KR20210039289A - Methods and apparatus for extracting nucleic acids maintaining two-dimensional spatial information from samples containing nucleic acids, and method and kit for spatial sequencing analysis using the same - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method and apparatus for extracting a nucleic acid and, more particularly, to a method and apparatus for extracting a nucleic acid from a sample containing the nucleic acid in such a way that 2-dimensional position information as it was in the sample is retained. The nucleic acid extracting method and apparatus according to the present invention is useful since the extraction can be performed such that the position information of the nucleic acid is retained in the sample, and by using the same, positions of individual reads in the original sample, obtained from the gene analysis result, can be analyzed.

Description

핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보를 유지한 채 추출하는 방법 및 장치, 이를 이용한 위치정보를 포함하는 유전체 분석 방법{Methods and apparatus for extracting nucleic acids maintaining two-dimensional spatial information from samples containing nucleic acids, and method and kit for spatial sequencing analysis using the same}A method and apparatus for extracting nucleic acids from a sample containing nucleic acids while maintaining two-dimensional position information, and a genome analysis method including position information using the same.{Methods and apparatus for extracting nucleic acids maintaining two-dimensional spatial information from samples containing nucleic acids, and method and kit for spatial sequencing analysis using the same}

본 발명은 핵산을 추출하는 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 시료 내에 위치했던 2차원의 위치가 유지되게 추출하는 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 시료 내 위치 정보가 유지되도록 핵산을 추출한 후 위치에 맞게 배치된 바코드를 결합하여 유전자 서열을 분석한 후, 분석된 위치바코드에 따라 각각의 개별 유전자 서열을 시료 이미지 위에 배치하여 개별 유전자 서열의 시료 내 원위치를 결정하는 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다. The present invention relates to a method and apparatus for extracting a nucleic acid, and more specifically, to a method and apparatus for extracting a nucleic acid from a sample containing the nucleic acid so that the two-dimensional position in the sample is maintained, and more specifically, After extracting the nucleic acid so that the location information in the sample is maintained, the gene sequence is analyzed by combining the barcodes arranged according to the location, and then each individual gene sequence is placed on the sample image according to the analyzed location barcode. It relates to a method for determining the home position and an apparatus therefor.

사람의 신체는 1014 개 이상의 세포를 포함하며 250개 이상의 상이한 기관과 조직으로 조직화된다. 복잡한 기관, 예컨대 뇌의 발달 및 조직화는 아직도 다 알려지지 않았고, 따라서 그런 조직의 발달 및 기능을 조절하는 유전자를 조사하고 측정하기 위한 정량적 방법을 사용하여 그런 조직에서 발현된 유전자의 발현을 분석할 필요가 있다. 기관은 그 자체가 조직화되고 유지되어야 할 모든 생체 기능, 예컨대 영양분 수송, 방어 등을 가능하게 하는 분화된 세포의 혼합체이다. 따라서 세포 기능은 특별한 조직 구조 내에 있는 세포의 위치 및 직접적이든 간접적이든 그 조직 내에서 다른 세포와 공유하는 상호작용에 좌우된다. 그러므로 이들 상호작용이 조직 내에서 전사 수준에서 각 세포에 영향을 미치는 방법을 구별할 필요가 있으며, 생물학적인 프로세스를 명확하게 확인하기 위해서 유전자가 조직 내 분포되어 있는 형태와 발현 수준을 연계하여 분석할 필요가 있다.The human body contains more than 10 14 cells and is organized into more than 250 different organs and tissues. The development and organization of complex organs, such as the brain, is still unknown, and therefore it is necessary to analyze the expression of genes expressed in such tissues using quantitative methods to investigate and measure the genes that control the development and function of such tissues. have. An organ is itself a mixture of differentiated cells that enables all biological functions to be organized and maintained, such as nutrient transport, defense, etc. Thus, cellular function depends on the location of cells within a particular tissue structure and the interactions they share with other cells within that tissue, whether directly or indirectly. Therefore, it is necessary to distinguish how these interactions affect each cell at the level of transcription within the tissue, and in order to clearly identify the biological process, it is necessary to analyze the gene distribution in the tissue by linking the form and expression level. There is a need.

초특급 게놈 서열화를 위해 NGS 기술의 개발은 생명 과학에서 획기적인 사건을 대표한다(Petterson E et al, Genomics. 2009; 93:105-11). 이런 신기술은 DNA 서열화 비용을 극적으로 감소시켰고, 특이한 개체의 게놈을 포함하여 고등 유기체의 게놈을 유례없는 속도로 측정하는 것을 가능하게 하였다(Wade CM et al Science. 2009; 326: 865-7; Rubin J et al, Nature 2010; 464:587-91). 고처리율 게놈학의 새로운 진보는 생물학 연구의 풍경을 새롭게 조성하였고, 게놈의 완전한 특성확인 외에 전체 전사체를 디지털 및 정량적 방식으로 연구하는 것도 가능하게 하였다. 이들 포괄적인 데이터 세트를 가시화하고 집약하기 위한 생물정보학 도구들도 또한 최근 수년동안 상당히 개선되었다.The development of NGS technology for ultra-high-end genomic sequencing represents a milestone in life sciences (Petterson E et al, Genomics. 2009; 93:105-11). These new technologies dramatically reduced the cost of DNA sequencing and made it possible to measure genomes of higher organisms, including those of specific individuals, at an unprecedented rate (Wade CM et al Science. 2009; 326: 865-7; Rubin). J et al, Nature 2010; 464:587-91). New advances in high-throughput genomics have created a new landscape for biological research, and in addition to the complete characterization of the genome, it is also possible to study the entire transcript in digital and quantitative ways. Bioinformatics tools to visualize and aggregate these comprehensive data sets have also improved significantly in recent years.

NGS 기술의 발전으로 전장유전체 분석, 전사체 분석 등을 통하여 생물의 유전자 이상(SNP, Insertion, Deletion, CNV, Gene fusion)과 유전자 발현이상 등 질병과 관련된 마커를 손쉽게 도출하고 평가하는 것이 기능해졌으며, 이로 인하여 Sanger sequencing, Real-time PCR을 사용한 돌연변이 혹은 유전자 발현 분석을 대체할 수 있게 되었고, 심지어 이러한 분석들은 한번의 NGS 분석으로 도출되고 있다. 하지만, 조직의 형태가 유지된 상태에서 분석되는 조직염색 기법을 사용한 발현분석(Immunohistochemistry, IHC), 특정 유전자의 조직 내 원위치 검사법(Fluorescence in-situ hybridization, FISH) 등의 위치정보가 포함된 조직 분석 기법의 경우는 NGS 분석으로 완전히 대체하지 못하고 있는 실정이다. 또한, 단일세포 NGS 분석으로 개별 세포의 유전정보를 분석하고 있으나, 세포간의 관계분석은 이루어지지 못하고 있다.With the development of NGS technology, it has become possible to easily derive and evaluate markers related to diseases such as genetic abnormalities (SNP, Insertion, Deletion, CNV, Gene fusion) and gene expression abnormalities of organisms through full-length genome analysis and transcript analysis. As a result, Sanger sequencing and real-time PCR can be substituted for mutation or gene expression analysis, and even these analyzes are derived from a single NGS analysis. However, tissue analysis that includes location information such as expression analysis (Immunohistochemistry, IHC) using a tissue staining technique that is analyzed while the shape of the tissue is maintained, and location information such as fluorescence in-situ hybridization (FISH) of a specific gene. In the case of the technique, NGS analysis has not been completely replaced. In addition, the genetic information of individual cells is analyzed by single-cell NGS analysis, but the relationship between cells has not been analyzed.

최근 암 조직 등 조직 내 암세포의 다양성(Heterogeneity)을 분석하거나, 암 조직 내 암세포와 면역세포의 관계인 암 미세 환경(Tumor microenvironment) 분석에 관심이 높아짐에 따라 조직의 구획에 따라 나뉘어 추출된 핵산을 NGS 분석하는 방법이 수행된 바 있으나, 구획의 수준이 수 밀리미터 수준으로 해당 구획 내 세포들의 정보가 혼재되어 나타난다는 단점과 각각의 분리된 구획을 독립적으로 분석해야 하는 단점을 가지고 있다. 또한, 최근 mRNA를 위치별로 다른 서열을 가지는 바코드핵산이 연결된 poly thymine을 글라스에 고정하여 역전사후 NGS 전사체 분석을 수행하는 Spatial transcriptomics 방법이 개발되었으나, 해당 방법은 poly A(adenine)가 손상되지 않은 mRNA 분석에 국한되기 때문에 poly A와 거리가 먼 mRNA의 5말단 유전자 서열은 분석이 불가능하고 mRNA의 3말단 손상여부에 따라 분석의 효율이 달라지게 된다. 또한, 분석을 위한 시간 소모가 많은 등 사용성이 낮은 한계를 가지고 있다.As interest in analyzing the diversity of cancer cells in tissues such as cancer tissues (Heterogeneity) or analysis of the cancer microenvironment, which is the relationship between cancer cells and immune cells in cancer tissues, is increasing, the extracted nucleic acids are divided according to tissue compartments, and the extracted nucleic acids are NGS. Although the method of analysis has been performed, it has the disadvantage that the level of the compartment is several millimeters, and the information of the cells in the compartment is mixed and it has the disadvantage of having to analyze each separated compartment independently. In addition, recently, a Spatial transcriptomics method was developed to perform NGS transcript analysis after reverse transcription by fixing a poly thymine linked to a barcode nucleic acid having a different sequence for each position on a glass, but the method does not damage poly A (adenine). Since it is limited to mRNA analysis, it is impossible to analyze the gene sequence at the 5th end of the mRNA, which is far from poly A, and the efficiency of the analysis varies depending on whether the 3rd end of the mRNA is damaged. In addition, it has a limitation of low usability, such as a lot of time consuming for analysis.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고자 유전체 분석 결과물의 조직 내 원위치를 밝혀내는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 위치별로 다른 서열을 가지는 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치별로 배치되어 고정된 기판에 핵산을 포함하는 시료를 올리고, 핵산을 추출하고 고정화시킨 다음, 추출된 시료 핵산과 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머를 표적 핵산과 혼성화한 후, 이를 신장시키고 증폭하여 유전체 분석할 경우, 시료 내 핵산의 위치를 지정할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to develop a method for revealing the original location of the result of genome analysis in the tissues to solve the above problems, and as a result, primers including a location barcode sequence having a different sequence for each location were arranged and fixed at each designated location. When a sample containing a nucleic acid is uploaded to a substrate, a nucleic acid is extracted and immobilized, the extracted sample nucleic acid and a primer containing a position barcode sequence are hybridized with a target nucleic acid, and then extended and amplified to analyze the genome. It was confirmed that the position of the nucleic acid could be specified, and the present invention was completed.

본 발명의 목적은 핵산 함유 시료에서 추출된 핵산의 시료 내 원위치를 밝혀내는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method of revealing the original location of a nucleic acid extracted from a nucleic acid-containing sample in a sample.

본 발명의 다른 목적은 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보가 유지된 채 추출하는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method and apparatus for extracting a nucleic acid of a sample containing the nucleic acid while maintaining two-dimensional positional information.

본 발명의 또 다른 목적은 위치별로 다른 서열을 가지는 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치별로 배치되어 고정된 기판을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a substrate in which primers including a position barcode sequence having a different sequence for each position are disposed at designated positions and fixed.

본 발명의 또 다른 목적은 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보가 유지된 채 추출하는 핵산 추출 시약을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a nucleic acid extraction reagent for extracting a nucleic acid from a sample containing the nucleic acid while maintaining two-dimensional positional information.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치에 배치되어 고정된 기판을 준비하는 단계; (b) 핵산을 함유한 시료를 상기 (a) 단계의 기판에 배치하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 시료에서 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 추출한 핵산을 (a) 단계의 기판에 고정하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 고정된 핵산과 인접한 프라이머를 혼성화하는 단계; (f) 상기 (e) 단계의 혼성화된 프라이머를 신장하여 상보핵산을 제작하는 단계; (g) 상기 (f) 단계의 상보핵산을 증폭하여 위치바코드 서열이 결합된 증폭산물을 수득하는 단계를 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보를 포함하는 증폭산물의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of: (a) preparing a substrate in which a primer including a position barcode sequence is disposed at a designated position and fixed; (b) disposing a sample containing a nucleic acid on the substrate of step (a); (c) extracting the nucleic acid from the sample of step (b) and delivering it to the surface of the substrate; (d) fixing the extracted nucleic acid in step (c) to the substrate in step (a); (e) hybridizing the primers adjacent to the nucleic acid immobilized in step (d); (f) preparing a complementary nucleic acid by extending the hybridized primer of step (e); It provides a method for preparing an amplification product including position information from a sample containing a nucleic acid comprising the step of (g) amplifying the complementary nucleic acid of step (f) to obtain an amplified product to which the position barcode sequence is bound.

본 발명은 또한, (a) 상기 방법으로 증폭산물을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물을 차세대 염기서열 분석하여 리드를 수득하는 단계; 및 (c) 수득한 리드를 분석하여 핵산을 함유한 시료 내 수득한 개별 리드의 위치를 결정하는 단계를 포함하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법을 제공한다.The present invention also includes the steps of (a) obtaining an amplification product by the above method; (b) obtaining a read by performing next-generation sequencing of the amplified product of step (a); And (c) analyzing the obtained read to determine the location of the obtained individual read in the sample containing the nucleic acid.

본 발명은 또한, 완충용액 패드; 시료 패드; 위치바코드 서열이 포함된 프라이머가 고정된 핵산 포획 기판; 완충용액 패드; 및 가열판을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치를 제공한다.The present invention also includes a buffer solution pad; Sample pad; A nucleic acid capture substrate to which a primer containing a position barcode sequence is fixed; Buffer solution pad; And an apparatus for extracting a nucleic acid from a sample containing a nucleic acid including a heating plate while maintaining the original position of the nucleic acid.

본 발명은 또한, 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보가 유지된 채 추출된 핵산과 혼성화 되어 유전자 서열 및 길이로 위치를 할당하는 것을 특징으로 하는 위치바코드 서열이 포함된 프라이머가 지정위치에 배열되어 고정된 핵산 수득용 기판을 제공한다.In the present invention, a primer containing a position barcode sequence, characterized in that it hybridizes with a nucleic acid extracted from a sample containing a nucleic acid while maintaining position information and assigns a position by gene sequence and length, is arranged at a designated position and fixed. A substrate for obtaining the prepared nucleic acid is provided.

본 발명은 또한, 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease 및 Lysozyme으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소; Tween-20, Triton X-100 및 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 계명활성제; DNA 또는 RNA 분해효소 및 전류이동완충액을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출 시약을 제공한다.The present invention also includes at least one enzyme selected from the group consisting of Proteinase K, Protease, and Lysozyme capable of decomposing a substrate surrounding a nucleic acid; At least one active agent selected from the group consisting of Tween-20, Triton X-100, and sodium dodecyl sulfate (SDS); A nucleic acid extraction reagent for extracting a nucleic acid while maintaining the original position of the nucleic acid from a sample containing a nucleic acid containing a DNA or RNA degrading enzyme and an electric current transfer buffer is provided.

본 발명에 따른 방법은 지정된 위치에 배열되어 부분 고정된 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머가 배치되어 고정된 기판에 핵산이 함유된 시료를 올린 후 2차원의 위치가 보존되게 핵산을 추출하고, 인접한 위치바코드 서열을 포함 프라이머와 위치가 보존되게 추출된 핵산을 혼성화시켜 위치 정보가 포함된 상보핵산을 제작하고 증폭하면 위치정보가 포함된 염기서열분석을 가능하게 하여, 세포간-, 조직간-, 미생물간-, 무기물-미생물간의 유전자 발현, 변이 등에 기반한 관계분석이 가능하고, 원 위치 정보가 보존된 다수의 유전자를 단일가닥 핵산과 이중가닥 핵산을 대상으로 분석하는 것이 가능하다는 면에서 유용하다.In the method according to the present invention, a primer including a partially fixed position barcode sequence is arranged at a designated position, and a sample containing a nucleic acid is placed on a fixed substrate, and then the nucleic acid is extracted so that the two-dimensional position is preserved, and the adjacent position By hybridizing the extracted nucleic acid to preserve the position with the primer containing the barcode sequence, the complementary nucleic acid containing the positional information is produced and amplified to enable the sequencing analysis including the positional information. It is useful in that it is possible to analyze the relationship based on gene expression and mutation between liver-, mineral-microorganism, etc., and that it is possible to analyze multiple genes whose original location information is preserved for single-stranded nucleic acids and double-stranded nucleic acids.

도 1은 본 발명의 간접 원위치 유전체분석(indirect in-situ sequencing)의 개념을 나타낸 간략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산을 포함하는 시료로부터 2차원의 위치정보를 유지한 채 핵산을 추출하고 기판에 전달하는 장치를 나타낸 도면이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산을 포함하는 시료로부터 2차원의 위치정보를 유지한 채 핵산을 추출 및 변성하고 기판에 전달하는 장치를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 사용된 위치바코드 서열을 포함하는 고정형 프라이머의 구조를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 사용된 단일분자 지정을 위한 서열 및 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머의 구조를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에 사용된 액상형 프라이머의 구조를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에 사용된 위치바코드 서열이 결합된 상보핵산을 생성하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 사용된 이중가닥 핵산으로부터 위치바코드 서열이 결합된 상보핵산을 생성하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 위치바코드 서열이 결합된 상보핵산을 증폭하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 간접 원위치 유전체분석(indirect in-situ sequencing)의 분석 결과물 리드(read)의 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 간접 원위치 단일분자 유전체분석(indirect in-situ single molecule sequencing)의 분석 결과물 리드의 구조를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 유전체분석(indirect in-situ sequencing)의 분석 절차를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 유전체분석(indirect in-situ sequencing)의 분석 결과물 리드와 냉동 조직 절편 사진을 결합한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머가 배치된 핵산수득 기판을 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 위치바코드 서열의 배치를 나타낸 도면이다.
도 16는 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 염기서열 데이터 분석 절차를 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 염기서열 데이터 분석 절차에 따른 결과물을 나타낸 도면이다.1 is a simplified diagram showing the concept of indirect in-situ sequencing according to the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing an apparatus for extracting nucleic acid from a sample containing nucleic acid according to an embodiment of the present invention while maintaining two-dimensional position information and delivering it to a substrate.
3 is a diagram showing an apparatus for extracting, denatured, and delivering a nucleic acid to a substrate while maintaining two-dimensional positional information from a sample containing a nucleic acid according to an embodiment of the present invention.
4 is a diagram showing the structure of a fixed-type primer including the position barcode sequence used in the present invention.
5 is a diagram showing the structure of a primer including a sequence for designating a single molecule and a position barcode sequence used in the present invention.
6 is a diagram showing the structure of a liquid primer used in the present invention.
7 is a diagram showing a method of generating a complementary nucleic acid to which the position barcode sequence used in the present invention is bound.
8 is a diagram showing a method of generating a complementary nucleic acid to which a position barcode sequence is bound from a double-stranded nucleic acid used in the present invention.
9 is a diagram showing a method of amplifying the complementary nucleic acid to which the position barcode sequence of the present invention is bound.
FIG. 10 shows the structure of an analysis result read of the indirect in-situ sequencing of the present invention.
FIG. 11 shows the structure of an analysis result lead of indirect in-situ single molecule sequencing according to the present invention.
12 shows an analysis procedure of indirect in-situ sequencing according to an embodiment of the present invention.
13 shows a result of combining a result of an analysis result read and a frozen tissue section photograph of indirect in-situ sequencing according to an embodiment of the present invention.
14 is a photograph showing a nucleic acid acquisition substrate on which a primer including a position barcode sequence of the present invention is disposed.
15 is a view showing the arrangement of the position barcode sequence according to an embodiment of the present invention.
16 is a diagram showing a procedure for analyzing indirect in situ single molecule sequence data according to an embodiment of the present invention.
17 is a view showing a result of an indirect in situ single molecule sequence data analysis procedure according to an embodiment of the present invention.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by an expert skilled in the art to which the present invention belongs. In general, the nomenclature used in this specification and the experimental methods described below are well known and commonly used in the art.

제1, 제2, A, B 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않으며, 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 이하 설명하는 기술의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.Terms such as 1st, 2nd, A, B, etc. may be used to describe various components, but the components are not limited by the above terms, and only for the purpose of distinguishing one component from other components. Is only used. For example, a first component may be referred to as a second component, and similarly, a second component may be referred to as a first component without departing from the scope of the rights of the technology described below. The term and/or includes a combination of a plurality of related listed items or any of a plurality of related listed items.

본 명세서에서 사용되는 용어에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 해석되지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함한다" 등의 용어는 설시된 특징, 개수, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 의미하는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 개수, 단계 동작 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.In terms of the terms used in the present specification, expressions in the singular should be understood as including plural expressions unless clearly interpreted differently in context, and terms such as "includes" are specified features, numbers, steps, actions, and components. It is to be understood that the presence or addition of one or more other features or numbers, step-acting components, parts or combinations thereof is not meant to imply the presence of, parts, or combinations thereof.

도면에 대한 상세한 설명을 하기에 앞서, 본 명세서에서의 구성부들에 대한 구분은 각 구성부가 담당하는 주기능 별로 구분한 것에 불과함을 명확히 하고자 한다. 즉, 이하에서 설명할 2개 이상의 구성부가 하나의 구성부로 합쳐지거나 또는 하나의 구성부가 보다 세분화된 기능별로 2개 이상으로 분화되어 구비될 수도 있다. 그리고 이하에서 설명할 구성부 각각은 자신이 담당하는 주기능 이외에도 다른 구성부가 담당하는 기능 중 일부 또는 전부의 기능을 추가적으로 수행할 수도 있으며, 구성부 각각이 담당하는 주기능 중 일부 기능이 다른 구성부에 의해 전담되어 수행될 수도 있음은 물론이다.Prior to the detailed description of the drawings, it is intended to clarify that the division of the constituent parts in the present specification is merely divided by the main function that each constituent part is responsible for. That is, two or more constituent parts to be described below may be combined into one constituent part, or one constituent part may be divided into two or more for each more subdivided function. In addition, each of the constituent units to be described below may additionally perform some or all of the functions of other constituent units in addition to its own main function, and some of the main functions of each constituent unit are different. It goes without saying that it can also be performed exclusively by.

또, 방법 또는 동작 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.In addition, in performing the method or operation method, each of the processes constituting the method may occur differently from the specified order unless a specific order is clearly stated in the context. That is, each of the processes may occur in the same order as the specified order, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the reverse order.

본 발명에서는, 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머가 공간적으로 지정 위치에 배치된 후, 고정된 기판을 사용하여 핵산이 포함된 시료의 핵산을 2차원의 위치가 유지된 채 추출하고 위치바코드 서열이 결합된 상보핵산을 생산하고 증폭하여 유전체 분석을 할 경우, 유전체 분석의 결과인 개별 리드(read)에 위치바코드 서열에 따라 좌표를 지정하여 조직의 원위치에 배치할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.In the present invention, after the primer containing the position barcode sequence is spatially arranged at a designated position, the nucleic acid of the sample containing the nucleic acid is extracted while maintaining the two-dimensional position using a fixed substrate, and the position barcode sequence is combined. In the case of genome analysis by producing and amplifying the prepared complementary nucleic acid, it was attempted to confirm that the coordinates can be designated according to the position barcode sequence in individual reads resulting from the genome analysis and placed in the original position of the tissue.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머를 기판의 지정위치에 배치한 후 고정한 다음, 시료의 핵산을 기판 위에서 2차원의 위치 유지되도록 추출하고, 기판 위에서 프라이머를 표적핵산에 결합하는 과정을 거친 후 증폭하여 NGS 기법을 통해 유전자 서열을 분석하여 그 위치 정보를 결정할 경우(도 1), 분석된 염기서열 결과물 리드 각각을 조직사진 내 원위치에 배치하여 그 위치를 간접적으로 확인할 수 있다는 것을 확인하였다(도 13). That is, in an embodiment of the present invention, a primer including a position barcode sequence is placed at a designated position on a substrate and fixed, and then the nucleic acid of the sample is extracted to maintain a two-dimensional position on the substrate, and the primer is applied to the target nucleic acid on the substrate. In the case of determining the location information by analyzing the gene sequence through the NGS technique after amplification after passing through the process of binding to (Fig. 1), each of the analyzed nucleotide sequence results reads are placed in their original positions in the tissue photo to indirectly check the location. It was confirmed that it can be (Fig. 13).

따라서, 본 발명은 일관점에서, Therefore, the present invention is consistent with,

(a) 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치에 배치되어 고정된 기판을 준비하는 단계;(a) preparing a substrate fixed by placing a primer including a position barcode sequence at a designated position;

(b) 핵산을 함유한 시료를 상기 (a) 단계의 기판에 배치하는 단계;(b) disposing a sample containing a nucleic acid on the substrate of step (a);

(c) 상기 (b) 단계의 시료에서 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계;(c) extracting the nucleic acid from the sample of step (b) and delivering it to the surface of the substrate;

(d) 상기 (c) 단계의 추출한 핵산을 (a) 단계의 기판에 고정하는 단계;(d) fixing the extracted nucleic acid in step (c) to the substrate in step (a);

(e) 상기 (d) 단계에서 고정된 핵산과 인접한 프라이머를 혼성화하는 단계; (e) hybridizing the primers adjacent to the nucleic acid immobilized in step (d);

(f) 상기 (e) 단계의 혼성화된 프라이머를 신장하여 상보핵산을 제작하는 단계(f) preparing complementary nucleic acid by extending the hybridized primer of step (e)

(g) 상기 (f) 단계의 상보핵산을 증폭하여 위치바코드 서열이 결합된 증폭산물을 수득하는 단계를 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보를 포함하는 증폭산물의 제조방법에 관한 것이다.(g) amplifying the complementary nucleic acid of the step (f) to obtain an amplified product to which the position barcode sequence is bound, relates to a method for producing an amplified product including position information from a sample containing a nucleic acid.

본 발명에서 용어 "뉴클레오시드"는 핵산 염기가 당 모이어티에 연결된 글리코실아민 화합물을 의미한다. "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 포스페이트를 의미한다. 뉴클레오티드는 표 1에 기재된 것과 같이, 그의 뉴클레오시드에 상응하는 알파벳 문자(문자 명칭)를 사용하여 표시될 수 있다. 예컨대, A는 아데노신(아데닌 핵염기를 함유하는 뉴클레오시드)을 지칭하고, C는 시티딘을 지칭하고, G는 구아노신을 지칭하고, U는 우리딘을 지칭하고, T는 티미딘(5-메틸 우리딘)을 지칭한다. W는 A 또는 T/U를 지칭하고, S는 G 또는 C를 지칭한다. N은 랜덤한 뉴클레오시드를 표시하고, dNTP는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 의미한다. N은 A, C, G, 또는 T/U 중 어떤 것도 될 수 있다.In the present invention, the term "nucleoside" refers to a glycosylamine compound in which a nucleic acid base is linked to a sugar moiety. "Nucleotide" means nucleoside phosphate. Nucleotides can be represented using the alphabetic letters (letter designations) corresponding to their nucleosides, as described in Table 1. For example, A refers to adenosine (nucleoside containing an adenine nucleobase), C refers to cytidine, G refers to guanosine, U refers to uridine, T is thymidine (5- Methyl uridine). W refers to A or T/U, and S refers to G or C. N denotes a random nucleoside, and dNTP denotes a deoxyribonucleoside triphosphate. N can be any of A, C, G, or T/U.

Figure pat00001
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본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 올리고머를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "서열"은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 명세서를 통틀어, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 문자의 서열에 의해 표시될 때마다, 뉴클레오티드는 좌에서 우로 5'→순서이다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA, RNA, 또는 그의 유사체(예컨대, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 개질된 염기 및/또는 골격(예컨대, 개질된 포스페이트 연결부 또는 개질된 당 모이어티)도 또한 포함할 수 있다. 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하는 합성 골격의 비-제한적 예시는 포스포로티오에이트 연결부, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 자일로스핵산, 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.In the present invention, the term "oligonucleotide" means an oligomer of nucleotides. As used herein, the term "nucleic acid" refers to a polymer of nucleotides. As used herein, the term “sequence” refers to the nucleotide sequence of an oligonucleotide or nucleic acid. Throughout the specification, whenever an oligonucleotide or nucleic acid is represented by a sequence of letters, the nucleotides are in the order of 5'→ from left to right. Oligonucleotides or nucleic acids can be DNA, RNA, or analogs thereof (eg, phosphorothioate analogs). Oligonucleotides or nucleic acids may also contain modified bases and/or backbones (eg, modified phosphate linkages or modified sugar moieties). Non-limiting examples of synthetic backbones that confer stability and/or other benefits to nucleic acids may include phosphorothioate linkages, peptide nucleic acids, locked nucleic acids, xylose nucleic acids, or analogs thereof.

본 발명에서 용어 “핵산”은 뉴클레오티드 폴리머를 지칭하며, 달리 한정되지 않는다면 자연적으로 발생한 뉴클레오티드와 유사한 방식(예컨대, 혼성화)으로 작용할 수 있는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체(analog)를 포함한다.In the present invention, the term “nucleic acid” refers to a nucleotide polymer and, unless otherwise limited, includes known analogs of natural nucleotides that can act in a manner similar to (eg, hybridization) naturally occurring nucleotides.

용어 핵산은, 예를 들어 유전체 DNA; 상보 DNA(cDNA)(이는 보통 전령 RNA(mRNA)의 역전사 또는 증폭으로 얻어지는 mRNA의 DNA 표현임); 합성으로 또는 증폭으로 생성된 DNA 분자; 및 mRNA를 포함한 임의의 형태의 DNA 또는RNA를 포함한다.The term nucleic acid includes, for example, genomic DNA; Complementary DNA (cDNA) (which is usually the DNA representation of mRNA obtained by reverse transcription or amplification of messenger RNA (mRNA)); DNA molecules produced synthetically or amplified; And any form of DNA or RNA including mRNA.

용어 핵산은 단일 가닥 분자뿐만 아니라 이중 또는 삼중 가닥 핵산을 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동연(coextensive)일 필요는 없다(즉, 이중 가닥 핵산은 양 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일 필요는 없다).The term nucleic acid includes single-stranded molecules as well as double or triple-stranded nucleic acids. In double or triple stranded nucleic acids, the nucleic acid strand need not be coextensive (ie, the double stranded nucleic acid need not be double stranded along the entire length of both strands).

용어 핵산은 또한 메틸화 및/또는 캡핑과 같은 것에 의한 이의 임의의 화학적 개질을 포함한다. 핵산 개질은 개별적인 핵산 염기 또는 핵산 전체에 추가적인 전하, 분극률, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 기능성을 포함하는 화학기의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 2' 위치 당 개질, 5 위치 피리미딘 개질, 8 위치 퓨린개질, 시토신 환외(exocyclic) 아민에서의 개질, 5-브로모-우라실의 치환, 주쇄 개질, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 특이 염기 쌍 조합 등과 같은 염기 개질을 포함할 수 있다.The term nucleic acid also includes any chemical modification thereof, such as by methylation and/or capping. Nucleic acid modification may include the addition of chemical groups including additional charge, polarization, hydrogen bonding, electrostatic interactions, and functionality to individual nucleic acid bases or to the entire nucleic acid. These modifications include modifications per 2'position, 5 position pyrimidine modifications, 8 position purine modifications, modifications in cytosine exocyclic amines, substitution of 5-bromo-uracil, main chain modification, isobase isocytidine and isoguanidine. And base modification such as specific base pair combination, such as.

핵산(들)은 고상 매개 화학적 합성(solid phase-mediated chemical synthesis)과 같은 완전한 화학적 합성 과정으로부터, 핵산을 생성하는 임의의 종으로부터 분리를 통해서와 같은 생물학적 공급원으로부터, 또는 DNA 복제, PCR 증폭, 역전사와 같은 분자 생물학 도구에 의한 핵산의 취급과 관련된 과정으로부터, 또는 이들 과정의 결합으로부터 유도될 수 있다.The nucleic acid(s) can be from a complete chemical synthesis process such as solid phase-mediated chemical synthesis, from a biological source such as through separation from any species producing the nucleic acid, or from DNA replication, PCR amplification, reverse transcription. Can be derived from processes related to the handling of nucleic acids by molecular biology tools such as, or from a combination of these processes.

본 발명에서 용어 “상보”는 2개의 뉴클레오티드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오티드가 다른 핵산의 뉴클레오티드와 수소 결합을 할 수 있다면, 2개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 뉴클레오티드의 일부만이 결합하여 2개의 단일 가닥 핵산 분자 사이의 상보성은 “부분적”일 수 있거나, 또는 전체 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재할 때 상보성은 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.In the present invention, the term “complementary” refers to the ability to accurately pair between two nucleotides. That is, if a nucleotide can hydrogen bond with a nucleotide of another nucleic acid at a given position in a nucleic acid, the two nucleic acids are considered to be complementary to each other at that position. Complementarity between two single-stranded nucleic acid molecules may be “partial” due to the binding of only a portion of the nucleotides, or complementarity may be complete when total complementarity exists between the single-stranded molecules. The degree of complementarity between nucleic acid strands significantly affects the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 핵산 합성 반응을 프라이밍하기 위한 표적 핵산 서열(예컨대, 증폭될 DNA 주형)에 혼성화되는 짧은 선형 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드, 또는 키메라 서열일 수 있다. 프라이머는 천연, 합성, 또는 개질된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 프라이머 길이의 상한 및 하한 둘 모두는 실험적으로 결정된다. 프라이머 길이의 하한은 핵산 증폭 반응 조건에서 표적 핵산과의 혼성화 후 안정한 듀플렉스를 형성하는데 필요한 최소 길이이다. 매우 짧은 프라이머(흔히 3 개 뉴클레오티드 미만 길이)는 이러한 혼성화 조건 하에서 표적 핵산과의 열열학적으로 안정한 듀플렉스를 형성하지 않는다. 상한은 표적 핵산에서 미리 결정된 핵산 서열 이외의 영역에서 듀플렉스 형성을 가질 수 있는 가능성에 의해 보통 결정된다. 일반적으로, 적합한 프라이머 길이는 약 3 개 뉴클레오티드 길이 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이의 범위에 있다.In the present invention, the term "primer" refers to a short linear oligonucleotide hybridized to a target nucleic acid sequence (eg, a DNA template to be amplified) for priming a nucleic acid synthesis reaction. Primers can be RNA oligonucleotides, DNA oligonucleotides, or chimeric sequences. Primers may contain natural, synthetic, or modified nucleotides. Both the upper and lower limits of the primer length are determined experimentally. The lower limit of the primer length is the minimum length required to form a stable duplex after hybridization with a target nucleic acid under nucleic acid amplification reaction conditions. Very short primers (often less than 3 nucleotides in length) do not form thermothermally stable duplexes with target nucleic acids under these hybridization conditions. The upper limit is usually determined by the likelihood of having a duplex formation in a region other than a predetermined nucleic acid sequence in the target nucleic acid. Generally, suitable primer lengths range from about 3 nucleotides in length to about 50 nucleotides in length.

본 발명에서 용어 “혼성화”는 상보적 염기서열을 가진 단일가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.In the present invention, the term "hybridization" refers to the formation of double-stranded nucleic acids by hydrogen bonding between single-stranded nucleic acids having complementary base sequences, and is used in a similar sense to annealing. However, in a slightly broader sense, hybridization includes cases where the nucleotide sequences between two single strands are completely complementary (perfect match) and, as an exception, some nucleotide sequences are not complementary (mismatch).

가장 광범위한 측면으로 본 발명의 방법은 시료 중의 핵산의 국지화된 검출에 사용될 수 있다. 그러므로 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 시료의 모든 전사체 또는 게놈, 예를 들어 시료의 전역적 전사체를 측정 및/또는 분석하는 데 사용될 수 있다. 그러나 본 발명의 방법은 이것에만 한정되는 것은 아니며 모든 또는 부분적인 전사체 또는 게놈을 측정 및/또는 분석하는 것을 포함한다. 그러므로 본 발명의 방법은 전사체 또는 게놈의 부분 또는 하위세트, 예컨대 하위세트의 유전자에 상응하는 유전자, 예를 들면 예컨대 특정 질병 또는 상태, 조직 유형 등에 관련된 특별한 유전자의 세트를 측정 및/또는 분석하는 것을 포함할 수 있다.In the broadest aspect, the methods of the present invention can be used for localized detection of nucleic acids in a sample. Therefore, in one embodiment, the methods of the invention can be used to measure and/or analyze all transcripts or genomes of a sample, eg, global transcripts of a sample. However, the method of the present invention is not limited thereto and includes measuring and/or analyzing all or partial transcripts or genomes. Therefore, the method of the present invention measures and/or analyzes a set of genes corresponding to a transcript or a portion or a subset of the genome, such as a subset of genes, for example a specific set of genes related to a particular disease or condition, tissue type, etc. May include.

다른 측면으로 보자면, 상기에서 정리된 방법의 단계들은 시료의 공간적으로 규정된 전사체 또는 게놈, 및 특히 공간적으로 얻어진 전역적 전사체 또는 게놈을 얻기 위한 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다.On the other hand, the steps of the method summarized above can be viewed as providing a method for obtaining a spatially defined transcript or genome of a sample, and in particular a spatially obtained global transcript or genome.

또는 달리 본 발명의 방법은 핵산, 그것이 시료 중의 DNA이거나 RNA이거나 그것의 국지화된 또는 공간적인 검출을 위한 방법, 또는 시료 중의 핵산(DNA 또는 RNA)의 국지화된 또는 공간적인 측정 및/또는 분석을 위한 방법이라 할 수 있다. 특히 본 방법은 시료 중의 유전자 발현 또는 게놈 변화의 국지화된 또는 공간적인 검출 또는 측정 및/또는 분석을 위해 사용될 수 있다. 국지화된/공간적인 검출/측정/분석이란 RNA 또는 DNA가 시료 중의 세포 또는 조직 내에서 그것의 원래 위치 또는 국지화에 위치할 수 있다는 것을 의미한다. 그러므로 예를 들어 RNA 또는 DNA는 시료 중의 세포 또는 세포 그룹, 또는 세포 유형에, 또는 시료 내의 특별한 영역에 위치할 수 있다. RNA 또는 DNA의 원래의 국지화 또는 위치(또는 달리 표현하면 시료 중의 RNA 또는 DNA의 국지화 또는 위치), 예컨대 발현된 유전자 또는 게놈 유전자좌는 측정될 수 있다.Or alternatively, the method of the present invention is a nucleic acid, a method for localized or spatial detection of a nucleic acid, whether it is DNA or RNA in a sample, or for localized or spatial measurement and/or analysis of a nucleic acid (DNA or RNA) in a sample. It can be called a method. In particular, the method can be used for localized or spatial detection or measurement and/or analysis of gene expression or genomic changes in a sample. Localized/spatial detection/measurement/analysis means that RNA or DNA can be located in its original location or localization within cells or tissues in a sample. Thus, for example, RNA or DNA may be located in a cell or group of cells in a sample, or in a cell type, or in a specific region within a sample. The original localization or location of RNA or DNA (or alternatively the localization or location of RNA or DNA in a sample), such as an expressed gene or genomic locus, can be determined.

본 발명에서 분석에 사용되는 핵산은 시료 내 DNA 또는 RNA이면 제한 없이 사용할 수 있으며, RNA는 세포에서 발생할 수 있는 모든 RNA 분자일 수 있다. 그러므로 그것은 mRNA, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA, 작은 핵 RNA(snRNA), 작은 인(nucleolar) RNA(snoRNA), 마이크로RNA(miRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 피위(piwi) 단백질과 상호작용하는 RNA(piRNA), 리보솜성 RNA, 안티센스 RNA 또는 비코딩 RNA일 수 있다.The nucleic acid used for analysis in the present invention may be used without limitation as long as it is DNA or RNA in a sample, and RNA may be any RNA molecule that can occur in cells. Therefore, it interacts with mRNA, tRNA, rRNA, viral RNA, small nuclear RNA (snRNA), small phosphorus RNA (snoRNA), microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), and piwi proteins. It may be RNA (piRNA), ribosomal RNA, antisense RNA or non-coding RNA.

본 발명에 있어서, 상기 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머는 3'->5' 순서로 표적 특이적 서열, 위치바코드 서열 및 어댑터 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기의 표적 특이적 서열은 표적 유전자 서열과 상보적인 서열이며, 예컨대, mRNA의 poly A(adenine)에 상보적인 poly T(thymine) 서열, 유전자의 발현, 변이 등의 평가를 위한 핵산에 상보적인 서열 등이 될 수 있다.In the present invention, the primer comprising the position barcode sequence may be characterized in that it comprises a target specific sequence, a position barcode sequence and an adapter sequence in the order of 3'->5'. The target-specific sequence is a sequence complementary to the target gene sequence, for example, a poly T (thymine) sequence complementary to poly A (adenine) of mRNA, a sequence complementary to a nucleic acid for evaluation of gene expression, mutation, etc. Can be, etc.

본 발명에 있어서, 상기 위치바코드는 위치별로 다른 서열 혹은 길이로 구성된 이미 알고 있는 서열로서, 기판의 지정된 위치에 배치시키고 고정시킨 위치바코드를 포함하는 프라이머 각각의 기판 상 위치를 대변하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the position barcode is a known sequence consisting of a different sequence or length for each position, and it is characterized in that it represents a position on each substrate of a primer including a position barcode placed and fixed at a designated position on the substrate. I can.

본 발명에 있어서, 상기 위치바코드 서열은 이미 알고 있는 서열로서 기판의 지정된 위치에 고정시켜 기판의 특정 위치를 나타내는 3 내지 8개로 구성된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the position barcode sequence may be characterized in that it includes a nucleotide sequence consisting of 3 to 8 indicating a specific position of the substrate by fixing at a designated position on the substrate as a known sequence.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 3'->5' 순서로 표적 특이적 서열, 위치바코드 서열, 3 내지 8개 무작위 염기서열 및 어댑터 서열을 포함하여 단일 분자를 지정하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the primer may be characterized in that it designates a single molecule, including a target-specific sequence, a position barcode sequence, 3 to 8 random nucleotide sequences, and an adapter sequence in the order of 3'->5'.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는In the present invention, the step (a) is

(i) 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머를 기판의 지정된 위치에 배치하는 단계; 및(i) arranging a primer including a position barcode sequence at a designated position on a substrate; And

(ii) UV 및 열로 기판에 고정하는 단계;(ii) fixing to the substrate by UV and heat;

를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.It may be characterized in that it is performed in a method comprising a.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는In the present invention, the step (b) is

(a) 시료를 기판 위에 위치시키는 단계; 및(a) placing the sample on the substrate; And

(b) 시료 위에 기질분해 시약이 포함된 버퍼가 함유된 패드를 올리는 단계;(b) placing a pad containing a buffer containing a matrix decomposition reagent on the sample;

를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.It may be characterized in that it is carried out in a method including a.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 30℃내지 65℃의 온도로 핵산이 포함된 샘플의 기질을 분해하여 핵산을 추출하고, 추출된 핵산을 인접한 기판의 표면에 전달 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the step (c) may be characterized in that the nucleic acid is extracted by decomposing the substrate of the sample containing the nucleic acid at a temperature of 30°C to 65°C, and the extracted nucleic acid is delivered to the surface of the adjacent substrate. have.

본 발명에서, 상기 (c) 단계는 (a) 단계의 기판에 핵산이 포함된 시료를 올리고, 핵산을 둘러싸고 있는 단백질 등의 기질을 분해할 수 있는 효소, 예컨대 Proteinase K, Protease, Lysozyme; 계면활성제, 예컨대 Tween-20, Triton X-100, 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 등이 포함된 완충용액을 머금은 흡수지로 덮은 후 일정 시간 동안 반응시켜 핵산이 핵산을 둘러싸고 있는 기질에서 유출되어 맞닿아 있는 (a) 단계의 기판의 표면에 위치할 수 있도록 하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (c) includes an enzyme capable of decomposing a substrate, such as a protein surrounding the nucleic acid, by uploading a sample containing a nucleic acid to the substrate of step (a), such as Proteinase K, Protease, Lysozyme; After covering with an absorbent paper containing a buffer solution containing surfactants such as Tween-20, Triton X-100, sodium dodecyl sulfate (SDS), etc., the nucleic acid is released from the substrate surrounding the nucleic acid by reacting for a certain period of time. It may be characterized in that it can be positioned on the surface of the substrate in step (a) in contact with each other.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계는 핵산을 기판 표면에 전달할 수 있는 방법이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 전기영동(electrophoresis) 또는 유체의 이동을 사용한 능동적인 전달일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the step of extracting and delivering the nucleic acid in step (c) to the surface of the substrate can be used without limitation as long as it is a method capable of delivering the nucleic acid to the surface of the substrate, but preferably, electrophoresis or fluid movement It may be an active delivery using, but is not limited thereto.

본 발명에서 시료는 수득되거나 생검된 시료거나 또는 가능하게는 배양된 시료다. 대표적인 시료로는 임상적 시료, 예컨대 전혈 또는 전혈-유도된 생성물, 혈구, 조직, 생검 시편, 또는 배양된 조직 또는 세포 등이며, 세포 현탁액을 아우른다. 인공 조직은 예를 들면 세포 현탁액(예컨대 혈액 세포를 포함하여)으로부터 제조될 수 있다. 세포는 매트릭스(예컨대 겔 매트릭스, 예컨대 아가, 아가로오스 등)에 포획될 수 있고, 그런 다음 종래 방식으로 절편화될 수 있다. 그런 과정은 면역조직화학의 맥락에서 해당 기술분야에 알려져 있다(Andersson et al 2006, J. Histochem. Cytochem. 54(12):1413-23. Epub 2006 Sep 6).In the present invention, the sample is a sample obtained or biopsied, or possibly a cultured sample. Representative samples include clinical samples, such as whole blood or whole blood-derived products, blood cells, tissues, biopsy specimens, or cultured tissues or cells, and the like, encompassing cell suspensions. Artificial tissues can be prepared, for example, from cell suspensions (including blood cells, for example). Cells can be entrapped in a matrix (eg gel matrix, such as agar, agarose, etc.) and then sectioned in a conventional manner. Such a process is known in the art in the context of immunohistochemistry (Andersson et al 2006, J. Histochem. Cytochem. 54(12):1413-23. Epub 2006 Sep 6).

시료 제조 방식 및 그 결과의 시료의 취급 방법은 본 발명의 방법의 전사체 또는 게놈 분석에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이 다양한 시료는 상이한 물리적 특성을 가질 것이고, 당업자에게는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 시료를 만들기 위해 필요한 조작을 수행하는 것이 잘 알려져 있다. 그러나 본원의 개시 내용으로부터, 본 발명의 방법에 사용하기에 적당한 시료를 얻기 위해 어떠한 시료 제조 방법이든지 사용될 수 있다는 것이 명백하다. 예를 들어 대략 1 세포 또는 그것보다 적은 두께를 가지는 어떠한 세포 층도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 시료의 두께는 세포의 단면의 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1보다 적을 수 있다. 그러나 상기에서 주지된 바와 같이 본 발명은 단일 세포 해상도에 제한되지 않고, 따라서 시료의 두께가 1 세포 직경 또는 그 미만이어야 할 필요는 없기 때문에, 필요하다면 더 두꺼운 시료가 사용될 수 있다. 예를 들어 예컨대 10 내지 20㎛ 두께의 동결 절편이 사용될 수 있다.The method of preparing the sample and the method of handling the resulting sample may affect the transcript or genomic analysis of the method of the present invention. Furthermore, various samples will have different physical properties, and it is well known to those skilled in the art to perform the necessary manipulations to make a sample for use in the method of the present invention. However, from the disclosure herein, it is clear that any sample preparation method can be used to obtain a sample suitable for use in the method of the present invention. For example, any cell layer having a thickness of about 1 cell or less can be used in the method of the present invention. In one embodiment, the thickness of the sample may be less than 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 or 0.1 of the cross section of the cell. However, as noted above, the present invention is not limited to single cell resolution, and therefore, the thickness of the sample need not be one cell diameter or less, so that a thicker sample may be used if necessary. For example, frozen sections with a thickness of 10 to 20 μm can be used.

본 발명에서 시료는 어떠한 편리한 또는 원하는 방식으로 제조될 수 있고, 본 발명은 조직 제조의 어떠한 특정 유형에 제한되지 않는다. 신선하고, 냉동된, 고정된 또는 고정되지 않은 조직이 사용될 수 있다. 어떠한 원하는 편리한 과정이, 해당 기술분야에 기술되고 공지되어 있는 것처럼 시료를 고정 또는 삽입시키기 위해 사용될 수 있다. 그러므로 어떠한 공지된 고정액 또는 삽입 물질이 사용될 수 있다.Samples in the present invention may be prepared in any convenient or desired manner, and the present invention is not limited to any particular type of tissue preparation. Fresh, frozen, fixed or unfixed tissue can be used. Any desired convenient procedure can be used to fix or insert the sample as described and known in the art. Therefore, any known fixative or insert material can be used.

본 발명에 사용하기 위한 시료의 첫 번째 대표적인 실예로서, 조직은 조직 구조의 통합성 (즉 물리적 특성)을 유지 또는 보존하기에 적당한 온도, 예컨대 -20℃보다 낮은, 바람직하게는 -25, -30, -40, -50, -60, -70 또는 -80℃보다 낮은 온도에서 초저온 냉동에 의해 제조될 수 있다. 냉동된 시료는 어떠한 적당한 수단에 의해 기판 표면 위에 절편화 될 수 있다. 즉 얇게 슬라이스 될 수 있다. 예를 들어 시료는 시료의 구조적 통합성과 시료 중의 핵산의 화학적 특성을 둘 다 유지하기에 적당한 온도, 예컨대 -15℃보다 낮은 온도, 바람직하게는 -20 또는 -25℃보다 낮은 온도에서 설치된 저온 마이크로톰, 저온 유지 장치를 사용하여 제조될 수 있다. 그러므로 시료는 조직의 핵산, 예컨대 RNA의 변성 또는 분해를 최소화하도록 처리되어야 한다. 그런 조건은 해당 기술분야에 잘 수립되어 있고, 어떠한 분해의 정도는 핵산 추출, 예컨대 총 RNA 추출 및 계속해서 시료의 제조의 다양한 단계에서 정성 분석을 통해 모니터 될 수 있다.As a first representative example of a sample for use in the present invention, the tissue is at a temperature suitable for maintaining or preserving the integrity (i.e. physical properties) of the tissue structure, such as lower than -20°C, preferably -25, -30 , -40, -50, -60, -70 or -80 ℃ can be prepared by cryogenic freezing at a lower temperature. The frozen sample can be sectioned onto the substrate surface by any suitable means. That is, it can be sliced thinly. For example, the sample may be a low temperature microtome installed at a temperature suitable to maintain both the structural integrity of the sample and the chemical properties of the nucleic acid in the sample, such as a temperature lower than -15°C, preferably lower than -20 or -25°C, It can be manufactured using a cryostat. Therefore, the sample should be treated to minimize denaturation or degradation of tissue nucleic acids, such as RNA. Such conditions are well established in the art, and any degree of degradation can be monitored through qualitative analysis at various stages of nucleic acid extraction, such as total RNA extraction, and subsequent sample preparation.

두 번째 대표적인 실례로, 조직은 해당 기술분야에 잘 수립되어 있는 포르말린-고정 및 파라핀-삽입(FFPE)의 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 시료의 고정과 파라핀 또는 수지 블록에의 삽입 후에, 시료는 기판 위에서 절편화, 즉 얇게 슬라이스 될 수 있다. 상기에서 주지된 것과 같이, 다른 고정액 및/또는 삽입 물질이 사용될 수 있다.As a second representative example, tissues can be prepared using standard formalin-fixed and paraffin-inserted (FFPE) methods that are well established in the art. After fixation of the sample and insertion into the paraffin or resin block, the sample can be sectioned, i.e., thinly sliced on the substrate. As noted above, other fixative and/or insert materials may be used.

시료 절편은 삽입 물질을 제거하기 위해, 예컨대 파라핀 제거를 위해, 즉 본 발명의 방법을 수행하기 전에 시료로부터 파라핀 또는 수지를 제거하기 위해 처리될 필요가 있을 것이다. 이것은 어떠한 적당한 방법에 의해 이루어질 수 있고, 시료로부터 파라핀 또는 수지 또는 다른 물질의 제거는 해당 기술분야에 잘 수립되어 있는데, 예를 들면 시료(어레이의 표면 위에 있는)을 적절한 용매, 예컨대 크실렌(xylene) 중에서, 예컨대 10분 동안 2회 인큐베이션 하고, 그런 다음 에탄올 세정, 예컨대 99.5% 에탄올 중에서 2분 동안, 96% 에탄올 중에서 2분, 그리고 70% 에탄올 중에서 2분 동안 세정함으로써 이루어질 수 있다.The sample section will need to be processed to remove the insert material, such as to remove paraffin, ie to remove paraffin or resin from the sample prior to carrying out the method of the present invention. This can be done by any suitable method, and the removal of paraffin or resin or other material from the sample is well established in the art, for example, the sample (on the surface of the array) is treated with a suitable solvent, such as xylene. In, for example, two incubation times for 10 minutes, then ethanol washing, such as in 99.5% ethanol for 2 minutes, 96% ethanol for 2 minutes, and 70% ethanol for 2 minutes.

당업자들에게는 FFPE 또는 다른 고정 및 삽입 방법을 사용하여 제조된 조직 단편 중의 RNA는 냉동된 조직의 경우에서 보다 더 잘 부분적으로 분해되는 것으로 보인다는 것이 명백할 것이다. 그러나 어떠한 특별한 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 이것은 본 발명의 방법에 유익할 것으로 여겨진다. 예를 들어 만약 시료 중의 RNA가 부분적으로 분해된다면, RNA 폴리뉴클레오티드의 평균 길이는 분해되지 않은 시료보다 더 줄어들 것이고 더 무작위가 될 것이다. 그러므로 부분적으로 분해된 RNA는 본원의 다른 곳에서 설명되는 다양한 프로세싱 단계, 예컨대 어댑터(증폭 도메인)의 결찰, cDNA 분자의 증폭 및 그것들의 서열화에서 덜 편향적이 될 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that RNA in tissue fragments prepared using FFPE or other immobilization and insertion methods appears to be more partially degraded than in the case of frozen tissue. However, while not wishing to be bound by any particular theory, this is believed to be beneficial to the method of the present invention. For example, if the RNA in a sample is partially degraded, the average length of the RNA polynucleotide will be shorter and more random than the undigested sample. Therefore, partially degraded RNA will be less biased in the various processing steps described elsewhere herein, such as ligation of adapters (amplification domains), amplification of cDNA molecules and their sequencing.

그러므로 본 발명의 한 구체예에서, 시료, 즉 기판에 접촉된 시료의 단편은 FFPE 또는 다른 고정 및 삽입 방법을 사용하여 제조된다. 달리 표현하면, 시료는 고정, 예컨대 고정되고 삽입될 수 있다. 발명의 대체 구체예에서 시료는 초저온 냉동에 의해 제조된다. 다른 구체예에서는 고정되지 않은 시료가 사용될 수 있다.Therefore, in one embodiment of the present invention, a sample, ie, a fragment of the sample in contact with the substrate, is prepared using FFPE or other fixing and insertion methods. In other words, the specimen can be fixed, eg fixed and inserted. In an alternative embodiment of the invention the sample is prepared by cryogenic freezing. In other embodiments, an unfixed sample may be used.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 시료 절편의 두께는 시료를 제조하기 위해 사용된 방법 및 조직의 물리적 특성에 따라 좌우될 것이다. 그러므로 어떠한 적당한 절편 두께도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 대표적인 구체예에서, 시료 절편의 두께는 최소한 0.1㎛, 더 바람직하게는 최소한 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10㎛일 것이다. 다른 구체예에서 시료 단편의 두께는 최소한 10, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 또는 50㎛일 것이다. 그러나 두께는 중요하지 않고, 이것들은 단지 대표적인 값이다. 보다 두꺼운 시료, 예컨대 70 또는 100㎛ 또는 그 이상의 시료가 바람직하거나 편리하다면 사용될 수 있다. 전형적으로 시료 절편의 두께는 1 내지 100㎛, 1 내지 50㎛, 1 내지 30㎛, 1 내지 25㎛, 1 내지 20㎛, 1 내지 15㎛, 1 내지 10㎛, 2 내지 8㎛, 3 내지 7㎛ 또는 4 내지 6㎛이지만, 상기에서 언급된 것과 같이 더 두꺼운 시료도 사용될 수 있다.The thickness of the sample section for use in the method of the present invention will depend on the method used to prepare the sample and the physical properties of the tissue. Therefore, any suitable section thickness can be used in the method of the present invention. In an exemplary embodiment of the present invention, the thickness of the sample section is at least 0.1 μm, more preferably at least 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, It will be 9 or 10 μm. In other embodiments the thickness of the sample fragment will be at least 10, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 or 50 μm. However, the thickness is not important, and these are only representative values. Thicker samples, such as samples of 70 or 100 μm or larger, may be used if desired or convenient. Typically, the thickness of the sample section is 1 to 100 μm, 1 to 50 μm, 1 to 30 μm, 1 to 25 μm, 1 to 20 μm, 1 to 15 μm, 1 to 10 μm, 2 to 8 μm, 3 to 7 Μm or 4 to 6 µm, but thicker samples can also be used as mentioned above.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 기판에 포함된 프라이머의 서열과 상관없이 추출된 핵산이 열 혹은 UV 반응(Cross linking)에 의해 기판에 고정되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (d) may be characterized in that the extracted nucleic acid is fixed to the substrate by heat or UV reaction (Cross linking) irrespective of the sequence of the primers included in the substrate.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 표적 핵산이 이중가닥 핵산일 경우, 핵산이 변성(denature) 된 다음, 열 혹은 UV에 의해 단일가닥의 형태로 기판의 표면에 고정되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, in the step (d), when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid, the nucleic acid is denatured and then fixed to the surface of the substrate in the form of a single strand by heat or UV. have.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계는 기판에 포함된 위치바코드 서열이 포함된 프라이머와 시료에서 추출된 핵산에 상보적인 서열이 있을 경우, 서로 혼성화하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (e) may be characterized in that when there is a sequence complementary to a primer including a position barcode sequence included in a substrate and a nucleic acid extracted from a sample, hybridization is performed with each other.

본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계에서 프라이머의 신장은 역전사효소 또는 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the extension of the primer in step (f) may be characterized by using a reverse transcriptase or a polymerase.

본 발명에서, 상기 (g) 단계는 (d) 단계의 기판 표면에 (a) 단계를 통하여 배치되고 고정된 위치바코드 서열을 포함하는 각각의 프라이머와 인접한 (c) 단계를 통하여 추출되어 고정된 시료 핵산을 혼성화 하여 결합하고, 핵산 신장효소, 예컨대 역전사효소, 중합효소 등으로 신장반응하고 그 결과물로 위치바코드 서열이 결합된 상보핵산(complementary nucleic acid)을 만들어내는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the step (g) is a sample that is extracted and fixed through step (c) adjacent to each primer including a position barcode sequence disposed on the substrate surface of step (d) through step (a) and fixed. It may be characterized in that the nucleic acid is hybridized and bound, and a nucleic acid elongation enzyme, such as reverse transcriptase, polymerase, etc., is used to elongate, and as a result, a complementary nucleic acid to which a position barcode sequence is bound is produced.

본 발명에 있어서, 상기 (g) 단계에서 상보핵산의 증폭은 어댑터 서열에 상보적인 서열을 사용하여 중합효소반응으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the amplification of the complementary nucleic acid in step (g) may be characterized in that it is performed by a polymerase reaction using a sequence complementary to an adapter sequence.

본 발명은 다른 관점에서,The present invention from another point of view,

(a) 상기 방법으로 위치정보를 포함하는 증폭산물을 수득하는 단계;(a) obtaining an amplification product including location information by the above method;

(b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물을 차세대 염기서열 분석하여 리드를 수득하는 단계; 및(b) obtaining a read by performing next-generation sequencing of the amplified product of step (a); And

(c) 수득한 리드를 분석하여 핵산을 함유한 시료 내 수득한 개별리드의 위치를 결정하는 단계를 포함하는 차세대염기서열분석(NGS) 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법에 관한 것이다.(c) Next-generation sequencing (NGS)-based method for analyzing the position of a specific nucleic acid in a sample containing a nucleic acid, comprising the step of analyzing the obtained read to determine the position of the obtained individual lead in the sample containing the nucleic acid It is about.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 프라이머가 무작위 서열을 포함하지 않을 경우,In the present invention, in the step (c), when the primer does not contain a random sequence,

(i) 표적 특이적 서열과 어댑터 서열 사이의 위치바코드 서열을 결정하는 추출하여 리드에 지정하는 단계;(i) determining the position barcode sequence between the target-specific sequence and the adapter sequence, extracting and assigning it to the read;

(ii) 상기 지정된 위치바코드 서열에 따라 리드를 분리하는 단계;(ii) separating the read according to the designated position barcode sequence;

(iii) 분리된 리드들의 바코드 서열에 따라 2차원의 좌표(x, y)를 할당하는 단계;(iii) allocating two-dimensional coordinates (x, y) according to the barcode sequences of the separated reads;

(iv) 좌표에 따라 개별 리드들을 하나의 그래프에 배치하는 단계; 및(iv) arranging individual leads in one graph according to coordinates; And

(v) 배치된 개별 리드들을 포함하는 그래프를 시료 이미지 위에 겹쳐 시료 내 위치를 결정하는 단계;(v) determining a position in the sample by overlapping a graph including the arranged individual leads on the sample image;

를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.It may be characterized in that it is carried out in a method including a.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는, 프라이머가 무작위 서열을 포함할 경우,In the present invention, the step (c), when the primer contains a random sequence,

(i) 제3항의 표적 특이적 서열과 어댑터 서열 사이의 무작위 서열을 추출하는 단계;(i) extracting a random sequence between the target-specific sequence of claim 3 and the adapter sequence;

(ii) 상기 추출된 서열이 같은 리드를 하나의 리드로 통합하는 단계;(ii) integrating the reads having the same extracted sequence into one read;

(iii) 제3항의 무작위 서열과 어댑터 서열 사이의 위치바코드 서열을 추출하여 리드에 지정하는 단계;(iii) extracting the position barcode sequence between the random sequence of item 3 and the adapter sequence and assigning it to a read;

(iv) 상기 지정된 위치바코드 서열에 따라 리드들 분리하는 단계;(iv) separating reads according to the designated position barcode sequence;

(v) 분리된 리드들에 바코드 서열에 따라 2차원의 좌표(x, y)를 할당하는 단계;(v) allocating two-dimensional coordinates (x, y) to the separated reads according to the barcode sequence;

(vi) 좌표에 따라 개별 리드들을 하나의 그래프에 배치하는 단계; 및(vi) arranging individual leads in one graph according to coordinates; And

(vii) 배치된 개별 리드들을 포함하는 그래프를 시료 이미지 위에 겹쳐 시료 내 위치를 결정하는 단계;(vii) determining a position in the sample by overlapping a graph including the arranged individual leads on the sample image;

를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.It may be characterized in that it is carried out in a method including a.

본 발명의 도 12에 개시된 바와 같이, 지정한 좌표 서열 (위치바코드 서열)을 알고 있는 서열인 어댑터 서열과, 표적특이 서열을 통하여 알아내고, 이 알아낸 위치바코드의 서열을 위치 정보, 즉 좌표로 표현할 수 있다.As disclosed in FIG. 12 of the present invention, the adapter sequence, which is a sequence that knows the designated coordinate sequence (location bar code sequence), and the target-specific sequence, are found, and the sequence of the found location bar code is expressed as location information, that is, coordinates. I can.

예를 들어, 개별 리드 #01 (5, 10)으로 지정하여 도 12의 x, y그래프에 좌표를 점 형태로 표시하게 되는 것이다. 분석된 모든 리드의 좌표를 분석하여 하나의 그래프에 점을 찍어 시퀀싱 리드를 위치에 맞게 재배치하게 되고, 이를 염기서열 지도(Sequencing map)라 명명한다. For example, by designating individual lead #01 (5, 10), coordinates are displayed in the form of points on the x and y graphs of FIG. 12. The coordinates of all the analyzed reads are analyzed and the sequencing reads are rearranged according to the location by drawing a dot on one graph, which is called a sequencing map.

어떠한 핵산 서열화 방법이든지 본 발명의 방법에 활용될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 그러나 소위 "차세대 염기서열 분석" 기술이 특히 본 발명에 활용될 수 있다. 고처리율 서열화가 특히 본 발명의 방법에 유용한데, 왜냐하면 그것이 대다수의 핵산이 매우 짧은 시간 동안 부분적으로 서열화되는 것을 가능하게 하기 때문이다. 전체적으로 또는 부분적으로 서열화된 많은 게놈에 있어 최근의 폭발적인 관점에서 볼 때, 각 분자에 상응하는 유전자를 측정하기 위하여 생성된 DNA 분자의 전 길이를 서열화할 필요는 없다. It will be apparent that any nucleic acid sequencing method can be utilized in the method of the present invention. However, so-called "next-generation sequencing" technology can be particularly utilized in the present invention. High throughput sequencing is particularly useful in the method of the present invention, as it allows the majority of nucleic acids to be partially sequenced for a very short time. From the recent explosive point of view for many genomes sequenced in whole or in part, it is not necessary to sequence the entire length of the resulting DNA molecule in order to determine the gene corresponding to each molecule.

대표적인 실례로서, 서열화 반응은 예컨대 IlluminaTM 기술에서 사용된 것과 같은 가역적인 염료-터미네이터(dye-terminator)를 토대로 할 수 있다. 예를 들어 DNA 분자는 먼저 예컨대 유리 또는 실리콘 슬라이드 위의 프라이머에 부착되고, 증폭되어 국소적인 클론성 콜로니가 형성된다 (브리지 증폭). 네 가지 유형의 ddNTP가 첨가되고, 통합되지 않은 뉴클레오티드는 세척되어 제거된다. 파이로시퀀싱 (pyrosequencing)과는 달리 DNA는 한 번에 한 뉴클레오티드만 연장될 수 있다. 카메라는 형광 표지된 뉴클레오티드를 촬영하고, 그런 다음 말단 3' 차단제와 함께 염료가 DNA로부터 제거되면 다음 주기가 이어진다. 이것은 필요한 서열 데이터가 얻어질 때까지 반복될 수 있다. 이 기술을 사용하여 수천 개의 핵산이 단일 슬라이드 상에서 동시에 서열화될 수 있다.As a representative example, the sequencing reaction can be based on a reversible dye-terminator such as that used in Illumina™ technology. For example, a DNA molecule is first attached to a primer, for example on a glass or silicone slide, and amplified to form local clonal colonies (bridge amplification). Four types of ddNTPs are added, and the unincorporated nucleotides are washed away. Unlike pyrosequencing, DNA can only be extended one nucleotide at a time. The camera photographs the fluorescently labeled nucleotides, and then the next cycle follows when the dye is removed from the DNA along with the terminal 3'blocker. This can be repeated until the necessary sequence data is obtained. Thousands of nucleic acids can be sequenced simultaneously on a single slide using this technique.

다른 고처리율 서열화 기법, 예컨대 파이로시퀀싱도 본 발명의 방법에 마찬가지로 적당할 것이다. 이 방법에서 DNA는 오일 용액 중의 물방울 내부에서 증폭되는데(에멀션 PCR), 이때 각 방울은 단일 프라이머-코팅된 비드에 부착된 단일 DNA 주형을 함유하고, 그런 다음 클론성 콜로니가 형성된다. 서열화 기계는 피코리터 부피의 많은 웰을 함유하고 있고, 각 웰은 단일 비드와 서열화 효소를 함유하고 있다. 파이로시퀀싱은 초기 DNA에 첨가된 개별 뉴클레오티드의 검출을 위해 빛을 생성하기 위해 루시페라제를 사용하고, 조합된 데이터는 서열 판독 결과를 생성하기 위해 사용된다.Other high-throughput sequencing techniques, such as pyrosequencing, would likewise be suitable for the method of the present invention. In this method, DNA is amplified inside droplets in an oil solution (emulsion PCR), where each droplet contains a single DNA template attached to a single primer-coated bead, and then clonal colonies are formed. The sequencing machine contains many wells of picoliter volume, each well containing a single bead and sequencing enzyme. Pyrosequencing uses luciferase to generate light for detection of individual nucleotides added to the initial DNA, and the combined data is used to generate sequence readout results.

개발중인 기술의 실례는 DNA의 중합반응 중에 방출된 수소 이온의 검출을 토대로 한다. 서열화하고자 하는 주형 DNA 가닥을 함유하고 있는 마이크로웰은 단일 유형의 뉴클레오티드로 넘치게 된다. 만약 도입된 뉴클레오티드가 리더 주형 뉴클레오티드에 상보한다면 그것은 늘어나고 있는 상보성 가닥에 통합된다. 이것은 민감성 이온 센서를 야기하는 수소 이온의 방출을 유발하고, 그것은 반응이 일어났음을 가리킨다. 만약 단일중합체 반복부가 주형 서열에 존재한다면, 다수의 뉴클레오티드가 단일 주기에 통합될 것이다. 이것은 상응하는 수의 수소 이온 방출 및 그와 비례하여 더 높은 이온 신호를 유도한다.An example of the technology under development is based on the detection of hydrogen ions released during the polymerization of DNA. The microwells containing the template DNA strands to be sequenced are flooded with single types of nucleotides. If the introduced nucleotide is complementary to the leader template nucleotide, it is incorporated into the growing complementary strand. This causes the release of hydrogen ions, causing a sensitive ion sensor, indicating that a reaction has occurred. If homopolymer repeats are present in the template sequence, multiple nucleotides will be incorporated in a single cycle. This leads to the release of a corresponding number of hydrogen ions and a proportionally higher ion signal.

그러므로 미래의 서열화 방식은 더디게 실용화되고 있지만, 그런 플랫폼의 주요 특징 중 하나로서 더 짧은 작동 시간을 나타내는 것이 분명하며, 다른 서열화 기술들도 본 발명의 방법에서 유용할 것임이 명백할 것이다.Therefore, although future sequencing schemes are slowly becoming practical, it is clear that they exhibit shorter operating times as one of the main features of such platforms, and it will be apparent that other sequencing techniques will be useful in the method of the present invention.

본 발명에 있어서, 상기 시료 이미지는 일반 사진, 현미경 사진, 면역염색 사진, 핵산 탐침자 형광 사진 및 색소 염색 사진에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the sample image may be selected from a general photo, a microscopic photo, an immunostaining photo, a fluorescence photo of a nucleic acid probe, and a dye staining photo.

본 발명에서 상기 시료 이미지는 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 편리한 조직학적 수단, 예를 들면 빛, 명시야(bright field), 암시야(dark field), 위상차, 형광, 반사, 간섭, 공초점 현미경 또는 그것들의 조합을 사용할 수 있다. 전형적으로 시료는 시료의 상이한 영역들, 예컨대 세포 사이의 대조를 보여주기 위한 가시화 단계 전에 염색된다. 사용된 염색의 유형은 조직 유형과 염색하고자 하는 세포의 영역에 따라 좌우될 것이다. 그런 염색 프로토콜은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 어떤 구체예에서 시료의 상이한 측면, 예컨대 시료의 상이한 영역, 특이한 세포 구조(예컨대 세포기관) 또는 상이한 세포 유형을 가시화(영상화)하기 위해 하나 이상의 염색이 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 시료는 예컨대 시료가 충분한 대조를 제공하는 안료를 이미 함유하고 있거나 특정 형태의 현미경이 사용되는 경우 시료를 염색하는 일 없이 가시화되거나 영상화될 수 있다.In the present invention, the sample image is any convenient histological means known in the art, such as light, bright field, dark field, phase difference, fluorescence, reflection, interference, confocal microscope Or you can use a combination of them. Typically the sample is stained prior to the visualization step to show the contrast between different areas of the sample, such as cells. The type of staining used will depend on the tissue type and the area of cells to be stained. Such staining protocols are known in the art. In some embodiments, more than one staining may be used to visualize (imaging) different aspects of the sample, such as different regions of the sample, specific cellular structures (eg organelles) or different cell types. In other embodiments, the sample can be visualized or imaged without staining the sample, for example if the sample already contains a pigment that provides sufficient contrast or a specific type of microscope is used.

본 발명에 있어서, 상기 차세대염기서열분석(NGS) 기반의 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법은 핵산을 함유한 시료의 연속된 절편을 분석하여 3차원의 위치를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the method of analyzing the position of a specific nucleic acid in a sample containing a nucleic acid based on the next generation nucleotide sequencing (NGS) is the step of determining a three-dimensional position by analyzing consecutive segments of the sample containing the nucleic acid. It may be characterized in that it further comprises.

본 발명은 또 다른 관점에서, 완충용액 패드; 시료 패드; 위치바코드 서열이 포함된 프라이머가 고정된 핵산 포획 기판; 완충용액 패드; 및 가열판을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치에 관한 것이다.In another aspect of the present invention, a buffer solution pad; Sample pad; A nucleic acid capture substrate to which a primer containing a position barcode sequence is fixed; Buffer solution pad; And an apparatus for extracting a nucleic acid from a sample containing a nucleic acid including a heating plate while maintaining the original position of the nucleic acid.

본 발명에 있어서, 상기 기판은 나일론, 니트로 셀룰로스, PVDF, 유리, 실리콘, 폴리-L-라이신 코팅된 물질, 폴리스티렌, 고리형 올레핀 공중합체(COC), 고리형 올레핀 중합체(COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리카보네이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the substrate is nylon, nitrocellulose, PVDF, glass, silicone, poly-L-lysine coated material, polystyrene, cyclic olefin copolymer (COC), cyclic olefin polymer (COP), polypropylene, It may be characterized in that it is selected from the group consisting of polyethylene and polycarbonate.

본 발명에서 상기 기판은 당업자들에게 알려져 있는 어떠한 적당한 기판일 수 있다. 기판은 어떠한 적당한 형태 또는 포맷을 취할 수 있는데, 예를 들면 기판은 평평하거나, 구부러져 있다. 예를 들면 기판은 시료와 기판 사이의 상호작용이 일어나는 구역을 향해 볼록하게 또는 오목하게 구부러져 있다. 특히 바람직한 것은 기판이 평평한 것, 즉 평면이거나, 멤브레인이거나, 칩이거나 슬라이드인 경우이다.In the present invention, the substrate may be any suitable substrate known to those skilled in the art. The substrate may take any suitable shape or format, for example the substrate may be flat or curved. For example, the substrate is bent convexly or concave toward a region where the interaction between the sample and the substrate takes place. Particularly preferred is when the substrate is flat, ie a planar, a membrane, a chip or a slide.

전형적으로 기판은 고체 지지체이고, 따라서 기판 위의 위치정보의 정확하고 추적가능한 위치측정이 가능해진다. 기판의 실례는 기능성 기, 예컨대 아민 기 또는 아민-기능화된 기를 포함하고 있는 고체 물질 또는 기판이다.Typically the substrate is a solid support, thus enabling accurate and traceable positioning of the location information on the substrate. Examples of substrates are solid materials or substrates containing functional groups such as amine groups or amine-functionalized groups.

본 발명에 의해 구상되는 기판은 다공성의 핵산을 포획할 수 있는 기판이다. 바람직한 다공성 기판은 나일론, 니트로 셀룰로스, PVDF, 유리, 실리콘, 폴리-L-라이신 코팅된 물질, 니트로셀룰로오스, 폴리스티렌, 고리형 올레핀 공중합체(COC), 고리형 올레핀 중합체(COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리카보네이트이다.The substrate envisioned by the present invention is a substrate capable of capturing a porous nucleic acid. Preferred porous substrates are nylon, nitrocellulose, PVDF, glass, silicone, poly-L-lysine coated material, nitrocellulose, polystyrene, cyclic olefin copolymer (COC), cyclic olefin polymer (COP), polypropylene, polyethylene. And polycarbonate.

당업자들에게 알려져 있는 적당한 물질이 어느 것이든지 사용될 수 있다. 전형적으로 유리 또는 폴리스티렌이 사용된다. 폴리스티렌은 보통 상태에서는 소수의 친수성 기를 함유하고 있기 때문에 네거티브 전하의 마크로 분자를 결합하기에 적당한 소수성 물질이다. 유리 슬라이드 위에 고정된 핵산의 경우, 나아가 유리 표면의 소수성을 증가시킴으로써 핵산의 고정화가 증가될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러한 증강은 상대적으로 더 밀접하게 충전된 구성을 가능하게 한다. 폴리-L-라이신을 사용한 코팅 또는 표면 처리하는 것 외에 기판, 특히 유리는예컨대 에폭시-실란 또는 아미노-실란을 사용한 실란처리에 의해 또는 실리네이션(silynation)에 의해 또는 폴리아크릴아미드 처리에 의해 처리될 수 있다.Any suitable material known to those skilled in the art can be used. Typically glass or polystyrene is used. Polystyrene is a hydrophobic material suitable for binding negatively charged macromolecules because it normally contains a small number of hydrophilic groups. In the case of a nucleic acid immobilized on a glass slide, it is known that the immobilization of the nucleic acid can be increased by further increasing the hydrophobicity of the glass surface. Such augmentation allows for a relatively more tightly packed configuration. In addition to coating or surface treatment with poly-L-lysine, the substrate, in particular glass, may be treated by silane treatment with, for example, epoxy-silane or amino-silane, or by silination or by polyacrylamide treatment. I can.

본 발명에 있어서, 상기 시료 패드는 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease, Lysozyme 등의 효소 및 Tween-20, Triton X-100, 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 등의 계면활성제로 구성된 군에서 선택되는 것을 포함하는 완충용액을 흡수할 수 있는 소재인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the sample pad includes enzymes such as Proteinase K, Protease, and Lysozyme capable of decomposing the substrate surrounding the nucleic acid, and Tween-20, Triton X-100, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), and the like. It may be characterized in that it is a material capable of absorbing a buffer solution including those selected from the group consisting of surfactants.

본 발명에 있어서, 상기 장치는 전기영동(electrophoresis)을 사용한 전달을 위하여 음극 및 양극을 추가로 포함하거나, 유체의 이동을 사용한 전달을 위하여 진공펌프, 펌프 내지는 실린지를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the device is characterized in that it further comprises a cathode and an anode for transfer using electrophoresis, or comprises a vacuum pump, a pump, or a syringe for transfer using fluid movement. I can.

본 발명에 있어서, 상기 장치는 이중가닥 샘플 핵산의 변성을 위한 변성패드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the device may be characterized in that it further comprises a denatured pad for denaturing the double-stranded sample nucleic acid.

본 발명은 또 다른 관점에서, 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보가 유지된 채 추출된 핵산과 혼성화 되어 유전자 서열 및 길이로 위치를 할당하는 것을 특징으로 하는 위치바코드 서열이 포함된 프라이머가 지정위치에 배열되어 고정된 핵산 수득용 기판에 관한 것이다.In another aspect, the present invention is a primer containing a position barcode sequence, characterized in that it is hybridized with a nucleic acid extracted from a sample containing nucleic acid while maintaining position information and assigns a position by gene sequence and length. It relates to a substrate for obtaining an arrayed and immobilized nucleic acid.

본 발명에 있어서, 상기 위치 정보는 기판의 멤브레인, 나노 와이어, 마이크로 와이어, 나노 입자 또는 마이크로 입자 표면에 고정되어 배치되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the positional information may be fixed and disposed on the surface of the membrane, nanowire, microwire, nanoparticle, or microparticle of the substrate.

본 발명에 있어서, 상기 기판은 전기적 양성 또는 20 내지 45μm의 크기(pore size)를 가지는 다공성 기판인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the substrate may be electrically positive or a porous substrate having a pore size of 20 to 45 μm.

본 발명에 있어서, 상기 위치바코드 서열이 포함된 프라이머의 배열을 위한 기판의 구조는 나노 입자, 마이크로 입자, 나노 와이어 또는 마이크로 와이어가 배치된 판형 또는 비드 형의 형태인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the structure of the substrate for the arrangement of the primers including the position barcode sequence may be in the form of a plate or bead in which nanoparticles, microparticles, nanowires, or microwires are arranged.

본 발명은 또 다른 관점에서, 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease 및 Lysozyme으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소; Tween-20, Triton X-100 및 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 계명활성제; DNA 또는 RNA 분해효소 및 전류이동완충액을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출 시약에 관한 것이다.In another aspect of the present invention, at least one enzyme selected from the group consisting of Proteinase K, Protease, and Lysozyme capable of degrading the substrate surrounding the nucleic acid; At least one active agent selected from the group consisting of Tween-20, Triton X-100, and sodium dodecyl sulfate (SDS); It relates to a nucleic acid extraction reagent for extracting a nucleic acid while maintaining the original position of the nucleic acid from a sample containing a nucleic acid containing a DNA or RNA degrading enzyme and an electric current transfer buffer.

실시예Example

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예 1: 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머의 제작Example 1: Preparation of a primer containing the position barcode sequence

이하 실시예에서는 위치정보가 보존된 유전체 분석 방법 중 표적 유전자의 증폭을 사용한 증폭산물 염기서열 분석법(amplicon sequencing)을 사용하였다. In the following examples, an amplification product sequencing method using amplification of a target gene was used among genome analysis methods in which location information is preserved.

위치정보가 포함된 증폭산물의 생성을 위하여 어댑터 서열, 위치바코드 서열 및 표적 특이서열이 포함된 프라이머를 제작하였으며, 서열번호 1 내지 10으로 기재되는 서열로 구성되어 있다. In order to generate an amplification product including location information, a primer including an adapter sequence, a location barcode sequence, and a target specific sequence was prepared, and is composed of the sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 10.

본 발명에서 사용한 DNA oligomer는 네오프로브(Neoprobe, 한국)와 코스모진텍(Cosmogenetech, 한국)에서 PAGE 정제 방법을 통해 합성하였다.The DNA oligomer used in the present invention was synthesized by a PAGE purification method in Neoprobe (Korea) and Cosmogenetech (Korea).

서열번호1SEQ ID NO: 1

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGCTCTTTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG CTCT TTATTGATGGTACACAAG

서열번호2 SEQ ID NO:2

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGCACGTTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG CACG TTATTGATGGTACACAAG

서열번호3 SEQ ID NO:3

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGAGAGTTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG AGAG TTATTGATGGTACACAAG

서열번호4 SEQ ID NO:4

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGTGTTTTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG TGTT TTATTGATGGTACACAAG

서열번호5 SEQ ID NO: 5

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGTAGCTTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG TAGC TTATTGATGGTACACAAG

서열번호6 SEQ ID NO: 6

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGAAGTTTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG AAGT TTATTGATGGTACACAAG

서열번호7 SEQ ID NO: 7

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGTGAGTTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG TGAG TTATTGATGGTACACAAG

서열번호8 SEQ ID NO: 8

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGCGCTTTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG CGCT TTATTGATGGTACACAAG

서열번호9 SEQ ID NO: 9

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGAGGCTTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG AGGC TTATTGATGGTACACAAG

서열번호10 SEQ ID NO: 10

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGAGTATTATTGATGGTACACAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG AGTA TTATTGATGGTACACAAG

상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 밑줄은 위치를 할당할 수 있는 위치바코드 서열을 나타내며, 배치 면적과 밀집도에 따라 임의로 선별된 서열을 서로 겹치지 않도록 지정하여 추가로 합성하였다.The sequence was expressed from the 5'end to the 3'end, and the underlined indicates the position barcode sequence to which the position can be assigned, and the sequences randomly selected according to the placement area and density were designated so as not to overlap each other and further synthesized.

상기 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머는 표적 핵산과 결합하여 신장반응에 사용되는 프라이머로, 표적 핵산의 상보핵산을 만드는 역할을 하며, 상보핵산 제작과 동시에 위치바코드가 할당되어 결합하게 된다.The primer including the position barcode sequence is a primer used in the extension reaction by binding to the target nucleic acid, and serves to create a complementary nucleic acid of the target nucleic acid, and the position barcode is assigned and bound at the same time as the complementary nucleic acid is produced.

표적 핵산은 하우스 키핑 유전자로 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 Bos taurus GAPDH gene을 이용하였다.As the target nucleic acid, the Bos taurus GAPDH gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 was used as a housekeeping gene.

서열번호 11SEQ ID NO: 11

GCTCTCTGCTCCTGCCCGTTCGACAGATAGCCGTAACTTCTGTGCTGTGCCAGCCGCATCCCTGAGACAAGATGGTGAAGGTCGGAGTGAACGGATTCGGCCGCATCGGGCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTTTTAATTCTGGCAAAGTGGACATCGTCGCCATCAATGACCCCTTCATTGACCTTCACTACATGGTCTACATGTTCCAGTATGATTCCACCCACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAAGGCAGAGAACGGGAAGCTCGTCATCAATGGAAAGGCCATCACCATCTTCCAGGAGCGAGATCCTGCCAACATCAAGTGGGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGTGGTGGAGTCCACTGGGGTCTTCACTACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCACTTGAAGGGTGGCGCCAAGAGGGTCATCATCTCTGCACCTTCTGCCGATGCCCCCATGTTTGTGATGGGCGTGAACCACGAGAAGTATAACAACACCCTCAAGATTGTCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTGGCCCCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACCACTTTGGCATCGTGGAGGGACTTATGACCACTGTCCACGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAGCTGTGGCGTGACGGCCGAGGGGCTGCCCAGAATATCATCCCTGCTTCTACTGGCGCTGCCAAGGCCGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTCAACGGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGCGTCCCCACTCCCAACGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGATGAGATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCAGAGGGCCCTCTCAAGGGCATTCTAGGCTACACTGAGGACCAGGTTGTCTCCTGCGACTTCAACAGCGACACTCACTCTTCTACCTTCGATGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTACGACAATGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTGGTGGACCTCATGGTCCACATGGCCTCCAAGGAGTAAGGTCCCTGGACCCCCAGCCCCAGCAGGAGCACGAGAGGAAGAGTTCCTCAGCTGCTGGGGAGTCCTGCCCCATCTCCGCCACACTGAGAATCTCCTGACTTCCACATGTTTCCATCTCTAAGGCCCTGAGGAAGGGGAGGGGCTTAGGGAGCCCTGCCTTGTGTACCATCAATAAAAGTACCCTATACCTAAAAAAAAAAAAAAAA CTTGTGTACCATCAATAA AAGTACCCTATACCTAAAAAAAAAAAAAAAA

상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 밑줄은 표적유전자 특이 프라이머(서열번호1 내지 10)가 결합하는 부위를 나타낸다.The sequence is expressed from the 5'end to the 3'end, and the underline indicates the site to which the target gene-specific primers (SEQ ID NOs: 1 to 10) bind.

실시예 2: 위치바코드를 포함하는 프라이머가 배치된 핵산 포집 플레이트의 제작Example 2: Preparation of a nucleic acid collection plate on which a primer containing a location barcode was placed

실시예 1의 지정된 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머를 Personal arrayer 16(Capitalbio, 중국)을 사용하여 나일론 멤브레인 위에 직사각형 모양으로 배치시켰다. 상기 멤브레인을 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000uJ의 UV를 조사하고 Heating block 위에서 85℃로 10분 동안 반응시켜 멤브레인을 제작하였다.The primer containing the designated position barcode sequence of Example 1 was placed in a rectangular shape on a nylon membrane using Personal arrayer 16 (Capitalbio, China). The membrane was irradiated with UV of 20,000 uJ per Cm 2 with a UV Crosslinker and reacted on a heating block at 85° C. for 10 minutes to prepare a membrane.

실시예 3: 조직내 위치정보를 유지한 핵산의 추출 및 고정Example 3: Extraction and fixation of nucleic acid retaining location information in tissue

조직 내 위치정보를 유지한 채 핵산을 분리하기 위하여 OCT compound를 사용하여 소 근육 동결 조직을 제작하고 cryostat을 사용하여 6㎛의 두께로 절편 한 후, 도 2와 같이 배치하였다. 핵산 포집 기판은 실시예 2를 통하여 제작된 위치 바코드를 포함하는 프라이머가 배치되어 고정된 기판을 사용하였다. 흡수 필터(2.1cm X 2.8cm)와 기판을 proteinase K를 포함하는 전기영동 버퍼(89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA)에 적시고 도 2와 같이 전극, 흡수필터 및 종이필터 사이에 배치하고 고정한 후 주변의 물기를 모두 제거하여 전류가 외부 표변으로 흐르는 것을 방지한 후, 65℃에서 15mA의 전류를 흘려주면서 15분 동안 반응시켰다. 이후 기판을 분리한 후 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000uJ의 UV를 조사하고 Heating block 위에서 85℃로 10분 동안 반응시켜 핵산을 기판에 고정하였다. 상기 UV 조사는 기판에 포집된 조직의 핵산이 이중 가닥인 샘플이거나, 표적 하고자 하는 핵산이 이중 가닥일 경우, 기판을 500mM NaOH로 5분 반응시켜 단일 가닥으로 변성(denature) 시킨 후 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000uJ의 UV를 조사하고 Heating block 위에서 85℃로 10분 동안 반응시켜 핵산을 기판에 고정하였다.In order to separate the nucleic acid while maintaining the location information in the tissue, a frozen bovine muscle tissue was prepared using an OCT compound and sectioned to a thickness of 6 μm using a cryostat, and then arranged as shown in FIG. 2. As the nucleic acid capture substrate, a substrate fixed by placing a primer including a position barcode prepared in Example 2 was used. Soak the absorption filter (2.1cm X 2.8cm) and the substrate in an electrophoresis buffer containing proteinase K (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA), and place it between the electrode, the absorption filter, and the paper filter as shown in FIG. After fixing and removing all of the surrounding water to prevent the current from flowing to the external surface, and then reacted for 15 minutes while passing a current of 15mA at 65 ℃. After separating the substrate, 20,000 uJ of UV per Cm 2 was irradiated with a UV crosslinker, and the nucleic acid was fixed on the substrate by reacting on a heating block at 85° C. for 10 minutes. The UV irradiation is a sample in which the nucleic acid of the tissue collected on the substrate is a double-stranded sample, or if the nucleic acid to be targeted is a double-stranded, the substrate is reacted with 500mM NaOH for 5 minutes to denature it into a single strand, and then Cm with a UV Crosslinker. 2 , 20,000 uJ of UV was irradiated and reacted on a heating block at 85° C. for 10 minutes to fix the nucleic acid on the substrate.

실시예 4: 위치바코드 프라이머가 결합된 상보핵산의 제작과 증폭Example 4: Preparation and Amplification of Complementary Nucleic Acid Conjugated with Position Barcode Primer

실시예 2에 따라 지정된 위치에 배치되고 고정된 위치 바코드를 포함하는 프라이머와 실시예 3의 위치 정보가 유지되어 기판에 포집된 조직 핵산의 혼성화와 신장반응을 통하여 위치 위치바코드 서열이 결합된 상보핵산(complementary nucleic acid)을 만들어내고, 만들어진 상보핵산을 증폭하기 위하여 SuperScript™IV One-Step RT-PCR premix(Thermofisher Scientific, 미국) 50ul, 어댑터 프라이머 (서열번호 12) 4ul, 어댑터-상보핵산 결합 프라이머 (서열번호 13) 4ul를 및 PCR grade water 42ul, 총 100ul의 반응액을 6개를 준비하였다. 실시예 3의 기판을 잘라 반응액에 잠기게 넣어주고, 50℃ 30분, 95℃ 10분 반응시키고 95℃ 30초, 64℃ 1분으로 32cycle 반응시킨 후 64℃에서 5분 반응시켜 어댑터 및 위치바코드 서열이 결합된 상보핵산을 제작하고 증폭하였다.Complementary nucleic acid in which the position position barcode sequence is combined through hybridization and extension reaction of the tissue nucleic acid collected on the substrate by maintaining the primer and the position information of Example 3, which is placed at the designated position according to Example 2 and includes the fixed position barcode. (complementary nucleic acid) and to amplify the prepared complementary nucleic acid, SuperScript™IV One-Step RT-PCR premix (Thermofisher Scientific, USA) 50ul, adapter primer (SEQ ID NO: 12) 4ul, adapter-complementary nucleic acid binding primer ( SEQ ID NO: 13) 4ul and 42ul of PCR grade water, 6 reaction solutions of a total of 100ul were prepared. The substrate of Example 3 was cut and put in a reaction solution, reacted for 30 minutes at 50°C, 10 minutes at 95°C, reacted for 32 cycles at 95°C for 30 seconds and 1 minute at 64°C, and then reacted at 64°C for 5 minutes. Complementary nucleic acid to which the barcode sequence was bound was prepared and amplified.

서열번호12 SEQ ID NO: 12

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG

상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 상기 서열은 위치바코드 서열이 포함된 프라이머가 가지는 어댑터 서열과 동일한 서열로 구성되어 있다.The sequence is expressed from the 5'end to the 3'end, and the sequence is composed of the same sequence as the adapter sequence of the primer containing the position barcode sequence.

서열번호13 SEQ ID NO: 13

AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTACCATCTCTAAGGCCCTGAGGAA AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA CCATCTCTAAGGCCCTGAGGAA

상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 밑줄은 표적 유전자의 상보핵산에 결합하는 서열을 나타낸다.The sequence is expressed from the 5'end to the 3'end, and the underline indicates the sequence that binds to the complementary nucleic acid of the target gene.

반응물 6개 모두 한 개의 튜브에 회수하고, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 정제하였다. 정재 된 산물에 일루미나사 NGS 분석을 위한 어댑터를 결합시키기 위하여 아래와 같은 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다.All six of the reactions were recovered in one tube and purified using Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA). Polymerase chain reaction was performed under the following conditions in order to bind the adapter for NGS analysis by Illumina to the purified product.

Platinum™SuperFi™ DNA polymerase premix (Thermofisher Scientific, 미국) 25ul, Primer F (서열번호 14) 1ul, Primer R (서열번호 15) 1ul, 정재 산물 10ul와 PCR grade water 13ul, 총 50ul의 반응액을 98℃ 30초 반응시킨 후 98℃ 20초, 65℃ 20초, 72℃ 30초로 8cycle 반응시킨 후 72℃에서 5분 반응시켰다.Platinum™SuperFi™ DNA polymerase premix (Thermofisher Scientific, USA) 25ul, Primer F (SEQ ID NO: 14) 1ul, Primer R (SEQ ID NO: 15) 1ul, purified product 10ul and PCR grade water 13ul, 50ul total reaction solution at 98℃ After reacting for 30 seconds, the reaction was carried out for 8 cycles at 98°C for 20 seconds, 65°C for 20 seconds, and 72°C for 30 seconds, followed by reaction at 72°C for 5 minutes.

반응산물을 회수하여, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 정제하였다.The reaction product was recovered and purified using Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA).

서열번호14SEQ ID NO: 14

TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG

서열번호15SEQ ID NO: 15

GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA

상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 밑줄은 NGS 분석 라이브러리 제작을 위한 어댑터가 결합하는 부위를 나타낸다.The sequence is expressed from the 5'end to the 3'end, and the underline indicates the site to which the adapter for constructing the NGS analysis library is bound.

실시예 5: 차세대염기서열분석을 위한 라이브러리의 제작Example 5: Construction of a library for next-generation nucleotide sequence analysis

실시예 4의 정제 산물을 주형으로 일루미나사의 iSeq 100 system (illumine, 미국)을 사용한 증폭산물 염기서열 분석(amplicon sequencing)을 위한 라이브러리 제작을 위하여 아래와 같은 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. Using the purified product of Example 4 as a template, a polymerase chain reaction was performed under the following conditions to prepare a library for amplification product sequencing using the Illumina's iSeq 100 system (illumine, USA).

2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix (Thermofisher Scientific, 미국) 25ul, Index Primer F (Nextera XT Index Kit v2, Illumina, 미국) 5ul, Index Primer R (Nextera XT Index Kit v2, Illumina, 미국) 5ul, 주형 DNA (실시예 4) 10ul와 PCR grade water 5ul, 총 50ul의 반응액을 98℃ 30초 반응시킨 후 98℃ 20초, 55℃ 20초, 72℃ 20초로 8cycle 반응시킨 후 72℃에서 5분 반응시켰다.2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix (Thermofisher Scientific, USA) 25ul, Index Primer F (Nextera XT Index Kit v2, Illumina, USA) 5ul, Index Primer R (Nextera XT Index Kit v2, Illumina, USA) 5ul, template DNA (implemented Example 4) 10ul and 5ul of PCR grade water, a total of 50ul, were reacted at 98℃ for 30 seconds, followed by 8 cycles at 98℃ for 20 seconds, 55℃ for 20 seconds, and 72℃ for 20 seconds, and then reacted at 72℃ for 5 minutes.

반응산물을 회수하여, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 정제하였다.The reaction product was recovered and purified using Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA).

실시예 6: Illumina iSeq 100 시스템을 사용한 염기서열분석Example 6: Sequence analysis using Illumina iSeq 100 system

실시예 5의 산물을 사용하여 iSeq 100 system (Illumina, 미국)의 사용자 설명과 같게 사용한 증폭산물 염기서열 분석(amplicon sequencing)을 진행하여 분석 리드를 확보하였다.Using the product of Example 5, the amplification product sequence analysis (amplicon sequencing) used as described by the user of the iSeq 100 system (Illumina, USA) was performed to obtain an analysis lead.

실시예 7: 시퀀싱 리드 분석Example 7: Sequencing Read Analysis

얻어진 분석 리드를 FASTA 파일로 변환한 후, 서열번호 16(어댑터 서열)과 서열번호 17(타겟 특이적 서열)을 포함하는 리드를 선별하고 서열번호 16과 서열번호 17 사이에 존재하는 위치바코드 염기서열을 도출하였다After converting the obtained analysis read to a FASTA file, a read containing SEQ ID NO: 16 (adapter sequence) and SEQ ID NO: 17 (target specific sequence) was selected, and the position barcode nucleotide sequence existing between SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 Was derived

서열번호16SEQ ID NO: 16

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG

서열번호17SEQ ID NO: 17

TTATTGATGGTACACAAGTTATTGATGGTACACAAG

도출된 위치바코드 염기서열에 따라 개별 리드에 미리 알고있는 2차원의 좌표(x, y)를 할당하였으며, 개별 리드 각각에 할당된 좌표에 따라 하나의 분산형 그래프에 점으로 배치하여 염기서열 리드 지도를 구성하였다(도 12). Two-dimensional coordinates (x, y) known in advance were assigned to individual reads according to the derived location barcode sequence, and the base sequence read map was placed as a dot on one scatter graph according to the coordinates assigned to each individual read. Was configured (Fig. 12).

상기의 염기서열 리드 지도와 조직 절편사진을 겹쳐, 시료 내 위치를 도출하였다(도 13).The location in the sample was derived by overlapping the nucleotide sequence read map and the tissue section picture (FIG. 13).

실시예 8: 단일분자 식별자 서열과 위치정보가 포함된 사람면역 관련 유전자 차세대염기서열분석을 위한 라이브러리의 제작 및 분석Example 8: Construction and analysis of a library for next-generation nucleotide sequencing of human immunity-related genes including single molecule identifier sequence and location information

8-1. 프라이머 및 핵산 포집 플레이트의 제작8-1. Preparation of primer and nucleic acid collection plate

단일분자 식별자 서열과 위치정보가 포함된 사람 면역 관련 유전자의 증폭산물의 생성을 위하여 CD25 gene(NM_000417.3), CD4 gene(NM_001195016.3), CD3e gene(NM_000733.4), CD8 gene(NM_001768.7), FoxP3 gene(NM_014009.4), TTF1 gene(NM_001079668.3) 및 PD1 gene(NM_005018.3)을 표적 하는 어댑터 서열, 단일분자 식별자 서열, 위치바코드 서열 및 표적 특이서열이 포함된 프라이머를 제작하였으며, 서열번호 18 내지 24로 기재되는 서열로 구성되어 있다.CD25 gene (NM_000417.3), CD4 gene (NM_001195016.3), CD3e gene (NM_000733.4), CD8 gene (NM_001768. 7), FoxP3 gene (NM_014009.4), TTF1 gene (NM_001079668.3) and PD1 gene (NM_005018.3) targeting adapter sequence, single molecule identifier sequence, position barcode sequence, and primers containing target specific sequence were prepared And, it consists of the sequence described in SEQ ID NO: 18 to 24.

본 발명에서 사용한 DNA oligomer는 마크로젠(Macrogen, 한국)에서 PAGE 정제 방법을 통해 합성하였다.The DNA oligomer used in the present invention was synthesized by PAGE purification method in Macrogen (Korea).

서열번호18SEQ ID NO:18

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNNLLLLAGGATCAGCAGGAAAACAGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNN LLLL AGGATCAGCAGGAAAACA

서열번호19SEQ ID NO: 19

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNNLLLLAAGCTACATGTCTTCTGAAAGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNN LLLL AAGCTACATGTCTTCTGAAA

서열번호20SEQ ID NO: 20

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNNLLLLGGAAGGAGGGAACTGAACGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNN LLLL GGAAGGAGGGAACTGAAC

서열번호21SEQ ID NO: 21

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNNLLLLCAGTCTTCGGTTCCTGTGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNN LLLL CAGTCTTCGGTTCCTGT

서열번호22SEQ ID NO:22

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNNLLLLGAGAGGAGTGCCTGTAAGTGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNN LLLL GAGAGGAGTGCCTGTAAGT

서열번호23SEQ ID NO: 23

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNNLLLLCACCGCTCATGTTCATGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNN LLLL CACCGCTCATGTTCAT

서열번호24SEQ ID NO: 24

GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNNLLLLGACACCAACCACCAGGGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNN LLLL GACACCAACCACCAG

상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 'LLLL'서열(밑줄)은 위치를 할당할 수 있는 위치바코드 서열을 나타내며, 배치 면적과 밀집도에 따라 임의로 선별된 서열을 서로 겹치지 않도록 지정하여 위치별로 추가 합성하였다(도 15).The sequence is expressed from the 5'end to the 3'end, and the'LLLL' sequence (underlined) represents the position barcode sequence to which the position can be assigned, and the randomly selected sequences according to the placement area and density are designated so that they do not overlap each other. It was further synthesized by position (Fig. 15).

상기 프라이머를 동일한 위치바코드 서열을 가지는 프라이머 그룹별로 혼합한 후 실시예 2에 기술된 바와 같이 서열번호 18 내지 24 프라이머가 배치된 핵산 포집 플레이트를 제작하였다.After the primers were mixed for each primer group having the same position barcode sequence, as described in Example 2, a nucleic acid collection plate having primers of SEQ ID NOs: 18 to 24 was prepared.

8-2. 핵산의 추출 및 고정8-2. Nucleic acid extraction and fixation

조직 내 위치정보를 유지한 채 핵산을 분리하기 위하여 사람 암 조직 동결 검체를 cryostat을 사용하여 5㎛의 두께로 절편 한 후 도 2와 같이 배치하였다. In order to separate nucleic acids while maintaining the location information in the tissue, a frozen sample of human cancer tissue was sectioned into a thickness of 5 μm using a cryostat. It was arranged as shown in Figure 2.

핵산 포집 기판은 실시예 8A를 통하여 제작된 서열번호 18 내지 24 프라이머가 배치되어 고정된 기판을 사용하였으며, 흡수 패드(2.1cm X 2.8cm)와 기판을 proteinase K를 포함하는 전기영동 버퍼에 적시고 도 2와 같이 전극, 흡수 패드 및 종이 필터 사이에 배치하고 고정한 후 주변의 물기를 모두 제거하여 전류가 외부 표변으로 흐르는 것을 방지한 후, 65℃에서 15mA의 전류를 흘려주면서 15분 동안 반응시켰다. As the nucleic acid collection substrate, a substrate fixed with primers of SEQ ID NOs: 18 to 24 prepared in Example 8A was placed and fixed, and the absorption pad (2.1cm X 2.8cm) and the substrate were wetted in an electrophoresis buffer containing proteinase K. As shown in Fig. 2, after placing and fixing between the electrode, the absorption pad and the paper filter, all the surrounding water was removed to prevent the current from flowing to the outer surface, and then reacted for 15 minutes while passing a current of 15 mA at 65°C.

이후 기판을 분리한 후 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000uJ의 UV를 조사하고 85℃에서 10분 동안 반응시켜 전달된 핵산을 기판에 고정하였다. After separating the substrate, 20,000 uJ of UV per Cm 2 was irradiated with a UV Crosslinker and reacted at 85° C. for 10 minutes to fix the delivered nucleic acid on the substrate.

기판에 포집된 조직의 핵산이 이중 가닥인 샘플이거나, 표적 하고자 하는 핵산이 이중 가닥일 경우, 기판을 500mM NaOH로 5분 반응시켜 단일 가닥으로 변성(denature) 시킨 후 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000uJ의 UV를 조사하고 Heating block 위에서 85℃로 10분 동안 반응시켜 핵산을 기판에 고정하거나, 8M urea를 포함하는 7% PAGE gel로 구성된 3mm 두께의 변성 패드(denaturing pad)를 제작하고 도 3과 같이 배치시켜 변성된 핵산이 핵산 포집 기판에 전달되도록 한 후 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000uJ의 UV를 조사하고 Heating block 위에서 85℃로 10분 동안 반응시켜 핵산을 기판에 고정하였다.If the nucleic acid of the tissue collected on the substrate is a double-stranded sample, or the nucleic acid to be targeted is a double-stranded, the substrate is denatured into a single strand by reacting with 500mM NaOH for 5 minutes, and then 20,000uJ per Cm 2 with a UV Crosslinker. UV irradiation and reacting on a heating block at 85°C for 10 minutes to fix the nucleic acid on the substrate, or to prepare a 3mm thick denaturing pad composed of 7% PAGE gel containing 8M urea, as shown in FIG. After placing the denatured nucleic acid to be transferred to the nucleic acid collection substrate, 20,000 uJ per Cm 2 was irradiated with a UV crosslinker and reacted on a heating block at 85° C. for 10 minutes to fix the nucleic acid on the substrate.

8-3. 프라이머가 결합된 상보핵산의 제작과 증폭과 정제8-3. Preparation, amplification and purification of primer-conjugated complementary nucleic acid

상기 처리된 기판을 잘라 SuperScript™IV One-Step RT-PCR premix(Thermofisher Scientific, 미국) 50ul, 20 mg/ml BSA(Sigma, 미국) 1ul, 어댑터 프라이머 (서열번호 14) 10pM 4ul, 어댑터-상보핵산 결합 프라이머 믹스쳐 (서열번호 25 내지 31) 10pM 4ul 및 PCR grade water 41ul를 포함하는 총 100ul의 반응액에 잠기게 넣어주고, 50℃ 30분, 95℃ 10분 반응시킨 후 95℃ 30초, 64℃ 1분으로 32cycle 반응시킨 후 64℃에서 5분 반응시켜 어댑터 및 위치바코드 서열이 결합된 상보핵산을 제작하고 증폭하였다.Cut the treated substrate, SuperScript™IV One-Step RT-PCR premix (Thermofisher Scientific, USA) 50ul, 20 mg/ml BSA (Sigma, USA) 1ul, adapter primer (SEQ ID NO: 14) 10pM 4ul, adapter-complementary nucleic acid Combined primer mixture (SEQ ID NOs: 25 to 31) Soaked in a total of 100 ul of reaction solution containing 4 ul of 10pM and 41 ul of PCR grade water, reacted at 50°C for 30 minutes, 95°C for 10 minutes, and then reacted at 95°C for 30 seconds, 64 After reacting for 32 cycles at 1 minute at ℃, 5 minutes at 64 ℃ to prepare and amplify complementary nucleic acid to which the adapter and position barcode sequences are bound.

서열번호25SEQ ID NO: 25

AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTAGAGACTTCCTGCCTCGTCACAA AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA GAGACTTCCTGCCTCGTCACAA

서열번호26SEQ ID NO: 26

AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTACACCGAAGGCGCCAAG AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA CACCGAAGGCGCCAAG

서열번호27SEQ ID NO: 27

AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTAAGTAGTCACACCCTCACAGCTGG AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA AGTAGTCACACCCTCACAGCTGG

서열번호28SEQ ID NO:28

AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTAGGGACTTGTGGGGTCCTTCTC AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA GGGACTTGTGGGGTCCTTCTC

서열번호29SEQ ID NO:29

AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTACTTCCTTGAACCCCATGCCA AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA CTTCCTTGAACCCCATGCCA

서열번호30SEQ ID NO: 30

AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTACAGGACACCATGAGGAACAGC AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA CAGGACACCATGAGGAACAGC

서열번호31SEQ ID NO: 31

AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTAAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGG AGTAAAATCGCCGTTCGCGGTA AGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGG

상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 밑줄은 표적 유전자의 상보핵산에 결합하는 서열을 나타낸다.The sequence is expressed from the 5'end to the 3'end, and the underline indicates the sequence that binds to the complementary nucleic acid of the target gene.

반응물을 한 개의 튜브에 회수하고, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 정제하였다. 정재 된 산물에 일루미나사 NGS 분석을 위한 어댑터를 결합시키기 위하여 아래와 같은 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다.The reaction was recovered in one tube and purified using Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA). Polymerase chain reaction was performed under the following conditions in order to bind the adapter for NGS analysis by Illumina to the purified product.

Platinum™SuperFi™ DNA polymerase premix (Thermofisher Scientific, 미국) 25ul, Primer F (서열번호 14) 1ul, Primer R (서열번호 15) 1ul, 정재 산물 10ul와 PCR grade water 13ul, 총 50ul의 반응액을 98℃ 30초 반응시킨 후 98℃ 20초, 68℃ 20초, 72℃ 20초로 8cycle 반응시킨 후 72℃에서 5분 반응시켰다.Platinum™SuperFi™ DNA polymerase premix (Thermofisher Scientific, USA) 25ul, Primer F (SEQ ID NO: 14) 1ul, Primer R (SEQ ID NO: 15) 1ul, purified product 10ul and PCR grade water 13ul, 50ul total reaction solution at 98℃ After reacting for 30 seconds, the reaction was carried out for 8 cycles at 98°C for 20 seconds, 68°C for 20 seconds, and 72°C for 20 seconds, followed by reaction at 72°C for 5 minutes.

반응산물을 회수하여, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 정제하였다.The reaction product was recovered and purified using Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA).

8-4. 차세대염기서열분석8-4. Next-generation base sequence analysis

실시예 5와 6에 기술된 바와 같이 차세대염기서열분석을 위한 라이브러리의 제작을 수행하고 염기서열 분석을 진행하여 분석 리드를 확보하였다.As described in Examples 5 and 6, a library for next-generation nucleotide sequencing was prepared, followed by sequencing to obtain an analysis lead.

얻어진 분석 리드는 도 16의 절차에 따라 분석하여 단일분자 식별자와 위치바코드 서열이 결합된 리드를 도출하였다(도 17).The obtained analysis read was analyzed according to the procedure of FIG. 16 to derive a read in which a single molecule identifier and a position barcode sequence were combined (FIG. 17).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that these specific techniques are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. will be. Accordingly, it will be said that the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

1. Indirect in-situ sequencing 라이브러리 제작 원리
11. 핵산 포획 기판
12. 지정된 위치에 배치되고 부분적으로 고정된 위치바코드 올리고머
13. 핵산을 함유한 시료
14. 핵산의 전달
15. 부분적으로 고정된 시료 핵산과 위치바코드 올리고머가 배치된 핵산 포획 기판
16. 반응 챔버
2. 시료로부터 핵산을 추출하는 장치
21. 양극 (+)
22. 흡수 패드
23. 핵산 포획 기판
24. 흡수 패드
25. 시료/종이 필터
26. 흡수 패드
27. 음극 (-)
28. 열 플레이트
3. 시료로부터 핵산을 추출하는 장치 (Nucleic acid isolation from tissue sample)
31. 양극 (+)
32. 흡수 패드
33. 핵산 포획 기판
34. 변성(denaturing) 패드
35. 시료/종이 필터
36. 흡수 패드
37. 음극 (-)
38. 열 플레이트
4. 위치바코드 서열의 결합을 위한 고정형 프라이머
41. 위치바코드 서열의 결합을 위한 프라이머
411. 어댑터 서열 #1
412. 위치바코드 서열
413. 표적 특이 서열 (Forward)
414. 부분적으로 고정된 상태
5. 단일 분자 지정 및 위치바코드 서열의 결합을 위한 고정형(solid phase) 프라이머
51. 위치바코드 서열과 단일분자 식별자를 포함하는 프라이머
511. 단일분자 식별자 서열(무작위 서열)
52. 위치바코드 서열과 분리된 단일분자 식별자를 포함하는 프라이머
521. 분리되어 배치된 단일분자 식별자 서열(무작위 서열)
53. 단일분자 식별자와 분리되어 배치된 위치바코드를 포함하는 프라이머
531. 분리되어 배치된 위치바코드 서열
54. 분리되어 배치된 위치바코드 및 단일분자 식별자를 포함하는 프라이머
6. 증폭을 위한 액상형(liquid phase) 프라이머
61. 증폭을 위한 정방향 프라이머
62. 시퀀싱 어댑터 서열을 포함하는 증폭을 위한 정방향 프라이머
621. 시퀀싱 어댑터 서열 #1
63. 시퀀싱 어댑터 서열을 포함하는 증폭을 위한 역방향 프라이머
631. 시퀀싱 어댑터 서열 #2
632. 표적특이 서열 (reverse)
7. 표적서열에 위치바코드를 결합시키는 방법
71. 고정형(solid phase) 프라이머의 결합 및 신장 반응
711. 표적 핵산
712. 부분적으로 결합된 상태
72. 위치바코드가 결합된 상보 핵산
8. 표적서열에 위치바코드를 결합시키는 방법
81. 고정형 프라이머의 결합 및 신장 반응
811. 변성화된(denatured) 표적 핵산
9. 위치바코드가 결합된 상보 핵산의 증폭
91. 중합효소연쇄반응의 첫번째 반응
92. 중합효소연쇄반응의 두번째 및 이후 반응
10. 간접 원위치 염기서열 분석 결과물 리드(Read)의 구성
101. 위치정보를 포함하는 시퀀싱 리드
1011. 어댑터 서열
1012. 위치바코드 서열
1013. 표적 유전자 서열, 프라이머 부위
1014. 표적 유전자 서열
1015. 표적 유전자 서열, 프라이머 부위
1016. 어댑터 서열
11. 간접 원위치 단일분자 염기서열 분석 결과물 리드(Read)의 구성
111. 단일분자 식별자와 위치정보를 포함하는 시퀀싱 리드
1111. 단일분자 식별자 서열
112. 위치정보와 분리된 단일분자 식별자를 포함하는 시퀀싱 리드
1121. 분리된 단일분자 식별자 서열
113. 단일분자 식별자와 분리된 위치정보 서열을 포함하는 시퀀싱 리드
1131. 분리된 위치정보 서열
114. 분리된 위치정보 서열과 분리된 단일분자 식별자를 포함하는 시퀀싱 리드
12. 간접 원위치 염기서열 데이터 분석의 분석 절차
121. 간접 원위치 염기서열 데이터 분석 흐름도
1211. 시퀀싱 어댑터 제거
1212. 개별 리드에 위치바코드 서열에 따라 특정 좌표를 지정함
1213. 할당된 좌표에 따라 시퀀싱 리드를 배치시킴
122. 분석 절차에 따른 결과물
1221. 시퀀싱 어댑터가 제거된 시퀀싱 리드
1222. X Y 좌표가 할당된 개별 시퀀싱 리드
1223. 시퀀싱 리드 맵
13. 동결 절편 조직 이미지와 시퀀싱 결과물의 결합
131. 제브라피쉬 절편 사진
132. 소 근육조직 절편 사진
133. 간접 원위치 유전체분석의 분석영역
134. 간접 원위치 단일분자 염기서열 분석 및 이미지 결합 결과
14. 핵산 포획 기판
141. 고정형 프라이머가 배치된 핵산 포획 기판
142. 단일한 위치바코드 서열을 가지는 고정형 프라이머 스팟
15. 스팟의 위치에 따른 위치바코드 서열
16. 간접 원위치 단일분자 염기서열 데이터 분석의 분석 절차
17. 간접 원위치 단일분자 염기서열 데이터 분석 절차에 따른 결과물
171. 차세대염기서열분석 리드(read) 데이터 (미가공, 일루미나 시스템)
172. 단일분자 지정서열이 추출된 리드(read) 데이터
173. 단일분자 지정서열이 동일한 리드(read)를 통합한 데이터
174. 단일분자 지정서열을 기준으로 통한한 데이터에서 특정 위치 바코드 서열을 가지는 리드(read)만을 통합한 데이터1. Principle of Indirect in-situ sequencing library creation
11. Nucleic acid capture substrate
12. Position barcode oligomers placed in designated positions and partially fixed
13. Sample containing nucleic acid
14. Delivery of nucleic acids
15. A nucleic acid capture substrate on which a partially immobilized sample nucleic acid and a position barcode oligomer are placed
16. Reaction Chamber
2. Device for extracting nucleic acid from sample
21. Positive (+)
22. Absorption pad
23. Nucleic Acid Capture Substrate
24. Absorption pad
25. Sample/Paper Filter
26. Absorption pad
27. Cathode (-)
28. Heat plate
3. Device for extracting nucleic acid from sample (Nucleic acid isolation from tissue sample)
31. Anode (+)
32. Absorption pad
33. Nucleic Acid Capture Substrate
34. Denaturing Pad
35. Sample/Paper Filter
36. Absorption pad
37. Cathode (-)
38. Heat plate
4. Fixed primer for binding of position barcode sequence
41. Primer for binding of position barcode sequence
411. Adapter Sequence #1
412. Position barcode sequence
413. Target specific sequence (Forward)
414. Partially Fixed
5. Solid phase primers for single molecule designation and binding of position barcode sequences
51. Primer Containing Position Barcode Sequence and Single Molecule Identifier
511. Single molecule identifier sequence (random sequence)
52. Primer containing a single-molecule identifier separated from the position barcode sequence
521. Separately placed single molecule identifier sequence (random sequence)
53. Primer containing a single molecule identifier and a location barcode that is arranged separately
531. Separately arranged position barcode sequence
54. Separately arranged location barcodes and primers containing single molecule identifiers
6. Liquid phase primer for amplification
61. Forward primer for amplification
62. Forward Primer for Amplification Containing Sequencing Adapter Sequence
621. Sequencing Adapter Sequence #1
63. Reverse Primer for Amplification Containing Sequencing Adapter Sequence
631. Sequencing Adapter Sequence #2
632. Target specific sequence (reverse)
7. How to bind the location barcode to the target sequence
71. Solid phase primer binding and elongation reaction
711. Target nucleic acid
712. Partially joined
72. Complementary Nucleic Acid Conjugated to Position Barcode
8. How to bind the location barcode to the target sequence
81. Binding and elongation reactions of fixed primers
811. Denatured target nucleic acid
9. Amplification of Complementary Nucleic Acids Conjugated to Position Barcode
91. The first reaction of the polymerase chain reaction
92. Second and subsequent reactions of the polymerase chain reaction
10. Composition of indirect in situ sequencing result read
101. Sequencing reads including location information
1011. Adapter sequence
1012. Position barcode sequence
1013. Target gene sequence, primer site
1014. Target gene sequence
1015. Target gene sequence, primer site
1016. Adapter sequence
11. Composition of indirect in situ single molecule sequencing result read
111. Sequencing read including single molecule identifier and location information
1111. Single molecule identifier sequence
112. Sequencing Reads Containing Location Information and Separate Single Molecular Identifiers
1121. Isolated single molecule identifier sequence
113. Sequencing Reads Containing Single Molecule Identifiers and Separated Position Information Sequences
1131. Separated position information sequence
114. Sequencing Reads Containing Separated Geolocation Sequences and Separated Single Molecule Identifiers
12. Analysis procedure of indirect in situ sequencing data analysis
121. Flow chart of indirect in situ sequencing data analysis
1211. Sequencing Adapter Removal
1212. Assign specific coordinates to individual reads according to the location barcode sequence
1213. Place sequencing leads according to assigned coordinates
122. Results of the analysis procedure
1221. Sequencing lead with sequencing adapter removed
1222. Individual sequencing reads assigned XY coordinates
1223. Sequencing Lead Map
13. Combination of frozen section tissue images and sequencing results
131. Zebrafish Section Photo
132. Photograph of a section of bovine muscle tissue
133. Analysis area of indirect in situ genome analysis
134. Results of indirect in situ single molecule sequencing and image conjugation
14. Nucleic Acid Capture Substrate
141. Nucleic acid capture substrate on which fixed primers are placed
142. Fixed primer spot having a single position barcode sequence
15. Location barcode sequence according to the location of the spot
16. Analysis procedure of indirect in situ single molecule sequence data analysis
17. Results of indirect in situ single molecule sequence data analysis procedure
171. Next-generation base sequence analysis read data (unprocessed, Illumina system)
172. Read data from which the single molecule designated sequence was extracted
173. Data that combines reads with the same single molecule designation sequence
174. Data incorporating only reads having a specific position barcode sequence in the data based on the single molecule designated sequence

<110> Contourgen Co., Ltd <120> Methods and apparatus for extracting nucleic acids maintaining two-dimensional spatial information from samples containing nucleic acids, and method and kit for spatial sequencing analysis using the same <130> P20-B254 <150> KR 10-2019-0121281 <151> 2019-10-01 <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 ggtgcattcg ttccggtgta agctctttat tgatggtaca caag 44 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 ggtgcattcg ttccggtgta agcacgttat tgatggtaca caag 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 3 ggtgcattcg ttccggtgta agagagttat tgatggtaca caag 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 4 ggtgcattcg ttccggtgta agtgttttat tgatggtaca caag 44 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 5 ggtgcattcg ttccggtgta agtagcttat tgatggtaca caag 44 <210> 6 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Sequence <220> <223> target specific sequence <400> 17 ttattgatgg tacacaag 18 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 1 <400> 18 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nnaggatcag caggaaaaca 50 <210> 19 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 2 <400> 19 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nnaagctaca tgtcttctga aa 52 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 3 <400> 20 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nnggaaggag ggaactgaac 50 <210> 21 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 4 <400> 21 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nncagtcttc ggttcctgt 49 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 5 <400> 22 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nngagaggag tgcctgtaag t 51 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 6 <400> 23 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nncaccgctc atgttcat 48 <210> 24 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 7 <400> 24 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nngacaccaa ccaccag 47 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 1 <400> 25 agtaaaatcg ccgttcgcgg tagagacttc ctgcctcgtc acaa 44 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 2 <400> 26 agtaaaatcg ccgttcgcgg tacaccgaag gcgccaag 38 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 3 <400> 27 agtaaaatcg ccgttcgcgg taagtagtca caccctcaca gctgg 45 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 4 <400> 28 agtaaaatcg ccgttcgcgg tagggacttg tggggtcctt ctc 43 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 5 <400> 29 agtaaaatcg ccgttcgcgg tacttccttg aaccccatgc ca 42 <210> 30 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 6 <400> 30 agtaaaatcg ccgttcgcgg tacaggacac catgaggaac agc 43 <210> 31 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 7 <400> 31 agtaaaatcg ccgttcgcgg taagctcagg gtgacagaga gaagg 45 <110> Contourgen Co., Ltd <120> Maintaining methods and apparatus for extracting nucleic acids two-dimensional spatial information from samples containing nucleic acids, and method and kit for spatial sequencing analysis using the same <130> P20-B254 <150> KR 10-2019-0121281 <151> 2019-10-01 <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 ggtgcattcg ttccggtgta agctctttat tgatggtaca caag 44 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 ggtgcattcg ttccggtgta agcacgttat tgatggtaca caag 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 3 ggtgcattcg ttccggtgta agagagttat tgatggtaca caag 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 4 ggtgcattcg ttccggtgta agtgttttat tgatggtaca caag 44 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 5 ggtgcattcg ttccggtgta agtagcttat tgatggtaca caag 44 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 6 ggtgcattcg ttccggtgta agaagtttat tgatggtaca caag 44 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 7 ggtgcattcg ttccggtgta agtgagttat tgatggtaca caag 44 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 8 ggtgcattcg ttccggtgta agcgctttat tgatggtaca caag 44 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 9 ggtgcattcg ttccggtgta agaggcttat tgatggtaca caag 44 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 10 ggtgcattcg ttccggtgta agagtattat tgatggtaca caag 44 <210> 11 <211> 1279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH <400> 11 gctctctgct cctgcccgtt cgacagatag ccgtaacttc tgtgctgtgc cagccgcatc 60 cctgagacaa gatggtgaag gtcggagtga acggattcgg ccgcatcggg cgcctggtca 120 ccagggctgc ttttaattct ggcaaagtgg acatcgtcgc catcaatgac cccttcattg 180 accttcacta catggtctac atgttccagt atgattccac ccacggcaag ttcaacggca 240 cagtcaaggc agagaacggg aagctcgtca tcaatggaaa ggccatcacc atcttccagg 300 agcgagatcc tgccaacatc aagtggggtg atgctggtgc tgagtatgtg gtggagtcca 360 ctggggtctt cactaccatg gagaaggctg gggctcactt gaagggtggc gccaagaggg 420 tcatcatctc tgcaccttct gccgatgccc ccatgtttgt gatgggcgtg aaccacgaga 480 agtataacaa caccctcaag attgtcagca atgcctcctg caccaccaac tgcttggccc 540 ccctggccaa ggtcatccat gaccactttg gcatcgtgga gggacttatg accactgtcc 600 acgccatcac tgccacccag aagactgtgg atggcccctc cgggaagctg tggcgtgacg 660 gccgaggggc tgcccagaat atcatccctg cttctactgg cgctgccaag gccgtgggca 720 aggtcatccc tgagctcaac gggaagctca ctggcatggc cttccgcgtc cccactccca 780 acgtgtctgt tgtggatctg acctgccgcc tggagaaacc tgccaagtat gatgagatca 840 agaaggtggt gaagcaggcg tcagagggcc ctctcaaggg cattctaggc tacactgagg 900 accaggttgt ctcctgcgac ttcaacagcg acactcactc ttctaccttc gatgctgggg 960 ctggcattgc cctcaacgac cactttgtca agctcatttc ctggtacgac aatgaatttg 1020 gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg tccacatggc ctccaaggag taaggtccct 1080 ggacccccag ccccagcagg agcacgagag gaagagttcc tcagctgctg gggagtcctg 1140 ccccatctcc gccacactga gaatctcctg acttccacat gtttccatct ctaaggccct 1200 gaggaagggg aggggcttag ggagccctgc cttgtgtacc atcaataaaa gtaccctata 1260 cctaaaaaaa aaaaaaaaa 1279 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor primer <400> 12 ggtgcattcg ttccggtgta ag 22 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor target specific primer <400> 13 agtaaaatcg ccgttcgcgg taccatctct aaggccctga ggaa 44 <210> 14 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F <400> 14 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggtgcat tcgttccggt gtaag 55 <210> 15 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R <400> 15 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagagtaaa atcgccgttc gcggta 56 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adapter sequence <400> 16 ggtgcattcg ttccggtgta ag 22 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target specific sequence <400> 17 ttattgatgg tacacaag 18 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 1 <400> 18 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nnaggatcag caggaaaaca 50 <210> 19 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 2 <400> 19 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nnaagctaca tgtcttctga aa 52 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 3 <400> 20 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nnggaaggag ggaactgaac 50 <210> 21 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 4 <400> 21 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nncagtcttc ggttcctgt 49 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 5 <400> 22 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nngagaggag tgcctgtaag t 51 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 6 <400> 23 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nncaccgctc atgttcat 48 <210> 24 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single molecule primer 7 <400> 24 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nngacaccaa ccaccag 47 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 1 <400> 25 agtaaaatcg ccgttcgcgg tagagacttc ctgcctcgtc acaa 44 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 2 <400> 26 agtaaaatcg ccgttcgcgg tacaccgaag gcgccaag 38 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 3 <400> 27 agtaaaatcg ccgttcgcgg taagtagtca caccctcaca gctgg 45 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 4 <400> 28 agtaaaatcg ccgttcgcgg tagggacttg tggggtcctt ctc 43 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 5 <400> 29 agtaaaatcg ccgttcgcgg tacttccttg aaccccatgc ca 42 <210> 30 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 6 <400> 30 agtaaaatcg ccgttcgcgg tacaggacac catgaggaac agc 43 <210> 31 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adator target binding primer 7 <400> 31 agtaaaatcg ccgttcgcgg taagctcagg gtgacagaga gaagg 45

Claims (26)

다음의 단계를 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보를 포함하는증폭산물의 제조방법:
(a) 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치에 배치되어 고정된 기판을 준비하는 단계;
(b) 핵산을 함유한 시료를 상기 (a) 단계의 기판에 배치하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 시료에서 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 추출한 핵산을 (a) 단계의 기판에 고정하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 고정된 핵산과 인접한 프라이머를 혼성화하는 단계;
(f) 상기 (e) 단계의 혼성화된 프라이머를 신장하여 상보핵산을 제작하는 단계; 및
(g) 상기 (f) 단계의 상보핵산을 증폭하여 위치바코드 서열이 결합된 증폭산물을 수득하는 단계.
A method for preparing an amplification product including positional information from a sample containing nucleic acid comprising the following steps:
(a) preparing a substrate fixed by placing a primer including a position barcode sequence at a designated position;
(b) disposing a sample containing a nucleic acid on the substrate of step (a);
(c) extracting the nucleic acid from the sample of step (b) and delivering it to the surface of the substrate;
(d) fixing the extracted nucleic acid in step (c) to the substrate in step (a);
(e) hybridizing the primers adjacent to the nucleic acid immobilized in step (d);
(f) preparing a complementary nucleic acid by extending the hybridized primer of step (e); And
(g) amplifying the complementary nucleic acid of step (f) to obtain an amplified product to which the position barcode sequence is bound.
 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 프라이머는 3’->5’ 순서로 표적 특이적 서열, 위치바코드 서열 및 어댑터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the primer in step (a) comprises a target-specific sequence, a position barcode sequence, and an adapter sequence in the order of 3'->5'.
 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 프라이머는 3’->5’ 순서로 표적 특이적 서열, 위치바코드 서열, 3 내지 8개 무작위 염기서열 및 어댑터 서열을 포함하여 단일 분자를 지정하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the primer in step (a) is a target-specific sequence, a position barcode sequence, 3 to 8 random nucleotide sequences, and an adapter sequence to designate a single molecule in the order of 3'->5'. Method for producing an amplification product, characterized in that.
 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 위치바코드는 이미 알고 있는 서열로서 기판의 지정된 위치에 고정시켜 기판의 특정 위치를 나타내는 3 내지 8개로 구성된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
The amplification product of claim 1, wherein the position barcode in step (a) includes a nucleotide sequence consisting of 3 to 8 nucleotide sequences representing a specific position of the substrate by fixing at a designated position on the substrate as a known sequence. Manufacturing method.
 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는
(i) 위치바코드 서열을 포함하는 프라이머를 기판의 지정된 위치에 배치하는 단계; 및
(ii) UV 및 열로 기판에 고정하는 단계;
를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법
The method of claim 1, wherein step (a)
(i) arranging a primer including a position barcode sequence at a designated position on a substrate; And
(ii) fixing to the substrate by UV and heat;
Method for producing an amplification product, characterized in that carried out by a method comprising a
 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는
(a) 시료를 기판 위에 위치시키는 단계; 및
(b) 시료 위에 기질분해 시약이 포함된 버퍼가 함유된 패드를 올리는 단계;
를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 증폭산물의 제조방법
The method of claim 1, wherein step (b) is
(a) placing the sample on the substrate; And
(b) placing a pad containing a buffer containing a matrix decomposition reagent on the sample;
A method for producing an amplification product, characterized in that it is carried out by a method comprising a
 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 30℃ 내지 65℃의 온도에서 핵산이 포함된 샘플의 기질을 분해하고, 노출된 핵산을 인접한 기판의 표면으로 이동시키는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법
The preparation of an amplification product according to claim 1, wherein the step (c) decomposes the substrate of the sample containing the nucleic acid at a temperature of 30°C to 65°C, and moves the exposed nucleic acid to the surface of the adjacent substrate. Way
 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 유체의 이동을 사용한 능동적인 전달인 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법
The method of claim 1, wherein the step of extracting the nucleic acid in step (c) and delivering it to the substrate surface is active delivery using electrophoresis or fluid movement.
 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 기판에 포함된 프라이머의 서열과 상관없이 추출된 핵산이 열 혹은 UV에 의해 기판의 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법
The method of claim 1, wherein in step (d), the extracted nucleic acid is fixed to the surface of the substrate by heat or UV irrespective of the sequence of the primers included in the substrate.
 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 표적 핵산이 이중가닥 핵산일 경우, 핵산이 변성(denature) 된 다음, 열 혹은 UV에 의해 단일가닥의 형태로 기판의 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법
The method of claim 1, wherein in the step (d), when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid, the nucleic acid is denatured and then fixed to the surface of the substrate in the form of a single strand by heat or UV. Amplification product manufacturing method
 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계는 기판에 포함된 위치바코드 서열이 포함된 프라이머와 시료에서 추출된 핵산에 상보적인 서열이 있을 경우, 서로 혼성화하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
The method of claim 1, wherein in step (e), when there is a sequence complementary to a primer containing a position barcode sequence included in a substrate and a nucleic acid extracted from a sample, the amplification product is hybridized with each other.
 제1항에 있어서, 상기 (f) 단계에서 프라이머의 신장은 역전사효소 또는 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the extension of the primer in step (f) uses a reverse transcriptase or a polymerase.
 제1항에 있어서, 상기 (g) 단계에서 상보핵산의 증폭은 어댑터 서열에 상보적인 서열을 사용하여 중합효소반응으로 수행되는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the amplification of the complementary nucleic acid in step (g) is performed by a polymerase reaction using a sequence complementary to an adapter sequence.
 다음의 단계를 포함하는 차세대염기서열분석(NGS) 기반의 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법:
(a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법으로 위치정보를 포함하는 증폭산물을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물을 차세대 염기서열 분석하여 리드를 수득하는 단계; 및
(c) 수득한 리드를 분석하여 핵산을 함유한 시료 내 수득한 개별 리드의 위치를 결정하는 단계
A method for analyzing the location of a specific nucleic acid in a sample containing a nucleic acid based on next-generation sequencing (NGS) comprising the following steps:
(a) obtaining an amplified product including location information by the method of any one of claims 1 to 13;
(b) obtaining a read by performing next-generation sequencing of the amplified product of step (a); And
(c) analyzing the obtained read to determine the position of the obtained individual read in the sample containing the nucleic acid
 제14항에 있어서, 상기 (c) 단계는
(i) 제2항의 표적 특이적 서열과 어댑터 서열 사이의 위치바코드 서열을 추출하여 리드에 지정하는 단계;
(ii) 상기 지정된 위치바코드 서열에 따라 리드들 분리하는 단계;
(iii) 분리된 리드들의 바코드 서열에 따라 2차원의 좌표(x, y)를 할당하는 단계;
(iv) 좌표에 따라 개별 리드들을 하나의 그래프에 배치하는 단계; 및
(v) 배치된 개별 리드들을 포함하는 그래프를 시료 이미지 위에 겹쳐 시료 내 위치를 결정하는 단계;
를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법.
The method of claim 14, wherein step (c) is
(i) extracting the position barcode sequence between the target-specific sequence of claim 2 and the adapter sequence and assigning it to a read;
(ii) separating reads according to the designated position barcode sequence;
(iii) allocating two-dimensional coordinates (x, y) according to the barcode sequences of the separated reads;
(iv) arranging individual leads in one graph according to coordinates; And
(v) determining a position in the sample by overlapping a graph including the arranged individual leads on the sample image;
A method of analyzing the location of a specific nucleic acid in a sample containing NGS-based nucleic acid, characterized in that performed by a method comprising a.
 제14항에 있어서, 상기 (c) 단계는
(i) 제3항의 표적 특이적 서열과 어댑터 서열 사이의 무작위 서열을 추출하는 단계;
(ii) 상기 추출된 서열이 같은 리드를 하나의 리드로 통합하는 단계;
(iii) 제3항의 무작위 서열과 어댑터 서열 사이의 위치바코드 서열을 추출하여 리드에 지정하는 단계;
(iv) 상기 지정된 위치바코드 서열에 따라 리드들 분리하는 단계;
(v) 분리된 리드들에 바코드 서열에 따라 2차원의 좌표(x, y)를 할당하는 단계;
(vi) 좌표에 따라 개별 리드들을 하나의 그래프에 배치하는 단계; 및
(vii) 배치된 개별 리드들을 포함하는 그래프를 시료 이미지 위에 겹쳐 시료 내 위치를 결정하는 단계;
를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법.
The method of claim 14, wherein step (c) is
(i) extracting a random sequence between the target-specific sequence of claim 3 and the adapter sequence;
(ii) integrating the reads having the same extracted sequence into one read;
(iii) extracting the position barcode sequence between the random sequence of item 3 and the adapter sequence and assigning it to a read;
(iv) separating reads according to the designated position barcode sequence;
(v) allocating two-dimensional coordinates (x, y) to the separated reads according to the barcode sequence;
(vi) arranging individual leads in one graph according to coordinates; And
(vii) determining a position in the sample by overlapping a graph including the arranged individual leads on the sample image;
A method of analyzing the location of a specific nucleic acid in a sample containing NGS-based nucleic acid, characterized in that performed by a method comprising a.
 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 시료 이미지는 일반 사진, 현미경 사진, 면역염색 사진, 핵산 탐침자 형광 사진 및 색소 염색 사진에서 선택되는 것을 특징으로 하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법
The specific nucleic acid in the sample containing NGS-based nucleic acid according to claim 15 or 16, wherein the sample image is selected from a general picture, a microscopic picture, an immunostaining picture, a nucleic acid probe fluorescence picture, and a pigment staining picture. How to analyze the location of
 제14항에 있어서, 상기 핵산을 함유한 시료의 연속된 절편을 분석하여 3차원의 위치를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법
The analysis of the location of a specific nucleic acid in a sample containing NGS-based nucleic acid according to claim 14, further comprising the step of determining a three-dimensional location by analyzing a continuous segment of the sample containing the nucleic acid. How to
 완충용액 패드; 시료 패드; 위치바코드 서열이 포함된 프라이머가 고정된 핵산 포획 기판; 완충용액 패드; 및 가열판을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치.
Buffer solution pad; Sample pad; A nucleic acid capture substrate to which a primer containing a position barcode sequence is fixed; Buffer solution pad; And an apparatus for extracting a nucleic acid from a sample containing a nucleic acid including a heating plate while maintaining the original position of the nucleic acid.
 제19항에 있어서, 상기 기판은 핵산이 결합할 수 있도록 표면 처리된 나일론, 니트로 셀룰로스, PVDF, 유리, 실리콘, 폴리-L-라이신 코팅된 물질, 폴리스티렌, 고리형 올레핀 공중합체 (COC), 고리형 올레핀 중합체 (COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리카보네이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치.
The method of claim 19, wherein the substrate is surface-treated nylon, nitrocellulose, PVDF, glass, silicone, poly-L-lysine-coated material, polystyrene, cyclic olefin copolymer (COC), cyclic A device for extracting a nucleic acid from a sample containing nucleic acid, while maintaining the original position of the nucleic acid, characterized in that it is selected from the group consisting of type olefin polymer (COP), polypropylene, polyethylene, and polycarbonate.
 제19항에 있어서, 상기 시료 패드는 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease, Lysozyme 등의 효소 및 Tween-20, Triton X-100, 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 등의 계면활성제로 구성된 군에서 선택되는 것을 포함하는 완충용액을 포함하는 흡수필터 혹은 겔로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치.
The method of claim 19, wherein the sample pad includes enzymes such as Proteinase K, Protease, and Lysozyme capable of decomposing the substrate surrounding the nucleic acid, and Tween-20, Triton X-100, and sodium dodecyl sulfate (SDS). An apparatus for extracting nucleic acids from a sample containing nucleic acids while maintaining the original position of the nucleic acid, characterized in that it consists of an absorption filter or a gel containing a buffer solution containing one selected from the group consisting of surfactants such as surfactants.
 제19항에 있어서, 상기 장치는 음극 및 양극, 실린지, 펌프 및 진공 펌프 군에서 선택되는 하나 이상의 장치를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치.
The method of claim 19, wherein the device further comprises at least one device selected from the group of cathode and anode, syringe, pump, and vacuum pump, while maintaining the original position of the nucleic acid from the sample containing the nucleic acid. A device for extracting nucleic acids.
 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보가 유지된 채 추출된 핵산과 혼성화 되어 유전자 서열 및 길이로 위치를 할당하는 것을 특징으로 하는 위치바코드 서열이 포함된 프라이머가 지정 위치에 배열되어 고정된 핵산 수득용 기판.
A substrate for obtaining a fixed nucleic acid by hybridizing with a nucleic acid extracted from a sample containing nucleic acid while maintaining position information and assigning a position by gene sequence and length. .
 제23항에 있어서, 상기 기판은 전기적 양성 또는 20 내지 45μm의 크기(pore size)를 가지는 다공성 기판인 것을 특징으로 하는 핵산 수득용 기판.
The substrate for obtaining nucleic acids according to claim 23, wherein the substrate is an electrically positive or porous substrate having a pore size of 20 to 45 μm.
 제23항에 있어서, 상기 기판은 나노 입자, 마이크로 입자, 나노 와이어 또는 마이크로 와이어가 배치된 것을 특징으로 하는 핵산 수득용 기판.
The substrate for obtaining a nucleic acid according to claim 23, wherein the substrate includes nanoparticles, microparticles, nanowires, or microwires.
 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease 및 Lysozyme으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소; Tween-20, Triton X-100 및 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 계면활성제; DNA 또는 RNA 분해효소 및 전류이동완충액을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출 시약. At least one enzyme selected from the group consisting of Proteinase K, Protease, and Lysozyme capable of degrading the substrate surrounding the nucleic acid; At least one surfactant selected from the group consisting of Tween-20, Triton X-100, and sodium dodecyl sulfate (SDS); A nucleic acid extraction reagent for extracting a nucleic acid while maintaining the original position of the nucleic acid from a sample containing a nucleic acid containing a DNA or RNA degrading enzyme and a current transfer buffer.
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