KR20210085759A - Lactic acid fermented powder having probiotic activity and antimicrobial activity, method of manufacturing the same and use of the same - Google Patents

Lactic acid fermented powder having probiotic activity and antimicrobial activity, method of manufacturing the same and use of the same Download PDF

Info

Publication number
KR20210085759A
KR20210085759A KR1020190179170A KR20190179170A KR20210085759A KR 20210085759 A KR20210085759 A KR 20210085759A KR 1020190179170 A KR1020190179170 A KR 1020190179170A KR 20190179170 A KR20190179170 A KR 20190179170A KR 20210085759 A KR20210085759 A KR 20210085759A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lactic acid
strain
acid bacteria
prometabolite
antibacterial activity
Prior art date
Application number
KR1020190179170A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
오덕환
쎌리아 라마찬드란
이정근
김중학
강수진
임석희
남동훈
Original Assignee
강원대학교산학협력단
주식회사 이롬
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 강원대학교산학협력단, 주식회사 이롬 filed Critical 강원대학교산학협력단
Priority to KR1020190179170A priority Critical patent/KR20210085759A/en
Publication of KR20210085759A publication Critical patent/KR20210085759A/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/40—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by drying or kilning; Subsequent reconstitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/51—Concentration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
    • A23P10/00—Shaping or working of foodstuffs characterised by the products
    • A23P10/20—Agglomerating; Granulating; Tabletting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The present invention relates to lactic acid fermented powder obtained by powdering the fermented liquid of Pediococcus acidilactici, which is a lactic acid having antibacterial activity, a manufacturing method thereof, and a composition including the same.

Description

항균활성을 갖는 유산균 발효분말, 그의 제조방법 및 그의 용도{Lactic acid fermented powder having probiotic activity and antimicrobial activity, method of manufacturing the same and use of the same}Lactic acid fermented powder having antibacterial activity, its manufacturing method, and its use {Lactic acid fermented powder having probiotic activity and antimicrobial activity, method of manufacturing the same and use of the same}

본 발명은 항균활성을 갖는 유산균 발효분말, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항균활성을 갖는 유산균인 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)의 발효액을 분말화한 유산균 발효분말, 그의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a fermented lactic acid bacterium powder having antibacterial activity, a method for producing the same, and a use thereof, and more particularly, to a lactic acid bacterium having an antibacterial activity, Pediococcus acidilactici ) to a powdered lactic acid bacteria fermentation broth, a method for producing the same, and a composition comprising the same.

유산균은 주로 장내 서식하면서 장내 미생물 생육조절 및 면역력 향상에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 건강한 생활양식에 도움이 될 뿐만 아니라, 항생제와는 다른 방식의 항균 기작으로 염증성 장 질환 혹은 자극성 장질환을 유발하는 항생제 내성을 가진 병원균을 효과적으로 제어하는 것으로 알려져 있다.Lactobacillus is known to play an important role in regulating the growth of intestinal microbes and improving immunity while mainly inhabiting the intestine. It is known to effectively control pathogens with antibiotic resistance.

모유(breast milk)는 신생아의 적절한 발달을 위해 필수적인 요소이며, 심바이오틱(symbioitc) 물질과 영양소가 복합적으로 함유되어 있는 매우 중요한 영양 공급원으로, 최근 모유 내 미생물이 신생아의 면역체계와 건강에 매우 밀접한 관계를 형성하고 있는 것으로 알려져 있다.Breast milk is an essential element for the proper development of newborns, and is a very important nutritional source that contains complex symbioitc substances and nutrients. Recently, microorganisms in breast milk are very important for the immune system and health of newborns. They are known to have a close relationship.

최근의 연구에서 모유는 신생아의 장내 서식하는 병원성균에 대해 다양한 방어기작을 통하여 감염 발생률이 훨씬 낮게 나타나는 것으로 보고되었다(비특허문헌 1).In a recent study, it has been reported that breast milk has a much lower rate of infection through various defense mechanisms against pathogenic bacteria that inhabit the intestines of newborns (Non-Patent Document 1).

한편, 페디오코커스(Pediococcus) 속 균주에 관한 특허문헌으로는 청국장으로부터 분리한 오르니틴 생산력이 우수한 페디오코커스 에시디락티시 균주(특허문헌 1), 가금 티푸스 감염에 저해활성이 있는 페디오코커스 아시딜락티시 PA GS 변이균주(특허문헌 2), 막걸리로부터 분리된 알코올 내성 페디오코커스 에시디락티시 균주(특허문헌 3) 등이 개시되어 있다.On the other hand, as a patent document on the Pediococcus sp. strain, Pediococcus acidi lactisi strain (Patent Document 1) with excellent ornithine-producing ability isolated from cheonggukjang, Pediococcus having inhibitory activity against poultry typhus infection Acidyl lactisi PA GS mutant strain (Patent Document 2), alcohol-resistant Pediococcus acidi lactisi strain isolated from makgeolli (Patent Document 3), and the like are disclosed.

그러나, 모유로부터 분리한 프로바이오틱 활성 및 항균활성을 갖는 페디오코커스 애시디락티시 균주의 발효액을 분말화한 유산균 발효분말에 대해서는 아직 알려져 있지 않은 실정이다. However, the lactic acid bacteria fermented powder obtained by powdering the fermented liquid of Pediococcus acidilactici strain having probiotic and antibacterial activity isolated from breast milk is not yet known.

대한민국 공개특허공보 제10-2014-0108359호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2014-0108359 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0122380호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2013-0122380 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0063253호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2013-0063253

JAMA Pediatr. 2017;171:647 (2017) JAMA Pediatr. 2017;171:647 (2017)

본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 지속적인 연구를 통하여, 항균활성이 우수한 프로바이오틱스 균주를 규명하고, 프로바이오틱스가 생산하는 항균활성 물질인 프로메타볼라이트 원료의 대량생산을 통하여 위건강 기능의 식품소재를 개발하며, 식품소재를 이용하여 위건강 컨셉의 식사대용 생식제품을 개발할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have identified a probiotic strain with excellent antibacterial activity through continuous research to solve the problems of the prior art as described above, and gastric health function through mass production of prometabolite raw material, an antibacterial active material produced by probiotics of food materials, and found that it is possible to develop a meal replacement product of the concept of stomach health by using the food materials, and completed the present invention.

따라서, 본 발명의 목적은 항균활성을 갖는 유산균 발효분말을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a fermented lactic acid bacterium powder having antibacterial activity.

본 발명의 다른 목적은 항균활성을 갖는 유산균 발효분말의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing lactic acid bacteria fermented powder having antibacterial activity.

본 발명의 또 다른 목적은 항균활성을 갖는 유산균 발효분말의 용도를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide the use of lactic acid bacteria fermented powder having antibacterial activity.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 항균활성을 갖는 유산균인 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)의 발효액을 분말화한 유산균 발효분말을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a lactic acid fermented powder obtained by powdering a fermented liquid of Pediococcus acidilactici, a lactic acid bacterium having antibacterial activity.

또한, 본 발명은 (a) 항균활성을 갖는 유산균인 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 전배양하는 단계, (b) 상기 전배양한 페디오코커스 애시디락티시 균주를 배양 배지에 접종하여 발효시키는 단계, 및 (c) 상기 (b) 단계에서 얻은 발효액을 농축한 후, 건조시켜 분말화하는 단계를 포함하는 유산균 발효분말의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of (a) pre-culturing Pediococcus acidilactici, a lactic acid bacterium having antibacterial activity, (b) adding the pre-cultured Pediococcus acidilactici strain to a culture medium. It provides a method for producing lactic acid bacteria fermented powder comprising the step of inoculating and fermenting, and (c) concentrating the fermentation broth obtained in step (b), drying and powdering.

또한, 본 발명은 상기 유산균 발효분말을 포함하는 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition comprising the lactic acid bacteria fermented powder.

본 발명에 의한 유산균 발효분말은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 등 병원성균에 대하여 항균활성을 갖기 때문에, 식사대용 선식이나 생식제품 등에 첨가함으로써, 위건강 기능성 제품 등에 활용할 수 있는 장점이 있다.Since the fermented lactic acid bacteria powder according to the present invention has antibacterial activity against pathogenic bacteria such as Helicobacter pylori , it is added to a meal replacement meal or raw product, etc. There is an advantage that it can be utilized for gastric health functional products.

도 1은 페이퍼 디스크 확산법(paper disc diffusion method)에 의해 항균활성을 측정하는 방법을 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 모유로부터 분리한 프로바이오틱스 균주의 병원성균에 대한 항균활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3d는 선별된 프로바이오틱스 균주의 Helicobacter pylori에 대한 항균활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 선별된 프로바이오틱스 균주의 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 선별된 프로바이오틱스 균주의 균주간 점착성(auto-aggregation) 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 선별된 프로바이오틱스 균주의 병원성균에 대한 점착성(co-aggregation)을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 선별된 프로바이오틱스 균주의 소수성(hydrophobicity)을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 한림대학교 병원성 연구소로부터 위장질환 환자의 조직에서 분리한 Helicobacter pylori 균주의 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 각종 배지에 따른 Helicobacter pylori의 생장률을 나타낸 것이다.
도 10은 선별된 프로바이오틱스 균주와 상기 균주가 생산한 프로메타볼라이트의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 11은 H. pylori-1과 H. pylori-2 균주가 생산한 프로메타볼라이트의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 12는 S31(Pediococcus lolii)과 S33(Pediococcus acidilatici)이 생산한 프로메타볼라이트의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 13은 S31과 S33 균주가 생산한 프로메타볼라이트가 Helicobacter pylori의 세포벽 손상에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 14는 공초점 현미경 분석에 의한 생장한 저해활성을 나타낸 것이다.
도 15는 프로메타볼라이트의 항생제 감수성 및 병원성균에 대한 선택성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 프로메타볼라이트의 내열성 평가 프로메타볼라이트 원료의 소화효소에 대한 항균활성 안정성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 프로메타볼라이트의 소화효소에 대한 항균활성 안정성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 프로메타볼라이트의 세포독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 프로바이오틱스가 생산한 프로메타볼라이트의 생장저해 활성을 나타낸 것이다.
도 20은 수정된 MRS 브로쓰 배지에서의 항균활성 및 유산균의 생장률을 나타낸 것이다.
도 21은 반응표면 분석(RSM)을 이용한 프로메타볼라이트의 최적 생산조건 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 Pediococcus acidilatici 균주의 스케일-업 테스트 과정을 나타낸 것이다.
도 23은 Pediococcus acidilatici 균주의 단일 콜로니 형성 및 제1차 전배양 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 Pediococcus acidilaticii 배양을 위한 5L JAR 퍼멘터를 나타낸 것이다.
도 25는 5L JAR 퍼멘터에서 48시간 배양시, Pediococcus acidilatici의 생장 곡선을나타낸 것이다.
도 26은 5L JAR 퍼멘터에서 48시간 배양시, Pediococcus acidilatici의 세포 모폴로지를 나타낸 것이다.
도 27은 프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트 원료 제조공정도를 나타낸 것이다.
도 28은 매스 스케일-업(mass scale-up)을 위한 바이오리액터를 나타낸 것이다.
도 29는 항균활성을 갖는 Pediococcus lacidilatici의 매스 스케일-업 테스트 과정을 나타낸 것이다.
도 30은 항균활성을 갖는 Pediococcus acidilatici의 매스 스케일-업 테스트를 위한 생장곡선을 나타낸 것이다.
도 31은 포스트바이오틱, 10% 덱스트린 포스트바이오틱 및 30% 덱스트린 포스트바이오틱의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 32는 프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트 원료의 확립된 최적 생산공정을 나타낸 것이다.
도 33은 PA 유산균 발효분말을 나타낸 것이다.
도 34a는 PA 유산균 발효분말의 품질 규격을 나타낸 것이다.
도 34b는 PA 유산균 발효분말의 품목제조보고서를 나타낸 것이다.
도 35는 활성 펩타이드의 분자량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 매스 스펙트로메트리에 의한 활성 펩타이드의 특성을 규명한 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 Phyre 2를 이용한 psi Blast에 의한 아미노산 서열의 상동성 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 뉴클레오타이드 시퀀싱을 통한 활성 펩타이드의 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 39 및 도 40은 항균활성 펩타이드의 상호작용 분석(SWISS-MODEL: Homology 모델링) 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 항균활성 펩타이드의 구조 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 42는 HPLC를 이용한 활성 펩타이드와 페디오신의 동시분석 결과를 나타낸 것이다.
도 43은 페디오신 표준물질(sigma P0098)을 이용한 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 44a 내지 도 44c는 HPLC에 의한 대조군 및 프로바이오틱 시료의 페디오신 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 45는 선별 균주의 CFS 및 항생제의 병원균 저해 활성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 46은 선별 균주의 CFS 및 정제 펩타이드의 병원균 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 47은 C. elegans 모델을 이용한 in vivo 항균활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 48은 NO 생성 및 사이토카인 생성 수준을 나타낸 것이다.
도 49는 Raw 264.7 세포주의 사이토카인 생성 수준을 나타낸 것이다.
도 50은 iNOS and COX-2의 유전자 발현 수준을 나타낸 것이다. 1 shows a method for measuring antimicrobial activity by a paper disc diffusion method.
Figures 2a to 2c shows the results of evaluating the antimicrobial activity against pathogenic bacteria of the probiotic strain isolated from breast milk.
3a to 3d show the results of evaluating the antibacterial activity against Helicobacter pylori of the selected probiotic strains.
4 shows the identification results of the selected probiotic strains.
5 shows the results of auto-aggregation between strains of selected probiotic strains.
Figure 6 shows the results of evaluating the adhesion (co-aggregation) to the pathogenic bacteria of the selected probiotic strain.
7 shows the results of evaluating the hydrophobicity of the selected probiotic strain.
8 shows the identification results of Helicobacter pylori strains isolated from the tissues of patients with gastrointestinal diseases from the Institute of Pathogenesis of Hallym University.
9 shows the growth rate of Helicobacter pylori according to various media.
10 shows the antibacterial activity of the selected probiotic strain and the prometabolite produced by the strain.
11 shows the antibacterial activity of prometabolite produced by H. pylori -1 and H. pylori -2 strains.
12 shows S31 ( Pediococcus lolii ) and S33 ( Pediococcus ) acidilatici ) showed the antibacterial activity of prometabolite produced.
13 shows the effect of prometabolite produced by strains S31 and S33 on cell wall damage of Helicobacter pylori.
14 shows the growth inhibitory activity by confocal microscopy analysis.
15 shows the results of evaluation of antibiotic sensitivity and selectivity for pathogenic bacteria of prometabolite.
16 is a heat-resistance evaluation of prometabolite, showing the results of evaluation of the stability of antibacterial activity against digestive enzymes of the raw material of prometabolite.
17 shows the results of evaluation of the stability of antibacterial activity against digestive enzymes of prometabolite.
18 shows the cytotoxicity evaluation results of prometabolite.
19 shows the growth inhibitory activity of prometabolite produced by probiotics.
20 shows the antimicrobial activity and growth rate of lactic acid bacteria in the modified MRS broth medium.
21 shows the results of analysis of the optimal production conditions of prometabolite using response surface analysis (RSM).
22 shows Pediococcus The scale-up test procedure of the acidilatici strain is shown.
23 shows Pediococcus The results of single colony formation and first pre-culture of acidilatici strain are shown.
24 is Pediococcus The 5L JAR Fermenter for culturing acidilaticii is shown.
Figure 25 is when cultured for 48 hours in 5L JAR Fermenter, Pediococcus acidilatici growth curve.
Figure 26 is when cultured for 48 hours in 5L JAR Fermenter, Pediococcus acidilatici cell morphology.
27 shows a process diagram of probiotics and prometabolite raw materials.
28 shows a bioreactor for mass scale-up.
29 is Pediococcus having antibacterial activity; The process of mass scale-up testing of lacidilatici is shown.
30 is Pediococcus having antibacterial activity acidilatici growth curves for the mass scale-up test.
Figure 31 shows the antimicrobial activity of postbiotic, 10% dextrin postbiotic and 30% dextrin postbiotic.
Figure 32 shows the established optimal production process of probiotics and prometabolites raw materials.
33 shows the PA lactic acid bacteria fermented powder.
Figure 34a shows the quality standards of the fermented powder of PA lactic acid bacteria.
Figure 34b shows the product manufacturing report of the PA lactic acid bacteria fermented powder.
35 shows the results of confirming the molecular weight of the active peptide.
36 shows the results of characterization of the active peptide by mass spectrometry.
Figure 37 shows the homology results of the amino acid sequence by psi Blast using Phyre 2.
38 shows the results of identification of active peptides through nucleotide sequencing.
39 and 40 show the results of the interaction analysis (SWISS-MODEL: Homology modeling) of the antimicrobial active peptide.
41 shows the results of structural identification of the antimicrobial active peptide.
Figure 42 shows the results of simultaneous analysis of the active peptide and pediosin using HPLC.
43 shows a standard curve using a pediosin standard (sigma P0098).
44a to 44c show the results of analyzing the pediosin content of the control and probiotic samples by HPLC.
45 shows the results of comparing the pathogen inhibitory activity of CFS and antibiotics of the selected strain.
Figure 46 shows the results of measuring the pathogen inhibitory activity of the CFS and purified peptide of the selected strain.
47 shows C. elegans Shows the results of evaluating the in vivo antimicrobial activity using the model.
Figure 48 shows NO production and cytokine production levels.
Figure 49 shows the cytokine production level of Raw 264.7 cell line.
50 shows the gene expression levels of iNOS and COX-2.

본 발명의 일 구현예는 항균활성을 갖는 유산균인 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)의 발효액을 분말화한 유산균 발효분말에 관한 것이다.One embodiment of the present invention relates to a lactic acid fermented powder obtained by pulverizing a fermented liquid of Pediococcus acidilactici , a lactic acid bacterium having antibacterial activity.

상기 유산균은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 대하여 항균활성을 갖지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 등과 같은 병원성균에 대해서도 항균활성을 갖는다.The lactic acid bacteria has antibacterial activity against Helicobacter pylori , but is not limited thereto, and Staphylococcus aureus , E. coli , Bacillus cereus , etc. Hospitals such as It also has antibacterial activity against bacteria.

상기 유산균은 모유로부터 분리된 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) OH1 균주(KCTC 13774BP)일 수 있는데, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 16S rRNA 유전자를 가질 수 있다.The lactic acid bacteria may be Pediococcus acidilactici OH1 strain (KCTC 13774BP) isolated from breast milk, and may have a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

상기 유산균은 pH 3 이하의 조건에서도 내산성을 갖는데, pH 2.5의 조건에서 90% 이상, 바람직하게는 93% 이상의 생존율을 나타낼 수 있다.The lactic acid bacteria have acid resistance even under conditions of pH 3 or less, and may exhibit a survival rate of 90% or more, preferably 93% or more at a pH of 2.5.

상기 유산균은 펩신에 대하여 저항성을 갖는데, 상기 펩신에 대하여 90% 이상의 생존율을 나타낼 수 있고, 담즙산(bile salt) 및 판크레아틴(pancreatin)에 대하여 저항성을 갖는데, 상기 담즙산 및 판크레아틴에 대하여 100%의 생존율을 나타낼 수 있다.The lactic acid bacteria have resistance to pepsin, can exhibit a survival rate of 90% or more for the pepsin, and have resistance to bile salt and pancreatin, 100% of the bile acid and pancreatin survival rate can be expressed.

상기 유산균은 암피실린, 클린다마이신, 메로페넴, 이미페넴 및 메티실린 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 항생제에 대하여 저항성을 갖기 때문에, 다양한 항생제와 병행하여 사용할 경우에도 안정성이 높아 우수한 항생제 내성을 보유할 수 있다.Since the lactic acid bacteria have resistance to one or more antibiotics selected from the group consisting of ampicillin, clindamycin, meropenem, imipenem, and methicillin, they have high stability even when used in parallel with various antibiotics. have.

상기 유산균은 34% 이상, 바람직하게는 34~35%의 장내세포 부착 활성((auto-aggregation)을 나타낼 수 있다.The lactic acid bacteria may exhibit an intestinal cell adhesion activity ((auto-aggregation) of 34% or more, preferably 34-35%.

상기 유산균은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pyroli-2), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원성균에 대하여 70% 이상, 특히 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대해서는 95% 이상의 점착 활성을 가질 수 있다.The lactic acid bacteria are Helicobacter pylori (Helicobacter pyroli -2), Staphylococcus aureus , Escherichia coli ( E. coli ) and Bacillus cereus ( Bacillus cereus ) 70% or more with respect to one or more pathogenic bacteria selected from the group consisting of, particularly staphylo It may have an adhesion activity of 95% or more against Staphylococcus aureus.

본 발명의 상기 발효분말은 덱스트린을 더 포함할 수 있는데, 상기 덱스트린 70~90 중량% 및 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) 발효액 10~30 중량%를 포함할 수 있다.The fermented powder of the present invention may further include dextrin, and 70 to 90% by weight of the dextrin and Pediococcus acidi lactisi (Pediococcus). acidilactici ) may contain 10 to 30% by weight of the fermentation broth.

본 발명의 상기 발효분말은 바람직하게는, 상기 덱스트린 80 중량% 및 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) 발효액 20 중량%를 포함할 수 있다.The fermented powder of the present invention is preferably 80% by weight of the dextrin and Pediococcus acidi lactisi (Pediococcus) acidilactici ) may contain 20% by weight of the fermentation broth.

본 발명의 다른 구현예는 (a) 항균활성을 갖는 유산균인 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 전배양하는 단계, (b) 상기 전배양한 페디오코커스 애시디락티시 균주를 배양 배지에 접종하여 발효시키는 단계, 및 (c) 상기 (b) 단계에서 얻은 발효액을 농축한 후, 건조시켜 분말화하는 단계를 포함하는 유산균 발효분말의 제조방법에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention comprises the steps of (a) pre-culturing Pediococcus acidilactici , a lactic acid bacterium having antibacterial activity, (b) culturing the pre-cultured Pediococcus acidilactici strain. It relates to a method for producing lactic acid bacteria fermented powder comprising the step of inoculating the medium to ferment, and (c) concentrating the fermentation broth obtained in step (b), drying and powdering.

이하, 본 발명의 상기 유산균 발효분말의 제조방법을 각 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, the manufacturing method of the lactic acid bacteria fermented powder of the present invention will be described in detail for each step.

(a) 전배양 단계(a) pre-culture step

상기 P. acidilatici 균주를 MRS 배지 플레이트에 스트리킹한 후, 36~38℃, 바람직하게는 37℃의 배양조에서 36~60시간, 바람직하게는 48시간 동안 배양하여 단일 콜로니(single colony)를 분리한다. 이 때, 상기 MRS 배지는 하기 표 14와 같다.After the P. acidilatici strain is streaked on the MRS medium plate, it is cultured for 36 to 60 hours, preferably 48 hours in a culture bath at 36 to 38 ° C., preferably at 37 ° C. to isolate a single colony. . At this time, the MRS medium is shown in Table 14 below.

상기 분리된 단일 콜로니를 500mL 배플드 플라스크(baffled flask)에 50~150mL, 바람직하게는 100mL의 용량으로 접종한 후에 36~38℃, 바람직하게는 37℃에서 100~200rpm, 바람직하게는 150rpm으로 15~20시간, 바람직하게는 17시간 동안 배양할 수 있다.The isolated single colony was inoculated in a 500 mL baffled flask at a volume of 50 to 150 mL, preferably 100 mL, and then at 36 to 38 ° C, preferably at 37 ° C, at 100 to 200 rpm, preferably at 150 rpm. It can be cultured for ~20 hours, preferably for 17 hours.

이 때, 상기 유산균은 모유로부터 분리된 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) OH1 균주(KCTC 13774BP)일 수 있는데, 상기 균주의 특성에 대해서는 상기 유산균 발효분말에서 설명한 바와 같다.At this time, the lactic acid bacteria may be Pediococcus acidilactici OH1 strain (KCTC 13774BP) isolated from breast milk, and the characteristics of the strain are as described in the lactic acid bacteria fermented powder.

(b) 본 배양 단계(b) this culturing step

상기 전배양한 페디오코커스 애시디락티시 균주를 배양 배지에 접종하여 발효시킴으로써, 본 단계를 수행할 수 있다.By inoculating the pre-cultured Pediococcus acidi lactisi strain into a culture medium and fermenting, this step may be performed.

상기 배양 배지는 바람직하게는, 포도당 20 g/L, 카제인 펩톤 15 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 소디움 아세테이트 5 g/L, K2HPO4 2 g/L, 구연산나트륨 2 g/L, 황산마그네슘 0.1 g/L, 황산망간 0.05 g/L 및 폴리솔베이트 80 1 g/L를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The culture medium is preferably glucose 20 g / L, casein peptone 15 g / L, yeast extract 10 g / L, sodium acetate 5 g / L, K 2 HPO 4 2 g / L, sodium citrate 2 g / L , magnesium sulfate 0.1 g/L, manganese sulfate 0.05 g/L, and polysorbate 80 1 g/L, but is not limited thereto.

상기 발효는 36~38℃, 바람직하게는 37℃, 0.4~0.6 vvm, 바람직하게는 0.5 vvm, 400~500 rpm, 바람직하게는 450 rpm 및 pH 6.0~6.3의 조건에서 24~48시간 동안 배양하여 수행할 수 있다.The fermentation is carried out at 36-38 ℃, preferably 37 ℃, 0.4-0.6 vvm, preferably 0.5 vvm, 400-500 rpm, preferably 450 rpm and pH 6.0-6.3 by culturing for 24-48 hours. can be done

(c) 발효액의 농축 및 건조 단계(c) concentrating and drying the fermentation broth

농축기(evaporator)를 사용하여 상기 (b) 단계에서 얻은 발효액을 농축시킬 수 있는데, 진공증발 농축기를 이용하여 발효액은 약 5배 정도 농축시킬 수 있다.The fermentation broth obtained in step (b) can be concentrated using an evaporator, and the fermentation broth can be concentrated about 5 times using a vacuum evaporator.

상기 농축 공정이 종료된 유산균 배양 농축액을 건조기, 바람직하게는 분무건조기를 이용하여 분말화할 수 있는데, 상기 분말화 조건은 입구(in let) 온도 200~210℃, 출구(out let) 온도 90~100℃로 설정하여 진행하는 것이 바람직하다.The lactic acid bacteria culture concentrate after the concentration process can be powdered using a dryer, preferably a spray dryer, wherein the powdering conditions are inlet temperature 200 to 210° C., outlet temperature 90 to 100 It is preferable to proceed by setting it to °C.

본 발명의 또 다른 구현예는 상기 유산균 발효분말을 포함하는 조성물에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention relates to a composition comprising the lactic acid bacteria fermented powder.

상기 조성물은 식품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.The composition may be a food composition, a health functional food composition, a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.

상기 조성물은 바람직하게는 식사대용 생식 조성물일 수 있다.The composition may preferably be a raw meal replacement composition.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples. However, these Examples are only for describing the present invention in detail, and the scope of the present invention is not limited by these Examples.

<실시예> <Example>

1. 재료 및 방법1. Materials and Methods

(1). 균주 및 배양조건(One). Strain and culture conditions

본 연구에 사용된 유산균주는 하기 표 1과 같이 한국 및 인도 모유로부터 55종을 분리하여 사용하였다.The lactic acid strains used in this study were used by separating 55 types from Korean and Indian milk as shown in Table 1 below.

Figure pat00001
Figure pat00001

또한, 본 연구에 사용된 병원성균은 Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43888 및 Staphylococcus aureus ATCC 19095이며, 이들 균주는 뉴트리언트 브로쓰(nutrient broth) 및 아가(Difco) 배지를 제조하여 37℃에서 24시간 배양하여 사용하였다.In addition, the pathogens used in this study were Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43888 and Staphylococcus aureus ATCC 19095, and these strains were prepared by preparing a nutrient broth and agar medium 37 It was used after incubation at ℃ for 24 hours.

Helicobacter pylori 균은 한림대학교 병원성 연구소로부터 위장질환 환자의 조직에서 분리한 것을 분양받았으며, 이균의 특성을 규명하기 위하여 16S rRNA 유전자 시퀀싱(gene sequencing)을 수행하여 동정후 사용하였다. Helicobacter pylori was isolated from the tissues of patients with gastrointestinal diseases from the Institute of Pathogenesis of Hallym University, and 16S rRNA gene sequencing was performed to characterize the bacteria and used after identification.

(2). 항균활성 유산균주의 분리 및 동정(2). Isolation and identification of antibacterial active lactic acid bacteria

모유로부터 선별된 55종 프로바이오틱스균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 수행하였으며, 유전자의 증폭은 세균은 the universal rRNA gene primers(27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(서열번호 1)과 1492R: 5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 2))를 사용하였다.For identification of 55 probiotic strains selected from breast milk, 16S rRNA gene sequencing was performed, and gene amplification was performed using the universal rRNA gene primers (27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 1) and 1492R: 5 '-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID NO: 2)) was used.

PCR 증폭 반응의 혼합물은 0.1 μg의 gDNA, 10 pM 프라이머 세트, 2.5 mM 디옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs), 10X 반응 버퍼, ExTaq 폴리머라제(Takara, Japan)와 증류수(distilled water)로 최종 부피가 50 μL가 되도록 하였으며, 94℃에서 5분간 초기변성 단계(initial denaturation)를 수행한 뒤, 94℃에서 1분간 변성(de-naturation), 55℃에서 1분간 결합반응(annealing), 72℃에서 1 분간 증폭반응(extension)을 30회 반복한 뒤 마지막으로 72℃에서 5분간 최종신장반응(final extension) 과정을 수행하였으며, 각 과정은 Serene Biosciences (Bangalore, India)를 통하여 진행하였다.The PCR amplification reaction mixture was prepared with 0.1 µg gDNA, 10 pM primer set, 2.5 mM deoxynucleoside triphosphate (dNTPs), 10X reaction buffer, ExTaq polymerase (Takara, Japan) and distilled water to a final volume in distilled water. was made to be 50 μL, followed by initial denaturation at 94°C for 5 minutes, de-naturation at 94°C for 1 minute, annealing at 55°C for 1 minute, followed by annealing at 72°C. After repeating the amplification reaction 30 times for 1 minute, a final extension reaction process was performed at 72° C. for 5 minutes, and each process was performed through Serene Biosciences (Bangalore, India).

분석된 16S rRNA 결과는 National Center for biotechnology Institute(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) analysis (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 통해 분석하였다.The analyzed 16S rRNA results were analyzed through Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analysis (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) of the National Center for biotechnology Institute (NCBI).

(3). 항균활성 측정(3). Antibacterial activity measurement

프로바이오틱스균 및 프로메타볼라이트의 항균활성은 미량 희석법 (Clinical and laboratory standard institute, 149 CLSI)과 디스크 확산법 (Brumfitt, Hamilton-Miller, & Franklin, 1990)을 이용하여 확인하였으며(도 1 참조), 4종의 병원성균 Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43888, Staphylococcus aureus ATCC 19095 및 Helicobacter pylori-1,2,3,4)에 대한 항균력을 확인하였다.The antimicrobial activity of probiotic bacteria and prometabolite was confirmed using a microdilution method (Clinical and laboratory standard institute, 149 CLSI) and a disk diffusion method (Brumfitt, Hamilton-Miller, & Franklin, 1990) (see FIG. 1), 4 pathogen of species Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43888, Staphylococcus aureus ATCC 19095 and Helicobacter pylori -1,2,3,4) were confirmed to have antibacterial activity.

분리된 유산균주는 MRS 브로쓰에서 24시간 동안 본 배양한 후, 원심분리 (4,000 × g, 4℃, 5분)하여 0.22 μm 필터를 이용해 여과한 상등액을 본 실험에 사용하였고, 5종의 병원성균은 trypiticase soy broth(TSB, Difco-France) 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 배양한 후 멸균된 페이퍼 디스크에 상등액을 50 μL씩 분주하여 37℃에서 배양한 후주변에 생성되는 저해환의 크기를 측정하여 항균활성을 측정하였다.The isolated lactic acid bacteria were cultured in MRS broth for 24 hours, then centrifuged (4,000 × g, 4℃, 5 minutes) and the supernatant filtered using a 0.22 μm filter was used in this experiment, and 5 pathogenic bacteria After culturing at 37°C for 24 hours using a trypiticase soy broth (TSB, Difco-France) medium, 50 μL of the supernatant was dispensed on a sterilized paper disk, incubated at 37°C, and then the size of the inhibition ring generated around it was measured. Thus, the antibacterial activity was measured.

(4). Helicobacter pylori 배지의 표준화(media starndardization)(4). Standardization of Helicobacter pylori medium (media starndardization)

H. pylori 균의 일정한 활성 및 생육을 위해 상업용 배지와 실험실 규모(lab scale) 배지조성을 표준화하기 위해, 일반적으로 사용되고, 5% hem Horse blood 및 특정 항생제 콤비네이션(5mg/L trimethoprim, 6mg/L vancomycin, and 6mg/L amphotericin B)로 이루어지는 콜롬비아 블러드 아가(columbia blood agar), BHIA(Brain Hear Infusion Agar), 5% hem Horse blood 및 TSA(Tryptic Soy Agar)가 보충된 BHIA(Brain Hear Infusion Agar), 5% hem Horse blood가 보충된 TSA (Tryptic Soy Agar)를 사용하여 최적의 생육조건 환경을 조사하였음 To standardize the composition of commercial medium and lab scale medium for constant activity and growth of H. pylori , it is commonly used, and a combination of 5% hem Horse blood and a specific antibiotic (5mg/L trimethoprim, 6mg/L vancomycin, and 6 mg/L amphotericin B), Colombia blood agar, Brain Hear Infusion Agar (BHIA), Brain Hear Infusion Agar (BHIA) supplemented with 5% hem Horse blood and Tryptic Soy Agar (TSA), 5 Optimal growth conditions were investigated using TSA (Tryptic Soy Agar) supplemented with % hem Horse blood.

(5). 프로바이오틱스 균주의 내산성 평가(5). Acid resistance evaluation of probiotic strains

분리 균주의 산 저항성은 Fuochi et al., Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 28, 426-433 (2015)의 방법을 이용하여 평가하였다. 즉, 37℃에서 24시간 배양된 프로바이오틱스 균주는 원심분리를 이용하여 4,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 얻은 펠렛은 phosphate-saline buffer(PBS, GIBCO-USA) 용액에 현탁시킨 후, KH2PO4로 pH를 2.5로 조정하였다.Acid resistance of isolates was described in Fuochi et al., Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 28, 426-433 (2015). That is, the probiotic strain cultured at 37° C. for 24 hours was centrifuged at 4,000 rpm for 20 minutes using centrifugation, and the resulting pellet was suspended in a phosphate-saline buffer (PBS, GIBCO-USA) solution, and then KH 2 PO 4 The pH was adjusted to 2.5 with

혼합액은 실온에서 4시간동안 방치한 후, 균주를 접종하여 4시간 반응시켰다. 각 시험구들은 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)로 연속희석한 후, MRS 배지에 도말하여 생균수를 측정하였다. 도말한 배지는 37℃에서 24시간 배양한 후, 균주의 생존율은 하기 수학식 1로 계산하여 나타내었다. After the mixture was left at room temperature for 4 hours, the strain was inoculated and reacted for 4 hours. Each test group was serially diluted with sterile physiological saline (0.85% NaCl), and then plated on MRS medium to measure the number of viable cells. After the plating medium was cultured at 37° C. for 24 hours, the viability of the strain was calculated by Equation 1 below.

Figure pat00002
Figure pat00002

(6). 프로바이오틱스 균주의 펩신 저항성 평가(6). Evaluation of pepsin resistance of probiotic strains

펩신(3mg/mL)은 멸균 생리식염수(0.85% NaCl, w/v)를 첨가하여 pH 2.5로 조정하여 사용하였다. 1% (v/v)의 프로바이오틱스 균주를 인공 위액에 접종한 후 37℃에서 4시간 동안 배양하였고, 생균수는 도말 평판법으로 측정하였으며 접종 전 (T1)과 접종 후 (T2) 로 나뉘어 측정한 후, 생존율은 내산성 실험과 동일한 방법을 적용하여 계산하였다.Pepsin (3 mg/mL) was used by adjusting the pH to 2.5 by adding sterile physiological saline (0.85% NaCl, w/v). After inoculating 1% (v/v) probiotic strain into artificial gastric juice, it was cultured at 37°C for 4 hours, and the number of viable cells was measured by the smear plate method and divided into pre-inoculation (T1) and post-inoculation (T2). , and the survival rate was calculated by applying the same method as in the acid resistance test.

(7). 프로바이오틱스 균주의 담즙산 및 판크레아틴 저항성 평가(7). Evaluation of Bile Acid and Pancreatin Resistance of Probiotic Strains

인공담즙 및 판크레아틴 저항성은 상기 Fuochi et al. (2015)의 방법을 사용하였다. 즉, 0.3%(w/v) 담즙산(Sigma-Aldrich, South Korea)과 1 mg/mL 판크레아틴(Sigma-Aldrich, South Korea)을 멸균 생리식염수 용액(0.85%NaCl, w/v)에 혼합한 후, pH 8.0으로 조정하여 인공 담즙 및 판크레아틴 용액을 제조하였다.Artificial bile and pancreatin resistance was described in Fuochi et al. (2015) was used. That is, 0.3% (w/v) bile acid (Sigma-Aldrich, South Korea) and 1 mg/mL pancreatin (Sigma-Aldrich, South Korea) were mixed in sterile physiological saline solution (0.85% NaCl, w/v). Then, the pH was adjusted to 8.0 to prepare an artificial bile and pancreatin solution.

1%(v/v) LAB을 인공 용액에 접종한 후, 37℃에서 6 시간동안 배양하였으며, 생균수는 접종 전, 후 도말 평판법을 이용하여 측정하였고, 생존율은 내산성 실험에서 사용한 동일한 방법을 적용하여 계산하였다.After inoculation with 1% (v/v) LAB in artificial solution, incubated at 37°C for 6 hours, the number of viable cells was measured before and after inoculation using the smear plate method, and the viability was the same method used in the acid resistance experiment. was calculated.

(8). 항생물질 감수성 평가(8). Antibiotic susceptibility assessment

항생물질 감수성 평가는 Ahram Oh et al. (2018)의 방법을 이용하여 진행하였음. 즉, 4개의 각 샘플은 10 μg/μL 젠타마이신(Gen), 15 μg/μL 이미페넴(Ery), 30 μg/μL 노보바이오신(Nov), 30 μg/μL 테트라싸이클린(Tet), 2 μg/μL 클린다마이신(Cli), 10 μg/μL 메로페넴(Mer), 10 μg/μL 엠피실린(Amp), and 10 μg/μL 페니실린(Pen)에 대한 감수성을 디스크 확산법을 이용하여 평가하였다.Antibiotic susceptibility assessment was conducted by Ahram Oh et al. (2018) was used to proceed. That is, each of the four samples contains 10 μg/μL gentamicin (Gen), 15 μg/μL imipenem (Ery), 30 μg/μL novobiocin (Nov), 30 μg/μL tetracycline (Tet), 2 μg/μL Sensitivity to clindamycin (Cli), 10 μg/μL meropenem (Mer), 10 μg/μL ampicillin (Amp), and 10 μg/μL penicillin (Pen) was evaluated using the disc diffusion method.

이때, 뉴트리언트 아가를 이용하였으며, 37℃에서 24시간 배양한 후 저해존의 형성 유무를 관찰하였다.At this time, nutrient agar was used, and the presence or absence of the inhibition zone was observed after incubation at 37° C. for 24 hours.

(9). 군주간의 점착능(auto-aggregation) 평가(9). Evaluation of auto-aggregation of lords

균주간의 점착능은 Rahman et al., Genet Resour Crop Evol 55:331-339(2008)의 방법을 이용하여 진행하였다. 즉, 배양된 균주를 4,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 PBS 버퍼로 수세한 후, 펠렛은 PBS에 재부유시키고 현탁액 3 mL를 10초간 볼택싱한 후 600nm에서 흡광도를 측정하였다(A0).The adhesion between strains was performed using the method of Rahman et al., Genet Resour Crop Evol 55:331-339 (2008). That is, after centrifuging the cultured strain at 4,000 rpm for 20 minutes and washing with PBS buffer, the pellet was resuspended in PBS, 3 mL of the suspension was vortexed for 10 seconds, and absorbance was measured at 600 nm (A0).

37℃에서 20시간 배양한 후 상등액을 600nm에서 흡광도를 측정하였으며(A1), 점착능은 하기 수학식 2와 같이 계산하였다. After culturing at 37° C. for 20 hours, the absorbance of the supernatant was measured at 600 nm (A1), and the adhesion ability was calculated as in Equation 2 below.

Figure pat00003
Figure pat00003

(10). 병원성균에 대한 점착능(co-aggregation) 평가(10). Evaluation of co-aggregation to pathogenic bacteria

병원성균에 대한 점착능은 상기 Rahman et al. (2008)의 방법을 이용하여 진행하였다. 즉, 1.5 mL의 프로바이오틱스 균주와 병원성균주를 혼합하여 10초간 볼텍싱한 후, 37℃에서 24시간 배양한 다음 600nm에서 흡광도를 측정하였으며, 점착능은 하기의 수학식 3과 같이 계산하였음Adhesive ability to pathogenic bacteria was determined by Rahman et al. (2008) was carried out using the method. That is, 1.5 mL of the probiotic strain and the pathogenic strain were mixed and vortexed for 10 seconds, then incubated at 37° C. for 24 hours, and then absorbance was measured at 600 nm, and the adhesion was calculated as in Equation 3 below.

Figure pat00004
Figure pat00004

(11). 균주의 소수성(hydrophobiocity) 평가(11). Evaluation of the hydrophobicity of the strain

균주 세포 표면의 소수성에 대한 평가는 크실렌(xylene)에 대한 부착능을 평가하였다(Ichikawa et al. 2017). 즉, 프로바이오틱스균주 세포를 4,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 pellet을 PBS로 2회 수세한 후에 pellet을 3mL의 0.1M KNO3에 재현탁시킨 후, 600nm에서 흡광도를 측정하였다(A0).For the evaluation of the hydrophobicity of the cell surface of the strain, the ability to adhere to xylene was evaluated (Ichikawa et al. 2017). That is, after centrifuging the probiotic strain cells at 4,000 rpm for 10 minutes, the pellet was washed twice with PBS, the pellet was resuspended in 3 mL of 0.1M KNO 3 , and absorbance was measured at 600 nm (A0).

1 ml의 크실렌(Sigma-Aldrich, South Korea)을 세포 현탁액에 유기상 또는 액상 형태로 첨가한 후, 실온에서 10분간 방치한 다음 1분간 볼텍싱한 후, 각 샘플은 실온에서 20분간 방치한 후 액상 샘플을 회수하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다(A1). 세포 표면에 대한 소수성은 하기의 수학식 4과 같이 계산하였음After adding 1 ml of xylene (Sigma-Aldrich, South Korea) to the cell suspension in the form of an organic or liquid phase, it was left at room temperature for 10 minutes and then vortexed for 1 minute, and each sample was left at room temperature for 20 minutes, followed by a liquid phase. The sample was recovered and absorbance was measured at 600 nm (A1). Hydrophobicity on the cell surface was calculated as in Equation 4 below.

Figure pat00005
Figure pat00005

(12). 반응표면 분석(RSM)을 이용한 프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트 최적 생산조건 분석(12). Analysis of optimal production conditions for probiotics and prometabolite using response surface analysis (RSM)

선별된 프로바이오틱 균주가 생산하는 프로메타볼라이트의 최적생산 조건을 확립하기 위하여, 실험계획은 중심합성계획에 따라 독립변수(Xn)는 배양온도 (26.5℃, 30℃, 33.5℃, 37 ℃℃, X1), 진탕배양속도 (50rpm, 100rpm, 150rpm, 200rpm, X2), 배양시간 (12h, 24h, 36h, 48h, X3), 그리고 초기 균접종량 (2%, 3%, 4%, 5%, X4)로 주요 변수로 작용할 수 있게 하였으며, 이들 요인에 의해 영향을 받는 프로메타볼라이트의 종속변수로는 프로메타볼라이트의 생산량(Y)를 중심으로 회귀분석하였다. 이들은 각각 3회 반복 측정하여 평균값을 회귀분석에 사용하였으며, 회귀식은 하기 수학식 5와 같다. In order to establish the optimal production conditions for prometabolites produced by the selected probiotic strain, the experimental plan is based on the central synthesis plan, and the independent variable (Xn) is the culture temperature (26.5°C, 30°C, 33.5°C, 37°C). ℃, X1), shaking culture rate (50rpm, 100rpm, 150rpm, 200rpm, X2), incubation time (12h, 24h, 36h, 48h, X3), and initial inoculum (2%, 3%, 4%, 5%) , X4) as the main variable, and as a dependent variable of prometabolite affected by these factors, regression analysis was conducted centered on the production (Y) of prometabolite. Each of these measurements was repeated three times, and the average value was used for regression analysis, and the regression equation is as shown in Equation 5 below.

Figure pat00006
Figure pat00006

(13). 프로메타볼라이트의 항균활성(13). Antibacterial activity of prometabolite

분리된 프로바이오틱스균가 생산하는 프로메타볼라이트 항균활성은 미량희석법(Clinical and laboratory standard institute, 149 CLSI)과 디스크확산법 (Brumfitt, Hamilton-Miller, & Franklin, 1990)을 이용한 실험법(도 1 참조)을 이용해 확인하였으며, 4종의 병원성균 Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43888, Staphylococcus aureus ATCC 19095 및 Helicobacter pylori-1,2,3,4)에 대한 항균력을 확인하였다.Prometabolite antibacterial activity produced by the isolated probiotic bacteria was tested using microdilution (Clinical and laboratory standard institute, 149 CLSI) and disc diffusion method (Brumfitt, Hamilton-Miller, & Franklin, 1990) (see Fig. 1). The antibacterial activity was confirmed against four pathogenic bacteria Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43888, Staphylococcus aureus ATCC 19095 and Helicobacter pylori -1,2,3,4).

분리된 유산균주는 MRS 브로쓰에서 24시간 동안 본 배양한 후, 원심분리 (4,000 × g, 4℃, 5분)하여 0.22 μm 필터를 이용해 여과한 상등액을 본 실험에 사용하였고, 4종의 병원성균은 trypiticase soy broth (TSB, Difco-France) 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 배양한 후 멸균된 페이퍼 디스크에 상등액을 50 μL씩 분주하여 37℃에서 배양하였다.The isolated lactic acid strain was mainly cultured in MRS broth for 24 hours, then centrifuged (4,000 × g, 4℃, 5 minutes) and the supernatant filtered using a 0.22 μm filter was used in this experiment, and 4 pathogenic bacteria Silver trypiticase soy broth (TSB, Difco-France) was cultured at 37°C for 24 hours using medium, and then 50 μL of the supernatant was dispensed onto sterilized paper disks and cultured at 37°C.

배양 후 주변에 생성되는 저해환의 크기를 측정하여 항균활성을 측정하였다.Antibacterial activity was measured by measuring the size of the inhibitory ring generated around the culture.

(14). 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope)(14). Transmission Electron Microscope

2% 글루타르알데하이드와 2% 파라포름알데하이드(in 0.1 M of carcodylate buffer) 혼합용액에 실온에서 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 세포는 0.1M carcodylate buffer 용액으로 수세한 후 에탄올을 이용하여 단계별로 농도(50-90%)를 달리하여 처리하였다.It was fixed in a mixed solution of 2% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde (in 0.1 M of carcodylate buffer) at room temperature for 1 hour. The fixed cells were washed with 0.1M carcodylate buffer solution and then treated with ethanol at different concentrations (50-90%).

프로필렌 옥사이로 치환시키는 과정을 2회 실시한 후, Eponate 812에 전처리하였으며, 각 샘플은 초박절편기 (Ultracut UCT, Leica)를 이용하여 절단 후 우라닐 아세테이트와 구연산납(lead citrate)으로 염색한 후에 염색된 절편조직을 field emission TEM (JEM-2100F, JEOL)을 이용하여 관찰하였다. After the process of substituting with propylene oxide was carried out twice, it was pre-treated with Eponate 812, and each sample was cut using an ultra-thin section (Ultracut UCT, Leica) and then stained with uranyl acetate and lead citrate. The tissue sections were observed using field emission TEM (JEM-2100F, JEOL).

(15). 공초점 현미경 분석(Conforcal microscopic analysis)(15). Confocal microscopic analysis

미생물 형태적 변화를 관찰하기 위하여, Syto-9(Laser Line- 488nm; Excitation -617; Emission- 503) 및 프로피디움 요오드화물(Laser Line-488nm; Excitation-535; Emission-488)로 염색한 후, super sensitive high resolution confocal laser scanning microscope imaging (SR-CLSM; LSM880 with Airyscan, ZEISS, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다. After staining with Syto-9 (Laser Line-488nm; Excitation-617; Emission-503) and propidium iodide (Laser Line-488nm; Excitation-535; Emission-488) to observe microbial morphological changes, It was observed with super sensitive high resolution confocal laser scanning microscope imaging (SR-CLSM; LSM880 with Airyscan, ZEISS, Oberkochen, Germany).

(16). 프로메타볼라이트의 선택적 항균 활성능 효능평가(16). Efficacy evaluation of the selective antibacterial activity of prometabolite

프로메타볼라이트의 병원성 세균에 대한 항균활성 및 프로바이오틱 균주에 미치는 항균활성을 조사하기 위하여, 37℃에서 24시간 배양한 배양액에 미량 희석법(Clinical and laboratory standard institute, 149 CLSI)과 디스크 확산법 (Brumfitt, Hamilton-Miller, & Franklin, 1990)을 이용한 실험법을 이용하여 확인하였으며, 4종의 병원성균 Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43888, Staphylococcus aureus ATCC 19095 및 Helicobacter pylori-1,2,3,4)에 대한 항균력을 확인하였다.To investigate the antimicrobial activity of prometabolites against pathogenic bacteria and probiotic strains, the microdilution method (Clinical and laboratory standard institute, 149 CLSI) and the disk diffusion method ( Brumfitt, Hamilton-Miller, & Franklin, 1990) were confirmed using an experimental method, and 4 pathogenic bacteria Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43888, Staphylococcus aureus ATCC 19095 and Helicobacter pylori -1,2,3,4) were confirmed to have antibacterial activity.

(17). 프로메타볼라이트의 분리 정제 및 항균활성 평가(17). Separation and purification of prometabolite and evaluation of antibacterial activity

37℃에서 24시간 배양시킨 균주로부터 상등액을 추출하고 30Kda, 10Kda, 3Kda의 필터 튜브를 사용하여 분자량에 따라 분획물을 제조하였다.The supernatant was extracted from the strain cultured at 37° C. for 24 hours, and fractions were prepared according to molecular weight using filter tubes of 30Kda, 10Kda, and 3Kda.

상등액을 30Kda 필터 튜브를 사용하여 4,000Ⅹg로 15분간 원심분리하였으며, 같은 방법으로 10Kda 및 3Kda 순서로 통과시켜 총 4개의 분획물로 분리한 후, 각 분획물의 Escherichia coli E22, and Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Helicobacter pylori에 대한 항균효과를 디스크 확산법을 이용하여 평가하였다.The supernatant was centrifuged for 15 minutes at 4,000 X g using a 30 Kda filter tube, and passed through in the same manner in the order of 10 Kda and 3 Kda to separate a total of 4 fractions, and Escherichia of each fraction The antibacterial effect on coli E22, and Staphylococcus aureus , Bacillus cereus , and Helicobacter pylori was evaluated using the disc diffusion method.

(18). 프로메타볼라이트의 세포독성 평가(18). Cytotoxicity evaluation of prometabolite

세포독성을 평가하기 위해 Terry et al. (2013)의 MTT 어세이를 이용하였다. 즉, 96-웰 플레이트에 세포를 접종한 후 조추출물과 함께 72시간 동안 배양시킨 후, 세포를 1X PBS로 세척한 다음, 100 μL의 0.5mg/mL MTT가 포함된 배양액에서 37℃에서 배양하였다.To evaluate cytotoxicity, Terry et al. (2013) was used for the MTT assay. That is, after inoculating the cells in a 96-well plate and incubating with the crude extract for 72 hours, the cells were washed with 1X PBS, and then cultured at 37°C in a culture medium containing 100 μL of 0.5 mg/mL MTT. .

30분 후 디메틸설폭사이드(DMSO)를 100 μL씩 분주하여 37℃에서 30분간 방치하여 dark blue crystals of formazan(MTT 메타볼라이트)를 용해시킨 후, MTT 감소 수준은 마이크로플레이트 리더(Spectra Max M5, Molecular Devices)을 이용하여 570nm 과 650nm에서 흡광도를 측정하였다.After 30 minutes, 100 μL of dimethyl sulfoxide (DMSO) was dispensed and left at 37 ° C for 30 minutes to dissolve dark blue crystals of formazan (MTT metabolite), and the level of MTT reduction was measured using a microplate reader (Spectra Max M5, Absorbance was measured at 570 nm and 650 nm using Molecular Devices).

U.S. NCI plant screening program에 따르면, 조추출물은 일반적으로 in vitro에서 IC50 값≤20 μg/mL 수준의 세포독성을 나타내야 하는 것으로 제시되었다.U.S. According to the NCI plant screening program, it was suggested that crude extracts should generally exhibit cytotoxicity at an IC50 value of ≤20 μg/mL in vitro.

(19). 프로메타볼라이트의 열 안정성 평가(19). Evaluation of the thermal stability of prometabolite

소화과정의 고온에서 유산균의 생존여부를 판단하기 위해 내열성 평가를 진행하였다. 1mL의 프로메타볼라이트를 Thermostat Eppendorf 022670204을 이용하여 95±2℃에서 30, 60, 90, 120 분간 노출시키고, 121℃에서 15분간 15lbs의 압력에 노출시킨 후, 프로메타볼라이트의 병원성에 대한 항균효과를 평가하였음 To determine the survival of lactic acid bacteria at high temperatures during the digestion process, heat resistance evaluation was performed. 1 mL of prometabolite was exposed using a Thermostat Eppendorf 022670204 at 95±2°C for 30, 60, 90, and 120 minutes, followed by exposure to 15 lbs of pressure at 121°C for 15 minutes. Antibacterial effect was evaluated

(20). 프로메타볼라이트의 판크레아틴 및 펩신 안정성 평가(20). Evaluation of the Pancreatin and Pepsin Stability of Prometabolite

추출한 생리활성물질에 함유되어 있는 단백질 함량을 측정하기 위하여, 판크레아틴 효소를 처리하였다. 프로메타볼라이트에 판크레아틴을 1mg/mL 농도로 처리한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰으며, 펩신은 3mg/mL 농도로 처리하여 4시간 동안 반응시킨 다음, 프로메타볼라이트의 항균활성을 평가하였다.In order to measure the protein content contained in the extracted physiologically active substances, pancreatin enzyme was treated. After treating prometabolite with pancreatin at a concentration of 1 mg/mL, it was reacted at 37°C for 2 hours, and pepsin was treated at a concentration of 3 mg/mL and reacted for 4 hours, The antibacterial activity of prometabolite was evaluated.

(21). HET-CAM 평가(21). HET-CAM evaluation

신선한 달걀을 최적온도 37.5℃, 습도 60% 조건에서 9일간 배양한 후, 배양 9일째에 검란기를 통하여 기실을 관찰하여 기실이 잘 관찰된 수정란만을 사용하였다.Fresh eggs were cultured for 9 days at an optimum temperature of 37.5° C. and humidity of 60%. On the 9th day of incubation, air chambers were observed through an incubator and only fertilized eggs with well observed air chambers were used.

기실 부근의 난각과 난각막을 제거하여 CAM(Chorioallantoic membrane)이 노출되도록 한 후, DMSO에 용해시킨 처리구 샘플 0.2 mL을 CAM에 300초간 노출시켰으며, 노출시간 동안의 자극성 테스트의 지표로 혈관 및 모세혈관과 알부민을 이용하였다.After removing the egg shell and egg shell membrane near the air chamber to expose the chorioallantoic membrane (CAM), 0.2 mL of the treated group sample dissolved in DMSO was exposed to the CAM for 300 seconds, and blood vessels and capillaries were used as indicators of the stimulation test during the exposure time. and albumin were used.

각 수정란에서 나타나는 자극반응은 초단위로 측정하여 결과를 얻었으며, 자극지수 (0부터 21)를 계산하였는데, 안점막자극지수(OII)는 하기 수학식 6과 같이 계산하였다 (자극 수준: OII ≤ 0.9, slightly irritating; 0.9 < OII ≤ 4.9, moderately irritating; 4.9< OII ≤ 8.9, irritating; and 8.9 < OII ≤ 21, severely irritating).The stimulation response in each fertilized egg was measured in seconds to obtain the results, and the stimulation index (0 to 21) was calculated, and the ocular mucosal stimulation index (OII) was calculated as in Equation 6 below (stimulation level: OII ≤ 0.9, slightly irritating; 0.9 < OII ≤ 4.9, moderately irritating; 4.9 < OII ≤ 8.9, irritating; and 8.9 < OII ≤ 21, severely irritating).

Figure pat00007
Figure pat00007

(22). 프로바이오틱스/프로메타볼라이트 공정개발 시험(22). Probiotic/prometabolite process development test

프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트를 상업용 대량생산 공정을 개발하기 위하여 확립된 실험실 배지성분을 기초로 하여 상업용 배지조성을 변경한 후, 대량생산용 퍼멘터에서의 최적 생산조건을 확인하기 위하여, 5L 소규모 JAR 퍼멘터를 이용하여 48시간 동안 유산균주의 생육조건을 측정하여 공정을 설계하였다.After changing the commercial medium composition based on the established laboratory medium components to develop a commercial mass production process for probiotics and prometabolite, to confirm the optimal production conditions in the mass production Fermenter, 5L small-scale JAR fur The process was designed by measuring the growth conditions of the lactic acid bacteria for 48 hours using a mentor.

2. 2. 프로바이오틱스probiotics 스크리닝 및 특성 규명 Screening and characterization

가. 모유로부터 분리한 end. isolated from breast milk 프로바이오틱스probiotics 균주의 항균활성 스크리닝 Screening for antibacterial activity of strains

(1). 프로바이오틱스 균주의 식중독균에 대한 항균활성 평가(One). Evaluation of antimicrobial activity against food poisoning bacteria of probiotic strains

한국 및 인도 모유로부터 분리된 총 55종의 프로바이오틱스 균주에 대하여 병원성 균주 중 Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43888 그리고 Staphylococcus aureus ATCC 19095에 대한 항균활성을 평가한 결과를 도 2a 내지 도 2c에 나타내었다.For a total of 55 probiotic strains isolated from Korean and Indian milk, Bacillus cereus ATCC 14576, Escherichia among pathogenic strains The results of evaluating the antimicrobial activity against coli O157:H7 ATCC 43888 and Staphylococcus aureus ATCC 19095 are shown in FIGS. 2a to 2c.

도 2a 내지 도 2c에서 보는 바와 같이, 모유로부터 분리된 프로바이오틱스 균주는 대부분 병원성 균에 대하여 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.As shown in FIGS. 2a to 2c , it was confirmed that most probiotic strains isolated from breast milk exhibit high activity against pathogenic bacteria.

(2). 선별된 프로바이오틱스 균주의 Helicobacter pylori에 대한 항균활성 평가(2). Evaluation of antibacterial activity against Helicobacter pylori of selected probiotic strains

모유로부터 분리한 55종의 프로바이오틱스 균주에 대하여 중 인체로부터 유래한 4종의 Helicobacter pylori 균주에 대한 항균활성을 평가한 결과를 도 3a 내지 도 3d에 나타내었다. The results of evaluating the antimicrobial activity against the 4 strains of Helicobacter pylori derived from the human body for 55 strains of probiotics isolated from breast milk are shown in FIGS. 3A to 3D .

도 3a 내지 도 3d에서 보는 바와 같이, 55종의 프로바이오틱스 균주 중 S15, S31, S33 및 S35 균주가 특히 H. pylori에 대한 항균활성이 매우 높은 것으로 확인 되었으며, 이 4종의 균주를 선별하여, 향후 연구에 사용하였다.As shown in FIGS. 3a to 3d , it was confirmed that the S15, S31, S33 and S35 strains among 55 probiotic strains had very high antibacterial activity, especially against H. pylori , and by selecting these 4 strains, used in the study.

또한, 도 4는 선별된 프로바이오틱스 균주(S33)의 Helicobacter pylori에 대한 항균활성을 나타낸 것이다. In addition, Figure 4 shows the antibacterial activity against Helicobacter pylori of the selected probiotic strain (S33).

나. I. 프로바이오틱스probiotics 균주의 동정 Identification of strains

모유로부터 분리한 55종의 프로바이오틱균주 중 Helicobacter pylori 4종의 균주에 대해 모두 높은 항균활성을 보인 4개의 프로바이오틱스 균주에 대하여 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 생화학적 특성을 조사하여 균주를 동정하였다.Among 55 probiotic strains isolated from breast milk, 4 probiotic strains showing high antibacterial activity against all 4 strains of Helicobacter pylori were identified by 16S rRNA gene sequencing and biochemical characteristics investigation.

선별된 프로바이오틱스 균주의 분석 결과는 도 4 및 하기 표 2(생화학적 특성, 표 3(분자적 특성) 및 표 4(S33의 16SrRNA 유전자 염기서열: 서열번호 3)와 같으며, 특히, Helicobacter pylori 4종에 높은 항균활성을 보인균주 S15, S31, S33, S35는 대부분 Pediococcus lolii 그리고 Pediococcus acidilactici로 확인되었다.The analysis results of the selected probiotic strains are shown in FIG. 4 and Table 2 (biochemical properties, Table 3 (molecular properties) and Table 4 (16SrRNA gene sequence of S33: SEQ ID NO: 3), in particular, Helicobacter pylori 4 Most of the strains S15, S31, S33, and S35 that showed high antibacterial activity against the species were Pediococcus. lolii and Pediococcus acidilactici was identified.

Figure pat00008
Figure pat00008

Figure pat00009
Figure pat00009

Figure pat00010
Figure pat00010

상기 선별된 프로바이오틱스 S33 균주를 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) OH1으로 명명하고, 이를 2018년 12월 13일자로 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 13774BP로 기탁하였다.The selected probiotics S33 strain was named Pediococcus acidilactici OH1, and it was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology's Biological Resources Center (KCTC) as accession number KCTC 13774BP on December 13, 2018. .

다. 선별된 All. selected 프로바이오틱스probiotics 균주의 특성 규명 Characterization of strains

(1). 선별된 프로바이오틱스 균주의 내산성 평가(One). Acid resistance evaluation of selected probiotic strains

선별된 프로바이오틱스 균주의 위장관 소화액 수준인 pH 3 이하의 낮은 pH조건에서의 내산성을 평가한 결과, 하기 표 5에서 보는 바와 같이, 초기 접종 균수와 비교하였을 때 pH 2.5의 환경에서도 모든 프로바이오틱스균주에서 최소 88% 이상의 생존율을 보였다.As a result of evaluating the acid resistance in a low pH condition of pH 3 or less, which is the level of the gastrointestinal digestive juices of the selected probiotic strains, as shown in Table 5 below, compared with the initial inoculation number, at least 88 in all probiotic strains even in an environment of pH 2.5 % or higher survival rate.

스트레인strain 초기계수 log (CFU/mL)Initial count log (CFU/mL) 6시간 후 생존 log (CFU/mL)Log of survival after 6 hours (CFU/mL) 생존률 (%)Survival rate (%) S15S15 8.18±0.14 8.18±0.14 7.70±0.1 7.70±0.1 94.194.1 S31S31 8.48±0.2 8.48±0.2 7.48±0.16 7.48±0.16 88.288.2 S33S33 8.11±0.17 8.11±0.17 7.60±0.09 7.60±0.09 93.793.7 S35S35 8.11±0.17 8.11±0.17 7.60±0.09 7.60±0.09 93.793.7

따라서, 일반적으로 프로바이오틱스 생균의 주요 사멸 원인은 낮은 pH이며, Lactobacillus 균주는 일반적으로 1% 내외의 생존율을 보이지만, 선별된 균주의 경우는 높은 내산성을 지니는 것으로 확인되었다. Therefore, in general, the main cause of death of live probiotics is low pH, and Lactobacillus strains generally show a survival rate of around 1%, but the selected strains were confirmed to have high acid resistance.

(2). 선별된 프로바이오틱스 균주의 펩신 저항성 평가(2). Pepsin resistance evaluation of selected probiotic strains

선별된 프로바이오틱스 균주에 대하여 위장관내 소화효소인 펩신에 대한 저항성을 평가한 결과, 하기 표 6에서 보SMS 바와 같이, 모든 시험구에서 펩신저항성을 가는 것으로 확인 되었으며, 최소 82% 이상의 생존율을 보였다.As a result of evaluating the resistance to pepsin, a digestive enzyme in the gastrointestinal tract, for the selected probiotic strains, as shown in Table 6 below, pepsin resistance was confirmed in all test groups, and the survival rate was at least 82%.

스트레인strain 초기계수 log (CFU/mL)Initial count log (CFU/mL) 6시간 후 생존 log (CFU/mL)Log of survival after 6 hours (CFU/mL) 생존률 (%)Survival rate (%) S15S15 8.71±0.088.71±0.08 8.63±0.178.63±0.17 99.1%99.1% S31S31 9.15±0.129.15±0.12 8.80±0.078.80±0.07 96.2%96.2% S33S33 9.70±0.119.70±0.11 8.77±0.258.77±0.25 90.4%90.4% S35S35 10.04±0.0310.04±0.03 8.23±0.198.23±0.19 82.0%82.0%

따라서, 선별된 프로바이오틱스 균주는 모두 높은 내산성과 위장관내 소화효소인 펩신에 대한 저항성을 가지고 있어, 위장내 안정성이 매우 높은 것으로 확인되었다.Therefore, all of the selected probiotic strains had high acid resistance and resistance to pepsin, a digestive enzyme in the gastrointestinal tract, and thus, it was confirmed that the gastrointestinal stability was very high.

(3). 선별된 프로바이오틱스 균주의 담즙산 및 판크레아틴 저항성 평가 (3). Evaluation of Bile Acid and Pancreatin Resistance of Selected Probiotic Strains

선별된 프로바이오틱스 균주에 대하여 담즙산 및 판크레아틴에 대한 저항성을 평가한 결과, 하기 표 7에서 보는 바와 같이, 모든 시험구에서 담즙산 및 판크레아틴에 대한 저항성이 높은 것으로 확인 되었으며 최소 96.2%의 생존율을 보였다.As a result of evaluating the resistance to bile acids and pancreatin for the selected probiotic strains, as shown in Table 7 below, it was confirmed that resistance to bile acids and pancreatin was high in all test groups, and the survival rate was at least 96.2%.

특히, 담즙산은 십이지장에서 분비되는 소화 효소로 양친매성 분자로 세포막을 파괴하여 강력한 항균 활성을 가지는데, 본 연구에서 선별된 프로바이오틱스 균주는 모두 담즙산에 대하여 높은 안정성을 갖는 것으로 확인되었다.In particular, bile acids are digestive enzymes secreted from the duodenum and have strong antibacterial activity by destroying cell membranes with amphiphilic molecules. All of the probiotic strains selected in this study were confirmed to have high stability to bile acids.

스트레인strain 초기계수 log (CFU/mL)Initial count log (CFU/mL) 6시간 후 생존 log (CFU/mL)Log of survival after 6 hours (CFU/mL) 생존률 (%)Survival rate (%) S15S15 8.74±0.148.74±0.14 8.62±0.118.62±0.11 99.1%99.1% S31S31 9.81±0.219.81±0.21 8.96±0.078.96±0.07 96.2%96.2% S33S33 8.62±0.088.62±0.08 8.70±0.138.70±0.13 100%100% S35S35 9.16±0.109.16±0.10 9.15±0.059.15±0.05 99.9%99.9%

(4). 선별된 프로바이오틱스 균주의 항생제 저항성 평가(4). Antibiotic resistance evaluation of selected probiotic strains

항생제 감수성의 측정은 Ahram Oh et al. (2018)의 방법으로 수행하였다. 즉, 선별된 프로바이오틱스 균주를 10 μg/μL의 젠타마이신(Gen), 15 μg/μL 이미페넴(Ery), 30 μg/μL 노보바이오신(Nov), 30 μg/μL 테트라싸이클린(Tet), 2 μg/μL 클린다마이신(cli), 10 μg/μL 메로페넴(mer), 10 μg/μL 암피실린(Amp), 10 μg/μL 페니실린(Pen)을 디스크 확산법을 사용하여 분석하였다.Determination of antibiotic sensitivity was performed by Ahram Oh et al. (2018) was performed. That is, the selected probiotic strain was treated with 10 μg/μL of gentamicin (Gen), 15 μg/μL imipenem (Ery), 30 μg/μL novobiocin (Nov), 30 μg/μL tetracycline (Tet), 2 μg/μL μL clindamycin (cli), 10 μg/μL meropenem (mer), 10 μg/μL ampicillin (Amp), and 10 μg/μL penicillin (Pen) were analyzed using the disk diffusion method.

선별된 프로바이오틱스 균주를 영양배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각각의 항생제에 대한 저항성을 조사한 결과, 하기 표 8에서 보는 바와 같이, 높은 항생제 저항성을 보임을 알 수 있다.After culturing the selected probiotic strains in a nutrient medium at 37° C. for 24 hours, the resistance to each antibiotic was investigated, and as shown in Table 8 below, it can be seen that high antibiotic resistance is shown.

스트레인strain 항생제Antibiotic AmpAmp CliCli NovNov PenPen TetTet MerMer ImpImp MetMet S15S15 RR RR RR RR NRNR RR RR NRNR S31S31 RR RR RR RR RR RR RR NRNR S33S33 RR RR NRNR NRNR NRNR RR RR RR S35S35 RR RR RR RR RR RR RR NRNR

따라서, 선별된 프로바이오틱스 균주는 높은 항생제 저항성으로 다양한 항생제와 병행하여 사용할 경우에도 안정성이 높아, 우수한 항생제 내성을 보유하는 기능성 프로바이오틱스균주로 평가되었다.Therefore, the selected probiotic strain was evaluated as a functional probiotic strain having excellent antibiotic resistance due to high antibiotic resistance and high stability even when used in parallel with various antibiotics.

(5). 균주간 점착성(auto-aggregation) 평가(5). Evaluation of auto-aggregation between strains

선별된 프로바이오틱스 균주에 대하여 체내에서 지속적으로 작용하기 위한 장내 세포 부착능 (auto-aggregation)을 평가하였으며, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 균주간 점착성을 평가한 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 모든 균주 중에서 S33 균주가 가장 높은 34.8%의 활성을 보이는 것으로 확인되었다.For the selected probiotic strains, intestinal cell adhesion (auto-aggregation) for continuous action in the body was evaluated, and after culturing at 37° C. for 24 hours, adhesion between strains was evaluated. It was confirmed that the S33 strain showed the highest activity of 34.8% among all strains.

(6). 병원성균에 대한 점착성(co-aggregation) 평가(6). Evaluation of co-aggregation to pathogenic bacteria

선별된 프로바이오틱스 균주의 병원성균 H. pyroli-2, S. aureus ATCC 19095, E. coli 0157:H7 ATCC 43888 및 B. cereus ATCC 1457에 대한 점착성을 평가한 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 모든 시험구에서 70% 이상의 높은 활성을 나타냄을 알 수 있다.As a result of evaluating the adhesion of the selected probiotic strains to the pathogens H. pyroli -2, S. aureus ATCC 19095, E. coli 0157:H7 ATCC 43888 and B. cereus ATCC 1457, as shown in FIG. 6, all tests It can be seen that the sphere exhibits a high activity of 70% or more.

(7). 선별된 프로바이오틱스 균주의 소수성 평가(7). Hydrophobicity evaluation of selected probiotic strains

세포표면의 소수성은 병원성 세균과의 부착 및 응집현상, 숙주세포의 방어 등 다양한 현상들과 연관되어 있는데, 본 연구에서는 미생물의 탄화수소에 대한 부착능을 측정함으로써 소수성 정도를 측정하였다.The hydrophobicity of the cell surface is related to various phenomena such as adhesion and aggregation with pathogenic bacteria, and defense of host cells. In this study, the degree of hydrophobicity was measured by measuring the ability of microorganisms to adhere to hydrocarbons.

선별된 프로바이오틱스 균주의 소수성을 측정한 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 4종의 균주 중 S15에서 가장 높은 46.3%의 활성을 나타내었으며, 대체적으로 모든 프로바이오틱균주에서 장점막에 붙어 장 질환을 유발하는 병원균들과 같은 유해한 균들을 경쟁적으로 떨어뜨리며, 장내 병원성균의 증식을 억제함으로써 질병의 예방효과가 우수할 것으로 평가되었다.As a result of measuring the hydrophobicity of the selected probiotic strains, as shown in FIG. 7 , S15 showed the highest activity of 46.3% among the four strains, and, in general, all probiotic strains attached to the intestinal mucosa to induce intestinal disease. It was evaluated that the preventive effect of diseases would be excellent by competitively dropping harmful bacteria such as pathogens and inhibiting the growth of pathogenic bacteria in the intestine.

한편, 향후 연구로 in vitro 조건에서 안전성, 안정성 및 병원균에 대한 길항능 추가연구가 필요한 것으로 사료된다.On the other hand, as a future study, it is considered that additional studies on safety, stability, and antagonistic ability against pathogens in in vitro conditions are necessary.

3. 3. 프로바이오틱스probiotics 유래 origin 프로메타볼라이트의of prometabolites 특성 규명 characterization

모유로부터 분리한 수종의 프로바이오틱스에 대한 특성을 규명한 기초연구 결과로부터 2종의 후보 균주로서 S31(Pediococcus lolii)과 S33(Pediococcus acidilatici)를 선정하여 균주가 생산하는 프로메타볼라이트의 생산조건 및 특성을 규명하고자 하였다.From the results of basic research that identified the characteristics of several types of probiotics isolated from breast milk, S31 ( Pediococcus) as two candidate strains lolii ) and S33 ( Pediococcus ) acidilatici ) was selected and the production conditions and characteristics of prometabolite produced by the strain were investigated.

가. end. 프로메타볼라이트pro metabolite 원료의 in vitro 효능평가 In vitro efficacy evaluation of raw materials

(1). Helicobacter pylori 동정(One). Identification of Helicobacter pylori

Helicobacter pylori 균주는 한림대학교 병원성 연구소로부터 위장질환 환자의 조직에서 분리한 균주를 분양받아 사용하였다. The Helicobacter pylori strain was used after receiving the strain isolated from the tissue of a patient with gastrointestinal disease from the Institute of Pathogenesis of Hallym University.

분리된 군주의 확인 및 균의 특성을 규명하기 위하여, 16S rRNA 유전자 시퀀싱(도 8) 및 생화학적 특성을 조사한 결과 (표 9, 10, 11), 분리된 균주는 H. pylori 균주로 확인되었으며, 본 연구의 항균활성 시험에 사용하였다.In order to identify the isolated monarch and characterize the fungus, 16S rRNA gene sequencing (FIG. 8) and biochemical properties were investigated (Tables 9, 10, 11), the isolated strain was identified as H. pylori strain, It was used for the antimicrobial activity test in this study.

No.No. 생화학 테스트biochemical test 결과result 1One 커탈라제catalase 양성(Positive)Positive 22 옥시다제oxidase 양성positivity 33 우레아제urease 양성positivity 44 세팔로틴(Cephalothin) Cephalothin 민감성sensitivity 55 달리딕스산(Nalidixic acid)Nalidixic acid 저헝성Zheheng Province

스트레인
번호strain
number 상동성에 기초한 동정 스트레인Sympathetic strains based on homology 상동성
(%)homology
(%) 기타Etc Strain 1Strain 1 HelicobacterHelicobacter pylori pylori
oki422oki422 7474 Complete Genome Sequences of Eight Helicobacter pylori Strains with Different Virulence Factor Genotypes and Methylation Profiles, Isolated from Patients with Diverse Gastrointestinal Diseases on Okinawa Island, Japan, Determined Using PacBio Single-Molecule Real-Time Technology Helicobacter pylori oki422 was isolated from patient with atrophy by the Department of Endoscopy, University Hospital, University of the Ryukyus, 207 Uehara, Nishihara, Okinawa 903-0215, Japan Complete Genome Sequences of Eight Helicobacter pylori Strains with Different Virulence Factor Genotypes and Methylation Profiles, Isolated from Patients with Diverse Gastrointestinal Diseases on Okinawa Island, Japan, Determined Using PacBio Single-Molecule Real-Time Technology Helicobacter pylori oki422 was isolated from patient with atrophy by the Department of Endoscopy, University Hospital, University of the Ryukyus, 207 Uehara , Nishihara, Okinawa 903-0215, Japan Strain 2Strain 2 HelicobacterHelicobacter pylori pylori 7777 Detection of high-level tetracycline resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori using PCR-RFLP
Submitted (17-APR-2003) Gastroenterology and Hepatology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Dr. Molewaterplein 40, Room L-459, Rotterdam, ZH 3015GD, The Netherlands Detection of high-level tetracycline resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori using PCR-RFLP
Submitted (17-APR-2003) Gastroenterology and Hepatology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Dr. Molewaterplein 40, Room L-459, Rotterdam, ZH 3015GD, The Netherlands Strain 3Strain 3 HelicobacterHelicobacter
nemestrinaenemestrinae 8080 The phylogenetic position of Helicobacter nemestrinae
Int. J. Syst. Bacteriol. 43 (2), 386-387 (1993) Submitted (28-JUL-1992) E. Stackebrandt, Department of Microbiology, University of Queensland, St Lucia, 4072, AUSTRALIA The phylogenetic position of Helicobacter nemestrinae
Int. J. Syst. Bacteriol. 43 (2), 386-387 (1993) Submitted (28-JUL-1992) E. Stackebrandt, Department of Microbiology, University of Queensland, St Lucia, 4072, AUSTRALIA Strain 4Strain 4 HelicobacterHelicobacter pylori pylori
oki422oki422 7474 Detection of high-level tetracycline resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori using PCR-RFLP
Submitted (17-APR-2003) Gastroenterology and Hepatology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Dr. Molewaterplein 40, Room L-459, Rotterdam, ZH 3015GD, The Netherlands Detection of high-level tetracycline resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori using PCR-RFLP
Submitted (17-APR-2003) Gastroenterology and Hepatology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Dr. Molewaterplein 40, Room L-459, Rotterdam, ZH 3015GD, The Netherlands Strain 5Strain 5 HelicobacterHelicobacter pylori pylori 7474 Helicobacter pylori 35A, complete genome.
Submitted (08-JUL-2010) Human Genome Sequencing Center, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Houston, TX 77030, USA Helicobacter pylori 35A, complete genome.
Submitted (08-JUL-2010) Human Genome Sequencing Center, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Houston, TX 77030, USA Strain 6Strain 6 HelicobacterHelicobacter pylori pylori 8181 A comparison of 16S ribosomal DNA sequences from five isolates of Helicobacter
pylori
Submitted (08-AUG-2011) National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD 20894, USA A comparison of 16S ribosomal DNA sequences from five isolates of Helicobacter
pylori
Submitted (08-AUG-2011) National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD 20894, USA Strain 7Strain 7 HelicobacterHelicobacter pylori pylori
strain strain ATCCATCC 43504 43504 7474 Complete Genome Sequences of Eight Helicobacter pylori Strains with Different Virulence Factor Genotypes and Methylation Profiles, Isolated from Patients with Diverse Gastrointestinal Diseases on Okinawa Island, Japan, Determined Using PacBio Single-Molecule Real-Time Technology Helicobacter pylori oki422 was isolated from patient with atrophy by the Department of Endoscopy, University Hospital, University of the Ryukyus, 207 Uehara, Nishihara, Okinawa 903-0215, Japan Complete Genome Sequences of Eight Helicobacter pylori Strains with Different Virulence Factor Genotypes and Methylation Profiles, Isolated from Patients with Diverse Gastrointestinal Diseases on Okinawa Island, Japan, Determined Using PacBio Single-Molecule Real-Time Technology Helicobacter pylori oki422 was isolated from patient with atrophy by the Department of Endoscopy, University Hospital, University of the Ryukyus, 207 Uehara , Nishihara, Okinawa 903-0215, Japan

Figure pat00011
Figure pat00011

(2). Helicobacter pylori 생장배지 표준화(2). Helicobacter pylori growth medium standardization

분양받은 H. pylori의 배양 및 항균활성 평가를 위하여 상업용 배지와 실험실 규모 배지조성을 표준화하기 위해, 하기 표 12와 같이 H. pylori의 배지조성을 달리하고, 혈액(blood) 2% (v/v) 첨가한 후 배양시간에 따른 생육을 조사하였다.In order to standardize the commercial medium and laboratory-scale medium composition for culture and antibacterial activity evaluation of the received H. pylori , the medium composition of H. pylori was changed as shown in Table 12 below, and 2% (v/v) blood was added. After that, the growth according to the incubation time was investigated.

배양 배지culture medium 1One Columbia 브로쓰 (CB)Columbia Broth (CB) 22 Columbia 브로쓰 (CBB) (2% 혈액) Columbia Broth (CBB) (2% blood) 33 Tryptic Soy 브로쓰 (TSB) Tryptic Soy Broth (TSB) 44 Tryptic Soy Broth (TSBB) (2% 혈액)Tryptic Soy Broth (TSBB) (2% blood) 55 Brain Heart Infusion 브로쓰 (BHIB) Brain Heart Infusion Broth (BHIB) 66 Brain Heart Infusion 브로쓰 (BHIBB) (2% 혈액)Brain Heart Infusion Broth (BHIBB) (2% blood)

도 9에서 보는 바와 같이, H. pylori를 37℃에서 24시간 배양을 한 결과, 모든 시험구에서 시간에 생육이 증가하는 경향을 보였으며, 혈액 첨가 전후 및 배지조성에 따른 생육의 차이는 나타나지 않아, 항균활성 평가에 TSB 배지를 표준배지로서 사용하였다.As shown in FIG. 9 , as a result of culturing H. pylori at 37° C. for 24 hours, growth tended to increase over time in all test groups, and there was no difference in growth between before and after the addition of blood and depending on the medium composition. , TSB medium was used as a standard medium for the evaluation of antibacterial activity.

(3). 프로바이오틱스의 프로메타볼라이트 항균활성 특성 규명(3). Characterization of the antibacterial activity of prometabolites of probiotics

위로부터 분리한 4종의 Helicobacter 균주 중 H. pylori-1 균주에 대하여, 프로바이오틱스와 프로메타볼라이트의 항균활성을 평가하여 항균활성의 특성을 규명하고자 하였다.Among the four Helicobacter strains isolated from the above, the antimicrobial activity of H. pylori -1 was evaluated by evaluating the antimicrobial activity of probiotics and prometabolite.

프로바이오틱스 배양액으로부터 프로메타볼라이트를 분리한 후에 항균활성을 평가한 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, 프로메타볼라이트 농도에 따라 유의하게 클리어존이 형성되었으며, 따라서 프로바이오틱스의 항균활성은 생산된 프로메타볼라이트로부터 기인된 것으로 확인되었다.As a result of evaluating the antibacterial activity after separating prometabolite from the probiotic culture medium, as shown in FIG. 10 , a clear zone was significantly formed according to the prometabolite concentration, and thus the antibacterial activity of the probiotics was It was confirmed to originate from the ballite.

(4). 프로메타볼라이트의 항균활성 평가(4). Evaluation of antibacterial activity of prometabolite

위로부터 분리한 4종의 Helicobacter 균주 중 H. pylori-1과 H. pylori-2 균주 2종을 선별하여 프로메타볼라이트의 항균활성 평가에 사용하였다. Among the four Helicobacter strains isolated from the above, two H. pylori -1 and H. pylori -2 strains were selected and used to evaluate the antimicrobial activity of prometabolite.

항균활성 평가에 사용된 프모메타볼라이트 시료는 앞서 선별된 4종의 프로바이오틱스 균주 중 항균활성이 상대적으로 우수했던 S31(Pediococcus lolii)과 S33(Pediococcus acidilatici)을 선정하고, 각각의 균주를 배양하여 얻은 프로메타볼라이트를 항균활성 평가에 사용하였다.The pmo metabolite sample used for the evaluation of antibacterial activity was S31 ( Pediococcus), which had relatively excellent antibacterial activity among the four probiotic strains previously selected. lolii ) and S33 ( Pediococcus ) acidilatici ), and prometabolite obtained by culturing each strain was used for the evaluation of antibacterial activity.

H. pylori에 대한 프모메타볼라이트의 항균활성 평가 결과, 도 11에서 보는 바와 같이, 2종의 프로메타볼라이트를 각각 단일로 처치한 실험구에서도 우수한 활성을 나타내었지만, 2종을 혼합분주한 실험구에서는 더 높은 활성을 보였다. As a result of the evaluation of the antibacterial activity of pmo metabolite against H. pylori , as shown in FIG. 11 , it showed excellent activity even in the experimental group in which two kinds of prometabolites were treated individually, but the two kinds of prometabolite were mixed and dispensed. The experimental group showed higher activity.

또한, 도 12에서 보는 바와 같이, S31과 S33가 생산한 프로메타볼라이트는 E. coli, S. aureus, B. cereus 항균활성 실험에서도 높은 활성을 나타내었다.In addition, as shown in FIG. 12 , prometabolite produced by S31 and S33 exhibited high activity in the E. coli , S. aureus , and B. cereus antibacterial activity tests.

S31과 S33 균주가 생산하는 프로메타볼라이트 50 μL를 2종의 H. pyroli균에 처리한 후 프로메타볼라이트가 H. pyroli에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 관찰한 결과, 도 13에서 보는 바와 같이, 프로메타볼라이트를 처리한 H. pyroli의 세포벽의 손상을 관찰하였고, 프로메타볼라이트를 단독으로 처리한 시험구보다 서로 다른 균주가 생산한 프로메타볼라이트 혼합물을 처리한 경우 세포 손상이 더 높은 것으로 관찰되었다. In order to observe the effect of prometabolite on H. pyroli after 50 μL of prometabolites produced by S31 and S33 strains were treated with two types of H. pyroli, transmission electron microscopy (TEM) was used. As a result of the observation, as shown in FIG. 13 , damage to the cell wall of H. pyroli treated with prometabolite was observed, and prometabolite produced by different strains than the test group treated with prometabolite alone Higher cell damage was observed when the mixture was treated.

본 연구의 결과에서 병원성 세균이 억제되는 기전은 프로바이오틱스로부터 생성되는 젖산과 그에 따른 pH 저하, 그리고 박테리오신(bacteriocin)으로 잘 알려진 항균 펩타이드 등의 항균물질의 생성 등 여러 요인이 관련된 것으로 추측되며, 정확한 항균기전 규명에 대한 추가적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.According to the results of this study, the mechanism of suppression of pathogenic bacteria is presumed to be related to several factors, such as lactic acid produced from probiotics and the resulting decrease in pH, and the production of antibacterial substances such as antibacterial peptides well known as bacteriocin. It is considered that additional research is needed to elucidate the mechanism.

(5). 프로메타볼라이트의 항생제 감수성 및 병원성균에 대한 선택성 평가(5). Evaluation of antibiotic sensitivity and selectivity for pathogenic bacteria of prometabolite

프로메타볼라이트의 선택적 항균활성을 평가하기 위하여, 병원성균주 4종과 유산균 3종에 대하여 항균활성을 평가한 결과, 도 13에서 보는 바와 같이, 프로메타볼라이트는 모든 병원성균주에 대하여 전반적으로 저해활성을 보였고, 연구에 사용한 유산균주와 상업적으로 판매하는 유산균의 경우, 선별된 균주 S33이 생성하는 프로메타볼라이트 1과 S31이 생성하는 프로메타볼라이트 2에 대해서는 어떠한 저해활성이 없는 것으로 평가되었다.In order to evaluate the selective antibacterial activity of prometabolite, the antibacterial activity was evaluated for 4 pathogenic strains and 3 lactic acid bacteria. As shown in FIG. 13, prometabolite was generally inhibited against all pathogenic strains. In the case of lactic acid strains used in the study and commercially sold lactic acid bacteria, it was evaluated that there was no inhibitory activity against prometabolite 1 produced by the selected strain S33 and prometabolite 2 produced by S31. .

또한, 선별된 S33과 S31이 생산하는 프로메타볼라이트는 유해한 병원성균에 대해서는 항균활성을 보인 반면, 유익한 유산균에는 저해활성이 없는 것으로 나타나 병원성균에 대한 선택적 항균활성이 있는 것으로 평가되었다.In addition, prometabolite produced by the selected S33 and S31 showed antibacterial activity against harmful pathogenic bacteria, but did not show inhibitory activity against beneficial lactic acid bacteria, which was evaluated to have selective antibacterial activity against pathogenic bacteria.

따라서, 선별된 유산균이 생성하는 프로메타볼라이트는 장내에서 유해균은 저해하는 한편, 유익한 프로바이오틱스 균주에 좋은 영향을 미칠 것으로 사료된다.Therefore, it is thought that prometabolite produced by the selected lactic acid bacteria inhibits harmful bacteria in the intestine and has a good effect on beneficial probiotic strains.

나. I. 프로메타볼라이트pro metabolite 원료의 안정성 및 안전성 규명 Identification of stability and safety of raw materials

(1). 프로메타볼라이트 원료의 내열성 평가(One). Heat resistance evaluation of prometabolite raw materials

프로바이오틱스 균주가 생산하는 프로메타볼라이트의 열 안정성을 관찰하기 위하여, 선별된 프로매타볼라이트 원료 2종과 상업용 균주로부터 분리한 프로메타볼라이트를 60, 70, 80, 90 그리고 121℃에서 15분간 열처리한 후 항균활성을 평가하여 비교한 결과, 도 16에서 보는 바와 같이, 상업용으로 이용하는 프로바이오틱스균주에 비해 선별된 프로바이오틱스균주 S31 및 S33의 메타볼라이트는 높은 온도에서도 내열성 보여 열에 매우 안정한 것으로 확인되었다.In order to observe the thermal stability of prometabolites produced by probiotic strains, two selected prometabolite raw materials and prometabolites isolated from commercial strains were incubated at 60, 70, 80, 90 and 121℃ for 15 minutes. As a result of evaluating and comparing the antimicrobial activity after heat treatment, as shown in FIG. 16 , the metabolite of the probiotic strains S31 and S33 selected compared to the commercially used probiotic strains showed heat resistance even at high temperatures, and it was confirmed that they were very stable to heat.

기능성 식품원료의 제조 과정 중 가장 문제가 되는 것은 가공 적성과 보존성인데, 제품의 생산과정 중 다양한 공정에서 열이 발생하게 되며, 특히 살균처리 과정에서 고온의 열이 발생하게 되므로 원료의 열안정성이 매우 중요하다.The most problematic during the manufacturing process of functional food raw materials is processing aptitude and preservation. Heat is generated in various processes during the production process of the product, and in particular, high temperature heat is generated during the sterilization process, so the thermal stability of raw materials is very high. It is important.

따라서, 본 연구의 결과 선별된 프로바이오틱스 균주가 생산하는 프로메타볼라이트 원료는 멸균 공정에 해당하는 121℃에서도 안정한 것으로 확인되어, 열에 대한 가공 적성이 매우 우수한 것으로 평가되었다.Therefore, as a result of this study, the prometabolite raw material produced by the selected probiotic strain was confirmed to be stable even at 121° C., which corresponds to the sterilization process, and was evaluated to have very good processing aptitude against heat.

(2). 프로메타볼라이트 원료의 소화효소에 대한 항균활성 안정성 평가(2). Evaluation of the stability of antibacterial activity against digestive enzymes of prometabolite raw materials

선별된 프로바이오틱스가 생산한 프로메타볼라이트에 대해서 3mg/mL 펩신과 1mg/mL 판크레아틴 등 소화효소에 대한 안정성을 평가한 결과, 도 17에서 보는 바와 같이, 상업용 균주에 비해 효소처리 후 활성이 크게 감소하지 않아 위장관 내의 환경에서도 항균활성에 대한 안정성이 매우 높은 것으로 평가되었다. As a result of evaluating the stability of digestive enzymes such as 3mg/mL pepsin and 1mg/mL pancreatin for prometabolite produced by the selected probiotics, as shown in FIG. 17, the activity after enzyme treatment was significantly higher than that of the commercial strain. It did not decrease, so it was evaluated that the stability of antibacterial activity was very high even in the environment of the gastrointestinal tract.

(3). 프로메타볼라이트 원료의 세포독성 평가(3). Cytotoxicity evaluation of prometabolite raw materials

선별된 프로바이오틱스 균주 S33이 생산한 프로메타볼라이트 추출물을 HeLa 및 KB 세포에 처리하여 세포의 생육억제 정도를 측정한 결과, 도 18에서 보는 바와 같이, 프로메타볼라이트를 10, 50 μg/mL 농도로 처리하였을 때 HeLa 및 KB 세포의 생육이 억제되지 않았으며, 가장 높은 농도인 100 μg/mL은 24시간 배양했을 때 10% 미만으로 감소한 것으로 나타났다.As a result of measuring the degree of cell growth inhibition by treating the prometabolite extract produced by the selected probiotic strain S33 to HeLa and KB cells, as shown in FIG. 18, prometabolite was added at a concentration of 10 and 50 μg/mL. The growth of HeLa and KB cells was not inhibited when treated with , and the highest concentration of 100 μg/mL was reduced to less than 10% when cultured for 24 hours.

따라서, 프로바이오틱스균주 S33이 생산하는 프로메타볼라이트는 정상세포에 대해서 세포독성을 유발시키지 않는 것으로 평가되었다. Therefore, it was evaluated that prometabolite produced by the probiotic strain S33 did not induce cytotoxicity to normal cells.

(4). 프로메타볼라이트 원료의 HET-CAM 어세이(4). HET-CAM Assay of Prometabolite Raw Material

선별된 4종의 프로바이오틱스 균주 S15, S31, S33 및 S35가 생산한 프로메타볼라이트 원료에 대해서 HET-CAM 어세이를 수행한 결과, 하기 표 13에서 보는 바와 같이, 모든 시험구에서 출혈, 용해 및 응고 현상이 관찰되지 않아 프로메타볼라이트 원료는 독성 및 알러지를 유발시키지 않는 것으로 평가되었다.As a result of performing a HET-CAM assay on the prometabolite raw material produced by the four selected probiotic strains S15, S31, S33 and S35, as shown in Table 13 below, bleeding, dissolution and Since no coagulation was observed, it was evaluated that the raw material of prometabolite did not cause toxicity and allergy.

시료 sample Irritation scoreIrritation score Irritation assessment Irritation assessment 음성 대조군negative control 00 Non-irritantNon-irritant NaOH (0.1M)NaOH (0.1M) 18.8218.82 Strong irritantStrong irritant S15S15 00 Non-irritantNon-irritant S31S31 00 Non-irritantNon-irritant S33S33 00 Non-irritantNon-irritant S35S35 00 Non-irritantNon-irritant

4. 4. 프로바이오틱스probiotics // 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 지표(활성) 성분 규명 및 분석 Identification and analysis of raw material indicator (active) ingredients

프로바이오틱스 유래 프로메타볼라이트 원료의 지표(활성)성분을 규명하기 위하여, 선별된 프로메타볼라이트 2종의 배양액으로부터 활성물질의 정제를 통하여 특성을 규명하고자 하였다.In order to identify the indicator (active) component of prometabolites-derived raw materials, it was attempted to characterize the active substances through purification of the two selected prometabolite cultures.

2종의 프로바이오틱스 S31(Pediococuus lolii) 및 S33(Pediococcus acidilatici)의 배양 상등액을 추출한 후에 30 kDa에서 10 kDa 까지 UF 필터를 사용하여 한와 여과(ultrafiltration)를 수행하여 분자량에 따라 분획물을 제조하였다.Two kinds of probiotics S31 ( Pediococuus lolii ) and S33 ( Pediococcus acidilatici ) After extracting the culture supernatant, ultrafiltration was performed using a UF filter from 30 kDa to 10 kDa to prepare fractions according to molecular weight.

분자량에 따라 조제된 각 분획물을 Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus ATCC 19095, Bacillus cereus ATCC 14576 및 Helicobacter pylori에 대한 항균효과를 평가한 결과, 도 19에서 보는 바와 같이, 모든 분획물에서 항균활성이 나타는 것으로 확인되었다.Each fraction prepared according to the molecular weight of Escherichia As a result of evaluating the antibacterial effect on coli O157:H7, Staphylococcus aureus ATCC 19095, Bacillus cereus ATCC 14576 and Helicobacter pylori , as shown in FIG. 19 , it was confirmed that all fractions exhibited antimicrobial activity.

분획물의 항균활성의 정도는 30 kDa 이상의 고분자를 포함한 분획물에 대해서 10kDa 이하의 분자량을 가지는 분획물의 항균활성이 유사한 활성을 보인 것으로부터, 활성물질은 10kDa 이하의 분자량을 갖는 것으로 추정하였다.As for the degree of antimicrobial activity of the fraction, it was estimated that the active material had a molecular weight of 10 kDa or less from the fact that the antimicrobial activity of the fraction having a molecular weight of 10 kDa or less was similar to the fraction containing a polymer of 30 kDa or more.

5. 5. 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 생산조건 확립 Establishment of raw material production conditions

최종 원료생산 균주로서 선정한 Pediococcus acidilatici 균주를 이용하여 대량생산을 위한 생산조건을 확립하고자 하였다. Pediococcus selected as the final raw material production strain acidilatici strain was used to establish production conditions for mass production.

가. end. 프로바이오틱스의of probiotics 프로메타볼라이트pro metabolite 생산조건 확립 Establishment of production conditions

(1). 프로바이오틱스 배양 배지조성 확립(One). Establishment of probiotic culture medium composition

프로메타볼라이트 원료의 대량생산을 위한 기초연구로서 시험용 MRS 배지조성에 대하여, 하기 표 14와 같이, 경제성을 고려한 수정된 MRS 배지조성을 설계하여 프로메타볼라이트의 최적 생산조건을 확인하고자 하였디.As for the MRS medium composition for testing as a basic study for mass production of prometabolite raw materials, as shown in Table 14 below, a modified MRS medium composition was designed in consideration of economic feasibility to confirm the optimal production conditions of prometabolite.

MRSMRS g/Lg/L 수정된 MRSModified MRS g/Lg/L 프로테오스 펩톤 proteose peptone 1010 카제인 펩톤 casein peptone 1515 비프 추출물 Beef Extract 1010 효모 추출물 yeast extract 1010 효모 추출물 yeast extract 55 포도당 glucose 2020 덱스트로스 dextrose 2020 아세트산나트륨 sodium acetate 55 구연산암모늄 Ammonium Citrate 1One 디포타슘포스페이트(K2HPO4)Dipotassium phosphate (K 2 HPO 4 ) 22 아세트산나트륨 sodium acetate 22 구연산나트륨 sodium citrate 22 황산마그네슘 magnesium sulfate 55 황산마그네슘 magnesium sulfate 0.10.1 황산망간 manganese sulfate 0.10.1 황산망간 manganese sulfate 0.050.05 폴리솔베이트 80 Polysorbate 80 0.050.05 폴리솔베이트 80 Polysorbate 80 1One 디포타슘포스페이트(K2HPO4)Dipotassium phosphate (K 2 HPO 4 ) 2.02.0

프로바이오틱스 온도는 30, 37℃의 2가지로 설정하였으며, 균주 접종량은 2%(v/v) 설정한 후 시간에 따른 항균활성을 비교한 결과, 도 20에서 보는 바와 같이, 두 시험구 모두 배양시간 18시간 이후에 항균활성이 나타났으며, 37℃ 배양 시험구에서 보다 높은 항균활성을 나타내었다.The probiotic temperature was set to 30 and 37 ° C., and the strain inoculation amount was set at 2% (v/v), and as a result of comparing the antibacterial activity according to time, as shown in FIG. 20, incubation time for both test groups Antibacterial activity appeared after 18 hours, and higher antibacterial activity was exhibited in the 37 ℃ culture test group.

따라서, 상업용 배지성분으로 조성한 수정된 MRS 배지조성은 Pediococcus acidilactic의 프로메타볼리아트 대량생산을 위한 배양 배지로서 적합한 것으로 평가되었다. Therefore, the modified MRS medium composition composed of commercial medium components was evaluated to be suitable as a culture medium for mass production of Pediococcus acidilactic prometabolith.

(2). 반응표면 분석(RSM)을 이용한 프로메타볼라이트의 최적 생산조건 분석(2). Analysis of Optimal Production Conditions for Prometabolite Using Response Surface Analysis (RSM)

프로바이오틱스가 생산하는 프로메타볼라이트 생산에 각 변수가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 온도 (temperature), 교반조건 (agitation) 및 생산수율 (biomass production)의 3개의 변수 중 1개의 독립변수를 최적점에 고정시킨 후, 나머지 2개의 변수를 이용하여 삼차원 형태로 교호작용을 확인하였다.In order to confirm the effect of each variable on the production of prometabolite produced by probiotics, one independent variable among the three variables of temperature, agitation, and biomass production was set to the optimal point. After fixing, the interaction was confirmed in a three-dimensional form using the remaining two variables.

주어진 데이터 균체량 증가에 각 변수가 미치는 영향을 쉽게 확인하기 위하여, 3개의 변수 중 1개의 독립변수를 최적점에 고정시킨 후 나머지 2개의 변수를 이용하여 삼차원 그래프 형태로 교호작용을 확인하였다.In order to easily check the effect of each variable on the increase in the amount of cells in the given data, one independent variable among the three variables was fixed at the optimal point, and then the interaction was confirmed in the form of a three-dimensional graph using the remaining two variables.

주어진 데이터에 대한 정확한 최적점을 찾기 위하여 모수추정에 의한 회귀식을 바탕으로 능선분석을 수행한 결과, 도 21에서 보는 바와 같이, 반응표면분석을 통하여 균체 생장에 가장 영향을 주는 독립변수의 농도에 따른 최적 생산조건은 온도 36.15℃, 교반속도 160 rpm, 균체접종량 2.81% 및 배양시간 38.45시간으로 확인되었다.As a result of performing ridge analysis based on the regression equation by parameter estimation to find the exact optimum point for the given data, as shown in FIG. 21 , the concentration of the independent variable that has the most influence on the cell growth was analyzed through the response surface analysis. The optimal production conditions were confirmed to be a temperature of 36.15° C., agitation speed of 160 rpm, a cell inoculation amount of 2.81%, and an incubation time of 38.45 hours.

도 21에서, (A)는 온도(X1) 및 교반(X2) 바이오매스 생성(Y, 반응값)의 영향을 보여주는 반응표면 플롯이고, (B)는 바이오매스 생성(X1) 및 온도(X3) 접종원 크기(Y, 반응값)의 영향을 보여주는 반응표면 플롯이며, (C)는 온도(X2) 및 인큐베이션 기간(X3) 바이오매스 생성(Y, 반응값)의 영향을 보여주는 반응표면 플롯을 나타낸 것이다.In Figure 21, (A) is a response surface plot showing the effect of temperature (X1) and stirring (X2) biomass production (Y, response value), (B) is biomass production (X1) and temperature (X3) Response surface plot showing the effect of inoculum size (Y, response value), (C) is a response surface plot showing the effect of temperature (X2) and incubation period (X3) biomass production (Y, response value) .

또한, (D)는 접종원 크기(X1) 및 교반(X2) 바이오매스 생성(Y, 반응값)의 영향을 보여주는 반응표면 플롯이고, (E)는 바이오매스 생성(X1) 교반 및 인큐베이션 기간(X3) 바이오매스 생(Y, 반응값)의 영향을 보여주는 반응표면 플롯이며, (F)는 접종원 크기(X2) 및 인큐베이션 기간(X3) 바이오매스 생성(Y, 반응값)의 영향을 보여주는 반응표면 플롯을 나타낸 것이다. Also, (D) is a response surface plot showing the effect of inoculum size (X1) and agitation (X2) biomass production (Y, response value), (E) is biomass production (X1) agitation and incubation period (X3) ) is a response surface plot showing the effect of biomass production (Y, response value), (F) is a response surface plot showing the effect of inoculum size (X2) and incubation period (X3) biomass production (Y, response value) is shown.

나. I. 프로바이오틱스의of probiotics 대량생산 배양조건 확립 Establishment of mass production culture conditions

(1). 배지조성 설정(One). Badge composition settings

프로바이오틱스의 대량생산 배양 조건 확립을 위하여, 하기 표 15와 같이,시험에 사용된 MRS 배지조성을 기초로 하여 보다 경제성이 높은 상업용 배지성분으로 수정하였다.In order to establish the culture conditions for mass production of probiotics, as shown in Table 15 below, based on the MRS medium composition used in the test, it was modified with more economical commercial medium components.

배지성분medium ingredients 함량 (g/L)Content (g/L) 비고remark 포도당glucose 20.0020.00 무수포도당anhydrous glucose 카제인 펩톤casein peptone 15.0015.00 CNFCNF 효모 추출물yeast extract 10.0010.00 Angel yeastAngel yeast 아세트산나트륨(Sodium acetate)Sodium acetate 5.005.00 삼전화학Samchun Chemical 디포타슘포스페이트(K2HPO4)Dipotassium phosphate (K 2 HPO 4 ) 2.002.00 개별 멸균 Individual sterilization 구연산나트륨(Sodium citrate)Sodium citrate 2.002.00 황산마그네슘(Magnesium sulfate)Magnesium sulfate 0.100.10 황산 망간(Manganese sulfate)Manganese sulfate 0.050.05 폴리솔베이트 80(Polysorbate 80)Polysorbate 80 1.001.00 Tween 80Tween 80 LS300 (소포제)LS300 (Antifoam) 0.40.4 1/5배 희석 용액1/5-fold dilution solution

(2). P. acidilactici의 전 배양(Seed culture)(2). Pre-culture of P. acidilactici (Seed culture)

기초활성 평가결과를 통하여 선별된 P. acidilatici 균주에 대하여 대량생산을 위한 스케일-업 테스트를 위하여, 도 22와 같은 5L 용량의 JAR 퍼멘터를 이용하여 연속배양 테스트를 수행하여 프로바이오틱스의 최적 생산조건을 확인하고자 하였다. For the scale-up test for mass production for the P. acidilatici strain selected through the evaluation result of the basic activity , a continuous culture test was performed using a JAR Fermenter of 5L capacity as shown in FIG. 22 to determine the optimal production conditions of probiotics. wanted to confirm.

시험을 위하여, 도 23에서 보는 바와 같이 P. acidilatici 균주를 MRS 배지 플레이트(media plate)에 스트리킹한 후, 37℃ 배양조에서 48시간 동안 배양하여 단일 콜로니(single colony)를 분리한 후에, 상기 단일 콜로니를 500mL 배플드 플라스크에 100mL의 용량으로 제1차 seeding한 후에 37℃에서 150rpm으로 17시간 동안 배양하였다.For the test, as shown in FIG. 23 , the P. acidilatici strain was streaked on an MRS medium plate, and then cultured for 48 hours in a 37° C. culture tank to isolate a single colony, and then Colonies were first seeded in a 500mL baffled flask at a volume of 100mL and then incubated at 37°C at 150rpm for 17 hours.

제1차 전 배양 후의 플라스크 배양액은 흡광도 600nm 및 pH 4.37 이었으며, 균주의 농도는 3.2 × 109 CFU/mL 이었다.The flask culture solution after the first pre-culturing had an absorbance of 600 nm and a pH of 4.37, and the concentration of the strain was 3.2 × 10 9 CFU/mL.

(3). Pediococcus acidilactici의 5L 연속배양(3). Pediococcus 5L continuous culture of acidilactici

제1차 전 배양한 균주를 5%의 농도로 도 24와 같이 5L 용량의 JAR 퍼멘터에 2.5L의 배양배지에 접종한 후에 37℃, 0.5vvm, 400rpm, pH 6.2의 조건에서 48시간 동안 연속배양 하였다.The first pre-cultured strain was inoculated in 2.5L of culture medium in 5L of JAR Fermenter as shown in FIG. 24 at a concentration of 5%, and then continuously for 48 hours at 37°C, 0.5vvm, 400rpm, pH 6.2. incubated.

배양 중 pH를 조정하기 위하여, 4N NaOH를 100mL로 분주(feeding) 하였으며, 배양시간 중에 거품(foam)은 형성하지 않는 것으로 관찰되어 소포제는 사용하지 않았다.In order to adjust the pH during culture, 4N NaOH was fed to 100 mL, and it was observed that no foam was formed during the incubation time, so an antifoaming agent was not used.

Pediococcus acidilatici 균주를 2개의 5L JAR 퍼멘터를 이용하여 48시간 동안 연속 배양한 결과, 도 25 및 하기 표 16에서 보는 바와 같이, 균체의 증식량은 두 가지 퍼멘터 모두 24시간에서 10 log로 최대 생육을 나타내는 것으로 나타났으며, 48시간까지 균체의 수가 유지되는 것으로 확인되었다. Pediococcus acidilatici strains were continuously cultured for 48 hours using two 5L JAR Fermenters, as shown in FIG. 25 and Table 16 below, the growth amount of the cells was the maximum growth from 24 hours to 10 log in both of the Fermenters. It was confirmed that the number of cells was maintained until 48 hours.

시료sample 24 시간24 hours 48 시간48 hours 비고remark O.D.
(600 nm)OD
(600 nm) Cell 수
(CFU/mL)number of cells
(CFU/mL) O.D.
(600 nm)OD
(600 nm) Cell 수
(CFU/mL)number of cells
(CFU/mL) 퍼멘터 AFermentor A 5.75.7 1.8×109 1.8×10 9 4.44.4 1.4×109 1.4×10 9 pH 6.2pH 6.2 퍼멘터 BFermentor B 6.46.4 2.2×109 2.2×10 9 6.16.1 1.7×109 1.7×10 9 pH 6.2pH 6.2

6. 6. 프로바이오틱스probiotics 및 and 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 대량생산 공정 개발 및 Development of raw material mass production process and 표준Standard 화anger

프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트 원료의 생산조건 시험을 통하여 확립된 공정조건을 적용하여 양산용 34톤 바이오리액터를 이용한 대량생산의 기초공정을 설계하였다.The basic process for mass production using a 34-ton bioreactor for mass production was designed by applying the process conditions established through the production condition test of probiotics and prometabolite raw materials.

가. end. 프로바이오틱스probiotics 및 and 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 제조공정도 Raw material manufacturing process diagram

프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트 원료 3톤 생산을 기준으로 도 27과 같은 기초 공정을 설정하였다.The basic process as shown in FIG. 27 was set based on the production of 3 tons of probiotics and prometabolite raw materials.

(1). 원재료(One). Raw materials

식품 첨가물 및 식품 기준 및 규격에 적합한 원료를 구입하고, 자체 검사를 합격한 원료를 사용하며, 배양에 관련된 원재료는 전자저울을 이용하여 각각 칭량하여 사용하였다.Raw materials suitable for food additives and food standards and specifications were purchased, raw materials that passed self-inspection were used, and raw materials related to culture were individually weighed using an electronic scale.

유산균 배양에 사용하는 Pediococcus acidilatici 균주는 냉동고(-70℃)에서 글리세롤 보관 중인 튜브를 사용하였다. Pediococcus used for culturing lactic acid bacteria acidilatici strain was used in a tube stored in glycerol in a freezer (-70 ℃).

1, 2, 3차 전 배양 및 주 발효 배지의 조성은 포도당 20 g/L, 카제인 펩톤 15 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 아세트산나트륨 5 g/L, K2HPO4 2 g/L, 구연산나트륨 2 g/L, 황산마그네슘 0.1 g/L, 황산망간 0.05 g/L 및 폴리솔베이트 80 1 g/L를 포함한다.The composition of the 1st, 2nd and 3rd pre-culture and main fermentation medium is glucose 20 g/L, casein peptone 15 g/L, yeast extract 10 g/L, sodium acetate 5 g/L, K 2 HPO 4 2 g/L , sodium citrate 2 g/L, magnesium sulfate 0.1 g/L, manganese sulfate 0.05 g/L, and polysorbate 80 1 g/L.

(2). 발효(2). Fermentation

주 발효는 2,375 L의 물에 3,000 L에 해당하는 배지 성분을 칭량한 후, 6,000 L 배양기에서 멸균하여 주 발효 배지를 제조하였다. 이 때, 2,375 L의 물을 사용하면 멸균 후 2,850L로 부피가 늘게 되는데, 이는 3차 전 배양 배양액 150 L를 첨가하기 때문이다.The main fermentation medium was sterilized in a 6,000 L incubator after weighing the medium components corresponding to 3,000 L in 2,375 L of water to prepare the main fermentation medium. At this time, if 2,375 L of water is used, the volume will increase to 2,850 L after sterilization, which is because 150 L of the culture medium before the third is added.

제조된 2,850 L의 주 발효 배지에 3차 발효된 균주를 150 L 농도로 접종하고, 37 ℃, 0.5 vvm, 24~48 시간 동안 배양하여 생산하였다.The tertiary fermented strain was inoculated into the prepared 2,850 L main fermentation medium at a concentration of 150 L, and cultured at 37 ° C., 0.5 vvm, for 24-48 hours.

(3). 농축(3). concentration

유산균 배양액을 농축하기 위하여, 농축기(evaporator)를 사용하는데, 진공증발 농축기를 이용하여 발효액을 약 5배 정도로 농축시켰다.In order to concentrate the lactic acid bacteria culture, an evaporator is used, and the fermentation broth is concentrated about 5 times using a vacuum evaporator.

(4). 분무 건조(4). spray drying

농축 공정이 종료된 유산균 배양 농축액을 분무 건조기를 이용하여 분말화 작업을 실시하였다. 이 때, 상기 분말화 조건은 입구 온도 200~210℃, 출구 온도 100~90℃로 설정하여 진행하였다.The lactic acid bacteria culture concentrate after the concentration process was completed was powdered using a spray dryer. At this time, the powdering conditions were carried out by setting an inlet temperature of 200 to 210 °C and an outlet temperature of 100 to 90 °C.

(5). 유산균 배양분말 포장(5). Lactobacillus culture powder packaging

분말의 입도 등을 기준으로 하여 분말의 품질규격을 검사하였다.The quality standard of the powder was inspected based on the particle size of the powder.

나. 제조공정에 사용된 물질의 규격서I. Specifications of substances used in the manufacturing process

제조공정에 사용된 물질의 규격서는 하기 표 17과 같다.Specifications of materials used in the manufacturing process are shown in Table 17 below.

Figure pat00012
Figure pat00012

8. 8. 프로바이오틱스probiotics // 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 Raw material 시생산trial production

Pediococcus acidilatici 균주를 이용한 프로메타볼라이트 원료의 생산에 대한 기초 공정을 확립하였으며, 최종 확정된 공정을 통하여 발효 탱크를 이용하여 원료의 #3 Lot. 시생산을 수행하였다. Pediococcus The basic process for the production of prometabolite raw materials using the acidilatici strain was established, and the #3 Lot. A trial production was performed.

가. end. 프로바이오틱스probiotics 및 and 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 Raw material 시생산trial production

시험생산 테스트를 통한 생산을 위한 전배양으로부터 대량생산 배양까지의 원재료 최적화는 하기 표 18과 같다.The optimization of raw materials from pre-culture to mass production culture for production through trial production testing is shown in Table 18 below.

Figure pat00013
Figure pat00013

유산균주의 생산 테스트는 100ml 스타트 배양(start culture) 후에 1L(1st seed) 로부터 150L(2nd seed) 및 3KL(3rd seed)로 스케일-업의 과정으로 수행하였다.The production test of the lactic acid strain was performed as a process of scale-up from 1L (1 st seed) to 150L (2 nd seed) and 3KL (3 rd seed) after 100ml start culture.

각각의 배양 시점에 대하여, 0, 4, 8, 12, 15, 16, 18 및 24 시간에 시료를 샘플링하여 pH, OD, 세포생존능(cell viability) 등의 생장 인자를 측정하였으며, 도 30 및 하기 표 19에서 보는 바와 같이, 최종 6KL(도 28 참조) 대량생산 조건에서도 안정적인 생육을 갖는 것으로 확인되었다.For each culture time point, samples were sampled at 0, 4, 8, 12, 15, 16, 18 and 24 hours to measure growth factors such as pH, OD, cell viability, etc. As shown in Table 19, it was confirmed to have stable growth even in the final 6KL (see FIG. 28) mass production conditions.

퍼멘터Fermentor 배양시간 (h)Incubation time (h) OD (600nm)OD (600nm) 1차 전베양1st pre-bearing 2424 2차 전배양Second pre-culture 2424 9.209.20 300L300L 2020 9.689.68 6KL6KL 2424 8.518.51

나. I. 프로바이오틱스probiotics 및 and 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 공정 최적화 Raw material process optimization

프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트 원료의 기본 생산공정에 대하여, 원료 수율의 안정적 증대와 생산성 향상을 위하여 부원료 혼합 공정을 검토하였다.Regarding the basic production process of raw materials for probiotics and prometabolite, the mixing process of auxiliary raw materials was reviewed in order to stably increase the yield of raw materials and improve productivity.

덱스트린(dextrin)은 식품첨가물로서 원료의 기능적 특성을 유지하면서도 관능 및 건조시 생산 안정성이 높아 부원료로 선정하여, 기존 배양공정 후 건조 전 단계에서 혼합 및 분무 건조 공정으로 전환 설계하기 위하여, 부원료 배합비에 따른 활성의 변화를 검토하였다.Dextrin is a food additive that maintains the functional properties of raw materials and has high sensory and dry production stability, so it is selected as an auxiliary raw material. Changes in activity were reviewed.

부원료로서 덱스트린을 배양액 중량대비로 10% (w/w) 및 30% (w/w)으로 혼합하여 건조한 시료와 부원료 없이 건조한 시료에 대하여 활성을 평가한 결과, 도 31에서 보는 바와 같이, 모든 시료에서 1μg/mL ~ 100μg/mL까지 높은 항균활성을 보이는 것으로 확인되었다.Dextrin as an auxiliary material was mixed at 10% (w/w) and 30% (w/w) relative to the weight of the culture medium, and the activity was evaluated for the dried sample and the dry sample without the auxiliary material. As shown in FIG. 31, all samples was confirmed to show high antibacterial activity from 1 μg/mL to 100 μg/mL in

생산 원가와 수율 및 안정성을 고려하여 최적 혼합비는 30% (w/w)으로 설정하였다.In consideration of production cost, yield and stability, the optimum mixing ratio was set to 30% (w/w).

다. All. 프로바이오틱스probiotics 및 and 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 대량공정 설계 및 원료 Raw material mass process design and raw material 시생sasaeng 산mountain

프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트 원료에 대한 스케일-업 테스트로부터 공정 최적화된 생산 공정에 대하여 유산균주의 배양으로부터 부원료를 적용한 최종 건조 단계까지의 생산 공정을 확립하고, 원료의 시생산을 수행하였다.From the scale-up test for probiotics and prometabolite raw materials, to the process-optimized production process, the production process was established from the cultivation of the lactic acid strain to the final drying stage where the auxiliary materials were applied, and the trial production of the raw materials was performed.

프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트 원료의 확립된 최적 생산공정은 도 32와 같다.The established optimal production process of probiotics and prometabolite raw materials is shown in FIG. 32 .

최적화 공정을 통하여 프로바이오틱스 및 프로메타볼라이트 원료를 #3Lot. 시생산을 진행하였고, 도 33에서 보는 바와 같이, 생산된 원료는 고유의 색택과 이미를 갖는 것으로 확인되었으며, 생산된 원료에 대하여 최종 품목명은 '피에이(PA)유산균발효분말'로 하여 품목제조 보고를 하였다.Through the optimization process, probiotics and prometabolite raw materials are #3Lot. Trial production was carried out, and as shown in FIG. 33, it was confirmed that the produced raw material had a unique color and texture, and the final item name for the produced raw material was 'PA lactic acid bacteria fermented powder'. reported

라. 원료의 표준화la. Standardization of raw materials

시생산을 통해 생산된 최종 원료에 대하여 식품원재료로서 사용하기 위한 성분 및 안전성 등 규격을 설정하여 표준화하였다.For the final raw materials produced through trial production, specifications such as ingredients and safety for use as food raw materials were established and standardized.

자가품질 검사 및 공인 시험검사를 통하여 원료의 최종 규격은 도 34a 및 도 34b와 같이 설정하였다.The final specifications of the raw materials were set as shown in FIGS. 34A and 34B through self-quality inspection and official test inspection.

9. 9. 프로바이오틱스probiotics // 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 지표(활성)성분 규명 Identification of raw material indicator (active) ingredients

Pediococcus acidilatici 균주를 이용한 프로메타볼라이트 원료의 항균활성에 대한 지표(활성)성분을 규명하고 분석하고자 하였다. Pediococcus The purpose of this study was to identify and analyze the indicator (active) component for the antibacterial activity of prometabolite raw materials using acidilatici strain.

가. 활성 end. activation 펩타이드의of peptide 분자량 확인 Molecular weight confirmation

Pediococcus acidilatici 균주가 생산하는 항균활성 물질의 특성을 분석한 결과, 3kDa 이하의 펩타이드의 특성을 갖는 것으로 확인하였으며, 균주의 특성에 따라 항균활성 박테리오신의 일종인 페디오신(pediocin)으로 추정되었다. Pediococcus As a result of analyzing the characteristics of the antibacterial active material produced by the acidilatici strain, it was confirmed that it has the characteristics of a peptide of 3 kDa or less, and it was estimated as pediocin, a kind of antibacterial active bacteriocin according to the characteristics of the strain.

SDS-PAGE를 이용하여 트리신 겔(Tricin gel)로 부분 정제된 페디오신에 대해 전기영동을 한 결과, 도 35에서 보는 바와 같이, 크기 배제 클로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용해 정제된 < 3 kDa 페디오신의 분자량은 2.5~3 kDa로 추정되었다.As a result of electrophoresis on pediosin partially purified by Tricin gel using SDS-PAGE, as shown in FIG. 35, <3 purified using size exclusion chromatography The molecular weight of kDa pediosin was estimated to be 2.5~3 kDa.

도 35에서, M은 저분자량 마커, C는 표준 페디오신, A 및 B는 S33의 CFS에서 정제한 < 3 kDa 펩타이드이다.In FIG. 35 , M is a low molecular weight marker, C is standard pediosin, and A and B are <3 kDa peptides purified from CFS of S33.

나. 매스 I. mass 스펙트로메트리에to spectrometry 의한 활성 activity by 펩타이드peptide 특성 규명 characterization

Pediococcus acidilatici 균주가 생산하는 항균활성 물질의 특성을 분석한 결과, 3kDa 이하의 펩타이드 특성을 갖는 것으로 확인하였으며, 따라서 LC-ESI-TOF-MS/MS 분석을 통하여 원료로부터 펩타이드의 프로파일링을 분석하였다. Pediococcus As a result of analyzing the characteristics of the antibacterial active material produced by the acidilatici strain, it was confirmed that the peptide had a characteristic of 3 kDa or less. Therefore, the profiling of the peptide from the raw material was analyzed through LC-ESI-TOF-MS/MS analysis.

분석 결과, 도 36에서 보는 바와 같이, 원료로부터 총 300개의 펩타이드가 확인할 수 있었으며, 항균활성을 평가하여 지표(활성) 후보물질을 선별하였다.As a result of the analysis, as shown in FIG. 36 , a total of 300 peptides could be identified from the raw material, and an indicator (activity) candidate was selected by evaluating the antibacterial activity.

펩타이드 서열은 in silico platform을 이용하여 분석하였으며, 항균 펩타이드 특성 규명을 위하여, QS 3.0 software(Applied Biosystems, Seoul, Korea)을 이용하여 펩타이드 및 단백질 프로파일링을 실시하였다.The peptide sequence was analyzed using an in silico platform, and to characterize the antibacterial peptide, peptide and protein profiling was performed using QS 3.0 software (Applied Biosystems, Seoul, Korea).

또한, 도 37에서 보는 바와 같이, 확인된 peptide의 후보 서열 중에서 KYYGNGV, FGNGV, NNGQV, ATGGGPVFGEE, ATGGIPLELLTDKLKAL이 가장 높은 항균활성을 나타내는 것으로 확인하였으며, 특히 3 Kda 미만의 분획물에서 가장 높은 항균활성을 보였다.In addition, as shown in FIG. 37 , it was confirmed that KYYGNGV, FGNGV, NNGQV, ATGGPVFGEE, and ATGGIPLELLTDKLKAL showed the highest antibacterial activity among the candidate sequences of the identified peptides.

또한, 표준 페디오신(SIGMA)과 유사한 수준의 항균활성을 나타내었다 (p>0.05).In addition, it exhibited a level of antimicrobial activity similar to that of standard pediosin (SIGMA) (p>0.05).

다. All. 뉴클레오타이드nucleotides 시퀀싱을 통한 활성 Activity via sequencing 펩타이드의of peptide 동정 Sympathy

Pediococcus 분리 균주의 박테리오신 생성량은 박테리오신 생성 구조 유전자, extended PCR fragment 및 해당 뉴클레오타이드 시퀀스에 기인한다. Pediococcus acidilactici의 항균 활성 펩타이드 유전자의 프라이머는 하기 표 20과 같다. The bacteriocin production amount of the Pediococcus isolate strain is due to the bacteriocin-generating structural gene, the extended PCR fragment and the corresponding nucleotide sequence. Pediococcus The primers of the antibacterial active peptide gene of acidilactici are shown in Table 20 below.

항균
펩타이드 유전자 동정을 위한
프라이머antibacterial
for peptide gene identification
primer 타겟 유전자 특이도target gene specificity 서열 (5’-3’)Sequence (5'-3') 앰플리콘크기Amplicon size 어닐링온도Annealing temperature PediococcusPediococcus acidilactici acidilactici PA-1PA-1 TGGCAAACATTCCTGCTCTGT (서열번호 20)TGGCAAACATTCCTGCTCCTGT (SEQ ID NO: 20) 8383 5555 CACCAGTAGCCCATGCCATAG (서열번호 21)CACCAGTAGCCCATGCCATAG (SEQ ID NO: 21) pedBpedB ATTGCCAGCCAAGCGTTAGT (서열번호 22)ATTGCCAGCCAAGCGTTAGT (SEQ ID NO: 22) 102102 5050 GCCCCACCCTTTTTGAGAAT (서열번호 23)GCCCCACCCTTTTTGAAT (SEQ ID NO:23) pedCpedC CCATATCGGTGAGTGCTGACA (서열번호 24)CCATATCGGTGAGTGCTGACA (SEQ ID NO: 24) 104104 4949 AGGAATAACGCCCCTGATGTT (서열번호 25)AGGAATAACGCCCCTGATGTT (SEQ ID NO: 25) pedDpedD GGCCCATCTTCGACAGCTT (서열번호 26)GGCCCATCTTCGACAGCTT (SEQ ID NO: 26) 101101 5353 GCACAGCTTCGGCATTTAAAT (서열번호 27)GCACAGCTTCGGCATTTAAAT (SEQ ID NO: 27) pedA-pedBpedA-pedB AAA ATA TCT AAC TAA TAC TTG(서열번호 28)AAA ATA TCT AAC TAA TAC TTG (SEQ ID NO: 28) 711711 5454 TAA AAA GAT ATT TGA CCA AAA(서열번호29)TAA AAA GAT ATT TGA CCA AAA (SEQ ID NO:29) pedB-pedDpedB-pedD GGG CGA GTT TAA CAT GCT AGA(서열번호30)GGG CGA GTT TAA CAT GCT AGA (SEQ ID NO:30) 28622862 5050 TGA TTA TGA ATT AAC CGT GCA(서열번호 31)TGA TTA TGA ATT AAC CGT GCA (SEQ ID NO: 31) Sequencing of the pediocin operonSequencing of the pediocin operon CTT GCT CGA TAA TGG TAA (서열번호 32)CTT GCT CGA TAA TGG TAA (SEQ ID NO: 32) 10091009 5050 CTA TCA GGT AAC TGA AAA (서열번호 33)CTA TCA GGT AAC TGA AAA (SEQ ID NO: 33) CAC GCT TTT CTG ATG CAA (서열번호 34)CAC GCT TTT CTG ATG CAA (SEQ ID NO: 34) 10091009 5252 TTC TTG ACC CCA TTA GAA (서열번호 35)TTC TTG ACC CCA TTA GAA (SEQ ID NO: 35) EntAF
EntAREntAF
EntAR Enterocin AEnterocin A AAATATTATGGAAATGGAGTGTAT (서열번호 36)AAATATTATGGAAATGGAGGTGTAT (SEQ ID NO: 36) 475475 5555 GCACTTCCCTGGAATTGCTC (서열번호 37)GCACTTCCCTGGAATTGCTC (SEQ ID NO: 37) Ent BF
Ent BREnt BF
Ent BR Enterocin BEnterocin B GAAAATGATCACAGAATGCCTA (서열번호 38)GAAAATGATCACAGAATGCCTA (SEQ ID NO: 38) 159159 5050 GTTGCATTTAGAGTATACATTTG (서열번호 39)GTTGCATTTAGGTATACATTTG (SEQ ID NO: 39) Ent PF
Ent PREnt PF
Ent PR Enterocin PEnterocin P GGTAATGGTGTTTATTGTAAT (서열번호 40)GGTAATGGTGTTTATTGTAAT (SEQ ID NO: 40) 117117 5050 ATGTCCCATACCTGCCAAAC (서열번호 41)ATGTCCCATACCTGCCAAAC (SEQ ID NO: 41) EntL50F
EntL50REntL50F
EntL50R Enterocins L50A, BEnterocins L50A, B GGAGCAATCGCAAAATTAG(서열번호 42)GGAGCAATCGCAAAATTAG (SEQ ID NO: 42) 150150 5151 ATTGCCCATCCTTCTCCAAT(서열번호 43)ATTGCCCATCCTTCTCCAAT (SEQ ID NO: 43) Ent31F
Ent31REnt31F
Ent31R Enterocin 31Enterocin 31 TATTACGGAAATGGTTTATATTG (서열번호 44)TATTACGGAAATGGTTTATATTG (SEQ ID NO: 44) 122122 4848 TCTAGGAGCCCAAGGGCC (서열번호 45)TCTAGGAGCCCAAGGGCC (SEQ ID NO: 45) L50AB-1F
L50AB-1RL50AB-1F
L50AB-1R Enterocin Enterocin ATTCAATACATATGGGAGCAATCGCAAAATTAGTAGC(서열번호 46)ATTCAATACATATGGGAGCAATCGCAAAATTAGTAGC (SEQ ID NO: 46) 405405 5050 TAAGTTATGTATACCCTCGTTAGCGTTTTAATCATCC
(서열번호 47)TAAGTTATGTATACCCTCGTTAGCGTTTTAATCATCC
(SEQ ID NO: 47) L50AB-2F
L50AB-2RL50AB-2F
L50AB-2R EnterocinEnterocin ATATAAGCTTGCGTTAAGCCGAATGTTTACACAAC
(서열번호 48)ATATAAGCTTGCGTTAAGCCGAATGTTTACACAAC
(SEQ ID NO: 48) 390390 5555 TATATTCGAACGCAATTCGGCTTACAAATGTGTTG
(서열번호 49)TATATTCGAACGCAATTCGGCTTACAAATGTGTTG
(SEQ ID NO: 49) L50A-1F
L50A-1RL50A-1F
L50A-1R EnterocinEnterocin ATATAAGCTTATTGCTCCCATGTACTAACACATCC
(서열번호 50)ATATAAGCTTATTGCTCCCATGTACTAACACATCC
(SEQ ID NO: 50) 185185 5050 TATATTCGAATAACGAGGGTACATGATTGTGTAGG
(서열번호 51)TATATTCGAATAACGAGGGTACATGATTGTGTAGG
(SEQ ID NO: 51) L50B-2F
L50B-2RL50B-2F
L50B-2R EnterocinEnterocin ATTCAATACATATGGGAGCAATCGCAAAACTAGTGA
(서열번호 52)ATTCAATACATATGGGAGCAATCGCAAAACTAGTGA
(SEQ ID NO: 52) 252252 5151 TAAGTTATGTATACCCTCGTTAGCGTTTTGATCACT
(서열번호 53)TAAGTTATGTATAACCCTCGTTAGCGTTTTGATCACT
(SEQ ID NO: 53)

P. acidilactici가 생산하는 박테리오신은 mass sepctrophotometry를 통해 페디오신으로 추정되며, 따라서 페디오신 생성 유전자를 가지고 있는 것으로 확인된 억제 스펙트럼 그룹 I, II 및 V 뿐만 아니라, 분리 균주 P. acidilactici S33의 배양 상등액에서 박테리오신의 생산 및 기능적 표현에 대해 평가하였다. The bacteriocin produced by P. acidilactici is presumed to be pediosin through mass sepctrophotometry, and thus suppression spectrum groups I, II and V confirmed to have pediosin-producing genes, as well as the culture supernatant of the isolated strain P. acidilactici S33 The production and functional expression of bacteriocins were evaluated.

NCI-ELISA 분석을 통해, P. acidilactici S33은 Ent L50을 생성하며, 4,835 ng/ml의 페디오신을 생성하는 것으로 나타났다.NCI-ELISA analysis showed that P. acidilactici S33 produced Ent L50 and pediosin at 4,835 ng/ml.

항균 펩타이드를 생성하는 Pediococcus 균주의 프라이머와 first-strand cDNA를 사용하여, PCR 증폭을 통해 150 bp DNA 단편 조각을 얻었으며, 도 38에서 보는 바와 같이, 이 조각은 Ent50F에 속하는 것으로 확인하였다. Pediococcus produces antibacterial peptides Using the primer and first-strand cDNA of the strain, a 150 bp DNA fragment was obtained through PCR amplification, and as shown in FIG. 38 , it was confirmed that this fragment belongs to Ent50F.

라. 항균활성 la. antibacterial activity 펩타이드의of peptide 상호작용 분석(SWISS-MODEL: Homology Interaction Analysis (SWISS-MODEL: Homology) 모델링modelling ))

항균활성 펩타이드의 성분과 목표물과의 상호작용을 분석하기 위해 분자역학 전산모사를 이용하였으며, 3D 정량 구조 활성 분석(3D-QSAR)을 동시 진행하였다.Molecular dynamics computational simulation was used to analyze the interaction between the components of the antimicrobial active peptide and the target, and 3D quantitative structural activity analysis (3D-QSAR) was performed simultaneously.

분석 결과, 도 39에서 보는 바와 같이, 페디오신 아날로그 5의 3-D 입체구조는 class IIa 박테리오신과 유사한 구조를 보이는 것으로 확인하였다.As a result of the analysis, as shown in FIG. 39, the 3-D conformational structure of pediosin analog 5 was confirmed to show a structure similar to that of class IIa bacteriocin.

또한, N-말단 역평행 β-시트 구조는 Cys9-Cys14 이황화 결합을 안정화시키고, C-말단의 접힘으로 인해 α-헬릭스를 형성하며(도 40의 S6b), β-시트를 헤어핀 유사(hairpin-like) 구조를 형성하도록 유도함을 알 수 있다.In addition, the N-terminal antiparallel β-sheet structure stabilizes the Cys9-Cys14 disulfide bond, and forms an α-helix due to the folding of the C-terminus (S6b in Fig. 40), and the β-sheet becomes hairpin-like. like) structure can be seen.

Helix 구조 양쪽 18, 33번에 트립토판 잔기가 위치하고 있으며, 두 개의 특정 구역이 Asp 17과 유동적인 중첨 구조를 이루고 있음을 확인하였다.It was confirmed that tryptophan residues are located at positions 18 and 33 on both sides of the Helix structure, and that two specific regions form a flexible central structure with Asp 17.

N-말단의 β-시트는 헤어핀 β-루프와 310 헬릭스 사이에 dual rigid hydrogen 결합을 갖고 있으며, 이로 인해 C-말단 사슬과 상호작용하여 펩타이드 접힘을 더욱 견고하게 만드는 것으로 확인되었다.It was confirmed that the N-terminal β-sheet has dual rigid hydrogen bonds between the hairpin β-loop and the 310 helix, which interacts with the C-terminal chain to make the peptide fold more rigid.

두 번째 이황화 결합은 고온 환경에 대한 안정성을 강화시키고, N-말단과 C-말단 사이의 결합력을 높이는 것으로 확인되었다.It was confirmed that the second disulfide bond enhances stability to a high-temperature environment and increases the bonding strength between the N-terminus and the C-terminus.

도 39에서, (a)의 (i)은 분자 도킹에 의한 Pediocin(Blue)과 LipoXc(Pink)간의 상호작용 분석 결과, (ii)는 복합체 Pediocin 및 LipoXc 단백질 복합체의 2D 구조의 상호작용 모델, (iii)은 Interfaces and key residues analysis, (iv)는 Pediocin(Blue)과 LipoXc(Pink) 복합체간의 수소 및 소수성 상호작용을 보여주는 Ligplot이다.In Figure 39, (i) of (a) is the interaction analysis result between Pediocin (Blue) and LipoXc (Pink) by molecular docking, (ii) is the interaction model of the 2D structure of the complex Pediocin and LipoXc protein complex, ( iii) is Interfaces and key residues analysis, and (iv) is a Ligplot showing hydrogen and hydrophobic interactions between Pediocin (Blue) and LipoXc (Pink) complexes.

도 39의 (b)에서, (i) 및 (ii)는 복합체 Pediocin 및 LipoXc의 상호작용 모델, (iii)은 Interfaces and key residues analysi을 나타낸 것이다.39 (b), (i) and (ii) show the interaction model of the complex Pediocin and LipoXc, (iii) shows the Interfaces and key residues analysis.

또한, 도 40의 (a)에서, (i)은 bad angel 모델, (ii)는 c 변이 모델, (iii)은 outiliers Ramachandra 플롯 모델, (iv)는 twisted non proline 모델, (v)는 rotamer outliers 모델이다.Also, in (a) of FIG. 40, (i) is a bad angel model, (ii) is a c mutation model, (iii) is an outiliers Ramachandra plot model, (iv) is a twisted non proline model, (v) is a rotamer outliers is a model

도 40의 (b)는 Cross points and key residues analysis을 나타낸 것이다.Figure 40 (b) shows the cross points and key residues analysis.

마. 항균활성 hemp. antibacterial activity 펩타이드의of peptide 구조 동정 rescue

Pediococcus accidilactici에 의해 생성된 페디오신의 구조 동정을 위해, 13C NMR 분석을 진행한 결과를 도 41에 나타내었다. Pediococcus In order to identify the structure of pediosin produced by accidilactici, the result of 13 C NMR analysis is shown in FIG. 41 .

도 41에서 보는 바와 같이, 페디오신 표준물질과 CFS 모두 페디오신에 상응하는 23.01 C-1에서의 단일 피크를 나타내는 것으로 확인되었다.As shown in FIG. 41 , it was confirmed that both the pediosin standard and CFS showed a single peak at 23.01 C-1 corresponding to pediosin.

도 41에서, A는 페디오신과 Pediococcus acidilactici 균주를 24시간 배양 후 정제된 <3 kDa 펩타이드 막의 13C NMR 구조이고, B는 막투과 페디오신 유사 항균 펩타이드(AMP)의 13C NMR 스펙트로스코피 구조를 나타낸 것이다.In Figure 41, A is Pediocin and Pediococcus The 13 C NMR structure of the <3 kDa peptide membrane purified after culturing the acidilactici strain for 24 hours, B shows the 13 C NMR spectroscopy structure of the transmembrane pediosin- like antibacterial peptide (AMP).

바. bar. HPLC를HPLC 이용한 항균활성 antibacterial activity using 펩타이드의of peptide 정량 분석 quantitative analysis

Pediococcus accidilactici에 의해 생성된 cationic class IIa AMP(2.5-2.7 Kda)의 특성을 규명하기 위해 HPLC 분석을 진행하였다. Daliri et al.의 방법을 일부 변형하여 실시하였으며(하기 표 21 참조), 페디오신 표준물질(sigma P0098)을 동시 분석하였다. Pediococcus In order to characterize the cationic class IIa AMP (2.5-2.7 Kda) produced by accidilactici, HPLC analysis was performed. The method of Daliri et al. was partially modified (see Table 21 below), and a pediosin standard (sigma P0098) was analyzed simultaneously.

기기device Agilent 1260Agilent 1260 검출기detector 포토다이오드 어레이 디텍터 (DAD)Photodiode Array Detector (DAD) 이동상mobile phase 용매 A : water with 1% TFA
용매 B : acetonitrile with 1% TFA
구배 : linear gradient of solvent B in solvent A from 0 to 80% in 60minSolvent A: water with 1% TFA
Solvent B: acetonitrile with 1% TFA
Gradient : linear gradient of solvent B in solvent A from 0 to 80% in 60min 컬럼column Symmetry C18 컬럼(5μm, 4.6×150mm, USA)Symmetry C18 column (5 μm, 4.6 × 150 mm, USA) 주입 부피injection volume 20.000 μL20.000 μL 유속flow rate 1 mL/min, 40℃1 mL/min, 40°C 스탠다드 standard 페디오신의 앨리쿼트(aliquot): 10mg/mL
표준농도: 5.95%(59.5 mg/L), 11.9%(119 mg/L), 23.8%(238 mg/L)Aliquot of Pediocin: 10 mg/mL
Standard concentration: 5.95% (59.5 mg/L), 11.9% (119 mg/L), 23.8% (238 mg/L)

P. accidilactici를 37℃에서 24 시간 배양한 후, <3 Kda 미만의 CFS에 대하여 HPLC 분석을 진행하였으며, 완충용액으로 50% 아세토니트릴을 이용하였다. CFS 100-μL 을 C18 소수성 친화 컬럼(hydrophobic affinity column)에 주입하여 유속 1ml/min으로 실시하였으며, 컬럼 온도는 39℃로 유지하였다. After culturing P. accidilactici at 37° C. for 24 hours, HPLC analysis was performed for CFS of <3 Kda, and 50% acetonitrile was used as a buffer. 100-μL of CFS was injected into a C18 hydrophobic affinity column and the flow rate was 1 ml/min, and the column temperature was maintained at 39°C.

HPLC를 이용한 활성 펩타이드와 페디오신의 동시분석 결과, 도 42에서 보는 바와 같이 동일한 피크를 확인할 수 있었으며, 따라서 활성 펩타이드는 페디오신으로 규명하여 정량분석을 실시하였다.As a result of simultaneous analysis of the active peptide and pediosin using HPLC, the same peak could be confirmed as shown in FIG. 42, and thus the active peptide was identified as pediosin and quantitative analysis was performed.

도 42에서, A는 P. acidilactici에 의해 생성되는 페디오신 PA-1의 HPLC이고, B는 P. acidilactici로부터 정제된 < 3kDa 분획의 HPLC이다.In FIG. 42, A is HPLC of pediosin PA-1 produced by P. acidilactici , and B is HPLC of <3 kDa fraction purified from P. acidilactici.

페디오신 표준물질(sigma P0098)을 이용한 표준곡선의 측정결과, 도 43과 같이 r2>0.999로 높은 상관관계를 보여 정량곡선으로 확정하여 분석하였다.As a result of the measurement of the standard curve using the pediosin standard material (sigma P0098), as shown in FIG. 43, r 2 >0.999 showed a high correlation and was confirmed as a quantitative curve and analyzed.

도 44a 내지 도 44c는 HPLC에 의한 대조군 및 프로바이오틱 시료의 페디오신 함량을 분석한 결과를 나타낸 것으로서, 도 44a는 대조군(배지만), 도 44b는 P. accidilactici, 도 44c는 세포가 제거된 상등액(cell free supernatant)의 결과를 나타낸 것이다. 44a to 44c show the results of analyzing the pediosin content of the control and probiotic samples by HPLC, FIG. 44a is the control (medium only), FIG. 44b is P. accidilactici , FIG. 44c is the cell-free supernatant (cell free supernatant) results are shown.

10. 10. 프로바이오틱스probiotics // 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 및 제품의 of raw materials and products in vitroin vitro 및 and in in vivoin vivo 효능평가 및 작용기전 규명 Efficacy evaluation and mechanism of action

프로바이오틱스/프로메타볼라이트 원료와 원료를 적용한 제품에 대하여, in vitro 및 in vivo 모델을 통해 효능과 작용기전을 입증하고자 하였다.The efficacy and mechanism of action of probiotics/prometabolite raw materials and products applied with raw materials were to be verified through in vitro and in vivo models.

가. end. In vitroin vitro 항균활성 평가 Antimicrobial activity evaluation

선별된 균주 P. acidilatici(S33)에 대하여 H. pylori 표준균주와 분리균주 및 Staphylococcus areus, E. Coli 및 Bacillus cereus 등 병원성 균주에 대한 항균활성을 평가하였으며, 모든 병원성 균주에 대한 항균활성을 확인한 결과를 도 45 및 하기 표 22(단위 : mm)에 나타내었다.For the selected strain P. acidilatici (S33), H. pylori standard and isolate and Staphylococcus areus , E. Coli and Bacillus ceeu s and the like, and the antimicrobial activity was evaluated, and the results of confirming the antimicrobial activity against all pathogenic strains are shown in FIG. 45 and Table 22 (unit: mm) below.

도 45에서, A는 CFS 25 μg, B: CFS 50 μg, C는 반코마이신, D는 테트라사이클린, E는 증류수(음성 대조군)의 결과이다.In Figure 45, A is CFS 25 μg, B: CFS 50 μg, C is vancomycin, D is tetracycline, E is the result of distilled water (negative control).

No.No. 병원균pathogen S33-postbioticsS33-postbiotics 반코마이신
(30 μg/mL)vancomycin
(30 μg/mL) 테트라사이클린
(30 μg/mL) tetracycline
(30 μg/mL) 증류수Distilled water 25 μg/mL25 μg/mL 50 μg/mL50 μg/mL 1One H. pylori ATCC 43504 H. pylori ATCC 43504 1010 1818 NZNZ 1515 NZNZ 22 H. pylori 9 (Isolate) H. pylori 9 (Isolate) 1010 1717 NZNZ 2525 NZNZ 33 H. pylori 3 (Isolate) H. pylori 3 (Isolate) 1111 1616 NZNZ 1414 NZNZ 44 Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus 1010 1818 NZNZ 2222 NZNZ 55 Escherichia coli E22 Escherichia coli E22 88 1717 NZNZ 1414 NZNZ 66 Bacillus Bacillus cereuscereus 88 1818 1515 NZNZ NZNZ

나.I. 항균활성 antibacterial activity 펩타이드의of peptide in vitro in vitro 항균활성 평가 Antimicrobial activity evaluation

4종의 프로바이오틱스 균주의 프로메타볼라이트(CFS)를 이용하여 5종의 병원균 E. coli 0157:H7 ATCC 35150, L. monocytogenes ATCC 15313, B. cereus ATCC 14576, S. aureus ATCC 19095 및 H. pylori oki422 균주에 대한 항균 활성을 측정한 결과, 도 46의 a에서 보는 바와 같이, Pediococcus acidilactici F56 균주의 항균 활성이 가장 높았다. Five pathogens E. coli 0157:H7 ATCC 35150, L. monocytogenes ATCC 15313, B. cereus ATCC 14576, S. aureus ATCC 19095 and H. pylori using prometabolite (CFS) of four probiotic strains As a result of measuring the antibacterial activity against the oki422 strain, as shown in a of Figure 46, Pediococcus acidilactici F56 strain had the highest antibacterial activity.

또한, 도 46의 b에서 보는 바와 같이, 크기 배제 크로마토그래피를 통해 스핀 컬럼을 이용하여 Pediococcus acidilactici F56 균주 배양액에서 3 kDa 이하의 분자 질량을 가지는 펩타이드를 분리하여, 5종의 병원균에 대해 항균 활성을 측정한 결과, 해당 균주의 CSF보다 더 높은 항균 활성을 나타낸다. In addition, as shown in FIG. 46 b, Pediococcus using a spin column through size exclusion chromatography A peptide having a molecular mass of 3 kDa or less was isolated from the acidilactici F56 strain culture medium, and the antibacterial activity was measured against five pathogens. As a result, the antimicrobial activity was higher than that of CSF of the corresponding strain.

다. All. C. C. eleganselegans 모델을 이용한using the model in in vivoin vivo 항균활성 평가 Antimicrobial activity evaluation

본 연구에서 C. elegans를 모델로 이용한 수명 측정 실험을 통해 선별된 4종의 프로바이오틱스 분리균주의 E. coli O157(STEC)와 H. pylori oki422에 대한 강한 항균 작용을 확인함. 본 연구 결과는 병원균에 대한 항균 활성을 나타내는 P. acidilactici 균주는 병원균에 대한 숙주 반응을 향상시킬 수 있음을 시사하고 있다.In this study, strong antibacterial activity against E. coli O157 (STEC) and H. pylori oki422 of four probiotic isolates selected through lifespan measurement experiments using C. elegans as a model was confirmed. The results of this study suggest that the P. acidilactici strain exhibiting antibacterial activity against pathogens can enhance the host response to pathogens.

프로바이오틱스 균주의 3 Kda 이하 펩타이드 및 표준 페디오신에 대한 먹이 선호도를 평가한 결과, 도 47에서 보는 바와 같이, 페디오신은 대조군에 비해 먹이 선호도가 낮은 것으로 나타난 반면, 항균성 펩타이드는 대조군과 유사한 선호도를 나타내었다.As a result of evaluating the food preference for the peptide and standard pediosin of 3 Kda or less of the probiotic strain, as shown in FIG. 47, pediosin showed a lower food preference compared to the control, whereas the antibacterial peptide showed a similar preference to the control. It was.

대조군 E. coli OP50 균주를 공급한 C. elegans의 수명은 최대 10일이었으나, E. coli O157 및 H. pylori oki422 균주를 공급한 선충의 수명은 7일로 감소하였다. 또한, 표준 페디오신을 공급한 C. elegans의 수명은 대조군과 유사하였다. The lifespan of C. elegans fed the control E. coli OP50 strain was up to 10 days, but E. coli The lifespan of nematodes fed with O157 and H. pylori oki422 strains was reduced to 7 days. In addition, the lifespan of C. elegans fed standard pediosin was similar to that of the control group.

반면, 3일 동안 병원균에 감염시킨 후 항균성 CFS 펩타이드를 공급한 C. elegans 그룹은 대조군과 비교하여 웜(worm)의 수명을 최대 9일로 증가시켰다. On the other hand, the C. elegans group supplied with the antimicrobial CFS peptide after infection with the pathogen for 3 days increased the lifespan of the worm by up to 9 days compared to the control group.

C. elegans에 대한 병원균의 장내 콜로니 형성능을 측정함으로써, 프로바이틱스 균주의 항균성 펩타이드와 표준 페디오신의 효능을 평가한 결과, 표준 병원균과 함께 페디오신을 공급한 C. elegans의 경우 병원균을 단독으로 공급한 것과 비교하였을 때, 병원균의 장내 콜로니 형성능을 감소시켰다. By measuring the intestinal colony-forming ability of the pathogen against C. elegans , the efficacy of the antibacterial peptide of the probiotic strain and the standard pediosin were evaluated. As a result, in the case of C. elegans supplied with pediosin together with the standard pathogen, the pathogen was used alone. Compared with the supplied one, the intestinal colony-forming ability of the pathogen was reduced.

또한, 병원균과 함께 항균성 펩타이드를 함께 공급한 C. elegans의 장내 E. coli O157(STEC) 및 H. pylori 균주의 콜로니 형성능을 평가한 결과, 표준 페디오신을 공급한 웜과 비교하여 병원균의 장내 콜로니 형성능을 더욱 감소시켰다. In addition, as a result of evaluating the colony-forming ability of E. coli O157 (STEC) and H. pylori strains of C. elegans supplied with the antimicrobial peptide together with the pathogen, the intestinal colony of the pathogen was compared with that of the worm supplied with standard pediocin. The formation ability was further reduced.

라. la. 프로메타볼라이트pro metabolite 원료 및 생식제품의 마우스 모델을 이용한 유효성 평가 Efficacy evaluation using mouse models of raw materials and raw products

원료 및 제품에 대하여 C57BL/6를 이용한 Helicobacter pylori 감염모델에서 항균활성 및 위기능 개선 효과를 평가하고자 하였다.The purpose of this study was to evaluate the antibacterial activity and gastric function improvement effect in the Helicobacter pylori infection model using C57BL/6 for raw materials and products.

본 실험에서는 생후 6~8주의 specific pathogen free C57BL/6 (of the Guru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences University-GADVASU, Ludhiana)을 H. pylori 감염 모델로 이용하였다.In this experiment, specific pathogen-free C57BL/6 (of the Guru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences University-GADVASU, Ludhiana) at 6-8 weeks of age was used as a H. pylori infection model.

프로메타볼라이트의 유효성을 평가하기 위해, 식이 그룹을 하기와 같이 분류하였다.To evaluate the effectiveness of prometabolite, dietary groups were classified as follows.

Group I: 정상식이 투여 그룹 (대조군); Group II: 정상식이 및 프로메타볼라이트 (500 mg/kg/day) 투여 그룹 (음성대조군); Group III: 정상식이 투여한 H. pylori 감염 그룹 (양성대조군); Group IV: 정상식이 및 프로메타볼라이트 (50 mg/kg/day) 투여한 H. pylori 감염 그룹; Group V: 정상식이 및 프로메타볼라이트 (250 mg/kg/day) 투여한 H. pylori 감염 그룹; Group VI: 정상식이 및 프로메타볼라이트 (500 mg/kg/day) 투여한 H. pylori 그룹Group I: Normal diet group (control group); Group II: Normal diet and prometabolite (500 mg/kg/day) administration group (negative control group); Group III: H. pylori- infected group administered with normal diet (positive control group); Group IV: H. pylori- infected group treated with normal diet and prometabolite (50 mg/kg/day); Group V: H. pylori- infected group receiving normal diet and prometabolite (250 mg/kg/day); Group VI: H. pylori group administered with normal diet and prometabolite (500 mg/kg/day)

H. pylori 균주에 의한 감염 및 위 궤양 질환 유도는 하기와 같이 진행하였다.Infection and gastric ulcer disease induction by the H. pylori strain proceeded as follows.

H. pylori 균주 배양액을 5,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 제조한 후, PBS에 희석하여 106 CFU/ml 로 균수를 조정하였다. 건강한 C57BL/6를 정상식이로 적응시킨 후, 균 현탁액 100 μl을 0.6 mm 폴리에틸렌 카테터(polyethylene catheter) 마우스용 위관을 이용하여 1주일에 3회씩 격일로 총 15일간 주입하였다. The H. pylori strain culture was centrifuged at 5,000 rpm for 3 minutes to prepare a cell pellet, and then diluted in PBS to adjust the number of cells to 10 6 CFU/ml. After adapting healthy C57BL/6 to a normal diet, 100 μl of the bacterial suspension was injected 3 times a week every other day for a total of 15 days using a 0.6 mm polyethylene catheter mouse gavage tube.

P. acidilactici 균주의 프로메타볼라이트의 유효성 평가를 위해, H. pylori 감염 7일이 경과한 mice에게 50, 250, 500 mg/kg/day 용량으로 일일 경구 투여하였으며, 마우스의 대변 샘플을 일정한 간격으로 채취하였다. To evaluate the effectiveness of prometabolite in P. acidilactici strain, mice 7 days after infection with H. pylori were orally administered daily at doses of 50, 250, and 500 mg/kg/day. was collected with

시술 후 H. pylori 감염 쥐는 1주 후에 6마리씩 경추 탈골의 방법으로 고통 없이 희생시켰다. H. pylori 균주와 조직병리학적 변화를 평가하기 위해 소만부(lesser curvature)를 따라 개복하여 조직을 절제하였다. 조직을 10% neutral-buffred formalin 용액을 이용하여 고정시킨 후, 파라핀에 임베딩(embedding) 병리학적으로 관찰하였다.After the procedure, six H. pylori- infected rats were sacrificed painlessly by cervical dislocation one week later. To evaluate the H. pylori strain and histopathological changes, the tissue was resected laparotomy along the lesser curvature. After fixing the tissue using a 10% neutral-buffered formalin solution, it was observed pathologically by embedding in paraffin.

파리핀 블록을 5 μm 간격으로 절제하여 헤마톡시린(Hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하여 위염의 병리학적 소견을 관찰하였다. 광학 현미경을 이용하여 위점막 염증, 호중구 침윤, 괴사 정도를 현미경을 이용하여 육안으로 관찰하였으며, 하기와 같이 등급을 분류하였다.The paraffin blocks were excised at intervals of 5 μm and stained with hematoxylin and eosin to observe the pathological findings of gastritis. Using an optical microscope, gastric mucosal inflammation, neutrophil infiltration, and necrosis were visually observed using a microscope, and grades were classified as follows.

1, mild multifocal; 2, mild widespread 또는 moderate multifocal; 3, mild widespread 및 moderate multifocal 또는 severe multifocal; 4, moderate widespread; 5, moderate widespread 및 severe multifocal; 및 6, severe widespread1, mild multifocal; 2, mild widespread or moderate multifocal; 3, mild widespread and moderate multifocal or severe multifocal; 4, moderate widespread; 5, moderate widespread and severe multifocal; and 6, severe widespread

궤양이 발생한 위 조직 샘플 표본을 채취하여 BHI 배지에 균질화시킨 후 BHI 아가에 도말 및 배양하였으며, H. pylori 콜로니를 계수하였다(log CFU/g). H. pylori 분리의 확인은 우레아제 어세이(urease assay)를 통해 확인하였다.A sample of ulcerated gastric tissue was collected, homogenized in BHI medium, smeared on BHI agar, and cultured, and H. pylori colonies were counted (log CFU/g). Confirmation of H. pylori isolation was confirmed through a urease assay.

마. hemp. PediococcusPediococcus acidilaticiacidilatici 균주의 strain in vitroin vitro 장관 면역활성 intestinal immune activity 규명 elucidation

Pediococcus acidilatici 균주는 원료의 생산중에 사균으로 공급되므로, cell lysate의 장관에서의 면역활성 기능을 평가하고자 하였다. Pediococcus acidilatici strains are supplied as dead cells during the production of raw materials, so the purpose of this study was to evaluate the immune activity function of cell lysate in the intestinal tract.

(1). 대식세포 활성 측정(One). Measurement of macrophage activity

RAW 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 5x104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 시료를 1~50μg/mL, LPS를 1μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 얻은 배양액의 일산화질소(NO) 생성 활성을 일산화질소(NO) 검출 키트(iNtRON)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.RAW 264.7 cells were seeded in a 96-well plate at 5x104 cells/well and cultured for 24 hours, then the sample was treated at a concentration of 1-50 μg/mL and LPS was treated at a concentration of 1 μg/mL and cultured for 24 hours. The absorbance was measured at 540 nm using a nitrogen monoxide (NO) detection kit (iNtRON) for the nitric oxide (NO) production activity of the culture medium obtained after incubation.

(2). 사이토카인 생성량 측정(2). Cytokine production measurement

사이토카인인 IL-1β, IL-10, IL-6 및 TNF-α은 각각의 해당 ELISA 키트(R&D systems)를 이용하여 생성량을 측정하였다. 각각의 단일클론 항체가 코팅된 96 웰 플레이트에 세포 배양액 50μL와 반응액을 넣은 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.Cytokines IL-1β, IL-10, IL-6 and TNF-α were measured for production using the respective ELISA kits (R&D systems). Each monoclonal antibody-coated 96-well plate was put in 50 μL of cell culture solution and reaction solution, and then reacted at room temperature for 2 hours.

반응 후 세척 버퍼(washing buffer)로 4회 세척한 다음, cytokine conjugate solutio를 100μL 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 4회 세척하였다.After the reaction, it was washed 4 times with a washing buffer, 100 μL of cytokine conjugate solutio was added, and the reaction was performed at room temperature for 2 hours, followed by washing 4 times.

이어서, 기질 용액(substrate solution)을 100 μL 첨가하여 실온에서 30분간 빛을 차단한 조건에서 반응시킨 후, 반응 정지 용액을 100 μL 첨가하고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.Then, 100 μL of a substrate solution was added and reacted at room temperature for 30 minutes under light blocking conditions. Then, 100 μL of the reaction stop solution was added, and absorbance was measured at 450 nm.

(3). 항염증 바이오마커 분석(3). Anti-inflammatory biomarker analysis

RT-PCR을 수행하기 위해 RAW 264.7 세포로부터 RNA 추출 키트를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하여 Total RNA를 분리하였다. 분리한 total RNA 2 μg을 주형으로 cDNA 합성 키트명를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다.In order to perform RT-PCR, total RNA was isolated from RAW 264.7 cells using an RNA extraction kit according to the manufacturer's manual. 2 μg of the isolated total RNA was used as a template and cDNA was synthesized according to the manufacturer's manual using the name of the cDNA synthesis kit.

합성된 cDNA를 주형으로 하여 유전자 특이적인 올리고 프라이머를 이용하여 PCR 과정을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 23과 같고, 프라이머는 Bioneer사(Daejeon, Korea)에 주문 제작하였으며, PCR은 Taq명을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.PCR was performed using the synthesized cDNA as a template using gene-specific oligo primers. The primers used for PCR are shown in Table 23 below, and the primers were ordered by Bioneer (Daejeon, Korea), and PCR was performed according to the manufacturer's protocol using the Taq name.

COX-2COX-2 센스sense 5'-CCGTGGTGAATGTATGAGCA-3' (서열번호 54)5'-CCGTGGTGAATGTATGAGCA-3' (SEQ ID NO: 54) 앤티센스antisense 5'-CCTCGCTTCTGATCTGTCTT-3' (서열번호 55)5'-CCTCGCTTCTGATCTGTCTT-3' (SEQ ID NO: 55) iNOSiNOS 센스sense 5'-ATT CGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT-3’
(서열번호 56)5'-ATT CGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT-3'
(SEQ ID NO: 56) 앤티센스antisense 5'-GCT GTG TGT CAC AGA ACT CTC GAA CTC-3' (서열번호 57)5'-GCT GTG TGT CAC AGA ACT CTC GAA CTC-3' (SEQ ID NO: 57) GAPDHGAPDH 센스sense 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3' (서열번호 58)5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3' (SEQ ID NO: 58) 앤티센스antisense 5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3' (서열번호 59)5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3' (SEQ ID NO: 59)

실험 결과, 도 48에서 보는 바와 같이, 유산균의 세포 용해물(cell lysate)는 대식세포활성이 매우 우수한 것으로 나타났으며, 한편 세포를 제외한 포스트바이오틱(postbiotic)이 포함된 배지는 활성이 낮은 것으로 확인되어, 면역활성 기능은 유산균의 사균체가 갖는 것으로 확인되었다.As a result of the experiment, as shown in FIG. 48 , the cell lysate of lactic acid bacteria was found to have very good macrophage activity, while the medium containing the postbiotic excluding the cells had low activity. It was confirmed, and it was confirmed that the immune activity function was possessed by the dead cells of the lactic acid bacteria.

도 42는 NO 및 사이토카인 생산 수준을 나타낸 것으로서, LB는 cell lysate, Meta는 배지 함유 포스트바이오틱스, LB+Meta는 cell lysate와 배지의 혼합물의 결과를 나타낸 것이다.Figure 42 shows NO and cytokine production levels, LB is cell lysate, Meta is the medium-containing postbiotics, LB + Meta shows the results of the mixture of cell lysate and medium.

사이토카인 분비활성의 측정 결과, 도 49에서 보는 바와 같이, IL-6, IL-10 및 IL-1β와 TNF-α는 세포 용해물의 처치 농도에 따라 유의하게 분비활성이 증가하는 것으로 확인되어, 장관에서의 면역활성에 도움을 줄 것으로 기대되었다. 한편,IL-1β는 10μ/mL까지 유의하게 증가하다가 20μg/mL부터 감소하는 양상을 보였다.As a result of the measurement of cytokine secretion activity, as shown in FIG. 49, it was confirmed that the secretion activity of IL-6, IL-10, IL-1β and TNF-α was significantly increased according to the treatment concentration of the cell lysate, It was expected to help with immune activity in the intestine. Meanwhile, IL-1β significantly increased up to 10 μg/mL and decreased from 20 μg/mL.

또한, 염증 관련 바이오마커인 COX-2와 iNOS의 발현양을 측정한 결과, 도 50에서 보는 바와 같이, 세포 용해물의 처치가 상기 인자의 발현에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.In addition, as a result of measuring the expression levels of COX-2 and iNOS, which are inflammation-related biomarkers, as shown in FIG. 50 , it was found that treatment of the cell lysate did not affect the expression of these factors.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.Although described with reference to preferred embodiments of the present invention as described above, those of ordinary skill in the art can see the present invention within the scope without departing from the spirit and scope of the present invention as set forth in the following claims. It will be understood that various modifications and variations of the invention are possible.

한국생명공학연구원Korea Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC13774BPKCTC13774BP 2018121320181213

Claims (11)

항균활성을 갖는 유산균인 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)의 발효액을 분말화한 유산균 발효분말. Lactobacillus fermented powder obtained by powdering the fermented liquid of Pediococcus acidilactici , a lactic acid bacterium with antibacterial activity. 제1항에 있어서, 상기 유산균는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 대하여 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 유산균 발효분말. According to claim 1, wherein the lactic acid bacteria is Helicobacter pylori ( Helicobacter pylori ) Lactobacillus fermented powder, characterized in that it has an antibacterial activity. 제1항에 있어서, 상기 유산균은 모유로부터 분리된 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) OH1 균주(KCTC 13774BP)인 것을 특징으로 하는 유산균 발효분말. According to claim 1, wherein the lactic acid bacteria is Pediococcus acidilactici ( Pediococcus acidilactici ) OH1 strain (KCTC 13774BP) isolated from breast milk, lactic acid bacteria fermented powder. 제1항에 있어서, 상기 발효분말은 덱스트린을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효분말.The lactic acid bacteria fermented powder according to claim 1, wherein the fermented powder further comprises dextrin. 제4항에 있어서, 상기 덱스트린 70~90 중량% 및 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) 발효액 10~30 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효분말.According to claim 4, wherein the dextrin 70 ~ 90% by weight and Pediococcus acidilactici ( Pediococcus acidilactici ) Lactobacillus fermented powder comprising 10 to 30% by weight of the fermentation broth. (a) 항균활성을 갖는 유산균인 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 전배양하는 단계;
(b) 상기 전배양한 페디오코커스 애시디락티시 균주를 배양 배지에 접종하여 발효시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 얻은 발효액을 농축한 후, 건조시켜 분말화하는 단계를 포함하는 유산균 발효분말의 제조방법. (A) pre-culturing lactic acid bacteria with antibacterial activity, Pediococcus acidilactici ( Pediococcus acidilactici );
(b) fermenting the pre-cultured Pediococcus acidi lactisi strain by inoculating the culture medium; and
(c) after concentrating the fermentation broth obtained in step (b), drying and pulverizing the lactic acid bacteria production method comprising the step of powder. 제6항에 있어서, 상기 배양 배지는 포도당 20 g/L, 카제인 펩톤 15 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 소디움 아세테이트 5 g/L, K2HPO4 2 g/L, 구연산나트륨 2 g/L, 황산마그네슘 0.1 g/L, 황산망간 0.05 g/L 및 폴리솔베이트 80 1 g/L를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효분말의 제조방법. According to claim 6, wherein the culture medium is glucose 20 g / L, casein peptone 15 g / L, yeast extract 10 g / L, sodium acetate 5 g / L, K 2 HPO 4 2 g / L, sodium citrate 2 g /L, magnesium sulfate 0.1 g / L, manganese sulfate 0.05 g / L, and polysorbate 80 1 g / L method for producing fermented lactic acid bacteria powder, characterized in that it contains. 제6항에 있어서, 상기 발효는 36~38℃, 0.4~0.6 vvm, 400~500 rpm 및 pH 6.0~6.3의 조건에서 24~48시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효분말의 제조방법. [Claim 7] The method of claim 6, wherein the fermentation is carried out at 36-38°C, 0.4-0.6 vvm, 400-500 rpm, and pH 6.0-6.3 for 24-48 hours. 제6항에 있어서, 상기 유산균은 모유로부터 분리된 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) OH1 균주(KCTC 13774BP)인 것을 특징으로 하는 유산균 발효분말의 제조방법. The method of claim 6, wherein the lactic acid bacteria is Pediococcus acidilactici OH1 strain (KCTC 13774BP) isolated from breast milk. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 유산균 발효분말을 포함하는 조성물.A composition comprising the lactic acid bacteria fermented powder of any one of claims 1 to 5. 제10항에 있어서, 식사대용 생식 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.11. The composition according to claim 10, which is a raw material for meal replacement.
KR1020190179170A 2019-12-31 2019-12-31 Lactic acid fermented powder having probiotic activity and antimicrobial activity, method of manufacturing the same and use of the same KR20210085759A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190179170A KR20210085759A (en) 2019-12-31 2019-12-31 Lactic acid fermented powder having probiotic activity and antimicrobial activity, method of manufacturing the same and use of the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190179170A KR20210085759A (en) 2019-12-31 2019-12-31 Lactic acid fermented powder having probiotic activity and antimicrobial activity, method of manufacturing the same and use of the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210085759A true KR20210085759A (en) 2021-07-08

Family

ID=76893885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190179170A KR20210085759A (en) 2019-12-31 2019-12-31 Lactic acid fermented powder having probiotic activity and antimicrobial activity, method of manufacturing the same and use of the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20210085759A (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130063253A (en) 2011-12-06 2013-06-14 에이엠바이오 (주) The alcohol resistant strain of lactic acid bacteria, pediococcus acidilactici and its use
KR20130122380A (en) 2012-04-30 2013-11-07 서울대학교산학협력단 New pediococcus acidilactici, the method of isolating the strain and composition for prevention and treation of fowl typhoid using it
KR20140108359A (en) 2013-02-25 2014-09-11 우석대학교 산학협력단 The strain of pediococcus acidilactici DM-9 having ornithine production capacity and the method of cheonggukjang preparation containing orenithine,and cheonggukjang prepared by the method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130063253A (en) 2011-12-06 2013-06-14 에이엠바이오 (주) The alcohol resistant strain of lactic acid bacteria, pediococcus acidilactici and its use
KR20130122380A (en) 2012-04-30 2013-11-07 서울대학교산학협력단 New pediococcus acidilactici, the method of isolating the strain and composition for prevention and treation of fowl typhoid using it
KR20140108359A (en) 2013-02-25 2014-09-11 우석대학교 산학협력단 The strain of pediococcus acidilactici DM-9 having ornithine production capacity and the method of cheonggukjang preparation containing orenithine,and cheonggukjang prepared by the method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAMA Pediatr. 2017;171:647 (2017)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
de Melo Pereira et al. How to select a probiotic? A review and update of methods and criteria
Fusco et al. The genus Weissella: taxonomy, ecology and biotechnological potential
Peres et al. Novel isolates of lactobacilli from fermented Portuguese olive as potential probiotics
Bujnakova et al. In vitro evaluation of the safety and probiotic properties of Lactobacilli isolated from chicken and calves
Gupta et al. Probiotic potential of Lactobacillus plantarum LD1 isolated from batter of Dosa, a South Indian fermented food
Nazef et al. Identification of lactic acid bacteria from poultry feces: evidence on anti-Campylobacter and anti-Listeria activities
Gupta et al. Probiotic potential of bacteriocin-producing Enterococcus hirae strain LD3 isolated from dosa batter
Xia et al. Probiotic potential of Weissella strains isolated from horse feces
CN112143680B (en) Lactobacillus paracasei ZJUIDS05 with antioxidant effect and application thereof
Vitola et al. Probiotic potential of Lactobacillus casei CSL3 isolated from bovine colostrum silage and its viability capacity immobilized in soybean
Kanjan et al. Functional and safety assessment of Staphylococcus simulans PMRS35 with high lipase activity isolated from high salt-fermented fish (Budu) for starter development
CN110577912A (en) lactobacillus gasseri and application thereof in preparing fermented milk
Darvishi et al. Genomic and proteomic comparisons of bacteriocins in probiotic species Lactobacillus and Bifidobacterium and inhibitory ability of Escherichia coli MG 1655
Babot et al. Compatibility and safety of five lectin-binding putative probiotic strains for the development of a multi-strain protective culture for poultry
Rezaei et al. Isolation of lactic acid probiotic strains from Iranian camel milk: technological and antioxidant properties
Lv et al. Lactobacillus plantarum CY 1-1: A novel quorum quenching bacteria and anti-biofilm agent against Aeromonas sobria
Wu et al. Evaluation of the Probiotic Potential of ssp. WDS-7 Isolated from Chinese Traditional Fermented Buffalo Milk
Damodharan et al. Probiotic characterization of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei KNI9 inhibiting adherence of Yersinia enterocolitica on Caco-2 cells in vitro
Shen et al. Evaluation of the potential probiotic yeast characteristics with anti-MRSA abilities
RU2409661C2 (en) Enterococcus faecium lvp1073 strain, producer of bacteriocin against bacterial pathogens, bacteriocin e1073 against bacterial pathogens, lactobacillus plantarum 1 lvp7 strain - bacteriocin e1073 synthesis inducer, signal peptide sp1073 - bacteriocin e1073 synthesis regulator, method for producing bacteriocin e1073
KR101098946B1 (en) A compound for feed additive comprising novel Lactobacillus salivarius G1-1
Dbeibia et al. Probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from colostrum of 3 different mammals
CN105104712B (en) A kind of additive for microbe feedstuff and preparation method thereof
Rayavarapu et al. Evaluation of potential probiotic characters of Lactobacillus fermentum
Wadoum et al. In vitro antimicrobial characterization of Lactobacillus Isolates towards their use as probiotic alternatives to antibiotic growth promoters

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination