KR20210032388A - 프레임워크 3 영역에 삽입된 폴리펩티드를 포함하는 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가변(V) 도메인 및 인서트 폴리펩티드를 포함하는 항체로서, 여기서, 인서트 폴리펩티드는 V 도메인의 프레임워크 3 영역 내에 있는 것인 항체를 제공한다.
Description
본 발명의 분야
본 발명은 가변(V) 도메인, 및 V 도메인의 프레임워크 3 영역 내에 인서트 폴리펩티드를 포함하는 항체에 관한 것이다. 그러한 항체는 인서트 폴리펩티드에 대한 개선된 기능성 및/또는 약동학을 제공할 수 있다.
본 발명의 배경
항체의 높은 특이성 및 친화성을 통해 항체는 이상적인 진단제 및 치료제가 될 수 있다. 재조합 항체 기술 분야가 발전함에 따라 항체 단편, 예컨대, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편이 생성되었다. 이러한 더 작은 분자는 완전 항체의 항원 결합 활성을 보유하고, 이는 또한 완전 면역글로불린 분자와 비교하여 개선된 조직 투과성 및 약동학적 특성을 나타낼 수 있다. 실제로, 항체 단편은 다용도 치료제인 것으로 입증되고 있다. 상기 단편이 완전 면역글로불린에 비하여 많은 이점을 나타내는 것으로 보이지만, 생체내에서의 장기간 수명을 부여하는 Fc 도메인이 결여되어 있기 때문에 이들 단편은 또한 혈청으로부터의 제거율 증가로 인한 문제를 겪고 있다(문헌 [Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158:2211-2217]). 항체 분자의 혈청 반감기를 개선시키는 이전 접근법으로는 FcRn 수용체, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA: human serum albumin)과 상호작용하는 작용제 또는 도메인에의 접합을 포함한다. PEG 또한 혈청 반감기를 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
이중 특이성을 갖는 항체, 즉, 2개의 상이한 항원에 결합하는 항체가 앞서 기술된 바 있다(리뷰를 위해, 문헌 [Segal et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:558-562]; [Pluckthun & Pack, 1997, Immunotechnology, 3:83-105]; [Fischer and Leger, 2007, Pathobiology, 74: 3-14] 참조). 이종이중특이적 항체 기반 분자를 제조하는 이전 접근법은 일반적으로 화학적 가교 결합 또는 단백질 조작 기술을 사용해 왔다. 화학적 가교 결합은 이종이량체 및 동종이량체 형성 수율이 불충분하고, 후속 크로마토그래피 분리를 필요로 한다는 문제가 있다. 단백질 조작 접근법은 매우 정교하거나(예컨대, 노브-인투-홀(knobs-into-holes) 조작; 문헌 [Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7):617-621]), 또는 안정성 특징이 부적절한 분자(예컨대, 디아바디, scFv)를 사용해 왔다. 일부 경우에, 이중특이적 항체는 또한 입체 장애 문제를 겪을 수 있고, 이로써, 두 항원 모두 각 항체 아암에 동시에 결합하지 못할 수 있다. 단일 도메인 항체, 또는 sdAb(single domain antibody)로도 공지된 단일 가변 도메인 항체는 항체의 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변 영역에 상응한다. 뮤린 단일 도메인 항체는 문헌 [Ward et al., 1989, Nature, 341, 544-546]에 의해 기술되었다. 인간 및 '카멜화된' 인간 단일 도메인 항체 또한 기술되었다(문헌 [Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490]). 단일 도메인 항체 또한 낙타과(낙타 및 라마), 및 연골 어류(워브공 및 수염상어)로부터 수득되었다. 상기 유기체들은 그의 면역계의 필수적이고, 중요한 성분으로서 Fc 등가의 불변 도메인 프레임워크 상에 탑재된, 고친화성 단일 V 유사 도메인(낙타과에서는 VVH로, 및 상어에서는 V-NAR로 불림)을 진화시켰다(문헌 [Holliger & Hudson, for a review; 2005, Nature Biotechnology, 23(9):1126-1136]).
이에, 추가로 조작된 항체, 예컨대, 하나 이상의 원하는 특성, 예컨대, 증가된 기능성(예컨대, 다가 결합) 또는 개선된 약동학적 성질(예컨대, 증가된 혈청 반감기)을 보이는 항체 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이 여전히 요구되고 있다. 본 발명의 목적은 증가된 기능성(예컨대, 그의 항원에의 증가된 결합, 이중특이적 결합, 또는 다가 결합) 또는 개선된 약동학적 성질(예컨대, 증가된 혈청 반감기)을 보이는 신규한 조작된 항체 포맷을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 특히, 안정적이고, 2개의 항원에 동시에 결합할 수 있는, 신규한 이중특이적 항체 포맷을 제공한다.
본 발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은 가변(V) 도메인 및 인서트 폴리펩티드를 포함하는 항체로서, 여기서, 인서트 폴리펩티드는 V 도메인의 프레임워크 3 영역 내에 있는 것인 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, V 도메인은 VH 도메인이고, 항체는 VL 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, V 도메인은 VL 도메인이고, 항체는 VH 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 VH 도메인의 아미노산 잔기 73과 76 사이에 존재한다. 예를 들어, 인서트 폴리펩티드는 VH 도메인 중 (i) 아미노산 잔기 73과 74 사이에; (ii) 아미노산 잔기 74와 75 사이에; 또는 (iii) 아미노산 잔기 75와 76 사이에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, VH 도메인의 73과 76 사이의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인서트 폴리펩티드에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 VL 도메인의 아미노산 잔기 67과 70 사이에 존재한다. 예를 들어, 인서트 폴리펩티드는 VL 도메인 중 (i) 아미노산 잔기 67과 68 사이에; (ii) 아미노산 잔기 68과 69 사이에; 또는 (iii) 아미노산 잔기 69와 70 사이에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, VL 도메인의 67과 70 사이의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인서트 폴리펩티드에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인서트 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단 단부를 프레임워크 3 영역에 연결하는, 바람직하게, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산으로 이루어진 링커 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전장의 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 전장의 IgG 또는 그의 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, VHH, 또는 scFv, 특히, dsscFv이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간화 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합하는 V 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열번호 3의 서열을 갖는 CDR-L1; 서열번호 4의 서열을 갖는 CDR-L2; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열번호 2를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열번호 1을 포함하는 경쇄(L)를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열번호 8의 서열을 갖는 CDR-H1; 서열번호 9의 서열을 갖는 CDR-H2; 서열번호 10의 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열번호 7을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열번호 6을 포함하는 중쇄(H)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 시토카인이고, 바람직하게, 여기서, 시토카인은 IL-10, IL-15, IL-2, G-CSF, GM-CSF 및 EPO로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 스클레로스틴이다. 다른 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 제2 항체이다, 바람직하게, 여기서, 제2 항체는 scFv, 특히, dsscFv, 또는 도메인 항체, 예컨대, VH 또는 VL 또는 VHH이다. VHH는 서열번호 67, 69 및 89로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 상기 실시양태에서, 항체는 인서트 폴리펩티드가 존재하지 않는 항체와 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%인 결합 친화도로 상기 V 도메인에 의해 그의 동족 항원에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 항체는 V 도메인관 동일한 항원에 결합한다. 바람직하게, 제2 항체는 V 도메인과 상이한 에피토프에 결합한다. 상기 실시양태에서, 항체는 제2 항체가 존재하지 않는 항체와 비교하여 더욱 큰 결합 친화도로 그의 동종 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 항체는 제1 항체, 즉, V 도메인을 포함하는 항체와 상이한 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 항체는 IL-17에 결합하고, 제1 항체, 즉, V 도메인을 포함하는 항체는 HSA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 항체는 CD3에 결합하고, 제1 항체, 즉, V 도메인을 포함하는 항체는 CD28에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 항체는 CD28에 결합하고, 제1 항체, 즉, V 도메인을 포함하는 항체는 CD3에 결합한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 항체를 코딩하는단리된 폴리뉴클레오티드(들), 예컨대, DNA 분자(들), 및 클로닝 또는 발현 벡터(들)를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)룰 포함하는 숙주 세포 또한 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체를 단리시키는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 항체 제조 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상의 것과 함께 조합하여 본원에 개시된 바와 같은 V 도메인 및 인서트 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 치료에서 사용하기 위한 상기 항체 또는 상기 약학 조성물 또한 제공한다. 치료를 필요로 하는 피험체에게 상기 항체 또는 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료법 또한 제공한다. 의약 제조를 위한 상기 항체의 용도 또한 제공한다.
도 1: (A) 프레임워크 3 루프 영역을 강조 표시한, 전형적인 Fab 구조; (B) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 3 영역 중 특정 잔기를 강조 표시한 것; (C) 경쇄 가변 도메인 프레임워크 3 영역 중 특정 잔기를 강조 표시한 것.
도 2: (A) IL-15 수용체 쇄에 결합하는 CA645/IL-15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 IL-15 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 3: (A) IL-15가 부가된 및 부가되지 않은 IL-2 수용체 β 쇄에 결합하는 CA645/IL-2Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 IL-2 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 4: (A) HSA 및/또는 G-CSF 수용체에 결합하는 CA645/G-CSFFwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 G-CSF 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 5: (A) CA645/GM-CSFCH1(인간) 구성물과 비교하여, GM-CSF 수용체에 결합하는 CA645/GM-CSFFwk3(인간)을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 GM-CSF 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 6: CA645/GM-CSFCH1(뮤린) 구성물과 비교하여, GM-CSF 수용체에 결합하는 CA645/GM-CSFFwk3(뮤린)을 보여주는 SPR 센서그램.
도 7: (A) EPO가 부가된 및 부가되지 않은 EPO 수용체에 결합하는 CA645/EPOFwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 EPO 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 8: (A) IL-6, HSA, HSA가 부가된 및 부가되지 않은 IL-6:gp80에 결합하는 CA645/VHH6Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 VHH6 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 9: (A) HSA 및/또는 IL-6에 결합하는 CA645/VHH15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 VHH15 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 10: (A) 다양한 링커 구성물을 갖는, LRP6 세포외 도메인에 결합하는 CA645/스클레로스틴Fwk3(코어 또는 전장)을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 스클레로스틴 코어 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 11: 다양한 링커 구성물을 갖는, LRP4 세포외 도메인에 결합하는 CA645/스클레로스틴Fwk3(코어 또는 전장)을 보여주는 SPR 센서그램.
도 12: (A) IL-10 수용체에 결합하는, 상이한 링커 서열을 갖는 CA645/(IL-10Fwk3)2를 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 IL-10 이량체를 보여주는 모델링된 구조.
도 13: IL-15가 부가된 및 부가되지 않은 IL-2 수용체 β 쇄에 결합하는 CA497/IL-15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램.
도 14: IL-15가 부가된 및 부가되지 않은 IL-2 수용체 β 쇄에 결합하는 CA240/IL-15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램.
도 15: 리소자임에 결합하는 HyHEL5/VHH D3L11Fwk3에 대한 희석액 시리즈를 보여주는 SPR 센서그램.
도 16: 리소자임에 결합하는 HyHEL5/VHH15Fwk3에 대한 희석액 시리즈를 보여주는 SPR 센서그램.
도 17: 리소자임에 결합하는 CA645/VHH D3L11Fwk3에 대한 희석액 시리즈를 보여주는 SPR 센서그램.
도 18: 리소자임에 결합하는 HyHEL5/VHH D3L11Fwk3에 대한 잠재적인 결합 개략도를 보여주는 대표도.
도 19: IL-15 수용체 쇄에 결합하는, 상이한 링커 서열을 갖는 CA645/IL-15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램.
도 20: DSC 곡선(실선: CA645 Fab; 점선: CA497 dsscFv; 역삼각형 표시: CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv(vLvH); 삼각형 표시: CA645 Fab- Fwk3 CA497 dsscFv(vHvL)).
도 21: HSA의 존재(솔리드 동그라미 표시) 또는 부재(오픈 동그라미 표시)하의 IL-17A의 억제 곡선; (A) CA497 IgG4; (B) CA645 Fab- Fwk3 CA497 dsscFv(vHvL); (C) CA645 Fab- Fwk3 CA497 dsscFv(vLvH).
도 22: Fwk3 영역 내로 삽입된 항IL-17 CA497 dsscFv(vHvL)를 포함하는 고정화된 CA645 IgG4P에의 IL-17A 및 HSA의 결합을 보여주는 SPR 분석.
도 23: DSC 곡선. (A) Fwk3 영역 내에 dsscFv 항CD3을 포함하는 IgG4P 항CD28(실선); Fwk3 영역 내에 dsscFv 항CD3을 포함하는 IgG4P 항CD3(점선). (B) Fwk3 영역 내에 dsscFv 항CD3을 포함하는 Fab 항CD28(실선); Fwk3 영역 내에 dsscFv 항CD3을 포함하는 Fab 항CD3(점선).
도 24: PBMC에서의 T 세포 활성화 검정법. 오픈 삼각형 표시: 항CD28 Fab Fwk3-항CD3 dsscFv; 솔리드 동그라미 표시: 항CD3 Fab; 솔리드 역삼각형 표시: 항CD28 Fab; 솔리드 동그라미 표시: 항CD3 Fab Fwk3-항CD3 dsscFv; 오픈 사각형 표시: 항CD28 IgG4P Fwk3-항CD3 dsscFv; 솔리드 삼각형 표시: 항CD3 IgG4P-Fwk3 항CD3 dsscFv; * 기호: OKT3; 오픈 동그라미 표시: 세포 단독 대조군. (A) CD4 T 세포 활성화(환자 1)(B) CD4 T 세포 활성화(환자 2)(C) CD8 T 세포 활성화(환자 1)(D) CD8 T 세포 활성화(환자 2).
도 2: (A) IL-15 수용체 쇄에 결합하는 CA645/IL-15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 IL-15 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 3: (A) IL-15가 부가된 및 부가되지 않은 IL-2 수용체 β 쇄에 결합하는 CA645/IL-2Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 IL-2 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 4: (A) HSA 및/또는 G-CSF 수용체에 결합하는 CA645/G-CSFFwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 G-CSF 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 5: (A) CA645/GM-CSFCH1(인간) 구성물과 비교하여, GM-CSF 수용체에 결합하는 CA645/GM-CSFFwk3(인간)을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 GM-CSF 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 6: CA645/GM-CSFCH1(뮤린) 구성물과 비교하여, GM-CSF 수용체에 결합하는 CA645/GM-CSFFwk3(뮤린)을 보여주는 SPR 센서그램.
도 7: (A) EPO가 부가된 및 부가되지 않은 EPO 수용체에 결합하는 CA645/EPOFwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 EPO 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 8: (A) IL-6, HSA, HSA가 부가된 및 부가되지 않은 IL-6:gp80에 결합하는 CA645/VHH6Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 VHH6 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 9: (A) HSA 및/또는 IL-6에 결합하는 CA645/VHH15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 VHH15 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 10: (A) 다양한 링커 구성물을 갖는, LRP6 세포외 도메인에 결합하는 CA645/스클레로스틴Fwk3(코어 또는 전장)을 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 스클레로스틴 코어 인서트를 보여주는 모델링된 구조.
도 11: 다양한 링커 구성물을 갖는, LRP4 세포외 도메인에 결합하는 CA645/스클레로스틴Fwk3(코어 또는 전장)을 보여주는 SPR 센서그램.
도 12: (A) IL-10 수용체에 결합하는, 상이한 링커 서열을 갖는 CA645/(IL-10Fwk3)2를 보여주는 SPR 센서그램; (B) CA645 VH 도메인의 프레임워크 3 내로의 IL-10 이량체를 보여주는 모델링된 구조.
도 13: IL-15가 부가된 및 부가되지 않은 IL-2 수용체 β 쇄에 결합하는 CA497/IL-15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램.
도 14: IL-15가 부가된 및 부가되지 않은 IL-2 수용체 β 쇄에 결합하는 CA240/IL-15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램.
도 15: 리소자임에 결합하는 HyHEL5/VHH D3L11Fwk3에 대한 희석액 시리즈를 보여주는 SPR 센서그램.
도 16: 리소자임에 결합하는 HyHEL5/VHH15Fwk3에 대한 희석액 시리즈를 보여주는 SPR 센서그램.
도 17: 리소자임에 결합하는 CA645/VHH D3L11Fwk3에 대한 희석액 시리즈를 보여주는 SPR 센서그램.
도 18: 리소자임에 결합하는 HyHEL5/VHH D3L11Fwk3에 대한 잠재적인 결합 개략도를 보여주는 대표도.
도 19: IL-15 수용체 쇄에 결합하는, 상이한 링커 서열을 갖는 CA645/IL-15Fwk3을 보여주는 SPR 센서그램.
도 20: DSC 곡선(실선: CA645 Fab; 점선: CA497 dsscFv; 역삼각형 표시: CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv(vLvH); 삼각형 표시: CA645 Fab- Fwk3 CA497 dsscFv(vHvL)).
도 21: HSA의 존재(솔리드 동그라미 표시) 또는 부재(오픈 동그라미 표시)하의 IL-17A의 억제 곡선; (A) CA497 IgG4; (B) CA645 Fab- Fwk3 CA497 dsscFv(vHvL); (C) CA645 Fab- Fwk3 CA497 dsscFv(vLvH).
도 22: Fwk3 영역 내로 삽입된 항IL-17 CA497 dsscFv(vHvL)를 포함하는 고정화된 CA645 IgG4P에의 IL-17A 및 HSA의 결합을 보여주는 SPR 분석.
도 23: DSC 곡선. (A) Fwk3 영역 내에 dsscFv 항CD3을 포함하는 IgG4P 항CD28(실선); Fwk3 영역 내에 dsscFv 항CD3을 포함하는 IgG4P 항CD3(점선). (B) Fwk3 영역 내에 dsscFv 항CD3을 포함하는 Fab 항CD28(실선); Fwk3 영역 내에 dsscFv 항CD3을 포함하는 Fab 항CD3(점선).
도 24: PBMC에서의 T 세포 활성화 검정법. 오픈 삼각형 표시: 항CD28 Fab Fwk3-항CD3 dsscFv; 솔리드 동그라미 표시: 항CD3 Fab; 솔리드 역삼각형 표시: 항CD28 Fab; 솔리드 동그라미 표시: 항CD3 Fab Fwk3-항CD3 dsscFv; 오픈 사각형 표시: 항CD28 IgG4P Fwk3-항CD3 dsscFv; 솔리드 삼각형 표시: 항CD3 IgG4P-Fwk3 항CD3 dsscFv; * 기호: OKT3; 오픈 동그라미 표시: 세포 단독 대조군. (A) CD4 T 세포 활성화(환자 1)(B) CD4 T 세포 활성화(환자 2)(C) CD8 T 세포 활성화(환자 1)(D) CD8 T 세포 활성화(환자 2).
상세한 설명
항체
본 발명은 가변(V) 도메인 및 인서트 폴리펩티드를 포함하는 항체로서, 여기서, 인서트 폴리펩티드는 V 도메인의 프레임워크 3(Fwk3) 영역 내에 있는 것인 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 인서트 폴리펩티드를 항체의 V 도메인의 Fwk3 영역 내로 도입시킴으로써 구성된다. V 도메인은 예를 들어, VH 도메인 또는 VL 도메인일 수 있다. 인서트 폴리펩티드가 그 내로 도입되는 항체는 스캐폴드 항체로 간주될 수 있고/거나, 인서트 폴리펩티드 또한 항체인 경우, 대안적으로, 인서트 폴리펩티드가 그 내로 도입되는 항체는 제1 항체로 명명될 수 있고, 인서트 폴리펩티드는 제2 항체로 명명된다. "스캐폴드 항체" 및 "제1 항체"라는 용어는 본 개시내용과 관련하여 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이는 인서트 폴리펩티드가 그 내로 도입되는 항체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전장의 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 전장의 IgG 또는 그의 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 전장의 IgG1이다. 일부 실시양태에서, 항체는 전장의 IgG4이다. 일부 실시양태에서, 항체는 (카바트(Kabat) 넘버링 체계에 따라 넘버링된) 241번 위치의 세린이 프롤린으로 변이된, 전장의 IgG4P이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, VHH, 또는 scFv이다. 일부 실시양태에서, 항체는 디술피드 안정화된 scFv 또는 "dsscFv(disulphide stabilised scFv)"이다. 본원에서 사용되는 바, "디술피드 안정화된 단일 쇄 가변 단편" 또는 "dsscFv(Disulphide-stabilised single chain variable fragment)"는 VH와 VL 가변 도메인 사이의 펩티드 링커에 의해 안정화되고, VH와 VL 사이에 도메인간 디술피드 결합도 또한 포함하는 단일 쇄 가변 단편을 지칭한다(예를 들어, 문헌 [Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012]; WO2007109254 참조). 일부 실시양태에서, VH와 VL 사이의 도메인간 디술피드 결합은 카바트 넘버링 체계에 따라 넘버링된 위치 VH44와 VL100 사이에 형성된다.
본원에서 사용되는 바, '항체'라는 용어는 일반적으로 전장의(온전한, 완전) 항체, 즉, IgG 항체인 경우, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 이루어진 요소를 포함하는 것에 관한 것이다.
"항체 구성물," "조작된 항체," "항체 융합 단백질"이라는 용어는 본 발명의 항체를 지칭하기 위해서 본 개시내용과 관련하여 상호교환적으로 사용될 수 있다.
항체의 결합 단편은 일반적으로 적어도 하나의 가변 경쇄(VL) 또는 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하고, 단일 쇄 항체(예컨대, 전장 중쇄 또는 경쇄), Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 단일 도메인 항체(sdAb, 예컨대, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, dsscFv, Bis-scFv, 디아바디, 트리바디, 트리아바디, 테트라바디 및 상기 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 포함한다(예를 들어, 문헌 [Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136]; [Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 이들 항체 결합 단편을 생성 및 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). 예를 들어, 항체 결합 단편은 임의의 적합한 효소 절단 및/또는 분해 기술, 예컨대, 펩신 처리를 사용하여 임의의 완전 항체, 특히, 완전 단일클론 항체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 항체 출발 물질은 항체 가변 및/또는 불변 영역을 코딩하는 DNA의 조작 및 재발현을 포함하는 재조합 DNA 기술 사용에 의해 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 아미노산 또는 도메인을 원하는 대로 변형, 부가 또는 결실시킬 수 있다. 가변 또는 불변 영역에 대한 임의의 변경은 본원에서 사용되는 바와 같은 '가변' 및 '불변' 영역이라는 용어에 의해 여전히 포함된다. 항체 단편 출발 물질은 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 낙타, 라마, 염소 또는 인간을 비롯한, 임의의 종으로부터 수득될 수 있다. 항체 단편의 부분들은 1 초과의 종으로부터 수득될 수 있고; 예를 들어, 항체 단편은 키메라일 수 있다. 한 예에서, 불변 영역은 한 종으로부터의 것이고, 가변 영역은 또 다른 것으로부터의 것이다. 항체 단편 출발 물질 또한 변형될 수 있다. 또 다른 예에서, 항체 단편의 가변 영역은 재조합 DNA 조작 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 상기 조작된 버전은 예를 들어, 천연 항체의 아미노산 서열에서 또는 아미노산 서열에의 삽입, 결실, 또는 변이에 의해 천연 항체 가변 영역으로부터 생성된 것을 포함한다. 상기 유형의 특정 예로는 적어도 하나의 CDR, 및 임의적으로, 한 항체로부터의 하나 이상의 프레임워크 아미노산 및 제2 항체로부터의 가변 영역 도메인의 나머지 부분을 함유하는 상기 조작된 가변 영역 도메인을 포함한다. Fab-Fv 포맷은 WO2009/040562에서 처음 개시되었고, 그의 디술피드 안정화된 버전인 Fab-dsFv는 WO2010/035012에서 처음 개시되었다. 다른 항체 단편으로는 국제 특허 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에서 기술된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성을 포함할 수 있고, 예컨대, 이중특이적 일 수 있거나, 또는 단일특이적일 수 있다(예를 들어, WO 92/22583 및 WO05/113605 참조). 후자에 관한 한 예로는 WO92/22583에 기술된 것과 같은 트리-Fab(또는 TFM)이 있다. 또 다른 다중 특이적 포맷은 WO2015/197772에 기술되어 있다.
전형적인 Fab' 분자는, 중쇄는 가변 영역 VH, 불변 도메인 CH1 및 천연 또는 변형된 힌지 영역을 포함하고, 경쇄는 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함하는 것인, 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함한다.
항체의 결합 도메인은 전형적으로, 중쇄로부터 3개 및 경쇄로부터 3개인, 6개의 CDR을 포함한다. 상기 항체에서, CDR은 프레임워크에 존재하고, 함께 가변 영역을 형성한다. 따라서, 한 실시양태에서 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 예를 들어, 항체가 단일 도메인 항체인 경우, 결합 도메인은 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나의 단일 V 도메인로부터의 3개의 CDR만을 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 항체는 경쇄 가변 영역(VL 도메인) 또는 중쇄 가변 영역(VH 또는 VHH 도메인) 중 하나를 포함하는, 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함한다. 항원에 결합하는 V 도메인은 단독으로 결합할 수 있거나, 또는 또 다른 V 도메인, 예를 들어, 상보적인 VH/VL 쌍으로서 협력하여 결합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, V 도메인을 포함하는 항체는 상보적인 V(VH 또는 VL) 도메인과 협력하여 그의 항원에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, V 도메인은 VH 도메인이고, 본 발명의 항체는 VL 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, VH 도메인은 VH/VL 쌍으로서 VL 도메인과 함께 협력하여 그의 항원에 결합하고, 즉, 본 발명의 항체는 VH 도메인을 포함하고, 상보적인 VL 도메인과 함께 협력하여 그의 항원에 결합한다. 한 실시양태에서, V 도메인은 VL 도메인이고, 본 발명의 항체는 VH 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, VL 도메인은 VH/VL 쌍으로서 VH 도메인과 함께 협력하여 그의 항원에 결합하고, 즉, 본 발명의 항체는 VL 도메인을 포함하고, 상보적인 VH 도메인과 함께 협력하여 그의 항원에 결합한다.
본 발명의 항체의 결합 도메인은 전형적으로 항원에 결합하는, VH, VL, 또는 VH/VL 쌍을 지칭한다.
항체는 일반적으로 하나 이상의 결합 도메인을 함유한다. 예를 들어, 비변형된 Fab 단편은 VH/VL 쌍에 의해 형성된 한 결합 도메인을 포함하고, 완전 IgG는 각각의 것이 VH/VL 쌍에 의해 형성된 두 결합 도메인을 포함하고, 여기서, 두 결합 도메인은 동일하거나(단일특이적 항체) 또는 상이한(이중특이적 또는 2가 항체)이다. 한 예에서, 본 발명의 항체는 VH 도메인, 및 VH 도메인의 Fwk3 영역 내에 존재하는 인서트 폴리펩티드를 포함하고, VH 도메인과 상보적인 쌍을 형성하는 VL 도메인을 추가로 포함하는 Fab 단편일 수 있다. 한 예에서, VL 도메인은 비변형된 것일 수 있거나(즉, 본 발명의 항체는 VH 도메인의 Fwk3 영역 내에 단일 인서트 폴리펩티드를 포함하는 Fab이다), 또는 그의 Fwk3 영역 내에 인서트 폴리펩티드를 포함할 수 있다(즉, 본 발명의 항체는, 동일하거나, 유사하거나, 또는 상이한 두 인서트 폴리펩티드로, 하나는 VH 도메인의 Fwk3 영역 내에 삽입되고, 나머지 하나는 VL 도메인의 Fwk3 영역 내에 삽입된 것인 두 인서트 폴리펩티드를 포함하는 Fab 단편이다). 한 예에서, 본 발명의 항체는 VL 도메인, 및 VL 도메인의 Fwk3 영역 내에 존재하는 인서트 폴리펩티드를 포함하고, VL 도메인과 상보적인 쌍을 형성하는 VH 도메인을 추가로 포함하는 Fab 단편일 수 있다. 한 예에서, VH 도메인은 비변형된 것일 수 있거나(즉, 본 발명의 항체는 VL 도메인의 Fwk3 영역 내에 단일 인서트 폴리펩티드를 포함하는 Fab이다), 또는 그의 Fwk3 영역 내에 인서트 폴리펩티드를 포함할 수 있다(즉, 본 발명의 항체는, 동일하거나, 유사하거나, 또는 상이한 두 인서트 폴리펩티드로, 하나는 VL 도메인의 Fwk3 영역 내에 삽입되고, 나머지 하나는 VH 도메인의 Fwk3 영역 내에 삽입된 것인 두 인서트 폴리펩티드를 포함하는 Fab 단편이다). 또 다른 예에서, 본 발명의 항체는 VH 도메인, 및 VH 도메인의 Fwk3 영역 내에 존재하는 인서트 폴리펩티드를 포함하고, VH 도메인과 상보적인 쌍을 형성하는 VL 도메인을 추가로 포함하는 전장의 IgG이다. 한 예에서, VL 도메인은 비변형된 것일 수 있거나(즉, 본 발명의 항체는, 각각의 것이 IgG의 두 VH 도메인 중 하나 내에 삽입된 것인 두 인서트 폴리펩티드를 포함하는 IgG이다), 또는 그의 Fwk3 영역 내에 인서트 폴리펩티드를 포함할 수 있다(즉, 본 발명의 항체는, 동일하거나, 유사하거나, 또는 상이한 4개의 인서트 폴리펩티드로, 그들 각각이 그의 두 VH 및 두 VL 도메인 각각의 것의 Fwk3 영역 내에 삽입된 것인 4개의 인서트 폴리펩티드를 포함하는 IgG이다). 또 다른 예에서, 본 발명의 항체는 VL 도메인, 및 VL 도메인의 Fwk3 영역 내에 존재하는 인서트 폴리펩티드를 포함하고, VL과 상보적인 쌍을 형성하는 VH 도메인을 추가로 포함하는 전장의 IgG이다. VH 도메인은 비변형된 것일 수 있거나(즉, 본 발명의 항체는, 각각의 것이 IgG의 두 VL 도메인 중 하나 내에 삽입된 것인 두 인서트 폴리펩티드를 포함하는 IgG이다), 또는 그의 Fwk3 영역 내에 인서트 폴리펩티드를 포함할 수 있다(즉, 본 발명의 항체는, 동일하거나, 유사하거나, 또는 상이한 4개의 인서트 폴리펩티드로, 그들 각각이 그의 두 VL 및 두 VH 도메인 각각의 것의 Fwk3 영역 내에 삽입된 것인 4개의 인서트 폴리펩티드를 포함하는 IgG이다).
항체 가변 도메인 중의 잔기는 통상적으로 카바트 등에 의해 고안된 체계에 따라 넘버링된다. 상기 체계는 문헌 [Kabat et al. This system is set forth in Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA]에 기재되어 있다. 달리 명시되는 경우를 제외하면, 본 명세서에서는 상기 넘버링 체계가 사용된다.
카바트 잔기 지정이 항상 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 직접적으로 상응하는 것은 아니다. 실제의 선형 아미노산 서열은, 프레임워크이거나 또는 상보성 결정 영역(CDR)이거나 상관없이, 기본 가변 도메인 구조의 구조 성문의 단축 또는 삽입에 상응하는 엄격한 카바트 넘버링에서보다 더 적은 수의 또는 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 잔기의 정확한 카바트 넘버링은 당업계에 공지된 방법에 의해 항체의 서열 중 상동성 잔기를 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 함께 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다. CDR 루프 이외에도, 프레임워크 3(Fwk3)에 의해 형성되는 제4 루프가 CDR-2와 CDR-3 사이에 존재한다. 도 1A는 경쇄 및 중쇄를 갖는 Fab와 관련하여 프레임워크 3 루프를 보여주는 대표도를 제공한다. 도 1B 및 1C는 또한 잔기 루프로부터의 대표적인 잔기를 보여주는 것이다. 카바트 넘버링 체계는 프레임워크 3을 중쇄 중 66-94번 위치 및 경쇄 중 57-88번 위치로서 정의한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 가변(V) 도메인 및 인서트 폴리펩티드를 포함하고, 여기서, 인서트 폴리펩티드는, V 도메인이 VH 도메인일 때에는 66-94번 위치 내에 있거나, 또는 V 도메인이 VL 도메인일 때에는 57-88번 위치 내에 있다.
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 카바트 넘버링 체계에 따라 VH 도메인의 아미노산 잔기 73과 76 사이에 존재한다. 바람직하게, 인서트 폴리펩티드는 카바트 넘버링 체계에 따라 VH 도메인의 아미노산 잔기 73과 74, 74와 75, 또는 75와 76 사이에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 카바트 넘버링 체계에 따라 VH 도메인의 아미노산 잔기 76과 77, 또는 77과 78 사이에 존재한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기가 인서트 폴리펩티드에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 카바트 넘버링 체계에 따라 VL 도메인의 아미노산 잔기 67과 70 사이에 존재한다. 바람직하게, 인서트 폴리펩티드는 카바트 넘버링 체계에 따라 VL 도메인의 아미노산 잔기 67과 68, 68과 69, 또는 69와 70 사이에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, VL 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기가 인서트 폴리펩티드에 의해 대체된다.
본 발명의 항체는 불변 영역 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은 존재할 경우, 항체 분자의 제안된 기능, 및 특히 요구될 수 있는 이펙터 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 이펙터 기능이 요구될 때에는 IgG1 및 IgG3 이소타입의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때에는 IgG2 및 IgG4 이소타입이 사용될 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변이체 또한 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Angal et al. Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108]에 기술된 바와 같이, 241번 위치의 세린이 프롤린으로 변이된 IgG4 분자가 사용될 수 있다. 항체는 다양하게 번역 후 변형이 이루어질 수 있다는 것도 또한 당업자는 이해할 것이다. 이러한 변형의 유형 및 정도는 대개 항체 발현에 사용되는 숙주 세포주 뿐만 아니라, 배양 조건에 의존한다. 상기 변형으로는 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화를 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 (문헌 [Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 기술된 바와 같이) 카복시펩티다제의 작용에 기인한 카복시-말단 기본 잔기(예컨대, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체는 완전 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 뮤린 항체가 아니다. "뮤린 항체"라는 용어는 배타적으로 뮤린 B 세포로부터만 유래된 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 따라서, 상기 항체는 그의 생산을 가능하게 하는 세포의 기점이 무엇이든 간에, 뮤린 아미노산 서열로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 키메라 항체이다. "키메라 항체"라는 용어는, 그의 각 경쇄 및/또는 각 중쇄 서열이 적어도 2개의 상이한 동물, 특히, 포유동물로부터 유래된 하이브리드 서열로 구성되거나, 그를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 특히, 토끼, 뮤린, 래트, 또는 시노몰구스 가변 영역을 인간 불변 영역과 조합한 항체를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 분자이다(예를 들어, US 5,585,089 참조). 특히, "인간화"라는 용어는 중쇄 및/또는 경쇄가 수용자 항체, 예컨대, 인간 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 그래프팅된 비인간 항체(예컨대, 토끼, 뮤린, 래트, 시노몰구스 또는 라마 단일클론 항체)로부터의 하나 이상의 CDR을 함유하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 전체 CDR이 전달되기보다는, 본원에서 상기에 기술된 CDR들 중 어느 하나로부터의 특이성 결정 잔기들 중 오직 하나 이상의 것만이 인간 항체 프레임워크로 전달될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 인간화 항체의 선택된 프레임워크 잔기는 예컨대, 항체 특이성 또는 친화성 회복 또는 개선을 위해 비인간 항체(예컨대, CDR 또는 특이성 결정 잔기의 유래 기점이 되는 항체)로부터의 상응하는 잔기(소위 공여자 잔기로 불림)로 치환될 수 있다.
완전 인간 항체는 중쇄 및/또는 경쇄, 둘 모두의 가변 영역(들) 및 불변 영역(들)(존재하는 경우)이 모두 인간 기원의 것이거나, 또는 반드시 동일한 항체로부터의 것일 필요는 없고, 인간 기원의 서열과 실질적으로 동일한 것인 항체이다. 완전 인간 항체의 예는 예를 들어, 파지 디스플레이 방법에 의해 제조된 항체, 및 예컨대, EP0546073 B1, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, EP 0438474 B1 및 EP0463151 B1에서 일반적으로 기술된 바와 같이, 뮤린 면역글로불린 가변 및/또는 불변 영역 유전자가 그의 인간 대응물에 의해 대체된, 마우스에 의해 생산된 항체를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 V 도메인 및 인서트 폴리펩티드를 포함하는 항체는 예를 들어, 예컨대, 항체의 약동학적 특성 또는 항원 결합에 영향을 줄 수 있는 추가 화합물에 화학적으로 접합되는 것과 같이, 추가로 변형될 수 있다.
한 예에서 본 발명의 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 예를 들어, PEG에 연결된 항체는 추가로 증가된 혈청 반감기를 보일 수 있다. 한 특정 예에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편에 위치하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어, 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카복실 기를 통해 부착될 수 있다. 상기 아미노산은 항체 단편으로 자연적으로 발생될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 단편으로 조작될 수 있다(예를 들어, US 5,219,996; US 5,667,425; WO98/25971, WO2008/038024 참조). 한 예에서, 본 발명의 항체는, 변형이 C-말단 단부의 부착을 허용하기 위한 하나 이상의 아미노산의 그의 중쇄의 C-말단 단부에서의 부가인, 변형된 Fab 단편이다. 적합하게, 아미노산의 부가가, 펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 2개 이상의 PEG 분자를 부착시키기 위해 다중 부위가 사용될 수 있다.
적합하게, PEG 분자는 항체 단편에 위치하는 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 공유적으로 연결될 수 있다. 변형된 항체 단편에 부착된 각 중합체 분자는 항체 단편에 위치하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유적으로 연결될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 디술피드 결합이거나, 또는 황-탄소 결합일 것이다. 티올 기가 부착점으로 사용되는 경우, 적절한 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어, 티올 선택적 유도체, 예컨대, 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기술된 바와 같이 중합체 변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응기, 예컨대, α-할로카복실산 또는 에스테르를 함유하는 임의의 중합체, 예컨대, 아이오도아세트아미드, 이미드, 예컨대, 말레이미드, 비닐 술폰 또는 디술피드일 수 있다. 상기 출발 물질은 상업적으로 입수할 수 있거나 (예컨대, 이전 Shearwater Polymers Inc.(미국 앨라배마주 헌츠빌 소재)인 Nektar로부터 입수), 또는 종래 화학 방법을 이용하여 상업적으로 이용가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 특정 PEG 분자로는 20K 메톡시-PEG-아민(이전 Shearwater인 Nektar; Rapp Polymere; 및 SunBio로부터 입수가능) 및 M-PEG-SPA(이전 Shearwater인 Nektar로부터 입수가능)를 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 항체는 (그의 해리 상수 KD에 의해 측정된), 그의 동종 항원에 대하여 10-5 M 이하, 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 또는 10-11 M 이하의 결합 친화도를 갖는다. 친화도는 예컨대, 비아코어(Biacore)™를 포함하는, 표면 플라스몬 공명 기술과 같은 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다. 친화도는 실온, 25℃ 또는 37℃에서 측정될 수 있다. 친화도는 생리적 pH, 즉, 약 pH 7.4에서 측정될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 항체의 친화도는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 변경될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한, 알부민에 대해 개선된 친화성을 갖는, 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이다. 상기 변이체는 CDR 돌연변이화(문헌 [Yang et al., J. Mol. Biol, 254. 392-403, 1995]), 쇄 셔플링(문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992]), E. 콜라이(E. coli) 돌연변이유발 균주 사용(문헌 [Low et al., J. Mol. Biol., 260. 359-368, 1996), DNA 셔플링(문헌 [Patten et al., Curr. Opin. BiotechnoL, 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(문헌 [Thompson et al., J. Mol. Biol, 256. 77-88, 1996) 및 유성 PCR(문헌 [Crameri et al.. Nature, 391. 288-291, 1998])을 비롯한, 다수의 친화도 성숙화 프로토콜에 의해 수득될 수 있다.
인간 혈청 알부민 결합 항체
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합하는 V 도메인을 포함한다. 상기 실시양태에서, 항체는 인서트 폴리펩티드의 혈청 반감기를 연장시키는 데 유용할 수 있다. 알부민에 결합하는 V 도메인은 단독으로 그렇게 결합할 수 있거나, 또는 예를 들어, 상보적인 VH/VL 쌍으로서, 또 다른 V 도메인과 함께 협력하여 결합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, V 도메인을 포함하는 항체는 상보적인 VH 또는 VL 도메인과 함께 협력하여 알부민에 결합한다. 한 실시양태에서, V 도메인은 VH 도메인이고, 본 발명의 항체는 VL 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, VH는 VH/VL 쌍으로서 VL 도메인과 함께 협력하여 알부민에 결합하고, 즉, 본 발명의 항체는 VH 도메인을 포함하고, 상보적인 VL과 함께 협력하여 알부민에 결합한다. 한 실시양태에서, V 도메인은 VL 도메인이고, 본 발명의 항체는 VH 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, VL는 VH/VL 쌍으로서 VH 도메인과 함께 협력하여 알부민에 결합하고, 즉, 본 발명의 항체는 VL 도메인을 포함하고, 상보적인 VH와 함께 협력하여 알부민에 결합한다. 본 발명의 항체가 알부민에 결합하는 경우, VH/VL은 전형적으로 "알부민 결합 도메인"으로 명명된다. 따라서, 본 발명의 항체의 알부민 결합 도메인은 알부민에 결합하는 VH, VL, 또는 VH/VL 쌍을 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 시노몰구스 혈청 알부민, 뮤린 혈청 알부민 및/또는 래트 혈청 알부민에 결합한다.
한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 알부민 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄가 인간 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 그래프팅된, 토끼, 뮤린, 또는 래트 단일클론 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 함유하는 것인 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 알부민 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄가 인간 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 그래프팅된 토끼 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 함유하고, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크가 예컨대, 공여자 잔기인 아미노산과 같은, 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 것인 인간화 항체이다.
한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 본 발명의 항체는 하기 제시되는 바와 같은 경쇄 및/또는 중쇄 서열을 포함한다(가변 도메인은 밑줄체로 표시; CDR은 굵은 이탤릭체로 표시 ). 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 본 발명의 항체는 하기로부터 선택되는 경쇄 및/또는 중쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 본 발명의 항체는 하기로부터 선택되는 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 본 발명의 항체는 하기로부터 선택되는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열 중 적어도 하나 및/또는 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 본 발명의 항체는 하기로부터 선택되는 경쇄 및/또는 중쇄 서열; 및/또는 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인 서열; 및/또는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열 중 적어도 하나; 및/또는 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
CA645 경쇄(gL5)
VL 도메인(gL5):
CDR-L1: QSSPSVWSNFLS(서열번호 3)
CDR-L2: EASKLTS(서열번호 4)
CDR-L3: GGGYSSISDTT(서열번호 5)
CA645 중쇄(gH5)
VH 도메인(gH5):
CDR-H1: GIDLSNYAIN(서열번호 8)
CDR-H2: IIWASGTTFYATWAKG(서열번호 9)
CDR-H3: TVPGYSTAPYFDL(서열번호 10)
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 디술피드 결합이 VL과 VH 도메인 사이에 형성될 수 있도록 추가의 시스테인 잔기를 포함하는, 상기 기술된 인간 혈청 알부민에 결합하는 VL 및 VH 도메인(각각 서열번호 2 및 7)의 변이체를 포함한다. 추가의 시스테인 함유 변이체는 하기 서열을 가질 수 있다(여기서, 추가의 시스테인 잔기는 밑줄체로 표시된다):
CA645-Cys VL 도메인(gL5):
CA645-Cys VH 도메인(gH5):
인간 혈청 알부민에 결합하고, 본 발명의 항체에서 사용될 수 있는 VL 및 VH 도메인의 추가 예로는 하기 기술되는 서열번호 105, 106, 107, 108 및 109를 포함한다(CDR은 굵은 이탤릭체로 표시 ).
CA645
VH
도메인(
gH1
):
CA645
VH
도메인(
gH37
):
CA645
VH
도메인(
gH47
):
CA645
VL
도메인(
gL1
):
CA645
VL
도메인(
gL4
):
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 디술피드 결합이 VL과 VH 도메인 사이에 형성될 수 있도록 추가의 시스테인 잔기를 포함하는, 상기 기술된 인간 혈청 알부민에 결합하는 VL 및 VH 도메인(서열번호 105 내지 서열번호 109)의 변이체를 포함한다. 추가의 시스테인 함유 변이체는 하기 서열을 가질 수 있다(여기서, 추가의 시스테인 잔기는 밑줄체로 표시된다):
CA645-Cys VL(gL4):
일부 실시양태에서, 알부민 결합 도메인의 VH 프레임워크는 인간의 것이고(예를 들어, VH3, 예컨대, VH3 1-3 3-23), 예를 들어, 예컨대, 공여자 잔기인 아미노산과 같은, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 실시양태에서, VH는 서열번호 7, 서열번호 103, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107에 제시된 서열, 또는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖는 상기 서열 중 어느 하나의 변이체를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 알부민 결합 도메인의 VL 프레임워크는 인간의 것이고 (예를 들어, Vκ1, 예컨대, 2-1-(1) L5), 예를 들어, 예컨대, 공여자 잔기인 아미노산과 같은, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 실시양태에서, VL은 서열번호 2, 서열번호 102, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110에 제시된 서열, 또는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖는 상기 서열 중 어느 하나의 변이체를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 알부민 결합 도메인은 조합 서열번호 7&2, 7&102, 7&108, 7&109, 7&110, 103&2, 103&102, 103&108, 103&109, 103&110, 105&2, 105&102, 105&108, 105&109, 105&110, 106&2, 106&102, 106&108, 106&109, 106&110, 107&2, 107&102, 107&108, 107&109, 107&110, 또는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖는 상기 조합 중 임의의 것의 변이체 또는 변이체들로부터 선택되는 VH 및 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 알부민 결합 도메인의 VL 및 VH 서열은 각각 서열번호 102 및 서열번호 103이다. 일부 실시양태에서, 알부민 결합 도메인의 VL 및 VH 서열은 각각 서열번호 2 및 서열번호 7이다.
한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 Fab 또는 scFv이다. 서열번호 2 및 7의 VL 및 VH 도메인이 Fab 포맷에 바람직하다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 상보적인 V(VL 또는 VH) 도메인과 함께 협력하여 알부민에 결합하는 scFv이다. 상기 실시양태에서, scFv는 (G4S)4 링커(서열번호 16)에 의해 VH-VL 또는 VL-VH 배향으로 연결된, 상기 기술된 바와 같은 VH 도메인들 중 어느 하나 및 VL 도메인들 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 서열번호 2 및 7의 VL 및 VH 도메인이 scFv 포맷에 바람직하다. 서열번호 2의 VL 도메인은 C-말단에 추가로 2개의 아미노산 RT를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 (G4S)4 링커에 의해 이격되어 있는 서열번호 2 및 7의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 scFv이다. 한 예에서, scFv는 VH-VL 배향성을 띤다. 또 다른 예에서, scFv는 VL-VH 배향성을 띤다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 하기 제시되는 서열번호 143을 포함하거나, 또는 그를 갖는 scFv이다. 한 특정 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 dsscFv이다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 상보적인 V(VL 또는 VH) 도메인과 함께 협력하여 알부민에 결합하는 dsscFv이다. 상기 실시양태에서, dsscFv는 이미 존재하고 있지 않다면, 디술피드 결합이 VL과 VH 도메인 사이에 형성될 수 있도록 추가의 시스테인 잔기를 포함하고, 여기서, VL 및 VH 도메인은 (G4S)4 링커에 의해 VH-VL 또는 VL-VH 배향으로 연결된 것인, 상기 기술된 바와 같은 VH 도메인들 중 어느 하나 및 VL 도메인들 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 서열번호 102 및 103의 VL 및 VH 도메인이 dsscFv 포맷에 바람직하다. 서열번호 102의 VL 도메인은 C-말단에 추가로 2개의 아미노산 RT를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 (G4S)4 링커(서열번호 16)에 의해 이격되어 있는 서열번호 102 및 103의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 dsscFv이다. 한 예에서, dsscFv는 VH-VL 배향성을 띤다. 또 다른 예에서, dsscFv는 VL-VH 배향성을 띤다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 하기 제시되는 서열번호 144를 포함하거나, 또는 그를 갖는 dsscFv이다.
CA645
scFv
(
VH
-
VL
):
CA645
dsscFv
(
VH
-
VL
)(여기서, 추가의 시스테인
잔기는
밑줄체로
표시되어 있다):
또 다른 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 전장의 IgG이다. 서열번호 2 및 7의 VL 및 VH 도메인이 IgG 포맷에 바람직하다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 IgG1이다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 IgG4이다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민에 결합하는 V 도메인을 포함하는 항체는 IgG4P이다.
그의 동족 항원(예컨대, HSA)에 결합할 수 있는 항체의 능력을 유의적으로 변경시키지 않으면서, 본 발명에 의해 제공되는 CDR 또는 다른 서열(예컨대, 가변 도메인)에 대해 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의) 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 임의의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실의 효과는 당업자에 의해 쉽게 시험할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 단편에서 사용되는 프레임워크 영역에 대해 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의) 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이 이루어질 수 있으며, 여기서, 동족 항원에 대한 결합 친화도는 유지되거나, 또는 증가된다. 일부 실시양태에서, VH 도메인의 프레임워크 3의 72번 위치의 아미노산은 천연적으로 상기 VH 도메인의 72번 위치에 존재하는, 야생형 아미노산이다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에 제공된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사 또는 동일한 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "동일성"은 정렬된 서열 내의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에서 동일함을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, "유사성"은 정렬된 서열 내의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열들 사이에서 유사한 유형의 것임을 나타낸다. 예를 들어, 류신이 이소류신 또는 발린을 치환할 수 있다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 하기의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산);
- 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산).
동일성 및 유사성의 정도는 쉽게 계산될 수 있다(문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987], [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]), NCBI로부터 이용가능한 BLAST™ 소프트웨어(문헌 [Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272]. [Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141]; [Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; [Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656]).
본 발명의 항체는 생체내에서 인서트 폴리펩티드, 예컨대, 치료 단백질 또는 제2 항체의 반감기를 연장시키는 데 충분한 결합 친화도로 알부민에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 HSA에 결합한다. 상기 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 스캐폴드 항체의 반감기를 연장시키는 데 충분한 결합 친화도로 알부민에 결합할 수 있다. 알부민에 대한 KD가 2.5 μM 이하인 것이 생체내 반감기를 연장시킬 것이라고 보고되었다(문헌 [Nguyen, A. et al (2006) Protein Engineering, Design & Selection, 19(7), 291-297]). 한 예에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, 3 nM 이하인 KD와 같이, 나노몰 또는 마이크로몰인 높은 결합 친화도로 알부민에 결합할 수 있다. 친화도는 천연 또는 재조합 혈청 알부민을 이용하는 표면 플라스몬 공명을 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 알부민 결합 펩티드이다. 알부민 결합 펩티드의 예는 WO2007/106120에 제공되어 있으며, 하기를 포함한다:
한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 HSA에 결합하는 제2 항체이다. 상기 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 V 도메인을 포함하는 항체, 즉, 스캐폴드 항체에 대해 상기 기술된 특징들을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같이, CDR 중 적어도 하나, VL 또는 VH 도메인중 적어도 하나, 또는 알부민에 결합하는 경쇄 또는 중쇄 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 서열 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 적어도 하나 및/또는 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 서열 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 중 하나를 포함한다.
인서트 폴리펩티드
본 발명에 따라, 본 개시내용은 V 도메인 중의 프레임워크 3 영역 내에 인서트 폴리펩티드를 포함하는 항체에 관한 것이다. V 도메인은 VL 또는 VH 도메인일 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 항체는 VL 및 VH, 둘 모두의 프레임워크 3 영역 내에 인서트 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 즉, 본 발명의 항체는, 한 인서트 폴리펩티드는 VL의 프레임워크 3 영역 내로 삽입되고, 한 인서트 폴리펩티드는 VH의 프레임워크 3 영역 내로 삽입되어 있으며, 여기서, 인서트 폴리펩티드는 동일하거나, 유사하거나, 또는 상이한 것인, 두 인서트 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 항체에 대해 이종성이다. 본원에서 사용되는 바, "이종성"이란, 일반적으로는 그의 비교 대상이 되는 엔티티의 나머지 부분과 유전적으로 상이한 엔티티로부터 유래되었다는 것을 의미한다. 이러한 맥락에서, 삽입된 폴리펩티드는 보통 천연 항체 서열에는 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 전장의 단백질이다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 전장의 단백질의 단편이다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 전장의 단백질의 기능성 단편이다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 단독으로 발현되었을 때, 기능성이다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 V 도메인 중의 프레임워크 3 영역에 존재할 때, 기능성이고/거나, 기능을 보유한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 가변(V) 도메인 및 인서트 폴리펩티드를 포함하는 항체로서, 여기서, 인서트 폴리펩티드는 V 도메인의 프레임워크 3(Fwk3) 영역 내에 있고, 여기서, 인서트 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 V 도메인 중의 프레임워크 3 영역에 존재할 때, 기능성이고/거나, 기능을 보유하는 것인 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 또는 200개의 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 250, 300 또는 350개 미만의 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 250개 미만의 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 또는 200개의 아미노산 내지 250개 미만의 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 50 내지 250개, 바람직하게, 100 내지 250개, 더욱 바람직하게, 150 내지 250개의 아미노산을 포함한다.
한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 치료 또는 진단 폴리펩티드일 수 있다. 적합한 치료 폴리펩티드는 예를 들어, 수용체 작용제 또는 길항제, 효소 억제제, 금속 킬레이터, 항바이러스제, 항진균제, 심혈관 약물 및 화학요법 약물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 시토카인이다. 시토카인은 예를 들어, IL-10, IL-15, IL-2, G-CSF, GM-CSF, EPO로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 스클레로스틴이다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 1 초과의 폴리펩티드 서열, 예컨대, 임의적으로, 연결된, 2 카피의 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 이롭게는, 상기 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 다량체, 특히, 기능성 다량체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 2, 3, 또는 4개의 폴리펩티드 서열을 포함하고, 폴리펩티드의 이량체, 삼량체 또는 사량체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서. 인서트 폴리펩티드는 동종이량체, 동종삼량체 또는 동종사량체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 적어도 2개의 시토카인을 포함한다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 임의적으로, 펩티드 링커, 예컨대, (G4S)3(서열번호 15)에 의해 이격되어 있는, 2개의 인간 IL-10 서열을 포함하고, 즉, 2개의 인간 IL-10 서열이 본 발명의 항체의 V 도메인의 Fwk3 영역 내로 삽입되어 있다. 상기 실시양태에서, 2개의 인간 IL-10 서열은 본 발명의 항체 내로 도입된 IL-10의 동종이량체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 케모카인이다. 케모카인은 예를 들어, CCL(C-C 모티프 케모카인 리간드), CXCL(CXC 모티프 케모카인 리간드)로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 호르몬이다. 호르몬은 예를 들어, 인슐린 또는 렙틴으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 성장 인자이다.
놀랍게도, 본 발명에 의해 V 도메인의 프레임워크 3 루프 영역에서 항체 내로의 폴리펩티드 삽입이 항체 또는 인서트 폴리펩티드의 기능을 유의적으로 방해하지 않는다는 것이 밝혀졌다. 특히, 본원 실시예는 항체 및 인서트 폴리펩티드, 둘 모두의 각각의 결합 파트너에의 특이적이고, 동족성인 결합이 수개의 시험된 융합 단백질 구성물에 대해 관찰된다는 것을 보여준다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인서트 폴리펩티드가 존재하지 않는 항체와 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%인 결합 친화도로 상기 V 도메인에 의해 그의 동종 항원에 결합한다. 항원에 결합하는 V 도메인은 단독으로, 또는 예를 들어, 상보적인 VH/VL 쌍과 같이, 항체 포맷에 의존하여 또 다른 V 도메인과 함께 협력하여 결합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, V 도메인을 포함하는 항체는 상보적인 V(VH 또는 VL) 도메인과 함께 협력하여 그의 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인서트 폴리펩티드가 존재하지 않는 항체와 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%인 결합 친화도로 그의 동족 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 VH 도메인을 포함하고, 인서트 폴리펩티드가 존재하지 않는 항체와 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%인 결합 친화도로 상보적인 VL과 함께 협력하여 그의 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 VL 도메인을 포함하고, 인서트 폴리펩티드가 존재하지 않는 항체와 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%인 결합 친화도로 상보적인 VH와 함께 협력하여 그의 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체의 인서트 폴리펩티드 부분은 항체에 연결되지 않았을 때의 유리 폴리펩티드와 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%인 결합 친화도로 그의 동족 결합 파트너에 결합한다.
그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 가변(V) 도메인 및 인서트 폴리펩티드를 포함하고, 여기서, 인서트 폴리펩티드는 V 도메인의 프레임워크 3(Fwk3) 영역 내에 있고, 여기서, V 도메인을 포함하는 항체 및 인서트 폴리펩티드, 둘 모두, 인서트 폴리펩티드가 존재할 때, 기능성이고/거나, 기능을 보유한다. 상기 실시양태에서, 본 발명의 항체는 스캐폴드 항체 및 인서트 폴리펩티드, 둘 모두의 기능을 갖는다. 이롭게는, 본 발명의 항체는 스캐폴드 항체 및 인서트 폴리펩티드, 둘 모두의 기능을 동시에 발휘할 수 있다.
가변(V) 도메인을 포함하는 항체는, 인서트 폴리펩티드가 V 도메인의 프레임워크 3 영역에 존재할 때, 이는 기능성이고/거나, 기능을 보유하는 것으로 간주되고, 여기서, 본 발명의 항체는 인서트 폴리펩티드가 존재하지 않는 가변(V) 도메인을 포함하는 항체의 기능들 중 적어도 하나의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 나타낸다. 인서트 폴리펩티드가 V 도메인의 프레임워크 3 영역에 존재할 때, 이는 기능성이고/거나, 기능을 보유하는 것으로 간주되고, 여기서, 인서트 폴리펩티드는 그 단독으로 발현되었을 때, 즉, 항체에 연결되지 않았을 때의 유리 폴리펩티드와 비교하여 인서트 폴리펩티드의 기능들 중 적어도 하나의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 나타낸다.
항체 및/또는 인서트 폴리펩티드가 기능성이 기능성이다, 또는 그의 기능이라는 것은 예를 들어, 표적 결합(예컨대, 항원 결합), 결합 친화도, 교차 반응성, 중화, 혈청 반감기, 예컨대, T 세포 표면 수용체와 같은, 세포 표면 단백질의 활성화를 비롯한, 상기 항체 및/또는 인서트 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 지칭한다. 기능, 예컨대, 결합 친화도, 중화, 및 표적 세포의 활성화를 측정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 본원에 제공된 실시예에 기술되어 있는 방법을 포함한다. 예를 들어, 표준 검정법, 예컨대, 스캐차드(Scatchard) 분석, 또는 표면 플라스몬 공명 기술(예컨대, BIACORE® 사용)이 표적 결합(예컨대, 항원 결합) 및 결합 친화도를 측정하는 데 사용될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명의 항체의 V 도메인(VL 또는 VH 도메인)은 존재하는 경우, 그의 상응하는 또는 상보적인 V 도메인(VH 또는 VL)과 여전히 기능성 결합 도메인을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 제2 항체, 또는 그의 결합 단편일 수 있다. 상기 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같이 항체의 특징들 중 임의의 것을 가질 수 있다. 특히, 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 scFv, dsscFv, 단일 도메인 항체 예컨대, VH 또는 VL 또는 VHH이다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 완전 인간, 인간화, 또는 키메라 항체이다. 인서트 폴리펩티드는 하나 이상의 CDR로 구성될 수 있거나, 또는 하나 이상의 CDR로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 인서트 폴리펩티드는 임의적으로, 연결된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 및/또는 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 중 적어도 하나를 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다.
당업자라면, 상기의 것이 2가 항체, 또는 이중특이적 항체로서 작용할 것임을 이해할 것이다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 2개의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는, 신규한 2가 또는 이중특이적 항체 포맷을 제공한다. 일부 측면에서, 에피토프는 동일한 항원 상에 존재하는 상이한 에피토프이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 2개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있는, 신규한 이중특이적 항체 포맷을 제공한다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 항체 또는 항체 단편이 결합하는 관심 항원은 세포 결합 단백질, 예를 들어, 세포 예컨대, 박테리아 세포, 효모 세포, T 세포, 내피 세포 또는 종양 세포 상에 존재하는 세포 표면 단백질일 수 있거나, 또는 가용성 단백질일 수 있다. 관심 항원은 또한 임의의 의학적으로 관련된 단백질, 예컨대, 감염 질환 동안 상향조절된 단백질, 예를 들어, 수용체 및/또는 그의 상응하는 리간드일 수 있다. 세포 표면 단백질의 특정 예로 부착 분자, 예를 들어, 인테그린, 예컨대, β1 인테그린, 예컨대, VLA-4, E-셀렉틴, P 셀렉틴 또는 L-셀렉틴, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, GDIS, CD19, CD20, CD23, CD25, CD28, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD 134(OX40), ICOS, BCMP7, CD 137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, 듀듈린2(dudulin2), FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, FTBP2, FTK, MAF2, MRP2, 넥틴 유사2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, 암 배아 항원(CEA: carcinoembryonic antigen), 인간 모유 지방 글로불린(HMFG(human milk fat globulin) 1 및 2), MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 항원, 및 VEGF, 및 적절할 경우, 그의 수용체를 포함한다. 가용성 항원으로는 인터류킨 예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16 또는 IL-17, 바이러스 항원, 예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스 또는 거대세포바이러스 항원, 면역글로불린, 예컨대, IgE, 인터페론, 예컨대, 인터페론 α, 인터페론 β 또는 인터페론 γ, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자 β, 콜로니 자극 인자, 예컨대, G-CSF 또는 GM-CSF, 및 혈소판 유래 성장 인자, 예컨대, PDGF α, 및 PDGF β, 및 적절할 경우, 그의 수용체를 포함한다. 다른 항원으로는 박테리아 세포 표면 항원, 박테리아 독소, 바이러스, 예컨대, 인플루엔자, EBV, Hep A, B 및 C, 생물테러병원체, 방사성 핵종 및 중금속, 및 뱀 및 거미 독 및 독소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드 항체도 인서트 폴리펩티드도 합텐(4-하이드록시-3-니트로페닐) 아세틸(NP) 또는 합텐(4-하이드록시-5-아이오도-3-니트로페닐) 아세틸(NIP)에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 BI-8 뮤린 항체와 상이한 것이다.
한 실시양태에서, 제2 항체는 항체의 V 도메인과 다른 항원에 결합한다.
다른 실시양태에서, 제2 항체는 항체의 V 도메인과 동일한 항원에 결합한다. 바람직하게, 제2 항체는 항체의 V 도메인과 비교하여 상이한 에피토프에 결합한다.상기 실시양태에서, 항체는 제2 항체가 존재하지 않는 항체와 비교하여 더욱 큰 결합 친화도로 그의 동종 항원에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 IL-17, 특히, IL-17A에 결합하는 제2 항체이다. 한 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 IL-17AA, IL-17AF, 및 IL-17FF에 결합하는 제2 항체이다. 한 실시양태에서, IL-17에 결합하는 제2 항체는 scFv이다. 한 실시양태에서, IL-17에 결합하는 제2 항체는 dsscFv이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HSA 및 IL-17, 둘 모두에 결합하는 Fab 단편이고, 특히, V 도메인을 포함하는 항체는 HSA에 결합하고, 인서트 폴리펩티드는 IL-17에 결합하는 dsscFv이고, 즉, 스캐폴드 항체는 HSA에 결합하는 Fab 단편이고, 스캐폴드 항체의 V 도메인의 Fwk3 영역 내로 삽입된 제2 항체는 IL-17에 결합하는 dsscFv이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HSA 및 IL-17, 둘 모두에 결합하는 완전 IgG이고, 특히, V 도메인을 포함하는 항체는 HSA에 결합하고, 인서트 폴리펩티드는 IL-17에 결합하는 dsscFv이고, 즉, 스캐폴드 항체는 HSA에 결합하는 전체 IgG이고, 스캐폴드 항체의 V 도메인의 Fwk3 영역 내로 삽입된 제2 항체는 IL-17에 결합하는 dsscFv이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열번호 129(CA497 dsscFv(vHvL)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄) 및 서열번호 1의 중쇄 및 경쇄, 또는 예컨대, HSA 및/또는 IL-17에의 결합과 같은 그의 기능을 보유한다면, 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖는 상기 중 임의의 것의 변이체 또는 변이체들을 포함하거나, 또는 그를 갖는 Fab 단편이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열번호 130(CA497 dsscFv(vLvH)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄) 및 서열번호 1의 중쇄 및 경쇄, 또는 예컨대, HSA 및/또는 IL-17에의 결합과 같은 그의 기능을 보유한다면, 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖는 상기 중 임의의 것의 변이체 또는 변이체들을 포함하거나, 또는 그를 갖는 Fab 단편이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열번호 131(CA497 dsscFv(vHvL)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 IgG4P 중쇄) 및 서열번호 1의 중쇄 및 경쇄, 또는 예컨대, HSA 및/또는 IL-17에의 결합과 같은 그의 기능을 보유한다면, 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖는 상기 중 임의의 것의 변이체 또는 변이체들을 포함하거나, 또는 그를 갖는 완전 IgG이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열번호 132(CA497 dsscFv(vLvH)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 IgG4P 중쇄) 및 서열번호 1의 중쇄 및 경쇄, 또는 예컨대, HSA 및/또는 IL-17에의 결합과 같은 그의 기능을 보유한다면, 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖는 상기 중 임의의 것의 변이체 또는 변이체들을 포함하거나, 또는 그를 갖는 완전 IgG이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CD3 및 CD28 둘 모두에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CD3 및 CD28 둘 모두에 결합하는 Fab 단편이고, 특히, V 도메인을 포함하는 항체는 CD3에 결합하고, 인서트 폴리펩티드는 CD28에 결합하는 dsscFv이고, 즉, 스캐폴드 항체는 CD3에 결합하는 Fab 단편이고, 스캐폴드 항체의 V 도메인의 Fwk3 영역 내로 삽입된 제2 항체는 CD28에 결합하는 dsscFv이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CD3 및 CD28 둘 모두에 결합하는 Fab 단편이고, 특히, V 도메인을 포함하는 항체는 CD28에 결합하고, 인서트 폴리펩티드는 CD3에 결합하는 dsscFv이고, 즉, 스캐폴드 항체는 CD28에 결합하는 Fab 단편이고, 스캐폴드 항체의 V 도메인의 Fwk3 영역 내로 삽입된 제2 항체는 CD3에 결합하는 dsscFv이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CD3 및 CD28 둘 모두에 결합하는 완전 IgG이고, 특히, V 도메인을 포함하는 항체는 CD3에 결합하고, 인서트 폴리펩티드는 CD28에 결합하는 dsscFv이고, 즉, 스캐폴드 항체는 CD3에 결합하는 전체 IgG이고, 스캐폴드 항체의 V 도메인의 Fwk3 영역 내로 삽입된 제2 항체는 CD28에 결합하는 dsscFv이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CD3 및 CD28 둘 모두에 결합하는 완전 IgG이고, 특히, V 도메인을 포함하는 항체는 CD28에 결합하고, 인서트 폴리펩티드는 CD3에 결합하는 dsscFv이고, 즉, 스캐폴드 항체는 CD28에 결합하는 전체 IgG이고, 스캐폴드 항체의 V 도메인의 Fwk3 영역 내로 삽입된 제2 항체는 CD3에 결합하는 dsscFv이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열번호 139(항CD3 dsscFv가 프레임워크 3 내로 삽입된 항CD28 Fab 중쇄) 및 서열번호 136의 중쇄 및 경쇄, 또는 예컨대, CD3 및/또는 CD28에의 결합과 같은 그의 기능을 보유한다면, 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖는 상기 중 임의의 것의 변이체 또는 변이체들을 포함하거나, 또는 그를 갖는 Fab 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열번호 141(항CD3 dsscFv가 프레임워크 3 내로 삽입된 항CD28 IgG4P 중쇄) 및 서열번호 136의 중쇄 및 경쇄, 또는 예컨대, CD3 및/또는 CD28에의 결합과 같은 그의 기능을 보유한다면, 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖는 상기 중 임의의 것의 변이체 또는 변이체들을 포함하거나, 또는 그를 갖는 완전 IgG이다.
본 발명에서 사용하기 위한 예시적인 서열로는 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 서열번호 137, 서열번호 138, 서열번호 139, 서열번호 140, 서열번호 141, 서열번호 142, 서열번호 143 및 서열번호 144를 포함한다. 본 발명의 Fab 단편에서 사용하기 위한 중쇄 및 경쇄의 예시적인 조합은 서열번호 54 및 서열번호 1, 서열번호 56 및 서열번호 1, 서열번호 58 및 서열번호 1, 서열번호 60 및 서열번호 1, 서열번호 61 및 서열번호 1, 서열번호 63 및 서열번호 1, 서열번호 64 및 서열번호 1, 서열번호 66 및 서열번호 1, 서열번호 68 및 서열번호 1, 서열번호 70 및 서열번호 1, 서열번호 73 및 서열번호 1, 서열번호 74 및 서열번호 1, 서열번호 75 및 서열번호 1, 서열번호 76 및 서열번호 1, 서열번호 93 및 서열번호 1, 서열번호 94 및 서열번호 1, 서열번호 95 및 서열번호 1, 서열번호 101 및 서열번호 1, 서열번호 129 및 서열번호 1, 서열번호 130 및 서열번호 1, 서열번호 139 및 서열번호 136, 서열번호 140 및 서열번호 133을 포함한다. 본 발명의 완전 IgG에서 사용하기 위한 중쇄 및 경쇄의 예시적인 조합은 서열번호 131 및 서열번호 1, 서열번호 132 및 서열번호 1, 서열번호 141 및 서열번호 136, 서열번호 142 및 서열번호 133을 포함한다.
링커 서열
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 항체의 프레임워크 3 영역에 직접 연결된다. 본원에서 사용되는 바, 직접 연결된다는 것은 이종성 인서트 폴리펩티드의 N- 및 C-말단 아미노산이 본 발명의 항체의 V 도메인의 프레임워크 3 영역에 펩티드 결합에 의해서 연결된다는 사실을 지칭하는 것으로 의도된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 링커 서열을 추가로 포함한다. 상기 실시양태에서, 링커 서열은 바람직하게, 항체 및 인서트 폴리펩티드, 둘 모두에 대해 이종성이고, 즉, 링커 서열은 보통 천연 항체 서열 또는 인서트 폴리펩티드 중 해당 위치에 존재하지 않을 것이다.
일부 실시양태에서, 링커 서열은 인서트 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단 단부를 프레임워크 3 영역에 연결하는, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 인서트 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단 단부를 프레임워크 3 영역에 연결하는, 1 내지 31개, 또는 5 내지 31개, 또는 6 내지 28개, 또는 10 내지 26개, 또는 15 내지 26개, 또는 10 내지 21개, 또는 5 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커 서열은 인서트 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단 단부를 프레임워크 3 영역에 연결하는, 최대 30개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드의 N-말단에 있는 링커는 인서트 폴리펩티드의 C-말단 단부에 있는 링커와 조성 및/또는 길이가 상이하다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드의 N-말단에 있는 링커는 인서트 폴리펩티드의 C-말단 단부에 있는 링커와 조성 및/또는 길이가 동일하거나, 또는 유사하다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 인간 서열로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 링커는 인간 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 비인간 서열로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 링커는 소 서열로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 링커는 소 링커이다.
인서트 폴리펩티드를 V 도메인의 프레임워크 3 영역에 연결하는 데 적합한 링커 영역의 예로는 가요성 링커 서열 및 강성 링커 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가요성 링커 서열은 문헌 [Huston et al., 1988, PNAS 85:5879-5883]; [Wright & Deonarain, Mol. Immunol., 2007, 44(11):2860-2869]; [Alfthan et al., Prot. Eng., 1995, 8(7):725-731]; [Luo et al., J. Biochem., 1995, 118(4):825-831]; [Tang et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(26):15682-15686]; 및 [Turner et al., 1997, JIMM 205, 42-54]에 개시된 것을 포함한다(대표적인 예에 대해 하기 표 1을 참조한다).
특정 실시양태에서, 항체는서열번호 106 및 107의 링커 서열을 포함한다.
강성 링커의 예로는 펩티드 서열 GAPAPAAPAPA(서열번호 51), PPPP(서열번호52), PPP, IPFTV(서열번호 82) 및 EYHGLQ(서열번호 104)를 포함한다. 추가 예로는 소 항체의 CDRH3의 신장된 스토크(stalk)로부터 유래된 서열(문헌 [Wang et al., Cell, 2013, 153:1379-1393])을 포함하고; 바람직한 서열로는 긴 링커 서열, 예컨대, TSVHQETKKYQS(서열번호 96) 및 SYTYNYEWHVDV(서열번호 97)(소 CDH3 스토크로부터의 용매 노출된 잔기 및 매립된 잔기, 둘 모두 포함); 및 짧은 링커 서열, 예컨대, ETKKYQS(서열번호 98) 및 SYTYNYE(서열번호 99)(소 CDH3 스토크로부터의 용매 노출된 잔기만 포함)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 링커 서열 중 임의의 것의 변이체, 예를 들어, 원래의 링커 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4개 이상의 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 제거된 것인 변이체가 사용될 수 있다. 링커 서열의 변이체 또한 반복 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서, 링커 서열은 반복 링커 서열에 의해 신장된 것이다. 한 실시양태에서, 반복되는 데 바람직한 링커 서열은 서열번호 13이며, 이를 통해 모티프: (GmS)n이 유도되고, 여기서, m은 4이고, n은 임의의 정수(예를 들어, 1, 2 또는 3)일 수 있다. 다른 실시양태에서, m은 1 내지 10인 상이한 정수일 수 있다.
인서트 폴리펩티드가 직접 연결되었건, 또는 링커 서열을 통해 연결되었건, 그에 상관 없이, 일부 실시양태에서, 프레임워크 3 영역 중 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드 인서트 연결 결과로서 결실될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인서트 폴리펩티드는 카바트 넘버링 체계에 따라, 아미노산 잔기 73과 75 사이에 있고, 74번 위치의 아미노산은 결실된다.
약학 조성물 및 사용 방법
본 발명 및 본원에 기술된 바와 같은 항체는 염증성 질환 및 장애, 면역 질환 및 장애, 섬유성 장애 및 암을 비롯한, 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용하다.
"염증성 질환" 또는 "장애" 및 "면역 질환 또는 장애"라는 용어는 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 스틸병, 머클-웰스 질환(Muckle Wells disease), 건선, 크론병, 궤양성 결장염, SLE(전신 홍반성 루프스: Systemic Lupus Erythematosus), 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 혈관염, I형 당뇨병, 이식 및 이식편-대-숙주 질환을 포함한다.
"섬유성 장애"라는 용어는 특발성 폐 섬유증(IPF: idiopathic pulmonary fibrosis), 전신성 경화증 (또는 피부경화증), 신장 섬유증, 당뇨병성 신장병증, IgA 신장병증, 고혈압, 말기 신장 질환, 복막 섬유증(지속성 외래 복막 투석), 간 경변, 연령 관련 황반 변성(ARMD: age-related macular degeneration), 망막병증, 심장 반응성 섬유증, 흉터형성, 켈로이드, 범(bum), 피부 궤양, 혈관성형, 관상동맥 우회 수술, 관절성형 및 백내장 수술을 포함한다.
"암"이라는 용어는 피부, 또는 더욱 보편적으로, 유방, 난소, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위, 방광 또는 장과 같은 신체 기관의 내벽에서 관찰되는, 상피로부터 발생하는 악성의 새로운 성장을 포함한다. 암은 인접한 조직으로 침윤되고, 원위 기관, 예를 들어, 골, 간, 폐 또는 뇌로 확산(전이)되는 경향이 있다.
따라서, 본 발명의 추가 측면에 따라, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 본 발명의 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
질환 또는 장애 치료용 의약 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도 또한 제공한다. 가장 바람직하게, 질환 또는 장애는 염증성 질환 또는 장애이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 예를 들어, 비경구, 피하, 또는 안구 투여에 적합한 형태를 취할 수 있다. 적절할 경우, 예를 들어, 항체가 그의 도메인을 통해 알부민에 결합한다면, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 인간 또는 재조합 혈청 알부민을 이용하여 본 발명의 항체를 미리 제제화시키는 것이 바람직할 수 있다.
약학 조성물이 예를 들어, 액제 또는 현탁제와 같은 액체일 경우, 이때 제제는 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 특히, 재조합 알부민, 예컨대, 재조합 인간 혈청 알부민을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 양은 전체 제제의 2% w/w 미만, 특히, 1, 0.5, 또는 0.1% w/w 미만 범위일 수 있다. 이는 제제 중 항체 성분을 안정화시키는 데 도움을 줄 수 있다. 제제는 추후 수성 용매를 이용한 재구성을 위해 동결건조될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 동결건조된 항체를 포함하는, 예컨대, 바이알과 같은 단위 용량 용기를 제공한다.
본 발명의 항체는 주사, 예컨대, 볼루스 주사 또는 주입에 의한 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 예컨대, 유리 앰플 또는 다회 용량 용기, 예컨대, 유리 바이알 중 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 주사용 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중 현탁제, 액제 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 예컨대, 현탁화제, 안정화제, 보존제 및/또는 분산화제과 같은 제제화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전 적합한 비히클, 예컨대, 멸균 발열성 물질 제거수로 재구성하기 위한 건조 형태일 수 있다.
원하는 경우, 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩 또는 디스펜싱 장치는 투여 설명서를 수반할 수 있다.
본 발명의 항체 포맷은 예컨대, 용액 또는 현탁액 형태로, 용매 중 분산되어 전달될 수 있다. 이는 적절한 생리학적 용액, 예컨대, 염수 또는 다른 약리학적으로 허용되는 용매 또는 완충처리된 용액 중에 현탁될 수 있다. 당업계에 공지된 완충처리된 용액은 pH 약 4.0 내지 5.0을 달성하기 위해 물 1 ml당 0.05 mg 내지 0.15 mg 에데트산이나트륨, 8.0 mg 내지 9.0 mg NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg 시트르산나트륨을 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들어, 동결건조된 항체를 이용할 수 있다.
치료용 현탁제 또는 액제 제제는 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있고, 완충제(예컨대, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 비카보네이트 완충제), 아미노산, 우레아, 알콜, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예컨대, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만닛톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생체분해성 미세구 내에 캡슐화될 수 있다. 제제는 일반적으로 멸균 제조 프로세스를 이용하여 실질적으로 멸균인 형태로 제공될 것이다.
이는 당업계의 숙련가에게 친숙한 방법에 의해 진행되는, 제제화에 사용된 완충처리된 용매/용액의 여과, 멸균 완충처리된 용매 용액 중 항체의 무균 현탁, 및 멸균 용기 내로의 제제의 분배에 의한 제조 및 멸균을 포함할 수 있다.
특정 병태 예방 또는 치료를 위해 필요한 본 발명의 항체의 양은 항체 및 치료하고자 하는 병태에 의존하여 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로 1일 투여량은 체중 1 kg을 기준으로 약 10 ng/kg 내지 1,000 mg/kg, 100 ng/kg 내지 100 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 범위일 수 있다.
본 발명은 또한 유전자 요법에 의해, 특히, 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 벡터에 의해 본원에 기술된 항체를 전달하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
그러므로, 본 발명은, 바이러스 캡시드, 및 반전 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat) 측면에 위치하는 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈을 갖는 바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 발현 카세트는 본원에 기술된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스진을 포함하는 것인, 약학 조성물을 제공한다. ITR 서열은 본원에 기술된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 인공 게놈을 바이러스 벡터의 비리온으로 패킹하는 데 사용될 수 있다.
발현 카세트에서 트랜스진은 예컨대, 인간 세포에서 트랜스진의 발현을 제어하는 프로모터와 같은 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결되어 있다.
바이러스 벡터는 바람직하게, AAV 기반 바이러스 벡터이다. 다양한 AAV 캡시드가 당업계에서 기술되었다. AAV 벡터를 생성하는 방법 또한 문헌에 광범위하게 기술되었다(예컨대, WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; 미국 특허 제7,588,772 B2호). AAV 캡시드의 공급원은 원하는 조직을 표적화하는 AAV로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 적합한 AAV는 예컨대, AAV9(미국 특허 제7,906,111호; US 2011-0236353-A1), rh10(WO 2003/042397) 및/또는 hu37(US 7,906,111B2; US20110236353)을 포함할 수 있다. 그러나, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV-TT, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV.PHP.B(또는 그의 변이체) 등을 비롯한 다른 AAV 또한 선택될 수 있다.
피험체에게 전달하는 데 적합한 AAV 바이러스 벡터를 생성하고, 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다(US7,790,449B2; US7,282,199B2; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; 및 US7,588,772 B2).
본 발명에 따른, 바이러스 캡시드 및 인공 게놈을 갖는 바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물은 중쇄 및 경쇄, 둘 모두가 확실히 발현되도록 디자인된다. 본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄의 폴리뉴클레오티드 서열은 단일 구성물로 조작될 수 있고, 중쇄 및 경쇄가 별개로 발현되도록 예를 들어, 절단가능한 링커 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site)에 의해 이격될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 링커는 자기 절단 퓨린/F2A 링커이다(문헌 [Fang et al., Nature Biotechnology 23: 584-590, 2005] 및 [Fang et al. Mol Ther 15: 1153-9, 2007]). 예를 들어, 퓨린/F2A 링커는 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오티드 코딩 서열을 이격시키기 위하여 발현 카세트 내로 도입될 수 있다.
일부 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄의 폴리뉴클레오티드 서열은 가요성, 비절단가능한 링커를 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 링커는 중쇄 및 경쇄 도메인이 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있도록 가요성 펩티드 링커, 예컨대, (Gly 및 Ser로 구성된) scFv를 코딩하는 것일 수 있다.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조로 하여 기술되지만, 이 실시예는 단지 예시적인 것이고, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
일반 방법
프레임워크
3 삽입
3개의 CDR 루프 이외에도, 항체 경쇄 및 중쇄, 종래 및 단일 쇄 낙타과 VHH는 프레임워크 3에 의해 형성된 4번째 루프를 갖는다(도 1A). 카바트 넘버링 체계는 프레임워크 3을 중쇄 중 66-94번 위치 및 경쇄 중 57-88범 위치로 정의한다.
유전자 디자인 및 일시적 세포 발현
프레임워크 3 삽입을 갖는 변이체를 포함하는, 경쇄 및 중쇄 V 영역을 코딩하는 유전자를 자동화된 합성 접근법(ATUM)에 의해 디자인하고, 구성하였다. 유전자를 각각 인간 Cκ 영역(Km3 알로타입) 및 중쇄 γ1 CH1 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 이어서, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 HEK293 세포로 공동 형질감염시키고, SPR 결합 검정법을 이용하여 재조합 항체/Fab 융합 단백질 분자를 스크리닝하였다.
하기 실시예에서 기술되는 CA645 Fab 융합 단백질의 경쇄 V 영역 또는 경쇄는 각각 서열번호 2(CA645 VL 도메인(gL5)) 또는 서열번호 1(CA645 경쇄 gL5)을 포함하거나, 또는 그를 가졌다. 예를 들어, 열번호 108 또는 서열번호 109의 VL 도메인을 포함하는 경쇄 V 영역과 같은, 대안적 경쇄 또는 경쇄 V 영역이 사용될 수 있다.
표면
플라스몬
공명에 의한 항체/
Fab
융합 단백질 결합 효능 측정
모든 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance) 실험은 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, EDTA 2 mM 및 0.005% (v/v) P20(HBS-EP 완충제)을 함유하는 pH 7.4 전개 완충제를 이용하여 비아코어 3000 시스템 상에서 25℃에서 수행하였다.
폴리클로날 염소 F(ab)2 단편 항인간 F(ab)2(Jackson Labs 제품 코드 #109-006-097)를 아민 커플링에 의해 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 표면에 고정화시켰다. 간략하면, 카복시메틸 덱스트란 표면을 10 ㎕/min의 유속으로 5분 동안 50 mM N-하이드록시숙신이미드 및 200 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드의 신선한 1:1 (v/v) 혼합물로 활성화시켰다. 10 mM 아세테이트 pH 5.0 완충제 중 항인간 F(ab)2를 같은 유속으로 10분 펄스로 칩에 50 ㎍/mL로 공유적으로 커플링시켰다. 마지막으로, 표면을 1 M 에탄올아민.HCl pH 8.5의 10분 펄스를 이용하여 비활성화시켰다. 상기 방법에서 단백질을 생략함으로써 칩 상에 참조 플로우 셀을 제조하였다.
Fab-루프 인서트 구성물을 함유하는 상청액, 야생형 Fab 또는 대조군 상청액을 HPS-EP 완충제 중 1/5로 희석한 후, 그의 각 리간드 또는 수용체의 결합에 대하여 시험하였다.
인간 혈청 알부민(HSA)은 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)(카탈로그 번호 009-000-051)에 의해 공급받았고, HBS-EP 완충제 중에서 1,000 nM로 희석시켰다. 하기 시토카인 및 수용체는 R&D 시스템즈 리미티드(R&D Systems Ltd.)로부터 입수하였다: IL-15, IL-15-Rα-hFc, IL-2, IL-2-sRβ, G-CSF, G-CSF-Rα, GM-CSF, GM-CSF-Rα, EPO, EPO-R, IL-6, LRP4(ecd)-hFc, LRP6(ecd)-hFc, 리소자임, KLK5. 이들 단백질을 전형적으로는 100 ㎍/mL로 재구성하고, -20℃에서 보관하였다. 실험 목적으로, 상기 단백질을 HBS-EP 완충제 중에 전형적으로는 50, 100 또는 200 nM로 새로 희석하였다.
전형적인 SPR 사이클은 전개 완충제로서 HBS-EP를 이용하여 10 ㎕/min 유속으로 진행되는 것으로 구성되었고, 희석된 상청액은 항체/Fab 융합 단백질을 포획하기 위해 1 min 동안 주입하였다. 이어서, 희석된 동족 리간드 또는 수용체 또는 완충제 대조군을 30 ㎕ 주입하였다. 후속된 해리 단계를 적어도 3 min 동안 모니터링하였다. 일부 실험에서, 항체 폴리펩티드 부분으로서 CA645 Fab을 사용하는 융합 단백질 구성물인 경우, HSA와 같이, 항체 부분의 관련된 동족 항원을 추가로 30 ㎕ 주입하는 것을 포함하였다. 일부 실험에서, 동족 수용체/리간드(항체/Fab 융합 단백질의 인서트 부분)를 2배 몰 과량의 그의 결합 파트너와 함께 미리 혼합하여 수행된 특이성 대조군 사이클을 포함하였다. 각 사이클은 40 mM HCl을 2회에 걸쳐 10 ㎕씩 주입하고, 그 사이에 5 mM NaOH를 5 ㎕ 주입하는 것을 포함하는 재생 단계로 종결되었다.
융합 단백질 구성물 포획을 측정하기 위해 상청액 및 리간드/수용체 주입 10 s 전에 및 5 s 전에 및 동족 리간드/수용체의 결합을 평가하기 위해 리간드/수용체 주입 종료 후 15 s째에 리포트 점을 수집하였다. 수집된 리포트 점 및 센서그램 데이터는 폴리클로날 포획 플로우 셀과 참조 플로우 셀 사이의 차이를 공명 단위(RU: RU)로 나타내었다.
포획 표면으로부터의 융합 단백질 구성물의 임의의 느린 해리를 설명하기 위해 리간드/수용체 사이클로부터 각 대조군 사이클을 감산함으로써 리포트 점 및 센서그램 데이터를 프로세싱하였다. 모든 실험에서, 각 야생형 Fab 상청액은 리간드/수용체의 임의의 비특이적인 결합에 대해 체크하기 위해 포함하였다. 유의적일 경우, 리간드/수용체의 임의의 비특이적인 결합을 상기로부터 감산하였다.
해리 상수(KD)를 추정한 실시예에서는 유속을 30 ㎕/min으로 증가시킴으로써 상기 방법을 수정하였다. Fab 구성물 포획 후, 90 ㎕의 동족 리간드 또는 완충제 대조군 주입 후, 이어서, 180 sec의 해리 단계가 이어졌다. (0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, & 10 nM) 농도 범위에 대한 리간드 결합을 시험하였다. 센서그램을 제로 리간드 센서그램 감산에 의해 드리프트에 대해 보정하고, 야생형 Fab 보정된 센서그램 감산에 의해 비특이적 상호작용에 대해 보정하였다. BIA이벨류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어(버전 4.1.1)의 랭뮤어(Langmuir) 모델을 이용하여 보정된 센서그램으로 피팅된 별개의 해리 상수 및 회합 상수로부터 친화도 상수를 계산하였다.
실시예
1 - IL-15 인서트 폴리펩티드를 갖는 CA645
Fab
인터류킨 15(IL-15)는 면역 반응에서 중요한 역할을 하고, T 세포 및 자연 살해(NK: natural killer) 세포의 증식을 촉진시키는 작용을 하는 시토카인이다. 이는 구조상 IL-2와 유사하고, 그의 수용체는 IL-2 수용체와 공통 쇄를 공유한다.
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, 인간 IL-15 서열을 CA645 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
인간 IL-15 서열:
인간 IL-15(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄(링커는 밑줄체로 표시):
도 2A는 100 nM IL-2-Rβ, IL-15-Rα(이 둘 모두 IL-15에 대한 결합 파트너이다) 및 1,000 nM HSA(CA645에 대한 리간드)를 이용하여 시험하였을 때의, 상기 CA645/IL-15 항체 융합 단백질에 대한 결합 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 도 2A에서 명백하게 나타난 바와 같이, 3개 리간드 모두에 대한 결합이 관찰되었고, 이는 CA645 Fab 부분에서 뿐만 아니라, 프레임워크 3 영역 중 IL-15 그래프트에서도 기능이 유지됨을 보여주는 것이다. 도 2B는 모델링된 CA645/IL-15Fwk3 단백질을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
실시예
2 - IL-2 인서트 폴리펩티드를 갖는 CA645
Fab
인터류킨 2(IL-2)는 주로 활성화된 CD4+ T 세포에 의해 생산되며, 정상적인 면역 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 하는 만능성 시토카인이다. IL-2는 활성화된 T 림프구의 증식 및 확장을 촉진시키고, B 세포 성장을 강화시키고, 단핵구 및 자연 살해 세포를 활성화시킨다.
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, 인간 IL-2 서열을 CA645 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
인간 IL-2 서열:
인간 IL-2(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄 (링커는 밑줄체로 표시):
도 3A는 200 nM IL-15(경쟁 리간드)와의 사전 인큐베이션하에, 및 사전 인큐베이션 없이 진행된, 100 nM IL-2-Rβ(IL-2에 대한 결합 파트너)를 이용하여 시험하였을 때의, CA645/IL-2 항체 융합 단백질에 대한 결합 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 도 3A에 제시된 바와 같이, IL-2-Rβ에 대해 관찰되는 결합은 몰 과량의 경쟁 리간드의 존재하에서는 폐지되고, 이는 융합 단백질의 프레임워크 3 중 IL-2 부분에 대해 관찰된 결합이 진정한 기능적 상호작용이고, 비특이적이 아님을 보여주는 것이다. 도 3B는 모델링된 CA645/IL-2Fwk3 단백질을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
실시예
3 - G-
CSF
인서트 폴리펩티드를 갖는 CA645
Fab
과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF: Granulocyte-colony stimulating factor)는 다수의 상이한 세포 유형(예컨대, 내피, 대식세포)에 의해 생산되며, 골수로부터의 성숙한 과립구 생산을 모의하는 작용을 하는 시토카인이다.
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, 인간 G-CSF 서열을 CA645 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
인간 G-
CSF
서열:
인간 G- CSF(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄(Gly-Ser 링커는 밑줄체로 표시):
도 4A는 100 nM G-CSF-Rα(G-CSF에 대한 결합 파트너), 1,000 nM HSA(CA645에 대한 리간드), 및 G-CSF-Rα 및 HSA, 둘 모두를 이용하여 시험하였을 때의, 상기 CA645/G-CSF 항체 융합 단백질에 대한 결합 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 도 4A는 다른 실시예와 일맥상통하게, 융합 단백질의 G-CSF 및 Fab 부분은 기능적으로 활성이고, 그의 각 결합 파트너에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 도 4A는 추가로 두 결합 파트너가 모두 존재하는 경우에 SPR 트레이스로부터 관찰된 신호는 단일 결합제 트레이스로부터 상가적이고, 이는 상기 두 기능성 부분에의 결합이 동시에 발생할 수 있다는 것을 보여준다. 도 4B는 모델링된 CA645/G-CSFFwk3 단백질을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
실시예
4 - GM-
CSF
인서트 폴리펩티드를 갖는 CA645
Fab
GM-CSF는 과립구(호중구, 호산구, 호염기구) 및 단핵구를 생산하도록 줄기 세포를 자극하는 시토카인이다.
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, 인간 및 뮤린 GM-CSF 서열을 CA645 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
인간 GM-
CSF
(
hGM
-
CSF
) 서열:
인간 GM- CSF(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄(Gly-Ser 링커는 밑줄체로 표시):
CH1의 C-말단에 인간 GM-
CSF(굵은 이탤릭체로 표시)를
갖는 CA645
중쇄
(
Gly
-Ser 링커는
밑줄체로
표시)(비교 목적):
뮤린
GM-
CSF
(
mGM
-
CSF
) 서열:
뮤린 GM- CSF(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄(Gly-Ser 링커는 밑줄체로 표시):
CH1의 C-말단에
뮤린
GM-
CSF(굵은 이탤릭체로 표시)를
갖는 CA645
중쇄
(
Gly
-Ser 링커는
밑줄체로
표시)(비교 목적):
도 5A 및 6은 동족 GM-CSF 수용체(100 nM)를 이용하여 시험하였을 때의, CA645/hGM-CSF 및 CA645/mGM-CSF 항체 융합 단백질(각각)에 대한 결합 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 본 결과는 GM-CSF 수용체에의 결합은 특이적이며, 인서트 폴리펩티드의 존재에 의존한다는 것을 입증한다. 본 도면은 또한 GM-CSF 펩티드의 불변 도메인(CH1) 융합물에 대한 별개의 트레이스를 보여주는 것으로서, 프레임워크 3 인서트가 유사한 방식으로 작용한다는 것을 보여준다. 도 5B는 모델링된 CA645/GM-CSFFwk3 단백질을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
실시예
5 - EPO 인서트 폴리펩티드를 갖는 CA645
Fab
에리트로포이에틴(EPO)은 골수에서 적혈구 세포 생산을 자극하는 세포 저산소상태에 대한 반응으로 신장에 의해 방출되는 시토카인이다.
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, 인간 EPO 서열을 CA645 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
인간 EPO 서열:
인간 EPO(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄 (Gly-Ser 링커는 밑줄체로 표시):
도 7A는 500 nM 가용성 EPO(경쟁 리간드)와의 사전 인큐베이션하에, 및 사전 인큐베이션 없이 진행된, 50 nM EPO-R(EPO에 대한 결합 파트너)를 이용하여 시험하였을 때의, 상기 CA645/EPO 항체 융합 단백질에 대한 결합 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 도 7A는 다른 실시예와 일맥상통하게, 융합 단백질의 EPO 부분은 기능적으로 활성이고, 그의 동족 수용체에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 추가로, EPO와의 사전 인큐베이션시에 관찰된 신호 감소는 상호작용의 특이성을 나타내고, 비변형된 CA645 Fab는 관찰된 결합은 EPO 그래프트로부터 유도된 것임을 입증하는 추가 대조군으로서 작용한다. 도 7B는 모델링된 CA645/EPOFwk3 단백질을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
실시예
6 -
VHH6
인서트를 갖는 CA645
Fab를
포함하는 항체/
Fab
융합 단백질
VHH6은 IL-6:gp80 복합체에는 결합할 수 있지만, 단독의 개별 성분에는 결합하지 못한다는 점에서, 연접 에피토프에 결합하는, 조작된 단일 도메인 중쇄 낙타과 항체이다.
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, VHH6 서열을 CA645 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
낙타과
VHH6
서열:
VHH6(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중 쇄(Gly-Ser 링커는 밑줄체로 표시):
도 8A는 100 nM IL-6(VHH6 단독으로 VHH6에 대한 음성 대조군은 복합체에 결합한다), 100 nM IL-6/gp80 융합(VHH6에 대한 결합 파트너), 1,000 nM HSA(CA645에 대한 결합 파트너) 및 IL-6 융합 및 HSA 함께인 것을 이용하여 시험하였을 때의, 상기 CA645/VHH6 항체 융합 단백질에 대한 결합 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 도 8A는 다른 실시예와 일맥상통하게, 항체 융합 단백질의 VHH6 및 CA645 부분, 둘 모두 결합 단편으로서 기능적으로 활성이고, 그의 각 결합 파트너에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 도 8A는 추가로 두 결합 파트너가 모두 존재하는 경우에 SPR 트레이스로부터 관찰된 신호는 단일 결합제 트레이스로부터 상가적이고, 이는 상기 두 기능성 부분에의 결합이 동시에 발생할 수 있다는 것을 보여준다. 도 8B는 모델링된 CA645/VHH6Fwk3 단백질을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다
실시예
7 -
VHH15
인서트를 갖는 CA645
Fab를
포함하는 항체/
Fab
융합 단백질
VHH15는 IL-6을 인식하고, 그에 결합하는 조작된 단일 도메인 중쇄 낙타과 항체이다.
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, VHH15 서열을 CA645 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
낙타과
VHH15
서열:
VHH15
,
항IL
-6 낙타과 도메인 항체(굵은 이탤릭체로 표시)가
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄(Gly-Ser 링커는 밑줄체로 표시):
도 9A는 100 nM IL-6(VHH15에 대한 리간드), 1,000 nM HSA (CA645에 대한 리간드), 및 IL-6 및 HSA 둘 모두인 것을 이용하여 시험하였을 때의, 상기 CA645/VHH15 항체 융합 단백질에 대한 결합 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 도 9A는 다른 실시예와 일맥상통하게, 항체 융합 단백질의 VHH15 및 Fab 부분, 둘 모두 결합 단편으로서 기능적으로 활성이고, 그의 각 결합 파트너에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 도 9A는 추가로 두 결합 파트너가 모두 존재하는 경우에 SPR 트레이스로부터 관찰된 신호는 단일 결합제 트레이스로부터 상가적이고, 이는 상기 두 기능성 부분에의 결합이 동시에 발생할 수 있다는 것을 보여준다. 도 9B는 모델링된 CA645/VHH15Fwk3 단백질을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다
실시예
8 -
스클레로스틴
인서트 폴리펩티드를 갖는 CA645
Fab
스클레로스틴은 인간에서의 SOST 유전자의 생성물이고, 골 형성 프로세스에 관여하며, 대개는 골세포에서 발현되는 것이다. 스클레로스틴은 LRP 유형의 공동 수용체에의 결합을 통해 Wnt 신호전달 경로에서 조절 단백질로서 작용한다.
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, 코어 또는 완전 스클레로스틴 서열을 CA645 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
인간 성숙한 전장의
스클레로스틴
서열:
인간
스클레로스틴의
코어 도메인의 서열:
인간
스클레로스틴
코어 도메인(굵은 이탤릭체로 표시)이
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄(단일 S 링커는 밑줄체로 표시):
인간
스클레로스틴
코어 도메인(굵은 이탤릭체로 표시)이
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄(Gly-Ser(2X G
4
S) 링커는 밑줄체로 표시):
인간
스클레로스틴
코어 도메인(굵은 이탤릭체로 표시)이
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645
Fab
중쇄
(강성 링커는
밑줄체로
표시):
인간 성숙한 전장의 스클레로스틴(굵은 이탤릭체로 표시)이 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄(Gly-Ser (1X G
4
S) 링커는 밑줄체로 표시):
도 10A 및 11은 각각 LRP6 및 LRP4의 세포외 도메인(스클레로스틴에 대한 결합 파트너)에의 결합에 대하여 1/5 희석된 상청액으로서 시험되었을 때의, 상기 CA645/스클레로스틴 항체 융합 단백질에 대한 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 본 실험에서는 또한 상이한 링커 영역 구성물의 효과도 조사하였다. 시험된 구성물 모두 LRP6 및 LRP4에의 결합을 보인 것으로 관찰되었다. 도 10B는 모델링된 CA645/스클레로스틴코어-Fwk3 단백질을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
실시예
9 - IL-10 인서트 폴리펩티드(IL-10
이량체
)를 갖는 CA645
Fab
인간 시토카인 합성 억제 인자(CSIF: cytokine synthesis inhibitory factor)로도 공지된 인터류킨 10(IL-10)은 항염증성 시토카인이다. 이는 일반적으로 동종이량체로서 작용한다.
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, 두개의 인간 IL-10 서열을 CA645 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
인간 IL-10 단량체 서열:
두개의 인간 IL-10(굵은 이탤릭체로 표시) 단량체가
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄(링커는 밑줄체로 표시):
도 12A는 200 nM IL-10(경쟁 리간드)과의 사전 인큐베이션하에, 및 사전 인큐베이션 없이 진행된, 100 nM IL-10 수용체(IL-10에 대한 결합 파트너)를 이용하여 시험하였을 때의, 상기 CA645/IL-10 항체 융합 단백질에 대한 결합 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 도 12A에 제시된 바와 같이, IL-10 수용체에 대해 관찰되는 결합은 몰 과량의 경쟁 리간드의 존재하에서는 폐지되고, 이는 융합 단백질의 프레임워크 3 중 IL-10 부분에 대해 관찰된 결합이 진정한 기능적 상호작용이고, 비특이적이 아님을 보여주는 것이다. 이러한 결과는 또한 삽입된 IL-10 단량체도 프레임워크 3 구성물 내에서 기능성 이량체를 형성할 수 있다는 것을 제안한다. 도 12B는 모델링된 CA645/IL-10Fwk3 단백질을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
실시예
10 - 다른
Fab를
갖는 항체-
프레임워크
3 삽입 구성물
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, 인간 IL-15 서열을 CA497 및 CA240 Fab 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다.
항IL
-17A CA497
Fab
중쇄
서열(
Fab
,
IgG1로부터의
CH1; 가변 도메인은
밑줄
체로 표시
; CDR은 굵은 이탤릭체로 표시);
인간 IL-15(굵은 이탤릭체로 표시)가
프레임워크
3 내로 삽입된
항IL
-17A CA497 Fab 중쇄(Gly-Ser 링커는 밑줄체로 표시):
항IL
-17A CA497
Fab
경쇄
서열:
항IL
-6 CA240
Fab
중쇄
서열(
Fab
,
IgG1로부터의
CH1; 가변 도메인은
밑줄체로
표시
;
CDR은
굵은 이탤릭체로 표시);
인간 IL-15(굵은 이탤릭체로 표시)가
프레임워크
3 내로 삽입된
항
IL-6 CA240 Fab 중쇄(Gly-Ser 링커는 밑줄체로 표시):
항IL
-6 CA240
Fab
경쇄
서열:
도 13 및 14는 IL-15(경쟁 리간드)와의 사전 인큐베이션하에, 및 사전 인큐베이션 없이 진행된, 100 nM IL-2-Rβ(IL-15에 대한 결합 파트너)를 이용하여 시험하였을 때의, CA497/IL-15 및 CA240/IL-15 (각각) 항체 융합 단백질에 대한 결합 효능에 관한 비아코어 분석을 보여주는 것이다. 상기 두 실험에 제시된 바와 같이,
IL-2-Rβ에 대해 관찰되는 결합은 몰 과량의 경쟁 리간드의 존재하에서는 폐지되고, 이는 융합 단백질의 프레임워크 3 중 IL-15 부분에 대해 관찰된 결합이 진정한 기능적 상호작용이고, 비특이적이 아님을 보여주는 것이다.
실시예
11 -
VHH가
프레임워크
3 내로 삽입된
Fab
구성물
HyHEL5는 하기 서열을 갖는 항리소자임 Fab이다:
HyHEL5
중쇄
:
HyHEL5
경쇄
:
D3L11은 하기 서열을 갖는 항리소자임 VHH이다:
D3L11:
하기 융합 구성물을 생성하여, 항체가 동일한 표적 항원에 결합하였을 때, 제2 항체 분자를 제1 항체의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하는 것이 개별 항체 중 어느 하나의 것보다 항원에 대해 더욱 큰 친화도를 일으키는지 여부를 시험하였다.
항리소자임
VHH
D3L11(굵은체로 표시)이
프레임워크
3 내로 삽입된 항리소자임 HyHEL5 경쇄(Gly-Ser 링커는 밑줄체로 표시):
항IL
-6
VHH15(굵은체로 표시)가
프레임워크 3 내로 삽입된 항리소자임 HyHEL5
경쇄
(
Gly
-
Ser
링커는
밑줄체로
표시):
VHH
D3L11(굵은체로 표시)이
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645
경쇄
(Gly-Ser 링커는
밑줄체로
표시):
리소자임에의 결합에 대해 시험하였을 때 각 구성물에 대하여 수행된 희석액 시리즈로부터의 SPR 트레이스가 도 15 내지 17에 제시되어 있다. 후속 분석으로부터, 상기 기술된 방법을 사용하여 하기 표는 각 구성물에 대해 계산된 리소자임에 대한 결합 친화도를 나타낸다:
상기 결과로부터 명확하게 관찰되는 바와 같이, Fab 및 VHH 인서트 둘 모두 리소자임에 결합한 구성물의 경우, 리소자임에 대한 결합 친화도는 증가한다(즉, KD 감소가 관찰된다). 도 18은 이것이 분자 수준에서 어떻게 발생할 수 있는지에 관해 도시한 것이다. 이는 또한 상기 항체에서 동일한 표적 분자 상에서 다가 상호작용이 일어날 수 있게 하는 데 중요할 수 있다고 가정한다.
실시예
12 - 소 링커를 이용한 IL-15 인서트 폴리펩티드를 갖는 CA645
Fab
링커를 소 링커를 비롯한 다른 유형의 링커로 교체하여, 실시예 1에 기술된 CA645/IL-15Fwk3 단백질에 대한 변이체를 생성하였고, 결합에 대한 그의 효과를 시험하였다. 원래의 중쇄 구성물(서열번호 54) 뿐만 아니라, 하기 제시된 추가 구성물 또한 생성하였다:
소의 긴 링커(
밑줄체로
표시)를 이용하여 인간 IL-15(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄
소의 짧은 링커(
밑줄체로
표시)를 이용하여 인간 IL-15(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄
2xG
4
S
링커(밑줄체로 표시)를 이용하여 인간 IL-15(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 CA645 Fab 중쇄
도 19는 100 nM IL-2-Rβ에 대해 시험하고, 실시예 1의 구성물(원래의 링커) 및 IL-15 인서트가 없는 야생형 CA645 Fab와 비교하였을 때의, 상기 CA645/IL-15Fwk3 구성물에 대한 비아코어 결합 분석을 보여주는 것이다. 시험된 구성물 모두 성공적인 결합을 보인 것으로 관찰되었다.
실시예
13 -
dsscFv가
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645
Fab
단편
유전자 디자인
상기 방법에 따라 본 발명의 두 항체를 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, 항IL17A CA497 dsscFv(vHvL, 또는 vLvH)를 CA645 Fab 단편(스캐폴드 항체)의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다. 생성된 항체를 각각 CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv(vHvL) 또는 CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv(vLvH)로 명명할 수 있다. CA497 dsscFv 및 CA645 Fab를 대조군으로서 생성하였다.
프레임워크 3 삽입을 갖는 변이체를 포함하는, 경쇄 및 중쇄 V 영역을 코딩하는 유전자를 자동화된 합성 접근법(ATUM)에 의해 디자인하고, 구성하였다. 경쇄 V 영역 유전자(예컨대, 서열번호 2의 CA645 VL 도메인을 코딩하는 것)를 인간 Cκ 영역(Km3 알로타입)을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 중쇄 V 영역 유전자를 IgG1 CH1 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 클로닝하였다.
CA497
dsscFv
(
vHvL
)
CA497
dsscFv
(
vLvH
)
CA497
dsscFv(vHvL)(굵은
이탤릭체로 표시)가
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645
Fab
중쇄
(링커는
밑줄체로
표시):
CA497
dsscFv(vLvH)(굵은
이탤릭체로 표시)가
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645
Fab
중쇄
(링커는
밑줄체로
표시):
일시적 세포 발현
엑스피펙타민 293(ExpiFectamine 293) 형질감염 키트(Life Technologies, 제조사의 설명서에 따라 수행)를 사용하여 HEK-293 세포에서, 또는 엑스피펙타민CHO(ExpiFectamine CHO) 형질감염 키트(Life Technologies, 제조사의 설명서에 따라 수행)를 사용하여 CHO-K1 유래 세포주(문헌 [Cain K et al, A CHO cell line engineered to express XBP1 and ERO1-Lα has increased levels of transient protein expression. Biotechnology Progress 2013; 29: 697-706])인 CHO-S XE 세포에서 조작된 Fab 단편을 일시적으로 발현시켰다. 소규모 발현(2 ml)을 위해 HEK-293 세포를 사용하여 직접적인 SPR 분석을 위해 항체 구성물을 제조하였다. 대규모 발현 (200 ml)을 위해 CHO-S XE 세포를 사용하여 추가 특징화하기 전 정제를 위한 항체 구성물을 제조하였다.
정제
친화성 크로마토그래피를 사용하여 배양물 상청액으로부터 Fab 단편을 정제하였다. 항체를 함유하는 상청액을 하이트랩 프로테인 G(HiTrap Protein G) 칼럼(GE Healthcare)을 통해 통과시켰다. 포스페이트 완충처리된 염수(PBS) pH 7.4를 이용한 세척 단계 후, 0.1 M 포스페이트 시트레이트 완충제 pH 2.6의 부피% 증가 대비로 PBS pH 7.4 구배로 결합 물질을 용리시켰다. 용출액을 2 M 트리스-HCl(pH 8)을 이용하여 중화시켰다. 분획을 풀링하고, 280 nm에서의 흡광도에 의해 정량화하고, 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 필터(Merck Millipore)를 이용하여 농축시켰다. 구성물의 단량체 분획을 단리시키기 위해, PBS pH 7.4로 평형화된 하이로드(HiLoad) 16/60, 슈퍼덱스 200(Superdex 200) 칼럼(GE Healthcare) 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 사용하였다. 단량체 Fab를 함유하는 분획을 풀링하고, 정량화하고, 농축시키고, 4℃에서 보관하였다.
UPLC(초 고성능 액체 크로마토그래피(Ultra-high-performance liquid chromatography)):
PBS, pH 7.4에서 미리 평형화된 SEC BEH200 칼럼 상에 2 ㎍의 샘플을 주입하고, 10 min 동안 전개시켰다. EM파워(EMpower) 소프트웨어에서 수동으로 선택된 용리 시간 및 피크 면적 대비로 형광 광도를 기록하였다.
UPLC 용리 프로파일을 수득하고, 분석하였다. 피크는 >98% 단량체로 나타났다(CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv(vLvH)의 경우, 99.42%, CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv(vHvL)의 경우, 99.51%). 대조군 CA497 dsscFv 및 CA645 Fab는 각각 9.99% 및 98.43%의 단량체 형태를 나타내었다(데이터는 제시되지 않음). 따라서, 정제된 단백질은 균질이고, 다량체 형태 또는 응집체는 없었다.
분자 안정성
시차 주사 열량 측정법(DSC: Differential Scanning Calorimetry) 방법에 의한 용융 온도(Tm)(언폴딩의 척도) 분석에 의해 분자 안정성을 측정하였다. 사전 인큐베이션 스캔 시간 15 min, 여과 기간 5 s, 및 수동으로 설정된 피드백하에 단계 속도 1℃/min을 이용하여 0-100℃에서 자동 마이크로칼 VP DSC(MicroCal VP DSC)(Malvern Panalytical) 상에서 써모그램을 획득하였다. 매뉴얼 기준선 감산 및 농도 보정 이전에 완충제의 것이 감소된 것이었다. 써모그램을 Origin7.0에서 비2-상태로 피팅하였다.
결과는 도 20(DSC 곡선; 세로축: (Cp) 비열; 가로축: 온도(도C: (℃)) 및 하기 표 3에 제시되어 있다. CA497 dsscFv 및 CA645 Fab는 각각 58.40℃에서 및 83.57℃에서 단일 전이를 보였다. dsscFv 포맷이 삽입되어 Fab-Fwk3으로 조합되었을 , CA497 dsscFv Tm은 거의 동일하고(2-3℃ 차이), CA645 Fab는 약 4-5℃의 Tm 변동을 보인다. 따라서, 본 발명에 따라 상기 항체 포맷의 CA497 dsscFv 및 CA645 Fab 쌍형성은 어느 도메인의 입체형태 안정성에도 유의적인 영향을 미치지 않는다.
중화 검정법
HSA의 존재 또는 부재하에 Hela 세포에서 인간 재조합 IL-17A에 대한 항체 CA497 IgG4, CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv(vHvL) 및 CA645 Fab- Fwk3 CA497 dsscFv(vLvH)의 효능을 시험하였다. ATCC의 세포 은행으로부터 Hela 세포(ATCC CCL-2)를 입수하였다. 세포를 10% 우태아 혈청, 페니실린, 젠타마이신 및 글루타민으로 보충된 둘베코스 변형 이글즈 배지(DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium) 중에서 세포를 성장시켰다. 1x104개의 세포를 96 웰 평평한 바닥의 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 밤새도록 인큐베이션시키고, 검정용 완충제 중에서 1회 세척하였다. 인간 IL-17A(25 ng ml- 1)를 고정 농도의 인간 TNF-α 존재하에서 인큐베이션시키고, 상기 혼합물을 시험된 항체와 미리 인큐베이션시켰다. 이어서, 시토카인 및 항체를 Hela 세포에 첨가하여 밤새도록 인큐베이션시킨 세포를 자극시켰다. Hela 세포주에서, IL-17A는 TNF-알파와 시너지화하여 IL-6 생산을 유도하고, 이는 예컨대, ELISA에 의해 정량화할 수 있다. 세포 배양 상청액 중 IL-6 생산은 세포에 첨가된 IL-17A의 양에 비례한다. ELISA에 의해 인간 IL-6 수준을 측정하고, 인간 IL-6의 공지된 표준 농도와 비교하여 정량화하였다. 본 검정법에서, IL-6 분비 억제는 IL-17A 억제와 상관관계를 갖는다.
억제 곡선이 도 21(가로축: 항체(억제제) 농도(ng/ml), 세로축: IL-6의 분비 억제율(%))에 제시되어 있고, 이는 모체 항체 CA497 IgG4, 및 두 항체 융합 구성물 모두 인간 재조합 IL-17A를 강력하게 중화시켰다는 것을 나타낸다. 추가로, 본 결과는 dsscFv 항IL-17이 Fab 항HSA의 Fwk3 영역 내로 삽입되었을 때, 기능을 보유하였다는 것을 나타낸다. 본 실험으로부터 계산된 EC50 값(하기 표 4)은 항체 CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv(vLvH) 및 CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv(vHvL)가 인간 재조합 IL-17A(25 ng.ml- 1)에 대하여 각각 10.5 ng/ml 및 10.6 ng/ml의 EC50을 보였고, 중화 효능은 HSA 존재에 의해 영향을 받지 않았다는 것을 나타내었다(HSA 존재하에 EC50은 각각 10.8 및 8.7 ng/ml). 또한, the CA645 Fab-Fwk3 CA497 dsscFv 구성물은 모체 CA497 IgG4 항체들 중 하나와 유사한 중화 효능을 가졌다.
실시예
14 -
dsscFv가
프레임워크
3 내로 삽입된 전체 CA645
IgG
상기 방법에 따라 융합 단백질을 생성하고, 발현시켜 하기 제시된 바와 같이, CA497 dsscFv(vH-vL) 또는 CA497 dsscFv(vL-vH)를 CA645 IgG4P 구성물의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다. 생성된 항체 융합 단백질을 CA645 IgG4P Fwk3-CA497 dsscFv(vHvL) 및 CA645 IgG4P Fwk3-CA497 dsscFv(vLvH)로 명명할 수 있다.
유전자 디자인
프레임워크 3 삽입을 갖는 변이체를 포함하는, 경쇄 및 중쇄 V 영역을 코딩하는 유전자를 자동화된 합성 접근법(ATUM)에 의해 디자인하고, 구성하였다. 경쇄 V 영역 유전자(예컨대, 서열번호 2의 CA645 VL 도메인을 코딩하는 것)를 인간 Cκ 영역(Km3 알로타입)을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 중쇄 V 영역 유전자를 전장의 항체에 대한 IgG4P 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 클로닝하였다.
CA497
dsscFv(vHvL)(굵은
이탤릭체로 표시)가
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645 IgG4P 중쇄(링커는 밑줄체로 표시):
CA497
dsscFv(vLvH)(굵은
이탤릭체로 표시)가
프레임워크
3 내로 삽입된 CA645 IgG4P 중쇄(링커는 밑줄체로 표시):
일시적 세포 발현
엑스피펙타민 293 형질감염 키트(Life Technologies, 제조사의 설명서에 따라 수행)를 사용하여 HEK-293 세포에서, 또는 엑스피펙타민CHO 형질감염 키트(Life Technologies, 제조사의 설명서에 따라 수행)를 사용하여 CHO-K1 유래 세포주인 CHO-S XE 세포에서 조작된 항체를 일시적으로 발현시켰다. 소규모 발현(2 ml)을 위해 HEK-293 세포를 사용하여 직접적인 SPR 분석을 위해 항체 구성물을 제조하였다. 대규모 발현 (200 ml)을 위해 CHO-S XE 세포를 사용하여 추가 특징화하기 전 정제를 위한 항체 구성물을 제조하였다.
정제
친화성 크로마토그래피를 사용하여 배양물 상청액으로부터 IgG를 정제하였다. IgG를 함유하는 상청액을 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe) 칼럼(GE Healthcare)을 통해 통과시켰다. 포스페이트 완충처리된 염수(PBS) pH 7.4를 이용한 세척 단계 후, 0.1 M 포스페이트 시트레이트 완충제 pH 2.6의 부피% 증가 대비로 PBS pH 7.4 구배로 결합 물질을 용리시켰다. 용출액을 2 M 트리스-HCl(pH 8)을 이용하여 중화시켰다. 분획을 풀링하고, 280 nm에서의 흡광도에 의해 정량화하고, 아미콘 울트라 원심분리 필터(Merck Millipore)를 이용하여 농축시켰다. IgG 기반 구성물의 단량체 분획을 단리시키기 위해, PBS pH 7.4로 평형화된 하이로드 16/60, 슈퍼덱스 200 칼럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 사용하였다. 단량체 IgG 구성물을 함유하는 분획을 풀링하고, 정량화하고, 농축시키고, 4℃에서 보관하였다.
IL-17 및
HSA에의
동시 결합
IL-17A 및 HSA의 CA645 IgG4P Fwk3-CA497 dsscFv(vHvL)에의 동시 결합을 시험하기 위해, 후자를 폴리클로날 염소 F(ab)2 대신으로 하여 상기와 동일한 방법으로 비아코어 칩 상에 고정시켰다. 고정화된 항체에의 낮은, 중간, 및 높은 결합 수준을 제공하기 위해 IL-17A 및 HSA, 둘 모두 3개 농도를 선택하였고, 이는 항체 대비 리간드의 화학량론 비가 각각 0.15 내지 0.3, 0.4 내지 0.6, 및 0.65 내지 0.75 범위인 것에 상응하였다. IL-17A 농도가 4, 20 및 100 nM이고, HSA의 경우, 농도는 각각 40, 200 및 1,000 nM이었다. 상기 낮은, 중간, 및 높은 농도를 개별 리간드로서 또는 IL17A/HSA 혼합물로서 개별 사이클에서 앞서 기술된 바와 같이 SPR에 의해 시험하고, 완충제 대조군 사이클을 감산하여 리포트 점을 보정하였다. 결과는 도 22에 제시되어 있고, 이는 CA645 IgG4P Fwk3-CA497 dsscFv(vHvL)이 농도에 의존하는 방식으로 IL-17A 및 HSA, 둘 모두에 결합한다는 것을 나타낸다. 도 22는 추가로 두 결합 파트너 모도 존재하는 경우, 신호는 상가적이라는 것을 추가로 보여주는 것이며, 이는 IL-17A 및 HSA, 둘 모두에의 결합이 동시에 발생할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
15- CD3 및 CD28, 둘 모두에 결합하는 본 발명의 항체
유전자 디자인
상기 방법에 따라 본 발명의 두 항체를 생성하고, 발현시켜 하기 표 5에 제시된 바와 같이, 항CD3 dsscFv(vH-vL)를 항CD3 또는 항CD28 스캐폴드 항체(IgG4P 또는 Fab 단편)의 프레임워크 3 영역 내로 삽입하였다. 본 발명에 따른 생성된 항체 구성물을 항CD28 Fab Fwk3-항CD3 dsscFv(서열번호 136의 LC, 서열번호 139의 HC), 항CD3 Fab Fwk3-항CD3 dsscFv(서열번호 133의 LC, 서열번호 140의 HC), 항CD28 IgG4P Fwk3-항CD3 dsscFv(서열번호 136의 LC, 서열번호 141의 HC), 항CD3 IgG4P Fwk3-항CD3 dsscFv(서열번호 133의 LC, 서열번호 142의 HC)로 명명할 수 있다.
항CD3
경쇄
,
뮤로모납
(인간화
OKT3
)(가변 도메인은
밑줄체로
표시; CDR은 굵은 이탤릭체로 표시):
항CD3
중쇄
Fab
,
IgG1로부터의
CH1,
뮤로모납
(인간화
OKT3
)(가변 도메인은 밑줄체로 표시;
CDR은
굵은 이탤릭체로 표시):
항CD3 중쇄
IgG4P
, 뮤로모납(인간화
OKT3)(가변 도메인은 밑줄체로 표시
; CDR은 굵은 이탤릭체로 표시):
항CD28
경쇄
,
테라리주맙
(가변 도메인은
밑줄체로
표시;
CDR은
굵은 이탤릭체로 표시):
항CD28
중쇄
Fab
,
IgG1로부터의
CH1,
테라리주맙
(가변 도메인은
밑줄체로
표시;
CDR은
굵은 이탤릭체로 표시):
항CD28
중쇄
IgG4P
,
테라리주맙
(가변 도메인은
밑줄체로
표시;
CDR은
굵은 이탤릭체로 표시):
항CD3 dsscFv(vHvL)(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 항CD28 Fab 중쇄 (링커는 밑줄체로 표시):
항CD3 dsscFv(vHvL)(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 항CD3 Fab 중쇄(링커는 밑줄체로 표시):
항CD3 dsscFv(vHvL)(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 항CD28 IgG4P 중쇄 (링커는 밑줄체로 표시):
항CD3 dsscFv ( vHvL )(굵은 이탤릭체로 표시)가 프레임워크 3 내로 삽입된 항CD3 IgG4P 중쇄 (링커는 밑줄체로 표시):
UPLC(초 고성능 액체 크로마토그래피):
PBS, pH 7.4에서 미리 평형화된 SEC BEH200 칼럼 상에 2 ㎍의 샘플을 주입하고, 10 min 동안 전개시켰다. EM파워 소프트웨어에서 수동으로 선택된 용리 시간 및 피크 면적 대비로 형광 광도를 기록하였다.
UPLC 용리 프로파일을 수득하고, 분석하였다. 피크는 >98% 단량체로 나타났고(항CD3 IgG4P Fwk3-항CD3 dsscFv: 99.02%, 항CD3 Fab Fwk3-항CD3 dsscFv: 99.79%, 항CD28 Fab Fwk3-항CD3 dsscFv: 99.48%), 단, 예외적으로, 항CD28 IgG4P Fwk3-항CD3 dsscFv에서 12.12%의 저분자량의 숄더가 나타났다. 임의의 포맷의 다량체화의 증거는 없었다.
분자 안정성
상기 기술된 바와 같은 시차 주사 열량 측정법(DSC) 방법에 의한 용융 온도(Tm)(언폴딩의 척도) 분석에 의해 분자 안정성을 측정하였다. DSC 곡선이 도 23(A) 및 (B)에 제시되어 있고, Tm 값은 하기 표 6 및 7에 제시되어 있다.
항CD3 Fab Fwk3-항CD3 dsscFv에 대한 DSC 곡선은 70.04℃에서 단일 언폴딩 전이를 보였다. 그에 반해, 항CD28을 함유하는 구성물의 언폴딩은 단일 전이로 정확하게 기술되지는 못했지만, 비2-상태, 두 전이 모델로 잘 피팅되었고; 그의 최저치는 dsscFv 성분에 기인하는 것일 수 있다. 값 65℃-75℃는 전형적인 IgG의 것과 일치하는 바, 상기 결과는 특히, 프레임워크 3 위치에 Fab를 삽입함으로써 안정한 구성물을 수득할 수 있었다는 것을 보여준다.
항CD3 IgG4P Fwk3-항CD3 dsscFv에 대한 DSC 곡선은 68.55℃에서 단일 언폴딩 전이를 보였다. 그에 반해, 항CD28을 함유하는 구성물의 언폴딩은 단일 전이로 정확하게 기술되지는 못했지만, 비2-상태, 두 전이 모델로 잘 피팅되었고; 그의 최저치는 dsscFv 성분에 기인하는 것일 수 있다. 값 65℃-75℃는 IgG 유사 분자에 전형적인 바, 상기 결과는 특히, 프레임워크 3 위치에 IgG를 삽입함으로써 안정한 구성물을 수득할 수 있었다는 것을 보여준다.
인간 기능성
PBMC
검정법에서의
프레임워크
3 인서트를 갖는
Fab
및
IgG4P
구성물의 평가
구성물을 하기 기술된 방법에 따라 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)의 배양물에서 T 세포 활성화를 자극시킬 수 있는 그의 능력에 대해 시험하였다.
시약
CD4 및 CD8 T 세포를 검출, 살아있는 세포와 사멸 세포를 구별, 및 활성화 마커 CD69를 측정하는 데 사용된 항체를 BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)로부터 입수하였다(항CD4 항체, 항CD8, 항CD69 항체 및 살아있는 세포/사멸 세포를 구별하는 항체를 각각 형광단 FITC, PE, BV421 및 근적외선에 커플링시켰다. 모든 세포 배양을 RPMI1640(Thermo) + 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청(Sigma) 및 2 mM 글루타민(Thermo) 중에서 수행하였다. 모든 유세포 분석법 염색은 둘베코스 PBS(Thermo) + 1% 소 혈청 알부민(Sigma), 2 mM EDTA(Sigma) 및 0.1% 아지드화나트륨(Sigma)을 포함하는 표준 유세포 분석법 완충제를 이용하여 수행하였다. 인간 OKT3(Ebioscience) 및 T 세포 트랜스액트(Transact)(Miltenyi) 항CD3 및 CD28의 콜로이드성 현탁액. iQUE플러스(iQUEplus)(Sartorius)를 이용하여 모든 유세포 분석법 데이터를 획득하였다. 데이터 변환 및 그래프 제시를 위해 그래프패드 프리즘 7(GraphPad Prism 7)(GraphPad)로 임포트된 포어사이트(Forecyt) 소프트웨어(Sartorius) 및 데이터 매트릭스를 이용하여 T 세포를 확인하였다.
방법
표 5의 항체 구성물을 25 ㎍/ml로부터 8개의 1/5 희석 단계로 희석하였다. 분석 단계 후, 상기 값 모두 nM 농도로 변환하여 모든 구성물에 대하여 동일하게 비교할 수 있도록 하였다. 96 웰 'U' 바닥 조직 배양 플레이트 (공여자 1 및 2로 익명으로 한 2개의 상이한 공여자로부터의) 1.5x105개의 PBMC 가하고, 희석된 항체와 혼합하였다. OKT3(5 ㎍/ml), 트랜스액트(CD3/CD28, 1/100으로 희석) 및 배지 단독인 것으로 본 실험을 위한 참조 대조군이었다. 혼합한 후, 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 시간 후, 플레이트를 얼음상에서 냉각시키고, 회전시키고(모든 후속 스핀은 4℃에서 5 min 동안 500 g로 이루어졌다), 상청액을 각 웰로부터 제거하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 상청액을 흡인하고, 20 ㎕의항체 칵테일을 각 웰에 첨가하였다(모든 항체는 유세포 분석법 완충제 중에서 1:20으로 희석하였고, 칵테일 1 ml당 1 ㎕ 생/사멸 염료를 첨가하였다. 플레이트를 암실에서 1시간 동안 얼음상에 놓아 두었다. 이 시간 후, 플레이트를 추가로 2회에 걸쳐 세척하고, 상청액을 모든 웰로부터 제거하였다. 마지막으로 플레이트를 20 ㎕의 유세포 분석법 완충제 중에 재현탁시키고, 웰당 적어도 10,000개의 세포를 획득하였다.
결과
본 결과는 도 24에 제시되어 있다(a-d; 세로축은 CD69 발현 수준(MFI)을 나타내고, 가로축은 항체 구성물의 농도(nM)를 나타낸다. 양성 대조군(OKT3)이 CD4 및 CD8 T 세포, 둘 모두에서 조기 활성화 마커인 CD69를 유도하였기 때문에, 본 실험은 성공적인 것으로 간주되었다. 활성화의 최소(오직 세포만 단독) 수준을 세포 단독 대조군에 의해 측정하였다. 도 24(A) 및 (B)로부터 알 수 있는 바, 시험된 구성물에 대해 CD4 T 세포 상에 CD69의 도입은 공여자들 간에 일치하였다.
CD3 및 CD28을 함유하는 본 발명의 항체(Fab 또는 IgG4P 포맷)가 CD4 T 세포의 가장 강력한 활성인자였다. 본 검정법에서 예상대로, Fc를 함유하는 구성물 또한 다른 (비) T 세포, 특히, 단핵구 상의 Fc 수용체를 통해 활성을 부가할 수 있고, 이는 증강된 공동 자극성 신호를 제공한다. 이와 관련하여, 항CD3 IgG4P Fwk3-항CD3dsscFv 또한 본 검정법에서 (완전 IgG 항CD3 항체인 OKT3 대조군과 같이) 활성을 보였다. 본 데이터는 CD3 및 CD28에 결합하는 본 발명의 항체는 혼합된 PBMC 검정법에서 인간 CD4 T 세포의 기능성 활성인자이고, 따라서, 이중특이적 항체의 기능을 수행할 수 있다는 것을 입증한다.
추가로, CD8 T 세포의 활성화 또한 동일한 검정법에서에서 측정되었다. 앞서 기술된 바와 같이, 모든 양성 대조군 및 음성 대조군은 예상대로 수행하였다. 도 24 (C) 및 (D)로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험된 구성물에 대한 CD8 T 세포 상의 CD69 도입은 공여자들 사이에 일치한다. CD3 및 CD28을 함유하는 본 발명의 항체(Fab 또는 IgG4P 포맷)가 CD8 T 세포의 가장 강력한 활성인자였다. 항CD3 IgG4P Fwk3 항CD3dsscFv 또한 본 검정법에서 (완전 IgG 항CD3 항체인 OKT3 대조군과 같이) 활성을 보였다. 본 데이터는 CD3 및 CD28에 결합하는 본 발명의 항체는 혼합된 PBMC 검정법에서 인간 CD8 T 세포의 기능성 활성인자이고, 따라서, 이중특이적 항체의 기능을 수행할 수 있다는 것을 입증한다.
본 결과는 인서트 폴리펩티드가 스캐폴드 항체의 Fwk3 영역에 존재할 때, 본 발명에 따른 항체는 스캐폴드 항체(예컨대, 항CD28 Fab 또는 IgG4P), 및 인서트 폴리펩티드, 즉, 제2 항체(예컨대, 항CD3 dsscFv) 둘 모두 기능을 갖는다.
본 명세서와 관련하여 포함하는(comprising)이란, 포함하는(including)이라는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
기술상 적절할 경우, 본 발명의 실시양태는 조합될 수 있다. 실시양태는 본원에서 특정 특징/요소를 포함하는 것으로 기술된다. 본 기술내용은 또한 특징/요소로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된 별개의 실시양태로 확장된다.
물론, 본 발명이 비록 예에 의해 기술되었지만, 예는 어느 방식으로든 제한하는 것을 의미하는 것은 아니며, 변형이 이하 청구범위의 범주 내에서 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 각 실시양태의 바람직한 특징은 필요한 수정을 가하여 각각의 다른 실시양태에 적용될 수 있다. 본 명세서에서 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하나, 이에 제한되지 않는 모든 공개 문헌은, 마치 각각의 개별 공개 문헌이 본원에서 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같이 본원에서 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> UCB Biopharma SPRL
<120> ANTIBODIES COMPRISING A POLYPEPTIDE INSERTED IN FRAMEWORK 3
REGION
<130> PF0155-WO
<150> GB1811368.8
<151> 2018-07-11
<160> 144
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Light Chain gL5
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Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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1 5 10 15
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Phe Pro
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rigid linker
<400> 51
Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 52
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rigid linker
<400> 52
Pro Pro Pro Pro
1
<210> 53
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 54
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Lys Tyr Gln Ser Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Met Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
85 90 95
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
100 105 110
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
115 120 125
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130 135 140
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
145 150 155 160
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
165 170 175
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
180 185 190
Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
260 265 270
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
275 280 285
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
290 295 300
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
305 310 315 320
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
325 330 335
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
340 345 350
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<213> Homo sapiens
<400> 55
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
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Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu
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115 120 125
Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu
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Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe
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His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu
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Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu
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Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln
195 200 205
Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu
210 215 220
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
260 265 270
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
275 280 285
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
290 295 300
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
305 310 315 320
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
325 330 335
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro
35 40 45
Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro
50 55 60
Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser
65 70 75 80
Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu
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Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu
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Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu
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Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe
130 135 140
Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His
145 150 155 160
Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala
165 170 175
Gln Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
65 70 75 80
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
85 90 95
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
100 105 110
Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu
115 120 125
Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu
130 135 140
Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln
145 150 155 160
Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu
165 170 175
Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp
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Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly
195 200 205
Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala
210 215 220
Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu
225 230 235 240
Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln
245 250 255
Pro Ser Gly Gly Gly Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
260 265 270
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro
275 280 285
Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
290 295 300
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
305 310 315 320
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
325 330 335
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
340 345 350
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
355 360 365
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
370 375 380
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
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Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val
1 5 10 15
Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
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50 55 60
Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
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100 105 110
Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
115 120 125
<210> 60
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab HC Fwk3 GM-CSF
<400> 60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr
130 135 140
Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr
145 150 155 160
Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr
165 170 175
Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu
180 185 190
Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln
195 200 205
Glu Gly Gly Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
210 215 220
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr
225 230 235 240
Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
245 250 255
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
260 265 270
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
275 280 285
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
290 295 300
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
325 330 335
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
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Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<210> 61
<211> 359
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab HC with GM-CSF at C-terminus of CH1
<400> 61
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro
225 230 235 240
Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg
245 250 255
Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val
260 265 270
Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln
275 280 285
Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys
290 295 300
Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys
305 310 315 320
Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu
325 330 335
Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp
340 345 350
Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
355
<210> 62
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<212> PRT
<213> Murine
<400> 62
Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His Val
1 5 10 15
Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val Thr
20 25 30
Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys Lys
35 40 45
Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu Arg
50 55 60
Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser Tyr
65 70 75 80
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Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu Thr
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<210> 63
<211> 359
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab HC Fwk3 mGM-CSF
<400> 63
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
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Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys
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His Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro
100 105 110
Val Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe
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Leu Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala
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Leu Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Gly Gln Lys Gly Gly
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Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala
225 230 235 240
Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
260 265 270
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
275 280 285
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
290 295 300
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
355
<210> 64
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab HC with mGM-CSF at C-terminus of CH1
<400> 64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
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Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr
225 230 235 240
Val Thr Arg Pro Trp Lys His Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn
245 250 255
Leu Leu Asp Asp Met Pro Val Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val
260 265 270
Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu
275 280 285
Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly
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Pro Gly Gln Lys
355
<210> 65
<211> 166
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
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Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
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Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
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Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
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Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210> 66
<211> 401
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab HC Fwk3 EPO
<400> 66
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
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Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg
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Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala
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Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val
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Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu
130 135 140
Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln
145 150 155 160
Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His
165 170 175
Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg
180 185 190
Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser
195 200 205
Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe
210 215 220
Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
225 230 235 240
Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Gly Lys Asn Thr Val Tyr
245 250 255
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
260 265 270
Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp
275 280 285
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
290 295 300
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
305 310 315 320
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
325 330 335
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
340 345 350
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
355 360 365
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
370 375 380
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
385 390 395 400
Cys
<210> 67
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH6
<400> 67
Asp Val Gln Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val His Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asn Cys Ala Thr Ser Gly Tyr Ile Tyr Ser Thr Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala His Ile Tyr Thr Asn Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Ser Ile Arg Cys Ala Ser Phe Ser Ala Thr Glu Tyr
100 105 110
Lys Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 68
<211> 369
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab HC Fwk3 VHH6
<400> 68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
85 90 95
His Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Asn Cys Ala Thr Ser Gly Tyr Ile
100 105 110
Tyr Ser Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
115 120 125
Arg Glu Gly Val Ala His Ile Tyr Thr Asn Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr
130 135 140
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
145 150 155 160
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
165 170 175
Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro Ser Ile Arg Cys Ala Ser Phe Ser
180 185 190
Ala Thr Glu Tyr Lys Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
195 200 205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Thr Val Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
260 265 270
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
275 280 285
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
290 295 300
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
305 310 315 320
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
325 330 335
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
340 345 350
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
355 360 365
Cys
<210> 69
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH15
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Cys Thr
20 25 30
Tyr Asp Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ser Gly Ile Asp Ser Asp Gly Arg Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Ser Asn Ala Lys Ile Ala Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Leu Gln Cys Leu Arg Tyr Pro Gly Glu Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 70
<211> 363
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab HC Fwk3 VHH15
<400> 70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
85 90 95
Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ala Ser Gly Tyr
100 105 110
Thr Gly Cys Thr Tyr Asp Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys
115 120 125
Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Asp Ser Asp Gly Arg Ala Thr Tyr
130 135 140
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Ser Asn Ala Lys
145 150 155 160
Ile Ala Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala
165 170 175
Met Tyr Tyr Cys Asn Leu Gln Cys Leu Arg Tyr Pro Gly Glu Tyr Tyr
180 185 190
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
210 215 220
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly
225 230 235 240
Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
260 265 270
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
275 280 285
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
290 295 300
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
325 330 335
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
340 345 350
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
355 360
<210> 71
<211> 190
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu
1 5 10 15
Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr
20 25 30
Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Phe Glu
35 40 45
Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg
50 55 60
Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu
65 70 75 80
Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile
85 90 95
Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile
100 105 110
Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly
115 120 125
Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys
130 135 140
Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly
145 150 155 160
Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gln Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala
165 170 175
Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr
180 185 190
<210> 72
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Core domain of human sclerostin
<400> 72
Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg
1 5 10 15
Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro
20 25 30
Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro
35 40 45
Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg
50 55 60
Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val
65 70 75 80
Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys
85
<210> 73
<211> 314
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab heavy chain with human sclerostin core domain inserted
into framework 3, single S linkers
<400> 73
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Ser Cys Arg Glu Leu His
65 70 75 80
Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val
85 90 95
Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro
100 105 110
Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe
115 120 125
Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Cys
130 135 140
Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser
145 150 155 160
Cys Lys Cys Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
165 170 175
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr
180 185 190
Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
195 200 205
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
210 215 220
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
225 230 235 240
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
245 250 255
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
260 265 270
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
275 280 285
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
290 295 300
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
305 310
<210> 74
<211> 333
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab heavy chain with human sclerostin core domain inserted
into framework 3, Gly-Ser (2X G4S) linkers
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp
85 90 95
Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly
100 105 110
Gln Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys
115 120 125
Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr
130 135 140
Arg Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
180 185 190
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val
195 200 205
Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
210 215 220
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
225 230 235 240
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
245 250 255
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
260 265 270
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
275 280 285
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
290 295 300
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
305 310 315 320
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
325 330
<210> 75
<211> 323
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab heavy chain with human sclerostin core domain inserted
into framework 3, rigid linkers
<400> 75
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Ile Pro Phe Thr Val Cys
65 70 75 80
Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser
85 90 95
Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala
100 105 110
Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser
115 120 125
Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val
130 135 140
Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg
145 150 155 160
Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Glu Tyr His Gly Leu Gln Lys Asn Thr
165 170 175
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
180 185 190
Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp
195 200 205
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
225 230 235 240
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
245 250 255
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
260 265 270
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
275 280 285
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
290 295 300
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
305 310 315 320
Lys Ser Cys
<210> 76
<211> 425
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab heavy chain with human mature full-length sclerostin
inserted into framework 3, Gly-Ser (1X G4S) linkers
<400> 76
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
65 70 75 80
Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu
85 90 95
Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met
100 105 110
Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr
115 120 125
Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr
130 135 140
Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val
145 150 155 160
Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly
165 170 175
Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro
180 185 190
Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu
195 200 205
Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys
210 215 220
Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr
225 230 235 240
Glu Ala Ala Arg Pro Gln Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg
245 250 255
Ser Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
275 280 285
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser
290 295 300
Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
305 310 315 320
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
325 330 335
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
340 345 350
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
370 375 380
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
385 390 395 400
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
405 410 415
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
420 425
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flexible linker
<400> 77
Lys Tyr Gln Ser Gly Gly Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flexible linker
<400> 78
Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flexible linker
<400> 79
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flexible linker
<400> 80
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5
<210> 81
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flexible linker
<400> 81
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 82
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rigid linker
<400> 82
Ile Pro Phe Thr Val
1 5
<210> 83
<211> 347
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA497 Fab heavy chain with human IL-15 inserted into framework 3,
Gly-Ser linkers
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ile Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Phe Asn Ala Asp Ile Ser Tyr Tyr Arg Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
85 90 95
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
100 105 110
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
115 120 125
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
130 135 140
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
145 150 155 160
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
165 170 175
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
180 185 190
Phe Ile Asn Gly Gly Gly Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Asp Ala Asn
210 215 220
Arg Gln Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
340 345
<210> 84
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA497 Fab light chain
<400> 84
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Met Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 85
<211> 346
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA240 Fab heavy chain with human IL-15 inserted into framework 3,
Gly-Ser linkers
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Met Arg Asn Lys Asn Tyr Gln Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
100 105 110
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
115 120 125
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
130 135 140
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
145 150 155 160
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
165 170 175
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
180 185 190
Gln Met Phe Ile Asn Gly Gly Gly Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
210 215 220
Ser Tyr Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
245 250 255
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
260 265 270
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
275 280 285
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
290 295 300
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
305 310 315 320
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
325 330 335
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
340 345
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA240 Fab light chain
<400> 86
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ile Ser
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 87
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1 5 10 15
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Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu His Gly Asn Tyr Asp Phe Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
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115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
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145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HyHEL5 light chain
<400> 88
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
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Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
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210
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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1 5 10 15
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100 105 110
Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-lysozyme HyHEL5 light chain with anti-lysozyme VHH D3L11
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Glu Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Gly Ser Thr Asp Ser Ile Glu Tyr Met Thr Trp Phe Arg Gln
100 105 110
Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val Ala Ala Leu Tyr Thr His Thr
115 120 125
Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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260 265 270
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Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-lysozyme HyHEL5 light chain with anti-IL-6 VHH15 inserted
into framework 3, Gly-Ser linkers
<400> 91
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Tyr Asp Met Arg Trp Tyr Arg
100 105 110
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Asp Ser Asp
115 120 125
Gly Arg Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
130 135 140
Gln Ser Asn Ala Lys Ile Ala Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys
145 150 155 160
Leu Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Asn Leu Gln Cys Leu Arg Tyr
165 170 175
Pro Gly Glu Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr
195 200 205
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Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Gly Arg Asn Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr
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260 265 270
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
275 280 285
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290 295 300
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
305 310 315 320
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
325 330 335
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345 350
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 light chain with anti-lysozyme VHH D3L11 inserted into
framework 3, Gly-Ser linkers
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
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Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val
65 70 75 80
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Asp Ser Ile Glu Tyr Met Thr Trp Phe
100 105 110
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val Ala Ala Leu Tyr Thr
115 120 125
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130 135 140
Ile Ser Gln Asp Lys Ala Lys Asn Met Ala Tyr Leu Arg Met Asp Ser
145 150 155 160
Val Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Thr Cys Gly Ala Thr Arg Lys
165 170 175
Tyr Val Pro Val Arg Phe Ala Leu Asp Gln Ser Ser Tyr Asp Tyr Trp
180 185 190
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
210 215 220
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly
225 230 235 240
Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
245 250 255
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
305 310 315 320
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
325 330 335
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
340 345 350
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 360
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab heavy chain with human IL-15 inserted into framework 3
with bovine long linker
<400> 93
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Thr Ser Val His Gln Glu
65 70 75 80
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Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
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Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys
115 120 125
Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser
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Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu
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Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu
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Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile
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210 215 220
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225 230 235 240
Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
260 265 270
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
275 280 285
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
290 295 300
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
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Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
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Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
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Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<211> 350
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab heavy chain with human IL-15 inserted into framework 3
with bovine short linker
<400> 94
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
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Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr
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275 280 285
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
325 330 335
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
340 345 350
<210> 95
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab heavy chain with human IL-15 inserted into framework 3
with 2xG4S linker
<400> 95
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
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Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile
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100 105 110
Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu
115 120 125
Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His
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Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser
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165 170 175
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180 185 190
Met Phe Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
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340 345 350
Pro Lys Ser Cys
355
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 96
Thr Ser Val His Gln Glu Thr Lys Lys Tyr Gln Ser
1 5 10
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 97
Ser Tyr Thr Tyr Asn Tyr Glu Trp His Val Asp Val
1 5 10
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 98
Glu Thr Lys Lys Tyr Gln Ser
1 5
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 99
Ser Tyr Thr Tyr Asn Tyr Glu
1 5
<210> 100
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr
1 5 10 15
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35 40 45
Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Pro
50 55 60
Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro
65 70 75 80
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Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly
100 105 110
Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser Ser Thr
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Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly Asn Asp
145 150 155 160
Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr Cys Leu
165 170 175
Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Gly Glu Tyr Lys
180 185
<210> 101
<211> 627
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab heavy chain with two human IL-10 monomers inserted into
framework 3
<400> 101
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu
85 90 95
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu
100 105 110
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys
115 120 125
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu
130 135 140
Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly
145 150 155 160
Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu
165 170 175
Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln
180 185 190
Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser Ser
195 200 205
Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys Asn
210 215 220
Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly Asn
225 230 235 240
Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr Cys
245 250 255
Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Gly Glu Tyr Lys Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Cys Trp Leu
275 280 285
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290 295 300
Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser Trp Thr
305 310 315 320
Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile Phe Asn
325 330 335
Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Pro Arg Cys Val Cys
340 345 350
Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp
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420 425 430
Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr
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Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser
450 455 460
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485 490 495
Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp
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Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
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530 535 540
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
580 585 590
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
595 600 605
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
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<213> Artificial Sequence
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50 55 60
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<213> Artificial Sequence
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20 25 30
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35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<213> Artificial Sequence
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1 5
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<213> Artificial Sequence
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 106
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Thr Val Pro Gly Tyr Ser Ala Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 VL domain (gL1)
<400> 108
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
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100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645-Cys VL domain (gL4)
<400> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 113
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Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
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<220>
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<400> 119
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
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<400> 122
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1 5 10 15
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20
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<211> 20
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<220>
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<400> 123
Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu
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Arg Ser Glu Gln
20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met
1 5 10
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<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA497 Fab Heavy Chain
<400> 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ile Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Phe Asn Ala Asp Ile Ser Tyr Tyr Arg Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Asp Ala Asn Arg Gln Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA240 Fab Heavy chain
<400> 126
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr
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Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 127
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1 5 10 15
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Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
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195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
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Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 128
<211> 247
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA497 dsscFv (vLvH)
<400> 128
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Met Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Pro Arg Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ile Phe Ser Asp Tyr Tyr Met
145 150 155 160
Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Ser
165 170 175
Ile Asn Phe Asn Ala Asp Ile Ser Tyr Tyr Arg Glu Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr
210 215 220
Asp Ala Asn Arg Gln Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 129
<211> 491
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 Fab HC Fwk3 CA497 dsscFv (vHvL)
<400> 129
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
85 90 95
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100 105 110
Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys
115 120 125
Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Asn Phe Asn Ala Asp Ile Ser Tyr Tyr
130 135 140
Arg Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
145 150 155 160
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala
165 170 175
Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Asp Ala Asn Arg Gln Asn Tyr Asp Trp Phe
180 185 190
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu
210 215 220
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
225 230 235 240
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Ser Ser Ser Met Tyr Ser Tyr
245 250 255
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
260 265 270
Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
275 280 285
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
290 295 300
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Thr Ala Pro Arg
305 310 315 320
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
325 330 335
Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
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Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 139
<211> 488
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-CD28 Fab HC Fwk3 anti-CD3 dsscFv (vHvL)
<400> 139
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
85 90 95
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
100 105 110
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
115 120 125
Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
130 135 140
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
145 150 155 160
Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
165 170 175
Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
180 185 190
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
225 230 235 240
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
245 250 255
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
260 265 270
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
275 280 285
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
290 295 300
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
305 310 315 320
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg
340 345 350
Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu
355 360 365
Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
370 375 380
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
385 390 395 400
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
405 410 415
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
420 425 430
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
435 440 445
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
450 455 460
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
465 470 475 480
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
485
<210> 140
<211> 487
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-CD3 Fab HC Fwk3 anti-CD3 dsscFv (vHvL)
<400> 140
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
85 90 95
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
100 105 110
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
115 120 125
Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
130 135 140
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
145 150 155 160
Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
165 170 175
Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
180 185 190
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
225 230 235 240
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
245 250 255
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
260 265 270
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
275 280 285
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
290 295 300
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
305 310 315 320
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg
340 345 350
Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His
355 360 365
Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
370 375 380
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
385 390 395 400
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
405 410 415
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
420 425 430
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
435 440 445
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
450 455 460
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
465 470 475 480
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
485
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<211> 712
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-CD28 IgG4P HC Fwk3 anti-CD3 dsscFv (vHvL)
<400> 141
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
85 90 95
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
100 105 110
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
115 120 125
Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
130 135 140
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
145 150 155 160
Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
165 170 175
Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
180 185 190
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
225 230 235 240
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
245 250 255
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
260 265 270
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
275 280 285
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
290 295 300
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
305 310 315 320
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg
340 345 350
Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu
355 360 365
Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
370 375 380
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
385 390 395 400
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
405 410 415
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
420 425 430
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
435 440 445
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
450 455 460
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
465 470 475 480
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
485 490 495
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
500 505 510
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
515 520 525
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
530 535 540
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
545 550 555 560
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
565 570 575
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
580 585 590
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
595 600 605
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
610 615 620
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
625 630 635 640
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
645 650 655
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
660 665 670
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
675 680 685
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
690 695 700
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
705 710
<210> 142
<211> 711
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-CD3 IgG4P HC Fwk3 anti-CD3 dsscFv (vHvL)
<400> 142
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
85 90 95
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
100 105 110
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
115 120 125
Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
130 135 140
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
145 150 155 160
Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
165 170 175
Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
180 185 190
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
225 230 235 240
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
245 250 255
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
260 265 270
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
275 280 285
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
290 295 300
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
305 310 315 320
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg
340 345 350
Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His
355 360 365
Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
370 375 380
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
385 390 395 400
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
405 410 415
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
420 425 430
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
435 440 445
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
450 455 460
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
465 470 475 480
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
485 490 495
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
500 505 510
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
515 520 525
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
530 535 540
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
545 550 555 560
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
565 570 575
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
580 585 590
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
595 600 605
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
610 615 620
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
625 630 635 640
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
645 650 655
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
660 665 670
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
675 680 685
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
690 695 700
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
705 710
<210> 143
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 scFv (VH-VL)
<400> 143
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu
180 185 190
Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 144
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA645 dsscFv (VH-VL)
<400> 144
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu
180 185 190
Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
Claims (47)
- 가변(V) 도메인 및 인서트 폴리펩티드를 포함하는 항체로서, 인서트 폴리펩티드가 V 도메인의 프레임워크 3 영역 내에 있는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, V 도메인이 VH 도메인인 항체.
- 제2항에 있어서, VL 도메인을 추가로 포함하는 항체.
- 제2항에 있어서, 인서트 폴리펩티드가 VH 도메인의 아미노산 잔기 73과 76 사이에 존재하는 항체.
- 제4항에 있어서, 인서트 폴리펩티드가 VH 도메인 중 (i) 아미노산 잔기 73과 74 사이에; (ii) 아미노산 잔기 74와 75 사이에; 또는 (iii) 아미노산 잔기 75와 76 사이에 존재하는 항체.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, VH 도메인의 73과 76 사이의 하나 이상의 아미노산 잔기가 인서트 폴리펩티드에 의해 대체되는 항체.
- 제1항에 있어서, V 도메인이 VL 도메인인 항체.
- 제7항에 있어서, VH 도메인을 추가로 포함하는 항체.
- 제7항에 있어서, 인서트 폴리펩티드가 VL 도메인의 아미노산 잔기 67과 70 사이에 존재하는 항체.
- 제9항에 있어서, 인서트 폴리펩티드가 VL 도메인 중 (i) 아미노산 잔기 67과 68 사이에; (ii) 아미노산 잔기 68과 69 사이에; 또는 (iii) 아미노산 잔기 69와 70 사이에 존재하는 항체.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, VL 도메인의 67과 70 사이의 하나 이상의 아미노산 잔기가 인서트 폴리펩티드에 의해 대체되는 항체.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인서트 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단 단부를 프레임워크 3 영역에 연결하는 적어도 하나의 아미노산의 링커 서열을 추가로 포함하는 항체.
- 제12항에 있어서, 링커 서열이 인서트 폴리펩티드 부분의 N-말단 단부에서의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이상의 아미노산인 항체.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 링커 서열이 인서트 폴리펩티드 부분의 C-말단 단부에서의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이상의 아미노산인 항체.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 전장의 항체 또는 그의 결합 단편인 항체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 전장의 IgG 또는 그의 결합 단편인 항체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, VHH, 또는 scFv, 특히, dsscFv인 항체.
- 제17항에 있어서, Fab인 항체.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 것인 항체.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 V 도메인이 인간 혈청 알부민에 결합하는 항체.
- 제20항에 있어서, 서열번호 3의 서열을 갖는 CDR-L1; 서열번호 4의 서열을 갖는 CDR-L2; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체.
- 제21항에 있어서, 서열번호 2 또는 서열번호 102를 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체.
- 제22항에 있어서, 서열번호 1을 포함하는 L 쇄를 포함하는 항체.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 8의 서열을 갖는 CDR-H1; 서열번호 9의 서열을 갖는 CDR-H2; 서열번호 10의 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체.
- 제24항에 있어서, 서열번호 7 또는 서열번호 103을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체.
- 제25항에 있어서, 서열번호 6을 포함하는 H 쇄를 포함하는 항체.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인서트 폴리펩티드가 시토카인인 항체.
- 제27항에 있어서, 시토카인이 IL-10, IL-15, IL-2, G-CSF, GM-CSF 및 EPO로부터 선택되는 항체.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인서트 폴리펩티드가 제2 항체인 항체.
- 제29항에 있어서, 제2 항체가 scFv, 특히, dsscFv, 또는 도메인 항체, 예컨대, VH 또는 VL 또는 VHH인 항체.
- 제30항에 있어서, VHH가 서열번호 67, 69 및 89로부터 선택되는 서열을 포함하는 항체.
- 제30항에 있어서, 제2 항체가 V 도메인과 동일한 항원에 결합하는 항체.
- 제32항에 있어서, 제2 항체가 V 도메인과 비교하여 상이한 에피토프에 결합하는 항체.
- 제30항에 있어서, 제2 항체가 V 도메인을 포함하는 항체와 상이한 항원에 결합하는 항체.
- 제34항에 있어서, 제2 항체가 IL-17에 결합하고, V 도메인을 포함하는 항체가 HSA에 결합하는 항체.
- 제34항에 있어서, 제2 항체가 CD3에 결합하고, V 도메인을 포함하는 항체가 CD28에 결합하는 항체.
- 제34항에 있어서, 제2 항체가 CD28에 결합하고, V 도메인을 포함하는 항체가 CD3에 결합하는 항체.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 인서트 폴리펩티드가 존재하지 않는 항체와 비교할 때, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%인 결합 친화도로 상기 V 도메인에 의해 그의 동족 항원에 결합하는 항체.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 제2 항체가 존재하지 않는 항체와 비교하여 더욱 큰 결합 친화도로 그의 동종 항원에 결합하는 항체.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 단리된 DNA 분자 또는 DNA 분자 쌍.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 클로닝 또는 발현 벡터, 또는 클로닝 또는 발현 벡터의 쌍.
- 제41항에 따른 클로닝 또는 발현 벡터, 또는 클로닝 또는 발현 벡터의 쌍을 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체를 제조하는 방법으로서, 제42항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체를 단리시키는 단계를 포함하는 제조 방법.
- 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상과 조합하여 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체를 포함하는 약학 조성물.
- 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체, 또는 제44항에서 정의된 바와 같은 조성물.
- 치료를 필요로 하는 피험체에게 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체, 또는 제44항에서 정의된 바와 같은 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 치료법.
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