 배양하여 50∼60%의 합류(confluence)를 이루는 시점에서 trypsin/EDTA를 이용하여 플라스틱 용기로부터 분리시킨 뒤 평판하여 passage-2 NHNE 세포를 만들었다. Passage-2 NHNE 세포를 transwell 배양기(0.45 mm 기공 크기를 갖는 24.5 mm; Costar Co., Cambridge, MA, USA)에 배양기 당 10⁵ 세포의 밀도로 0.5 ㎖씩 접종하였다. 세포 배양액은 BEGM 과 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 1 : 1의 비율로 혼합하여 이용하였다. 세포 접종 후 처음 9일 동안 이틀에 한 번씩 배양액을 교체해 주며 세포 단층을 형성할 때까지 배양하였다. 9일째에 세포 표면의 배양액을 제거함으로써 air-liquid interface(ALI)를 형성하였다. 그 후 NHNE 세포는 기저 구획(basal compartment)로 부터 영양을 공급받게 되며 기저 구획의 배양액 ALI가 형성된 뒤 매일 교환하였다. 기존의 세포 배양액에 항생제와 항진균제를 추가하였고 PAO1 균주 처치 7일 전에는 항생제 또는 항진균제가 없는 배양액을 사용하였다. 본원에 기재된 모든 실험은 ALI 생성 후 14일 이후의 NHNE 세포를 사용하였다.Nasal epithelial cells isolated from the middle turbinate nasal mucosa of the subject were subcultured in a plastic container with bronchialepithelialgrowth media (BEGM) culture solution and separated from the plastic container using trypsin/EDTA at the time of achieving 50-60% confluence. Then plated to make passage-2 NHNE cells. Passage-2 NHNE cells were inoculated in a transwell culture medium (24.5 mm with 0.45 mm pore size; Costar Co., Cambridge, MA, USA) at ^{a density of 10 5} cells per incubator at 0.5 ml each. The cell culture medium was used by mixing BEGM and Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) in a 1:1 ratio. For the first 9 days after cell inoculation, the culture medium was changed once every two days and cultured until a cell monolayer was formed. On day 9, an air-liquid interface (ALI) was formed by removing the culture medium on the cell surface. Thereafter, NHNE cells were supplied with nutrients from the basal compartment and exchanged daily after ALI was formed in the culture medium in the basal compartment. Antibiotics and antifungals were added to the existing cell culture medium, and a culture medium without antibiotics or antifungals was used 7 days before PAO1 strain treatment. All experiments described herein used NHNE cells 14 days after ALI generation.

2. 세균 균주 및 시약2. Bacterial strains and reagents

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 PAO1 균주는 연세대학교로부터 제공받았으며, NHNE 세포에서 급성 박테리아 감염을 유도하는데 사용되었다. PAO1 균주는 필요할 때까지 -80℃ 냉동고에서 유지 보관하였고 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트(Difco^TM LB agar, Miller base; Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)에 도말 하고, 37℃에서 24시간 동안 성장시켰다. PAO1 균주의 단일 콜로니를 37℃ 배양 진탕기(shaker)에서 24시간 동안 1㎖의 액체 LB 배지(Difco^TM LB broth, Miller base; Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 24시간 동안 성장시켰다. 10 ㎖의 새로운 LB 배지를 100 ㎕의 PAO1 균주 배양배지에 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃ 배양 진탕기에서 2시간 동안 성장시켜 생균수는 일정하게 유지되고 총균수는 최대가 되는 안정기(log or stationary phase)에 도달하게 하였다. 준비된 NHNE 세포에 multiplicity of infection(MOI) 0.25로 항생제 또는 항진균제가 없는 세포 배양액을 이용하여 배양기당 300 ㎕씩 PAO1 균주를 접종하였다. 접종 후, NHNE 세포를 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 접종 후 지정된 시간에, 세포 용해물(lysate) 및 배양 상층액을 수집하였다. 재조합 인간 인터루킨-17C(recombinant human IL-17C, rhIL-17C, 카탈로그 번호 1234-IL) 및 LCN2 항체(카탈로그 번호 AF1757)는 모두 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. 인터루킨-17C의 항녹농균(antipseudomonal) 효과를 조사하기 위해, PAO1 균주 접종과 함께 세포 배양액에 rhIL-17C을 적정 농도로 희석하여 처리하였다.The PAO1 strain of Pseudomonas aeruginosa was provided by Yonsei University and was used to induce acute bacterial infection in NHNE cells. The PAO1 strain was maintained and stored in a -80 °C freezer until needed, plated on Luria-Bertani (LB) agar plates (Difco ^TM LB agar, Miller base; Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA), and at 37 °C. grown for 24 hours. A single colony of the PAO1 strain was grown in 1 ml of liquid LB medium (Difco ^TM LB broth, Miller base; Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) for 24 hours on a 37° C. culture shaker for 24 hours. did it 10 ml of fresh LB medium was added to 100 μl of PAO1 strain culture medium. The mixture was grown for 2 hours on a culture shaker at 37° C. to reach a stable phase (log or stationary phase) in which the number of viable cells was kept constant and the total number of cells was maximum. The prepared NHNE cells were inoculated with the PAO1 strain at a multiplicity of infection (MOI) of 0.25 using a cell culture medium without antibiotics or antifungals, at a rate of 300 μl per incubator. After inoculation, NHNE cells were cultured at 37° C., 5% CO _{2 .} At designated times after inoculation, cell lysates and culture supernatants were collected. Recombinant human IL-17C (recombinant human IL-17C, rhIL-17C, Cat. No. 1234-IL) and LCN2 antibody (Cat. No. AF1757) were both purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). In order to investigate the antipseudomonal effect of interleukin-17C, rhIL-17C was diluted to an appropriate concentration in the cell culture solution together with the PAO1 strain inoculation.

3. 콜로니(colony) 수3. Number of colonies

박테리아 샘플을 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 10배 연속 희석하였다. 이어서, 각각의 희석된 샘플 10㎕를 LB 한천 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 한천 표면에서 성장하는 PAO1 균주 콜로니 수는 수동으로 세었다. 박테리아 성장은 각각의 샘플에 대한 콜로니 형성 단위(colony forming unit, CFU)에 기초하여 확인하였다.Bacterial samples were serially diluted 10-fold with phosphate-buffered saline (PBS). 10 μl of each diluted sample was then plated on LB agar plates. Plates were incubated at 37° C. for 24 hours. The number of colonies of the PAO1 strain growing on the agar surface was manually counted. Bacterial growth was identified based on colony forming units (CFU) for each sample.

4. 유전자 마이크로어레이(microarray) 분석4. Gene microarray analysis

PAO1 균주 감염 후 유전자 발현의 변화를 평가하기 위해, HumanHT-12 v4.0 expression bead arrays(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 유전자 발현 분석을 수행하였다(16-18 h at 58℃; Illumina, Inc., San Diego, CA, USA). 데이터는 robust 다중 배열 분석 알고리즘(백그라운드 수정, 정규화 단계 및 프로브 수준 요약 수행)을 사용하여 처리되었다. 생성된 유전자 발현 데이터를 PBS를 처리한 세포를 기준으로 정규화하였다. PAO1 균주 감염에 의해 영향을 받는 잠재적 유전자를 확인하기 위해, PAO1 균주를 접종한 NHNE 세포에 대한 마이크로어레이 분석을 사용하여 감염 후 0 시간 및 8 시간에 mRNA의 발현 분석을 수행하였다. 마이크로어레이 분석은 표준 기술 매뉴얼(data accessible at NCBI GEO database, accession GSE109118)에 따라 MacroGen Korea(서울, 한국)에 의해 수행되었다.To evaluate the change in gene expression after PAO1 strain infection, gene expression analysis was performed using HumanHT-12 v4.0 expression bead arrays (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) according to the manufacturer's instructions ( 16-18 h at 58° C.; Illumina, Inc., San Diego, CA, USA). Data were processed using a robust multi-sequence analysis algorithm (performing background corrections, normalization steps, and probe-level summarization). The generated gene expression data were normalized to PBS-treated cells. To identify potential genes affected by PAO1 strain infection, mRNA expression analysis was performed at 0 and 8 hours post infection using microarray analysis of NHNE cells inoculated with PAO1 strain. Microarray analysis was performed by MacroGen Korea (Seoul, Korea) according to the standard technical manual (data accessible at NCBI GEO database, accession GSE109118).

5. Real-time PCR 및 RNA 준비5. Real-time PCR and RNA preparation

TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 8시간, 1일 및 2일 동안 PAO1 균주를 접종한 NHNE 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. cDNA는 Moloney murine 백혈병 바이러스 역전사 효소(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 무작위 헥사머 프라이머(PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA, USA)를 갖는 3 ㎍의 RNA로부터 합성되었다. TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Biosystems, Foster City, CA, USA)가 선택되었고, PCR 조건은 제조업체의 프로토콜에 따라 설정되었다. 12㎕의 총 반응 부피는 2㎕의 cDNA(역전사 혼합물), 최종 농도 800nM의 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 200nM의 TaqMan 혼성화 프로브를 함유하였다. Real-time PCR(rt-PCR) 프로브는 5 '말단에서 carboxyfluorescein(FAM)으로, 3'말단에서 소광제 carboxytetramethylrhodamine(TAMRA)으로 표지되었다.Total RNA was isolated from NHNE cells inoculated with PAO1 strain for 8 hours, 1 day and 2 days using TRIzol reagent (Invitrogen). cDNA was synthesized from 3 μg of RNA with random hexamer primers (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA, USA) using Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) was selected and PCR conditions were established according to the manufacturer's protocol. A total reaction volume of 12 μl contained 2 μl of cDNA (reverse transcription mixture), oligonucleotide primers at a final concentration of 800 nM and TaqMan hybridization probes at 200 nM. Real-time PCR (rt-PCR) probes were labeled with carboxyfluorescein (FAM) at the 5' end and carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) at the 3' end of the quencher.

인간 인터루킨-17C 및 LCN2에 대한 프라이머는 Applied Biosystems(Foster City, CA, USA)에서 구매하였다. PE Biosystems ABI PRISM^® 7700 서열 검출 시스템을 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 열 순환기 파라미터는 2분 동안 50℃ 및 10분 동안 95℃였고, 이어서 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 40회 사이클로 수행하였다. 인터루킨-17C, LCN2 및 GAPDH에 대한 표적-특이적 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 표적 mRNA 수준을 정량화 하였다. 모든 PCR 분석은 정량적이며 표준으로서 표적 유전자 서열을 함유하는 플라스미드를 사용하였다. 모든 프로브는 인트론에 걸치도록 설계되었으며 게놈 DNA와 반응하지 않았다. 모든 real-time PCR 데이터를 내인성 대조군으로서 하우스키핑 유전자(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH, 1 × 10⁶ 카피) 수준으로 정규화하여 샘플 사이의 변화를 교정하였다. 모든 반응을 3회 수행하였고, PCR에 사용되는 프라이머는 표 1에 나타내었다.Primers for human interleukin-17C and LCN2 were purchased from Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Real-time PCR was performed using a PE Biosystems ABI PRISM ^{® 7700 sequence detection system.} Thermal cycler parameters were 50° C. for 2 minutes and 95° C. for 10 minutes followed by 40 cycles of 95° C. for 15 seconds and 60° C. for 1 minute. Target mRNA levels were quantified using target-specific primers and probe sets for interleukin-17C, LCN2 and GAPDH. All PCR analyzes were quantitative and used a plasmid containing the target gene sequence as a standard. All probes were designed to span introns and did not react with genomic DNA. All real-time PCR data were normalized to the level of housekeeping gene (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH, 1×10 ⁶ copies) as an endogenous control to correct for changes between samples. All reactions were performed in triplicate, and the primers used for PCR are shown in Table 1.

6. 단백질 분리 및 웨스턴 블롯6. Protein Isolation and Western Blot

총 세포 용해물을 RIPA lysis buffer(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)에서 획득하였다. 세포 용해물(lane 당 25㎍, Thermo Fisher Scientific에서 구매한 BCA 단백질 분석기로 측정)을 10% SDS 겔에서 전기 영동하고 실온에서 1시간 동안 트리스-완충 염수(TBS; 50mM Tris-Cl, pH 7.5, 및 150 mM NaCl)의 polyvinylidene difluoride 막으로 옮겼다. 각 막을 4℃에서 트윈-트리스-완충 염수(Tween-tris-buffered saline, TTBS; TBS 중 0.5 % Tween-20)의 1차 항체와 함께 밤새 배양하였다. TTBS로 세척한 후, 각 블롯을 TTBS의 2차 항-토끼 또는 항-마우스 항체(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 발현은 강화된 화학 발광 시스템(Amersham, Little Chalfont, UK)을 사용하여 검출하였다.Total cell lysates were obtained in RIPA lysis buffer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). Cell lysates (25 μg per lane, measured with a BCA protein analyzer purchased from Thermo Fisher Scientific) were electrophoresed on a 10% SDS gel and stored in Tris-buffered saline (TBS; 50 mM Tris-Cl, pH 7.5; and 150 mM NaCl) onto a polyvinylidene difluoride membrane. Each membrane was incubated overnight with primary antibody in Tween-tris-buffered saline (TTBS; 0.5% Tween-20 in TBS) at 4°C. After washing with TTBS, each blot was incubated with a secondary anti-rabbit or anti-mouse antibody in TTBS (Cell Signaling, Beverly, MA, USA) for 1 hour at room temperature. Expression was detected using an enhanced chemiluminescence system (Amersham, Little Chalfont, UK).

7. 분비된 사이토카인 정량7. Quantification of secreted cytokines

분비된 인간 LCN2(DY1757)는 제조업체의 지침에 따라 R&D Systems의 DuoSet^® ELISA 키트를 사용하여 정량화되었다. LCN2를 정량 하기 위해, 세포 상층액을 수집 하였다. 분석의 범위는 78.1-5000 pg/㎖였다.Secreted human LCN2 (DY1757) was quantified using the ^{DuoSet ®} ELISA kit from R&D Systems according to the manufacturer's instructions. To quantify LCN2, the cell supernatant was collected. The range of the assay was 78.1-5000 pg/ml.

8. 철 격리(sequestration) 분석8. Iron sequestration analysis

Colorimetric iron assay kit(SideroTech assay kit, Emergen Bio Inc., Ireland)를 사용하여 무세포 배양 상층액에 대해 철 격리 분석을 수행하였다. 분석은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. 분석은 시약 복합체로부터 세포 상층액에 존재하는 사이드로포어(siderophore)의 제2 철 전달의 결과로서 발생하는 색 변화에 기초하였다. 핵심 시약은 염료, 철 및 세제의 복합체이다. 염료 복합체는 초기에 청색이지만, 철의 격리 시 염료는 샘플에 존재하는 사이드로포어의 양에 따라 자주색 또는 분홍색으로 변색된다. 테스트는 사이드로포어 검출을 위한 정성적 지표로 사용되거나 샘플에 존재하는 사이드포어의 수준을 측정하기 위한 정량 테스트로 사용될 수 있다. 사이드로포어가 없는 경우 반응 색은 파란색으로 유지된다. 각 웰의 광학 밀도(OD)를 630 nm로 설정된 마이크로 플레이트 판독기로 측정하였고, 결과는 샘플에서 사이드로포어의 상대적인 양으로 나타냈다.Iron sequestration assay was performed on cell-free culture supernatants using a Colorimetric iron assay kit (SideroTech assay kit, Emergen Bio Inc., Ireland). The analysis was performed according to the manufacturer's instructions. The analysis was based on the color change that occurred as a result of ferric transfer of the siderophore present in the cell supernatant from the reagent complex. The key reagents are complexes of dyes, iron and detergents. The dye complex is initially blue, but upon sequestration of iron the dye changes to purple or pink depending on the amount of sideropores present in the sample. The test can be used as a qualitative indicator for sidepore detection or as a quantitative test to measure the level of sidepores present in a sample. In the absence of siderophores, the reaction color remains blue. The optical density (OD) of each well was measured with a microplate reader set to 630 nm, and the results were expressed as the relative amount of sideropores in the sample.

9. 인터루킨-17 수용체 E(IL17RE) 및 인터루킨-17C short hairpin RNA(shRNA)로 세포 형질감염(transfection)9. Cell transfection with interleukin-17 receptor E (IL17RE) and interleukin-17C short hairpin RNA (shRNA)

IL17RE 및 인터루킨-17C의 내인성 발현을 억제하기 위해, IL17RE 및 인터루킨-17C shRNA(렌티 바이러스 입자)를 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)로부터 구입하였다. 유전자-특이적 shRNA에 대한 형질 감염 속도는 NHNE 세포에서 70% 보다 큰 것으로 확인되었다. 제조업자의 지시에 따라 올리고 펙타민 시약(Invitrogen)을 사용하여 각 shRNA로 세포를 형질 감염시켰다. shRNA(10 ㎕, 1 × 10⁴ 바이러스 감염 단위) 및 올리고 펙타민(1 ㎍)을 배양 배지와 개별적으로 혼합시켰다. 12-웰 NHNE 세포 배양기에서 48시간 동안 형질 감염을 수행하였다. 이 과정은 세포 생존력에 영향을 미치지 않았다. 형질 감염 48시간 후, 세포를 PAO1 균주를 접종하였다. 이 과정은 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입한 대조군 shRNA로 반복되었다. shRNA를 사용하여 IL17RE 및 인터루킨-17C의 내인성 발현을 부분적으로 억제시켰다. 내인성 유전자 발현의 억제는 real-time PCR에 의해 확인되었다.To inhibit endogenous expression of IL17RE and interleukin-17C, IL17RE and interleukin-17C shRNA (lentiviral particles) were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). The transfection rate for gene-specific shRNA was found to be greater than 70% in NHNE cells. Cells were transfected with each shRNA using oligofectamine reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. shRNA (10 μl, 1×10 ⁴ virus infection units) and oligofectamine (1 μg) were individually mixed with the culture medium. Transfection was performed for 48 h in a 12-well NHNE cell incubator. This process did not affect cell viability. 48 hours after transfection, cells were inoculated with PAO1 strain. This process was repeated with control shRNA purchased from Santa Cruz Biotechnology. The endogenous expression of IL17RE and interleukin-17C was partially suppressed using shRNA. Inhibition of endogenous gene expression was confirmed by real-time PCR.

10. 통계 분석10. Statistical Analysis

각 피험자로부터 제공된 비강 점막으로 배양된 NHNE 세포로 3회 이상의 독립적인 실험을 수행하였고, 데이터는 5개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현하였다. Mann-Whitney U test로 그룹을 비교하고 post hoc test를 통한 분산 분석(ANOVA)으로 처리 그룹 간의 차이를 평가하였다. p-value of <0.05 은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism software(version 5; GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)로 수행되었다.Three or more independent experiments were performed with NHNE cells cultured with nasal mucosa provided from each subject, and data were expressed as mean±standard deviation (SD) of 5 independent experiments. Groups were compared by Mann-Whitney U test, and differences between treatment groups were evaluated by analysis of variance (ANOVA) via post hoc test. A p-value of <0.05 was considered statistically significant. All statistical analyzes were performed with GraphPad Prism software (version 5; GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

결과result

1. 녹농균 감염 후 NHNE 세포에서 인터루킨-17C 유도1. Interleukin-17C induction in NHNE cells after P. aeruginosa infection

녹농균에 대한 감수성을 평가하기 위해 5명의 정상 피험자의 비강 점막을 이용하여 배양된 NHNE 세포를 준비하였다. NHNE 세포를 0.25의 MOI에서 PAO1 균주를 감염시켰다. 감염 후 0, 2, 4, 6, 8 및 24시간에 세포 용해물 및 상층액을 수확하였다. 그런 다음 real-time PCR을 사용하여 PAO1 균주 유전자(PA4834)의 mRNA의 발현 수준을 측정하였다. PA4834 mRNA가 감염 8시간 후에 현저히 증가하였고 24시간 후에 가장 높은 발현이 관찰됨을 발견하였다(도 1A). PAO1 균주의 콜로니 수도 감염 24시간 후에 현저히 증가하였다. 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM) 이미지는 감염 8시간 후에 NHNE 세포에서 PAO1 균주에 대한 감수성을 증명하는 추가 정보를 제공하였다(도 1B, 1C). 또한, PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포는 감염 후 24시간까지 정상 범위의 transepithelial electric resistance(TEER) 값을 나타냈다(도 2). 이러한 결과는 PAO1 균주 감염이 감염 후 24시간까지 세포 생존에 영향을 미치지 않으며 PAO1(MOI 0.25)의 농도는 NHNE 세포의 조직학적 특징을 보존하기에 적합할 것이라는 것을 알 수 있다.To evaluate the susceptibility to P. aeruginosa, cultured NHNE cells were prepared using the nasal mucosa of 5 normal subjects. NHNE cells were infected with the PAO1 strain at an MOI of 0.25. Cell lysates and supernatants were harvested at 0, 2, 4, 6, 8 and 24 hours post infection. Then, the mRNA expression level of the PAO1 strain gene (PA4834) was measured using real-time PCR. It was found that PA4834 mRNA was significantly increased after 8 hours of infection and the highest expression was observed after 24 hours ( FIG. 1A ). The number of colonies of the PAO1 strain also increased significantly 24 hours after infection. Scanning electron microscope (SEM) images provided additional information demonstrating susceptibility to PAO1 strains in NHNE cells 8 h after infection (Figs. 1B, 1C). In addition, NHNE cells infected with the PAO1 strain showed transepithelial electric resistance (TEER) values in the normal range up to 24 hours after infection ( FIG. 2 ). These results suggest that PAO1 strain infection did not affect cell viability until 24 h after infection and that the concentration of PAO1 (MOI 0.25) would be suitable for preserving the histological characteristics of NHNE cells.

PAO1 균주 감염 후 8시간에 NHNE 세포에서 전반적인 유전자 발현의 변화를 정량화하기 위해 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 마이크로어레이 데이터는 PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포에서 8시간 후에 259개의 유전자에서 현저하게 변화된 발현(4배 이상)을 나타내었다. 이 중 76개의 유전자가 외부 병원체에 대한 면역 기능 및/또는 세포 방어에 관여하였다(도 3A). 계층적 군집화는 인터루킨-17C가 감염 8시간 후에 34.69배로 상향 조절되었으며 실제로 인터루킨-17C는 이 시점에서 두 번째로 가장 많이 유도된 유전자라는 것을 보여주었다(도 3B). 분석 결과, 인터루킨-17의 다른 하위 유형(IL-17A, IL-17B, IL-17D 또는 IL-17E)은 PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포에서 상향 조절되지 않은 것으로 나타났다.Microarray analysis was performed to quantify changes in overall gene expression in NHNE cells 8 hours after PAO1 strain infection. Microarray data showed markedly altered expression (over 4-fold) in 259 genes after 8 h in NHNE cells infected with PAO1 strain. Of these, 76 genes were involved in immune function and/or cellular defense against foreign pathogens (FIG. 3A). Hierarchical clustering showed that interleukin-17C was up-regulated 34.69-fold after 8 h of infection and indeed interleukin-17C was the second most induced gene at this time point (Fig. 3B). The analysis showed that other subtypes of interleukin-17 (IL-17A, IL-17B, IL-17D or IL-17E) were not upregulated in NHNE cells infected with the PAO1 strain.

다음 단계로, 본 발명자들은 PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포에서 인터루킨-17C의 유전자 발현 및 분비된 단백질 수준을 분석하였다. Real-time PCR 결과는 인터루킨-17C mRNA의 발현 수준이 감염 후 8시간(4.3 × 10⁴ ± 3.6 × 10³)과 24시간(1.04 × 10⁵ ± 8.2 × 10³) 사이에서 유의하게 상승함을 보여 주었다(도 3C). PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포의 상층액에서 분비된 인터루킨-17C의 수준을 정량하기 위해 ELISA를 수행하였고, 결과는 분비된 인터루킨-17C 단백질의 농도가 감염 후 24시간까지 증가함을 보여주었다(9.97 × 10³ pg/㎖, 도 3D).Next, we analyzed the gene expression and secreted protein levels of interleukin-17C in NHNE cells infected with the PAO1 strain. Real-time PCR results showed that the expression level of interleukin-17C mRNA significantly increased between ^{8 hours (4.3 × 10 4} ± 3.6 × 10 ³ ) and 24 hours (1.04 × 10 ⁵ ± 8.2 × 10 ^{3 ) after infection.} showed (Fig. 3C). ELISA was performed to quantify the level of secreted interleukin-17C in the supernatant of NHNE cells infected with the PAO1 strain, and the results showed that the concentration of secreted interleukin-17C protein increased up to 24 hours after infection (9.97 × 10). 10 ³ pg/ml, FIG. 3D).

NHNE 세포를 IL-17RE 및 인터루킨-17C shRNA로 형질 감염시켜 PAO1 균주 감염 전에 인터루킨-17C 특이 수용체인 IL-17RE를 통한 신호 전달을 억제하거나 인터루킨-17C의 내인성 발현을 억제하였다. 대조군 shRNA로 형질 감염된 세포와 비교하여, shRNA 형질 감염 후 내인성 인터루킨-17C 발현은 72% 감소하고 내인성 IL17RE 발현은 81% 감소되었다. 상기 준비된 NHNE 세포에 PAO1 균주 감염 후 24시간째 세포 용해물 및 상층액을 수확하였다. 각 세포에서 PAO1 균주를 감염시켜 PAO1 균주의 콜로니 수를 측정하였을 때 NHNE 세포(2.8 × 10⁴ CFU/㎖) 또는 대조군 shRNA(1.62 × 10⁴ ± 2.1 × 10³ CFU/㎖)로 형질 감염된 세포보다 IL17RE shRNA(12.10 × 10⁷ ± 5.8 × 10⁶ CFU/㎖) 또는 IL-17C shRNA(20.80 × 10⁷ ± 4.4 × 10⁶ CFU/㎖)로 형질 감염된 세포에서 PAO1 균주의 콜로니 수가 유의하게 더 높았다(도 3E). 이러한 결과는 NHNE 세포가 녹농균 감염 후 8시간 이내에 반응한다는 것을 입증한다. 인터루킨-17 서브타입(subtypes) 중에서도 인터루킨-17C는 비강 상피에서 우선적으로 발현이 상승하고 인터루킨-17C의 내인성 억제는 NHNE 세포에서 심각한 녹농균 감염을 초래할 수 있다는 것을 알 수 있다.NHNE cells were transfected with IL-17RE and interleukin-17C shRNA to inhibit signal transduction through IL-17RE, an interleukin-17C-specific receptor, or to inhibit endogenous expression of interleukin-17C prior to infection with the PAO1 strain. Compared with cells transfected with control shRNA, endogenous interleukin-17C expression was reduced by 72% and endogenous IL17RE expression by 81% after shRNA transfection. The prepared NHNE cells were harvested 24 hours after infection with the PAO1 strain, the cell lysate and the supernatant. When the number of colonies of the PAO1 strain was measured by infecting the PAO1 strain in each cell, it was higher than the cells transfected with NHNE cells (2.8 × 10 ⁴ CFU/ml) or control shRNA (1.62 × 10 ⁴ ± 2.1 × 10 ³ CFU/ml). The colony number of the PAO1 strain was significantly higher in cells transfected with IL17RE shRNA (12.10 × 10 ⁷ ± 5.8 × 10 ⁶ CFU/ml) or IL-17C shRNA (20.80 × 10 ⁷ ± 4.4 × 10 ^{6 CFU/ml) (} Figure 3E). These results demonstrate that NHNE cells respond within 8 hours after P. aeruginosa infection. Among the interleukin-17 subtypes, interleukin-17C is preferentially upregulated in the nasal epithelium, and it can be seen that endogenous inhibition of interleukin-17C can lead to severe P. aeruginosa infection in NHNE cells.

2. 인터루킨-17C를 이용한 외인성 처리의 비강 상피에서 녹농균의 제거에의 기여2. Contribution of exogenous treatment with interleukin-17C to the clearance of P. aeruginosa from the nasal epithelium

NHNE 세포에 처리하기 위한 인간 재조합 IL-17C(rhIL-17C)의 적절한 농도를 평가하기 위해, Thermo Fisher(Scientific, Wilmington, DE, USA)에서 구입한 Vybrant^® MTT cell proliferation assay kit를 사용하여 세포 독성을 분석하였다. 제조업체의 지침에 따라 NHNE 세포를 재구성 완충제(0.1% bovine 혈청 알부민을 함유하는 멸균 4mM HCl)에서 rhIL-17C와 함께 배양하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 상대 세포 생존율은 rhIL-17C의 농도 100 ng/㎖에서 83.66 ± 4.70 %, 200 ng/㎖에서 62.78 ± 5.14 % 인 것으로 나타났다. 따라서, NHNE 세포에서 PAO1에 대한 rhIL-17C의 치료적 농도로서 100ng/㎖를 사용하였다.To evaluate the appropriate concentration of human recombinant IL-17C (rhIL-17C) for treatment in NHNE cells, cytotoxicity was performed using the ^{Vybrant ® MTT cell proliferation assay kit purchased from Thermo Fisher (Scientific, Wilmington, DE, USA).} was analyzed. NHNE cells were incubated with rhIL-17C in reconstitution buffer (sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin) according to the manufacturer's instructions. As can be seen in FIG. 4 , the relative cell viability was 83.66 ± 4.70% at a concentration of rhIL-17C of 100 ng/ml and 62.78 ± 5.14% at 200 ng/ml. Therefore, 100 ng/ml was used as the therapeutic concentration of rhIL-17C for PAO1 in NHNE cells.

인터루킨-17C의 직접적인 항녹농균 효과를 입증하기 위해, NHNE 세포에 PAO1 균주 감염 8시간 전 및 감염과 동시에 rhIL-17C를 처리하였다. 획득한 상층액을 PAO1 균주의 콜로니 수 측정으로 위해 LB 한천 플레이트에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다(도 5A). 이어서, PAO1 균주의 콜로니 수를 rhIL-17C 처리하지 않은 NHNE 세포의 경우와 비교하였다. rhIL-17C 처리하지 않은 NHNE 세포의 PAO1 균주의 콜로니 수는 2.8 × 10³ ± 4.6 × 10² CFU/㎖(8 시간), 3.3 × 10⁶ ± 5.3 × 10⁵ CFU/㎖(24 시간), 및 1.5 × 10⁶ ± 2.4 × 10⁴ CFU/㎖(48시간)였다. PAO1 균주 감염과 동시에 100 ng/㎖ 농도의 rhIL-17C를 처리한 경우에는 유의하게 감소되지 않았지만, 감염 48시간 후에 약간 감소하였다(감염 후 8시간, 2.5 × 10³ ± 8.1 × 10² CFU/㎖; 24시간, 2.2 × 10⁶ ± 6.9 × 10⁵ CFU/㎖; 48시간, 5.9 × 10⁵ ± 1.1 × 10⁴ CFU/㎖)(도 5B, 5C 및 5D). 그러나 PAO1 균주 감염 8시간 전에 100 ng/㎖ 농도의 rhIL-17C로 처리한 경우에는 감염 후 48시간까지 PAO1 균주의 콜로니 수가 확연히 감소하였다(감염 후 8시간, 1.01 × 10² ± 0.24 × 10² CFU/㎖; 24시간, 7.1 × 10³ ± 4.1 × 10³ CFU/㎖; 48 시간, 1.6 × 10² ± 1.2 × 10² CFU/㎖)(도 5B, 5C 및 5D).To demonstrate the direct antibacterial effect of interleukin-17C, NHNE cells were treated with rhIL-17C 8 hours before and simultaneously with PAO1 strain infection. The obtained supernatant was plated on an LB agar plate to measure the number of colonies of the PAO1 strain and incubated at 37° C. for 24 hours ( FIG. 5A ). Then, the number of colonies of the PAO1 strain was compared with that of NHNE cells not treated with rhIL-17C. The colony number of the PAO1 strain of NHNE cells not treated with rhIL-17C was 2.8 × 10 ³ ± 4.6 × 10 ² CFU/mL (8 hours), 3.3 × 10 ⁶ ± 5.3 × 10 ⁵ CFU/mL (24 hours), and 1.5 × 10 ⁶ ± 2.4 × 10 ⁴ CFU/ml (48 hours). It was not significantly reduced when treated with rhIL-17C at a concentration of 100 ng/ml at the same time as PAO1 strain infection, but slightly decreased after 48 hours of infection (8 hours after infection, 2.5 × 10 ³ ± 8.1 × 10 ² CFU/mL ; 24 hours, 2.2 × 10 ⁶ ± 6.9 × 10 ⁵ CFU/mL; 48 hours, 5.9 × 10 ⁵ ± 1.1 × 10 ⁴ CFU/mL) ( FIGS. 5B, 5C and 5D ). However, when the PAO1 strain was treated with rhIL-17C at a concentration of 100 ng/ml 8 hours before infection, the number of colonies of the PAO1 strain was significantly reduced until 48 hours after infection (8 hours after infection, 1.01 × 10 ² ± 0.24 × 10 ² CFU) /mL; 24 hours, 7.1 × 10 ³ ± 4.1 × 10 ³ CFU/mL; 48 hours, 1.6 × 10 ² ± 1.2 × 10 ² CFU/mL) (Figures 5B, 5C and 5D).

다음 단계로서, rhIL-17C(100ng/㎖)로 24시간 동안 처리된 NHNE 세포로부터 200㎕의 상층액을 얻었다. 상층액을 100 ㎕의 PAO1 균주 배양배지에 직접 첨가하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, PAO1 균주의 콜로니의 수를 측정하였다. 결과는 rhIL-17C가 처리된 NHNE 세포의 상층액에 노출된 후의 콜로니 수(6.7 × 10⁴ ± 3.3 × 10³ CFU/㎖)가 rhIL-17C를 처리하지 않은 NHNE 세포의 상층액에 노출된 후의 콜로니 수와 비교하여 유의하게 감소된 것을 보여주었다(4.9 × 10⁶ ± 7.3 × 10⁵ CFU/㎖). 양성 대조군(LB 배지) 및 음성 대조군(PBS)은 각각 1.4 × 10⁷ ± 3.2 × 10⁶ CFU/㎖ 및 1.9 × 10³ ± 2.2 × 10² CFU/㎖의 콜로니 수를 나타냈다(도 5E). 이러한 결과는 rhIL-17C의 NHNE 세포에의 외인성 처리(또는 rhIL-17C를 처리한 NHNE 세포의 상층액)는 비강 상피에서 녹농균의 성장을 억제하고 인터루킨-17C는 녹농균 감염에 대한 억제 반응을 유도한다는 것을 알 수 있다.As a next step, 200 μl of supernatant was obtained from NHNE cells treated with rhIL-17C (100 ng/ml) for 24 hours. The supernatant was directly added to 100 μl of the culture medium of the PAO1 strain and cultured at 37° C. for 24 hours, and then the number of colonies of the PAO1 strain was measured. The results show that the number of colonies (6.7 × 10 ⁴ ± 3.3 × 10 ³ CFU/ml) after exposure to the supernatant of rhIL-17C-treated NHNE cells was determined after exposure to the supernatant of NHNE cells not treated with rhIL-17C. It showed a significant decrease compared to the number of colonies (4.9 × 10 ⁶ ± 7.3 × 10 ⁵ CFU/ml). The positive control (LB medium) and negative control (PBS) ^{showed colony numbers of 1.4 × 10 7} ± 3.2 × 10 ⁶ CFU/ml and 1.9 × 10 ³ ± 2.2 × 10 ² CFU/ml, respectively (FIG. 5E). These results indicate that exogenous treatment of rhIL-17C to NHNE cells (or supernatant of rhIL-17C-treated NHNE cells) inhibits the growth of P. aeruginosa in the nasal epithelium, and that interleukin-17C induces an inhibitory response to P. aeruginosa infection. it can be seen that

3. 인터루킨-17C의 PAO1 균주에 감염된 비강 상피에서 LCN2 발현 유도 및 녹농균에 의한 철 격리 억제 효과3. Induction of LCN2 expression in nasal epithelium infected with PAO1 strain of interleukin-17C and inhibition of iron sequestration by Pseudomonas aeruginosa

PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포의 상층액에서 인터루킨-17C의 항녹농균 활성 이후의 메커니즘을 평가하였다. 숙주 즉, 인체 또는 동물로부터의 철분 획득은 녹농균을 포함한 박테리아의 생존에 필수적이고, 녹농균에서 철분 획득력의 억제는 항녹농균 효과를 중재하기 때문에 비강 상피의 PAO1 균주 감염 후 철분 농도와 인터루킨-17C의 발현 유도 사이의 관계에 중점을 두었다.The mechanism after the anti-P. aeruginosa activity of interleukin-17C in the supernatant of NHNE cells infected with the PAO1 strain was evaluated. Since iron acquisition from the host, i.e., human or animal, is essential for the survival of bacteria including P. aeruginosa, and inhibition of iron acquisition ability in P. aeruginosa mediates the antibacterial effect, iron concentration and interleukin-17C levels after infection with PAO1 strain in the nasal epithelium Emphasis was placed on the relationship between expression induction.

먼저, PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포에서 녹농균의 사이드로포어 억제제로서 작용하는 LCN2의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, 감염 8시간 후 LCN2 mRNA의 발현 수준이 유의하게 증가하였고 LCN2 mRNA의 발현 수준은 PAO1 균주를 감염시켰을 때 100 ng/㎖ 농도의 rhIL-17C가 처리된 NHNE 세포 (감염 후 8시간, 9.8 × 10⁴; 24시간,1.6 × 10⁵)에서 rhIL-17C가 처리되지 않은 NHNE 세포보다(감염 후 8 시간, 3.2 × 10⁴; 24시간, 4.2 × 10⁴) 유의하게 더 증가함을 보여 주었다(도 6A). 또한 감염 후 24 시간까지 rhIL-17C가 처리된 NHNE 세포에서 PAO1 균주 감염 후 LCN2 단백질 발현 수준이 더 높음을 보여 주었다(도 6B).First, the expression level of LCN2 acting as a sideropore inhibitor of P. aeruginosa in NHNE cells infected with the PAO1 strain was measured. As a result, the expression level of LCN2 mRNA was significantly increased 8 hours after infection, and the expression level of LCN2 mRNA was NHNE cells treated with rhIL-17C at a concentration of 100 ng/mL when the PAO1 strain was infected (8 hours after infection, 9.8 hours). × 10 ⁴ ; 24 hours, 1.6 × 10 ⁵ ) showed a significantly higher increase in rhIL-17C than untreated NHNE cells (8 hours post infection, 3.2 × 10 ⁴ ; 24 hours, 4.2 × 10 ^{4 )} (Fig. 6A). It also showed that LCN2 protein expression level was higher after PAO1 strain infection in rhIL-17C-treated NHNE cells up to 24 hours post-infection (Fig. 6B).

rhIL-17C의 처리에 따른 NHNE 세포에서 PAO1 균주의 사이드로포어 활성을 비교하기 위해 SideroTech assay kit를 이용하여 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행하였다. PAO1 균주의 철분 획득 능력은 어떠한 처리도 하지 않은 PAO1 균주에 감염된 NHNE 세포에서의 사이드로포어 활성을 기준으로 정규화되었다. 이어서, rhIL-17C 처리에 따른 PAO1 균주의 사이드로포어 활성을 측정하였다. 결과는 PAO1 균주의 사이드로포어 활성도가 rhIL-17C를 처리하지 않은 NHNE 세포(감염 후 8시간, 204.8 %; 24시간, 302.5 %)보다 100 ng/㎖ 농도의 rhIL-17C로 8시간(기저 기준 98.1 %) 및 4시간(기저 기준 38.4 %)동안 처리된 NHNE 세포의 상층액에서 현저하게 감소됨을 보여주었다(도 6C).In order to compare the sideropore activity of the PAO1 strain in NHNE cells following the treatment of rhIL-17C, the assay was performed according to the manufacturer's instructions using the SideroTech assay kit. The iron acquisition ability of the PAO1 strain was normalized based on the siderophore activity in NHNE cells infected with the PAO1 strain without any treatment. Next, the siderophore activity of the PAO1 strain following rhIL-17C treatment was measured. The results showed that the siderophore activity of the PAO1 strain was higher than that of NHNE cells not treated with rhIL-17C (8 hours after infection, 204.8%; 24 hours, 302.5%) with rhIL-17C at a concentration of 100 ng/ml for 8 hours (basal basis). 98.1%) and the supernatant of NHNE cells treated for 4 hours (basal basis 38.4%) showed a significant decrease ( FIG. 6C ).

PAO1 균주의 사이드로포어 활성은 대조군 shRNA로 형질 감염된 NHNE 세포(기저에 비해 112.4%)와 비교하여 IL17RE(기저 기준 278.4 %) 또는 인터루킨-17C shRNA(기저 기준 285.4 %)로 형질 감염된(인터루킨-17C NHNE 세포에서 증가되었다(도 6D). 흥미롭게도, LCN2 mRNA의 발현 수준은 rhIL-17C가 처리된 NHNE 세포에서 유의하게 더 높았고(평균값 : 2.8 × 10⁵), IL17RE shRNA로 형질 감염된 NHNE 세포에서 LCN2 mRNA의 발현 증가는 관찰되지 않았다(평균값 : 8.4 × 10⁴)(도 6E).The siderophore activity of the PAO1 strain was compared with NHNE cells transfected with control shRNA (112.4% relative to basal) compared with IL17RE (278.4% basal basis) or interleukin-17C shRNA (285.4% basal basis) transfected (interleukin-17C). was increased in NHNE cells (Fig. 6D) Interestingly, the expression level of LCN2 mRNA was significantly higher in NHNE cells treated with rhIL-17C (mean value: 2.8 × 10 ⁵ ), and LCN2 in NHNE cells transfected with IL17RE shRNA. No increase in mRNA expression was observed (mean value: 8.4 × 10 ⁴ ) ( FIG. 6E ).

이러한 결과는 인터루킨-17C가 비강 상피에서 녹농균의 사이드로포어 활성의 감소를 나타내고 인터루킨-17C의 외인성 처리는 PAO1 균주에 감염된 비강 상피에서 녹농균의 사이드로포어 억제 작용을 하는 LCN2의 발현을 증가 시킬 수 있음을 증명하였다. 이를 통해 인터루킨-17C은 직접적으로 또는 LCN2의 발현을 증가시켜 항녹농균 효과를 유도한다는 것을 알 수 있다.These results indicate that interleukin-17C decreases the sideropore activity of P. aeruginosa in the nasal epithelium, and exogenous treatment of interleukin-17C can increase the expression of LCN2, which acts as a sideropore inhibitor of P. aeruginosa in the nasal epithelium infected with the PAO1 strain. proved that there is From this, it can be seen that interleukin-17C induces an anti-P. aeruginosa effect either directly or by increasing the expression of LCN2.

<110> GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infection <130> 19OP12012PCT <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr Cys 1 5 10 15 Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly 20 25 30 Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val 50 55 60 Ala Leu Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu 65 70 75 80 Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val 85 90 95 Leu Glu Ala Asp Thr His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg 100 105 110 Val Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu 115 120 125 Cys Leu Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg 145 150 155 160 Arg Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe 165 170 175 Ala Phe His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val 180 185 190 Leu Pro Arg Ser Val 195 <210> 2 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PA4834 primer_F <400> 2 mtgtwhtcah hdsrghhshg thcysagaha rgakwgavav ssaashrgrh rsattcvrva 60 dthrsswryr vdtddrykaa ccrgcdartg rtaansvrll qsllvlrrrp csrdgsglpt 120 pgafafhtef ihvpvgctcv lprsv 145 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PA4834 primer_R <400> 3 gcttccttga ccagggcgtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_F <400> 4 tgggctacac tgagcaccag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_R <400> 5 gggtgtcgct gttgaagtca 20 <110> GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infection <130> 19OP12012PCT <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr Cys 1 5 10 15 Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly 20 25 30 Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val 50 55 60 Ala Leu Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu 65 70 75 80 Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val 85 90 95 Leu Glu Ala Asp Thr His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg 100 105 110 Val Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu 115 120 125 Cys Leu Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg 145 150 155 160 Arg Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe 165 170 175 Ala Phe His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val 180 185 190 Leu Pro Arg Ser Val 195 <210> 2 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PA4834 primer_F <400> 2 mtgtwhtcah hdsrghhshg thcysagaha rgakwgavav ssaashrgrh rsattcvrva 60 dthrsswryr vdtddrykaa ccrgcdartg rtaansvrll qsllvlrrrp csrdgsglpt 120 pgafafhtef ihvpvgctcv lprsv 145 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PA4834 primer_R <400> 3 gcttccttga ccagggcgtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_F <400> 4 tgggctacac tgagcaccag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_R <400> 5 gggtgtcgct gttgaagtca 20

Claims

인터루킨-17C(Interleukin-17C); 또는 인터루킨-17C로 처리된 세포를 포함하는 박테리아 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.Interleukin-17C; Or a pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infection comprising cells treated with interleukin-17C.

청구항 1에 있어서, 상기 세포는 비강 상피세포인, 조성물.The composition of claim 1 , wherein the cells are nasal epithelial cells.

청구항 1에 있어서, 상기 세포는 상기 세포 배양액의 상층액에 포함된 것인, 조성물.The composition of claim 1, wherein the cells are contained in the supernatant of the cell culture solution.

청구항 1에 있어서, 상기 박테리아는 녹농균인, 조성물. The composition of claim 1, wherein the bacterium is Pseudomonas aeruginosa.

청구항 1에 있어서, 상기 감염증은 만성 폐쇄성 폐질환, 축농증, 낭포성 섬유증, 중이염, 각막염, 내안구염, 균혈증, 화상 상처 감염, 폐렴, 뇌막염, 요로염, 복막염 또는 패혈증을 포함하는, 조성물.The composition of claim 1, wherein the infectious disease includes chronic obstructive pulmonary disease, sinusitis, cystic fibrosis, otitis media, keratitis, endophthalmitis, bacteremia, burn wound infection, pneumonia, meningitis, urethritis, peritonitis or sepsis.

인터루킨-17C(Interleukin-17C); 또는 상기 인터루킨-17C를 처리한 세포를 포함하는 항균용 조성물.Interleukin-17C; Or an antibacterial composition comprising the cells treated with the interleukin-17C.

청구항 6에 있어서, 상기 균은 녹농균인, 조성물. The composition of claim 6, wherein the bacteria is Pseudomonas aeruginosa.