KR20210061397A - 키메라 항원 수용체-변형된 면역 세포의 활성화 및 확장을 위한 단백질 l - Google Patents

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이단 맥러드
신 장
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후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
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Abstract

본원에서는 T 세포의 활성화 및 확장을 위한 방법이 제공된다. 추가로 치료요법을 위한 T 세포의 용도를 위한 방법이 제공된다.

Description

키메라 항원 수용체-변형된 면역 세포의 활성화 및 확장을 위한 단백질 L
[0001] 본 출원은 2018년 9월 19일자로 출원된 미국 가특허출원 62/733,291호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
1. 기술 분야
[0002] 본 발명은 일반적으로 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 키메라 항원 수용체를 발현하도록 가공된 면역 세포의 방법 및 조성물에 관한 것이다.
2. 관련 선행 기술 기재
[0003] 입양 암 면역치료요법은 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 T 세포 (CAR-T)의 시험관내 확장에 의해 생성될 수 있는 종양 항원에 특이적인 CAR로 변형된 면역 세포의 전달을 포함한다. 현재, CAR-T 세포는 CD3-활성화 항체 (Ab)를 사용한 통상적인 방법을 사용하여 시험관내 확장된다. 상기 방법에서, CAR 발현과는 상관 없이 모든 T 세포는 증식하도록 유도되고 CAR-특이적 방식이 아니다. 상기 방법은 CD3-확장된 CAR-T 집단에서 CAR 발현 및 기능의 “사일런싱”을 유도할 수 있다.
[0004] CAR-T 세포는 단리된 형태이거나 피더 세포에 의해 발현되는 CAR-특이적 종양 항원과 함께 배양물 중에서 선택적으로 확장될 수 있지만, 항원 배양물만이 특이적 CAR 유형에 대해 적용될 수 있다. 상기 접근법은 특히 치료학적 세포 제조를 위해 범용이 아니거나 매우 실용적이지 않다. 따라서, CD3 활성화를 기준으로 범-T 세포 확장 배양과 유사하게, CAR-T 세포 치료학적 분야는 CAR-T 세포가 CAR-특이적 방식으로 활성화되고 확장될 수 있는 범용의 범-CAR-특이적 시험관내 배양으로부터 이득을 얻을 것이다.
발명의 개요
[0005] 제1 구현예에서, 본원의 개시내용은 CAR-변형된 면역 세포의 활성화 및/또는 확장을 위한 시험관내 방법을 제공하고, 상기 방법은 CAR-변형된 면역 세포의 출발 집단을 수득하는 단계 및 상기 CAR-변형된 면역 세포의 집단을, 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포 집단을 생성하기 위해 충분한 기간 동안 단백질 L의 존재하에 배양하는 단계를 포함한다.
[0006] 특정 양상에서, 단백질 L은 0.1 내지 5㎍/cm2, 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0. 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 또는 2.5㎍/cm2의 농도로 존재한다. 특히, 단백질 L은 1 내지 5㎍/mL, 예를 들어, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 또는 4.5㎍/mL의 농도로 존재할 수 있다. 일부 양상에서, 단백질 L은 배양 표면 상에 코팅된다. 예를 들어, 배양 표면은 배양 플레이트, 배양 플라스크, 마이크로캐리어, 마이크로입자, 하이드로겔 입자 또는 배양 백일 수 있다.
[0007] 일부 양상에서, 배양물은 항-CD3 항체 및/또는 항원-특이적 표적 세포를 포함하지 않는다. 특정 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포이다. 특정 양상에서, T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, αβ T 세포 또는 γδ T 세포이다. 특정 양상에서, 상기 방법은 추가로 CD8+ T 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
[0008] 특정 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 동종이계이다. 다른 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 자가유래이다. 특정 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 유래한다. 특정 양상에서, PSC는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)이다. 일부 양상에서, iPSC는 혈액 세포 또는 T 세포로부터 재프로그래밍된다. 특정 양상에서, iPSC는 에피좀적으로 재프로그래밍된다. 일부 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 1차 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 1차 조혈 줄기 세포로부터 유래한다. 특정 양상에서, iPSC는 사이토카인-지시된 분화를 통해 CD34+ 전구체로 분화된다. 특정 양상에서, iPSC는 정배향 프로그래밍을 통해 CD34+ 전구체로 분화된다. 예를 들어, CAR은 F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv, 및 scFv로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, CAR은 CD28 동시-자극 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다.
[0009] 일부 양상에서, 배양 표면은 추가로 레트로넥틴, 피브로넥틴 또는 VCAM1으로 코팅된다. 특정 양상에서, 레트로넥틴은 0.1-1㎍/cm2, 예를 들어, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0㎍/cm2 이상의 농도로 배양물에 첨가된다. 추가의 양상에서, 배양 플레이트는 추가로 노치(Notch) 리간드 DLL4로 코팅된다. 특정 양상에서, DLL4는 0.1-1㎍/cm2, 예를 들어, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0㎍/cm2 이상의 농도로 배양물에 첨가된다.
[0010] 추가의 양상에서, 배양물은 추가로 IL-2 및/또는 IL-15을 포함한다. 일부 양상에서, IL-12 및/또는 IL-15는 5-15 ng/mL, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ng/mL 이상의 농도로 존재한다.
[0011] 특정 양상에서, 배양은 저산소 조건하에 있다. 일부 양상에서, 저산소 조건은 5% 산소를 포함한다.
[0012] 일부 양상에서, 충분한 기간은 8-12일, 예를 들어, 8, 9 또는 10일이다. 일부 양상에서, 배양은 SCF, TPO, FLT3L, 및/또는 IL-7을 포함하는 배지에서 배양한다. 특정 양상에서, SCF, TPO, FLT3L, 및/또는 IL-7은 50 ng/mL의 농도로 있다. 일부 양상에서, 상기 배지는 추가로 니코틴아미드를 포함한다.
[0013] 특정 양상에서, 상기 방법은 비-CAR-변형된 면역 세포와 비교하여 CAR-변형된 면역 세포의 선택적 확장을 유도한다. 일부 양상에서, CAR-변형된 면역 세포의 확장된 집단의 적어도 40% 또는 50%는 CAR-변형된 면역 세포이다. 일부 양상에서, CAR-변형된 T 세포의 확장된 집단은 적어도 25% CD3+CD8+ CAR-변형된 T 세포를 포함한다. 특정 양상에서, CAR-변형된 T 세포의 확장된 집단은 항-CD3 확장된 CAR-변형된 T 세포와 비교하여 2 내지 3배 높은 세포독성 활성을 포함한다. 일부 양상에서, CAR-변형된 T 세포의 확장된 집단은 항-CD3-확장된 CAR-변형된 T 세포와 비교하여 증가된 IFNγ 및/또는 TNFα 수준을 포함한다.
[0014] 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 구현예 및 이의 양상의 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포의 집단이 제공된다. 본원에서는 상기 구현예의 CAR-변형된 면역 세포 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 추가로 제공된다.
[0015] 본원의 개시내용은 추가로 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 구현예의 치료학적 유효량의 확장된 CAR-변형된 면역 세포를 상기 대상체에게 투여함을 포함한다. 일부 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 동종이계이다. 다른 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 자가유래이다.
[0016] 추가의 양상에서, 상기 방법은 추가로 적어도 제2 치료학적 제제를 투여함을 포함한다. 일부 양상에서, 상기 적어도 제2 치료학적 제제는 치료학적 유효량의 면역조절제 또는 면역억제제이다. 일부 양상에서, 적어도 제2 치료학적 제제는 화학치료요법, 방사선치료요법 및 면역치료요법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 양상에서, CAR-변형된 면역 세포 및/또는 적어도 제2 치료학적 제제는 정맥내로, 복막내로, 기관내, 종양내, 근육내, 내시경으로, 병변내, 경피적으로, 피하내, 국부적으로, 또는 직접 주사 또는 관류에 의해 투여된다.
[0017] 상기 구현예의 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포의 조성물의 용도가 이를 필요로 하는 대상체에서 암의 치료를 위해 제공된다. 일부 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 동종이계이다. 다른 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 자가유래이다.
[0018] 본원에서는 CAR-변형된 면역 세포 및 단백질 L을 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 특정 양상에서, 단백질 L은 0.1 내지 5㎍/cm2, 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0. 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 또는 2.5㎍/cm2의 농도로 존재한다. 특히, 단백질 L은 1 내지 5 g/mL, 예를 들어, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 또는 4.5㎍/mL의 농도로 존재할 수 있다. 일부 양상에서, 단백질 L은 배양 표면 상에 코팅된다. 예를 들어, 배양 표면은 배양 플레이트, 배양 플라스크, 마이크로캐리어, 마이크로입자, 하이드로겔 입자 또는 배양 백일 수 있다.
[0019] 일부 양상에서, 배양 표면은 추가로 레트로넥틴, 피브로넥틴 또는 VCAM1으로 코팅된다. 특정 양상에서, 레트로넥틴은 0.1-1㎍/cm2, 예를 들어, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0㎍/cm2 이상의 농도로 배양물에 첨가된다. 추가의 양상에서, 배양 플레이트는 추가로 노치(Notch) 리간드 DLL4로 코팅된다. 특정 양상에서, DLL4는 0.1-1㎍/cm2, 예를 들어, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0㎍/cm2 이상의 농도로 배양물에 첨가된다.
[0020] 일부 양상에서, 배양물은 항-CD3 항체 및/또는 항원-특이적 표적 세포를 포함하지 않는다. 특정 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포이다. 특정 양상에서, T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, αβ T 세포 또는 γδ T 세포이다. 특정 양상에서, 상기 방법은 추가로 CD8+ T 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
[0021] 특정 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 동종이계이다. 다른 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 자가유래이다. 특정 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 유래한다. 특정 양상에서, PSC는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)이다. 일부 양상에서, iPSC는 혈액 세포 또는 T 세포로부터 재프로그래밍된다. 특정 양상에서, iPSC는 에피좀적으로 재프로그래밍된다. 일부 양상에서, CAR-변형된 면역 세포는 1차 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 1차 조혈 줄기 세포로부터 유래한다. 특정 양상에서, iPSC는 사이토카인-지시된 분화를 통해 CD34+ 전구체로 분화된다. 특정 양상에서, iPSC는 정배향 프로그래밍을 통해 CD34+ 전구체로 분화된다. 예를 들어, CAR은 F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv, 및 scFv로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, CAR은 CD28 동시-자극 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다.
[0022] 본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구현예를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것임을 알아야 한다.
[0023] 하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
[0024] 도 1: 단백질 L은 용량-의존성 방식으로 CAR-T 세포의 발현을 유도한다. T 세포의 배수 확장은 단독으로 또는 레트로넥틴 및/또는 DLL4와 조합된 단백질 L의 존재하에 나타난다.
[0025] 도 2: 단백질 L 및 레트로넥틴 조합은 단독의 단백질 L과 비교하여 효율적인 CAR-T 확장을 유도하였다. CD8 및 CD3 발현의 유동 세포측정 분석은 단독으로 또는 레트로넥틴 및/또는 DLL4와 조합된 단백질 L의 존재하에 확장된 T 세포에 대해 나타낸다.
[0026] 도 3: 항-CD3 모노클로날 항체 대 단백질 L을 사용한 T 세포 확장의 비교.
[0027] 도. 4a-4b: (도 4a) CD19+ P15 세포와의 배양은 IFNγ, TNFα, 그랜자임 B, sFasL, CCL3, CCL2, GM-CSF, IL2 및 IL13의 유도가능한 생성을 밝혔다. 항-CD3 모노클로날 항체와 단백질 L을 사용한 T 세포 확장에서 사이토카인 생성의 비교. (도 4B) 단백질 L에 의해 유도된 CAR-의존성 시험관내 사이토카인 생성.
[0028] 도 5: 항-CD3 mAb 및 단백질 L 둘다로 확장된 CAR-T 세포는 CD19+ P815, 다우디(Daudi) 및 라이(Raji) 세포에 대해 강한 세포독성 활성을 나타낸다.
[0029] 도 6: CAR-T 주사 후 6주까지 CAR-T 세포로 처리된 마우스에서 종양 성장.
[0030] 단백질 L은 CAR의 항원-결합 부위를 구성하는, 최소 항원-결합 잔기-단일-쇄 가변 도메인 단편(scFv)을 포함하는 면역글로불린의 경쇄에 결합하기 위해 특유의 특이성을 갖는 세균 단백질이다. 단백질 L은 세포 표면 CAR과 결합할 수 있는 것으로 나타났다(문헌참조: Zheng et al., 2012). 추가로, 쳉 등(Zheng et al.)은 유동 세포측정에 의해 CAR의 발현을 검출하기 위한 시약으로서 단백질 L의 잠재력을 입증하였다.
[0031] 단백질 L은 항원-결합 부위를 방해하는 것 없이, 가변 경쇄와의 특이적 고-친화성 상호작용을 통해 면역글로불린 (Ig)에 결합하는 세균 단백질이다. 단백질 L은 또한 CAR의 항원-결합 도메인을 구성하는, 단일쇄 가변 단편 (scFv) 내 경쇄 성분에 결합할 수 있다. 단백질 L의 또 다른 특유의 특징은 하나의 분자에 5개의 동일한 Ig-결합 부위를 갖는 이의 다중-도메인 구조이다. 다가 결합, 및 이에 따른 세포 표면 상에 발현된 표적 분자의 잠재적 가교-결합은 단백질 L이 강력한 세포 활성화제로서 기능할 수 있음을 지적한다.
[0032] 항원-결합 부위에 직접적으로 결합하지 않고 차단시키지 않으면서, CAR의 scFv 부분에 결합되는 경우, 단백질 L은 항원 결합을 모방하고 CAR 활성화를 유도할 수 있다. 이러한 방식으로, 이것은 치료학적 적용을 위한 CAR-유도된 세포 반응 및 CAR-발현 세포의 확장의 기능적 분석을 포함하는, CAR-변형된 세포를 사용한 세포 배양 적용에서 범용 CAR-활성화 시약으로서 사용될 수 있다.
[0033] 따라서, 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, 및 CAR-대식세포와 같은 CAR-변형된 이펙터 면역 세포의 활성화 및/또는 확장을 위한 단백질 L의 용도를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법은 이의 항원-특이성과는 무관하게 CAR-변형된 세포의 활성화 및 확장을 위한 범용 세포 배양 시스템을 제공한다.
[0034] 항-사람 CD19 CAR-변형된 PSC-유래된 T 세포를 사용하여, 본 발명의 연구는 고정화된 단백질 L이 CAR-변형된 T 세포에서 특이적 증식 반응을 유도하지만 비-변형된 T 세포에서는 유도하지 않는다는 실험 증거를 제공한다. 레트로넥틴 (재조합 피브로넥틴 단편)이 단백질 L의 CAR-유도성 기능을 지지하고 노치 리간드 DLL4가 CD19+ CAR-T 세포의 증식성 반응 및 확장을 추가로 개선시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항-CD3 모노클로날 항체에서 확장된 CAR-T 세포와 단백질 L 배양물이 비교되는 경우, 보다 우수한 CAR-매개된 사이토카인 생성, 시험관내 및 생체내 항-종양 활성은 단백질 L-확장된 CAR-T 세포에서 발견되었다.
[0035] 따라서, 단백질 L은 시험관내 CAR-변형된 세포의 특이적 활성화, 확장 및 분석을 위한 세포 배양 시약으로서 동정되었다. 단백질 L은 이것이 동물-부재 조건하에서 생성되기 때문에 치료학적 적용을 위해 적합한 GMP-순응성 배양을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 PSC-유래된 CAR-T 치료학적 생성물의 개발을 위해 사용될 수 있다. 특이적 적용은 PSC-유래된 T 세포를 위한 최적의 CAR 구성의 선택, CAR-T 세포에 대한 품질 관리 검정 및 임상전 동물 연구를 위한 CAR-T 세포의 확장을 포함한다.
I. 정의
[0036] 본원에서, 특정 성분과 관련하여 "필수적으로 없는"이라는 말은 해당 특정 성분이 의도적으로 조성물 내로 전혀 조제하여 넣지 않았고/않았거나 해당 특정 성분이 오염물로서만 존재하거나 미량으로만 존재하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 야기된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01%이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
[0037] 본원 명세서에서, 단수형 관사("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
[0038] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "또 다른" 이라는 말은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
[0039] 용어 “약”은 기재된 값 + 또는 - 5%를 언급한다.
[0040] 본원에 사용된 바와 같이, 특정 물질 또는 재료가 “실질적으로 부재”인 조성물은 물질 또는 재료의 30%, 20%, 15%, 보다 바람직하게 10%, 보다 더 바람직하게 5%, 또는 가장 바람직하게 1%를 함유한다.
[0041] “발현 작제물” 또는 “발현 카세트”란 전사를 지시할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 작제물은 하나 이상의 목적하는 세포 유형, 조직 또는 기관에서 유전자 발현을 지시하는 하나 이상의 전사 제어 요소들(예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 이와 구조적으로 균등한 구조물)을 포함한다. 전사 종결 신호와 같은 추가의 요소들이 또한 포함될 수 있다.
[0042] “벡터” 또는 “작제물” (때로는 유전자 전달 시스템 또는 유전자 전달 “비히클”로 언급됨)은 시험관내 또는 생체내 숙주 세포로 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자의 복합체를 언급한다.
[0043] 벡터의 통상적인 유형인 “플라스미드”는 염색체 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있는 염색체 DNA로부터 분리된 염색체외 DNA 분자이다. 특정 경우에, 이것은 환형 및 이중 가닥이다.
[0044] 본 명세서에서 사용되는 용어 "환자" 또는 "대상체"는 살아있는 포유동물 유기체, 예를 들어, 사람, 원숭이, 소, 양, 염소, 개, 고양이, 마우스, 래트, 기니피그 또는 이들의 형질전환 종을 의미한다. 특정 구현예에서, 환자 또는 대상체는 영장류이다. 사람 환자의 비제한적인 예는 성인, 청소년, 유아 및 태아이다.
[0045] 용어 “종양-관련 항원”, “종양 항원” 및 “암 세포 항원”은 본원에 상호교환적으로 사용된다. 각각의 경우에, 상기 용어는 암 세포에 의해 특이적으로 또는 우선적으로 발현되는 단백질, 당단백질 또는 탄수화물을 언급한다.
[0046] "에피토프"는 아미노산 서열의 특이성에 의해 결정된 바와 같은 항체에 의해 인지되는 항원 상의 부위이다. 2개의 항체는 경쟁 결합 검정에서 측정된 바와 같이 각각이 다른 하나가 항원으로의 결합을 경쟁적으로 억제 (차단)하는 경우 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 일컬어 진다. 대안적으로, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내 대부분의 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 동일한 에피토프를 갖는다. 2개의 항체는 각각이 부분적으로 다른 하나의 항원으로의 결합을 부분적으로 억제하고/하거나, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 중첩 에피토프를 갖는 것으로 일컬어진다.
[0047] 질환 또는 병태의 “치료하는" 또는 치료는 질환의 징후 또는 증상을 완화시키는 노력에서 하나 이상의 약물을 환자에게 투여함을 포함할 수 있는 프로토콜을 실행함을 언급한다. 바람직할 수 있는 치료 효과는 질환 진행율의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 완화는 이들의 출현 후 뿐만 아니라 질환 또는 병태의 징후 또는 증상 출현 전에 일어날 수 있다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 목적하지 않을 수 있는 병태를 “예방하는” 또는 이의 “예방”을 포함할 수 있다. 추가로, "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 요구하지 않고, 치유를 요구하지 않으며 구체적으로 환자에 대해 단지 미진한 효과를 갖는 프로토콜을 포함한다.
[0048] 해당 용어가 명세서 및/또는 청구항에서 사용되는 용어 "효과적인"은 원하거나 예상되거나 의도된 결과를 달성하기에 적절한 것을 의미한다. 환자 또는 대상체를 화합물로 치료하는 맥락에서 사용될 때의 "유효량", "치료학적 유효량" 또는 "약제학적 유효량"은 질환을 치료하거나 예방하기 위해 대상체 또는 환자에게 투여될 때 상기 질환의 치료 또는 예방을 달성하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다.
[0049] “치료" 또는 "치료하는"은, (1) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 질환을 억제하는 것 (예를 들어, 병리 및/또는 증상의 추가 진행을 저지하는 것), (2) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 질환을 개선하는 것 (예를 들어, 병리 및/또는 증상을 역전시키는 것), 및/또는 (3) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 질환 또는 이의 증상의 임의의 측정가능한 감소를 달성하는 것을 포함한다.
[0050] “예방" 또는 "예방하는"은 다음을 포함한다: (1) 질환의 위험에 있을 수 있고/있거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 임의 또는 모든 병리 또는 증상을 경험하지 않았거나 나타내지 않는 대상체 또는 환자에서 질환의 발병을 억제하는 것, 및/또는 (2) 질환의 위험에 있을 수 있고/있거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 임의 또는 모든 병리 또는 증상을 경험하지 않았거나 나타내지 않는 대상체 또는 환자에서 질환의 병리 또는 증상의 발병을 지연시키는 것.
[0051] 용어 “정배향 프로그래밍”은 다능성 또는 만능성 세포에 하나 이상의 특이적 계통-결정 유전자들 또는 유전자 생성물을 제공함에 의해 어떠한 만능성을 갖지 않는 분화된 체세포와는 반대되는 바와 같이 다능성 또는 만능성 세포의 프로그래밍을 언급한다.
[0052] 본 명세서에서 일반적으로 사용되는 "약제학적으로 허용되는"은, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 적합하고, 사람 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 의미한다.
[0053] “약제학적으로 허용되는 염”은 상기 정의된 바와 같이 약제학적으로 허용되고 목적하는 약리학적 활성을 갖는 본원에 기재된 화합물의 염을 의미한다. 상기 염은 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등; 또는 유기산, 예를 들어, 1,2-에탄디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 3-페닐프로피온산, 4,4′-메틸렌비스(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 4-메틸바이사이클로[2.2.2]옥트-2-엔-1-카복실산, 아세트산, 지방족 모노- 및 디카복실산, 지방족 황산, 방향족 황산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캄포르설폰산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클로펜탄프로피온산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 헵탄산, 헥산산, 하이드록시나프토산, 락트산, 라우릴설푸르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 무콘산, o-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 옥살산, p-클로로벤젠설폰산, 페닐-치환된 알칸산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 3급 부틸아세트산, 트리메틸아세트산 등과 형성된 산 부가염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 또한 존재하는 산성 부분이 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 경우 형성될 수 있는 염기 부가염을 포함한다. 허용되는 무기 염기는 수산화나트륨, 탄산나트륨, 수산화칼륨, 수산화알루미늄 및 수산화칼슘을 포함한다. 허용되는 유기 염기는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등을 포함한다. 본 발명의 임의의 염의 일부 형성하는 특정 음이온 또는 양이온은 전반적으로 염이 약제학적으로 허용될 수 있는 한 중요하지 않는 것으로 인지되어야 한다. 약제학적으로 허용되는 염, 및 이의 제조 방법 및 용도의 추가의 예는 문헌[참조: Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002)]에 제공된다.
[0054] “약제학적으로 허용되는 담체”, “약물 담체”, 또는 단순히 “담체”는 화학적 제제를 운반하고, 전달하고/하거나 수송하는데 관여하는 활성 성분 약물과 함께 제형화되는 약제학적으로 허용되는 물질이다. 약물 담체를 사용하여 예를 들어, 약물 생물유용성을 조절하고, 약물 대사를 감소시키고/시키거나 약물 독성을 감소시키기 위한 제어 방출 기술을 포함하는, 약물의 전달 및 효과를 개선시킬 수 있다. 일부 약물 담체는 특정 표적 부위로의 약물 전달의 효과를 증가시킬 수 있다. 담체의 예는 다음을 포함한다: 리포좀, 미소 구체(예를 들어, 폴리(락틱-코-글리콜)산으로 구성되는), 알부민 미소 구체, 합성 중합체, 나노섬유, 단백질-DNA 복합체, 단백질 접합체, 적혈구, 비로솜 및 덴드리머.
[0055] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “키메라 항원 수용체(CAR)”는 예를 들어, 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 또는 키메라 면역수용체를 언급할 수 있고, 특정 면역 이펙터 세포 상으로의 인공 특이성이 이식된 가공된 수용체를 포함한다. CAR은 모노클로날 항체의 특이성을 T 세포상으로 부여함으로써 다수의 특이적 T 세포가, 예를 들어, 입양 세포 치료요법에 사용하기 위해 생성되도록 할 수 있다. 특이적 구현예에서, CAR은 세포의 특이성을 예를 들어, 종양 연관 항원에 지시한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인 및 종양 연관 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 특정 양상에서, CAR은 CD3-제타 a 막관통 도메인 및 엔도도메인에 융합된 모노클로날 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편 (scFv)의 융합체를 포함한다. 다른 CAR 디자인의 특이성은 수용체의 리간드 (예를 들어, 펩타이드)로부터 또는 덱틴과 같은 패턴-인지 수용체로부터 유래할 수 있다. 특정 경우에, 항원 인지 도메인의 공간은 활성화 유도된 세포사를 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 특정 경우에, CAR은 CD3ζ, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10, 및/또는 OX40과 같은 추가의 동시-자극 신호전달을 위한 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 분자는 동시-자극 분자, 이미지화를 위한 리포터 유전자(예를 들어, 양전자 방출 단층 촬영술을 위해), 프로드럭, 호밍 수용체, 케모킨, 케모킨 수용체, 사이토카인 및 사이토카인 수용체의 첨가 시 T 세포를 조건적으로 절제하는 유전자 생성물을 포함하는, CAR과 함께 동시 발현될 수 있다.
[0056] 용어 “배양”은 적합한 배지에서 세포의 시험관내 유지, 분화 및/또는 증식을 언급한다. “집적된”이란 이들이 유기체에 존재하는 조직에서 발견되는 것 보다 총 세포의 보다 큰 퍼센트로 존재하는 세포를 포함하는 조성물을 의미한다.
[0057] "항-암" 제제는 예를 들어, 암 세포의 사멸을 촉진시키거나, 암 세포에서 아폽토시스를 유도하거나, 암 세포의 성장 속도를 감소시키거나, 전이의 발생률 또는 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 또는 암 세포로의 혈액 공급을 감소시키거나, 암 세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진시키거나, 암의 진행을 예방 또는 억제하거나 암을 가진 대상체의 수명을 증가시킴에 의해 대상체에서 암 세포/종양에 음성으로 영향을 미칠 수 있다.
II. CAR-변형된 면역 세포
[0058] 본원 개시내용의 특정 구현예는 CAR을 발현하는 면역 세포에 관한 것이다. 면역 세포는 T 세포 (예를 들어, 조절 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 알파-베타 T 세포 또는 감마-델타 T 세포), NK 세포, 영구 NK 세포, NKT 세포, 또는 줄기 세포 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 유도된 만능 줄기 (iPSC) 세포)일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵구 또는 과립구, 예를 들어, 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염구이다. 또한 본원에서는 입양 세포 치료요법 (이 경우에 상기 세포는 자가유래 또는 동종이계일 수 있다)을 위해 세포를 사용하고 투여하는 방법 뿐만 아니라 면역 세포를 생성하고 가공하는 방법이 제공된다. 따라서, 면역 세포는 예를 들어, 암 세포를 표적화하기 위한 면역치료요법으로서 사용될 수 있다.
[0059] 본원에서는 단백질 L의 존재하에 CAR-변형된 면역 세포, 예를 들어, CAR-T 세포를 선택적으로 활성화시키고/시키거나 확장하기 위해 면역 세포의 활성화 및/또는 확장을 위한 방법이 제공된다. 단백질 L은 단독으로 또는 레트로넥틴 및/또는 DLL4와 조합하여 배양물 중에 존재할 수 있다.
[0060] 면역 세포는 대상체, 특히 사람 대상체로부터 단리될 수 있다. 면역 세포는 관심 대상의 대상체, 예를 들어, 특정 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는 대상체, 특정 질환 또는 병태에 대한 소인을 갖는 것으로 의심되는 대상체, 또는 특정 질환 또는 병태에 대해 치료요법을 받고있는 대상체로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 혈액, 제대혈, 비장, 흉선, 림프절 및 골수를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 대상체내에 존재하는 임의의 위치로부터 수거될 수 있다. 단리된 면역 세포는 직접 사용될 수 있거나, 또는 이들은 예를 들어, 동결에 의해 일정 기간 동안 저장 될 수 있다.
[0061] 면역 세포는 혈액 (혈액 은행 또는 제대혈 은행에 의해 수거되는 혈액을 포함하는), 비장, 골수, 수술 과정 동안에 제거되고/되거나 노출된 조직 및 생검 과정에 의해 수득된 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 이들의 존재하는 임의의 조직으로부터 집적/정제될 수 있다. 이로부터 면역 세포가 집적되고, 단리되고/되거나 정제되는 조직/기관은 생존 및 비-생존 대상체로부터 단리될 수 있고, 여기서, 상기 비-생존 대상체는 기관 공여자이다.
A. T 세포
[0062] 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 기능성 항-종양 이펙터 세포의 유도화, 활성화 및 확장을 위한 여러 기본 접근법은 지난 20년 동안 기재되었다. 이들은 다음을 포함한다: 자가유래 세포, 예를 들어, 종양-침윤 림프구 (TIL); 자가유래 DC를 사용하여 생체외 활성화된 T 세포, 림프구, 인공 항원-제공 세포 (APC) 또는 T 세포 리간드 및 활성화 항체로 코팅된 비드, 또는 표적세포막을 포획함에 의해 단리된 세포; 항-숙주 종양T 세포 수용체 (TCR)를 천연적으로 발현하는 동종이계 세포; 및 "T-몸체"로서 공지된 항체 유사 종양 인지 능력을 나타내는 종양-반응성 TCR 또는 키메라 TCR 분자를 발현하도록 유전학적으로 재프로그래밍되거나 “재지시된” 비-종양-특이적 자가유래 또는 동종이계 세포. 이들 접근법은 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 T 세포 제조 및 면역화를 위한 수많은 프로토콜을 생성하였다.
[0063] 일부 구현예에서, T 세포는 혈액, 골수, 림프, 탯줄 또는 림프 기관으로부터 유래한다. 일부 양상에서, 세포는 사람 세포이다. 세포는 전형적으로 1차 세포, 예를 들어, 대상체로부터 직접 단리되고/되거나 대상체로부터 단리되어 동결된 것들이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 서브세트, 예를 들어, 전체 T 세포 집단, CD4+　세포, CD8+　세포, 및 이의 서브집단, 예를 들어, 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화를 위한 잠재력, 확장, 재순환, 위치화 및/또는 지속성 능력, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 격실내에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도에 의해 한정된 것들을 포함한다. 치료될 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 세포를 단리하고, 이들을 제조하고, 가공하고, 배양하고/하거나 조작하고 이들을 냉동보존 또는 이의 부재하에 동일한 환자에게 재도입함을 포함한다.
[0064] T 세포 (예를 들어, CD4+　및/또는 CD8+　T 세포)의 서브유형 및 서브집단 중에는 순수 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 메모리 T 세포 및 이의 서브타입, 예를 들어, 줄기 세포 메모리 T (TSCM), 중추 메모리 T (TCM), 이펙터 메모리 T (TEM), 또는 최종적으로 분화된 이펙터 메모리 T 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 연합 불변 T (MAIT) 세포, 천연적으로 존재하고 적응성 조절 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 난포 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 있다.
[0065] 일부 구현예에서, T 세포 집단의 하나 이상은 특이적 마커, 예를 들어, 표면 마커에 대해 양성이거나 특이적 마커에 대해 음성인 세포에 대해 집적되거나 고갈된다. 일부 경우에, 상기 마커는 T 세포의 특정 집단 (예를 들어, 비-메모리 세포)상에 부재이거나 비교적 보다 낮은 수준으로 발현되는 것들 및 존재하거나 T 세포의 특정 다른 집단 (예를 들어, 메모리 세포) 상에 존재하거나 비교적 보다 높은 수준으로 발현되는 것들이다.
[0066] 일부 구현예에서, T 세포는 비-T 세포, 예를 들어, B 세포, 단핵구, 또는 다른 백혈구 세포 상에서 발현되는 마커, 예를 들어 CD 14의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 양상에서, CD4+　또는 CD8+　선택 단계는 CD4+　헬퍼 및 CD8+　세포독성 T 세포를 분리하기 위해 사용된다. 상기 CD4+　및 CD8+　집단은 추가로 하나 이상의 순수, 메모리 및/또는 이펙터 T 세포 서브집단상에서 발현되거나 비교적 보다 높은 정도로 발현되는 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 서브집단으로 분류될 수 있다.
[0067] 일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 추가로 예를 들어, 각각의 서브집단과 관련된 표면 항원을 기준으로 양성 또는 음성 선택에 의해 순수, 중추 기억, 이펙터 기억 및/또는 중추 기억 줄기 세포에 대해 집적되거나 이들이 고갈된다. 일부 구현예에서, 중추 기억 T (TCM) 세포에 대한 집적은 효능을 증가시키기 위해, 예를 들어, 일부 양상에서 특히 상기 서브집단에서 강력한, 투여 후 장기 생존, 확장 및/또는 생착을 개선시키기 위해 수행된다.
[0068] 일부 구현예에서, T 세포는 자가유래 T 세포이다. 상기 방법에서, 종양 샘플은 환자로부터 수득하였고, 단일 세포 현탁액을 수득한다. 단일 세포 현탁액은 임의의 적합한 방식, 예를 들어, 기계적으로(예를 들어, gentleMACS™ 분해기를 사용하여 종양을 분해시키는, Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.) 또는 효소적으로(예를 들어, 콜라게나제 또는 Dnase) 수득될 수 있다. 종양 효소 분해물의 단일-세포 현탁액을 인터류킨-2 (IL-2)에서 배양한다.
[0069] 배양된 T 세포를 풀링하고 신속하게 확장시킬 수 있다. 신속한 확장은 약 10 내지 약 14일의 기간 동안 적어도 약 50배 (예를 들어, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 또는 100-배 이상)의 항원-특이적 T-세포 수의 증가를 제공한다. 보다 바람직하게, 신속한 확장은 약 10 내지 약 14일의 기간 동안 적어도 약 200-배 (예를 들어, 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 700-, 800-, 900-, 이상)의 증가를 제공한다.
[0070] 확장은 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 다수의 방법에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 피더 림프구 및 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터류킨-15 (IL-15)의 존재하에 바람직하게는 IL-2의 존재하에 비-특이적 T-세포 수용체 자극을 사용하여 신속하게 확장될 수 있다. 비-특이적 T-세포 수용체 자극은 약 30 ng/ml 용량의 OKT3, 마우스 모노클로날 항-CD3 항체(Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.로부터 가용함)를 포함한다. 대안적으로, T 세포는 임의로 벡터로부터 발현될 수 있는, 암의 하나 이상의 항원 (이의 항원성 부분, 예를 들어, 에피토프(들) 또는 세포), 예를 들어, 사람 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩타이드를 사용하여, T-세포 성장 인자, 예를 들어, 300 IU/ml IL-2 또는 IL-15, 바람직하게는 IL-2의 존재하에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 시험관내 자극에 의해 신속하게 확장될 수 있다. 시험관내 유도된 T-세포는 HLA-A2-발현 항원-제공 세포 상에 펄싱된 암의 동일한 항원(들)을 사용한 재-자극에 의해 신속하게 확장될 수 있다. 대안으로, T-세포는 예를 들어, 조사된 자가유래 림프구로 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 재자극될 수 있다.
[0071] 자가유래 T 세포를 변형시켜 자가유래 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 T 세포 성장 인자를 발현시킬 수 있다. 적합한 T 세포 성장 인자들은 예를 들어, 인터류킨 (IL)-2, IL-7, IL-15, 및 IL-12를 포함한다. 변형을 위한 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994)을 참조한다. 특정 양상에서, 변형된 자가유래 T 세포는 고수준으로 T 세포 성장 인자를 발현한다. IL-12의 서열과 같은 T 세포 성장 인자 암호화 서열은 당업계에서 용이하게 가용하고, T 세포 성장 인자 암호화 서열로 작동가능하게 연결된 프로모터는 고수준의 발현을 촉진시킨다.
[0072] 일부 구현예에서, T 세포는 단백질 L의 존재하에 활성화되고/되거나 확장된다. 단백질 L은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0㎍/cm2의 농도로 배양물에 첨가될 수 있다. 단백질 L은 표면상에 고정화되거나 배지 내 가용성인 배양물에 첨가될 수 있다. 배양 표면은 배양 플레이트, 배양 플라스크, 마이크로캐리어, 마이크로입자, 하이드로겔 입자 또는 배양 백이다. 단백질 L은 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 레트로넥틴 또는 피브로넥틴과 조합하여 첨가될 수 있다.
B. 줄기 세포
[0073] 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 CAR-변형된 면역 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포(PSC), 간엽 줄기 세포 (MSC), 또는 조혈 줄기 세포 (HSC)일 수 있거나 이들로부터 유래한다.
[0074] 생식 세포, 적혈구 세포 및 혈소판을 제외하고는, 어떤 세포라도 iPCS를 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포형은 케라틴세포, 섬유아세포, 조혈 세포, 간엽 세포, 간 세포 또는 위 세포일 수 있다. 세포 분화의 정도 또는 해당 세포가 수거되는 동물의 연령에는 제한이 없으며; 미분화 전구 세포 (체세포 줄기 세포를 포함) 및 최종적으로 분화된 성숙한 세포조차도 본원에 개시된 방법에서 체세포의 공급원으로 사용될 수 있다.
[0075] 체세포는 당업자에게 공지된 방법들을 사용하여 재프로그래밍되어 iPS 세포를 생성할 수 있다. 일반적으로, 핵 재프로그래밍 인자를 사용하여 체세포로부터 만능 줄기 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog 및 Lin28을 사용한다. 다른 구현예에서, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4 또는 Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28가 사용된다.
[0076] iPSC는 일단 유도되면 다능성을 유지하기에 충분한 배지 중에서 배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 비한정 조건이 사용될 수 있는데; 예를 들어, 만능 세포는 섬유아세포 피더 세포 또는 줄기 세포를 미분화 상태로 유지하기 위해 섬유아세포 피더 세포에 노출된 배지 상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 피더 세포로서 세포 분열을 종료시키기 위해 방사선 또는 항생제로 처리된 마우스 배아 섬유아세포의 공존 하에 배양된다. 대안으로, 만능 세포는 TESR™ 배지 또는 E8™/필수 8™ 배지와 같은 합성된 피더 독립적인 배양 시스템을 사용하여 배양되어 필수적으로 미분화 상태로 유지될 수 있다.
C. 사이토카인-지시된 분화
[0077] 본원의 개시내용의 특정 구현예는 PSC의 HPC로의 분화에 관한 것이다. PSC는 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제8,372,642호에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 HPC로 분화될 수 있다. 하나의 방법에서, BMP4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3, 및 GM-CSF의 조합을 사용하여 조혈 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 배양물의 분화를 위해 PSC를 제조하기 위한 제1 배지, BMP4, VEGF, 및 FGF를 포함하는 제2 배지에 이어서 Flt3 리간드, SCF, TPO, IL-3, 및 IL-6을 포함하는 제3 배지에서의 세포 배양물로 순차적 노출은 만능 세포를 HPC 및 조혈 세포로 분화시킬 수 있다. 제2 한정된 배지는 또한 헤파린을 포함할 수 있다. 추가로, BMP4 및 VEGF를 함유하는 배지에서 FGF-2 (50 ng/ml)의 내포는 만능 세포로부터 조혈 전구 세포의 생성 효율을 증진시킬 수 있다. 추가로, 제1 한정된 배지에서 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제 (예를 들어, CHIR99021, BIO, 및 SB-216763)의 내포는 추가로 HPC의 생성을 추가로 증진시킬 수 있다.
[0078] 일반적으로, 만능 세포의 조혈 전구 세포로의 분화는 한정되거나 비한정된 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 한정된 조건은 일반적으로 수득한 세포가 사람 대상체에게 투여되는 것으로 의도되는 구현예에서 바람직할 수 있는 것으로 인지된다. 조혈 줄기 세포는 한정된 조건 (예를 들어, TeSR 배지를 사용하여) 하에서 만능 줄기 세포로부터 유래될 수 있고, 조혈 세포는 만능 세포로부터 유래된 배아체로부터 생성될 수 있다. 다른 구현예에서, 만능 세포는 OP9 세포 또는 마우스 배아 섬유아세포 상에서 동시 배양되고 후속적으로 분화될 수 있다.
[0079] 만능 세포는 분화 공정의 일부로서 배아체 또는 응집물을 형성하도록 될 수 있다. 분화를 유도하기 위해, “배아체”(EB) 또는 성장하는 세포의 클러스터의 형성은 일반적으로 사람 만능 줄기 세포의 EB로의 시험관내 응집을 포함하고 내배엽, 외배엽 및 중배엽 기원을 나타내는 다중 조직 유형으로의 자발적 및 무작위 분화를 가능하게 한다. 따라서 3차원 EB를 사용하여 조혈 세포 및 내피 세포의 일부 분획물을 생성할 수 있다.
[0080] EB는 하기의 프로토콜을 사용하여 형성될 수 있다. MATRIGELTM 코팅된 플레이트 상에서 피더 부재 성장에 적응된 미분화된 iPSC는 실온에서 약 8 내지 10분동안 0.5M EDTA 처리를 사용하여 컨플루언시에서 수거될 수 있다. EDTA는 항온처리 후 흡인시키고 EB는 rock 억제제 또는 블레비스타틴을 함유하는 SFD 배지에서 세포를 수거함에 의해 형성될 수 있다. 배지는 다음 날 상이한 사이토카인 제형을 함유하는 EB1 분화 배지로 변화될 수 있다. 세포는 ml 당 25만 내지 50만 세포의 밀도로 분주하여 응집물 형성을 촉진시킨다.
[0081] 응집물 형성을 촉진시키기 위해, 세포는 75% IMDM (Gibco), RA 보충물 없이 0.05% N2 및 B-27이 보충된 25% 햄스 개질된 F12 (Cellgro), 200 mM 1-글루타민, 0.05 mg/ml 아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 염(Asc 2-P) (WAKO), 및 4.5 x 10-4 MTG로 이루어진, 무혈청 분화 (SFD) 배지에서 밤새 항온처리를 위해 저-접착 플레이트에 전달될 수 있다. 다음 날, 세포는 각각의 웰로부터 수거하고 원심분리할 수 있다. 세포는 이어서 제1의 4일 분화 동안 약 50 ng/ml 골 형태형성 인자 (BMP4), 약 50 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 및 50 ng/ml zb FGF가 보충된 SFD 기본 배지로 이루어진, “EB 분화 배지”에 재현탁시킬 수 있다. 세포는 48시간 동안 절반 공급한다. 분화 5일째에, 배지는 50 ng/ml 줄기 세포 인자 (SCF), 약 50 ng/ml Flt-3 리간드 (Flt-3L), 50 ng/ml 인터류킨-6 (IL-6), 50 ng/ml 인터류킨-3 (IL-3), 50 ng/ml 트롬보포이에틴 (TPO)이 보충된 SFD 배지로 구성된 제2 배지로 대체한다. 세포에 신선한 분화 배지가 49시간 마다 절반 공급된다. 배지 변화는 5분 동안 300g에서 분화 배양물을 회전 침강시키고 분화 배양물로부터 용적 절반을 흡인시키고 이를 새로운 배지로 새롭게 함에 의해 수행된다. 특정 구현예에서, EB 분화 배지는 약 BMP4 (예를 들어, 약 50 ng/ml), VEGF (예를 들어, 약 50 ng/ml), 및 임의로 FGF-2 (예를 들어, 약 25-75 ng/ml 또는 약 50 ng/ml)을 포함할 수 있다. 상등액은 흡인될 수 있고 분화 배지로 대체될 수 있다. 대안적으로 세포에 2일 마다 신선한 배지가 절반 공급될 수 있다. 세포는 분화 공정 동안에 상이한 시점에서 수확될 수 있다.
[0082] HPC는 한정된 배지를 사용하여 만능 줄기 세포로부터 배양될 수 있다. 한정된 배지를 사용하여 만능 세포를 조혈 CD34+ 줄기 세포로 분화시키기 위한 방법은 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 출원 제12/715,136호에 기재되어 있다. 이들 방법은 본원의 개시내용에 따라 사용될 수 있는 것으로 예상된다.
[0083] 예를 들어, 한정된 배지를 사용하여 조혈 CD34+ 분화를 유도할 수 있다. 한정된 배지는 성장 인자 BMP4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3 및/또는 GMCSF를 함유할 수 있다. 만능 세포는 BMP4, VEGF, 및 임으로 FGF-2를 포함하는 제1의 한정된 배지에서 배양하고 이어서 (Flt3 리간드, IL-3, 및 GMCSF) 또는 (Flt3 리간드, IL-3, IL-6, 및 TPO)를 포함하는 제2 배지에서 배양할 수 있다. 제1 및 제2의 배지는 또한 하나 이상의 SCF, IL-6, G-CSF, EPO, FGF-2, 및/또는 TPO를 포함할 수 있다. 실질적으로 저산소 조건(예를 들어, 20% 미만의 O2)은 추가로 조혈 또는 내피 분화를 촉진시킬 수 있다.
[0084] 세포는 실질적으로 기계적 또는 효소적 수단 (예를 들어, 트립신 또는 TrypLETM를 사용하여)을 통해 개별화될 수 있다. ROCK 억제제(예를 들어, H1152 또는 Y-27632)는 또한 상기 배지에 포함될 수 있다. 이들 근접법은 예를 들어, 로봇 자동화를 사용하여 자동화될 수 있는 것으로 예상된다.
[0085] 특정 구현예에서, 실질적으로 저산소 조건을 사용하여 만능 세포의 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 약 20.8% 미만의 대기 산소 함량은 저산소인 것으로 고려된다. 배양물 중 사람 세포는 주위 공기와 비교하여 감소된 산소 함량을 갖는 대기 조건에서 성장시킬 수 있다. 상기 상대적인 저산소증은 배양 배지에 노출된 대기 산소를 감소시킴에 의해 성취될 수 있다. 배아 세포는 주위 수준의 이산화탄소와 함께, 전형적으로 약 1% 내지 약 6%의 감소된 산소 조건하에서 생체내 발육시킨다. 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, 저산소 조건은 특정 배아 발육 조건의 양상을 모방할 수 있는 것으로 예상된다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 저산소 조건은 특정 구현예에서 사용하여 iPSC 또는 hESC와 같은 만능 세포의 HPC와 같은 보다 분화된 세포 유형으로의 추가 분화를 촉진시킬 수 있다.
[0086] 하기의 저산소 조건을 사용하여 만능 세포의 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1%의 대기 산소 함량을 사용하여 조혈 전구체 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 저산소 대기는 약 5% 산소 가스를 포함한다.
[0087] 특정 구현예에서, 약 95% 미만, 약 90% 미만, 약 85% 미만, 약 80% 미만, 약 75% 미만, 약 70% 미만, 약 65% 미만, 약 60% 미만, 약 55% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5%의 용존 산소 함량을 사용하여 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 용존 산소 함량 수준은 약 25% 산소이다.
[0088] 임의의 소정의 조혈 전구 세포 확장에서 사용되는 특정 배지에 상관 없이, 사용되는 배지는 바람직하게 약 0.1 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 보다 일반적으로 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도로 적어도 하나의 사이토카인이 보충된다. 적합한 사이토카인은 c-키트 리간드(KL) (또한 강철 인자 (Stl), 비만 세포 성장 인자 (MGF), 및 줄기세포 인자 (SCF)), IL-6, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-1α, IL-11 MIP-1α, LIF, c-mpl 리간드/TPO, 및 flk2/flk3 리간드(Flt2L 또는 Flt3L)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히, 배양물은 SCF, Flt3L 및 TPO 중 적어도 하나를 포함한다. 보다 특히, 배양물은 SCF, Flt3L 및 TPO를 포함한다.
[0089] 일부 구현예에서, HPC는 파괴된 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2)를 나타내고 골수 분화 또는 림프구 분화를 촉진시키기 위한 조건하에서 배양한다. 일부 양상에서, HPC는 필수적으로 메틸화된 DNA에 결합하지 않는 비-기능성 MeCP2를 발현한다. 특정 양상에서, HPC는 MeCP2 DNA 결합 활성을 수행하기에 충분한 수준에서 MeCP2를 발현하지 않는다. 특정 양상에서, MeCP2는 MeCP2 유전자 내 절단 또는 돌연변이에 의해 비-기능성이다. 일부 양상에서, 파괴된 MeCp2를 나타내는 HPC를 수득하는 것은 HPC를 siRNA, shRNA 또는 MeCP2의 소분자 억제제와 접촉시킴을 포함한다.
D. 정배향 프로그래밍
[0090] 본원의 개시내용의 특정 구현예는 조혈 세포 분화/기능을 위해 중요한 프로그래밍 유전자의 조합의 발현을 통한 CAR-PSC의 정배향 프로그래밍에 의해 HPC를 제공한다. 하나의 방법에서, PSC는 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 PCT/US2016/057893에 기재된 바와 같이 ETS 유전자 (예를 들어, ETC2 또는 ERG), 조혈 발육 유전자 (예를 들어, GATA2) 및 호모에박스 유전자 (예를 들어, HOX49)와 같은 적어도 3개의 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 발현하도록 변형시킨다. 특정 양상에서, ETV2/ERG, GATA2, 및 HOXA9 유전자는 CAR-PSC로 형질감염된 양방향 강한 프로모터를 사용하여, 유도성 PiggyBac 벡터와 같은 하나의 벡터에 의해 동시 발현시킨다.
[0091] 추가로, EGH-CAR-PSC는 추가로 장기간 생착 잠재력을 위한 추가의 유전자를 발현하도록 변형시킬 수 있다. 예시적인 유전자는 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350, 및/또는 RBAK를 포함한다. 예를 들어, PSC는 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, 및 HOXA4를 발현하도록 하나 이상의 벡터로 형질감염시킬 수 있다.
[0092] 바람직하게, ETV2/GAT2/HOXA9 유전자들은 PSC의 조혈 전구체 세포로의 프로그램을 진행하기에 충분한 기간동안에만 발현한다. 따라서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자들은 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 따라서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자의 발현은 다중-계통 조혈 전구체 세포로의 프로그램을 진행하기에 충분한 기간 동안 PSC에서 유도될 수 있다. 상기 기간은 약 1일 내지 약 20일, 예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일일 수 있다. 대안적으로, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자들은 에피좀성 벡터에 의해 PSC로 도입될 수 있다. 따라서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자들은 PSC에서 일시적으로 발현될 수 있다.
E. 항원
[0093] 본원에 제공된 CAR은 질환 또는 장애의 치료에 유용한 임의의 항원성 특이성을 가질 수 있다. 유전학적으로 가공된 항원 수용체에 의해 표적화된 항원들 중에는 입양 세포 치료요법을 통해 표적화될 질환, 병태 또는 세포 유형과 관련하여 발현되는 것들이다. 질환 및 병태 중에는 혈액암, 면역계의 암, 예를 들어, 림프종, 백혈병 및/또는 골수종, 예를 들어, B, T, 및 골수 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함하는, 암 및 종양을 포함하는 증식성, 신생물성 및 악성 질환 및 장애들이 있다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 정상 또는 비-표적화된 세포 또는 조직, 자가면역 또는 동종면역 장애와 관련된 항원 또는 병원체-특이적 항원과 비교하여 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/되거나 가공된 세포 상에서 발현된다.
[0094] 임의의 적합한 항원은 본원의 방법에 사용될 수 있다. 예시적인 항원은 감염성 제제로부터의 항원 분자, 자동-/자가-항원, 종양-/암-연합된 항원, 및 종양 신생항원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양상에서, 항원은 NY-ESO, EGFRvIII, Muc-1, Her2, CA-125, WT-1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4, 및 CEA를 포함한다.
[0095] 종양-관련 항원은 전립선, 유방, 결장직장, 폐, 췌장, 신장, 악성중피종, 난소 또는 흑색종 암으로부터 유래할 수 있다. 예시적인 종양 관련 항원 또는 종양 세포 유래된 항원은 MAGE 1, 3, 및 MAGE 4; PRAME; BAGE; RAGE, Lage (또한 NY ESO 1으로서 공지된); SAGE; 및 HAGE 또는 GAGE를 포함한다. 종양 항원의 이들 비제한적인 예는 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광암종과 같은 광범위한 종양 유형에서 발현된다. 전립선 암 종양-관련 항원은 예를 들어, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 전립선-특이적 항원 (PSA), 전립선 산 포스페이트, NKX3.1, 및 전립선의 6개 막관통 상피 항원(STEAP)을 포함한다.
[0096] 다른 종양 관련 항원은 Plu-1, HASH-1, HasH-2, Cripto 및 Criptin을 포함한다. 추가로, 종양 항원은 많은 암의 치료에 유용한, 짧은 10개 아미노산 길이의 펩타이드인 전장 고나도트로핀 호르몬 방출 호르몬과 같은 자가 펩타이드 호르몬일 수 있다.
[0097] 종양 항원은 종양-관련 항원 발현, 예를 들어, HER-2/neu 발현을 특징으로 하는 암으로부터 유래된 종양 항원을 포함한다. 관심 대상의 종양 관련 항원은 멜라닌세포-흑색종 계통 항원 MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제 및 티로시나제 관련 단백질과 같은 계통 특이적 종양 항원을 포함한다. 예시적인 종양-관련 항원은 p53, Ras, c-Myc, 세포질 세린/트레오닌 키나제 (예를 들어, A-Raf, B-Raf, 및 C-Raf, 사이클린-의존성 키나제), MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K), TRK 수용체, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 빌름스 종양 항원(Wilms' tumor antigen) (WT1), AFP, -카테닌/m, 카스파제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양 관련 칼슘 신호 전달인자 1 (TACSTD1) TACSTD2, 수용체 티로신 키나제(예를 들어, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) (특히, EGFRvIII), 혈소판 유래된 성장 인자 수용체 (PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)), 세포질 티로신 키나제(예를 들어, src-패밀리, syk-ZAP70 패밀리), 인테그린-연결된 키나제(ILK), 신호 전달인자 및 전사 STAT3, STATS, 및 STATE의 신호 전달인자 및 활성화인자(예를 들어, HIF-1 및 HIF-2), 핵 인자 -카파 B (NF-B), 노치 수용체(예를 들어, 노치1-4), c-Met, 라파마이신의 포유동물 표적(mTOR), WNT, 세포외 신호 조절된 키나제 (ERK), 및 이들의 조절 서브유닛, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린, 신장 세포 암종-5T4, SM22-알파, 카보닉 언하이드라제 I (CAI) 및 IX (CAIX) (또한 G250로서 공지된), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테이나제 3, hTERT, 육종 전좌 중지점(breakpoint), EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시일산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔리안, PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGsS, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구마인, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, fos 관련 항원 1, CBX2, CLDN6, SPANX, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, SUNC1, LRRN1 및 유전자형 중 임의의 하나 이상으로부터 유래되거나 이들을 포함하는 종양 항원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0098] 항원은 종양 세포로부터 돌연변이된 유전자로부터 또는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 상이한 수준으로 전사되는 유전자로부터 유래된 에피토프 영역 또는 에피토프 펩타이드, 예를 들어, 텔로머라제 효소, 수르비빈, 메소텔린, 돌연변이된 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 돌연변이된 또는 야생형 p53, 시토크롬 P450 1B1, 및 비정상적으로 발현된 인트론 서열, 예를 들어, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V; 흑색종 및 B-세포 림프종에서 특유의 유전자형을 생성하는 면역글로불린 유전자의 클론 재정렬; 발암바이러스 공정으로부터 유래된 에피토프 영역 또는 에피토프 펩타이드를 포함하는 종양 항원, 예를 들어, 사람 파필로마 바이러스 단백질 E6 및 E7; 엡슈타인 바르 바이러스 단백질 LMP2; 종양-선택적 발현을 갖는 비돌연변이된 발암태아 단백질, 예를 들어, 암배아 항원 및 알파-페토단백질을 포함할 수 있다.
[0099] 다른 구현예에서, 항원은 병원성 미생물로부터 또는 기회주의적 병원성 미생물 (또한 본원에서 감염성 질환 미생물로서 호칭되는), 예를 들어, 바이러스, 진균류, 기생충 및 세균으로부터 수득되거나 유래된다. 특정 구현예에서, 상기 미생물로부터 유래된 항원은 전장 단백질을 포함한다.
[00100] 이의 항원이 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 병원성 유기체는 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 호흡기 신시티알 바이러스(respiratory syncytial virus) (RSV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus) (EBV), 인플루엔자 A, B, 및 C, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 폴리오마바이러스(예를 들어, BK 바이러스 및 JC 바이러스), 아데노바이러스, 메티실린-내성 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus (MRSA))을 포함하는 스타필로코커스 종(Staphylococcus species), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)를 포함하는 스트렙토코커스 종 (Streptococcus species)을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이들 및 본원에 기재된 바와 같은 항원으로서 사용하기 위한 다른 병원성 병원체로부터 유래된 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 공보 및 GENBANK®, SWISS-PROT®, 및 TREMBL®와 같은 공용 데이터베이스로부터 동정될 수 있다.
[00101] 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)로부터 유래된 항원은 임의의 HIV 비리온 구조적 단백질(예를 들어, gp120, gp41, p17, p24), 프로테아제, 역전사효소, 또는 tat, rev, nef, vif, vpr 및 vpu에 의해 암호화된 HIV 단백질을 포함한다.
[00102] 헤르페스 심플렉스 바이러스 (예를 들어, HSV 1 및 HSV2)로부터 유래된 항원은 HSV 후기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유전자의 후기 그룹은 우세하게 비리온 입자를 형성하는 단백질을 암호화한다. 상기 단백질은 바이러스 캡시드를 형성하는 (UL): UL6, UL18, UL35, UL38 및 주요 캡시드 단백질 UL19, UL45, 및 UL27로부터의 5개의 단백질을 포함하고, 이들 각각은 본원에 기재된 바와 같은 항원으로서 사용될 수 있다. 본원에 항원으로서 사용하기 위해 고려되는 다른 예시적인 HSV 단백질은 ICP27 (H1, H2), 당단백질 B (gB) 및 당단백질 D (gD) 단백질을 포함한다. HSV 게놈은 적어도 74개 유전자를 포함하고 이들 유전자 각각은 잠재적으로 항원으로서 사용될 수 있는 단백질을 암호화한다.
[00103] 사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유래된 항원은 CMV 구조적 단백질, 바이러스 복제의 이메디에이트 어얼리 및 어얼리 단계 동안에 발현되는 바이러스 항원, 당단백질 I 및 III, 캡시드 단백질, 코트 단백질, 보다 낮은 매트릭스 단백질 pp65 (ppUL83), p52 (ppUL44), IE1 및 1E2 (UL123 및 UL122), UL128-UL150로부터의 유전자 클러스터로부터의 단백질 생성물, 외피 당단백질 B (gB), gH, gN, 및 pp150을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 기재된 항원으로서 사용하기 위한 CMV 단백질은 또한 GenBank®, Swiss-Prot®, 및 TrEMBL®와 같이 공용의 데이터베이스에서 동정될 수 있다.
[00104] 특정 구현예에서 사용하기 위해 고려되는 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus (EBV))로부터 유래된 항원은 EBV 용해 단백질 gp350 및 gp110, 엡슈타인-반 핵 항원 (EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-리더 단백질(EBNA-LP) 및 잠재적 막 단백질 (LMP)-1, LMP-2A 및 LMP-2B를 포함하는 잠재적 사이클 감염 동안에 생성되는 EBV 단백질을 포함한다.
[00105] 본원에 사용하기 위해 고려되는 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV)로부터 유래된 항원은 RSV 게놈에 의해 암호화된 임의의 11개 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함한다: NS 1, NS2, N (뉴클레오캡시드 단백질), M (매트릭스 단백질) SH, G 및 F (바이러스 코트 단백질), M2 (제2 매트릭스 단백질), M2-1 (연장 인자), M2-2 (전사 조절), RNA 폴리머라제 및 인단백질 P.
[00106] 사용하기 위해 고려되는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)로부터 유래된 항원은 VSV 게놈에 의해 암호화된 5개 주요 단백질, 및 이의 항원성 단편 중 임의의 하나를 포함한다: 대형 단백질 (L), 당단백질 (G), 뉴클레오단백질 (N), 인단백질 (P), 및 매트릭스 단백질 (M) .
[00107] 특정 구현예에서 사용하기 위해 고려되는 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 항원은 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 뉴클레오단백질 (NP), 매트릭스 단백질 M1 및 M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2, 및 PB2를 포함한다.
[00108] 예시적 바이러스 항원은 또한 아데노바이러스 폴리펩타이드, 알파바이러스, 칼리시바이러스 폴리펩타이드(예를 들어, 칼리시바이러스 캡시드 항원), 코로나바이러스 폴리펩타이드, 디스템페르 바이러스 폴리펩타이드, 에볼라 바이러스 폴리펩타이드, 엔테로바이러스 폴리펩타이드, 플라비바이러스 폴리펩타이드, 간염 바이러스 (AE) 폴리펩타이드 (B형 간염 코어 또는 표면 항원, C형 간염 바이러스 E1 또는 E2 당단백질, 코어, 또는 비-구조적 단백질), 헤르페스바이러스 폴리펩타이드 (헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 바리셀라 조스터 바이러스 당단백질을 포함하는), 감염성 복막염 바이러스 폴리펩타이드, 백혈병 바이러스 폴리펩타이드, 마르부르크 바이러스 폴리펩타이드, 오르토믹소바이러스 폴리펩타이드, 파필로마 바이러스 폴리펩타이드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드(예를 들어, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 폴리펩타이드), 파라믹소바이러스 폴리펩타이드, 파르보바이러스 폴리펩타이드, 페스티바이러스 폴리펩타이드, 피코나 바이러스 폴리펩타이드(예를 들어, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩타이드), 폭스 바이러스 폴리펩타이드(예를 들어, 백시니아 바이러스 폴리펩타이드), 랍비 바이러스 폴리펩타이드(예를 들어, 랍비 바이러스 당단백질 G), 레오바이러스 폴리펩타이드, 레트로바이러스 폴리펩타이드, 및 로타바이러스 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00109] 특정 구현예에서, 상기 항원은 세균성 항원일 수 있다. 특정 구현예에서, 관심 대상의 세균 항원은 분비된 폴리펩타이드일 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 세균 항원은 세균의 외부 세포 표면 상에 노출된 폴리펩타이드 부분 또는 부분들을 갖는 항원을 포함한다.
[00110] 사용하기 위해 고려되는 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(MRSA)를 포함하는 스타필로코커스 종으로부터 유래된 항원은 독성 조절제, 예를 들어, Agr 시스템, Sar 및 Sae, Arl 시스템, Sar 동족체 (Rot, MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, SarZ 및 TcaR), Srr 시스템 및 TRAP를 포함한다. 항원으로서 작용할 수 있는 다른 스타필로코커스 단백질은 Clp 단백질, HtrA, MsrR, 아코니타제, CcpA, SvrA, Msa, CfvA 및 CfvB를 포함한다(문헌참조: 예를 들어, Staphylococcus: Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay). 스타필로코커스 아우레우스의 2개의 종 (N315 및 Mu50)에 대한 게놈은 서열분석되었고 예를 들어, PATRIC (PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder et al., 2007)에서 공용화되어 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항원으로서 사용하기 위한 스타필로코커스(Staphylococcus) 단백질은 또한 GenBank®, Swiss-Prot®, 및 TrEMBL®와 같이 다른 공용의 데이터베이스에서 동정될 수 있다.
[00111] 본원에 기재된 특정 구현예에서 사용하기 위해 고려되는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로 부터 유래된 항원은 뉴모라이신, PspA, 콜린-결합 단백질 A (CbpA), NanA, NanB, SpnHL, PavA, LytA, Pht, 및 필린 단백질(RrgA; RrgB; RrgC)을 포함한다. 스트렙토코커스 뉴모니아의 항원 단백질은 또한 당업계에 공지되어 있고 일부 구현예에서 항원으로서 사용될 수 있다. 스트렙토코커스 뉴모니아의 독성 균주의 완전한 게놈 서열은 서열분석되었고, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 사용하기 위한 에스. 뉴모니아 단백질은 또한 GENBANK®, SWISS-PROT®, 및 TREMBL®와 같은 다른 공용의 데이터베이스에서 동정될 수 있다. 본원의 개시내용에 따른 항원에 대한 특정 관심 대상의 단백질은 뉴모코씨의 표면에 노출될 것으로 예측된 독성 인자 및 단백질을 포함한다.
[00112] 항원으로서 사용될 수 있는 세균 항원의 예는 액티노마이세스(Actinomyces) 폴리펩타이드, 바실러스(Bacillus) 폴리펩타이드, 박테로이데스(Bacteroides) 폴리펩타이드, 보르데텔라 (Bordetella) 폴리펩타이드, 바르토넬라(Bartonella) 폴리펩타이드, 보렐리아(Borrelia) 폴리펩타이드 (예를 들어, 비. 부르그도르페리(B. Burgdorferi )OspA)), 브루셀라(Brucella) 폴리펩타이드, 캠필로박터(Campylobacter) 폴리펩타이드, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 폴리펩타이드, 클라미디아(Chlamydia) 폴리펩타이드, 코리네박테리움(Corynebacterium) 폴리펩타이드, 콕시엘라(Coxiella) 폴리펩타이드, 더마토필러스(Dermatophilus) 폴리펩타이드, 엔테로코커스(Enterococcus) 폴리펩타이드, 에흐를리키아(Ehrlichia) 폴리펩타이드, 에스케리키아(Escherichia) 폴리펩타이드, 프란시셀라(Francisella) 폴리펩타이드, 푸소박테리움(Fusobacterium) 폴리펩타이드, 해모바르토넬라(Haemobartonella) 폴리펩타이드, 해모필러스(Haemophilus) 폴리펩타이드 (예를 들어, 에이취. 인플루엔자(H. Influenzae)) b형 외막 단백질), 헬리코박터(Helicobacter) 폴리펩타이드, 크렙시엘라(Klebsiella) 폴리펩타이드, L-형태 세균 폴리펩타이드, 렙토스피라(Leptospira) 폴리펩타이드, 리스테리아(Listeria) 폴리펩타이드, 마이코박테리아(Mycobacteria) 폴리펩타이드, 마이코플라스마(Mycoplasma) 폴리펩타이드, 나이세리아(Neisseria) 폴리펩타이드, 네오리케치아(Neorickettsia) 폴리펩타이드, 노카디아(Nocardia) 폴리펩타이드, 파스퇴렐라(Pasteurella) 폴리펩타이드, 펩토코커스(Peptococcus) 폴리펩타이드, 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus) 폴리펩타이드, 뉴모코커스(Pneumococcus) 폴리펩타이드 (즉, 에스. 뉴모니아(S. pneumoniae)) 폴리펩타이드) (본원의 기재사항을 참조한다), 프로테우스(Proteus) 폴리펩타이드, 슈도모나스(Pseudomonas) 폴리펩타이드, 리케치아(Rickettsia) 폴리펩타이드, 로칼리마에아(Rochalimaea) 폴리펩타이드, 살모넬라(Salmonella) 폴리펩타이드, 쉬겔라(Shigella) 폴리펩타이드, 스타필로코커스(Staphylococcus) 폴리펩타이드, 그룹 A 스트렙토코커스(streptococcus) 폴리펩타이드 (예를 들어, 에스. 피오게네스(S. Pyogenes) M 단백질), 그룹 B 스트렙토코커스(streptococcus)(에스. 아갈락티아(S. agalactiae)) 폴리펩타이드, 트레포네마(Treponema) 폴리펩타이드, 및 예르시니아(Yersinia) 폴리펩타이드(예를 들어, 와이 페스티스(Y pestis) F1 및 V 항원)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00113] 진균류 항원의 예는 압시디아(Absidia) 폴리펩타이드, 아크레모니움(Acremonium) 폴리펩타이드, 알테르나리아(Alternaria) 폴리펩타이드, 아스퍼질러스(Aspergillus) 폴리펩타이드, 바시디오볼루스(Basidiobolus) 폴리펩타이드, 바이폴라리스(Bipolaris) 폴리펩타이드, 블라스토마이세스(Blastomyces) 폴리펩타이드, 캔디다(Candida) 폴리펩타이드, 코씨디오이데스(Coccidioides) 폴리펩타이드, 코니디오볼루스(Conidiobolus) 폴리펩타이드, 크립토코커스(Cryptococcus) 폴리펩타이드, 쿠르발라리아(Curvalaria) 폴리펩타이드, 에피더모피톤(Epidermophyton) 폴리펩타이드, 엑소피알라(Exophiala) 폴리펩타이드, 게오트리쿰(Geotrichum) 폴리펩타이드, 히스토플라스마(Histoplasma) 폴리펩타이드, 마두렐라(Madurella) 폴리펩타이드, 말라세지아(Malassezia) 폴리펩타이드, 마이크로스포룸(Microsporum) 폴리펩타이드, 모닐리엘라(Moniliella) 폴리펩타이드, 모르티에렐라(Mortierella) 폴리펩타이드, 뮤코르(Mucor) 폴리펩타이드, 파에실로마이세스(Paecilomyces) 폴리펩타이드, 페니실리움(Penicillium) 폴리펩타이드, 피알레모니움(Phialemonium) 폴리펩타이드, 피알로포라(Phialophora) 폴리펩타이드, 프로토테카(Prototheca) 폴리펩타이드, 슈달레스케리아(Pseudallescheria) 폴리펩타이드, 슈도마이크로도키움(Pseudomicrodochium) 폴리펩타이드, 피티움(Pythium) 폴리펩타이드, 리노스포리디움(Rhinosporidium) 폴리펩타이드, 리조푸스(Rhizopus) 폴리펩타이드, 스콜레코바시디움(Scolecobasidium) 폴리펩타이드, 스포로트릭스(Sporothrix) 폴리펩타이드, 스템필리움(Stemphylium) 폴리펩타이드, 트리코피톤(Trichophyton) 폴리펩타이드, 트리코스포론(Trichosporon) 폴리펩타이드, 및 크실로히파(Xylohypha) 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00114] 원생동물 기생충 항원의 예는 바베시아(Babesia) 폴리펩타이드, 발란티디움(Balantidium) 폴리펩타이드, 베스노이티아(Besnoitia) 폴리펩타이드, 크립토스포리디움(Cryptosporidium) 폴리펩타이드, 에이메리아(Eimeria) 폴리펩타이드, 엔세팔리토준(Encephalitozoon) 폴리펩타이드, 엔타모에바(Entamoeba) 폴리펩타이드, 기아르디아(Giardia) 폴리펩타이드, 하몬디아(Hammondia) 폴리펩타이드, 헤파토준(Hepatozoon) 폴리펩타이드, 이소스포라(Isospora) 폴리펩타이드, 라이슈마니아(Leishmania) 폴리펩타이드, 마이크로스포리디아(Microsporidia) 폴리펩타이드, 네오스포라(Neospora) 폴리펩타이드, 노세마(Nosema) 폴리펩타이드, 펜타트리코모나스(Pentatrichomonas) 폴리펩타이드, 플라스모디움(Plasmodium) 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유충 기생충 항원의 예는 아칸토케일로네마(Acanthocheilonema) 폴리펩타이드, 아엘루로스트론길러스(Aelurostrongylus) 폴리펩타이드, 안실로스토마(Ancylostoma) 폴리펩타이드, 안기오스트론길러스 (Angiostrongylus) 폴리펩타이드, 아스카리스(Ascaris) 폴리펩타이드, 브루기아(Brugia) 폴리펩타이드, 부노스토뭄(Bunostomum) 폴리펩타이드, 카필라리아(Capillaria) 폴리펩타이드, 카베르티아(Chabertia) 폴리펩타이드, 쿠페리아(Cooperia) 폴리펩타이드, 크레노소마(Crenosoma) 폴리펩타이드, 딕티오카울루스(Dictyocaulus) 폴리펩타이드, 디옥토피메(Dioctophyme) 폴리펩타이드, 디페탈로네마(Dipetalonema) 폴리펩타이드, 디필로보트리움(Diphyllobothrium) 폴리펩타이드, 디플리디움(Diplydium) 폴리펩타이드, 디로필라리아(Dirofilaria) 폴리펩타이드, 드라쿤쿨러스(Dracunculus) 폴리펩타이드, 엔테로비우스(Enterobius) 폴리펩타이드, 필라로디에스(Filaroides) 폴리펩타이드, 해몬쿠스(Haemonchus) 폴리펩타이드, 라고킬라스카리스(Lagochilascaris) 폴리펩타이드, 로아(Loa) 폴리펩타이드, 만소넬라(Mansonella) 폴리펩타이드, 무엘레리우스(Muellerius) 폴리펩타이드, 나노피에투스(Nanophyetus) 폴리펩타이드, 네카토르(Necator) 폴리펩타이드, 네마토디루스(Nematodirus) 폴리펩타이드, 오에소파고스토뭄(Oesophagostomum) 폴리펩타이드, 온코세르카(Onchocerca) 폴리펩타이드, 오피스토르키스(Opisthorchis) 폴리펩타이드, 오스테르타기아(Ostertagia) 폴리펩타이드, 파라필라리아(Parafilaria) 폴리펩타이드, 파라고니무스(Paragonimus) 폴리펩타이드, 파라스카리스(Parascaris) 폴리펩타이드, 피살로프테라(Physaloptera) 폴리펩타이드, 프로토스트론길루스(Protostrongylus) 폴리펩타이드, 세타리아(Setaria) 폴리펩타이드, 스피로세르카(Spirocerca) 폴리펩타이드, 스피로메트라(Spirometra) 폴리펩타이드, 스테파노필라리아(Stephanofilaria) 폴리펩타이드, 스트론길로이데스(Strongyloides) 폴리펩타이드, 스트론길러스(Strongylus) 폴리펩타이드, 텔라지아(Thelazia) 폴리펩타이드, 톡사스카리스(Toxascaris) 폴리펩타이드, 톡소카라(Toxocara) 폴리펩타이드, 트리키넬라(Trichinella) 폴리펩타이드, 트리코스트론길러스(Trichostrongylus) 폴리펩타이드, 트리쿠리스(Trichuris) 폴리펩타이드, 운시나리아(Uncinaria) 폴리펩타이드, 및 우체레리아(Wuchereria) 폴리펩타이드(예를 들어, 피. 팔시파룸(P. Falciparum)) 포자소체(circumsporozoite) (PfCSP)), 포자소체 표면 단백질(sporozoite surface protein) 2 (PfSSP2), 간 상태 항원 1의 카복실 말단 (PfLSA1 c-term), 및 배출된 단백질 1 (PfExp-1), 뉴모시스티스(Pneumocystis) 폴리펩타이드, 사코시스티스(Sarcocystis) 폴리펩타이드, 쉬스토소마 (Schistosoma) 폴리펩타이드, 테일레리아(Theileria) 폴리펩타이드, 톡소플라스마(Toxoplasma) 폴리펩타이드 및 트리파노소마 (Trypanosoma) 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00115] 체외기생충 항원의 예는 벼룩; 강성 진드기 및 연성 진드기를 포함하는 진드기; 파리, 예를 들어, 미드게스(midges), 모기, 응애, 진딧물, 말파리, 뿔파리, 사슴 파리(deer flies), 체체 파리(tsetse flies), 안정한 파리(stable flies), 승저증 원인 파리 및 깔따구과(biting gnats); 개미; 거미, 이(lice); 진드기(mites); 및 진정한 벌레(true bugs), 예를 들어, 베드 벌레(bed bugs) 및 키싱 벌레(kissing bugs)로부터의 폴리펩타이드 (항원 및 알레르겐을 포함하는)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
F. 키메라 항원 수용체
[00116] 일부 구현예에서, CAR은 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인지 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 세포 표면 상에서 발현되는 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR-유사 CAR이고 상기 항원은 가공된 펩타이드 항원, 예를 들어, TCR과 같이 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자와 관련하여 세포 표면 상에서 인지되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원이다.
[00117] 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 a) 세포내 신호전달 도메인, b) 힌지 및 막관통 도메인, 및 c) 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
[00118] 일부 구현예에서, 가공된 항원 수용체는 활성화 또는 자극 CAR, 동시 자극 CAR (문헌참조: WO2014/055668), 및/또는 억제 CAR (iCAR, 문헌(Fedorov et al., 2013)을 참조한다)을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 포함한다. CAR은 일반적으로 일부 양상에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된 세포외 항원 (또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 상기 분자는 전형적으로 천연 항원 수용체를 통한 신호, 동시 자극 수용체와 조합된 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 단독의 동시 자극 수용체를 통한 신호를 모방하거나 근접한다.
[00119] 본원의 개시내용의 특정 구현예는 세포내 신호전달 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 신호전달 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 면역원성을 감소시키기 위해 사람화된 CAR (hCAR)을 포함하는 항원-특이적 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 핵산의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 간의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인지할 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 영역은 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역, 모노클로날 항체의 가변 영역 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 특이성은 수용체에 결합하는 펩타이드 (예를 들어, 사이토카인)로부터 유래한다.
[00120] 사람 CAR 핵산은 사람 환자에 대한 세포성 면역치료요법을 증진시키기 위해 사용되는 사람 유전자들일 수 있는 것으로 고려된다. 특이적 구현예에서, 본 발명은 전장 CAR cDNA 또는 암호화 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제7,109,304호에 기재된 것들과 같은 특정 사람 모노클로날 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 또한 사람 항원-특이적 항체의 임의의 수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 단편은 사람 세포에서 발현을 위한 사람 코돈 용법을 위해 최적호된 서열에 의해 암호화된 항원-특이적 scFv이다.
[00121] 정렬은 다량체성, 예를 들어, 디아바디 또는 다량체일 수 있다. 다량체는 경쇄 및 중쇄의 가변부의 가교 결합쌍에 의해 디아바디로 형성될 가능성이 높다. 작제물의 힌지 부분은 전체적으로 결실되고, 제1 시스테인이 유지되고, 세린 보다는 프롤린 치환, 제1 시스테인까지 절단된 다중 대안물을 가질 수 있다. Fc 부분은 결실될 수 있다. 안정하고/하거나 이량체화하는 임의의 단백질은 상기 목적에 작용할 수 있다. Fc 도메인, 예를 들어, 사람 면역글로불린으로부터의 CH2 또는 CH3 도메인 중 단지 하나를 사용할 수 있다. 또한, 이량체화를 개선시키기 위해 변형된 사람 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다. 또한 단지 면역글로불린의 힌지 부분을 사용할 수 있다. 또한 CD8알파 부분을 사용할 수 있다.
[00122] 일부 구현예에서, CAR 핵산은 막관통 도메인 및 변형된 CD28 세포내 신호전달 도메인과 같은, 다른 동시자극 수용체를 암호화하는 서열을 포함한다. 다른 동시자극 수용체는 하나 이상의 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, DAP12 및 4-1BB (CD137)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00123] 일부 구현예에서, 입양 치료요법에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현되는 항원, 예를 들어, 암 마커 및/또는 약화된 반응을 유도하기 위해 의도된 항원, 예를 들어, 정상 또는 비-환부 세포 유형 상에 발현되는 항원과 같은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR이 작제된다. 따라서, CAR은 전형적으로 세포외 부분에서, 하나 이상의 항원 결합 분자, 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인, 또는 이의 일부, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인, 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 모노클로날 항체 (mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)로부터 유래된 단일쇄 항체 단편 (scFv)와 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다.
[00124] 키메라 항원 수용체의 특정 구현예에서, 수용체의 항원 특이적 부분(이는 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인으로서 언급될 수 있다)은 종양 관련 항원 또는 병원체-특이적 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원은 패턴-인지 수용체, 예를 들어, Dectin-1에 의해 인지되는 탄수화물 항원을 포함한다. 종양 관련 항원은 이것이 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 한 임의의 종류일 수 있다. 종양 관련 항원의 예시적 구현예는 CD19, CD319 (CS1), CD20, 암배아 항원, 알파페토단백질, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras 등을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 사이토카인과 동시 발현하여 저량의 종양 관련 항원이 있는 경우 지속성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, CAR은 IL-15와 동시 발현될 수 있다.
[00125] 키메라 수용체를 암호화하는 개방 판독 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 수득될 수 있거나 합성되거나 (예를 들어, PCR을 통해) 이의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 의존하여, 인트론이 mRNA를 안정화시키는것으로 밝혀짐에 따라 cDNA 또는 이의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 추가로, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-암호화 영역을 사용하는 것이 유리할 수 있다.
[00126] 키메라 작제물은 누출된 DNA로서 또는 적합한 벡터에서 면역 세포로 도입될 수 있는 것으로 고려된다. 세포를, 누출된 DNA를 사용하는 전기천공에 의해 안정하게 형질감염시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 누출된 DNA는 일반적으로 발현을 위한 적당한 배향에서 플라스미드 발현 벡터 내 함유된, 키메라 수용체를 암호화하는 DNA를 언급한다.
[00127] 대안적으로, 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 키메라 작제물을 마우스 세포에 도입할 수 있다. 본원의 개시내용의 방법에 따라 사용하기 위해 적합한 벡터는 면역 세포에서 비-복제성이다. 바이러스를 기반으로 하는 다수의 벡터가 공지되어 있고, 여기서, 세포에 유지되는 바이러스의 카피수는 세포의 생존율을 유지하기에 충분히 낮고, 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV, 또는 BPV를 기반으로 하는 벡터가 있다.
[00128] 일부 양상에서, 항원-특이적 결합, 또는 인지 성분은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 천연적으로 CAR 내 도메인 중 하나와 연합된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인으로의 도메인의 결합을 회피하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
[00129] 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래한다. 공급원이 천연인 경우, 일부 양상에서 도메인은 임의의 막 결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래한다. 막관통 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, ICOS/CD278, 및 GITR/CD357 분자의 알파, 베타, 또는 제타 쇄로부터 유래된 것들(즉, 이의 적어도 막관통 영역(들)을 포함하는)을 포함한다. 대안적으로, 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성이다. 일부 양상에서, 합성 막관통 도메인은 주로 소수성 잔기들, 예를 들어, 류신 및 발린을 포함한다. 일부 양상에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견된다.
III. 사용 방법
[00130] 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원의 개시내용의 CAR을 발현하는 유효량의 면역세포를 투여함을 포함하는 면역치료요법을 위한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 의학적 질환 또는 장애는 면역 반응을 유발하는 면역 세포 집단의 전달에 의해 처리된다. 본원의 개시내용의 특정 구현예에서, 암 또는 감염은 면역 반응을 유발하는 면역 세포 집단의 전달에 의해 처리된다. 본원에 제공된 것은 유효량의 항원 특이적 세포 치료요법을 개체에게 투여함을 포함하는 개체 내 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 방법이다. 본 발명의 방법은 면역 장애, 고형 암, 혈액암 및 바이러스 감염의 치료를 위해 적용될 수 있다.
[00131] 특정 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어, 본원에 제공된 CAR을 상기 암에 의해 발현된 항원에 특이적인 항원-결합 도메인과 함께 발현하는, NK 세포 및/또는 T 세포를 투여함에 의해 암 환자를 치료하기 위한 방법이 제공된다.
[00132] 본 발명의 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 예를 들어, 고형 종양 또는 혈액학적 종양에서 발견되는 것들을 포함한다. 예시적인 고형 종양은 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기관의 종양을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 혈액학적 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등을 포함한다. 본원에 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가의 예는 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는), 복막, 위장 또는 위암(위장암 및 위장 기질 암을 포함하는), 췌장암, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 음경암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00133] 상기 암은 구체적으로 하기의 조직학적 유형을 가질 수 있지만 이들에 제한되지 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 스핀들 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프구상피 암종; 기저 세포 암종; 섬모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관 암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선낭 암종; 선종폴립 내 선암종; 가족성 폴립증 콜리 선암종; 고형 암종; 악성 카시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 색소형성 암종; 호산성 암종; 호산소성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종 (skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종; 귀지 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막상피 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점소양 낭선암종; 점소양 선암종; 시그넷 환 세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤 도관 암종(infiltrating duct carcinoma); 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파게트 질환(paget's disease, mammary); 소포 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평 상피화생; 악성 흉선종thymoma; 악성 난소 기질 종양(ovarian stromal tumor, malignant); 악성 포막종(thecoma, malignant); 악성 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor, malignant); 악성 암성모세포종; 세르톨리 세포 암종(sertoli cell carcinoma); 악성 라이디히 세포 종양(leydig cell tumor, malignant); 악성 지질 세포 종양; 악성 부신결정종(paraganglioma, malignant); 악성 유선외 부신결정종(extra-mammary paraganglioma, malignant); 크롬친화세포종(pheochromocytoma); 사구체혈관육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 흑색점 악성 흑색종(lentigo malignant melanoma); 선단 흑자성 흑색종(acral lentiginous melanomas); 결절성 흑색종; 거대 색소성모반에서 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색모반(blue nevus, malignant); 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종(myxosarcoma); 지방육종; 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러관 혼합 종양; 신아세포종(nephroblastoma); 간아세포종(hepatoblastoma); 암육종; 악성 중간엽종; 악성 브레너 종양 (brenner tumor, malignant); 악성 엽상 종양(phyllodes tumor, malignant); 활액 육종; 악성 중피종(mesothelioma, malignant); 미분화배세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 악성 기형종(teratoma, malignant); 악성 난소갑상선종(struma ovarii, malignant); 융모암종; 악성 중신종(mesonephroma, malignant); 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종(hemangiopericytoma, malignant); 림프관 육종; 골육종; 피질주위 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽성 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 골의 거대 세포 종양; 어윙 육종(ewing's sarcoma); 악성 치원성 종양(odontogenic tumor, malignant); 에나멜아세포 치원서육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 에나멜아세포종(ameloblastoma, malignant); 사기질모세포섬유육종; 악성 송과체부종양; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실막세포종(ependymoma); 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지교모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽종양; 소뇌 육종; 신경절아세포종(ganglioneuroblastoma); 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종(meningioma, malignant); 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 악성 신경초종(neurilemmoma, malignant); 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨(hodgkin's); 파라육아종(paragranuloma); 소림프구 악성 림프종(malignant lymphoma, small lymphocytic); 대형 세포 확산 악성 림프종(malignant lymphoma, large cell, diffuse); 여포성 악성 림프종(malignant lymphoma, follicular); 균상식육종(mycosis fungoides); 다른 특정 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/여포 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소 비-절단된 세포 NHL; 벌크 질환 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia); 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프구 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병)(erythroleukemia); 림프구육종 세포 백혈병; 골수백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수 육종; 모발 세포 백혈병; 만성 림프구 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 급성 골수 백혈병 (AML); 및 만성 골수아구성 백혈병.
[00134] 특정 구현예는 백혈병의 치료 방법에 관한 것이다. 백혈병은 혈액암 또는 골수 암이고 혈액 세포, 일반적으로 백혈구 세포 (백혈구)의 비정상적 증식 (증식에 의한 생성)을 특징으로 한다. 이것은 혈액학적 신생물로 불리우는, 광범위한 그룹의 질환의 일부이다. 백혈병은 광범위한 질환을 포괄하는 광범위한 용어이다. 백혈병은 임상적으로 및 병리학적으로 이의 급성 및 만성 형태로 나누어진다.
[00135] 본원 개시내용의 특정 구현예에서, 면역 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 암 또는 감염을 갖는 개체에게 전달된다. 상기 세포는 이어서 각각의 암 또는 병원성 세포를 공격하는 개체의 면역계를 증진시킨다. 일부 경우에, 상기 개체에는 하나 이상의 용량의 면역 세포가 제공된다. 개체에게 2 이상의 용량의 면역 세포가 제공되는 경우에, 투여 사이의 지속 기간은 개체내 증식을 위한 시간을 허용하기 위해 충분해야만 하고 특정 구현예에서, 투여 사이의 지속 기간은 l, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상이다.
[00136] 본원 개시내용의 특정 구현예는 면역-매개된 장애를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 대상체는 자가면역 질환을 갖는다. 자가면역 질환의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 자가면역 애디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트 질환(Behcet's disease), 수포성 유사천포창, 심근증, 셀리악 스페이트-피부염(celiac spate-dermatitis), 만성 피로 면역 기능부전 증후군(CFIDS), 만성 ㅇ며증 탈수초 다발신경병증, 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성 유천포창(cicatrical pemphigoid), CREST 증구훈, 한냉응집질환(cold agglutinin disease), 크론 질환, 원판성 루프스(discoid lupus), 한랭 글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 섬유근통-섬유근염(fibromyalgia-fibromyositis), 사구체신염(glomerulonephritis), 그레이브스 질환(Graves' disease), 길리안-바레(Guillain-Barre), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스(lupus erthematosus), 메니어 질환(Meniere's disease), 혼성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 1형 또는 면역-매개된 진성 당뇨병, 중증 근무력증, 신증후군(예를 들어, 최소 변화 질환, 병소 사구체경화증, 또는 막성 신장병증), 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 악성 빈혈(pernicious anemia), 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군(polyglandular syndromes), 류마티스성 다발근통, 다발근염 및 피부근염, 1차 무감마글로불린혈증, 1차 담즙성 경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노드 현상(Raynaud's phenomenon), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증(scleroderma), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 강직 인간 증후군, 전신 홍반성 낭창, 홍반 루프스, 궤양성 대장염, 포도막염, 맥관염 (예를 들, 결절성 다발관절염( polyarteritis nodosa), 타카야수 관절염(takayasu arteritis), 측두 동맥염(temporal arteritis)/거대 세포 관절염(giant cell arteritis), 또는 피부염 포진 혈관염), 백반증, 및 베게너 육아종증. 본원에 기재된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 자가면역 질환의 일부 예는 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창, I형 진성 당뇨병, 크론 질환; 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 사구체신염, 강직성 척추염, 혈관염 또는 건선을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대상체는 또한 천식과 같은 알레르기 질환을 가질 수 있다.
[00137] 치료학적 유효량의 면역 세포는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 복막내, 근육내, 흉골하 또는 관절내 주사 또는 주입을 포함하는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
[00138] 입양 세포 치료요법에 사용하기 위한 면역 세포의 치료학적 유효량은 치료받는 대상체에서 목적하는 효과를 성취하는 양이다. 예를 들어, 이것은 진행을 억제하거나 자가면역 또는 동종면역 질환의 퇴행을 유발하기 위해 필요하거나 자가면역 질환, 예를 들어, 통증 및 염증에 의해 유발된 증상을 경감시킬 수 있는 면역 세포의 양일 수 있다. 염증, 예를 들어, 암, 부종 및 승온과 같은 염증과 연관된 증상을 경감시키기 위해 필요한 양일 수 있다. 이것은 또한 이식된 기관의 거부를 감소시키거나 방지하는데 필요한 양일 수 있다.
[00139] 면역 세포 집단은 상기 질환에 맞는 치료 용법, 예를 들어, 질환 상태를 개선하기 위해 1일 내지 수일에 걸쳐 단일 용량 또는 수회 용량 또는 질환 진행을 억제하고 질환 재발을 예방하기 위해 연장된 기간 동안 주기적 용량으로 투여될 수 있다. 제형 중에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 의존하고 임상의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. 면역 세포의 치료학적 유효량은 치료받는 대상체, 환부의 중증도 및 유형 및 투여 방식에 의존한다. 일부 구현예에서, 사람 대상체의 치료에 사용될 수 있는 용량은 적어도 3.8×104, 적어도 3.8×105, 적어도 3.8×106, 적어도 3.8×107, 적어도 3.8×108, 적어도 3.8×109, 또는 적어도 3.8×1010 면역 세포/m2의 범위이다. 특정 구현예에서, 사람 대상체의 치료에 사용되는 용량은 약 3.8×109 내지 약 3.8×1010 면역 세포/m2의 범위이다. 추가의 구현예에서, 면역 세포의 치료학적 유효량은 체중 kg 당 약 5×106 세포 내지 체중 kg 당 약 7.5×108 세포, 예를 들어, 체중 kg 당 약 2×107 세포 내지 약 5×108 세포, 또는 체중 kg 당 약 5×107 세포 내지 약 2×108 세포로 다양할 수 있다. 면역 세포의 정확한 양은 대상체의 연령, 체중, 성별 및 생리학적 병태를 기준으로 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
[00140] 면역 세포는 면역 매개된 장애의 치료를 위해 하나 이상의 다른 치료학적 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합 치료요법은 하나 이상의 항-미생물 제제(예를 들어, 항생제, 항-바이러스 제제 및 항-진균제), 항-종양 제제(예를 들어, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 플루다라빈, 에토포시드, 독소루비신, 또는 빈크리스틴), 면역-고갈 제제(예를 들어, 플루다라빈, 에토포시드, 독소루비신, 또는 빈크리스틴), 면역억제제 (예를 들어, 아자티오프린, 또는 글루코코르티코이드, 예를 들어, 덱사메타손 또는 프레드니손), 소염제 (예를 들어, 글루코코르티코이드, 예를 들어, 하이드로코르티손, 덱사메타손 또는 프레드니손, 또는 비-스테로이드성 소염제, 예를 들어, 아세틸살리실산, 이부프로펜 또는 나프록센 나트륨), 사이토카인(예를 들어, 인터류킨-10 또는 형질전환 성장 인자-베타), 호르몬(예를 들어, 에스트로겐), 또는 백신을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 칼시뉴린 억제제(예를 들어, 사이클로스포린 및 타크롤리무스); mTOR 억제제 (예르 들어, 라파마이신); 마이코페놀레이트 모페틸, 항체 (예를 들어, CD3, CD4, CD40, CD154, CD45, IVIG, 또는 B 세포를 인지하는); 화학치료학적 제제(예를 들어, 메토트렉세이트, 트레오설판, 부설판); 조사; 또는 케모킨, 인터류킨 또는 이들의 억제제(예를 들어, BAFF, IL-2, 항-IL-2R, IL-4, JAK 키나제 억제제)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역억제 또는 관용성 제제가 투여될 수 있다. 상기 추가의 약제학적 제제는 목적하는 효과에 의존하여 면역 세포의 투여 전, 투여 동안에 또는 투여 후 투여될 수 있다. 세포 및 제제는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 및 동일 부위에 또는 상이한 부위에 투여될 수 있다.
B. 약제학적 조성물
[00141] 또한 본원에서 면역 세포 (예를 들어, T 세포 및 NK 세포) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 제공된다.
[00142] 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로, 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 항체 또는 폴리펩타이드)을 혼합함에 의해 제조할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012). 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅 제제, 예를 들어, EDTA; 슈가, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 역이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn- 단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
C. 조합 치료요법
[00143] 특정 구현예에서, 본 구현예의 조성물 및 방법은 적어도 하나의 추가의 치료요법과 조합된 면역 세포 집단을 포함한다. 추가의 치료요법은 방사선 치료요법, 수술 (예를 들어, 종괴절제술 및 유방절제술), 화학치료요법, 유전자 치료요법, DNA 치료요법, 바이러스 치료요법, RNA 치료요법, 면역치료요법, 골수 이식, 나노치료요법, 모노클로날 항체 치료요법, 또는 이전의 치료 조합일 수 있다. 추가의 치료요법은 보조제 또는 신규보조제 치료요법 형태일 수 있다.
[00144] 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 소분자 효소 억제제 또는 항-전이성 제제의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 부작용 제한 제제 (예를 들어, 항오심 제제 등과 같은 치료의 부작용의 발병 및/또는 중증도를 감소시키는 것으로 의도된 제제)의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 수술이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법과 수술의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료요법은 감마 방사선 조사이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 PBK/AKT/mTOR 경로, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 아폽토시스 억제제, 및/또는 화학예방제를 표적화하는 치료요법이다. 추가의 치료요법은 당업계에 공지된 하나 이상의 화학치료학적 제제일 수 있다.
[00145] 면역 세포 치료요법은 면역 관문 치료요법과 같은 추가의 암 치료요법과 관련하여, 치료요법 전, 치료요법 동안에, 치료요법 후 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 내지 수분 내지 수일 내지 수주 범위의 간격일 수 있다. 면역 세포 치료요법이 추가의 치료학적 제제와는 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 당업자는 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 충분한 시기가 만료되지 않도록 보장하여 2개의 화합물은 여전히 환자에 대한 유리한 조합 효과를 발휘할 수 있다. 상기 경우에, 당업자는 환자에게 항체 치료요법 및 항암 치료요법이 서로 약 12 내지 24 또는 72 h 내에, 보다 특히 서로 약 6-12 h 내에 항체 치료요법 및 항암 치료요법이 제공될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 각각의 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과하는 경우, 치료를 위한 시기를 유의적으로 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
[00146] 다양한 조합이 사용될 수 있다. 하기 예시에 대해, CAR 면역 세포 치료요법은 “A”이고 항암 치료요법은 “B”이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[00147] 본 구현예의 임의의 화합물 또는 치료요법의 환자로의 투여는 경우에 따라 제제의 독성을 고려하여 상기 화합물의 투여를 위한 일반 프로토콜에 따른다. 따라서, 일부 구현예에서, 조합 치료요법에 기인할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
1. 화학치료요법
[00148] 광범위한 화학치료학적 제제는 본 발명의 구현예에 따라 사용될 수 있다. 용어 “화학치료요법”은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 언급한다. “화학치료학적 제제”는 암의 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하기 위해 사용된다. 이들 제제 또는 약물은 이들이 세포 주기에 영향을 미칠지 및 어느 단계에서 영향을 미칠지와 같은 세포 내 이들의 활성 방식에 의해 분류된다. 대안적으로, 제제는 DNA를 직접 가교결합시키거나 DNA에 삽입되거나 핵산 합성에 영향을 미침에 의해 염색체 및 유사분열 일탈을 유도하는 이의 능력을 기준으로 특징 분석될 수 있다.
[00149] 화학치료학적 제제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드,트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함하는); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함하는); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체 , KW-2189 및 CB1-TM1을 포함하는); 엘레우트레오빈; 판크라티스타틴; 사코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감몰 및 칼리케아미신 오메가I1); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스퍼라미신; 및 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라르니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모프폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함하는), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스톨락톤; 항-부신제(anti-adrenal), 예를 들어, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 이오니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2”-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (“Ara-C”); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 플라티늄 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들어, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티늄, 및 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 상기 임의의 유도체를 포함한다.
2. 방사선 치료요법
[00150] DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어온 다른 인자들은 통상적으로 γ-선, X-선, 및/또는 방사성 동위원소의 종양 세포의 직접적인 전달로서 공지된 것을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려되고, 예를 들어, 마이크로파, 양성자 빔 조사, 및 UV-조사가 있다. 모든 이들 인자들은 DNA에 대해, DNA의 전구체에 대해, DNA의 복제 및 복구에 대해 및 염색체의 어셈블리 및 유지에 대해 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 높다. X-선에 대한 용량 범위는 장기간 (3 내지 4주) 동안 하루 50 내지 200 뢴트겐로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량의 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 용량 범위는 매우 다양하고 동위원소의 반감기, 방출된 방사선 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
3. 면역치료요법
[00151] 당업자는 추가의 면역치료요법이 구현예의 방법과 조합하거나 연계하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료와 관련하여, 면역치료제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자에 의존한다. 리툭시맙 (RITUXAN®)은 그러한 예이다. 면역 이펙터는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 단독의 항체는 치료요법의 이펙터로서 작용할 수 있거나 이것은 실제로 세포 사멸에 영향을 미치는 다른 세포를 동원할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학치료제, 방사성핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소) 등에 접합될 수 있고 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 직접적으로 또는 간접적으로 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자를 함유하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
[00152] 항체-약물 접합체 (ADC)는 세포-사멸 약물에 공유적으로 연결된 모노클로날 항체 (Mab)를 포함하고 조합 치료요법에 사용될 수 있다. 상기 접근법은 이들의 항원 표적에 대한 고특이성의 Mab와 상당히 강력한 세포독성 약물을 조합하여 농축된 수준의 항원과 함께 페이로드 (약물)를 종양 세포에 전달하는 “무장된(armed)” Mab를 유도한다. 약물의 표적화된 전달은 또한 정상 조직에서 이의 노출을 최소화하여 감소된 독성 및 개선된 치료학적 지수를 유도한다. 예시적인 ADC 약물은 ADCETRIS® (브렌툭시맙 베도틴) 및 KADCYLA® (트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)을 포함한다.
[00153] 면역치료요볍의 하나의 양상에서, 종양 세포는 표적화에 순응할 수 있는, 즉 대다수의 다른 세포 상에 존재하지 않는 일부 마커를 함유해야만 한다. 많은 종양 마커가 존재하고 임의의 이들 마커는 본 발명의 구현예와 관련하여 표적화를 위해 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B, 및 p155를 포함한다. 면역치료요법의 대안적 양상은 항암 효과를 면역 자극 효과와 조합하는 것이다. 면역 자극 분자는 또한 다음을 포함한다: 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모킨, 예를 들어, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어, FLT3 리간드.
[00154] 면역치료요법의 예는 면역 애쥬번트(예를 들어, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물); 사이토카인 치료요법, 예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF, 및 TNF; 유전자 치료요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2, 및 p53; 및 모노클로날 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오시드 GM2, 및 항-p185를 포함한다. 하나 이상의 항암 치료요법은 본원에 기재된 항체 치료요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
[00155] 일부 구현예에서, 면역치료요법은 면역 관문 억제제일 수 있다. 면역 관문은 신호 (예를 들어, 동시 자극 분자)를 상향시키거나 신호를 하향시킨다. 면역 관문 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 관문은 아데노신 A2A 수용체 (A2AR), B7-H3 (또한 CD276로서 공지된), B 및 T 림프구 약화인자 (BTLA), 세포독성 T-림프구-연합 단백질 4 (CTLA-4, 또한 CD152로서 공지된), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 킬러-세포 면역글로불린 (KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 서프레서(VISTA)를 포함한다. 특히, 면역 관문 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.
[00156] 면역 관문 억제제는 소분자, 재조합 형태의 리간드 또는 수용체와 같은 약물일 수 있거나, 특히 항체, 예를 들어, 사람 항체이다. 면역 관문 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제가 사용될 수 있고 특히 키메라화된, 사람화된 또는 사람 형태의 항체가 사용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 대안적 및/또는 균등한 명칭이 본원 개시내용에 언급된 특정 항체에 대해 사용될 수 있다. 상기 대안적 및/또는 균등한 명칭은 본원 개시내용과 관련하여 상호교환될 수 있다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 대안적 및 균등한 명칭인 MK-3475 및 펨브롤리주맙으로 공지되어 있다.
[00157] 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 이의 리간드 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 PDL1의 이의 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 PDL2의 이의 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
[00158] 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예를 들어, 사람 항체, 사람화된 항체 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 면역어드헤신　(예를 들어,　불변 영역 (예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO®로서 공지된 니볼루맙은 사용될 수 있는 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA®, 및 SCH-900475로서 또한 공지된 펨브롤리주맙은 예시적인 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로서 또한 공지된 CT-011은 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로서 또한 공지된 AMP-224는 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
[00159] 본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 관문은 CD152로서 공지된 세포독성 T-림프구-연합된 단백질 4 (CTLA-4)이다. 사람 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 승인 번호 L15006을 갖는다. CTLA-4는 T 세포의 표면 상에서 발견되고 항원-제공 세포의 표면 상에 CD80 또는 CD86에 결합하는 경우 “오프” 스위치로서 작용한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면상에서 발현되고 억제 신호를 T 세포에 전송하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. CTLA4는 T-세포 동시 자극 단백질 CD28과 유사하고 2개의 분자는 각각 항원-제공 세포 상에서 B7-1 및 B7-2으로 불리우는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 억제 신호를 T 세포에 전송하는 반면 CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 또한 조절 T 세포에서 발견되고 이들의 기능을 위해 중요할 수 있다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제 수용체인, CTLA-4의 증가된 발현을 유도한다.
[00160] 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 사람 항체, 사람화된 항체, 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.
[00161] 본 발명의 방법에 사용하기 위해 적합한 항-사람-CTLA-4 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당업계에서 인지된 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(또한 10D1, MDX- 010, MDX- 101, 및 Yervoy®로서 공지된) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체이다. 다른 구현예에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 CTLA-4상의 동일한 항체에 결합하는 것에 경쟁하고/하거나 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90%의 가변 영역 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 가변 영역 동일성)을 갖는다.
4. 수술
[00162] 암을 갖는 사람의 대략 60%는 동일한 유형의 수술을 진행하고 이는 예방적, 진단학적 또는 단계 결정, 치유적 및 일시적인 수술을 포함한다. 치유적 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거되고, 절제되고/되거나 파괴된 절제술을 포함하고 본 발명의 구현예의 치료, 화학치료요법, 방사성 치료요법, 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법 및/또는 대안적 치료요법과 같은 다른 치료요법과 연계하여 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 언급한다. 종양 절제술에 추가로, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경적으로 제어된 수술(모흐 수술(Mohs’ surgery))을 포함한다.
[00163] 암성 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제 시, 공동이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접적인 주사 또는 추가의 항암 치료요법을 사용한 영역의 국소 적용에 의해 성취될 수 있다. 상기 치료는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주 마다, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 용량일 수 있다.
5. 다른 제제
[00164] 다른 제제는 치료의 치료학적 효능을 개선시키기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이들 추가의 제제는 세포 표면 수용체 및 GAP 접속부의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포증식 억제 및 분화제, 세포 접착의 억제제, 과증식성 세포의 아폽토시스 유도제에 대한 민감성을 증가시키는 제제 또는 다른 생물학적 제제를 포함한다. GAP 접속부의 수를 상승시킴에 의한 세포내 신호전달의 증가는 이웃하는 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 세포증식억제 또는 분화제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선시키기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있다. 세포 접착의 억제제는 본 구현예의 효능을 개선시키는 것으로 고려된다. 세포 접착 억제제의 예는 병소 접착 키나제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 과증식성 세포의 아폽토시스에 대한 민감성을 증가시키는 다른 제제, 예를 들어, 항체 c225는 치료 효능을 개선하기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
IV. 제품 또는 키트
[00165] 면역 세포를 포함하는 제품 또는 키트가 또한 본원에 제공된다. 제품 또는 키트는 추가로 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키거나 암을 갖는 개체의 면역 기능을 증진시키기 위해 면역 세포를 사용하기 위한 지침서를 포함하는 팩키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 항원-특이적 면역 세포는 제품 또는 키트에 포함될 수 있다. 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 시린지를 포함한다. 컨테이너는 다양한 재료, 예를 들어, 유리, 플라스틱 (예를 들어, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀), 또는 금속 합금 (예를 들어, 스테인레스강 또는 하스텔로이)으로부터 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 컨테이너는 제형 및 이의 위에 또는 연합된 표지를 보유하고, 상기 컨테이너는 사용 지침을 지적할 수 있다. 제품 또는 키트는 추가로 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 시린지 및 팩키지 삽입물을 사용 지침서와 함께 포함하는, 상업적 및 사용자 견지에서 요구될 수 있는 다른 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제품은 추가로 하나 이상의 또 다른 제제 (예를 들어, 화학치료학적 제제 및 항-신생물제)를 포함한다. 하나 이상의 제제를 위해 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 시린지를 포함한다.
V. 실시예
[00166] 하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 구현예를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 구현예에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - CAR-T 세포의 단백질 L 활성화 및 확장
[00167] 단백질 L은 CAR-T 세포 확장을 유도한다: 에피좀 벡터를 사용하여 말초 혈액 T 세포 (TiPSC)로부터 재프로그래밍된 E11 만능 줄기 세포는 FMC63 모노클로날 항체-유래된 인간 CD19-결합 scFv 도메인, CD28 동시-자극 및 CD3ζ 신호전달 도메인으로 이루어진 2세대 항-인간 CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항시성 발현을 위해 변형시켰다.
[00168] 비-변형된 및 CAR-변형된 E11 TiPSC는 사이토카인-지시된 분화를 통해 T/NK CD34+ 전구체로 분화시켰다. 단리된 CD34+ 전구체는 추가로 아스코르브산 인산마그네슘(0.25 mM), 니코틴아미드 (2 mM), GlutaMax (Gibco) 및 사이토카인 (SCF, TPO, FLT3L, IL7; 각각 50 ng/ml로)이 보충된 StemSpan SFEM (Stem Cell Technologies)로 이루어진 T 세포 분화 배지 (TCDM)에서 DLL4/레트로넥틴-코팅된 플레이트 상에 2주 저산소 배양 중에서 CD3+ T 세포로 분화시켰다.
[00169] CAR-T 세포는 레트로넥틴 (Takara; 0.5㎍/cm2) 및 인간 DLL4-Fc (Acro Biosystems; 0.5㎍/cm2)의 존재 또는 부재하에 IL2 및 IL15 (둘다 10ng/mL로)가 보충된 TCDM에서 10,000 CD3+ T 세포/cm2 밀도로 상이한 농도의 단백질 L(Pierce; 0, 0.1, 0.5, 2.5㎍/cm2)로 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 배양은 저산소 (5% O2) 조건에서 유지시키고 10일 후 수거하였다. 총 수거된 세포를 계수하고 CD3+ 세포의 퍼센트를 결정하고, 배수 T 세포 확장을 계산하였다(아웃풋/인풋 T 세포 수).
[00170] 단백질 L은 용량-의존적 방식으로 CAR-T 세포의 확장을 유도하였지만; 레트로넥틴은 상기 증식 반응을 증진시켰다(도 1). DLL4는 또한 CAR-T 세포의 단백질 L-의존성 확장을 상당히 개선시키는 보충적 T 세포 성장 인자이다. 저산소 환경은 병행 정상 산소 배양이 시험된 변이체에서 하위의 확장 수율을 나타냄으로 효율적인 CAR-T 세포 확장을 성취하기 위해 사용하였다.
[00171] DLL4는 CD8+ CAR-T 확장을 촉진시킨다: CD8 발현은 렉트로넥틴 및 DLL4-Fc (모두 0.5㎍/cm2로 사용됨) (도 2)와 조합된 단백질 L 상에서의 10일 확장 배양으로부터 수거된 CAR-T 세포에서 결정하였다.
[00172] 단백질 L 및 레트로넥틴 조합은 단독의 단백질 L과 비교하여 효율적인 CAR-T 확장을 유도하였지만, 많은 보다 높은 확장률에도 불구하고, CD8 발현은 낮게 유지되었다. 대조적으로, DLL4가 첨가된 경우, CAR-T 확장률에서 추가로 ~25% 개선과 함께, 상당한 비율의 CD3+ T 세포가 CD8 발현을 획득하였다(도 2).
[00173] 단백질 L에 의해 유도된 CAR-특이적 T 세포 확장: 단백질 L 배양물 중에 CAR-유도된 T 세포 확장의 특이성은 CD3-유도된 범-T 세포 (대조군) 및 단백질 L-유도된 확장 배양물 둘다에서 확장을 위해 플레이팅된 CAR-변형된 것 대 비-변형된 T 세포를 사용하여 입증되었다. CAR-변형된 및 비-변형된 E11-유래된 T 세포는 배양 변이물 둘다에서 레트로넥틴과 DLL4-Fc (각각 0.5㎍/cm2)함께 항-CD3 모노클로날 항체 (OKT3 클론; 0.5㎍/cm2) 또는 단백질 L(0.5㎍/cm2)로 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 세포는 IL2 및 IL15 (둘다 10 ng/ml로)로 보충된 TCDM에서 10,000 CD3+ T 세포/cm2 밀도로 플레이팅하였다. 8일 후, 세포를 수거하고, 계수하고, CD3+의 퍼센트를 결정하고 배수 T 세포 확장을 계산하였다(아웃풋/인풋 T 세포 수) (도 3).
[00174] T 및 CAR-T 세포 둘다가 유사한 효율로 증식하는 CD-3 활성화된 배양과는 대조적으로, CAR-T 세포의 배타적 확장은 단백질 L 배양물에서 관찰되었다. 항-CD3 및 단백질 L 배양물 중에서 CAR-T 세포 확장의 효율은 유사하였다. 확장된 CAR-T 세포에서 CAR 발현이 단백질 L 염색에 의해 결정된 경우, 유의적으로 보다 높은 비율의 CAR+ T 세포는 단백질 L-확장된 CAR-T 집단에서 발견되었고, 이는 단백질 L 배양물에서 CAR+ T 세포의 양성 선택을 지적한다.
[00175] 단백질 L-확장된 CAR-T 세포에서 사이토카인 생성: 항-CD3 mAb 및 단백질 L 배양물에서 8일 확장된 CAR-T 세포는 비-형질감염된 P815 세포 (대조군)와 사람 CD19 CAR 항원으로 형질감염된 P815 세포와 항온처리하였다. CAR-T 이펙터 (E) 및 P815 표적 (T) 세포는 105 및 2x105/ml (1:2 E/T 비율)의 동시-배양물 중에 첨가하였다. 상등액은 LegendPlex 멀티플렉스 유동 세포측정 검정(BioLegend)에 의한 사이토카인 분석을 위해 24시간 후 수거하였다.
[00176] 비-형질감염된 P815 세포와 CAR-T 동시 배양물은 어떠한 유의적인 표적 세포-유도성 사이토카인 생성을 나타내지 않는 반면, CD19+ P815 세포와의 배양물은 IFNγ, TNFα, 그랜자임 B, sFasL, CCL3, CCL2, GM-CSF, IL2 및 IL13의 유도성 생성을 나타냈고; 따라서 CAR 활성화에 응답하여 생성된 사이토카인 세트를 한정한다. 사이토카인 분비 프로필은 항-CD3 mAb 또는 단백질-L 배양물에서 확장된 CAR-T 세포에서 유사하였지만, 보다 높은 IFNγ 및 TNFα 수준은 단백질 L 확장된 CAR-T 세포에서 검출되었다(도 4a).
[00177] 단백질 L에 의해 유도된 CAR-의존성 시험관내 사이토카인 생성. CAR 활성화에 의해 유도된 사이토카인 생성은 CAR-T 세포를 플라스틱-흡착된 단백질 L과 항온처리함에 의해 평가하였다. E11 PSC-유래된 CAR-T 세포는 단백질 L 및 레트로넥틴 (둘다 0.5㎍/cm2로), 또는 단독의 레트로넥틴 (대조군)으로 코팅된 웰에 첨가하였다. 세포는 0.5 mL TCDM에서 20000/웰 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 항온처리 후, 상등액은 LegendPlex 멀티플렉스 유동 세포측정 검정 (BioLegend)에 의한 사이토카인 분석을 위해 수거하였다.
[00178] CAR-T 세포는 단독의 레트로넥틴으로 코팅된 웰에서 24시간 항온처리 동안에 그랜자임 B (GzmB), CCL3 및 저수준의 GM-CSF 및 IL13을 생성하였다. CAR-T 세포가 단백질 L로 코팅된 웰에서 항온처리된 경우, TNFα, IP10, IFNγ, sFasL 및 IL6의 유도가 검출되었고, 따라서 단백질 L에 의해 유도된 CAR-의존성 사이토카인 생성 반응을 밝힌다(도 4b). CAR-변형된 면역 세포의 단백질 L로의 처리를 사용하여 사이토카인 생성을 포함하는, 시험관내 CAR-의존성 기능성 반응을 평가할 수 있다.
[00179] 단백질 L-확장된 CAR-T 세포에서 세포독성 활성 항-CD3 모노클로날 항체 및 단백질 L 배양물 중에서 8일 확장된 CAR-T 세포의 세포독성 기능은 루시퍼라제-발현 비-형질감염된 P815 세포 (대조군), 사람 CD19 CAR 항원으로 형질감염된 P815 세포, CD19+ B 세포 림프종 Daudi 및 Raji에 대한 시험관내 세포독성 검정을 사용하여 평가하였다(도 5). CAR-T 이펙터 (E) 세포는 1:2 E/T 비율에서 종양 표적 (T) 세포와 24시간 항온처리하였고, 루시퍼라제 활성은 안정한-Glo 루시퍼라제 검정 시약 (Promega)에 의해 배양 용해물에서 정량하였다. 24시간 세포독성 배양물 중에 표적 세포의 절대 수는 각각의 표적 세포 표준물의 연속 희석에 대한 보정에 의해 결정하였다. 세포독성은 단일 이펙터 세포에 의해 용해되고 하기의 식에 의해 계산된 표적 세포의 절대 수로서 표현한다: (T 대조군 - T 실험) / E, 여기서, “실험” 및 “대조군” - 각각 이펙터 세포가 존재하고 부재인 표적 세포 배양물; T 및 E - 각각 표적 및 이펙터 세포의 절대 수. 추가로, 단백질 L 배양물 중에서 확장된 CAR-T 세포의 세포독성 기능은 항온처리물 S3 생존 세포 분석 시스템 (Essen Biosciences)을 사용하는 실시간 GFP+ 세포 계수에 의해 GFP 발현 Raji 세포에 대해 입증하였다.
[00180] 최소 세포독성은 CD19 CAR 항원-음성 P815 세포와의 배양물에서 검출된 반면, 항-CD3 모노클로날 항체 및 단백질 L 확장된 CAR-T 세포 둘다는 CD19+ P815, Daudi 및 Raji 세포에 대해 강한 세포독성 활성을 나타냈다. 주목할만하게, 단백질 L-확장된 CAR-T 세포는 항-CD3 모노클로날 항체 배양물 중에서 확장된 CAR-T 세포 보다 ~2-3x 높은 세포독성 활성을 나타냈다. 단백질 L-확장된 CAR-T 세포의 세포용해 활성은 또한 GFP+ Raji 세포와의 배양물에서 확인되었고, 여기서, GFP+ 생존 세포 수에서 유의적 감소는 비-변형된 T 세포가 아닌 CAR-T 세포의 배양물에서만 검출되었다.
[00181] 단백질 L-확장된 CAR-T 세포의 항-종양 잠재력: 8-주령의 NSG 마우스에 복막내 (ip)로 루시퍼라제-발현 Daudi 세포를 주사하였다. 4일 후, 종양 세포 접종이 대조군 이미지화로 확인된 경우, 마우스는 대조군 (종양 단독) 및 항-CD3 모노클로날 항체 또는 단백질 L 배양물 중에서 확장된 CAR-T 세포로 처리된 2개의 실험 그룹으로 나누었다. CAR-T 세포에 2-일 간격으로 2회 주사하였다. CAR-T 주사 및 추가의 1주 동안에, 모든 마우스에 (ip)로 IL2 및 IL15 사이토카인을 주사하였다. 종양 진행은 생발광 생체내 이미지화에 의해 주마다 모니터링하였다. InVivo-Glo 루시페린 (Promega)이 주사(ip)된 마취된 마우스는 펄 트리로지(Pearl Trilogy) 생체내 이미지화기(LiCor)를 사용하여 루시페린 주사 후 15분 이내에 분석하였다. 지정된 그룹 내 마우스의 이미지를 나타낸다(좌측 패널). 생체내 종양 성장은 이미지 스튜디오 소프트웨어 (LiCor)를 사용한 생발광 신호 강도 (BLI)의 정량에 평가하였다. 그래프는 시간 경과에 따른 각각의 그룹에서 평균 ± STD BLI 값을 보여준다.
[00182] 종양 성장은 CAR-T 주사 후 6주까지 CAR-T 세포로 처리된 마우스에서 유의적으로 억제되는 것으로 관찰되었다(도 6). 시험관내 세포독성 잠재력에 따라, 생체내 항-종양 효과는 단백질 L 배양물에서 확장된 CAR-T 세포에서 보다 높았다.
* * *
[00183] 본원에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.
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U.S. Patent No. 8,372,642
Zheng et al., J Transl Med, 10:29, 2012.

Claims (53)

  1. CAR-변형된 면역 세포의 활성화 및/또는 확장을 위한 시험관내 방법으로서, 상기 방법이:
    (a) CAR-변형된 면역 세포의 출발 집단을 수득하는 단계 및
    (b) 상기 CAR-변형된 면역 세포의 집단을, 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포의 집단을 생성하기 위해 충분한 기간 동안 단백질 L의 존재하에 배양하는 단계
    를 포함하는, 시험관내 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 L이 배양 표면 상에 코팅된, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 배양 표면이 배양 플레이트, 배양 플라스크, 마이크로캐리어, 마이크로입자, 하이드로겔 입자 또는 배양 백인, 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 배양이 항-CD3 항체 및/또는 항원-특이적 표적 세포의 부재하에 수행되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 CAR-변형된 면역 세포가 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, αβ T 세포 또는 γδ T 세포인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법이 CD8+ T 세포에 대해 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 CAR-변형된 면역 세포가 동종이계인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 CAR-변형된 면역 세포가 자가유래인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 CAR-변형된 면역 세포가 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 유래하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PSC가 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 iPSC가 혈액 세포로부터 재프로그래밍된, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 iPSC가 T 세포로부터 재프로그래밍된, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 iPSC가 에피좀적으로 재프로그래밍된, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 CAR-변형된 면역 세포가 1차 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 1차 조혈 줄기 세포로부터 유래하는, 방법.
  16. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC가 사이토카인-지시된 분화를 통해 CD34+ 전구체로 분화된, 방법.
  17. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC가 정배향 프로그래밍을 통해 CD34+ 전구체로 분화된, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 CAR이 F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv, 및 scFv로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 CAR이 CD28 동시-자극 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  20. 제2항에 있어서, 상기 배양 표면이 추가로 레트로넥틴, 피브로넥틴 또는 VCAM1으로 코팅된, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 레트로넥틴이 0.1 내지 1㎍/cm2의 농도로 존재하는, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 레트로넥틴이 0.5㎍/cm2의 농도로 존재하는, 방법.
  23. 제2항 또는 제20항에 있어서, 상기 배양 표면이 추가로 노치 (Notch) 리간드 DLL4로 코팅된, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 DLL4가 0.1 내지 1㎍/cm2의 농도로 존재하는, 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 DLL4가 0.5㎍/cm2의 농도로 존재하는, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 배양이 IL-2 및/또는 IL-15의 존재하에 수행되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 IL-12 및/또는 IL-15가 5 내지 15ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 IL-12 및/또는 IL-15가 약 10ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 배양이 저산소 조건하에 수행되는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 저산소 조건이 5% 산소를 포함하는, 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 충분한 기간이 8 내지 12일인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 충분한 기간이 8, 9, 또는 10일인, 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 배양이 SCF, TPO, FLT3L, 및/또는 IL-7을 포함하는 배지에서 수행되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 SCF, TPO, FLT3L, 및/또는 IL-7이 50ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 배지가 니코틴아미드를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제1항에 있어서, 상기 방법이 비-CAR-변형된 면역 세포와 비교하여 CAR-변형된 면역 세포의 선택적 확장을 유도하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 CAR-변형된 면역 세포의 확장된 집단의 적어도 40% 또는 50%가 CAR-변형된 면역 세포인, 방법.
  38. 제5항에 있어서, 상기 CAR-변형된 T 세포의 확장된 집단이 적어도 25%의 CD3+CD8+ CAR-변형된 T 세포를 포함하는, 방법.
  39. 제5항에 있어서, 상기 CAR-변형된 T 세포의 확장된 집단이 항-CD3 확장된 CAR-변형된 T 세포와 비교하여 2 내지 3배 높은 세포독성 활성을 포함하는, 방법.
  40. 제5항에 있어서, 상기 CAR-변형된 T 세포의 확장된 집단이 항-CD3 확장된 CAR-변형된 T 세포와 비교하여 증가된 IFNγ 및/또는 TNFα 수준을 포함하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포의 집단.
  42. 제41항의 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포의 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  43. 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 제41항의 치료학적 유효량의 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포가 동종이계인, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포가 자가유래인, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 적어도 제2 치료학적 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 적어도 제2 치료학적 제제가 치료학적 유효량의 면역조절제 또는 면역억제제인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 적어도 제2 치료학적 제제가 화학치료요법, 방사선치료요법 및 면역치료요법으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 활성화되고/되거나 확장된 CAR-변형된 면역 세포 및/또는 상기 적어도 제2 치료학적 제제가 정맥내로, 복막내로, 기관내, 종양내, 근육내, 내시경으로, 병변내, 경피적으로, 피하내, 국부적으로, 직접 주사 또는 관류에 의해 투여되는, 방법.
  50. 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 암 치료를 위한 제41항 또는 제42항의 조성물의 용도.
  51. CAR-변형된 면역 세포 및 단백질 L을 포함하는 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 단백질 L이 배양 표면 상에 코팅된, 조성물.
  53. 제51항에 있어서, 레트로넥틴을 추가로 포함하는, 조성물.

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