KR20210084431A - 개선된 수율의 dna 합성 - Google Patents

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폴 제임스 로쓰웰
스테파니 게릭-지안니니
안나 바불라
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Abstract

본 발명은 개선된 수율 및/또는 개선된 효율로, 바람직하게는 대규모로, 데옥시리보핵산 (DNA)의 합성, 특히 DNA의 무세포 효소적 합성을 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 반대-이온으로서 뉴클레오티드 염에 존재하는 양이온 종은 고수율의 효소적 DNA 합성 반응의 수율, 효율성 및 충실도에 매우 중요적이다. 본원의 방법은 이온성 뉴클레오티드에 대한 반대-이온으로서 대안적인 양이온을 사용하여 DNA 합성에서 더 높은 농도의 뉴클레오티드의 사용을 허용하고 나아가 더 유리한 반응 조건이 사용될 수 있도록 한다.

Description

개선된 수율의 DNA 합성
본 발명은 개선된 수율 및/또는 개선된 효율로, 바람직하게는 대규모로, 데옥시리보핵산 (DNA)의 합성, 특히 DNA의 무세포 효소적 합성을 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
데옥시리보핵산 (DNA)의 증폭은 발효조에서 증폭될 DNA를 증식하는 박테리아의 배양과 같은 세포 기반 공정의 사용을 통해 수행될 수 있다. 중합효소 연쇄 반응 및 가닥 치환 반응(strand-displacement reactions)을 포함하여 출발 주형으로부터 DNA를 증폭하기 위한 무세포의 효소적 방법도 기재되어 왔다.
과거에는 마이크로타이터 플레이트 및 로봇 제어 피펫을 기반으로하는 장치를 사용하여 필요에 따라 반응 성분을 추가하여 테스트 규모의 DNA 증폭을 수행했다. 이러한 장치 및 공정은 테스트 목적으로 소량의 DNA를 제조하는 데 적합하지만 다른 목적으로는 충분한 양을 제공하지 않는다. 특정 핵산 및 단백질의 대규모 증폭 및 제조는 대부분 세포 기반 방법을 통해 수행되었다. 이러한 방법은 일반적으로 대량의 제품을 생산하는 데 효과적이지만 설치 비용이 많이 든다. 또한 임상 및 치료 목적을 위해 세포가 없는 환경에서 DNA를 합성하는 것이 바람직하다.
포스포라미다이트 방법과 같은 화학적 합성을 사용하는 대규모 DNA 합성이 알려져 있지만 결점이 없는 것은 아니다. 반응은 일반적으로 유기 용매에서 수행되어야 하는데, 대부분은 독성이 있거나 아니면 위험하다. 화학적 합성의 또 다른 단점은 각 뉴클레오티드 첨가 후에, 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬의 일정 퍼센트가 캡핑되어 수율 손실이 발생하기 때문에 완전히 효율적이지 않다는 것이다. 따라서 합성되는 뉴클레오티드 사슬의 총 수율 손실은 각 뉴클레오티드가 서열에 추가될 때마다 증가한다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성에 있어서 이러한 본질적인 비효율성은 효율적으로 생산될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 길이를 궁극적으로 50 개 이하의 핵산 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드로 제한하고, 더욱이 합성의 정확성에 영향을 미친다.
현재까지 중합효소와 같은 생물학적 촉매는 시험관 내 DNA 생성물의 산업적 규모의 제조에 일상적으로 활용되지 않았으며 반응은 대개 마이크로리터 규모의 부피로 제한되었다. 효소적 DNA 합성을 사용하여 공정을 스케일업(scale-up)하는 것은 문제가 있는 것으로 입증되었으며, 특히 DNA 생성물의 실망스러운 수율이 문제였다.
본 출원인은 상업적으로 이용 가능한 뉴클레오티드를 사용하여 스케일업하는 능력을 이전에 해결했다. 본원에 참고로서 포함된 WO2016/034849에 기재된 바와 같이, 고갈되거나 생성물의 농도가 역치에 도달함에 따라 반응 혼합물에 신선한 뉴클레오티드를 첨가하는 것을 포함하는 새로운 방법을 개발하였다. 그러나, 훨씬 더 높은 수율이 달성될 수 있다는 것이 확립되어 본 발명자들은 효소적인 DNA 합성으로부터 수율을 더욱 향상시키기 위해 본원에 기술된 새로운 방법을 개발했다.
효소적인 DNA 합성은 일반적으로 초기 핵산 사슬에 뉴클레오티드의 부가를 촉매하기 위해 중합효소 또는 중합효소 유사 효소의 사용을 요한다. 일반적으로 반응에서 증폭되는 주형 DNA가 필요하다. 그러나 통합이 신규생성(de novo)으로 발생하는, 주형없는 DNA 합성을 수행하는 것도 가능하다.
핵산의 고도로 하전된 특성으로 인해, 이들은 대부분의 전하를 중화하기 위해 반대-이온으로 지속적으로 둘러싸여서 서열 섹션 사이의 정전기 반발을 감소시켜 세포 내에서 깔끔하고 조밀 한 구조로 응축될 수 있다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 핵산의 빌딩 블록인 뉴클레오티드는 또한 이온성 종(species)이며 전기적 중성을 유지하기 위해 양의 반대-이온의 존재를 필요로 한다. 따라서 전부는 아니지만 대부분의 뉴클레오티드는 양성의 반대-이온을 가진 염으로서 공급된다. 뉴클레오티드가 4 개의 음전하를 갖기 때문에 염은 전형적으로 2가 양이온 2 개, 또는 1가 양이온 4 개로 제조된다. 뉴클레오티드 염이 물 또는 다른 용매에 분산되자마자 염이 용액에서 음이온성 및 양이온성 성분으로 해리될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
일반적으로 뉴클레오티드는 리튬 또는 소듐 염으로서 DNA 합성, 증폭 또는 시퀀싱을 위해 공급된다. 리튬은 이러한 염이 소듐 염보다 더 큰 용해도와 반복된 동결 및 해동 주기에 대한 안정성을 부여하고 다양한 미생물에 대한 리튬의 정균 활성으로 인해 멸균 상태를 유지하여 더 큰 신뢰성과 장기간의 저장 수명(extended shelf life)을 제공하므로, 리튬이 일반적으로 선호된다. 이들 염의 사용은 매우 일상적이어서 당업자는 뉴클레오티드와 함께 존재하는 반대-이온에 의문을 제기하지 않는 것으로 보인다. 실제로, WO2016/034849의 실시예에서 사용된 모든 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 리튬 염인데, 이것들이 당업자에게 우세한 선택으로 판매되기 때문이다.
그러나, 본 발명자들은 반대-이온으로서 뉴클레오티드 염에 존재하는 양이온 종이 고수율의 효소적 DNA 합성 반응의 수율, 효율성 및 정확도(fidelity)에 결정적임을 발견했다. 상업적으로 이용 가능한 뉴클레오티드는 일반적으로 리튬 또는 소듐 염으로만 이용 가능하기 때문에 이것은 다소 예상치 못한 일이다. 그러나, 이온성 뉴클레오티드에 대한 반대-이온으로서 대안적인 양이온을 사용하는 것은 본원에 포함된 실시예에서 알 수 있는 바와 같이 DNA 합성 반응에 큰 영향을 미칠 수 있다. 뉴클레오티드 염의 사용에 대한 기존의 이해에 도전하고 실시예를 수행하기 위해 새로운 반대-이온 염 dNTP의 설계 및 생산을 필요로 하기 때문에 그러한 효과는 놀랍고 예상치 못한 것이다.
요약
본 발명은 DNA의 무세포 생산 또는 합성을 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 현재의 방법론에 비해 향상된 DNA 생산 즉, 현재의 방법론에서 가능하다고 생각되는 것보다 더 적은 수의 추가 성분을 갖는 환경에서 더 큰 수율, 더 효율적인 공정 또는 효소적 DNA 합성을 수행할 수 있는 능력을 가능하게 할 수 있다. 이는 DNA 합성, 특히 대규모에서 비용을 줄이면서 생산성을 크게 향상시킨다.
일반적으로, 본 발명은 중합효소 효소 또는 기타 DNA 합성 효소를 사용하는 효소적인 DNA 합성에 관한 것으로, 이들 효소 중 임의의 것은 특정 특성을 제공하도록 선택적으로 조작될 수 있다.
본 발명은 일반적으로, 증폭 동안 가열 및 냉각을 통해 온도를 순환시킬 필요가 없지만 열을 사용하여 DNA 주형을 초기에 변성시킬 수 있는 등온적 DNA 증폭 방법에 관한 것이다. 본 발명은 바람직하게는 독립적으로 또는 다른 효소의 도움으로 가닥 변위 복제(strand-displacement replication)를 통해 DNA 주형을 복제할 수 있는 중합효소 효소의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 염 형태의 뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 상기 염은 양성 반대-이온 (양이온)을 포함한다. 이 반대-이온은 1가 양이온 인 것이 바람직한데, 즉 하나의 전자의 손실로 인해 단일 양전하를 갖는다. DNA 합성의 수율 및/또는 효율성을 높이기 위해, 1가 양이온은 전적으로 소듐 또는 리튬 이온 또는 이들의 혼합물일 수는 없지만 양이온의 적어도 일부는 소듐보다 더 큰 이온 반경을 가질 것이다. 일반적으로 상기 염에서 또는 상기 방법에서 소듐 또는 리튬의 일부의 존재는 허용될 수 있지만, 상기 염은 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양이온을 포함하는 것이 바람직하다. 뉴클레오티드가 4 개의 음전하를 가지므로 일반적으로 4 개의 1가 양이온이 전기적 중성을 유지하기 위해 염에 존재할 것임을 이해할 것이다.
따라서, 염으로서 공급되는 뉴클레오티드의 사용을 포함하는 효소적 DNA 합성을 위한 무세포 방법을 제공하며, 여기서 상기 염은 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양이온을 포함한다.
따라서, 염 형태의 뉴클레오티드를 사용하는 것을 포함하는 효소적 DNA 합성을 위한 무세포 방법을 제공하며, 상기 염은 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양이온을 포함한다.
바람직하게는 상기 효소적 DNA 합성은 더 큰 규모의 DNA 제조를 위해, 즉 실험실 규모의 증폭보다는 치료적 또는 예방적 용도를 위한 것이다. 본 발명자들은 더 많은 기질 및 다른 성분을 제공하고 수율이 적절하다는 것을 발견하는 것만큼이나 간단하지 않다는 것을 발견한 것은 실험실 규모 증폭의 이러한 스케일업에서이다. 소듐과 리튬과의 뉴클레오티드 염의 경우, 이들은 더 높은 농도에서 DNA 합성 효소를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 이러한 억제에 대한 대안적인 방법을 발견했다. 본 발명은 반응 설정이 변경되도록 허용하고, 따라서 10mM 이상의 농도에서 뉴클레오티드 염의 사용을 허용한다. 따라서, 상기 방법은 10mM 이상의 농도에서 뉴클레오티드 염의 사용을 포함하며, 상기 농도는 뉴클레오티드가 첨가될 때 결정된다. 상기 농도는 방법이 수행되는 반응 혼합물에서 결정된다. 따라서, 뉴클레오티드의 농도는 뉴클레오티드가 첨가 되는 시점에 반응 혼합물 내에서 결정된다. 따라서 상기 농도는 개시 농도, 또는 상기 방법의 개시 시점에서의 농도이다.
따라서, 적어도 10mM의 농도로 염으로서 공급되는 뉴클레오티드의 사용을 포함하는 효소적인 DNA 합성을 위한 무세포 방법을 제공하며, 상기 염은 소듐 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양이온을 포함한다 .
따라서, 적어도 10mM의 농도로 염 형태의 뉴클레오티드를 사용하는 것을 포함하는 효소적인 DNA 합성을 위한 무세포 방법을 제공하며, 상기 염은 소듐 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양이온을 포함한다.
여기에 설명된 임의의 뉴클레오티드 염은 전기적 중성을 유지하기 위해 4 개의 1가 양이온까지 가질 수 있다.
또한, 효소적 DNA 합성 또는 무세포 방법에서 뉴클레오티드 염의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다.
따라서, 염으로서 공급되는 뉴클레오티드의 사용을 포함하는 효소적인 DNA 합성을 위한 무세포 방법을 제공하며, 여기서 상기 뉴클레오티드는 다음 중 어느 하나이다:
(a) 그 이온 반경이 소듐 이온의 반경보다 큰 단일 1가 양이온을 갖는 염의 형태, 또는
(b) 2 개 이상의 상이한 1가 양이온을 갖는 염의 형태로서, 상기 이온 중 적어도 하나는 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 염의 형태.
이 양상에서 뉴클레오티드는 10mM 초과의 농도로 제공될 수 있다.
따라서, 염 형태의 뉴클레오티드의 사용을 포함하는 효소적인 DNA 합성을 위한 무세포 방법을 제공하며, 상기 클레오티드는 다음 중 어느 하나이다:
(a) 그 이온 반경이 소듐 이온의 반경보다 큰 단일 1가 양이온을 갖는 염의 형태, 또는
(b) 2 개 이상의 상이한 1가 양이온을 갖는 염의 형태로서, 여기서 상기 이온 중 적어도 하나는 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 염의 형태.
이 양상에서 뉴클레오티드는 10mM 초과의 농도로 존재한다.
본원에 사용된 "단일 1가 양이온"은 단일 1가 양이온 종을 의미하며, 이 중 뉴클레오티드 이온상의 음전하를 상쇄(counter-balance)하기 위해 4 개까지 사용될 수 있다.
대안적으로 하기를 제공한다:
염 형태의 뉴클레오티드를 사용하는 것을 포함하는 DNA의 효소적인 합성을 위한 무세포 방법으로서, 상기 염은 적어도 10mM의 농도로 존재하며 다음 중 어느 하나이다:
(a) 그 이온 반경이 소듐 이온의 반경보다 큰 단일 1가 양이온을 갖는 염의 형태, 또는
(b) 2 개 이상의 염의 형태로서, 각 염은 상이한 1가 양이온을 포함하고, 여기서 상기 양이온 중 적어도 하나는 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 것.
효소적인 DNA 합성은 중합효소 또는 개질된 중합효소를 포함하여 DNA를 합성할 수 있는 임의의 효소를 포함할 수 있다. 중합효소는 패밀리 A, B, C, D, X, Y 및 RT를 포함하는 DNA 중합효소의 알려진 패밀리로부터 유래될 수 있다. 패밀리 X의 DNA 중합효소의 예는 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이 효소이다.
효소적인 DNA 합성은 주형을 사용하지 않고 신규생성(de novo)으로 발생할 수 있다.
효소적인 DNA 합성은 DNA 주형과 같은 주형을 포함할 수 있다.
효소적인 DNA 합성은 여기에 설명된 성분을 포함하는 반응 혼합물에서 발생할 수 있다.
대안적으로, 염 형태의 하나 이상의 뉴클레오티드의 존재하에 DNA 주형을 하나 이상의 중합효소와 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하는, DNA 합성을 위한 무세포 방법이 제공되며, 여기서 상기 뉴클레오티드는 적어도 10mM의 농도로 존재하며 다음 중 어느 하나이다:
(a) 그 이온 반경이 소듐 이온의 이온 반경보다 큰 단일 1가 양이온을 갖는 염의 형태, 또는
(b) 2 개 이상의 상이한 1가 양이온을 갖는 염의 형태로, 여기서 양이온 중 적어도 하나는 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 것.
대안적으로, 뉴클레오티드 염은 전적으로 소듐 또는 리튬이 아닌 1가 양이온을 포함하지만, 상당한 비율은 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 양이온을 포함하는 뉴클레오티드 염이다. 따라서, 1가 양이온을 갖는 염 형태의 하나 이상의 뉴클레오티드의 존재하에 DNA 주형을 적어도 하나의 중합효소와 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하는, DNA를 합성하는 무세포 방법이 제공되며, 여기서 상기 뉴클레오티드는 적어도 10mM의 농도로 존재하며 전적으로 소듐이나 리튬은 아니다.
뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염의 농도를 언급할 때, 이것은 상기 방법이 시작될 때 뉴클레오티드 (또는 이의 염)의 농도, 즉 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 염)의 시작 또는 초기 농도인 것이 바람직하다. 따라서 그것은 반응 혼합물에 첨가한 후의 농도이다. 상기 방법 도중에 다른 구성 요소를 추가할 수 있음과; 농도를 보충하기 위해 뉴클레오티드가 더 공급되지 않는 한 이러한 첨가는 뉴클레오티드/뉴클레오티드 염의 농도를 희석시킬 수 있음을 알 수 있다. 나아가, 뉴클레오티드/뉴클레오티드 염은 상기 방법, 즉 DNA 합성 반응에 의해 사용되거나 소비되므로 상기 방법이 진행됨에 따라 뉴클레오티드/뉴클레오티드 염의 농도가 떨어질 것이다. 특정 구체예에서, 효소 반응을 위한 기질을 보충하기 위해 상기 방법이 진행됨에 따라 뉴클레오티드/뉴클레오티드 염이 더 첨가될 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 뉴클레오티드 염이 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양이온을 포함하는 경우, 합성에서 2가 양이온에 대한 필요성이 감소된다는 것을 발견했다. 예를 들어, 관례적으로 마그네슘 (2가 양이온)이 뉴클레오티드 염과 적어도 1:1의 최소 비율로 DNA 합성 반응에 존재한다고 규정하다. 이는 일부 중합효소의 활성 부위에 마그네슘이 필요하고; 그것이 혼입에 앞서서 뉴클레오티드와 복합체를 형성할 수 있으며 나아가 DNA 합성 중에 방출된 인산염 이온 종과 자체 염을 형성할 수 있기 때문이다. 그러나, 특정 조건 하에서, 본 발명자들은 마그네슘 또는 다른 2가 양이온에 대한 요구성이 훨씬 감소되는 방법을 개발했다. DNA 합성에 포함된 구성 요소를 줄이면 비용이 현저하게 줄어들지만 더욱 높은 마그네슘 농도는 DNA 합성의 충실도 감소와 관련이 있으므로 이는 중요하다.
2가 양이온은 Mg2+, Be2+, Ca2+, Sr2+, Mn2+ 또는 Zn2+, 바람직하게는 Mg2+ 또는 Mn2+로 구성된 목록에서 선택된 하나 이상의 금속을 포함할 수 있다. 금속 양이온과 뉴클레오티드 염 사이의 비율은 반응 혼합물에서 약 1:1 일 수 있다. 1:1 보다 높은 비율은 DNA 합성에 약간의 불충실성을 유발할 수 있으므로 1:1 보다 낮은 비율이 바람직하며 DNA 합성에서 바람직하다. 2가 양이온은 임의의 적합한 염의 형태로 효소적인 DNA 합성에 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 소듐 이온의 이온 반경 보다 더 큰 이온 반경을 갖는 양이온 또는 1가 양이온을 갖는 뉴클레오티드 염의 사용을 포함하는 환원된 2가 양이온의 조건 하에서 수행되는 효소적인 DNA 합성에 관한 것이다. 이러한 맥락에서 환원된 것은 리튬 또는 소듐 이온이 뉴클레오티드 염에 존재하는 동일한 반응과 비교된다.
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 방법에서 암모늄 및 세슘 이온과 같은 대안적인 반대-이온과 함께 뉴클레오티드 염을 사용하면 효소적인 DNA 합성에 포함될 완충제에 대한 요구 사항이 감소한다는 것을 발견했다. 이것은 다시 말하여 합성 반응의 비용을 줄이고 치료 용도로 DNA 합성에 유익할 수 있으므로 유리하다.
나아가, 본 발명자들에 의해 여기에서 개발된 방법은 존재하는 다른 구성 요소에 대해 광범위한 조건에서 수행될 수 있다. 이러한 조건은 종래의 완충 수준에서 추가적인 완충제를 제공하지 않는 것에 이르기까지 다양하며, 물에서 필요로 하는 성분과의 반응을 효과적으로 수행한다. 필요로 하는 성분은 DNA 합성 효소, 즉 중합효소, 뉴클레오티드 염, 및 (염으로서)2가 양이온을 포함할 수 있으며, 주형, 변성제, 파이로포스파타제, 또는 하나 이상의 프라이머에서 선택되는 바와 같이 반응 조건에 따라 선택적인 추가 성분이 요구된다.
따라서, 놀랍게도 개선된 DNA 수율 및/또는 뉴클레오티드의 DNA 로의 전환의 개선된 효율을 허락하므로, 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양성의 반대-이온 (양이온)을 갖는 염으로서 적어도 일부의 뉴클레오티드를 상기 방법, 즉 반응 혼합물에 제공하는 것이 유리하다. 이러한 개선은 모든 뉴클레오티드가 오직 종래의 염, 예를 들어 단독으로 리튬 또는 소듐 염, 또는 이들 두 이온의 혼합물로서 공급되는 유사한 반응 혼합물에 대비할 수 있다. 종래 사용되는 것들에 다른 뉴클레오티드 염을 제공하는 것은 반응 혼합물에서 완충제의 농도를 어떤 경우엔 0으로 낮추고, 반응 혼합물에 대한 2가 양이온 보조 인자, 가장 특별하게는 마그네슘에 대한 요구 사항을 낮추는 능력과 같은 몇 가지의 더욱 놀라운 이점을 가지고 있다.
한 측면에서, 주형은 상기 방법에서 효소적인 DNA 합성을 안내한다. 이 주형은 DNA 주형일 수 있다. 주형의 증폭은 바람직하게는 가닥 변위(strand-displacement)를 통해 이루어진다. 주형의 증폭은 바람직하게는 등온이며, 즉 증폭을 진행시키기 위해 저온과 고온 사이를 순환할 필요가 없다. 이 시나리오에서는 필요한 경우 주형을 변성하기 위해 처음에 열을 사용하거나 화학적 수단으로 주형을 변성시킬 수 있다. 그러나 적절한 경우, 임의의 프라이머가 이중 가닥 주형 사이에 들어갈 수 있도록 일단 주형이 변성되면 온도는 주형과 제품의 변성에 영향을 미치지 않는 온도 범위에서 유지될 수 있다. 등온 온도 조건은 (주형 및 제품을 변성시키기 위해 열주기가 필요한 PCR과 비교하여) 주형 및 제품이 변성되는 지점까지 반응이 가열되지 않을 것을 요한다. 일반적으로 그러한 반응은 효소 자체의 선호도에 따라 일정한 온도에서 수행된다. 온도는 효소에 적합한 임의의 온도일 수 있다.
무세포 방법은 바람직하게는 가닥 변위 복제를 통한 주형의 증폭을 포함한다. 이 합성은 단일 가닥 DNA를 방출하는데, 이는 중합효소를 사용하여 이중 가닥 DNA로 차례로 복사될 수 있다. 용어 가닥 변위는 합성 중에 만나는 하류 DNA를 대체하는 능력을 설명하며, 여기서 중합효소는 발생기의 단일 가닥을 연장시키기 위해 이중 가닥 DNA를 연다. 다양한 정도의 가닥 변위 활성을 갖는 DNA 중합효소는 상업적으로 이용 가능하다. 대안적으로 DNA 중합효소와 별도의 헬리카제를 공급하여 가닥 변위를 달성할 수 있다. 복제 헬리카제는 이중 DNA를 열고 선도 가닥 중합효소의 진전을 촉진할 수 있다.
독립적으로, 본 발명의 임의의 측면의 선택적 특징은 다음과 같을 수 있다:주형은 원형일 수 있다. 상기 DNA 주형의 가닥 변위 증폭은 RCA (rolling circle amplification)에 의해 수행될 수 있다. 중합효소는 Phi29, 또는 이의 변이체일 수 있다. DNA의 증폭은 등온 증폭, 즉 일정한 온도에서 이루어질 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 랜덤 프라이머일 수 있다. 한 쌍 또는 한 세트의 프라이머가 사용될 수 있다. 합성된 DNA는 DNA 주형으로부터 증폭된 DNA 서열의 직렬 단위(tandem units)를 포함하는 연쇄체(concatamers)를 포함할 수 있다. DNA 주형은 닫힌 선형 DNA 일 수 있다; 바람직하게는 DNA 주형은 폐쇄된 원형 단일 가닥 DNA를 형성하기 위해 변성 조건 하에서 인큐베이트된다.
합성될 수 있는 DNA의 양은 반응 혼합물 1 리터당 3g 이상, 특히 16g/l 이상, 바람직하게는 최대 30g/l 이상이다.
합성될 수 있는 DNA의 양은 반응 혼합물에 대해 계산된 최대 수율의 60 %를 초과 할 수 있다. 바람직하게는, 합성될 수 있는 DNA의 양은 계산된 최대 수율의 80 %를 초과할 수 있다. 계산된 최대 수율은 모든 뉴클레오티드가 제품에 포함되어야하는 이론적 수율을 기반으로하며, 이는 당업자에 의해 계산될 수 있다.
뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 염)로부터의 DNA 합성 효율은 반응 과정에 걸쳐 생성물에 성공적으로 통합되는, 반응 혼합물에 공급되는 뉴클레오티드 또는 이의 염의 백분율로 설명될 수 있다.
무세포 방법에는 적어도 하나의 뉴클레오티드가 필요하다. 그 다음 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드가 부가될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 추가적인 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP), 또는 이의 유도체 또는 개질된 버전이다. 뉴클레오티드 또는 추가 뉴클레오티드는 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 및 이들의 유도체 중 하나 이상이다. 뉴클레오티드 또는 추가적인 뉴클레오티드는 이의 염으로 제공된다. 각각의 개별 뉴클레오티드 염은 전기적 중성을 유지하기 위해 최대 4 개의 1가 양이온을 포함할 수 있다. 상기 방법에 사용되는 뉴클레오티드 염은 하나 이상의 1가 양이온, 즉 하나 이상의 1가 양이온 종을 포함할 수 있으며, 상기 1가 양이온의 전부는 아니더라도 대부분이 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 것이 바람직하다. 이들은 용액에서 해리될 수 있고 따라서 상기 방법에서 양이온의 존재에 기여할 수 있음을 이해할 것이다.
상기 방법에서, 즉 반응 혼합물에서 뉴클레오티드 또는 이의 염의 농도는 10mM 초과 및 100mM까지 일 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 농도는 더 높은 수율의 DNA 생산에 중요하며, 주어진 두 가지 농도의 경우 3g/l 내지 30g/l까지 높을 수 있다. 언급된 뉴클레오티드 또는 이의 염의 농도는 상기 방법의 시작 시에서인 것이 바람직한데, 즉 DNA 합성에 필요한 효소도 포함하는 반응 혼합물에서 뉴클레오티드 또는 이의 염의 시작 또는 초기 농도이다. 추가적인 성분의 후속적 첨가는 이 농도를 감소시킬 수 있으며, DNA 합성 효소에 의한 이들의 사용은 또한 시작 농도로부터 농도를 감소시킬 것이다. 당업자는 다른 성분의 부피 및 사용된 스톡 뉴클레오티드 염 용액/분말에 기초하여 상기 방법이 준비될 때 뉴클레오티드/뉴클레오티드 염의 농도를 계산하는 방법을 알고있을 것이다.
모든 뉴클레오티드가 본질적으로 염으로 공급되므로 용어 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 염은 당업계에서 상호 교환적으로 사용된다.
상기 방법은 배치 공정 또는 연속 흐름 공정일 수 있다. 배치는 폐쇄 배치일 수 있거나 (즉, 모든 반응 성분이 DNA 합성의 시작에서 제공됨) 또는 본원에 참조로서 통합되는WO2016/034849에 설명된 것과 같이 공정 중에 필요에 따라 추가적인 성분이 반응에 공급될 수 있다. 추가적인 첨가가 필요한 경우 농도를 보충하기 위해 추가적인 뉴클레오티드 염이 추가되지 않는 한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염의 농도는 희석될 것이다.
본 발명자들은 각각의 상이한 반대-이온이 효소적인 DNA 합성 반응에 특별한 특징을 추가할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 세슘 이온과 함께 뉴클레오티드 염을 사용하면 마그네슘 수준이 감소된 상태에서의 효소적인 DNA 합성을 초래한다. 또한, 뉴클레오티드 염에서 암모늄 이온을 사용하면 일부 고농도의 뉴클레오티드가 사용되는 것을 유발하였는데, 실시예에서는 80mM 뉴클레오티드 농도에서의 DNA 합성을 보여준다.
본 발명자들은 이전에 뉴클레오티드 염에서 이러한 양이온 중 몇 가지를 사용하는 것을 알지 못했으며, 이는 상업적 공급원으로부터 즉각적으로 이용이 가능하지 않았기 때문이다. 이러한 뉴클레오티드 염은 필요한 경우 뉴클레오티드 제조업체에 맞춤 주문할 수 있다.
따라서, DNA의 효소적인 무세포 합성에서 세슘, 암모늄, 암모늄 유도체 또는 루비듐 양이온 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드 염의 사용은 본 발명의 일부를 형성한다. 따라서, 이들 이온을 포함하는 뉴클레오티드 염의 사용은 본 발명의 일부를 형성한다.
이러한 이온으로 DNA의 효소적인 무세포 합성은 낮은 수준의 2가 양이온의 존재하에, 바람직하게는 약 1:1 미만, 바람직하게는 0.2:1 내지 0.8:1로 2가 양이온 대 뉴클레오티드의 비율로, 바람직하게는 0.2:1 내지 0.5:1로 수행될 수 있다. 상기 이온은 뉴클레오티드 염에서 반대-이온이다.
이러한 이온으로 DNA의 효소적인 무세포 합성은 최소 완충제에서 수행할 수 있으며, 여기서는 DNA 합성을 향상시키거나 프라이머 결합을 돕는 것으로 나타난 추가 염, 또는 세제가 첨가되지 않다. 이 최소 완충액은 pH를 안정화시키는 작용제 (완충제)를 포함할 수 있다. 최소 완충제는 주형을 변성시키는 데 사용되는 화학 물질, 예를 들어 수산화 암모늄, 소듐, 또는 칼륨의 존재에 의해 제공되는 매우 소량의 양이온을 함유할 수 있다. 이온은 뉴클레오티드 염에서 반대-이온이다.
효소적인 DNA 합성에서 낮은 수준의 마그네슘 이온이 바람직하다면, 본 발명자들은 그러한 합성을 위한 신뢰할 수 있는 뉴클레오티드가 세슘 이온을 갖는 뉴클레오티드 염임을 발견했다.
따라서, 본 발명은 세슘 이온을 포함하는 뉴클레오티드 염의 사용을 포함하여 2가 이온 대 뉴클레오티드의 비 0.5:1 이하를 유지하는 것이 요구되는 DNA의 효소적 무세포 합성을 제공한다.
추가적인 이점들이 아래에 설명되어 있다.
본 발명은 예시적인 구체예 및 하기와 같은 첨부 도면을 참조하여 아래에서 더 설명될 것이다.
도 1의 A 내지 E는 DNA 합성 반응에서 상이한 반대-이온 및 상이한 초기/시작 농도의 마그네슘 이온(MgCl2)을 갖는 다양한 시작 농도의 뉴클레오티드 염을 사용한 실험으로 얻은 결과를 보여주는 플롯이다. 각 플롯은 얻은 원시(raw) DNA 수율 (g/l) 대 총 초기/시작 뉴클레오티드 염 농도 (mM)에 해당하는 이론적 DNA 수율 (g/l)을 보여준다. 모든 플롯에서 점선은 뉴클레오티드 염의 DNA 로의 변환 효율이 80 %임을 나타내고 실선은 100 % 변환 효율을 나타낸다. 도 1의 A는 리튬-dNTP를 사용하여 얻은 DNA 합성 결과를 도시하고; 도 1의 B는 소듐-dNTP로 얻은 결과, 도 1C는 칼륨-dNTP로 얻은 결과, 도 1의 D는 암모늄-dNTP로 얻은 결과, 도 1E는 세슘-dNTP를 사용할 때의 결과이다.
도 2는 DNA 합성 실험 데이터를 보여주는 그래프이며 마그네슘 이온의 다양한 반응 농도에 대해 최대 원시 DNA 수율을 제공하는 dNTP 염 농도(mM)의 플롯이다. 리튬, 소듐, 칼륨, 암모늄 및 세슘을 반대-이온으로서 사용한 뉴클레오티드 염에 대한 결과가 나타나 있다. 그래프는 마그네슘 이온 대 뉴클레오티드 염의 비율이 0.5 미만인 결과, 상기 비율이 0.5및 1인 섹션, 상기 비율이 1을 초과하는 마지막 섹션을 강조하는 세 부분으로 나누어져 있다. 또한 마그네슘 이온 대 뉴클레오티드(dNTP)의 0.5:1 비율을 나타내는 점선과 1:1 비율을 나타내는 실선으로 이들 섹션에 대한 역치값이 표시된다.
도 2는 DNA 합성 실험에서 얻은 데이터를 보여주는 그래프이다. 실시예에서 DNA 수율은 다양한 반대-이온을 사용하고 염화 마그네슘의 농도를 증가시켜 고정된 시작 농도의 뉴클레오티드 염으로 수행된 다양한 DNA 합성 반응에 대해 측정하였다. 그래프는 테스트 된 모든 뉴클레오티드 염에 관해 염화마그네슘 농도에 대해 플롯된 원시 DNA 수율(g/l)을 보여준다.
도 3은 다양한 시작 농도의 뉴클레오티드 염을 사용하여 최소 버퍼에서 수행된 롤링 서클 증폭을 사용한 DNA 합성 반응의 데이터를 보여주는 그래프이다. 원시 DNA 수율(g/l) 대 초기/시작 dNTP 염 농도(mM)가 플롯되었다.
도 4는 DNA 주형의 롤링 서클 증폭을 사용한 DNA 합성 실험의 플롯으로서 그러한 동안에 반응 혼합물에 추가 1가 양이온의 존재가 DNA 합성 반응에 영향을 미칠지 여부를 테스트했다. 이 실험에서는 암모늄-뉴클레오티드 염이 사용되었으며, 표시된 1가 양이온 염화물 염도 반응 혼합물에 포함되었다. 암모늄 dNTP 염 대 1가 염화물 염의 시작 비율은 1:4 이었는데; dNTP(이는 4 개가 있음)에 존재하는 각 암모늄 이온에 하나의 1가 양이온이 제공되었기 때문이다. 따라서 1가 양이온에 대한 암모늄 이온(dNTP 염 상에서)의 시작 비율은 1:1이다. 마그네슘의 시작 농도는 또한 도면에 표시된 17.5mM, 25mM, 35mM 및 50mM 농도의 암모늄 반대-이온 dNTP에 각각 해당하는 5mM, 10mM, 20mM 및 40mM으로 다양하다. 리튬, 소듐, 칼륨, 암모늄 및 세슘을 포함한 1가 양이온의 반대-이온 염화물 염의 존재하에 표시된 농도의 암모늄 반대-이온 dNTP (NH4-dNTP)에 대한 원시 DNA 수율이 플롯되며 대조군은 추가 염이 없는 것이다.
도 5의 A 및 6의 B는 다양한 시작 농도의 뉴클레오티드 염에서 중합효소, 주형 및 프라이머가 없는 반응 혼합물의 pH를 비교한 여러 pH 측정 실험의 결과이다. 가변적인 초기 염화 마그네슘(MgCl2) 농도가 사용된다. 플롯은 명시된 초기 염화 마그네슘 농도에서 뉴클레오티드 염의 농도에 대해 측정된 pH를 보여준다. DNA 합성은 발생하지 않았다. 도 6의 A는 세슘(caesium)-dNTP에 대한 데이터 플롯을 보여주고, 도 6의 B는 암모늄(ammonium)-dNTP에 대한 데이터 플롯을 보여준다. 그리고
도 7은 실시예에서 사용된 바와 같은 플라스미드 맵 proTLx-K B5X4 LUX ST (AT)이다. 가공 부위 (TelRL), Luc 2 리포터 유전자, 카나마이신 내성 유전자, CMV 프로모터 및 pUC ori가 나타나 있다.
본 발명은 대규모 DNA 합성을 위한 무세포 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 DNA의 높은 처리량(throughput) 합성을 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 따라 합성되는 데옥시리보핵산 (DNA)은 임의의 DNA 분자일 수 있다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 선형일 수 있다. DNA는 원형, 특히 미니원형, 단일 가닥 폐쇄 원형, 이중 가닥 폐쇄 원형, 이중 가닥 개방 원형 또는 폐쇄 선형 이중 가닥 DNA를 형성하도록 처리될 수 있다. DNA는 헤어핀 루프 (줄기 루프), 불완전한 헤어핀 루프, 유사 매듭, 또는 다양한 유형의 이중 나선 (A- DNA, B-DNA 또는 Z-DNA) 중 어느 하나와 같지만 이에 제한되지 않는 특정 2 차 구조를 형성하거나 형성하도록 처리될 수 있다. DNA는 또한 헤어핀과 압타머 구조를 형성할 수 있다.
합성된 DNA는 임의의 적절한 길이일 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 77 킬로베이스까지 또는 그 초과의 길이가 가능할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법에 따라 합성될 수 있는 DNA의 길이는 최대 60 킬로베이스, 또는 최대 50 킬로베이스, 또는 최대 40 킬로베이스, 또는 최대 30 킬로베이스일 수 있다. 바람직하게는 합성되는 DNA는 100 베이스 내지 77 킬로베이스 이상, 500 염기 내지 60 킬로베이스, 200 염기 내지 20 킬로베이스, 보다 바람직하게 200 염기 내지 15 킬로베이스, 가장 바람직하게 2 킬로베이스 내지 15 킬로베이스일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 합성되는 DNA의 양은 3g/l를 초과할 수 있다. 합성되는 DNA의 양은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30g/l보다 큰 것이 바람직하다. 합성되는 DNA의 바람직한 양은 5g/l이다. 생산되는 DNA의 양은 대규모 또는 대량 생산에서 산업적 또는 상업적 수량으로 설명될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성 된 DNA는 품질, 즉 DNA 길이 및 서열이 균일할 수 있다. 따라서 상기 방법은 대규모 DNA 합성에 적합할 수 있다. 상기 방법은 합성 충실도 측면에서 균일할 수 있다.
대안적으로, 합성 반응에서 생성된 DNA의 양은 100 % 뉴클레오티드가 합성된 DNA에 통합된 경우 달성될 이론적 최대 수율에 대비할 수 있다. 본 발명의 방법은 수득된 총 수율을 개선 할뿐만 아니라 공정의 효율성도 개선하는데, 이는 공급된 뉴클레오티드 중 더 많은 것이 합성된 DNA 생성물에 이전 방법에서보다 통합된다는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 수율은 이론적 최대값의 50 %를 초과하고 이론적 최대값의 최대 90 %에 이르거나 이를 초과한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 달성된 이론적 최대 수율의 비율은 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % 및 95 % 이상을 포함한다. 통상적으로, 상업적으로 이용 가능한 뉴클레오티드 염을 사용하면, 공정을 억제할 수 있는 이온의 효과로 인해 달성된 수율이 실망스러울 수 있다.
DNA는 효소 반응으로 합성된다. 이 효소적 합성은 DNA 합성 효소, 특히 중합효소 효소 또는 개질된 중합효소 효소의 사용을 포함할 수 있다. 이에 대해서는 아래에서 자세히 설명된다. DNA 합성은 신규한 방식(de novo)일 수 있고 주형이 필요하지 않을 수 있다. 효소적 합성은 또한 DNA 합성을 위한 주형의 사용을 요할 수 있다. 이 주형은 중합효소에 따라 적합한 핵산 일 수 있지만 바람직하게는 DNA 주형이다.
주형은 특정 서열을 포함하여 DNA 합성을 위한 지침을 단지 제공하는 임의의 적합한 주형일 수 있다. 주형은 단일 가닥 (ss) 또는 이중 가닥 (ds)일 수 있다. 주형은 선형 또는 원형일 수 있다. 주형은 천연, 인공 또는 개질된 염기 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
주형은 자연적으로 유래되거나 인공적인 임의의 서열을 포함할 수 있다.
주형은 임의의 적절한 길이일 수 있다. 특히, 주형은 최대 60 킬로베이스, 또는 최대 50 킬로베이스, 또는 최대 40 킬로베이스, 또는 최대 30 킬로베이스일 수 있다. 바람직하게는 DNA 주형은 10 베이스 내지 100 베이스, 100 베이스 내지 60 킬로베이스, 200 베이스 내지 20 킬로베이스, 보다 바람직하게 200 베이스 내지 15 킬로베이스, 가장 바람직하게 2 킬로베이스 내지 15 킬로베이스일 수 있다.
주형은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 본 공정에서 사용하기에 충분한 양으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 주형은 PCR에 의해 생성될 수 있다.
주형의 전체 또는 선택된 부분이 본 방법에서 증폭될 수 있다.
주형은 발현을 위한 서열을 포함할 수 있다. DNA는 세포 (즉, 시험 관내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 형질 감염된 세포)에서의 발현을 위한 것일 수 있거나, 무세포 시스템 (즉, 단백질 합성)에서의 발현을 위한 것일 수 있다. 발현을 위한 서열은 치료 목적, 즉 DNA 백신의 유전자 치료를 위한 것일 수 있다. 발현을 위한 서열은 유전자일 수 있고, 상기 유전자는 DNA 백신, 치료 단백질 등을 코딩할 수 있다. 서열은 활성 RNA 형태, 즉 작은 간섭 RNA 분자 (siRNA)로 전사되는 서열을 포함할 수 있다.
필요한 경우, 주형은 아래에 설명된 바와 같이 적어도 하나의 중합효소와 접촉할 수 있다.
효소적인 DNA 합성 반응은 적어도 하나의 DNA 합성 효소를 필요로 할 수 있다. 바람직하게는 효소는 중합효소이다. 중합효소는 뉴클레오티드들을 서로 연결하여 DNA 중합체를 형성한다. 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 다른 효소 및/또는 중합효소가 사용될 수 있다. 중합효소는 DNA의 중합체를 합성하는 중합효소 계열의 임의의 적합한 중합효소일 수 있다. 중합효소는 DNA 중합효소일 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 DNA 중합효소를 포함하여 임의의 DNA 중합효소를 사용할 수 있다. 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 이상의 상이한 DNA 중합효소, 예를 들어 교정 기능을 제공하는 것 및 그렇지 않은 하나 이상의 다른 것들이 사용될 수 있다. 상이한 메커니즘을 갖는 DNA 중합효소, 예를 들어 가닥 변위형 중합효소 및 다른 방법으로 DNA를 복제하는 DNA 중합효소가 사용될 수 있다. 가닥 변위 활성이 없는 DNA 중합효소의 적합한 예는 T4 DNA 중합효소이다. 말단 전이 효소와 같은 주형-독립 중합효소가 사용될 수 있다.
변형된 중합효소도 사용될 수 있다. 이들은 주형에 대한 의존성을 제거하거나, 온도 의존성을 변경하거나, 시험관 내에서 사용하기 위해 효소를 안정화하는 것과 같이 특성을 수정하도록 엔지니어링되었을 수 있다.
중합효소는 매우 안정할 수 있어서 공정 조건 하에서 장기간 인큐베이트해도 활성이 실질적으로 감소하지 않는다. 따라서, 효소는 바람직하게는 온도 및 pH를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 공정 조건 하에서 긴 반감기를 갖는다. 중합효소는 제조 공정에 적합한 하나 이상의 특성을 갖는 것이 또한 바람직하다. 중합효소는 바람직하게는 예를 들어 교정 활성(proofreading activity)을 통해 높은 충실도를 갖는다. 더욱이, 중합효소는 dNTP 및 DNA에 대해 높은 처리율(processivity), 높은 가닥-변위 활성 및 낮은 Km을 나타내는 것이 바람직하다. 중합효소는 원형 및/또는 선형 DNA를 주형으로서 사용할 수 있다. 중합효소는 dsDNA 또는 ssDNA를 주형으로서 사용할 수 있다. 중합효소는 교정 활성과 관련이 없는 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하다.
당업자는 시판되는 중합효소, 예를 들어 Phi29 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, US), Deep Vent® (New England Biolabs, Inc.), Bacillus stearothermophilus (Bst) DNA 중합효소 I (New England Biolabs, Inc.), DNA 중합효소 I의 클레노 단편 (New England Biolabs, Inc.), M-MuLV 역전사 효소 (New England Biolabs, Inc.), VentR® (exo-minus) DNA 중합효소 (New England Biolabs, Inc.), VentR® DNA 중합효소 (New England Biolabs, Inc.), Deep Vent® (exo-) DNA 중합효소 (New England Biolabs, Inc.) 및 Bst DNA 중합효소 큰 단편 (New England Biolabs, Inc.)에 의해 나타나는 특성과 대비하여 주어진 중합효소가 상기 정의된 특성을 나타내는지 여부를 결정할 수 있다. 높은 처리율이 언급되는 경우, 이는 전형적으로 주형과의 회합/해리 당 중합효소 효소에 의해 추가된 평균 뉴클레오티드 수, 즉 단일 회합 이벤트에서 얻은 초기 확장의 길이를 나타낸다.
가닥 변위형(Strand displacement-type) 중합효소가 선호된다. 바람직한 가닥 변위형 중합효소는 Phi29, Deep Vent 및 Bst DNA 중합효소 I 또는 이들의 변이체이다. "가닥 변위"는 합성 중에 이중 가닥 DNA 영역을 만나면 상보적 가닥을 대체하는 중합효소의 능력을 설명하는 것이다. 따라서 주형은 상보적 가닥을 대체하고 새로운 상보적 가닥을 합성하여 증폭된다. 따라서, 가닥 변위 복제 동안, 새로 복제된 가닥이 치환되어 중합효소가 추가로 상보적인 가닥을 복제할 수 있는 길을 만든다. 증폭 반응은 프라이머 또는 단일 가닥 주형의 3' 자유 말단이 주형상의 상보적 서열에 어닐링될 때(둘 다 프라이밍 이벤트) 시작된다. DNA 합성이 진행될 때 그것이 추가적인 프라이머 또는 주형에 어닐링된 다른 가닥을 만나면 중합효소가 이것을 대체하고 가닥 연장을 계속한다. 가닥 변위는 더 많은 프라이밍 이벤트에 대한 주형으로서 작용할 수 있는 단일 가닥 DNA를 방출할 수 있다. 새로 방출된 DNA의 프라이밍은 과다 분지(hyper-branching), 및 높은 수율의 제품으로 이어질 수 있다. 이중 가닥 DNA는 새로운 DNA 가닥의 지속적인 합성에 장애물이 아니므로 변성주기가 효율적인 DNA 증폭에 필수적이지 않다는 점에서 가닥 변위 증폭 방법이 PCR 기반 방법과 다르다는 점을 이해해야 한다. 가닥 변위 증폭은 프라이머가 사용되는 경우 프라이머가 프라이머 결합 부위에 어닐링되도록 하기 위해 이중 가닥인 경우 초기 주형을 변성시키기 위해 1 회의 초기 가열만 필요할 수 있다. 그 후, 더 이상 가열 또는 냉각이 필요하지 않기 때문에 증폭은 등온으로 설명될 수 있다. 대조적으로, PCR 방법은 이중 가닥 DNA를 녹이고 새로운 단일 가닥 주형을 제공하기 위해 증폭 과정 중에 변성(즉, 섭씨 94도 이상으로 온도 올리기)의 주기가 필요하다. 가닥 변위 동안 중합효소는 이미 합성된 DNA 가닥을 대체한다. 또한 새로 합성된 DNA를 주형으로서 사용하여 DNA의 빠른 증폭을 보장한다.
본 발명의 방법에 사용되는 가닥 변위 중합효소는 바람직하게는 적어도 20kb, 더 바람직하게는 적어도 30kb, 적어도 50kb, 또는 적어도 70kb 이상의 처리율을 갖는다. 일 구체예에서, 가닥 변위 DNA 중합효소는 phi29 DNA 중합효소에 맞먹거나 그보다 더 큰 처리율을 갖는다.
따라서 스트랜드 변위 복제가 선호된다. 가닥 변위 복제 동안, 주형은 중합효소의 작용에 의해 합성된 이미 복제된 가닥을 대체하고, 이중 가닥 주형의 원래의 상보적 가닥 또는 새로 합성된 상보적 가닥일 수 있는 다른 가닥을 차례로 대체하여 증폭되는데, 후자는 주형에 어닐링된 초기 프라이머상에서 중합효소의 작용에 의해 합성되는 것이다. 따라서, 주형의 증폭은 다른 가닥의 가닥 변위 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해 발생할 수 있다. 이 과정은 가닥 변위 증폭 또는 가닥 변위 복제로 설명될 수 있다.
바람직한 가닥 변위 복제 프로세스는 루프-매개 등온 증폭(Loop-mediated isothermal amplification) 또는 LAMP이다. LAMP는 일반적으로 주형 DNA의 6-8 개의 구분된 영역을 인식하는 4-6 개의 프라이머를 사용하다. 간단히 말해서, 가닥-변위 DNA 중합효소가 합성을 시작하고 프라이머 중 2 개가 루프 구조를 형성하여 후속 증폭 라운드를 용이하게 한다. 표적 DNA의 센스 및 안티센스 가닥의 서열을 포함하는 내부 프라이머는 LAMP를 시작하다. 외부 프라이머에 의해 프라이밍된 후속 가닥 변위 DNA 합성은 단일-가닥 DNA를 방출하다. 이것은 줄기-루프 DNA 구조를 생성하는 표적의 다른 쪽 말단에 혼성화하는 두 번째 내부 및 외부 프라이머에 의해 프라이밍된 DNA 합성을 위한 주형으로서 역할한다. 후속 LAMP 사이클링에서 하나의 내부 프라이머가 제품의 루프에 혼성화되고 변위 DNA 합성을 시작하여 원래의 줄기-루프 DNA와 줄기가 두 배 더 긴 새로운 줄기-루프 DNA를 생성한다. 수정된 LAMP 절차도 채택할 수 있는데, 여기서는 더 적은 내부 프라이머가 요구된다.
선호되는 가닥 변위 복제 프로세스는 롤링 서클 증폭 (rolling circle amplification, RCA)이다. RCA라는 용어는 혼성화 프라이머를 확장하면서 원형 DNA 주형 가닥 주위에서 지속적으로 진행하는 RCA-형 중합효소의 능력을 설명하는 것이다. 이것은 증폭된 DNA의 다중 반복을 갖는 선형 단일 가닥 생성물의 형성으로 이어진다. 원형 주형 (단일 단위)의 서열은 선형 제품 내에서 복수로 반복된다. 원형 주형의 경우, 가닥 변위 증폭의 초기 생성물은 단일 가닥 연쇄체(concatamer)이며, 이는 주형의 극성에 따라 센스 또는 안티센스이다. 이러한 선형 단일 가닥 산물은 다중 혼성화, 프라이머 연장 및 가닥 변위 이벤트의 기초로서 역할하여, 연쇄적(concatameric) 이중 가닥 DNA 산물을 형성하는데 이는 증폭된 DNA의 다중적 반복을 다시 포함하는 것이다. 따라서 연쇄적 이중 가닥 DNA 산물에는 증폭된 각 "단일 단위" DNA의 복수의 사본이 있다. RCA 중합효소는 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 바람직하다. RCA-형 가닥 변위 복제 공정의 제품은 단일 단위 DNA를 방출하기 위한 처리가 필요할 수 있다. 이것은 단일 단위의 DNA가 필요한 경우 바람직하다. Phi29 DNA 중합효소를 사용하는 전형적인 가닥 변위 조건은 높은 수준의 마그네슘 이온, 예를 들어 0.2 내지 4mM 뉴클레오티드와 조합된 10mM 마그네슘 (일반적으로 염화물 염으로서)을 포함한다.
증폭을 허용하기 위해, 일부 측면에 따르면 하나 이상의 프라이머가 효소적인 DNA 합성에 필요할 수도 있다. 주형을 사용하지 않는 경우 프라이머는 DNA 합성의 시작점을 허용하고 합성 반응을 시작하도록 설계되어 있다. 주형이 사용되는 경우, 프라이머는 비특이적일 수 있거나 (즉, 서열상 무작위) 또는 주형 내에 포함된 하나 이상의 서열에 대해 특이적일 수 있다. 대안적으로, 프리마제 효소가 공급되어 프라이머를 새롭게(de novo) 생성할 수 있다. 프라이머가 무작위 서열인 경우 주형의 어떠한 자리에서도 비-특이적 개시를 허용한다. 이는 각 주형 가닥에서 다중적인 개시 반응을 통해 증폭 효율을 높일 수 있도록 하는 것이다. 랜덤 프라이머의 예는 헥사머, 헵타머, 옥타머, 노나머, 데카머 또는 길이가 더 긴 서열, 예를 들어 길이가 12, 15, 18, 20 또는 30 개 뉴클레오티드이다. 랜덤 프라이머는 길이가 6 내지 30 개, 8 내지 30 개 또는 12 내지 30 개 뉴클레오티드일 수 있다. 랜덤 프라이머는 전형적으로 주형에서 예컨대 헥사머, 헵타머, 옥타머 또는 노나머의 모든 잠재적 조합을 대표하는 올리고뉴클레오티드의 혼합물로서 제공된다.
한 구체예에서, 프라이머 또는 하나 이상의 프라이머는 특이적이다. 이것은 그로부터 증폭의 개시가 요구되는 주형의 서열에 상보적인 서열을 그것들이 가지고 있음을 의미하다. 이 구체예에서, 한 쌍의 프라이머를 사용하여 2 개의 프라이머 결합 부위 내부에 있는 DNA 주형의 일부를 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 대안적으로는 단일의 특이적 프라이머를 사용할 수 있다. 프라이머 세트가 사용될 수 있다.
프라이머는 임의의 핵산 조성물일 수 있다. 프라이머는 표지되지 않았거나 하나 이상의 표지, 예를 들어 방사성핵종 또는 형광 염료를 포함할 수 있다. 프라이머는 또한 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 캡이 제거될 때까지(즉 화학적 또는 물리적 수단에 의해) DNA 합성의 시작을 방지하기 위해 프라이머는 캡핑될 수 있다. 프라이머 길이/서열은 일반적으로 온도 고려 사항, 즉 증폭 단계에서 사용되는 온도에서 주형에 결합할 수 있는지에 기초하여 선택할 수 있다.
특정 측면에서, 주형과, 중합효소 및 하나 이상의 프라이머의 접촉은 주형에 대한 프라이머의 어닐링을 촉진하는 조건 하에서 발생할 수 있다. 상기 조건은 프라이머의 혼성화를 허용하는 단일-가닥 핵산의 존재를 포함한다. 상기 조건은 관습적으로 프라이머를 주형에 어닐링할 수 있는 온도 및 완충액을 또한 포함한다. 프라이머의 특성에 따라 적절한 어닐링/혼성화 조건을 선택할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 관습적인 어닐링 조건의 예는 30mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM KCl, 8mM MgCl2를 포함하는 완충액을 포함한다. 그러나, 본 발명자들은 프라이머 결합을 여전히 허용하는 감소된 완충액 및 2가 금속 이온 성분으로 본원에서의 조건을 설명했으며, 이들은 아래에서 더 논의된다. 어닐링은 열을 사용하여 변성시킨 후 원하는 반응 온도로 점진적으로 냉각시킨 후 수행할 수 있다.
그러나 가닥 변위 복제를 사용한 증폭은 프라이머 없이도 발생할 수 있으므로 혼성화 및 프라이머 연장이 발생할 것을 요하지 않는다. 대신, 단일 가닥 주형은 연장을 위해 이용가능한 자유 3' 말단을 갖는 헤어핀을 형성함으로써 자체-프라이밍한다. 증폭의 나머지 단계는 동일하게 유지된다.
주형 및/또는 중합효소는 또한 뉴클레오티드 염으로서 뉴클레오티드와 접촉하다. DNA 주형, 중합효소 및 뉴클레오티드 염의 조합은 반응 혼합물을 형성하는 것으로 설명될 수 있다. 반응 혼합물은 또한 하나 이상의 프라이머 또는 프리마제를 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 또한 독립적으로 하나 이상의 2가 금속 양이온을 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 화학적 변성제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 변성제는 칼륨, 암모늄 또는 수산화 소듐일 수 있다. 반응 혼합물은 추가적인 효소, 예컨대 헬리카제 또는 피로포스파타제를 더 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 pH 완충제를 함유할 수 있고, 일부 측면에서 pH 완충제를 함유하지 않는다.
뉴클레오티드는 핵산의 모노머 또는 단일 단위이며 뉴클레오티드는 질소 염기, 5-탄소 당 (리보스 또는 데옥시리보스), 및 하나 이상의 인산염 기로 구성된다. 임의의 적합한 뉴클레오티드를 사용할 수 있다.
뉴클레오티드는 1가 양이온의 염으로 존재한다. 1가 양이온은 단일 양전하를 가진 이온 종이며, 따라서 일반적으로 뉴클레오티드 염에 최대 4 개가 존재할 것이다. 1가 양이온은 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 것이 바람직하다. 이온 반경은 이온 결정 구조에서 이온의 반경이다. 이온 반경은 전형적으로는 피코미터 (pm) 또는 옹스트롬 (Å) 단위로 주어진다. 이온 반경은 주어진 이온의 고정된 속성이 아니지만 배위 수 및 스핀 상태를 포함한 다양한 매개 변수에 따라 가변적이다. 그럼에도 불구하고, 이온 반경 값은 원자 이온에 대해 주기적 경향을 인식할 수 있을 만큼 충분히 구별되며, 이온 반경은 주기율표 족에서 하강할 때 증가한다. 동일한 이온의 경우 배위 수가 증가함에 따라 이온 반경이 증가하고, 낮은 스핀 상태의 이온은 높은 스핀 상태의 동일한 이온보다 작다. 일반적으로 이온 반경은 양전하가 증가함에 따라 감소하다. 따라서, 이온 반경이 본 명세서에서 언급될 때, 그것은 그 이온의 임의의 가능한 이온 반경일 수 있다. 예시적인 이온 반경은 표 6에 제시되어있다.
뉴클레오티드는 알칼리 금속 (1족)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1가 금속 이온의 염을 포함할 수 있다: 리튬 (Li+), 소듐 (Na+), 칼륨 (K+), 루비듐 (Rb+), 세슘 (Cs+) 또는 프란슘 (Fr+). 대안적으로 또는 추가적으로, 1가 금속 이온은 전이 금속 (11족)일 수 있다: 구리 (Cu+),은 (Ag+), 금 (Au+) 또는 뢴트게늄 (Rg+). 알칼리 금속이 바람직하고, 따라서 바람직한 반대-이온은 칼륨 (K+), 루비듐 (Rb+), 세슘 (Cs+) 또는 프란슘 (Fr+)일 수 있다.
뉴클레오티드는 다원자 1가 이온의 염을 포함할 수 있다. 다원자 이온은 둘 이상의 원자를 포함하는 이온이다. 이것은 하나의 원자만 포함하는 단일 원자 이온과 다원자 이온을 구별한다. 예시적인 1가 다원자 양이온은 암모늄 (NH4 +) 및 히드로늄 (H3O+)을 포함하며, 여기서 암모늄이 특히 바람직하다. 암모늄은 모든 조건에서 소듐보다 더 큰 이온 반경을 가지고 있다. 암모늄 유도체도 포함되며, 이들의 예시적인 목록에는 모노알킬 암모늄, 디알킬 암모늄, 트리알킬 암모늄, 콜린, 4 차 암모늄 및 이미다졸륨이 포함된다. 당업자는 뉴클레오티드 염상의 반대-이온으로서 사용하기에 적합한 단일 양전하를 운반하는 암모늄의 추가 유도체를 인식할 것이다.
질소 염기는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)일 수 있다. 질소 염기는 또한 5-메틸시토신 (m5C), 슈도우리딘 (Ψ), 디히드로우리딘 (D), 이노신 (I), 및 7-메틸구아노신 (m7G)과 같은 개질된 염기일 수 있다. 질소 염기는 또한 인공적 염기일 수 있다. 뉴클레오티드 염의 농도는 다양한 질소 염기의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
5-탄소 당은 뉴클레오티드가 데옥시뉴클레오티드가 되도록 데옥시리보스인 것이 바람직하다.
뉴클레오티드는 dNTP로 표시되는 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 형태일 수 있다. 이것은 본 발명의 바람직한 구체예이다. 적합한 dNTP는 dATP (데옥시아데노신 트리포스페이트), dGTP (데옥시구아노신 트리포스페이트), dTTP (데옥시티미딘 트리포스페이트), dUTP (데옥시우리딘 트리포스페이트), dCTP (데옥시시티딘 트리포스페이트), dITP (데옥시이노신 트리포스페이트), dXTP (데옥시크산토신 트리포스페이트), 및 유도체 및 개질된 그것의 버전을 포함할 수 있다. dNTP는 dATP, dGTP, dTTP 또는 dCTP, 또는 이들의 개질된 버전 또는 유도체 중 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다. dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP의 혼합물 또는 이들의 개질된 버전을 사용하는 것이 바람직하다. 반응의 필요에 따라 이러한 dNTP의 적절한 비율을 사용할 수 있다.
뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 염은 용액에 있을 수 있거나, 예를 들어 분말로서 고체로 공급될 필요가 있을 수 있다. 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 염은 개질된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 염은 하나 이상의 적합한 염기, 바람직하게는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 중 하나 이상의 혼합물로 제공될 수 있다. 2 개, 3 개 또는 바람직하게는 4 개의 뉴클레오티드 (A, G, T 및 C) 모두가 DNA 합성 과정에 사용된다. 이들 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 염은 모두 실질적으로 동일한 양으로 존재할 수 있거나, 합성될 DNA의 성격에 따라 1 개 또는 2 개 이상이 제공될 수 있다.
뉴클레오티드는 모두 천연 뉴클레오티드 (즉, 개질되지 않음) 일 수 있으며, 천연 뉴클레오티드처럼 작용하고 생물학적으로 활성인 개질된 뉴클레오티드 (즉, LNA 뉴클레오티드-잠금 핵산) 일 수 있으며, 개질되고 생물학적으로 비활성이거나 비 개질 및 개질된 뉴클레오티드의 혼합물, 및/또는 생물학적으로 활성 및 생물학적으로 비활성인 뉴클레오티드의 혼합물일 수 있다.
뉴클레오티드의 각 유형 (즉, 염기)은 하나 이상의 형태, 즉 비개질 및 개질, 또는 생물학적 활성 및 생물학적 비활성으로 제공될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 전부가 적절한 염을 형성할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염은 적어도 10mM의 농도로 존재한다. 이러한 측면에 따르면, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염은 10mM 초과, 15mM 초과, 20mM 초과, 25mM 초과, 30mM 초과, 35mM 초과, 40mM 초과, 45mM 초과, 50mM 초과, 55mM 초과, 60mM 초과, 65mM 초과, 70mM 초과, 75mM 초과, 80mM 초과, 85mM 초과, 90mM 초과, 95mM 초과, 또는 100mM 초과의 농도로 반응 혼합물에 존재할 수 있다. 이러한 농도는 공정 개시 또는 시작시의 뉴클레오티드 염의 농도로서 제공된다. 농도는 뉴클레오티드/뉴클레오티드 염의 첨가 후에 주어지며, 여기서 상기 첨가는 반응 혼합물에 있을 수 있다. 뉴클레오티드 염은 가변적인 질소 염기와 함께 뉴클레오티드 염의 임의의 적절한 혼합물일 수 있다. 농도는 공정 시작시에 존재하는 뉴클레오티드 염의 총합에 적용되는데, 그 조성과는 무관하다. 따라서, 예를 들어, 10mM 농도의 뉴클레오티드 염은 적절한 1가 양이온과 반대-이온화된 dCTP, dATP, dGTP 및 dTTP의 임의의 혼합물일 수 있다.
염으로서 공급된 뉴클레오티드는 음이온성 뉴클레오티드 실체 및 양이온을 형성하기 위해 물 및 다른 용매내에 해리될 수 있음을 이해할 것이다.
뉴클레오티드 염이 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 반대-이온에 의해 형성되는 것이 본 발명의 임의의 측면의 바람직한 부분이다. 그러나 중합효소 또는 DNA 합성 효소는 리튬 및/또는 소듐 뉴클레오티드 염의 어떤 농도를 견딜 수 있는(tolerate) 것 같다. 따라서, 반대-이온이 소듐 및/또는 리튬인 본 발명의 방법에 포함된 뉴클레오티드 염의 일부가 있을 수 있다. 이 부분은 바람직하게는 25 % 미만, 선택적으로 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 % 또는 그 미만이다. 중합효소 또는 DNA 합성 효소는 또한 변성제와 같은 다른 공급원의 소듐 및/또는 리튬을 견딜 수 있다. 반응 혼합물에서 리튬 이온의 총 농도는 15mM, 바람직하게는 10mM, 훨씬 더 바람직하게는 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 또는 그 미만을 초과하지 않는 것이 바람직하다. 리튬이 더 억제성을 보이므로 이 이온은 반응 혼합물에서 실질적으로 제외되는 것이 바람직하다. 소듐 이온의 경우 수산화 나트륨이 일반적으로 변성제로 사용되기 때문에 소듐 이온의 존재는 견딜 수(tolerable) 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 뉴클레오티드 염은 상이한 뉴클레오티드 염의 혼합물, 예를 들어 칼륨-뉴클레오티드 염 및 세슘-뉴클레오티드 염의 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 염을 얼마든지 사용할 수 있다. 염의 적어도 75 %가 소듐 이온보다 이온 반경이 더 큰 반대-이온을 갖는 것이 바람직한데, 선택적으로는 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% 또는 그 초과이다.
DNA의 수율을 최대화하고 다양한 반대-이온의 다른 특성을 활용하기 위해 다른 염의 혼합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로 기재하자면, DNA 주형을 염 형태의 하나 이상의 뉴클레오티드 존재하에 적어도 하나의 중합효소와 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하는 DNA 합성을 위한 무세포 방법이 제공되는데, 여기서 상기 뉴클레오티드는 둘 이상의 염의 형태이며, 각각의 염은 상이한 1가 양이온을 포함하고, 양이온 중 적어도 하나는 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는다. 따라서, 2 개 이상의 상이한 뉴클레오티드 염이 본 발명의 방법에 사용될 수 있으며, 상기 염은 상이한 반대-이온의 사용으로 인해 가변적이다. 모든 염은 소듐 이온의 이온 반경보다 이온 반경이 더 큰 반대-이온의 사용을 요하는 것이 바람직할 수 있다.
효소적인 DNA 합성은 DNA 합성을 촉진하는 조건 하에서 유지될 수 있으며, 이는 선택한 특정 방법에 의존적이다.
가닥 변위를 통한 주형의 증폭이 바람직하다. 바람직하게는, 조건이 다른 가닥의 가닥 변위 복제를 통해 복제된 가닥의 변위에 의해 상기 주형의 증폭을 촉진한다. 상기 조건은 일반적으로 섭씨 20 ~ 90도 범위에서 DNA 증폭을 허용하는 임의의 온도의 사용을 포함한다. 바람직한 온도 범위는 섭씨 약 20 내지 약 40 또는 약 25 내지 약 35 도일 수 있다. LAMP 증폭을 위한 바람직한 온도는 섭씨 약 50 내지 약 70 도이다.
전형적으로 효소적인 DNA 합성을 위한 적절한 온도는 특정 중합효소가 최적의 활성을 갖는 온도에 기초하여 선택된다. 이 정보는 통상적으로 이용가능하며 당업자의 일반적인 지식의 일부를 형성한다. 예를 들어, phi29 DNA 중합효소가 사용되는 경우 적절한 온도 범위는 섭씨 약 25도에서 약 35도, 바람직하게는 섭씨 약 30 도이다. 그러나 내열성 phi29는 더 높은 일정한 온도에서 작동할 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법에 따라 효율적인 증폭에 적합한 온도를 일상적으로 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어, 공정은 다양한 온도에서 수행될 수 있으며, 증폭된 DNA의 수율은 주어진 중합효소에 대한 최적 온도 범위를 식별하기 위해 모니터링될 수 있다. 증폭은 일정한 온도에서 수행할 수 있으며, 공정은 등온인 것이 바람직하다. 가닥 변위 증폭이 선호되므로 DNA 가닥을 분리하기 위해 온도를 변경할 필요가 없다. 따라서 공정은 등온 공정일 수 있다.
DNA 합성을 촉진하는 다른 조건은 통상적으로 효소 성능 또는 안정성에 필요한 적절한 완충제/pH 및 기타 요인의 존재를 포함하는 것으로 생각된다. 적합한 통상적인 조건은 당업계에 공지된 중합효소 효소의 활성을 제공하기 위해 사용되는 임의의 조건을 포함한다.
예를 들어, 반응 혼합물의 pH는 3 내지 10, 바람직하게는 5 내지 8 또는 약 7, 예컨대 약 7.5의 범위 내에있을 수 있다. pH는 하나 이상의 완충제를 사용하여 이 범위로 유지될 수 있다. 이러한 완충제로는 MES, Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOBS, MOPS, MOPSO, Bis-Tris 프로판, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, Trizma, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Tricine, Gly-Gly, Bicine, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS, 포스페이트, 시트르산-인산 수소 나트륨, 시트르산-시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨-아세트산 , 이미다졸 및 탄산나트륨-중탄산 나트륨을 포함하되 이에 제한되지 않는다.
완충제는 일반적으로 반응 성분의 혼합물로 정의된다. 일반적으로는 안정된 pH를 유지하기 위한 완충제가 포함된다; 양이온성 및 음이온성 종으로 구성된 하나 이상의 추가 염, 즉 염화나트륨, 염화칼륨; 및/또는 효소의 최적 활성 또는 안정성을 보장하기 위한 Triton-X-100과 같은 세제. 최소 완충제는 추가 염이나 세제가 제공되지 않은 완충 시약으로만 구성되며, 다만 소량의 양이온성 종은 화학적 변성이 필요한 DNA 합성에 존재할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 방법에서 더 높은 농도의 뉴클레오티드 염의 사용은 이러한 최소 완충제의 사용을 허여한다.
"무완충제(no buffer)" 시스템은 반응 성분의 혼합물에 제공된 또는 정의된 pH 완충제가 없고 추가 염 또는 세제가 없다. 이 "무-완충제" 시스템은 오직 DNA 합성에 필요한 반응 성분만을 포함하고, 화학적 변성을 위해 또는 뉴클레오티드 염 반대-이온만으로서 제공되는 양이온 종을 포함한다. 따라서 이 시스템에서는 DNA 합성 반응에서 특정 목적에 사용되는 이온 외에 추가되는 추가적인 이온이 없다. 뉴클레오티드 (염으로서)와 함께 제공되는 반대-이온은 공정에서 사용하기 전에 뉴클레오티드를 안정화시키는 역할을 한다.
열의 적용 (95 ℃에 몇 분 동안 노출)이 이중 가닥 DNA를 변성시키는 데 사용되는 동안 DNA 합성에 더 적합한 다른 접근법이 사용될 수 있다. 이중 가닥 DNA는 높거나 낮은 pH 환경에 노출되거나 양이온이 없거나 탈 이온수와 같이 매우 낮은 농도로 존재하는 경우 쉽게 변성될 수 있다. 중합효소는 복제를 개시하기 위해 DNA 주형의 단일 가닥 영역에 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열의 결합을 필요로 한다. 이러한 상호 작용의 안정성과 따라서 DNA 합성의 효율성은 특별히 금속 양이온의 농도에 의해 영향을 받을 수 있으며, 특히 공정의 필수 부분으로 보일 수 있는 Mg2+ 이온과 같은 2가 양이온에 의해 영향을 받을 수 있다.
효소적인 DNA 합성에는 2가 금속 이온이 필요할 수도 있다. 이 공정은 마그네슘 (Mg2+), 망간 (Mn2+), 칼슘 (Ca2+), 베릴륨 (Be2+), 아연 (Zn2+) 및 스트론튬 (Sr2+)과 같은 2가 금속 이온의 염의 사용을 포함할 수 있다. DNA 합성에서 가장 자주 사용되는 2가 이온은 마그네슘 또는 망간이다.
효소적인 DNA 합성은 이전에 가능하다고 생각했던 것보다 낮은 농도의 2가 금속 이온에서 수행할 수 있다. 통상적으로 2가의 양이온 대 뉴클레오티드 2:1까지의 비율이 필요하거나 최적이라고 생각되며, 실시예의 데이터에서 보여주는 바와 같이 이는 특히 주로 사용되는 형태인 리튬 이온을 갖는 뉴클레오티드 염에 대해 사실이다. 그러나 이들 염에 대체 이온을 사용하면 2가 이온, 특히 마그네슘에 대한 요구성이 급격히 감소하여 이온 대 뉴클레오티드 염의 비율이 1.5:1, 또는 약 1:1 또는 그 미만이 된다. 0.2:1의 마그네슘 대 뉴클레오티드 염의 비율에 대한 결과도 얻어졌으며, 이러한 결과는 세슘과 함께 뉴클레오티드 염에서도 얻어졌다. 이러한 비율은 더 높은 농도의 뉴클레오티드 염 (즉, 20mM 이상)에서 특별히 뚜렷하다. 따라서, 본 발명은 또한 마그네슘 이온 대 뉴클레오티드 염의 비율이 1:1 이하인 DNA의 합성에 관한 것으로, 뉴클레오티드 염이 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 반대-이온을 포함하는 것을 특징으로 하며 뉴클레오티드 염의 농도는 25mM 초과, 30mM 초과, 35mM 초과, 40mM 초과, 45mM 초과, 50mM 초과, 55mM 초과, 60mM 초과, 65mM 초과, 70mM 초과, 75mM 초과, 80mM 초과, 85mM 초과, 90mM 초과, 95mM 초과, 또는 100mM 초과이다.
합성 중에 중합효소는 성장하는 DNA 사슬에 통합된 뉴클레오티드에서 피로 인산염을 방출한다. 피로인산염은 삼인산 뉴클레오시드와 유사한 마그네슘 이온에 대한 결합 친화력을 가지고 있으므로 이 과정에서 유리 마그네슘 이온이 방출되지 않는다. 합성 중에 높은 시작 농도로 뉴클레오티드를 사용하면 유리 마그네슘 이온 수준이 감소한다. 이러한 이온은 중합효소 촉매 활성에 필요할 수 있으므로 인산염 또는 인산염기와의 상호 작용으로 인한 차선의 수준이 효율적인 증폭에 해로울 수 있다고 생각하는 것이 종래로부터의 생각이다. 충분한, 그리고 결과적으로 과잉 농도의 마그네슘 이온은 DNA 수율과 증폭에 중요한 것으로 생각되었다. 따라서 수율을 유지하면서 마그네슘 수준을 낮추는 능력은 관련 기술에 대한 흥미로운 개선점이다.
따라서, 본 발명은 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 양이온들 또는 1가 양이온을 갖는 뉴클레오티드 염의 사용을 포함하는, dNTP에 대한 2가 양이온의 감소된 비율의 조건 하에서 수행되는 효소적인 DNA 합성을 제공한다.
이 효과는 특히 암모늄과 세슘을 포함하는 뉴클레오티드 염 또는 이들의 혼합물로써 특히 현저하다.
세제는 또한 특정 측면에서 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 적합한 세제의 예는 Triton X-100TM, Tween 20TM 및 이들의 유도체를 포함한다. 안정화제도 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 임의의 적합한 안정화제, 특히 소 혈청 알부민 (BSA) 및 기타 안정화 단백질이 사용될 수 있다. 반응 조건도 DNA를 이완시키고 주형 변성을 쉽게 만드는 제제를 추가하여 개선할 수 있다. 이러한 제제에는 예를 들어 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 포름 아미드, 글리세롤 및 베타인이 포함된다. DNA 축합제도 또한 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 이러한 제제는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 양이온성 지질 또는 양이온성 중합체를 포함한다.
그러나, 특정 구체예에서, 이러한 성분은 예를 들어 최소 또는 무-완충계에서 반응 혼합물로부터 감소되거나 제거될 수 있다.
당업자는 그들의 일반적인 지식에 기초하여 이러한 추가 성분 및 조건을 사용하여 본 발명의 방법에 대한 합성 조건을 수정하고 최적화할 수 있음을 이해해야한다. 마찬가지로, 특정 제제의 특정 농도는 당업계의 이전 예에 기초하여 선택될 수 있고 일반적인 지식에 기초하여 더욱 최적화될 수 있다.
예를 들어, 당업계의 RCA-기반 방법에 사용되는 적합한 반응 완충제는 50mM Tris HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 20mM (NH4)2SO4, 5 % 글리세롤, 0.2mM BSA, 1mM dNTP이다. 본 발명의 RCA 증폭에 사용되는 바람직한 반응 완충제는 30mM Tris-HCl pH 7.9, 30mM KCl, 7.5mM MgCl2, 10mM (NH4)2SO4, 4mM DTT, 2mM dNTP들이다. 이 완충제는 Phi29 DNA 중합효소와 함께 사용하기에 특히 적합하다.
본 발명의 뉴클레오티드 염과 함께 사용하기에 적합한 반응 완충제는 30mM Tris HCl, pH 7.9, 5mM (NH4)2SO4, 및 30mM KCl이다. 특정 상황에서 효소적인 DNA 합성은 물에서 수행될 수 있다( "무완충제").
효소적인 DNA 합성은 또한 하나 이상의 추가적인 단백질의 사용을 포함할 수 있다. DNA 주형은 효소 무기 피로인산가수분해효소와 같은 적어도 하나의 피로인산가수분해효소의 존재하에 증폭될 수 있다. 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 그 이상의 상이한 피로인산가수분해효소가 사용될 수 있다. 이들 효소는 가닥 복제 동안 dNTP로부터 중합효소에 의해 생성된 피로인산염을 분해할 수 있다. 반응에서 피로인산염이 축적되면 DNA 중합효소가 억제되고 DNA 증폭의 속도와 효율성이 저하될 수 있다. 피로인산가수분해효소는 피로인산염을 비-억제성 인산염으로 분해할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 피로인산가수분해효소의 예는 New England Biolabs, Inc.로부터 상업적으로 이용가능한 사카로마이세스 세레비지에 피로포스파타제(Saccharomyces cerevisiae pyrophosphatase)이다.
단일 가닥 DNA를 안정화시키기 위해 임의의 단일 가닥 결합 단백질 (SSBP)이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. SSBP는 살아있는 세포의 필수 구성 요소이며 DNA 복제, 복구 및 재조합과 같이 ssDNA와 관련된 모든 과정에 참여하다. 이러한 과정에서 SSBP는 일시적으로 형성된 ssDNA에 결합하여 ssDNA 구조를 안정화하는 것을 도와줄 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 SSBP의 예는 New England Biolabs, Inc.로부터 상업적으로 이용가능한 T4 유전자 32 단백질이다.
반응의 수율은 합성된 DNA의 양과 관련이 있다. 본 발명에 따른 방법으로부터 예상되는 수율은 3g/l를 초과할 수 있다. 합성되는 DNA의 양은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30g/l 이상인 것이 바람직하다. 합성되는 DNA의 바람직한 양은 5g/l이다. 본 발명은 DNA의 효소적인 합성으로부터 가능한 수율을 향상시킨다. 본 발명의 목적은 비용 효율적인 방식으로 DNA를 대규모로 합성할 수 있도록 무세포 효소적인 DNA 합성 공정의 수율을 향상시키는 것이다. 본 발명은 DNA 합성 효소 또는 중합효소에 의해 촉매되는 효소 공정을 이용하여 산업적 규모로 경제적으로 DNA를 제조/합성할 수 있게 한다. 본 방법은 DNA 산물에 뉴클레오티드의 효율적인 통합을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 반응 혼합물이 수십 리터를 포함하여 수 리터로 확장될 수 있도록 할 것으로 생각된다. 개선된 수율, 생산성 또는 공정성은 모든 뉴클레오티드가 통상적인 염(소듐 및/또는 리튬)으로 공급되는 동일한 반응 혼합물에 필적할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 DNA 합성을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 향상은 사용된 모든 뉴클레오티드 염이 오로지 소듐 또는 리튬, 또는 이들의 혼합물인 것을 제외하고는 동일한 반응 혼합물에 필적할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 반응 혼합물을 형성하기 위하여 1가 양이온 또는 양이온들과의 염 형태로 하나 이상의 뉴클레오티드의 존재하에 DNA 주형을 적어도 하나의 중합효소와 접촉시키는 단계를 포함하는 DNA 합성을 위한 무세포 방법을 제공하는데, 여기서 상기 뉴클레오티드는 적어도 10mM의 농도로 존재하고 상기 양이온은 소듐 또는 리튬만은 아니다.
대안적으로, 반응 혼합물을 형성하기 위하여 염 형태로 하나 이상의 뉴클레오티드의 존재하에 DNA 주형을 적어도 하나의 중합효소와 접촉시키는 단계를 포함하는 DNA 합성을 위한 무세포 방법에 있어서, 여기서 상기 뉴클레오티드는 적어도 10mM의 농도로 존재하고 다음 중 어느 하나이다:
(a) 이온 반경이 소듐 이온의 반경보다 큰 단일 1가 양이온을 갖는 염의 형태, 또는
(b) 2 개 이상의 상이한 1가 양이온을 갖는 염의 형태로, 여기서 양이온 중 적어도 하나는 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는다.
본원에 언급된 뉴클레오티드의 농도는 공정 시작시 뉴클레오티드의 시작 농도, 반응 혼합물이 형성될 때의 초기 농도인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 10 내지 20mM, 또는 30mM까지의 농도로 소듐 이온과 염 형태의 하나 이상의 뉴클레오티드의 존재하에 DNA 주형을 적어도 하나의 중합효소와 접촉시키는 단계를 포함하는 DNA 합성을 위한 무세포 방법에 관한 것일 수 있다. 본 발명은 염으로서 공급되는 뉴클레오티드의 사용을 포함하는 DNA의 효소적인 합성을 위한 무세포 방법을 제공하며, 여기서 상기 염은 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양이온을 포함하며, 바람직하게는 뉴클레오티드 염은 공급되거나 10mM 초과의 농도로 존재한다.
본 발명은 나아가 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 양이온들 또는 1가 양이온을 갖는 뉴클레오티드 염의 사용을 포함하는, 감소된 2가 양이온, 바람직하게는 마그네슘의 조건 하에서 수행되는 효소적인 DNA 합성을 제공한다.
본 발명은 대안적으로 칼륨 이온보다 더 큰 이온 반경을 갖는 반대-이온을 갖는 뉴클레오티드 염을 사용하여 수행될 수 있으며, 선택적으로 상기 뉴클레오티드 염의 농도는 25mM 초과, 30mM 초과, 35mM 초과, 40mM 초과, 45mM 초과, 50mM 초과, 55mM 초과, 60mM 초과, 65mM 초과, 70mM 초과, 75mM 초과, 80mM 초과, 85mM 초과, 90mM 초과, 95mM 초과, 또는 100mM 초과이다.
염 형태의 뉴클레오티드는 본원에서 뉴클레오티드 염이라고도 칭한다.
본 발명은 이제 몇 가지 비제한적인 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
실시예
재료 및 방법
시약
제시된 실시예에서는 다음 시약이 사용되었다:
dNTP 염 리튬 염, 스톡 농도 100mM (Bioline)
dNTP 염 소듐, 칼륨, 세슘, 암모늄, 염, 스톡 농도 100mM (계약 합성)
Phi29 DNA 중합효소, 스톡 농도 2.4g/l (사내 생산)
내열성 피로포스파타제, 스톡 농도 2000 U/ml (Enzymatics)
DNA 프라이머, 스톡 농도 5mM (Oligofactory)
플라스미드 주형: ProTLx-K B5X4 LUX 15-0-15-10-15 AT-STEM, 스톡 농도 0.1 g/l (사내 생산)
뉴클레아제가 없는 물 (Sigma Aldrich)
염화 마그네슘, 스톡 농도 2M (Sigma Aldrich)
Tris-base (Thermo Fisher Scientific)
Tris-HCl (Sigma Aldrich)
NaCl (Sigma Aldrich)
EDTA, 스톡 농도 0.5M (Sigma Aldrich)
PEG 8000 (Applichem)
에탄올 (Thermo Fisher Scientific)
GeneRuler 1kb + DNA 래더 (Thermo Fisher Scientific)
20x 스톡으로부터의 TAE 버퍼 (Thermo Fisher Scientific)
염화 칼륨 (Sigma Aldrich)
염화 리튬 (Sigma Aldrich)
염화 세슘 (Sigma Aldrich)
염화 암모늄 (Sigma Aldrich)
황산 암모늄 (Thermo Fisher Scientific)
실시예 1
상이한 농도의 마그네슘 이온 및 뉴클레오티드 염 (dNTP 염)에서 롤링 서클 증폭 (RCA) 반응 (리튬, 소듐, 칼륨, 세슘 및 암모늄 양이온으로 반대-이온화 됨); DNA 수율에 미치는 효과.
서론
반응 완충액에서 마그네슘 이온의 농도는 DNA 중합효소에 의한 최적의 DNA 합성에 중요하다. 낮은 마그네슘 이온 농도는 DNA 합성을 거의 또는 전혀 일으키지 않을 수 있는 반면, 높은 농도는 종종 비특이적 산물의 생산을 초래할뿐만 아니라 dNTP의 잘못된 통합 및 복제 오류의 후속적 증가를 유발하는 것으로 보고되었다. 마그네슘은 각 dNTP의 포스페이트 부분에 결합하기 때문에 사용되는 dNTP의 농도와 같거나 더 높은 농도의 마그네슘 이온을 사용하는 것이 일반적인 실무이다 (Dean, F. B., Nelson, J. R., Giesler, T. L., & Lasken, R. S. (2001). Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification.　Genome Research,　11(6), 1095-1099. http://doi.org/10.1101/gr.180501). 마그네슘-dNTP는 DNA 중합효소에 의한 고 충실도 DNA 합성을 위한 절대적인 요구 사항이다. 마그네슘은 또한 DNA에 결합하여 구조적 변화에 영향을 미치고 DNA 합성에 필요한 농도보다 높은 농도에서 별개의 가닥 사이에서 교차 연결을 형성할 수 있다.
산업적으로 적절한 양의 DNA를 효소적으로 생산하려면 가장 높은 수율의 DNA를 얻기 위해 반응에 사용되는 dNTP의 농도를 최대화할 필요가 있다. 또한 반응은 효율적이고 정확해야 한다. 시판되는 dNTP는 분자 당 4 개의 금속 1가 양이온을 갖는 소듐 또는 리튬 염이 전형적이다. DNA 합성에 관한 대부분의 출판물은 반대-이온의 특성과 마그네슘 -dNTP의 형성에 대한 그것들의 가능한 영향을 무시한다. 반응에서 dNTP의 농도가 증가하면 1가 반대-이온의 농도가 4 배 증가할 수 있으므로 DNA 증폭 반응에 잠재적인 영향력을 갖는다.
따라서 DNA 합성에서 마그네슘 1가 반대-이온 역학을 이해하는 것은 가능한 가장 낮은 마그네슘 농도에서 DNA 수율을 최대화하여 DNA 생성물의 최고 정확도를 허용하는 데 매우 중요하다.
다음 실험 설정은 초기 마그네슘 농도 (5mM, 10mM, 20mM 및 40mM) 및 dNTP의 상이한 염들이 RCA (Rolling Circle Amplification)에 의해 증폭된 DNA 수율에 미치는 영향을 평가했다.
반응 설정
반응은 다음과 같이 100μl 규모로 설정되었다: 변성 혼합물을 준비하고 반응 혼합물을 모으는 동안 실온에 두었다. 그런 다음 이들을 혼합하고 DNA 중합효소와 피로 포스파타제를 첨가했다. 표 1은 실험 프로토콜을 보여준다.
RCA 반응은 진행 전에 최소 48 시간 동안 30 ℃에서 인큐베이트하였다.
표 1 - RCA 반응 성분
Figure pct00001
샘플 처리 절차
RCA의 48 시간 후에 1.5x 몰 과량의 EDTA 대 MgCl2를 첨가하고 반응을 물과 함께 800 μl 부피로 만들었다. 15 분 동안 격렬하게 흔들어 반응이 완전히 혼합될 때까지 회전 장치에 두었다. 그 다음 200μl의 5M NaCl을 첨가하여 1M NaCl에서 1ml로 반응시켰다. 이어서 100μl 50 % (w / v) PEG 8000을 추가로 첨가하여 연쇄체(Concatemeric) DNA를 침전시켰다. 혼합물을 15 분 동안 격렬하게 흔들어 완전한 침전을 보장한 다음 벤치-탑 원심 분리기에서 10 분 동안 13,000rpm으로 회전시켰다. 상청액을 조심스럽게 따라내고, 펠릿을 100 % 에탄올 500μl로 세척했다. 펠렛을 10 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 13,000rpm으로 재원심분리하고 에탄올 상청액을 조심스럽게 따라내었다. 펠렛을 5 분 동안 건조시켜 잔류 에탄올을 증발시키고, 1ml 물에 재현탁시키고 밤새 회전장치에 두었다.
Implen NP80 나노 광도계를 사용하여 UV 흡수 측정으로 반응 DNA 농도를 정량했다. 반응 부피의 10 배 증가에 대해 데이터가 수정되고 농도는 원래 부피 대 사용된 dNTP 농도의 g/l로 표시된다.
결과
표 2 내지 5와 도 1 및 2는 마그네슘의 초기 농도와 상이한 dNTP 염들의 시작 농도가 원시 DNA 수율에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 괄호 안의 값은 각 유형의 dNTP 염에 대해 달성된 최고 DNA 수율에서 마그네슘/dNTP의 비율을 나타낸다.
표 2 - 5mM MgCl 2 의 반응 농도. 최고(peak) 수율은 굵게 강조 표시되고, 괄호 안의 숫자는 마그네슘/dNTP 비율이다:
Figure pct00002
표 3 - 10mM MgCl 2 의 반응 농도. 최고(peak) 수율은 굵게 강조 표시되고, 괄호 안의 숫자는 마그네슘/dNTP 비율이다:
Figure pct00003
표 4 - 20mM MgCl 2 의 반응 농도. 최고(peak) 수율은 굵게 강조 표시되고, 괄호 안의 숫자는 마그네슘/dNTP 비율이다:
Figure pct00004
표 5 - 40mM MgCl 2 의 반응 농도. 최고(peak) 수율은 굵게 강조 표시되고, 괄호 안의 숫자는 마그네슘/dNTP 비율이다:
Figure pct00005
표 2 내지 5의 데이터는 비상업적으로 이용 가능한 칼륨, 암모늄 및 세슘 dNTP 염으로 DNA의 가장 높은 수율을 얻을 수 있음을 보여준다. 이러한 dNTP 염 반대-이온을 사용하고 마그네슘 농도를 40mM로 증가시킴으로써 최대 50mM dNTP의 시작 농도를 사용하고 Phi29 DNA 중합효소에 의해 DNA 로의 효율적인 변환을 달성하는 것이 가능하다.
리튬-dNTP는 다른 1가 양이온보다 훨씬 높은 수준의 마그네슘을 필요로하는 DNA 합성을 위한 열악한 기질이었다. 실제로 40mM 마그네슘(4.328g/l)에서 최대 DNA 수율은 20mM dNTP의 농도에서만 발생했다. 소듐-dNTP는 30mM dNTP로 달성된 40mM 마그네슘에서 최고 DNA 수율(6.897g/l)로 리튬 당량보다 더 나은 성능을 발휘했다.
암모늄은 0.8의 마그네슘/dNTP 비율을 유지하면서 dNTP (50mM dNTP 및 40mM MgCl2)의 최고 시작 농도에서 가장 높은 DNA 수율(13.44g/l)을 달성하는 데 가장 좋은 dNTP 반대-이온이었다. 데이터의 추세는 MgCl2 농도를 추가로 증가시킴으로써 암모늄-dNTP의 시작 농도와 그것들의 DNA 로의 통합을 더욱 증가시키는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
칼륨-dNTP도 높은 dNTP 농도 (50mM 및 40mM MgCl2)와 0.80의 마그네슘/dNTP 비율에서 달성된 DNA 수율 모두에서 리튬 및 소듐 대응물보다 우수했다. 반응 조건에서 칼륨-dNTP는 암모늄-dNTP와 거의 필적할 만한 성능을 보였다.
공정의 5mM 및 10mM MgCl2에서 각각 25mM 및 30mM의 시작 농도에서 세슘-dNTP를 사용하여 가장 높은 DNA 수율 (5.719g/l 및 8.262g/l)을 달성한다. 5mM MgCl2 및 25mM dNTP에서 마그네슘/dNTP 비율은 0.2였으며 제시된 모든 데이터에 대해 가장 낮은 수치를 기록했다. 따라서 세슘-dNTP의 사용은 높은 수율을 생성하면서 가능한 가장 낮은 농도의 마그네슘 이온을 사용하는 것이 유익한 조건 (DNA 증폭 과정의 결과)하에서 유리하다.
암모늄 이온은 다원자며 완전히 비금속이라는 점에서 조사된 다른 1가-양이온 중에서 독특하다. 그것은 pH 완충제로서 작용할 수 있으며 그것의 9.24의 pKa에서는 물에 50 % 암모니아(NH3)로서 존재하다. NH3의 휘발성으로 인해 금속 1가-양이온으로는 불가능한 저압 증발과 같은 DNA 처리 기술을 사용할 수 있다.
도 1은 표 2 내지 5에 표시된 데이터를 그래프로 나타낸 것이며, 상이한 농도들의 염화 마그네슘에서, 수득한 원시 DNA 수율 (g/l) 대 총 초기/시작 뉴클레오티드 염 농도(mM)에 해당하는 이론적 DNA 수율(g/l)의 플롯을 보여준다.
도 2는 마그네슘 이온의 상이한 반응 농도들에 대해 최대 원시 DNA 수율을 제공한 dNTP 염 농도 (mM)의 플롯이다. 마그네슘에 대한 의존도가 리튬-dNTP 및 소듐-dNTP에 대해 가장 높지만 다른 반대-이온들에 대해서는 감소한다는 것을 분명히 보여준다.
표 6은 상이한 배위 수에서 1가 반대-이온의 이온 반경을 포함한다. 반대-이온의 크기 (마그네슘 대비) 및 높은 수준의 dNTP를 사용하는 데 필요한 마그네슘 농도 사이에는 명확한 관계가 있다. 칼륨, 세슘 및 암모늄과 같은 보다 큰 양이온들은 소듐 및 특별히 리튬보다 훨씬 우수하다.
표 6 - 반대-이온의 원자 반경:
Figure pct00006
참조: http://abulafia.mt.ic.ac.uk/shannon/ptable.php, Shriver & Atkins
따라서 dNTP 염 반대-이온을 선택적으로 사용하면 산업적인 공정에서 DNA 수율을 높일 수 있다. 이는 실시예 6에서 제시된 바와 같이 dNTP, DNA, 및 방출된 포스페이트(PO4 3-) 음이온에 대한 반대-이온의 차별적 친화성 및 마그네슘 2가 양이온과의 경쟁 역학에 의해 매개될 수 있다.
실시예 2
상이한 농도의 마그네슘 이온 및 고정된 농도의 dNTP 염 (리튬, 소듐, 칼륨, 세슘 및 암모늄 양이온과 반대-이온화됨)에서 롤링 서클 증폭 (RCA) 반응; DNA 수율에 미치는 효과.
서론 및 반응 설정
이 실험은 시작 단계에서 고정된 양의 dNTP (10mM)를 통합하는 데 필요한 마그네슘 이온의 최소 농도를 결정하도록 설계되었다. RCA 반응 및 처리는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다. dNTP (리튬, 소듐, 칼륨, 세슘 및 암모늄 염으로서)의 농도는 시작시 공정에서 10mM로 고정되었고 반응은 2mM, 4mM, 6mM, 8mM, 및 10 mM MgCl2가 보충된 실시예 1에서 사용된 표준 RCA 완충액에서 수행되었다..
결과
결과는 효율적인 dNTP 통합을 위해 마그네슘/dNTP의 적어도 1:1의 비율이 필요하다는 폭 넓은 견해에 대조적으로, 리튬보다는 상이한 반대-이온으로 dNTP로 변경할 때 추가적으로 DNA 수율을 향상시키면서 RCA 반응에서 마그네슘은 이 비율 아래로 훨씬 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.
도 3에서 볼 수 있는 바와 같이 소듐-dNTP 및 리튬-dNTP 양자의 수율은 마그네슘 수준에 강한 의존성을 가지고 있다. 칼륨-dNTP에 대해 2mM MgCl2에서 생성된 DNA가 약간 감소했지만, 이러한 형태의 dNTP 염은 세슘-dNTP 및 암모늄-dNTP와 함께 마그네슘 이온 농도에 대해 의존도가 낮음을 보여준다. 이는 최적의 마그네슘/dNTP 비율이 1:1이라는 일반적인 가정이 dNTP 반대-이온의 유형을 고려하지 않고 잘못인도한다는 것을 시사한다. 데이터는 리튬과 소듐에 대한 대안적인 반대-이온을 사용하면이 이 비율을 0.2:1 만큼 줄일 수 있음을 보여준다.
실시예 3
고정된 수준의 마그네슘 이온과 증가하는 농도의 dNTP 염 (리튬, 소듐, 칼륨, 및 암모늄 양이온으로 반대-이온화됨)에서 최소 완충액 내 롤링 서클 증폭 (RCA) 반응; DNA 수율에 미치는 효과.
서론 및 반응 설정
완충액 성분의 가능한 반대-이온 효과를 제거하기 위해 5mM MgCl2로 보충된 30mM Tris HCl (pH7.9)만으로 구성된 최소 완충액에서 실험을 수행했다. 이러한 반응은 5mM MgCl2를 포함하는 반응에서 시작 dNTP 염 농도 (리튬, 소듐, 칼륨, 또는 암모늄 염으로 공급되는 2.5mM내지 20mM dNTP) 증가의 효과를 조사하였다.
표 7-최소 완충액으로써 RCA 반응 성분 :
Figure pct00007
DNA 처리 및 정량화는 실시예 1에 설명된 대로 수행하였다.
결과는 도 4에 나타나 있다.
데이터는 RCA가 표준 반응 완충액에 존재하는 30mM KCl 및 5mM (NH4)2SO4의 존재없이 진행됨을 보여준다. 수율 증가 대 다양한 반대-이온을 갖는 dNTP 염 농도의 관찰 된 경향은 실시예 1에 제시된 데이터와 일치하는데, 암모늄-dNTP가 다른 반대-이온화된 dNTP 염보다 더 우수한 성능을 보이는 것으로 확인하는 것이다.
도 4는 dNTP 염 반대-이온을 바꾸면 RCA가 더 높은 농도의 dNTP에서 진행할 수 있으며 수율이 상응하여 증가된다는 것을 입증하는 것이다.
표 8 - 5mM MgCl 2 에서 최소 완충액 내에서 수행된 다양한 반대-이온화 dNTP로부터의 원시 DNA 수율. 최고 수율은 굵게 강조 표시되어 있으며 마그네슘/dNTP의 비율은 괄호 안에 보여진다.
Figure pct00008
실시예 4
가장 높은 원시 DNA 수율을 결정하기 위한 상이한 농도들의 마그네슘 이온 및 암모늄-dNTP에서 RCA (Rolling Circle amplification) 반응
서론 및 반응 설정
이러한 반응은 실시예 3 (도 4)에 표시된 실험 데이터를 확장하고 상이한 마그네슘 농도들의 존재하에 암모늄-dNTP의 농도를 증가시켜 DNA 수율의 한계를 찾는 것을 목표로 한다. RCA 반응 및 DNA 처리는 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 최소 완충액에서 수행되었다.
결과
표 9 - 상이한 MgCl 2 농도들에서 최소 완충액에서 수행된 암모늄-dNTP의 원시 DNA 수율. 최고 수율은 굴게 강조 표시되어 있으며, 괄호 안의 숫자는 마그네슘/dNTP의 비율이다:
Figure pct00009
데이터는 암모늄 반대-이온화 dNTP를 사용하여 반응에서 dNTP의 시작 농도를 추가로 증가시키고(최대 80mM) 매우 높은 수준의 DNA를 생성할 수 있음을 보여준다. 이것은 최소 완충액에서 MgCl2의 농도를 80mM로 상당히 증가시킴으로써 달성된다. 80mM MgCl2 및 80mM 암모늄-dNTP에서도 DNA의 최대 수율에 도달하지 않은 것이 분명하다. 더 많은 dNTP를 추가하면 DNA 수율이 더욱 높아진다. MgCl2 및 암모늄-dNTP의 농도가 증가하면 (80mM 이상) 마그네슘/dNTP 비율이 1 미만일 것으로 예상되는 조건하에서 훨씬 더 높은 수준의 DNA가 생성된다.
실시예 5
물-염화 마그네슘 혼합물에서 RCA의 생산성 한계 결정.
서론 및 반응 설정
DNA 증폭 실험은 Tris 완충제 또는 최적의 DNA 증폭에 통상적으로 필요한 기타 염을 함유하지 않는 반응 매질에서 다양한 칼륨-, 세슘- 및 암모늄-dNTP와 함께 10mM, 20mM 및 40mM 농도의 MgCl2에서 수행되었다. 리튬과 소듐-dNTP는 둘다 스크린에서 다른 양이온이 성능이 뛰어났으므로 그 시점에서 생략되었다. 마그네슘과 dNTP 반대-이온을 제외하고, 반응에서 유일한 다른 양이온은 주형 변성에 사용된 NaOH의 5mM 소듐 이온을 포함하였다. dNTP 자체 및 반응의 포스페이트 부산물이 Phi29 DNA 중합효소 활성과 효과적인 DNA 프라이밍에 필요한 물리 화학적 조건을 촉진한 수준으로 pH를 유지할 수 있었는지 여부를 확인하기 위해 실험을 수행하였다.
결과
표 10 - Tris 완충제가 없는 RCA 반응 성분 :
Figure pct00010
DNA 처리 및 정량화는 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다.
표 11 - 10mM MgCl2 를 갖는 무완충액 배지. 최고 수율은 굴게 강조 표시되고, 괄호 안의 숫자는 마그네슘/dNTP 비율이다:
Figure pct00011
표 12 - 20mM MgCl 2 를 갖는 무완충액 배지. 최고 수율은 굴게 강조 표시되고, 괄호 안의 숫자는 마그네슘/dNTP 비율이다:
Figure pct00012
표 13 - 40mM MgCl 2 를 갖는 무완충 배지. 최고 수율은 굴게 강조 표시되고, 괄호 안의 숫자는 [Mg]/[dNTPs] 비율이다:
Figure pct00013
실험 데이터는 칼륨-dNTP로 수행된 반응이 Tris 완충액이 없을 때 다양한 결과를 제공했음을 보여준다. 반면에, 세슘-dNTP와 암모늄-dNTP는 모두 마그네슘 이온과 dNTP의 농도가 증가함에 따라 점차적으로 더 높은 DNA 수율을 제공했다. 세슘-dNTP는 표준 완충된 환경에 비해 이러한 비완충된 조건에서 훨씬 더 나은 성능을 발휘했다 (표 5 참조). 높은 DNA 수율은 40mM MgCl2 및 50mM 세슘-dNTP (마그네슘/dNTP 비율 0.80)에서 기록되었다. 완충 또는 비완충 조건에서 암모늄 -dNTP를 사용한 DNA 수율 사이에는 유의한 차이가 없었다. 높은 DNA 수율은 60mM 암모늄-dNTP (마그네슘/dNTP 비율 0.67)로 40mM MgCl2에서 관찰되었다.
실시예 6
암모늄-dNTP를 사용한 DNA 증폭에 대한 다른 반대 이온 염의 영향
서론 및 반응 설정
이 실험은 암모늄-dNTP를 사용하여 RCA에서 얻은 DNA의 수율에 대한 리튬, 소듐 및 칼륨 양이온의 효과를 보여주기 위해 수행되었다.
표 14 - 반응 구성 요소 :
Figure pct00014
반응은 표 14에 표시된 대로 설정되었다. 각각 5mM, 10mM, 20mM 및 40mM MgCl2와 함께 17.5mM, 25mM, 35mM 및 50mM 암모늄-dNTP의 시작 농도를 포함하여 네가지 군의 실험을 수행했다. 각 군에 LiCl, NaCl, KCl, 또는 NH4Cl을 각각 70mM, 100mM, 140mM 및 200mM의 총 농도로 첨가했다. 이는 dNTP 암모늄 반대-이온 농도와 경쟁하여 추가적인 양이온 농도를 초래했다. 또한 NH4Cl을 첨가하면 암모늄 농도가 두 배가 되었다. 각 실험 군의 마그네슘/dNTP 비율은 1.0 미만이다.
DNA 처리 및 정량화는 본질적으로 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하였다.
결과는 도 5에 나타나 있다.
도 5는 암모늄-dNTP를 사용할 때 세슘, 암모늄 및 칼륨 이온이 DNA 합성을 억제하지 않음을 보여준다. 또한 암모늄 농도는 DNA 수율에 영향을 주지 않고 두 배로 늘릴 수도 있다.
반면에 리튬과 소듐은 억제성이 있는데, 리튬은 소듐보다 억제성이 더 높다. 이를 바탕으로 높은 DNA 수율을 위해 높은 농도의 dNTP가 필요한 산업 DNA 생산 공정에서 리튬과 소듐의 존재를 피해야 한다.
실시예 7
dNTP에 의한 DNA 합성 반응의 완충 조사
서론 및 반응 설정
이 실험은 특정 완충제가 없는 전혀 상태에서 반응 혼합물을 완충하는 dNTP 염의 능력을 조사하기 위해 수행되었다.
표 15 - 10mM MgCl 2 에서 pH 측정을 위한 실험 설정
Figure pct00015
표 16 - 20mM MgCl 2 에서 pH 측정을 위한 실험 설정
Figure pct00016
표 17 - 30mM MgCl 2 에서 pH 측정을 위한 실험 설정
Figure pct00017
반응 성분은 위 표에 나타낸 비율로 혼합되어 최종 부피가 50μl가 되었다. 그 다음 InLab®Micro pH 전극이 장착된 Mettler Toledo SevenCompact ™ S220 pH 미터를 사용하여 혼합물의 pH를 측정했다.
도 6은 10mM, 20mM 및 40mM MgCl2의 존재 하에서 다양한 dNTP 농도 (세슘 및 암모늄 염)의 측정된 pH를 보여준다. NaOH 농도는 DNA 합성 반응에 사용되는 주형 DNA를 변성시키는 데 사용되는 농도이다. 이 실험의 목적 상 다른 모든 DNA 합성 반응 성분은 시작 pH에 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있으므로 생략되었다. 모든 경우에 특정 pH 안정화 완충제(예: Tris)는 첨가되지 않았다. 30mM 미만의 dNTP 염 농도에서 세슘 dNTP보다 암모늄 dNTP의 더 큰 완충 용량은 분명하고 기대된다. 흥미롭게도, 30mM 보다 큰 dNTP 염 농도에서 세슘 dNTP 반응 및 암모늄 dNTP 반응의 평균 pH는 각각 약 7과 7.5에서 유사하다. 데이터는 dNTP의 포스페이트기 자체가 충분한 농도로 존재할 때 약 7에서 pH를 조절하는 작용을 한다는 것을 시사한다. DNA 중합효소는 약 pH 7에서 효율적으로 작동 할 수 있으므로 이는 높은 농도의 dNTP 염 사용을 요하는 산업 규모의 합성 반응에 유리하다. 중요하게도 이는 산업 규모 반응의 경우 높은 생산성을 달성하기 위해 특정 완충액을 낮은 농도로 또는 사용하지 않고 DNA 합성을 수행할 수 있음을 보여준다.

Claims (25)

  1. 뉴클레오티드 염의 사용을 포함하는 효소적 DNA 합성을 위한 무세포 방법으로서, 여기서 상기 염은 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양이온을 포함하는 무세포 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 뉴클레오티드 염이 10mM 초과의 농도로 존재하는 것인 무세포 방법.
  3. 뉴클레오티드 염의 사용을 포함하는 효소적 DNA 합성을 위한 무세포 방법으로서, 여기서 상기 뉴클레오티드 염은 적어도 10mM의 농도로 존재하며 다음 중 어느 하나인 무세포 방법:
    (a) 이온 반경이 소듐 이온의 이온 반경보다 큰 1가 양이온을 포함하는 뉴클레오티드 염, 또는
    (b) 2 개 이상의 뉴클레오티드 염으로서, 각각의 염은 상이한 1가 양이온을 포함하며, 여기서 양이온 중 적어도 하나는 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 염.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 염이 적어도 15mM, 적어도 20mM, 적어도 25mM, 적어도 30mM, 적어도 35mM 또는 적어도 40mM의 농도로 존재하는 것인 무세포 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1가 양이온 또는 양이온들은 알칼리토 금속, 전이 금속, 또는 다원자 이온으로부터 독립적으로 선택된 것인 무세포 방법.
  6. 청구항 5 에 있어서, 상기 1가 양이온 또는 양이온들은 칼륨, 암모늄, 암모늄 유도체, 루비듐, 세슘, 또는 프란슘을 포함하는 목록으로부터 독립적으로 선택된 것인 무세포 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무세포 방법은 하나 이상의 프라이머 또는 프리마제의 사용을 더 포함하는 것인 무세포 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무세포 방법은 주형의 사용을 더 포함하는 것인 무세포 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무세포 방법이 하나 이상의 2가 금속 양이온, 바람직하게는 마그네슘, 망간, 칼슘, 베릴륨, 아연, 및 스트론튬을 포함하는 목록으로부터 선택되는 것의 사용을 더 포함하는 것인 DNA 합성을 위한 무세포 방법.
  10. 청구항 9 에 있어서, 상기 2가 금속 양이온과 뉴클레오티드 사이의 비가 반응 혼합물에서 1:1 이하, 바람직하게는 1:1 미만인 무세포 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 최대 농도의 10mM 소듐 및/또는 리튬 뉴클레오티드 염을 사용하는 무세포 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변성제, 바람직하게는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 또는 수산화 암모늄, 및 피로포스파타제의 사용을 더 포함하는 것인 무세포 방법.
  13. 청구항 12 에 있어서, pH 완충제가 상기 방법에 첨가되지 않고, 바람직하게는 추가적인 염 또는 세제가 첨가되지 않는 것인 무세포 방법.
  14. 청구항 13 에 있어서, 뉴클레오티드 염이 세슘 이온을 포함하는 것인 무세포 방법.
  15. 청구항 12 에 있어서, pH 완충제는 첨가되지만 추가적인 염 또는 세제는 첨가되지 않는 것인 무세포 방법.
  16. 청구항 15 에 있어서, 상기 뉴클레오티드 염이 암모늄 이온을 포함하는 것인 무세포 방법.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 대규모, 바람직하게는 적어도 3g/l의 DNA 합성을 위한 것인 무세포 방법.
  18. 효소적인 무세포 DNA 합성에서 세슘 양이온을 포함하는 뉴클레오티드 염의 용도.
  19. 청구항 18 에 있어서, 효소적인 무세포 DNA 합성이 낮은 수준의 2가 양이온의 존재하에, 선택적으로 0.2:1 내지 0.8:1의 2가 양이온 대 뉴클레오티드, 바람직하게는 0.2:1 내지 0.5:1의 비율로 발생하는 것인 용도.
  20. 청구항 18 에 있어서, 상기 무세포 DNA 합성이 최소 완충제에서, 선택적으로 pH 완충제만을 포함하고, 세제 또는 추가적인 염은 없이 발생하는 것인 용도.
  21. DNA 중합효소를 사용하여 DNA 주형을 증폭하는 방법으로서, 반응 혼합물에서 2가 양이온 대 뉴클레오티드의 비율을 0.5:1 이하로 유지하는 것을 요하고, 세슘 이온을 포함하는 뉴클레오티드 염의 사용을 포함하는 방법.
  22. 효소적인 무세포 DNA 합성에서 루비듐 양이온을 포함하는 뉴클레오티드 염의 용도.
  23. DNA 주형을 증폭하는 무세포 방법으로서, 상기 방법은 상기 주형 및 DNA 중합효소를 염 형태의 뉴클레오티드와 40mM 이상, 바람직하게는 60mM 이상 또는 선택적으로 80mM 이상의 양으로 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 염은 암모늄 이온을 포함하는 방법.
  24. 효소적 DNA 합성으로서, 감소된 농도의 2가 양이온, 바람직하게는 마그네슘의 조건 하에서 수행되며, 소듐 이온의 이온 반경보다 더 큰 이온 반경을 갖는 1가 양이온을 포함하는 염 형태의 뉴클레오티드의 사용을 포함하는 효소적 DNA 합성.
  25. 청구항 1 항 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 DNA 중합효소, 선택적으로 가닥 변위형(strand-displacement type) 중합효소인 무세포 공정, 용도, 방법, 무세포 방법 또는 효소적 합성.
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