KR20210052355A - 우수한 전환 활성을 갖는 균체 고정화 비드 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 균체 고정화 비드 및 이의 제조방법, 더욱 자세하게는 고정화 비드에 포함된 균체의 전환 활성이 우수하고, 유통 및 보관 과정에서도 전환 활성을 유지딘 균체 고정화 비드, 균체 고정화 비드의 제조방법, 및 상기 비드의 전환 활성을 이용한 용도에 관한 것이다.

Description

우수한 전환 활성을 갖는 균체 고정화 비드 및 이의 제조방법{Cell-immobilized bead with improved conversion activity and method of preparing the same}
본 발명은 균체 고정화 비드 및 이의 제조방법, 더욱 자세하게는 고정화 비드에 포함된 균체의 전환 활성이 우수하고, 유통 및 보관 과정에서도 전환 활성을 유지한 균체 고정화 비드, 균체 고정화 비드의 제조방법, 및 상기 비드의 전환 활성을 이용한 용도에 관한 것이다.
알룰로스는 다이어트 감미료로서 관심이 높아지고 있지만, 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 알룰로스를 효율적으로 제조하는 기술의 개발이 필요하다. 종래의 알룰로스 제조 방법은 주로 화학적 합성 과정을 거쳐 제조하는 방법과 미생물의 효소를 이용한 생물학적 제조 방법으로 제조되는 방법이 알려져 있다. 최근의 식품 소재는 화학적인 방법에 의한 생산 보다 친환경적인 생물학적 생산 방법이 선호되며, 그에 따라 알룰로스 생산 방법에 미생물을 이용하는 연구들이 많이 진행되어 왔다.
알룰로스를 생산하는 미생물이 가지고 있는 과당 전환 알룰로스 생산 효소인 알룰로스 에미머화 효소는 세포 밖으로 용출하여 효소 고정화 방법에 의한 생산 방법과 세포 포함 담체 고정화에 의한 생산이 산업적으로 이용되고 있는 방법이 연구 되고 있으나, 이 중 세포에서 효소를 수득하는 공정 없이 보다 경제적인 방법으로 균체 고정화 담체에 의한 생산 방법이 주로 산업적으로 적용되고 있고 있다. 알룰로스 생산에 사용되는 균체 고정화 담체는 식품 소재 제조에 적합한 알긴산이 사용되고 있다. 알긴산은 식품첨가물로서 유산균 캡슐, 음료 등과 의료용 조직공학 재료 및 약품 전달체 등 다양한 분양에서 사용되고 있다. 알긴산은 하이드롤겔을 쉽게 형성하므로 담체(비드)로 많이 이용되어 특히 효소 및 세포의 고정화에 많이 이용되고 있다. 또한, 알긴산 또는 이의 염을 이용한 비드(alginate bead)는 팽윤성 및 신축성이 있는 다공성 물질로서 무작위로 베타-1,4 결합을 형성하므로, 균체나 효소가 안정적으로 고정화될 수 있어 유리하다.
그러나, 알긴산의 의해 균체 고정화된 비드들은 다량의 수분이 함유된 상태로 미생물이 자랄 수 있는 환경에 노출된 상태에서 수시간이 지남에 따라 부패가 진행되어지며, 이에 따라 비드의 결합력 약화로 담체로부터 균체의 방출과 더불어 균체 내 알룰로스 에피머화 효소의 역가 또한 급격히 감소되어져 이를 과당 전환 알룰로스 생산 반응시 알룰로스 생산 속도를 떨어뜨리게 한다.
또한, 알긴산 또는 이의 염을 이용한 비드 수용액에 침지된 상태에서는 다공성의 특징이 잘 보존되나, 특별한 약품 및 오염에 대한 예방 없이는 수용액 외 보관 및 유통이 어려운 문제가 있다. 즉, 수분이 함유된 균체 고정화 알긴산 담체는 제조 했을 때와 동일하게 담수된 상태로 존재하기 때문에 대량 생산시 보관성이 용이 하지 못하며, 유통시 많은 비용 발생과 액상 상태로 보관하는 등의 까다로운 제약이 발생 될 수 있다.
또한, 대부분의 효소 및 세포의 활성에 적정한 pH가 대부분 pH7 근처에 분포하고 있어, pH7 근처에서 알긴산 비드의 결합력이 약해짐에 의해 발생하는 팽윤(swelling) 및 분해되는 특징과 고온에서 그 결합력이 더욱 약해지는 특징을 가지고 있어 산업적으로 적용이 제한적이다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 균체나 효소와 같은 생촉매가 고정화된 알긴산 담체의 함유된 수분을 제거하는 제조 공정 및 조건을 정립하여 전환 활성이 유지되는 보관성 및 유통성 우수한 건조 비드를 제조하는 방법이 필요하다.
본 발명의 일 예는 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 알룰로스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주의 균체가 알긴산 또는 이의 염에 고정화된, 알룰로스 생산용 건조 비드 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 예는 과당으로부터 상기 알룰로스 생산용 건조 비드를 물 또는 과당액으로 복원한 복원 비드, 및 이를 이용한 알룰로스 생산용 조성물 또는 이를 이용하여 과당-함유 기질로부터 알룰로스-함유 생산물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 건조된 형태의 균체 고정화 비드를 포함하는 알룰로스 생산용 조성물 또는 이용하여 과당-함유 기질로부터 알룰로스-함유 생산물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예는 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 알룰로스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주의 균체가 담체에 고정화되고 건조되어 수분 함량이 낮은 건조 비드 및 이의 제조방법, 상기 건조 비드를 복원한 복원 비드 및 이의 제조방법, 상기 건조 비드 및/또는 복원 비드를 포함하는 알룰로스 생산용 조성물, 및 알룰로스 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 담체에 고정화된 균체를 포함하는 건조 비드는 수분 함량이 낮고, 보관 안정성 및 열 안정성을 우수한다.
또한, 상기 건조 비드를 복원한 복원 비드는, 물성 회복율이 우수하여 건조 전 비드의 물성과 유사한 수준을 나타내고, 비교적 동등하거나 유사한 수준의 알룰로스 전환 반응 활성을 갖는다. 상기 건조 비드는 비드의 부피를 감소시켜 단위 부피당 컬럼 충진량을 증가시켜 알룰로스 생산량을 증가시켰으며, 보관 안정성이 높은 비드를 제조하여 종래 기술에서 문제점으로 인식된 수분이 함유된 상태의 비 건조 비드가 보관 중 미생물의 오염에 의한 비드의 결합력 약화 및 분해로 인해, 비드 외부로 균체 유출 및 전환 활성 감소가 있어 이를 해결하여 장기간 안정적으로 높은 알룰로스 생산량을 제공할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일예는 담체로서 알긴산 또는 알긴산염과, 상기 담체에 고정화된 알룰로스 에피머화 효소를 생산하는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주의 균체를 포함하며 수분 함량이 14%이하인 건조 비드에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일에는 상기 건조 비드를 물 또는 과당액을 이용하여 복원한 복원 비드에 관한 것이다.
본 발명에 따른 건조비드의 수분 함량 또는 함수율이 14 %이하, 상기 건조 비드는, 수분 함량 90% 이상을 갖는 미건조 비드의 부피 또는 무게 100%을 기준으로, 건조 후 부피 또는 무게가 50%이하일 수 있다.
본 발명의 일 예는 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 알룰로스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주의 균체가 담체에 고정화되고 건조되어 수분 함량이 낮은 건조 비드에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명에 따른 건조 비드는 하기 특성 중 적어도 하나 이상을 가질 수 있다:
(i)수분 함량이 14 %이하,
(ii) 미건조 비드의 무게 100%을 기준으로, 건조 후 무게가 35%이하,
(iii) 겉보기 밀도 (bulky density)가 0.6 내지 0.8 Kg/L,
(iv) 제조 직후 건조 비드의 알룰로스 전환 활성 100%를 기준으로 25℃ 온도조건에서 38주 기간 동안 보관한 후 건조 비드의 알룰로스 전환 활성이 60% 이상,
(v) 제조 직후 건조 비드의 전환 활성 100%를 기준으로 60℃ 온도조건에서 38주 기간 동안 보관한 후 건조 비드의 알룰로스 전환 활성을 50% 이상,
(vi) 미건조 비드의 반응탑 충진율(부피%) 100%을 기준으로, 35%이하의 반응탑 충진율(부피%)를 갖는 것, 및
(viii) 건조 비드를 복원한 복원 비드의 평균 입경은 1.1 내지 1.9mm임.
본 발명의 추가 일 예는, 상기 건조 비드를 물 또는 과당액을 이용하여 복원한 복원 비드에 관한 것이다. 구체적으로 상기 복원 비드는 하기 특성 중 적어도 하나 이상을 가질 수 있다:
(i)수분 함량이 90 %이상,
(ii) 미건조 비드의 반응탑 충진율(부피%) 100%을 기준으로, 35%이상의 반응탑 충진율(부피%)를 갖는 것, 및
(iii) 비드의 평균 입경 1.1 내지 1.9mm,
(iv) 건조 비드의 평균 입경 100%을 기준으로, 복원 비드의 평균 입경은 120 내지 190%,
(v) 50 중량%의 과당액을 통액하여 알룰로스 전환율이 25% 이상으로 유지되는 기질통액유속(mL/min)이, 미건조 비드 100%를 기준으로 110 내지 300인 것, 및
(vi) 과당 함유 원료로부터 얻어지는 알룰로스 전환 반응생성물의 알룰로스 함량이, 건조 전 비드의 알룰로스 생산량 100%을 기준으로 약 110%이상임.
자세하게는, 본 발명의 일 예에 따른 건조 비드의 수분 함량 또는 함수율이 14 %이하, 12%이하, 10%이하, 9.9%이하, 9.5%이하, 9.0%이하, 8.9%이하, 8.7%이하, 8.5%이하, 또는 8 %이하일 수 있으며, 수분함량의 하한치는 1%이상, 2%이상, 3%이상, 4%이상 또는 5%이상일 수 있으며, 또한, 상기 수분 함량의 범위는 상기 상한치와 하한치의 조합한 범위일 수 있으며, 예를 들면 1 내지 14%, 2 내지 12%, 3 내지 10%, 3 내지 8%, 4 내지 8% 또는 5 내지 8%일 수 있다.
상기 건조 비드는, 미건조 비드, 예를 들면 수분 함량 90% 이상을 갖는 미건조 비드의 무게 100%을 기준으로, 건조 후 비드의 무게가 35중량%이하, 30중량%이하, 25중량%이하, 20중량%이하, 17 중량%이하, 15 중량%이하, 12중량%이하, 10 중량%이하 또는 8중량%이하일 수 있으며, 바람직하게는 30중량%이하, 25중량%이하, 20중량%이하, 17 중량%이하, 15 중량%이하, 12중량%이하, 10 중량%이하 또는 8중량%이하일 수 있다. 구체적으로, 상기 제조된 비드를 용액에서 회수한 건조 전 비드 100g에서 건조 후 무게가 50g 이하, 예를 들면 10 g이하일 수 있다. 상기 건조 비드의 무게 (중량)변화는 건조 전 중량과 건조 후 중량을 측정하여 상대적 퍼센트 수치로 표시한 것이며, 건조 전과 후의 중량은 동일 측정 단위를 갖는 것이다.
본 발명에 따른 건조 비드는 복원 시 비드의 물성 회복율이 우수하고, 알룰로스 전환 반응 효율이 비교적 건조전 비드의 물성과 유사한 수준을 나타낸다.
또한, 상기 건조 비드는, 미건조 비드, 예컨대 수분 함량 90% 이상을 갖는 미건조 비드의 반응탑 충진율(부피%) 100%을 기준으로 35%이하, 30%이하, 25%이하, 20%이하, 17 %이하, 15 %이하, 13 %이하 또는 11%이하일 수 있으며, 예를 들면 1.0 내지 35%, 1.0 내지 30%, 1.0 내지 25%, 1.0 내지 20%, 1.0 내지 20%, 1.0 내지 17 %, 1.0 내지 15 %, 1.0 내지 13 %, 1.0 내지 11%, 3.0 내지 35%, 3.0 내지 30%, 3.0 내지 25%, 3.0 내지 20%, 3.0 내지 20%, 3.0 내지 17 %, 3.0 내지 15 %, 3.0 내지 13 %, 3.0 내지 11%, 5.0 내지 35%, 5.0 내지 30%, 5.0 내지 25%, 5.0 내지 20%, 5.0 내지 20%, 5.0 내지 17 %, 5.0 내지 15 %, 5.0 내지 13 %, 5.0 내지 11%, 5.5 내지 35%, 5.5 내지 30%, 5.5 내지 25%, 5.5 내지 20%, 5.5 내지 20%, 5.5 내지 17 %, 5.5 내지 15 %, 5.5 내지 13 %, 또는 5.5 내지 11%일 수 있다.
구체적으로, 상기 제조된 비드를 용액에서 회수한 건조 전 비드 100 mL에서 건조 후 부피가 35mL 이하, 예를 들면 15 mL이하일 수 있다. 상기 건조 비드의 부피 변화는 건조 전 부피와 건조 후 부피를 측정하여 상대적 퍼센트 수치로 표시한 것이며, 건조 전과 후의 부피는 동일 측정 단위를 갖는 것이다.
상기 건조 비드는 동일 중량의 비드가 수분 함량이 감소함으로써, 부피가 감소하고 밀도가 증가한다. 본 발명에 따른 건조 비드는 부피 및 중량이 건조 전 비드에 비해 감소하여 보관 및 유통이 용이하다. 상기 건조 비드는 비드의 부피와 입경을 감소시켜 단위 부피당 컬럼 충진량을 증가시켜 알룰로스 생산량을 증가시켰으며, 보관 안정성이 높은 비드를 제조하여 기존 문제시 되었던 수분이 함유된 상태의 비 건조 비드가 보관 중 미생물의 오염에 의한 비드의 결합력 약화 및 분해로 인해, 비드 외부로 균체 유출 및 전환 활성 감소가 있어 이를 해결하여 장기간 안정적으로 높은 알룰로스 생산량을 제공할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 건조 비드는 보관 안정성 및 열 안정성을 우수하여 건조전 알룰로스 전환 활성을 최대한 유지하는 장점이 있다. 건조 비드를 제조하는 경우, 건조 전 비드의 물성 및 활성에 근접한 물성과 활성을 갖는 것이 중요하다.
구체적으로, 상기 건조 비드는 제조 직후 건조 비드의 전환 활성 100%를 기준으로, 건조 비드를 제조한 후 25℃ 온도조건에서 38주 기간 동안 보관한 후 건조 비드의 알룰로스 전환 활성을, 60%이상, 70%이상, 75% 이상, 80% 이상, 85%이상, 90%이상, 또는 91%이상, 92%이상, 93%이상, 또는 94%이상을 가질 수 있다. 상기 건조비드는, 제조 직후 건조 비드의 전환 활성 100%를 기준으로, 건조 비드를 제조한 후 60℃ 온도조건에서 38주 기간 동안 보관한 후 건조 비드의 효소 역가를 50% 이상, 60%이상, 70%이상, 또는 75% 이상을 가지는 것일 수 있다.
상기 보관 안정성 측정의 일 예는 건조 비드를 과당-함유 기질 용액에 보관하는 조건으로 진행한다. 상기 보관된 비드를 반응탑에 충진하고 온도 50 ℃, 및 pH 6.5 ~ 7.2로 조절된 50brix(%)의 과당 함유 기질을 상기 비드가 충진된 반응탑에 통액하여 알룰로스 전환율 25% 이상으로 유지되는 유속하에서 알룰로스 전환 반응을 수행하고, 상기 얻어진 전환 반응생성물에 포함된 알룰로스를 정량하여 수행할 수 있다. 상기 알룰로스 전환 활성 측정을 보관 전 비드와 동일하게 진행하여 보관 전 비드의 알룰로스 전환 활성 100%을 기준으로 상대적인 전환 활성의 퍼센트로 표시할 수 있다. 상기 과당-함유 기질은 40 내지 60 중량%의 고형분 함량 및 30 내지 99%(w/w)의 과당순도를 갖는 과당 함유 원료일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 건조 비드는 과당-함유 기질로부터 알룰로스를 생산함에 있어서 보다 장기간 동안 높은 전환율 및 생산량을 제공할 수 있다. 구체적으로, 상기 건조 비드는, 과당액으로 복원한 복원 비드가 40 내지 60 중량%의 고형분 함량 및 30 내지 99%(w/w)의 과당순도를 갖는 과당 함유 원료로부터 얻어지는 알룰로스 전환 반응생성물의 알룰로스 함량이, 건조 전 비드 대비 알룰로스 생산량 100%을 기준으로 약110%이상, 120%이상, 130%이상, 140% 이상, 150%이상, 160%이상, 170%이상 또는 180%이상일 수 있으며, 바람직하게는 150%이상, 160%이상, 170%이상 또는 180%이상일 수 있으며, 예를 들면 101 내지 300%, 105 내지 300%, 110 내지 300%, 120 내지 300%, 130 내지 300%, 또는 140 내지 300% 일 수 있다. 바람직하게는, 상기 비드에 사용된 균체가 30 내지 70 ℃의 온도에서 열처리한 균체일 수 있으며, 과당액으로 복원한 복원 비드를 이용한 알룰로스 전환 반응생성물의 알룰로스 함량이, 건조 전 비드를 이용한 알룰로스 생산량 100%을 기준으로 약 150%이상, 160 %이상, 170%이상, 180%이상, 190%이상 또는 200%이상일 수 있으며, 상한치는 205%이하, 210%이하, 220%이하, 230%이하, 250% 이하, 260%이하, 270% 이하, 280%이하, 290%이하, 300%이하 일 수 있으며, 예를 들면 상기 하한치와 상한치의 조합한 수치 범위일 수 있다.
상기 복원 비드는, 과당액을 통액하여 알룰로스 전환율이 25% 이상으로 유지되는 기질통액유속(mL/min)이 0.15이상, 0.17 이상, 0.20이상, 0.22이상, 또는 0.24 이상일 수 있으며, 예를 들면 0.15 내지 0.5, 0.17 내지 0.5, 0.20 내지 0.5, 0.22 내지 0.5 또는 0.24 내지 0.5일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따라 상기 건조 비드를 물 또는 과당액으로 복원하는 경우, 예를 들면 알룰로스 생산에 사용되는 반응탑에 건조된 비드를 충진시 물 또는 과당액에서 본래의 구형의 형태로 복원될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 건조 비드를 복원한 복원 비드는 미건조 비드의 반응탑 충진율(부피%) 100%을 기준으로, 35%이상, 40%이상, 또는 45%이상의 반응탑 충진율(부피%)를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따라 건조 비드는 과당으로부터 알룰로스를 전환하는 반응에 사용하기 전에 본래의 형태로 복원이 될 수 있도록 하는 공정이 필요하다. 복원 시키는 방법은 과당이 포함된 반응 기질 또는 물에 건조 비드를 투입하여 본래의 형태로 복원을 시킬 수 있다. 구체적으로 건조된 비드 10g을 비이커에 넣은 후, 상온의 상태에서 200mL의 물을 넣은 다음 30분 이상 동안 100rpm의 속도로 교반하여 본래의 구형에 가까운 형태로 복원시킨다.
본 발명의 일 예에 따라 복원 전 건조 비드를 반응탑에 투입한 다음 알룰로스 생산에 사용되는 전환 반응용 기질을 반응 온도 50 ℃ 하에서 공급 유속 0.2 내지 0.5SV로 통액 또는 순환 시키는 방식으로 건조 비드를 수화시켜 본래의 형태로 복원을 시킨다.
상기 건조 비드를 복원한 복원 비드의 평균 입경은 1.1 내지 1.9mm, 1.15 내지 1.9mm, 1.2 내지 1.9mm, 1.25 내지 1.9mm, 1.3 내지 1.9mm, 1.1 내지 1.8mm, 1.15 내지 1.8mm, 1.2 내지 1.8mm, 1.25 내지 1.8mm, 1.3 내지 1.8mm, 1.1 내지 1.7mm, 1.15 내지 1.7mm, 1.2 내지 1.7mm, 1.25 내지 1.7mm, 1.3 내지 1.7mm, 1.1 내지 1.6mm, 1.15 내지 1.6mm, 1.2 내지 1.6mm, 1.25 내지 1.6mm, 또는 1.3 내지 1.6일 수 있다.
상기 건조 비드를 복원한 복원 비드의 평균 입경(mm)은, 상기 건조비드의 평균 입경(mm) 100%를 기준으로, 120%이상, 또는 130%이상일 수 있으며, 예를 들어 120%이상 내지 190%, 130%이상 내지 190%, 120%이상 내지 180%, 130%이상 내지 180%, 120%이상 내지 170%, 130%이상 내지 170%, 120%이상 내지 160%, 또는 130%이상 내지 160% 일 수 있다.
구체적으로, 초기 반응탑 충진 부피 100%를 기준으로 40%이상, 예를 들면 40 내지 70% 부피로 복원될 수 있으며, 이에 미건조 비드 대비 반응탑 충진율이 늘어나 단위 부피당 생산성은 미건조 비드에 비해 높은 결과를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따라 알룰로스를 생산하는 알룰로스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주의 균체가 담체에 고정화되고 건조되어 수분 함량이 낮은 건조 비드의 제조방법을 제공한다.
상기 건조 비드의 특성은 상기 건조비드에 관한 설명에서 상술한 바와 같다.
더욱 자세하게는, 상기 건조 비드의 제조방법은, 균체를 담체에 고정화하는 비드 형성단계 및 건조단계를 포함하며, 선택적으로 비드 형성에 사용될 균체의 열처리 단계, 비드의 저온 경화단계 및 비드 코팅 단계로 이루어지는 1종 이상의 추가 단계를 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 비드 형성단계는 알룰로스 생산 균체 또는 효소와 담체로서 알긴산 또는 이의 염을 포함하는 혼합 용액을, 2가 양이온 염화 화합물이 포함된 반응액에 적가하여 수행할 수 있다.
또한, 비드를 형성하는 단계 이후에, 균체 또는 효소-함유 비드를 경화하는 단계, 2가 양이온 염화화합물을 세척하는 단계, 및 균체 또는 효소-함유 비드를 과당-함유 기질로 처리하는 단계로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 처리단계를 포함할 수 있다. 상기 비드 형성후 추가 공정은 본 기술분야에서 통상의 전문가에게 알려진 방법으로 수행할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.
상기 비드 형성단계의 예는, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 첨가하여 혼합한 후, 상기 얻어진 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써 비드를 제조할 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담체로서 알긴산 또는 이의 염을 사용하며, 상기 알긴산염은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 알긴산나트륨, 알긴산칼륨, 알긴산마그네슘, 알긴산암모늄염 등이 있다. 예를 들면, 담체로서 알긴산, 알긴산나트륨 또는 알긴산칼륨염은 점도가 2,000 내지 50,000 cps를 갖는 것일 수 있다. 또한, 비드 형성단계에서 알긴산염 용액의 농도는 응집 형성 및 제조과정의 편의성을 고려하여 1 중량% 내지 10 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 8 중량%, 보다 바람직하게는 2 중량% 내지 5 중량% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알룰로스 생산 균체는 알룰로스 에피머화 효소를 생산하는 야생형 균주 또는 알룰로스 에피머화 효소를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주일 수 있다. 또는, 알룰로스 에피머화 효소를 생산하는 균주 또는 알룰로스 에피머화 효소를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주를 얻고, 균주의 균체, 상기 균주로부터 얻어지는 효소일 수 있다.
상기 비드에 고정화될 균체는, 균체를 함유하는 용액을 30 내지 70 ℃의 온도, 또는 30 내지 65 ℃ 에서, 40 내지 65℃, 50 내지 63 ℃, 예를 들면 60℃에서 열처리된 균체일 수 있으며, 상기 열처리 시간은 0.1시간 내지 2시간 동안 수행할 수 있다. 상기 알룰로스 생산 균체는 배양액에서 회수된 세포 또는 상기 배양액을 열처리하고 얻어진 균체일 수 있다. 상기 열처리된 균체 자체(비드가 아닌 균체로 측정한 알룰로스 전환 활성)는 열처리 전 균체에 비해 상대적 알룰로스 전환 활성이 101% 이상, 105% 이상, 110% 이상, 예를 들면 101 내지 160%인 것일 수 있다. 또한, 상기 비드 형성 단계에서 상기 균체와 알긴산 또는 이의 염의 혼합 용액의 점도는, 열처리 전 균체를 포함하는 균체 농도 2%(w/w) 및 알긴산 2%(w/w)의 혼합액의 25℃에서 측정하는 경우, 열처리하지 않는 균체를 포함하는 혼합액에 비해 90%이하, 예를 들어, 4,000 내지 6,000 cps인 것일 수 있다.
상기 열처리 방법의 일 예는, 알긴산과 균체 혼합된 고정화 비드를 20 내지 70 ℃에서 건조화를 통해 비드의 수분함량을 14% 이하로 제거하는 과정을 수행하여 초기 건조 전 비드의 부피 또는 무게 100%을 기준으로, 약 50%이하로 건조 비드를 제조할 수 있다.
본 발명의 구체적 일예에서, 알룰로스 에피머화 효소를 생산하는 균주로는 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 알룰로스 에피머화 효소를 생산할 수 있는 균주일 수 있으며. 바람직하게는 마이크로박테리움속 균주, 예를 들면, Microbacterium foliorum, Microbacterium oxydans, 또는 Microbacterim phyllosphaerae일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 알룰로스 생산용 건조 비드의 제조방법에서, 바람직하게는 동결과정을 수행하지 않는 것일 수 있으며, 동결 과정에서 균체의 활성이 낮아지는 문제점이 있으며 대량으로 동결건조 공정을 수행할 경우 생산 단가 급격히 상승하는 문제점이 있다. 구체적으로, 건조 비드는, 공기 또는 바람을 이용한 건조를 수행하며, 공기 온도는 20 내지 70 ℃, 예를 들면 40 내지 50℃ ℃의 온도를 갖는 공기를 이용하여 수시간 동안 공기를 순환하는 방식으로 건조화를 수행할 수 있다.
구체적으로서, 상기 비드 형성 단계는, 2가 금속이온으로 비드를 처리하는 공정을 단독으로 수행하거나, 2가 금속이온으로 비드를 처리하는 공정을 수행한 후에 팽윤 억제제로 비드를 코팅하는 공정을 수행할 수 있다.
상기 2가 금속으로 처리하는 공정은, Mn2+, Zn2+, Co2+, Mg2+, Ni2+, Fe2+, 및 Cu2+ 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 2가 금속이온으로 비드를 처리할 수 있다. 구체적으로, 상기 2가 금속이온이 첨가된 수용액 또는 과당-함유 기질용액에, 효소 또는 균체를 함유하는 비드를 담지하거나, 상기 비드가 충진된 칼럼에 상기 2가 금속이온이 첨가된 수용액 또는 과당-함유 기질용액을 흘려주어 수행할 수 있다. 상기 2가 금속이온이 첨가된 수용액 또는 과당-함유 기질용액에 포함된 2가 금속 이온의 함량은 1mM 내지 15mM일 수 있으나, 비드의 충분한 압축 효과를 가지기 위해서는 바람직하게 5mM 내지 10mM로 처리한다.
상기 팽윤 억제제로 비드를 코팅하는 공정은, 비드를 팽윤 억제제를 함유하는 용액에 침지하거나 첨가하여 수행할 수 있다. 상기 팽윤 억제제는 키토산, 키틴, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌이민(PEI), 키토-올리고당(Chito-oligosaccharide) 및 폴리라이신으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 팽윤 억제제는 키토산-올리고당을 사용하는 경우 중량평균 분자량이 700 내지 9,000범위일 수 있으며 특별히 한정하지는 않는다. 코팅 공정에서 팽윤 억제제 용액의 농도는 0.1 중량% 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 5 중량% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 추가적인 예는 상기 균체와 담체를 포함하는 건조 비드를 포함하는 알룰로스 생산용 조성물 또는 상기 건조 비드를 이용하여 과당-함유 기질을 이용하여 알룰로스를 생산하는 방법을 제공한다.
바람직하게는 본 발명의 알룰로스 생산 방법은 효소나 균체를 함유하는 비드를 컬럼에 충진시키고 과당-함유 기질 용액을 흘려 수행할 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 사용된 효소나 균체, 또는 고정화 담체에 따라 적합한 것으로 용이하게 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 알룰로스 에피머화 효소를 포함하는 균체가 충진된 충진상 컬럼에 과당 용액을 일정 농도로 공급하면, 고정화된 균체에 의해 에피머화 반응이 진행되어 과당이 알룰로스로 전환된다. 전환된 알룰로스는 분리탑을 이용해 분리 및 정제 후 순수한 알룰로스로 이용 가능하다.
본 명세서에서 사용된 고정화 반응기는 알룰로스를 생산하기 위한 반응이 담체에 고정화된 균체 또는 효소에 의해, 또는 담체에 고정화된 균체 또는 효소가 충진된 컬럼을 통해 일어나는 반응기를 의미한다. 즉, 고정화는 생물학적 활성을 제공하는 물질, 이 경우, 알룰로스 에피머화 효소나 포도당 에피머화 효소 또는 이들을 포함하는 균체가 담체에 고정화되었다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 운전 안정성은 알룰로스와 같은 목적 산물을 연속적으로 생산하기 위해 생물 반응기를 초기 활성 대비 적합한 수준의 생산성을 유지하면서 운전할 수 있는 것을 의미하며, 보통 운전 기간으로 표시된다. 본 발명에 따른 압축 비들 이용하여 알룰로스를 생산하는 경우, 예를 들면 40 내지 50 brix 농도의 과당 함유 기질로부터 얻어지는 반응물의 알룰로스 함량이 20 중량% 이상으로 15일 이상의 기간 동안 제공할 수 있다. 또한, 상기 건조 비드가 충진한 컬럼에 50 ℃온도 조건으로 공급하는 기질로부터 얻어지는 반응물의 최대 전환율의 90 내지 100의 범위를 가지는 유속에서 공급하여 알룰로스 함량이 20 중량% 이하로 감소하는 시점까지 고정된 유속으로 공급하는 조건으로 수행하여 운전 안정성을 확보할 수 있다.
상기 알룰로스 생산 방법에 있어서, 효율적인 알룰로스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.
상기 알룰로스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 pH 6 내지 9.5, 예컨대, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 30 ℃이상, 예컨대 40 ℃이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 온도가 80 ℃이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 75℃, 60 내지 75 ℃, 또는 68 내지 75 ℃의 조건 하에서 수행될 수 있다.
또한 상기 반응 시간이 길수록 알룰로스 전환률이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 산업적 및 경제적 측면을 고려하여 적절히 조절하여 수행할 수 있으며, 과당에서 알룰로스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로 선정될 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 건조 비드, 복원 비드, 및 이들을 이용한 알룰로스 생산은, 부피 및 중량이 건조 전 비드에 비해 감소하여 보관 및 유통이 용이하고, 단위 부피당 컬럼 충진량을 증가시켜 알룰로스 생산량을 증가고, 보관 안정성이 높아 종래 보관 과정에서 미생물의 오염에 의한 비드의 결합력 약화 및 분해로 인해 비드 외부로 균체 유출 및 전환 활성 감소가 되는 문제점을 해소하며, 이에 장기간 안정적으로 높은 알룰로스 생산량을 제공할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따라 고정화 비드를 건조하고, 건조 전 비드와 건조 후 얻어진 비드의 사진을 보여준다.
도 2는 실시예 1-3에서 얻은 건조 전 비드와 실시예 2에서 얻어진 건조 비드의 수분 증발량을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 건조 비드의 복원 전 상태와 복원 후에 얻어진 복원 비드의 사진을 보여준다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따라, Microbacterium oxydans 및 Microbacterim phyllosphaerae 균체를 고정화한 건조 비드의 사진, 실체 현미경 사진(배율 X 40) 및 비드의 직경을 나타낸다.
도 5는 클로스트리디움 신댄스의 알룰로스 에피머화 효소를 발현하는 코리네박테리움 글루타리쿰 재조합 균주의 균체를 고정화한 건조 비드의 사진, 실체 현미경 사진(배율 X 40) 및 비드의 직경을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따라 균체 고정화 비드를 이용한 알룰로스 전환 반응을 수행하여 비드의 생산성 증가율 및 상대전환율를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1: 균체 고정화 비드의 제조
1-1: 균체 준비
한국특허 10-1944103에 기재된 M. foliorum의 고농도 배양을 위해, 각각의 종균 배지를 상기 표 1의 조성으로 제조한 후 121 ℃, 15분 이상의 고온고압 증기멸균 처리하여 각 종균 배지를 준비하였다. 각각의 종균 배지 및 본 배양 배지(초기 배양 배지)의 조성은 가격 경쟁력과 생산성을 고려하여 아래 표 2와 같이 선정하였으며, DPEase 활성을 증가시키기 위해 알룰로스로 DPEase를 유도하였다.
배지성분 1차
종균배양		 2차
종균배양		 본 배양
알룰로스 (g/L) 5 5 10
MgSO4-7H2O(g/L) 0.5 0.5 1.5
Yeast extract(g/L) 2 2 4
(NH4)2SO4(g/L) 7 7 7
KH2PO4(g/L) 0.5 0.5 0.5
K2HPO4 (g/L) 0.5 0.5 0.5
FeSO4-7H2O (mg/L) 6 6 12
MnSO4-4H2O(mg/L) 4 4 8
Biotin (mg/L) 0.2 0.2 0.2
Thiamine-HCl (mg/L) 0.2 0.2 0.2
Nicotinamide(mg/L) - - 10
소포제 (mL) - - 0.5
종균 준비는 -70 ℃의 온도로 보관된 M. foliorum 모균을 3ml 종균 배지에 접종하여 30 ℃의 온도 에서 24시간 1차 종균 배양한 뒤, 100 ml 종균 배지에 접종하여 30 ℃에서 24시간 2차 종균 배양을 진행하였다. 2차 종균 배지는 최종적으로 5L 발효조를 이용해 2L 본 배양 생산 배지에 접종하여, 배양온도 30 ℃에서 배양하였다. 발효조 내로 공급되는 공기(air)는 0.2um air filter를 이용하여 제균된 상태로 사용하였으며, 표 2의 발효조 배양 조건에 따라 배양을 실시하였다. 하기 표 2에선 공기 공급 단위는 vvm (volume of air per volume of liquid per minute, L/min)이었다.
pH-stat 당 공급 방식은 탄소원이 1회 투입될 때 배양액(발효조) 내의 탄소원 농도(g/L)의 증가분을 f값으로 정의하여, f값 0.25가 되게 탄소원의 투입 시간을 조절하였다. 추가 배지, 즉 Feeding 용액의 조성은 알룰로스 400g/L, yeast extract 40g/L, MnCl2 1mM을 사용하였다. pH-stat 기본 원리에 따라 pH가 6.95 초과될 때 당이 공급되어 pH가 감소되게 하였으며, pH 범위 6.8-6.95 구간에서 9% 암모니아수와 당 용액을 통해 pH를 조절하였다. 그 결과 상기 표와 같이 균체 농도 및 효소 활성 증가를 보였다.
배양 단계 1차 종균배양 2차 종균 배양 본 배양
배양 장비 Test tube 플라스크 5L 발효조
배양 부피 0.003L 0.1L 2L
접종 부피 3% (v/v) 6% (v/v) 5% (v/v)
배양 시간 24hr 24hr 30-40hr
RPM 200 200 500-800
Air (vvm) - - 2
1-2: 균체 고정화 비드 제조
상기 배양이 완료된 균체는 장기간 사용이 가능한 특성을 가지기 위해 알긴산에 균체가 고정화된 형태의 비드로 제조한다. 구체적으로는 다음과 같은 방법으로 진행하였다. 배양이 완료된 균체는 원심분리를 통해 균체를 회수한 다음 증류수와 혼합하여 균체 농도 4% (w/w)가 될 수 있도록 조정한 다음 물에 용해된 4% (w/w) 알긴산과 1:1로 혼합하여, 최종 균체 농도 2%(w/w) 및 알긴산 2%(w/w)의 혼합액을 제조하였다.
상기 혼합액은 천천히 가동되는 펌프에 연결된 실리콘 튜브로 이동하여 튜브의 끝 부분에 결합된 주사기(내경 0.20 내지 0.30mm)를 통해 혼합액이 한 방울씩 하강하여 100 mM 염화칼슘 용액과 섞여 교반되면서 경화된 구형 또는 타원형의 비드(지름 1.8 내지 2.2mm)를 형성하였다.
상기 제조된 비드를 다음 공정으로 사용이 가능하기도 하나 내부의 알긴산 결합력을 더욱 증가시키기 위해 4 내지 6시간 냉장 보관하면서 교반한 다음 새로운 100 mM 염화칼슘 용액과 교체하여 5 내지 15 ℃ 이하의 저온 상태에서 약 6시간 정도 더 경화시켜 최종 균체가 포집된 고정화 비드를 제조하여 사용하기도 한다.
1-3: 균체 고정화 비드의 코팅 처리
제조가 완료된 균체가 포함된 알긴산 비드들은 메쉬(mesh)가 있는 체를 통해 표면의 물기를 제거하고 비드 부피 대비 2배 부피의 물을 투입한 후 10분간 교반을 하였고, 이러한 과정을 3회 반복하여 잔존 염화칼슘 용액을 제거하였다.
상기 염화칼슘이 제거된 균체 고정화 비드는 비드 부피 2배 부피의 0.5% (w/v) 키토-올리고당 수용액에 첨가하여, 상온에서 30분간 교반하여 알긴산 비드에 키토-올리고당을 코팅시켰다. 키토-올리고당 코팅이 완료된 비드들은 메쉬(mesh)가 있는 채를 통해 표면의 물기를 제거한 후, 비드 부피 2배수의 물로 세척 및 체를 통해 제거하여 남아 있는 키토-올리고당을 제거하였다.
실시예 2: 균체 고정화 비드의 건조
실시예 1에서 제조, 코팅 및 세척이 완료된 비드들은 구체적인 예시로 건조 장치(dry-oven)에 건조가 잘 이루어지도록 평탄하게 비드들을 판(plate)위에 놓은 후, 45 ℃ (±5℃)에서 수 시간 동안 열풍이 순환되는 방식으로 건조화를 진행하여 비드가 함수하는 수분을 약 14% 이하의 수준으로 낮아질 때까지 건조화를 진행하였다. 도 1에는 균체 고정화 비드를 건조하고, 건조 전 비드와 건조 후 얻어진 비드의 사진을 보여준다.
상기 건조된 비드에 대해 건조 전 비드와 함께 부피, 무게, 비드 직경, 수분 함량, 비드의 겉보기 밀도(bulk density)를 각각 측정하였다. 구체적 측정 방법 및 결과는 하기와 같다. 상기 비드 측정 결과를 표 3에 나타내며, 표 3에 기재된 상대적 수치값은 건조 전 비드의 수치값 100을 기준으로, 건조 후 부피, 무게, 직경, 수분 함량, 겉보기 밀도의 상대적 측정값을 의미한다.
(1)비드의 부피 변화 (반응탑 충진율)의 측정
구체적인 방법으로 건조 전과 후의 비드의 부피 감소 변화를 측정하기 위해, 도 1의 사진과 같이 실시예 1-3의 물기가 제거된 비드를 메스실린더에서 100mL 부피로 잰 후, 이를 열풍 건조 후 부피를 재었을 때 메스실린더에서 10mL의 부피를 보여 건조 전 부피 100을 기준으로 대비 약 10%의 부피로 감소된 결과를 나타내었다.
(2) 비드의 중량 변화 측정
건조 전, 후의 무게 변화는, 상기 제조된 비드를 용액에서 회수한 건조 전 비드 100g에서 열풍 건조 후 무게가 7.5g으로 건조 전 대비 약 7.5%로 감소되었다.
(3) 비드의 겉보기 밀도 측정
비드의 겉보기 밀도(bulk density)를 측정하기 위해서 물기가 제거된 건조 전 비드 100mL 부피로 채웠을 때 그 무게가 62.2g으로 bulk density 0.62kg/L의 수치를 나타내며, 동일한 방법으로 건조 비드 100mL 부피로 채웠을 때 그 무게가 69.9g으로 bulk density 0.7kg/L를 나타낸 결과를 보였다.
(4) 비드의 직경 분포 측정
상기 열풍 건조 전, 후에 얻어진 비드의 직경은 산별적으로 20개의 비드의 길이를 각각 측정기(Mitutoyo M530-123)로 측정하였을 때, 건조 전 비드의 평균 직경 2.08mm이나, 건조 후 비드의 평균 직경이 1.05mm으로 건조 전 비드 평균 직경을 100%으로 하였을 때 건조 후 비드의 평균 직경은 건조 전 대비 50.5% 수준으로 49.5% 감소율을 보였다.
(5) 비드의 수분 함량 측정
수분 함량은 건조 전 비드 10g과 건조 후 비드 10g을 측정 장비(A&D MX-50 Moisture analyser) 이용하여, 125 ℃ 적외선 조사 조건에서 30분간 무게변화를 측정하였을 때 건조 전 비드의 수분 함량 95.9% (w/w)이나, 건조 후 비드의 수분 함량은 9.93 %(w/w)으로, 건조 전 비드의 수분 ?t량 100을 기준으로 수분 함량이 약 10%인 결과를 얻었다.
항목 건조 전
(wet bead)		 건조 후
(dry bead)		 건조 후 상대적 측정값 (%)
실린더 충진부피 (mL) 100 10 10
무게 (g) 100 7.5 7.5
비드 평균 직경 (mm) 2.08 1.05 50.5
수분 함량 (w/w%) 95.9 9.93 10.4
겉보기 밀도 0.62 Kg/L 0.70 Kg/L 112.9
실시예 3: 건조 비드의 복원
3-1: 비드의 복원
실시예 2에서 얻어진 건조 비드는 과당으로부터 알룰로스를 전환하는 반응에 사용하기 전에 본래의 형태로 복원이 될 수 있도록 하는 공정이 필요하다. 복원 시키는 방법은 과당이 포함된 반응 기질인 50brix (%) 결정 과당 또는 물에 건조 비드를 투입하여 본래의 형태로 복원을 시킬 수 있다.
구체적으로 복원 전 건조 비드를 반응탑에 투입한 다음 알룰로스 생산에 사용되는 전환 반응용 기질 (온도 50 ℃, 및 pH 6.5 내지 7.2로 조절된 50 brix(%)의 결정 과당)을 반응 온도 50 ℃ 하에서 공급 유속 0.2 내지 0.5SV로 통액 또는 순환시키는 방식으로 건조 비드를 수화시켜 본래의 형태로 복원시켰다. 상기 건조 비드의 복원 전 상태와 복원 후에 얻어진 복원 비드의 사진을 도 2에 나타낸다.
3-2: 복원 비드의 특성 분석
도 3의 복원 전 후 비드 사진에 나타낸 바와 같이, 복원 전의 건조 비드 형태에서 복원 후의 비드 형태가 건조 전의 비드와 유사한 구형 또는 타원형의 비드로 복원 되었다. 이에, 복원된 비드가 반응탑에 충진 후 기질과의 반응이 원활하게 이루어질 수 있으며, 균일하게 반응탑에 채워져 반응 기질의 흐름이 특이적 방향으로 흐르는 채널링이 문제가 생기지 않는 반응에 적합한 비드의 형태가 되었다.
표 4와 같이 상기 제조된 비드를 산별적으로 20개의 비드의 길이를 각각 측정기(Mitutoyo M530-123)로 재었을 때 복원 전 비드 평균 직경 1.05mm이나, 복원 후 비드의 평균 직경이 1.43mm으로 측정되었으며, 건조 전 비드 평균 직경을 100%으로 하였을 때 복원 비드의 평균 직경이 건조 전 비드 대비 약 68.8% 수준이며, 31.2% 감소율을 보였다.
초기 동일한 100mL 비드의 부피에서 건조 및 수화에 의한 복원 공정을 거친 비드와 건조 공정을 거치지 않은 건조 전 비드를 각각 반응탑에 충진 하였을 때, 건조 후 복원 비드의 반응탑 충진율 (부피%)가 52mL로 채워져, 복원비드의 반응탑 충진율이 52%으로 확인되었다.
항목 건조 전
(wet bead)		 건조 후
(dry bead)		 복원후
부피 변화 (ml) 100 - 52
비드 평균 직경 (mm) 2.08 1.05 1.43
반응탑 충진율 (부피%) 100 - 52
3-3: 복원 비드의 soaking 처리
실시예 3-2에서 복원이 완료된 건조 비드들은 전환 반응에 사용될 수 있도록 과당이 함유된 기질(pH 6.5 ~ 7.5)을 비드 부피 대비 2배 부피로 투입하여 10분간 교반하였다. 이 과정을 2회 반복하여 비드 내부를 50Brix(%) 결정 과당액으로 치환시켰다.
상기 비드의 표면 과당액을 제거 후, 망간 이온 처리용 과당 함유 기질 (10mM MnCl2.4H2O 포함 중량 50brix 결정 과당)을 비드의 충분한 반응을 위해 비드 부피의 2배 이상의 부피로 투입한 후 50℃ 항온 수조에서 30분 내지 60 분 동안 서서히 교반하여 비드에 망간 이온을 처리하였다. 그런 후, 체를 통해 비드 표면의 상기 과당 함유 기질을 제거 후, 알룰로스 전환에 사용되는 생산용 과당 함유 기질 (1mM MnCl2.4H2O 포함 중량 50bx 결정 과당)을 비드의 충분한 세척을 위해 비드 부피의 2배 이상으로 투입 후 10분간 교반하여 새로운 기질로 교체하는 방법으로 최소 2회 이상 반복 세척하여 최종적으로 전환 반응에 사용되는 비드를 제조하였다.
실시예 4: 건조 비드의 제조 (2)
4-1: 균체 열처리
실시예 1-1에서 배양이 완료된 마이크로박테리움 속 균주는 균체의 활성을 증가 시키기 위해 배양이 완료된 상태에서 열처리를 하여 균체의 활성을 높이는 공정을 진행하였다. 구체적으로, 발효조에서 배양 종료 후 균체 농도 18.5(OD600nm)인 배양액을 150rpm으로 교반하면서 발효조의 온도를 30 ℃에서 60 ℃로 서서히 높인 다음, 60℃에서 1hr 동안 유지시켜 균체 열처리를 진행하였다. 그런 다음 60℃에서 30℃ 냉각하는 과정을 거쳐 열처리된 균체 배양액을 얻었다.
4-2: 열처리 균체의 특성 분석
균체 열처리 전과 후의 전환 활성(U/g_cell) 값을 측정하기 위해 50mM PIPES 완충용액 (pH 7.0)에 용해된 최종 농도 1mM MnCl2.4H2O 포함하며 35Brix 결정 과당 용액과 최종 건조 균체 농도 5 mg/ml 포함한 반응액 부피를 1mL로 맞춘다. 그런 후, 균체 포함 반응 기질액을 70℃에서 1시간 동안 반응한 다음 원심분리를 통해 상등액을 회수한 후 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 분석을 실시하였다.
상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 RID(Refractive Index Detector, Agilent 1260 RID)를 이용하여 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6 ml/min로 하여 과당으로부터 전환 반응된 알룰로스의 전환 농도로 균체 활성을 분석하였다. 또한, 균체 활성 측정에 사용된 건조 균체 무게 5mg/mL은 배양액의 흡광도가 OD600nm 12.5가 되도록 희석하여 맞춘 다음 1mL을 회수하여, 원심분리를 통해 상등액을 제거한 후 남아 있는 균체의 건조 균체 환산 계수 0.4를 곱하였을 때 건조 균체 농도가 5mg이 된다. 상등액이 제거된 5mg의 건조 균체 농도에 상기 전환 반응에 사용되는 반응 기질 1mL을 투입하여 최종 건조 균체 농도를 5mg/mL로 최종 맞추어 반응에 사용하였다.
상기 균체의 열처리 전과 후의 균체 농도의 변화 및 활성을 비교한 결과는 표 5와 같다.
구분 균체 농도 균체 활성
OD600nm 변화율 (%) Activiy (U/g_cell) 변화율 (%)
열처리 전 18.5 100 1168.3 100
열처리 후 16.3 88 1345.9 115
표 5의 결과와 같이 열처리 전의 균체 농도 대비 열처리 후 균체 농도가 다소 낮아져 열처리 전 대비 약 88% 균체 농도 감소를 보였다. 이는 60℃에서 균체 열처리시 고온에 의한 균체의 용해(lysis)가 일부 일어나 균체 농도의 감소가 일어난 것으로 보인다.
또한, 열처리 전 균체 알룰로스 전환 활성을 100%로 볼 때, 열처리 전과 동량의 균체를 열처리하여 전환 활성을 측정한 결과 열처리 전 대비 115% 증가하였다. 이는 균체를 60℃에서 열처리시 고온에 의한 균체의 세포벽의 lysis에 의해 세포질 내부로 기질 이동이 보다 원활한 다공성 세포벽 생성으로 인해 균체의 알룰로스 전환 활성이 높아진 것으로 보인다.
상기 결과로부터, 균체 열처리를 통한 균체 농도의 감소와 균체의 전환 활성 증가는 균체 고정화 알긴산 비드 제조 시 실제적으로 균체 투입량이 약 12% 증가하며, 균체 활성 약 15% 증가한 결과로서 최종적으로 비드 제조시 열처리 전 생산성 대비 약 25% 증가하는 것으로 확인하였다.
4-3: 균체 고정화 비드 제조
상기 배양이 완료된 균체는 장기간 사용이 가능한 특성을 갖도록 알긴산에 균체가 고정화된 형태의 비드로 제조한다.
구체적으로, 열처리가 완료된 배양액은 원심분리로 세포를 회수한 다음 증류수와 혼합하여 균체 농도 4% (w/w)로 맞추고, 물에 용해된 4% (w/w) 알긴산과 회수된 균체의 중량비를 1:1로 혼합하여, 최종 균체 농도 2%(w/w) 및 알긴산 2%(w/w)의 혼합액을 제조하였다.
상기 혼합액은 열처리된 균체를 이용하는 경우, 실시예 1-2와 같이 비열처리 균체를 사용한 혼합액에 비해 점성이 낮아지는 경향이 있다. 본 실시예에서 얻어진 열처리된 균체를 이용한 알긴산 혼합액과 실시예 1-2에서 얻어진 비열처리 균체를 이용한 알긴산 혼합액의 점도를 온도 25℃에서 Brookfield 점도계를 사용하여 측정하였다. 상기 점도 측정 결과, 실시예 1-2의 알긴산 혼합액의 점도는 5,580 cps이며, 본 실시예에서 얻어진 알긴산 혼합액의 점도는 4,900 cps로서 약 12% 감소한 수준인 열처리 전 대비 87.8%을 보였다. 이는 균체가 함유 다당류가 열처리에 의해 일부 제거되어 점성이 낮아지는 것으로 보인다.
상기 열처리 균체와 비열처리 균체를 이용한 알긴산 혼합액의 점도 (cps)를 하기 표 6에 나타낸다.
구분 점도(cps) 변화율 (%)
실시예 1-2의 알긴산 혼합액 5,580 100%
실시예 4-2의 알긴산 혼합액 4,900 87.8%
상기 건조된 비드에 대해 건조 전 비드와 함께 부피, 무게, 비드 직경, 수분 함량, 비드의 겉보기 밀도(bulk density)를 각각 측정하였다. 구체적 측정 방법은 실시예 2의 측정 방법과 동일하게 하였으며 그 결과는 표 7과 같다. 표 7에 기재된 상대적 수치값은 건조 전 비드의 측정값 100을 기준으로, 건조 후 부피, 무게, 직경, 수분 함량, 겉보기 밀도의 상대적 측정값을 의미한다.
항목 건조 전
(wet bead)		 건조 후
(dry bead)		 건조 후 상대적 측정값 (%)
부피 변화 (mL) 100 9.3 9.3
무게 변화 (g) 100 7.2 7.2
비드 평균 직경 (mm) 2.01 1.02 50.7
수분 함량 (w/w%) 95.9 9.64 9.9
겉보기 밀도 (Kg/L) 0.61 0.69 113.1
4-4: 건조 비드의 복원
실시예 3-1의 건조 비드의 복원방법 및 실시예 3-3의 soaking 방법과 동일한 방법으로서, 상기 실시예 4-2에서 얻어진 열처리 균체를 고정화한 비드를 복원하고, 복원이 완료된 건조 비드들은 전환 반응에 사용될 수 있도록 과당이 함유된 기질(pH 6.5 ~ 7.5)을 이용하여 soaking 하였다.
표 8과 같이 상기 제조된 비드를 산별적으로 20개의 비드의 길이를 각각 측정기(Mitutoyo M530-123)로 재었을 때 복원 전 비드 평균 직경 1.02mm이나, 복원 후 비드 직경이 1.41mm으로 측정되었다. 상기 비드의 평균 직경을 건조 전 비드 평균 직경을 100%으로 하여 상대적 크기를 계산하면, 건조 후 비드의 평균 직경은 52.7%이고, 복원 비드의 평균 직경은 70.1%이었다.
초기 동일한 100mL 비드의 부피에서 건조 및 수화에 의한 복원 공정을 거친 비드와 건조 공정을 거치지 않은 건조 전 비드를 각각 반응탑에 충진 하였을 때, 건조 후 복원 비드의 부피가 48mL로 채워져, 비드 부피 복원율이 48%으로 확인 되었다.
항목 건조 전
(wet bead)		 건조 후
(dry bead)		 복원후
부피 변화 (mL) 100 - 48
비드 평균 직경 (mm) 2.01 1.02 1.41
반응탑 충진율 (부피%) 100% - 48%
실시예 5: 건조 비드의 제조 (3)
5-1: 균체 고정화 비드 및 건조 비드의 제조
Microbacterium foliorum 이외 동일 속에 속하는 다른 종으로서, Microbacterium oxydans 및 Microbacterim phyllosphaerae 균체를 확보하기 위해 실시예 1-1과 같은 방법으로 균체를 배양하였으며, 배양이 완료된 균체는 원심분리를 통해 균체를 회수하였다. Microbacterium oxydans 및 Microbacterim phyllosphaerae 균체는 한국특허 10-1944104에 기재된 균주와 동일하다.
배양이 완료된 균체는 원심분리를 통해 균체를 회수한 다음 회수된 균체는 실시예 1-2의 균체 고정화 비드 제조 방식과 실시예 1-3의 균체 고정화 비드의 코팅하는 방식과 동일한 방법으로 균체 고정화된 형태의 비드를 제조하였으며, 실시예 2와 동일한 방법으로 비드의 건조를 수행하였다.
5-2: 건조된 균체 고정화 비드의 복원
건조가 완료된 Microbacterium oxydans 또는 Microbacterim phyllosphaerae 균체를 포함하는 고정화 비드 10g을 비이커에 넣은 후, 상온의 상태에서 200mL의 물을 넣은 다음 30분 동안 100rpm의 속도로 교반하여 복원 공정을 수행하였다. 증류수에서 수화하여 건조 전 비드 형태로 복원 과정을 단계별로 도 4에 나타내었다. 상기 각 균주별로 제조된 건조 전 비드, 건조 후 비드 및 복원 된 건조 비드를 산별적으로 20개 비드를 선정하여 비드 길이를 각각 측정기(Mitutoyo M530-123)로 측정한 결과 표 9와 같은 결과로 나타났으며, 각 균주별 제조된 비드는 건조 전, 건조 후 직경이 유사한 결과를 보이며, 상기 복원 방법을 통해 동일한 직경 수준으로 복원이 가능함을 볼 수 있다.
또한, 도 4의 복원 비드의 사진에 나타낸 바와 같이, Microbacterium foliorum 균체와 동일하게 구형에 가까운 형태로 복원이 가능함을 볼 수 있었다.
항목 M.foliorum M.oxydans M.phyllosphaerae
건조 전 비드 평균 직경 (mm) 2.08 2.01 2.04
건조 후 비드평균 직경 (mm) 1.05 0.97 1.01
복원 후 비드평균 직경 (mm) 1.43 1.38 1.41
실시예 6: 건조 비드의 제조 (4)
6-1: 균체 준비
클로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens ATCC 35704)로부터 유래된 알룰로스 에피머화 효소의 암호화 유전자(DPE gene; Gene bank: EDS06411.1)를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드로 합성하고(CDPE 명명), 상기 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NotI과 XbaI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pCES208(J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pCES208/알룰로스 에피머화 효소(pCES_sodCDPE)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_sodCDPE) 플라스미드를 전기천공법(electroporation)을 사용하여 코리네박테리움 글루타리쿰을 형질전환시켜, CDPE 효소를 발현하는 코리네박테리움 글루타리쿰 재조합 균주를 제조하였다. 상기 CDPE 효소를 발현하는 코리네박테리움 글루타리쿰 재조합 균주의 제조방법은 특허 10-1607633 특허의 기재된 제조방법을 참고할 수 있다.
6-2: 균체 고정화 비드 제조
실시예 6-1에서 얻어진 알룰로스 에피머화 효소를 생산하는 재조합 균주를 포함하는 균주를 배양한 다음, 배양액으로부터 원심분리를 통해 균체를 회수한 진행하였다. 회수된 균체는 실시예 1-2의 균체 고정화 비드 제조 방식과 실시예 1-3의 균체 고정화 비드의 코팅하는 방식과 동일한 방법으로 균체 고정화된 형태의 비드를 제조하였으며, 실시예 2와 동일한 방법으로 비드의 건조를 수행하였다.
6-3: 건조 비드의 복원
상기 실시예 6-2에서 제조된 건조 비드 10g을 비이커에 넣은 후, 상온의 상태에서 200mL의 물을 넣은 다음 30분 동안 100rpm의 속도로 교반하여 복원공정을 수행하고 6시간 동안 정치하였다. 건조 비드와 6시간 수화로 얻어진 복원 비드의 사진, 실체 현미경 사진 (배율 X 40) 및 비드의 직경 범위를 도 5에 나타낸다. 상기 건조 비드의 수화로 복원된 복원 비드의 평균 직경은 1.05mm이었다.
도 5의 사진에 나타낸 바와 같이, 코리네박테리움 글루타리쿰의 균체 고정화 비드는, 6시간 동안 수화를 하여도 본래의 비드 형태로 복원되지 못하며, 시간이 더 경과하여도 더 이상 변화되는 모습을 볼 수 없었다.
표 10과 같이 상기 제조된 비드를 산별적으로 20개의 비드의 길이를 각각 측정기(Mitutoyo M530-123)로 재었을 때 복원 전 건조 비드 평균 직경 0.93mm이나, 복원 후 비드 직경이 1.05mm으로 측정되었으며, 건조 전 비드 평균 직경을 100%으로 하였을 때 복원 비드의 평균 직경이 건조 전 비드 대비 약 54% 수준으로 46% 감소율을 보였다.
초기 동일한 100mL 비드의 부피에서 건조 및 수화에 의한 복원 공정을 거친 비드와 건조 공정을 거치지 않은 건조 전 비드를 각각 반응탑에 충진 하였을 때, 건조 후 복원 비드의 부피가 16mL로 채워져, 비드 부피 복원율이 16%으로 확인되었다. 이 결과, 상기 도 5의 사진의 복원 공정에서 비드의 형태가 건조 전 형태로 돌아오지 못하는 것과 같이 코리네박테리움 글루타리쿰의 균체 고정화 건조 비드의 복원율이 낮은 것을 확인 하였다.
항목 건조 전
(wet bead)		 건조 후
(dry bead)		 복원후
부피 변화 (ml) 100 9.1 16mL
비드 평균 직경 (mm) 1.92 0.93 1.05
반응탑 충진율 (부피%) 100% - 16%
실시예 7: 고정화 생촉매를 이용한 전환 반응
7-1: 비드의 전환 활성 평가
실시예 2에서 균체를 고정한 건조 비드와 실시예 3에서 열처리 균체를 고정한 건조 비드의 알룰로스 전환 활성을 비교하고자, 반응탑에서 생산성 비교 실험을 진행하였다. 실시예 1에 따라 제조된 코팅 비드로서 균체 열처리 및 건조 공정을 수행하는 않은 비드(비드 1), 실시예 2에 따라 제조된 균체 열처리가 되지 않으나 건조 공정을 수행한 비드(비드 2) 실시예 4-2에 따라 제조된 열처리 균체를 고정하고 건조공정을 수행하지 않은 비드 (비드 3), 및 실시예 4-3에 따라 제조된 열처리 균체를 고정한 건조 비드 (비드 4)를 준비하였다.
상기 비드 1은 그대로 반응탑에 충진하고, 비드 2, 비드 3 및 비드 4는 복원 처리를 실시예 3의 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하여 반응탑에 충진하였다. 온도 50 ℃, 및 pH 6.5 ~ 7.2로 조절된 50 brix(중량%)의 과당 함유 기질을 상기 비드가 충진된 반응탑에 통액하여 알룰로스 전환율이 25% 이상으로 유지되는 유속하에서 알룰로스 전환 활성 및 생산성 실험을 수행하고, 상기 실험 결과를 하기 표 6에 나타낸다. 상기 생산성 평가는, 동일한 부피로 충진된 반응탑의 비드 충진 부피에서 초기 반응 기질의 과당으로부터 알룰로스 전환율 25% 이상 전환되는 기질 통액 유속으로 비드 1의 유속 대비 유속의 증가에 따른 생산성 증가율을 비교하였다. 즉, 비드 1 내지 4를 이용하여 반응탑의 비드 충진부피(mL)가 동일하고, 알룰로스 전환율 25% 이상으로 유지하는 조건으로 반응을 진행하여, 기질통액 유속(mL/min)으로 상기 생산성을 평가한 것이다.
표 12과 같이 건조공정을 수행하지 않은 비드(비드 1)의 생산성을 100%으로 설정하고, 비드 2 내지 4의 비드를 상기 비드 1과 동일한 부피로 반응탑에 충진하여 반응 조건에 따라 과당 함유 기질을 통액하였을 때, 비드 2 내지 4에 대한 결과이다.
표 11에 나타낸 바와 같이, 반응탑의 비드 충진부피(mL)가 비드 1 내지 4에서 모두 동일함에도 불구하고, 건조 및/또는 균체 열처리에 의한 알룰로스 전환활성의 증가로 인해, 알룰로스 전환율이 25% 이상으로 유지되는 유속이, 비드 1, 비드 3, 비드 2 및 비드 4의 순서로 증가하는 것을 확인하였다. 즉, 반응탑의 비드 충진부피(mL)가 동일한 조건에서, 알룰로스 전환율이 25% 이상으로 유지되는 유속이 빠르다는 것은, 해당 반응탑에 충진된 비드의 알룰로스 전환율이 상대적으로 높음을 의미한다. 따라서, 균체 열처리 및 건조 공정을 수행하지 않은 비드 1이 가장 낮은 알룰로스 전환 활성을 나타내고, 균체 열처리가 되지 않으나 건조 공정을 수행한 비드 2가 비드 1에 비해 높고, 열처리 균체를 고정한 건조 비드 4가 가장 높은 전환 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
비드 기질통액 유속(mL/min) 생산성증가율(%)
비드1 0.13 100
비드2 0.24 185
비드3 0.19 146
비드4 0.35 270
상기 표 11의 결과에 따르면, 건조 공정과 균체 열처리 공정을 수행하지 않는 비드1의 생산성 100을 기준으로 설정한 상대 생산성 수치를 보면, 비드 3 및 비드 4의 생산성은 각각 146% 및 270%로서 월등한 증가를 보였다. 이와 같은 생산성 증가 요인은, 균체가 가지고 있는 다당류 등을 열처리에 의해 제거하여, 균체내 포함된 알룰로스 전환 효소가 균체 외부의 과당 함유 기질과의 반응성 증대와 열처리에 의한 감소된 점성으로 제조된 알긴산 비드의 과당 함유 기질 이동성이 보다 원활한 효과를 보여 생산성이 증가한 결과를 보였다.
또한, 열처리 균체를 이용 제조된 알긴산 비드를 건조화를 통해 제조된 비드 4는 미건조 비드 (비드 3)와 동일한 충진 부피에서 패킹율이 약 200% 증가하여, 최종적으로 비드 1 대비 비드 4를 동일한 부피로 충진하고 동일한 반응 조건하에서의 생산성은 270% 증가한 결과를 보였다.
7-2: 비드의 반응 안정성 분석
상기 실시예 7-1에서 기재한 바와 같이, 실시예 4-3에 따라 제조된 열처리 균체를 고정한 건조 비드 (비드 4)와 실시예 1에 따라 제조된 코팅 비드로서 균체 열처리 및 건조 공정을 수행하는 않은 비드(비드 1)에 대해, 실시예 7-1과 동일한 방법으로 처리하여 반응탑에 충진하였다. 온도 50 ℃, 및 pH 6.5 내지 7.2로 조절된 50Brix(%) 결정 과당액을 상기 비드가 충진된 반응탑에 통액하여 과당으로부터 알룰로스 전환율 25% 이상으로 유지되는 초기 유속을 설정하여 반응을 실시하였을 때를 수치를 100% 라고 하였을 때, 반응 일수 별 반응액의 초기 알룰로스 전환율 대비 감소율 수치를 도 6에 나타내었다.
본 실시예와 같이 도 6의 초기 알룰로스 전환율 대비 감소율 결과에 따르면, 상기 비드 1의 초기 전환율 100%에서 약 35일 경과 하였을 때 초기 전환율 대비 감소율은 약 55%에 도달한 것에 비해, 열처리 및 건조 처리한 비드 4의 안정성은 초기 전환율 100%에서 동일하게 약 35일 경과 하였을 때 초기 전화율 대비 감소율이 약 70% 이상 유지함을 볼 수 있어 열처리 후 건조 처리한 비드의 안정성이 비드 1에 비해 높은 것으로 확인되었다.
이는 비드 건조 처리 후 복원시 비드의 압축율이 비드 1에 대비하여 더욱 높아져 반응 온도 50 ℃ 및 기질의 pH 조절에 투입된 Na+ 이온 등에 의해 비드의 결합력이 낮아지는 영향으로부터 종래 방법으로 제조된 비드 1에 비하여 비교적 높은 결합력을 부여함으로써 비드 안정성 면에서 더욱 유리한 결과를 얻어진 것으로 보인다.
실시예 8: 건조 비드의 보관 안정성
실시예 4에서 제조된 열처리 균체를 이용한 건조 비드를 보관 온도 25℃, 30℃, 37℃, 45℃, 및 60℃에서 보관하여 보관 주수(week)에 따른 비드의 알룰로스 전환 활성의 감소율을 평가하였다.
구체적으로, 상기 비드의 보관 주수에 따라 일부 비드를 취하였다. Round flask 에 5mL의 반응 기질(pH 6.5 ~ 7.2로 조절된 50Brix 결정 과당액)의 온도를 60℃로 유지하고, 건조 비드 0.5 g을 투입하여 2 시간 동안 반응하여, 알룰로스 전환율을 얻었다. 보관된 건조 비드의 알룰로스 전환 활성의 감소율은 상기 실시예7-1과 동일한 방법으로 알룰로스 전환율을 측정하여 보관 주수(week)에 따라 측정하였다.
상기 비드의 보관기간 및 보관 온도에 따른 비드의 알룰로스 전환 활성의 감소율을 표 13에 나타낸다.
Figure pat00001
표 12와 같이 건조 비드의 제조직후 전환율 대비 보관 주수별 감소율 결과를 보면, 보관 온도가 증가할수록 상대적 활성은 다소 감소하기는 하나 37℃ 이하의 온도에서는 알룰로스 전환활성을 80% 이상으로 38주 동안 유지되며, 특히 60 ℃의 고온에서도 38주에서도 75% 이상 효소의 안정성이 높게 유지됨을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 담체로서 알긴산 또는 알긴산염과, 상기 담체에 고정화된 알룰로스 에피머화 효소를 생산하는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 미생물의 균체를 포함하며, 수분 함량이 14 %이하인, 알룰로스 생산용 건조 비드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 건조 비드는, 수분 함량 90% 이상을 갖는 미건조 비드의 반응탑 충진율(부피) 100%을 기준으로, 35%이하의 반응탑 충진율(부피%)을 갖는 것인 비드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 건조 비드의 평균 입경 100%을 기준으로, 과당-함유 기질로 복원 처리한 후 얻어지는 복원 비드의 평균 입경이 120 내지 190%인 건조 비드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 건조 비드는, 과당-함유 기질로 복원 처리한 후 얻어지는 복원 비드의 평균 입경이 1.1 내지 1.9mm 것인 건조 비드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 건조 비드는, 제조 직후 건조 비드의 전환 활성 100%를 기준으로, 제조 후 25℃ 온도조건에서 38주 기간 동안 보관한 후에 비드의 알룰로스 전환 활성을 60% 이상을 가지는 것인 건조 비드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 건조 비드는, 제조 직후 건조 비드의 전환 활성 100%를 기준으로, 제조 후 60℃ 온도조건에서 38주 기간 동안 보관 후에 비드의 알룰로스 전환 활성을 50% 이상을 가지는 것인 건조 비드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 건조 비드는 평균 겉보기 밀도 (bulky density)가 0.6 내지 0.8 Kg/L인 건조 비드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 비드는, 상기 균체와 담체의 혼합액을 2가 양이온 염화화합물이 포함된 반응액에 적가하여 제조된 균체 고정화 비드인 건조 비드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 균체와 알긴산 담체를 포함하는 비드가 팽윤 억제제의 코팅층을 포함하는 것인 건조 비드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 팽윤 억제제는 키토산, 키틴, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌이민(PEI), 키토-올리고당(Chito-oligosaccharide) 및 폴리라이신으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 건조 비드.
  11. 제1항에 있어서, 상기 균체는 균체를 함유하는 용액을 30 내지 70 ℃의 온도에서 처리하여 열처리된 사균체인 건조 비드.
  12. 제1항에 있어서, 상기 건조 비드를 과당-함유 기질로 복원 처리한 후 얻어지는 복원 비드가, 50 중량%의 과당액을 통액하여 알룰로스 전환율이 25% 이상으로 유지되는 기질통액유속(mL/min)이, 미건조 비드 100%를 기준으로 110 내지 300인 것인 건조비드.
  13. 제11항에 있어서, 상기 건조 비드를 복원하여 과당-함유 원료로 알룰로스 전환 반응을 수행한 비드의 알룰로스 생산량은, 균체 열처리와 건조를 수행하지 않는 비드의 알룰로스 생산량 100%을 기준으로 상대적 생산량이 110 % 이상인 건조 비드.
  14. 알룰로스 에피머화 효소를 생산하는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주의 균체와 담체로서 알긴산 또는 이의 염을 포함하는 혼합 용액을, 2가 양이온 염화화합물이 포함된 반응액에 적하하여 균체 고정화 비드를 형성하는 단계; 및 상기 비드에 건조처리를 수행하는 단계;를 포함하는 알룰로스 생산용 건조 비드의 제조방법.
  15. 제1항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 따른 알룰로스 생산용 건조 비드를 포함하는 알룰로스 생산용 조성물.
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