KR20210081397A - 당화된 apoj에 특이적인 항체 및 그 용도 - Google Patents

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글리카디얼 디아그노스틱스, 에스.엘.
콘세호 수페리오르 데 인베스티가시오네스 시엔티피카스
푼다시오 인스티튜트 드 레세르카 드 로’스피딸 드 라 산타 크루 아이 상 파우
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Abstract

본 발명은 ApoJ 단백질 내 특정 당화 부위에 대한 새로운 항체 및 허혈증의 진단 및 예후 예측과 재발성 허혈성 현상의 위험을 결정하는데 있어 이의 용도에 관한 것이다.

Description

당화된 APOJ에 특이적인 항체 및 그 용도
본 발명은 생의학 분야에 포함된다. 본 발명은, 특히, 당화된 ApoJ에 특이적으로 결합하는 항체, 및 허혈증의 진단과 예후 예측에서의 용도에 관한 것이다.
급성 심근경색 (AMI)은 죽상혈전증의 가장 빈번한 임상 증상 중 하나로, 전세계적으로 사망 및 장애의 주된 요인 중 하나이다. 초기 혈관재형성의 중요성과 높은 사망 위험으로 인해, 초기 진단이 필수적이다. 이러한 맥락에서, 바이오마커는, AMI가 의심되는 환자를 진단, 분류, 위험 계층화 및 관리하기 위해, 임상 평가 및 12-리드 심전도 (ECG)를 보완하기 위한 중요한 도구로서 부상하고 있다.
병태의 여러 진행 단계들에서의 잠재적인 직접적인 의미로 인해, 단백질은 바이오마커를 검색하기 위한 우수한 표적이다. 그래서, 지금까지, 심혈관 질환 (CVD)의 진행과 임상 현상 발현에 대해 제안된 대부분의 바이오마커는 특히 다음과 같이 질환의 여러가지 진행 단계들에 관여한다: 지질 대사 (Apo A-I), 염증 (CRP), 세포 괴사 (트로포닌, CK-MB 및 미오글로빈) 또는 심장 기능 (NT-proBNP). 그러나, 급성 관상동맥 증후군 (ACS)의 진단과 관리는 임상 평가, 심전도 소견 및 허가된 유일한 바이오마커 군인 트로포닌 수준에 기초하여 이루어진다. 이 프로토콜의 적용은 심근허혈증 환자의 관리 알고리즘을 개선하기 위한 새로운 바이오마커의 검색을 불가피하게 만드는 몇가지 한계를 수반한다. 심장 트로포닌 (cTn)은, 이의 구조적인 역할로 인해, 비가역적인 세포 손상에 대해 우수한 마커이다. 그러나, cTn은 완전히 만연된 괴사로 진행되기 전에는 허혈성 현상을 검출하지 못한다. 고-민감성 cTn 분석 (hs-cTn)은 최소량의 순환성 cTn을 검출할 수 있고, 이러한 현상이 허혈성 단계와 관련있는 것으로 시사됨에도 불구하고, 돼지 MI 모델에 대한 최근 연구에서 초기 cTn 상승이 근세포의 세포자살과 관련있는 것으로 드러났으며, 이는 일부 유형의 세포 사멸이 cTn의 방출에 필요하다는 것을 암시한다. 또한, 현행 가이드라인은 급성 가슴통증을 앓고 있는 환자를 적절하게 분류하기 위해 일련의 hs-cTn을 측정할 필요가 있음을 강조한다. AMI의 초기 단계에서, 클러스테린 (clusterin)으로도 알려진 아포리포단백질 J (ApoJ)의 당화 프로파일에서 변동이 검출될 수 있는 것으로 개시된 바 있다. 이로써, AMI에 대한 잠재적인 바이오마커로서 당화된 ApoJ가 제안되기에 이르렀다 (Cubedo J. et al., Journal of Proteome Research 2011; 10:211-20).
이러한 맥락에서, 이러한 초기 단계에서 허혈증 현상을 맵핑할 수 있는 특이적인 허혈증 바이오마커를 동정하는 것이 급성 허혈성 현상의 현행 진단 알고리즘을 개선하는데 중요할 것이다.
본 발명의 발명자들은, ApoJ 단백질 내 특이적인 당화 부위에 대한 특이적인 단일클론 항체를 이용한 당화된 ApoJ 단백질의 전신 수준 측정 결과에 기반하여, 허혈증의 진단 및 예후 예측뿐 아니라 재발성 허혈증 현상의 위험을 결정하기 위한 새로운 도구를 놀랍게도 발견하게 되었다. 예상치 못하게도, 본원의 실시예에서 확인된 바와 같이, ApoJ 내 여러가지 당화 부위를 표적화하는 단일클론 항체는, ApoJ에서 발견되는 N-글리칸을 특이적으로 인지하는 렉틴에 비해, 허혈증의 존재를 식별하는데 개선된 능력을 나타낸다. 이러한 결과는, 고도로 당화된 단백질이 전형적으로 mAb를 생성하기 어려운 표적이어서 친화성이 만족스럽지 못하고 특이성이 낮은 한계가 존재하는 것으로 일반적으로 공지되어 있다는 점에서, 예상치못하였다.
이에, 제1 측면에서, 본 발명은 당화된 ApoJ에 특이적으로 결합하지만 비-당화된 ApoJ에는 결합하지 않는, 하기와 같은 항체에 관한 것이다:
(i) 항체는 ApoJ 내 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하고, 당화 부위가 NCBI 데이터베이스 등재 번호 NP_001822.3에서 정의되는 ApoJ 전구체 서열에 대해 86, 103, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치들에서의 Asn들로 이루어진 군으로부터 선택되는 Asn 잔기를 포함하거나, 또는
(ii) 항체는 서열번호 118, 119, 120, 121, 122, 123 또는 124로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 특이적으로 인지하거나 또는 이러한 펩타이드를 이용해 생성된 것이고, 상기한 펩타이드는 서열번호 118번에서 5번 Asn 잔기, 서열번호 119번에서 5번 Asn 잔기, 서열번호 120번에서 5번 Asn 잔기, 서열번호 121번에서 6번 Asn 잔기, 서열번호 122번에서 5번 Asn 잔기, 서열번호 123번에서 5번 Asn 잔기 또는 서열번호 124번에서 5번 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐 아니라 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에서 정의되는 항원을 적어도 2 이상 포함하는 조성물에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 샘플에서 당화된 ApoJ를 측정하는 방법에 관한 것이다:
(i) 샘플을, 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물과, 샘플에 존재하는 당화된 ApoJ와 항체 간에 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계,
(ii) 단계 (i)에서 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계.
제5 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 제1 측면에서 정의되는 항체, 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 제4 측면에서 정의되는 방법을 이용해, 당화된 ApoJ의 수준을 개체의 샘플에서 측정하는 단계를 포함하고, 기준 값 대비 당화된 ApoJ의 수준 감소는 환자가 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 앓고 있다는 것을 의미하는, 개체에서 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 진단하는 방법에 관한 것이다.
제6 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 제1 측면에서 정의되는 항체, 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 제4 측면에서 정의되는 방법을 이용해 환자의 샘플에서 당화된 ApoJ의 수준을 측정하는 것을 포함하고, 기준 값 대비 당화된 ApoJ의 수준 감소는 허혈증이 진행 중이거나 또는 환자의 불량한 예후를 의미하는, 허혈성 현상을 겪는 환자에서 허혈증의 진행을 예측하거나 또는 허혈성 현상을 겪는 환자의 예후를 결정하는 방법에 관한 것이다.
제7 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 제1 측면에서 정의되는 항체, 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 제4 측면에서 정의되는 방법을 이용해 환자의 샘플에서 당화된 ApoJ의 수준을 측정하는 것을 포함하고, 기준 값 대비 당화된 ApoJ의 수준 감소는 환자가 재발성 허혈성 현상을 겪을 위험의 증가를 의미하는, 안정적인 관상동맥 질환을 앓고 있는 환자가 재발성 허혈성 현상을 겪을 위험을 결정하는 방법에 관한 것이다.
제8 측면에서, 본 발명은, 환자에서 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 진단하거나, 허혈성 현상을 겪는 환자에서 허혈증 진행을 확인하거나, 허혈성 현상을 겪는 환자의 예후를 예측하거나, 또는 안정적인 관상동맥 질환을 앓는 환자가 재발성 허혈성 현상을 앓을 위험을 결정하기 위한, 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.
도 1. 신호 펩타이드 (아미노산 1-22번), 그 다음으로 베타 체인 (아미노산 23-227번)과 알파 체인 (아미노산 228-449번)을 나타낸 ApoJ 단백질 서열. ApoJ 단백질 서열에서 글루코사민 (GlcNAc)이 존재하는 N-당화 부위 7곳 (86, 103, 145, 291, 317, 354 및 374)에 대해 단일클론 항체를 생성하였다.
도 2. 7곳의 ApoJ-GlcNAc 당화 부위에 대해 특이적인 단일클론 항체를 개발하기 위해 이용한 방법적인 접근을 개략적으로 나타낸 도표. 표적 부위 5곳에 대해서는 하나씩, 2곳에 대해서는 클론 2씩, 총 클론 9종이 제조되었다.
도 3. ApoJ-GlcNAc 전체 수준 및 여러가지 mAb를 이용한 검출 수준. 총 ApoJ-GlcNAc 수준 (A)을 검출하는 렉틴-기반의 면역분석 및 각각의 독립적인 ApoJ-GlcNAc 당화된 잔기 (B-J)를 표적화하는 특이 항체를 이용하여 측정한, 건강한 대조군 및 허혈증 pre-AMI 환자의 혈청 샘플에서 ApoJ-GlcNAc 수준의 강도 (임의 단위 (AU)의 광학 밀도 (OD))를 도시한 막대 도표 (평균 ± SEM)). 구체적으로, 당화된 잔기 2 (클론 Ag2G-17) 및 6 (클론 Ag6G-1)에 대한 mAb를 이용한 ApoJ-GlcNAc 검출에서, AMI 환자의 초기 허혈증 단계에서 ApoJ-GlcNAc 수준이 최대 감소하였다.
도 4: 건강한 대조군 및 허혈증 pre-AMI 환자의 혈청 샘플에서, 총 ApoJ-GlcNAc 수준 (ApoJ-GlcNAc 총 수준)을 검출하는 렉틴-기반의 면역분석 및 각각의 독립적인 ApoJ-GlcNAc 당화된 잔기를 표적화하는 특이 항체를 이용해 측정한, 심장 허혈증에서 ApoJ-GlcNAc 수준의 감소%.
도 5. mAb 조합들의 C-통계학적 ROC 분석. 허혈증 검출에 대해 우수한 식별력을 가진 여러가지 ApoJ-GlcNAc 당화된 잔기 검출용 mAb들의 조합을 도시한 ROC 곡선.
도 6: 인간 혈장 및 혈청으로부터 정제된 ApoJ 단백질에는 결합하지만 알부민 및 트랜스페린과 같은 다른 고도로 당화된 단백질에는 결합하지 않는 항체의 특이성을 보여주는, GlcNAc 당화된 ApoJ를 표적화하는 특이 항체 Ag2G17 및 Ag6G11의 도트 블롯 결합 분석.
본 발명의 발명자들은 ApoJ의 각각의 당화 부위에 대해 특이적인 단일클론 항체를 이용하여 단백질 ApoJ의 당화 패턴을 식별하는 것을 토대로 한, 새로운 허혈증 진단 및 예후 예측 방법을 개시한다.
달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 제공되고 본 발명의 모든 다른 측면들에서 제공된 정의들은 전체 본 발명에 동일하게 적용가능하다.
항체
제1 측면에서, 본 발명은 비-당화된 ApoJ에는 결합하지 않지만 당화된 ApoJ에는 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로서,
(i) 항체는 ApoJ 내 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하고, 이러한 당화 부위는 NCBI 데이터베이스 등재 번호 NP_001822.3에서 정의되는 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 86, 103, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치에서의 Asn 잔기들로 이루어진 군으로부터 선택되는 Asn 잔기를 포함하거나, 또는
(ii) 항체는 서열번호 118, 119, 120, 121, 122, 123 또는 124로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 특이적으로 인지하거나 또는 이러한 펩타이드를 이용해 생성된 것이며, 이 펩타이드는 서열번호 118에서 5번 Asn 잔기, 서열번호 119번에서 5번 Asn 잔기, 서열번호 120에서 5번 Asn 잔기, 서열번호 121에서 6번 Asn 잔기, 서열번호 122에서 5번 Asn 잔기, 서열번호 123에서 5번 Asn 잔기 또는 서열번호 124에서 5번 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민으로 변형된 것이다.
본원에서, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자, 또는 본 발명의 일부 구현예에서, 분자 ("항원")의 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 면역글로불린의 단편을 지칭한다. 자연 생성 항체는 통상적으로 2 이상의 중 (H) 쇄와 2 이상의 경 (L) 쇄로 구성되는 테트라머를 전형적으로 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변성 도메인 (본원에서 VH로 약칭함)과, 도메인 3개 (CH1, CH2 및 CH3)로 일반적으로 구성된 중쇄 불변 도메인으로 구성된다. 중쇄는 IgG (lgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4 서브타입)를 비롯한 임의의 이소형일 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변성 도메인 (본원에서 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 도메인 (CL)으로 구성된다. 경쇄는 κ 쇄와 λ 쇄를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변성 도메인은 전형적으로 항원 인지를 담당하고, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 면역 시스템의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 구성성분 (C1 q) 등의, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 도메인과 VL 도메인은, "프래임워크 영역" (FR)으로 지칭되는 더 보존적인 서열로 된 도메인 사이에 위치하는 "상보성 결정부"로 지칭되는 과변이 도메인으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 도메인 3개와 FR 도메인 4개로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 방향으로 다음과 같은 순서로 구성된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변성 도메인은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 특히, 자연에서 생성될 수 있는 것과는 다른 물리적 환경에서 존재하도록 "단리"된, 또는 자연 생성 항체와 아미노산 서열이 상이하도록 변형된, 항체 및 이의 에피토프-결합 단편이 적절하다.
용어 "항체"는 하나 이상의 CDR 영역을 유지하는 완전한 단일클론 항체 또는 다클론 항체, 또는 이의 단편을 포함하며, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 및 비-인간 기원의 항체 등이 있다.
"단일클론 항체"는 단일 부위 또는 항원 "결정기"를 겨냥하는 동질적인 고 특이적인 항체 집단이다. "다클론 항체"는 여러가지 항원 결정기를 겨냥하는 이질적인 항체 집단을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 비-인간 기원의 항체, 바람직하게는 뮤라인 기원의 항체이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 다클론 항체이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간-토끼 키메라 항체이다. 또한 바람직한 구현예에서, 인간-토끼 키메라 항체는 인간 불변 도메인 (Ck 및 CH1)에 연결된 토끼 가변성 도메인 (Vλ, Vκ 및 VH), 특히 인간 Cκ에 융합된 토끼 Vλ/Vκ 도메인 및 인간 IgG1의 인간 CH1에 융합된 토끼 VH 도메인을 포함한다.
항체의 기본 구조 단위가 테트라머를 포함한다는 것은 잘 알려져 있다. 각각의 테트라머는 동일한 2개의 폴리펩타이드 체인 쌍들로 구성되며, 각 체인은 경쇄 (25 KDa) 및 중쇄 (50-75 KDa)로 구성된다. 각 체인의 아미노-말단 영역은 항원 인지에 참여하는 아미노산 약 100-110개로 된 가변부를 포함한다. 각 체인의 카르복시-말단 영역은 작동자 기능을 매개하는 불변부를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 쌍 각각의 가변부는 항체의 결합부를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합부를 가진다. 경쇄는 κ 또는 λ로 분류된다. 중쇄는 γ, μ, α, δ 및 ε로 분류되는데, 이는 항체의 이소형을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로 정의한다.
경쇄 및 중쇄 쌍 각각의 가변부는 항체의 결합부를 형성한다. 이는 상보성 결정부 (CDR)로 지칭되는 과가변부 3개에 의해 연결된 프래임워크 (FR)로 지칭되는 상대적으로 보존된 영역으로 구성된 동일한 일반적인 구조가 특징적이다 (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD.; Chothia and Lesk, 1987, J Mol Biol 196:901-17). 용어 "상보성 결정부" 또는 "CDR"은 본원에서 단백질이 항원의 형태에 상보적인 항체 내 영역을 지칭한다. 즉, CDR은 특정 항원에 대한 단백질의 친화성 (대략적으로, 결합 세기) 및 특이성을 결정한다. 각 쌍의 체인 2개의 CDR들은 프래임워크 영역에 의해 일렬로 정렬되어, 특이적인 에피토프에 결합하는 기능을 획득한다. 따라서, 중쇄 및 경쇄 모두 3개의 CDR, 각각 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3를 특징으로 한다.
CDR 서열은 통례적인 기준에 따라, 예를 들어, IgBLAST의 기준 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/ (Ye et al., 2013, Nucleic Acids Res 41 (Web Server issue:W34-40))에 의해, Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에 의해 제공된 번호 지정 체계, 또는 Chothia et al. (1989, Nature 342:877-83)에 의해 제공된 번호 지정 체계에 따라, 정해질 수 있다.
본원에서, 본 발명의 항체는 전장 항체 (예, IgG)뿐 아니라 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 비-인간 기원의 항체, 재조합 항체, 및 유전자 조작 기법에 의해 제조된 면역글로불린 유래 폴리펩타이드, 예를 들어, 단쇄 Fv (scFv), 다이아바디, 중쇄 또는 이의 단편, 경쇄 또는 이의 단편, VH 또는 이의 다이머, VL 또는 이의 다이머, 이황화 결합에 의해 안정화된 Fv 단편 (dsFv), 단쇄 가변부 도메인을 가진 분자 (Abs), 미니바디 (minibody), scFv-Fc, VL 및 VH 도메인 및 항체를 포함하는 융합 단백질, 또는 바람직한 특이성을 가진 항원 인지부를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구조를 포괄한다. 또한, 본 발명의 항체는 이중 특이성 항체일 수 있다. 항체 단편은 항원 결합 단편을 지칭할 수 있다.
본원에서, "재조합 항체"는 2종의 서로 다른 종 또는 2종의 서로 다른 출처로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함하는 항체이며, 합성 분자, 예를 들어, 비-인간 CDR 및 인간 프래임워크 또는 불변부를 포함하는 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 항체는 재조합 DNA 분자로부터 제조하거나 또는 합성된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 항체의 아미노산 서열이, 폴리펩타이드의 일차 서열의 변형에도 불구하고, 당화된 ApoJ에 결합하는 항체 능력은 유지되도록, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있는 것으로 이해할 것이다. 이러한 치환은 보존적인 치환일 수 있으며, 일반적으로 하나의 아미노산을 비슷한 특성을 가진 다른 아미노산으로 치환하는 것을 의미하는 것으로 적용된다 (예, 글루탐산 (음으로 하전된 아미노산)에서 아스파르트산으로의 치환이 보존적인 치환임).
본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 또는 펩타이드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형으로는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열에서 잔기 결손 및/또는 삽입 및/또는 치환 등이 있다. 최종 구조체가 바람직한 특징을 가지는 한, 최종 구조체를 달성하기 위해, 결손, 삽입 및 치환의 임의 조합이 이루어진다. 아미노산 변화는, 또한, 당화 부위의 개수 또는 위치 변동과 같이, 단백질의 번역 후 공정을 변경시킬 수 있다.
아미노산 서열의 삽입은 잔기 하나 내지 백개 이상을 함유한 폴리펩타이드 길이 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합뿐 아니라, 아미노산 잔기 하나 또는 복수개의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입에 대한 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 펩타이드 또는 세포독성 폴리펩타이드가 융합된 항체 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 분자에 대한 다른 삽입 변이체는 효소 또는 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단 융합을 포함한다.
다른 유형의 변형은 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체는 분자에 다른 잔기에 의해 치환된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 항체의 치환 돌연변이 유발에 가장 흥미로운 부위는 과가변부이지만, FR 변이도 고려된다.
항체에 대한 다른 유형의 아미노산 변형은 항체의 오리지널 당화 패턴을 변형시킨다. 변형은 분자에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결손, 및/또는 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위의 부가를 의미한다. 폴리펩타이드의 당화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결된다는 것은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 결합되는 것을 의미한다. X가 프롤린을 제외한 아미노산인 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌은, 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 결합하기 위한 인지 서열이다. 즉, 폴리펩타이드에서 이들 임의의 트리펩타이드 서열의 존재는 잠재적인 당화 부위를 형성한다. O-연결된 당화는 단당류 또는 단당류 유도체 N-아세틸갈로토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나가 하이드록시 아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 결합하는 것을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시 라이신도 이용할 수 있다. 항체에 당화 부위의 부가는 편리하게는 (N-연결된 당화 부위에 대해) 전술한 트리펩타이드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 달성된다. 또한, 변형은 (O-연결된 당화를 위해) 오리지널 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법으로 제조한다. 이러한 방법으로는, 비-제한적으로, (자연 생성 아미노산 서열 변이체의 경우) 천연 소스로부터 단리 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-특이적인) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 카세트 돌연변이 유발 등이 있다.
항원에 대한 항체의 친화성은 이러한 항원에 결합하는 항체의 효율로서 정의할 수 있다. 항원-항체 결합은 가역적인 결합이며, 양쪽 분자가 동일한 용액에 충분한 시간 동안 희석된 상태로 존재하는 경우, 이 용액은 항원-항체 복합체 (AgAb), 유리 항원 (Ag) 및 유리 항체 (Ab)의 농도가 일정해지는 평형에 도달하게 된다. 따라서, [AgAb]/[Ag]*[Ab] 비율은 각각의 에피토프에 대한 일부 항체의 친화성을 비교하기 위해 이용할 수 있는 Ka로 지칭되는 결합 상수로서 정의되는 상수이다.
친화성을 측정하는 일반적인 방법은 실험적으로 결합 곡선을 구하는 것이다. 이는 유리 항원의 농도에 대한 함수로서 항체-항원 복합체의 양을 측정하는 것을 수반한다. 이러한 측정을 수행하는 일반적인 방법은 2가지이다: (1) 스캐차드 (Scatchard) 분석을 이용한 고전적인 평형 투석, 및 (ii) 항체 또는 항원을 전도성 표면에 결합시키거나 또는 항원 또는 항체의 결합이 각각 이 표면의 전기적 특성에 영향을 미치는 표면 플라스몬 공명 방법.
본 발명의 항체가 당화된 ApoJ 단백질에 결합하는 능력은 당해 기술 분야에서 이용가능한 다수의 분석에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포의 클론에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침강에 의해 또는 시험관내 결합 분석에 의해, 예를 들어 방사성면역분석 (RIA), 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 표면 플라스몬 공명 또는 면역형광 기법에 의해, 예를 들어 면역조직화학 (IHC), 형광 현미경 또는 유세포 측정으로 결정한다.
종종, 본 발명의 항체 또는 이의 기능적 변이체의 경우에서와 같이, 동일한 에피토프에 결합하는 2 이상의 항체의 상대적인 친화성만 결정하면 된다. 이 경우, 항체 하나의 연속 희석물을 일정량의 리간드와 인큐베이션한 다음 임의의 적절한 추적 물질로 표지된 제2 항체를 첨가하는 경쟁적인 분석을 수행할 수 있다. 이 mAb의 결합 및 비-결합된 항체를 세척한 다음, 제2 항체의 농도를 측정하고, 제1 항체의 농도에 대해 그래프를 작성하여 스캐차드 방법으로 분석하였다. 일 예는 Tamura et al., J. Immunol. 163 : 1432-1441 (2000)이다.
본원에서, 용어 "ApoJ"는 "클러스테린", "테스토스테론-억제된 전립선 메시지 (testosterone-Repressed Prostate Message)", "아포리포단백질 J", "보체-관련 단백질 SP-40,40", "보체 세포분해 (cytolysis) 저해제", 보체 세포용해 (Lysis) 저해제", "황산화 당단백질", "Ku70-결합 단백질", "NA1/NA2", "TRPM-2", "KUB1", "CLI"으로도 또한 알려진 폴리펩타이드를 의미한다. 인간 ApoJ는 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스 (2018년 9월 12일, 등재 버전 212)에 등재 번호 P10909로 제공되는 폴리펩타이드이다.
용어 "당화된"은 일반적으로 공유 결합된 올리고사카라이드 쇄를 가진 임의의 단백질을 지칭한다.
용어 "당화된 ApoJ" 또는 "GlcNAc 잔기 함유 ApoJ"는, 본원에서, 전형적으로, ApoJ가 각각의 글리칸 쇄에 하나 이상의 N-아세틸글루코사민을 함유할 것이지만, 하나 이상의 글리칸 쇄에 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 반복 단위를 하나 이상 함유한 ApoJ 분자를 의미한다. 일 구현예에서, 당화된 ApoJ는 NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3 (2018년 9월 23일 공개)에서 정의되는 ApoJ 프리프로단백질 서열을 기준으로 86, 103, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치들에서의 Asn 잔기들로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 Asn 잔기에 N-글리칸을 함유한다. 다른 구현예에서, 당화된 ApoJ는 ApoJ의 모든 N-당화 부위들에, 즉 NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3 (2018년 9월 23일 공개)에서 정의된 ApoJ 프리프로단백질 서열을 기준으로 86, 103, 145, 291, 317, 354 및 374번 위치들의 각각의 Asn에서 N-글리칸을 함유한다.
"GlcNAc 잔기를 함유한 ApoJ"는 고 수준의 만노스 N-글리칸, 복합체-유형의 N-글리칸, 하이브리드 올리고당 N-글리칸 또는 O-글리칸에 하나 이상의 GlcNAc 잔기를 함유한 ApoJ 분자를 포함한다. GlcNAc은, N-글리칸의 유형에 따라, 폴리펩타이드 쇄에 직접 결합되거나 또는 N-글리칸에서 말단 위치에서 확인할 수 있다.
용어 "GlcNAc" 또는 "N-아세틸 글루코사민"은 글루코사민이 아세트산에 의해 아미드화되어 수득되는 글루코스 유도체를 지칭하며, 하기 일반 구조식을 가진다:
Figure pct00001
일 구현예에서, ApoJ-함유성 GlcNAc 잔기는 GlcNAc 잔기 2개를 함유하며, 본원에서 (GlcNAc)2로 언급된다. (GlcNAc)2 잔기를 함유한 ApoJ 분자는, 고도의 만노스 N-글리칸, 복합체-유형의 N-글리칸, 하이드리드 올리고당 N-글리칸 또는 O-글리칸에서 (GlcNAc)2가 확인되는, 분자를 포함한다. (GlcNAc)2는, N-글리칸의 유형에 따라, N-글리칸에서 말단 위치에서 또는 폴리펩타이드 쇄에 직접 결합된 것으로 확인할 수 있다.
바람직한 구현예에서, "ApoJ-함유성 GlcNAc 잔기"는 다른 유형의 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물을 실질적으로 포함하지 않는다. 일 구현예에서, "ApoJ-함유성 GlcNAc 잔기"는 N-연결된 또는 O-연결된 α-만노스 잔기를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, "ApoJ-함유성 GlcNAc 잔기"는 N-연결된 또는 O-연결된 α-글루코스 잔기를 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, "ApoJ-함유성 GlcNAc 잔기"는 N-연결된 또는 O-연결된 α-만노스 잔기 또는 N-연결된 또는 O-연결된 α-글루코스 잔기를 포함하지 않는다.
본원에서, 용어 "비-당화된 ApoJ"는, ApoJ 폴리펩타이드 NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3 (2018년 9월 23일 공개)에서 정의된 ApoJ 프리프로단백질 서열을 기준으로 86, 103, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치에서의 Asn 잔기들이 모두 당화되지 않은 ApoJ를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "결합성", "결합" 또는 "결합한다"는, 비-제한적인 예로, 수소 결합, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 결합, 이온 결합 또는 이들의 조합과 같은 비-공유 결합의 결과로서 친화성 결합 분자 또는 특이적인 결합 쌍들 간의 상호작용을 의미한다. 용어 "결합 쌍"은, 결합 쌍이 상호작용하여 결합 쌍의 다른 구성원에 결합함으로써 제1 구성성분과 제2 구성성분이 결합 쌍의 제1 구성원과 제2 구성원 간의 특이적인 상호작용을 이용해 서로 결합된 접합체를 형성하는 것 이외의, 임의의 다른 기술적인 구조 특징을 가진 임의의 특정 크기를 수반하지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 결합 쌍은 항원/항체, 항원/항체 단편 또는 합텐/항-합텐과 같은 임의 유형의 면역 상호작용을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합한다", "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 인지한다"는, 본 발명에서 사용되는 경우, ApoJ의 당화된 형태에 항체 또는 이의 단편이 결합하는 것을 의미하며, 이는 항체 또는 이의 단편과 ApoJ의 당화된 형태 간의 결합이 바람직하게는 임의의 이러한 분자가 반응 혼합물에 존재하는 다른 분자에 결합하기 전에 이루어지도록, 비-특이적인 결합에 대해 실질적으로 더 높은 친화성을 가진 2개의 분자들의 3차원 구조 간의 상보성의 존재를 이용하여 ApoJ의 당화된 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편의 능력으로서 이해된다. 이로써 항체 또는 이의 단편은 ApoJ 분자에 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있는 다른 글리칸과 교차 반응하지 않게 된다. 항체 또는 이의 단편의 교차-반응성은, 예를 들어, 통상적인 조건에서 항체 또는 이의 단편의 대상 글리칸뿐 아니라 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 다소 근접한 복수의 글리칸에 대한 결합성을 평가함으로써, 검사할 수 있다. 항체 또는 이의 단편이 대상 글리칸에 결합하지만 임의의 다른 글리칸에는 결합하지 않거나 또는 본질적으로 결합하지 않는 경우에만, 대상 글리칸에 특이적인 것으로 간주한다. 예를 들어, 항체와 당화된 ApoJ 간의 결합 친화성이 10-6 M 미만, 10-7 M, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11 M 미만, 10-12 M 미만, 10-13 M 미만, 10-14 M 미만 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 (KD)를 가진다면, 그 결합은 특이적인 것으로 간주할 수 있다.
일 구현예에서, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 ApoJ의 86번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는, ApoJ의 103, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 하나 이상의 임의의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
일 구현예에서, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 ApoJ의 103번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는, ApoJ의 86, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 하나 이상의 임의의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
일 구현예에서, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 ApoJ의 145번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는, ApoJ의 86, 103, 291, 317, 354 또는 374번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 하나 이상의 임의의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
일 구현예에서, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 ApoJ의 291번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는, ApoJ의 86, 103, 145, 317, 354 또는 374번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 하나 이상의 임의의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
일 구현예에서, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 ApoJ의 317번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는, ApoJ의 86, 103, 145, 291, 354 또는 374번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 하나 이상의 임의의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
일 구현예에서, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 ApoJ의 354번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는, ApoJ의 86, 103, 145, 291, 317 또는 374번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 하나 이상의 임의의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
일 구현예에서, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 ApoJ의 374번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는, ApoJ의 86, 103, 145, 291, 317 또는 354번 위치에 N-당화 부위를 포함하는 하나 이상의 임의의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
일 구현예에서, ApoJ 내에 N-당화 부위를 포함하는 에피토프에 대해 특이적인 결합을 나타내는 본 발명에 따른 항체는, N-당화 부위를 포함하는 ApoJ 내 다른 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않거나, 및/또는 ApoJ 이외의 다른 N-당화된 폴리펩타이드에는 실질적으로 결합하지 않는다.
다른 구현예에서, 5번 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민으로 변형된 서열번호 118의 펩타이드를 특이적으로 인지하는 항체는, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 119, 120, 121, 122, 123 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 5번 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민으로 변형된 서열번호 119의 펩타이드를 특이적으로 인지하는 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 120, 121, 122, 123 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 5번 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민으로 변형된 서열번호 120의 펩타이드를 특이적으로 인지하는 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 121, 122, 123 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 6번 위치의 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민으로 변형된 서열번호 121의 펩타이드를 특이적으로 인지하는 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 120, 122, 123 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 5번 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민으로 변형된 서열번호 122의 펩타이드를 특이적으로 인지하는 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 120, 121, 123 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 5번 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민으로 변형된 서열번호 123의 펩타이드를 특이적으로 인지하는 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기기 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 120, 121, 122 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 서열번호 118의 5번 위치에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 서열번호 118의 펩타이드를 이용해 구축된 항체는, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 서열번호 119, 120, 121, 122 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 서열번호 119의 5번 위치에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 서열번호 119의 펩타이드를 이용해 구축된 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 서열번호 118, 120, 121, 122 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 서열번호 120의 5번 위치에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 서열번호 120의 펩타이드를 이용해 구축된 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 121, 122 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 서열번호 121의 6번 위치에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 서열번호 121의 펩타이드를 이용해 구축된 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 120, 122 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 5번 위치에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 서열번호 122의 펩타이드를 이용해 구축된 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 120, 121, 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 5번 위치에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 서열번호 123의 펩타이드를 이용해 구축된 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 120, 121, 122 또는 124의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 5번 위치에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 서열번호 124의 펩타이드를 이용해 구축된 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치 또는 서열번호 123의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 120, 121, 122 또는 123의 펩타이드들 중 하나 이상 또는 임의의 펩타이드를 실질적으로 인지하지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 O-연결된 글리칸, 더 바람직하게는 O-연결된 GlaNAc에 실질적으로 결합하지 않는다.
부가적인 구현예에서, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 86, 103, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치에서의 Asn들로 이루어진 군으로부터 선택되는 Asn 잔기를 포함하는 N-당화 부위를 ApoJ에 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는, O-연결된 글리칸, 더 바람직하게는 O-연결된 GlaNAc에는 실질적으로 결합하지 않는다.
부가적인 구현예에서, 서열번호 118, 119, 120, 121, 122, 123 또는 124로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 특이적으로 인지하거나 또는 이를 이용해 구축된 항체이되, 펩타이드가 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치의 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 것인, 항체는, O-연결된 글리칸, 더 바람직하게는 O-연결된 GlaNAc에는 실질적으로 결합하지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 N-아세틸갈락토사민, 또는 N-아세틸갈락토사민을 함유하나 N-아세틸글루코사민을 함유하지 않는 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
부가적인 구현예에서, 당화 부위가 NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 86, 103, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치의 Asn 잔기들로 이루어진 군으로부터 선택되는 Asn 잔기를 포함하는 N-당화 부위를 ApoJ에 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는, N-아세틸갈락토사민에는 실질적으로 결합하지 않거나, 또는 N-아세틸갈락토사민을 함유하나 N-아세틸글루코사민을 함유하지 않는 에피토프에 실질적으로 결합하지 않는다.
부가적인 구현예에서, 서열번호 118, 119, 120, 121, 122, 123 또는 124로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 특이적으로 인지하거나 또는 이를 이용해 구축된 항체이되, 펩타이드가 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 항체는, N-아세틸갈락토사민에 실질적으로 결합하지 않거나, 또는 N-아세틸갈락토사민을 함유하나 N-아세틸글루코사민을 함유하지 않는 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 167 (TKLKELPGVCNETMMALWEE)의 서열을 포함하되 11번 위치에 N-당화를 포함하는 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
다른 구현예에서, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3에 정의된 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 103번 위치에서 N-당화 부위를 ApoJ 내에 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 본 발명에 따른 항체는, 서열번호 167의 서열을 포함하되 11번 위치에서 N-당화를 포함하는 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
부가적인 구현예에서, 서열번호 119의 펩타이드를 특이적으로 인지하거나 또는 이를 이용해 구축된 항체이되, 펩타이드가 서열번호 119의 5번 Asn 잔기에서 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된 항체는, 서열번호 167의 서열을 포함하되 11번 위치에서 N-당화를 포함하는 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는다.
본 발명에 따른 결합 물질, 특히 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편이, 당화된 ApoJ 단백질에 결합하는 능력은, 당해 기술 분야에 잘 공지된 여러가지 분석으로 결정할 수 있다. 바람직하게는, 결합 물질의 결합 능력은 면역침강에 의해 또는 시험관내 결합 분석에 의해, 예를 들어 방사성면역분석 (RIA), 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 표면 플라스몬 공명 또는 면역형광 기법, 예를 들어 면역조직화학 (IHC), 형광 현미경 또는 유세포 측정에 의해 결정한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 함유한 당화된 ApoJ에 특이적으로 결합하거나, 또는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)과 시알산 잔기를 함유한 당화된 ApoJ에 특이적으로 결합한다.
본원에서, 용어 "ApoJ-함유성 GlcNAc 및 시알산 잔기"는 임의의 ApoJ 분자가 글리칸 쇄에 하나 이상의 N-아세틸-글루코스 반복 단위 및 하나 이상의 시알산 잔기 반복 단위를 함유하는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "시알산"은 N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac)으로도 알려진 단당류이며, 하기 일반식을 가진다.
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일 구현예에서, ApoJ는 GlcNAc 잔기 2개와 시알산 잔기 1개를 함유한다 (이하, (GlcNAc)2-Neu5Ac라 함). 다른 구현예에서, GlcNAc와 시알산 잔기는 하나 이상의 단당류에 의해 연결된다. 일 구현예에서, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)과 시알산 잔기를 함유한 당화된 ApoJ의 수준은 트리티컴 불가리스 (Triticum vulgaris) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 ApoJ의 수준에 해당한다.
바람직한 구현예에서, "ApoJ-함유성 GlcNAc 잔기 및 시알산 잔기"는 다른 유형의 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물은 실질적으로 함유하지 않는다. 일 구현예에서, "ApoJ-함유성 GlcNAc 및 시알산 잔기"는 N-연결된 또는 O-연결된 α-만노스 잔기를 함유하지 않는다. 다른 구현예에서, "ApoJ-함유성 GlcNAc 및 시알산 잔기"는 N-연결된 또는 O-연결된 α-글루코스 잔기를 함유하지 않는다. 또 다른 구현예에서, "ApoJ-함유성 GlcNAc 잔기 및 시알산 잔기"는 N-연결된 또는 O-연결된 α-만노스 잔기 또는 N-연결된 또는 O-연결된 α-글루코스 잔기를 함유하지 않는다.
본 발명의 항체는, NCBI 데이터베이스 엔트리 등재 번호 NP_001822.3 (2018년 9월 23일 공개)에서 정의된 ApoJ 프리프로단백질 서열을 기준으로 86, 103, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치들에서의 Asn 잔기들로 이루어진 군으로부터 선택되는 Asn 잔기를 포함하는 N-당화 부위를 ApoJ 내에 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지한다.
본원에서, 용어 "에피토프"는, 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법에 의해 측정하였을 때, 소정의 면역원성 물질에 대해 면역 반응이 탑재된 숙주 면역 시스템의 항체 또는 세포-표면 수용체에 의해 결합되거나 또는 이의 표적이 되는 소정의 면역원성 물질의 일부를 의미한다. 나아가, 에피토프는, 당해 기술 분야에서 이용가능한 임의 방법에 의해 측정하였을 때, 동물에서 T 세포 반응을 유도하거나 또는 항체 반응을 발생시키는 면역원성 물질의 일부로서 정의할 수도 있다. Walker J, Ed., "The Protein Protocols Handbook" (Humana Press, Inc., Totoma, NJ, US, 1996)을 참조한다. 용어 "에피토프"는 "항원 결정기" 또는 "항원 결정부"와 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 단백질 항원의 에피토프는 구조 및 항체와의 상호작용에 따라 구조 에피토프와 선형 에피토프 2종으로 나뉜다.
Asn 잔기는 폴리펩타이드 서열 내 아스파라긴 아미노산을 의미한다. 본 구현예에서, 당화는 Asn 잔기에 연결되며, 당화는 또한 Asn-연결된 당화 또는 N-연결된 당화라고도 하며, 당 잔기가 아스파라긴 잔기의 아미드 질소를 통해 연결되는 경우에 이루어진다. 세포내 Asn-연결된 올리고당의 합성은 소포체 내강에서, 그리고 단백질에서 골지 소기관으로 이동하면서 이루어진다. Asn-연결된 당화는 다음과 같은 트리펩타이드 당화 컨센서스 서열: Asn-Xaa-Yaa (Asn-Xaa-Thr/Ser; NXT/S)에서 이루어지며, 여기서 Xaa는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있으며, Yaa는 세린 또는 트레오닌이다.
모든 Asn-연결된 올리고당은 공통 생합성 중간산물로부터 기원하는 공통 5당류 코어 (Man 3GlcNAc2)를 가진다. 이들은 푸코스 및 시알산과 같이 말단 당의 존재 및 분지 개수에 차이를 가진다. 이들은 만노스로만 (고도의 만노스 N-글리칸) 이루어질 수 있는 분지의 조성; 얼터네이팅 GIcNAc 및 다양한 당 서열들로 끝나는 Gal 잔기, 및 바이섹팅 Fuc 및 코어 GlcNAc (복합체 N-글리칸)의 체인내 치환 가능성; 또는 고도의 만노스 및 복합체 체인 (하이브리드 N-글리칸)의 속성에 따라 분류할 수 있다. Hounsell, E. F ed., "Glycoprotein Analysis in Biomedicine," Methods in Molecular Biology 14:298 (1993)을 참조한다.
대안적으로, 본 발명의 항체는, 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치의 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민 잔기로 변형된, 서열번호 118, 119, 120, 121, 122 123 또는 124로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 특이적으로 인지하는 것이거나 또는 이를 이용해 구축된 것이다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 본 발명에서 상호 호환적으로 임의 아미노산 길이의 폴리머를 지칭한다.
용어 "아미노산"은 자연 생성 아미노산 및 합성 아미노산뿐 아니라 자연 생성 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 아울러, 용어 "아미노산"은 D- 및 L-아미노산 (입체이성질체)을 둘다 포괄한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 하기를 포함한다:
a) 서열번호 1, 6, 11, 16, 21, 26. 31, 36, 41 중 어느 하나에 기술된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 경쇄 상보성 결정부 1 (VL-CDR1);
b) 아미노산 서열 QAS, KAS, RAS, SAS, DAS 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 경쇄 상보성 결정부 2 (VL-CDR2);
c) 서열번호 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 경쇄 상보성 결정부 3 (VL-CDR3),
d) 서열번호 3, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 중쇄 상보성 결정부 1 (VH-CDR1);
e) 서열번호 4, 9, 14, 19, 24, 29, 34, 39, 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 중쇄 상보성 결정부 2 (VH-CDR2), 또는
f) 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 중쇄 상보성 결정부 3 (VH-CDR3).
본원에서, 용어 "상보성 결정부" 또는 "CDR"은 단백질이 항원의 형태에 상보적인 항체내 영역을 지칭한다. 즉, CDR은 특이 항원에 대한 단백질의 친화성 (대략적으로, 결합 세기) 및 특이성을 결정한다. 각 쌍의 쇄 2개의 CDR들은 프래임워크 영역과 나란히 정렬되어, 특이적인 에피토프에 결합하는 기능을 획득한다. 따라서, 중쇄 및 경쇄 둘다 CDR 3개, 각각 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 및 VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3를 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR 서열의 기능적 등가 변이체"는 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가지면서 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편의 일부일 경우 동족 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 유지하는, 특정 CDR 서열에 대한 서열 변이체를 의미한다. 예를 들어, CDR 서열의 기능적 등가 변이체는 하나 이상의 아미노산의 부가, 결손 또는 치환을 포함하는 서열의 폴리펩타이드 서열 유도체일 수 있다.
본 발명에 따른 CDR 서열의 기능적 등가 변이체는, 전술한 기준 서열들 중 하나에 나타낸 대응되는 아미노산 서열과 적어도 대략 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가진 CDR 서열들을 포함한다. 또한, CDR 서열의 기능적 등가 변이체는 상기한 기준 서열들 중 하나에 나타낸 대응되는 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에 아미노산 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상으로 이루어진 부가를 포함하는 것으로 고려된다. 마찬가지로, 또한, 변이체는 상기한 기준 서열들 중 하나에 나타낸 대응되는 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에 아미노산 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상으로 이루어진 결손을 포함하는 것으로, 고려된다.
본 발명에 따른 CDR 서열의 기능적 등가 변이체는, 바람직하게는 서열번호 1-45 중 어느 하나에 나타낸 대응되는 아미노산 서열 또는 경쇄 CDR2 서열 QAS, KAS, RAS, SAS 및 DAS이 본 발명의 것과 같이 항체 또는 항체 단편의 일부인 경우에, 이의 동족 항원에 결합하는 능력을 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 그 이상으로 유지할 것이다. 이러한 동족 항원에 결합하는 능력은 항체 또는 항체 단편의 동족 항원에 대한 친화성, 항체항원 결합성, 특이성 및/또는 선택성의 값으로서 확인할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 하기를 특징으로 한다:
(i) VL-CDR1은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(ii) VL-CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 QAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(iii) VL-CDR1은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 RAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(iv) VL-CDR1은 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 QAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(v) VL-CDR1은 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 SAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(vi) VL-CDR1은 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 DAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(vii) VL-CDR1은 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 SAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(viii) VL-CDR1은 서열번호 36에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 37에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(ix) VL-CDR1은 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(x) VH-CDR1은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(xi) VH-CDR1은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(xii) VH-CDR1은 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(xiii) VH-CDR1은 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(xiv) VH-CDR1은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(xv) VH-CDR1은 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(xvi) VH-CDR1은 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(xvii) VH-CDR1은 서열번호 38에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 40에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
(xviii) VH-CDR1은 서열번호 43에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 45에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 전술한 항체는 하기를 특징으로 한다:
(i) VL-CDR1은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(ii) VL-CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 QAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(iii) VL-CDR1은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 RAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(iv) VL-CDR1은 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 QAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(v) VL-CDR1은 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 SAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(vi) VL-CDR1은 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 DAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(vii) VL-CDR1은 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 SAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(viii) VL-CDR1은 서열번호 36에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 37에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 38에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 40에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
(ix) VL-CDR1은 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 43에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 45에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하기를 특징으로 한다:
(i) 서열번호 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102 또는 110 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 프래임워크 1 (VL-FR1) 영역 아미노산 서열,
(ii) 서열번호 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103 또는 111 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 프래임워크 2 (VL-FR2) 영역 아미노산 서열,
(iii) 서열번호 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104 또는 112 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 프래임워크 3 (VL-FR3) 영역 아미노산 서열, 및
(iv) 서열번호 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105 또는 113 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 프래임워크 4 (VL-FR4) 영역 아미노산 서열.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하기 중 하나 이상을 더 포함한다:
(i) 서열번호 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 또는 114 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 프래임워크 1 (VH-FR1) 영역 아미노산 서열,
(ii) 서열번호 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 또는 115 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 프래임워크 2 (VH-FR2) 영역 아미노산 서열,
(iii) 서열번호 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 또는 116 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 프래임워크 3 (VH-FR3) 영역 아미노산 서열, 및
(iv) 서열번호 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109 또는 117 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 프래임워크 4 (VH-FR4) 영역 아미노산 서열.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는, 각 항체의 각각의 VL-FR1, VL-CDR1, VL-FR2, VL-CDR2, VL-FR3, VL-CDR3, VL-FR4, VH-FR1, VH-CDR1, VH-FR2, VH-CDR2, VH-FR3, VH-CDR3 및 VH-FR4가 표 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, Ag1G-11, Ag2G-17, Ag3G-4, Ag4g-6, Ag5G-17, Ag6G-1, Ag6G-11, Ag7G-17 또는 Ag7g-19 항체이다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
i) 서열번호 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 또는 133 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 의해 정의되는 경쇄, 및/또는
ii) 서열번호 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 또는 142중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 의해 정의되는 중쇄.
추가적인 구현예에서, 본 발명의 임의의 항체는 인간화된 또는 초-인간화된 (super-humanised) 인간 항체 프래임워크 영역으로부터 유래되는 하나 이상의 하나 이상의 프래임워크 영역을 포함한다.
"인간화된"은, 부모 항체의 항원-결합 특성을 유지하지만 인간에서 면역원성이 낮은, 비-인간 항체, 전형적으로 뮤라인 항체로부터 유래되는 항체를 의미한다. 이는, (a) 비-인간 가변성 도메인 전체를 인간 불변부 상에 그래프팅하여 키메라 항체를 구축하고; (b) 비-인간 상보성 결정부 (CDR)만 인간 프래임워크 및 불변부에 주요 프래임워크 잔기를 유지하면서 또는 유지하지 않으면서 그래프팅하고; 및 (c) 비-인간 가변성 도메인 전체를 이식하지만, 이를 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 부분으로 클로킹하는 (cloaking) 단계를 포함하여, 다양한 방법들에 의해 달성할 수 있다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 바람직하게는 인간화된 항체는 비-인간 기원으로부터 이에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는, 전형적으로 "이입 (import)" 가변성 도메인으로부터 취해지는, 흔히 "이입" 잔기로 지칭된다.
인간화는 기본적으로 인간 항체의 대응되는 서열을 과가변부 서열로 치환함으로써 윈터 및 공동 연구자들의 방법에 따라 수행할 수 있다 (Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)). 실제, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 과가변부 잔기와 가능하게는 일부 프래임워크 영역 (FR) 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터 유래된 잔기로 치환된 인간 항체이다. 인간화된 항체를 제조하는데 사용할 경쇄 및 중쇄 둘다에서 인간 가변성 도메인의 선정은 항원의 특이성 및 친화성을 유지하면서 면역원성을 줄이는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏" 방법에 따라, 설치류 항원의 가변성 도메인의 서열을 공지된 인간 가변성-도메인 서열의 전체 라이브러리에서 스크리닝한다. 그런 후, 설치류의 서열에 가장 가까운 인간 서열을 인간화된 항체에 대한 인간 프래임워크 영역 (FR)으로 취한다 (Suns et al., J. Immunol, 151 :2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래되는 특정 프래임워크 영역을 이용하는 것이다. 이 동일한 프래임워크는 수종의 다른 인간화된 항체에도 사용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151: 2623 (1993)).
항체는 높은 항원 친화성과 다른 우호적인 생물학적 특성을 유지하면서 인간화되는 것이 특히 중요하다. 이를 달성하기 위해, 인간화된 항체는 부모 서열의 분석 공정 및 부모 서열과 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용한 다양한 구성의 인간화된 생산물에 의해 제조한다. 이러한 접근법에서 추가적인 단계는, 인간과 더 유사한 항체를 만들기 위해, 소위 영장류화된 항체, 즉 원숭이 (또는 기타 영장류) 항체, 특히 시노몰구스 원숭이 항체의 가변성 중쇄 및 경쇄 도메인을 함유하도록 조작되고, 인간 불변 도메인 서열, 바람직하게는 인간 면역글로불린 γ1 또는 γ4 불변 도메인 (또는 PE 변이체)를 함유하는, 재조합 항체를 제조하는 것이다.
"인간 항체"는 공지된 임의의 표준 방법에 의해 제조된, 인간 경쇄 및 중쇄뿐 아니라 불변부를 전적으로 포함하는 항체를 의미한다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 구축할 수 있다. 예를 들어, 현재, 면역화시, 내인성 면역글로불린의 생산없이 인간 항체에 대한 전체 레퍼토리를 구현할 수 있는 형질전환 동물 (예, 마우스)의 생산이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식-계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 PH 유전자의 동형접합성 결손시 내인성 항체 생산이 완전히 저해되는 것으로, 개시되어 있다. 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식-계열 돌연변이 마우스에 이식하면, 면역화 후 인간 항체의 생산이 달성될 것이다. 예를 들어, Jakobovits et al, Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90:255 1 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993), Lonberg, 2005, Nature Biotech. 23: 1117-25를 참조한다.
또한, 인간 항체는 인간 세포로 재구축된 면역 시스템으로 시험관내 활성화된 B 세포 또는 SCID 마우스에 의해 제조할 수도 있다.
인간 항체가 수득되면, 이의 코딩 DNA 서열을 단리 및 클로닝하여, 적절한 발현 시스템, 즉, 세포주, 바람직하게는 포유류 세포주에 도입하고, 이후 발현시켜 항체를 단리할 수 있는 배양 배지로 분비시킨다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 Fab, F(ab)2, 단일-도메인 항체, 단쇄 가변성 단편 (scFv) 또는 나노바디이다.
Fab, F(ab)2, 단일-도메인 항체, 단쇄 가변성 단편 (scFv) 및 나노바디는 에피토프-결합성 항체 단편으로서 간주된다.
항체 단편은 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fab' 및 scFv와 같은 항체의 단편이다. 항체 단편을 제조하기 위한 다양한 기법들이 개발되어 있다. 전통적으로, 이러한 단편은 온전한 항체의 단백질 분해를 통해 유래되지만, 최근 들어 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산할 수 있다. 다른 구현예들에서, 선택 항체는 부가적으로 단일 특이성 또는 이중 특이성일 수 있는 단쇄 Fv (scFv) 단편이다.
항체를 파파인으로 분해하면, 각각 항원-결합부 하나를 가진 "Fab"로 지칭되는 2개의 동일한 항원 결합 단편과, 쉽게 결정화되는 성향이 명칭에 반영된 나머지 "Fc" 단편이 만들어진다. 펩신 처리시 항원-결합부가 2개이고 여전히 항원에 가교할 수 있는 F(ab')2 단편이 만들어진다.
"Fv"는 완전한 항원-인지 및 항원-결합 부위를 가진 최소 항체 단편이다. 이 영역은 중쇄 가변성 도메인 하나와 경쇄 가변성 도메인 하나가 견고하게 비-공유 결합된 이량체로 구성된다. 이러한 구성에서, 각각의 가변성 도메인의 과가변부 3곳이 상호작용하여, VH-VL 이량체의 표면 위에 항원-결합부를 규정한다. 일괄적으로, 과가변부 6 영역이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변성 도메인 (또는 항원에 특이적인 과가변부 3개만 포함하는 Fv의 절반)은, 전체 결합부보다는 친화성이 낮음에도 불구하고, 이 항원을 인지하여 결합하는 능력을 가진다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CHI)을 포함한다. Fab' 단편은, 항체 힌지부로부터 유래된 하나 이상의 시스테인을 포함한 중쇄 CHI의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 존재한다는 점에서, Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 하나 이상의 유리 티올 기를 가진 Fab'에 대해 명명된다. F(ab')Z 항체 단편은 본래 단편 사이에 힌지 시스테인을 가진 Fab' 단편들의 쌍으로서 만들어진다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
용어 "단일 도메인 항체"는 상보성 결정부가 단일 도메인 폴리펩타이드의 일부인 항체를 나타낸다. 그 예로는, 비-제한적으로, 중쇄 항체 (나노바디), 경쇄가 천연적으로 결여된 항체, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체로부터 유래된 것 이외의 다른 단일 도메인 스캐폴드 등이 있다. 단일 도메인 항체는 당일 기술 분야의 임의의 것으로부터 유래하거나, 또는 임의의 향후 단일 도메인 항체로부터 유래할 수 있다. 단일 도메인 항체는, 비-제한적으로, 마우스, 인간, 낙타과, 라마, 염소, 토끼, 소과 등의 임의 종으로부터 유래할 수 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 단일 폴리펩타이드 쇄로 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있는 폴리펩타이드 링커를 VH와 VL 도메인 사이에 더 포함한다. scFv에 대한 리뷰로 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994)를 참조한다.
더 바람직하게는, Fv 단편의 도메인 2개, 즉 VL과 VH는 본래 분리된 유전자에 의해 코딩됨에도 불구하고, 이들 유전자 서열 (예, 이의 코딩 cDNA)을 코딩하는 폴리펩타이드는, VL과 VH 영역이 결합하여 일가 에피토프-결합 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단쇄 Fv (scFv)로 지칭됨)로서 이를 제조할 수 있는 유연한 링커에 의해, 재조합 방법을 이용해, 연결될 수 있다. 대안적으로, 짧아 (예, 잔기 약 9개 미만) 단일 폴리펩타이드 쇄의 VL 도메인과 VH 도메인을 함께 결합시키지 못하는 유연한 링커를 사용함으로써, 이중 특이성 항체, 다이아바디 또는 (이러한 폴리펩타이드 쇄 2개가 서로 연합하여 2가 에피토프-결합 분자를 형성하는) 유사 분자를 형성할 수 있다. 본 발명에 포함되는 에피토프-결합성 항체 단편에 대한 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 일가 단편인 Fab' 또는 Fab 단편, 또는 WO2007059782에 기술된 바와 같은 일가 항체; (ii) 힌지 도메인에서 이황화 결합에 의해 연결된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 필수적으로 VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 필수적으로 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 필수적으로 VH 도메인으로 이루어지며 또한 도메인 항체로도 지칭되는 dAb 단편; (vi) 카멜리드 (camelid) 또는 나노바디; 및 (vii) 단리된 상보성 결정부 (CDR) 등이 있다. 아울러, Fv 단편의 도메인 2개, VL 및 VH는 분리된 유전자에 의해 코딩되고, 재조합 방법을 이용해 VL 및 VH 도메인이 쌍을 형성하여 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단쇄 항체 또는 단쇄 Fv (scFv)라고도 함)로서 이를 제조할 수 있는 합성 링커에 의해, 연결될 수 있다.
용어 "나노바디"는 면역글로불린의 중쇄 (VH 단편)의 항원 결합부로부터 생성되는 소형 물질 (15 kDa)을 지칭한다. 이 나노바디는 주로, 중쇄 가변성 도메인에 의해 항원을 인지하고 본래 경쇄가 없는 항체를 가지는 특성을 가진, 낙타, 라마 및 단봉 낙타, 주로 라마와 같은 낙타과; 또한 상어과의 동물을 면역화하여 제조한다. 그럼에도 불구하고, 이들 기원으로부터 유래된 나노바디는 이의 치료학적 용도를 위해 인간화 공정이 필요하다. 나노바디를 수득하기 위한 다른 잠재적인 기원은 가변부의 VH 및 VL 도메인을 분리함으로써 서로 다른 인간 샘플로부터 유래한 항체로부터 유래된다. 나노바디는 전체 항체에 대해 생산 비용 절감, 안정성 및 면역원성 감소와 같은 이점을 가진다.
용어 "다이아바디"는 2개의 항원-결합부를 가진 소형 항체 단편을 지칭하며, 이들 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 (VH-VL)로 중쇄 가변성 도메인 (VH)을 경쇄 가변성 도메인 (VL)과 연결한다. 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 간의 쌍을 형성하기에는 매우 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들은 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하여 항원-결합부 2개를 형성하게 된다.
본 발명에 포함되는 당화된 ApoJ에 결합하는 항체의 기능성 단편은 이것이 유래된 전장 항체의 하나 이상의 결합 기능 및/또는 조절 기능을 유지한다. 바람직한 기능성 단편은 대응되는 전장 항체의 항원-결합 기능 (예, 포유류 CCR9에 결합하는 능력)을 유지한다.
또한, 본 발명은 이중 특이성 항체를 포함할 수 있다. 이중 특이성 항체는 적어도 2개의 서로 다른 에피토프에 대해 결합 특이성을 가진 항체이다. 예시적인 이중 특이성 항체는 당화된 ApoJ의 2개의 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 이중 특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예, F(ab)2 이중 특이성 항체, 미니바디, 다이아바디)로서 제조할 수 있다. 다른 접근법으로, 면역글로불린 불변 도메인 서열을, 바람직한 결합 특이성 (항체-항원 조합 부위)을 가진 항체 가변성 도메인과 융합한다. 융합은, 바람직하게는, 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 하나 이상의 융합체에 존재하는, 경쇄 결합에 필수적인 부위를 함유한 제1 중쇄 불변부 (CHI)를 가지는 것이, 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 적절한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 분리된 개별 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 유기체에 공동 형질전환한다. 이는, 구축시 사용된 폴리펩타이드 쇄 3개의 불-균등한 비율이 최적의 수율을 제공하는 경우, 구현예들에서 폴리펩타이드 단편 3개의 상호 비율을 조정하는데 상당한 유연성을 부여한다. 그러나, 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄를 동등한 비율로 발현하였을 때 고 수율이 달성되거나 또는 비율이 특히 중요하지 않을 경우, 폴리펩타이드 쇄 2개 또는 3개 모두에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것도 가능하다.
항체 단편으로부터 이중 특이성 항체를 제조하기 위한 기법들은 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 이중 특이성 항체는 화학적 연결을 이용해 제조할 수 있다.
당화된 ApoJ에 결합하는 능력을 가진 단편 역시 당해 기술 분야의 당업자에 의해 공지된 통상적인 방법으로 수득할 수 있다. 이러한 방법은 대상 단일클론 항체의 폴리펩타이드 쇄 (또는 이의 단편)를 코딩하는 DNA를 단리하고, 재조합 DNA 기법을 이용해 DNA를 조작하는 것을 수반할 수 있다. DNA를 이용해 하나 이상의 아미노산을 부가, 제거 또는 치환하기 위한 다른 대상 DNA 또는 (예, 돌연변이 유발에 의해) 변형된 DNA를 만들 수 있으며, 예를 들어, 항체 (예, 중쇄 또는 경쇄, 가변부 또는 항체 전체)의 폴리펩타이드 쇄를 코딩하는 DNA를 당화된 ApoJ로 면역화된 마우스로부터 수득한 뮤라인 B 세포로부터 단리할 수 있다. DNA는 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 PCR을 이용해 단리 및 증폭시킬 수 있다.
단쇄 항체는 아미노산 브릿지를 이용한 중쇄 및 경쇄 (Fv 영역)의 가변부의 결합을 통해 통상적인 방법으로 수득할 수 있다. scFv는 가변부 (VL 및 VH)의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA들 사이에 링커 펩타이드를 코딩하는 DNA를 융합함으로써 제조할 수 있다. scFv의 제조는 다수의 문헌, 예를 들어, 미국 특허 US 4,946,778, Bird (Science 242: 423, 1988), Huston et al. (Proc. Natl. Acad Sci USA 85: 5879, 1988) 및 Ward et al. (Nature 334: 544, 1989)에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 항체는 VL 도메인과 VH 도메인을 포함한다. 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변성 도메인을 지칭하고, 용어 "VL 도메인"은 면역글로불린 경쇄의 아미노 말단의 가변성 도메인을 지칭한다. 본원에 언급된 VL 도메인은 불변 도메인과 연결되어 경쇄, 예를 들어 전장 경쇄를 형성할 수 있다. 본원에 언급된 VH 도메인은 불변 도메인과 연결되어 중쇄, 예를 들어 전장 중쇄를 형성할 수 있다.
추가적인 구현예에서, 본 발명의 항체에는 검출가능한 표지물질이 부착된다. 다른 바람직한 구현예에서, 표지물질은 하나 이상의 물리적, 화학적, 전기적 또는 자기 특성의 변화를 이용해 검출할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "검출가능한 표지물질" 또는 "표지제"는, 본원에서, 적절한 검출 공정 및 장치를 사용해, 예를 들어 분광측정, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단에 의해, 이것이 부착된 분자의 검출, 위치 및/또는 동정을 수행할 수 있는 분자 표지물질을 지칭한다. 항체를 표지하는데 적합한 표지제로는 방사핵종, 효소, 형광단, 화학발광 시약, 효소 기질 또는 조인자, 효소 저해제, 입자, 자기 입자, 염료 및 유도체 등을 포함한다.
방사성동위원소 또는 방사핵종으로도 지칭되는 방사성 동위원소를 이용하여 방사성 표지되는 화합물로는, 비-제한적으로, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, mIn, 125I, 131I, 133Xe, 111Lu, 211At 및 213B를 포함한다. 방사성동위원소 표지는 전형적으로 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA와 같이 금속 이온과 착물을 형성할 수 있는 킬레이팅 리간드를 이용함으로써 수행한다. 단백질에 방사성동위원소를 접합하는 방법은 종래 기술 분야에 잘 알려져 있다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 형광성 기로 표지된다. 형광성 기는 아미노산의 측쇄에 직접 또는 연결 기를 통해 부착될 수 있다. 폴리펩타이드 형광 시약을 접합하는 방법은 종래 기술 분야에 잘 알려져 있다.
항체와 같은 폴리펩타이드를 형광성 기로 표지하는데 적합한 시약으로는, 아미노 기 및 티올 기 등의, 단백질의 측쇄에 열거된 다양한 기들에 대해 반응가능한 능력을 가진 화학적 기들을 포함한다. 즉, 본 발명에 따른 항체를 변형하기 위해 이용할 수 있는 화학적 기로는, 비-제한적으로, 말레이미드, 할로아세틸, 요오도아세트아미드 숙신이미딜 에스테르 (예, NHS, N-하이드록시숙신이미드), 이소티오시아네이트, 설포닐 클로라이드, 2,6-다이클로로트리아지닐, 펜타플루오로페닐 에스테르, 포스포르아미디트 등이 있다. 적합한 반응성 관능기에 대한 예는 카르복실 기로 변형된 검출성 기의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (NHS)이다. 전형적으로, 형광 화합물을 변형시키는 카르복실 기는, 화합물을, 카르보디이미드 시약 (예, 다이사이클로헥실카르보디이미드, 다이이소프로필카르보디이미드, 우라늄 또는 TSTU (0-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), HBTU((0-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 또는 HATU (0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트와 같은 시약), 표지물질의 NHS 에스테르를 형성하기 위한 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt) 및 N-하이드록시숙신이미드 타입의 활성제와 접촉시켜, 활성화한다.
형광 표지물질은, 비-제한적으로, 에티듐 브로마이드, SYBR 그린, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민 테트라메틸 이소티올 (TRIT), 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인, 플루오레세인, HEX (6-카르복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레세인), 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, Joe (6-카르복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시플루오레세인), 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인,5-카르복시로다민, 로다민, 테트라메틸로다민 (Tamra), Rox (카르복시-X-로다민), R6G (로다민 6G), 프탈로시아닌, 아조메타지나스 (azometazinas), 시아닌 (Cy2, Cy3 및 Cy5), 텍사스 레드, 프린세스톤 레드, BODIPY FL-Br2, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, DABCYL, 에오신, 에리트로신, 에티듐 브로마이드, 그린 형광 단백질 (GFP) 및 이의 유사체, 무기-계 형광 반도체 나노결정 (양자점), 란탄족 원소 기반의 형광성 표지물질, 예를 들어 Eu3 + 및 Sm3 + 등, 로다민, 포스포러스-란탄족 원소 또는 FITC를 포함한다.
효소 표지물질은, 비-제한적으로, 호스래디시 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제 또는 알칼라인 포스파타제를 포함할 수 있다.
바람직한 표지물질은, 비-제한적으로, 플루오레세인, 알칼라인 포스파타제와 같은 포스파타제, 바이오틴, 아비딘, 호스래디시 퍼옥시다제와 같은 퍼옥시다제 및 바이오틴과 관련된 화합물 또는 아비딘과 관련된 화합물 (예, 스트렙타비딘 또는 ImmunoPure® NeutrAvidin, Pierce, Rockford, IL)을 포함할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 결합 쌍의 제1 구성원에의 접합을 통해 표지된다. 바람직한 구현예에서, 이러한 변형은 공유적 바이오틴화이다. 본원에서, 용어 "바이오틴화"는 바이오틴이 분자 (전형적으로, 단백질)에 공유 결합되는 것을 의미한다. 바이오틴화는 단백질의 측쇄에 접합될 수 있는 바이오틴 시약을 이용해 수행되며, 접합은 주로 단백질의 측쇄에 함유된 1차 아미노 기 및 티올 기에서 이루어진다. 아미노 기를 바이오틴화하는데 적합한 시약으로는 바이오틴 함유 물질, 및 아미노 기와 반응가능한 기, 예를 들어 숙신이미드 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르 또는 알킬 할라이드 등이 있으며, 바이오틴 모이어티와 반응성 기는 임의 길이의 스페이서에 의해 이격되어 있다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 콜로이드성 금 나노입자를 비롯하여 금 (Au)과 같은 금속 이온으로 표지되며, 정전기 상호작용을 통해 항체에 직접 부착될 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 콜로이드성 금 나노입자는 바이오틴에 사전 부착시킨 후 항체에 공유 결합시킬 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 다른 측면에서 당화된 ApoJ에 대해 높은 친화성 및 특이성을 가진 단일클론 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 이들 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
이에, 제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은, 일부 구현예에서, 하나 이상의 본 발명의 항체를 코딩하는, 핵산 분자, 특히 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 용어 "핵산"은 광의의 의미에서 뉴클레오티드로 된 폴리머를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 이들 폴리머는 흔히 폴리뉴클레오티드로 지칭된다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 언급되는 바와 같이 염기 10개 이상의 길이의 뉴클레오티드로 된 폴리머 형태를 의미한다. 특정 구현예에서, 염기는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드이거나, 또는 임의의 뉴클레오티드 타입의 변형된 형태일 수 있다. 이 용어는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포괄한다.
본 발명의 예시적인 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로는, 비-제한적으로, 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 트레오스 핵산 (TNA), 글리콜 핵산 (GNA), 펩타이드 핵산 (PNA), 잠긴 (locked) 핵산 (β-D-리보 배위를 가진 LNA, α-L-리보 배위를 가진 α-LNA (LNA의 부분입체이성질체), 2'-아미노 관능기를 가진 2'-아미노-LNA, 및 2'-아미노 관능기를 가진 2'-아미노-α-LNA 등의 LNA), 에틸렌 핵산 (ENA), 사이클로헥세닐 핵산 (CeNA) 또는 하이브리드 또는 이들의 조합 등이 있다.
일 구현예에서, 시험관내 전사 (IVT) 효소적 합성 방법만으로 제조되는, 본 발명의 하나 이상의 항체 구조체를 코딩하는 선형 폴리뉴클레오티드는 "IVT 폴리뉴클레오티드"로 언급된다. IVT 폴리뉴클레오티드의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 계류 중인 2013년 3월 9일자 국제 특허 공개번호 WO2013151666에 기술되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
전술한 임의의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, 코딩된 폴리펩타이드, 항체 불변부 또는 본원에 기술된 바와 같이 다른 이종의 폴리펩타이드의 직접 분비를 지시하기 위한 신호 펩타이드를 코딩하는, 부가적인 핵산을 더 포함할 수 있다. 또한, 본원의 도처에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명은 전술한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 제1 폴리뉴클레오티드가 본원에 기술된 VH 도메인을 코딩하고; 제2 폴리뉴클레오티드가 본원에 기술된 VL 도메인을 코딩하는, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함한다. 아울러, 본원에 기술된 바와 같이, 융합 폴리폴리펩타이드, Fab 단편 및 기타 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에 고려된다.
폴리뉴클레오티드는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다면, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 간략하게는 항체를 코딩하는 서열의 일부들을 함유한 올리고뉴클레오티드를 중첩시키고, 어닐링한 다음 이들 올리고뉴클레오티드를 라이게이션한 다음 라이게이션한 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭시키는 것을 수반하는, (예, Kutmeier et al., Bio Techniques 17:242 (1994)에 기술된 바와 같이) 화학 합성한 올리고뉴클레오티드로부터 조립할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 당화된 ApoJ 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 적정 기원의 핵산으로부터 구축할 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 함유한 클론이 이용가능하진 않지만 항체 분자의 서열이 공지되어 있다면, 항체를 코딩하는 핵산은, 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 동정하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 클로닝에 의해 또는 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해, 화학적으로 합성하거나 또는 적절한 기원 (예, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포와 같이, 항체 또는 기타 항-당화된 ApoJ 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 구축된 cDNA 라이브러리 또는 이로부터 단리한 핵산, 바람직하게는 폴리 A+RNA)로부터 수득할 수 있다. PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 이후 당해 기술 분야에 잘 알려진 임의의 방법을 이용해 복제가능한 클로닝 벡터에 클로닝할 수 있다.
항-당화된 ApoJ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체에 대한 뉴클레오티드 서열 및 대응되는 아미노산 서열이 결정되면, 이의 뉴클레오티드 서열은 당해 기술 분야에 잘 알려진 뉴클레오티드 서열 조작 방법을 이용해, 예를 들어 재조합 DNA 기법, 부위 특이적인 돌연변이 유발, PCR 등을 이용해 조작함으로써 (예를 들어, Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 및 Ausubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)에 기술된 기법을 참조하며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 여러가지 아미노산 서열을 가진 항체를 구축할 수 있으며, 예를 들어 아미노산 치환, 결손 및/또는 삽입을 구현할 수 있다.
항-당화된 ApoJ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 비-변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 항-당화된 ApoJ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 및 이중 가능 DNA, 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합형 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합형 RNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로는 이중 가닥일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자, 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합으로 구성될 수 있다. 또한, 항-당화된 ApoJ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA를 포함하는 삼중 가닥 영역으로 구성될 수 있다.
항-당화된 ApoJ 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 하나 이상의 변형된 염기 또는 DNA 또는 RNA 백본을 함유할 수 있다. "변형된" 염기는, 예를 들어, 트리틸화된 염기 및 비-통상적인 염기, 예를 들어 이노신 (inosine)을 포함한다. 다양한 변형은 DNA 및 RNA에서 수행될 수 있으며; 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소학적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다.
면역글로불린 (예, 면역글로불린 중쇄 영역 또는 경쇄 영역)으로부터 유래된 폴리펩타이드의 비-천연 변이체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결손이 코딩된 단백질에 도입되도록, 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결손을 도입함으로써, 구축할 수 있다. 돌연변이는 부위-특이적인 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 표준 기법에 의해 도입할 수 있다. 바람직하게는, 보존적인 아미노산 치환은 하나 이상의 비-필수 아미노산 잔기에서 이루어진다.
일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 항체, 이의 단편 또는 변이체 중 하나 이상을 코딩하기 위한 모듈 설계를 가진다. 비-제한적인 예로서, 폴리뉴클레오티드 구조체는 다음과 같은 설계 중 임의의 것을 코딩할 수 있다: (1) 항체의 중쇄, (2) 항체의 경쇄, (3) 항체의 중쇄 및 경쇄, (4) 링커에 의해 분리되어 있는 중쇄와 경쇄, (5) VHl, CHI, CH2, CH3 도메인, 링커 및 경쇄, 및 (6) VHl, CHI, CH2, CH3 도메인, VL 영역 및 경쇄. 이들 설계 중 임의의 설계는 또한 임의의 도메인 및/또는 영역 사이에 선택적인 링커를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 Fab, F(ab)2, 단일 도메인 항체, 단쇄 가변성 단편 (scFv) 또는 나노바디를 코딩한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 항체가 단일 도메인 항체, 단쇄 가변성 단편 (scFv) 또는 나노바디인, 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(ii) 표 1에 따른 중쇄 가변부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(iii) 표 1에 따른 경쇄 가변부를 함유한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(iv) 표 1에 따른 경쇄 가변부 및 표 1에 따른 중쇄 가변부를 함유한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리시스트로닉 폴리뉴클레오티드.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열번호 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150 또는 151에 따른 서열을 포함한다.
관련 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
"벡터"는 셔틀 및 발현 벡터를 포함하며, 예를 들어 플라스미드, 코스미드 또는 파지미드 등이 있다. 전형적으로, 플라스미드 구조체는 또한 박테리아에서 플라스미드의 각각 복제 및 선별을 위한, 복제 오리진 (예, ColE1 복제 오리진) 및 선별 마커 (예, 암피실린 또는 테트라사이클린 내성)를 포함할 것이다. "발현 벡터"는, 원핵생물, 예를 들어 박테리아 또는 진핵생물 세포에서 본 발명의 항체 단편을 비롯하여, 항체를 발현시키기 위한 필수 제어 서열 또는 조절 인자를 함유한 벡터를 지칭한다. 적절한 벡터는 아래에 기술한다.
항체를 재조합 생산하기 위해, 이를 코딩하는 핵산 분자를 단리하여, 추가적으로 클로닝 (DNA 증폭)하기 위한 복제가능한 벡터에 삽입하거나, 또는 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결된 상태로 벡터에 삽입된다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 공정 (예, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)을 이용해 쉽게 단리 및 서열분석한다. 복수의 벡터들이 이용가능하다. 벡터 구성성분들은 일반적으로 비-제한적으로 다음 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열, 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 인자, 프로모터 및 전사 종결 서열.
본 발명의 항-당화된 ApoJ 항체는 직접뿐 아니라 이종의 폴리펩타이드, 바람직하게는, 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적인 절단부를 가진 신호 서열 또는 기타 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 재조합 방식으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 선택되는 이종의 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인지 및 처리 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 네이티브 항-당화된 ApoJ 항체 신호 서열을 인지 및 처리하지 않는 원핵생물 숙주 세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들어 알칼라인 포스파타제, 페니실린아제, 1pp 또는 열-안정적인 내독소 II 리더로 이루어진 군으로부터 선택되는 원핵생물 신호 서열로 교체된다. 효모 분비를 위해, 네이티브 신호 서열은, 예를 들어, 효모 인버타제 리더, oc 팩터 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 cc-팩터 리더 등), 또는 산 포스파타제 리더, C. 알비칸스 글루코아밀라제 리더 또는 WO 90/13646에 기술된 신호로 치환될 수 있다. 포유류 세포에서 발현하는 경우, 포유류 신호 서열뿐 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 gD 신호가 이용가능하다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 항-당화된 ApoJ 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프래임으로 연결된다.
발현 벡터 및 클로닝 벡터 둘다 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 이 서열은 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 벡터가 복제할 수 있는 것이며, 복제 오리진 또는 자율적인 복제 시스템을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스들에서 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터 유래되는 복제 오리진은 대부분의 그람 음성 박테리아에 적합하며, 2 μ 플라스미드 오리진은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 오리진 (SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유류 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 오리진 구성성분은 포유류 발현 벡터에는 필요하지 않다 (SV40 오리진은 전형적으로 초기 프로모터를 포함하지 않기 때문에 유일하게 사용가능함).
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 선별 마커로도 지칭되는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는, (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하며, 예를 들어, 바실러스에 대한 D-알라닌 라세마제 (racemase)를 코딩하는 유전자이다. 선택 공정의 일 예는 숙주 세포의 증식을 중지시키기 위해 약물을 이용한다. 이종의 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하며, 따라서 선택 용법에서 살아남는다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용하는 것이다.
포유류 세포에 적합한 선별 마커에 대한 다른 예는 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등과 같이, 항-당화된 ApoJ 항체 핵산을 흡수하는데 적합한 세포를 식별가능한 것이다. 예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는, 먼저, 형질전환체를 모두 DHFR의 경쟁적인 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유한 배양 배지에서 배양함으로써 동정한다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우에 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예, ATCC CRL-9096)이다.
대안적으로, 항-당화된 ApoJ 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)와 같은 다른 선별 마커를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환 또는 공동-형질전환된, 숙주 세포, 특히 내인성 DHFR을 함유한 야생형 숙주는, 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별 마커에 대한 선택 물질을 함유한 배지에서 세포 배양함으로써 선별할 수 있다. 미국 특허 4,965,199를 참조한다.
효모에서 이용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 생장할 수 있는 능력이 결핍된 효모 돌연변이주, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4 Jones, Genetics, 85:12 (1977)에 대한 선택 마커를 제공한다. 효모 숙주 세포 게놈 내 trp1 변이의 존재는 트립토판 부재 하 배양시 형질전환을 검출하는 유효한 환경을 제공해준다. 마찬가지로, Leu2-결함 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 가진 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
아울러, 클루이베로마이세스 효모를 형질전환하기 위해 1.6 pm 원형 플라스미드 pKDI으로부터 유래된 벡터를 이용할 수 있다. 대안적으로, 재조합 소 키모신 (calf chymosin)을 대량 생산하는 발현 시스템이 클루이베로마이세스 락티스에서 보고되어 있다. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). 클루이베로마이세스 공업용 균주에 의해 돌연변이 재조합 인간 혈청 알부민을 분비하기 위한 안정적인 복수 카피의 발현 벡터도 개시되어 있다. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 통상적으로 숙주 유기체에 의해 인지되며 항-당화된 ApoJ 항체 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 가진다. 원핵생물 숙주에 사용하기 적합한 프로모터로는 phoA 프로모터, P-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 등이 있다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적절하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 항-당화된 ApoJ 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 신-달가노 (Shine-Dalgarno, S.D.) 서열을 함유할 것이다.
프로모터 서열은 진핵생물에서 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵생물 유전자들이 전사가 시작되는 부위로부터 약 25-30 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 가지고 있다. 다수의 유전자의 전사 개시부로부터 상류 70-80 염기 위치에서 발견되는 다른 서열은 CNCAAT 영역으로, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는, 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 부가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 위치한다. 이들 서열들 모두 진핵생물 발현 벡터에 적절하게 삽입된다. 효모 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데하이드 포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스 포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터 등이 있다.
증식 환경에 의해 제어되는 부가적인 전사 이점을 가진 유도성 프로모터로서 다른 효모 프로모터로는 알코올 데하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드 포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기술되어 있다. 또한, 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유익하게 사용된다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터 항-당화된 ApoJ 항체의 전사는, 예를 들어, 프로모터가 숙주 세포 시스템과 혼용가능한 한, 폴리오마 바이러스 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예, 아데노바이러스 2), 보바인 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 시미안 바이러스 40 (SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득되는 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터에 의해 제어된다.
SV40 바이러스의 초기 프로모터와 후기 프로모터는 편리하게는 sv40 바이러스 복제 오리진을 함유한 sv40 제한효소 절단 단편으로서 수득한다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최초기 프로모터는 편리하게는 미국 특허 4,419,446에 기술된 벡터와 같이 보바인 파필로마 바이러스를 이용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 HindIII E 제한효소 절단 단편 A 시스템으로서 수득한다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기술되어 있다. 또한, 마우스 세포에서 헤르페스 심플렉스 유래의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 인간 P-인터페론 cDNA의 발현에 대한 Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)를 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체를 프로모터로 이용할 수도 있다.
본 발명의 항-당화된 ApoJ 항체를 코딩하는 DNA의 고등 진핵생물에 의한 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 강화한다. 다수의 인핸서 서열들이 포유류 유전자들 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인 및 인슐린)에서 알려져 있다. 그러나, 전형적으로, 진핵생물 세포 바이러스 유래의 인핸서가 이용될 것이다. 그 예로는 복제 오리진의 후기 사이드 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 오리진의 후기 사이드 상의 폴리오마 바이러스 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서 등이 있다. 또한, 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 인자에 대한 Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)를 참조한다. 인핸서는 항-당화된 ApoJ 항체-코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터로부터 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충. 식물, 동물, 인간 또는 기타 다세포 유기체 유래의 유핵 세포)에서 이용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 때때로는 3' 비번역 영역으로부터 입수가능하다. 이들 영역은 항-당화된 ApoJ 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역부에 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 이용가능한 전사 종결 구성성분은 보바인 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 이 문헌에 기술된 발현 벡터를 참조한다.
다른 관련 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "숙주 세포"는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 등의 본 발명의 핵산이 도입되어 본 발명의 마이크로펩타이드를 발현할 수 있는, 세포를 지칭한다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 이러한 용어들은 특정 대상 세포뿐 아니라 이 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 변형은 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 연속 세대들에서 발생할 수 있으므로, 이러한 자손은, 실제, 부모 세포와 동일하진 않지만, 여전히 본 발명의 용어 범위에 포함된다. 이 용어는 이종의 DNA의 도입에 의해 변형될 수 있는 임의의 증식가능한 세포를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 발현시켜, 번역 후 수정한 다음 적절한 세포내 구획으로 위치되어 적절한 전사 장치와 결합할 수 있는 것이다. 적절한 숙주 세포의 선택은 또한 검출 신호를 선택하는데 영향을 미칠 것이다.
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 전술한 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 장내세균과, 예로 에셰리키아 (Escherichia), 예컨대, 에셰리키아 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예컨대, 살로넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예컨대 세라티아 마르세칸스 (Serratia marcescans) 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐 아니라 바실러스, 바실러스 섭틸리스 (B. subtilis) 및 바실러스 리체니포미스 (B. licheniformis) (예, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 기술된 바실러스 리체니포미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예컨대, 슈도모나스 에어루지노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 등이 있다. 바람직한 에셰리키아 콜라니 클로닝 숙주는 E. coli 294 (ATCC 31,446)이지만, E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) 및 E. coli W31 10 (ATCC 27,325)와 같은 다른 균주도 적절하다. 이들 예는 제한되기 보다는 예시일 뿐이다.
전장 항체, 항체 단편 및 항체 융합 단백질은, 특히 당화 및 Fc 작동자 기능이 필요하지 않을 경우, 예를 들어 치료학적 항체를 세포독성 물질 (예, 독소)과 접합하고 면역접합체 자체가 종양 세포 파괴 효과를 나타내는 경우에, 박테리아에서 생산할 수 있다. 전장 항체는 순환계에서 우수한 반감기를 가진다. E. coli에서 생산하는 것이 보다 빠르고, 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 5,648,237 (Carter et. al.), 미국 특허 5,789,199 (Joly et al.) 및 발현 및 분비를 최적화하기 위한 신호 서열 및 번역 개시 영역 (TIR)을 기술한 미국 특허 5,840,523 (Simmons et al.)을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 항체는, 발현 후, E. coli 세포 페이스트로부터 용해 분획에서 단리하고, 예를 들어 이소타입에 따라 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는 예를 들어 CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 공정과 비슷하게 수행할 수 있다.
원핵생물 외에도, 사상성 진균 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물도 항-당화된 ApoJ 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하급 진핵생물 숙주 미생물 중에서도 사카로마이세스 세레비지애 또는 일반 빵 효모가 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드로소필라럼 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 클루이베로마이세스 서모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코더마 리시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 슈바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 슈바니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 사상성 진균, 예를 들어, 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 아스퍼질러스 니둘란스 (A. nidulans) 및 아스퍼질러스 나이거 (A. niger) 등의, 다수의 다른 속, 종 및 균주들도 일반적으로 이용가능하며, 본원에서 이용가능하다.
당화된 항-당화된 ApoJ 항체를 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 다세포성 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 세포 및 곤충 세포가 있다. 다수의 베큘로바이러스 균주 및 변이체 및 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)(애벌레), 에이데스 에집티 (Aedes aegypti)(모기), 에이데스 알보픽쿠스 (Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster)(초파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)과 같은 숙주 유래의 대응되는 허용성 (permissive) 곤충 숙주 세포가 동정되어 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주를 공개적으로 이용할 수 있으며, 이러한 바이러스는 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포를 형질감염하기 위한 바이러스로서 이용할 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토, 아라비돕시스 및 담배의 식물 세포 배양물 역시 숙주로서 이용할 수 있다. 식물 세포 배양물에서 단백질을 생상하는데 이용가능한 클로닝 벡터 및 발현 벡터는 당해 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, 및 Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986을 참조한다.
그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 높으며, 배양 (조직 배양)시 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 이용가능한 포유류 숙주 세포에 대한 예로는 SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CVI 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양으로 증식하기 위해 서브클로닝한 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CVI ATCC CCL 70); 아프리카 푸른 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL1587); 인간 자궁경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, 1413 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL5 1); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포 (Hep G2)가 있다.
숙주 세포는 항-당화된 ApoJ 항체 생산을 위한 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환하고, 적절한 경우 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 바람직한 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
본 발명의 항-당화된 ApoJ 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 햄의 FIO (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM)(Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM)(Sigma)와 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기술된 임의의 배지도 숙주 세포의 배양 배지로 이용할 수 있다. 이러한 임의의 배지에 호르몬 및/또는 기타 성장인자 (예, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예, 소듐 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예, HEPES), 뉴클레오티드 (예, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (마이크로 몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원을 필요에 따라 첨가할 수 있다. 또한, 임의의 다른 필수 첨가제도 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 이용되어 온 조건이며, 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다.
재조합 기법을 이용하는 경우, 항체는 세포내에서, 페리플라즘 공간에서 또는 배지로 직접 분비되게 제조할 수 있다. 만일 항체가 세포내에서 만들어진다면, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 세포용해된 단편과 같은 미립 파편을, 예를 들어 원심여과 또는 한외여과에 의해 제거한다. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)에는 E coli의 페리플라즘 공간으로 분비된 항체를 단리하는 공정이 기술되어 있다. 간략하게는, 세포 페이스트를 소듐 아세테이트 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분간 용해한다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되면, 이 발현 시스템의 상층액을 일반적으로 상업적으로 구입가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 이용해 먼저 농축한다. 단백질 분해를 저해하기 위해 임의의 이전 단계에서 PMSF와 같은 프로테아제 저해제를 포함시킬 수 있으며, 우발적인 오염물의 증식을 방지하기 위해 항생제를 함유시킬 수 있다.
세포로부터 제조될 수 있는 항체 조성물은, 예를 들어 하이드록시아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용해 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기법이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 이소형 및 종에 따라 결정된다. 단백질 A를 이용해, 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기본으로 하는 항체를 정제할 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입과 인간 γ3에 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 아가로스가 가장 일반적이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 제어된 다공성 유리 (controlled pore glass) 또는 폴리(스티렌다이비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스를 이용하여 달성가능한 결과와 비교해 더 빠른 유속과 짧은 공정 시간이 가능하다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 이용가능하다. 이온-교환 컬럼에서의 분획화 (fractionation), 에탄올 침강, 역상 HPLC, 실리카 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지를 이용한 SEPHAROSE™ 크로마토그래피 (예, 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 암모늄 설페이트 침강과 같은 다른 단백질 정제 기법 역시 회수할 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 대상 항체 및 오염물질을 포함하는 혼합물은 pH 약 2.5-4.5에서의 용출 완충제를 이용한 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행할 수 있으며, 바람직하게는 저 염 농도 (예를 들어, 염 약 0-0.25M)에서 수행할 수 있다.
조성물
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에서 정의되는 항체 2종 이상 또는 전술한 특정 실현예 또는 구현예 중 임의의 것을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "조성물"은 전술한 임의의 항체를 임의 비율 및 양으로 포함하는 물질 조성물뿐 아니라 임의 함량의 여러가지 항체들의 조합물로부터 직접 또는 간접적으로 수득되는 임의의 생산물에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물의 일부를 구성하는 항체의 w/w 비율은 전형적으로 대략 0.01:1 내지 100:1 범위이다. 적절한 비율은, 비-제한적으로, 예를 들어, 0.05:1, 0.1:1, 0.5:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:0.5, 1:0.1 및 1:0.05를 포함한다.
더 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물의 일부를 구성하는 항체의 w/w 비율은 1:1이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 조성물을 단일 제형으로서 제형화하거나 또는 각 항체의 개별 제형으로서 제공할 수 있으며, 이들 각각은 조합된 제제 (combined preparation)로서 공동 사용하도록 조합될 수 있음을 알 것이다. 조성물은 각 구성성분이 개별적으로 제형화 및 포장된 부품 키트 (kit-of-parts)일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항체들 중 하나가 Ag2G-17 항체인 것을 특징으로 한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기를 포함한다:
(i) Ag2G-17 및 Ag6G-1 항체,
(ii) Ag2G-17 및 Ag6G-11 항체,
(iii) Ag2G-17 및 Ag7G-19 항체,
(iv) Ag2G-17 및 Ag1G-11 항체,
(v) Ag2G-17 및 Ag7G-17 항체,
(vi) Ag2G-17 및 Ag4G-6 항체,
(vii) Ag2G-17 및 Ag3G-4 항체, 또는
(viii) Ag2G-17 및 Ag5G-17 항체.
당화된 ApoJ의 검출 방법
제4 측면에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 당화된 ApoJ를 확인하기 위한 방법 (이하, 본 발명의 제1 방법으로 지칭됨)에 관한 것이다:
(i) 샘플을, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 조성물과, 항체와 샘플에 존재하는 당화된 ApoJ 간에 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에서 접촉시키는 단계,
(ii) 단계 (i)에서 형성된 복합체의 양을 확인하는 단계.
일반적으로, 면역결합 방법은 당화된 ApoJ 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하는 단계, 그 샘플을 당화된 ApoJ 단백질에 선택적으로 결합하거나 또는 검출할 수 있는 조성물과 면역복합체를 형성할 수 있도록 효과적인 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함한다.
샘플은, 예를 들어, 조직 절편 또는 시료, 균질화된 조직 추출물, 세포, 소기관, 상기한 임의의 항원-함유 조성물의 분리된 및/또는 정제된 형태, 또는 혈액, 혈청 및 혈장 등의 임의의 생물학적 유체 등의 당화된 ApoJ 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있다. 바람직하게는, 당화된 ApoJ 단백질의 함유가 의심되는 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장이다.
선택한 생물학적 샘플을 본 발명의 항체와 면역 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 시간 및 효과적인 조건 하에 접촉시키는 것은, 일반적으로 항체 조성물을 샘플에 단순히 첨가하여, 항체가 면역 복합체를 형성하기에 충분히 긴 시간 동안 혼합물을 인큐베이션하는 것이다.
"복합체를 형성하기에 적절한 조건 하"는, 조건이 바람직하게는 항원 및/또는 항체를 BSA, 보바인 감마 글루불린 (BGG) 또는 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)/Tween과 같은 용액으로의 희석하는 것을 포함하는 것을 의미한다. 첨가되는 이들 물질은 비-특이적인 백그라운드를 줄이는데 유익한 경향을 보인다.
"적합한" 또는 "적절한" 조건은, 또한, 인큐베이션이 유효한 결합을 허용하기에 충분한 시간 동안 또는 온도에서 이루어지는 것을 의미한다. 인큐베이션 단계는 전형적으로 약 1 내지 2 내지 4시간 등으로, 바람직하게는 25℃ 내지 27℃ 수준의 온도에서이거나 또는 약 4℃에서 밤새 등일 수 있다.
형성된 복합체의 양 결정은 다양한 방식으로 수행할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체를 표지하고, 직접 결합을 확인한다. 예를 들어, 이는 당화된 ApoJ 단백질을 고체 지지체에 부착시키고, 표지된 항체 (예, 형광 표지)를 첨가한 다음 과량의 시약을 세척 제거하고, 표지가 고체 지지체 상에 존재하는 지를 확인함으로써, 수행할 수 있다. 다양한 차단 단계 및 세척 단계를 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 적용할 수 있다.
일반적으로, 면역복합체 형성을 검출하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 접근법들을 적용함으로써 달성할 수 있다. 이러한 방법들은 일반적으로 방사성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그 중 임의의 것과 같은 표지물질 또는 마커의 검출을 기반으로 한다. 이러한 표지물질의 사용에 대한 미국 특허로는 미국 특허 번호 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 및 4,366,241 등이 있다. 물론, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 2차 항체 및/또는 바이오틴/아비진 리간드 결합 어레인지먼트 (binding arrangement)와 같은 2차 결합 리간드를 사용함으로써 추가적인 이점을 달성할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 방법의 단계 (ii)에서 복합체의 확인은 항-ApoJ 항체를 이용해 이루어진다.
더 바람직한 구현예에서, 단계 (i)에서 사용되는 항체 또는 본 발명의 제1 방법의 단계 (i)에서 사용되는 조성물 내 항체는 고정된다.
당해 기술 분야의 당업자는 표지되지 않은 본 발명의 항체 (1차 항체)와 표지된 본 발명의 항체 (2차 항체)를 이용하는 본 발명에서 이용가능한 통상적인 매우 다양한 분석들이 존재함을 이해하는 바, 이러한 기법으로는 웨스턴 블롯 또는 면역블롯, ELISA (효소-연결된 면역흡착 분석), RIA (방사성 면역분석), 경쟁적인 EIA (경쟁적인 효소 면역분석), DAS-ELISA (이중 항체 샌드위치-ELISA), 면역세포화학 및 면역조직화학 기법, 유세포 측정 또는 본 발명의 항체를 함유한 단백질 미소구, 바이오칩 또는 마이크로어레이에 기반한 멀티플렉스 검출 기법 등이 있다. 본 발명의 항체를 이용해 당화된 ApoJ를 검출 및 정량하는 다른 방법으로는 친화성 크로마토그래피 기법, 리간드 결합 분석 또는 렉틴 결합 분석 등이 있다.
또한, 표지되지 않은 항체는 부가적인 시약, 예를 들어 표지된 이차 항체로 검출하여야 하는 것으로 이해될 것이다. 이는 특히 신호 증폭을 가능하게 하므로, 검출 방법의 민감성을 높이는데 유용하다.
아울러, 항체 검출은 또한 항체가 이의 동족 항원에 결합함으로써 발생되는 샘플에서의 물리적인 특성 변화를 검출하여 수행할 수 있다. 이러한 분석으로는 샘플에서 당해 기술 분야에 공지된 전송-관련 매개변수 (transmission-related parameter)를 확인하는 것을 포함한다. 본원에서, 용어 "전송-관련 매개변수"는 샘플의 투과광 대 입사광의 비율 또는 이로부터 유래되는 매개변수를 나타내거나 또는 이와 관련있는 매개변수에 대한 것이다.
일 구현예에서, 전송-관련 매개변수는 탁도 측정 또는 비탁법에 의해 결정한다.
본원에서, 탁도 측정은 용액 통과 후 입사 빔의 세기 감소를 이용해 용액 내 광-산란 종을 측정하는 것이다. 탁도 측정 분석의 경우, (조사된 양 대비) 흡수된 광량의 변화는 발생한 응집의 양과 관련 있을 수 있다. 따라서, 샘플 내 분석물 (응집 유발 종)을 쉽게 결정할 수 있다.
본원에서, 비탁법은 샘플을 통과하는 입사광으로부터 먼 각도에서 빛의 세기를 측정하여 용액내 광-산란 종을 측정하는 기법을 의미한다. 비탁 분석은 오리진으로부터 소정의 각도 (전형적으로 90°)에서 반사 또는 산란되는 빛의 양을 측정함으로써 샘플내 분석물의 양을 측정하는 간접적인 방법이다. 단백질 항원의 존재 하에, 항체가 항원과 반응해 침강 반응이 시작된다. 측정은 침강 반응 시간순에서 초기에 이루어진다. 기존에 확립된 표준 곡선과 비교하여 정량적인 값을 구한다. 검출 민감도를 높이기 위해, 항체를 폴리머 미소구에 흡착 또는 공유 결합시킬 수 있다. 이런 방식으로, 적은 시약으로 더 강한 신호를 발생시킨다.
본 발명에 따른 탁도 측정 또는 비탁법에 기반한 검출 방법은 미세입자 강화 (microparticles enhancement)가 수반된 및 수반되지 않은 모든 공지된 응집 시험과 함께 수행된다. 전형적으로, 본 발명에서는 "입자-강화된 탁도 측정 면역분석" (PETIA)이라고도 하는 "미세입자-강화된 광 산환 응집 시험"을 이용한다. 응집-기반의 면역분석은 임의의 분리 또는 세척 단계가 필요없는 준-균질 분석 (quasi-homogeneous assay)이라는 이점이 있어, 임상 화학 분석기에서 혈청 단백질, 치료학적 약물 및 남용 약물을 정량하기 위해 임상 진단에서 일상적으로 사용된다. 반응 혼합물에서 검출할 항원과 특이 항체 간의 광학적 검출을 강화하기 위해, 항체에 적절한 입자를 연결시킬 수 있다. 이로써, 항원은 항체로 코팅된 입자와 반응해 응집된다. 항체의 양 증가에 따라, 복합체의 응집 및 크기가 증가해, 추가적으로 광 산란의 변화가 발생된다.
다른 구현예에서, 항체의 이의 동족 항원에의 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 검출할 수 있다.
본원에서, SPR은, 레이저 빔을 금속 박막에 조사하였을 때, 특정 입사광 (즉, 공명 각)에서 반사광의 세기가 급격하게 감소하는 현상을 의미한다. SPR은 전술한 현상에 기반한 측정 방법으로, 센서인 금속 박막의 표면 상에 흡착된 물질을 고 민감도로 분석할 수 있다. 본 발명에서, 예를 들어, 샘플내 표적 물질은 본 발명에 따른 하나 이상의 항체를 금속 박막 표면 위에 미리 고정하고, 샘플을 금속 박막의 표면을 통과시키고, 샘플 통과 전과 통과 후 항체와 표적 항원의 결합으로부터 발생되는 금속 박막 표면 상에 흡착된 물질의 양 변화를 검출함으로써 검출할 수 있다.
허혈성 조직 손상의 진단 방법
제5 측면에서, 본 발명은, 당화된 ApoJ의 수준을 본 발명의 제1 측면에서 정의되는 항체, 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 제4 측면에서 정의되는 방법을 이용해 개체의 샘플에서 측정하는 것을 포함하며, 기준 값에 대하여 당화된 ApoJ의 수준 감소가 환자가 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 앓고 있다는 지표인, 개체에서 허혈증 또는 허혈성 조직 손상의 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "진단"은 심근허혈 또는 이로 인한 허혈성 조직 손상을 가진 환자의 샘플을 이러한 상해 및/또는 손상을 입지 않은 개체의 샘플과 구별하는 능력을 지칭한다. 이러한 검출은 당해 기술 분야의 당업자들에게 이해되는 바와 같이 모든 샘플들에서 100% 정확한 것으로 의도되진 않는다. 그러나, 분석 샘플들 중 통계학적으로 유의한 개수가 정확한 것으로 분류되어야 한다. 통계학적으로 유의한 수준은 예를 들어 여러가지 통계학적 도구를 이용해 당해 기술 분야의 전문가에 의해 설정될 수 있지만, 신뢰구간, p값 결정, 스튜던트 t 검정 및 피셔의 판별 함수 (discriminating function Fisher)에 의해 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 신뢰구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 99% 미만이다. 바람직하게는, p 값은 0.05 미만, 0.01 미만, 0.005 미만 또는 0.0001 미만이다. 바람직하게는, 본 발명은 특정 검사 군 또는 집단에서 개체의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%에서 허혈증 또는 허혈성 손상을 정확하게 검출할 수 있다.
용어 "허혈증"은 본원에서 "허혈성 현상"과 상호 호환적으로 사용되며, 장기 또는 조직으로의 혈류 감소 또는 중단으로 발생하는 임의의 상황을 의미한다. 허혈증은 일시적이거나 또는 영구적일 수 있다.
표현 "허혈성 조직 손상", "허혈성 조직 상해", "허혈증으로 인한 조직 손상", "허혈증과 관련된 조직 손상", "허혈증의 결과로서 조직 손상", "허혈증에 의해 유발된 조직 손상" 및 "허혈성-손상된 조직"은 허혈증 시기의 결과로서 장기 또는 조직 또는 세포에 대한 형태학적, 생리학적 및/또는 분자 손상을 의미한다.
일 구현예에서, 허혈증에 의해 유발된 손상은 심장 조직의 손상이다. 더 바람직한 구현예에서, 심장 조직에 대한 손상은 심근허혈에 의해 유발된다.
용어 "심근허혈"은 관상 중상동맥경화증 및/또는 심근에 산소 공급 부족에 의해 유발되는 순환 장애를 지칭한다. 예를 들어, 급성 심근경색은 심근 조직에의 비가역적인 허혈성 공격이다. 이러한 공격은 관상 순환에서 폐색 (예, 혈전성 또는 색전성)을 발생시키며, 심근 대사 요구량이 심근 조직으로의 산소 공급을 초과하는 환경을 만든다.
또 다른 구현예에서, 심근허혈은 급성 심근허혈 또는 미세혈관 협심증이다.
용어 "미세혈관 협심증"은, 본원에서, 작은 심장 혈관을 통한 혈류 부족으로 인해 발생되는 병태를 의미한다.
일 구현예에서, 허혈증에 의해 유발되는 손상은 뇌 조직의 손상이다. 다른 구현예에서, 뇌 조직 손상은 허혈성 뇌졸중에 의해 유발된다. 용어 "허혈성 뇌졸중"은, 근육 제어 소실, 감각 또는 지각의 감소 또는 소실, 어지럼증, 불분명한 발음 또는 뇌 사고 또는 뇌혈관 사고로도 지칭되는 뇌 손상의 정도 및 중증도에 따라 다양한 증상을 특징으로 하는, 혈관에서 뇌로의 차단 (뇌로의 산소 공급 부족을 유발함)에 의해 야기되는 갑작스러운 뇌 기능 손상을 의미한다. 용어 "뇌 허혈증" (또는 "뇌졸중")은 또한 종종 뇌로의 산소 부족을 유발하는 뇌로의 혈액 공급 부족을 의미한다.
추가적인 구현예에서, 환자는 허혈성 현상을 앓은 것으로 의심된다.
용어 "개체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자"는 치료가 요망되는 임의의 개체, 특히 포유류 개체를 포함한다. 포유류 개체는 인간, 가축, 농장 동물 및 동물원 동물 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 고양이, 기니아피그, 토끼, 랫, 마우스, 말, 소과, 암소 등을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 개체는 포유류이다. 더 바람직한 구현예에서, 개체는 인간이다.
본원에서, 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 개체로부터 분리된 생물학적 물질을 지칭한다. 생물학적 샘플은 소정의 단백질, 예를 들어 ApoJ의 당화된 형태의 수준을 검출하는데 적합한 임의의 생물학적 물질을 함유한다. 샘플은, 예를 들어 혈액, 타액, 혈장, 혈청, 뇨, 뇌척수액 (CSF) 또는 변과 같은 임의의 적합한 조직 또는 생물학적 유체로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 샘플은 조직 샘플 또는 체액 (biofluid)이다. 본 발명의 보다 특정한 구현예에서, 체액은 혈액, 혈청 또는 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, ApoJ의 여러가지 당화된 형태의 수준을 측정하기 위해 이용되는 샘플은 측정을 상대적으로 수행하는 경우에는 기준 값을 결정하기 위한 사용되는 샘플와 동일한 유형이다. 예를 들어, 당화된 ApoJ의 측정이 혈장 샘플에서 이루어진다면, 혈장 샘플은 기준 값을 결정하는데에도 이용될 것이다. 샘플이 체액이라면, 기준 샘플은 체액의 샘플 유형, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 뇌척수액에서 결정될 것이다.
용어 "수준 감소" 또는 "낮은 수준"은 당화된 ApoJ의 수준과 관련하여, 샘플에서 본 발명에 따른 항체를 사용해 검출한 당화된 ApoJ의 임의의 발현 수준이 기준 값보다 낮은 것을 의미한다. 즉, 당화된 ApoJ 발현 수준은, 기준 값보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상으로 낮을 경우에, 기준 값보다 감소되거나 또는 낮은 것으로 간주된다.
본 발명의 진단 방법은, 검사 대상 개체에서 수득한 수준을 기준 값과 비교하는 것을 포함하며, 기준 값 대비 당화된 ApoJ의 수준 감소는 환자가 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 겪고 있다는 지표이다.
본원에서, 용어 "기준 값"은 개체로부터 수집한 샘플로부터 수득된 값 또는 데이터를 평가하기 위한 기준으로서 사용되는 미리 결정된 기준을 의미한다. 기준 값 또는 기준 수준은 절대치; 상대치; 상한 또는 하한을 가진 값; 범위 값; 산술 평균값 (average value); 중앙값; 평균값 (mean value); 또는 특정 제한 또는 베이스라인 값에 비교되는 값일 수 있다. 기준 값은, 예를 들어 검사 중인 개체로부터 보다 이전 시점에 수득한 샘플에서 구한 값과 같이, 개별 샘플 값에 기초할 수 있다. 기준 값은 생활 연령 매칭된 군의 개체 집단과 같은 많은 샘플 수를 토대로 하거나, 또는 검사할 샘플을 포함하거나 또는 제외한 샘플 풀을 토대로 할 수 있다. 일 구현예에서, 기준 값은 건강한 개체에서 결정된 당화된 ApoJ 잔기의 수준에 해당하며, 건강한 개체는 당화된 ApoJ 수준을 결정하는 시점에 허혈성 조직 손상을 나타내지 않는 개체로서, 바람직하게는 허혈성 손상 병력이 없는 개체로서 이해된다.
다른 구현예에서, 기준 값은 임상적인 관점에서 잘 기록되고, 질환이 없으며, 특히 허혈성 조직 손상을 앓고 있지 않으며, 특히 허혈성 심근 손상 또는 허혈성 뇌 손상을 앓지 않는 환자 군으로부터 수득한 샘플 풀로부터 결정된 해당 바이오마커의 산술 평균 또는 평균 수준에 해당한다. 이러한 샘플에서, 발현 수준은, 예를 들어, 기준 집단에서의 산술 평균 발현 수준의 결정을 이용함으로써, 결정할 수 있다. 기준 값 결정시, 환자의 나이, 성별, 신체 상태 또는 그외 특징 등의 샘플의 유형의 일부 특징들을 고려하여야 한다. 예를 들어, 기준 샘플은, 집단이 통계학적으로 유의하도록, 개체 2명 이상, 10명 이상, 100명 이상에서 1000명 이상으로 된 군의 동일한 양으로부터 입수할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 진단 방법은 Ag2G-17 항체, Ag3G-4 항체, Ag4G-6 항체, Ag5G-17 항체, Ag6G-1 항체, Ag6G-11 항체, Ag7G-17 항체, Ag7G-19 항체를 이용해 수행한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 진단 방법은 본 발명에 따른 항체 수종을 포함하는 조성물을 이용함으로써 이루어지며, 그래서 비교에 사용되는 값은 각각의 사용 항체에 대한 결합의 총합이다. 바람직한 구현예에서, 당화된 ApoJ의 검출은 하기 군으로부터 선택되는 조성물을 이용해 이루어진다:
(i) Ag2G-17 및 Ag6G-1 항체를 포함하는 조성물,
(ii) Ag2G-17 및 Ag6G-11 항체를 포함하는 조성물,
(iii) Ag2G-17 및 Ag7G-19 항체를 포함하는 조성물,
(iv) Ag2G-17 및 Ag1G-11 항체를 포함하는 조성물,
(v) Ag2G-17 및 Ag7G-17 항체를 포함하는 조성물,
(vi) Ag2G-17 및 Ag4G-6 항체를 포함하는 조성물,
(vii) Ag2G-17 및 Ag3G-4 항체를 포함하는 조성물, 또는
(viii) Ag2G-17 및 Ag5G-17 항체를 포함하는 조성물.
본 발명의 진단 방법에 따른 환자를 진단하는데 이용되는 기준 값은 진단에서 고려되는 동일한 유형의 샘플과 동일한 항체로부터 수득되는 값이다. 즉, 진단 방법이 Ag2G-17 항체를 사용해 당화된 ApoJ의 수준을 결정함으로써 이루어진다면, 진단에 사용된 기준 값은 또한 동일 항체를 이용하여 검출한 당화된 ApoJ의 발현 수준이다. 마찬가지로, 진단 방법을 본 발명에 따른 수종의 항체 조성물을 이용해 당화된 ApoJ의 수준을 결정함으로써 수행한다면, 진단시 이용되는 기준 값은 또한 경우에 따라 상기에서 정의되는 바와 같은 샘플 풀 또는 건강한 개체로부터 수득한 동일 조성물을 이용하여 검출한 당화된 ApoJ의 발현 수준이다.
다른 구현예에서, 심근 조직 손상을 진단하기 위해 바이오마커가 결정되면, 기준 값은 심근 조직 손상이 없으며 바람직하게는 심근 조직 손상을 앓은 병력이 없는 건강한 개체에서의 동일 바이오마커의 수준일 것이다. 기준 값이 개체들의 샘플 풀로부터 수득한 동일한 바이오마커의 산술 평균 수준이라면, 샘플 풀이 준비된 개체는 심근 조직 손상이 없으며 바람직하게는 심근 조직 손상을 앓은 병력이 없는 개체이다.
다른 구현예에서, 바이오마커가 뇌 조직 손상을 진단하기 위해 결정된다면, 기준 값은 뇌 조직 손상이 없으며 바람직하게는 뇌 조직 손상을 앓은 병력이 없는 건강한 개체에서의 동일 바이오마커의 수준일 것이다. 기준 값이 개체들의 샘플 풀로부터 수득한 동일한 바이오마커의 산술 평균 수준이라면, 샘플 풀이 준비된 개체는 뇌 조직 손상이 없으며 바람직하게는 뇌 조직 손상을 앓은 병력이 없는 개체이다.
본 발명의 진단 방법에서 이용되는 기준 값은 원하는 특이성 및 민감도를 달성하기 위해 최적화될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 당화된 ApoJ의 수준 결정은 괴사 마커의 검출가능한 증가가 샘플에서 검출될 수 있기 전에 이루어진다. 바람직한 구현예에서, 괴사 마커는 T-트로포닌 또는 CK이다. 또 다른 구현예에서, 당화된 ApoJ의 수준 결정은 허혈성 손상 증상의 개시 시점에서 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 30시간, 40시간, 50시간 이내 또는 그 이상의 시간 이내에 수득한 샘플에 대해 수행된다. 바람직한 구현예에서, 심근 허혈성 손상의 경우, 증상은 통상적으로 가슴 통증, 숨가쁨, 발한, 쇠약, 어지럼증, 구역질, 구토 및 두근거림이다. 일 구현예에서, 환자는 pre-AMI 환자이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 진단 방법에 따른 당화된 ApoJ의 수준 결정은 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 완화하기 위해 환자에게 임의의 약물을 투여하기 전에 수득한 환자 샘플에 대해 이루어진다. 일 구현예에서, 심근 조직 손상의 경우, 당화된 ApoJ 형태의 수준 결정은 스타틴, 항-혈소판제 및/또는 항-응고제로 환자를 치료하기 전에 수득한 환자 샘플에 대해 수행된다.
또한 바람직한 구현예에서, 한가지 이상의 괴사 마커의 수준이 상승하기 전 및/또는 환자에게 의심되는 허혈성 현상에 대한 임의의 치료를 수행하기 전에, 의심되는 허혈성 현상이 개시된 후 처음 6시간 이내에 측정한다.
허혈성 손상을 앓고 있는 환자의 예후 예측 방법
제6 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 제1 측면에서 정의되는 항체, 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 제4 측면에서 정의되는 방법을 이용해 당화된 ApoJ의 수준을 환자 샘플에서 결정하는 것을 포함하며, 기준 값에 대하여 당화된 ApoJ의 수준 감소는 허혈증이 진행 중이거나 또는 환자의 예후가 불량하다는 지표인, 허혈성 현상을 앓고 있는 환자에서 허혈증의 진행을 예측하거나 또는 허혈성 현상을 앓고 있는 환자의 예후를 결정하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 예후 예측 방법은 Ag1G-11 항체, Ag2G-17 항체, Ag3G-4 항체, Ag4G-6 항체, Ag5G-17 항체, Ag6G-1 항체, Ag6G-11 항체, Ag7G-17 항체, Ag7G-19 항체를 이용해 이루어진다.
다른 구현예에서, 본 발명의 예후 예측 방법은 본 발명에 따른 항체 수종을 포함하는 조성물을 이용해 이루어지며, 그래서 비교에 이용되는 값은 사용된 각각의 항체의 결합의 총합이다. 바람직한 구현예에서, 당화된 ApoJ의 검출은 하기 군으로부터 선택되는 조성물을 이용해 이루어진다:
(i) Ag2G-17 및 Ag6G-1 항체를 포함하는 조성물,
(ii) Ag2G-17 및 Ag6G-11 항체를 포함하는 조성물,
(iii) Ag2G-17 및 Ag7G-19 항체를 포함하는 조성물,
(iv) Ag2G-17 및 Ag1G-11 항체를 포함하는 조성물,
(v) Ag2G-17 및 Ag7G-17 항체를 포함하는 조성물,
(vi) Ag2G-17 및 Ag4G-6 항체를 포함하는 조성물,
(vii) Ag2G-17 및 Ag3G-4 항체를 포함하는 조성물, 또는
(viii) Ag2G-17 및 Ag5G-17 항체를 포함하는 조성물.
본 발명의 맥락에서, 용어 "진행 예측"은 본원에 기술된 방법을 적용하였을 때, 허혈증 또는 이와 관련된 허혈성 조직 손상을 앓은 이후의 질환의 진행을 예측하는 능력을 의미한다. 이러한 검출은, 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 모든 샘플에서 100% 정확한 것으로 의도되진 않는다. 그러나, 분석한 샘플들 중 통계학적으로 유의한 개수가 정확한 것으로 분류되어야 한다. 통계학적으로 유의한 수준은 예를 들어 여러가지 통계학적 도구를 이용해 당해 기술 분야의 전문가에 의해 설정될 수 있지만, 신뢰구간, p값 결정, 스튜던트 t 검정 및 피셔의 판별 함수에 의해 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 신뢰구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 99% 미만이다. 바람직하게는, p 값은 0.05 미만, 0.01 미만, 0.005 미만 또는 0.0001 미만이다. 바람직하게는, 본 발명은 특정 검사 군 또는 집단에서 개체의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%에서 허혈증 또는 허혈성 손상을 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "예후 결정"은 "예후 예측"과 상호 호환적으로 사용되며, 본원에 개시된 방법을 적용하였을 때, 심근 또는 뇌 허혈증 또는 이와 관련된 허혈성 조직 손상을 앓은 이후의 환자의 결과를 예측하는 능력을 지칭한다. 이러한 검출은, 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 모든 샘플에서 100% 정확한 것으로 의도되진 않는다. 그러나, 분석한 샘플들 중 통계학적으로 유의한 개수가 정확한 것으로 분류되어야 한다. 통계학적으로 유의한 수준은 예를 들어 여러가지 통계학적 도구를 이용해 당해 기술 분야의 전문가에 의해 설정될 수 있지만, 신뢰구간, p값 결정, 스튜던트 t 검정 및 피셔의 판별 함수에 의해 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 신뢰구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 99% 미만이다. 바람직하게는, p 값은 0.05 미만, 0.01 미만, 0.005 미만 또는 0.0001 미만이다. 바람직하게는, 본 발명은 특정 검사 군 또는 집단에서 개체의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%에서 허혈증 또는 허혈성 손상을 정확하게 검출할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 허혈성 현상은 심근 허혈성 현상이다. 또한 바람직한 구현예에서, 심근 허혈성 현상은 ST-상승 심근경색이다.
일 구현예에서, 환자의 예후는 6개월 재발 위험으로서 결정된다. 6개월 재발 위험을 결정하는 경우, 재발은 1차 허혈성 현상 후 처음 6개월 이내의 2차 허혈성 현상을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 일 구현예에서, 2차 허혈성 현상은 1차 허혈성 현상과 동일한 유형이며, 즉 1차 허혈성 현상은 심근 허혈증이며, 예후는 환자가 2차 심근 허혈성 현상을 앓을 위험이 있는 것으로 결정된다. 다른 구현예에서, 2차 허혈성 현상은 1차 허혈성 현상과 다른 유형이며, 즉 1차 허혈성 현상이 심근허혈증이라면, 예후는 환자가 뇌 혀혈성 현상을 앓을 위험이 있는 것으로 결정되거나, 또는 그 역도 성립된다.
더욱 바람직한 구현예에서, 환자의 예후는 6개월 재발 위험, 병원 사망 위험 또는 6개월 사망 위험으로서 결정된다.
다른 구현예에서, 환자의 예후는 병원 사망 위험으로 결정된다.
바람직한 구현예에서, 환자의 예후는 6개월 사망 위험으로 결정된다.
용어 "기준 값"은, 본 발명의 예후 예측 방법을 참조하는 경우, 개체로부터 수집한 샘플로부터 수득한 값 또는 데이터를 평가하기 위한 참조로서 사용되는 미리 결정된 기준을 의미한다. 기준 값 또는 기준 수준은 절대치; 상대치; 상한 또는 하한을 가진 값; 범위 값; 산술 평균값; 중앙값; 평균값; 또는 특정 제한 또는 베이스라인 값과 비교한 값일 수 있다. 기준 값은, 예를 들어 검사 중인 개체로부터 보다 이전 시점에 수득한 샘플에서 구한 값과 같이, 개별 샘플 값에 기초할 수 있다. 기준 값은 생활 연령 매칭된 군의 개체 집단과 같은 많은 샘플 수를 토대로 하거나, 또는 검사할 샘플을 포함하거나 또는 제외한 샘플 풀을 토대로 할 수 있다. 일 구현예에서, 기준 값은 허혈성 현상을 앓은 적 있으나 허혈증이 진행되지 않았거나 또는 양호한 진행을 나타낸 개체에서 결정된 당화된 ApoJ의 수준에 해당한다. 6개월 재발 위험으로서 결정되는 진행의 경우, 기준 값은, 1차 허혈성 현상 후 적어도 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월 간 또는 그 이상 동안 임의의 추가적인 허혈성 현상을 앓지 않은 환자에서, 허혈성 현상 시점에 취해진 환자 샘플내 당화된 ApoJ 수준으로서 취할 수 있다. 다른 구현예에서, 진행이 병원 사망 위험으로서 결정된다면, 기준 값은 병원에서 퇴원한 환자에서 허혈성 현상 시점에 취해진 환자 샘플내 당화된 ApoJ의 수준으로서 취할 수 있다. 6개월 사망 위험으로서 진행이 결정되는 경우, 기준 값은, 허혈성 현상 후 적어도 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월 또는 그 이상 동안 여전히 살아있는 환자에서, 허혈성 현상 시점에 취해진 환자 샘플내 당화된 ApoJ 수준으로서 취할 수 있다.
다른 구현예에서, 기준 값은 임상적인 관점에서 잘 기록되고, 허혈성 현상을 겪은 후 전술한 단락에서 정의되는 바와 같이 양호한 예후를 보이는 환자 군으로부터 수득한 샘플 풀로부터 결정된 해당 바이오마커의 산술 평균 또는 평균 수준이다. 이러한 샘플에서, 발현 수준은, 예를 들어, 기준 집단에서의 산술 평균 발현 수준의 결정을 이용함으로써, 결정할 수 있다. 기준 값 결정시, 환자의 나이, 성별, 신체 상태 또는 그외 특징 등의 샘플 유형의 일부 특징들을 고려하여야 한다. 예를 들어, 기준 샘플은, 집단이 통계학적으로 유의하도록, 개체 2명 이상, 10명 이상, 100명 이상에서 1000명 이상으로 된 군의 동일한 양으로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 예후 예측 방법에 따라 환자의 예후를 예측하는데 이용되는 기준 값은 분석 중인 환자의 샘플에서 사용된 것과 동일한 항체 또는 항체 조성물을 이용하여 동일한 유형의 샘플로부터 수득한 값으로 이해될 것이다. 즉, 예후 예측 방법이 Ag2G-17 항체를 사용해 당화된 ApoJ의 수준을 결정함으로써 이루어진다면, 진단에 이용되는 기준 값은 또한 동일 항체를 이용하여 검출한 당화된 ApoJ의 발현 수준이다. 마찬가지로, 예후 예측 방법이 본 발명에 따른 수종의 항체 조성물을 이용해 당화된 ApoJ의 수준을 결정함으로써 이루어진다면, 진단시 이용되는 기준 값은 또한 경우에 따라 상기에서 정의되는 바와 같은 샘플 풀 또는 건강한 개체로부터 수득한 동일 조성물을 이용하여 검출한 당화된 ApoJ의 발현 수준이다.
다른 구현예에서, 바이오마커가 심근 조직 손상을 앓고 있는 환자의 예후를 결정하기 위해 정해진다면, 기준 값은 심근 허혈성 현상을 앓은 후 상기에서 정의되는 임의의 기준에 따라 양호한 예후 (6개월 후 허혈성 현상의 재발, 병원 사망 또는 6개월 후 사망의 결여)를 보이는 개체에서의 동일한 바이오마커의 수준일 것이다. 기준 값이 개체들의 샘플 풀로부터 수득한 동일한 바이오마커의 산술 평균 수준이라면, 샘플 풀을 준비한 개체는 심근 허혈성 현상을 앓은 후 상기에서 정의되는 임의의 기준에 따라 양호한 예후 (6개월 후 허혈성 현상의 재발, 병원 사망 또는 6개월 후 사망의 결여)를 나타내는 개체이다.
다른 구현예에서, 바이오마커가 뇌 조직 손상의 예후를 예측하기 위해 정해진다면, 기준 값은 뇌 허혈성 현상을 앓은 후 상기에서 정의되는 임의의 기준에 따라 양호한 예후 (6개월 후 허혈성 현상의 재발, 병원 사망 또는 6개월 후 사망의 결여)를 보이는 개체에서의 동일한 바이오마커의 수준일 것이다. 기준 값이 개체들의 샘플 풀로부터 수득한 동일한 바이오마커의 산술 평균 수준이라면, 샘플 풀을 준비한 개체는 뇌 허혈성 현상을 앓은 후 상기에서 정의되는 임의의 기준에 따라 양호한 예후 (6개월 후 허혈성 현상의 재발, 병원 사망 또는 6개월 후 사망의 결여)를 보이는 개체이다.
본 발명의 예후 예측 방법에서 이용되는 기준 값은 바람직한 특이도 민감도를 수득하기 위해 최적화될 수 있다.
본 발명의 위험 계층화 방법
본 발명의 발명자들은, 또한, 본 발명에 따른 항체 및 조성물을 이용해 검출하는 당화된 ApoJ가 안정적인 관상 동맥 질환 (CAD)을 앓는 환자가 재발성 허혈성 현상을 겪을 위험을 결정하기 위한 유용한 바이오마커라는 것을, 입증하였다. 이 방법은 허혈성 현상을 겪을 위험에 따라 환자를 계층화할 수 있으며, 따라서, 위험에 따라 환자에게 특이적인 예방 요법을 정하는데 유용하다.
제7 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 제1 측면에서 정의되는 항체, 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 제4 측면에서 정의되는 방법을 이용해 당화된 ApoJ의 수준을 환자 샘플에서 결정하는 것을 포함하며, 기준 값에 대하여 당화된 ApoJ의 수준 감소는 환자가 재발성 허혈성 현상을 겪을 위험이 높다는 지표인, 안정적인 관상 동맥 질환을 앓고 있는 환자가 재발성 허혈성 현상을 겪을 위험을 결정하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 위험 계층화 방법은 Ag1G-11 항체, Ag2G-17 항체, Ag3G-4항체, Ag4g-6 항체, Ag5G-17 항체, Ag6G-1 항체, Ag6G-11 항체, Ag7G-17 항체, Ag7G-19 항체를 이용해 이루어진다.
다른 구현예에서, 본 발명의 위험 계층화 방법은 본 발명에 따른 항체 수종을 포함하는 조성물을 이용함으로써 이루어지며, 그래서 비교에 사용되는 값은 각각의 사용 항체에 대한 결합의 총합이다. 바람직한 구현예에서, 당화된 ApoJ의 검출은 하기 군으로부터 선택되는 조성물을 이용해 이루어진다:
(i) Ag2G-17 및 Ag6G-1 항체를 포함하는 조성물,
(ii) Ag2G-17 및 Ag6G-11 항체를 포함하는 조성물,
(iii) Ag2G-17 및 Ag7G-19 항체를 포함하는 조성물,
(iv) Ag2G-17 및 Ag1G-11 항체를 포함하는 조성물,
(v) Ag2G-17 및 Ag7G-17 항체를 포함하는 조성물,
(vi) Ag2G-17 및 Ag4G-6 항체를 포함하는 조성물,
(vii) Ag2G-17 및 Ag3G-4 항체를 포함하는 조성물, 또는
(viii) Ag2G-17 및 Ag5G-17 항체를 포함하는 조성물.
본 발명의 맥락에서, 용어 "위험 결정" 또는 "위험 계층화"는 다음과 같은 위험 또는 가능성을 결정하는 능력을 의미한다: a) 심근 또는 뇌 허혈증 또는 이와 관련된 허혈성 조직 손상을 앓은 후 환자의 부가적인 임상 합병증을 앓거나, 및/또는 b) 본원에 개시된 방법을 적용하였을 때, 심근 또는 뇌 허혈증 또는 이와 관련된 허혈성 조직 손상에 대한 특이적인 치료가 유익함. 이러한 검출은, 당해 기술 분야의 당업자들에게 이해되는 바와 같이 모든 샘플들에서 100% 정확한 것으로 의도되진 않는다. 그러나, 분석 샘플들 중 통계학적으로 유의한 개수가 정확한 것으로 분류되어야 한다. 통계학적으로 유의한 수준은 예를 들어 여러가지 통계학적 도구를 이용해 당해 기술 분야의 전문가에 의해 설정될 수 있지만, 신뢰구간, p값 결정, 스튜던트 t 검정 및 피셔의 판별 함수에 의해 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 신뢰구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 99% 미만이다. 바람직하게는, p 값은 0.1 미만, 0.05 미만, 0.01 미만, 0.005 미만 또는 0.0001 미만이다. 바람직하게는, 본 발명은 특정 검사 군 또는 집단에서 개체의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%에서 허혈증 또는 허혈성 손상을 정확하게 검출할 수 있다.
용어 "안정형 관상동맥 질환" 및 "안정형 관상 심장 질환"은 동일한 의미이며, 상호 호환적으로 사용가능하다. 이들 용어는 의학적인 상태로서 안정형 관상 동맥 질환 (SCAD)을 포함한다. 용어 "안정형 심혈관 질환", "안정형 관상동맥 질환" 또는 "안정형 관상 심장 질환" 맥락에서 "안정형"은 급성 심혈관 현상이 없는 심혈관 질환으로 진단되는 임의의 병태로서 정의된다. 따라서, 예를 들어, 안정형 관상동맥 질환은, 관상 동맥 혈전증이 임상적인 발현에서 가장 두드러진 상황 (급성 관상동맥 증후군)을 제외한, 관상동맥 질환의 여러가지 진화 단계를 정의한다. SCAD를 앓고 있는 환자는 다음과 같은 병태들 중 하나 이상으로 정의된다: ECG 스트레스 검사 양성, 심근 섬광조영술 양성 또는 관상 동맥 중 >50%에서 협착을 동반한 안정형 협심증, 급성 관상동맥 증후군 병력, 관상 재혈관화 병력, 적어도 3개월 동안 항-혈소판제, 항-응고제 및/또는 스타틴을 안정적인 투여량으로 치료 중임.
바람직한 구현예에서, 안정형 관상동맥 질환을 앓고 있는 환자는 안정형 관상동맥 질환 이전에 급성 관상동맥 증후군을 앓은 적이 있는 환자이다. 바람직한 구현예에서, 안정형 관상동맥 질환을 앓고 있는 환자는 안정형 관상동맥 질환 발병하기 전 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월, 60개월 전 또는 그 이상의 시간 이전에 급성 관상동맥 증후군을 겪은 환자이다.
용어 "기준 값"은 본 발명의 위험 계층화 방법에 대해 언급되는 경우, 개체로부터 수집한 샘플로부터 수득한 값 또는 데이터를 평가하기 위한 참조로서 이용되는 미리 결정된 기준을 의미한다. 기준 값 또는 기준 수준은 절대치; 상대치; 상한 또는 하한을 가진 값; 범위 값; 산술 평균값; 중앙값; 평균값; 또는 특정 제한 또는 베이스라인 값과 비교한 값일 수 있다. 기준 값은, 예를 들어 검사 중인 개체로부터 보다 이전 시점에 수득한 샘플에서 구한 값과 같이, 개별 샘플 값에 기초할 수 있다. 기준 값은 생활 연령 매칭된 군의 개체 집단과 같은 많은 샘플 수를 토대로 하거나, 또는 검사할 샘플을 포함하거나 또는 제외한 샘플 풀을 토대로 할 수 있다. 일 구현예에서, 기준 값은 안정형 관상동맥 질환을 앓고 있지만 임의의 재발성 허혈성 현상은 앓은 적 없는 개체에서 결정된 당화된 ApoJ의 수준다. 이 경우, 기준 값이 결정될 수 있는 적합한 환자는 안정형 관상동맥 질환을 앓고 있지만, 안정형 관상동맥 질환이 개시된 후 적어도 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월 동안 또는 그 이상의 기간 동안 허혈성 재발 현상을 겪지 않은 환자이다.
다른 구현예에서, 기준 값은 임상적인 관점에서 잘 기록되고, 안정형 관상동맥 질환을 알고 있지만 안정형 관상동맥 질환이 발병한 후 적어도 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월 동안 또는 그 이상의 기간 동안 재발성 허혈성 현상을 앓은 적 없는 환자 군으로부터 수득한 샘플 풀로부터 결정된 해당 바이오마커의 산술 평균 또는 평균 수준이다. 이러한 샘플에서, 발현 수준은, 예를 들어, 기준 집단에서의 산술 평균 발현 수준의 결정을 이용함으로써, 결정할 수 있다. 기준 값 결정시, 환자의 나이, 성별, 신체 상태 등과 같은 샘플 유형의 일부 특징들을 고려하여야 한다. 예를 들어, 기준 샘플은, 집단이 통계학적으로 유의하도록, 개체 2명 이상, 10명 이상, 100명 이상에서 1000명 이상으로 된 군의 동일한 양으로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 위험 계층화에 이용되는 기준 값은 분석 중인 환자의 샘플에서 사용된 것과 동일한 항체 또는 항체 조성물을 이용하여 동일한 유형의 샘플로부터 수득한 값으로 이해될 것이다. 즉, 위험 계층화 방법이 Ag2G-17 항체를 사용해 당화된 ApoJ의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 위험 계층화에 이용되는 기준 값은 또한 동일 항체를 이용하여 검출한 당화된 ApoJ의 발현 수준이다. 마찬가지로, 계층화 방법이 본 발명에 따른 수종의 항체 조성물을 이용해 당화된 ApoJ의 수준을 결정함으로써 수행한다면, 계층화 방법에 이용되는 기준 값은 또한 경우에 따라 상기에서 정의되는 바와 같은 샘플 풀 또는 건강한 개체로부터 수득한 동일 조성물을 이용하여 검출한 당화된 ApoJ의 발현 수준이다.
바람직한 구현예에서, 안정형 관상동맥 질환을 앓고 있는 환자는 안정형 관상동맥 질환 이전에 급성 관상동맥 증후군을 앓은 적이 있는 환자이다.
더욱 바람직한 구현예에서, 재발성 허혈성 현상은 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중 또는 일시적인 허혈성 현상이다.
제7 측면에서, 본 발명은, 환자에서 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 진단하기 위한, 허혈성 현상을 겪고 있는 환자에서 허혈증 진행을 결정하거나, 허혈성 현상을 겪고 있는 환자의 예후를 예측하거나 또는 안정형 관상동맥 질환을 겪고 있는 환자가 재발성 허혈성 현상을 겪을 위험을 결정하기 위한, 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.
제8 측면에서, 본 발명은, 환자에서 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 진단하기 위한, 허혈성 현상을 겪고 있는 환자에서 허혈증 진행을 결정하거나, 허혈성 현상을 겪고 있는 환자의 예후를 예측하거나 또는 안정형 관상동맥 질환을 겪고 있는 환자가 재발성 허혈성 현상을 겪을 위험을 결정하기 위한, 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 설명될 것이나, 실시예는 주로 예로서 간주되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
재료 및 방법
ApoJ - GlcNAc에 대한 특이적인 단일클론 항체 ( MAb )의 개발
ApoJ 서열에 당화 부위 7곳을 포함하는 7가지 당화된 펩타이드에 대한 특이적인 단일클론 항체를 도 2의 파지 디스플레이에 의해 개발하였다. 구체적으로, 각각의 특이 부위에 대해서는 항체 하나를, 6번 부위 및 7번 부위에 대해서는 2개의 클론을 개발하였다.
허혈증을 검출하기 위해 여러가지 ApoJ- GlcNAc 형태들을 정량하기 위한 mAb 검증
환자 집단
검증 실험은, 통증 개시 후 처음 6시간 이내에 응급실에 입원하였으며 입원시 통상적인 트로포닌 T (cTn-T) 수준이 음성이었으나 (아급성 심근경색은 제외) 1차 채혈 후 제99 백분위수 상한 기준 한계를 초과하는 후속적인 상승이 관찰된 (허혈증 pre-AMI), ST-상승 심근경색 (STEMI) 신규 발병 환자 군으로 구성하였다.
이전에 어떠한 심혈관 질환의 증상이 관찰된 바 없는 건강한 공여자 군은 대조군으로 이용하였다. 대조군과 허혈증 pre-AMI 환자군의 인구학적 및 임상적 특징을 표 2에 나타낸다.
Figure pct00009
본 프로젝트는 산타 크레우 이 산트 파우 병원의 윤리 위원회로부터 승인받았으며, 헬싱키 선언의 원칙에 따라 이행하였다. 참가자들 모두 실험에 참여하기 위해 고지에 입각하여 서면 동의하였다.
샘플 수집 및 준비
환자 및 건강한 개체로부터 금방 채혈한 정맥혈 샘플을 수집하여 혈청을 준비하고, 이를 나누어 -80℃에서 보관하였다.
특이적인 mAb를 이용한 여러가지 ApoJ- GlcNAc 형태들의 정량
허혈증 pre-AMI 환자 및 건강한 대조군의 혈청 샘플에서 여러가지 ApoJ-GlcNAc 형태들의 수준을 여러가지 ApoJ-GlcNAc 잔기들에 대한 여러가지 mAb를 이용한 면역분석으로 측정하였다. 이 방법은 하기를 토대로 한다:
1) ApoJ 단백질의 특정 당화 잔기에 각각의 특이적인 mAb에 특이적으로 결합시킴으로써 ApoJ-GlcNAc를 고정하는 제1 단계;
2) 고정된 ApoJ를 ApoJ 단백질 서열 (ab69644, Abcam)에 대한 상업적으로 구입가능한 바이오틴화된 특이 항체로 검출하는, 제2 단계; 및
3) 바이오틴화된 항체와 반응하는 스트렙타비딘-HRP 접합체 (21130, Pierce)로 이루어진 리포터 시스템에 의해 고정된 당화된 특정 ApoJ 형태의 양을 추가로 정량하는, 마지막 단계.
렉틴을 이용한 총 ApoJ - GlcNAc 수준의 정량
허혈증 pre-AMI 환자 및 건강한 대조군의 혈청 샘플에서 총 ApoJ-GlcNAc 형태들의 수준을 렉틴을 이용한 면역분석으로 측정하였다. 이 방법은 하기를 토대로 한다:
1) 다투라 스트라모늄 (D. stramonium) 렉틴을 고정하기 위해 단백질을 결합시키는, 제1 단계,
2) ApoJ를 ApoJ 단백질 서열에 대한 단일클론 또는 다클론 항체로 검출하는, 제2 단계, 및
3) 고정된 당화된 ApoJ 형태의 양을 리포터 시스템 또는 분자에 의해 추가로 검출 및 정량하는, 마지막 단계. 이 리포터 시스템은 바이오틴-스트렙타비딘-HRP와 같은 리포터 시스템과 함께 2차 항체를 기초로 한다.
통계학적 분석
데이터는 언급된 경우를 제외하고는 평균 및 표준 오차로 나타낸다. N은 검사 개체의 수를 표시한다. 통계학적 분석은 Stat View 5.0.1 소프트웨어로 수행하였다. 군들 간의 비교에는 스튜던트 t-검정을 이용하였다. 임의의 기대치가 >5이면, 범주형 변수 (categorical variable)에 대해 카이제곱검정 (χ2) 또는 피셔의 정확검정을 이용하였다. (선택 변수의 식별력을 분석하기 위해) ROC (Receiver operating characteristic) 곡선을 IBM SPSS Statistics v19.0으로 수행하였다. P 값 < 0.05는 유의한 것으로 간주하였다.
결과
단일클론 항체 개발
도 2는 ApoJ-GlcNAc 당화 부위에 대한 특이적인 단일클론 항체를 개발하기 위해 사용한 방법론적 접근법에 대한 개략도를 보여준다.
1. 면역 라이브러리 구축
각각의 표적 당화 부위에 대한 5가지 유형의 펩타이드 (도 1)를 여러가지 형태로 합성하였다 (네이키드형, BSA-접합된 및 바이오틴-접합된 당화된 펩타이드, 네이키드 펩타이드, 및 바이오틴-접합된 비-당화된 펩타이드). 그런 후, 각각의 BSA-접합된 당화된 펩타이드를 사용해 각각의 토끼를 7회 면역화하였다. 이후, 채혈하고, 항혈청 역가 측정을 바이오틴-접합된 당화된 펩타이드를 사용해 수행하여, 면역반응을 모니터링하였으며, 양성 대조군으로서 바이오틴-접합된 펩타이드를 이용하였다. 역가 측정을 위한 펩타이드 서열을 표 3에 열거한다.
Figure pct00010
바이오틴-접합된 당화된 펩타이드 총 7종에 대한 항-혈청 역가는 바이오틴-접합된 펩타이드의 역가보다 높았으며, 이는 이를 항체 파지 디스플레이 구축에 이용할 수 있다는 것을 의미한다.
이후, 면역 라이브러리를 구축하였다. 비장으로부터 RNA를 단리하였다. Vκ, VH, Cκ 및 CH1을 PCR에 의해 증폭시키고, Fab 코딩 유전자들을 조립하여 라이브러리 구축을 위해 pCDisplay-11에 클로닝하였다. 라이브러리 다양성은 표 4에 요약한 바와 같이 2.8x108이었다. QC 콜로니 PCR을 수행하여, 엔드 라이브러리 (end library)의 삽입 비율을 분석하였다.
Figure pct00011
QC 콜로니 PCR을 수행하여, 엔드 라이브러리의 삽입 비율을 분석하였으며, 양성 비율은 14/20이었다. 이후, DNA의 서열을 분석하였다.
2. 라이브러리 스크리닝
토끼/인간 키메라 Fab 라이브러리를 성공적으로 구축한 후, 파지 스크리닝을 수행하였다. 바이오패닝을 2회 수행하였다. 비-당화 부위 및 비-특이적인 당화 부위에 결합하는 결합 물질을 제거하기 위해, 바이오틴-접합된 비-당화된 펩타이드 7종의 혼합물 (Ag1, Ag2, Ag3, Ag4, Ag5, Ag6, Ag7)과 바이오틴-당화된 펩타이드 혼합물 (AgnG, n=1-7, 표적 펩타이드 제외)로 먼저 파지 라이브러리에 대해 수행하였다. 그런 후, 양성 표적을 스크리닝하여 농화하였다.
백그라운드를 줄이기 위해, 실험 조건을 다음과 같이 최적화하였다. (1) 비-차단된 스트렙타비딘 코팅 웰 및 차단된 스트렙타비딘 코팅 웰에서 먼저 파지 라이브러리에 대해 수행한 다음 (Ag1, Ag2, Ag3, Ag4, Ag5, Ag6, Ag7) 혼합물 및 (AgnG, n=1-7, 표적 펩타이드 제외) 혼합물을 이용하였다. (2) 양성 표적을 스크리닝하여 농화하였다. (3) 차단 완충제를 교체하고, 차단 시간을 또한 연장하였다. (4) 세척 시간 및 횟수를 증가시켰다.
표적 7종 (Ag1G, Ag2G, Ag3G, Ag4G, Ag5G, Ag6G, Ag7G)에 대한 바이오패닝을 3회 수행한 다음, 다클론 파지 ELISA를 1차, 2차 및 3차 라운드의 결과물로 수행하였다. 그런 후, 공정 최적화한 다음 다클론 파지 ELISA를 수행하였다. 비-특이적인 결합 물질을 추가로 줄이기 위해, (Ag1, Ag2, Ag3, Ag4, Ag5, Ag6, Ag7) 혼합물 및 (AgnG, n=1-7, 표적 펩타이드 제외) 혼합물로 1차, 2차 및 3차 라운드의 결과물에 대해 수행한 다음 인큐베이션하였다.
3. 결합 물질 검증
표적 7종에 대한 바이오패닝 3rd-P로부터 수득한 클론 20개를 무작위 선택하였다. QC 단일클론 파지 ELISA를 침강과 함께 배양 배지 중의 파지를 이용해 수행하였다. 그 결과, 표적 총 6종 (Ag1G, Ag2G, Ag4G, Ag5G, Ag6G, Ag7G)에서 고유 클론 17/59개가 동정되었다. 이는, Ag1G에 대한 클론 2종, Ag2G에 대한 클론 2종, Ag4G에 대한 클론 4종, Ag5G에 대한 클론 2종, Ag6G에 대한 클론 3종 및 Ag7G에 대한 클론 4종이었다. 그러나, Ag3G의 표적의 경우, 무손상 항체 서열은 1차 라운드에서 동정되지 않았다. 게다가, 나머지 클론 42/59개는 동일한 서열로서 VH 도메인의 일부를 가진 불완전 항체 서열이었으며, 모든 표적들에서 비-특이적인 것으로 관찰되었다.
2차 라운드에서, Ag3G 군의 다른 클론 5개를 서열분석하기 위해 취하였다. 이들 클론 5개의 서열을 분석하였으며, 이중 4개는 (다른 표적 6종에서와 마찬가지로) 동일한 비-특이적인 서열이었다. 양성 클론 하나가 동정되었으며, 항체 서열은 온전하였다.
이후, 본 발명자들은 표적 7종에 대한 클론을 선별하기 위해 용해성 ELISA를 수행하였다. 각 표적 (Ag1G - Ag5G)에 대한 양성 클론 하나와 표적 Ag6G 및 Ag7G에 대한 양성 클론 2개가 단일클론 파지 ELISA에서 동정되었다. 발현 벡터를 구축하였으며, 세포용해물을 이용해 가용성 ELISA를 수행하였다.
4. IgG 생산 및 검증
클론 9종 (Ag1G-11, Ag2G-17, Ag3G-4, Ag4G-6, Ag5G-17, Ag6G-1, Ag6G-11, Ag7G-17 및 Ag7G-19)을 IgG 형태로 생산하여, QC ELISA를 수행하였다. 마지막으로, IgG 9종 모두 기존의 QC 용해성 ELISA에서 일관된 결과를 나타내었다. 아울러, Ag6G에 대한 IgG 2종은 (이의 대응되는 표적에 대해) 다른 결합 물질보다 차이를 더 잘 구별하는 것으로 관찰되었다. 단일클론 항체의 명칭 및 대응되는 결합 당화 부위를 표 5에 나타낸다.
Figure pct00012
허혈증 존재를 식별하는 능력
GlcNAc를 함유하는 ApoJ 서열의 특이적인 당화 부위를 검출하는 식별력을 검사하기 위해, 허혈증 pre-AMI 환자 (N=38) 및 건강한 대조군 (N=40)의 혈청 샘플에서 당화 부위 7곳을 표적화하는 각각의 특이적인 클론을 이용해 ELISA 검사를 수행하였다. 렉틴-기반의 면역분석으로 총 ApoJ-GlcNAc 수준의 정량 결과와 비교해, 각각의 독립적인 당화된 잔기를 표적화하는 특이적인 항체를 이용한 각각의 ApoJ-GlcNAc 형태의 정량 결과는, 도 3 및 4 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 대조군 개체와 비교해 허혈증 pre-AMI 환자에서 가장 높은 수준으로 감소되는 것으로 나타났다.
Figure pct00013
구체적으로, 당화된 잔기 2 (클론 Ag2G-17) 및 6 (클론 Ag6G-1)에 대한 mAb로 ApoJ-GlcNAc를 검출한 결과, AMI 환자들에서 초기 허혈성 단계에서 ApoJ-GlcNAc 수준이 가장 많이 감소하였다. 아울러, 표 6은, 허혈증 pre-AMI 환자에서 ApoJ-Glyc가 렉틴에 비해 더 높은 감소 %를 나타내어, GlcNAc 잔기를 가진 ApoJ에 대한 모든 mAb가 ApoJ-GlcNAc 수준 감소를 검출하는데 보다 우수한 식별력을 가지고 있다는 것을 보여준다: 49-76 mAb 대 46 렉틴 (도 4).
C-통계 분석에서는 각각의 독립적인 ApoJ-GlcNAc 당화된 잔기를 표적화하는 특이적인 항체를 이용한 바, 혈청 샘플에서 ApoJ-GlcNAc 수준을 검출하는 허혈성 현상에 대한 높은 식별력이 확인되었다. 개별 mAb의 ROC 분석에서는 AUC (곡선 하 면적) 값이 0.751 내지 0.918이었으며, 표 7과 같은 민감도 및 특이도를 나타내었다.
Figure pct00014
여러가지 당화된 잔기들의 조합이 ApoJ-GlcNAc의 민감도 및 특이도를 높일 수 있는 지를 평가하기 위해, 개별 mAb 측정의 모든 잠재적인 조합들의 ROC 분석으로 허혈증 존재를 식별하는 정량화 방법을 수행하였다. 도 5는, 허혈성 현상의 존재를 검출하는데 높은 식별력을 나타낸 조합물 6종의 ROC 곡선을 보여준다. 중요하게도, 독립적인 당화된 잔기를 표적화하는 특이 항체로 여러가지 ApoJ-GlcNAc 형태를 검출하는 조합이, 렉틴-기반의 면역분석을 이용한 총 ApoJ-GlcNAc 수준의 정량화에 비해 허혈성 현상을 검출하는데 더 우수한 식별력을 보여주었다 (표 8). 특히, 클론 Ag6G-1, Ag6G-11, Ag7G-19 및 Ag1G-11과 조합하여, 클론 Ag2G-17으로 혈청 내 ApoJ-GlcNAc 수준을 검출하는 조합이, 가장 높은 허혈증 검출 식별력을 나타내었다 (1.000의 값에 이르는 95% 신뢰구간).
Figure pct00015
ApoJ에서 7곳의 당화 부위를 표적화하는 mAb는 ApoJ에서 발견되는 N- 글리칸을 특이적으로 인지하는 렉틴보다 허혈증 존재에 대해 개선된 식별력을 가진다.
GlcNAc를 함유한 ApoJ 서열의 특이적인 당화 부위를 검출하는 식별력을 검사하기 위해, 허혈증 pre-AMI 환자 (N=38) 및 건강한 대조군 (N=40)의 혈청 샘플에서 당화 부위 7곳을 표적화하는 각각의 특이적인 클론을 이용해 ELISA 검사를 수행하였다. 다투라 스트라모늄 (D. stramonium) 렉틴-기반의 면역분석으로 총 ApoJ-GlcNAc 수준을 정량한 결과는 표 9에 나타낸다.
Figure pct00016
렉틴-기반의 면역분석으로 총 ApoJ-GlcNAc 수준을 정량한 결과 (표 9)와 비교해, 각각의 독립적인 당화된 잔기를 표적화하는 특이 항체를 이용해 각각의 ApoJ-GlcNAc 형태를 정량한 결과, 대조군 개체와 비교해 허혈증 pre-AMI 환자에서 가장 큰 폭의 감소가 관찰되었다 (도 3 및 4 및 표 6 참조). 특히, 당화된 잔기 2 (클론 Ag2G-17) 및 6 (클론 Ag6G-1)에 대한 mAb를 이용해 ApoJ-GlcNAc를 검출하였을 때, AMI 환자에서 초기 허혈성 단계에서 ApoJ-GlcNAc 수준이 가장 큰폭으로 감소하였다.
C-통계 분석 결과, 각각의 독립적인 ApoJ-GlcNAc 당화된 잔기를 표적화하는 특이적인 항체를 이용해 혈청 샘플에서 ApoJ-GlcNAc 수준을 검출하는 방법이 허혈성 현상의 존재에 대해 높은 식별력을 보이는 것으로 확인되었다. 개별 mAb의 ROC 분석에서는 AUC (곡선 하 면적) 값이 0.751 내지 0.918으로, 렉틴보다 높은 특이성 %를 나타내었다 (74-82% MAb 대 53-72 렉틴) (표 7의 mAb 검출 분석에서의 특이도 값을 표 9의 렉틴 분석에서의 특이도 값과 비교함).
mAb는 혈청 유래의 네이티브 ApoJ에 결합하지만, 강하게 N- GlcNAc로 당화된 다른 단백질에는 결합하지 않는다.
강하게 N-GlcNAc로 당화된 다른 단백질 (예, 알부민 및 트랜스페린)에 대해서도 mAb 특이성을 검사하였다. 이를 위해, 인간 혈장 및 혈청으로부터 정제한 네이티브 ApoJ 단백질, 알부민 및 트랜스페린을 각각 2 ㎍ 씩 입구가 좁은 파이펫 팁을 사용해 니트로셀룰로스 막에 로딩하였다. 이를 건조시킨 후, 비-특이적인 영역은 TBS-T 중의 5% BSA 용액에 침지하여 (실온에서 1시간) 차단하였다. 막을 Ag2G-17 또는 Ag6G-11 클론 (이들 클론은 최상의 특이도-민감도 조합을 나타냄)과 함께 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 막을 TBS-T로 3번 헹군 후, HRP가 접합된 이차 항체와 함께 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 마지막으로, TBS-T (1 x 15분 및 2 x 5분)로 3번 헹군 다음 TBS (5분)로 헹구었다. 막을 Supersignal과 인큐베이션하고, ChemiDoc에 노출시켰다.
단일클론 항체는 혈장 및 혈청 유래 네이티브 ApoJ에 결합하지만, 강하게 N-GlcNAc로 당화된 다른 단백질 (예, 알부민 및 트랜스페린)에는 결합하지 않아, 당화된 ApoJ에 대한 특이성이 입증되었다 (도 6). 반면, 렉틴은 정의에 따라 아미노산 서열과 무관하게 당화된 단백질들 모두에 비-특이적으로 결합하였다.
<110> Glycardial Diagnostics S.L. Institut de Recerca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC) <120> ANTIBODIES SPECIFC FOR GLYCOSYLATED APOJ AND USES THEREOF <130> P16665PC00 <150> EP 18382752 <151> 2018-10-23 <160> 167 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 1 Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Glu 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 2 Gln Gly Ile Tyr Leu Gly Ser Asp Trp Tyr Asp Val 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 3 Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 4 Ile Gly Val Asn Gly Asp Thr 1 5 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 5 Ala Arg Val Arg Tyr Pro Tyr Tyr Asp Thr Asp Ala Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 6 Gln Ser Ile Gly Asn Leu 1 5 <210> 7 <211> 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ctcttctagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc 1440 ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actagtggat 1500 cccatcatca ccatcaccac gcggccgcta cgtaa 1535 <210> 149 <211> 1261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polynicleotide <400> 149 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcagc aagcggcgcg 60 catgtcgacc ctatgctgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcacctgt gggaggcaca 120 gtcaccatca agtgccaggc cagtgagagc attagtagta gattagcctg gtatcagcag 180 aaaccagggc agcgtcccaa gctcctgatc tattctgcat ccactctggc atctggggtc 240 tcatcgcggt ttaaaggcag tggatctgag acccagttca ctctcaccat cagcgacgtg 300 cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt ctaggcactt atagtgccat ccggactttc 360 ggcggaggga ccgaggtggt cgtcaaacgt acggtggggc gccatctgtc ttcatcttcc 420 cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact 480 tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact 540 cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc 600 tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc 660 agggcctgag ttcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttaa gtcgactaat 720 taattaggag gaatttaaaa tgaaatacct attgcctacg gcagccgctg gattgttatt 780 actcgctgcc cagccggcca tggcccagga gcagctggag gagtccgggg gtcgcctggt 840 cacgcctggg acacccctga cactcacctg cacagtctct ggattctccc tcagtaccta 900 caacatgggc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gaatacatcg gaatcattta 960 tggcagtggt agcgtacagt acgcgacctg ggcgaaaggc cgattcacca tctccaaaac 1020 ctcgaccacg gtggatctga aaatcaccag tctgacaacc gaggacacgg ccacctattt 1080 ctgtgccaga atgggtagtg gctggggttt taacatctgg ggcccaggca ccctggtccc 1140 atctcctcag ctagcaccaa gggcccatcg gtcttcccgc tggcaccctc ctccaagagc 1200 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg 1260 a 1261 <210> 150 <211> 1526 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recominant polynucleotide <400> 150 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcagc aagcggcgcg 60 catgcctatg tcatgatgac ccagactcca gcctccgtgt ctgaacctgt gggaggcaca 120 gtcaccatca agtgccaggc cagtcagagc attgatagct acttagcctg gtatcagcag 180 aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacaaggctt ccactctggc atctggggtc 240 ccatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacgtg 300 gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt caatgtagtc attatggtag taattggctt 360 ggacctttcg gcggagggac cgaggtggtc gtcaaacgta cggtggcggc gccatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcaacaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ttcscccgtc acagagagct tcaacagggg agagtgttaa 720 gtcgactaat taattaggag gaatttaaag tgaaatacct attgcctacg gcagccgctg 780 gattgttatt actcgctgcc cagccggcca tggcccagtc gctggaggag tccgggggtc 840 gcctggtcac gcctgggaca cccctgacac tcacctgcac agcctctgga ttctccctca 900 atacctacta ttgggtgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg 960 gacacattaa tcctgatggg actgcatact acgcgacctg ggcaaaaggc cgattcacca 1020 tctccagaac ctcgaccacg gtggatctga aaatcaccag tccgacaacc gaggacacgg 1080 ccacgtattt ctgtgccaga ctgggtagta ctggtgacaa ctttaacatc tggggcccag 1140 gcaccctggt caccatctcc tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc ccgctggcac 1200 cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact 1260 tccccgaacc cgtgacggtg tcgtggaact caggtgctct gaccagcggc gtccacacct 1320 tcccggctgt cctacagtct agcggactct actccctcag cagcgtagtg accgtgccct 1380 cttctagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca 1440 aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tagtggatcc catcatcacc 1500 atcaccacgc ggccgctact gaaagg 1526 <210> 151 <211> 1535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polynucleotide <400> 151 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcagc aagcggcgcg 60 catgcctatg tcatgatgac ccagactcca tcttccacgt ctgcggctgt gggaggcaca 120 gtcaccatca actgccagtc cagtcagagt gtttatagta acagcttctt atcctggtat 180 cagcagaaac cagggcagct tcccaagctc ctgatctaca aggcttccac tctggcatct 240 ggggtcccat cgcggtttaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct cacaatcagc 300 gaacttcagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtcaag gcggttatgt cgattggatg 360 cgtgctttcg gcggagggac cgaggtggtc gtcaaacgta cggtggcggc gccatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ttcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttaa 720 gtcgactaat taattaggag gaatttaaaa tgaaatacct attgcctacg gcagccgctg 780 gattgttatt actcgctgcc cagccggcca tggcccagtc ggtggaggag tccgggggtc 840 gcctggtcac gcctgggaca cccctgacac tcacctgcac agtctctgga atcgacctca 900 gtagcaatgc aatgagctgg gtccgccagg ctccaggggg ggggctggag tggatcggaa 960 ccattaatac taatggtaag acatacgacg cgagctggat gaatggccga ttcaccatct 1020 ccaaaacctc gtcgaccacg gtggatctga aaatgaccag tctgacaacc gaggacacgg 1080 ccacctattt ctgtgccaga ggtcgatgga ctggtaatac tggttggtat atagacttgt 1140 ggggcccagg caccctggtc accgtctctt cagctagcac caagggccca tcggtcttcc 1200 cgctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca 1260 aggactactt ccccgaaccc gtgacggtgt cgtggaactc aggtgctctg accagcggcg 1320 tccacacctt cccggctgtc ctacagtcta gcggactcta ctccctcagc agcgtagtga 1380 ccgtgccctc ttctagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca 1440 gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact agtggatccc 1500 atcatcacca tcaccacgcg gccgctacgg aaagg 1535 <210> 152 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Met Met Lys Thr Leu Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu 1 5 10 15 Ser Gly Gln Val Leu Gly Asp Gln Thr Val Ser Asp Asn Glu Leu Gln 20 25 30 Glu Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys Tyr Val Asn Lys Glu Ile Gln Asn 35 40 45 Ala Val Asn Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile Glu Lys Thr Asn 50 55 60 Glu Glu Arg Lys Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys 65 70 75 80 Lys Glu Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser Glu Thr Lys Leu Lys 85 90 95 Glu Leu Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu 100 105 110 Cys Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val 115 120 125 Cys Arg Ser Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu 130 135 140 Asn Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Trp Met Asn Gly Asp Arg Ile Asp 145 150 155 160 Ser Leu Leu Glu Asn Asp Arg Gln Gln Thr His Met Leu Asp Val Met 165 170 175 Gln Asp His Phe Ser Arg Ala Ser Ser Ile Ile Asp Glu Leu Phe Gln 180 185 190 Asp Arg Phe Phe Thr Arg Glu Pro Gln Asp Thr Tyr His Tyr Leu Pro 195 200 205 Phe Ser Leu Pro His Arg Arg Pro His Phe Phe Phe Pro Lys Ser Arg 210 215 220 Ile Val Arg Ser Leu Met Pro Phe Ser Pro Tyr Glu Pro Leu Asn Phe 225 230 235 240 His Ala Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met Ile His Glu Ala Gln Gln 245 250 255 Ala Met Asp Ile His Phe His Ser Pro Ala Phe Gln His Pro Pro Thr 260 265 270 Glu Phe Ile Arg Glu Gly Asp Asp Asp Arg Thr Val Cys Arg Glu Ile 275 280 285 Arg His Asn Ser Thr Gly Cys Leu Arg Met Lys Asp Gln Cys Asp Lys 290 295 300 Cys Arg Glu Ile Leu Ser Val Asp Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln 305 310 315 320 Ala Lys Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln Val Ala Glu Arg 325 330 335 Leu Thr Arg Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr Gln Trp Lys Met 340 345 350 Leu Asn Thr Ser Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp 355 360 365 Val Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu 370 375 380 Arg Val Thr Thr Val Ala Ser His Thr Ser Asp Ser Asp Val Pro Ser 385 390 395 400 Gly Val Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr 405 410 415 Val Thr Val Pro Val Glu Val Ser Arg Lys Asn Pro Lys Phe Met Glu 420 425 430 Thr Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Arg Lys Lys His Arg Glu 435 440 445 Glu <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <220> <221> CARBOHYD <222> (6) <223> GlcNAc <400> 153 Arg Glu Ile Arg His Asn Ser Thr Gly Cys 1 5 10 <210> 154 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <400> 154 Arg Glu Ile Arg His Asn Ser Thr Gly Cys 1 5 10 <210> 155 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <220> <221> CARBOHYD <222> (5) <223> GlcNAc <400> 155 Glu Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser 1 5 10 <210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <400> 156 Glu Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser 1 5 10 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <220> <221> CARBOHYD <222> (5) <223> GlcNAc <400> 157 Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala 1 5 10 <210> 158 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <400> 158 Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala 1 5 10 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <220> <221> CARBOHYD <222> (5) <223> GlcNAc <400> 159 Glu Glu Phe Leu Asn Gln Ser Ser Pro 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <400> 160 Glu Glu Phe Leu Asn Gln Ser Ser Pro 1 5 <210> 161 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <220> <221> CARBOHYD <222> (5) <223> GlcNAc <400> 161 Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu 1 5 10 <210> 162 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <400> 162 Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu 1 5 10 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <220> <221> CARBOHYD <222> (5) <223> GlcNAc <400> 163 Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln Ala Lys 1 5 10 <210> 164 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <400> 164 Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln Ala Lys 1 5 10 <210> 165 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <220> <221> CARBOHYD <222> (5) <223> GlcNAc <400> 165 Trp Lys Met Leu Asn Thr Ser Ser Leu Glu 1 5 10 <210> 166 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Biotin <400> 166 Trp Lys Met Leu Asn Thr Ser Ser Leu Glu 1 5 10 <210> 167 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gycosylated peptide from Clusterin/ApoJ <400> 167 Thr Lys Leu Lys Glu Leu Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala 1 5 10 15 Leu Trp Glu Glu 20

Claims (35)

  1. 당화된 ApoJ에 특이적으로 결합하지만 비-당화된 ApoJ에는 결합하지 않는 항체로서,
    (i) 상기 항체는 ApoJ 내 N-당화 부위를 포함하는 에피토프를 특이적으로 인지하고, 상기 당화 부위는 NCBI 데이터베이스 등재 번호 NP_001822.3에서 정의되는 ApoJ 전구체 서열을 기준으로 86, 103, 145, 291, 317, 354 또는 374번 위치에서의 Asn 잔기들로 이루어진 군으로부터 선택되는 Asn 잔기를 포함하거나, 또는
    (ii) 상기 항체는 서열번호 118, 119, 120, 121, 122, 123 또는 124로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 특이적으로 인지하거나 또는 상기 펩타이드를 이용해 생성된 것이며, 상기 펩타이드는 서열번호 118의 5번 위치, 서열번호 119의 5번 위치, 서열번호 120의 5번 위치, 서열번호 121의 6번 위치, 서열번호 122의 5번 위치, 서열번호 123의 5번 위치 또는 서열번호 124의 5번 위치에서 Asn 잔기가 N-아세틸글루코사민으로 변형된, 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 당화된 ApoJ가 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 잔기를 함유한 당화된 ApoJ, 또는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유한 당화된 ApoJ인, 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 서열번호 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 경쇄 상보성 결정부 1 (VL-CDR1);
    b) 아미노산 서열 QAS, KAS, RAS, SAS, DAS 중 어느 하나, 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 경쇄 상보성 결정부 2 (VL-CDR2);
    c) 서열번호 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 경쇄 상보성 결정부 3 (VL-CDR3);
    d) 서열번호 3, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 중쇄 상보성 결정부 1 (VH-CDR1);
    e) 서열번호 4, 9, 14, 19, 24, 29, 34, 39, 44 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 중쇄 상보성 결정부 2 (VH-CDR2); 또는
    f) 서열번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함하는 중쇄 상보성 결정부 3 (VH-CDR3)
    를 포함하는, 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    (i) VL-CDR1은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (ii) VL-CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 QAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (iii) VL-CDR1은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 RAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (iv) VL-CDR1은 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 QAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (v) VL-CDR1은 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 SAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (vi) VL-CDR1은 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 DAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (vii) VL-CDR1은 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 SAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (viii) VL-CDR1은 서열번호 36에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 37에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (ix) VL-CDR1은 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (x) VH-CDR1은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (xi) VH-CDR1은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하며,
    (xii) VH-CDR1은 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (xiii) VH-CDR1은 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (xiv) VH-CDR1은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (xv) VH-CDR1은 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (xvi) VH-CDR1은 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (xvii) VH-CDR1은 서열번호 38에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 40에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    (xviii) VH-CDR1은 서열번호 43에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 45에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    (i) VL-CDR1은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (ii) VL-CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 QAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (iii) VL-CDR1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 RAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (iv) VL-CDR1은 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 QAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (v) VL-CDR1은 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 SAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (vi) VL-CDR1은 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 DAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (vii) VL-CDR1은 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 SAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나,
    (viii) VL-CDR1은 서열번호 36에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 37에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 38에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 40에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    (ix) VL-CDR1은 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL-CDR2는 아미노산 서열 KAS를 포함하고, VL-CDR3는 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR1은 서열번호 43에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR2는 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VH-CDR3는 서열번호 45에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 중 하나 이상을 더 포함하는 항체:
    (i) 서열번호 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102 또는 110 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 프래임워크 1 (VL-FR1) 영역 아미노산 서열,
    (ii) 서열번호 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103 또는 111 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 프래임워크 2 (VL-FR2) 영역 아미노산 서열,
    (iii) 서열번호 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104 또는 112 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 프래임워크 3 (VL-FR3) 영역 아미노산 서열, 및
    (iv) 서열번호 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105 또는 113 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 프래임워크 4 (VL-FR4) 영역 아미노산 서열.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 중 하나 이상을 더 포함하는, 항체:
    (i) 서열번호 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 또는 114 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 프래임워크 1 (VH-FR1) 영역 아미노산 서열,
    (ii) 서열번호 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 또는 115 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 프래임워크 2 (VH-FR2) 영역 아미노산 서열,
    (iii) 서열번호 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 또는 116 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 프래임워크 3 (VH-FR3) 영역 아미노산 서열, 및
    (iv) 서열번호 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109 또는 117 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 프래임워크 4 (VH-FR4) 영역 아미노산 서열.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 서열번호 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 또는 133 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 의해 정의되는, 경쇄 도메인, 및/또는
    ii) 서열번호 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 또는 142 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 의해 정의되는, 중쇄 도메인
    을 포함하는, 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    각 항체의 VL-FWR1, VL-CDR1, VL-FWR2, VL-CDR2, VL-FWR3, VL-CDR3, VL-FWR4, VH-FWR1, VH-CDR1, VH-FWR2, VH-CDR2, VH-FWR3, VH-CDR3 및 VH-FWR4 영역들이 각각 표 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화된 또는 초-인간화된 (super-humanized), 인간 항체 프래임워크 영역으로부터 유래되는 하나 이상의 프래임워크 영역을 포함하는, 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 Fab, F(ab)2, 단일-도메인 항체, 단쇄 가변성 단편 (scFv) 또는 나노바디인, 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체에 검출가능한 표지물질이 부착된, 항체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 표지물질이 물리적 특성, 화학적 특성, 전기적 특성 또는 자기적 특성 중 하나 이상의 변화에 의해 검출될 수 있는, 항체.
  14. 하기 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:
    (i) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하며, 항체가 단일 도메인 항체, 단쇄 가변성 단편 (scFv) 또는 나노바디인, 폴리뉴클레오티드,
    (ii) 표 1에 따른 중쇄 가변부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
    (iii) 표 1에 따른 경쇄 가변부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
    (iv) 표 1에 따른 경쇄 가변부와 표 1에 따른 중쇄 가변부를 코딩하는 폴리시스트로닉 폴리뉴클레오티드.
  15. 제14항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제17항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 항체 2 이상을 포함하는 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 항체 중 하나가 Ag2G-17 항체인, 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 조성물이 하기를 포함하는, 조성물:
    (i) Ag2G-17 및 Ag6G-1 항체,
    (ii) Ag2G-17 및 Ag6G-11 항체,
    (iii) Ag2G-17 및 Ag7G-19 항체,
    (iv) Ag2G-17 및 Ag1G-11 항체,
    (v) Ag2G-17 및 Ag7G-17 항체,
    (vi) Ag2G-17 및 Ag4G-6 항체,
    (vii) Ag2G-17 및 Ag3G-4 항체, 또는
    (viii) Ag2G-17 및 Ag5G-17 항체.
  20. 하기 단계를 포함하는 샘플에서 당화된 ApoJ를 측정하는 방법:
    (i) 샘플을, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물과, 샘플에 존재하는 당화된 ApoJ와 항체 간에 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계,
    (ii) 단계 (i)에서 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계.
  21. 제20항에 있어서,
    단계 (ii)에서 복합체의 양 측정이 항-ApoJ 항체를 사용해 수행되는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    단계 (i)에서 사용된 항체 또는 단계 (i)에서 사용된 조성물 내 항체가 고정되는, 방법.
  23. 개체에서 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 진단하는 방법으로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용해, 당화된 ApoJ의 수준을 개체의 샘플에서 측정하는 단계를 포함하고,
    기준 값 대비 당화된 ApoJ의 수준 감소는 환자가 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 앓고 있다는 것을 의미하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 허혈증이 심근허혈인, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 심근허혈이 급성 심근허혈 또는 미세혈관 협심증인, 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 허혈성 현상을 앓는 것으로 의심되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 측정은 의심되는 허혈성 현상이 개시된 후 처음 6시간 이내, 하나 이상의 괴사 마커의 수준 증가 전, 및/또는 환자가 의심되는 허혈성 현상에 대해 임의의 치료를 받기 전에 수행되는, 방법.
  28. 허혈성 현상을 앓고 있는 환자에서 허혈증의 진행을 예측하거나 또는 허혈성 현상을 앓고 있는 환자의 예후를 결정하는 방법으로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용해 환자의 샘플에서 당화된 ApoJ의 수준을 측정하는 것을 포함하고,
    기준 값 대비 당화된 ApoJ의 수준 감소는 허혈증이 진행 중이거나 또는 환자의 예후 불량을 의미하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 허혈성 현상이 심근 허혈성 현상인, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 심근 허혈성 현상이 ST-상승 심근경색인, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    환자의 예후는 6개월 재발 위험, 병원 사망 (hospital mortality) 위험 또는 6개월 사망 위험으로서 결정되는, 방법.
  32. 안정적인 관상동맥 질환을 앓고 있는 환자가 재발성 허혈성 현상을 겪을 위험을 결정하는 방법으로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용해 환자의 샘플에서 당화된 ApoJ의 수준을 측정하는 것을 포함하고,
    기준 값 대비 당화된 ApoJ의 수준 감소는 환자가 재발성 허혈성 현상을 겪을 위험이 높다는 것을 의미하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    안정적인 관상동맥 질환을 앓고 있는 환자는 안정적인 관상동맥 질환 이전에 급성 관상동맥 증후군을 앓은 적이 있는, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 재발성 허혈성 현상이 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중 또는 일시적 허혈성 현상인, 방법.
  35. 환자에서 허혈증 또는 허혈성 조직 손상을 진단하거나, 허혈성 현상을 앓고 있는 환자에서 허혈증 진행을 확인하거나, 허혈성 현상을 앓고 있는 환자의 예후를 예측하거나, 또는 안정적인 관상동맥 질환을 앓는 환자가 재발성 허혈성 현상을 앓을 위험을 결정하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
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