KR20210068252A - 수박 잎 결각 형질 선발용 신규 유전자 마커 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수박에서 잎 결각(lobed leaf) 형질을 갖는 개체를 선발하는 것에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물, 프라이머 세트 및 키트와 이를 이용하여 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 잎 결각 유전자 마커의 제공으로, 엽결각 형질을 갖는 품종 개발시 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 빠르고 간편하게 엽결각 유무를 확인할 수 있게되어 엽결각을 나타내는 수박 품종의 효율적 판별 및 육성이 가능해 지므로, 육종에 소요되는 시간, 비용, 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 예측되며, 이와 같이 선발된 잎 결각 형질을 갖는 수박은 고온에 높은 저항성을 나타내므로 생산성이 크게 향상될 것으로 기대된다.

Description

수박 잎 결각 형질 선발용 신규 유전자 마커 및 이의 이용 {Novel genetic markers for selection of watermelon with lobed leaf trait and use thereof}

본 발명은 수박에서 잎 결각(lobed leaf) 형질을 갖는 개체를 선발하는 것에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물, 프라이머 세트 및 키트와 이를 이용하여 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다.

수박은 아시아(82.4%)를 비롯하여 유럽(5.8%), 오세아니아(0.1%), 아프리카(5.3%), 아메리카(6.3%) 등지에서 전세계적으로 생산되고 있으며, 아시아 중에서도 중국(약 5천만 톤)에서 가장 많은 수박을 생산하고 있다. 우리나라에서도 수박은 여름뿐만 아니라 연중내내 소비되는 과채류이다. 그러나 지구 온난화에 따른 이상기후 현상 및 시설재배, 하우스 재배의 증가에 의해 재배지의 온도가 상승하고 과습한 기후 조건이 조성됨에 따라 고온에 잘 견디는 품종이 필요한 실정이다.

한편, 최근 차세대 염기서열 분석법의 발달에 따라 염기서열 분석 비용이 절감되어 식물의 염기서열 분석 또한 빠르게 진행되고 있으며, 박과 식물의 경우 오이(2009년), 멜론(2012년), 수박(2013년)의 전장 염기서열이 공개되었다. 수박의 경우 최근 게놈(genome)의 서열분석을 통한 게놈서열 기반 고밀도 유전자지도가 작성되고 있으며, 이를 기반으로 한 다량의 SNP(single nucleotide polymorphism; 단일염기다형성) 정보의 결과로 다양한 식물 계통, 품종의 구분뿐만 아니라, 분자마커(molecular marker)로서의 활용도가 증가되고 있다. 과거 전통육종에서는 원하는 형질의 게놈부위를 교배육종을 통해 형질도입을 하였는데, 이를 확인하기 위해서 해당 표현형을 관찰하기까지 많은 노동력과 긴 시간이 소요되는 문제점이 있었다. 이를 해결하기 위해 원하는 형질과 연관된 분자마커의 개발이 이루어 지고 있으며, 나아가 개발된 마커로 유묘기때 개체를 선발하여 노동력 절감, 육종효율 증진 및 육종기간 단축을 위한 연구 개발이 이루어지고 있다.

식물이 고온에서 버티기 위해서는 충분한 수분과 원활한 기체 교환이 필수적이다. 식물의 잎은 광합성을 담당하고 있는 기관으로서 그 모양이나 크기에 따라 수분 이용 능력과 가스 교환 능력이 달라지게 되며, 이러한 잎의 모양 결정에는 다양한 환경요소들이 영향을 준다고 알려져 있다. 이에 따라, 수박의 잎 모양은 개체의 생존에 있어서 중요한 외관적 요소로 취급되고 있다. 이전의 연구를 통하여 수박의 잎 결각 형질은 우성형질이며, 무결각의 형질에 대해 멘델의 유전법칙(Mendel's laws)에 따라 유전된다고 알려져 있다. 그러나 잎 결각을 포함한 수박의 잎 모양을 결정하는 유전적 요인에 대한 연구는 거의 전무한 실정이다.

KR 10-1923647 B1

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 잎 결각(lobed leaf) 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 3의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 잎 결각(lobed leaf) 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 수박의 유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)에 적용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기를 포함하는 8 내지 100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는, 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 4 및 5로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 9로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 고해상도 융해(High-resolution melting; HRM) 분석용 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 판별하고자 하는 수박으로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 상기 유전체 DNA에서, 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및 (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 단계를 포함하는, 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 (c) 단계는 고해상도 융해, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 수박 잎 결각 형질 선발용 유전자 마커의 제공으로, 엽결각 계통 품종 개발시 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 잎의 결각 유무를 확인함으로써, 엽결각 형질을 나타내는 수박 품종을 효율적으로 판별하고 육성할 수 있으므로 육종에 소요되는 시간, 비용, 및 노력을 절감할 수 있다. 또한, 종자 생산을 위한 채종과정에서 F1의 순도를 높이기 위한 시간과 노력을 절감할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따라 선발된 엽결각 형질 수박은 고온에 대한 높은 저항성을 나타내므로, 수박의 생산량 증대에 기여할 것으로 기대된다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명에서 사용한 부본 PS137과 모본 SIT463ST의 표현형을 나타낸 것으로서, 도 1a는 과실 및 꽃의 형태를, 도 1b는 9번째 본엽의 형태를 나타낸 것이다. (노란색 화살표: 함몰부)
도 2는 SIT463ST × PS137 분리세대로부터 양성한 F₂ 분리세대에서 0점, 1점 및 2점의 표현형 스코어의 기준이 되는 대표 개체에서의 9~10번째 본엽을 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 각 개체들의 DNA 전기영동 결과로서, 도 3a는 결각 형질의 DNA 풀(LL), 도 3b는 무결각 형질의 DNA 풀(non-LL)에 사용된 DNA를 전기영동한 밴드를 나타낸 도이다.
도 4는 차세대 시퀀싱 플랫폼을 이용한 시퀀싱 작업 흐름도를 나타낸 도이다.
도 5는 염색체별 ΔSNP-인덱스 값을 나타낸 도이다. (빨간색 선, 신뢰수준 95%; 파란색 선, 신뢰수준 99%)
도 6은 염색체별 G' 값의 유의도에 따른 QTL 분포를 나타낸 도이다. (빨간색 화살표, 가장 높은 피크)
도 7a 내지 도 7g는 본 발명의 일 실시예에 따른 수박 염색체 4번의 21.2Mbp~21.5Mbp 사이의 지역에서 선택된 후보 유전자좌를 나타낸 도이다(SNP의 위치는 빨간색 문자 및 노란색 바탕으로 표시): (도 7a) 서열번호 10의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치(21,239,403 지역); (도 7b) 서열번호 1의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치(21,262,238 지역); (도 7c) 서열번호 2의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치(21,285,956 지역), (도 7d) 서열번호 3의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치(21,287,252 지역); (도 7e) 서열번호 11의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치(21,306,879 지역); (도 7f) 서열번호 12의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치(21,324,868 지역); (도 7g) 서열번호 13의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치(21,439,325 지역).
도 8은 4번 염색체의 21.28Mbp 지역(21,285,956bp) SNP를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 HRM 분석을 수행한 결과 얻은 융해 곡선을 나타낸 도면이다.

본 발명자들은 고온에 잘 견디는 품종을 선발하여 수박의 생산량을 증가시킬 수 있는 수박 잎 결각 형질과 관련된 유전자 마커를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 수박의 4번 염색체 상의 21,262,238번째 염기, 21,285,956번째 염기 및 21,287,252번째 염기가 수박의 잎 결각 형질과 연관되어 있음을 확인하였다. 이에 따라 해당 염기의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 확인할 수 있는 프라이머 세트를 개발하여 F₂ 분리집단에서 검정한 결과 모든 개체에서 수박의 잎 결각 여부를 정확하게 판별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 수박의 잎 결각 형질을 수치화하기 위해 각 개체의 잎 결각 표현형을 0점~2점으로 점수를 매겨 분류하고, F₂ 분리세대의 개체별 표현형 검정에서 결각 : 무결각의 분리비가 3 : 1로 나타남을 관찰하여, 엽결각 형질이 멘델의 유전법칙에 따라 단일 우성유전됨을 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 수박의 잎에서 DNA를 추출하고 각각의 표현형 스코어 별로 유전자 풀(pool)을 만든 후, 차세대 시퀀싱 및 BSA(Bulked Segregant Analysis) 기법을 이용하여 엽결각 형질과 연관된 유전자좌의 후보를 선정하고, ΔSNP-인덱스 분석을 통해 수박 염색체 4번의 21.2Mbp~21.5Mbp 사이의 지역을 후보 유전자좌로 선택하였다(실시예 2 및 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 고해상도 융해(High-resolution melt) 분석을 통해 수박의 4번 염색체의 21,262,238 지역, 21,285,956 지역 및 21,287,252 지역에 해당하는 LL-4-238, LL-4-956 및 LL-4-252 HRM 프라이머가 F₂ 분리집단 188 개체에서 모두 표현형과 유전자형이 100% 일치함을 확인하였다(실시예 4 참조).

따라서 상기 실시예를 통해 확인한 수박 엽결각 형질에 관여하는 SNP 마커 및 이를 검출하는 프라이머는 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 데 이용될 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 3의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신규한 SNP 마커 조성물을 이용하면, 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 종래의 방법보다 더 빠르고 정확하게 판별할 수 있다.

본 발명에 따른 SNP 마커는, 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 염기가 (G→A)이거나, 서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기가 (T→C)이거나, 또는 서열번호 3의 염기서열 내에서 501번째 염기가 (C→T)인 경우 잎 결각 형질을 갖는 것으로 판별할 수 있는 바, 상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 유전자 마커로 사용함으로써 품종 개발시 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 잎 결각 형질의 유무를 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열은 수박의 4번 염색체 상에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 21.26Mbp ~ 21.28Mbp 영역 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “수박(Citrullus lanatus, watermelon)”은 한반도에서 재배되거나 혹은 품종 개량을 목적으로 육종된 수박을 의미하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “다형성(polymorphism)”이란 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미 하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 '단일염기다형성', 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “마커”란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유 전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 엽결각(lobed leaf)과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “마커(marker)”는, 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 유전자 마커(genetic marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “유전자 마커”는, DNA 마커, 바이오마커, 분자마커 등의 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 마커는 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 형질을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 유전자 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법으로서, 주로 반복되는 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새틀라이트(microsatellite)나 유전자 염기서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커가 이용되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 SNP 마커 조성물은 수박의 유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)에 적용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)”은 유전자 마커를 사용하여 유묘기에 여교잡 자손의 염색체 전체 조성을 확인함으로써 여교잡 자손이 회복친의 우수형질을 가진 유전체 구성으로 회복하는데 걸리는 시간을 단축시킬 수 있는 육종기법을 의미한다. 기존의 여교잡 육종의 경우 6~7 세대 이상의 시간이 소요되지만 유전자 마커를 이용한 여교잡 선발(MABC) 육종은 빠른 경우에는 여교잡 2세대에서부터 개체를 선발할 수 있기 때문에 작물 개량에 소요되는 노력과 비용을 절감하여 육종의 규모와 효율성을 증대시킬 수 있다. MABC용 마커 제작에는 주로 SNP를 이용하는데 이는 단순반복서열(Simple sequence repeat)이나 삽입/결실(insertion /deletion; indel)과 같은 변이에 비하여 유전체 내 발생빈도가 높은 구조 변이의 하나이며 탐색에서 분석에 이르는 전 과정이 자동화될 수 있기 때문이다. 하지만 과도하게 많은 SNP는 실험에 많은 시간과 비용이 소모되기 때문에 정확도 및 활용도가 높은 SNP를 선발하는 것이 중요하다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기를 포함하는 8 내지 100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는, 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 4 및 5로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 9로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 본 명세서에서 개시하고 있는 SNP 마커를 검출하기 위한 프라이머라면 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드” 또는 “폴리뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥의 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 (폴리)뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머레이즈와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도, 및 적합한 버퍼 하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정되지만, 통상적으로 15bp 내지 30bp의 길이로 사용된다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야 한다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 고해상도 융해(High-resolution melting; HRM) 분석용 프라이머 세트일 수 있으나, 본 발명에 따른 SNP를 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “고해상도 융해(High-resolution melting; HRM)”는, PCR에 의해 증폭된 영역 내에 존재하는 DNA 상의 SNP에 따라서, 형광시약과 결합한 증폭산물 DNA를 약 60℃에서 95℃까지 온도를 변화시키며 단일가닥의 DNA로 변성될 때의 형광강도 변화를 측정하는 방법을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 수박의 유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)에 적용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 키트는 본 발명에 따른 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 및 Mg²⁺와 같은 보조인자(cofactor) 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계를 포함하는 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 (a) 판별하고자 하는 수박으로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 상기 유전체 DNA에서, 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및 (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 (b) 단계의 검출하는 단계는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 것일 수 있으나, 실질적으로 동일한 목적을 달성하기 위한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 (c) 단계의 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 단계는 고해상도 융해, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정 등의 실험 기법을 통해 수행될 수 있으나, 본 발명에 따른 SNP 마커 또는 프라이머 세트를 이용하는 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 수박의 엽결각 지표 설정 및 표현형 검정

1.1. 수박의 엽결각 지표 개발

수박의 본엽 결각 형질은 6매째 이상의 본엽 때부터 명확한 결각 유무의 판단이 가능하므로, 본 발명자들은 생육단계를 더 진행시켜 9번째 또는 10번째 본엽에서 잎 결각의 유무를 판단하였다. 모본으로 사용한 엽결각 표현형을 나타내는 'SIT463ST'는 주맥을 중심으로 하여 4쌍의 함몰부를 확인할 수 있었으며, 부본으로 사용한 무결각 표현형을 나타내는 'PS137'은 상기 'SIT463ST'에서 나타나는 깊은 함몰부가 관찰되지 않았다(도 1a 및 도 1b 참조). 수박의 잎 결각 형질을 수치화하기 위해 0점, 1점, 2점으로 나누어 결각이 없는 경우(0점), 결각이 있는데 심한경우보단 덜해 중간형질을 보이는 경우(1점), 결각이 심한 경우(2점)로 분류하였다(도 2 참조). 상세 기준은 하기 표 1에 기재하였다.

표현형 스코어	분류 기준
0	결각이 없음, 대칭적인 돌출부 있음.
1	주맥을 중심으로 하여 양쪽에 함몰부가 3개씩 있음, 함몰의 깊이가 깊지 않음.
2	주맥을 중심으로 하여 양쪽에 함몰부가 4개씩 있음, 함몰의 깊이가 깊음.

1.2. SIT463ST × PS137 :F ₂ 분리집단 표현형 검정

상기 표 1에 따른 기준에 의해 SIT463ST × PS137 의 F₂ 분리세대에서의 결각 유무 정도를 평가하여 0점, 1점 또는 2점으로 분류하였다. 총 SIT463ST 15개체, PS137 12개체, F₁ 13개체, F₂ 287개체의 표현형 검정을 수행하였으며, 1점과 2점의 경우 결각 형질이 있다고 판단하였고, 0점의 경우 결각이 없는 형질이라고 판단하였다.

그 결과 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, SIT463ST에서는 모두 2점의 형질을, PS137에서는 모두 0점의 형질을, F1에서는 모두 중간형질인 1점의 표현형을 나타내는 것을 확인하였으며, F₂ 분리세대에서는 멘델의 유전 법칙이 성립하여, 결각 : 무결각의 분리비가 3 : 1로 나타났고, 이를 카이제곱검정(Chi-square test)을 통해 검증하였다. F₂ 분리세대의 개체별 표현형 검정 결과는 표 3에 나타내었다.

세대	9~10번째 본엽의 표현형		전체 개체수	기대비	자유도	X 2 값	P-값
	결각 있음	결각 없음
SIT463ST	15	0	15	-	-	-	-
PS137	0	12	12	-	-	-	-
F 1	13	0	13	-	-	-	-
F 2	228	59	287	3:1	1	0.048339	0.826

실시예 2: 수박 잎의 샘플링 및 DNA 추출

상기 실시예 1의 표현형 검정 결과에서 양극의 스코어인 0점과 2점으로 평가된 SIT463ST, PS137, SIT463ST × PS137 :F₁ 및 F₂ 개체를 각각 30개 씩 임의로 선정하여 80-85 mg의 무게로 샘플링을 진행하였다.

보다 구체적으로, DNA 추출을 위해 GeneAll® Exgene™Plant SV mini 키트를 사용하였다. 식물체 잎 80-85mg의 샘플을 2ml 튜브(Eppendorf, 독일)에 넣고 액체질소를 이용하여 동결시킨 뒤 오토밀(Automill; Tokken, 일본)을 이용하여 마쇄 하였다. 식물체를 마쇄한 후 키트에 내장된 DNA 추출 버퍼 PL 400㎕ 과 Proteinase K 5㎕ 첨가하고 항온수조 65℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 완료 후 키트에 내장된 버퍼 PD를 140㎕ 첨가하여 섞어준 뒤 얼음에 5분간 정치한 후 4℃ 13,000rpm에서 원심분리 하였다. 그 후 상등액을 키트에 내장된 EzSep™filter (blue)에 걸러준 후 걸러진 상등액의 1.5 volume만큼 키트에 내장된 버퍼 BD를 첨가하고 섞어 주었다. 섞어준 용액을 키트에 내장된 GeneAll® SV column(green)을 이용하여 DNA를 수득하였다. 이 후 내장된 버퍼 CW를 이용하여 1분간 세척해주고 내장된 버퍼 AE를 100㎕ 첨가하여 DNA를 녹여 회수해준다. 추출된 DNA의 품질은 전기영동 및 분광 광도계(Spectrophotometer; DS-11, 28 DeNovix, 미국)를 이용하여 확인하였고, 정량은 형광 광도계(flourometer; Qubit^® 2.0, Invitrogen, 미국)를 이용하여 측정하였다.

상기 샘플에서 고순도의 DNA를 추출하여 결각이 심한 표현형(표현형 스코어: 2)을 보이는 SIT463ST × PS137 :F₂ 개체 30개의 DNA 풀(pool)과 결각을 보이지 않는(표현형 스코어: 0) SIT463ST × PS137 :F2 개체 30개의 DNA 풀을 동량으로 만들고 결각 DNA 풀을 'LL', 무결각 DNA풀을 'Non-LL'이라고 명명하였다. 각 DNA 풀에 사용된 개체들의 DNA를 확인한 결과는 도 3a(LL) 및 3b(non-LL)에 나타내었다.

실시예 3: 수박 엽결각 형질의 BSA(Bulk Segregant Analysis) 및 서열정렬을 통한 유전자 변이 확인

3.1. NGS(Next-Generation Sequencing)을 통한 서열의 도출

부모집단인 SIT463ST 및 PS137과 상기 실시예 2에서 제작한 LL 및 Non-LL DNA 풀의 NGS를 수행하여 염기서열을 도출하였다. NGS 등급의 DNA인 것을 확인한 후, NovaSeq-6000 시스템(Illumina, 미국)을 이용하여 101bp의 리드 길이(Read length) 기준으로 페어드-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing)을 진행하였다. 상기 시스템을 이용한 시퀀싱 작업 흐름도는 도 4에 나타내었으며, 상세한 시퀀싱 조건은 하기 표 4에 기재하였다.

리드 타입(Read Type)	Paired-end
리드 길이(Read Length)	101
라이브러리 키트	TruSeq DNA PCR-Free kit
라이브러리 프로토콜	ruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Guide, Part # 15036187 Rev. D
시퀀서 타입	Illumina platform

3.2. 서열정렬을 통한 서열의 변이 확인

상기 실시예 3.1의 시퀀싱을 통해 얻어진 서열을 정렬하기 위해 Bowtie2 프로그램을 이용하였고, 유전자 분석 툴킷(Genome Analysis Toolkit, GATK)을 통하여 도출된 서열과 수박의 레퍼런스 서열인 97103의 BAM 파일을 만들어내어, 생산된 BAM 파일로 리드(read)들을 맵핑한 후 VCF(Variant Call Format) 파일을 얻었다. 상기 실시예 2에서 얻은 DNA 풀인 LL 및 Non-LL을 가지고 BSA-NGS를 수행하여 얻은 VCF 파일로 ΔSNP-인덱스(index)를 구하였다.

슬라이딩 윈도우 기법으로 ΔSNP-인덱스 값을 계산한 후, R script에서 신뢰구간 및 유의수준의 통계적 옵션을 주어 수박 엽결각 형질에 관여하는 유전자좌를 분석한 후 R프로그램의 시각화를 위해 ggplot2로 표현하였다

플롯팅 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 2번, 4번 및 5번 염색체에서 피크(peak)가 확인되었으며, 그 중 4번 염색체에서 deltaSNP 수치가 유의수준 99% 기준으로(파란색 선) 가장 유의미한 피크(peak)가 확인되었다. 해당 염색체 상에서 SIT463ST 및 PS137 사이의 SNPs(single nucleotide polymorphisms)를 보이는 후보 유전자좌를 발굴하였다.

또한, 유전체내에서의 SNPs와 표현형의 상관관계를 나타내기 위해서 회기분석을 이용하여 도출된 G' 값으로 후보 유전자좌를 확인하였다. 염색체별 G' 값 유의도에 따른 QTL 분포는 도 6에 나타내었으며, 임계값(Threshold)을 초과한 2번, 4번 및 5번 염색체의 G' 값은 하기 표 5에 나타내었다.

상기에서 얻은 GATK 파일과 VCF 파일을 추합하여 SNPs의 후보 지역을 선정하였고, Tablet1.19 프로그램을 이용하여 지역별 1kb 이상의 거리를 두는 SNPs를 선별하여, 이를 대상으로 HRM(High Resolution Melting)분석용 프라이머를 제작하였다. 상기 SNPs 후보 지역으로는 4번 염색체 상의 21,239,403 지역(도 7a), 21,262,238 지역(도 7b), 21,285,956 지역(도 7c), 21,287,252 지역(도 7d), 21,306,879 지역(도 7e), 21,324,868 지역(도 7f) 및 21,439,325 지역(도 7g)이 선정되었다.

실시예 4: HRM(High-resolution melting) 분석을 통한 엽결각 형질 연관 유전자 마커 개발

본 발명자들은 상기 실시예 3을 통하여 일곱 개의 후보 유전자좌를 선정하였으며, 수박의 엽결각 연관 단일 염기서열 변이 기반 연관 마커의 제작을 위해 HRM(High-resolution melting) 프라미어를 제작하여 실험을 진행하였다.

HRM 분석은 LightCycler96®소프트웨어 1.1(Roche, 스위스)을 통해 분석하여 F₂ 분리세대의 표현형과 예상 유전자형의 비교를 통해 일치율이 높은 지역을 탐색하였다. HRM 분석의 레퍼런스로는 부모집단인 SIT463ST 및 PS137과 분리세대 집단 중 SIT463ST × PS137 :F₁을 사용하였다. 실험은 로슈 사의 LightCycler®480 키트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 먼저, 클린벤치 내에서 하기 표 7에 기재된 대로 각 DNA 샘플마다 마스터믹스를 제조하고, 이를 96-웰 플레이트에 8㎕씩 분주하였다.

마스터믹스용 시약	부피
LightCycler®480 ResoLight Mix (Roche)	5㎕
LightCycler®480 ResoLight Dye (Roche)	0.5㎕
25mM MgCl₂ Solution (NEB)	1.2㎕
Primer 5pmol	1㎕
Ultra Pure Water (iNtRON)	0.3㎕
Total	8㎕

1ng/㎕의 DNA 샘플을 96-웰 플레이트의 순서에 맞춰서 2㎕씩 넣어주고, 실러(sealer)를 이용하여 상기 플레이트를 씌워준 후, 5000 rmp에서 숏스핀을 하였다. 이후, LightCycler96® 기기를 이용하여 HRM 분석을 수행하였다. 레퍼런스로 사용한 PS137, SIT463S 및 SIT463ST × PS137 :F₁이 각각 고유의 곡선를 보여 그룹핑(grouping)이 가능한 것을 확인한 후 SIT463ST × PS137 :F₂ 집단을 분석하였다.

그 결과 도 8 및 표 7에 나타난 바와 같이, 4번 염색체 상의 21.26Mbp ~ 21.28Mbp 지역에서 표현형과의 100% 일치율을 보이는 결과를 얻었다. 도 8에서는 파란색 곡선이 그룹 1(표현형 스코어: 2) 로 결각이 있는 SIT463ST(P1)이고, 빨간색 곡선이 그룹 2(표현형 스코어: 0)로 결각이 없는 PS137(P2)이며, 주황색 곡선이 그룹 3(표현형 스코어: 1)으로 SIT463ST × PS137 :F₁을 나타낸다. 또한, 하기 표 7의 표현형 데이터를 기반으로 그룹 1은 우성 Homotype LL이며, 그룹 2는 열성 Homotype ll이고, 그룹 3는 Ll인 Heterotype 임이 확인되었다. 표현형과 불일치를 보이는 F₂ 개체는 붉은색 볼드체로 표시하였다.

* Group1=LL(표현형 스코어: 2), Group2=ll(표현형 스코어: 0), Group3=Ll(표현형 스코어: 1)

상기 HRM 분석에 사용한 각각의 프라이머 서열 및 SNPs 지역은 하기 표 8에 나타내었다.

프라이머	지역	SNP	서열 (5'->3')	길이
LL-4-403-F (서열번호 14)	21,239,403 (서열번호 10)	C→T	TCGGCCAAGTAGCTCAATTC	20
LL-4-403-R (서열번호 15)			GCGGGTGAATTTGGACTAGA	20
LL-4-238-F (서열번호 4)	21,262,238 (서열번호 1)	G→A	TCAAAATTTGCATGTTTGGATT	22
LL-4-238-R (서열번호 5)			AAGTAGACATGTATTTGGTGGACAA	25
LL-4-956-F (서열번호 6)	21,285,956 (서열번호 2)	T→C	GGCCAAGTTCAACAAAAGGA	20
LL-4-956-R (서열번호 7)			CGGTTTCCATGACGTTTAAT	20
LL-4-252-F (서열번호 8)	21,287,252 (서열번호 3)	C→T	GAAATCCACCGAGTCCCATA	20
LL-4-252-R (서열번호 9)			TCCAAAAACAAAGCTCCTGAA	21
LL-4-879-F (서열번호 16)	21,306,879 (서열번호 11)	G→A	CCACTGCCACCATCTTTTCT	20
LL-4-879-R (서열번호 17)			TTTGTTGTCTCAAAAACATTCAAAA	25
LL-4-868-F (서열번호 18)	21,324,868 (서열번호 12)	G→A	TTGACATTTTTCCTTGGTTAAGTT	24
LL-4-868-R (서열번호 19)			TTGAATTGCTCGACGTTTCT	20
LL-4-325-F (서열번호 20)	21,439,325 (서열번호 13)	A→G	TCCTAACCAACCCAAATGTTTA	22
LL-4-325-R (서열번호 21)			GGAGCAATTTTTAAACTCAATCCA	24

상기 7 세트의 프라이머(LL-4-403, LL-4-238, LL-4-956, LL-4-252, LL-4-879, LL-4-868 및 LL-4-325)를 이용한 HRM 분석 결과 4번 염색체 상의 21,262,238 지역, 21,285,956 지역 및 21,287,252 지역에 해당하는 LL-4-238, LL-4-956 및 LL-4-252 HRM 프라이머가 F₂ 분리집단 188개체 모두 표현형과 100% 일치하는 결과를 보였다(표 7). 따라서, 상기 상기 SNP 마커를 이용하는 경우, 완벽한 정확도로 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별할 수 있다는 점에 기술적 의의가 있다고 사료된다. 상기 유전자 지역 사이에는 3개의 유전자 Cla018362, Cla018363 및 Cla018364가 존재하는데, 이는 기존의 엽결각 형질 관련 유전자로 알려진 Serine/threonine protein kinase를 암호화하는 유전자 Cla018357과 Homeobox-leucine zipper-like protein을 암호화하는 유전자 Cla018360와는 전혀 상이한 유전자로서, 각각 Pyruvate kinase, 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase(KDTA)-like protein 및 Phosphoprotein phosphatase을 암호화하고 있는 것이다.

상기와 같은 결과를 바탕으로 본 발명자들은 수박의 4번 염색체 상의 21,262,238 지역(서열번호 1), 21,285,956 지역(서열번호 2) 및 21,287,252 지역(서열번호 3)의 SNPs를 수박의 엽결각 형질을 선발하기 위한 신규 유전자 마커로 최종 선정하여, 수박 엽결각 형질 개체를 판별하는 신규 유전자 마커의 개발을 완성하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Novel genetic markers for selection of watermelon with lobed leaf trait and use thereof <130> MP19-294 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 1 catatatgtg ttttgtagca tattcagaaa ttggatttta atttaaacaa ttgtttaaaa 60 tgtatgttga tactatatag ttataaatca ttaaaactaa ttatagttac tcactaatat 120 ttagttgaca ataagttatt attaatttgt ttatgagtat gatttaggtt aaaaaaaaaa 180 gttttatata attattatta attaatatta tataatttat aatacattac ataatacata 240 tgacataggg ttattttcaa atataggaaa atggacacaa atatttacaa atatagcaaa 300 aatttactat agactactat ctaagtcaga ggcagataat ggtctattgt gatctatcgc 360 ggtccatcgc aaataactgt gatattttgt tattatttgt aaatattttc aacaattttc 420 atttaaaatt caaaatttgg atacaatgga aacataaaaa tgttattttc aaaatttgca 480 tgtttggatt acaaaattcg gaaacagttt tcagaaacaa aatttgaatt gtccaccaaa 540 tacatgtcta cttaagtcaa taaatctgaa aacatgaaat agaatctgat ttttttaccc 600 aaatgtctca aatgtaacct aaacatccgc 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ttgtttaatt ctaattattt 540 ggatgaaaaa aagttataat tagaacaatt ggattgagtt taaaaattgc tccaacctaa 600 ctcaaccatg aatattgata atagaaatca tattcctaag ttacaagttg tgtttgtgtg 660 tgtgtgtaag agagaggtta agttgatatc aaaacttaat ttgcttagtt gttgccgtgt 720 tttaggggtt tgtctcaatc ttattacaga gtttatttgt tgctattata tttcaattta 780 ggaccactta tgtatgtata tgtcacgtta cgatcaatac gagaaactca tgtgaccaaa 840 attacaattt tggacactgt tttctcattt ctatcttttg tagttctatt tctttttcat 900 atatatatat tatattcttt tcttcttttg ggtataagaa tttcaacata ccataatgac 960 ctttatttag agataagatt tgtgtcatgt ggtatataat c 1001 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LL-4-403-F Primer <400> 14 tcggccaagt agctcaattc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LL-4-403-R Primer <400> 15 gcgggtgaat ttggactaga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LL-4-879-F Primer <400> 16 ccactgccac catcttttct 20 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LL-4-879-R Primer <400> 17 tttgttgtct caaaaacatt caaaa 25 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LL-4-868-F Primer <400> 18 ttgacatttt tccttggtta agtt 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LL-4-868-R Primer <400> 19 ttgaattgct cgacgtttct 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LL-4-325-F Primer <400> 20 tcctaaccaa cccaaatgtt ta 22 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LL-4-325-R Primer <400> 21 ggagcaattt ttaaactcaa tcca 24

Claims (9)

1. 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
   서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
   서열번호 3의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 잎 결각(lobed leaf) 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 수박의 유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)에 적용하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기를 포함하는 8 내지 100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는, 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 프라이머 세트는, 서열번호 4 및 5로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 9로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 프라이머 세트.
   
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 고해상도 융해(High-resolution melting; HRM) 분석용 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
   
6. 제3항 또는 제4항의 프라이머 세트를 포함하는, 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하기 위한 키트.
   
7. 하기의 단계를 포함하는, 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 방법:
   (a) 판별하고자 하는 수박으로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하는 단계;
   (b) 분리된 상기 유전체 DNA에서, 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및
   (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 잎 결각 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 단계.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 (b) 단계는 제3항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 (c) 단계는 고해상도 융해, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.

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