KR20210077633A - 효능이 증진된 줄기세포의 제조 방법 - Google Patents

효능이 증진된 줄기세포의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효능이 증진된 줄기세포의 제조 방법, 제조된 줄기세포 및 이를 이용한 질환의 치료 방법에 관한 것이다
본 발명은 특정 배양 방법을 통해 줄기세포의 크기 감소를 야기하고, 세포의 증식력, 분화능, 이동능 및 혈관 신생능을 현저히 개선할 수 있으므로, 줄기세포를 이용한 치료제 개발에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

효능이 증진된 줄기세포의 제조 방법{A method for producing stem cell with enhanced efficacy}
본 발명은 효능이 증진된 줄기세포의 제조 방법, 제조된 줄기세포 및 이를 이용한 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
줄기세포(Stem cell) 는 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포로서 자기 재생(self-renewing), 분화, 영구성(immortal) 등의 특징을 가지고 있다. 줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있으며, 다분화능이 특징인 성체 줄기세포는 만능 분화능을 지닌 배아줄기세포 및 IPS에 비해 암 발생의 위험, 면역거부반응 및 윤리적인 측면에서 비교적 자유롭기 때문에 많은 연구 및 치료제 개발이 진행 중이다. 특히, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 (UCB-MSCs)의 경우 임신 중 태아의 심혈관계를 순환하다가 분만 후 태반과 탯줄로부터 얻을 수 있는 신생아의 혈액 유래 중간엽 줄기세포로서 타 조직 유래의 줄기세포보다 증식능이 뛰어나다는 연구결과들이 보고 된 후로 연구 및 의학 분야에서 많은 주목을 받기 시작했다. 특히 버려지는 조직으로부터 분리하는 줄기세포로서 공여자의 부담이 적고 의료 폐기물은 재활용한다는 점에서 높은 가치가 있다.
제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 치료제로서 처리한 상처, 당뇨병, 심장 경색(heart infraction) 모델에서의 치료 효능이 다수의 논문들을 통해 보고되고 있다(Wang, H., Qiu, X., Ni, P., Qiu, X., Lin, X., Wu, W. Ma, L. (2014). Immunological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells and the therapeutic effects of their transplantion on hyperglycemia in diabetic rats. International Journal of Molecular Medicine, 33, 263-270 등). 따라서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 치료제로서 상업적 가치가 있다. 하지만 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 초반에 획득 할 수 있는 양에 한계가 있기에, 계대 배양이 필수적이나 종래의 세포 배양 기술은 공정 중 세포의 증식 및 분화능이 감소하며 노화가 진행되는 등 줄기세포 특성을 잃어가기에 산업적 이용을 위한 대량 생산 및 치료제 개발에 있어 어려움이 있다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 줄기세포 효능을 증가시킬 수 있는 새로운 줄기세포의 배양 방법을 개발하고, 제조된 줄기세포가 기존 배양방법에 비해 우수한 효능을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 줄기세포를 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 효능 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 줄기세포를 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양하여, 효능이 증진된 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는, 세포치료제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 수득된 줄기세포; 이의 배양액; 상기 줄기세포 및 배양액 유래 물질 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 세포치료제 및 이를 이용한 치료 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 줄기세포를 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 효능 증진 방법을 제공한다.
상기 배양 단계는 3차원 세포배양 구조체 상에서 배양하는, "3D 배양"을 의미할 수 있고, 상기 멤브레인은 3D 배양에서의 세포 배양용 지지체로 사용될 수 있다. 본 발명에서, "세포 배양용 지지체"는 "스캐폴드(Scaffold)"로도 지칭할 수 있으며, 세포 또는 조직의 시험관 내 배양, 생체 외 배양, 또는 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체를 말한다.
상기 멤브레인은 3차원 세포 배양을 위해 스캐폴드로 사용할 수 있는 것이면 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 멤브레인을 구성하는 섬유는 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리우레탄 공중합체, 셀룰로오스 아세테이트(Cellulose acetate), 셀룰로오스(Cellulose), 아세테이트 부틸레이트(Acetate butyrate), 셀룰로오스 유도체, 스타이렌 아크릴로나이트릴(SAN, Styrene-acrylonitrile), 폴리아크릴로나이트릴(PAN, Polyacrylonitrile), 폴리비닐아세테이트(PVAc, Poly(vinyl acetate)), 폴리비닐피롤리돈(PVP, Polyvinylpyrrolidone), 폴리비닐알코올(PVA, Polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌옥사이드(PEO, Polyethylene oxide), 폴리아크릴릭액시드(PAA,Polyacrylic acid), 히드록시프로필셀룰로오스(HPC, Hydroxypropyl cellulose), 폴리메틸메타클릴레이트(PMMA, Polymethylmethacrylate), 폴리퍼퓨릴알콜(PPFA, Polyfurfuryl alcohol), 폴리스티렌(PS, polystyrene), 폴리스티렌 공중합체, 폴리아닐린(PANI, Polyaniline), 폴리비닐클로라이드(PVC, Polyvinylchloride), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF, Poly(vinylidene fluoride)), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET, Polyethylene terephthalate), 폴리프로필렌(PP, Polypropylene) 또는 폴리에틸렌(PE, Polyethylene), 폴리이미드(Polyimide) 중 선택되는 어느 하나 이상의 고분자 유래일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 구현예로 상기 멤브레인은 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 섬유를 포함하는 멤브레인, 즉 "PVDF 멤브레인" 일 수 있다.
상기 멤브레인은 PVDF를 전기방사법을 이용하여 필름화 시킨 것일 수 있다. 추가로 세포 배양에 필요한 단백질, 예를 들어 파이브로넥틴을 코팅한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양은 부유배양 또는 부착배양 일 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 배양된 줄기세포는 부유배양세포 및 부착배양세포 모두 포함할 수 있다. 본 발명에서,"부유배양(suspension culture)"이란 세포가 어떠한 표면에 부착되지 않고 배지 중에 떠 있는 상태로 배양되는 것이다. 이때, 일정 수의 세포가 서로 응집되어 세포괴를 형성하여 증식할 수 있다.
상기 배양 단계에서 사용되는 배지는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지를 모두 포함한다. 본 발명에서, "배지" 는 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장과 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물로, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지는 제한 없이 사용 될 수 있다. 일 예로, KSB-3, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 배지에 필요한 성분을 적절히 가감하여 변형한 배지 역시 사용 할 수 있다.
본 발명의 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 배양용 배지는 필요에 따라 혈청을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 또한, 상기 배양용 배지는 혈청 대신에 혈청 대체물(serum replacement)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 배양 단계는 72시간 이하의 시간 동안 배양하는 것일 수 있고, 구체적으로는 60시간 이하, 48시간 이하, 36시간 이하의 시간 동안 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 줄기세포 효능을 감소시키지 않는 범위에서 적절하게 가감될 수 있다.
상기 배양 단계는 20℃ 내지 45℃ 범위에서 배양하는 것일 수 있고, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로는 30℃ 내지 40℃ 범위에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 줄기세포 효능을 감소시키지 않는 범위에서 적절하게 가감될 수 있다.
본 발명에서, "줄기세포 효능 증진"이란, 성장인자 발현 증가, 신호 전달 경로에 관여하는 인자의 발현 조절, 줄기세포 크기의 감소, 증식능 개선, 분화능 개선, 면역조절능 개선, 이동능 개선, 생착능 개선, 혈관 신생(Angiogenesis)능 개선, 및 생체나노입자의 분비량 증가 중 어느 하나 이상 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고, 줄기세포를 이용한 질병의 치료 방법 또는 치료제 개발에 있어서 유용한 특성이 강화되는 것은 모두 포함할 수 있다. 예를 들면, 면역원성 감소, 줄기세포성(stemness) 증가, 세포생존율 감소 억제, 세포노화 감소 등의 특성 강화 역시 포함된다.
일 구현예로, 상기 줄기세포 효능 증진은, 줄기세포 크기 감소를 수반하는 것일 수 있다. 또한 줄기세포 크기 감소에 따른 줄기세포 특성의 변화를 포함하는 것일 수 있다.
상기 줄기세포 효능 증진은, 본 발명의 배양 방법을 사용하지 않은 줄기세포에 비해 효능이 증진되는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 줄기세포 효능 증진은 다음 중 어느 하나 이상의 유전자 발현의 증가를 포함할 수 있다: EFNA1, ADAM8, ANGPTL4, ANGPTL6, CYP1B1, APOD, KDR, EREG, ADTRP, SLC7A8, ITGA11, IL1B, FLRT3, THBD, CXCL6, ITGB8, HGF, CAMK1D, LACC1, GPR68, BDKRB2, NLRC4, SCN1A, ASS1, KCNAB2, SLC6A9, CTSW, SYT12, TNFSF13B, ABCC3, QPCT.
일 구현예로, 상기 줄기세포 효능 증진은 다음 중 어느 하나 이상의 유전자 발현의 감소를 포함할 수 있다: EPHA2, ESM1, SLC7A10, HES1, WWC1, NEDD9, IL31RA.
본 발명의 일 구현예에서는 본 발명의 배양 방법을 사용하여 배양된 줄기세포는 다른 배양 방법을 사용한 줄기세포에 비해 크기가 감소하고, 우수한 분화능, 이동능 및 증식능 등을 나타내는 것을 확인하여, 줄기세포의 효능이 개선되는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 배양 방법을 사용하여 배양된 줄기세포가 다른 배양 방법을 사용한 줄기세포에 비해 EFNA1, ADAM8, ANGPTL4, ANGPTL6, CYP1B1, APOD, KDR, EREG, ADTRP, SLC7A8, ITGA11, IL1B, FLRT3, THBD, CXCL6, ITGB8, HGF, CAMK1D, LACC1, GPR68, BDKRB2, NLRC4, SCN1A, ASS1, KCNAB2, SLC6A9, CTSW, SYT12, TNFSF13B, ABCC3, QPCT 등의 유전자 발현이 증가하고, EPHA2, ESM1, SLC7A10, HES1, WWC1, NEDD9, IL31RA등의 유전자 발현이 감소된 것을 확인하였다(실시예 7).
따라서, 본 발명은 EFNA1, ADAM8, ANGPTL4, ANGPTL6, CYP1B1, APOD, KDR, EREG, ADTRP, SLC7A8, ITGA11, IL1B, FLRT3, THBD, CXCL6, ITGB8, HGF, CAMK1D, LACC1, GPR68, BDKRB2, NLRC4, SCN1A, ASS1, KCNAB2, SLC6A9, CTSW, SYT12, TNFSF13B, ABCC3 및 QPCT로 이루어진 유전자들 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 효능 증진 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 EPHA2, ESM1, SLC7A10, HES1, WWC1, NEDD9 및 IL31RA 유전자 중 하나 이상의 발현을 감소시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 효능 증진 방법을 제공한다. 상기 줄기세포 효능 증진에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 유전자 발현 증가 및 감소는 당업계에 공지된 방법을 이용하거나, 또는 본 발명에서 제공하는 배양 방법을 이용하여 줄기세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "성장인자"란 세포 분열이나 생장, 분화에 관여하는 물질을 의미한다.
본 발명의 성장인자는 뇌 유래 신경 성장인자(brain-derived neurotropic factor, BDNF), 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 혈관상피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 유사인슐린 성장 인자 (insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자(transforming growth factor, TGF), 혈소판 유래성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 뼈 유래 성장인자(bone-derived growth factor, BDF), 콜로니 자극 인자(colony stimulation factor, CSF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 및 각질세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF) 를 포함한다.
본 발명에서 세포 "증식" 이란 세포수의 증가, DNA 복제, 세포분열 및 각종 세포 성분의 증가를 동반하는 세포내의 반응을 포함한다. 구체적으로 세포 수의 증가를 의미할 수 있다. 상기 세포 증식은, 자신과 똑같은 복사본을 만들어낼 수 있는 능력인 세포 재생을 포함할 수 있다. 일 구현에로서, 상기 세포 증식은 "미분화 증식(undifferentiated proliferation)" 일 수 있다. 상기 미분화 증식은 줄기세포가 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 즉, 전분화능을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "분화" 란 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말한다. 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 전능성 줄기세포가 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포로 변하는 과정도 분화에 포함된다. 본 발명에서 상기 "분화능 개선" 은, 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화시킬 수 있는 능력을 개선하는 것 또한 포함한다.
본 발명에서, "면역조절능" 이란 생체의 면역반응을 억제시키거나, 활성시키는 능력을 의미하며, 생체가 항진한 면역응답능은 억제하고, 저하한 면역응답능은 부활증강하여 정상적인 면역응답능에는 아무런 영향을 주지 않는 작용을 포함한다. 상기 면역조절능은 사이토카인 발현의 증가 또는 감소, 면역조절 세포의 증식 증가 또는 억제를 수반할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 면역조절능은, 면역질환, 염증성 질환의 치료와 연결될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서, "이동능"이란 줄기세포의 이동 활성 (migration activity)에서의 증진 효과 일 수 있다. 구체적으로, 이식부위로부터 손상부위로 줄기세포의 이동 능력 증가, 골수로부터 말초 혈액으로의 줄기세포의 이동능력 증가 및 말초 혈액으로부터 림프 노드, 심장, 허파, 간, 피부, 비장, 작은 창자 및 큰 창자, 위, 또는 췌장과 같은 특정한 조직 또는 기관으로 이동 증가 등의 효과를 모두 포함한다. 상기 이동능 증진은, 이식 부위에서 손상 부위로 이동 촉진에 따라 유효 이식 줄기세포 수의 절감, 이에 따른 줄기세포 체외 배양 기간 단축 및 줄기세포의 안전성 증가 등의 효과로 이어질 수 있는바 전술한 효과 또한 포함한다. 또한, 골수에서 말초 혈액으로 이동이 촉진됨으로써 말초 혈액에서 이동된 많은 수의 줄기세포의 분리를 용이하게 하며, 골수 유래 줄기세포 이식을 위한 줄기세포 채집을 용이하게 할 수 있다. 또한, 말초 혈액에서 말초 장기로의 이동을 촉진하여 질환의 치료 효능을 제고할 수 있는바, 전술한 효과 또한 포함한다.
본 발명에서, "생착능"이란 이식된 줄기세포가 분화된 후속세포, 이식된 후 체내에서 생산한 세포 또는 주입된 세포가 손실 혹은 손상된 세포를 대체할 수 있는 능력일 수 있다. 상기 생착능 증진은 유효 이식 줄기세포 수의 절감, 이에 따른 줄기세포 체외 배양 기간 단축 및 줄기세포의 안전성 증가 등의 효과로 이어질 수 있는바, 전술한 효과 또한 포함한다.
본 발명에서, "생체나노입자" 란, 세포에서 유래된 물질로, 세포 내외부의 자극에 의해 생성되어 세포막을 통해 분비되는 것을 의미한다. 상기 생체나노입자는 그 크기에 따라 엑소좀(exosome), 마이크로파티클(microparticle), 쉐딩베지클(shedding vesicle), 마이크로베지클(microvesicle) 등으로 분류할 수 있다. 상기 생체나노입자에는 세포 유래 물질, 예를 들어 성장인자 등이 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "혈관 신생(Angiogenesis)능" 은 기존 존재하는 혈관(vessel)으로부터 새로운 혈관을 형성하는 줄기세포의 능력으로, 발아(sprouting) 및 분열 과정에 의해 혈관계를 성장시키는 능력을 의미한다. 줄기세포의 혈관 신생능은 조직의 형성, 성장, 발달 및 상처 치유와 밀접한 관련이 있다. 줄기세포의 혈관 신생능을 평가하는 하나의 방법으로 튜브 형성능 분석(tube formation assay)이 있다. 튜브 형성능 분석은 당업계에 알려진 방법으로 수행할 수 있다(J Vis Exp. 2014; (91): 51312. 등).
본 발명에서 신호 전달 경로에 관여하는 인자의 발현 조절은, 줄기세포 효능을 증진시킬 수 있는 신호 전달 경로의 활성화 혹은 불활성화에 기여하는 인자의 발현 변화를 포함한다. 일 구현예로, 상기 신호 전달 경로에 관여하는 인자의 발현 조절은, 줄기 세포 크기 감소를 유도하는 신호전달 경로의 활성화를 유도하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 신호 전달 경로에 관여하는 인자는, PI3K, Akt, PTEN, mTOR, STAT, MAPK, MEK, Raf, Ras, SOS, Grb-2, ERK, IGF, IGF-1R, IRS, Pten, TSC, Bcl-2, elF4G, mTORC2, Bax, RP-S6, P-S6K1, 4E-BP1, Rheb, p53, Gsk, Caspase 중에서 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않고, IGF pathway, PI3K pathway, AKT pathway, mTORC1 pathway, 또는 IGF/PI3K/AKT/mTORC1 pathway에 관여하는 인자는 제한 없이 포함한다. 다른 구현예로, Wnt signaling, Inflammatory Response Pathway, Integrin signaling pathway, Interferon (IFN) signaling pathway, JAK-STAT signaling pathway, Erk signaling, MAPK Cell Signaling Pathway, Toll-like Receptor (TLR) signaling pathway 등의 경로에 관여하는 인자 또한 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 또 다른 구현예로, BDNF, FGF, HGF, NGF, VEGF, TGF, PDGF, BDF, CSF, EGF, KGF 및 이들 인자가 조절하는 경로에 관여하는 인자 또한 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
그러나, 상기 신호 전달 경로에 제한되지 않고, 줄기 세포 크기 감소를 유도할 수 있는 신호 전달 경로와 이에 관여하는 인자의 발현 조절이면, 제한 없이 포함된다.
본 발명의 "줄기세포"는 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화 세포이다. 상기 줄기세포는 만능줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있다.
상기 줄기세포는. 인간 또는 동물 유래 일 수 있고, 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 줄기세포는, 구체적으로 성체줄기세포일 수 있다. 성체줄기세포는 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화하게 되는 미분화상태의 세포로, 골수나 뇌세포 등 이미 성장한 신체조직에서 추출 될 수 있다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중 간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 줄기세포일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양한 줄기세포; 이의 배양액; 상기 줄기세포 및 배양액 유래 물질 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 줄기세포를 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양하여, 효능이 증진된 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는, 세포치료제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질병의 치료 방법을 제공한다.
상기 질병은, 줄기세포, 이의 배양물 및 이로부터 유래된 물질을 투여하여 발병을 억제 또는 지연시킬 수 있거나, 그 증세가 호전되거나 이롭게 되는 질병이면, 제한 없이 포함 될 수 있다. 예를 들어 특정 조직을 구성하는 세포의 손실 및 이로 인한 조직 손상이 원인이 되어 발생하는 질환을 포함한다.
본 발명에서 "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 세포치료제는 1ml 당 1.0Х10개 내지 1.0Х109개의 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 세포치료제는 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다. 또한, 상기 세포치료제는 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 이용될 수 있다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton ickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 세포치료제에는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 세포치료제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.
상기 세포치료제는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 간세포, 췌도베타세포, 혈관세포 또는 폐세포의 재생 또는 보호에 이용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 세포치료제는 지방세포, 골세포 또는 연골세포의 재생 또는 보호에 이용 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 하나의 양태는 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양한 줄기세포; 이의 배양액; 상기 줄기세포 및 배양액 유래 물질 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 골질환 또는 연골질환 치료용 조성물을 제공하며, 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골질환 또는 연골질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 용어, "골질환"은 골밀도가 감소되어 일어날 수 있는 모든 질환을 포함하는 것으로, 골세포 또는 골조직 변형, 손실 등이 원인이 되어 발생하는 질환일 수 있으며, 구체적으로는 골다공증(osteoporosis), 류마티스 관절염, 치주질환, 골연화증(osteomalacia), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 골화석증(osteopetrosis), 골경화증(osteosclerosis), 파제트병(Paget's disease), 무형성 골질환(adynamic bone disease), 대사성 골질환(metabolic bone disease), 구루병(rickets) 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "연골질환"이란, "연골손상 질환"이라고도 하고, 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해됨으로써 발생하는 질환을 의미한다. 상기 연골질환은, 연골세포 또는 연골조직 변형, 손실 등이 원인이 되어 발생하는 질환일 수 있으며, 구체적으로 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 외상에 의한 관절손상일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 세포치료제는 폐질환 치료; 폐질환에 의한 염증 억제 또는 치료; 폐조직 재생; 및 폐조직 섬유증 억제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 유용한 것을 특징으로 하며, 폐질환에 의한 염증반응 및 섬유증(fibrosis)을 억제하거나 호전시킬 수 있다. 나아가, 본 발명의 세포치료제는 심혈관 질환의 치료 또는 연골 재생용으로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 세포치료제는 면역조절 기능을 증가시키거나, 면역유발성, 면역세포침투 또는 면역원성 중 하나를 저하시킬 수 있으며, 염증반응을 억제시킬 수 있으므로 이에 대한 치료용으로 이용될 수 있으나, 제한되지 않는다.
본 발명은 특정 배양 방법을 통해 줄기세포의 크기 감소를 야기하고, 세포의 증식력, 분화능, 이동능 및 혈관 신생능을 현저히 개선할 수 있으므로, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 치료제 개발에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 부착 상태 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 크기를 배양 조건에 따라 확인한 것이다.
도 2는 비부착 상태 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 크기를 배양 조건에 따라 확인한 것이다.
도 3은 배양 조건에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식능을 비교한 것이다.
도 4는 배양 조건에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 비교 분석한 것이다. 도 4a는 골분화, 도 4b는 지방분화, 도 4c는 연골분화능을 확인한 것이다.
도 5는 배양 조건에 따른 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 세포 이동능을 비교 분석한 것이다.
도 6은 배양 조건에 따른 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 튜브 형성능 비교 분석한 것이다.
도 7은 배양 조건에 따른 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 유전자 발현 수준을 비교 분석한 것이다.
도 8은 배양 조건에 따른 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 면역 표현형을 비교 분석한 것이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 부착 상태 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 모양 분석
제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 6 Well 플레이트; 및 전기방사법으로 필름화한, 파이브로넥틴이 코팅된 PVDF 멤브레인 (이하 Membrane) 이 코팅된 6 Well 플레이트 당 1X105 세포수의 밀도로 동일하게 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 48 시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척 한 후 3% Glutaraldehyde로 고정 하였다. 그 후 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올로 순차적으로 처리하여 탈수를 진행 한 후 완전히 건조하여 2000배의 배율에서 SEM 촬영을 진행 하였다. 그 결과 일반 플레이트 배양 세포에 비해 membrane 배양 시 상대적으로 줄기세포의 3차원 구조가 유지되는 것을 확인할 수 있다. (도 1)
실시예 2. 비부착 상태 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 크기 분석
상기 실시예 1 에서 배양중인 일반배양 조건 및 membrane배양 조건의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 트리플을 처리하여 단일 세포를 수득했다. 그 후, 수득한 단일 세포를 NC200 기기를 이용하여 세포의 크기를 비교 분석 하였다. 그 결과 일반 플레이트 배양 세포에 비해 membrane 배양 후 중간엽 줄기세포의 직경이 작음을 확인 할 수 있다. (도 2)
실시예 3. 배양 조건에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식능 비교
배양 조건에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식능을 비교분석하기 위해, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 일반 6 Well 플레이트 및 membrane이 코팅된 6 Well 플레이트에 Well 당 1X105 세포수의 밀도로 동일하게 접종하여 P4부터 P8까지 각 조건으로 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양 하였다. 분열 시간을 측정하기 위해 세포에 다음 식을 대입하여 계산하였다 (T-T0)log2/logN-logN0, (T: final time(h), T0: initial time(h), N: final cell number, N0: initial cell number). 그 결과 membrane에서 지속적으로 계대한 중간엽 줄기세포의 분열시간이 일반 플레이트에서 지속 계대한 중간엽 줄기세포의 분열시간보다 확연히 감소함을 확인 할 수 있다. (도 3)
실시예 4. 배양 조건에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분화능 분석
분화능을 비교 분석 하기 위해, 일반배양조건 및 membrane 배양 조건에서 각각 골분화(osteogenic differentiation), 지방분화(Adipogenic differentiation), 연골분화(chondrogenic differentiation) 등의 분화능을 비교 분석하였다.
4-1. 골분화 유도 및 분석
골분화의 유도를 위해, 세포를 5x104 개씩 6 Well 플레이트 및 membrane 코팅 6 Well 플레이트에 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양한 후 골분화 배지(Stempro)로 교체하였다. 2-3일마다 분화 배지를 교체하면서 2주간 분화를 유도하였다. 분화된 세포를 PBS로 2회 세척한 후 well당 4% Paraformaldehyde를 2 ml씩 넣고 RT에서 10분간 고정화를 진행했다. 그 후 PBS 2회 세척하고 2% Alizarin Red S 염색 시약을 각 well당 2 ml 처리 하여 RT에서 15분간 incubation 했다. 염색 시약 제거 후, 3차 증류수로 2회 세척한 후 현미경으로 검경 하였다.
골분화와 관련된 인자의 mRNA 수준 발현을 비교 분석 하기 위해, 골분화 한 세포에서 총 RNA를 수득하고, RT-Premix(Biorad)를 이용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 mRNA 수준에서 Osteocalcin(OCN), Osterix 의 발현을 비교하였다. 이때, 내부 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
OCN F: 5'- AGC AAA GGT GCA GCC TTT GT -3'
OCN R: 5'- GCG CCT GGG TCT CTT CAC T -3'
Osterix F: 5'- TGG CCA TGC TGA CTG CAG CC -3'
Osterix R: 5'- TGG GTA GGC GTC CCC CAT GG -3'
그 결과, 일반 플레이트에 비해 membrane에서 중간엽 줄기세포의 골 분화능이 증가 됨을 확인 할 수 있다. (도 4a)
4-2. 지방분화 유도 및 분석
지방분화의 유도를 위해, 세포를 1x105 개씩 6 Well 플레이트 및 membrane 코팅 6 Well 플레이트에 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양한 후 지방분화 배지(Stempro)로 교체하였다. 2-3일마다 분화 배지를 교체하면서 2주간 분화를 유도하였다. 분화된 세포를 PBS로 2회 세척한 후 well당 4% Paraformaldehyde를 2 ml씩 넣고 RT에서 10분간 고정화를 진행했다. 그 후 3차 증류수로 2회 세척한 후, 60% Isopropanol로 1회 세척하고 Oil red O 염색 시약을 각 well당 2 ml 처리 하여 RT에서 30분간 incubation 했다. Oil red O 염색 시약 제거 후, 3차 증류수로 2회 세척한 후 현미경으로 검경 하였다.
지방분화와 관련된 인자의 mRNA 수준 발현을 비교 분석 하기 위해, 지방 분화 후 획득한 세포에서 총 RNA를 수득하고, RT-Premix(Biorad)를 이용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 mRNA 수준에서 peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ), lipoprotein lipase(LPL) 의 발현을 비교하였다. 이때, 내부 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
PPARγ F: 5'- CAG GAA AGA CAA CAG ACA AAT CA -3'
PPARγ R: 5'- GGG GTG ATG TGT TTG AAC TTG -3'
LPL F: 5'- AGA CAC AGC TGA GGA CAC TT -3'
LPL R: 5'- GCA CCC AAC TCT CAT ACA TT -3'
그 결과, 일반 플레이트에 비해 membrane에서 중간엽 줄기세포의 지방 분화능이 증가 됨을 확인 할 수 있다. (도 4b)
4-3. 연골분화 유도 및 분석
연골분화의 유도를 위해, 6 Well 플레이트 및 membrane 코팅 6 Well 플레이트에서 세포를 1x105/ 10μL의 Micromass 형성을 유도하였다. 약 4시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양 후 안정적인 Micromass의 형성을 확인 하고 연골분화 배지(Stempro)를 추가하였다. 2-3일마다 분화 배지를 교체하면서 10일간 분화를 유도하였다. 분화된 Micromass를 PBS로 2회 세척한 후 well당 4% Paraformaldehyde를 2 ml씩 넣고 RT에서 10분간 고정화를 진행했다. 그 후 1% Alcian blue (in 3% acetic acid) 염색 시약으로 30분간 염색하여 현미경으로 검경 하였다.
연골분화와 관련된 인자의 mRNA 수준 발현을 비교 분석 하기 위해, 연골 분화 한 세포에서 총 RNA를 수득하고, RT-Premix(Biorad)를 이용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 mRNA 수준에서 Collagen type 2(Col2), aggrecan 의 발현을 비교하였다. 이때, 내부 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
Col2 F: 5'- CGT CCA GAT GAC CTT CCT ACG -3'
Col2 R: 5'- TGA GCA GGG CCT TCT TGA G -3'
Aggrecan F: 5'- CTG CAT TCC ACG AAG CTA ACC T -3'
Aggrecan R: 5'- GAC GCC TCG CCT TCT TGA A -3'
그 결과, 일반 플레이트에 비해 membrane에서 중간엽 줄기세포의 연골 분화능이 증가 됨을 확인 할 수 있다. (도 4c)
실시예 5. 배양 조건에 따른 세포 이동능 비교 분석
배양 조건에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 이동능을 비교분석하기 위해 보이든 챔버 분석법(Boyden chamber assay)을 이용하였다. 5X105 개의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 일반 100 플레이트 및 membrane 코팅 100 플레이트에 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양 하였고, 배양 4일차 FBS가 없는 배지로 교환하여 하루 동안 추가 배양 하였다. 배양 후 계대 세포 중 5X104 개의 세포를 보이든 챔버의 상부 챔버에 부하하고 하부에는 10% FBS가 포함된 배지를 부하하여 18시간 동안 세포의 이동을 유도 하였다. 세포 이동 후 상부챔버를 Crystal violet 염색 시약으로 염색 한 후 상부 막 표면상의 세포를 제거하여 하부 이동 세포의 현미경 검경 및 염색시약 검출을 통한 분석을 진행 하였다.
그 결과, membrane에서 배양된 중간엽 줄기세포의 이동능이 일반 플레이트 배양 세포에 비해 증가 됨을 확인 할 수 있다. (도 5)
실시예 6. 배양 조건에 따른 혈관 신생능 비교 분석
배양 조건에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 튜브 형성능을 비교분석 하기 위해 5X105 개의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 일반 100 플레이트 및 membrane 코팅 100 플레이트에 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일 동안 배양 하였다. 배양 후 계대 세포 중 2X104 개의 세포를 100 μL 의 마트리겔로 코팅된 48 Well plate에 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 Human umbilical vein endothelial growth medium (CEFO bio) 배지로 배양 하며 각 관찰 시간마다 현미경을 이용하여 튜브 형성을 분석하였다.
그 결과, membrane에서 배양된 중간엽 줄기세포의 튜브 형성능이 일반 플레이트 배양 세포에 비해 증가 됨을 현미경 검경을 통해 확인 할 수 있었으며 (도 6 오른쪽) 2시간 및 6시간 분석 결과 일반 플레이트에 비해 membrane에서 배양된 중간엽 줄기세포의 loop 및 branching point 형성 수 가 많음을 확인 할 수 있다. (도 6 왼쪽)
실시예 7. 배양 조건에 따른 유전자 발현 비교 분석
배양 조건에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 유전자 발현을 비교분석 하기 위해 5X105 개의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 일반 100 플레이트 및 membrane 코팅 100 플레이트에 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양 하였다. mRNA 수준 발현을 비교 분석 하기 위해, 상기 실시예 7에서 획득한 세포에서 총 RNA를 수득하고 Functional annotation 및 Selected gene plot analysis분석을 진행하였다. Functional annotation 분석 결과, membrane에서 배양된 중간엽 줄기세포의 증식능이 일반 플레이트 배양 중간엽 줄기세포에 비해 증가함을 확인 할 수 있었고 Selected gene plot analysis 분석 결과 membrane 배양시 중간엽 줄기세포의 혈관신생(Angiogenesis), 이동(migration), 염증반응(inflammatory response) 그리고 분비(secretion) 관련 유전자 발현 변화를 확인하였으며, 대체로 증가하는 경향을 확인하였다. (도 7a-7c)
구체적으로 다음과 같은 발현 변화를 확인하였다.
혈관신생(Angiogenesis) 관련 유전자의 발현 수준 변화
증 감
EFNA1 EPHA2
ADAM8 ESM1
ANGPTL4
ANGPTL6
CYP1B1
APOD
KDR
EREG
ADTRP
이동(Migration) 관련 유전자의 발현 수준 변화
증 감
EFNA1 EPHA2
ADAM8 SLC7A10
SLC7A8 HES1
ITGA11 WWC1
CYP1B1 NEDD9
IL1B
FLRT3
THBD
KDR
CXCL6
ADTRP
ITGB8
HGF
면역반응(Inflammatory response) 관련 유전자의 발현 수준 변화
증 감
CAMK1D EPHA2
ADAM8 IL31RA
LACC1
GPR68
BDKRB2
NLRC4
IL1B
SCN1A
CXCL6
ASS1
분비(Secretion) 관련 유전자의 발현 수준 변화
증
KCNAB2
SLC6A9
ADAM8
CTSW
SYT12
TNFSF13B
BDKRB2
ABCC3
QPCT
HGF
실시예 8. 배양 조건에 따른 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 면역 표현형 비교 분석
FACS 장비를 이용하여 표지 마커 단백질 (양성 항원: CD29, CD44, CD73, CD105, 음성 항원: CD11b, CD34, CD45, HLA-DR)을 분석하였다. 상기 실시예7 에서 확보한 일반 배양 조건 및 membrane 코팅 플레이트 배양 된 제대혈 중간엽 줄기세포를 PBS 를 이용하여 세척 하고, 상온에서 항체 반응을 진행하였다. 반응 후 다시 PBS로 세척 하여 분석 현탁액을 제조하였고, FACS 기기 (MACSQuant VYB 유세포분석기)를 이용하여 항체의 신호를 탐색하여 전체 세포 중 해당 마커를 발현하는 세포 비율을 얻었다. 분석은 MACSQuantify 소프트웨어를 이용하였다. 그 결과 일반 플레이트 및 membrane에서 배양된 중간엽 줄기세포의 양성 항원 및 음성 항원의 차이는 보이지 않았음을 확인하였다. (도 8)
이를 통해, 본 발명의 배양 방법을 이용하는 경우 줄기세포의 면역 표현형이 유지 됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Kangstem Biotech CO., LTD. <120> A method for producing stem cell with enhanced efficacy <130> KPA191217-KR-P1 <150> KR 10-2019-0168248 <151> 2019-12-16 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN F <400> 1 agcaaaggtg cagcctttgt 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN R <400> 2 gcgcctgggt ctcttcact 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osterix F <400> 3 tggccatgct gactgcagcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osterix R <400> 4 tgggtaggcg tcccccatgg 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARgamma F <400> 5 caggaaagac aacagacaaa tca 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARgamma R <400> 6 ggggtgatgt gtttgaactt g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL F <400> 7 agacacagct gaggacactt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL R <400> 8 gcacccaact ctcatacatt 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2 F <400> 9 cgtccagatg accttcctac g 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2 R <400> 10 tgagcagggc cttcttgag 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan F <400> 11 ctgcattcca cgaagctaac ct 22 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan R <400> 12 gacgcctcgc cttcttgaa 19

Claims (13)

  1. 줄기세포를 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 효능 증진 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 멤브레인은 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 멤브레인인 것인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 효능 증진은 줄기세포 크기의 감소를 수반하는 것인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 효능 증진은 줄기세포 크기의 감소, 증식능 개선, 분화능 개선, 이동능 개선 및 혈관 신생(Angiogenesis)능 개선 중 어느 하나 이상인 것인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 효능 증진은
    (a) EFNA1, ADAM8, ANGPTL4, ANGPTL6, CYP1B1, APOD, KDR, EREG, ADTRP, SLC7A8, ITGA11, IL1B, FLRT3, THBD, CXCL6, ITGB8, HGF, CAMK1D, LACC1, GPR68, BDKRB2, NLRC4, SCN1A, ASS1, KCNAB2, SLC6A9, CTSW, SYT12, TNFSF13B, ABCC3 및 QPCT 중 하나 이상의 발현 증가; 또는
    (b) EPHA2, ESM1, SLC7A10, HES1, WWC1, NEDD9 및 IL31RA 중 하나 이상의 발현 감소를 포함하는 것인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 것인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 배양은 KSB-3 Basal Medium, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimalessential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), Human umbilical vein endothelial growth medium, Adipocyte differentiation medium, Osteocyte differentiation medium, Chondrocyte differentiation medium 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 배지에서 배양되는 것인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  8. 줄기세포를 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양하여, 효능이 증진된 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는, 세포치료제의 제조방법.
  9. 제8항에 있어, 상기 줄기세포 효능 증진은 줄기세포 크기의 감소, 증식능 개선, 분화능 개선, 이동능 개선 및 튜브 형성능 개선 중 어느 하나 이상인 것인, 세포 치료제의 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 수득된 줄기세포를 배양하여 줄기세포를 분화시키는 단계를 추가로 더 포함하는, 세포치료제의 제조방법.
  11. 파이브로넥틴이 코팅된 멤브레인에서 배양한 줄기세포; 이의 배양액; 상기 줄기세포 및 배양액 유래 물질 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 세포치료제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 간세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 세포의 재생 또는 보호를 위한 것인, 세포치료제.
  13. 제12항의 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골질환 또는 연골질환의 치료방법.
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