KR20210058902A - sPD-1 변이체-FC 융합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질에 관한 것이다.

Description

sPD-1 변이체-FC 융합 단백질
I. 관련 출원의 전후 참조
본 출원은 2018년 9월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/731,488 및 2019년 8월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/888,320을 우선권으로 주장하며, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함된다.
II. 발명의 분야
본 발명은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제조하는 방법, 및 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을, 예를 들어, 암, 감염 등과 같은 질병을 치료하는데 사용하는 방법에 관한 것이다.
III. 발명의 배경
PD-1(프로그램된 세포 사멸 1)은 활성화된 T 세포 및 B 세포에 의해 발현되는 중요한 면역 체크포인트 수용체이다. 이것은 면역억제를 매개하는 기능을 한다. PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 발현된다. PD-1에 대한 리간드는 프로그램된 세포 사멸 1 리간드 1(PD-L1, 대안적으로 B7-H1) 및 프로그램된 세포 사멸 1 리간드 2(PD-L2, 대안적으로 B7-DC)이며, 이들은 많은 종양 세포 및 항원-제시 세포, 예를 들어, 단핵구, 수지상 세포(DC) 및 대식세포에서 발현된다.
PD-1은 세포외 영역에 단일 Ig V-유사 도메인을 함유하는 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리의 구성원이다. PD-1 세포질 도메인은 2개의 티로신을 함유하며, 대부분의 막-근위 티로신은 면역-수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM) 내에 위치한다. PD-1은 세포질 도메인을 통해 세포질 포스파타제를 동원함으로써 항원 수용체 신호 전달을 약화시킨다. 인간 및 뮤린 PD-1 단백질은 4개의 잠재적인 N-글리코실화 부위 및 Ig-V 도메인을 정의하는 잔기의 보존과 함께 약 60% 아미노산 동일성을 공유한다.
PD-1은 T 세포에서 유도될 때 음성 면역 반응 신호를 전달하는 역할을 한다. 리간드 중 하나에 대한 선택적 결합을 통한 PD-1의 활성화는 T 세포 증식 및/또는 T 세포 반응의 강도 및/또는 지속 기간을 감소시키는 억제성 면역 반응을 활성화시킨다. PD-1은 또한 감염 또는 종양 진행에 반응하여 말초 조직에서 이펙터 T 세포 활성을 조절한다(Pardoll, Nat Rev Cancer, 2012, 12(4):252-264).
부차적 조직 손상을 완화시키기 위해 일반적으로 면역 반응을 종결시키는 PD-1 신호 전달 경로와 같은 내인성 면역 체크포인트는 면역 파괴를 피하기 위해 종양에 의해 포섭될 수 있다. 암에서 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용은 종양-침윤성 면역 세포의 수를 감소시키고, 암 세포에 대한 면역 반응을 억제할 수 있다. PD-1에 결합시 T 세포 활성화 및 사이토카인 분비의 하향조절이 여러 인간 암에서 관찰되었다(Freeman et al., J Exp Med, 2000, 192(7):1027-34; Latchman et al, Nat Immunol, 2001, 2(3):261-8). 또한, PD-1 리간드 PD-L1은 유방암, 결장암, 식도암, 위암, 신경아교종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 다발성 골수종, 난소암, 췌장암, 신장 세포 암종 및 요로 상피암을 포함하는 많은 암에서 과발현된다. 또한 암 환자는 면역 세포에 의한 PD-1/PD-L1 상호작용의 증가로 인해 제한적이거나 감소된 적응성 면역 반응을 갖는 것으로 나타났다. 활성화된 PD-1 신호 전달의 이러한 증가는 바이러스 감염 환자에서도 관찰되었다. 예를 들어, B형 및 C형 간염 바이러스는 간세포에서 PD-1 리간드의 과발현을 유도하고, 이펙터 T-세포에서 PD-1 신호 전달을 활성화할 수 있다. 이는 차례로 바이러스 감염에 대한 T-세포 고갈 및 면역 내성으로 이어진다(Boni et al., J Virol, 2007, 81: 4215-4225; Golden-Mason et al, J Immunol, 2008, 180: 3637- 3641).
피딜리주맙, 펨브롤리주맙(Keytruda®) 및 니볼루맙(Opdivo®)과 같은 현재의 PD-1 길항제는 신체의 모든 림프 세포에서 PD-1을 표적화하는 항체이다. 이러한 항체는 PD-1에 대한 나노몰 친화성을 가지며, 이는 면역 시냅스 내에서 PD-1과 이의 리간드 사이의 상호작용, 예를 들어, 항원-제시 세포와 림프구 사이의 계면보다 약하다.
암 또는 감염 환자에서 적응 면역의 억제를 완화시키거나 역전시킬 수 있는 효과적인 단백질-기반 치료용 치료가 당 분야에 필요하다. 본 발명은 이러한 요구 및 다른 요구를 만족시킨다.
본 발명의 목적은 개선된 특성을 갖는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 증가된 결합 친화성 및 증가된 단백질 안정성 등)뿐만 아니라 암 및/또는 감염 환자를 치료하는데 있어서 그러한 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제조하고 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
IV. 발명의 간단한 개요
본 발명은, 특히, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제조하는 방법, 및 특히 적응성 면역 시스템이 억제되거나 면역 반응의 크기 또는 수준의 증가가 필요한 질병 또는 장애를 치료하기 위해 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 암 또는 만성 바이러스 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 암 치료를 위한 애주번트 요법으로서 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다:
a) SEQ ID NO:1과 비교하여 아미노산 치환을 포함하는 가용성 PD-1(sPD-1) 변이체 도메인으로서, 상기 아미노산 치환이 120, 112, 107, 104, 67, 69, 96 및 42로 구성된 군으로부터 선택되는 위치 번호에 있는 sPD-1 변이체 도메인;
b) 선택적 링커; 및
c) Fc 도메인.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 Fc 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다:
a) sPD-1 변이체 도메인;
b) 선택적 링커; 및
c) Fc 도메인.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 Fc 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다:
a) Fc 도메인;
b) 선택적 링커; 및
c) sPD-1 변이체 도메인.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 95% 동일성을 나타낸다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 상기 위치 중 1개, 상기 위치 중 2개, 상기 위치 중 3개, 상기 위치 중 4개, 상기 위치 중 5개, 상기 위치 중 6개, 상기 위치 중 7개 또는 상기 위치 중 8개에서 아미노산 치환(들)을 갖는다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 A120V, A112I, S107V, G104S, S67G, P69L, N96S 및 S42G로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V, P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, S67G/G104S/S107V/A112I/A120V, S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, G104S/S107V/A112I/A120V, 및 G104S/S107V/A112I로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 세트를 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 상기 sPD-1 변이체 도메인은 P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 상기 sPD-1 변이체 도메인은 S67G/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 상기 sPD-1 변이체 도메인은 S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 상기 sPD-1 변이체 도메인은 G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 상기 sPD-1 변이체 도메인은 G104S/S107V/A112I의 아미노산 치환의 세트를 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:2를 갖는다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:3을 갖는다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:72를 갖는다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:110을 갖는다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:130을 갖는다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:131을 갖는다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 sPD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:138을 갖는다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 Fc 도메인은 인간 IgG Fc 도메인 또는 변이체 인간 IgG Fc 도메인이다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 인간 IgG Fc 도메인은 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 EU 넘버링 인덱스에 따른 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되며, n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 링커는 GGGGS이다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:5를 갖는다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:6를 갖는다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 a) 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를 Fc 융합 단백질이 발현되는 조건하에 배양하는 단계; 및 b) 상기 Fc 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 암에 걸린 대상체에서 종양의 전이 또는 침습을 치료, 감소 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 상기 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 암에 걸린 대상체에서 종양의 전이 또는 침습을 치료, 감소 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 흑색종, 신경아교종, 림프종, 골수종, 두경부암, 식도암, 신장암, 폐암, 유방암, 간암, 결장직장암, 담낭암, 위암, 췌장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 고환암, 및 임의의 다른 고형 종양 암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 감염을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 상기 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 감염을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 감염은 진균 감염, 박테리아 감염 또는 바이러스 감염이다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 감염을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 인간 유두종 바이러스 감염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염, 인간 T-림프친화 바이러스(HTLV) 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 헤르페스 바이러스 감염, 시토메갈로바이러스 감염, 및 임의의 다른 만성 바이러스 감염으로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 암에 걸린 대상체에서 종양의 전이 또는 침습을 치료, 감소 또는 예방하는 방법, 또는 상기 기재된 바와 같은 감염을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 유효 용량의 하나 이상의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 대상체에서 야생형 PD-1에 의해 매개되는 신호 전달을 억제, 감소 또는 조절한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 암에 걸린 대상체에서 종양의 전이 또는 침습을 치료, 감소 또는 예방하는 방법, 또는 상기 기재된 바와 같은 감염을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 유효 용량의 하나 이상의 Fc 융합 단백질은 대상체에서 T 세포 반응을 증가시킨다.
V. 도면의 간단한 설명
도 1은 야생형 PD-1 폴리펩티드(PD1WT), sPD-1 변이체 버전 1(PD1 V1), sPD-1 변이체 버전 2(PD1 V2) 및 IgG4의 도메인의 개략도를 제공한다. 신호 펩티드 영역은 잔기 1 내지 20이며 이탤릭체로 표시되고, 세포외 도메인(ECD)은 잔기 21 내지 170이다. 돌연변이된 N-글리코실화 부위는 볼드체 및 밑줄로 표시된다. 다른 돌연변이된 잔기는 볼드체로 표시된다. 링커는 이중 밑줄로 표시된다. 서열 넘버링은 신호 펩티드 영역의 첫 번째 아미노산에서 시작된다.
도 2는 인간 PD-1, 4ZQK의 사슬 B 및 5IUS의 사슬 A의 서열 정렬 결과를 제공한다. 동일한 잔기는 청색으로 표시되고, 둘 모두의 결정 구조에서 누락된 잔기는 적색으로 표시되고, 4ZQK에서만 누락된 잔기는 청록색으로 표시된다.
도 3은 인간 PD-1 모델 및 인간 PD-1/PD-L1(PDBID: 4ZQK)의 결정 구조의 오버레이를 제공한다. 4ZQK에서 PD-1 및 PD-L1의 결정 구조는 각각 청색 및 녹색으로 표시된다. 돌연변이를 위한 PD-1 상의 7개의 잔기(위치 넘버링이 신호 영역에서 시작할 때 Ser62, Ser87, Pro89, Gly124, Ser127, Ala132 및 Ala140)는 주황색 막대로 표시되고, N-글리코실화 부위(Asn116)는 자주색 막대로 표시된다. 위치 넘버링은 신호 펩티드 영역의 첫 번째 아미노산에서 시작된다.
도 4는 WT PD-1/PD-L1(청색), 3개의 계면 돌연변이를 갖는 PD-1/PD-L1(적색) 및 8개 모두의 계면 돌연변이를 갖는 PD-1/PD-L1(녹색)에 대한 백본 원자-위치 RMSD의 시간-진화를 보여준다.
도 5a는 인간 PD-L2 및 마우스 PD-L2(PDBID: 3RNQ, 3BP6 및 3BP5)의 서열 정렬 결과를 보여준다. 인간 PD-L2와 마우스 PD-L2 사이의 서열 동일성은 약 72%이다. 도 5b는 인간 PD-L2의 컨센서스 모델을 보여준다. 동일한 잔기는 청색으로 표시된다. 누락된 루프의 잔기는 적색으로 표시된다.
도 6은 인간 PD-L2 모델과 마우스 PD-L2 결정 구조(PDBID: 3BP5) 사이의 PD-1 결합 계면 비교를 제공한다. 계면 잔기는 선으로 표시된다. 계면 잔기는 인간 PD-L2 모델(진한 청색으로 표시됨)에서 녹색으로 표시된다. 마우스 PD-L2의 결정 구조는 분홍색으로 표시된다.
도 7은 인간 PD-1/PD-L2 모델 및 마우스 PD-1/PD-L2 결정 구조(PDBID: 3BP5)의 오버레이를 제공한다. 인간 PD-1 및 PD-L2 모델은 청록색 및 진한 청색으로 표시되고, 마우스 PD-1 및 PD-L2 구조는 각각 황색 및 분홍색으로 표시된다.
도 8은 PD-L1 및 PD-L2에 대한 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 결합 친화성을 보여준다. sPD-1변이체-Fc 융합 단백질은 WT PD-1-Fc 융합 단백질("모 Fc 융합 단백질")과 비교하여 PD-L1 결합이 약 10,000배 개선되었으며, 모 Fc 융합 단백질과 비교하여 PD-L2 결합이 약 200배 개선되었음을 나타낸다.
도 9a는 MC38 hPD-L1 녹-인(knock-in) 세포에 대한 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질(즉, sPD-1 변이체 버전 1-Fc 융합 단백질, 및 sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질)의 결합 활성을 보여준다. 둘 모두의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 MC38-PD-L1 녹-인 세포에서 야생형 그룹(즉, 야생형 PD-1-Fc 융합 단백질의 그룹)보다 훨씬 더 잘 결합한다. 도 9b는 MC38 모체 세포에 대한 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질(즉, sPD-1 변이체 버전 1-Fc 융합 단백질, 및 sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질)의 결합 활성을 보여준다. sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질도 모체 MC38 세포에 결합하지만 더 낮다.
도 10은 상이한 농도의 sPD-1 돌연변이체, sPD-1 야생형 및 hIgG4와 함께 인큐베이션시 Hep3B-hPD-L1 세포의 존재하에 T 세포 활성화를 보여준다. T 세포 활성은 IFN-γ에 의해 측정된다. 오차 막대는 기술적 삼중 실험의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 실험은 다른 공여자로부터 분리된 PBMC로 독립적으로 2회 수행되었다.
도 11a는 양성 대조군 그룹(즉, 항-PD-L1 항체의 그룹)과 비교하여 PD-1-ECD-Fc(즉, sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질의 그룹)에서 감소된 종양 부피에 의해 입증되는 바와 같이 sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질이 항-PD-L1 항체와 비교하여 우수한 항-종양 활성을 나타내는 것을 보여준다. 도 11b는 양성 대조군 그룹(즉, 항-PD-L1 항체의 그룹)과 비교하여 PD-1-ECD-Fc(즉, sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질의 그룹)에서 증가된 종양 성장 억제에 의해 입증되는 바와 같이 sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질이 항-PD-L1 항체와 비교하여 우수한 항-종양 활성을 나타내는 것을 보여준다. 도 11c는 양성 대조군 그룹(즉, 항-PD-L1 항체의 그룹)과 비교하여 PD-1-ECD-Fc(즉, sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질의 그룹)에서 증가된 생존율에 의해 입증되는 바와 같이 sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질이 항-PD-L1 항체와 비교하여 우수한 항-종양 활성을 나타내는 것을 보여준다. 도 11d는 비히클 대조군, PD-1-ECD-Fc(즉, sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질의 그룹) 및 양성 대조군(즉, 항-PD-L1 항체의 그룹)의 그룹에서의 상대적인 체중 변화를 보여준다.
도 12는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 힌지 서열을 보여준다.
도 13은 인간 PD-L2가 Hep3B 및 MC38 세포주에서 과발현되었음을 보여준다. 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 양성 클론을 선택하였다.
도 14는 sPD-1 변이체 2-Fc 융합 단백질이 Hep3b-hPDL2 세포에 대한 PD1 단백질 및 PDL2 tab1 결합 시험에서 Hep3b-hPDL2 세포에 강하게 결합하는 것을 보여준다.
도 15는 PBMC 및 Hep3B-OS8-PDL2 4B9의 공동 배양액에서 T 세포 활성화 시험을 보여준다.
도 16은 MC38-hPDL2 결장직장 종양 세포주를 사용하는 생체내 종양 모델에서 비히클 대조군, sPD-1 변이체 2-Fc 융합 단백질 또는 펨브롤리주맙의 투여 후 상이한 날의 종양 부피를 보여준다.
도 17a-17o는 PD1 WT와 비교하여 PD1 WT(SEQ ID NO:11) 및 상이한 sPD-1 변이체(SEQ ID NO:12-139)의 성숙한 세포외 도메인(ECD)의 아미노산 서열을 보여준다. SEQ ID NO:7에 제시된 것과 같은 신호 펩티드 영역이 도 17a-17o에 나타낸 바와 같은 각각의 서열 앞에 첨가될 수 있다. GGGGS와 같은 링커 도메인이 도 17a-17o에 나타낸 바와 같은 각각의 서열 뒤에 첨가될 수 있다. 돌연변이된 N-글리코실화 부위는 볼드체 및 밑줄로 표시된다. 다른 돌연변이된 잔기는 볼드체로 표시된다. 각 콜로니의 돌연변이(들)는 서열 넘버링이 성숙한 영역에서 시작하는 표 10에 요약되어 있다. 도 17a는 PD1 WT(SEQ ID NO:11) 및 상이한 sPD-1 변이체(SEQ ID NO:12-19)의 아미노산 서열을 보여준다. 도 17b는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:20-28)을 보여준다. 도 17c는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:29-37)을 보여준다. 도 17d는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:38-46)을 보여준다. 도 17e는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:47-55)을 보여준다. 도 17f는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:56-64)을 보여준다. 도 17g는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:65-73)을 보여준다. 도 17h는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:74-82)을 보여준다. 도 17i는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:83-91)을 보여준다. 도 17j는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:92-100)을 보여준다. 도 17k는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:101-109)을 보여준다. 도 17l은 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:110-118)을 보여준다. 도 17m은 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:119-127)을 보여준다. 도 17n은 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:128-136)을 보여준다. 도 17o는 상이한 sPD-1 변이체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:137-139)을 보여준다.
도 18a-18f는 난소, 식도, 위 및 뇌 종양의 인간 조직 마이크로어레이에서 PD-L2, PD-L1 및 CD8+ T 세포 발현을 보여준다. 도 18a는 형광 면역조직화학에 의해 정상 및 악성 샘플(N = 156) 둘 모두를 함유하는 난소암 조직 마이크로어레이의 대표적인 이미지가 항-인간 PD-L2(회색), 항-인간 PD-L1(Latchman, Wood et al.) 및 사이토케라틴(적색)으로 염색되었음을 보여준다. 염색된 각 샘플의 강도를 종양 등급(우측 상부, PD-L2. 우측 하부, PD-L1)에 따라 스코어링하고 정량화하였다. 도 18b는 형광 면역조직화학에 의해 정상 및 암성 식도 조직(N = 72)의 대표적인 이미지가 항-인간 PD-L2(회색), 항-인간 PD-L1(Latchman, Wood et al.) 및 사이토케라틴(적색)으로 염색되었음을 보여준다. PD-L2(우측 상부) 및 PD-L1(우측 하부) 발현 둘 모두를 종양 등급에 따라 나타내기 위해 각각의 샘플을 스코어링하고 정량화하였다. 도 18c는 위암 조직 마이크로어레이(N = 76)의 대표적인 이미지가 염색된 후 종양 등급에 기초하여 PD-L2(우측 상부) 및 PD-L1(우측 하부) 발현 둘 모두에 대해 정량화되었음을 보여준다. 도 18d는 아교모세포종 조직 마이크로어레이(N = 152)의 대표적인 이미지가 염색된 후 종양 등급에 기초하여 PD-L2(우측 상부) 및 PD-L1(우측 하부) 발현에 대해 정량화되었음을 보여주며, DAPI 염색은 핵의 존재를 표시한다. 도 18e는 도 18a에서 조사된 동일한 샘플을 함유하는 난소암 조직 마이크로어레이가 여기에 도시된 대표적인 이미지로 항-인간 CD8(적색) 및 DAPI(청색)에 대해 염색되었음을 보여준다. 양성 CD8 세포는 화살표로 주석을 달았고 눈금 막대는 100μM를 나타낸다. 도 18f는 도 18b에서 조사된 동일한 샘플을 함유하는 식도암 조직 마이크로어레이가 도시된 대표적인 이미지로 항-인간 CD8(적색) 및 DAPI(청색)에 대해 염색되었음을 보여준다. 양성 CD8 세포는 화살표로 주석을 달았고 눈금 막대는 100μM를 나타낸다. 필드 당 양성 핵의 수를 보여주는 각 샘플을 정량화하고 종양 등급에 따라 그래프로 표시하였다(우측). 점수 또는 환자 샘플 당 양성 핵의 수를 나타내는 모든 정량 데이터를 계산된 평균 및 표준 편차로 플롯팅하였다. 통계 분석은 치료 그룹 간 비교를 위해 일원 ANOVA로 수행되었다. P 값 *=<0.05, **=<0.01 및 ***=<0.001.
도 19a-19d는 PD-L1 및 PD-L2에 대한 우수한 결합 친화성을 갖는 조작 sPD-1 돌연변이체를 보여준다. 도 19a는 PD-1 신호 전달을 억제하기 위한 3개의 상이한 전략의 그래픽 예시를 보여준다. 도 19b는 PD-L1에 결합하는 효모-디스플레이된 sPD-1 돌연변이체 라이브러리를 보여주는 대표적인 유세포분석 도트 플롯을 보여준다. PD-L1에 대한 가장 강한 결합을 갖는 클론은 PD-L1 농도의 순차적인 감소(분류 1 내지 분류 4)에 이어 인큐베이션 시간의 증가(분류 5 및 분류 6)를 통해 선택되었다. 도 19c는 인간 PD-L1에 대한 sPD-1 돌연변이체 버전 1(Topalian, Hodi et al. 2012, N Engl J Med 366(26): 2443-2454, 이의 전체내용은 참조로 포함됨) 및 야생형 PD-1(하부) 결합의 동역학이 BIAcore 표면 플라스몬 공명 시스템에 의해 결정되었음을 보여준다. 각 곡선은 분석물의 단일 농도를 나타낸다. 도 19d는 인간 PD-L2에 대한 sPD-1 돌연변이체 버전 1(Topalian, Hodi et al. 2012, N Engl J Med 366(26): 2443-2454, 이의 전체내용은 참조로 포함됨) 및 야생형 PD-1(하부) 결합의 동역학이 BIAcore 표면 플라스몬 공명 시스템에 의해 결정되었음을 보여준다. 각 곡선은 분석물의 단일 농도를 나타낸다.
도 20a-20c는 인간 PD-L1 및 PD-L2와 공동-복합체에서 sPD-1 돌연변이체의 컴퓨터 모델링 기반 구조 분석을 보여준다. 도 20a는 좌측 패널이 sPD-1 돌연변이 G124S(주황색)가 PD-L1 Tyr123(녹색 및 적색 막대)과 수소 결합을 생성함을 입증하는 것을 보여준다. 야생형 PD-1 구조는 청록색으로 표시된다. 우측 패널은 돌연변이 A132I가 PD-L1 Gln166과 수소 결합을 하나 더 생성함을 보여준다. 야생형 PD-1 구조(청록색), 돌연변이된 PD-1 구조(주황색). 결정 PD-L1 구조는 분홍색으로 표시되고 sPD-1 돌연변이체와 PD-L1 공동-복합체는 녹색으로 표시된다. 도 20b는 돌연변이 A132I의 표면 상보성의 비교를 보여준다. PD-L1 결합 부위는 정전기 전위 표면을 나타내기 위해 표시된다. 적색은 음성 정전기 전위를 나타내고, 청색은 양성 정전기 전위를 나타내며, 회색은 소수성 영역을 나타낸다. 야생형 PD-1은 청록색 카툰 및 볼(좌측 패널)로 표시된다; 돌연변이된 PD-1은 주황색 카툰 및 볼(우측 패널)로 표시된다. 도 20c는 도 20b와 동일한 색 주석을 갖는 PD-L2와 돌연변이 A132I의 표면 상보성의 비교를 보여준다.
도 21a-21c는 sPD-1 돌연변이체가 T 세포 생존력에 영향을 주지 않으면서 리간드-의존적 방식으로 PD-L1 및 PD-L2 매개된 활성을 차단하는데 우수한 능력을 나타내었음을 입증한다. 도 21a는 PD-1 야생형, hIgG4 및 sPD-1 돌연변이체와 경쟁하는 비오틴 컨쥬게이션된 PD-1 야생형에 대한 Hep3B-hPD-L1 결합의 억제 퍼센트를 나타내는 세포 기반 수용체-차단 검정을 보여준다. 2개의 독립적인 실험 중 하나가 2회 기술적 반복의 평균을 나타내는 개별 포인트로 여기에 표시된다. 도 21b는 sPD-1 야생형, hIgG4 및 sPD-1 돌연변이체 버전 1 및 2와 경쟁하는 비오틴 컨쥬게이션된 PD-1 야생형에 대한 Hep3B-hPD-L2 세포 결합의 억제 퍼센트를 나타내는 세포 기반 수용체-차단 검정을 보여준다. 2개의 독립적인 실험 중 하나가 2회 기술적 반복의 평균을 나타내는 개별 포인트로 여기에 표시된다. 도 21c는 재조합 PD-L1이 첨가되거나 첨가되지 않은 sPD-1 돌연변이체 버전 2 및 aPD-1 항체의 존재하에 시간에 따른 T 세포 증식을 보여준다. CD3/CD28 항원으로 처리된 T 세포를 양성 대조군으로 사용하고, 처리되지 않은 T 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 각 데이터 포인트는 기술적 이중 실험의 평균 및 표준 편차를 보여준다. 다른 공여자로부터 분리된 T 세포로 실험을 반복하였다. 통계 분석은 치료 그룹 간 비교를 위해 일원 ANOVA로 수행되었고 시간에 따른 변화에 대해 ANOVA를 반복하였다. P 값 *=<0.05, **=<0.01.
도 22a-22h는 sPD-1 돌연변이체가 결장직장암, 흑색종 및 난소암의 마우스 종양 모델에서 종양 성장을 억제함을 보여준다. 도 22a는 Alexa Fluor® 488로 표지된 sPD-1 돌연변이체의 생체분포가 시간에 따라 이미지화되었음을 보여준다. 도 22b는 인간 IgG4에 대한 ELISA를 사용하여 검출된 10mg/kg 분자의 단일 투여 후 마우스 혈청에서 sPD-1 돌연변이체의 생체분포를 보여준다. 각 데이터 포인트는 동일한 시점에 수집된 2마리 동물의 평균을 나타낸다. 도 22c는 MC39-hPD-L2 결장직장암을 접종한 후 비히클 대조군, sPD-1 돌연변이체 10mg/kg 또는 펨브롤리주맙 10mg/kg에 할당된 C57B/6 마우스에서 시간에 따른 종양 성장을 보여준다. 각 데이터 포인트는 시간에 따라 측정된 개별 종양의 평균 및 SEM을 나타낸다. 도 22d는 B16/OVA 흑색종 세포를 접종한 후 비히클 대조군 또는 sPD-1 돌연변이체 10mg/kg으로 치료한 C57B/6 마우스에서 시간에 따른 종양 성장을 보여준다. 각 선은 시간에 따른 개별 종양 성장을 나타낸다. 도 22e는 ID8 마우스 난소 종양 세포를 동소 접종하고 비히클 대조군, 항-마우스 αPD-1 차단 항체 10mg/kg 및 sPD-1 돌연변이체 10mg/kg로 치료한 C57B/6 마우스의 카플란 마이어 생존 플롯을 보여준다. 복수의 발생시 동물을 종결시켰다. 도 22f는 비히클 대조군, 항-마우스 αPD-1 차단 항체 10mg/kg 및 sPD-1 돌연변이체 10mg/kg으로 치료된 B16/OVA 흑색종 종양의 종양(상부 패널) 및 비장(하부 패널)으로부터 분리된 CD4+ 및 CD8+ 세포독성 T-세포의 대표적인 유세포분석 도트 플롯을 보여준다. 도 22g는 비히클 대조군, 항-마우스 αPD-1 차단 항체 10mg/kg 및 sPD-1 돌연변이체 10mg/kg로 처리된 MC38-hPD-L2 종양으로부터 분리되고 분석된 CD8+ T 세포를 보여준다. 도 22h는 비히클 대조군, 항-마우스 αPD-1 차단 항체 10mg/kg 및 sPD-1 돌연변이체 10mg/kg로 처리된 MC38-hPD-L2 종양으로부터 분리되고 분석된 CD4+ T 세포를 보여준다. 통계 분석은 치료 그룹 간 비교를 위해 일원 ANOVA를 사용하여 수행되었고 시간에 따른 변화에 대해 ANOVA를 반복하였다. 카플란 마이어 추정값이 생존 곡선에 대해 계산되었다. P 값 *=<0.05, **=<0.01. ***=<0.001.
도 23a-23e는 sPD-1 돌연변이체가 PD-L2 의존성인 난소암 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있음을 보여준다. 도 23a는 ID8 PD-L1 CRSIPR KO 종양을 PD-L1 KO 마우스에 접종하고 PD-L1 및 PD-L2 발현에 대해 염색하였음을 보여준다. 눈금 막대 100 μm. 도 23b는 ID8 PD-L1 CRSIPR KO 종양을 접종한 후 비히클 대조군, 항-마우스 αPD-L1 차단 항체 10mg/kg 및 sPD-1 돌연변이체 10mg/kg으로 치료한 C57B/6 PD-L1 KO 마우스에서 시간에 따른 피하 종양 성장을 보여준다. 도 23c는 종결시 ID8 PD-L1 CRISPR KO 종양의 총 종양 중량을 보여준다. 도 23d는 ID8 PD-L1 CRISPR KO 마우스 난소 종양 세포로 동소 접종되고 비히클 대조군, 항-마우스 αPD-L1 차단 항체 10mg/kg 및 sPD-1 돌연변이체 10mg/kg로 치료된 C57B/6PD-L1 KO 마우스의 카플란 마이어 생존 분석을 보여준다. 복수의 발생시 동물을 종결시켰다. 도 23e는 비히클 대조군, 항-마우스 αPD-L1 차단 항체 10mg/kg 및 sPD-1 돌연변이체 10mg/kg로 처리된 ID8 종양에서 PD-L1 및 PD-L2의 IHC 염색을 보여준다. 눈금 막대 100 μm. 통계 분석은 치료 그룹 간 비교를 위해 일원 ANOVA를 사용하여 수행되었고 시간에 따른 변화에 대해 ANOVA를 반복하였다. 카플란 마이어 추정값이 생존 곡선에 대해 계산되었다. P 값 *=<0.05, **=<0.01. ***=<0.001.
도 24a-24e는 PD-L1 및 PD-L2 발현이 환자 종양 샘플에서 양의 상관 관계가 있음을 보여준다. 도 24a는 난소암에서 PD-L1 및 PD-L2 발현의 피어슨 상관 관계 플롯을 보여준다. 도 24b는 식도암에서 PD-L1 및 PD-L2 발현의 피어슨 상관 관계 플롯을 보여준다. 도 24c는 위암에서 PD-L1 및 PD-L2 발현의 피어슨 상관 관계 플롯을 보여준다. 도 24d는 아교모세포종에서 PD-L1 및 PD-L2 발현의 피어슨 상관 관계 플롯을 보여준다. 도 24e는 특정 염색 패턴을 나타내는 정상 편도 조직에서 인간 PD-L1및 PD-L2의 IHC 염색을 보여준다.
도 25a-25b는 난소암 및 식도암 환자 샘플에서 CD8 발현을 보여준다. 도 25a는 난소암 표본을 필드 당 CD8 양성 핵의 수로 정량화하고 종양 등급에 따라 그래프로 표시하였다. 도 25b는 식도암 표본을 필드 당 CD8 양성 핵의 수로 정량화하고 종양 등급에 따라 그래프로 표시하였다.
도 26은 우수한 결합 특성을 나타내는 돌연변이체 클론의 방향적 진화 기반 분류를 보여준다. 처음 2개의 분류는 라이브러리와 함께 인큐베이션된 PD-L1의 양을 순차적인 방식으로 감소시킴으로써 수행되었다. 분류 3 내지 분류 6은 리간드의 농도 감소 및 동역학 오프-레이트 분류 전략 둘 모두의 조합에 기초하여 스크리닝되었고, 여기서 클론은 더 낮은 리간드 농도의 존재하에 PD-L1에 결합하는 능력 및 경쟁자의 존재하에 더 긴 인큐베이션에 기초하여 분리되었다. 각 패널의 백분율은 수집된 관문 하위집단에 해당한다.
도 27a 및 27b는 PD-L1 및 PD-L2에 대한 sPD-1 돌연변이체 V2 결합 동역학의 분석을 보여준다. 도 27a는 25℃에서 BIAcore T200에 의한 PD-L1에 대한 동역학에 대한 sPD-1 돌연변이체 버전 2 결합의 결합 분석을 보여준다. 도 27b는 25℃에서 BIAcore T200에 의한 PD-L2에 대한 동역학에 대한 sPD-1 돌연변이체 버전 2 결합의 결합 분석을 보여준다.
도 28a-28f는 sPD-1 돌연변이체의 재조합 단백질 생산을 보여준다. 도 28a는 정제된 야생형 sPD-1 Fc, 환원된 레인 1 및 환원되지 않은 레인 2의 SDS-PAGE를 보여준다. 도 28b는 정제된 야생형 sPD-1Fc 및 하기 표에 제시된 내독소 수준의 SEC-HPLC 분석을 보여준다. 도 28c는 정제된 sPD-1 돌연변이체 버전 1, 환원된 레인 1 및 환원되지 않은 레인 2의 SDS-PAGE를 보여준다. 도 28d는 정제된 sPD-1 돌연변이체 버전 1 및 하기 표에 제시된 내독소 수준의 SEC-HPLC 분석을 보여준다. 도 28e는 정제된 sPD-1 돌연변이체 버전 2, 환원된 레인 1 및 환원되지 않은 레인 2의 SDS-PAGE를 보여준다. 도 28f는 정제된 sPD-1 돌연변이체 버전 2 및 하기 표에 제시된 내독소 수준의 SEC-HPLC 분석을 보여준다.
도 29는 sPD-1 돌연변이체와 PD-L1 사이의 단백질 상호작용 및 PD-1 및 PD-L1의 결합 계면 내에서 3개의 돌연변이 각각에 대한 표면 상보성 및 수소 결합의 분석을 보여준다.
도 30은 야생형 및 돌연변이된 인간 PD-1/PD-L2 모델에 대한 단백질 상호작용을 비교하고, PD-1 및 PD-L2의 결합 계면 내에서 2개의 돌연변이에 대한 표면 상보성 및 수소 결합의 분석 결과를 보여준다.
도 31은 PD-L2를 과발현하는 Hep3B 세포에 대한 야생형 sPD-1, PD-1 돌연변이체 버전 2 및 IgG4 사이의 FAC 기반 분석을 보여준다.
도 32a-32e는 MC38 세포에서 인간 PD-L2 과발현의 검증을 보여준다. 도 32a는 21개의 인간 PD-L2 개별 클론을 발현하는 MC38 세포의 백분율 및 평균 형광 강도를 보여주는 표를 나타낸다. 도 32b는 MC38-hPDL2 세포가 30% 미만의 hPD-L2 양성 집단을 나타내는 것을 입증한다. 도 32c는 MC38-hPD-L2 세포가 30%-50% 미만의 hPD-L2 양성 집단을 나타내는 것을 입증한다. 도 32d는 MC38-hPD-L2 세포가 50%-60%의 hPD-L2 양성 집단을 나타내는 것을 입증한다. 도 32e는 MC38-hPD-L2 세포가 60% 초과의 hPD-L2 양성 집단을 나타내는 입증한다.
도 33a 및 33b는 Hep3B-OS8 세포 및 MC38 세포에서 인간 PD-L2 발현의 검증을 보여준다. 도 33a는 인간 PD-L2 과발현에 대해 양성인 16개의 cDNA 클론으로 트랜스펙션된 Hep3B-OS8 세포의 평균 형광 강도 및 퍼센트를 보여주는 표를 나타낸다. 양성 클론은 우측에서 가장 낮은 효율로부터 가장 높은 효율로 분류되었다. Ab1은 항-인간 PD-L2 항체이고 Ab2는 대조군 IgG이다. 도 33b는 Hep3B 모체, Hep3B-OS8 벡터 단독, Hep3B-OS8-hPD-L1 및 Hep3B-OS8-hPD-L2 세포에서 PD-L2 발현(상부 패널); 및 MC38 모체, MC38-hPD-L 및 MC38-hPD-L2 세포에서 PD-L2 발현(하부 패널)을 보여준다. 주황색 히스토그램은 양성 PD-L2 발현을 보여준다.
도 34는 실험 과정 동안 비히클 대조군, sPD-1 돌연변이체 및 아테졸루주맙으로 처리된 MC38-hPD-L1 종양을 갖는 마우스의 총 체중을 보여준다. 각 치리 그룹에 대해 N=10. 오차 막대는 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 35a-35b는 항-마우스 PD-1 항체 및 sPD-1 돌연변이체로 치료된 MC38 모체 종양 모델에서 종양 관련 NK 세포 및 대식세포의 면역 프로파일을 보여준다. 도 35a는 비히클 대조군(N=8), 항-마우스 αPD-1 항체(N=8) 및 sPD-1 돌연변이체 항체(N=10)로 치료된 각 동물의 종양에서 양성 NK 세포 퍼센트를 보여준다. 개별 데이터 포인트, 평균 및 표준 편차가 표시된다. 도 35b는 비히클 대조군(N=8), 항-마우스 αPD-1 항체(N=8) 및 sPD-1 돌연변이체 항체(N=10)로 치료된 각 동물의 종양에서 양성 대식세포 퍼센트를 보여준다. 개별 데이터 포인트, 평균 및 표준 편차가 표시된다.
도 36a 및 36b는 PD-L1 CRISPR 트랜스펙션 후 PD-L1 음성 세포의 분리를 보여준다. 도 36a는 PD-L1 CRISPR 클론 4(좌측) 및 클론 5(우측) 트랜스펙션 후 분류 및 수집된 PD-L1 음성 ID8 세포를 보여준다. 도 36b는 PD-L1 CRISPR 클론 4(좌측) 및 클론 5(우측) 트랜스펙션 후 분류 및 수집된 PD-L1 음성 MC38 PD-L2 과발현 세포를 보여준다.
도 37은 각각의 연속적인 분류 라운드로부터 풍부한 sPD-1 라이브러리 풀의 시퀀싱을 보여준다. 잔기 번호는 상단에 나열되고 상응하는 야생형 아미노산이 제공된다.
도 38a는 초기 돌연변이체 PD-1 클론에 존재하는 아미노산 돌연변이의 예시된 지도를 보여준다. 7개 돌연변이의 모든 가능한 순열을 포함하는 128개의 sPD-1 돌연변이체 클론의 라이브러리를 생성하기 위해 모든 돌연변이를 사용하였다. 도 38b는 추가 결합 분석을 위해 128개의 sPD-1 돌연변이체 클론 라이브러리로부터 선택된 상위 5개 돌연변이체 클론의 목록을 보여준다.
도 39a는 PD-L1에 대한 원래의 돌연변이체 sPD-1의 용량-의존적 결합 곡선 및 Kd를 보여준다. 도 39b는 PD-L1에 대한 클론 #1의 용량-의존적 결합 곡선 및 Kd를 보여준다. 도 39c는 PD-L1에 대한 클론 #2의 용량-의존적 결합 곡선 및 Kd를 보여준다. 도 39d는 PD-L1에 대한 클론 #3의 용량-의존적 결합 곡선 및 Kd를 보여준다. 도 39e는 클론 #4의 용량-의존적 결합 곡선 및 Kd를 보여준다. 도 39f는 PD-L1에 대한 클론 #5의 용량-의존적 결합 곡선 및 Kd를 보여준다.
도 40a는 초기 돌연변이체 PD-1 클론에 존재하는 아미노산 돌연변이의 예시된 지도를 보여준다. 7개 돌연변이의 모든 가능한 순열을 포함하는 128개의 sPD-1 돌연변이체 클론의 라이브러리를 생성하기 위해 모든 돌연변이를 사용하였다. 도 40b는 나열된 인간 PD-L1에 대한 Kd를 갖는 128개의 sPD-1 돌연변이체 클론으로부터 선택된 상위 5개 돌연변이체 클론의 목록을 보여준다.
도 41a는 PD-L2에 대한 원래의 돌연변이체 sPD-1의 용량-의존적 결합 곡선, Kd 및 Bmax를 보여준다. 도 41b는 PD-L2에 대한 클론 #1의 용량-의존적 결합 곡선, Kd 및 Bmax를 보여준다. 도 41c는 PD-L2에 대한 클론 #2의 용량-의존적 결합 곡선, Kd 및 Bmax를 보여준다. 도 41d는 PD-L2에 대한 클론 #3의 용량-의존적 결합 곡선, Kd 및 Bmax를 보여준다. 도 41e는 PD-L2에 대한 클론 #4의 용량-의존적 결합 곡선, Kd 및 Bmax를 보여준다. 도 41f는 PD-L2에 대한 클론 #5의 용량-의존적 결합 곡선, Kd 및 Bmax를 보여준다.
도 42a는 초기 돌연변이체 PD-1 클론에 존재하는 아미노산 돌연변이의 예시된 지도를 보여준다. 7개 돌연변이의 모든 가능한 순열을 포함하는 128개의 sPD-1 돌연변이체 클론의 라이브러리를 생성하기 위해 모든 돌연변이를 사용하였다. 도 42b는 나열된 인간 PD-L2에 대한 Kd를 갖는 128개의 sPD-1 돌연변이체 클론으로부터 선택된 상위 5개 돌연변이체 클론의 목록을 보여준다.
VI. 발명의 상세한 설명
A. 도입
PD-1은 면역 및 내성 동안 T-세포 기능을 제어하는데 관여하는 억제성 세포 표면 수용체이다. PD-L1 또는 PD-L2와 같은 이의 리간드에 결합할 때, PD-1은 T-세포 이펙터 기능을 억제한다. PD-1의 구조는 단일-패스 타입 1 막 단백질이다. PD-1은 프로그램된 세포 사멸 1 수용체 유전자(Entrez Gene ID: 5133)에 의해 인코딩된다. 인간 PD-1 mRNA(코딩) 서열은, 예를 들어, Genbank 수탁 번호 NM 005018에 제시되어 있다. 인간 PD-1 폴리펩티드 서열은, 예를 들어, Genbank 수탁 번호 NP_005009 또는 UniProt No. Q15116에 제시되어 있다. PD-1은 프로그램된 세포 사멸 1, PDCD1, PD1, CD279, SLEB2, hPD-1 및 hSLE-1으로도 알려져 있다. 야생형 인간 PD-1 폴리펩티드는 288개의 아미노산이다. 신호 펩티드 서열은 잔기 1 내지 20(도 1)이고, ECD는 잔기 21 내지 170(도 1)이고, 막횡단 도메인은 잔기 171 내지 191이고, 세포내 도메인은 잔기 192 내지 288이다(이는 신호 펩티드 영역에서 시작하는 넘버링을 사용함; 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 넘버링은 또한 표 1의 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6에서 볼 수 있는 바와 같이 성숙한 서열의 첫 번째 아미노산을 첫 번째 아미노산 위치로 사용하는 것을 기초로 할 수 있다; 즉, ECD 도메인은 또한 1 내지 150일 수 있다, 기타 등등).
당 분야에 공지된 바와 같이, PD-1에 결합하여 PD-1이 PD-L1 또는 PD-L2 수용체에 결합하는 것을 차단함으로써 면역 억제를 감소시켜 면역 활성화에 영향을 미치는 다수의 치료적 항체가 존재한다. 이러한 항체는 KEYTRUDA® 및 OPDIVO®뿐만 아니라 임상에서 시험 중인 다른 여러 항체를 포함한다. 유사하게, TECENTRIQ®와 같이 유사한 메커니즘 및 치료 효과를 초래하도록 승인된 항-PD-L1 항체가 있다.
본 발명은 변이체를 포함하는 인간 PD-1의 ECD를 사용하여 유사한 생물학적 기능 및 치료적 효과를 달성하는 신규한 메커니즘에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 융합 단백질을 제공한다. 본원에 기재된 융합 단백질은 2개의 일반적인 기능적 성분을 포함한다. 제1 성분은 인간 PD-1의 가용성 ECD의 변이체(이하 "sPD-1 변이체")를 포함한다. sPD-1 변이체는 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 결합 친화성 및/또는 단백질 안정성을 증가시키는 역할을 한다. 제2 성분은 인간 IgG 단백질, 예를 들어, 인간 IgG4의 Fc 도메인이며, 융합 단백질로서 sPD-1 변이체의 반감기에 상당한 증가를 부여한다. 이러한 2개의 성분 또는 도메인은 일반적으로 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 형성하기 위해 본원에 개략된 대로 글리신-세린 링커와 같은 도메인 링커를 사용하여 연결된다.
본원에서 sPD-1 변이체 도메인은 PD-1 리간드, 즉, PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하여 이를 차단/길항시키고, 인간 IgG 단백질의 Fc 도메인(임의로 힌지 도메인 및 선택적 기타 링커를 포함함)에 연결된다. sPD-1 변이체는 PD-L1 및/또는 PD-L2의 경쟁 길항제로서 작용하고, 면역 체크포인트 PD-1 경로를 차단하고, PD-1 수용체를 통한 신호 전달을 방지할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 T 세포 억제성 신호를 차단하고, 면역 매개된 항종양 활성을 유도한다. 또한, 조성물 및 방법은 감염, 예를 들어, 만성 감염을 앓고 있는 대상체에서 면역 반응을 활성화, 향상 또는 증가시킬 수 있다. 본 발명은 암 또는 감염 환자에서 T 세포 증식을 자극하고/거나, T 세포 활성화를 증가시키고/거나, T 세포 억제성 신호를 감소시키는 것과 같은 T 세포 반응을 자극하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
B. 정의
본원에서 사용되는 바와 같은 하기 용어는 달리 특정되지 않는 한 이들에 기인하는 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 단수 형태는 하나의 구성원을 갖는 양태를 포함할 뿐만 아니라 하나 초과의 구성원을 갖는 양태도 포함한다. 예를 들어, 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 그러한 세포를 포함하며, "제제"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 제제에 대한 언급을 포함하며, 기타 사항도 마찬가지이다.
본원에서 사용되는 "단백질"은 여기서 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드를 포함하는 적어도 2개의 공유적으로 부착된 아미노산을 의미한다.
용어 "분리된"은 자연 환경에 실질적으로 없는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 분리된 단백질은 이것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 단백질이 실질적으로 없다. 용어 "분리된"은 또한 분리된 단백질이 약학적 조성물로서 투여하기에 충분히 순수하거나, 적어도 약 70-80%, 80-90% 또는 90-95%(w/w) 순수하거나, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(w/w) 순수한 제조물을 지칭한다.
용어 "리간드"는 생물학적 목적을 제공하기 위해 표적 세포의 표면에 존재하는 수용체와 같은 제2 생체분자에 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 생체분자를 지칭한다. 리간드는 일반적으로, 예를 들어, 이온 결합, 수소 결합, 소수성 상호작용, 쌍극자-쌍극자 결합 또는 반 데르 발스 힘과 같은 분자간 힘에 의해 표적 단백질 상의 부위에 결합하는 이펙터 분자이다. 본 발명의 sPD-1 변이체는 PD-L1 및/또는 PD-L2와 같은 PD-1 리간드에 결합하여 복합체를 형성할 수 있다.
용어 "수용체"는 리간드와 같은 제2 생체분자에 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 표적 세포의 표면에 존재하는 생체분자를 지칭한다. 수용체는 일반적으로 특정 신호 전달 경로를 활성화한다. PD-L1 및 PD-L2는 세포 표면 수용체의 예이다.
본원에서 사용되는 "위치"는 단백질의 서열에서의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 형식, 예를 들어, EU 인덱스에 따라 넘버링될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 위치는 성숙한 단백질의 첫 번째 아미노산에서 시작하여 순차적으로 넘버링된다.
본원에서 "아미노산 변형"은 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다.
본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 있는 아미노산을 상이한 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 특히, 일부 구체예에서, 치환은 유기체 또는 임의의 유기체 내에서 자연적으로 발생하지 않는, 특정 위치에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산에 대한 것이다. 예를 들어, 치환 S228P는 변이체 폴리펩티드, 이 경우에는 위치 228의 세린이 프롤린으로 대체된 인간 IgG4의 Fc 변이체를 지칭한다. 명확성을 위해, 핵산 코딩 서열은 변경되지만 시작 아미노산은 변경되지 않도록 조작된 단백질(예를 들어, 숙주 유기체 발현 수준을 높이기 위해 CGG(아르기닌 인코딩)를 CGA(여전히 아르기닌 인코딩)로 교환함)은 "아미노산 치환"이 아니다; 즉, 동일한 단백질을 인코딩하는 새로운 유전자의 생성에도 불구하고, 단백질이 시작되는 특정 위치에 동일한 아미노산을 갖는 경우, 이는 아미노산 치환이 아니다.
본원에서 사용되는 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 아미노산 서열의 첨가를 의미한다. 예를 들어, -233E 또는 233E는 위치 233 뒤 그리고 위치 234 앞에 글루탐산의 삽입을 지정한다. 또한, -233ADE 또는 A233ADE는 위치 233 뒤 그리고 위치 234 앞에 AlaAspGlu의 삽입을 지정한다.
본원에서 사용되는 "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 있는 아미노산 서열의 제거를 의미한다. 예를 들어, E233- 또는 E233#, E233() 또는 E233del은 위치 233에 있는 글루탐산의 결실을 지정한다. 추가로, EDA233- 또는 EDA233#은 위치 233에서 시작하는 서열 GluAspAla의 결실을 지정한다.
본원에서 사용되는 "모 폴리펩티드"는 후속적으로 변형되어 변이체를 생성하는 출발 폴리펩티드를 의미한다. 모 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드, 또는 자연 발생 폴리펩티드의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 모 폴리펩티드는 폴리펩티드 자체, 모 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 "모 면역글로불린"은 변이체를 생성하도록 변형된 변형되지 않은 면역글로불린 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 맥락에서, "모 Fc 도메인"은 언급된 변이체에 상대적일 것이고; 따라서, "변이체 인간 IgG Fc 도메인"은 인간 IgG의 모 Fc 도메인과 비교되며, 예를 들어, "변이체 인간 IgG4 Fc 도메인"은 인간 IgG4의 모 Fc 도메인과 비교된다, 기타 등등.
본원에서 "야생형 또는 WT"는 대립유전자 변이를 포함하는 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. WT 단백질은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본원에서 사용되는 "변이체 단백질" 또는 "단백질 변이체" 또는 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 모 단백질과 상이한 단백질을 의미한다. 일부 구체예에서, 모 단백질은 인간 야생형 서열이다. 일부 구체예에서, 모 단백질은 변이체를 갖는 인간 서열이다. 단백질 변이체는 단백질 자체, 단백질을 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 아미노 서열을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 변이체는 모 단백질에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어, 모체와 비교하여 약 1 내지 약 20개의 아미노산 변형, 및 바람직하게는 약 1 내지 약 8개의 아미노산 변형을 갖는다. 본원의 단백질 변이체 서열은 바람직하게는 모 단백질 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%/97%/98%/99% 동일성을 가질 것이다. 2개의 유사한 서열(예를 들어, sPD-1 가변 도메인) 사이의 서열 동일성은 다음과 같은 알고리즘으로 측정할 수 있다[Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Comparison Of Biosequences," Adv. Appl. Math. 2:482 [local homology algorithm]; Needleman, S.B. & Wunsch, CD. (1970) "A General Method Applicable To Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins," J. Mol. Biol.48:443 [homology alignment algorithm], Pearson, W.R. & Lipman, D.J. (1988) "Improved Tools For Biological Sequence Comparison," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 [search for similarity method]; or Altschul, S.F. et al, (1990) "Basic Local Alignment Search Tool," J. Mol. Biol. 215:403-10, the "BLAST" algorithm, see https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]. 앞서 언급한 알고리즘 중 하나를 사용할 때, 디폴트 파라미터(창 길이, 갭 패널티 등)가 사용된다. 한 구체예에서, 서열 동일성은 디폴트 파라미터를 사용하여 BLAST 알고리즘을 사용하여 수행된다.
본원에서 사용되는 "IgG 변이체" 또는 "변이체 IgG"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 IgG(다시 말해, 많은 경우에, 인간 IgG 서열로부터)와 상이한 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 "Fc 변이체" 또는 "변이체 Fc"는 모 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 단백질을 의미한다. 일부 구체예에서, 모 Fc 도메인은 인간 야생형 Fc 서열, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 Fc 영역이다. 따라서, "변이체 인간 IgG4 Fc 도메인"은 인간 IgG4 Fc 도메인과 비교하여 아미노산 변형(일반적으로 아미노산 치환)을 포함하는 것이다. 예를 들어, S241P 또는 S228P는 모 IgG4 힌지 폴리펩티드에 비해 위치 228에 치환 프롤린을 갖는 힌지 변이체이고, 여기서 넘버링 S228P는 EU 인덱스에 따르고 S241P는 Kabat 넘버링이다. EU 인덱스 또는 Kabat 또는 EU 넘버링 체계에서와 같은 EU 인덱스는 EU 넘버링을 지칭한다(SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al. 참조, 그 전체내용은 본원에 참조로 포함됨; 및 또한 Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85 참조, 그 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 일부 구체예에서, 모 Fc 도메인은 변이체를 갖는 인간 Fc 서열이다. 달리 언급되지 않는 한, 인간 IgG의 Fc 도메인과 관련된 본 발명에서 논의된 모든 위치에 대해, 아미노산 위치 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 변형은 본원에 개략된 바와 같이 첨가, 결실, 치환 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 대안적으로, 변이체 Fc 도메인은 모 Fc 도메인과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 추가로, 본원에서 논의된 바와 같이, 본원의 변이체 Fc 도메인은 비-변성 겔 전기영동과 같은 본원에 기재된 바와 같은 공지된 기술을 사용하여 측정시 FcRn 수용체에 결합할 뿐만 아니라 다른 Fc 도메인과 이량체를 형성하는 능력을 여전히 보유한다.
본원에서 용어 "가용성 PD-1" 또는 "sPD-1"은 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 단편 또는 트렁케이션된 버전을 함유하지만, PD-1의 막횡단 도메인 또는 세포질(세포내) 도메인은 함유하지 않는 프로그램된 세포 사멸 1(PD-1) 폴리펩티드의 가용성 부분을 의미한다. 인간 야생형 PD-1의 ECD는 도 1에서 잔기 21 내지 170으로 제시되고 또한 표 1에서 SEQ ID NO:1로 제시된다. 일부 구체예에서, 모 야생형 sPD-1 도메인은 트렁케이션된 야생형 sPD-1이 생물학적 활성, 예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 결합을 보유하는 한 N-말단 및/또는 C 말단 트렁케이션을 가질 수 있다.
용어 "sPD-1 변이체"는 야생형 sPD-1의 변이체를 지칭한다. sPD-1 변이체는 PD-L1 및/또는 PD-L2와 같은 PD-1 리간드에 대한 특이적 결합을 유지하지만, 아미노산 치환을 갖고, 야생형 sPD-1과 비교하여 N- 또는 C-말단 트렁케이션을 가질 수 있다. 이 경우에 특이적 결합은 ELISA, Biacore, Sapidyne KinExA 또는 유세포분석 결합 분석과 같은 표준 결합 검정에 의해 결정되며, 이들 검정은 또한 결합 친화성을 결정하는데 사용될 수 있다. 본원에서 논의되는 바와 같이, sPD-1 변이체는 일부 경우에 야생형 sPD-1과 비교하여 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다.
용어 "결합 친화성"은 단백질, 예를 들어, 수용체 또는 이의 변이체와 배위 결합을 형성하는 리간드 또는 이의 변이체의 능력을 지칭한다. 리간드와 단백질 사이의 결합 친화성은 리간드와 단백질(예를 들어, 수용체 또는 이의 변이체) 사이의 koff/kon 비인 평형 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. KD와 결합 친화성은 반비례한다. 예를 들어, KD 값은 PD-1 리간드에 결합하는데 필요한 sPD-1 변이체의 농도와 관련되고, 더 낮은 KD 값(더 낮은 PD-1 변이체 농도)은 PD-1 리간드에 대한 더 높은 결합 친화성에 해당한다. 높은 결합 친화성은 리간드와 단백질 사이의 더 큰 분자간 힘에 해당한다. 낮은 결합 친화성은 리간드와 단백질 사이의 더 낮은 분자간 힘에 해당한다. 일부 경우에, 리간드 결합 친화성의 증가는, 예를 들어, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 500배, 또는 그 초과만큼의 오프-레이트(off-rate)의 감소로서 나타낼 수 있다.
PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 sPD-1 변이체의 능력은, 예를 들어, 검정 플레이트에서 코팅된 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 추정 리간드의 능력에 의해 결정될 수 있다. 한 구체예에서, PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 sPD-1 변이체의 결합 활성은 리간드, 예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2 또는 sPD-1 변이체를 고정함으로써 검정될 수 있다. 예를 들어, 검정은 His-태그에 융합된 PD-L1 및/또는 PD-L2를 Ni-활성화된 NTA 수지 비드 상에 고정시키는 것을 포함할 수 있다. 제제는 적절한 완충액에서 첨가될 수 있고 비드는 주어진 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 결합된 단백질은, 예를 들어, SDS, 높은 pH를 갖는 완충액 등에 의해 방출되고 분석될 수 있다.
대안적으로, PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 sPD-1 변이체의 결합 친화성은 미생물 세포 표면, 예를 들어, 효모 세포 표면에 sPD-1 변이체를 디스플레이하고, 예를 들어, 유세포분석에 의해 결합된 복합체를 검출함으로써 결정될 수 있다. PD-1 리간드에 대한 sPD-1의 결합 친화성은 실시예에 기재된 방법, 방사성 리간드 결합 검정, 비-방사성(형광) 리간드 결합 검정, 표면 플라스몬 공명(SPR), 예를 들어 Biacore™, Octet™, 플라스몬-도파관 공명(PWR), 열역학적 결합 검정, 전체 세포 리간드-결합 검정 및 구조-기반 리간드 결합 검정을 포함하나 이에 제한되지 않는 당 분야에 알려진 임의의 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
특정 리간드 또는 이의 변이체에 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은 비-특이적 상호작용으로부터 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 결합 친화성은 상기 논의된 바와 같은 당 분야의 검정, 예를 들어, 표준 Biacore 검정을 사용하여 측정된다.
특정 리간드 또는 이의 변이체에 특이적인 결합은, 예를 들어, 다른 리간드 단백질에 대한 KD가 적어도 약 10-4 M, 적어도 약 10-5 M, 적어도 약 10-6 M, 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 적어도 약 10-9 M, 대안적으로 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M, 적어도 약 10-12 M, 또는 그 초과인 단백질에 의해 나타날 수 있으며, 여기서 KD는 특정 단백질-리간드 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 전형적으로, 리간드에 특이적으로 결합하는 단백질은 그 단백질에 비해 대조군 분자에 대해 20-, 50-, 100-, 200-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000-배 이상 더 큰 KD를 가질 것이다.
본원에서 사용되는 "잔기"는 단백질에서의 위치 및 이와 관련된 아미노산 실체를 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297(Asn297 또는 N297로도 지칭함)은 인간 항체 IgG1의 위치 297에 있는 잔기이다.
본원에서 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "힌지 도메인"은 항체의 제1 및 제2 불변 도메인 사이에 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩티드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 215에서 끝나고, IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 231에서 시작한다. 따라서, IgG의 경우, 항체 힌지는 본원에서 위치 216(IgG1의 E216) 내지 230(IgG1의 p230)을 포함하도록 정의되며, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 경우에, 힌지 도메인의 N- 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두에 더 적은 아미노산을 함유하는 "힌지 단편"이 사용된다. 본원에 개략된 바와 같이, 일부 경우에, 힌지를 포함하는 Fc 도메인이 사용되며, 힌지는 일반적으로 가요성 링커로서 사용된다. (추가적으로, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 추가의 가요성 링커 성분이 힌지의 유무에 관계없이 사용될 수 있다).
본원에서 사용되는 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 IgG 분자의 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미하고, 일부 경우에, 힌지를 포함한다. 인간 IgG1에 대한 EU 넘버링에서, CH2-CH3 도메인은 아미노산 231 내지 447을 포함하고, 힌지는 216 내지 230이다. 따라서, "Fc 도메인"의 정의는 아미노산 231-447(CH2-CH3) 또는 216-447(힌지-CH2-CH3) 둘 모두, 또는 이의 단편을 포함한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인을 지칭하고, IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인을 지칭하며, 일부 경우에, 이러한 도메인에 대한 가요성 힌지 N-말단을 포함한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3을 포함하고, 일부 경우에, Cγ1 및 Cγ2 사이에 하부 힌지 영역을 포함한다. 이러한 맥락에서 "Fc 단편"은 N- 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두로부터 더 적은 아미노산을 함유할 수 있지만, 일반적으로 크기에 기반하여, 표준 방법을 사용하여 검출될 수 있는 바와 같이 다른 Fc 도메인 또는 Fc 단편과 함께 이량체를 형성하는 능력을 여전히 보유한다(예를 들어, 비-변성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등). 인간 IgG Fc 도메인이 특히 본 발명에서 사용되며, 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 Fc 도메인일 수 있다. 일반적으로, IgG1, IgG2 및 IgG4가 IgG3보다 더 빈번하게 사용된다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 하나 이상의 FcγR 수용체 또는 FcRn 수용체에 대한 결합을 변경하고/거나 생체내 반감기를 증가시키기 위해 Fc 영역에 대한 아미노산 변형이 이루어진다.
본원에서 사용되는 "IgG 하위부류 변형" 또는 "아이소형 변형"은 한 IgG 아이소형의 하나의 아미노산을 상이한 정렬된 IgG 아이소형의 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG1은 EU 위치 296에 티로신을 그리고 IgG2는 페닐알라닌을 포함하기 때문에, IgG2의 F296Y 치환은 IgG 하위부류 변형으로 간주된다. 유사하게, IgG1는 위치 241에 프롤린을 갖고 IgG4는 거기에 세린을 가지므로, S241P를 갖는 IgG4 분자는 IgG 하위부류 변형으로 간주된다. 하위부류 변형은 본원에서 아미노산 치환으로 간주된다는 점에 유의한다.
본원에서 사용되는 "비-자연 발생 변형"은 아이소형이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG 중 어느 것도 위치 297에 아스파라긴을 포함하지 않기 때문에, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4(또는 이들의 하이브리드)에서 치환 N297A는 비-자연 발생 변형으로 간주된다.
본원에서 사용되는 "아미노산" 및 "아미노산 동일성"은 DNA 및 RNA에 의해 코딩되는 20개의 자연 발생 아미노산 중 하나를 의미한다.
본원에서 사용되는 "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로부터 발생하는 생화학적 사건을 의미한다. 이펙터 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 많은 경우에, 상이한 IgG 아이소형(예를 들어, IgG4) 또는 아미노산 치환을 사용하여 Fc 도메인에서 대부분 또는 모든 이펙터 기능을 제거하는 것이 바람직하다; 그러나, FcRn 수용체에 대한 결합은 보존하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이것이 인간 혈청에서 융합 단백질의 반감기에 기여하기 때문이다.
본원에서 사용되는 "Fc 감마 수용체", "FcγR" 또는 "FcgammaR"은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 FcγR 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 패밀리의 임의의 구성원을 의미한다. 인간에서 이 패밀리는 아이소형 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc을 포함하는 FcγRI(CD64); 아이소형 FcγRIIa(동종이형 H131 및 R131 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함) 및 FcγRIIc을 포함하는 FcγRII(CD32); 및 아이소형 FcγRIIIa(동종이형 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb(동종이형 FcγRIIb-NA1 및 FcγRIIb-NA2 포함)을 포함하는 FcγRIII(CD16)(Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, 그 전체내용은 본원에 참조로 포함됨)뿐만 아니라 발견되지 않은 임의의 인간 FcγR 또는 FcγR 아이소형 또는 동종이형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. FcγR은 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 마우스 FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2)뿐만 아니라 발견되지 않은 임의의 마우스 FcγR 또는 FcγR 아이소형 또는 동종이형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "FcRn" 또는 "신생아 Fc 수용체"는 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 FcRn 유전자에 의해 적어도 부분적으로 인코딩되는 단백질을 의미한다.
본원에서 사용되는 "링커" 또는 "링커 펩티드"는 요망되는 활성을 유지하도록 서로에 대해 정확한 입체형태를 가정하는 방식으로 2개의 분자를 연결하기에 적합한 길이를 갖는다. 링커 또는 링커 펩티드는 주로 다음 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Gly, Ser, Ala 또는 Thr. 한 구체예에서, 링커는 약 1 내지 50개의 아미노산 길이, 바람직하게는 약 1 내지 30개의 아미노산 길이이다. 한 구체예에서, 1 내지 20개의 아미노산 길이의 링커가 사용될 수 있으며, 약 4 내지 약 10개의 아미노산이 일부 구체예에서 사용된다. 유용한 링커는, 예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n을 포함하는 글리신-세린 중합체(여기서 n은 적어도 1(및 일반적으로 3 내지 4)의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 다른 가요성 링커를 포함한다. 대안적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 비단백질성 중합체가 링커로서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 링커는, 예를 들어, sPD-1 변이체 도메인을 (변이체) Fc 도메인과 연결하기 위해, 본원에 개략된 임의의 2개의 도메인을 함께 연결하는데 사용되는 "도메인 링커"이다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있지만, 많은 구체예는, 예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n을 포함하는 글리신-세린 중합체(여기서 n은 적어도 1(및 일반적으로 3 내지 4 내지 5)의 정수임)뿐만 아니라 각 도메인이 이의 생물학적 기능을 유지할 수 있도록 충분한 길이 및 가요성으로 2개의 도메인의 재조합 부착을 허용하는 임의의 펩티드 서열을 이용한다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 특히 유용한 도메인 링커는 IgG4의 힌지 도메인에 결합된 GGGGS 링커이다.
본원에서 사용되는 "표적 세포"는 표적 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 세포를 의미한다.
본원에서 본 발명에 따른 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 생산하는 맥락에서 "숙주 세포"는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 성분을 인코딩하는 외인성 핵산을 함유하고 적절한 조건하에 그러한 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 적합한 숙주 세포는 아래에 기술된다.
본원에서 "개선된 활성" 또는 "개선된 기능"은 적어도 하나의 생화학적 특성의 바람직한 변화를 의미한다. 이러한 맥락에서 개선된 기능은 특정 활성의 백분율 증가 또는 감소로서, 또는 바람직한 특성의 증가(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 증가된 결합 친화성 및/또는 특이성, 융합 단백질의 증가된 안정성, 증가된 생체내 반감기 등)인 "배수" 변화로서 측정될 수 있다. 일반적으로, 백분율 변화는 100% 미만의 생화학적 활성의 변화를 설명하기 위해 사용되며, 배수-변화는 (모 단백질과 비교하여) 100% 초과의 생화학적 활성의 변화를 설명하는데 사용된다. 본 발명에서, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 및 99%의 생화학적 활성의 백분율 변화(일반적으로 증가)가 달성될 수 있다. 본 발명에서, "배수 증가"(또는 감소)는 모 단백질과 비교하여 측정된다. 많은 구체예에서, 개선은 적어도 1배 및 10분의 1배(1.1), 1과 1/2배(1.5배), 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 50배, 100배, 200배 이상이다. 예를 들어, 도 8에 도시된 바와 같이, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 모 WT PD-1-Fc 융합 단백질("모 Fc 융합 단백질")과 비교하여 약 10,000배 개선된 PD-L1 결합, 및 모 Fc 융합 단백질과 비교하여 약 200배 개선된 PD-L2 결합을 나타내었다.
C. 가용성 PD-1 변이체-Fc 융합 단백질
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 가용성 PD-1 변이체-Fc 융합 단백질("sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질")은 sPD-1 변이체 도메인, Fc 도메인, 및 선택적으로 sPD-1 변이체 도메인과 Fc 도메인을 연결하는 링커를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 융합 단백질의 포맷은 단백질에서 (N-말단에서 C-말단으로) 순서를 전환하는 성분 도메인과 함께 여러 구성을 취할 수 있다. 한 구체예에서, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로, sPD-1 변이체 도메인-도메인 링커-Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로, Fc 도메인-도메인 링커-sPD-1 변이체 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 사용되지 않으며, 이 경우에 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로, sPD-1 변이체 도메인-Fc 도메인 또는 Fc 도메인-sPD-1 변이체 도메인을 포함한다. 어떤 경우에는, 동일한 융합 단백질이 다소 다르게 표지될 수 있음에 유의한다. 예를 들어, Fc 도메인이 힌지 도메인을 포함하는 경우, sPD-1 변이체 도메인-Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질은 여전히 힌지 도메인 형태의 링커를 포함한다. 대안적으로, 이 동일한 단백질은 Fc 도메인에 포함된 힌지 도메인을 갖지 않을 수 있으며, 이 경우에 융합 단백질은 sPD-1 변이체 도메인-CH2-CH3를 포함한다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 Fc 도메인은 힌지 도메인을 포함하고 sPD-1 변이체 도메인은 힌지 도메인에 의해 Fc 도메인과 연결된다: sPD-1 변이체 도메인-힌지 도메인-CH2-CH3.
일부 구체예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 Fc 도메인은 힌지 도메인을 포함하고 sPD-1 변이체 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 추가 링커에 의해 Fc 도메인과 연결된다. 즉, 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단으로, sPD-1 변이체 도메인-도메인 링커-힌지 도메인-CH2-CH3; sPD-1 변이체 도메인-도메인 링커-CH2-CH3; 힌지 도메인-CH2-CH3-도메인 링커-sPD-1 변이체 도메인 또는 CH2-CH3-도메인 링커-sPD-1 변이체일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 Fc 도메인은 힌지 도메인을 포함하지 않고 sPD-1 변이체 도메인은 상기 기재된 바와 같은 도메인 링커에 의해 Fc 도메인과 연결된다(예를 들어, 비-힌지).
1. sPD-1 변이체 도메인
본 발명의 sPD-1 변이체 도메인은 변이체를 갖는 인간 PD-1의 가용성 ECD를 포함한다. sPD-1 변이체는 Biacore 검정과 같은 당 분야의 결합 친화성 검정에 의해 결정된 바와 같이 야생형 PD-1과 비교하여 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 결합 친화성 및/또는 특이성을 증가시키는 역할을 한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체는 PD-1 리간드(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2)에 결합하고 이를 차단하여 이의 수용체 PD-1에 대한 리간드의 결합을 방해하거나 억제하는 길항제이다. 길항제는 PD-1 수용체에 결합하는데 이용 가능한 리간드의 양을 감소시킴으로써 PD-1에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 억제함으로써 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 이와 같이, 보다 강력한 면역 반응이 대상체에 의해 생성될 수 있다.
일부 경우에, 유용한 sPD-1 변이체 도메인은 표적 세포, 예를 들어, 암 세포 상의 PD-L1 및/또는 PD-L2에 특이적으로 결합하여 PD-L1/PD-L2와 PD-1(예를 들어, 면역 세포, 예를 들어, T 세포 상의 야생형 PD-1) 사이의 상호작용을 감소(예를 들어, 차단, 방지 등)시킨다. 따라서, 본원에 제공된 sPD-1 변이체는 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 조작된 유인 수용체로서 작용할 수 있다. PD-L1 및/또는 PD-L2와 야생형 PD-1 사이의 상호작용을 감소시킴으로써, sPD-1 변이체 도메인은 PD-L/PD-1 상호작용에 의해 생성된 면역 억제성 신호를 감소시킬 수 있으며, 따라서 면역 반응(예를 들어, T 세포 활성화를 증가시킴으로써)을 증가시킬 수 있다. 적합한 sPD-1 변이체 도메인은 일반적으로 신호 서열과 막횡단 도메인 사이에 존재하는 PD-1 리간드에 인식 가능한 친화성, 예를 들어, 높은 친화성으로 결합하기에 충분한 PD-1의 부분, 또는 결합 활성을 보유하는 이의 단편을 포함할 수 있다.
지정된 단백질/단백질 도메인의 명칭 및 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:10의 상응하는 아미노산 서열이 각각 표 1에 열거되어 있다.
표 1. SEQ ID 번호, 설명 및 상응하는 아미노산 서열.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
일부 구체예에서, sPD-1 변이체는 야생형 PD-1과 비교하여 PD-L1, PD-L2 또는 둘 모두에 대한 결합 활성을 증가시키거나 향상시키는 SEQ ID NO:1에 제시된 WT PD-1 도메인에 대한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명은 성숙한 영역에서 시작하는 넘버링을 사용하여, SEQ ID NO:1의 인간 야생형 모 PD-1 도메인과 비교하여 위치 120, 112, 107, 104, 67, 69, 96 및 42에 상응하는 하나 이상(예를 들어, 여러) 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공한다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체는 모 PD-1 도메인에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 모 PD-1 도메인은 SEQ ID NO:1이다. 바람직한 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 본원에 언급된 바와 같이, 변이체 sPD-1 도메인은 트렁케이션된 변이체 sPD-1이 생물학적 활성을 보유하는 한(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 결합) 야생형 sPD-1에 비해 N-말단 및/또는 C 말단 트렁케이션을 가질 수 있다. 명확하게 말하면, 본 발명의 sPD-1 변이체는 적어도 하나의 아미노산 치환을 가지므로 SEQ ID NO:1을 갖지 않는다.
본 발명은 SEQ ID NO:1의 인간 야생형 모 PD-1 ECD 도메인과 비교하여 위치 42, 67, 69, 96, 104, 107, 112 및 120에 상응하는 하나 이상(예를 들어, 여러) 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 표 10에 나타낸 바와 같이 상기 위치 중 1개, 상기 위치 중 2개, 상기 위치 중 3개, 상기 위치 중 4개, 상기 위치 중 5개, 상기 위치 중 6개, 상기 위치 중 7개 또는 상기 위치 중 8개에서 아미노산 치환(들)을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여 A120V, A112I, S107V, G104S, S67G, P69L, N96S 및 S42G로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G, S42G/P69L, S42G/G104S, S42G/S107V, S42G/A112I, S42G/A120V, S67G/P69L, S67G/G104S, S67G/S107V, S67G/A112I, S67G/A120V, P69L/G104S, P69L/S107V, P69L/A112I, P69L/A120V, G104S/S107V, G104S/A112I, G104S/A120V, S107V/A112I, S107V/A120V, A112I/A120V, S42G/S67G/P69L, S42G/S67G/G104S, S42G/S67G/S107V, S42G/S67G/A112I, S42G/S67G/A120V, S42G/P69L/G104S, S42G/P69L/S107V, S42G/P69L/A112I, S42G/P69L/A120V, S42G/G104S/S107V, S42G/G104S/A112I, S42G/G104S/A120V, S42G/S107V/A112I, S42G/S107V/A120V, S42G/A112I/A120V, S67G/P69L/G104S, S67G/P69L/S107V, S67G/P69L/A112I, S67G/P69L/A120V, S67G/G104S/S107V, S67G/G104S/A112I, S67G/G104S/A120V, S67G/S107V/A112I, S67G/S107V/A120V, S67G/A112I/A120V, P69L/G104S/S107V, P69L/G104S/A112I, P69L/G104S/120V, P69L/S107V/A112I, P69L/S107V/120V, P69L/A112I/A120V, G104S/S107V/A112I, G104S/S107V/A120V, G104S/A112I/A120V, S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/G104S, S42G/S67G/P69L/S107V, S42G/S67G/P69L/A112I, S42G/S67G/P69L/A120V, S42G/S67G/G104S/S107V, S42G/S67G/G104S/A112I, S42G/S67G/G104S/A120V, S42G/S67G/S107V/A112I, S42G/S67G/S107V/A120V, S42G/S67G/A112I/A120V, S42G/P69L/ G104S/S107V, S42G/P69L/G104S/A112I, S42G/P69L/G104S/A120V, S42G/P69L/S107V/A112I, S42G/P69L/S107V/A120V, S42G/P69L/A112I/A120V, S42G/G104S/S107V/A112I, S42G/G104S/S107V/A120V, S42G/G104S/A112I/A120V, S42G/S107V/A112I/A120V, S67G/P69L/G104S/S107V, S67G/P69L/G104S/A112I, S67G/P69L/G104S/A120V, S67G/P69L/S107V/A112I, S67G/P69L/S107V/A120V, S67G/P69L/A112I/A120V, S67G/G104S/S107V/A112I, S67G/G104S/S107V/A120V, S67G/G104S/A112I/A120V, S67G/S107V/A112I/A120V, P69L/G104S/S107V/A112I, P69L/G104S/S107V/A120V, P69L/G104S/A112I/A120V, P69L/S107V/A112I/A120V, G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/G104S/S107V, S42G/S67G/P69L/G104S/A112I, S42G/S67G/P69L/G104S/A120V, S42G/S67G/P69L/S107V/A112I, S42G/S67G/P69L/S107V/A120V, S42G/S67G/P69L/A112I/A120V, S42G/S67G/G104S/S107V/A112I, S42G/S67G/G104S/S107V/A120V, S42G/S67G/G104S/A112I/A120V, S42G/S67G/S107V/A112I/A120V, S42G/P69L/G104S/S107V/A112I, S42G/P69L/G104S/S107V/A120V, S42G/P69L/G104S/A112I/A120V, S42G/P69L/S107V/A112I/A120V, S42G/G104S/S107V/A112I/A120V, S67G/P69L/G104S/S107V/A112I, S67G/P69L/G104S/S107V/A120V, S67G/P69L/G104S/A112I/A120V, S67G/P69L/S107V/A112I/A120V, S67G/G104S/S107V/A112I/A120V, P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I, S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A120V, S42G/S67G/P69L/G104S/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, 및 S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인(들), 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질(들)을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V, P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, S67G/G104S/S107V/A112I/A120V, S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, G104S/S107V/A112I/A120V 및 G104S/S107V/A112I로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공하며; sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공하며; sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여 P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공하며; sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S67G/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공하며; sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공하며; sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여 G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공하며; sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1과 비교하여 G104S/S107V/A112I의 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인을 제공하며; sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2를 갖는 sPD-1 변이체 도메인을 제공하며, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:2, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3를 갖는 sPD-1 변이체 도메인을 제공하며, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:3, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:5를 갖는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:6를 갖는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 성숙한 영역으로부터 시작하는 위치 넘버링을 사용하여 위치 42에서 세린의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 19개의 자연 발생 아미노산, 즉, 트레오닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 글리신, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신 중 임의의 것으로의 치환이며, 일부 구체예는 시스테인(가능한 디설파이드 형성으로 인해) 또는 프롤린(입체 효과로 인해)을 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 S42G이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 성숙한 영역으로부터 시작하는 위치 넘버링을 사용하여 위치 67에서 세린의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 19개의 자연 발생 아미노산, 즉, 트레오닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 글리신, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신 중 임의의 것으로의 치환이며, 일부 구체예는 시스테인(가능한 디설파이드 형성으로 인해) 또는 프롤린(입체 효과로 인해)을 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 S67G이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 성숙한 영역으로부터 시작하는 위치 넘버링을 사용하여 위치 69에서 프롤린의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 19개의 자연 발생 아미노산, 즉, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 글리신, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신 중 임의의 것으로의 치환이며, 일부 구체예는 시스테인(가능한 디설파이드 형성으로 인해)을 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 P69L이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 성숙한 영역으로부터 시작하는 위치 넘버링을 사용하여 위치 96에서 아스파라긴의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 19개의 자연 발생 아미노산, 즉, 세린, 트레오닌, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 글리신, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신 중 임의의 것으로의 치환이며, 일부 구체예는 시스테인(가능한 디설파이드 형성으로 인해) 또는 프롤린(입체 효과로 인해)을 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 N96S이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 성숙한 영역으로부터 시작하는 위치 넘버링을 사용하여 위치 104에서 글리신의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 19개의 자연 발생 아미노산, 즉, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신 중 임의의 것으로의 치환이며, 일부 구체예는 시스테인(가능한 디설파이드 형성으로 인해) 또는 프롤린(입체 효과로 인해)을 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 G104S이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 성숙한 영역으로부터 시작하는 위치 넘버링을 사용하여 위치 107에서 세린의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 19개의 자연 발생 아미노산, 즉, 트레오닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 글리신, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신 중 임의의 것으로의 치환이며, 일부 구체예는 시스테인(가능한 디설파이드 형성으로 인해) 또는 프롤린(입체 효과로 인해)을 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 S107V이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 성숙한 영역으로부터 시작하는 위치 넘버링을 사용하여 위치 112에서 알라닌의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 19개의 자연 발생 아미노산, 즉, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신 중 임의의 것으로의 치환이며, 일부 구체예는 시스테인(가능한 디설파이드 형성으로 인해) 또는 프롤린(입체 효과로 인해)을 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 A112I이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 도메인은 성숙한 영역으로부터 시작하는 위치 넘버링을 사용하여 위치 120에서 알라닌의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 19개의 자연 발생 아미노산, 즉, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 시스테인, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신 중 임의의 것으로의 치환이며, 일부 구체예는 시스테인(가능한 디설파이드 형성으로 인해) 또는 프롤린(입체 효과로 인해)을 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 A120V이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체 단백질은 전장 ECD보다 짧다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체는 트렁케이션된 형태가 본원에 개략된 결합 검정 중 하나에 의해 측정시 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 능력을 보유하는 한, 트렁케이션된 버전의 ECD를 포함할 수 있다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어, SEQ ID NO:1의 대략 잔기 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 33, 35, 40, 45 또는 50 내지 대략 잔기 130, 135, 140, 145, 149 또는 150, 예를 들어, 잔기 33-150의 N-말단 및 C-말단 트렁케이션 둘 모두가 가능하다. 일부 경우에, 활성이 유지되는 한, N 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두로부터 몇 개의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)만이 제거된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 sPD-1 변이체는 야생형 PD-1 폴리펩티드/도메인보다 더 나은 PD-1 리간드(즉, PD-L1 및/또는 PD-L2)에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체는 야생형 PD-1의 결합 친화성보다 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배, 200배 이상보다 더 큰 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체는 야생형 PD-1의 결합 친화성보다 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배, 200배 이상보다 더 큰 PD-L1에 대한 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체는 야생형 PD-1의 결합 친화성보다 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배, 200배 이상보다 더 큰 PD-L2에 대한 결합 친화성을 가질 수 있다.
특정 구체예에서, PD-L1, PD-L2 또는 둘 모두에 대한 sPD-1 변이체의 결합 친화성은 야생형 PD-1의 결합 친화성과 비교하여 적어도 약 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과만큼 증가된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체는 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대해 약 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M 또는 1 x 10-12 M 미만의 결합 친화성을 갖는다. 본 발명의 sPD-1 변이체는 PD-L1에 대해 약 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M 또는 1 x 10-12 M 미만의 결합 친화성을 가질 수 있다. 본 발명의 sPD-1 변이체는 PD-L2에 대해 약 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M 또는 1 x 10-12 M 미만의 결합 친화성을 가질 수 있다. 또 다른 구체예에서, sPD-1 변이체는 생체내, 시험관내 또는 둘 모두에서 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 야생형 PD-1 결합을 억제하거나 그와 경쟁한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체는 야생형 PD-1의 PD-L1에 대한 해리 반감기보다 2배 이상(예를 들어, 5배 이상, 10배 이상, 100배 이상, 500배 이상, 1000배 이상, 5000배 이상, 10000배 이상 등) 더 큰 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 해리 반감기를 갖는다.
2. Fc 도메인
본원에서 논의된 바와 같이, 상기 기재된 sPD-1 변이체 도메인 이외에, 본 발명의 융합 단백질은 또한 일반적으로 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 하위부류를 갖는 IgG 부류에 기초한 항체의 Fc 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, Fc 도메인은 선택적으로 IgG 항체의 힌지 도메인을 포함한다.
인간 IgG Fc 도메인이 특히 본 발명에서 사용되며, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 Fc 도메인일 수 있다. 일반적으로, IgG1, IgG2 및 IgG4가 IgG3보다 더 빈번하게 사용된다.
본 발명의 융합 단백질에 포함된 인간 IgG 단백질의 Fc 도메인은 융합 단백질의 반감기에 상당한 증가를 부여하고, Ig 분자와의 추가 결합 또는 상호작용을 제공한다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 단량체 sPD-변이체 폴리펩티드와 비교하여 다른 분자를 정제, 다량체화, 결합 및 중화시키는 것을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 Fc 도메인은 또한 필요에 따라 기능을 변경하기 위해 Fc 변이체를 함유할 수 있다. 그러나, 임의의 Fc 변이체는 일반적으로 FcRn에 결합하는 능력뿐만 아니라 이량체를 형성하는 능력을 모두 보유할 필요가 있다. 따라서, 본원의 많은 구체예는 이펙터 기능을 피하기 위해 인간 IgG4 도메인의 사용에 의존하지만, 다른 IgG 도메인에서 기능을 증강시키거나 폐지시키는 Fc 변이체가 만들어질 수 있다. 따라서, 예를 들어, IgG1 또는 IgG2에서 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 절제 변이체가 사용될 수 있고/거나 FcRn에 보다 긴밀한 결합을 부여하는 Fc 변이체가 사용될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 이해될 것이다.
a. IgG4 Fc 도메인
IgG4 하위부류는 C1q 단백질 복합체에 대한 무시할 만한 결합을 나타내고 고전적인 보체 경로를 활성화할 수 없기 때문에 다른 IgG 하위부류와 구별된다(A. Nirula et al., 2011, Current Opinion in Rheumatology 23:119-124, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 결과적으로, IgG4는 현저한 이펙터 기능을 갖지 않기 때문에 본 발명에서 사용되며, 따라서 세포 고갈 없이 수용체-리간드 결합을 차단하는데 사용된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 인간 IgG4의 CH2-CH3을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 변이체 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 그러나, 본원의 변이체 Fc 도메인은 FcRn에 결합하는 능력뿐만 아니라 공지된 것을 사용하여 측정시 또 다른 Fc 도메인과 함께 이량체를 형성하는 능력을 여전히 보유하는데, 이는 본원의 융합 단백질의 혈청 반감기의 증가에 상당히 기여한다.
변이체 IgG4 Fc 도메인은 모 인간 IgG4 Fc 도메인과 비교하여 첨가, 결실, 치환 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 변이체 인간 IgG4 Fc 도메인은 상응하는 모 인간 IgG4 Fc 도메인와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다(상기 논의된 동일성 알고리즘 사용, 한 구체예는 디폴트 파라미터를 사용한 당 분야에 공지된 바와 같은 BLAST 알고리즘을 활용함).
일부 구체예에서, 본 발명의 변이체 인간 IgG4 Fc 도메인은 모 인간 IgG4 Fc 도메인과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 변이체 인간 IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링 인덱스에 따른 위치 228에서 세린의 프롤린으로의 아미노산 치환을 포함한다.
b. 다른 IgG Fc 도메인
일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG3와 같은 IgG4 이외의 다른 IgG로부터의 Fc 도메인일 수 있다. 일반적으로, IgG1 및 IgG2는 IgG3보다 더 빈번하게 사용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 인간 IgG1의 Fc 도메인이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 인간 IgG2의 Fc 도메인이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 변이체 인간 IgG2 Fc 도메인이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인은 상응하는 모 인간 IgG1 Fc 도메인와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다(상기 논의된 동일성 알고리즘 사용, 한 구체예는 디폴트 파라미터를 사용한 당 분야에 공지된 바와 같은 BLAST 알고리즘을 활용함).
일부 구체예에서, 본 발명의 변이체 인간 IgG2 Fc 도메인은 상응하는 모 인간 IgG2 Fc 도메인와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다(상기 논의된 동일성 알고리즘 사용, 한 구체예는 디폴트 파라미터를 사용한 당 분야에 공지된 바와 같은 BLAST 알고리즘을 활용함).
일부 구체예에서, 본 발명의 변이체 인간 IgG3 Fc 도메인은 상응하는 모 인간 IgG3 Fc 도메인와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다(상기 논의된 동일성 알고리즘 사용, 한 구체예는 디폴트 파라미터를 사용한 당 분야에 공지된 바와 같은 BLAST 알고리즘을 활용함).
일부 구체예에서, 본 발명의 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인은 모 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 변이체 인간 IgG2 Fc 도메인은 모 인간 IgG2 Fc 도메인과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 변이체 인간 IgG3 Fc 도메인은 모 인간 IgG3 Fc 도메인과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형을 가질 수 있다.
3. 링커
상기 기재된 2개의 도메인(즉, sPD-1 변이체 도메인 및 Fc 도메인)은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 도메인 링커를 사용하여 연결된다. 본 발명의 맥락에서, 중요한 것은 2개의 도메인이 독립적으로 작용할 수 있는 방식으로 가요성 링커를 사용하여 부착된다는 것이다. 이는 전통적인 링커 및/또는 힌지 링커를 사용하여 다양한 방식으로 달성될 수 있다.
임의의 적합한 링커가 사용될 수 있지만, 많은 구체예는, 예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n을 포함하는 글리신-세린 중합체(여기서 n은 적어도 1(및 일반적으로 3 내지 4 내지 5)의 정수임)뿐만 아니라 각 도메인이 이의 생물학적 기능을 유지할 수 있도록 충분한 길이 및 가요성으로 2개의 도메인의 재조합 부착을 허용하는 임의의 펩티드 서열을 이용한다.
일부 구체예에서, 인간 IgG 항체의 힌지 도메인이 사용된다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 힌지 도메인은 도 12에 제시되어 있다. 일부 경우에, 힌지 도메인은 또한 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, S228P 변이체를 포함하는 IgG4로부터의 힌지 도메인이 사용된다.
일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
한 구체예에서, 링커는 약 1 내지 50개의 아미노산 길이, 바람직하게는 약 1 내지 30개의 아미노산 길이이다.
다른 구체예에서, 링커는 1 내지 20개의 아미노산 길이, 바람직하게는 약 5 내지 약 10개의 아미노산이다.
4. 본 발명의 특정 구체예
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 나타내는 sPD-1 변이체 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 a) SEQ ID NO:1과 비교하여 아미노산 치환을 포함하는 가용성 PD-1(sPD-1) 변이체 도메인으로서, 상기 아미노산 치환이 42, 67, 69, 96, 104, 107, 112 및 120으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치 번호에 있는 sPD-1 변이체 도메인, b) 링커, 및 c) Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 a) 상기 sPD-1 변이체 도메인; b) 상기 링커; 및 c) 상기 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 a) 상기 Fc 도메인; b) 상기 링커; 및 c) 상기 sPD-1 변이체 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 비교하여 아미노산 치환을 포함하는 가용성 PD-1(sPD-1) 변이체 도메인으로서, 상기 아미노산 치환이 42, 67, 69, 96, 104, 107, 112 및 120으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치 번호에 있는 sPD-1 변이체 도메인, 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 a) 상기 sPD-1 변이체 도메인; 및 b) 상기 링커를 포함한다. 일부 구체예에서, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 a) 상기 Fc 도메인; 및 b) 상기 sPD-1 변이체 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 a) SEQ ID NO:1과 비교하여 S42G, S67G, P69L, N96S, G104S, S107V, A112I 및 A120V로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인; b) 링커; 및 c) Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S42G, S67G, P69L, N96S, G104S, S107V, A112I 및 A120V로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 sPD-1 변이체 도메인; 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 a) SEQ ID NO:1과 비교하여 S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G, S42G/P69L, S42G/G104S, S42G/S107V, S42G/A112I, S42G/A120V, S67G/P69L, S67G/G104S, S67G/S107V, S67G/A112I, S67G/A120V, P69L/G104S, P69L/S107V, P69L/A112I, P69L/A120V, G104S/S107V, G104S/A112I, G104S/A120V, S107V/A112I, S107V/A120V, A112I/A120V, S42G/S67G/P69L, S42G/S67G/G104S, S42G/S67G/S107V, S42G/S67G/A112I, S42G/S67G/A120V, S42G/P69L/G104S, S42G/P69L/S107V, S42G/P69L/A112I, S42G/P69L/A120V, S42G/G104S/S107V, S42G/G104S/A112I, S42G/G104S/A120V, S42G/S107V/A112I, S42G/S107V/A120V, S42G/A112I/A120V, S67G/P69L/G104S, S67G/P69L/S107V, S67G/P69L/A112I, S67G/P69L/A120V, S67G/G104S/S107V, S67G/G104S/A112I, S67G/G104S/A120V, S67G/S107V/A112I, S67G/S107V/A120V, S67G/A112I/A120V, P69L/G104S/S107V, P69L/G104S/A112I, P69L/G104S/120V, P69L/S107V/A112I, P69L/S107V/120V, P69L/A112I/A120V, G104S/S107V/A112I, G104S/S107V/A120V, G104S/A112I/A120V, S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/G104S, S42G/S67G/P69L/S107V, S42G/S67G/P69L/A112I, S42G/S67G/P69L/A120V, S42G/S67G/G104S/S107V, S42G/S67G/G104S/A112I, S42G/S67G/G104S/A120V, S42G/S67G/S107V/A112I, S42G/S67G/S107V/A120V, S42G/S67G/A112I/A120V, S42G/P69L/G104S/S107V, S42G/P69L/G104S/A112I, S42G/P69L/G104S/A120V, S42G/P69L/S107V/A112I, S42G/P69L/S107V/A120V, S42G/P69L/A112I/A120V, S42G/G104S/S107V/A112I, S42G/G104S/S107V/A120V, S42G/G104S/A112I/A120V, S42G/S107V/A112I/A120V, S67G/P69L/G104S/S107V, S67G/P69L/G104S/A112I, S67G/P69L/G104S/A120V, S67G/P69L/S107V/A112I, S67G/P69L/S107V/A120V, S67G/P69L/A112I/A120V, S67G/G104S/S107V/A112I, S67G/G104S/S107V/A120V, S67G/G104S/A112I/A120V, S67G/S107V/A112I/A120V, P69L/G104S/S107V/A112I, P69L/G104S/S107V/A120V, P69L/G104S/A112I/A120V, P69L/S107V/A112I/A120V, G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/G104S/S107V, S42G/S67G/P69L/G104S/A112I, S42G/S67G/P69L/G104S/A120V, S42G/S67G/P69L/S107V/A112I, S42G/S67G/P69L/S107V/A120V, S42G/S67G/P69L/A112I/A120V, S42G/S67G/G104S/S107V/A112I, S42G/S67G/G104S/S107V/A120V, S42G/S67G/G104S/A112I/A120V, S42G/S67G/S107V/A112I/A120V, S42G/P69L/G104S/S107V/A112I, S42G/P69L/G104S/S107V/A120V, S42G/P69L/G104S/A112I/A120V, S42G/P69L/S107V/A112I/A120V, S42G/G104S/S107V/A112I/A120V, S67G/P69L/G104S/S107V/A112I, S67G/P69L/G104S/S107V/A120V, S67G/P69L/G104S/A112I/A120V, S67G/P69L/S107V/A112I/A120V, S67G/G104S/S107V/A112I/A120V, P69L/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I, S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A120V, S42G/S67G/P69L/G104S/A112I/A120V, S42G/S67G/P69L/S107V/A112I/A120V, S42G/S67G/G104S/S107V/A112I/A120V, S42G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V 및 S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인, b) 선택적 링커 및 c) Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 비교하여 P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S67G/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 비교하여 S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 비교하여 G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:1과 비교하여 G104S/S107V/A112I의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 IgG의 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 변이체 인간 IgG Fc 도메인이고, 여기서 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 도메인 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 링커는 GGGGS이다. 일부 구체예에서, 도메인 링커는 힌지 도메인 및 가요성 링커의 조합, 예를 들어, 또한 GGGGS 링커와 함께 S228P를 갖는 IgG4 힌지이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 PD-1 변이체 도메인은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138 및 SEQ ID NO:139로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:2에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:3에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:72에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:110에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:130에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:131에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:138에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:12에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:13에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:14에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:15에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:16에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:17에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:18에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:19에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:20에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:21에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:22에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:23에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:24에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:25에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:26에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:27에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:28에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:29에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:30에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:31에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:32에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:33에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:34에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:35에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:36에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:37에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:38에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:39에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:40에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:41에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:42에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:43에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:44에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:45에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:46에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
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일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:48에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
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일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:51에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
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일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:55에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:56에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:57에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:58에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:59에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:60에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:61에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:62에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:63에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:64에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:65에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:66에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:67에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:68에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:69에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:70에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:71에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:73에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:74에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:75에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:76에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:77에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:78에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
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일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:80에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:81에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:82 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:83에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:84에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:85에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:86에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:87에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:88에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:89에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:90에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:91에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:92에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:93에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:94에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:95에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:96에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:97에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:98에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:99에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:100에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:101에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:102에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:103에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:104에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:105에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:106에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:107에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:108에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:109에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:111에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:112에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:113에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:114에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:115에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:116에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:117에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:118에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:119에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:120에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:121에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:122에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:123에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:124에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:125에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:126에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:127에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:128에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:129에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:132에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:133에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:134에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:135에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:136에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:137에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:139에 제시된 바와 같은 sPD-1 변이체 도메인, 선택적 링커 및 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 인간 IgG Fc 도메인 또는 변이체 인간 IgG Fc 도메인을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 변이체 인간 IgG Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함하는 인간 IgG Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 인간 IgG4의 CH2-CH3를 포함하는 인간 IgG Fc 도메인을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 EU 넘버링 인덱스에 따른 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3을 포함하는 변이체 인간 IgG Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되는 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 GGGGS의 링커를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 모 Fc 융합 단백질(예를 들어, SEQ ID NO:4에 제시된 바와 같은 WT PD-1-Fc 융합 단백질)의 결합 친화성보다 적어도 약 1.1배 이상(예를 들어, 5배 이상, 10배 이상, 100배 이상, 500배 이상, 1000배 이상, 5000배 이상, 10000배 이상 등)인 PD-1 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 모 융합 단백질의 결합 친화성보다 적어도 약 100배 더 강한 PD-1 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 모 융합 단백질의 결합 친화성보다 적어도 약 200배 더 강한 PD-1 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 모 융합 단백질의 결합 친화성보다 적어도 약 10,000배 더 강한 PD-1 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 10-8 M 이상의 친화성의 KD로 PD-1 리간드에 대한 결합 친화성을 가지며, 여기서 친화성은 표준 Biacore 검정에 의해 측정된다. .
일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 시험관내 또는 생체내에서 야생형 PD-1 폴리펩티드와 PD-1 리간드 사이의 결합을 억제하거나 방지한다.
sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 sPD-1 변이체 도메인은 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 결합 친화성을 증가시키는 역할을 한다. 인간 IgG 단백질의 (변이체) Fc 도메인은 융합 단백질의 반감기를 상당히 증가시킨다. 본 발명의 융합 단백질은 적응성 면역계가 억제되거나 면역 반응 수준의 크기 증가가 필요한 질병 또는 장애를 치료하는데 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 암 또는 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.
D. 핵산
본 발명은 또한 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 그러한 핵산은 본 출원에 언급된 임의의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩할 수 있다.
본 발명의 핵산은 실질적인 순도로 분리되고 수득될 수 있다. 일반적으로, DNA 또는 RNA로서의 핵산은 다른 자연-발생 핵산 서열이 실질적으로 없이 수득될 것이며, 일반적으로 적어도 약 50%, 일반적으로 적어도 약 90% 순수하고, 전형적으로, 예를 들어, 자연 발생 염색체 상에 일반적으로 결합되지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드가 측면에 위치하는 "재조합"이다.
일부 구체예에서, 조성물은 SEQ ID NO:5의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 SEQ ID NO:6의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산은 신호 서열을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 신호 서열은 발현 생성물을 세포 외부로 유도하기 위해 사용된다. 이 경우에, 본 발명의 융합 단백질의 발현에 적합한 신호 서열은 도 1에 이탤릭체로 표시되고 표 1의 SEQ ID NO:7에 제시된 바와 같은 야생형 PD-1의 신호 서열이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질의 발현에 적합한 신호 서열은 발현에 사용되는 숙주 세포에 "일치(matched)"할 수 있다. 즉, 본 발명의 융합 단백질이 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 발현될 때, 예를 들어, CHO 세포로부터의 신호 서열이 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 SEQ ID NO:9의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 SEQ ID NO:10의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, 및 SEQ ID NO:139로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 구체예에서, sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화된 버전 또는 변이체를 포함한다.
이러한 맥락에서 "코돈 최적화"는 특정 숙주 유기체 및 이의 일반적으로 바람직한 아미노산 코돈과 관련하여 수행되며; 즉, 숙주 생산 유기체, 예를 들어, 아스퍼질루스(Aspergillus) 종은 아스퍼질루스 선호 코돈을 사용하여 효모 생산 유기체에 비해 더 높은 번역 및/또는 분비를 일으킬 수 있다.
코돈 최적화는 사용된 숙주 세포에서 발현을 최적화하기 위해, 본 발명의 임의의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질에 사용될 수 있다.
sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 일반적으로 모 유전자의 부위-지정 돌연변이유발 및 합성 유전자 작제를 포함하는 잘 알려진 기술을 사용하여 융합 단백질 서열을 인코딩하는 작제 유전자에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 핵산의 발현은 그 자체로 또는 당 분야에 공지된 다른 조절 서열에 의해 조절될 수 있다.
1. 조절 서열
본 발명은 또한 조절 서열과 양립될 수 있는 조건하에 적합한 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이다. 조절 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 폴리뉴클레오티드인 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 Fc 융합 단백질의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 포함한다. 프로모터는 돌연변이체, 트렁케이션 및 하이브리드 프로모터를 포함하는 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 숙주 세포와 동종 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다.
일부 구체예에서, 조절 서열은 또한 변이체의 N-말단에 연결된 신호 펩티드를 인코딩하고 변이체 피타제가 세포의 분비 경로로 발현되도록 지시하는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 5'-말단은 본래 변이체 피타제를 인코딩하는 코딩 서열의 세그먼트와 번역 판독 프레임에서 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열의 5'-말단은 코딩 서열에 외래인 신호 펩티드 코딩 서열을 포함할 수 있다. 코딩 서열이 신호 펩티드 코딩 서열을 자연적으로 포함하지 않는 경우 외래 신호 펩티드 코딩 서열이 필요할 수 있다. 대안적으로, 외래 신호 펩티드 코딩 서열은 단순히 변이체 피타제의 분비를 향상시키기 위해 자연 신호 펩티드 코딩 서열을 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 변이체를 숙주 세포의 분비 경로로 지시하는 임의의 신호 펩티드 코딩 서열이 사용될 수 있다.
E. 발현 벡터
항시적으로 또는 하나 이상의 조절 요소하에, 본 발명의 하나 이상의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 시험관내 또는 생체내 발현을 위한 발현 벡터가 또한 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 본 발명은 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 다양한 뉴클레오티드 및 조절 서열은 함께 결합되어 하나 이상의 편리한 제한 부위를 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터를 생성함으로써 그러한 부위에서 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 또는 치환을 허용할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물을 발현을 위한 적절한 벡터에 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터를 생성할 때, 코딩 서열은 코딩 서열이 발현을 위한 적절한 조절 서열과 작동 가능하게 연결되도록 벡터에 위치한다.
재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 절차를 거칠 수 있고 폴리뉴클레오티드의 발현을 일으킬 수있는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스) 일 수 있다. 벡터의 선택은 일반적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 양립성에 따라 달라질 것이다. 벡터는 선형 또는 폐쇄형 원형 플라스미드일 수 있다.
벡터는 자율 복제 벡터, 즉, 염색체외 실체로 존재하여 그 복제가 염색체 복제와 무관한 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 보장하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 유전체에 통합되고 이것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 또한, 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 숙주 세포의 유전체에 도입될 전체 DNA를 함께 포함하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포존이 사용될 수 있다. 본 발명의 방법과 함께 사용하기 위해 고려되는 벡터는 통합 및 비-통합 벡터 둘 모두를 포함한다.
F. 숙주 세포 및 생산 균주
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 변이체 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 재조합 생산을 위한 매우 다양한 생산 숙주 유기체가 존재하며, 이는 비제한적으로 박테리아 세포, 포유동물 세포 및 효모를 포함하는 진균 세포를 포함한다.
본 발명의 핵산은 트랜스페린 폴리양이온-매개된 DNA 전달, 네이키드 또는 캡슐화된 핵산을 사용한 트랜스펙션, 리포솜-매개된 DNA 전달, DNA-코팅된 라텍스 비드의 세포내 수송, 원형질체 융합, 바이러스 감염, 전기천공, 유전자 총, 칼슘 포스페이트-매개된 트랜스펙션 등과 같은 당 분야에서 이용 가능한 다양한 기술을 사용하여 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다.
G. 융합 단백질을 제조하는 방법
본 발명은 또한 a) 본 발명의 숙주 세포를 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및 b) 선택적으로 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
H. 치료 방법
1. 치료를 받을 수 있는 대상체
본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 사용한 결과로 달성된 증가된 T 세포 반응은 암, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염 및 기생충 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병 또는 장애를 치료하기에 충분하다.
본 발명의 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본원에 기재된 하나 이상의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 암을 갖고 치료적 유효량의 하나 이상의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 투여는 대상체에서 종양의 전이 또는 침습을 치료, 감소 또는 예방할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질(들)은 암에 걸린 대상체에서 고형 종양의 성장을 감소시키거나 억제할 수 있다.
일부 구체예에서, 감염, 예를 들어, 국소 또는 전신 감염을 갖는 대상체는 감염을 치료하기 위해 치료적 유효량의 본원에 기재된 하나 이상의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 투여받는다. 다른 구체예에서, 대상체는 박테리아, 바이러스, 원생동물, 기생충 또는 다른 미생물 병원체에 의해 야기된 만성 감염성 질환을 갖는다.
2. 치료적 투여
특정 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 포함하는 치료적으로 유효한 조성물 또는 제형은 이를 필요로 하는 개체에게 전신적으로 또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
3. 투여
일부 구체예에서, 예를 들어, 전이성 암 또는 감염의 치료를 위한 본 발명의 치료적 실체의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 사람인지 동물인지, 투여되는 다른 약물, 및 치료가 예방적인지 치료적인지를 포함하는 많은 다양한 요인에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 수 있다.
VII. 실시예
A. 실시예 1: 인간 PDL1 및 PDL2 복합체를 갖는 sPD1 변이체 모델링
1. 방법
인간 PD-1/PD-L1 복합체 구조는 Protein Data Bank에서 이용 가능하며, PDBID는 4ZQK 및 5IUS이다. 그러나, 둘 모두의 PDB 구조에서, PD-1의 일부 잔기가 루프 영역에서 누락되고, 잔기 중 일부는 야생형 PD-1과 비교하여 돌연변이되었다. 결합 친화성 및 단백질 안정성에 대한 돌연변이의 영향을 더 잘 조사하기 위해, 누락된 루프를 먼저 고정하고 잔기를 결정 구조 4ZQK에 기반하여 야생형 PD-1으로 다시 돌연변이시켰다. 돌연변이된 PD-1 구조는 Schrodinger Suite의 잔기 스캐닝 모듈을 사용하여 모델링되었다. 돌연변이된 잔기의 5.0 Å 이내 잔기는 측쇄 예측 및 백본 샘플링으로 정제되었다. 단백질 상호작용 분석은 WT PD-1/PD-L1 복합체 구조 및 sPD-1 변이체/PD-L1 복합체 구조 둘 모두에 대해 수행되었다. 3개의 PD-1/PD-L1 복합체 모델, WT 모델, 3개의 계면 돌연변이를 갖는 모델, 8개 모두의 돌연변이를 갖는 모델을 추가 정제 및 최적화를 위해 OPLS3 포스-필드(force-field)를 사용하여 10 ns 분자 역학(MD) 시뮬레이션에 제출하였다. 각 복합체를 SPC 수를 용매로서 사용하여 주기적인 사방정계 상자에서 용매화하였다. 임의의 복합체 원자로부터 상자 벽까지의 최소 거리는 10 Å로 설정되었다. 3개의 MD 시뮬레이션은 모두 300 K의 일정한 온도와 1 atm의 일정한 압력에서 수행되었다. 분석을 위해 1 ps 간격으로 저장된 궤적 좌표가 사용되었다.
인간 PD-L2 구조가 Protein Data Bank에서 사용할 수 없기 때문에, PD-L2의 상동성 모델을 인간 PD-1과 PD-L2 사이의 상호작용을 조사하기 위해 구성하였다. PDB 비-중복 데이터 세트에서 상동성 검색 후, 마우스 PD-L2의 3개의 PDB 구조를 주형으로 선택하였다. 앞서 설명한 바와 같이, WT 및 sPD-1 변이체/PD-L2 모델에 대해서도 단백질 상호작용 분석을 수행하였다.
2. 인간 PD-1/PD-L1 복합체의 모델링
WT PD-1, 4ZQK 및 5IUS의 서열 정렬 결과는 도 2에 도시되어 있다. 동일한 잔기는 청색으로 표시되고, 둘 모두의 결정 구조에서 누락된 잔기는 적색으로 표시되고, 4ZQK에서만 누락된 잔기는 청록색으로 표시된다.
누락된 루프가 고정되고 잔기 93이 Cys로 다시 돌연변이된 PD-1의 모델은 도 3에 청록색으로 표시된다. 4ZQK에서 PD-1 및 PD-L1의 결정 구조는 각각 청색 및 녹색으로 표시된다. 돌연변이를 위한 PD-1 상의 7개의 잔기(넘버링이 신호 영역에서 시작할 때 Ser62, Ser87, Pro89, Gly124, Ser127, Ala132 및 Ala140; 이는 넘버링이 성숙한 영역에서 시작할 때 Ser42, Ser67, Pro69, Gly104, Ser107, Ala112 및 Ala120과 동일함)는 주황색 막대로 표시되고, N-글리코실화 부위(Asn116)는 자주색 막대로 표시된다.
돌연변이된 PD-1 구조는 Schrodinger Suite의 잔기 스캐닝 모듈을 사용하여 모델링되었다. 돌연변이된 잔기의 5.0 Å 이내 잔기는 측쇄 예측 및 백본 샘플링으로 정제되었다. 단백질 상호작용 분석은 WT PD-1/PD-L1 복합체 구조 및 돌연변이된 8개 모두의 잔기를 갖는 돌연변이된 PD-1/PD-L1 복합체 구조 둘 모두에 대해 수행되었다. 분석 결과는 각각 표 2 및 3에 나열되어 있다. 위치 넘버링이 신호 영역에서 시작할 때 돌연변이 G124S, S127V 및 A132I는 계면 돌연변이로 간주된다. 그리고 위치 넘버링이 신호 영역에서 시작할 때 돌연변이 S62G, S86G, P89L 및 A140V는 외부 돌연변이로 간주된다. 돌연변이 G124S는 PD-L1과 수소 결합을 하나 더 만들고, 돌연변이 A132I는 PD-L1과 수소 결합을 유지하고 표면 상보성을 증가시킨다.
돌연변이가 PD-1/ PD-L1 결합에 어떻게 영향을 미치는지 추가로 조사하기 위해, 각 돌연변이 전후의 결합 친화성 및 단백질 안정성의 변화를 계산하였다. 결과는 표 4에 나열되어 있다. 결합 친화성 및 단백질 안정성의 변화 계산이 또한 다중 돌연변이에 대해 수행되었다. 결과는 표 5에 나열되어 있다. 결합 친화성 또는 안정성이 더 음의 값이면 이들이 더 크게 증가함을 나타낸다. 일반적으로, 계면 돌연변이는 결합 친화성과 단백질 안정성 둘 모두를 증가시키며, 외부 돌연변이는 기본적으로 안정성에만 기여한다. 8개 모두의 돌연변이를 갖는 경우, 결합 친화성이 19.03 kcal/mol만큼 증가하고 단백질 안정성이 69.92 kcal/mol만큼 증가한다.
3개의 PD-1/PD-L1 복합체 모델, WT 모델, 3개의 계면 돌연변이를 갖는 모델, 8개 모두의 돌연변이를 갖는 모델을 추가 정제 및 최적화를 위해 OPLS3 포스-필드를 사용하여 10 ns 분자 역학(MD) 시뮬레이션에 제출하였다. 각 복합체를 SPC 수를 용매로서 사용하여 주기적인 사방정계 상자에서 용매화하였다. 임의의 복합체 원자로부터 상자 벽까지의 최소 거리는 10 Å로 설정되었다. 3개의 MD 시뮬레이션은 모두 300 K의 일정한 온도와 1 atm의 일정한 압력에서 수행되었다. 분석을 위해 1 ps 간격으로 저장된 궤적 좌표가 사용되었다. 백본 원자-위치 RMSD의 시간-진화는 도 4에 도시되어 있다. MD 결과는 또한 돌연변이가 모델 안정성을 증가시키는 것을 보여준다.
표 2. WT 인간 PD-1/PD-L1 모델의 단백질 상호작용 분석.
Figure pct00004
표 3. 돌연변이된(위치 넘버링이 신호 영역에서 시작할 때 S62G, S87G, P89L, G124S, S127V, A132I, A140V 및 N116S) 인간 PD-1/PD-L1 모델의 단백질 상호작용 분석.
Figure pct00005
표 4. 각각의 단일 돌연변이에 대한 인간 PD-1/PD-L1의 결합 친화성 및 단백질 안정성의 변화(kcal/mol).
Figure pct00006
표 5. 다중 돌연변이에 대한 인간 PD-1/PD-L1의 결합 친화성 및 단백질 안정성의 변화(kcal/mol). 결합 친화성 또는 안정성이 더 음의 값이면 이들이 더 크게 증가함을 나타낸다.
Figure pct00007
3. 인간 PD-1/PD-L2 복합체의 모델링
서열 정렬 결과는 도 5a에 도시되어 있다. 인간 PD-L2와 마우스 PD-L2 사이의 서열 동일성은 약 72%이다. 인간 PD-L2의 컨센서스 모델은 도 5b에 도시되어 있다. 동일한 잔기는 청색으로 표시된다. 누락된 루프의 잔기는 적색으로 표시된다.
인간 PD-L2 모델과 마우스 PD-L2 결정 구조(PDBID: 3BP5) 사이의 PD-1 결합 계면 비교는 도 6에 도시되어 있다. 계면 잔기는 선으로 표시된다. 계면 잔기는 인간 PD-L2 모델(진한 청색으로 표시됨)에서 녹색으로 표시된다. 마우스 PD-L2의 결정 구조는 분홍색으로 표시된다. 계면 상의 서열 동일성은 66%이다. 인간 PD-1/PD-L2 복합체 모델은 인간 PD-1 모델(부분 I에 설명됨)과 컨센서스 인간 PD-L2 모델에 기반하여 마우스 PD-1/PD-L2 결정 구조(PDBID: 3BP5)에 중첩시킴으로써 구성되었다. 인간 PD-1/PD-L2 모델 및 마우스 PD-1/PD-L2 결정 구조(PDBID: 3BP5)의 오버레이는 도 7에 도시되어 있다. 인간 PD-1 및 PD-L2 모델은 청록색 및 진한 청색으로 표시되고, 마우스 PD-1 및 PD-L2 구조는 각각 황색 및 분홍색으로 표시된다.
방법 섹션에 설명된 바와 같이, 단백질 상호작용 분석은 WT 및 돌연변이된 인간 PD-1/PD-L2 모델에 대해서도 수행되었다. 결과는 표 6 및 7에 나열되어 있다. 돌연변이 G124S 및 A132I는 표면 상보성을 약간 증가시킨다. 결합 친화성 및 단백질 안정성의 변화 계산이 또한 각각의 단일 돌연변이 및 다중 돌연변이에 대해 수행되었다. 결과는 표 8 및 9에 나열되어 있다. 일반적으로, 계면 돌연변이는 결합 친화성을 증가시키고, 외부 돌연변이는 안정성을 증가시킨다. 8개 모두의 돌연변이를 갖는 경우, 결합 친화성이 10.62 kcal/mol만큼 증가하고 단백질 안정성이 10.7 kcal/mol만큼 증가한다. PD-1/PD-L2의 결합 친화성 및 안정성의 변화는 PD-1/PD-L1의 변화만큼 현저하지 않다. 이는 상동성 모델과 결정 구조 사이의 구조적 정밀도 차이로 인한 것일 수 있다.
표 6. WT 인간 PD-1/PD-L2 모델의 단백질 상호작용 분석.
Figure pct00008
표 7. 돌연변이된(위치 넘버링이 신호 영역에서 시작할 때 S62G, S87G, P89L, G124S, S127V, A132I, A140V 및 N116S, 이는 위치 넘버링이 성숙한 영역에서 시작할 때 S42G, S67G, P69L, G104S, S107V, A112I, A120V 및 N96S와 각각 동일함) 인간 PD-1/PD-L2 모델의 단백질 상호작용 분석.
Figure pct00009
표 8. 각각의 단일 돌연변이에 대한 인간 PD-1/PD-L2의 결합 친화성 및 단백질 안정성의 변화(kcal/mol).
Figure pct00010
표 9. 다중 돌연변이에 대한 인간 PD-1/PD-L2의 결합 친화성 및 단백질 안정성의 변화(kcal/mol).
Figure pct00011
표 10. 콜로니 추적 번호, SEQ ID 번호 및 야생형(SEQ ID NO:11)과 관련하여 상이한 콜로니에서 아미노산 돌연변이. 신호 펩티드 영역은 잔기 1 내지 20이며, 성숙한 세포외 도메인(ECD)은 잔기 21에서 시작하여 170까지이다. 링커 도메인은 잔기 171에서 시작하여 175까지이다. 각 서열의 아미노산 돌연변이(들)에 대한 서열 넘버링은 성숙한 영역에서 시작한다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
B. 실시예 2: PD-L1 및 PD-L2에 대한 sPD-1 변이체의 결합 친화성
결합 친화성 검정은 제조업체의 검정 프로토콜에 따라 수행되었다. 기계 모델은 Biacore T200, GE Healthcare Life sciences이다. 실험은 25℃에서 수행되었다. 분석물은 인간 PD-L1 및 인간 PD-L2였다. 실행 완충액은 HBS-EP+였다. 간단히, 항-인간 Fc IgG를 CM5 센서 칩에 고정하였다. sPD-1 변이체를 고정된 센서 칩에 포획하였다. 연속 희석된 분석물을 주입하여 다중 사이클 동역학을 수행하였다.
sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 WT PD-1-Fc 결합 단백질("모 Fc 융합 단백질")과 비교하여 약 10,000배 개선된 PD-L1 결합, 및 모 Fc 융합 단백질과 비교하여 약 200배 개선된 PD-L2 결합을 나타내었다(도 8).
C. 실시예 3: MC38 세포에 대한 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 결합 활성
FACS 결합 분석을 수행하여 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질과 MC38 마우스 결장직장암 세포주 및 인간 PD-L1 녹-인을 갖는 MC38 세포의 결합 활성을 평가하였다.
간단히, 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. 세포를 표준 절차에 따라 수확하고, 상청액을 버렸다. 세포를 웰 당 30 만개 세포로 염색 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 300g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 2% FBS를 포함하는 FACS 완충액에서 일련의 농도의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질 및 음성 대조군을 500ug/ml로부터 1:5로 적정하였다. 100ul를 각 웰에 첨가하고 세포를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200ul FACS 완충액으로 2회 세척하고, 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 각 세척 전후에 상청액을 버렸다. 이후 세포를 항-인간 IgG-Alexa 488로 재현탁시켰다. 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 FACS 분석을 위해 2회 세척하였다. FACS 분석을 FACS Canto II, BD Biosciences로 제조업체의 지시에 따라 수행하였다.
sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질(예를 들어, sPD-1 변이체 버전 1-Fc 융합 단백질 및 sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질)은 야생형 PD-1 그룹(즉, SEQ ID NO:4에 제시된 야생형 PD-1-Fc 융합 단백질)보다 MC38-PD-L1 녹-인 세포에 대한 더 높은 결합 친화성을 입증했지만(도 9a), sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질은 또한 모 MC38에 더 낮은 정도로 결합한다(도 9b).
D. 실시예 4: T 세포 활성화 검정
PBMC 분리: 개별 공여자의 혈액 샘플을 동일한 부피의 멸균 PBS로 희석하였고, 예를 들어, 25ml 멸균 PBS를 25ml 신선한 전혈에 첨가하고 부드럽게 진탕시켜 충분히 혼합하였다. 15ml Ficoll-Pague 배지를 새로운 50ml 원심분리 튜브로 옮겨 Ficoll과 혈액 부피 비가 3:4인지 확인한 다음, 희석된 혈액 샘플을 Ficoll 배지의 표면에 조심스럽게 첨가하였으며, 두 액체의 층이 명확하게 보일 수 있도록 가능한 부드럽게 첨가하여 섞이는 것을 피하였다. 튜브를 원심분리 중에 최대 가속 및 최소 감속 설정을 갖는 400xg, 30분, 20℃의 원심분리기로 부드럽게 이동시켰다. 단핵 세포의 층을 조심스럽게 흡수하여 다른 새로운 멸균 원심분리 튜브로 옮겼다. 수집된 PBMC에 멸균 PBS 완충액을 세척을 위해 3:1의 부피 비로 첨가하고 300xg, 10분, 20℃에서 원심분리하였다. 이후 세포를 검정을 위해 10%FBS + RPMI 1640으로 재현탁시켰다.
Hep3B 인간 PD-L1 녹-인 세포의 제조: 마이코플라스마가 없는 Hep3b-hPDL1-OS8 세포를 15cm 디쉬에 준비하고 사용 전에 컨플루언시(confluency)를 60-80%로 유지하였다. 세포를 TrypLETM Express Enzyme으로 트립신화한 후, 트립신을 중화하고, 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 50ml 원심분리 튜브에 수집하였다. 상청액을 버리고, 세포를 미토마이신, 10ug/ml(5-10ml 10%FBS + RPMI1640 배지 중)로 재현탁시켰다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 15-20ml PBS로 4회 세척한 후 세포계수기로 세포를 계수한 다음, 20℃에서 1000rpm, 5분으로 원심분리하였다. 세포를 검정을 위해 10% FBS + RPMI 1640으로 재현탁시켰다.
PBMC 자극: PBMC를 50,000개 세포/웰, 100 ul/웰로 첨가한 다음 일련의 5X sPD-1 변이체 버전 2(PD1 V2), 5X PD1 WT 또는 hIgG4 단백질 용액 50 ul/웰을 첨가한 후 50 ul/웰에 대해 5000개 세포/웰의 Hep3b-hPDL1 세포를 첨가하였다. 혼합된 용액을 37℃ 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 시험 전에 상청액을 수확하고 -20℃ 아래에서 동결시켰다. IFN-감마 농도를 ELISA 키트에 의해 시험하였다. IFN-γ의 정량화는 R&D에서 구입한 Quantifkine ELISA 키트에 의해 결정되었다. 절차는 인간 IFN-γ ELISA 키트, R&D, Cat#DY285의 검정 절차에 따라 수행되었다.
도 10은 sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질이 인간 PBMC로부터 분리된 T 세포를 활성화시킬 수 있음을 보여준다.
E. 실시예 5: MC38-hPD-L1 결장직장 종양 세포주를 사용한 생체내 종양 연구
모든 동물을 구입하여 AAALC 인증, 온도 제어 및 병원체가 없는 환경에 수용하였다. 종양 크기가 윤리적 한계에 도달하면 동물을 연구에서 제거하였다. C57/B6 마우스에 MC38-hPD-L1 종양 세포를 접종하고 5일 동안 관찰하여 종양 성장을 확인한 다음, 각 그룹에 10마리의 동물을 갖는 3개의 치료 그룹 각각에 할당하였다: 비히클 대조군, 항-PD-L1 항체 10 mg/kg(양성 대조군의 그룹), 및 sPD-1 변이체 2-Fc 융합 단백질 10mg/kg(PD1-ECD-Fc 10mg/kg의 그룹). 종양 접종 6일 후에 치료를 시작하고, 종양 크기가 2000 mm3를 초과하면 동물을 연구에서 제거하였다. 시간에 따른 종양 성장 및 생존을 실험 종말점으로 기록하였다.
sPD-1 변이체 2-Fc 융합 단백질은 항-PD-L1 항체의 그룹과 비교하여 sPD-1 변이체 2-Fc 융합 단백질의 그룹(즉, PD-1-ECD-Fc 그룹)에서 감소된 종양 부피, 증가된 종양 성장 억제, 증가된 생존율 및 감소된 체중에 의해 입증되는 바와 같이, 양성 대조군 그룹(즉, 항-PD-L1 항체)에 비해 우수한 항-종양 활성을 입증하였다.
F. 실시예 6: 렌티바이러스 형질도입된 Hep3B-OS8 세포 및 MC38 세포에서 PD-L2의 발현
Hep3B-OS8 세포 및 MC38 세포를 인간 PD-L2 발현을 갖는 렌티바이러스 플라스미드로 형질도입시켰다.
Hep3B-OS8 세포 및 MC38 세포의 단일 클론에서 PDL2의 발현을 FACS를 사용하여 분석하였다. 간단히, 세포를 표준 절차에 따라 수확하고, 상청액을 버렸다. 세포를 웰 당 30 만개의 세포로 염색 플레이트에 분배하고, 플레이트를 300g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 100ul/웰 토끼 항-hPD-L2(1 ug/시험) 항체를 적정된 FACS 완충액에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200 μl FACS 완충액으로 2회 세척하고, 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 각 세척 전후에 상청액을 버렸다. 세포를 이차 항체의 1:1000 희석액으로 100 μl/웰로 재현탁시켰다. 플레이트를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200 μl FACS 완충액으로 2회 세척하고, 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 각 세척 전후에 상청액을 버렸다. 세포를 100 μl PBS에 재현탁시켰다. 세포를 암실에 유지하고 FACS 분석을 위해 제출하였다. FACS 분석을 FACS Canto II, BD Biosciences로 제조업체의 지시에 따라 수행하였다.
도 13은 인간 PD-L2가 Hep3B 및 MC38 세포주에서 과발현되었음을 보여준다.
G. 실시예 7: 인간 PD-L2를 과발현하는 Hep3b 세포(Hep3B-hPDL2)에 대한 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 결합 활성
FACS 결합 분석을 수행하여 인간 PD-L2를 과발현하는 인간 간세포 암 세포주 Hep3b 세포(Hep3B-hPDL2)와 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질의 결합 활성을 평가하였다.
간단히, 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. 세포를 표준 절차에 따라 수확하고, 상청액을 버렸다. 세포를 웰 당 30 만개 세포로 염색 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 300g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 2% FBS를 함유하는 FACS 완충액에서 일련의 농도의 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질, 야생형 PD-1, PDL2 tab1 및 음성 대조군 인간 IgG4를 500 μg/ml로부터 1:5로 적정하였다. 100 μl를 각 웰에 첨가하고 세포를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200 μl FACS 완충액으로 2회 세척하고, 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 각 세척 전후에 상청액을 버렸다. 이후 세포를 항-인간 IgG-Alexa 488로 재현탁시켰다. 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 FACS 분석을 위해 2회 세척하였다. FACS 분석을 FACS Canto II, BD Biosciences로 제조업체의 지시에 따라 수행하였다.
도 14는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질(예를 들어, sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질)이 야생형 PD-1 그룹보다 Hep3B-hPDL2 세포에 대해 더 높은 결합 친화성을 나타내었음을 보여준다.
H. 실시예 8: PBMC 및 Hep3B-OS8-PDL2 4B9의 공동 배양액에서 T 세포 활성화 검정
PBMC 분리: 개별 공여자의 혈액 샘플을 동일한 부피의 멸균 PBS로 희석하였고, 예를 들어, 25ml 멸균 PBS를 25ml 신선한 전혈에 첨가하고 부드럽게 진탕시켜 충분히 혼합하였다. 15ml Ficoll-Pague 배지를 새로운 50ml 원심분리 튜브로 옮겨 Ficoll과 혈액 부피 비가 3:4인지 확인한 다음, 희석된 혈액 샘플을 Ficoll 배지의 표면에 조심스럽게 첨가하였으며, 두 액체의 층이 명확하게 보일 수 있도록 가능한 부드럽게 첨가하여 섞이는 것을 피하였다. 튜브를 원심분리 중에 최대 가속 및 최소 감속 설정을 갖는 400xg, 30분, 20℃의 원심분리기로 부드럽게 이동시켰다. 단핵 세포의 층을 조심스럽게 흡수하여 다른 새로운 멸균 원심분리 튜브로 옮겼다. 수집된 PBMC에 멸균 PBS 완충액을 세척을 위해 3:1의 부피 비로 첨가하고 300xg, 10분, 20℃에서 원심분리하였다. 이후 세포를 검정을 위해 10%FBS + RPMI 1640으로 재현탁시켰다.
Hep3B hPD-L2 세포의 제조: 마이코플라스마가 없는 Hep3b-hPDL2-OS8 세포를 15cm 디쉬에 준비하고 사용 전에 컨플루언시를 60-80%로 유지하였다. 세포를 TrypLETM Express Enzyme으로 트립신화한 후, 트립신을 중화하고, 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 50ml 원심분리 튜브에 수집하였다. 상청액을 버리고, 세포를 미토마이신, 10μg/ml(5-10ml 10%FBS + RPMI1640 배지 중)로 재현탁시켰다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 15-20ml PBS로 4회 세척한 후 세포계수기로 세포를 계수한 다음, 20℃에서 1000rpm, 5분으로 원심분리하였다. 세포를 검정을 위해 10% FBS + RPMI 1640으로 재현탁시켰다.
PBMC 자극: PBMC를 50,000개 세포/웰, 100 μl/웰로 첨가한 다음 일련의 5X sPD-1 변이체 버전 2(PD1 V2), 5X PD1 WT 또는 hIgG4 단백질 용액 50 μl/웰을 첨가한 후 50 μl/웰에 대해 5000개 세포/웰의 Hep3b-hPDL2 세포를 첨가하였다. 혼합된 용액을 37℃ 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 시험 전에 상청액을 수확하고 -20℃ 아래에서 동결시켰다. IFN-감마 농도를 ELISA 키트에 의해 시험하였다. IFN-γ의 정량화는 R&D에서 구입한 Quantifkine ELISA 키트에 의해 결정되었다. 절차는 인간 IFN-γ ELISA 키트, R&D, Cat#DY285의 검정 절차에 따라 수행되었다.
도 15는 sPD-1 변이체 버전 2-Fc 융합 단백질이 PBMC 및 Hep3B-OS8-PDL2 4B9의 공동 배양액을 사용한 T 세포 활성화 시험에서 T 세포를 활성화시킬 수 있음을 보여준다.
I. 실시예 9: MC38-hPDL2 결장직장 종양 세포주를 사용한 생체내 종양 연구
모든 동물을 구입하여 AAALC 인증, 온도 제어 및 병원체가 없는 환경에 수용하였다. 종양 크기가 윤리적 한계에 도달하면 동물을 연구에서 제거하였다. C57/B6 마우스에 MC38-hPD-L2 종양 세포를 접종하고 5일 동안 관찰하여 종양 성장을 확인한 다음, 각 그룹에 10마리의 동물을 갖는 3개의 치료 그룹 각각에 할당하였다: 비히클 대조군, 항-PD-1 항체 10 mg/kg(양성 대조군의 그룹), 및 sPD-1 변이체 2-Fc 융합 단백질 10mg/kg(PD1-ECD-Fc 10mg/kg의 그룹). 종양 접종 6일 후에 치료를 시작하고, 종양 크기가 2000 mm3를 초과하면 동물을 연구에서 제거하였다. 시간에 따른 종양 성장 및 생존을 실험 종말점으로 기록하였다.
도 16은 감소된 종양 부피에 의해 입증되는 바와 같이, sPD-1 변이체 2-Fc 융합 단백질이 양성 대조군 그룹(즉, 항-PD-1 항체, 펨브롤리주맙)과 비교하여 동등한 항-종양 활성을 나타내었음을 보여준다.
J. 실시예 10: 면역 체크포인트 억제제의 효능을 향상시키기 위한 PD-L1 및 PD-L2 중화
1. 요약
PD-1 및 PD-L1을 표적화하는 면역 체크포인트 억제제는 암 치료에 크게 기여하여, 가장 널리 사용되는 면역요법 중 하나가 되었다. 불행히도, 낮은 환자 반응률이 그 자체로 주요 임상 과제로 제시되었고, 그러한 단점을 해결하기 위해, 많은 연구 노력이 면역 체크포인트 요법을 받는 환자의 효능 및 반응률을 개선하는데 집중되어 왔다. 이 연구에서, 본 발명자들은 PD-L2가 난소암, 위암 및 식도암과 같은 암 유형에서 고도로 발현된다는 임상적 및 생물학적 증거를 모두 제시했으며, 이들 암 유형은 모두 PD-1 및 PD-L1 억제제 둘 모두에 대해 불량한 반응자이다. 본 발명자들은 그러한 효능의 결여가 부분적으로 종양에 존재하는 압도적인 수준의 PD-L2 때문이라는 가설을 세웠다. PD-L2가 PD-L1과 비교하여 PD-1에 대해 10배 더 높은 고유 결합 친화성을 갖는다는 이전의 발견과 일관되게, 높은 수준의 PD-L2는 PD-1 신호 전달 경로의 불충분한 차단을 초래한다. 이러한 임상적 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 이들의 야생형 상호작용과 비교할 때 각각 10000배 및 200배의 개선된 결합 친화성으로 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두에 결합하여 중화시키는 돌연변이체 가용성 PD-1 유인 분자를 조작하였다. 그러한 결합 친화성의 향상은 부분적으로 결합 계면의 내부 및 외부 둘 모두에서 보존된 아미노산 돌연변이에 의해 부여된다. 또한, 본 발명자들은 sPD-1 돌연변이체 분자가 T-세포 생존력에 영향을 미치지 않으면서 T-세포 매개된 사멸을 자극할 수 있으며, 후속적으로 PD-L2 및 PD-L1 둘 모두에 의해 유도되는 다수의 동계 암 모델에서 우수한 생체내 효능을 초래한다는 것을 입증하였다.
2. 도입
임상에서 전례없는 지속적인 반응을 보이는(Abdel-Rahman 2016, Immunotherapy 8(12): 1383-1391, 그 전체내용은 본원에 참조로 포함됨) PD-1 신호 전달 경로의 치료적 억제는 악성 질환을 치료하는데 성공적인 전략임이 입증되었다(Berger and Pu 2018, Gene 638: 20-25, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). PD-1 및 PD-L1에 대한 치료적 항체는 단일요법으로서 또는 현재의 표준 치료와 조합하여 다양한 암 유형의 치료를 위해 승인되었다(Abdel-Rahman 2016, Immunotherapy 8(12): 1383-1391, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 불행히도, PD-1/PD-L1 억제제에 대한 임상 반응은 악성 질환 자체의 이질적인 특성만큼 다양할 수 있으며, 이는 암 진행과 관련된 면역 조절 및 조절장애의 복잡성을 추가로 드러낸다(Ruiz de Galarreta, Bresnahan et al. 2019, Cancer Discov 9(8): 1124-1141, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). PD-1 신호 전달 경로의 활성화가 PD-L1 및 PD-L2의 결합 및 활성화를 필요로 한다는 것이 분명하게 입증되었다(Latchman, Wood et al. 2001, Nat Immunol 2(3): 261-268; Ishida, Iwai et al. 2002, Immunol Lett 84(1): 57-62, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). PD-L1은 PD-1에 대한 우세한 리간드이며 PD-1에 대한 치료적 반응에 대한 바이오마커로서 잘 연구되고 인식된다(Freeman, Long et al. 2000, J Exp Med 192(7): 1027-1034, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 그러나, 종양 면역 생물학에서 PD-L2의 역할은 명확하지 않다(Bardhan, Anagnostou et al. 2016, Front Immunol 7: 550, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨).
PD-1/PD-L1 억제제의 반응률을 높이기 위한 지속적인 노력은 이들 억제제를 세포독성 약물의 칵테일, 표적화 요법 및 방사선 치료와 조합하여 시험함으로써 임상에서 이루어졌으며, 이는 관리 가능한 독성 프로파일을 보존하면서 치료 효능을 개선하는 것을 목표로 한다(Sullivan, Hamid et al. 2019, Nat Med 25(6): 929-935, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 그러나 모든 노력에도 불구하고, 난소암, 식도암 및 위암과 같은 특정 암 유형이 CD8+ 세포독성 T 세포의 최소 침윤 및 제한된 T-세포 활성을 보여주는 차선의 임상 반응을 여전히 겪고 있다는 사실은 아직도 수수께끼이다(Meza-Perez and Randall 2017, Trends Immunol 38(7): 526-536; Sato, Olson et al. 2005, Proc Natl Acad Sci U S A 102(51): 18538-18543, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 흥미롭게도, 환자 종양의 면역조직화학 분석은 종양에서 PD-L1 및 PD-L2 발현 둘 모두에 관한 추가 정보를 밝혀내었다. PD-L1의 발현은 많은 악성종양에서 높게 유지된다. 크게 연구되지 않은 PD-1의 두 번째 리간드인 PD-L2도 PD-1/PD-L1 억제제에 대한 불량한 반응자인 것으로 알려진 이들 암에서 고도로 발현되는 것으로 보고되었다(Mak, Tong et al. 2016, Clin Cancer Res 22(3): 609-620, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 일반적인 인식은 αPD-1 항체의 치료가 PD-1의 PD-L1 및 PD-L2 매개된 활성화 둘 모두를 차단하기에 충분하다는 것이다(Garon, Rizvi et al. 2015, N Engl J Med 372(21): 2018-2028, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 그러나, 본 발명자들과 다른 사람들에 의해 수행된 결합 연구는 PD-1과 PD-L1에 비해 PD-1과 PD-L2 사이의 결합 친화성이 현저히 더 높고(Lazar-Molnar, Yan et al. 2008, Proc Natl Acad Sci U S A 105(30): 10483-10488, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨), PD-L2가 수용체 결합에 대해 PD-1 항체와 경쟁할 때 상당한 이점을 제공하는 것을 보여주었다.
이 연구에서, 본 발명자들은 PD-L2의 과발현이 난소암, 식도암 및 위암에서 임상적으로 관련된 관찰이고, 높은 PD-L1 발현 및 CD8+ 세포독성 T-세포의 배제와 상관 관계가 있음을 입증한다. 이 관찰은 PD-L1 및 PD-L2에 대한 결합 친화성이 향상된 가용성 PD-1 리간드 트랩을 개발하도록 촉발시켰다. 가용성 PD-1 돌연변이체는 PD-L1 및 PD-L2 사이의 야생형 결합과 비교할 때 PD-1 수용체에 대한 결합 친화성에서 각각 x10,000 및 x200배 개선을 보여주었다. 수용체-리간드 복합체의 구조적 모델링은 그러한 친화성 향상에 기여하는 결합 계면 및 비-결합 부위 둘 모두에서 독특한 돌연변이를 나타내었다. 결합 친화성의 이러한 향상은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 PD-1 수용체 활성의 개선된 억제로 번역되어, 다수의 암 유형에서 PD-L1 및 PD-1을 표적화하는 항체를 능가한다. 더욱 중요하게는, 유전적 및 약리학적 접근법 둘 모두를 통해, 본 발명자들은 PD-1 신호 전달에 대한 독립적인 기여자로서 PD-L2의 생물학적 요건을 확고히 하였고, 고 친화성 가용성 PD-1 돌연변이체의 사용이 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두를 발현하는 암을 표적화하기 위한 임상적으로 실행 가능한 전략임을 입증하였다.
3. 결과
PD-L2는 인간의 난소, 식도, 위 및 뇌 종양에서 풍부하게 발현된다.
PD-L1 매개된 PD-1 신호 전달이 면역-종양학 분야에서 광범위한 연구의 대상이 되었지만, 특히 항-PD-1/PD-L1 요법에 대한 불량한 반응자인 암에서 PD-L2의 상태에 대해서는 덜 알려져 있다(Derks, Nason et al. 2015, Cancer Immunol Res 3(10): 1123-1129; Lingohr, Dohmen et al. 2019, Epigenomics 11(6): 639-653; 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 현재의 연구에서, 본 발명자들은 종양 진행 동안, 및 특히 체크포인트 억제제에 대한 반응으로 차선의 항-종양 효과를 나타낸 암 유형에서 PD-L2의 임상적 관련성을 조사하고자 하였다. 본 발명자들은 난소암(n=156), 식도암(n=72), 위암(n=76) 및 아교모세포종(n=152)으로부터 인간 암 TMA를 선택하였다. 각 표본은 상피 세포의 마커로서 PD-L1(Latchman, Wood et al.), PD-L2(회색) 및 범(pan)-사이토케라틴(적색)으로 공동-염색되었다. 항-PD-L1 및 항-PD-L2 항체의 특이성은 2개의 항체 사이의 가능한 교차-반응성을 피하기 위해 인간 편도 조직에서 검증되었다(도 24e). PD-L1 및 PD-L2의 발현 수준은 염색 강도에 따라 스코어링되었고 종양 등급에 따라 추가로 계층화되었다. 난소암, 식도암 및 위암에서, PD-L1의 발현은 암성 조직에서 상승하지만 비-악성 표본에서 유의하게 낮았다(도 18a-18c). 흥미롭게도, PD-L2 발현 수준도 암에서 유의하게 증가하였고, 이의 발현 패턴은 아교모세포종(도 18d)을 제외한 난소암, 위암 및 식도암의 경우 PD-L1을 따랐다(도 18a-18c). 아교모세포종에서의 PD-L2 발현만이 등급에 관계 없이 종양에서 유의하게 상승하였다. 정상 대 상이한 등급의 아교모세포종 표본 사이에 PD-L1 발현의 변화는 검출되지 않았다(도 18d는 정량화가 우측에 표시됨). 비-악성 뇌 조직은 표본에서 매우 적은 세포를 가졌지만, 이들 세포는 PD-L1에 대한 강한 신호를 가졌으므로 정상 조직에서 PD-L1의 높은 점수를 가졌다. PD-L1과 PD-L2 사이의 피어슨 상관 관계를 또한 각각의 암 유형에 대해 계산하고 플롯팅하였다(도 24a-24d). 면역염색 결과와 일관되게, 본 발명자들은 4개 모두의 암 유형에 걸쳐 PD-L1과 PD-L2 사이에 양의 상관 관계를 발견하였고, PD-L2가 면역 체크포인트 요법에 불량하게 반응하는 종양에 풍부하게 존재한다는 본 발명자들의 가설을 확인하였다(도 24a-24d). 기능적으로, 본 발명자들은 PD-L1 및 PD-L2 발현의 존재가 침윤성 CD8+ T 세포의 변화를 초래하는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 동일한 TMA로부터의 난소암(도 18e) 및 식도암(도 18f) 표본을 염색하고 종양 등급에 따라 계층화된 CD8+ 세포를 다시 정량화하였다. 난소암에서, 혈관을 갖는 비-악성 난소 조직이 혈류에 국한된 CD8+ T 세포의 대부분을 보여주는 양성 대조군으로서 포함되었다(도 18e 상부 패널). 침윤 CD8+ T 세포에 대해 양성 및 음성인 난소암의 대표적인 사진은 도 18e에 도시되어 있고 종양 등급에 따라 다시 정량화되었다(도 25a). 식도암 TMA에서, 대부분의 식도암 샘플은 더 높은 CD8 세포를 나타내는 소수를 제외하고는 낮은 CD8+ T 세포 염색을 가졌다(도 18f 및 도 25b). 염증성 식도염 조직이 양성 대조군으로서 TMA에 포함되었다. 종양에서 CD8+ T 세포의 부족은 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두의 존재가 T-세포 배제에 기여하는 요인일 수 있음을 시사한다. 요약하면, 본 발명자들의 결과는 PD-1/PD-L1 요법에 대해 알려진 차선의 임상 반응을 갖는 다수의 암 유형에서 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두의 높은 발현을 입증하였으며, 이러한 발현은 또한 암 조직에서 CD8+ 세포독성 T 세포의 면역 배제에 역할을 할 수 있다.
PD-L1 및 PD-L2에 대한 우수한 결합 친화성을 갖는 sPD-1 돌연변이체 조작
생물학적 시스템에서 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두를 길항시키는 정교한 방법은 PD-1 수용체의 가용성 성분을 이용하는 것이다(도 19a). 불행히도, 야생형 가용성 PD-1 및 이의 리간드 둘 모두의 고유 친화성은 마이크로몰 범위로 낮기 때문에, 야생형 sPD-1을 PD-1/PD-L1/PD-L2 신호 전달 축을 차단하는데 있어 비효과적인 길항제로 만든다(Lazar-Molnar, Yan et al. 2008, Proc Natl Acad Sci U S A 105(30): 10483-10488, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). PD-L1 및 PD-L2 둘 모두를 중화시키는 것에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 길항제를 개발하려는 시도에서, 본 발명자들은 PD-1 분자(가용성 PD-1)의 세포외 성분을 통해 무작위 돌연변이를 도입함으로써 돌연변이체의 라이브러리를 생성하였다. 본 발명자가 이전에 발표한 유사한 전략을 채택하여(Kariolis, et al. 2014, Nat Chem Biol 10(11): 977-983, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨) 돌연변이체 라이브러리가 효모 세포 표면에 융합 단백질로서 디스플레이되었고 PD-L1에 대한 결합이 강화된 클론이 더욱 풍부해졌다(도 19b 및 도 26). 6 라운드의 분류 후, 추가 특성화 및 분석을 위해 우수한 결합 친화성을 갖는 클론을 시퀀싱하였다(도 37). 8개의 잔기가 위치 넘버링을 신호 영역에서 시작할 때 Ser62, Ser87, Pro89, Asn116, Gly124, Ser127, Ala132 및 Ala140에 상응하는 sPD-1 도메인에서 돌연변이되었다(표 4). N-글리코실화 부위의 돌연변이를 피하기 위해 Asn116 상의 돌연변이를 제거함으로써 sPD-1 돌연변이체의 업데이트된 버전(버전 2)을 생성하였다. 둘 모두의 돌연변이체 버전은 개선된 안정성 및 명백한 친화성을 위해 인간 IgG4의 Fc 도메인에 융합되었다. 인간 PD-L1 및 PD-L2에 대한 돌연변이체 V1 및 V2 IgG4 둘 모두의 명백한 친화성은 BIAcore® 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여 정량적으로 측정되었고 야생형 sPD-1 IgG4와 비교되었다. 인간 PD-L1 및 PD-L2에 대한 결합 친화성의 현저한 개선이 야생형 sPD-1과 비교할 때 돌연변이체 V1 및 V2 둘 모두에서 검출되었으며, PD-L1 및 PD-L2에 대한 결합 친화성에서 각각 약 10,000배 및 200배 개선을 나타낸다(도 8). 둘 모두의 경우에 이러한 친화성의 개선은 주로 더 느린 해리 속도에 의해 유도되었다(도 19c 및 19d). 그 이후로 본 발명자들은 sPD-1 돌연변이체 V1과 sPD-1 돌연변이체 V2 사이에 유의한 차이를 보지 못했다. 모든 세포 기반 및 생체내 연구는 sPD-1 돌연변이체 V2를 사용하여 수행되었다. 종합적으로, 효모-표면 디스플레이 기반 기술을 사용하여, 본 발명자들은 PD-L1 및 PD-L2에 대해 높은 결합 친화성을 나타내는 sPD-1 돌연변이체 클론을 동정하였다. 이러한 클론은 부위-특이적 돌연변이의 결과로서 구조적 및 생물학적 향상 둘 모두를 평가하기 위해 추가로 특성화된다.
고 친화성 결합에 대한 구조적 근거를 식별하기 위한 컴퓨터 기반 모델링
PD-1/PD-L1 및 PD-L2 사이의 그러한 친화성 증가를 초래하는 구조적 확인의 변화를 결정하기 위해, 본 발명자들은 공동-복합체의 인간 PD-L1 및 PD-L2를 sPD-1 돌연변이체와 비교하는 컴퓨터 모델링을 수행하였다. 야생형 인간 PD-1/PD-L1 복합체 구조는 PDB(4ZQK 및 5IUS)에서 이용 가능하다. 그러나, PD-1의 루프 영역에 누락 및 돌연변이된 잔기가 있기 때문에, 본 발명자들은 먼저 누락된 루프를 고정하고 잔기를 4ZQK에 기초하여 야생형 PD-1으로 다시 돌연변이시켰다. 4ZQK 및 5IUS의 서열 정렬은 도 2에 도시되어 있다. sPD-1 돌연변이체 구조는 Schrodinger Suite의 잔기 스캐닝 모듈을 사용하여 모델링되었다. PD-1 및 PD-L1의 결정 구조는 각각 청색 및 녹색으로 표시되며 8개의 돌연변이(위치 넘버링이 신호 영역에서 시작할 때 Ser62, Ser87, Pro89, Asn116, Gly124, Ser127, Ala132 및 Ala140)는 주황색 막대로 표시된다(도 3). 이전에 발표된 문헌의 지식과 본 발명자들의 구조적 모델링 데이터를 결합하여, 본 발명자들은 결합 계면 내에 있는 돌연변이로서 잔기 G124S, S127V 및 A132I를 확인하였고, S62G, S87G, P89L 및 A140V는 결합 계면의 외부에 있다. G124S 및 A132I는 각각 PD-L1의 Tyr 123및 Gln 66과 하나의 추가 수소 결합을 만든다(도 20a 좌측 및 우측 패널). 돌연변이 A132I는 또한 PD-L1과의 표면 상보성을 0.72에서 0.85로 증가시켰다(도 20b, 도 29). 이들 돌연변이가 PD-1과 PD-L1 사이의 전체 결합에 어떻게 영향을 미치는지 추가로 조사하기 위해, 개별 돌연변이 전후의 결합 친화성 및 복합체 안정성의 변화를 표 4에 나열된 결과로 계산하였다. 결합 친화성 및 복합체 안정성 변화의 계산은 또한 결합 계면의 내부 및 외부에서 그룹화된 돌연변이에 대해 수행되었다(표 5). 더 높은 음의 값은 증가된 결합 친화성 및 안정성을 나타낸다. 전반적으로, 계면 돌연변이는 예상대로 결합 친화성 및 단백질 안정성 모두에 기여했으며, 결합 계면 외부의 돌연변이는 증가된 안정성을 유도한다. 흥미롭게도, 결합 계면 외부의 돌연변이 A140V는 복합체의 안정성을 25.89 kcal/mol만큼 상당히 개선시킨다. 이러한 관찰은 공동-복합체의 전반적인 안정성을 개선하기 위해 결합 계면 외부의 돌연변이를 확인하기 위한 편향되지 않은 스크리닝 접근법의 중요성을 더욱 강화시켰다.
인간 PD-L2 단백질 구조가 PDB에서 사용할 수 없기 때문에, 인간 PD-L2의 모델을 이용 가능한 마우스 PD-L2 구조를 주형으로 사용하여 구성하였다(도 5a). 인간 PD-L2와 마우스 PD-L2 사이의 서열 동일성은 약 72%이다(도 6, 도 5a). 제안된 인간 PD-1/PD-L2 모델 및 마우스 PD-1/PD-L2 결정 구조(PDBID: 3BP5)의 오버레이는 도 6 및 도 5b에 도시되어 있다. 제안된 인간 PD-L2 공동-복합체 결정 구조를 갖는 돌연변이체 sPD-1은 도 7에 도시되어 있다. 제안된 야생형 인간 PD-1/PD-L2와 비교할 때, PD-1/PD-L1 결합과 유사하게, 돌연변이 A132I는 PD-L2와 동일한 추가 수소 결합을 다시 유지하여, 표면 상보성의 증가를 초래하였다(도 20c 및 도 30). 결합 친화성 변화 및 단백질 안정성의 계산은 또한 결합 계면의 내부 및 외부에서 단일 돌연변이 및 그룹화된 돌연변이에 대해 수행되었다(표 8 및 표 9). 구조적 시뮬레이션 분석에 기초하여, 본 발명자들은 결합 계면의 내부 및 외부 둘 모두의 돌연변이가 전체적인 결합 친화성 및 안정성의 개선에 기여함을 보여주었다.
sPD-1 돌연변이체는 PD-L1 및 PD-L2 매개된 PD-1 활성화를 차단하고 T-세포 활성화를 유도한다
sPD-1 돌연변이체가 PD-L1/PD-L2와 PD-1 사이의 상호작용을 효과적으로 방해할 수 있음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 먼저 녹-인 인간 PD-L1을 갖는 MC38 세포(ChemPartner, Shanghai에 의해 제공됨)를 사용하여 PD-L1에 대한 sPD-1 돌연변이체의 결합 활성을 평가하였다. sPD-1 돌연변이체의 둘 모두의 버전, 야생형 sPD-1 및 hIgG4 대조군을 FACS 기반 결합 분석을 사용하여 시험하였다. 야생형 sPD-1 및 hIgG4 대조군과 비교하여 결합 신호의 현저한 개선이 sPD-1 돌연변이체의 둘 모두의 버전에서 관찰되었으며, 여기서 형광 신호는 야생형 sPD-1에 대해 최대 μM 범위까지 검출될 수 없다(도 9a). 후속 생체내 시험을 수행하기 위해 마우스 PD-L1에 대한 sPD-1의 결합을 검증하기 위해, 본 발명자들은 또한 마우스 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 야생형 모 MC38에 대한 sPD-1 돌연변이체 결합을 분석하였다. 결합 신호의 증가는 또한 야생형 sPD-1과 비교하여 버전 1 및 2 둘 모두에서 전체적으로 더 낮은 강도로 검출되었다(도 9b). 결합 분석은 또한 유사한 결과로 간세포 암종 세포주 Hep3B-OS8-hPD-L1(ChemPartner, Shanghai)에서 반복되었다(도 31). sPD-1 돌연변이체가 PD-L1과 PD-1 사이의 수용체 매개된 상호작용을 차단할 수 있는지 여부를 시험한다. 본 발명자들은 sPD-1 돌연변이체, 야생형 sPD-1 및 hIgG4 대조군을 사용하여 수용체 결합 검정(RBA)을 수행하였다. 둘 모두의 sPD-1 돌연변이체는 야생형 sPD-1 및 hIgG4와 비교할 때 PD-1에 대한 PD-L1 매개된 수용체 결합의 우수한 억제를 나타내었다(도 21a). sPD-1 돌연변이체가 PD-L2에 결합하여 PD-L2 매개된 PD-1 활성화를 차단할 수 있음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 MC38 및 Hep3B 세포 둘 모두에서 인간 PD-L2를 과발현시켰다(도 32 및 33). 결합 분석을 위해, 본 발명자들은 야생형 sPD-1, 양성 대조군으로서 αPD-L2 항체 및 음성 대조군으로서 hIgG4와 함께 sPD-1 돌연변이체 V2를 시험하였다. sPD-1 돌연변이체는 MC38-PD-L2에 대한 더 나은 결합을 보였고, 야생형 sPD-1 및 αPD-L2 항체는 더 적은 효능으로 MC38-PD-L2에 결합한다(도 14). 유사하게, sPD-1 돌연변이체는 또한 수용체 결합 검정에서 PD-1의 PD-L2 매개된 활성화를 차단하는 향상된 능력을 나타내었다(도 21b). sPD-1 돌연변이체가 PD-L1 또는 PD-L2 매개된 신호 전달을 차단함으로써 인간 세포독성 T-세포를 활성화할 수 있는지 시험하기 위해, 인간 PBMC를 건강한 공여자로부터 수집하고 Hep3B-OS8-hPDL1 및 Hep3B-OS8-hPDL2 세포와 함께 인큐베이션하였다. sPD-1 돌연변이체, 야생형 PD-1 및 IgG4를 첨가하고 세포독성 T 세포 활성을 인터페론-γ 수준에 의해 측정하였다. sPD-1 돌연변이체는 야생형 sPD-1 및 IgG4 둘 모두와 비교할 때 각각 PD-L1 및 PD-L2의 존재하에 T-세포를 용량 의존적 방식으로 활성화시킬 수 있는데(도 10 및 15), 이는 sPD-1 돌연변이체가 PD-L1/PD-L2와 PD-1 사이의 상호작용을 차단함으로써 T-세포 활성을 기능적으로 자극할 수 있다는 주장을 뒷받침한다. T-세포 상의 αPD-1 항체 및 PD-1 수용체를 사용한 직접 결합을 통한 T-세포 활성의 연장된 자극은 시간이 지남에 따라 잠재적으로 T-세포 기능성 및 생존력에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 본 발명자들의 SPD-1 돌연변이체는 PD-L1 및 PD-L2를 발현하는 암 세포만을 표적화하도록 설계되었고, 이는 T-세포 수명 및 기능성을 보존하는 것을 목표로 한다. 이 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 먼저 고 순도 및 저 내독소를 갖는 인간 IgG4 Fc에 모두 융합된 sPD-1 돌연변이체(V1 및 V2) 및 야생형 sPD-1 둘 모두를 제조하였다(도 28). 이후 활성화된 인간 T-세포(CD3/CD28 칵테일로 자극을 통해)를 PD-L1의 존재 또는 부재하에 12일 동안 αPD-1 항체 또는 sPD-1 돌연변이체로 처리하였다. αPD-1을 사용한 연속 처리는 시간에 따라 T-세포 증식을 늦추는 반면, sPD-1 돌연변이체 처리는 T-세포 성장에 영향을 미치지 않았는데, 이는 CD3/CD28 자극된 T-세포와 유사한 성장 속도를 나타낸다. 예상대로, 천연 T 세포는 CD3/CD28 자극 없이 증식하지 않았다(도 21c). 이러한 관찰은 sPD-1 돌연변이체가 PD-1/PD-L1 및 PD-L2 신호 전달 캐스케이드에 결합하여 이를 차단할 수 있고 T-세포 생존력 및 기능성을 보존하면서 T-세포 활성을 자극할 수 있다는 개념을 강화시켰다.
sPD-1 돌연변이체는 동계 마우스 암 모델에서 우수한 항-종양 효능을 보여준다
sPD-1 돌연변이체의 치료 효능을 여러 동계 마우스 종양 모델에서 평가하였다. N-글리코실화 부위(Asn116)에 돌연변이가 없는 sPD-1 돌연변이체를 모든 생체내 연구에 사용하였다. 생체내에서 sPD-1 돌연변이체의 투여 일정 및 약동학을 결정하기 위해, 분자를 형광 염료로 표지하고 10 mg/kg의 단일 용량을 마우스에 주입하고 처리 후 30분, 8시간, 24시간 및 72시간에 이미지화하였다(도 22a). 추가로, sPD-1 돌연변이체 분자의 인간 IgG4 부분을 검출하는 ELISA가 또한 동일한 투여량으로 처리된 동물로부터 시간에 따라 취해진 혈청에 대해 수행되었다(도 22b). 형광 이미지 및 ELISA 분석 둘 모두는 sPD-1 돌연변이체 분자의 반감기가 투여 후 약 24시간이라는 유사한 결론에 도달했으며, 48시간마다 10 mg/kg의 생체내 투여에 대한 근거를 제공한다. MC38-hPDL1 결장직장암으로 피하 접종된 마우스를 비히클 대조군, sPD-1 돌연변이체 또는 아테졸리주맙으로 처리하였다. sPD-1 돌연변이체 및 아테졸리주맙으로 처리된 종양 둘 모두에서 종양 성장의 현저한 감소가 관찰되었다(도 11a). 아테졸리주맙 처리와 비교하여, sPD-1 돌연변이체로 처리된 종양은 체중 변화에 의해 정의되는 심각한 독성 없이 종양 성장을 억제하고 생존을 연장하는데 있어 우수한 효능을 보였고(도 11c, 35, 11b), 추가로 최적의 항종양 활성을 위해 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두를 표적화하기 위한 근거를 제공한다(도 11b). PD-L2 매개된 종양 성장을 길항시키는 sPD-1 돌연변이체에 대한 능력은 인간 PD-L2를 과발현하는 MC38 종양으로 접종된 생체내 모델에서 입증되었다(도 22c). sPD-1 돌연변이체 또는 αPD-1 항체 펨브롤리주맙으로 처리된 종양 보유 마우스에서 종양 성장의 상당한 지연이 관찰되었다. 통계적으로 유의하지는 않지만, 펨브롤리주맙으로 처리된 그룹과 비교하여 sPD-1 돌연변이체로 처리된 그룹에서 종양 성장이 더 잘 억제되는 경향이 있었고 이는 추가 조사가 필요할 수 있다(도 22c). sPD-1 돌연변이체의 항종양 효능이 또한 마우스 B16/OVA 흑색종 모델 및 ID8 난소암 모델에서 시험되었다. sPD-1 돌연변이체로 처리된 흑색종 종양은 비히클 처리된 그룹과 비교할 때 종양 성장을 유지하지 못한다(도 22d). 임상적으로, 난소암 환자는 PD-1 억제에 불량하게 반응하는 것으로 알려져 있다. 이 연구에서 본 발명자들은 동계 난소암 모델에서 sPD-1 돌연변이체의 효능을 시험하고자 하였다. 동소적으로 접종된 ID8 난소 종양 세포를 갖는 동물을 비히클 대조군, sPD-1 돌연변이체 또는 마우스 αPD-1 항체로 처리하였고 동물은 복수의 발생시 종결되었다. 카플란 마이어 생존 분석은 αPD-1 항체 처리된 마우스 및 sPD-1 돌연변이체 처리된 그룹 둘 모두에서 전체 생존의 개선을 보여주었다. 그러나, sPD-1 돌연변이체 그룹으로 처리된 동물에서 가장 중요한 생존 이점이 나타났는데, 이는 난소암을 표적화한 다음 PD-1 수용체를 차단하는 sPD-1 돌연변이체가 더 효과적임을 시사한다(도 22e). αPD-1 항체 또는 sPD-1 돌연변이체로 처리된 B16/OVA(도 22f) 및 MC38(도 22g 및 22h) 종양을 갖는 마우스에서 종양 침윤성 T 세포(TIL)를 분석하였다. 둘 모두의 억제제로부터의 치료는 CD4+, CD8+ 세포독성 T-세포의 침윤을 다시 증가시켰으며, sPD-1 돌연변이체 치료 그룹에서 가장 중요한 변화가 관찰되었다. 다른 종양-관련 면역 세포도 프로파일링되었지만, 처리 그룹 사이에 유의한 차이는 검출되지 않았다(도 36). 종합적으로, 본 발명자들은 다중 동계 마우스 종양 모델에서 시험된 sPD-1 돌연변이체의 우수한 항종양 효능을 입증하였고, 이는 TIL의 더 나은 침윤에 부분적으로 기인하며, 상기 돌연변이체는 새로운 형태의 체크포인트 억제제로서 αPD-L1 및 αPD-1 항체 둘 모두를 대체할 가능성을 갖는다.
sPD-1 돌연변이체는 인간 암의 PD-L2 유도된 동물 모델에서 효과적이다(도 23)
PD-L2가 PD-1의 기능적으로 중요한 리간드이고 덧붙여 PD-L2가 특히 PD-L1 억제에 대해 불량한 반응자인 암 유형에서 PD-1 매개된 종양 성장을 촉진할 수 있음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 CRISPR-CAS9 기술을 사용하여 ID8 난소 종양 세포에서 PD-L1을 유전적으로 절제하고 종양 세포를 PD-L1 녹아웃 마우스에 접종하여, 종양 및 숙주 둘 모두에서 PD-L1 발현을 제거하였다(도 23a 및 37a). 흥미롭게도, PD-L1의 완전한 손실은 정상 C57/B6 마우스에서 성장한 야생형 ID8 종양과 비교하여 더 느린 종양 성장 속도 및 더 작은 종양 형성을 초래하였다. 그럼에도 불구하고, 상승된 PD-L2 발현으로 인해 가능한 더 많은 수의 ID8 세포를 마우스에 접종할 때 만족스러운 종양 성장이 발생하였다(도 2). sPD-1 돌연변이체로 처리된 종양은 성장하지 못하고 일부 처리된 동물에서 유의한 종양 퇴행을 나타내었는데, 이는 αPD-L1 항체로 처리된 예상 종양이 크게 반응하지 않는 상태로 남아 있기 때문이다(도 23b 및 23c). ID8 PD-L1 CRISPR 세포가 동소적으로 i.p. 접종된 별도의 연구에서, αPD-L1 처리된 그룹의 8마리 마우스 중 7마리와 비교하여, sPD-1 돌연변이체 처리된 그룹의 8마리 마우스 중 3마리만이 복수를 발생시켰다. PD-L2에 의해서만 유도된 난소암을 갖는 마우스의 생존 결과가 현저하게 향상되었다(도 23d). 마지막으로, ID8 종양이 PD-L2 및 CD8 발현 둘 모두에 대해 염색되었을 때, 예상한 바와 같이, 치료 그룹에 관계 없이 모든 종양은 양성 PD-L2 발현을 보였지만, sPD-1 돌연변이체로 처리된 종양만이 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두의 손실로 인해 종양으로의 CD8+ T 세포의 침윤을 보였다(도 23e).
이 연구에서, 본 발명자들은 면역 체크포인트 억제제에 대한 불량한 반응자로 간주되는 암에서 PD-L2의 임상적 관련성을 입증하고, PD-L1 및 PD-L2 둘 모두를 초-고 친화성으로 우선적으로 표적화하는 치료 전략을 제시하였다. sPD-1 돌연변이체의 구조적 및 생물학적 분석은 결합 친화성의 개선이 이의 리간드 둘 모두를 차단함으로써 PD-1 경로의 우수한 억제로 이어진다는 본 발명자들의 가설을 강력하게 뒷받침하였다. 향상된 항-종양 효과를 입증하는 생체내 데이터와 함께, sPD-1 돌연변이체는 높은 PD-L2 발현의 결과로서 PD-1/PD-L1 억제제에 대한 만족스러운 반응이 결여된 암 유형을 표적화하기 위한 실행 가능한 임상 접근법으로서 그 자체를 제시한다.
4. 논의
PD-1 신호 전달 경로의 억제제와 같은 면역요법은 암 치료 환경을 혁신하고 치료에 대한 지속적인 반응을 누린 암 환자의 생존 결과를 획기적으로 개선시켰다(Topalian, Hodi et al. 2012, N Engl J Med 366(26): 2443-2454, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 그러나, 면역요법은 암과의 전쟁에서 진정 "돌파구"로 명명될 가치가 있지만, 치료를 받는 모든 환자에서 적절한 면역 반응을 촉진하는 "널리-적용되는" 확실한 접근법은 없다. PD-1/PD-L1 억제제에 대한 반응은 악성 질환의 면역원성 특성에 따라 동일한 치료 코호트 내의 개별 환자뿐만 아니라 암 유형에 따라 다르다(Pitt, Vetizou et al. 2016, Immunity 44(6): 1255-1269, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 체크포인트 억제제로 관찰된 이질성은 1) 면역원성이 더 높기 때문에 PD-1 억제제에 더 나은 반응을 보이는 미세불안정성(MSI-H)을 유발하는 특정 암 세포 내의 유전적 돌연변이(Diaz and Le 2015, N Engl J Med 373(20): 1979, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 2) 면역 감시로부터 암 세포를 보호하여 세포독성 T-세포 동원 및 활성화를 방지하는 PD-L1 및 PD-L2와 같은 종양 미세환경 내에서 암 및 암-관련 간질 세포 둘 모두에 의해 분비되는 인자(Tumeh, Harview et al. 2014, Nature 515(7528): 568-571, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨)를 포함하는 여러 인자에 기인할 수 있다. 종합적으로, 표적 암 세포에 대한 숙주 면역 반응을 촉진할 수 있는 전략은 면역 체크포인트 요법의 성공에 필수적이다.
이 연구에서 본 발명자들은 PD-1 체크포인트 요법에 대한 임상적으로 불량한 반응자인 암 유형에서 PD-L1과 PD-L2의 발현 수준 및 상관 관계 둘 모두를 이해하는데 초점을 맞추고 있다(Imai, Hasegawa et al. 2018, Oncol Lett 15(5): 6457-6468, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). PD-1의 더 잘 알려진 리간드인 PD-L1과 대조적으로, 암에서 PD-L2의 역할은 여전히 규정하기 힘들다(Yearley, Gibson et al. 2017, Clin Cancer Res 23(12): 3158-3167, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 흥미롭게도, PD-L1이 암 세포에 의해 상향조절되는 우세한 PD-1 리간드라는 일반적인 믿음과 대조적으로, 본 발명자들은 조사한 모든 환자 샘플에서 PD-L2 발현의 유의한 상승을 관찰했으며, 이의 발현 수준은 PD-L1 발현과 높은 상관 관계가 있다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 또한 암 및 비-암성 조직 둘 모두에서 PD-L1 발현을 관찰한 반면, 상승된 PD-L2 발현은 암 조직에 제한되는 것으로 보이는데, 이는 PD-L2 발현이 악성 질환 동안 유도될 수 있음을 시사한다. 이러한 관찰에 기초하여, 본 발명자들은 PD-1 억제제에 불량하게 반응하는 암에서 PD-L2 발현이 고도로 발현되며 PD-1 신호 전달 경로를 최적으로 길항시키기 위해서는 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두의 적절한 억제가 필요하다고 생각한다.
PD-1과 PD-L1/L2 사이의 수용체 리간드 상호작용을 방해하더라도 PD-1 신호 전달 경로의 최적 억제를 달성하는 것이 가능하다. PD-1 항체를 사용하여 T-세포에서 PD-1 수용체를 차단하는 것은 환자의 서브세트에 대해 지속적인 임상 반응을 가져왔지만, 본 발명자들의 환자 데이터는 PD-1/PD-L1 억제에 대한 반응률이 낮은 암에서 높은 수준의 PD-L2 발현을 보여주었는데, 이는 PD-L2의 존재가 잠재적으로 PD-1 억제의 노력을 약화시킬 수 있음을 시사한다. 실제로, 본 발명자들의 데이터는 PD-L1과 PD-1 사이의 결합 친화성보다 PD-L2와 PD-1 사이의 고유 결합 친화성의 10배 증가를 보여주었다. 대부분의 αPD-1 항체는 리간드의 존재하에 PD-1에 결합하는 능력을 향상시키는 친화성 성숙을 겪지만, 암 세포에 의해 발현되는 높은 수준의 PD-L2는 PD-1 결합에 대해 경쟁하는 αPD-1 항체의 능력을 현저하게 방해할 수 있다. T-세포에서 PD-1 수용체를 차단하는 대신, 본 발명자들은 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두에 대한 결합 친화성이 상당히 향상된 sPD-1 돌연변이체를 생성하였다. 방향적 진화 접근법에 의한 효모 표면 디스플레이 플랫폼(Kariolis, et al. 2014, Nat Chem Biol 10(11): 977-983, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨)을 이용하여, PD-L1 및 PD-L2 둘 모두에 대한 결합 친화성에서 상당한 향상을 나타내는 돌연변이체 클론을 선택하고 그러한 고 친화성 결합을 부여하는 구조적 기초를 컴퓨터 구조 모델링을 통해 분석하였다. 야생형 및 돌연변이된 sPD-1과 PD-L1 사이의 단백질 상호작용의 비교는 결합 친화성의 변화가 Ala 132에서 추가 수소 결합을 얻고 Ser127 및 Ala140에서 돌연변이의 결과로서 공동-복합체의 안정성이 개선된 결과였음을 밝혀내었고 이 때 위치 넘버링은 신호 영역에서 시작한다. 야생형 및 돌연변이된 PD1/PD-L2 복합체 사이의 단백질 상호작용을 비교할 때 유사한 발견이 관찰되었으며, 이는 다시 결합 계면에서 발생하는 돌연변이가 수용체-리간드 결합 친화성을 개선할 수 있는 반면, 결합 계면의 외부에 존재하는 돌연변이는 전체 구조의 안정성을 촉진하는데 똑같이 중요할 수 있다는 개념을 강화시킨다. 흥미롭게도, 고 친화성 결합 sPD-1 클론을 생성한 두 추가 연구가 보고되었다(Maute, Gordon et al. 2015, Proc Natl Acad Sci U S A 112(47): E6506-6514; Li, Liang et al. 2018, Cancer Sci 109(8): 2435-2445, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 두 연구 모두는 본 발명자들의 현재 연구와 겹치지 않는 그들의 강화된 결합 친화성에 기여하는 독특한 돌연변이 부위를 보고하였고, 이는 다시 요망되는 생물학적 특성을 갖는 친화성 향상된 치료제를 생성하는데 비-편향적 접근이 필수적임을 시사한다.
향상된 친화성의 개념은, 시험관내 FACS 결합 분석 및 RBA 검정이 sPD-1 돌연변이체가 결합 친화성 및 PD-1과 PD-L1/L2 사이의 상호작용을 차단하는 능력을 향상시켰음을 명백히 입증했을 때 우수한 생물학적 활성이 강화된 것으로 번역된다. 기능적으로, sPD-1 돌연변이체는 또한 면역 체크포인트 억제의 특징인 T-세포 활성을 증가시켰다. 모든 시나리오에서, PD-L1 또는 덧붙여 PD-L2 둘 모두가 PD-1 경로를 활성화시키기에 충분하고 sPD-1 돌연변이체의 첨가가 둘 모두의 리간드에 의해 매개되는 신호 전달을 효과적으로 방해한다는 것이 분명하였다. 본 발명자들의 연구에서, 본 발명자들은 αPD-1 항체를 사용한 연속 처리 후 T-세포의 감소된 생존력을 관찰한 반면, sPD-1 처리로 치료된 T-세포는 세포 성장에 영향을 미치지 않았다. αPD-1 처리 후 T-세포 생존력의 감소가 T 세포 고갈의 결과인지 확인하는 것은 어렵다. αPD-1 항체가 T-세포에 직접 결합하여 이를 자극하는 것으로 알려져 있는 반면, sPD-1 돌연변이체는 암 세포에서 PD-L1/L2만을 표적화하는 것을 감안할 때, T-세포와의 직접적인 상호작용을 피하는 것이 T-세포 생존력 및 기능성을 보존하는데 유리할 수 있다.
현재 연구는 두 가지 질문을 다루기 위해 αPD-L1 또는 αPD-1 항체 둘 모두에 대한 sPD-1 돌연변이체의 항-종양 활성을 평가하였다. 1) sPD-1 돌연변이체가 PD-L1 및 PD-L2를 차단하는 향상된 능력으로 인해 αPD-L1 및 αPD-1 항체 둘 모두를 능가할 수 있는가? 2) sPD-1 돌연변이체가 PD-L2에 의해서만 유도된 종양 모델에서 종양 성장에 영향을 미칠 수 있는가? 실제로, sPD-1 돌연변이체는 다중 동계 마우스 종양 모델에서 αPD-L1 및 αPD-1 항체 둘 모두를 능가하여, 향상된 수용체-리간드 결합 친화성이 PD-1 억제의 치료 결과를 개선시킨다는 주장을 확인시켰다. 더 중요한 것은, 종양 성장에서 PD-L2의 기여가 여전히 정의되지 않았기 때문에, 본 발명자들은 PD-L1 CRISPR 종양으로 접종된 PD-L1 녹아웃 마우스를 사용하여 PD-L2의 기능적 관련성을 평가함으로써, PD-L2가 덧붙여 PD-L1의 부재하에 종양 성장을 촉진할 수 있으며 αPD-L1 항체가 아닌 sPD-1 돌연변이체를 사용하여 성공적으로 표적화될 수 있음을 입증하였다. 그러나, PD-L1이 결여된 종양 모델에서 더 높은 종양 세포 수 및 지연된 종양 성장 둘 모두가 관찰되었지만, 결국 PD-L2의 존재는 sPD-1 돌연변이체를 사용하여 효과적으로 표적화될 수 있는 종양 성장을 유지할 수 있다는 점에 주목할 가치가 있다.
요약하면, 이 연구는 PD-L2를 여러 암 유형에서 PD-1 억제제에 대한 불량한 임상 반응과 관련된 잠재적 위험 인자로 확인하였다. 이러한 관찰은 본 발명자들로 하여금 PD-1과 PD-L1/L2 사이의 상호작용을 폐지하기 위한 전략으로서 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두에 대해 우수한 결합 친화성을 갖는 sPD-1 돌연변이체를 개발하도록 촉구한다. 결합 계면의 내부 및 외부 둘 모두의 돌연변이는 결합 친화성의 향상에 기여하였고 αPD-L1 및 αPD-1 항체 둘 모두와 비교할 때 우수한 항-종양 활성을 초래하였다. 또한, PD-L2를 발현하는 종양이 생체내에서 PD-L1 독립적인 방식으로 성장할 수 있었고, 이의 성장이 sPD-1 돌연변이체에 의해 억제되었지만 αPD-L1 항체에 의해 억제되지 않았다는 관찰은 암에서 PD-L2의 종양 보호 역할을 더욱 확고히 하였다. 이들 데이터는 PD-L1 및/또는 PD-L2를 발현하는 암의 치료에서 PD-1 억제제에 대한 대안으로서 sPD-1 돌연변이체를 평가하기 위한 정당성을 종합적으로 제공하였다.
5. 물질 및 방법
연구 설계
이 연구는 생체내 모델 및 인간 임상 표본 둘 모두에서 PD-L2의 관련성을 평가하고 PD-L1 및 PD-L2 둘 모두에 대해 초-고 결합 친화성을 갖는 가용성 PD-1 돌연변이체의 구조적, 생화학적, 기능적 및 치료적 효능을 특성화하도록 설계되었다. 모든 종양 마이크로어레이 표본은 US Biomax(Derwood, MD)에서 상업적으로 구입하였다. 기관 인증 수의사 병리학자는 염색된 종양 마이크로어레이 표본의 면역조직화학 스코어링을 수행하였다. 마우스 생체내 연구는 Stanford University 및 ChemPartner, Shanghai의 AAAPLAC의 승인하에 수행되었다. 동물 연구를 위한 샘플 크기는 유사한 생체내 연구에 대한 이전 경험을 기반으로 하였다. 모든 동물을 치료 그룹에 무작위 할당하였다. 연구와 관련이 없는 질병으로 인해 조기 종료가 필요한 동물을 제외하고는 샘플을 연구에서 제외하지 않았다. 실험의 종말점은 각 실험에 대해 미리 정의되었다. 종양 성장을 측정할 수 있는 연구에 대해 종양 성장 곡선을 제시하고, ID8 이방성 난소암 모델에 대해 카플란 마이어 곡선을 사용하였다. 각 실험 연구에 대해 적절한 통계 분석을 사용하였다.
세포주
MC38, ID8, ID8-PDL1 CRISPR, B16/OVA, MC38-hPD-L1, MC38-hPD-L2, MC38-hPD-L2-PD-L1 CRISPR, Hep3B-OS8-hPD-L1, Hep3B-OS8-hPD-L2를 10% 우태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제가 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 가습된 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지하였다. 세포를 트립신화하고 80% 컨플루언시로 계대시켰다.
효모-디스플레이 sPD-1 라이브러리의 합성
인간 PD-1 세포외 도메인, 아미노산 Leu25-Val170을 인코딩하는 DNA를 NheI 및 BamHI 제한 부위를 사용하여 pCT 효모 디스플레이 플라스미드로 클로닝하였다. 야생형 단백질과의 작업 비교를 용이하게 하기 위해 Mihalis S. Kariolis 등(Kariolis, et al. 2014, Nat Chem Biol 10(11): 977-983, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 사용된 것과 일치하도록 서열 넘버링을 수행하였다. PD-1 세포외 도메인 DNA를 주형으로 사용하여 오류-발생이 쉬운 라이브러리를 생성하고, 저-충실도 Taq 중합효소(Invitrogen) 및 뉴클레오티드 유사체 8-oxo-dGTP 및 dPTP(TriLink Biotech)를 사용하여 돌연변이를 도입하였다. 돌연변이 빈도의 범위를 얻기 위해 유사체의 농도 및 사이클의 수를 변화시킨 6개의 개별 PCR 반응을 수행하였다; 5 사이클(200 μM), 10 사이클(2, 20 또는 200 μM) 및 20 사이클(2 또는 20 μM). 이들 반응으로부터의 생성물을 뉴클레오티드 유사체의 부재하에 pCT 플라스미드에 대해 각각 50 bp 상동성을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 겔 전기영동을 사용하여 정제하고 pCT 플라스미드를 NheI 및 BamHI로 분해하였다. 정제된 돌연변이체 cDNA 및 선형화된 플라스미드를 5:1 중량비로 EBY100 효모에 전기천공하였고 여기서 이들은 상동 재조합을 통해 생체내에서 어셈블링되었다(Kariolis, et al. 2014, Nat Chem Biol 10(11): 977-983, 이의 전체내용은 본원에 참조로 포함됨). 라이브러리 크기는 희석 플레이팅에 의해 7.4×107로 추정되었다.
라이브러리 스크리닝
고 친화성 PD-1 돌연변이체를 디스플레이하는 효모를 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 라이브러리로부터 분리하였다. FACS 라운드 1-3의 경우, 효모가 다음 명목 농도의 Gas6(R&D Systems)와 함께 1 mg/ml BSA를 갖는 포스페이트 완충 염수(PBSA)에서 실온으로 인큐베이션되는 평형 결합 분류가 수행되었다: 분류 1) 10 nM PD-L1 3시간; 분류 2) 2 nM PD-L1 3시간; 분류 3) 0.2 nM PD-L1 24시간. PD-L1과 함께 인큐베이션한 후, 효모를 펠렛화하고, 세척하고, PBSA에서 1:250의 닭 항-c-Myc(Invitrogen)으로 4℃에서 1시간 동안 재현탁시켰다. 이후 효모를 세척하고, 펠렛화하고, 이차 표지화를 1:100 희석된 염소 항-닭 Alexa Fluor 555(Invitrogen) 및 마우스 항-HIS Hilyte Fluor 488(Anaspec)을 갖는 PBSA를 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 수행하였다.
FACS 라운드 4-6의 경우, 효모를 2 nM PD-L1과 함께 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 2회 세척하여 과량의 결합되지 않은 Gas6를 제거하고, 약 50배 몰 과량의 PD-1을 함유하는 PBSA(R&D Systems)에 재현탁시켜 탈결합 사건이 비가역적이 되게 하는 동역학적 오프-레이트 분류를 수행하였다. 탈결합 단계의 길이는 다음과 같았다: 분류 4) 4 h; 분류 5) 4 h; 분류 6) 24 h, 모든 탈결합 반응은 실온에서 수행되었다. 해리 반응의 마지막 시간 동안, 닭 항-c-Myc를 1:250의 최종 희석액으로 첨가하였다. 효모를 펠렛화하고, 세척하고, 앞서 기재된 바와 같이 이차 표지화를 수행하였다. 표지된 효모를 Vantage SE 유세포분석기(Stanford FACS Core Facility) 및 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 FACS에 의해 분류하였다. 가장 높은 Gas6 결합/c-Myc 발현 비율을 갖는 클론의 1-3%가 선택되도록 분류를 수행하여, Gas6에 대한 가장 높은 결합 친화성을 갖는 클론에 대한 라이브러리를 풍부하게 하였다. 분류 1에서, 108개의 세포를 스크리닝하고 후속 라운드에서 라이브러리 다양성의 적절한 샘플링을 보장하기 위해 이전 분류 라운드에서 수집된 클론 수의 최소 10배를 분석하였다. 선택된 클론을 증식시키고 추가 라운드의 FACS에 적용하였다. 분류 5 및 6후에, 플라스미드 DNA를 Zymoprep 키트(Zymo Research Corp.)를 사용하여 회수하고, XL-1 블루 초적격 세포로 형질전환하고, 플라스미드 미니프렙 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 시퀀싱은 Sequetech Corp에 의해 수행되었다.
동일한 시약 및 프로토콜을 사용하여 효모-디스플레이된 분류 생성물의 분석을 수행하고 라이브러리 분류에 대해 설명하였다. FACSCalibur(BD Biosciences)에서 샘플을 분석하고 FlowJo 소프트웨어(Treestar Inc.)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
재조합 단백질 생산
HIgG4Fc에 연결된 가용성 PD-1 야생형 및 돌연변이체를 신호 전달 펩티드를 갖는 pCPC 플라스미드에 클로닝하고(ChemPartner, Shanghai) HEK293 인간 배아 신장 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고 4L OPM-293 CD03에서 배양하였다. 이후 생성물을 단백질 A 수지 MabSelect SuRe(GE Healthcare)를 통해 정제하고, 추가로 superdex 200 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다. 각 정제 단계 이후에 SDS-PAGE 확인 및 SEC-HPLC 분석이 이어졌다. 최종 생성물은 내독소 시험되었고 0.09E U/mg로 확인되었다.
컴퓨터 모델링 분석
인간 PD-1/PDL1 복합체 구조는 Protein Data Bank에서 이용 가능하며, PDBID는 4ZQK 및 5IUS이다. 그러나, 둘 모두의 PDB 구조에서, PD1의 일부 잔기가 루프 영역에서 누락되고, 잔기 중 일부는 야생형 PD1과 비교하여 돌연변이되었다. 누락된 루프 및 돌연변이된 잔기를 결정 구조 4ZQK에 기초하여 야생형 PD1으로 다시 재작제하였다. 돌연변이된 PD1 구조는 Schrodinger Suite의 잔기 스캐닝 모듈을 사용하여 모델링되었다. 돌연변이된 잔기의 5.0 Å 이내 잔기는 측쇄 예측 및 백본 샘플링으로 정제되었다. 결합 친화성 및 복합체 안정성의 변화 계산이 또한 다중 돌연변이에 대해 수행되었다. 결합 친화성 또는 안정성이 더 음의 값이면 이들이 더 크게 증가함을 나타낸다. PDL2의 상동성 모델이 인간 PD1과 PDL2 사이의 상호작용을 조사하기 위해 구성되었다. PDB 비-중복 데이터 세트에서 상동성 검색 후, 마우스 PDL2의 3개의 PDB 구조를 주형으로 선택하였다. 인간 PDL2 모델과 마우스 PDL2 결정 구조(PDBID: 3BP5) 사이의 PD1 결합 계면 비교.
면역검정
슬라이드를 탈파라핀화하고, 10mM 시트르산 완충제, 0.05% Tween 20, pH 6을 사용하여 항원 회수를 수행하고, 완충제로부터 슬라이드를 제거하고 15분 동안 실온에서 냉각시켰다. 15분 동안 34% 과산화수소 및 물의 1:10 희석액으로 내인성 퍼옥시다제를 켄칭시켰다. 아비딘 및 비오틴 차단제는 각각 15분 동안 첨가되었다. 2% 우태아 혈청을 사용한 단백질 블록을 20분 동안 첨가하였다. 혈청 및 항체를 PBT(1XPBS, 0.1% BSA, 0.2%, 0.01% Tween 20)에서 희석하였다. α인간 PD-L1 1:500(#AF154, R&D systems, Minneapolis, MN), α인간 PD-L2 1:500(#MABC1120, EMD Millipore, MA), α인간 CD8 1:500(#Ab4005, Abcam, Cambridge, MA), α마우스 PD-L1 1:750(#17952-1-AP, Proteintech, IL), α마우스 PD-L2 1:750(#Ab21107, Abcam, Cambridge, MA) 및 α마우스 CD8 1:500(#Ab203035, Abcam, Cambridge, MA) 항체를 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 면역조직화학을 위해, 항-토끼 및 항-래트를 각 슬라이드에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, STREP-HRP와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, DAB 기질 키트(#34002, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 신호를 발생시켰다. 면역형광 검출을 위해, 모든 염색은 암실에서 수행되었고, PBS 중 2% BSA 및 0.1% tween 20에서 1:400 희석된 이차 항체를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. RT로 예열된 주사기 필터를 통해 70% 에탄올 중 Sudan Black B 0.2% 용액을 실온에서 10분 동안 슬라이드에 첨가하였다. DAPI(#F6057, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 0.1μg/mL를 대조염색을 위해 사용하고 커버슬립을 적용하였다. 인간 IgG4(#BMS2059, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)의 ELISA 정량화를 제조업체의 지시에 따라 수행하였다.
표면 플라스몬 공명
인간 PD-L1(#10084-H08H, SinoBiological, Wayne, PA) 및 인간 PD-L2(#10292-H08H, SinoBiological, Wayne, PA)를 분석물로 사용하였다. 실행 완충액 HBS-EP+(10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% P20, pH 7.4)를 제조하였다. 유량은 30 μL/분으로 수행되었다. CM5 센서칩에 항-인간 Fc IgG의 고정. PD1-Fc는 고정된 센서칩에 포획되었다. 연속 희석된 분석물의 주입이 사용되었다. 30초 동안 글리신 pH 1.5를 표면 재생으로 사용하였다. 다중 사이클 동역학이 Biacore T200에서 수행되었다. Biacore T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 계산된 Kd 분석.
유세포분석 기반 결합 분석
MC38-hPD-L1, MC38-hPD-L2, Hep3B-OS8-hPD-L1, Hep3B-OS8-hPD-L2 및 모 MC38 세포를 표준 조직 배양 조건에서 배양하였다. 세포를 수확하고 상청액을 폐기한 다음 웰 당 3x105개 세포로 염색 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 300g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 다양한 농도의 sPD-1 돌연변이체 및 음성 대조군을 2% FBS를 함유하는 FACS 완충액에서 희석하고, 100μL/웰을 첨가하였다. 세포를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 200μL FACS 완충액으로 2회 세척하고 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 각 세척 전후에 상청액을 버렸다. 세포를 항-인간 IgG-Alexa 488(#A28175, ThermoFisher, Waltham, MA)과의 1:1000 희석제로 100μL/웰로 재현탁시켰다. 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포를 100μL의 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 암실에서 유지하고 FACS CantoII(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 FACS 분석을 수행하였다.
수용체 차단 검정
Hep3B-OS8-hPD-L1, Hep3B-OS8-hPD-L2, MC38-hPD-L1 및 MC38-hPD-L2 세포를 T175 플라스크에서, PRMI 1640 배지, 10% FBS, G418 및 hygro에서 60-80%의 컨플루언시로 배양하였다. 세포를 수확하고 희석 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 2x105개 세포/웰의 밀도로 둥근 바닥 96-웰 플레이트 corning #3799에 분배하였다. 600, 120, 24, 4.8, 0.96, 0.192, 0.00384 nM 및 0 nM의 여러 농도의 sPD-1 돌연변이체를 희석 완충액에 재현탁시켰다. sPD-1 야생형이 또한 희석 완충액에서 제조되었다. 플레이트를 500g에서 3분 동안 원심분리하고 상청액을 버렸다. 세포를 50μL 항체로 재현탁시킨 다음 50μL의 리간드를 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 원심분리하고 세척하였다. 희석 완충액에서 1:1000으로 희석된 스트렙타비딘-Alexa Flour 488(#S11223, Thermo Fisher, Waltham, MA)을 제조하고 세포와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 원심분리하고 세척한 다음 200μL FACS 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 FACS Canto II(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 실행시켰다. MFI 값에 의해 곡선을 그렸고 IC50 및 최고를 계산하였다.
T 세포 자극 및 T 증식 검정
건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 동일한 부피의 멸균 PBS로 희석하고 부드럽게 진탕시켜 혼합하였다. 15mL의 Ficoll-Paque PLUS(-1440-02, GE Healthcare, Pittsburgh, PA) 배지를 Ficoll 및 혈액 부피 비가 3:4인 신선한 50mL 원심분리기 튜브로 옮겼다. 이후 희석된 혈액 샘플은 혼합을 피하기 위해 Ficoll 배지의 표면에 조심스럽게 층을 이룬다. 튜브는 원심분리 동안 최대 가속 및 최소 감속 설정으로 20℃에서 30분 동안 400 g로 원심분리되었다. 4개의 계면이 위에서 아래로 보이는 혈장, 단핵 세포, Ficoll 배지 및 RBC의 층으로 원심분리 후 관찰되었다. 단핵 세포 층을 부드럽게 제거하여 새로운 멸균 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮겼다. 세척을 위해 수집된 PBMC에 멸균 PBS 완충액을 첨가하였다. 튜브는 원심분리 동안 최대 가속 및 최소 감속 설정으로 20℃에서 10분 동안 300xg로 원심분리되었다. 검정을 위해 세포를 10%FBS+RPMI 1640으로 재현탁시켰다. 마이코플라스마가 없는 Hep3b-hPDL1-OS8 세포를 15cm 디쉬에 준비하고 사용 전에 컨플루언시를 60-80%로 유지하였다. 세포를 TrypLETM Express(#12605-036, Thermo Fisher, Waltham, MA)로 트립신화하여 50mL 원심분리기 튜브에 수집하고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포를 5-10mL 10%FBS + RPMI 1640 배지에서 미토마이신(#H33020786, Zhejiang, China) 10μg/mL로 재현탁시켰다. 세포를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS에서 세척하고 세포를 세포계수기로 계수한다. 세포를 20℃에서 5분 동안 1000rpm에서 원심분리하였다. 이후 세포를 10%FBS + RPMI 1640 검정으로 재현탁시켰다. PBMC 자극은 96 웰 마이크로플레이트 상에 100μL/웰로 5E4개 세포/웰의 PBMC를 첨가함으로써 수행되었다. 50 μL/웰의 일련의 5X OD1 v2, 5X PD1 WT, 또는 hIgG4 단백질 용액을 첨가한 다음, 50μL/웰에 대해 5000개 세포/웰의 APC Hep3b-hPDL1-OS8을 첨가하였다. 혼합된 용액을 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 수확하고 ELISA 시험 전에 -20℃에 두었다. IFN-γ 농도를 ELISA 키트로 시험하였다. IFN-γ의 정량화는 R&D에서 구입한 quantikine ELISA 키트에 의해 결정되었다. 인간 IFN-γ ELISA 키트, R&D, Cat#DY285에 의해 개괄된 검정 절차를 따랐다. 플레이트는 450nm 파장에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독되었다.
렌티바이러스 형질도입된 Hep3B-OS8 세포 및 MC38 세포에서 PD-L2의 발현
Hep3B-OS8(4E8) 세포주를 사내에서 pLVX-IRES-hygro-hPDL2:CP로 형질도입하여 1640 배지에서 증식시켰다. MC38 세포를 pLVX-IRES-hygro-hPDL2로 형질도입시켰다. 세포를 표준 절차에 따라 수확하고 상청액을 버렸다. 세포를 둥근 바닥 96-웰 염색 플레이트: corning, REF#3799에 웰 당 3e5개 세포로 분배하였다. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 300g의 원심분리기에 두었다. 적정된 1xPBS+2%FBS FACS 완충액 중 100μL의 토끼 항-hPD-L2를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200μL FACS 완충액으로 2회 세척하고 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 각 세척 전후에 상청액을 버렸다. 세포를 이차 당나귀-항-토끼 IgG(H+L) Alexa488 life technology 항체의 1:1000 희석액으로 100μL/웰로 재현탁하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 200μL FACS 완충액으로 2회 세척하고 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 각 세척 전후에 상청액을 버렸다. 세포를 100μL PBS에 재현탁시켰다. 세포를 암실에 유지하고 FACS 분석을 위해 제출하였다.
생체내 종양 연구
모든 동물 실험은 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 및 ChemPartner, Shanghai의 동물 윤리 위원회에 의해 검토되고 승인되었다. hPD-L1 녹인을 갖는 C57B/6 마우스는 Biocytogen(Beijing, China)에서 구입하였고 야생형 C57/B6 마우스는 Biocytogen(Beijing, China) 또는 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, Maine)에서 구입하였다. C57B/6 배경의 PD-L1 녹아웃 마우스는 (Dr. Dean W. Felsher at Stanford University)가 친절하게 선물하였다. 6-8주령의 암컷 마우스를 ID8 난소 종양 연구에 사용하였고 6-8주령의 수컷 마우스를 MC38 결장직장 연구 및 B16/OVA 흑색종 연구에 사용하였다. 마우스를 병원체가 없는 동물 시설에 수용하고, 일정한 온도 및 습도하에 유지하고, 12시간 명암주기를 조절하였다. MC38, MC38-hPD-L1, MC38-hPD-L2 결장직장 연구 및 B16/OVA 흑색종 연구를 위해, 1x10^6개 세포를 피하 주입하고 종양 접종 후 대략 7일에 종양 성장을 확인한 후 대조군 또는 적절한 치료 그룹에 무작위 할당하였다. 연구를 통틀어 종양 성장을 측정하고 체중을 기록하였다. 대부분의 종양이 윤리적 종말점에 도달했을 때 동물을 동시에 희생시켰다. ID8 난소 연구를 위해, 5x10^6개 세포를 복강내 주입하였고, 각 동물은 생존 분석을 위해 복막 복수의 발생시 종결되었다. PD-L1 녹아웃 마우스에서 수행된 종양 연구의 경우, 2개의 개별 연구를 위해 10x10^6개 ID8 세포를 피하 또는 복강내 주입하였다.
통계 분석
Pearson 상관 관계는 종양 표본의 모든 상관 관계 분석에 사용되었다. IHC H 점수 값은 기관 인증 수의사 병리학자에 의해 결정되었다. 모든 종양 부피, 생존, 생체내 면역조직화학의 정량화는 Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc)를 사용하여 수행되었다. Tukey-Kramer 시험을 통한 ANOVA를 사용하여 여러 처리 그룹을 서로 비교하였다. P < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 반복 측정 ANOVA는 시간에 따라 측정된 여러 처리 그룹을 비교하기 위해 사용되었다. 생존 곡선의 통계 분석이 ID8 생존 연구에서 수행되었다. log-rank(Mantel-Cox) 시험을 수행하여 그룹 간의 평균 생존을 비교하였다; P ≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
K. 실시예 11: 면역 체크포인트 억제제의 효능을 향상시키기 위한 PD-L1 및 PD-L2 중화
1. 인간 PD-L1 및 PD-L2에 대한 돌연변이체 클론 스크리닝
7개의 돌연변이(위치 넘버링이 신호 영역에서 시작할 때 62-87-89-124-127-132-140)를 갖는 고 친화성 결합 sPD-1 돌연변이체로부터 발생한 과돌연변이의 모든 가능한 조합으로 구성된 128개의 sPD-1 돌연변이체의 효모 디스플레이 라이브러리를 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 라이브러리로부터 분리하였다. 평형 결합 분류를 수행하였고, 여기서 효모를 하기 명목 농도의 PDL1-Fc 및 PD-L2-Fc와 함께 1 mg/ml BSA를 갖는 포스페이트 완충 염수(PBSA)에서 실온으로 인큐베이션하였다. 가장 높은 결합 클론을 수집하고 추가 분석을 위해 시퀀싱하였다.
2. 선택된 클론의 특성화
도 38a는 초기 돌연변이체 PD-1 클론에 존재하는 아미노산 돌연변이를 예시하며, 모든 돌연변이는 7개 돌연변이의 모든 가능한 과돌연변이를 포함하는 128개의 sPD-1 돌연변이체 클론의 라이브러리를 생성하는데 사용되었다. 도 38b는 추가 결합 분석을 위해 128개의 sPD-1 돌연변이체 클론 라이브러리로부터 선택된 상위 5개의 돌연변이체 클론의 목록을 보여준다. 도 39는 원래의 돌연변이체 sPD-1 및 PD-L1에 대한 클론 #1-5의 용량-의존적 결합 곡선을 도시하고, 도 40은 원래의 돌연변이체 sPD-1 및 PD-L1에 결합하는 클론 #1-5의 Kd 값을 요약한다. 도 41은 원래의 돌연변이체 sPD-1 및 PD-L2에 대한 클론 #1-5의 용량-의존적 결합 곡선을 도시하고, 도 42는 원래의 돌연변이체 sPD-1 및 PD-L2에 결합하는 클론 #1-5의 Kd 값을 요약한다.
상기 제시된 실시예는 당업자에게 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법의 구체예를 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제공되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 것이 아니다. 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 전술한 방식의 수정은 다음 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자의 기술 수준을 나타낸다. 본 개시에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌의 전체내용이 개별적으로 참조로 포함된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다.
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당업자에게 명백한 바와 같이, 본 출원의 많은 수정 및 변형이 이의 사상 및 범위를 벗어나지 않으며 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 특정 구체예 및 실시예는 단지 예로서 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY AKSO BIOPHARMACEUTICAL, INC. <120> SPD-1 VARIANT - FC FUSION PROTEINS <130> 1151248 <140> PCT/US2019/050742 <141> 2019-09-12 <150> 62/888,320 <151> 2019-08-16 <150> 62/731,488 <151> 2018-09-14 <160> 163 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser 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Arg Ile Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Thr Cys Gln Ala Arg Gly 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Gln Asn Val Ser Val Pro Ala Asn 130 135 140 Thr Ser His Ile Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val 145 150 155 160 Leu Arg Leu Lys Pro Gln Pro Ser Arg Asn Phe Ser Cys Met Phe Trp 165 170 175 Asn Ala His Met Lys Glu Leu Thr Ser Ala Ile Ile Asp Pro Leu Ser 180 185 190 Arg Met Glu Pro Lys Val Pro Arg Thr 195 200 <210> 158 <211> 202 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 158 Met Leu Phe Thr Val Thr Ala Pro Lys Glu Val Tyr Thr Val Asp Val 1 5 10 15 Gly Ser Ser Val Ser Leu Glu Cys Asp Phe Asp Phe Phe Glu Cys Thr 20 25 30 Glu Leu Glu Gly Ile Arg Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr 35 40 45 Ser Leu Gln Ser Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu 50 55 60 Gly Lys Ala Leu Phe His Ile Pro Ser Val Gln Val Arg Asp Ser Gly 65 70 75 80 Gln Tyr Arg Cys Leu Val Ile Cys Gly Ala Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr 85 90 95 Leu Thr Val Lys Val Lys Ala Ser Tyr Met Arg Ile Asp Thr Arg Ile 100 105 110 Leu Glu Val Pro Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Thr Cys Gln Ala Arg 115 120 125 Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Gln Asn Val Ser Val Pro Ala 130 135 140 Asn Thr Ser His Ile Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser 145 150 155 160 Val Leu Arg Leu Lys Pro Gln Pro Ser Arg Asn Phe Ser Cys Met Phe 165 170 175 Trp Asn Ala His Met Lys Glu Leu Thr Ser Ala Ile Ile Asp Pro Leu 180 185 190 Ser Arg Met Glu Pro Lys Val Pro Arg Thr 195 200 <210> 159 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Ala Leu Phe Thr Val Glu Leu Thr Ser Gln Thr Ser Pro His Gln Gln 1 5 10 15 Cys Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu 20 25 <210> 160 <211> 29 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 160 Met Leu Phe Thr Ala Glu Val Arg Ser Gln Thr Ser Leu Gln Gln Arg 1 5 10 15 Cys Leu Ile Cys Gly Ala Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu 20 25 <210> 161 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 <210> 162 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro <210> 163 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Phe Leu Gly Gly Pro 65 70

Claims (40)

  1. a) SEQ ID NO:1과 비교하여 아미노산 치환을 포함하는 가용성 PD-1(sPD-1) 변이체 도메인으로서, 상기 아미노산 치환이 120, 112, 107, 104, 67, 69, 96 및 42로 구성된 군으로부터 선택되는 위치 번호에 있는 sPD-1 변이체 도메인;
    b) 선택적 링커; 및
    c) Fc 도메인을 포함하는 sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Fc 융합 단백질이 N-말단에서 C-말단으로:
    a) 상기 sPD-1 변이체 도메인;
    b) 상기 선택적 링커; 및
    c) 상기 Fc 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Fc 융합 단백질이 N-말단에서 C-말단으로:
    a) 상기 Fc 도메인;
    b) 상기 선택적 링커; 및
    c) 상기 sPD-1 변이체 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 95% 동일성을 나타내는 Fc 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 상기 위치 중 1개, 상기 위치 중 2개, 상기 위치 중 3개, 상기 위치 중 4개, 상기 위치 중 5개, 상기 위치 중 6개, 상기 위치 중 7개 또는 상기 위치 중 8개에서 아미노산 치환(들)을 갖는 Fc 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 A120V, A112I, S107V, G104S, S67G, P69L, N96S 및 S42G로 구성된 군으로부터 선택되는 상기 아미노산 치환을 포함하는 Fc 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이
    S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V,
    S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V,
    P69L/G104S/S107V/A112I/A120V,
    S67G/G104S/S107V/A112I/A120V,
    S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V,
    G104S/S107V/A112I/A120V, 및
    G104S/S107V/A112I로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 세트를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 S67G/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 G104S/S107V/A112I/A120V의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 G104S/S107V/A112I의 아미노산 치환의 세트를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 SEQ ID NO:2를 갖는 Fc 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 SEQ ID NO:3를 갖는 Fc 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 SEQ ID NO:72를 갖는 Fc 융합 단백질.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 SEQ ID NO:110을 갖는 Fc 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 SEQ ID NO:130을 갖는 Fc 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 SEQ ID NO:131을 갖는 Fc 융합 단백질.
  21. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sPD-1 변이체 도메인이 SEQ ID NO:138을 갖는 Fc 융합 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인이 인간 IgG Fc 도메인 또는 변이체 인간 IgG Fc 도메인인 Fc 융합 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 상기 인간 IgG Fc 도메인이 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  24. 제22항에 있어서, 상기 Fc 도메인이 변이체 인간 IgG Fc 도메인인 Fc 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 상기 변이체 인간 IgG Fc 도메인이 S228P 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG4의 힌지-CH2-CH3를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 n이 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택되는 Fc 융합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 링커가 GGGGS인 Fc 융합 단백질.
  28. 제1항에 있어서, 상기 Fc 융합 단백질이 SEQ ID NO:5를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  29. 제1항에 있어서, 상기 Fc 융합 단백질이 SEQ ID NO:6를 포함하는 Fc 융합 단백질.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 상기 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
  31. 제30항의 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  32. 제30항의 상기 핵산 또는 제31항의 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  33. sPD-1 변이체-Fc 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, a) 제32항의 상기 숙주 세포를 상기 Fc 융합 단백질이 발현되는 조건하에 배양하는 단계; 및 b) 상기 Fc 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 암에 걸린 대상체에서 종양의 전이 또는 침습을 치료, 감소 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 치료적 유효량의 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 하나 이상의 상기 Fc 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 암이 흑색종, 신경아교종, 림프종, 골수종, 두경부암, 식도암, 신장암, 폐암, 유방암, 간암, 결장직장암, 담낭암, 위암, 췌장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 고환암, 및 임의의 다른 고형 종양 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  36. 치료적 유효량의 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 하나 이상의 상기 Fc 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 감염을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 감염이 진균 감염, 박테리아 감염 및 바이러스 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 바이러스 감염이 B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 인간 유두종 바이러스 감염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염, 인간 T-림프친화 바이러스(HTLV) 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 헤르페스 바이러스 감염, 시토메갈로바이러스 감염, 및 임의의 다른 만성 바이러스 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 하나 이상의 Fc 융합 단백질이 대상체에서 야생형 PD-1에 의해 매개되는 신호 전달을 억제, 감소 또는 조절하는 방법.
  40. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 하나 이상의 Fc 융합 단백질이 대상체에서 T 세포 반응을 증가시키는 방법.
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