KR20210058854A - 비피더스 활성 저알레르기성 gos 조성물 및 락토바실러스 델브루에키 ssp 불가리쿠스의 균주로부터의 베타-갈락토시다제를 수반하는 이의 제공 방법 - Google Patents

비피더스 활성 저알레르기성 gos 조성물 및 락토바실러스 델브루에키 ssp 불가리쿠스의 균주로부터의 베타-갈락토시다제를 수반하는 이의 제공 방법 Download PDF

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KR20210058854A
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린치우 카오
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프리슬랜드캄피나 네덜란드 비.브이.
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Abstract

본 발명은 영양 조성물에서 사용하기 위한 저알레르기성 올리고당 분야, 특히 프리바이오틱 특성을 갖는 올리고당에 관한 것이다. 갈락토-올리고당(GOS)을 포함하는 저알레르기성 올리고당 조성물이 제공되되, (i) 갈락토-올리고당(GOS) 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 40 중량%이고; (ii) 알로락토스 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 10 중량%이며; (iii) 6'-GL 함량은 조성물 중의 총 GOS의 적어도 30중량%이고; (iv) 총 GOS의 적어도 0.5 중량%는 중합도(DP)가 6 이상이다. GOS 조성물은 호염기구 활성화 시험(BAT)에서 평가한 바와 같이 GOS-알레르기를 촉발하지 않는다.

Description

비피더스 활성 저알레르기성 GOS 조성물 및 락토바실러스 델브루에키 SSP 불가리쿠스의 균주로부터의 베타-갈락토시다제를 수반하는 이의 제공 방법
본 발명은 영양 조성물에서 사용하기 위한 올리고당 분야, 특히 프리바이오틱(prebiotic) 특성을 갖는 올리고당에 관한 것이다. 프리바이오틱 특성을 갖는 제품은 인간 및/또는 동물의 위장관에서 건강한 세균총(flora)을 촉진시킬 수 있다. 전형적으로, 이러한 제품은 향상된 면역 기능 및 칼슘, 철 및 마그네슘과 같은 무기염의 개선된 흡수를 유도하는 데, 이는 폐경기 여성, 노인 및 교란된 장 기능을 앓고 있는 환자에게 유익하다.
인간 위장관(human gastrointestinal tract: GIT)은 결장에 있는 500 내지 1000개의 상이한 계통형의 거대한 박테리아 집단의 숙주가 된다. 그 중에서도, 비피도박테리아 종은 영아 GIT에서 우세한 미생물이며, 이들의 숙주에 유리한 효과, 예컨대 특히 면역-자극, 인간 병원균 저해, 비타민 생성 및 항발암성 활성을 발휘한다(문헌[Harmsen, H. J., et al. 2000 J Pediatr Gastroenterol Nutr 30:61-7]; 문헌[Casci, T., et al. 2007 Human Gut microflora in Health and Disease: Focus on Prebiotics. In Functional food and Biotechnology. Ed Taylor and Francis, pp 401-434]). "비피더스 활성(bifidogenic)" 효과를 갖는 제품은 구체적으로는 장에서의 비피도박테리아 성장을 향상시킨다. 영아에서, 비피도박테리아의 풍부함은 모유를 섭취한 영아의 세균총과 더 유사하게 만들고/만들거나 위장관에서의 천연 유래 세균총의 임의의 교란을 방지하고/하거나 치료하는 데 사용될 수 있다. 이들 효과는 임상 환자에서 그리고 신생아에서 특히 유리하다.
아기가 잘 자라게 하는 데 필요한 영양소 및 에너지를 모유가 제공하는 것에 추가로, 또한 비분해성 올리고당(모유 올리고당; HMO)을 함유한다는 것은 잘 공지되어 있다. HMO는 소장에서 비피도박테리아 및 락토바실리(lactobacilli)와 같은 미생물총(microbiota)의 군집화를 촉진시켜, 설사 및 감염에 대해 증가된 내성, 면역계 성숙 및 면역계 활성의 자극을 포함하는 다수의 건강상의 이점을 갖는 장내 미생물상(microflora)을 확립한다.
또한 조제식-섭취(formula-fed) 영아의 장내 미생물상이 모유를 섭취한 영아의 장내 미생물상과 다르다는 것이 공지되어 있다. 일반적으로, 모유를 섭취한 영아의 미생물총은 주로 비피도박테리아를 포함하는 한편, 조제식-섭취 영아의 미생물총은 더 다양하며, 비피도박테리아가 종종 우세한 종이지만, 또한 다른 덜 유익한 종을 상당량 포함하고 있다. 이는 프리바이오틱으로서 작용함에 따라 비피더스 활성 미생물총에 기여하는, 영아 조제식 중의 특정의 비분해성 HMO 결여 때문일 가능성이 있다.
더 양호한 비피더스 활성 효능을 위해, 대다수의 현재의 영아 조제식은 갈락토올리고당(galactooligosaccharide: GOS)를 함유한다. GOS는 인간이 소화할 수 없는 탄수화물 성분이지만, 비피도박테리아 및 락토바실리를 발효시킬 수 있기 때문에 이들에 대한 성장 촉진 효과를 갖는 것으로 나타났다. 또한, GOS는 IBD 및 IBS에 대해 잠재적 항-염증제로서 연구되었다. 일부 조제식에서, GOS는 더 양호한 비피더스 활성(신바이오틱스)을 위해 살아있는 장 박테리아와 조합되며, 예를 들어 WO00/33854를 참조한다. 과거 십년간, GOS는 유제품, 당 대체물 및 기타 영양 또는 기능식품(nutraceutical) 보충물을 비롯한 인간 식료품에서의 적용이 증가되었다.
전형적으로, GOS의 기본 구조는 전형적으로 최대 7개의 갈락토스 잔기(중합도(degree of polymerization: DP)는 최대 8)로 연장된 환원 말단에 글루코스 잔기를 포함한다.
6'-갈락토실-락토스(6'-GL)는 더 중요한 HMO 중 하나라는 것이 당업계에서 시사되었다. 초유 갈락토실락토스에서 발현되는 3가지의 갈락토실락토스(3'-GL, 4'-GL 및 6'-GL)가 인간 장상피세포에서 그리고 인간 미성숙 장에서 NF-κB 염증 신호전달을 약화시켰다는 것을 관찰한 Newburg 등의 문헌[(2016), J. Nutri. 146, 358-367]을 참조한다. 이는 갈락토실락토스가 인간 초유 및 초기 모유에서 강한 생리적 항염증제로서 작용하여, 선천성 면역 조절에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다.
GOS는 공지된 화학적 방법에 의해 생산될 수 있지만, 이들을 합성하기 위한 바람직한 방법은 효소적 접근이다. 상업적 GOS 제제는 일반적으로 진균, 효모 및/또는 박테리아와 같은 상이한 공급원으로부터의 β-갈락토시다제(EC.3.2.1.23)를 이용하는 락토스의 효소적 처리에 의한 트랜스갈락토실화 반응을 통해 생산되어, 다양한 쇄 길이의 올리고머 혼합물을 수득하며, 다양한 DP 및 결합을 갖는 대략 100가지 상이한 유형의 구조를 함유하는 혼합물의 형성을 초래한다. 베타-갈락토시다제는 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 클루이베로마이세스 마르크시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 스포로볼로마이세스 싱귤라리스(Sporobolomyces singularis) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)과 같은 많은 미생물에서 생산된다. GOS 구조적 다양성은 트랜스-갈락토실화 반응에서 사용되는 효소, 및 반응 조건, 예컨대 pH, 온도 및 효소 투약량에 따라 다르다(Dumortier, V., et al. 1990, Carbohydr Res 201: 115-23).
베타-갈락토시다제는 글리코시드 결합의 입체- 및 위치 선택성을 초래하는 이들의 3차원 구조가 다르다. 예를 들어, 전형적으로 진균 종, 예컨대 아스퍼질러스(Aspergillus)는 대부분 β1-6 결합을 생성하는 반면(따라서 주로 6'-GOS를 초래하고, 소수의 GOS 성분으로서 3'-GOS 및 4'-GOS를 초래함), 바실러스와 같은 박테리아는 대부분 β1-4 결합(주로 4'-GOS를 초래)을 생성한다. 또한, 바실러스 서큘란스에 의해 생산된 베타-갈락토시다제는 특히 강한 트랜스갈락토실화 활성을 갖고, 따라서, 바실러스 서큘란스로부터의 베타-갈락토시다제에 의해 제조된 GOS는 전세계적으로 상업화되어 있다. 시장에 도입된 이후로(1999), 대략 1억명의 영아가 바실러스 서큘란스에 의해 제조된 GOS를 함유하는 영아용 조제식을 소비하였다. 이는 FDA가 GRAS 상태를 인정한 안전한 성분임이 입증되었다. 또한, 아기 대변의 미생물총 조성에 대한 코호트 연구는 IF 함유 GOS를 섭취한 영아의 대변이 모유를 섭취한 아기와 비슷하다는 것을 나타내었다(Knol et al. J Ped Gastr Nut 2005, 40:36-42).
그러나, 과거 몇 년간, GOS-관련 알레르기의 소수의 매우 드문 사례가 동남 아시아에서 보고되었다. 연구는 GOS에 존재하는 특정 올리고당 구조가 매우 민감한 대상체에서 알레르기 반응을 일으킬 수 있다는 것을 나타내었다(Chiang, W. C. et al. (2012) J. Allergy Clin. Immunol. 130, 1361-1367). Kaneko 등(Biosc. Biotechnol. Biochem. 2014, 78, 100-108)은 바실러스 서큘란스로부터 유래된 베타-갈락토시다제 제제로 락토스를 처리함으로써 생성된 GOS가 알레르기 반응을 유도할 수 있고, 알레르기가 2가지 4당류[Gal β1-4(Gal β1-4 Gal β1-6) Glc, Gal β1-4 Gal β1-4 Gal β1-3 Glc]에 의해 야기된다는 것을 관찰하였다. 이들 GOS 알레르기 사례는 이미 아토피 병력이 있는 대상체에서 발생했으며, 이는 GOS 알레르기에 대한 주된 촉발자로 이 외에 다른 것이 있다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 높은 GOS 함량을 갖고, 프리바이오틱 및 저알레르기 특성의 바람직한 조합을 갖는 GOS 종을 포함하는 신규한 올리고당 조성물의 제조를 목표로 하였다. 특히, 이들은, 예를 들어, 바실러스 서큘란스 베타-갈락토시다제에 의해 얻은 GOS에 비해, 대상체에서 알레르기 반응을 유도하는 감소된 능력과 조합된 향상된 비피더스 활성 특성을 갖는 GOS 제제를 제공하는 것을 추구한다.
이를 위하여, 이들은 효소 GOS 제조에 적용하기 위해 다수의 락트산-생산 박테리아 균주를 선별하기 시작하였다. 그 결과, 특정 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 균주로부터의 베타-갈락토시다제를 확인하고, 특히 (i) 높은 GOS 함량; (ii) 높은 6'-GL 함량; 및 (iii) GOS DP6 이상의 높은 함량을 특징으로 하는, GOS를 포함하는 신규한 올리고당 조성물을 제공하게 되었다. 놀랍게도, 이 조성물(본 명세서에서 "L-GOS"로도 지칭됨)은 강한 비피더스 활성 효과 및 BAT-분석에서 검출 가능한 반응 없음을 나타내는데, 이는 알레르기 유발성이 없거나 매우 낮다는 것을 나타낸다.
따라서, 일 실시형태에서 본 발명은 갈락토-올리고당(GOS)을 포함하는 올리고당 조성물을 제공하며, 여기서:
(i) 갈락토-올리고당(GOS) 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 40 중량%이고;
(ii) 알로락토스 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 10 중량%이며;
(iii) 6'-갈락토실-락토스(6'-GL) 함량은 조성물의 총 GOS의 적어도 30 중량%이고; 그리고
(iv) 총 GOS의 적어도 0.5 중량%는 중합도(DP)가 6 이상이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "GOS"는 1 내지 7개의 갈락토스 분자 및 환원 말단으로서 1개의 글루코스 분자를 포함하는 비분해성 올리고당을 지칭한다. 일부 경우에, 갈락토바이오스 또는 분지된 GOS가 형성될 수 있다. 그러나, 본 출원에서 총 GOS 함량, 또는 건조 물질을 기준으로 한 GOS 함량에 대해 주어진 올리고당의 함량이 언급되는 경우, 알로락토스는 총 GOS 함량에 포함되지 않는다. 이는 알로락토스가 역사적으로, AOAC GOS 결정(AOAC 방법 2001.02)에서 정해진 정량적 HPLC 측정에서 락토스와 구별될 수 없었기 때문이다. 이런 이유로, "총 GOS의 중량으로" 또는 "건조 물질을 기준으로 한 GOS 함량"이라는 표현은 6'-GL을 포함하지만, 알로락토스를 제외하는 GOS-화합물을 지칭한다.
특히, 본 발명의 올리고당 조성물은 트랜스갈락토실화에 의해 얻어진 공지된 GOS 조성물과 비교할 때 상대적으로 높은 GOS 함량을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, GOS 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 42 중량%, 바람직하게는 적어도 44 중량%, 더 바람직하게는 적어도 46 중량% 및 가장 바람직하게는 적어도 48중량%이다. 추가 실시형태에서, GOS 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 50 중량%, 바람직하게는 적어도 55 중량%, 더 바람직하게는 적어도 60 중량%이다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 올리고당 조성물 중의 총 GOS의 적어도 0.5 중량%는 DP가 6 이상이다. 이는 DP6, DP7, DP8 및 DP9, 바람직하게는 적어도 DP6 및/또는 DP7 중 하나 이상을 포함한다. WO2008/041843에 개시된 바와 같이, GOS 5당류(본 명세서에서 DP5로도 지칭됨) 및 GOS 6당류(DP6)는 표적 세포 상에서 Ctx가 이의 천연 수용체 GM1에 결합하는 것을 방지함으로써 효과적인 항-Ctx-B 접착제가 된다. 이로써, DP6의 존재는 콜레라 독소 패밀리 구성원의 접착 및/또는 흡수와 연관되거나 이에 의해 야기된 급성 또는 만성 질환, 특히 설사병의 치료 또는 예방에 기여할 수 있다. 게다가, DP>5 GOS 성분의 존재는 영아 장내 미생물총에서 주요 비피도박테리아 종 중 하나인 비피도박테리아 롱검(Bifidobacteria longum)에 의해 주로 이용되며, 이에 의해 균형 잡힌 장내 비피도박테리아 종의 성장을 자극할 뿐만 아니라(Barboza M et al., (2009) Applied and Environmental Microbiology 75:7319-7325) 영아의 인플루엔자의 발생률 및 발열을 감소시키며(Namba et al. (2010) Biosci Biotechnol Biochem. 74:939-45) 및 호흡기 감염을 감소시킬 것이다(Puccio et al. (2007) Nutrition 23:1-8).
일 양상에서, DP≥6 함량은 적어도 1 중량%, 바람직하게는 적어도 1.5 중량%이다. 예를 들어, DP6+DP7 GOS의 함량은 0.8 내지 3 중량%의 범위, 예컨대 1.0 내지 2.5 중량% 또는 1.1 내지 2.8 중량%이다. DP6+DP7 GOS의 함량이 보다 높은 조성물이 또한 고려된다. 예를 들어, 정제 후에, GOS 중량%는 락토스 및 단당, 예컨대 글루코스 및 갈락토스의 제거로 인해 최대 1.5 내지 2.0배로 증가될 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, DP6+DP7 GOS의 함량은 1.2 내지 6 중량%의 범위, 예컨대 1.2 내지 5 중량% 또는 1.4 내지 4 중량%이다.
알로락토스는 락토스와 유사한 이당류이다. 이는 락토스의 β1-4 결합 대신 β1-6 글리코시드 결합을 통해 연결되는 단당류 D-갈락토스 및 D-글루코스로 이루어진다. 이는 때때로 β-갈락토시다제에 의한 락토스의 트랜스글리코실화로부터 일어날 수 있다. 알로락토스는 이콜라이(E. coli) 및 다수의 다른 장 박테리아에서 락토스 수송 및 분해를 가능하게 하는 lac 오페론의 유도물질이다. 이의 존재는 이용 가능한 글루코스가 없을 때 락토스 및 GOS 이용을 초래하는 베타-갈락토시다제의 유도에 중요하다. 따라서, 본 발명자들은 알로락토스가 GOS의 중요한 성분이라는 것을 추정한다. 본 발명의 조성물의 알로락토스 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 10 중량%이다. 일 실시형태에서, 알로락토스 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 12 중량%, 바람직하게는 적어도 13 중량%이다. 전형적으로, 알로락토스 함량은 GOS에 대해 20 중량% 이하, 예컨대 최대 18, 16 또는 15 중량%이다.
GOS 3당류 6'-갈락토실락토스는 인간 대장에 존재하는 비피도박테리움 또는 락토바실러스의 성장 자극 효과를 갖는 것으로 알려져 있으며, 따라서 영아 및 노인을 위한 식품, 예컨대 변통 개선 또는 설사 예방 등을 위한 식품에 사용된다. 또한, 갈락토실락토스는 대장에서 미생물상 변화를 통한 순조로운 장 활동에 의해 유도되는 것으로 추정되는 대장 거동을 촉진시키고(장의 유익한 박테리아 성장을 자극하는 효과), 이에 의해 피부 노화를 저해하는 피부 노화 속도를 저해하는 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에 제공된 조성물의 6'-갈락토실-락토스(6'-GL) 함량은 조성물의 총 GOS의 적어도 30 중량%이다. 예를 들어, 이는 적어도 32 중량%, 34 중량%; 36 중량% 또는 적어도 38 중량%이다. 바람직하게는, 6'-GL 함량은 조성물의 총 GOS의 적어도 40 중량%, 더 바람직하게는 적어도 42 중량%, 43 중량% 또는 44 중량%이다.
본 명세서에서 위에 열거된 특징 (i) 내지 (iv)의 임의의 바람직한 실시형태는 서로 임의의 조합으로 조합될 수 있음을 이해할 것이다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 앞서 언급한 청구항 중 어느 하나에 따른 올리고당 조성물을 제공하되,
(i) GOS 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 65 중량%, 바람직하게는 적어도 70중량%이고;
(ii) 알로락토스 함량은 조성물의 총 건조 물질의 적어도 12 중량%이며;
(iii) 6'-GL 함량은 조성물의 총 GOS의 적어도 40중량%이고; 그리고
(iv) 총 GOS의 적어도 1중량%는 DP 6 이상이다.
본 발명은 또한 (i) 락토스 공급물을 베타-갈락토시다제(EC 3.2.1.23)와 접촉시키는 단계 및 (ii) 올리고당 합성을 가능하게 하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 올리고당 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이되, 상기 베타-갈락토시다제는 락토바실러스 델브루에키 하위 종 불가리쿠스 또는 락토바실러스 델브루에키 하위 종 락티스로부터 유래된다. 예를 들어, 상기 방법은 베타-갈락토시다제를 이용하여 유청막 투과액 또는 락토스를 효소적 트랜스갈락토실화 처리하는 단계를 포함한다. 트랜스갈락토실화 반응을 위한 조건은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, GOS 합성은 50 내지 60℃에서 목적하는 pH로 사전 조절한 건조 물질 중 적어도 40%(w/w) 락토스의 락토스 현탁액에 선택된 베타-갈락토시다제를 첨가함으로써 적합하게 수행된다. 사용되는 효소 투약량은 락토스 농도, pH 및 온도에 매우 의존적이다. 그러나, 선택된 효소 투약량은 선택된 시간 이내에 락토스 현탁액을 투명하게 하는 데 충분하여야 한다. 전형적으로, 다음의 조건이 적용될 수 있다:
50% 락토스, pH 6.5, 온도 50℃, 및 효소 투약량 3 LU/그램 락토스, 반응 시간 적어도 48시간.
특히, 서열번호 1에 따른 아미노산 서열(도 7a 참조), 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 베타-갈락토시다제는 높은 GOS 함량, 강한 비피더스 활성 특성 및 낮은 알레르기 유발성을 특징으로 하는 본 발명의 올리고당을 제공할 수 있다는 것이 발견되었다. 이 효소는 Vasiljevic 등(문헌[Lait 83 (2003), 453-467])에 의해 사용되는 균주에서 발견된 것과 구조적으로 별개이며, 이는 5- 또는 6당류의 형성이 임의의 이들의 과정에 의해 검출되지 않았다는 사실을 설명할 수 있다.
Vasiljevic 등에 의해 사용되는 효소(DSM20081; 이명: ATCC 11842)는 또한 Nguyen 등(문헌[J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 1713-1721])에 의해 사용되었다. 또한 후자의 문헌에서, 5- 또는 6당류의 형성은 보고되지 않았다.
일 실시형태에서, 베타-갈락토시다제는 서열번호 1에 대해 적어도 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 예를 들어, 효소는 서열번호 1에 대해 적어도 99%, 99.3%, 99.5%, 99.6% 또는 99.8%의 서열 동일성을 나타낸다.
베타-갈락토시다제 활성이 유지된다면(활성은 어느 정도 달라질 수 있음) 아미노산 서열의 차이는 허용 가능하다. 조건이 충족된다면, 아미노산 서열에서 차이의 위치는 특별히 제한되지는 않으며, 복수의 위치에서 차이가 생길 수 있다. 아미노산 서열의 차이는 복수의 위치에서 생길 수 있다. 바람직하게는, 베타-갈락토시다제 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기에서 보존적 아미노산 치환을 야기함으로써 동등한 단백질이 얻어진다. "보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 아미노산 잔기가 유사한 특성의 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미한다.
아미노산 잔기는 다음과 같은 이들의 측쇄에 따라 몇몇 패밀리로 분류된다: 예컨대 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신 및 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판), β-분지된 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린 및 이소류신), 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘). 보존적 아미노산 치환은 바람직하게는 하나의 패밀리 내 아미노산 잔기 간의 치환이다. 일 실시형태에서, 동등한 효소는 최대 6, 바람직하게는 최대 5, 더 바람직하게는 최대 4개의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다.
위에 기재한 아미노산 서열을 갖는 본 발명에서 사용하기 위한 효소는 유전자 조작 기법에 의해 용이하게 제조된다. 예를 들어, 적절한 숙주 세포(예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli))는 본 발명의 효소를 암호화하는 DNA에 의해 형질전환된다. DNA는 서열번호 2에 따른 핵산 분자와 동일하거나 동등한 핵산 서열을 가질 수 있다(도 7b 참조). 본 명세서에서 "동등한 핵산 서열"은 서열번호 2에 따른 핵산 서열과 부분적으로 상이한 핵산 서열을 의미하지만, 이때 서열에 의해 암호화된 단백질의 기능(본 명세서에서, β-갈락토시다제 활성)은 차이에 의해 실질적으로 영향받지 않는다.
단백질 발현 후에, 형질전환체에서 발현된 단백질이 수집되며, 이에 의해 본 발명의 효소를 제조한다. 수집된 단백질은 의도된 용도에 따라 적절하게 처리된다. 재조합 단백질로서 이렇게 얻어진 효소에는 다양한 변형이 가해질 수 있다. 예를 들어, 임의의 펩티드 또는 단백질에 연결된 재조합 단백질로 구성된 효소는 효소를 암호화하는 DNA가 다른 적절한 DNA와 함께 삽입된 벡터를 이용하여 재조합 단백질을 생성함으로써 얻어질 수 있다. 추가로, 당 사슬 및/또는 지질의 첨가, 또는 N- 또는 C-말단의 가공을 야기하기 위한 변형이 수행될 수 있다. 이들 변형은, 예를 들어, 재조합 단백질의 추출, 정제의 단순화, 또는 생물학적 기능의 첨가를 가능하게 한다.
그러나, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 효소는 효소를 내인성으로 발현시키는 미생물에 포함된다. 이는 효소를 단리시키는 수고를 덜기 때문에 가공을 더 저렴하고 용이하게 한다. 미생물, 예를 들어, 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 균주는 전체 세포로서 또는 이의 활성 부분 또는 분획, 바람직하게는 무 세포 추출물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 올리고당 조성물을 제공하는 데 사용하기 위한 갈락토시다제 효소 활성을 생성할 수 있는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 균주는 수탁 번호 DSM20080 하에 기탁되었다.
본 명세서에서 위에 약술한 이유 때문에, 본 발명에 따른 올리고당 조성물은 인간 아기 또는 동물 새끼가 경구 섭취 시 다양한 유익한 효과를 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 전체 소장 및 대장, 및/또는 십이지장, 공장, 회장 및 결장을 포함하는 이의 하나 이상의 부분 전체적으로 이들의 건강-촉진 작용을 제공할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 조성물은 또한 동일 또는 상이한 부분일 수 있는 전체 장관 및/또는 이의 부분 전체적으로 이들의 접착 방지 및/또는 이들의 비피더스 활성 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 올리고당 조성물을 포함하는 영양 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "영양 조성물"은 단백질, 탄수화물, 지질 공급원, 1종 이상의 비타민, 1종 이상의 무기염 등 중에서 하나 이상을 포함한다.
이런 이유로, 또한 단백질, 지질 및/또는 탄수화물 공급원을 갖지 않을 수도 있는 식품 보충물을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 영양 조성물은 고체, 액체, 기체 상태 무엇이든지 영양적 목적을 위해 소화관으로 들어가는 임의의 조성물 또는 제형을 지칭한다. 따라서, 영양 조성물은 식품 항목 또는 음료 항목일 수 있다.
일 실시형태에서, 영양 조성물은 단백질 공급원, 지질 공급원, 탄수화물 공급원 및 본 발명에 따른 올리고당 조성물을 포함한다. 예를 들어, 영양 조성물은 지방, 단백질, 탄수화물, 비타민 및 무기염을 포함하며, 이들 모두는 표적 또는 한정된 (인간) 집단에 대해 유일한 영양 공급원을 제공하기 위한 종류 및 양으로 선택된다. 영양 조성물은 바람직하게는 영아 조제식, 후속 조제식, 성장 우유, 유제품, 씨리얼 및 의학적 영양 제품으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 의학적 영양 제품은 경구로, 예를 들어, 음료, 식품 또는 보충물-유사 방식으로서, 그리고 삽관을 통해 섭취되는 장 조제식으로서 이용 가능하다.
일 양상에서, 영양 조성물은 0 내지 6개월령, 3 내지 6개월령, 6 내지 9개월령 또는 9 내지 12개월령의 영아용으로 조제된 영아 조제식이다. 기본 조제식으로서 사용하기 위한 영아 조제식은 임의의 공지된 바로 먹을 수 있는(ready-to-feed) 영아 조제식, 또는 영아에서 사용하기에 적합한 임의의 영양 조제식을 포함하며, 단, 이러한 조제식은 본 명세서에 규정된 범위 이내의 열량 밀도 및 삼투몰 농도 값을 갖는 유일한 영양 공급원이다. 탄수화물, 지방, 단백질, 무기염 및 비타민의 다수의 상이한 공급원 및 유형은 공지되어 있으며, 본 명세서에 기본 조제식에서 사용될 수 있고, 단, 이러한 영양소는 선택된 조제식에서 첨가된 성분과 양립될 수 있고, 다르게는 영아 조제식에서 사용하기에 적합하다. 본 명세서의 기본 조제식에서 사용하기에 적합한 탄수화물은 단순하거나 복잡한, 락토스-함유 또는 무 락토스, 또는 이들의 조합물일 수 있고, 이의 비제한적 예는 가수분해, 무손상(intact), 천연 및/또는 화학적으로 변형된 옥수수 전분, 말토덱스트린, 글루코스 중합체, 수크로스, 옥수수 시럽, 옥수수 시럽 고체, 벼 또는 감자 유래 탄수화물, 글루코스, 프럭토스, 락토스, 고프럭토스 옥수수 시럽 및 추가로 비분해성 올리고당, 예컨대 프럭토올리고당(FOS) 및 이들의 조합물을 포함한다. 시알릴락토스, 및 GOS를 포함하는 본 발명의 올리고당 조성물의 조합물을 포함하는 영아 조제식이 특히 바람직하다.
본 명세서의 기본 조제식에서 사용하기에 적합한 단백질은 가수분해, 부분적 가수분해 및 비가수분해 또는 무손상 단백질 또는 단백질 공급원을 포함하고, 임의의 공지되었거나 또는 달리 적합한 공급원, 예컨대 유즙(예를 들어, 카세인, 유청, 인유 단백질), 동물(예를 들어, 고기, 생선), 곡물(예를 들어, 벼, 옥수수), 식물(예를 들어, 대두) 또는 이들의 조합물로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 유청 단백질 a-락트알부민(a-LA) 및 카세인 마크로펩티드(casein macropeptide: CMP)를 포함하는 유청 분획을 포함하되, a-LA와 CMP 사이의 중량비는 2 미만이다.
본 명세서에서 사용하기 위한 단백질은 또한 영아 조제식에서 사용하기 위한 것으로 공지되거나 달리 적합한 유리 아미노산을 포함하거나, 이들로 전체적으로 또는 부분적으로 대체될 수 있고, 이의 비제한적 예는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 카르니틴, 아스파르트산, 시스틴, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 타우린, 트레오닌, 트립토판, 타우린, 타이로신, 발린, 및 이들의 조합을 포함한다. 이들 아미노산은 가장 전형적으로는 이들의 L-형태로 사용되지만, 영양적으로 동등할 때에 대응하는 D-이성질체가 또한 사용될 수 있다. 라세미 또는 이성질체 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에서 지질 공급원은 (아동의) 영양 제품에서 사용하는 데 적합한 임의의 유형의 지질 또는 지질의 조합물일 수 있다. 적합한 지질 공급원의 예는 트리, 디 및 모노글리세리드, 포스포지질, 스핑고지질, 지방산 및 이들의 에스테르 또는 염이다. 지질은 동물, 식물, 미생물 또는 합성 기원을 가질 수 있다. 다불포화 지방산(PUFA), 예컨대 감마 리놀렌산(GLA), 디호모 감마 리놀렌산(DHGLA), 아라키돈산(AA), 스테아리돈산(SA), 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA), 도코사펜타엔산(DPA) 및 접합 리놀레산(CLA)에 특히 관심이 있다. CLA는 아동에서의 습진 및 호흡기 질환에 대한 보호에 중요하다. 이는 특히 CLA의 시스-9, 트랜스-11 및 시스-12 이성질체를 수반한다. 적합한 식물성 지질 공급원의 예는 해바라기유, 고 올레산 해바라기유, 코코넛유, 팜유, 팜커넬유, 대두유 등을 포함한다. 동물 유래의 적합한 지질 공급원의 예는 유지방, 예를 들어, 무수 유지방(AMF), 크림 등을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 유지방과 식물 기원 지질의 조합물이 사용된다.
영양 조성물에서 사용하기에 적합한 비타민 및 유사한 다른 성분은 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 티아민, 리보플라빈, 피리독신, 비타민 B12, 니아신, 엽산, 판토텐산, 비오틴, 비타민 C, 콜린, 이노시톨, 이들의 염 및 유도체, 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 무기염은 칼슘, 인, 마그네슘, 철, 아연, 망간, 구리, 크롬, 요오드, 나트륨, 칼륨, 염화물 및 이들의 조합을 포함한다.
놀랍게도 본 발명의 올리고당 조성물의 낮은 알레르기 유발성을 고려하여, 본 발명은 또한 (i) 본 발명의 올리고당 조성물 및 (ii) 저알레르기성 또는 비-알레르기성 단백질 공급원, 바람직하게는 비-알레르기성 유즙 단백질 가수분해물, 유리 아미노산, 프로바이오틱스(probiotics), 지질 공급원 및 탄수화물, 예컨대 락토스, 사카로스, 전분 또는 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가적인 성분을 포함하는, 영양 조성물을 제공한다.
저알레르기성 또는 비-알레르기성 단백질 공급원은, 특히 영아 조제식에서의 사용이 당업계에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 적어도 1종의 추가적인 저알레르기성 또는 비-알레르기성 성분은 비-알레르기성 단백질 가수분해물, 및 알레르기 단백질, 저알레르기 단백질 공급원 및 가수분해된 유청 단백질이 실질적으로 없는 가수분해물로부터 선택된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 비-알레르기성 가수분해물 및 알레르기 단백질이 실질적으로 없는 가수분해물이라는 용어는 상호 호환 가능하다. 이들은 알레르기 반응을 유도하는 일 없이 식이 단백질, 더 구체적으로는 우유 단백질에 대해 불내성을 갖는 영야에게 투여될 수 있는 단백질 가수분해물을 지칭한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,039,532호는 알파-락트알부민, 베타-락토글로불린, 혈청 알부민 및 면역글로불린으로 이루어진 알레르겐이 제거된 가수분해된 유청 단백질 물질을 개시하되, 가수분해된 물질이 알레르기 단백질 및 단백질 기원의 알레르겐이 실질적으로 없도록 가수분해된 알레르겐을 포함하는 가수분해된 단백질 물질은 분자량이 10,000 Da을 초과하지 않는 가수분해 잔여물 형태이다. 일 실시형태에서, 최대 3000 Da의 펩티드를 갖는 저-알레르기 카세인 가수분해물이 포함된다.
특정 실시형태에서, 조성물은 알레르기, 특히 우유 단백질 알레르기(CMA)가 발생할 위험이 있는 대상체, 특히 영아에게 투여하기 위한 것이다. 알레르기가 발생할 위험이 있는 것으로 알려진 영아는 아토피 장애(예를 들어, 습진) 및/또는 알레르기, 가장 구체적으로는 CMA를 앓고 있거나 앓았던 적어도 한 명의 부모로부터 태어난 영아를 포함한다.
본 명세서에 제공된 올리고당 조성물의 예상치 못한 비피더스 활성 특성을 고려하면, 본 발명은 또한 장내 미생물총 균형 및 건강을 촉진시키는 방법에서 본 발명에 따른 올리고당 조성물 또는 영양 조성물의 용도에 관한 것이며, 상기 방법은 유효량의 올리고당 조성물 또는 영양 조성물을 이러한 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이런 이유로, 장내 미생물총 균형 및 건강을 촉진시키는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 유효량의 본 발명에 따른 올리고당 조성물 또는 영양 조성물을 이러한 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 장내 미생물총 및 건강을 촉진시키는 것은 장관 내 비피더스 활성 미생물을 향상시키는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 장내 미생물총 균형 및 건강을 촉진시키는 것은 위장관 장애를 야기하는 다양한 의학적 치료에 대한 환자 내약성을 개선시키는 것을 포함하며, 이러한 치료는 방사선요법, 화학요법, 위장 수술, 마취, 항생제, 진통제 약물의 투여, 또는 설사 치료를 포함한다.
본 발명은 또한 프리바이오틱 조성물로서, 바람직하게는 비피더스 활성 조성물로서 본 발명에 따른 올리고당 조성물 또는 영양 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 추가적인 실시형태는 본 발명에 따른 올리고당 조성물을 지방, 탄수화물, 무기염, 미량 원소 및 비타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분에 첨가하는 단계를 포함하는, 비피더스 활성의 영아 또는 식이성 식품을 생산하는 공정에 관한 것이다.
조성물은, 본 발명의 비피더스 활성 올리고당 조성물에 추가로, 추가적인 프리바이오틱뿐만 아니라 프리바이오틱 화합물, 특히 섬유질 및 단백질을 함유할 수 있다. 섬유질은 특히 가용성 및 불용성의 비분해성 다당류, 예컨대 비-전분 다당류(셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 기타 유형), 저항성 전분, 검 등을 포함한다. 본 발명의 조성물은 보통 가용성인 다른 비분해성 올리고당, 예컨대 프럭토-올리고당(FOS), 자일로-올리고당(XOS) 및 만노-올리고당을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 이들 다른 올리고당은 바람직하게는, 예를 들어, 이눌린(FOS)의 경우에는 직접 추출에 의해, 또는, 예를 들어, 이눌린 및 레반(FOS), 및 자일란 및 기타 헤미셀룰로스 구성성분(XOS)의 경우에는 적합한 다당류 또는 다당류 혼합물의 가수분해에 의해, 천연 공급원으로부터 얻는다. 다른 올리고당의 양은, 예를 들어, 비분해 올리고당의 총량에 대해 10% 내지 400%로 다를 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 인유 올리고당(HMO)을 더 포함한다. HMO는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 2'-FL(2'-푸코실 락토스), 3-FL(3-푸코실 락토스), 3'-SL(3'-시알릴락토스), 6'-SL(6'-시알릴 락토스), LNT(락토-N-테트라오스) 및 LnNt(락토-N-네오테트라오스)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HMO를 포함한다.
조성물은 유리하게는 또한, 예를 들어, 개체당 1일 용량으로 적어도 107 개의 살아있는 미생물 수준으로 프로바이오틱 유기체를 함유할 수 있다. 프로바이오틱 박테리아는 당업계에 공지되어 있다. 적합하게는, 프로바이오틱은 조성물의 건조 중량 g당 10exp2 내지 10exp13 cfu, 적합하게는 10exp5 내지 10exp12 cfu/g, 가장 적합하게는 10exp7 내지 10exp10 cfu/g의 양으로 본 조성물에 포함된다. 바람직하게는, 프로바이오틱 박테리아는 유전자 변형되지 않는다. 적합한 프로바이오틱 박테리아는 비피도박테리아 속(예를 들어 비피도박테리움 브레브(B. breve), 비피도박테리아 롱검, 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum)), 락토바실러스 속(예를 들어, 락토바실러스 아시도필루스(L. Acidophilus), 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei), 락토바실러스 존소니(L. johnsonii), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 레우테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 락티스(L. lactis)) 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 속(예를 들어, 스트렙토코커스 써모필루스(S. thermophilus))의 박테리아를 포함한다. 비피도박테리움 브레브 및 비피도박테리아 롱검은 특히 적합한 프로바이오틱스이다. 적합한 비피도박테리움 브레브 균주는, 예를 들어, 건강한 인유-섭취 영아의 대변으로부터 단리될 수 있다. 영아 조제식에서 사용하기 위한 다른 바람직한 프로바이오틱스는 초기 비피더스 활성 장 미생물총, 예를 들어, 유럽 특허 제1974734호에 개시된 균주의 발생을 촉진할 수 있는 것을 포함한다.
도 1: (패널 A) 기준 GOS + 6'-GL 및 (패널 B) 본 발명의 대표적인 L-GOS 조성물의 HPLC 크로마토그램. 피크의 확인을 위해, 표 1을 참조한다.
도 2: 균주 RFC-219, RFC-227, RFC-302의 전체 세포에 의해 합성된 GOS Dionex 패턴의 비교.
도 3: 락토바실러스 균주 RFC227의 무세포 추출물 및 전체 세포를 이용하는 것에 의한 GOS 프로파일의 비교.
도 4: MRS 배지에서 유일한 탄소 공급원으로서 본 발명의 L-GOS, 당 대조군 또는 기준 GOS1 및 2를 이용하는 5종의 대변 비피도박테리아 성장의 비교. 패널 A: 7시간의 발효 후. 패널 B: 24시간의 발효 후.
도 5: 호염기구 활성화 마커 CD203c(MFl = 평균 형광)의 발현에 의해 측정한 바와 같은 4명의 시험 대상체(a 내지 d)에서의 호염기구 활성화. 상이한 농도의 시험 조성물(L-GOS) 및 기준 조성물(vGOS)을 연구에 포함시켰다. 상세한 설명에 대해 실시예 5를 참조한다.
도 6: 호염기구 활성화 마커 CD36(MFl = 평균 형광)의 발현에 의해 측정한 바와 같은 4명의 시험 대상체(a 내지 d)에서의 호염기구 활성화. 상이한 농도의 시험 조성물(L-GOS) 및 기준 조성물(vGOS)을 연구에 포함시켰다. 상세한 설명에 대해 실시예 5를 참조한다.
도 7: 본 발명에서 사용하기 위한 예시적인 베타-갈락토시다제 효소의 (a) 아미노산 서열(서열번호 1) 및 (b) 뉴클레오티드 서열(서열번호 2).
실험 부문
실시예 1: 락토바실러스로부터의 베타-갈락토시다제 효소의 제조
3종의 선택된 내부 락토바실러스 시험 균주인 RFC 219, RFC 227 및 RFC 302를 MRS 배지에 접종하고, 대략 1.0의 600 ㎚에서의 광학밀도(O.D.600)로 성장시키고, 후속적으로 접종물을 신선한 MRS 배지에서 0.01 내지 0.02의 O.D.600으로 희석시키고, 호기성 조건 하에 16 내지 32시간의 발효 후 37℃에서 대략 1.0 내지 1.5의 OD로 성장시켰다.
6000 rpm 및 18℃에서 10분 동안 발효 브로스의 원심분리에 의해 전체 세포를 채취하였다. 발효 브로스를 디캔팅(decanting)한 후에, 임의의 불용성 잔사를 제거할 목적으로 탈염수 중에서 전체 세포를 반복적으로 분산시키고 원심분리함으로써 2회의 세척 단계를 수행하였다.
얻어진 습식 전체 세포를 10%(w/w)의 비로 10 mM 시트르산나트륨 완충제, pH 6.5에서 분산시켰다. GOS 합성을 위해 전체 세포 분산물을 직접 사용하거나(전체 세포), 최대 속도로 0.1 ㎜ 유리 비드를 이용하는 미니-비드 비터(mini-bead beater)(Biospec Product)를 이용함으로써 붕괴시켰다(무세포 추출물).
균질화 공정 동안의 열 생성으로 인해, 균질화 공정은 60초 후에 중단될 필요가 있다. 후속적으로, 전체 세포의 샘플을 제2 라운드 동안 균질화 공정을 반복하기 전에 빙수욕에 침지시킴으로써 0℃로 냉각시켰다.
제2 라운드 균질화 후에 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하고, 임의의 추가적인 처리 없이 GOS 합성을 위해 무세포 추출물(상청액)을 직접 사용하였다.
실시예 2: 효소적 GOS 합성
다음의 조건 하에 GOS 합성을 수행하였다:
비교를 용이하게 하기 위해 27 그램의 락토스 결정(28.42 그램의 lactochem®, 의약품 등급, 95% 락토스 함유)을 (10 mM 시트르산나트륨 완충제 중) 실시예 1의 전체 세포 분산물로서 베타-갈락토시다제 또는 동일한 양의 실시예 1의 전체 세포 분산물로부터 유래된 무세포 추출물을 함유하는 27 그램의 10 mM 시트르산염 완충제, pH 6.5에 첨가하였다. 자기 교반기를 이용하여 반응 혼합물을 교반시키고, 수욕에 의해 온도가 50℃가 되도록 조절하였다. 반응 시간은 65시간이었다.
필요한 효소 활성의 양을, 락토스 슬러리로부터 시작하여 위와 동일한 조건 하에, 위의 척도의 1/4에서 반응 혼합물의 정화 시간에 의해 분석에서 미리 결정한다. 후속적으로, 기준 효소 Biolacta N5(Amano)에 기반하여 제조한 효소 제제의 활성을 다음의 식을 이용하여 추정하였다:
효소 투약량(단위/그램 락토스)=36.77*(정화 시간(hr)^-0.549.
전체 세포에 대해, 효소 투약량을 RFC227에 대해 2.95 LU/그램 락토스, RFC219에 대해 3.3 LU/그램 및 RFC302에 대해 4.4 LU/그램 락토스가 되는 것으로 계산하였다. 당업자에 의해 공지된 바와 같이, 반응을 촉진시키기 위해 반응의 임의의 순간에 더 많은 효소를 첨가함으로써 반응 시간을 단축시킬 수 있다.
실시예 3: GOS 조성물의 특성규명
분석 CarboPac PA-1 칼럼 상에서 Dionex HPAEC-PAD 크로마토그래피(문헌[van Leeuwen et al., Carbohydrate Research 2014, 400:59-73])에 의해 상이한 올리고당 함량을 분석하였다. GOS 함량을 피크 백분율로 추정하였다. 이 방법의 타당성을 상업적 Vivinal® GOS의 기준 조성물에 의해 확인하였다(표 2).
기준 GOS에 6'-GL 표준을 소량 첨가(spiking)함으로써 6'-GL 성분을 확인하였다. 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 6'-GL은 피크 6이다. 동일한 방법에서, L-GOS에서 피크 6은 또한 6'-GL이 되는 것을 확인하였다(도 1의 B 참조).
L-GOS에서 6'-GL 함량을 표 1에 나타낸 바와 같이 총 GOS(알로락토스 제외)의 6'-GL의 피크 백분율에 의해 계산하였다.
Figure pct00001
GOS 중합도(DP)를 결정하기 위해, 대략 DP18(중합도)까지 올리고당에 대해 고분해능을 갖는 Phenomenex로부터의 Rezex RSO 칼럼에 대한 이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 올리고당을 분리하였다. 칼럼 상에서 분리 후에, RI 검출기를 이용하여 상이한 성분을 측정하였다. 이 검출기는 굴절률에 기반하여 화합물을 검출할 수 있다. 각각의 피크 백분율에 의해 개개 DP 백분율을 계산한다. 표 2는 기준 조성물 Vivinal® GOS에 비해 본 발명에 따른 L-GOS 조성물의 DP 조성물을 나타낸다.
Figure pct00002
3가지 전체 세포에 의해 얻은 GOS 프로파일을 도 2에 도시하며, 이는 3가지 효소 제제 각각에 의해 합성된 GOS 프로파일이 사실상 동일하다는 것을 나타내고, 이들 3가지 락토바실러스 균주와 연관된 베타-갈락토시다제가 기능적으로 동일하다는 것을 시사한다.
이런 유사성을 고려하여, 50%(w/w)의 락토스 농도를 제외하고 위에서 언급한 것과 동일한 조건 하에서 사용한 3.3 LU/그램 락토스의 효소 투약량으로 균주 RFC219 단독의 전체 세포 및 무세포 추출물을 이용하여 후속 실험을 수행하였다. 균주 RFC219는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스이다. RFC219로부터 얻은 베타-갈락토시다제는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 가진다. 29시간, 36시간, 53시간 및 65시간의 체류 시간에 2.0 ㎖ 샘플의 분취액을 취하고, 1.5% 1.5 M HCl(v/v)의 첨가에 의해 비활성화시켰다. GOS 조성물 및 핑거프린트(fingerprint) 프로파일을 분석하고, 표 3 및 도 3에 요약한다. 예상한 바와 같이, 전체 세포 또는 단리된 무세포 효소를 이용하는 것에 의한 GOS 프로파일은 완전히 매칭되는데, 이는 효소 역학이 동일하다는 것을 시사한다.
Figure pct00003
실시예 4: GOS 조성물의 비피더스 활성 효과
Rodriguez-Colinas 등(문헌[2013, Appl. Microbiol. And Biotechn. Vol. 97, pp 5743-5752])의 공개된 방법을 이용하여 단당을 제거함으로써 GOS의 부분적 정제를 수행하였다.
확립된 시험관내 모델에서 아기 대변을 이용하여 표 2에 나타낸 조성을 갖는 부분적으로 정제된 GOS 제제("L-GOS 시험 조성물")를 이의 비피더스 활성 효과에 대해 시험하였다.
Figure pct00004
인간에서 회맹판을 통과하는 물질을 자극할 수 있는 TIM-2 모델(문헌[TNO in vitro model of the colon (TIM-2), Venema K. (2015)], 문헌[The TNO In Vitro Model of the Colon (TIM-2). In: Verhoeckx K. et al. (eds), The Impact of Food Bioactives on Health. Springer, Cham])을 이용하여 GOS의 비피더스 활성 효과를 평가하였다. 모의 회장 유출 배지(simulated ileal efflux medium: SIEM)를 함유하는 식품 주사기를 통해 시스템 내로 미생물총을 공급하였다.
본 발명을 위해 이 모델에서 사용한 미생물총을 6명의 건강한 영아로부터의 대변 공여를 통해 확립하였다(1 내지 6개월령, 공여 전 적어도 1개월 동안 우유를 섭취하고, 항생제의 사용이 없었음). 또한, 모든 아기들은 대부분 우유를 섭취하였다. 아기 4의 대변은 임의의 검출 가능한 비피더스 활성을 함유하지 않았기 때문에, 이 샘플을 분석으로부터 회수하였다.
사용한 표준 배지는 다음의 성분(단위: g)을 함유하였다: 펙틴 (9.4), 자일란 (9.4), 아라비노갈락탄 (9.4), 아밀로펙틴 (9.4), 카세인 (47.0), 전분 (78.4), Tween 80 (34.0), 박토 펩톤 (47.0) 및 우담즙(ox bile) (0.8). 투석 액체는 (리터당): 2.5 g K2HPO4.3H2O, 4.5 g NaCl, 0.005 g FeSO4.7H2O, 0.5 g MgSO4.7H2O, 0.45 g CaCl2.2H2O, 0.05 g 담즙 및 0.4 g 시스테인.HCl뿐만 아니라, (리터당) 1 ㎎ 메나디온, 2 ㎎ D-바이오틴, 0.5 ㎎ 비타민 B12, 10 ㎎ 판토텐산, 5 ㎎ 니코틴아마이드, 5 ㎎ p-아미노벤조산 및 4 ㎎ 티아민을 함유하는 1 ㎖의 비타민 혼합물도 함유하였다.
비피더스 활성 효과를 결정하기 위해, 총 탄수화물을 당 대조군, 본 발명의 L-GOS 시험 조성물 또는 기준 조성물 GOS1 및 GOS2로 동등하게 대체하였다. 당 대조군은 단당(갈락토스 및 글루코스를 대응하는 정제된 GOS 제제에 존재하는 락토스와 합한 것)의 당 조성물과 등가인 조성물이다. GOS1 및 GOS2는 각각 비피도박테리아 롱검으로부터의 베타-갈락토시다제로부터 제조한 GOS 및 상업적 제품 Vivinal®GOS를 지칭한다.
7시간(도 4의 A) 및 24시간(도 4의 B) 후에 비피도박테리움 성장 속도를 분석하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 L-GOS 조성물은 당 대조군 또는 기준 조성물 GOS1 및 2와 비교할 때 5명 아기 대변의 성장을 가장 효과적으로 자극할 수 있다.
실시예 5: 본 발명의 올리고당 조성물의 저알레르기성
본 실시예는 공지된 갈락토-올리고당 알레르기를 갖는 4명의 인간 대상체에서의 본 발명의 올리고당 조성물의 감소된 알레르기 유발성을 입증한다. 균주 RFC227 무세포 추출물로부터의 베타 갈락토시다제 및 바실러스 서큘란스 효소(vGOS)를 이용하여 얻은 상업적 GOS 기준 제제를 이용하여 트랜스갈락토실화에 의해 얻은 L-GOS를 시험에 포함시켰다.
Soh 등(Allergy 2015, 70, 1020-3)에 의해 기재된 바와 같이, 싱가포르 아토피 집단에서의 GOS-알레르기 유병률에 대해 이미 연구한 코호트로부터 자격이 있는 대상체를 선택하였다.
환자 혈액 샘플에 대해 호염기구 활성화 검사(BAT)를 수행하였다. 이를 위하여, 헤파린 처리한 말초 혈액 분취액(100 ㎕)을 37℃에서 5분 동안 미리 인큐베이션시키고, 이어서, 100 ㎕의 PBS(음성 대조군), 항-IgE 항체(양성 대조군, G7-18; BD Biosciences, 캘리포니아주 산호세에 소재) 또는 희석시킨 GOS 샘플과 함께 15분 동안(37℃) 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 세포를 PBS-EDTA(20 m㏖/ℓ)에서 세척하고, 이어서, 피코에리트린-표지 항-인간 IgE(Ige21; eBioscience, 캘리포니아주 산호세에 소재), 바이오틴-표지된 항-인간 CD203c(NP4D6; BioLegend, 캘리포니아주 산호세에 소재), 및 플루오레세인 아이소티오사이아네이트-표지된 항-인간 CD63(MEM-259, BioLegend) mAb와 함께 20분 동안 48℃에서 인큐베이션시켰다. CD203c 및 CD63의 발현은 둘 다 호염기구 활성화를 위한 마커이다.
1% BSA/PBS로 세포를 세척한 후에, 알로피코사이아닌-접합 스트렙타비딘(BD Biosciences)을 첨가하고, 15분 동안 48℃에서 인큐베이션시켰다. 이후에, 샘플에 2 ㎖의 FACS 용해 용액(BD Biosciences)을 이용하여 적혈구 용해를 실시하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 1% BSA/PBS에서 재현탁시키고, FACSCalibur(BD Biosciences)에 의해 분석하였다. 측방 산란(side-scatter) 특징 및 IgE 발현(IgEhigh)에 기반하여 호염기구를 검출하였다.
기준 GOS 조성물과 대조적으로, 활성화 마커 CD203c(도 5) 및 CD63(도 6)의 발현이 매우 낮거나 사실상 없는 것으로 입증되는 바와 같이, 본 발명에서 사용한 균주의 락토바실러스 효소에 의해 제조한 L-GOS는 BAT 검사에서 양성 반응을 일으키지 않았다.
실시예 6: 락토바실러스 효소의 유전자 및 단백질 서열 결정
3종의 락토바실러스 델브레우키 균주에 의해 생성된 β-갈락토시다제를 암호화하는 유전자 서열을 결정하기 위한 시도를 하였다.
대략 1.0의 OD에 도달하도록 위에서 언급한 바와 같이 MRS 액체 배지에서 박테리아를 배양하였다. 이런 바이오매스를 이용하여 DNA 추출을 직접 수행하였다. 사용한 DNA 추출 프로토콜은 주로 Zymo Research Bacterial/Fungal DNA microPrep 키트 D6007의 사용에 기반한다. 얻은 DNA 샘플을 Illumina HiSeq2500에 의해 분석하였다.
FASTQ 서열 판독의 품질 분석
Illumina HiSeq2500 시스템을 이용하여 짝지어진 말단 서열 판독을 생성하였다. bcl2fastq2 버전 2.18을 이용하여 FASTQ 서열 파일을 생성하였다. 초기 품질 평가는 Illumina Chastity 필터링을 통과하는 데이터에 기반하였다. 후속적으로, 내부 필터링 프로토콜을 이용하여 PhiX 대조군 신호를 함유하는 판독을 제거하였다. 또한, (부분적) 어댑터를 함유하는 판독을 (최소 판독 길이 50bp까지) 클리핑하였다(clipped). 제2 품질 평가는 FASTQC 품질 관리 툴 버전 0.11.5를 이용하여 남아있는 판독에 기반하였다.
드 노보 조립체
Figure pct00005
조립체
SPAdes 버전 3.10 게놈 조립체 툴키트에서 판독 오류 수정 모듈 BayesHammer를 이용하여 FASTQ 서열 품질이 향상되었다(Bankevich A et. Al. (2012) J Comput Biol. 19:455-477). SPAdes를 이용하여 고품질 판독을 콘틱(contig)에 조립하였다. Illumina 데이터와 콘틱 서열 간의 오조립(Misassembly) 및 뉴클레오티드 불일치는 Pilon(Walker BJ et. al. (2014) PLOS ONE 9(11): e112963) 버전 1.21을 이용하여 수정한다.
Figure pct00006
스캐폴딩
콘틱을 연결하고 스캐폴드에 위치시켰고, 여기서 짝지어진 말단 및/또는 짝짓는 쌍(matepair) 판독 사이의 삽입 크기를 이용하여 이들 사이의 배향, 순서 및 거리를 추정하였다. SSPACE Premium Scaffolder 버전 2.3을 이용하여 분석을 수행하였다(Boetzer et. al, 2011).
Figure pct00007
자동화된 갭 폐쇄
스캐폴드 내의 갭 영역은 (부분적으로) GapFiller 버전 1.10(Boetzer and Pirovano, 2012)을 이용하여 자동화된 방식으로 폐쇄한다. 상기 방법은 짝지어진-말단 및/또는 짝짓는 쌍 판독 사이의 삽입 크기를 이용한다.
DNA 주석 툴을 이용하여 얻어진 게놈 서열의 주석을 첨가하였다: "ClustalW"(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), 오프라인 패키지("sms2", http://www.bioinformatics.org/sms2/에서 다운로드함)에서 DNA의 단백질로의 전환을 행하였다.
얻어진 대표적인 β-갈락토시다제의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 각각 도 7a 및 도 7b에 나타낸다.
<110> FrieslandCampina Nederland B.V. <120> Bifidogenic GOS compositions and methods for providing the same <130> P1604EP00 <160> 2 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 1128 <212> PRT <213> Lactobacillus delbrueckii <400> 1 Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu 1 5 10 15 Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro 20 25 30 His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly 35 40 45 Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asp Trp Leu Ile Asp Tyr 50 55 60 Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Val Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp 65 70 75 80 Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln Tyr Pro Trp Asp Gly 100 105 110 Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Ile Pro Ser Lys Asn Pro Leu Ala 115 120 125 Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Phe Trp Asp Lys Glu 130 135 140 Val Ser Leu Lys Phe Asp Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu 145 150 155 160 Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu 165 170 175 Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Asn Asn Arg Leu Ala Val 180 185 190 Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe 195 200 205 Trp Arg Met Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Gln Ala Lys Pro 210 215 220 Arg Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn 225 230 235 240 Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu 245 250 255 Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu 260 265 270 Val Ala Glu Lys Leu Gly Pro Ile Arg Ser Glu Gln Leu Glu Phe Thr 275 280 285 Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu 290 295 300 Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val 305 310 315 320 Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile 325 330 335 Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Ala Asn Arg His 340 345 350 Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Ile 355 360 365 Trp Asp Ile Lys Thr Met Lys Arg Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys 370 375 380 Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr 385 390 395 400 Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp 405 410 415 Glu Lys Val Gly Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp 420 425 430 Asp Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met 435 440 445 Ala Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn 450 455 460 Glu Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg 465 470 475 480 Lys Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn 485 490 495 Arg Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro 500 505 510 Ala Lys Val Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Pro Ala Lys Pro Phe 515 520 525 Ile Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Lys Ala Asp Pro 530 535 540 Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn Arg Lys Phe Asp 545 550 555 560 Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro Ala Lys Val Ile 565 570 575 Glu Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Pro Ala Lys Pro Phe Ile Ser Val Glu 580 585 590 Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Lys Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln 595 600 605 His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn Arg Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln 610 615 620 Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro Ala Lys Val Ile Glu Glu Tyr Leu 625 630 635 640 Thr Asn Lys Pro Ala Lys Pro Phe Ile Ser Val Glu Tyr Ala His Ala 645 650 655 Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu Ala Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys 660 665 670 Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly 675 680 685 Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg 690 695 700 Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg 705 710 715 720 Thr Glu Ser Pro Lys Leu Ala Asn Val Lys Ala Leu Tyr Ala Asn Leu 725 730 735 Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln Leu Phe Leu Lys Asn Asp Asn Leu 740 745 750 Phe Thr Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr Phe Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp 755 760 765 Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Arg Pro Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro 770 775 780 Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu Pro Trp Pro Glu Val Ala Asp Glu 785 790 795 800 Lys Gly Glu Val Val Tyr Arg Val Thr Ala His Leu Lys Glu Asp Leu 805 810 815 Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr Val Ala Glu Ala Glu Glu Val Ala 820 825 830 Gln Lys Leu Pro Glu Phe Lys Pro Glu Gly Arg Pro Asp Leu Val Asp 835 840 845 Ser Asp Tyr Asn Leu Gly Leu Lys Gly Asn Asn Phe Gln Ile Leu Phe 850 855 860 Ser Lys Val Lys Gly Trp Pro Val Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Arg Glu 865 870 875 880 Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe Thr Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp 885 890 895 Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly Tyr Asp Leu Ala Arg Trp Glu Asn 900 905 910 Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Lys Asp Ile Ser Cys Glu Val Lys Glu 915 920 925 Asp Ser Val Leu Val Lys Thr Ala Phe Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys 930 935 940 Gly Asp Leu Thr Val Thr Tyr Glu Val Asp Gly Arg Gly Lys Ile Ala 945 950 955 960 Val Thr Ala Asp Phe Pro Gly Ala Glu Glu Ala Gly Leu Leu Pro Ala 965 970 975 Phe Gly Leu Asn Leu Ala Leu Pro Lys Glu Leu Thr Asp Tyr Arg Tyr 980 985 990 Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser Tyr Pro Asp Arg Leu Glu Gly Asn 995 1000 1005 Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Ala Val Lys Lys Asn Phe Ser Pro Tyr 1010 1015 1020 Leu Arg Pro Gln Glu Thr Gly Asn Arg Ser Lys Val Arg Trp Tyr Gln 1025 1030 1035 1040 Leu Phe Asp Glu Lys Gly Gly Leu Glu Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp 1045 1050 1055 Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr Ser Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala 1060 1065 1070 Asp His Ala Phe Glu Leu Thr Asn Asn Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu 1075 1080 1085 Ser Ala Gln Met Gly Val Gly Gly Asp Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val 1090 1095 1100 His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala Gln Lys Ala Arg Gln Leu Arg Leu 1105 1110 1115 1120 Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys 1125 <210> 2 <211> 3027 <212> DNA <213> Lactobacillus delbrueckii <400> 2 ttattttagt aaaaggggct gaatcaccag gcggagctgg cgggcttttt gagcatccag 60 gcagaattcc gggtggacct tctgccccca ggagtcatcc ccgccgaccc ccatctgggc 120 gcttaaggct ctaacccaag tgtaattgtt agtcagttca aaagcgtggt ccgctgcttc 180 aatttgggcg gcagaatatg gcaaagcaga caagttcaag tctgccccat tggccgtaaa 240 ttccaagccg cccttttcat caaagagctg gtaccagcga accttgctcc ggttgcccgt 300 ttcctgcgga cgcaggtatg ggctaaagtt cttttttacc gctccctggt agatgcccag 360 gtaattacct tccaagcggt ctgggtagct ctcattaggt cccagaccat agtagcggta 420 atcggtcagt tcttttggca gggccaggtt caagccaaag gctggcaaga ggccggcttc 480 ttccgcgcct gggaagtcag ctgttacagc aatcttgccc cgtccatcga cttcataggt 540 cacggttaaa tcacccttta aggcgacagg caacgtaaag gcagtcttga ccaaaacgga 600 gtcttccttg acctcgcagc tgatgtcttt caagcgggca tacttgccgg cattttccca 660 ccgggccaga tcatagccgt aaccagctcc ccggtcgttg tccgtcaggg cccgccagaa 720 ggtaaattcc ggcagccgct tcaagtattc cctaccggca tacttgaggg aaaccggcca 780 gcccttgacc ttggagaaga gaatttggaa gttatttcct ttcaggccta ggttgtagtc 840 ggaatcaact aaatctggcc gcccttccgg cttaaattcc ggcagctttt gagctacttc 900 ttctgcttca gccacagtga agccctcatc cgcccaaggc aagtcttctt ttaagtgggc 960 cgttacccgg tagacgacct ctcctttttc atcagcgact tccggccaag gcagggcaaa 1020 ggtcccggat tcgccaggct ccaggccaaa ggtcagaggc cggctctggt aggtcaactt 1080 gccatcgacc aaaagactag tcaagaagta gtaagatgag ctgttggtaa ataaattgtc 1140 gtttttgagg aagagctgcc catcttttac ttctaactta aggttggcgt aaagggcctt 1200 gacattagcc agtttcggcg attcagtccg gtcagcaaag accaggccgt tcccgcagaa 1260 ttcatagtcg gttggccggt catcgaagtc gcccccataa agcaggtgcc cgtctttttc 1320 cagtccttgg tcaatccagt cccagatgaa gccgccctgg tagtgggggt atttttccag 1380 ggccgtgtag gcggccaggt caccgacgga gttgcccatg gcgtgagcgt attcaactga 1440 gataaatggc ttggctggtt tattggtcaa gtattcttca attaccttgg ccggagcata 1500 catccggctt tcaatctggg tggcgtcgtc aaacttccgg ttgtgggtca ccccttcata 1560 gtgctgaacc cgggtcggat cagccttccg gacgtaatca gccatttggg caaagacagt 1620 gccggcgtaa gactcattgc ctaaagacca gatcaggatt gaagcatggt tcttgtcccg 1680 agccatcatg ttcttcaccc gggataagct ggctcccagc caatgctggt catcgcctgg 1740 aacattgaag ctaggatctt cgtgcccccc cactttttcc caggtgccgt ggctttccag 1800 gttagcttca tcaatgacgt aaaggccgta cttgtcacag agccggtaaa agagggactg 1860 gttcgggtag tgagagcagc ggacagcatt gatgttgctt cgcttcatgg tcttgatatc 1920 ccagatcata tcctcttctg tgatagcccg gcccaactta ctgtcaaatt cgtgccggtt 1980 ggcccccttg aagacgatcc gctggccgtt aaggtacata atcccgtctt ttagttcaaa 2040 gttgcggaaa cccacttcct gccggctaac ctctaagagg ctgcctgcct ggtataaata 2100 caggcggacc tggtaaaggt taggcttttc cgcgctccag gcagctactg gcaaatcagc 2160 cagagtgaat tccagctgct cgcttctgat tgggcccagc ttttcagcaa ccaagtcacc 2220 ttcactatcc cgcacttcca gcttaaagct ggcatttggc aagcggtagg caatattggc 2280 ttcgacttcc agctttcctt tttggtagtt atcggtcaag ctggccgtaa gcttaaggtc 2340 ctccaagtgc agacgcggct tggcctgaag agtcactgat ctgaacaaac cagacatgcg 2400 ccagaagtcc tggtcttcca gccaggaggc ggaagaatac ttgtagagag ccactgccag 2460 gcggttgttt tctttcttga ggaacttggt aaccataaac tcgcttgggg taaaggagtc 2520 ttccccgtag ccgacgaagt ggccgttcag ccagacatag atggctgttg ccgccccgtc 2580 aaacttcaag ctgacttcct tgtcccagaa agcttcatcc aggtcaaagt atctgacata 2640 agaagcgagc ggatttttgc ttggaatttg gggcgggaaa atctcctcac tgccgtccca 2700 tggatattgg acgttgacat actggggctg gccaaagcct tgcagttcca ggttgccggg 2760 tactttgact gacttaaaat tgctatcgtc aaagtcttct gcatagaagt tgactggtcc 2820 ctggccgttt tcagcgtagt caatcagcca gtccccgtcc agggactgca ctaaactgga 2880 cttgccctcc tccagttctt cctggctttg gaaggactca tggtcggagt gcgggggaat 2940 tgtattgact tcgtaaactt ccgggtcagt cagccaggcc aggtctgcct ggtcaactct 3000 tttttctttt actaacttat tgctcat 3027

Claims (15)

  1. 갈락토-올리고당(galacto-oligosaccharide: GOS)을 포함하는 올리고당 조성물로서,
    (i) 갈락토-올리고당(GOS)의 함량은 상기 조성물의 총 건조 물질의 적어도 40 중량%이고;
    (ii) 알로락토스의 함량은 상기 조성물의 총 건조 물질의 적어도 10 중량%이며;
    (iii) 6'-갈락토실-락토스(6'-GL)의 함량은 상기 조성물의 총 GOS의 적어도 30 중량%이고; 그리고
    (iv) 총 GOS의 적어도 0.5 중량%는 중합도(DP)가 6 이상인, 올리고당 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 GOS 함량은 상기 조성물의 총 건조 물질의 적어도 42중량%, 바람직하게는 적어도 44 중량%, 더 바람직하게는 적어도 46 중량%, 더 바람직하게는 적어도 48 중량%, 더 바람직하게는 적어도 50 중량%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 55%, 가장 바람직하게는 적어도 60 중량%인, 올리고당 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 총 GOS의 적어도 1 중량%, 바람직하게는 적어도 1.5 중량%는 DP가 6 이상인, 올리고당 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알로락토스 함량은 상기 조성물의 총 건조 물질의 적어도 12 중량%, 바람직하게는 적어도 13 중량%인, 올리고당 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 6'-GL 함량은 상기 조성물의 총 GOS의 적어도 40 중량%, 바람직하게는 적어도 43 중량%인, 올리고당 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 GOS 함량은 상기 조성물의 총 건조 물질의 적어도 70 중량%이고;
    (ii) 상기 알로락토스 함량은 상기 조성물의 총 건조 물질의 적어도 12 중량%이며;
    (iii) 상기 6'-GL 함량은 상기 조성물 중의 총 GOS의 적어도 40중량%이고; 그리고
    (iv) 상기 총 GOS의 적어도 1 중량%는 중합도(DP)가 6 이상인, 올리고당 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 올리고당 조성물을 포함하는 영양 조성물로서, 상기 영양 조성물은 바람직하게는 영아 조제식, 후속 조제식, 성장 우유, 유제품, 씨리얼 및 의학적 영양 제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 영양 조성물.
  8. 단백질 공급원, 지질 공급원, 탄수화물 공급원 및 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 올리고당 조성물을 포함하는, 영양 조성물.
  9. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 올리고당 조성물.
  10. 장내 미생물총 균형 및 건강을 촉진시키는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 올리고당 조성물 또는 제7항 또는 제8항에 따른 영양 조성물로서, 상기 방법은 유효량의 상기 올리고당 조성물 또는 상기 영양 조성물을 이러한 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 올리고당 조성물 또는 영양 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 장내 미생물총 및 건강을 촉진시키는 것은 장관에서 비피더스 활성(bifidogenic) 미생물을 향상시키는 것 및/또는 위장관 장애를 야기하는 다양한 의학적 치료에 대한 환자 내약성을 개선시키는 것을 포함하며, 이러한 치료는 방사선요법, 화학요법, 위장 수술, 마취, 항생제, 진통제 약물의 투여, 또는 설사 치료를 포함하는, 올리고당 조성물 또는 영양 조성물.
  12. 프리바이오틱(prebiotic) 조성물로서의, 바람직하게는 비피더스 활성 조성물로서의, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 올리고당 조성물 또는 제7항 또는 제8항에 따른 영양 조성물의 용도.
  13. 비피더스 활성 영아 조제식 또는 식이성 식품의 생산 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 올리고당 조성물을 지방, 탄수화물, 무기염, 미량 원소 및 비타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 올리고당 조성물의 제공 방법으로서, (i) 락토스 공급물을, 바람직하게는 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 아종 불가리쿠스 균주 DSM20080으로부터 얻은 베타-갈락토시다제(EC 3.2.1.23)와 접촉시키는 단계, 및 (ii) 올리고당 합성을 가능하게 하는 단계를 포함하되, 상기 베타-갈락토시다제는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 갖는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 베타-갈락토시다제는 상기 락토스 공급물과 접촉되는 한편, 상기 베타-갈락토시다제를 내인성으로 발현시키는 미생물에 존재하되, 상기 미생물은 전체 세포 또는 이의 활성 부분 또는 분획으로서 사용되고, 상기 미생물은 바람직하게는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 DSM20080인, 방법.
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