KR20210031651A - 항-음성 면역 관문 항체와 항-globo h 또는 항-ssea-4 항체를 사용한 병용 요법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 억제된 T 세포 활성을 구제하기 위해 항-음성 면역 관문 항체와 함께 항-Globo 시리즈 항원(Globo H 및 SSEA-4) 항체로의 암 환자의 치료에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조문헌
본 출원은 2018년 6월 1일에 출원된 미국가출원 제62/679,510호의 혜택을 주장하며, 이러한 문헌 모두의 개시는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 항-PD-1 또는 PD-L1 항체와 조합된 항-Globo H 또는 항-SSEA-4 탄수화물 항체에 관한 것이다. Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여에 의해 유도된 T 세포 비활성화를 상승적으로 구제하기 위해 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 조합하여 항-Globo H 또는 항-SSEA-4 탄수화물 항체의 동시-투여의 근거에 대한 결과가 제공된다. 본 개시는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 조합하여 항-Globo H 또는 항-SSEA-4 탄수화물 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
여러 표면 탄수화물은 악성 종양 세포에서 발현된다. 예를 들어, 탄수화물 항원 Globo H(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)는 세라마이드-결합된 당지질로서 최초로 단리되고, 1984년에 유방암 MCF-7 세포로부터 동정되었다[Bremer E G, et al. (1984) J Biol Chem 259:14773-14777]. 이전 연구에서는 또한 Globo H 및 단계-특이적 배아 항원 3(Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)(SSEA-3, Gb5로도 불리워짐)이 유방암 세포 및 유방암 줄기 세포에서 관찰된 것으로 나타났다[WW Chang et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11667-11672]. 또한, SSEA-4(단계-특이적 배아 항원-4)(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)는 다능성 인간 배아 줄기 세포에 대한 세포 표면 마커로서 일반적으로 사용되고 있고, 중간엽 줄기 세포를 단리시키고 신경 전구 세포를 풍부하게 하는데 사용되었다[Kannagi R et al. (1983) EMBO J, 2:2355-2361]. 이러한 발견은, Globo 시리즈 항원(Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4)이 암 치료법을 위한 독특한 타겟이고, 치료제를 타겟화 암세포로 효과적으로 유도하기 위해 사용될 수 있음을 지지한다.
프로그램 사멸 1(PD-1)은 T 세포, B 세포, 또는 단핵구 상에서 발현된 억제 수용체이다[Ishida et al. (1992) EMBO J. 11: 3887-2895; Agata et al. (1996) Int. Immunol. 8: 765-772]. PD-L1 및 PD-L2는 PD-1에 결합 시에 T 세포 활성화 및 시토카인 분비를 하향조절하는 것으로 확인된 PD-1에 대한 리간드이다[Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8]. PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2의 참여는 면역 반응의 하향-조절을 초래한다. 이에 따라, PD-1/PD-L1 경로의 차단은 암에 대한 중추 및 말초 면역 반응을 약화시키는 것으로 제한되었다. PD-1 및 PD-L1 경로를 타겟화하는 것은 흑색종, 비소세포 폐암(NSCLC), 신세포 암종(RCC), 방광 암종 및 호지킨 림프종을 포함하는 15개를 초과하는 암 타입에서 임상 효능을 나타낸다[Sharma et al. (2015) Science 348(6230):56-61]. 그러나, 여전히 많은 환자가 반응하지 않는다. 일부 환자는 초기 반응을 나타내었지만 시간에 따라 내성을 획득한다. 이에 따라, 병용 요법에 대한 내성의 메커니즘을 확인하는 필요성이 시급하다.
Globo H 세라마이드는 종양 미세환경으로 흘러 들러가는 것으로 확인되었다. 면역 세포에 의한 Globo H 세라마이드의 흡수는 세포 증식 및 시토카인 생산을 억제하는 것으로 보고되었는데, 이는 Globo H 세라마이드가 면역 감시로부터 벗어나는 면역 관문으로서 작용함을 시사하는 것이다[YC Tsai et al. (2013) J Cancer Sci Ther 5: 264-270]. T 세포 활성화를 부정적으로 조절하는 T 세포에 의해 발현된, 넓은 스펙트럼의 공동-수용체, 예를 들어, CTLA4, LAG3, TIGIT 및 TIM3이 존재한다[Sledzinska et al. (2015) Mol Oncol. Dec; 9(10):1936-65].
따라서, 음성 면역 관문의 차단과 조합한 항-Globo H 항체에 의한 Globo H 세라마이드의 고갈은 면역억제를 극복하는 데 효과적일 수 있다. 본 발명자의 발견은, 항-음성 면역 관문 차단으로 Globo 시리즈 항원(Globo H 또는 SSEA-4)의 타겟화가 T 세포 비활성화를 구제하기 위해 공동으로 작용함을 지지한다.
이에 따라, 본 발명의 제1 구현예는 항-Globo H 및/또는 항-SSEA-4 항체 또는 이의 단편 및 면역 관문의 적어도 하나의 억제제를 포함하는 조합물에 관한 것이다. 특별한 특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-음성 면역 관문 항체이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조합물은 하나의 항-Globo-H 및/또는 항-SSEA-4 항체 또는 이의 단편 및 하나의 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 포함한다.
바람직하게는, Globo H 또는 SSEA-4 항체와 병용 요법을 위해 적합한 상기 항체는 키트루다 및/또는 테센트리크로부터 선택된다.
비제한적인 일 구현예에서, 키트루다 및 테센트리크는 하기로부터 얻어진다:
본 발명의 목적을 위해, 항체는 바람직하게는, 뮤린 항체, 재조합 항체, 인간화된 또는 완전 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 특히, 이중특이적 항체, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 항-Globo H 또는 항-SSEA-4 항체 또는 이의 단편 및 면역 관문의 적어도 하나의 억제제인 본 발명의 조합물의 유효 성분은, 또한 각 유효 성분에 대한 상이한 투여 경로에 따라, 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 추가 구현예에 따르면, 조합물의 유효 성분은 동일한 투여 경로를 통해 또는 상이한 투여 경로를 통해, 함께 투여될 수 있거나, 이러한 것은 동일한 투여 경로를 통해 또는 상이한 투여 경로를 통해 별도로 투여될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 항-Globo H 또는 항-SSEA-4 항체 또는 이의 단편은 주사 가능한 형태, 경구 형태, 정제, 캡슐, 용액, 현탁액, 과립 및 오일상 캡슐로 제형화될 수 있는 반면, 면역 관문의 적어도 하나의 억제제는 완충제 수용액 또는 오일상 현탁액과 같이 비경구적으로 제형화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 항-Globo-H 또는 SSEA-4 항체 또는 이의 단편을 함유한 제형은 매주 또는 1주일에 여러 차례 투여되는 반면, 면역 관문의 적어도 하나의 억제제를 함유한 제형은 비경구 경로를 통해, 바람직하게는, 1주일에 1회 내지 여러 차례 투여된다.
이에 따라, 본 개시는 암에 대한 Globo 시리즈 항원이 미세환경으로 흘러들어가고 T 세포에 도입될 수 있다는 발견을 기초로 한 것이다. T 세포 활성화는 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 도입 후에 억제되었다. T 세포에 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 도입을 억제하기 위해 항-Globo H 항체 또는 항-SSEA-4 항체를 첨가하면, Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드 유도된 면역억제가 억제될 수 있다. PD-1/PD-L1 참여는 TCR 신호전달 경로를 억제하였다. T 세포에 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드를 첨가하면, TCR 신호전달이 추가로 억제된다. Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 도입은 TCR 신호전달의 활동 효과(exertion effect)를 감소시켰는데, 이는 PD-1/PD-L1 참여에 의한 억제를 차단하기 위한 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 결과이다(즉, 면역 관문 효과). 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 함께 항-Globo H 항체 또는 항-SSEA-4 항체를 첨가하면, Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여에 의해 억제된 TCR 신호전달이 상승적으로 역전된다. Globo H 또는 SSEA-4 항원을 발현시키는 암은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교아세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담도암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 대장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협측암, 구인두암, 후두암 및 전립선암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일 양태에서, 본 개시는 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 치료학적 유효량의 항-음성 면역 관문 항체와 조합하여 항-Globo 시리즈 항원 항체를 포함하는 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, Globo 시리즈 항원은 단계-특이적 배아 항원-4(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1), 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3; Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1) 또는 Globo H(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)이다.
일 구현예에서, 면역 관문 항원 분자는 PD-1/PD-L1 항원, CTLA-4(세포독성 T-림프구-연관 단백질 4), LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIGIT(T-세포 면역글로불린 및 면역수용체 트립신-기반 억제 모티프 도메인), Ceacam 1(암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1), LAIR-1(백혈구-연관 면역글로불린-유사 수용체-1) 또는 TIM-3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-3)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 항-Globo 시리즈 항원 항체는 OBI-888 또는 OBI-898이다.
일 구현예에서, 항-음성 면역 관문 작용제는 PD-1/PD-L1 길항제이다.
일 구현예에서, 항-PD-1/PD-L1 항체는 바벤시오(아벨루맙), 옵디보(니볼루맙), 키트루다(펨브롤리주맙), 임핀지(두발루맙) 및/또는 테센트리크(아테졸리주맙)이다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협측암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종, 또는 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 방법은 하나의 항-Globo 시리즈 항원 항체 또는 이의 단편 및 하나의 항-PD-1/PD-L1 항체 또는 이의 단편을 투여하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 항-Globo 시리즈 항원 항체 및/또는 면역 관문의 적어도 하나의 억제제는 뮤린 항체, 재조합 항체, 인간화된 또는 완전 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 특히, 이중특이적 항체로부터 선택된 단일클론 항체 또는 이의 단편이다.
일 구현예에서, 면역 관문의 적어도 하나의 억제제는 항체, 단백질, 소분자 및/또는 si-RNA이다.
일 구현예에서, 항-Globo 시리즈 항원 항체 또는 이의 단편은 표 1 및 표 2에 기술된 서열번호 1 내지 서열번호 108을 포함하는 항-Globo H 항체, 또는 표 6 내지 표 9에 기술된 서열번호 109 내지 서열번호 182를 포함하는 항-SSEA4 항체이다.
일 구현예에서, 면역 관문의 억제제는 항원(PD-1/PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIGIT, Ceacam 1, LAIR-1 또는 TIM-3)에 결합하는 항체 또는 이의 단편이다.
일 구현예에서, 항-Globo 시리즈 항원 항체 또는 이의 단편 및 면역 관문의 적어도 하나의 억제제는 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여된다.
일 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일 구현예에서, 항-음성 면역 관문 차단과 조합하여 Globo 시리즈 항원(Globo H 또는 SSEA-4를 가짐) 항체의 타겟화는 T 세포 비활성화를 구제하고 치료 효능을 개선시키기 위해 공동으로, 부가적으로, 및/또는 상승적으로 작용한다.
일 구현예에서, 치료 효능은 T 세포 비활성화의 구제에 의해 향상된다.
일 구현예에서, 암의 성장 또는 진행은 억제되고/거나 감소된다.
일 구현예에서, 종양 용적은 감소된다.
일 양태에서, 본 개시는 T 세포 비활성화를 구제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 항-음성 면역 관문 항체와 조합하여 항-Globo 시리즈 항원 항체를 포함하는 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 암 성장/진행을 감소 및/또는 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 치료학적 유효량의 항-음성 면역 관문 항체와 조합하여 항-Globo 시리즈 항원 항체를 포함하는 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 항-음성 면역 관문 항체 억제제는 키트루다(펨브롤리주맙), 및/또는 옵디보(니볼루맙)로부터 선택된 항-PD-1 항체, 및 바벤시오(아벨루맙), 임핀지(두발루맙), 및/또는 테센트리크(아테졸리주맙)로부터 선택된 상기 항-PD-L1 항체를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 항-Globo 시리즈 항원 항체 및 항-음성 면역 관문 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 약제 조성물 및 이의 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 보다 완전한 이해는 후속하는 상세한 설명과 함께 고려될 때, 첨부된 도면을 참조하여 얻어질 수 있다. 도면에 예시된 구현예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 의도되는 것으로서, 본 발명의 예시된 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1. 다양한 암 세포로부터 인간 CD3+ T 세포로의 Globo H 또는 SSEA-4의 분비(shedding).
도 2. Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드에 의한 T 세포 활성화의 억제.
도 3. 항-Globo H 항체에 의한 Globo H 세라마이드 유도된 T 세포 비활성화의 역전.
도 4. 항-SSEA-4 항체에 의한 SSEA-4 세라마이드 유도된 T 세포 비활성화의 역전.
도 5. Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드와 PD-1/PD-L1의 참여는 TCR 신호전달에 대한 억제를 향상시킴.
도 6. 감소된 키트루다 또는 테센트리크 방출된 PD-1/PD-L1 참여는 Globo H 세라마이드에 의해 TCR 신호전달을 억제함.
도 7. 감소된 키트루다 또는 테센트리크 방출된 PD-1/PD-L1 참여는 SSEA-4 세라마이드에 의해 TCR 신호전달을 억제함.
도 8. 방출된 Globo H 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여는 키트루다 또는 테센트리크와 조합된 항-Globo H 항체에 의해 TCR 신호전달을 억제함.
도 9. 방출된 SSEA-4 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여는 키트루다 또는 테센트리크와 조합된 항-SSEA-4 항체에 의해 TCR 신호전달을 억제함.
도 10. T 세포 활성를 억제하기 위한 음성 면역 관문 참여와 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 작용 메커니즘의 개략도.
도 11. T 세포 활성을 구제하기 위한 항-음성 면역 관문 항체와 항-Globo H 항체 또는 항-SSEA-4 항체의 작용 메커니즘의 개략도.
도 1. 다양한 암 세포로부터 인간 CD3+ T 세포로의 Globo H 또는 SSEA-4의 분비(shedding).
도 2. Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드에 의한 T 세포 활성화의 억제.
도 3. 항-Globo H 항체에 의한 Globo H 세라마이드 유도된 T 세포 비활성화의 역전.
도 4. 항-SSEA-4 항체에 의한 SSEA-4 세라마이드 유도된 T 세포 비활성화의 역전.
도 5. Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드와 PD-1/PD-L1의 참여는 TCR 신호전달에 대한 억제를 향상시킴.
도 6. 감소된 키트루다 또는 테센트리크 방출된 PD-1/PD-L1 참여는 Globo H 세라마이드에 의해 TCR 신호전달을 억제함.
도 7. 감소된 키트루다 또는 테센트리크 방출된 PD-1/PD-L1 참여는 SSEA-4 세라마이드에 의해 TCR 신호전달을 억제함.
도 8. 방출된 Globo H 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여는 키트루다 또는 테센트리크와 조합된 항-Globo H 항체에 의해 TCR 신호전달을 억제함.
도 9. 방출된 SSEA-4 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여는 키트루다 또는 테센트리크와 조합된 항-SSEA-4 항체에 의해 TCR 신호전달을 억제함.
도 10. T 세포 활성를 억제하기 위한 음성 면역 관문 참여와 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 작용 메커니즘의 개략도.
도 11. T 세포 활성을 구제하기 위한 항-음성 면역 관문 항체와 항-Globo H 항체 또는 항-SSEA-4 항체의 작용 메커니즘의 개략도.
본 개시는 암 환자를 치료하기 위한 항-PD-1 또는 PD-L1 항체와 조합한 항-Globo H 또는 항-SSEA-4 항원 항체에 관한 것이다.
이에 따라, 본 개시는 암에 대한 Globo 시리즈 항원이 미세환경으로 분비되고 T 세포에 도입될 수 있다는 발견을 기초로 한 것이다. T 세포 활성화는 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 도입 후에 억제되었다. T 세포에 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 도입을 억제하기 위한 항-Globo H 항체 또는 항-SSEA-4 항체의 첨가는 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드 유도된 면역억제를 억제할 수 있다. PD-1/PD-L1 참여는 TCR 신호전달 경로를 억제하였다. T 세포에 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 첨가는 TCR 신호전달을 추가로 억제한다. Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 도입은 TCR 신호전달의 활동 효과를 감소시켰는데, 이는 PD-1/PD-L1 참여(즉, 면역 관문 효과)에 의한 억제를 차단하기 위한 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 결과이다. 항-Globo H 항체 또는 항-SSEA-4 항체와 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 첨가는 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여에 의해 억제된 TCR 신호전달을 상승적으로 역전시킨다. Globo H 또는 SSEA-4 항원을 발현시키는 암은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교아세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담도암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 대장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협측암, 구인두암, 후두암 및 전립선암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 물질로서 규정된다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성"은 면역 반응을 유발할 수 있는 면역원, 항원, 또는 백신의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자의 부분으로서 규정된다.
본원에서 사용되는 용어 "백신"은 유기체가 유발하는 질환에 대한 면역을 부여하기 위해 사용되는, 전체 질병-유발 유기체(사멸 또는 약화) 또는 이러한 유기체의 성분, 예를 들어, 단백질, 펩타이드, 또는 다당류로 이루어진, 항원을 함유한 제제를 지칭한다. 백신 제제는 천연, 합성 또는 재조합 유래 제제 중 어느 하나를 포함하거나 배제할 수 있다. 재조합 유래 제제는 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 수득될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 특이적"은 특정 항원, 또는 항원의 단편의 공급이 특정 세포 증식을 초래하는 세포 집단의 성질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "CD1d"는 다양한 인간 항원-제시 세포의 표면 상에서 발현된 당단백질의 CD1(분화 클러스터 1) 패밀리의 구성원을 지칭한다. CD1d 제시 지질 항원은 자연 살해 T 세포를 활성화시킨다. CD1d는 당지질 항원이 결합하는 깊은 항원-결합 홈(groove)를 갖는다. 수지상 세포 상에서 발현되는 CD1d 분자는 C34와 같은 GalCer 유사체를 포함하는 당지질에 결합하고 제시할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "글리칸"은 다당류, 또는 올리고사카라이드를 지칭한다. 글리칸은 또한, 본원에서, 다당류, 또는 올리고사카라이드를 지칭한다. 글리칸은 또한, 본원에서 당단백질, 당지질, 당펩타이드, 당프로테옴, 펩티도글리칸, 지질다당류, 또는 프로테오글리칸과 같은 당컨쥬게이트의 탄수화물 부분을 지칭하기 위해 사용된다. 글리칸은 대개 단당류들 사이의 O-글리코시드 결합으로만 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로오스는 ß-1,4-결합된 D-글루코오스로 이루어진 글리칸(또는 더욱 상세하게는, 글루칸)이며, 키틴은 ß-1,4-결합된 N-아세틸-D-글루코사민으로 이루어진 글리칸이다. 글리칸은 단당류 잔기의 호모폴리머 또는 헤테로폴리머일 수 있고, 선형이거나 분지될 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착되는 것으로 확인될 수 있다. 이러한 것은 일반적으로, 세포의 외부 표면 상에서 발견된다. O- 및 N-결합된 글리칸은 진핵 생물에서 매우 일반적인 것이지만, 덜 일반적이지만, 원핵 생물에서도 발견될 수 있다. N-결합된 글리칸은 세쿠온에서 아스파라긴의 R-기 질소(N)에 부착되는 것으로 확인된다. 세쿠온은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 여기서, X는 프랄린을 제외한 임의의 아미노산이다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은 결합쌍(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 상호작용을 지칭한다. 다양한 경우에, 특이적으로 결합한다는 것은 약 10-6 mol/리터, 약 10-7 mol/리터, 또는 약 10-8 mol/리터 또는 그 미만의 친화력 상수에 의해 구현될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유세포 분석법" 또는 "FACS"는 광학 및 전자 검출 디바이스를 통해, 유체 스트림에 현탁된 입자 또는 세포의 물리적 및 화학적 성질을 시험하기 위한 기술을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 글리코엔자임(glycoenzyme)은 globo시리즈 생합성 경로에서 적어도 부분적으로 효소를 지칭한다. 예시적인 글리코엔자임은 알파-4GalT; 베타-4GalNAcT-I; 또는 베타-3GalT-V 효소를 포함한다.
"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/거나 회수된 것이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질함유 또는 비단백질함유 용질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 예를 들어, 로우리 방법(Lowry method)에 의해 결정한 경우 95 중량% 초과의 항체 및 일부 구현예에서, 99 중량% 초과까지, (2) 예를 들어, 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하는 데 충분한 정도까지, 또는 (3) 예를 들어, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용한 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 동질성까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경 중의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내에 인시튜로 항체를 포함한다. 그러나, 일반적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 상호 교환 가능하게 사용되는 용어 "지지체" 또는 "기질"은 하나 또는 복수의 성분을 포함하는, 물질 또는 물질의 그룹을 지칭하는 것이며, 이와 함께 하나 이상의 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나, 부착되거나, 합성되거나, 연결되거나, 달리 회합된다. 지지체는 생물학적, 비-생물학적, 무기, 유기 또는 이들의 조합인 물질로부터 구성될 수 있다. 지지체는 특정 구현예 내에서 이의 사용을 기초로 하여 임의의 적절한 크기 또는 구성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "타겟"은 검정 내에서 고려되는 종을 지칭한다. 타겟은 자연 발생적이거나 합성, 또는 조합일 수 있다. 타겟은 변경되지 않거나(유기체 또는 이의 샘플 내에서 직접적으로 사용되거나) 검정을 위한 적절한 방식으로 변경될 수 있다(예를 들어, 정제, 증폭, 여과될 수 있다). 타겟은 특정 검정 내에서 결합 구성원에 대한 적합한 수단을 통해 결합될 수 있다. 타겟의 비제한적인 예는 항체 또는 이의 단편, 세포막 수용체, 단일클론 항체 및 특정 항원 결정인자(예를 들어, 바이러스, 세포 또는 다른 물질 상에서)와 반응성인 항혈청제, 약물, 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 펩타이드, 보조인자, 당, 렉틴 다당류, 세포, 세포막, 및 세포기관을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 타겟은 검정에 따라 임의의 적합한 크기를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 구 "실질적으로 유사한," "실질적으로 동일한," "동등한," 또는 "실질적으로 동등한"은, 당업자가 2개의 값 간의 차이가 상기 값(예를 들어, Kd 값, 항-바이러스 효과, 등)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 없거나 전혀 없다는 것으로 고려한 것으로, 2개의 수치 값(하나는 분자와 관련되며, 다른 하나는 기준/대조군 분자와 관련되어 있음) 간에 충분히 높은 유사성의 정도를 나타낸다. 상기 두 값의 차이는 기준/대조군 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 및/또는 약 10% 미만이다.
이에 따라, 본 발명의 항암 항체는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역과 조합하여, 본 발명의 항체에 도입될 수 있는, 비-뮤린 기원, 바람직하게는, 인간 기원의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이의 임의의 부분을 포함한다.
본 발명의 항체는 시험관내, 인시튜 및/또는 생체내에서 적어도 하나의 Globo-H 및/또는 SSEA-4 발현 암 세포 활성을 조절, 감소, 길항, 완화, 경감, 차단, 억제, 폐지 및/또는 방해할 수 있다.
본 발명의 항체는 본원에 기술된 바와 같이, 2C2(ATCC 수탁번호: PTA-121138로 기탁됨)로 지정된 하이브리도마, 3D7(ATCC 수탁번호: PTA-121310으로 기탁됨)로 지정된 하이브리도마, 7A11(ATCC 수탁번호: PTA-121311로 기탁됨)로 지정된 하이브리도마, 2F8(ATCC 수탁번호: PTA-121137로 기탁됨)로 지정된 하이브리도마, 또는 1E1(ATCC 수탁번호: PTA-121312로 기탁됨)로 지정된 하이브리도마에 의해 생성된 항체로부터 유도된, 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 리간드 결합 부분의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 항체는 항체 단편, 항체 변이체, 단일클론 항체, 다클론 항체, 및 재조합 항체, 등을 포함한다. 항체는 마우스, 토끼 또는 인간에서 발생될 수 있다.
용어 "항체"는 항체 미메틱 또는, 단일 사슬 항체 및 이의 단편을 포함하는, 항암 항체의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분 또는 이의 특정 단편 또는 부분을 포함하는 항체, 소화 단편, 이의 특정 부분 및 변이체를 포함하도록 추가로 의도되며, 이들 각각은 본 발명의 항암 항체로부터 유도된 적어도 하나의 CDR을 함유한다.
예를 들어, 기능성 단편은 암 세포를 발현시키는 Globo-H에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, Fab(예를 들어, 파파인 소화에 의한), Fab'(예를 들어, 헵신 소화 및 부분 환원에 의한) 및 F(ab')2(예를 들어, 펩신 소화에 의한), facb(예를 들어, 플라스민 소화에 의한), pFc'(예를 들어, 펩신 또는 플라스민 소화에 의한), Fd(예를 들어, 펩신 소화, 부분 환원 및 재구성에 의한), Fv 또는 scFv(예를 들어, 분자 생물학 기술에 의한) 단편을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 Globo-H 발현 암 세포 또는 이의 부분에 결합할 수 있는 항체 단편은 본 발명에 포함된다(예를 들어, [Colligan, Immunology, 전술됨] 문헌 참조).
항체의 항원-결합 부분은 탄수화물 항원(예를 들어, Globo H, SSEA-4)에 특이적으로 결합하는 항체의 부분을 포함할 수 있다.
본 발명의 인간화된 항체는 항체가 이의 본래 결합 능력을 유지하면서 인강 항체와 더욱 밀접하게 닮도록 비-항원 결합 영역(및/또는 항원-결합 영역)에서의 아미노산 서열이 변경된 비-인간 종으로부터의 항체이다.
인간화된 항체는 항원 결합과 직접적으로 관련되지 않은 가변 영역의 서열을 인간 가변 여역으로부터의 동등한 서열로 대체함으로써 생성될 수 있다. 그러한 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나로부터의 가변 영역 모두 또는 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 단리, 조작, 및 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 핵산의 소스는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 인간화된 항체를 인코딩하는 재조합 DNA, 또는 이의 단편은 이후에 적절한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
본 발명의 인간화된 항체는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체가 수득된 직후에, 가변 영역은 시퀀싱될 수 있으며, CDR 및 프레임워크 잔기의 위치가 결정된다[Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917]. 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 선택적으로, 상응하는 불변 영역에 결찰되고, 이후에 적절한 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. CDR-이식된 항체 분자는 CDR-이식 또는 CDR 치환에 의해 생성될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 1개, 2개, 또는 모든 CDR이 대체될 수 있다. 예를 들어, 특정 항체의 모든 CDR은 비-인간 동물(예를 들어, 마우스, 예를 들어, CDR)의 적어도 부분으로부터 비롯될 수 있거나, CDR의 단지 일부만이 대체될 수 있다. 사전결정된 탄수화물 항원에 항체를 결합시키기 위해 필요한 CDR을 유지하는 것이 유일하게 필요하다[예를 들어, Globo H). Morrison, S. L., 1985, Science, 229:1202-1207. Oi et al., 1986, BioTechniques, 4:214. 미국특허 제5,585,089호; 제5,225,539호; 제5,693,761호 및 제5,693,762호. EP 519596호. Jones et al., 1986, Nature, 321:552-525. Verhoeyan et al., 1988, Science, 239:1534. Beidler et al., 1988, J. Immunol., 141:4053-4060].
또한, 본 발명에는 인간, 토끼, 양, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 돼지, 원숭이, 유인원, 고릴라, 침팬지, 오리, 거위, 닭, 양서류, 파충류 및 다른 동물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 적어도 하나의 상이한 종으로부터의 서열에 의해 대체된 다른 영역을 갖는, 본원에 개시된 바와 같은 1 또는 2개의 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 포함된다.
키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유도된 분자이다. 예를 들어, 항체는 뮤린 mAb로부터 유도된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 함유할 수 있다. 키메라 항체는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다[Morrison, et al., Proc Natl Acad Sci, 81:6851-6855 (1984)]. 예를 들어, 뮤린(또는 다른 종) 항체 분자를 인코딩하는 유전자는 뮤린 Fc를 인코딩하는 영역을 제거하기 위해 제한 효소로 소화되며, 인간 Fc 불변 영역을 인코딩하는 유전자의 동등한 부분은 이후에 재조합 DNA 분자로 치환된다. 키메라 항체는 또한, 뮤린 V 영역을 인코딩하는 DNA가 인간 불변 영역을 인코딩하는 DNA에 결찰될 수 있는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다[Better et al., Science, 1988, 240:1041-1043. Liu et al. PNAS, 1987 84:3439-3443. Liu et al., J. Immunol., 1987, 139:3521-3526. Sun et al. PNAS, 1987, 84:214-218. Nishimura et al., Canc. Res., 1987, 47:999-1005. Wood et al. Nature, 1985, 314:446-449. Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 1988, 80:1553-1559. 국제특허출원 WO1987002671호 및 WO 86/01533호. 유럽특허출원 제184,187호; 제171,496호; 제125,023호; 및 제173,494호. 미국특허 제4,816,567호].
항체는 전장일 수 있거나, Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 단쇄 Fv(scFv), 이가 scFv(bi-scFv), 삼가 scFv(tri-scFv), Fd, dAb 단편(예를 들어, Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)), 단리된 CDR, 이중체, 삼중체, 사중체, 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 항원-결합 부분을 갖는 항체의 단편(또는 단편들)을 포함할 수 있다. 재조합 방법, 또는 합성 링커를 이용하여 항체 단편을 결합시킴으로서 생성된 단쇄 항체가 또한, 본 발명에 포함된다[Bird et al. Science, 1988, 242:423-426. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:5879-5883].
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 단일특이적, 이중-특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 또흔 이중-특이적 항체 또는 이의 단편은 하나의 타겟 탄수화물의 상이한 에피토프(예를 들어, Globo H)에 대해 특이적일 수 있거나, 하나 초과의 타겟 탄수화물에 대해 특이적인 항원-결합 도메인(예를 들어, Globo H 및 SSEA-4에 대해 특이적인 항원-결합 도메인)을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하며, 여기서, 각 가변 도메인은 별도의 탄수화물 항원에 또는 동일한 탄수화물 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다[Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69. Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244]. 본 항체는 다른 기능성 분자, 예를 들어, 다른 펩타이드 또는 단백질에 결합되거나 이와 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 제2 결합 특이성을 갖는 이중-특이적 또는 다중특이적 항체를 생성하기 위해 다른 항체 또는 항체 단편과 같은 하나 이상의 다른 분자 독립체에 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합, 등에 의해) 기능적으로 결합될 수 있다. 다중특이적 또는 이중-특이적 항체 또는 이의 단편은 하나의 타겟 탄수화물(예를 들어, Globo H)의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 하나 초과의 타겟 탄수화물에 대해 특이적인 항원-결합 도메인(예를 들어, Globo H 및 SSEA-4에 대해 특이적인 항원-결합 도메인)을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하며, 여기서, 각 가변 도메인은 별도의 탄수화물 항원에 또는 동일한 탄수화물 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.[Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69. Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244].
본 발명의 항체는 다른 기능성 분자, 예를 들어, 다른 펩타이드 또는 단백질에 결합되거나 이와 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 제2 결합 특이성을 갖는 이중-특이적 또는 다중특이적 항체를 생성하기 위해 다른 항체 또는 항체 단편과 같은 하나 이상의 다른 분자 독립체에 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합, 등에 의해) 기능적으로 결합될 수 있다.
항체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDR로 지칭되는, 3개의 초가변 영역에 의해 중단된 프레임워크 영역(FW)을 포함한다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하기 구조를 가질 수 있다:
리더 서열-FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-
여기서, 본 발명의 FW1, FW2, FW3, CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이 개시된다.
또한, 본 발명의 범위 내에는 특정 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 포함된다. 예시적 구현예에서, 이러한 변경(즉, 보존적 치환, 보존적 결실 또는 보존적 부가)은 이펙터 기능 또는 결합 친화력과 같은 펩타이드의 생물학적 성질에 대한 실질적인 효과를 가지지 않는다. 보존적 또는 비-보존적인 것으로서 아미노산 변경을 분류하기 위해, 아미노산은 하기와 같이 그룹화될 수 있다: 소수성, 중성, 산성, 및 염기성. 보존적 치환은 동일한 그룹에서 아미노산 간의 치환을 포함한다. 비-보존적 치환은 이러한 그룹 중 하나의 구성원을 다른 그룹의 구성원으로 교환하는 것을 구성한다. 문헌[Ng et al. (Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2006. 7:61-80]에는 당업자가 단백질 기능을 변경시키지 않으면서, 아미노산 치환을 예측하고 선택할 수 있는 다양한 아미노산 치환(AAS) 예측 방법의 개요가 제공된다.
다른 예시적인 구현예에서, 항체는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 결합 친화력을 개선하기 위해, CDR에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 선택된 적은 수의 수용체 프레임워크 잔기는 상응하는 공여체 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 공여체 프레임워크는 성숙 또는 생식 계열 인간 항체 프레임워크 서열 또는 공통 서열일 수 있다. 표현형으로 사일런트 아미노산 치환을 수행하는 방법과 관련된 지침은 문헌[Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990). Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989). Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994). T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992)]에 제공되어 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본원에 기술된 아미노산 치환은 Kabat 넘버링 식에 해당하는 위치에서 일어난다[예를 들어, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)].
본원에서 사용되는 "정상 수준"은 예를 들어, 정상 환자 또는 정상 환자의 집단으로부터의 샘플에서 TACA 결합된 항체의 수준의 측정을 기준으로 한 기준 값 또는 범위일 수 있다. "정상 수준"은 또한, 예를 들어, 정상 환자 또는 정상 환자의 집단으로부터의 샘플에서 TACA의 측정을 기준으로 한 기준 값 또는 범위일 수 있다.
본원에서 사용되는 "대상체"는 포유동물이다. 이러한 포유동물은 가축, 농장 동물, 실험에서 사용되는 동물, 동물원 동물, 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
용어 "Globo시리즈-관련 장애"는 경로의 비정상적인 기능 또는 제시에 의해 통상적으로 특징화되거나 기여하는 장애를 지칭하거나 이러한 장애를 기술한다. 이러한 장애의 예는 암을 포함하는 과다증식성 질병을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 과다증식성 질병 및/또는 질환의 예는 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담도암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암 및 전립선암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 신생물/과형성 및 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 뇌암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암, 또는 췌장암이다. 다른 구현예에서, 과다증식성 질환 상태는 유방, 난소, 폐, 췌장, 복부(위), 대장, 전립선, 간, 자궁경부, 식도, 뇌, 입, 및 신장과 관련되어 있다.
일 구현예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 치료에서 항신생물제의 치료 효능을 결정하는 방법으로서, (a) 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 대상체로부터 수집된 샘플을 접촉시키는 단계; (c) 종양 관련 항원(TACA) 또는 항체 중 하나 이상의 결합을 검정하는 단계; 및 (d) 글리칸 검출의 검정된 값을 기초로 하여 신생물에 대한 치료에서 항신생물제의 치료 효과를 결정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시는 암의 검출에서 링커-당컨쥬게이트(예를 들어, Globo H)의 병용 사용의 놀라운 부가적 및/또는 상승적 효능 및 유용성의 증거를 제공한다. 이는 본원의 링커 및 컨쥬게이트가 Globo시리즈 당단백질과 관련된 결정인자 및 분자를 타겟으로 하는 임의의 치료제에 대한 동반 진단 조성물 및 방법으로서 유용한 베이스(base)를 제공한다. 본 개시와 조합하여 사용하기에 적합한 항신생물제를 포함하는 예시적인 치료 방법 및 조성물은 예를 들어, 특허공개문 WO2015159118호, WO2014107652호 및 WO2015157629호의 개시에 기술된다(예를 들어, OBI-822, OBI-833 및 OBI-888). 각 문헌의 내용은 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적 결합"은 결합쌍(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 상호작용을 지칭한다. 다양한 경우에, 특이적 결합은 약 10-6 mol/리터, 약 10-7 mol/리터, 또는 약 10-8 mol/리터, 또는 그 미만의 친화력 상수로 구현될 수 있다.
본원에서 사용되는 구 "실질적으로 감소된," 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 2 값 간의 차이가 상기 값(예를 들어, Kd 값)에 의해 특정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 통계적 유의성이 있는 것으로 고려되도록 2개의 수치 값(일반적으로 하나는 분자와 관련이 있으며, 다른 하나는 기준/대조군 분자와 관련이 있음) 간에 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2 값 간의 차이는 기준/대조군 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 및/또는 약 50% 초과이다.
본원에서 사용되는 "결합 친화력"은 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 간의 전체 비공유 상호작용의 합의 강도를 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 "결합 친화력"은 결합쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화력을 지칭한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화력은 일반적으로, 해리 상수(Kd)로 표현될 수 있다. 친화력은 본원에 기술된 것을 포함하는, 당해 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화력 항체는 일반적으로, 항원에 서서히 결합하고, 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화력 항체는 일반적으로, 항원에 더 빠르게 결합하고, 더 오랫 동안 결합을 유지하는 경항이 있다. 결합 친화력을 측정하는 다양한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정의 예시적인 구현예는 하기에 기술된다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 검정에 의해 기술된 바와 같이 고려되는 Fab 버젼의 항체 및 이의 항원으로 수행된 방사성 표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화력은 표지되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재 하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형상태로 만들고 이후에 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다[Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]. 검정을 위한 조건을 설정하기 위해, 미세적정 플레이트(Dynex)를 50 mM 나트륨 카보네이트(pH 9.6) 중 5 ㎍/mL의 포집 항-Fab 항체(Cappel Labs)로 밤새 코팅시키고, 후속하여, 실온(대략 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 PBS 중 2%(w/v) 우혈청알부민로 차단한다. 비-흡착성 플레이트(Nunc, Cat #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 고려되는 Fab의 일련 희석으로 혼합한다[예를 들어, 문헌[Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서, 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함]. 고려되는 Fab를 이후에 밤새 인큐베이션한다. 그러나, 인큐베이션은 평형상태에 도달하도록 더 긴 기간(예를 들어, 65시간) 동안 지속할 수 있다. 이후에, 혼합물을 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션을 위해 포집 플레이트로 옮긴다. 용액을 이후에 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1% 트윈-20으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조하였을 때, 150 ㎕/웰의 섬광제(scintillant)(MicroScint-20; Packard)를 첨가하며, 플레이트를 10분 동안 Topcount 감마 카운터(Packard) 상에서 카운팅한다. 20% 이하의 최대 결합을 제공하는 각 Fab의 농도는 경쟁적 결합 검정에서 사용하기 위해 선택된다. 다른 구현예에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 이용한 표면 플라스몬 공명 검정을 이용하여 측정하며, 약 10 반응 유닛(RU)에서 항원 CM5 칩이 고정된다. 간단하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센스 칩(CM5, BIAcore Inc.)을 공급업체의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원은 대략 10 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유량으로 주사하기 전에 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8로, 5 ㎍/mL(약 0.2 μM)까지 희석한다. 항원의 주사 후에, 미반응된 그룹을 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주사한다. 각 실험에서, 스폿(spot)을 활성화시키고, 단백질을 고정화하지 않으면서 에탄올아민을 차단하여, 기준 감산을 위해 사용하였다. 동력학 측정을 위해, 2배 일련 희석의 Fab(0.78 nM 내지 500 nM)를 25℃에서 대략 25 ㎕/분의 유량으로 PBS 중 0.05% Tween 20(PBST)과 함께 주사한다. 결합 속도((kon) 및 해리 속도(koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 이용하여 계산한다. 평형상태 해리 상수(Kd)를 koff/kon의 비율로서 계산한다[예를 들어, 문헌[Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881] 참조]. 온-레이트(on-rate)가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 정지-유동 장착된 분광계(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳과 함께 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계(ThermoSpectronic)와 같은 분광계에서 측정한 경우 증가하는 농도의 항원의 존재 하에서, PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 세기(여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한, 고정된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 이용하여 상술된 것과 동일한 표면 플라스몬 공명 기술로 결정될 수 있거나, 본 발명에 따른 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한, 공급업체 설명서에 따라 동일한 표면 플라스몬 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 결정될 수 있다. 대략 10 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유량으로 주사 전에 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8로, 5 ㎍/mL(약 0.2 μM)까지 희석한다. 항원의 주사 후에, 미반응된 그룹을 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주사한다. 동력학 측정을 위해, 2배 일렬 희석의 Fab(0.78 nM 내지 500 nM)를 25℃에서 대략 25 ㎕/분의 유량으로 0.05% Tween 20을 갖는 PBS(PBST) 중에서 주사한다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단수 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 이용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산한다. 평형상태 해리 상수(Kd)를 비율 koff/kon으로서 계산하였다[예를 들어, 문헌[Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881] 참조]. 그러나, 온-레이트가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 분광계, 예를 들어, 정지-유동 장착 분광계(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 구비한 8000-series SLM-Aminco 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정한 경우 증가하는 농도의 항원의 존재 하에서 PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 세기(여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 결합된 다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭하도록 의도된다. 한 타입의 벡터는 "플라스미드"인데, 이는 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 타입의 벡터는 파지 벡터이다. 다른 타입의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서, 추가 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이러한 것이 도입되는 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포내에 도입 시에 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순하게, "재조합 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태를 갖는다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문에 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
"폴리뉴클레오타이드," 또는 "핵산"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되는 것으로서, 이는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의해 또는 합성 반응에 의해 폴리머에 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다.
본원에서 사용되는 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 통상적으로 길이가 약 200 뉴클레오타이드인 짧은, 단일 가닥, 합성 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 배타적인 것은 아니다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오타이드에 동일하게 그리고 전체적으로 적용 가능하다.
본원에서 사용되는 "항체"(Ab) 및 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체가 특정 학원에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 일반적으로 항원 특이성이 결여된 항체 및 다른 항체-유사 분자 둘 모두를 포함한다. 후자 부류의 폴리펩타이드는 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 수준으로 및 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다.
본원에서 사용되는 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미로 상호 교환 가능하게 사용되고, 단일클론 항체(예를 들어, 전장 또는 온전한 단일클론 항체), 다클론 항체, 일가, 다가 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한, 본원에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 특정 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화된, 및/또는 친화력 성숙될 수 있다.
본원에서 사용되는 항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 대부분의 가변 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.
본원에서 사용되는 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 간에 서열에 있어서 광범위하게 상이하고, 이의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균일하게 분포되는 것은 아니다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 상보성-결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역으로 불리워지는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 높게 보존된 부분은 프레임워크(FR)로 불리워진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 베타-시트 구조를 연결시키고 일부 경우에 이의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된, 거의 베타-시트 구성을 채택하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 사슬에서 CDR은 FR 영역에 의해 함께 밀접하게 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다[Kabat et al., Sequences of Protein of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) 참조]. 불변 도메인은 항원에 항체를 결합하는 데 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예를 들어, 항체-의전 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리워지는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성하며, 각각은 단일 항원-결합 부위, 및 잔류 "Fc" 단편을 가지며, 이의 명칭은 용이하게 결정화하는 이의 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유한 최소 항체 단편이다. 2-사슬 Fv 종에서, 이러한 영역은 단단한 비-공유 결합에서, 하나의 중쇄- 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 다이머로 이루어진다. 단쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄- 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-사슬 Fv 종에서와 유사한 "다이머" 구조로 결합하도록 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유 결합될 수 있다. 이러한 구성에서 VH-VL 다이머의 표면 상에서 항원-결합 부위를 규정하기 위해 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용한다. 총괄적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)는 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖지만, 전체 결합 부위보다 낮은 친화력을 갖는다.
Fab 단편은 또한, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에서 수 개의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올 기를 지닌 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래, 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 알려져 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리워지는, 2개의 명확하게 구별되는 타입 중 하나로 지정될 수 있다.
이의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체(면역글로불린)는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5개의 주요 부류의 면역글로불린, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 수 개는 하위부류(아이소형), IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린(불린으로 불리워짐)에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 상이한 부류로 지정될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린의 5개의 3차원 구성이 널리 알려져 있고, 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 기술되어 있다. 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 항체의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체," "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호 교환 가능하게, 하기에서 규정된 바와 같은 항체 단편이 아닌 이의 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 용어는 특히, Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "항체 단편"은 온전한 항체의 단지 부분을 포함하며, 여기서, 이러한 부분은 온전한 항체에 존재할 때 그러한 부분과 일반적으로 관련된 기능 중 적어도 하나, 및 최대한 최대 또는 모두를 보유한다. 일 구현예에서, 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 이에 따라, 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 다른 구현예에서, 항체 단편, 예를 들어, Fc 영역을 포함하는 것은 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합과 같은, 온전한 항체에 존재할 때 Fc 영역과 일반적으로 관련된 생물학적 기능 중 적어도 하나를 보유한다. 일 구현예에서, 항체 단편은 온전한 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 일가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 이에 따라, 수식어 "단일클론"은 별개의 항체들의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 이러한 단일클론 항체는 통상적으로, 타겟을 결합시키는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서, 타겟-결합 폴리펩타이드 서열은 복수의 폴리펩타이드 서열로부터 단일 타겟 결합 폴리펩타이드 서열의 선택을 포함하는 공정에 의해 수득되었다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 천연 서열을 배제할 수 있다. 일부 양태에서, 선택 공정은 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀과 같은, 복수의 클론으로부터 독특한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 타겟 결합 서열이 예를 들어, 타겟에 대한 친화력을 개선시키고, 타겟 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양물에서 이의 생산을 개선시키고, 생체내에서 이의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체, 등을 생성시키기 위해 추가로 변경될 수 있으며, 변경된 타겟 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 단일클론 항체인 것으로 이해되어야 한다. 통상적으로 상이한 결정인자(예를 들어, 에피토프)와 관련된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와는 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 관한 것이다. 이의 특이성 이외에, 단일클론 항체 제제는 통상적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득되는 것으로서 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 필요로 하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법(예를 들어, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제4,816,567호 참조), 파지 디스플레이 기술(예를 들어, Clackson et al., Nature, 352: 624-628(1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성시키기 위한 기술(예를 들어, WO98/24893호; WO96/34096호; WO96/33735호; WO91/10741호; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258(1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); 미국특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) 참조)을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 단일클론 항체는 상세하게, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 일치하거나 상동성이며 나머지 사슬(들)이 다른 종으로부터 유도되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체를 포함한다[미국특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)].
본 발명의 항체는 또한, 본 발명의 항체로부터 생성된 키메라화된 또는 인간화된 단일클론 항체를 포함한다.
항체는 정장일 수 있거나, Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 단쇄 Fv(scFv), 이가 scFv(bi-scFv), 삼가 scFv(tri-scFv), Fd, dAb 단편(예를 들어, Ward et al, Nature, 341:544-546 (1989)), CDR, 이중체, 삼중체, 사중체, 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 항원-결합 부분을 갖는 항체의 단편(또는 단편들)을 포함할 수 있다. 재조합 방법 또는 합성 링커를 사용하여 항체 단편을 연결시킴으로써 생성된 단쇄 항체가 또한 본 발명에 포함된다[Bird et al. Science, 1988, 242:423-426. Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:5879-5883].
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 단일특이적, 이중-특이적, 또는 다중특이적일 수 있다.
본 발명에는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 또는 IgE(모든 부류 및 하위부류가 본 발명에 포함됨)를 포함하는 모든 항체 아이소형이 포함된다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 포유류(예를 들어, 마우스, 인간) 항체 또는 이의 항원-결합 부분일 수 있다. 항체의 경쇄는 카파 또는 람다 타입일 수 있다.
기준 항체에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%>, 적어도 약 88%>, 적어도 약 89%>, 적어도 약 90%>, 적어도 약 91%>, 적어도 약 92%>, 적어도 약 93%>, 적어도 약 94%>, 적어도 약 95%>, 적어도 약 96%>, 적어도 약 97%>, 적어도 약 98%>, 적어도 약 99%> 또는 약 100%(또는 상기 나열된 값 중 2개 사이의 범위의 임의의 수) 상동성인 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 갖는 항체는 또한, 탄수화물 항원(예를 들어, Globo H, SSEA-4)에 결합할 수 있다. 상동성은 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 수준 중 어느 하나로 제시될 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 기술된 상동성을 갖는 항체의 서열은 자연 발생 항체 서열을 배제할 것이다. 일부 양태에서, 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 기술된 상동성을 갖는 항체의 서열은 자연 발생 항체 서열을 포함할 것이다.
특정 구현예에서, CDR은 서열 변이를 갖는다. 예를 들어, CDR에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 잔기 또는 전체 잔기의 20% 미만, 30% 미만, 또는 약 40% 미만이 치환되거나 결실된 CDR은 탄수화물 항원에 결합하는 항체(또는 이의 항원-결합 부분)에 존재할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 부분은 펩타이드일 수 있다. 이러한 펩타이드는 생물학적 활성, 예를 들어, 탄수화물 항원의 결합을 나타내는 펩타이드의 변이체, 유사체, 오르쏘로그(ortholog), 상동체 및 유도체를 포함할 수 있다. 펩타이드는 아미노산(예를 들어, 비-자연 발생 아미노산, 단지 관련되지 않은 생물학적 시스템에서 자연적으로 발생하는 아미노산, 포유류 시스템으로부터의 변형된 아미노산, 등), 치환된 연결을 갖는 펩타이드뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 변형의 하나 이상의 유사체를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 범위 내에는 특정 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 속한다. 예시적인 구현예에서, 이러한 변경은 결합 친화력에 대한 펩타이드의 생물학적 성질에 대한 실질적인 효과를 갖지 않는다. 다른 예시적인 구현예에서, 항체는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 결합 친화력을 개선하기 위해 프레임워크 영역에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 선택된 적은 수의 수용체 프레임워크 잔기는 상응하는 공여체 아미노산에 의해 교체될 수 있다. 공여체 프레임워크는 성숙 또는 생식 계열 인간 항체 프레임워크 서열 또는 공통 서열일 수 있다. 표현형으로 사일런트 아미노산 치환을 수행하는 방법과 관련된 지침은 문헌[Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990). Cunningham et al, Science, 244: 1081-1085 (1989). Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994). T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992)]에 제공된다.
항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 다른 기능성 분자에 유도체화되거나 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체는 하나 이상의 분자 독립체, 예를 들어, 다른 항체, 검출 가능한 작용제, 세포독성제, 약제학적 작용제, 다른 분자와의 연관을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드(예를 들어, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그), 아미노산 링커, 신호 서열, 면역원성 담체, 또는 단백질 정제에서 유용한 리간드, 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스페라아제, 히스티딘 태그, 및 스타필로코코스 단백질 A에 기능적으로(화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 상호작용, 등에 의해) 연결될 수 있다. 한 타입의 유도체화된 단백질은 둘 이상의 단백질(동일한 타입 또는 상이한 타입)을 가교시킴으로서 생성된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)에 의해 분리된 2개의 구별되는 반응성 기를 갖는 이종이작용성, 또는 동종이작용성(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트)인 것을 포함한다. 이러한 링커는 Pierce Chemical Company(Rockford, 111)로부터 입수 가능하다. 단백질을 유도체화(또는 라벨화)할 수 있는 유용한 검출 가능한 작용제는 형광 화합물, 다양한 효소, 보결단(prosthetic group), 발광 물질, 생체발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 비제한적인, 예시적인 형광 검출 가능한 작용제는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 및 피코에리스린을 포함한다. 단백질 또는 항체는 또한, 검출 가능한 효소, 예를 들어, 알칼리 포스파타아제, 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 베타-갈락토시다아제, 아세틸콜린스테라아제, 글루코오스 옥시다아제, 등으로 유도체화될 수 있다. 단백질은 또한, 보결단(예를 들어, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴)으로 유도체화될 수 있다.
본 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 기능적 활성 변이체를 인코딩하는 핵산이 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 핵산 분자는 중간 엄격성, 높은 엄격성, 또는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 임의의 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산과 혼성화할 수 있다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 지침은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989]에서 확인될 수 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 지칭된 특정 혼성화 조겅은 하기와 같다: 1) 중간 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃에서 6 × SSC, 이후 60℃에서 0.2 × SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척; 2) 높은 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃에서 6 × SSC, 이후 65℃에서 0.2 × SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상의 세척; 및 3) 매우 높은 엄격성 혼성화 조건: 65℃에서 0.5 M 나트륨 포스페이트, 7% SDS, 이후 65℃에서 0.2 × SSC, 1% SDS에서 1회 이상의 세척.
본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산은 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있는 발현 벡터 내로 도입되고, 이후에 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 단리 또는 정제될 수 있다. 선택적으로, 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산은 무세포 번역 시스템에서 번역될 수 있다[미국특허 제4,816,567호, 문헌[Queen et al, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10033 (1989)].
본 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 요망되는 항체의 경쇄 및 중쇄(또는 이의 부분)를 인코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다. 항체는 표준 기술을 이용하여 이러한 배양 상청액 및/또는 세포로부터 단리되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 둘 모두를 인코딩하는 DNA로 형질전환될 수 있다. 재조합 DNA 기술은 또한, 결합을 위해 필수적이지 않은 경쇄 및 중쇄(예를 들어, 불변 영역) 중 어느 하나 또는 둘 모두를 인코딩하는 DN중 일부 또는 모두를 제거하기 위해 이용될 수 있다.
본 핵산은 원핵 세포 및 진핵 세포, 예를 들어, 박테리아 세포(예를 들어, 대장균), 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포를 포함하는 다양한 적합한 세포에서 발현될 수 있다. 다수의 포유류 세포주는 당해 분야에 공지되어 있고, 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 입수 가능한 불멸화 세포주를 포함한다. 세포의 비제한적인 예는 원숭이 신장 세포(COS, 예를 들어, COS-1, COS-7), HEK293, 새끼 햄스터 신장(BHK, 예를 들어, BHK21), 중국 햄스터 난소(CHO), NSO, PerC6, BSC-1, 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), SP2/0, HeLa, Madin-Darby 소 신장(MDBK), 골수종 및 림프종 세포의 부모 세포, 유도체, 및/또는 조작된 변이체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 포유류 기원 또는 포유류-유사 특징의 모든 세포주를 포함한다. 조작된 변이체는 예를 들어, 글리칸 프로파일 변형된 및/또는 부위-특이적 통합 부위 유도체를 포함한다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 하이브리도마 또는 감염체일 수 있다.
대안적으로, 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 당해 분야에 널리 공지된 고체상 절차에 의해 합성될 수 있다[Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach by E. Atherton and R. C. Sheppard, published by IRL at Oxford University Press (1989). Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. W.Pennington and B. M. Dunn), chapter 7. Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984). G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 1 and Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254. M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984)].
비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 인간화된 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 요망되는 특이성, 친화력, 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 1, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 여기서, 초가변 로프 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린 서열의 것에 해당하며, FR 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로, 또한, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 통상적으로, 인간 면역글로불린의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대하여, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)이 참조된다. 또한, 검토 문헌[Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038(1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)] 및 여기에 인용된 참고문헌이 참조된다.
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 본원에서 사용될 때, 서열에서 초가변적이고/거나 구조적으로 규정된 루프(loop)를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역, 즉, VH에서 3개(H1, H2, H3), 및 VL에서 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 다수의 초가변 영역 설명이 사용되고 있고, 본원에 포함된다. Kabat 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성을 기초로 하고, 가장 일반적으로 사용되는 것이다[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]. Chothia는 대신에 구조 루프의 위치를 지칭한다[Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)].
본원에서 사용되는 "프레임워크" 또는 "FW" 잔기는 본원에서 규정된 초가변 영역 잔기와는 다른 가변 도메인 잔기이다.
용어 "Kabat에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이의 변형은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서 항체의 편집(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 여기에 삽입에 상응하여 더 적은 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후 단일 아미노산 삽입물(예를 들어, Kabat에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후 삽입된 잔기(예를 들어, Kabat에 따른 잔기s 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 항체의 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 "단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서, 이러한 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 scFc가 항원 결합을 위한 요망되는 구조를 형성할 수 있는 VH 도메인과 VL 도메인 간의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "이중체"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는 것으로서, 여기서, 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 페어링(pairing)을 허용하지 않는 링커를 이용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링을 이루고 2개의 항원-결합 부위를 생성시키도록 만든다. 이중체는 예를 들어, EP 404,097호; WO93/1161호; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)]에 더욱 충분히 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열과 일치하고/거나 본원에 개시된 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 이용하여 제조된 아미노산 서열을 지니는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로, 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.
본원에서 사용되는 "친화력 성숙 항체"는 그러한 변경(들)을 갖지 않는 부모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화력을 개선시키는 하나 이상의 이의 HVR에서의 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 일 구현예에서, 친화력 성숙 항체는 타겟 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화력을 갖는다. 친화력 상숙 항체는 당해 분야에 공지된 절차에 의해 생성된다. 문헌[Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화력 성숙이 기술되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이 유발은 문헌[Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 "차단 항체" 또는 "길항제 항체"는 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용되는 "효능제 항체"는 고려되는 폴리펩타이드의 기능성 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
본원에서 사용되는 "장애"는 본 발명의 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 모든 상태이다. 이는 포유동물이 고려되는 장애에 취약한 병리학적 증상을 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질병을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포 증식 장애" 및 "증식 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 일 구현예에서, 세포 증식 장애는 암이다.
본원에서 사용되는 "종양"은 악성이든 양성이든, 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암," "암성," "세포 증식 장애," "증식 장애" 및 "종양"은 본원에서 지칭된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
본원에서 사용되는 용어 "암" 및 "암성"은 통상적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식에 의해 특징되는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 이를 기술한 것이다. 암의 예는 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더욱 구체적인 예는 편평세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식 장애, 및 다양한 타입의 두경부암을 포함한다.
본원에서 사용되는 "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경하려는 시도의 임상 개입을 의미하고, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 요망되는 치료 효과는 질병의 발병 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과, 염증 및/또는 조직/장기 손상의 예방 또는 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 경감 또는 예후 개선을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 질병 또는 장애의 발병을 지연시키기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 "항체-약물 컨쥬게이트(ADC)"는 세포독성제, 예를 들어, 화학치료제, 약물, 성장억제제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사컨쥬게이트(radioconjugate))에 컨쥬게이션된 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "T 세포 표면 항원"은 MHC-연관 펩타이드 항원의 특정 인식을 위해 T-세포에 의해 사용된 모든 T-세포의 원리 한정 마커(principle defining 마커)인 T-세포 항원 수용체(TcR)를 포함하는, 당해 분야에 공지된 대표적인 T 세포 표면 마커를 포함할 수 있는 항원을 지칭한다. TcR과 관련된 예는 CD3으로서 공지된 단백질의 복합물이며, 이는 이의 동족 MHC/항원 복합물에 TcR 결합 후에 세포내 신호의 형질도입에 참여한다. T 세포 표면 항원의 다른 예는 CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L 및/또는 CD44를 포함(배제)할 수 있다.
본원에서 사용되는 "개체" 또는 "대상체"는 척추동물이다. 특정 구현예에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 농장 동물(예를 들어, 소), 스포츠 동물, 애완 동물(예를 들어, 고양이, 개, 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 척추동물은 인간이다.
본원에서 사용되는 치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소, 등을 포함하는 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
본원에서 사용되는 "유효량"은 요망되는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료학적 유효량"은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 물질/분자가 개체에서 요망되는 반응을 유발하는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한, 물질/분자의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료학적으로 유익한 효과보다 덜 큰 양이다. "예방학적 유효량"은 요망되는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 통상적으로 그러나 반드시 그러한 것은 아니지만, 예방적 용량이 질병의 초기 단계 이전 또는 초기 단계의 대상체에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제하거나 방해하고/거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제(예를 들어, 메토트렉사트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 또는 다른 인터칼레이팅 작용제), 효소, 및 이의 단편, 예를 들어, 핵분해효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어, 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 효소 활성 독소, 이의 단편 및/또는 변이체, 및 하기에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하도록 의도된다. 다른 세포독성제는 하기에 기술되어 있다. 종양파괴제는 종양 세포의 파괴를 유발시킨다.
본원에서 사용되는 "화학치료제"는 암의 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민, 및 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에티일렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함한 메틸라멜라민; 아세토제닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN®), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토파이신(특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스터드, 예를 들어, 클로람부실, 클로마파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 아이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네다인 항생제(예를 들어, 칼리케아마이신, 특히, 칼리케아마이신 감마1I 및 칼리케아마이신 오메가I1(예를 들어, 문헌[Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라, 네오카르지노스타틴 크로모포어 및 관련된 크로모단백질 에네다인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신® 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 예를 들어, 메토트렉사트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데놉테린, 메토트렉사트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미톡신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE®, FILDESIN®); 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL® 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ 크레모포르-부재, 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), 및 TAXOTERE® 도세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, Anthony, France); 클로란부실; 겜시타빈(GEMZAR®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉사트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴(VELBAN®); 백금; 에토포시드(VP-16); 아이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴(ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉사트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈(XELODA®); 약제학적으로 허용되는 염, 임의의 상기한 것의 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기한 것 중 둘 이상의 조합, 예를 들어, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 병용 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴(ELOXATIN™)으로의 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함한다.
약제 조성물
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 생리학적으로 혼화 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 등장성 및 흡수 지연제, 등을 포함한다. 일 구현예에서, 약제 조성물은 대상체에서 암 세포를 억제하는 데 효과적이다. 일부 구현예에서, 제형은 둘 이상의 치료제를 함유한 병용 제형이다.
투여 경로
본 약제 조성물의 투여 경로는 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 경구, 국소, 피하, 피부내, 경피, 피하(subdermal), 비경구, 직장, 척추, 또는 표피 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
제형
본 병용 요법의 약제 조성물은 별도의 단일요법으로서 제조되거나, 주사제로서, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 또는 주사 전에 액체 비히클 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서 공동제형화될 수 있다. 약제 조성물은 또한, 고체 형태로 제조되거나, 에멀젼화 또는 지속 전달을 위해 사용되는 리포솜 비히클 또는 다른 미립자 담체에 캡슐화된 활성 성분으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 약제 조성물은 약제 조성물의 지속 방출을 가능하게 하는, 오일 에멀젼, 유중수 에멀젼, 수중유중수 에멀젼, 부위-특이적 에멀젼, 장기-체류 에멀젼(long-residence emulsion), 점착성 에멀젼(stickyemulsion), 마이크로에멀젼, 나노에멀젼, 리포솜, 미세입자, 미소구체, 나노구체, 나노입자 및 다양한 천연 또는 합성 폴리머, 예를 들어, 비재흡수성 불투과성 폴리머, 예를 들어, 에틸렌비닐 아세테이트 코폴리머 및 Hytrel® 코폴리머, 팽윤성 폴리머, 예를 들어, 하이드로겔, 또는 재흡수성 폴리머, 예를 들어, 콜라겐 및 특정 다중산 또는 폴리에스테르, 예를 들어, 재흡수성 봉합선을 제조하기 위해 사용되는 것의 형태를 가질 수 있다.
물론, 생체내 투여를 위해 사용되는 약제 조성물은 무균이어야 하며, 살균은 통상적인 기술, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 소위 고농도 액체 제형(HCLF)이 되도록 항체의 농도를 증가시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 HCLF를 생성하기 위한 다양한 방식이 기술되어 있다.
약제 조성물은 조합물로서 동시-투여되고/거나 또 다른 치료제와 혼합될 수 있다. 조합 생성물은 둘 이상의 구성성분들의 혼합물일 수 있거나, 이러한 것은 공유 결합될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 또한, 암 백신, 예를 들어, 디프테리아 독소 및 사포닌 애주번트와 컨쥬게이션된 Globo H와 함께 투여될 수 있다. 추가 치료제는 선택적으로, 동일한 약제학적 제제의 성분으로서 동시에, 또는 본 발명의 청구된 항체의 투여 전 또는 후에, 투여될 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 변형될 것이다[예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 21st edition] 참조].
투약 및 투여 형태
약제 조성물은 대상체의 연령, 체중 및 상태, 사용되는 특정 조성물, 및 투여 경로, 약제 조성물이 예방 목적 또는 치료 목적을 위해 사용되는 지의 여부, 등에 대해 스케쥴에 따라 및 적절한 시기에 걸쳐 단일 용량 치료 또는 다중 용량 치료로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 약제 조성물은 1개월에 1회, 1개월에 2회, 1개월에 3회, 격주로(qow), 1주일에 1회(qw), 1주일에 2회(biw), 1주일에 3회(tiw), 1주일에 4회, 1주일에 5회, 1주일에 6회, 격일(qod), 매일(qd), 하루에 2회(qid), 또는 하루에 3회(tid) 투여된다.
본 발명에 따른 항체 병용 요법의 투여 기간, 예를 들어, 약제 조성물이 투여되는 기간은 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 대상체 반응, 등에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 약제 조성물은 약 1초 이상 내지 1시간 이상, 1일 내지 약 1주, 약 2주 내지 약 4주, 약 1개월 내지 약 2개월, 약 2개월 내지 약 4개월, 약 4개월 내지 약 6개월, 약 6개월 내지 약 8개월, 약 8개월 내지 약 1년, 약 1년 내지 약 2년, 또는 약 2년 내지 약 4년, 또는 그 이상의 범위의 시간에 걸쳐 투여될 수 있다.
투여 용이성 및 투약 균일성을 위해, 투약 유닛 형태의 경구 또는 비경구 약제 조성물이 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 투약 유닛 형태는 치료되는 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다. 각 단위는 요망되는 약제학적 담체와 공동으로 요망되는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 소정 범위의 투여량을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 소정 범위의 순환 농도 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다. 다른 구현예에서, 치료학적 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정된 경우 IC50(즉, 증상의 최대-절반 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다[Sonderstrup, Springer, Sem. Immunopathol. 25: 35-45, 2003. Nikula et al., Inhal. Toxicol. 4(12): 123-53, 2000].
본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분의 치료학적 또는 예방학적 유효량을 위한 예시적인, 비제한적인 범위는 약 0.001 내지 약 60 mg/kg 체중, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg 체중, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg 체중, 약 0.5 내지 약 25 mg/kg 체중, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 10 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 0.75 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 1 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 2 내지 약 9 mg/kg 체중, 약 1 내지 약 2 mg/kg 체중, 약 3 내지 약 8 mg/kg 체중, 약 4 내지 약 7 mg/kg 체중, 약 5 내지 약 6 mg/kg 체중, 약 8 내지 약 13 mg/kg 체중, 약 8.3 내지 약 12.5 mg/kg 체중, 약 4 내지 약 6 mg/kg 체중, 약 4.2 내지 약 6.3 mg/kg 체중, 약 1.6 내지 약 2.5 mg/kg 체중, 약 2 내지 약 3 mg/kg 체중, 또는 약 10 mg/kg 체중이다.
약제 조성물은 유효량의 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 함유하도록 제형화되며, 여기서, 이러한 양은 치료되는 동물 및 치료되는 질환에 따른다. 일 구현예에서, 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 약 0.01 mg 내지 약 10 g, 약 0.1 mg 내지 약 9 g, 약 1 mg 내지 약 8 g, 약 2 mg 내지 약 7 g, 약 3 mg 내지 약 6 g, 약 10 mg 내지 약 5 g, 약 20 mg 내지 약 1 g, 약 50 mg 내지 약 800 mg, 약 100 mg 내지 약 500 mg, 약 0.01 ㎍ 내지 약 10 g, 약 0.05 ㎍ 내지 약 1.5 mg, 약 10 ㎍ 내지 약 1 mg 단백질, 약 30 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 40 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 0.1 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 0.1 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 25 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 1 mg, 약 1 mg 내지 약 2 mg 범위의 용량으로 투여된다. 임의의 특정 대상체에 대한 특정 용량 수준은 특정 펩타이드의 활성, 연령, 체중, 일반 건강, 성별, 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 및 분비율, 약물 조합 및 치료 중인 특정 질병의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 따르고, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "백신"은 유기체가 유발하는 질병에 대해 면역을 부여하기 위해 사용되는, 전체 질병-유발 유기체(사멸 또는 약화) 또는 단백질, 펩타이드, 또는 다당류와 같은 이러한 유기체의 성분들로 이루어진, 항원을 함유하는 제제를 지칭한다. 백신 제제는 천연, 합성이거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유도될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은 결합쌍(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 상호작용을 지칭한다. 다양한 경우에, 특이적으로 결합한다는 것은 약 10-6 mol/리터, 약 10-7 mol/리터, 또는 약 10-8 mol/리터, 또는 그 미만의 친화력 상수에 의해 구현될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 글리코엔자임은 적어도 부분적으로 Globo시리즈 생합성 경로에서의 효소를 지칭한다. 예시적인 글리코엔자임은 알파-4GalT; 베타-4GalNAcT-I; 또는 베타-3GalT-V 효소를 포함한다.
조합을 위해 적합한 OBI-888(Globo H 항체)의 예의 설명
특정 구현예에서, 항체는 OBI-888(항-Globo H 단일클론 항체)이다. 예시적인 OBI-888은 PCT 특허공개문(WO2015157629A2호 및 WO2017062792A1호), 특허 출원에 기술된 바와 같으며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 참고로 포함된다.
본 발명은 당해 분야에 공지된 것과 조합하여, 본원에 기술되고 사용 가능한 바와 같은, 탄수화물 항원, 이러한 항체의 컨쥬게이션된 버젼, 인코딩 또는 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제형, 디바이스, 이와 관련된 형질전환 동물, 형질전환 식물에 결합하는 가변 도메인을 포함하는, Globo H 항체, 또는 이의 항원-결합 부분 및 이를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 약 10E-7 M 이하, 약 10E-8 M 이하, 약 10E-9 M 이하, 약 10E-10 M 이하, 약 10E-11 M 이하, 또는 약 10E-12 M 이하의 해리 상수(KD)를 가질 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 인간화되거나 키메라화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 3에 나타낸 아미노산과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.서열번호: 4에 나타낸 아미노산과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 3에 나타낸 아미노산과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호: 4에 나타낸 아미노산과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
제4 구현예에서, 본 발명은 각각 서열번호: 5, 6, 및 7에 나타낸 아미노산과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR), CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 중쇄는 서열번호: 87과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 상기 CDR1과 리더 서열 사이의 프레임워크를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 중쇄는 서열번호: 89와 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 상기 CDR2와 상기 CDR3 사이의 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 중쇄는 서열번호: 11과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 상기 CDR1과 상기 CDR2 사이의 프레임워크를 추가로 포함하며, 여기서, 프레임워크는 위치 9에 글리신을 함유하며, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 탄수화물 항원, 예를 들어, Globo H에 결합한다.
제5 구현예에서, 본 발명은 각각 서열번호: 8, 9 및 10으로 기술된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 경쇄는 서열번호: 88과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 리더 서열과 상기 CDR1 사이의 프레임워크를 추가로 포함한다. 다른 예시적인 구현예에서, 경쇄는 서열번호: 90과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 상기 CDR2와 상기 CDR3 사이의 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 경쇄는 서열번호: 12와 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 상기 CDR1과 상기 CDR2 사이의 프레임워크를 추가로 포함하며, 여기서, 프레임워크는 위치 12에 프롤린을 함유하며, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 Globo H에 결합한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 경쇄는 서열번호: 12와 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 상기 CDR1과 상기 CDR2 사이의 프레임워크를 추가로 포함하며, 여기서, 프레임워크는 위치 13에 트립토판을 함유하며, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 탄수화물 항원, 예를 들어, Globo H에 결합한다.
제6 구현예에서, 본 발명은 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서, 중쇄 영역은 각각 서열번호: 5, 6 및 7에 기술된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 경쇄 영역은 각각 서열번호: 8, 9 및 10에 기술된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호: 5, 6 또는 7로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다. 다른 구현예에서, 서열번호: 8, 9 또는 10으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다.
본 발명은 또한, 서열번호: 13에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 서열번호: 14에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 서열번호: 13에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호: 14에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
예시적인 구현예는 각각 서열번호: 15, 16 및 17에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 다른 예시적인 구현예는 각각 서열번호: 18, 19 및 20에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
다른 예시적인 구현예는 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서, 중쇄 영역은 각각 서열번호: 15, 16 및 17에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 경쇄 영역은 각각 서열번호: 18, 19 및 20에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호: 15, 16 또는 17로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다. 다른 구현예에서, 서열번호: 18, 19 또는 20으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다.
본 발명의 일 구현예는 서열번호: 21에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이다.
본 발명의 다른 구현예는 서열번호: 22에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 서열번호: 21에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호: 22에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이다.
예시적인 구현예는 각각 서열번호: 23, 24 및 25에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 다른 예시적인 구현예는 각각 서열번호: 26, 27 및 28에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
다른 예시적인 구현예는 각각 서열번호: 23, 24 및 25에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 영역, 및 각각 서열번호: 26, 27 및 28에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
일부 구현예에서, 각각 서열번호: 23, 24 및 25로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다. 다른 구현예에서, 서열번호: 26, 27 및 28로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다.
본 발명은 또한, 서열번호: 29에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 개시한다.
본 발명은 또한, 서열번호: 30에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 개시한다.
본 발명은 또한, 서열번호: 29에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호: 30에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 개시한다.
예시적인 구현예는 각각 서열번호: 31, 32 및 33에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 다른 예시적인 구현예는 각각 서열번호: 34, 35 및 36에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
다른 예시적인 구현예는 각각 서열번호: 31, 32 및 33에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 영역, 및 각각 서열번호: 34, 35 및 36에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
일부 구현예에서, 서열번호: 31, 32 또는 33으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다. 다른 구현예에서, 서열번호: 34, 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다.
본 발명의 일 구현예는 서열번호: 37에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예는 서열번호: 38에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예는 서열번호: 37에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호: 38에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
예시적인 구현예는 각각 서열번호: 39, 40 및 41에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 다른 예시적인 구현예는 각각 서열번호: 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 개시한다.
다른 예시적인 구현예는 각각 서열번호: 39, 40 및 41에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 영역, 및 각각 서열번호: 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
일부 구현예에서, 서열번호: 39, 40 또는 41로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 영역을 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다. 다른 구현예에서, 서열번호: 42, 43 또는 44로부터 선택된 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다.
본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 부분 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 암 세포를 발현시키는 Globo H를 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 유효량의 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 투여하는 것을 포함하며, 암 세포를 발현시키는 Globo H가 억제되는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 2C2(미국 세포주 은행(ATCC) 수탁번호 PTA-121138로 기탁됨), 3D7(ATCC 수탁번호 PTA-121310으로 기탁됨), 7A11(ATCC 번호 PTA-121311로 기탁됨), 2F8(ATCC 수탁번호 PTA-121137로 기탁됨) 및 1E1(ATCC 수탁번호 PTA-121312로 기탁됨), 이로부터 형성된 항체 또는 항원-결합 부분으로서 지명된 하이브리도마 클론을 제공한다.
본 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 약 10E-7 M 미만, 약 10E-8 M 미만, 약 10E-9 M 미만, 약 10E-10 M 미만, 약 10E-11 M 미만, 또는 약 10E-12 M 미만의 해리 상수(KD)로 Globo H에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항체 결합 부분은 1 내지 10 x 10E-9 또는 그 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 다른 구현예에서, Kd는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된다.
클론 2C2에 의해 생성된 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 상동성인 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 갖는 항체는 또한 탄수화물 항원(예를 들어, Globo H)에 결합할 수 있다. 상동성은 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 수준 중 어느 하나로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 예를 들어, 하이브리도마 2C2, 하이브리도마 3D7, 하이브리도마 7A11, 하이브리도마 2F8 및 하이브리도마 1E1에 의해 생성된 항체의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄를 포함하고, 표 1에 나타나 있다.
관련된 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 예를 들어, 하이브리도마 2C2, 하이브리도마 3D7, 하이브리도마 7A11, 하이브리도마 2F8 및 하이브리도마 1E1로부터 생성된 항체의 가변 중쇄의 CDR 및/또는 가변 경쇄의 CDR을 포함한다. 이러한 하이브리도마 클론으로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 CDR 및 프레임워크는 표 1에 나타나 있다.
표 1. GH 888 2015 서열번호 1 내지 서열번호 90
본 발명은 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 탄수화물 항원은 Globo H이다.
또 다른 구현예에서, 탄수화물 항원은 SSEA-4이다. 핵산은 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생성하기 위해 세포에서 발현될 수 있다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하기 중 어느 하나와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다:
서열번호: 3(하이브리도마 2C2); 서열번호: 13(하이브리도마 3D7); 서열번호: 21(하이브리도마 7A11); 서열번호: 29(하이브리도마 2F8); 또는 서열번호: 37(하이브리도마 1E1).
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하기 중 어느 하나와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다:
서열번호: 4(하이브리도마 2C2); 서열번호: 14(하이브리도마 3D7); 서열번호: 22(하이브리도마 7A11); 서열번호: 30(하이브리도마 2F8); 또는 서열번호: 38(하이브리도마 1E1).
본 발명의 일 양태에서, 비변형된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서, 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호: 91, 92 및 93에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는, 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 비변형된 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 가변 영역은 (i)서열번호: 94와 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 상기 CDR1과 리더 서열 사이의 프레임워크, 또는 (ii) 서열번호: 95와 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 상기 CDR1과 상기 CDR2 사이의 프레임워크, 또는 (iii) 서열번호: 96과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는, 중쇄의 상기 CDR2와 상기 CDR3 사이의 프레임워크로부터 선택된 적어도 하나의 프레임워크를 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 중쇄 가변 영역(서열번호. 95)의 프레임워크 2에서의 아미노산 잔기 46(또는 프레임워크 2의 C-말단으로부터의 6번째 아미노산 잔기)은 글리신이고 치환되지 않는다. 서열번호. 95의 아미노산 잔기의 위치는 하기에 예시된다:
* 프레임워크 2의 아미노산 잔기 38(W)은 CDR1에 인접한 잔기 또는 프레임워크 2의 N 말단으로부터 첫번째 아미노산 잔기이다.
** 프레임워크 2의 아미노산 잔기 51(A)은 CDR2에 인접한 잔기 또는 프레임워크 2의 C-말단으로부터 첫번째 아미노산 잔기이다.
본 발명의 다른 양태에서, 비변형된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 각각 서열번호: 97, 98 및 99에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 비변형된 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 경쇄 가변 영역은 (a) 서열번호: 100과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 상기 CDR1과 리더 서열 사이의 프레임워크, (b) 서열번호: 101과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 경중쇄의 상기 CDR1과 상기 CDR2 사이의 프레임워크, 또는 (c) 서열번호: 102와 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 상기 CDR2와 상기 CDR3 사이의 프레임워크로부터 선택된 적어도 하나의 프레임워크를 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 경쇄(서열번호. 101)의 프레임워크 2에서의 아미노산 잔기 45(또는 프레임워크 2의 C-말단으로부터 4번째 아미노산 잔기)는 프롤린이고/거나, 경쇄의 프레임워크 2에서의 아미노산 잔기 46(프레임워크 2의 C-말단으로부터 3번째 아미노산 잔기)은 트립토판이며, 단, 아미노산 잔기 45 및/또는 아미노산 잔기 46은 치환되지 않는다. 서열번호: 101의 아미노산의 위치는 하기에 예시되어 있다:
* 프레임워크 2의 위치 34에서의 아미노산(W)은 CDR1에 인접한 잔기 또는 프레임워크 2의 N-말단으로부터 첫번째 아미노산 잔기이다.
** 프레임워크 2의 위치 48에서의 아미노산(Y)은 CDR2에 인접한 잔기 또는 프레임워크 2의 C-말단으로부터 첫번째 잔기이다.
본 발명의 비변형된 항체는 종양 탄수화물 또는 이의 단편이 결합하는 인간화된 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 인간화된 항체는 서열번호: 103과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호: 104와 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 비변형된 항체는 또한 종양 탄수화물 또는 이의 단편에 결합하는 키메라 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 항체는 서열번호: 105와 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호: 106과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
표 2는 비변형된 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, CDR, 및 FW의 아미노산 서열 및 변형된 항체의 하나의 예시적인 구현예를 나타낸 것이다.
표 2. GH 888 2017 서열번호. 91 내지 서열번호. 108
본 설명 및 당해 분야의 교시에 따르면, 일부 구현예에서, 본 발명의 변형된 항체가 야생형 대응 항체와 비교하여, 예를 들어, 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다는 것이 고려된다. 변형된 항체는 이의 비변형된 야생형 대응물과 비교하여 치료 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특징을 유지할 것이다. 그러나, 본원에 기술된 위치에서 아미노산 잔기의 특정 변형이 생성되는 비변형된 야생형 항체와 비교하여 종양-결합 탄수화물에 대한 개선되거나 최적화된 결합 친화력을 갖는 변형된 항체를 초래할 것으로 사료된다. 일 구현예에서, 본 발명의 변형된 항체는 "친화력 성숙된" 항체이다.
한 타입의 변형은 변형된 항체를 생성하기 위해 야생형/비변형된 항체의 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 이러한 변형된 항체는 파지 디스플레이-기반 친화력 성숙 기술을 이용하여 보편적으로 생성될 수 있다. 간단하게, 여러 초가변 영역 부위(예를 들어, 6 내지 7개의 부위)는 돌연변이되어 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 이에 따라 생성된 항체는 각 입자 내에 패키징된 파지 코트 단백질(예를 들어, M13의 유전자 III 산물)의 적어도 일부에 융합으로서 섬질 파지 입자(사상 파지 particle)로부터 디스플레이된다. 파지-디스플레이된 변이체는 이후에 이의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화력)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 스크리닝 돌연변이 유발(예를 들어, 알라닌 스크리닝)은 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체와 항원 간의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합물의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 본원에서 설명되는 것을 포함하는, 당해 분야에 공지된 기술에 따라 치환에 대한 후보물이다. 이러한 변형된 항체가 생성된 직후에, 변이체의 패널은 본원에 기술된 것을 포함하는, 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 스크리닝되며, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 성질을 갖는 변형된 항체는 추가 개발을 위해 선택될 수 있다.
변형된 항체는 또한, 예를 들어, 문헌[Marks et al., 1992, (가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인 셔플링에 의한 친화력 돌연변이), 또는 Barbas, et al., 1994; Shier et al., 1995; Yelton et al., 1995; Jackson et al., 1995; 및 Hawkins et al., 1992 (CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이 유발)]에 기술된 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 변형된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서, 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호: 91, 92 및 93에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 아미노산 잔기s 28, 31, 57, 63 또는 105로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 비변형된 항체에 존재하는 것과는 상이한 다른 아미노산으로 치환되어, 비변형된 항체의 결합 친화력을 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600% 또는 약 700%까지 증가시킨다.
일 구현예에서, 변형된 항체의 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) CDR1에서의 아미노산 잔기 28(세린)은 염기성 아미노산, 중성 아미노산, 또는 소수성 아미노산으로 치환되며, 단, 중성 아미노산은 세린이 아님,
(b) CDR1에서의 아미노산 잔기 31(트레오닌)은 염기성 아미노산으로 치환됨,
(c) CDR2에서의 아미노산 잔기 57(아스파르트산)은 중성, 염기성 또는 소수성 아미노산으로 치환됨,
(d) CDR2에서의 아미노산 잔기 63(프롤린)은 중성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 소수성 아미노산으로 치환되며, 단, 소수성 아미노산은 프롤린이 아님, 또는
(e) CDR3에서의 아미노산 잔기 105(아스파르트산)는 염기성 아미노산, 소수성 아미노산, 또는 중성 아미노산으로 치환됨.
20개의 아미노산은 이의 측쇄에 따라 4개의 부류(염기성, 중성, 소수성 및 산성)로 나누어진다. 표 3은 4개의 부류의 아미노산을 나열한 것이다.
표 3. GH 888 2017 4개 부류의 아미노산
구현예는 중쇄 영역에 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 갖는 변형된 항체를 포함한다: (a) CDR1에서의 아미노산 잔기 28(또는 CDR1의 N-말단으로부터 3번째 아미노산 잔기)은 염기성 아미노산, 세린, 글리신 또는 글루타민 이외의 중성 아미노산, 또는 이소류신, 류신, 메티오닌 또는 트립토판 이외의 소수성 아미노산으로 치환됨, (b) CDR1에서의 아미노산 잔기 31(또는 CDR1의 N-말단으로부터 6번째 아미노산 잔기)은 히스티딘 이외의 염기성 아미노산으로 치환됨, (c) CDR2에서의 아미노산 잔기 57(또는 CDR2의 N-말단으로부터 6번째 아미노산 잔기)은 아스파라긴 또는 트레오닌 이외의 중성 아미노산, 이소류신, 프롤린 또는 발린 이외의 소수성 아미노산 또는 염기성 아미노산으로 치환됨, (d) CDR2에서의 아미노산 잔기 63(또는 CDR2의 C-말단으로부터 5번째 아미노산 잔기)는 아스파라긴, 글루타민 또는 트레오닌 이외의 중성 아미노산, 염기성 아미노산, 또는 프롤린 또는 메티오닌 이외의 소수성 아미노산으로 치환됨, 또는 (e) CDR3에서의 아미노산 잔기 105(또는 CDR3의 N-말단으로부터 6번째 아미노산 잔기)는 염기성 아미노산, 중성 아미노산 또는 류신 이외의 소수성 아미노산으로 치환됨.
표 4는 변형된 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 치환의 예를 제공한 것이다. 각 치환에 대하여, 첫번째 문자는 비변형된 항체의 아미노산을 명시하는 것이며, 숫자는 Kabat 넘버링 방식에 따른 위치를 명시하는 것이며, 두번째 문자는 변형된 항체의 아미노산을 명시하는 것이다. 예를 들어, 아미노산 잔기 28에서의 세린은 라이신(S028K) 또는 아르기닌(S028R), 트립신(S028Y), 페닐알라닌(S028F)으로 치환되며, 아미노산 잔기 31에서의 트레오닌은 라이신(T031K) 또는 아르기닌(T031R)으로 치환되며, 아미노산 잔기 57에서의 아스파르트산은 글리신(D057G), 세린(D57S), 글루타민(D057Q), 히스티딘(D057H) 또는 트립토판(D57W)으로 치환되며, 아미노산 잔기 63에서의 프롤린은 히스티딘(P063H), 아르기닌(P063R), 트립신(P063Y), 알라닌(P063A), 류신(P063L) 또는 발린(P063V)으로 치환되며, 아미노산 잔기 105에서의 아스파르트산은 아르기닌(D105R), 글리신(D105G), 트레오닌(D105T), 메티오닌(D105M), 알라닌(D105A), 이소류신(D105I), 라이신(D105K) 또는 발린(D105V)으로 치환된다.
표 4. 중쇄 가변 영역의 아미노산 치환의 GH 888 2017 예
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 변형된 항체 또는 이의 항원 결합은 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서, 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호: 97, 98 및 99에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는, 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 여기서, 아미노산 잔기 24, 32, 49, 53 또는 93으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 비변형된 항체에 존재하는 것과 상이한 다른 아미노산으로 치환되어, 비변형된 항체의 결합 친화력을 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600% 또는 약 700%까지 증가한다.
일 구현예에서, 변형된 항체의 경쇄 가변 영역은 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) CDR1에서의 아미노산 잔기 24(아르기닌)(또는 CDR1의 N-말단으로부터 첫번째 아미노산 잔기)는 중성 아미노산 또는 소수성 아미노산으로 치환됨,
(b) CDR1에서의 아미노산 잔기 32(메티오닌)(또는 CDR1의 C-말단으로부터 두번째 아미노산 잔기)는 중성 아미노산 또는 소수성 아미노산으로 치환되며, 단, 소수성 아미노산은 메티오닌이 아님,
(c) CDR2에서의 아미노산 잔기 49(알라닌)(또는 CDR2의 N-말단으로부터 첫번째 아미노산 잔기)는 중성 아미노산으로 치환됨,
(d) CDR2에서의 아미노산 잔기 53(류신)(또는 CDR2의 N-말단으로부터 5번째 아미노산 잔기)은 중성 아미노산 또는 염기성 아미노산으로 치환됨, 또는
(e) CDR3에서의 아미노산 잔기 93(아스파라긴)(또는 CDR3의 N-말단으로부터 6번째 아미노산 잔기)은 중성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 소수성 아미노산으로 치환되며, 단, 중성 아미노산은 아스파라긴이 아님.
구현예는 경쇄 영역에서 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 갖는 변형된 항체를 포함한다: (a) CDR1에서의 아미노산 잔기 24는 트레오닌 이외의 중성 아미노산 또는 메티오닌, 프롤린 또는 발린 이외의 소수성 아미노산으로 치환됨, (b) CDR1에서의 아미노산 잔기 32는 세린 또는 트레오닌 이외의 중성 아미노산 또는 메티오닌, 류신 또는 트립토판 이외의 소수성 아미노산으로 치환됨, (c) CDR2에서의 아미노산 잔기 49는 중성 아미노산으로 치환되며, 단, 이는 아스파라긴 또는 트레오닌이 아님, (d) CDR2에서의 아미노산 잔기 53은 아스파라긴 이외의 중성 아미노산 또는 아르기닌 이외의 염기성 아미노산으로 치환됨, 또는 (e) CDR3에서의 아미노산 잔기 93은 중성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 소수성 아미노산으로 치환되며, 단, 중성 아미노산은 아스파라긴이 아니며, 소수성 아미노산은 발린이 아님.
표 5는 변형된 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 치환의 예를 제공한다. 예를 들어, Kabat 넘버링 방식을 이용한 24에서의 아미노산 잔기는 글리신(R024G), 세린(R024S) 또는 트립토판(R024W)으로 치환되며, 32에서의 아미노산 잔기는 글리신(M032G), 글루타민(M032Q) 또는 발린(M032V)으로 치환되며, 49에서의 아미노산 잔기는 글리신(A049G)으로 치환되며, 53에서의 아미노산 잔기는 라이신(L053K), 글루타민(L053G), 또는 트레오닌(L053T)으로 치환되며, 93에서의 아미노산 잔기는 아르기닌(N093R), 글루타민(N093Q), 세린(N093S), 트레오닌(N093T), 페닐알라닌(N093F), 류신(N093L), 메티오닌(N093M)으로 치환된다.
표 5: 경쇄 가변 영역의 아미노산 치환의 GH 888 2017 예
일 구현예에서, 변형된 항체는 하기 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서,
(a) 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호: 91, 92 및 93에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는, 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함하며:
(i) CDR1에서 아미노산 잔기 28는 라이신(S028K), 아르기닌(S028R), 트립신(S028Y) 또는 페닐알라닌(S028F)으로 치환됨,
(ii) CDR1에서의 아미노산 잔기 31은 라이신(T031K) 또는 아르기닌(T031R)으로 치환됨,
(iii) CDR2에서의 아미노산 잔기 57은 히스티딘(D057H), 글리신(D057G), 세린(D057S), 글루타민(D057Q) 또는 트립토판(D057W)으로 치환됨,
(iv) CDR2에서의 아미노산 잔기 63은 히스티딘(P063H), 아르기닌(P063R), 트립신(P063Y), 알라닌(P063A), 류신(P063L) 또는 발린(P063V)으로 치환됨,
(v) CDR3에서의 아미노산 잔기 105는 아르기닌(D105R), 글리신(D105G), 트레오닌(D105T), 메티오닌(D105M), 알라닌(D105A), 이소류신(D105I), 라이신(D105K) 또는 발린(D105V)으로 치환됨, 및/또는
(b) 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호: 97, 98 및 99에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는, 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 하기 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다:
(i) CDR1에서의 아미노산 잔기 24는 글리신(R024G), 세린(R024S) 또는 트립토판(R024W)으로 치환됨,
(ii) CDR1에서의 아미노산 잔기 32는 글리신(M032G), 글루타민(M032Q) 또는 발린(M032V)으로 치환됨,
(iii) CDR2에서의 아미노산 잔기 49는 글리신(A049G)으로 치환됨,
(iv) CDR2에서의 아미노산 잔기 53은 라이신(L053K), 글루타민(L053G), 또는 트레오닌(L053T)으로 치환됨,
(v) CDR3에서의 아미노산 잔기 93은 아르기닌(N093R), 글루타민(N093Q), 세린(N093S), 트레오닌(N093T), 페닐알라닌(N093F), 류신(N093L) 또는 메티오닌(N093M)으로 치환됨.
다른 구현예에서, 변형된 항체는 중쇄 가변 영역, 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서,
(a) 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호: 91, 92 및 93에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는, 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함하며:
(i) CDR1에서의 아미노산 잔기 28는 아르기닌(S028R)으로 치환됨,
(ii) CDR1에서의 아미노산 잔기 31은 아르기닌(T031R)으로 치환됨,
(iii) CDR2에서의 아미노산 잔기 57은 글리신(D057G)으로 치환됨,
(iv) CDR2에서의 아미노산 잔기 63은 트립신(P063Y)으로 치환됨,
(v) CDR3에서의 아미노산 잔기 105는 아르기닌(D105R)으로 치환됨, 및/또는
(b) 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호: 97, 98 및 99에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 갖는, 3개의 CDR, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다:
(i) CDR1에서의 아미노산 잔기 24는 트립토판(R024W)으로 치환됨,
(ii) CDR1에서의 아미노산 잔기 32는 글루타민(M032Q)으로 치환됨,
(iii) CDR2에서의 아미노산 잔기 49는 글리신(A049G)으로 치환됨,
(iv) CDR2에서의 아미노산 잔기 53은 라이신(L053K)으로 치환됨,
(v) CDR3에서의 아미노산 잔기 93은 아르기닌(N093R)으로 치환됨.
조합물을 위해 적합한 OBI-898(SSEA-4 항체)의 예의 설명
특정의 조합 구현예에서, 항체는 OBI-898(항-SSEA-4 단일클론 항체)이다. 예시적인 OBI-898은 PCT 특허공개문(WO2017172990A1호), 미국특허출원공개(US2018339061A1호), 특허출원에 기술되어 있으며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 참고로 포함된다.
넓은 스펙트럼의 암을 진단 및 치료하는 데 사용하기 위한 마커에 관한 항체 방법 및 조성물이 제공된다. 항-SSEA-4 항체는 개발되었고 본원에 개시되어 있다. 사용 방법은 비제한적으로, 암 치료제 및 진단제를 포함한다. 본원에 기술된 항체는 넓은 스펙트럼의 SSEA-4-발현 암 세포에 결합하여, 암 진단 및 치료를 촉진시킬 수 있다. 항체에 의해 타겟화될 수 있는 세포는 암종, 예를 들어, 피부, 혈액, 림프구, 뇌, 폐, 유방, 입, 식도, 위, 간, 담관, 췌장, 결장, 신장, 자궁경부, 난소, 전립선암, 등에 있는 것을 포함한다.
본 개시의 예시적인 SSEA-4 항체 및 결합 단편은 단계-특이적 배아 항원 4(SSEA-4)가 정상 세포 상이 아닌, 넓은 스펙트럼의 암에서 풍부하게 발현된다. SSEA-4를 발현시키는 암은 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협측암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종, 또는 뇌종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일 양태에서, 본 개시는 SSEA-4에 대해 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편을 특징으로 한다. 항-SSEA-4 항체는 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1에 결합한다.
특정 양태에서, 본 개시는 1J1s(미국 세포주 은행(ATCC) 수탁번호 PTA-122679로 기탁됨), 1G1s(ATCC 수탁번호 PTA-122678로 기탁됨), 2F20s(ATCC 번호 PTA-122676으로 기탁됨), 및 이로부터 생성된 항체 또는 항원-결합 단편로서 지명된 하이브리도마 클론을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 서열번호: 111에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중변 가변 도메인(VH), 및또는 서열번호: 112에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 항원, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 양태에서, 서열번호: 111에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 배제할 것이다. 일부 양태에서, 서열번호: 112에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 배제할 것이다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기에 나타낸 (i) 내지 (iii)으로부터 선택된 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3, 및 하기 (iv) 내지 (vi)로부터 선택된 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 추가로 포함한다:
(i) 서열번호: 121로부터 선택된 H-CDR1;
(ii) 서열번호: 123으로부터 선택된 H-CDR2;
(iii) 서열번호: 125로부터 선택된 H-CDR3, 각각;
(iv) 서열번호: 114로부터 선택된 L-CDR1;
(v) 서열번호: 116으로부터 선택된 L-CDR2; 및
(vi) 서열번호: 118로부터 선택된 L-CDR3, 각각.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 영역을 포함하며, 여기서, 중쇄 영역은 서열번호: 121, 123 또는 125로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 영역을 포함하며, 여기서, 경쇄 영역은 서열번호: 114, 116 또는 118로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 자연 발생 서열을 배제한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 자연 발생 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 (i) 내지 (iv)로부터 선택된 H-FW1, H-FW2, H- FW3, 및 H-FW4, 및 하기 (v) 내지 (viii)로부터 선택된 L-FW1, L-FW2, L-FW3, 및 L-FW4를 추가로 포함한다:
(i) 서열번호: 120으로부터 선택된 H-FW1;
(ii) 서열번호: 122로부터 선택된 H-FW2;
(iii) 서열번호: 124로부터 선택된 H-FW3,
(iv) 서열번호: 126으로부터 선택된 H-FW4, 각각;
(v) 서열번호: 113으로부터 선택된 L-FW1;
(vi) 서열번호: 115로부터 선택된 L-FW2;
(vii) 서열번호: 117로부터 선택된 L-FW3,
(viii) 서열번호: 119로부터 선택된 L-FW4, 각각.
일 양태에서, 본 개시는 ATCC 수탁번호 PTA-122679로 기탁된 1J1s로서 지명된 하이브리도마에 의해 생성된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 ATCC 수탁번호 PTA-122679로 기탁된 1J1s로서 지명된 하이브리도마를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시는 서열번호: 129에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및/또는 서열번호: 130에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 양태에서, 서열번호: 129에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 배제할 것이다. 일부 양태에서, 서열번호: 130에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(LH)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 배제할 것이다.
특정 구현예에서, 항체, 또는 항원-결합 단편은 하기 (i) 내지 (iii)으로부터 선택된 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 , 및 하기 (iv) 내지 (vi)로부터 선택된 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 추가로 포함한다:
(i) 서열번호: 139로부터 선택된 H-CDR1;
(ii) 서열번호: 141로부터 선택된 H-CDR2;
(iii) 서열번호: 143으로부터 선택된 H-CDR3, 각각;
(iv) 서열번호: 132로부터 선택된 L-CDR1;
(v) 서열번호: 134로부터 선택된 L-CDR2; 및
(vi) 서열번호: 136으로부터 선택된 L-CDR3, 각각.
특정 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 영역을 포함하며, 여기서, 중쇄 영역은 서열번호: 139, 141, 또는 143으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 영역을 포함하며, 여기서, 경쇄 영역은 서열번호: 132, 134 또는 136으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 자연 발생 서열을 포함하거나 배제한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 (i) 내지 (iv)로부터 선택된 H-FW1, H-FW2, H- FW3 및 H-FW4, 및 하기 (v) 내지 (viii)로부터 선택된 L-FW1, L-FW2, L-FW3 및 L-FW4를 추가로 포함한다:
(i) 서열번호: 138로부터 선택된 H-FW1;
(ii) 서열번호: 140으로부터 선택된 H-FW2;
(iii) 서열번호: 142로부터 선택된 H-FW3,
(iv) 서열번호: 144로부터 선택된 H-FW4, 각각;
(v) 서열번호: 131로부터 선택된 L-FW1;
(vi) 서열번호: 133으로부터 선택된 L-FW2;
(vii) 서열번호: 135로부터 선택된 L-FW3,
(viii) 서열번호: 137로부터 선택된 L-FW4, 각각.
일 양태에서, 본 개시는 ATCC 수탁번호 PTA-122678로 기탁된 1G1s로 지명된 하이브리도마에 의해 생성된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하다.
일 양태에서, 본 개시는 ATCC 수탁번호 PTA-122678로 기탁된 1G1s로 지명된 하이브리도마를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시는 서열번호: 147에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및/또는 서열번호: 148에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 양태에서, 서열번호: 147에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 배제할 것이다. 일부 양태에서, 서열번호: 148에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 배제할 것이다.
특정 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 (i) 내지 (iii)으로부터 선택된 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3, 및 하기 (iv) 내지 (vi)으로부터 선택된 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 추가로 포함한다:
(i) 서열번호: 157로부터 선택된 H-CDR1;
(ii) 서열번호: 159로부터 선택된 H-CDR2;
(iii) 서열번호: 161로부터 선택된 H-CDR3, 각각;
(iv) 서열번호: 150으로부터 선택된 L-CDR1;
(v) 서열번호: 152로부터 선택된 L-CDR2; 및
(vi) 서열번호: 154로부터 선택된 L-CDR3, 각각.
특정 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 영역을 포함하며, 여기서, 중쇄 영역은 서열번호: 157, 159 또는 161로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 영역을 포함하며, 여기서, 경쇄 영역은 서열번호: 150, 152 또는 154로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 자연 발생 서열을 포함하거나 배제한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 (i) 내지 (iv)로부터 선택된 H-FW1, H-FW2, H- FW3 및 H-FW4, 및 하기 (v) 내지 (viii)로부터 선택된 L-FW1, L-FW2, L-FW3 및 L-FW4를 추가로 포함한다:
(i) 서열번호: 156으로부터 선택된 H-FW1;
(ii) 서열번호: 158로부터 선택된 H-FW2;
(iii) 서열번호: 160으로부터 선택된 H-FW3,
(iv) 서열번호: 162로부터 선택된 H-FW4, 각각;
(v) 서열번호: 149로부터 선택된 L-FW1;
(vi) 서열번호: 151로부터 선택된 L-FW2;
(vii) 서열번호: 153으로부터 선택된 L-FW3,
(viii) 서열번호: 155로부터 선택된 L-FW4, 각각.
일 양태에서, 본 개시는 ATCC 수탁번호 PTA-122676으로 기탁된 2F20s로 지명된 하이브리도마에 의해 생성된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 ATCC 수탁번호 PTA-122676으로 기탁된 2F20s로 지명된 하이브리도마를 제공한다.
특정 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 (i) 내지 (iii)으로부터 선택된 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3, 및 하기 (iv) 내지 (vi)로부터 선택된 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 추가로 포함한다:
(i) 서열번호: 175로부터 선택된 H-CDR1;
(ii) 서열번호: 176으로부터 선택된 H-CDR2;
(iii) 서열번호: 177로부터 선택된 H-CDR3, 각각;
(iv) 서열번호: 180으로부터 선택된 L-CDR1;
(v) 서열번호: 181로부터 선택된 L-CDR2; 및
(vi) 서열번호: 182로부터 선택된 L-CDR3, 각각.
특정 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 영역을 포함하며, 여기서, 중쇄 영역은 서열번호: 175, 176 또는 177로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 영역을 포함하며, 여기서, 경쇄 영역은 서열번호: 180, 181 또는 182로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 자연 발생 서열을 포함하거나 배제한다.
특정 구현예에서, 예시적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 탄수화물 항원에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 탄수화물 항원 SSEA-4(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)(SSEA-4 육당류)를 타겟으로 한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(a) 전체 면역글로불린 분자;
(b) scFv;
(c) Fab 단편;
(d) F(ab')2; 또는
(e) 디설파이드 결합된 Fv로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 항체는 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 항체는 IgG 또는 IgM이다.
일 양태에서, 본 개시는 항체 또는 항원-결합 단편; 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 약제 조성물은 적어도 하나의 추가 치료제를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 암 세포의 증식을 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 유효량의 예시적인 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 암 세포의 증식은 억제되는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 유효량의 본원에 기술된 예시적인 항체를 투여하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협측암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종, 또는 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 개시는 대상체에서 암을 단계화(staging)하는 방법으로서,
(a) SSEA-4의 발현을 검출하는 하나 이상의 항체를 대상체로부터 획득된 세포 또는 조직 샘플에 적용하는 단계;
(b) 세포 또는 조직 샘플에 대한 하나 이상의 항체의 결합을 검정하는 단계;
(c) 대상체에서 암의 존재를 결정하기 위해 이러한 결합을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및
(d) 정상 기준선 지수와 비교하여 상응하는 항체 결합의 상대적인 수준을 기초로 하여 질병 진행 단계를 카테고리화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
SSEA-4를 타겟으로 하는 항체
본 개시의 일 양태는 SSEA-4 관련 항원을 타겟으로 하는 새로운 항체를 특징으로 한다.
mAb 1J1s(ATCC 수탁번호 PTA-122679)는 하이브리도마 세포주(ATCC 수탁번호 PTA-122679)에 의해 생성된 단일클론 항체이다. 본원에 기술된 항체는 항체 1J1s와 동일한 VH 및 VL 사슬을 함유할 수 있다. 1J1s와 동일한 에피토프에 대한 항체 결합은 또한 본 개시의 범위 내에 속한다.
표본 및 이의 아미노산 및 핵산 구조/서열은 하기에 제공된다.
표 6. 항체 1J1s의 SSEA-4 898 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
mAb 1G1s(ATCC 수탁번호 PTA-122678)는 하이브리도마 세포주(ATCC 수탁번호 PTA-122678)에 의해 생성된, 마우스 단일클론 항체이다. 본원에 기술된 항체는 항체 1G1s와 동일한 VH 및 VL 사슬을 함유할 수 있다. 1G1s와 동일한 에피토프에 대한 항체 결합은 또한, 본 개시의 범위 내에 속한다.
표본 및 이의 아미노산 및 핵산 구조/서열은 하기에 제공된다:
표 7. 항체 1G1s의 SSEA-4 898 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
mAb 2F20s(ATCC 수탁번호 PTA-122676)는 하이브리도마 세포주(ATCC 수탁번호 PTA-122676)에 의해 생성된 단일클론 항체이다. 본원에 기술된 항체는 항체 2F20s와 동일한 VH 및 VL 사슬을 함유할 수 있다. 2F20s와 동일한 에피토프에 대한 항체 결합은 또한, 본 개시의 범위 내에 속한다.
표본 및 이의 아미노산 및 핵산 구조/서열은 하기에 제공된다:
표 8. 항체 2F20s의 SSEA-4 898 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열s of
SSEA-4 898 인간화된 클론의 표본 및 이의 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
표 9. SSEA-4 898 인간화된 클론 아미노산 서열 리스트
본 개시의 일 양태는 SSEA-4에 대해 특이적인 새로운 항체를 특징으로 한다. 항-SSEA-4 항체는 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4 육당류)에 결합한다.
숙주 동물의 면역화 및 하이브리도마 기술
일 구현예에서, 임의의 본원에 기술된 항체는 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 단쇄 Fv 단편이다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 단쇄 Fv 단편이다. 일부 예에서, 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 또는 단쇄 항체이다.
임의의 본원에 기술된 항체는 하기 중 하나 이상의 특징을 갖는다: (a) 재조합 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 일가 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, 또는 항체의 유도체임; (b) 인간, 뮤린, 인간화된, 또는 키메라 항체, 항원-결합 단편, 또는 항체의 유도체임; (c) 단쇄 항체 단편, 다중체, Fab 단편, 및/또는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 아이소형의 면역글로불린 및/또는 이의 하위부류임; (d) 하기 특징 중 하나 이상의 가짐: (i) 암 세포의 ADCC 및/또는 CDC를 매개함; (ii) 암 세포의 아폽토시스를 유도하고/거나 촉진함; (iii) 암 세포의 타겟 세포의 증식을 억제함; (iv) 암 세포의 식균 작용의 유도하고/거나 촉진함; 및/또는 (v) 세포독성제의 방출을 유도하고/거나 촉진함; (e) 종양-특이적 탄수화물 항원인 종양-연관 탄수화물 항원에 특이적으로 결합함; (f) 비-암세포, 비-종양 세포, 양성 암세포 및/또는 양성 종양 세포 상에서 발현된 항원에 결합하지 않음; 및/또는 (g) 암 줄기 세포 및 정상 암 세포 상에서 발현된 종양-연관 탄수화물 항원에 특이적으로 결합함.
바람직하게는, 개개 항원에 대한 항체의 결합은 특이적이다. 용어 "특이적"은 일반적으로, 결합쌍의 하나의 구성원이 이의 특이적 결합 파트너(들)와는 다른 분자에 대한 임의의 상당한 결합을 나타내지 않을 것이고, 예를 들어, 본원에 기술된 것 이외의 임의의 다른 분자와 약 30% 미만, 바람직하게는, 20%, 10%, 또는 1% 교차-반응성을 갖는 상황을 지칭하기 위해 사용된다.
항체는 고친화력(낮은 KD 값)으로 타겟 에피토프에 대한 적합한 결합이며, 바람직하게는, KD는 나노몰 범위 또는 그 미만이다. 친화력은 예를 들어, 표면 플라스몬 공명과 같은, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
예시적인 항체 제조
본원에 기술된 Globo H 에피토프 및 SSEA-4 에피토프에 결합할 수 있는 예시적 항체는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다[예를 들어, Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold 참조]. 본 발명은 탄수화물 항원(예를 들어, Globo H)에 특이적으로 결합하는 항체를 발현시키는 하이브리도마를 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 하기 단계를 포함한다: 동물을, 탄수화물 항원(예를 들어, Globo H)을 포함하는 조성물로 면역화하는 단계; 동물로부터 비장 세포를 단리하는 단계; 비장 세포로부터 하이브리도마를 생성하는 단계; 및 Globo H에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택하는 단계[Kohler and Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988].
일 구현예에서, 탄수화물 항원은 마우스를 피하로 면역화하기 위해 사용된다. 하나 이상의 부스트(boost)가 제공될 수 있거나 제공되지 않을 수 있다. 혈장에서 항체의 역가는 예를 들어, ELISA(효소-결합된 면역흡착 검정) 또는 유세포 분석법에 의해 모니터링될 수 있다. 항-탄수화물 항원 항체의 충분한 역가를 갖는 마우스는 융합을 위해 사용된다. 마우스는 희생 및 비장의 제거 3일전에 항원으로 부스팅될 수 있거나 부스팅되지 않을 수 있다. 마우스 비장 세포는 단리되고 PEG와 함께 마우스 골수종 세포주에 융합된다. 얻어진 하이브리도마는 이후에 항원-특이적 항체의 생성에 대해 스크리닝된다. 세포는 선택적 배지에 플레이팅되고, 이후에 인큐베이션된다. 개개 웰로부터의 상청액은 이후에 ELISA에 의해 인간 항-탄수화물 항원 단일클론 항체에 대해 스크리닝된다. 하이브리도마를 분비하는 항체는 반복되고, 다시 스크리닝되고, 항-탄수화물 항원 항체에 대해 여전히 양성인 경우 희석을 제한함으로써 서브클로닝될 수 있다.
탄수화물 항원 중 하나 이상의 면역원성을 증가시키기 위해 애쥬번트가 사용될 수 있다. 애쥬번트의 비제한적인 예는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, MF59(4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v 폴리소르베이트 80(Tween 80), 0.5%> w/v 소르비탄 트리올레에이트 (Span 85)), CpG-함유 핵산, QS21(사포닌 애쥬번트), a-갈락토실-세라마이드 또는 이의 합성 유사체(예를 들어, C34, US 8,268,969호 참조), MPL(모노포스포릴 지질 A), 3DMPL(3-O-데아실화된 MPL), 아퀼라(Aquilla)로부터의 추출물, ISCOMS(예를 들어, Sjolander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713; WO90/03184호; W096/11711호; WO 00/48630호; W098/36772호; WO00/41720호; WO06/134423호 및 WO07/026190호 참조), LT/CT 돌연변이체, 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)(PLG) 마이크로입자, Quil A, 인터류킨, 프로인트, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-nor-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP로 지칭됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835 A, MTP-PE로 지칭됨), 및 2%> 스쿠알렌/트윈 80 에멀젼 중 박테리아로부터 추출된 3가지 성분, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로오스 디미콜레이트 및 세포 벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 함유하는 RIBI를 포함한다.
항-SSEA-4 항체에 대한 예시적 다클론 항체는 혈청에서 요망되는 항체를 증가시키기 위해 시험된 면역화된 포유동물로부터 체혈함으로써, 및 임의의 통상적인 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리함으로써 제조될 수 있다. 다클론 항체는 하클론 항체를 함유한 혈청뿐만 아니라, 혈청으로부터 단리될 수 있는 다클론 항체를 함유한 분획을 포함한다.
다클론 항체는 일반적으로, 관련 항원 및 애쥬번트의 다수의 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 숙주 동물(예를 들어, 토끼, 마우스, 말, 또는 염소)에서 상승된다. 이작용성 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-하이드록시숙신이미드(라이신 잔기를 통함), 글루타르알데하이드, 숙신산 무수물, SOCl2, 등을 사용하여, 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 컨쥬게이션시키는 것이 유용할 수 있다.
임의의 포유류 동물은 요망되는 항체를 생산하기 위한 항원으로 면역화될 수 있다. 일반적으로, 설치류, 토끼목, 또는 영장류의 동물이 사용될 수 있다. 설치류의 동물은 예를 들어, 마우스, 래트, 및 햄스터를 포함한다. 토끼목의 동물은 예를 들어, 토끼를 포함한다. 영장류의 동물은 예를 들어, 카타리니(Catarrhini)의 원숭이(구세계 원숭이), 예를 들어, 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis),레수스 원숭이, 개코원숭이, 및 침펜지를 포함한다.
동물을 항원으로 면역화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 항원의 복강내 주사 또는 피하 주사는 포유동물의 면역화를 위한 표준 방법이다. 더욱 상세하게는, 항원은 적절한 양의 포스페이트 완충 염수(PBS), 생리학적 염수, 등 중에 희석되고 현탁될 수 있다. 요망되는 경우에, 항원 현탁액은 에멀젼으로 제조된 프로인트 완전 애쥬번트와 같은 적절한 양의 표준 애쥬번트와 혼합되고, 이후에 포유류 동물에 투여될 수 있다. 동물은 1 mg 또는 1 ㎍의 펩타이드 또는 컨쥬게이트(각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트 불완전 애쥬번트와 조합함으로써 항원, 면역원성 컨쥬게이트, 또는 유도체에 대해 면역화된다.
동물은 4 내지 21일마다 적절한 양의 프로인트 불완전 애쥬번트와 혼합된 항원의 여러 차례 투여에 의해 역가 안정기까지 부스팅될 수 있다. 동물은 여러 부위에 피하 주사에 의해 프로인트 완전 애쥬번트 중 본래 양의 1/5 내지 1/10의 펩타이드 또는 컨쥬게이트로 부스팅된다. 7일 내지 14일 후에, 동물은 채혈되며, 혈청은 항체 역가에 대해 검정된다. 적절한 담체가 또한 면역화를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역화 후에, 혈청은 요망되는 항체의 양을 증가시키기 위한 표준 방법에 의해 시험된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 항원의 컨쥬게이트지만, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교제를 통해 컨쥬게이션된 컨쥬게이트로 부스팅된다. 컨쥬게이트는 또한, 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양물에서 제조될 수 있다. 또한, 응집제, 예를 들어, 알룸은 면역 반응을 향상시키기 위해 적합하게 사용된다.
지난 20년 내지 30년에 걸쳐, 인간 생체내 치료 적용을 위한 키메라, 인간화된 또는 인간 항체를 제조하기 위한 여러 방법이 개발되었다. 가장 많이 사용되고 입증된 방법은 하이브리도마 방법을 이용하여 마우스 mAb를 제조하고, 이후에 mAb의 VH 및 VL 도메인의 프레임워크 영역 및 불변 도메인을 요망되는 인간 γ 면역글로불린 아이소형 및 하위부류의 인간 VH 및 VL 도메인의 가장 상동성인 인간 프레임워크 영역 및 불변 영역으로 전환시킴으로써 mAb를 인간화시키는 것이다. 졸레어(Xolair)와 같은 여러 mAb는 인간 γ1, κ 아이소형 및 하위부류의 인간화된 mAb이고, 이러한 방법을 이용하여 제조된다.
특정 구현예에서, 항체는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터 또는 토끼는 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 본원의 상기에 기술된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
단일클론 항체를 제조하기 위해, 면역 세포는 항원으로 면역화된 포유동물로부터 수집되고, 상술된 바와 같이 혈청에서 요망되는 항체의 증가된 수준에 대해 체크되고, 세포 융합으로 처리된다. 세포 융합을 위해 사용되는 면역 세포는 바람직하게는, 비장으로부터 획득된다. 상기 면역 세포와 융합되는 다른 바람직한 부모 세포는 예를 들어, 포유류의 골수종 세포, 및 더욱 바람직하게는, 약물에 의해 융합된 세포의 선택을 위한 후천적 성질을 갖는 골수종 세포를 포함한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하고 HAT 배지와 같은 배지에 대해 민감한 것이다. 이러한 것들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어, 소크 연구소 세포 분배 센터(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA)로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유도된 것, 및 미국 세포주 은행(Rockville, Md. USA)으로부터 입수 가능한 SP-2 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 기술되었다[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
상기 면역 세포 및 골수종 세포는 공지된 방법, 예를 들어, 문헌[Milstein et al. (Galfre et al., Methods Enzymol. 73:3-46, 1981)]의 방법에 따라 융합될 수 있다. 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합된다[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. 세포 융합에 의해 얻어진 최종 하이브리도마는 HAT 배지(하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘 함유 배지)와 같은, 표준 선택 배지에서 이를 배양함으로써 선택될 수 있다. 세포 배양은 통상적으로, HAT 배지에서 수일 내지 수주 동안 계속되며, 이러한 시간은 요망되는 하이브리도마(비-융합된 세포)를 제외하고 다른 모든 세포가 사멸하기에 충분한 시간이다. 이후에, 표준 제한 희석은 요망되는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 스크리닝하고 클로닝하기 위해 수행된다.
이에 따라 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된, 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 시딩되고 성장된다. 예를 들어, 부모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 통상적으로, 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이며, 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 유도된 단일클론 항체의 생산에 대해 검정된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 및 시험관내 결합 검정에 의해 결정된다. 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 효소 면역검정(EIA), 방사면역검정(RIA), 및/또는 면역형광에서 흡광도의 측정은 본 발명의 항체의 항원 결합 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명은 항체는 플레이트 상에 고정되며, 본 발명의 단백질은 플레이트에 적용되며, 이후에, 요망되는 항체를 함유한 샘플, 예를 들어, 세포 또는 정제된 항체를 생성하는 항체의 배양 상청액이 적용된다. 이후에, 1차 항체를 인식하고 알칼리 포스파타아제와 같은 효소로 라벨링된 2차 항체가 적용되며, 플레이트가 인큐베이션된다. 다음으로, 세척 후에, 효소 기질, 예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트가 플레이트에 첨가되며, 샘플의 항원 결합 활성을 평가하기 위해 흡광도가 측정된다. 단백질의 단편, 예를 들어, C-말단 또는 N-말단 단편이 이러한 방법에 사용될 수 있다. BIAcore(Pharmacia)는 본 발명에 따른 항체의 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 단일클론 항체의 결합 친화력은 예를 들어, 문헌[Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
상술된 것을 포함하는 통상적인 임의의 방법을 적용하여, 본원에 기술된 에피토프에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 추가 특징분석을 위해 식별되고 선택될 수 있다.
요망되는 특이성, 친화력 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 식별된 후에, 클론은 희석 절차를 제한함으로써 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다[Goding, Monoclonal Antibody: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. 이러한 목적을 위한 적합한 배양 배지는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로오스, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화력 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다. 예를 들어, 얻어진 하이브리도마는 후속하여 마우스의 복강에 이식될 수 있으며, 복수가 수확된다.
얻어진 단일클론 항체는 예를 들어, 암모늄 설페이트 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, 또는 친화력 컬럼에 의해 정제될 수 있으며, 여기에 본 발명의 단백질이 결합된다. 본 발명의 항체는 본 발명의 단백질의 정제 및 검출을 위해 사용될 뿐만 아니라, 본 발명의 단백질의 효능제 및 길항제를 위한 후보물질로서 사용될 수 있다. 또한, 이러한 항체는 본 발명의 단백질과 관련된 질병을 위한 항체 치료에 적용될 수 있다.
재조합 기술
이에 따라 수득된 단일클론 항체는 또한, 유전 공학 기술을 이용하여 재조합으로 제조될 수 있다[예를 들어, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. Therapeutic Monoclonal Antibody, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD, 1990]. DNA 인코딩 항체는 면역 세포, 예를 들어, 하이브리도마 또는 면역화된 림프구 생산 항체로부터 클로닝되고, 적절한 벡터에 삽입되고, 재조합 항체를 제조하기 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 발명은 또한, 상기에 기술된 바와 같이 제조된 재조합 항체를 제공한다.
얻어진 항체가 인간 신체에 투여될 때(항체 치료), 인간 항체 또는 인간화된 항체가 면역원성을 감소시키기 위해 바람직하다. 예를 들어, 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물은 단백질, 단백질 발현 세포, 또는 이의 용해물로부터 선택된 항원으로 면역화될 수 있다. 항체 생성 세포는 이후에 동물로부터 수집되고 하이브리도마를 수득하기 위해 골수종 세포와 융합되며, 이로부터 단백질에 대한 인간 항체가 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체를 생성하는, 면역 세포, 예를 들어, 면역화된 림프구는 종양 유전자에 의해 불명화되고 단일클론 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
단일클론 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써) 용이하게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 소스로서 역할을 하다. 단리된 직후에, DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있으며, 이는 이후에 재조합 숙주 세포에서 단일클론의 합성을 얻기 위해, 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 대장균, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 트랜스펙션된다. 항체를 인코딩하는 DNA의 박테리아에서 재조합 발현에 대한 검토 문헌은 문헌[Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Rev., 130:151-188(1992)]을 포함한다.
상술된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체를 인코딩하는 DNA는 유전적으로 조작된 항체를 생성하기 위해 일상적인 기술을 통해 유전적으로 변형될 수 있다. 유전적으로 조작된 항체, 예를 들어, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 및 이중특이적 항체는 예를 들어, 통상적인 재조합 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA는 이후에, 예를 들어, 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 코딩 서열로 치환함으로써[Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851], 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열 모두 또는 일ㄹ부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 그러한 방식으로, 유전적으로 조작된 항체, 예를 들어, "키메라" 또는 "하이브리드" 항체는 타겟 항원의 결합 특이성을 갖도록 제조될 수 있다.
"키메라" 항체의 생산을 위해 개발된 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[예를 들어, Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; 및 Takeda et al. (1984) Nature 314:452].
통상적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 이러한 것은 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 이가 항체를 생성하기 위해 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환된다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 또한, 가교제를 포함하는 것을 포함하는, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디설파이드-교환 반응을 이용하여 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 작제화될 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간인 소스로부터 여기에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로서 지칭되며, 이는 "유입" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 윈터 및 공동 연구자의 방법에 따라 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 본질적으로 수행될 수 있다[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]. 이에 따라, 이러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체이며[미국특허 제4,816,567호], 여기서, 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 것이 비-인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환되었다. 실제로, 인간화된 항체는 통상적으로, 일부 CDR 잔기 및 가능하게 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다.
인간화된 항체를 제조하는 데 사용되는, 경쇄 및 경쇄 둘 모두인 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "최적-적합" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 가까운 인간 서열은 이후에 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크(FR)로서 허용된다[Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]. 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유도된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 수 개의 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다[Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Prestaetal., J. Immnol., 151:2623 (1993)].
항체가 항원에 대한 높은 친화력 및 다른 유리한 생물학적 성질의 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따르면, 인간화된 항체는 부모 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용하여 부모 서열 및 다양한 개념적 인간화된 산물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 상업적으로 입수 가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 이의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자로부터 선택되고, 요망되는 항체 특징, 예를 들어, 타겟 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 달성되도록 서열을 가져올 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여된다.
대안적으로, 면역화 시에, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에서 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)를 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래하는 것이 기술되었다. 이러한 생식선 돌연변이 마우스에서 인간 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 접종 시에 인간 항체의 생산을 초래할 것이다[예를 들어, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258(1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993) 참조]. 인간 항체는 또한, 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유도될 수 있다[Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)].
본원에 기술된 임의의 항-SSEA-4 항체를 인코딩하는 핵산(중쇄, 경쇄, 또는 둘 모두를 포함함), 벡터, 예를 들어, 핵산 중 하나 이상을 포함하는 발현 벡터, 및 벡터 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포는 또한, 본 개시의 범위 내에 속한다. 일부 예에서, 벡터는 본원에 기술된 바와 같이 항-Globo H 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 중 하나를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 예에서, 벡터는 본원에 기술된 바와 같은 항-SSEA-4 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 예에서, 벡터는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 둘 모두를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이의 발현은 단일 프로모터 또는 2개의 별개의 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 또한, 본원에는 예를 들어, 본원에 기술된 재조합 기술을 통해, 본원에 기술된 바와 같은 임의의 항-Globo H 및 항-SSEA-4 항체를 생산하는 방법이 제공된다.
항체를 제조하기 위한 다른 기술
특정 구현예에서, 완전 인간 항체는 특정 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수 가능한 마우스를 사용함으로써 얻어질 수 있다. 더욱 요망되거나(예를 들어, 완전 인간 항체) 더욱 강력한 면역 반응을 생성하도록 설계된 형질전환 동물은 또한, 인간화된 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예에는 Amgen, Inc.(Fremont, Calif.)로부터의 XenomouseRTM 및 Medarex, Inc.(Princeton, N.J.)로부터의 HuMAb-MouseRTM 및 TC MouseTM가 있다. 대안적으로, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합으로 제조될 수 있다[예를 들어, 미국특허 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455]. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553)은 비면역화된 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터, 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생성하기 위해 사용될 수 있다.
온전한 항체(즉, 전장 항체)의 항원-결합 단편은 일상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자, 및 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기술된 항-Globo H 및 항-SSEA-4 항체는 문헌[McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al., J. Mol Biol., 222:581-597 (1991)]에 기술된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리(예를 들어, 단쇄 항체 파지 라이브러리)로부터 단리될 수 있다. 후속 출판물에는 사슬 셔플링에 의한 높은 친화력(nM 범위) 인간 항체의 생산(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐만 아니라, 매우 큰 파지 라이브러리를 작제화하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))이 기술되어 있다. 이에 따라, 이러한 기술은 단일클론 항체의 단리를 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대안이다.
본원에 기술된 바와 같이 얻어진 항체는 동질성으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체의 분리 및 정제는 일반 단백질에 대해 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체는 친화력 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석(salting-out), 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전 포커싱, 등(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)(그러나, 이로 제한되지 않음)의 적절하게 선택되고 조합된 사용에 의해 분리되고 단리될 수 있다. 상기와 같이 얻어진 항체의 농도는 흡광도 측정, 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 등에 의해 결정될 수 있다. 친화력을 제외한, 예시적 크로마토그래피는 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 등을 포함한다[Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996]. 크로마토그래피 절차는 HPLC 또는 FPLC와 같은 액상 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.
항체는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 특징될 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 항원이 결합하는 에피토프, 또는 "에피토프 맵핑"을 식별하는 것이다. 예를 들어, 문헌[Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]에 기술된 바와 같이, 항체-항원 복합물의 결정 구조를 해석하는 것, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩타이드-기반 검정을 포함하는, 단백질 상에 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징분석하기 위한 당해 분야에 공지된 여러 방법이 존재한다. 추가로, 에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프(예를 들어, 아미노산의 단일 스트레치에 함유됨) 또는 단일 스트레치(1차 구조 선형 서열)에 반드시 함유되는 것은 아닐 수 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 구조적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이(예를 들어, 적어도 4 내지 6개의 아미노산 길이)의 펩타이드는 단리되거나 합성되고(예를 들어, 재조합으로) 항체로의 결합 검정을 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프는 타겟 항원 서열로부터 유도된 중첩 펩타이드를 사용하고 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적인 스크리닝에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, 타겟 항원을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 무작위적으로 또는 특정 유전적 작제화에 의해 단편화되며, 시험되는 항체로 항원의 발현된 단편의 재활성이 결정된다. 유전자 단편은 예를 들어, 방사성 아미노산의 존재 하에서, 시험관내에서 PCR에 의해 생성되고 이후에 단백질로 전사되고 번역될 수 있다. 방사성 라벨링된 항원 단편에 대한 항체의 결합은 이후에 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정의 에피토프는 또한, 파지 입자의 표면 상에 표시된 랜덤 펩타이드 서열의 큰 라이브러리(파지 라이브러리)를 사용함으로써 식별될 수 있다. 대안적으로, 중첩하는 펩타이드 단편의 규정된 라이브러리는 단순 결합 검정에서 시험 항체에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다.
추가 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이 유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발은 에피토프 결합을 위해 요망되고/거나 충분하고/거나 필요한 잔기를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 도메인 스와핑 실험은 후보 항체에 대한 결합 에피토프에서의 다양한 잔기가 밀접하게 관련이 있지만 항원적으로 별개의 단백질(뉴로트로핀 단백질 패밀리의 다른 구성원)로부터의 서열로 대체(스와핑)되는 타겟 항원의 돌연변이체를 사용하여 수행될 수 있다. 돌연변이 타겟 단백질에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 항원 단편의 중요성이 평가될 수 있다.
대안적으로, 경쟁 검정은 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프(예를 들어, 본원에 기술된 MC45 항체)에 결합하는 지의 여부를 결정하기 위해 동일한 항원에 결합하는 것으로 알려진 다른 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 경쟁 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
예시적인 적합한 일반 항체 생산 방법의 추가 양태
동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양, 또는 말))에서 단일클론 및 다클론 항체 및 이의 단편을 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[예를 들어, Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]. 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이의 단편, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, scFv(단쇄 항체), 및 dAb를 포함한다[도메인 항체; Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544].
본원에 개시된 조성물은 약제 조성물에, 본 개시를 읽으면 당업자에게 식별 가능한 추가 활성제, 담체, 비히클, 부형제, 또는 보조제와 함께 포함될 수 있다.
약제 조성물은 바람직하게는, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 약제 조성물에서, 본원에 개시된 조성물은 "활성제"로도 지칭되는 "활성 화합물"을 형성한다. 본원에서 사용되는 언어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여와 혼화 가능한, 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 등을 포함한다. 보제 활성 화합물은 또한, 조성물에 도입될 수 있다. 약제 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피부내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(예를 들어, 국소), 경피, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피부내, 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예를 들어, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트제, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트, 및 장력의 조정을 위한 작용제, 예를 들어, 나트륨 클로라이드 또는 덱스트로오스, pH는 산 또는 염기, 예를 들어, 염산 또는 나트륨 하이드록사이드로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 시린지, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 담을 수 있다.
적어도 하나의 항-SSEA-4 항체 또는 항-SSEA-4 항체를 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 조성물은 약제 조성물일 수 있다. 본원에서 사용되는 조성물은 하나 이상의 SSEA-4에 결합하는 하나 이상의 항체, 및 하나 이상의 SSEA-4에 결합하는 하나 이상의 항체를 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를포함한다. 이러한 조성물은 적합한 담체, 예를 들어, 완충제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
일 구현예에서, 항-SSEA-4 항체는 단일클론이다. 다른 구현예에서, 항-SSEA-4 항체의 단편(예를 들어, Fab, Fab'-SH 및 F(ab')2 단편)이 제공된다. 이러한 항체 단편은 전통적인 수단, 예를 들어, 효소 소화에 의해 생성될 수 있거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 항체 단편은 키메라, 인간화된, 또는 인간일 수 있다. 이러한 단편은 하기에 기술되는 진단 및 치료 목적을 위해 유용하다.
다양한 방법은 고려되는 항체가 얻어질 수 있는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위해 당해 분야에 공지되어 있다. 고려되는 항체를 생성하는 하나의 방ㅂ버은 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에 기술된 바와 같이 파지 항체 라이브러리의 사용을 통한 것이다.
본 발명의 항-SSEA-4 항체는 요망되는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위해 조합 라이브러리를 이용함으로써 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역(Fv)의 다양한 단편을 표시하는 파지를 함유한 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리는 요망되는 항원에 대해 친화력 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 요망되는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현시키는 클론은 항원에 흡착되고, 이에 따라, 라이브러리에서 비-결합 클론으로부터 분리된다. 결합 클론은 이후에, 항원으로부터 용리되고, 항원 흡착/용리의 추가 사이클에 의해 추가로 농축될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-SSEA-4 항체는 문헌[Kabat et al., Sequences of Protein of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기술된 바와 같이, 고려되는 파지 클론을 선택하기 위해 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계하고 이후에 고려되는 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 적합한 불변 영역(Fc) 서열을 사용하여 전장 항-SSEA-4 항체 클론을 작제화함으로써 얻어질 수 있다.
항체의 항원-결합 도메인은 약 110개의 아미노산의 2개의 가변(V) 영역으로부터 형성되며, 각각은 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 영역이며, 둘 모두는 3개의 초가변 루프 또는 상보성-결정 영역(CDR)을 제공한다. 가변 도메인은 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이, VH 및 VL이 짧은 가요성 펩타이드를 통해 공유 결합된 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서, 또는 각각 불변 도메인에 융합되고 비공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 파지 상에 기능적으로 디스프레이될 수 있다. 본원에서 사용되는 scFv 인코딩 파지 클론 및 Fab 인코딩 파지 클론은 총괄적으로, "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위적으로 재조합될 수 있으며, 이는 이후에 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 항원-결합 클론에 대해 조사될 수 있다. 면역화된 소스로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제화하는 요건 없이 면역원에 고-친화력 항체를 제공한다. 대안적으로, 천연 레퍼토리는 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이 어떠한 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 인간 항체의 단일 소스를 제공하기 위해 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 천연 라이브러리는 또한, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 세그먼트를 클로닝함으로써 및 고도로 가변 CDR3 영역을 인코딩하고 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)]에 기술된 바와 같이 시험관내에서 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유한 PCR 프라이머를 사용하여 합성적으로 제조될 수 있다.
사상 파지는 작은 코트 단백질 pIII에 대한 융합에 의해 항체 단편을 표시하기 위해 사용된다. 항체 단편은 단쇄 VH 및 VL 도메인은 예를 들어, 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기술된 바와 같이, 유연한 폴리펩타이드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩타이드 사슬 상에 연결된 Fv 단편으로서, 또는 하나의 사슬이 pIII에 융합되며 다른 하나가 문헌[Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기술된 바와 같이, 야생형 코트 단백질의 일부를 대체함으로써 파지 vyus 상에 Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리가 표시되는 박테리아 숙주 세포 세포질로 분비되는 Fab 단편으로서 표시될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 인코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수확된 면역 세포로부터 얻어진다. 항-SSEA-4 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 요망되는 경우에, 대상체는 항체 반응을 생성하기 위해 SSEA-4로 면역화되며, 비장 세포 및/또는 순환하는 B 세포 또는 다른 말초 혈액 림프구(PBL)는 라이브러리 작제를 위해 회수된다. 일 구현예에서, 항-인간 SSEA-4 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 SSEA-4 면역화가 SSEA-4에 대해 인간 항체를 생성하는 B 세포를 생성시키도록 기능성 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 운반하는(및 기능성 내인성 항체 생산 시스템이 결여된) 형질전환 마우스에서 항-인간 SSEA-4 항체 반응을 생성시킴으로써 얻어진다. 인간 항체-생산 형질전환 마우스의 생성은 하기에 기술된다.
항-SSEA-4 반응성 세포 집단에 대한 추가 농축은 SSEA-4-특이적 항체를 발현시키는 B 세포를 단리시키기 위한 적합한 스크리닝 절차를 이용함으로써, 예를 들어, 형광색소-표지된/SSEA-4에 대한 세포의 SSEA-4 친화력 크로마토그래피 또는 합축/이후 유동-활성화 세포 분류(FACS)로의 세포 분리에 의해 얻어질 수 있다.
대안적으로, 면역화되지 않은 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은 가능한 항체 레퍼토리의 더 양호한 묘사를 제공하고, 또한 SSEA-4가 항원성이 아닌 임의의 동물(인간 또는 비-인간) 종을 사용하여 항체 라이브러를 작제화할 수 있다. 시험관내 항체 유전자 작제를 도입한 라이브러리에 대하여, 줄기 세포는 재배열되지 않은 항체 유전자 세그먼트를 인코딩하는 핵산을 제공하기 위해 대상체로부터 수확된다. 고려되는 면역 세포는 다양한 동물 종, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 이리(luprine), 개, 고양이, 돼지, 소, 말 및 조류 종, 등으로부터 얻어질 수 있다.
항체 가변 유전자 세그먼트(VH 및 VL 세그먼트를 포함함)를 인코딩하는 핵산은 고려되는 세포로부터 회수되고, 증폭된다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우에, 요망되는 DNA는 문헌[Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기술된 바와 같이, 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리시키고 이후에 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 단부를 매칭시키는 프라이머로 폴리머라이제 연쇄 반응(PCR)을 수행함으로써 수득될 수 있으며, 이에 의해, 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리를 제조할 수 있다. V 유전자는 문헌[Orlandi et al. (1989) and in Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기술된 바와 같이, cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있으며, 엑손의 5' 단부에서 백 프라이머는 성숙 V-도메인을 인코딩하며, 포워드 프라이머는 J-세그먼트 내에 기반으로 한다. 그러나, cDNA에서 증폭하기 위해, 백 프라이머는 또한 문헌[Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기술된 바와 같은 리더 엑손을 기초로 할 수 있으며, 포워드 프라이머는 문헌[Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기술된 바와 같이 불변 영역 내에 있을 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 퇴화는 문헌[Orlandi et al. (1989) 또는 Sastry et al. (1989)]에 기술된 바와 같이 프라이머에 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어, 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법 및 문헌[Orum et al., Nucleic Acid Res., 21: 4491-4498(1993)]의 방법에 기술된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플에 존재하는 모든 이용 가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각 V-유전자 패밀리에 타겟화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터에 클로닝하기 위해, 드문 제한 부위는 문헌[Orlandi et al. (1989)]에 기술된 바와 같이 한 단부에 태그로서 또는 문헌[Clackson et al., Nature, 352: 624-628(1991)]에 기술된 바와 같이 태그화된 프라이머로의 추가 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 V 유전자 세그먼트로부터 시험관내에서 유도될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 세그먼트는 클로닝되고 시퀀싱되고(문헌[Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798(1992)]에 보고됨), 맵핑되며(문헌[Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 이러한 클로닝된 세그먼트(H1 및 H2 루프의 주요 형태 모두를 포함함)는 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)]에 기술된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 인코딩하는 PCR 프라이머와 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 문헌[Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기술된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성으로 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 세그먼트는 클로닝되고 시퀀싱되고(문헌[Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 소정 범위의 VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이를 기초로 한 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 인코딩할 것이다. V-유전자 인코징 DNA의 증폭 후에, 생식계열 V-유전자 세그먼트는 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 여러 방식으로 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 함께 결합시큼으로서 작제화될 수 있다. 각 레퍼토리는 상이한 벡터에서 생성될 수 있으며, 벡터는 예를 들어, 문헌[Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기술된 바와 같이, 시험관내에서 또는 생체내에서 조합 감염, 예를 들어, 문헌[Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기술된 loxP 시스템에 의해 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 방법은 대장균 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기에 대한 한계를 극복하기 위해 Fab 단편의 2-사슬 특성을 이용한다. 고유 VH 및 VL 레퍼토리는 별도로 클로닝되는데, 하나는 파지미드 내에 및 다른 하나는 파지 벡터 내에 클로닝된다. 2개의 라이브러리는 이후에, 각 세포가 상이한 조합을 함유하고 라이브러리 크기가 존재하는 세포의 수(약 1012개의 클론)에 의해서만 제한되도록 파지미드-함유 박테리아의 파지 감염에 의해 결합된다. 두 벡터 모두는, VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘 상에서 재조합되고 파지 비리온에 동시-패키징되도록 생체내 재조합 신호를 함유한다. 이러한 힌지 라이브러리는 다수의 양호한 친화력의 다양한 항체를 제공한다.
대안적으로, 레퍼토리는 예를 들어, 문헌[Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기술된 바와 같이 동일한 벡터 내에 순차적으로 클로닝되거나, 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature, 352: 624-628(1991)]에 기술된 바와 같이, PCR에 의해 함께 어셈블링되고 이후에 클로닝될 수 있다. PCR 어셈블리는 또한, 단쇄 Fv(scFv) 레퍼토리를 형성하기 위해 가요성 펩타이드를 인코딩하는 DNA와 함께 VH 및 VL DNA를 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, "세포 PCR 어셈블리에서"는 문헌[Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기술된 바와 같이 PCR에 의해 림프구 내에서 VH 및 VL 유전자를 결합시키고 이후에 결합된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하기 위해 사용된다.
라이브러리의 스크리닝은 임의의 당해 분야에 공지된 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, SSEA-4 타겟은 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용되거나, 흡착 플레이트에 부착되거나 세포 분류에서 사용되는 숙주 세포 상에서 발현되거나, 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기위한 비오틴에 컨쥬게이션되거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 당해 분야에 공지된 방법에서 사용될 수 있다.
파지 라이브러리 샘플은 흡착제와 파지 입자의 적어도 일부의 결합을 위해 적합한 조건 하에서 고정된 SSEA-4와 접촉된다. 일반적으로, pH, 이온 강도, 온도, 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하기 위해 선택된다. 고체상에 결합된 파지는 예를 들어, 문헌[Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기술된 바와 같은 산에 의해, 또는 예를 들어, 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기술된 바와 같은 알칼리에 의해, 또는 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature, 352: 624-628(1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차에서 SSEA-43/항원 경쟁에 의해 세척되고 이후에 용리된다. 파지는 단일 선택 라운드에서 20 내지 1,000배 농축될 수 있다. 또한, 농축된 파지는 박테리아 배양물에서 성장되고 추가 선택 라운드로 처리될 수 있다.
선택 효율은 세척 동안 해리 동력학, 및 단일 파지 상의 다수의 항체 단편이 동시에 항원과 결합하는 지의 여부를 포함하는 여러 인자에 따라 달라진다. 빠른 해리 동력학(및 약한 결합 친화력)을 갖는 항체는 짧은 세척, 다가 파지 디스플레이 및 고체상에서 항원의 높은 코팅 밀도의 사용에 의해 유지될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라 해리된 파지의 재결합을 선호한다. 느린 해리 동력학(및 양호한 결합 친화력)을 갖는 항체의 선택은 문헌[Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690호에 기술된 바와 같은 긴 세척 및 일가 파지 디스플레이, 및 문헌Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)[]에 기술된 바와 같은 항원의 낮은 코팅 밀도의 사용에 의해 증진될 수 있다.
SSEA-4에 대해 친화력이 약간 상이하더라도, 상이한 친화력의 파지 항체 중에서 선택하는 것이 가능하다. 그러나, 선택된 항체의 랜덤 돌연변이(예를 들어, 상술된 친화력 성숙 기술 중 일부에서 수행됨)는 대부분 항원에 결합하고 소수가 더 높은 친화력을 갖는, 여러 돌연변이체를 유발할 수 있다. SSEA-4를 제한하면, 드문 높은 친화력 파지가 경쟁할 수 있다. 모두 더 높은 친화력 돌연변이체를 유지하기 위해, 파지는 과량의 비오틴화된 SSEA-4와 함께 인큐베이션될 수 있지만, SSEA-4에 대한 타겟 몰 친화력 상수보다 낮은 몰 농도의 비오틴화된 SSEA-4와 함께 인큐베이션될 수 있다. 높은 친화력-결합 파지는 이후에 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포착될 수 있다. 이러한 "평형 포획"은 낮은 친화력을 갖는 매우 과량의 파지로부터 최소 2배 더 높은 친화력을 갖는 돌연변이 클론을 단리할 수 있는 민감성과 함께, 결합 친화력에 따라 항체가 선택될 수 있게 한다. 고체 파지에 결합된 파지를 세척하는 데 사용되는 조건은 또한, 해리 동력학을 기초로 하여 식별하도록 조작될 수 있다.
항-SSEA-4 클론이 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 SSEA-4 리간드와 SSEA-4 간의 결합을 차단하지만, SSEA-4 리간드와 제2 단백질 간의 결합을 차단하지 않는 항-SSEA-4 항체를 제공한다. 이러한 항-SSEA-4 항체에 해당하는 Fv 클론은 (1) 상기 섹션 B(I)(2)에 기술된 파지 라이브러리로부터 항-SSEA-4 클론을 단리시키고, 선택적으로, 적합한 박테리아 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 파지 클론의 단리된 집단을 증폭시키고; (2) 활성의 차단 및 비-차단 각각이 요망되는 것에 대해 SSEA-4 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 고정된 SSEA-4에 항-SSEA-4 파지 클론을 흡착시키고; (4) 제2 단백질의 결합 결정인자와 중첩하거나 공유되는 SSEA-4-결합 결정인자를 인식하는 임의의 요망되지 않는 클론을 용리시키기 위해 과량의 제2 단백질을 사용하고; (5) 단계 (4) 후에 흡착된 채로 유지된 크론을 용리하는 것에 의해 선택될 수 있다. 선택적으로, 요망되는 차단/비-차단 성질을 갖는 클론은 본원에 기술된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 추가로 농축될 수 있다.
본 발명의 Fv 클론을 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 고려되는 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 시퀀싱된다. 단리된 직후에, DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있으며, 이는 이후에, 재조합 숙주 세포에서 요망되는 단일클론 항체의 합성을 얻기 위해, 숙주 세포, 예를 들어, 대장균, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생선하지 않는 골수종 세포에 트랜스펙션된다. 항체-인코딩 DNA의 박테리아에서 재조합 발현에 대한 리뷰 문헌은 문헌[Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)]을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 인코딩하는 DNA는 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 클론을 형성하기 위해 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 공지된 DNA 서열(예를 들어, 적절한 DNA 서열은 문헌[Kabat et al., supra]으로부터 수득될 수 있음)과 결합될 수 있다. 이러한 목적을 위해 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 아이소형의 불변 영역이 사용될 수 있으며, 이러한 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 하나의 동물(예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유도되고, 이후에, 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드", 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 위한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에서 사용되는 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 일 구현예에서, 인간 가변 DNA로부터 유도된 Fv 클론은 모든 인간, 전장 및 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 위한 코딩 서열(들)을 형성하기 위해 인간 불변 영역 DNA에 융합된다.
천연 라이브러리(천연 또는 합성)에 의해 생성된 항체는 중간 정도의 친화력을 가질 수 있지만, 친화력 성숙은 또한, 문헌[Winter et al. (1994), supra]에 기술된 바와 같이 2차 라이브러리로부터 작제화하고 재석택함으로써 시험관내에서 모방될 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 자연 발생 항체 서열을 배제할 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이는 문헌[Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌[Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 오류 발생하기 쉬운 폴리머라아제(문헌[Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 사용함으로써 시험관내에서 랜덤으로 도입될 수 있다. 추가적으로, 친화력 성숙은 예를 들어, 선택된 개개 Fv 클론에서, 고려되는 CDR에 걸쳐 랜덤 서열을 운반하는 프라이머와 함께 PCR을 이용하여 하나 이상의 CDR을 무작위적으로 돌연변이시키고 더 높은 친화력 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 9607754호(1996년 3월 14일에 공개됨)에는 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이 유발을 유도하는 방법이 기술되어 있다. 다른 효과적인 방법은 문헌[Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기술된 바와 같이 비면역화된 공여자로부터 수득된 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리와 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 결합시키고 사슬 재셔플링의 여러 라운드에서 더 높은 친화력을 스크린하는 것이다. 이러한 기술은 10-9 M 범위의 친화력을 갖는 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다. 이의 다른 방법.
항-SSEA-4 항체 생성
항체를 생성하고 이의 친화력을 평가하는 다른 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); 미국특허 제4,816,567호; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986; Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987; Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980); Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989); Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]에 기술되어 있다.
일반 방법
일반적으로, 본 발명은 친화력-성숙된 SSEA-4 항체를 제공한다. 이러한 항체는 SSEA-4에 대한 증가된 친화력 및 특이성을 갖는다. 이러한 친화력 및 민감성의 증가는 본 발명의 분자가 (a) 본 발명의 분자의 증가된 민감성, 및/또는 (b) 본 발명의 분자에 의한 SSEA-4의 긴밀한 결합에 의해 혜택을 받은 적용 및 방법에서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, SSEA-4 항체는 하나 이상의 SSEA-4 활성의 부분 또는 전체 차단이 요망되는 SSEA-4-매개 장애의 치료를 위해 유용하다. 일 구현예에서, 본 발명의 항 SSEA-4 항체는 암을 치료하기 위해 사용된다.
본 발명의 항-SSEA-4 항체는 질량 분석법 또는 유전자 조작에 대한 필요성 없이 면역침전, ELISA, 또는 면역현미경법과 같은 간단하고 일상적인 생체분자 검정에서 에피토프의 민감하고 특이적인 검출을 가능하게 한다. 또한, 이는 이러한 경로의 정상 기능을 관찰 및 설명하고 경로가 비정상적으로 작동할 때를 감지하는 데 상당한 이점을 제공한다.
본 발명의 SSEA-4 항체는 또한, 질병의 발병 및 발병기전에 대한 역할을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상술된 바와 같이, 본 발명의 SSEA-4 항체는 TACA가 하나 이상의 질병 상태와 연관될 수 있는 일반적으로 일시적으로 발현되는 지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 SSEA-4 항체는 본 발명의 항-SSEA-4 항체가 특이적이지 않은 SSEA-4의 정상 활성을 방해하지 않으면서 하나 이상의 SSEA-4가 비정상적으로 조절되거나 비정상적으로 기능하는 질병을 치료하기 위해 추가로 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 다양한 세포 타입 및 조직에서 암 상태의 검출을 위한 시약으로서 유용성을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 항-SSEA-4 항체는 본 발명의 대상 항체와 유사한 활성 패턴을 차단하는 SSEA-4 길항제의 개발을 위해 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 동일한 SSEA-4 결합 특징 및/또는 SSEA-4 경로를 차단하는 능력을 갖는 다른 항체를 결정하고 식별하기 위해 사용될 수 있다.
추가 예로서, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 선형 및 형태적 에피토프를 포함하는, 본원에 예시된 항체와 실질적으로 동일한 SSEA-4의 항원성 결정인자(들)와 결합하는 다른 항-SSEA-4를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 항-SSEA-4 항체는 항체와 마찬가지로 SSEA-4에 대한 하나 이상의 결합 파트너의 결합을 차단하는 데 유사한 약리학적 효과를 나타내는 SSEA-4의 소분자 길항제를 스크리닝하기 위해 SSEA-4가 관여되는 생리학적 경로를 기초로 하는 검정에서 사용될 수 있다.
항체의 생성은 하이브리도마 기술 및 바인더 분자의 파지 디스플레이된 라이브러리의 스크리닝과 같은, 본원에 기술된 것을 포함하는, 당업계의 일상적인 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야에서 잘 확립되어 있다.
간단하게, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 요망되는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위해 조합 라이브러리를 사용함으로써 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역(Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유한 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리는 요망되는 항원에 대한 친화력 크로마토그래피에 의해 패닝된다(panned). 요망되는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현시키는 클론은 항원에 흡착되고, 이에 따라, 라이브러리에서 비-결합 클론으로부터 분리된다. 결합 클론은 이후에 항원으로부터 용리되고, 항원 흡착/용리의 추가 사이클에 의해 추가로 농축될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-SSEA-4 항체는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기술된 바와 같이, 고려되는 파지 클론을 선택하기 위해 적합ㅎ나 항원 스크리닝 절차를 설계하고 이후에, 고려되는 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 적헙한 불변 영역(Fc) 서열을 사용하여 전장 항-SSEA-4 항체 클론를 작제화함으로써 수득될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 단일클론이다. 또한, 본원에 제공된 항-SSEA-4 항체의 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2 단편 및 이의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 항체 단편은 효소 소화와 같은 전통적인 수단에 의해 생성될 수 있거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 항체 단편은 키메라, 인간, 또는 인간화될 수 있다. 이러한 단편은 본원에 기술된 실험, 진단 및 치료 목적을 위해 유용하다.
단일클론 항체는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득될 수 있으며, 즉, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 이에 따라, 수식어 "단일클론"은 별개 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다.
본 발명의 항-SSEA-4 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에서 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 포함하는, 당해 분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 제조될 수 있거나, 대안적으로, 이러한 것은 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해, 이를 인코딩하는 핵산은 단리되고 추가 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터에 삽입된다. 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 시퀀싱된다. 다수의 벡터가 이용 가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵(일반적으로 포유류) 기원의 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 목적을 위해 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 아이소형의 불변 영역이 사용될 수 있으며, 이러한 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
원핵 숙주 세포를 사용한 항체 생성
벡터 작제화
본 발명의 항체의 폴리펩타이드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 재조합 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 요망되는 폴리뉴클레오타이드 서열은 하이브리도마 세포와 같은 항체 생성 세포로부터 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 수득된 직후에, 폴리펩타이드를 엔코딩하는 서열은 원핵 숙주에서 이종 폴리뉴클레오타이드를 복제 및 발현시킬 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 이용 가능하고 당해 분야에 공지된 여러 벡터는 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특ㅈ겅 숙주 세포에 의존적일 것이다. 각 벡터는 이의 기능(이종 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두), 및 존재하는 특정 숙주 세포와의 양립성에 따라, 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로, 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 신호 서열, 이종 핵산 인서트 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립 가능한 종으로부터 유도된 레플리콘 및 제어 서열을 함유한 플라스미드 벡터는 이러한 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 일반적으로 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열뿐만 아니라 복제 부위를 운반한다. 예를 들어, 대장균은 통상적으로, pBR322, 대장균 종으로부터 유도된 플라스미드를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 임피실린(Amp) 및 테트라사이클린(Tet) 내성을 인코딩하는 유전자를 함유하고, 이에 따라, 형질전환된 세포를 식별하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한, 내인성 단백질의 발현을 위한 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유할 수 있거나, 이를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 문헌[Carter et al. 미국특허 제5,648,237호]에 상세히 기술되어 있다.
또한, 숙주 유기체와 양립 가능한 레플리콘 및 제어 서열을을 함유한 파지 벡터는 이러한 숙주와 관련하여 변형 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예를 들어, λGEM™-11은 대장균 LE392와 같은 감수성 숙주 세포를 변형시키기 위해 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 폴리펩타이드 성분 각각을 인코딩하는, 둘 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 조절하는 시스트론의 업스트림(5')에 위치된 비번역 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 통상적으로, 두 부류, 즉, 유도성 및 보존적에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도 변화에 응하여 이의 제어 하에서 시스트론의 증가된 전사 수준을 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식된 다수의 프로모터가 널리 알려져 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 소스 DNA로부터 프로모터를 제거하고 본 발명의 벡터에 단리된 프로모터 서열을 삽입함으로써 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 시스트론 DNA에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열과 많은 이종 프로모터 모두는 타겟 유전자의 증폭 및/또는 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이종 프로모터는, 이러한 것이 일반적으로 천연 타겟 폴리펩타이드 프로모터에 비해 발현된 타겟 유전자의 더 큰 전사 및 더 높은 수율을 허용하기 때문에 사용된다.
원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, tion를 포함하며, 박테리아에서 제한 효소를 통해 소스 DNA로부터 프로모터(예를 들어, 다른 공지된 박테리아 또는 파지 프로모터)를 제거함으로써 천연 타겟 폴리펩타이드 프로모터에 비해 더 높은 발현된 타겟 유전자의 수율이 또한 적합하다. 이의 뉴클레오타이드 서열은 공개되어 있고, 이에 의해 당업자가 임의의 요망되는 제한 부위에 링커 또는 어댑터를 사용하여 타겟 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 시스트론에 작동하게 결찰할 수 있게 한다[Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269].
본 발명의 일 양태에서, 재조합 벡터 내의 각 시스트론은 막을 가로질러 발현된 폴리펩타이드의 전위를 유도하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 이는 벡터 내에 삽입되는 타겟 폴리펩타이드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리된(즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단된) 것이어야 한다. 이종 폴리펩타이드에 대해 고유한 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵 숙주 세포에 대해, 신호 서열은 예를 들어, 알칼리 포스파타아제, 페니실리나아제, Ipp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 II(STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 본 발명의 일 구현예에서, 발현 시스템의 두 시스트론 모두에서 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 이의 변이체이다.
본 발명에 따른 면역글로불린의 생성은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고, 이에 따라, 각 시스트론 내에 분비 신호 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 세포질 내에서 기능성 면역글로불린을 형성하기 위해 발현, 폴딩, 및 어셈블링된다. 특정 숙주 균주(예를 들어, 대장균 trxB-균주)는 디설파이드 결합 형성을 위해 유리한 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 어셈블리를 허용한다[Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995)].
본 발명의 항체는 또한, 본 발명의 분비되고 적절하게 어셈블링된 항체의 수율을 최대화하기 위해 발현된 폴리펩타이드 성분의 정량적 비율을 조절할 수 있는 발현 시스템을 이용함으로써 생성될 수 있다. 이러한 조절은 적어도 부분적으로 폴리펩타이드 성분에 대한 번역 강도를 동시에 조절함으로써 달성된다.
번역 강도를 조절하기 위한 하나의 기술은 문헌[Simmons et al., 미국특허 제5,840,523호]에 개시되어 있다. 이는 시스트론 내에서 번역 개시 영역(TIR)의 변이체를 사용한다. 제공된 TIR에 대하여, 아미노산 또는 핵산 서열 변이체의 시리즈는 소정 범위의 번역 강도로 생성되어, 특정 사슬의 요망되는 발현 수준에 대해 이러한 인자를 조정하는 보편적인 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경시킬 수 있는 코돈 변화를 초래하는 통상적인 돌연변이 유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열에서의 변화는 사일런트이다. TIR의 변형은 예를 들어, 신호 서열에서의 변형과 함께, 샤인-달가노 서열의 수 또는 간격의 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이 신호 서열을 생성하기 위한 하나의 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는(즉, 변화는 사일런트임) 코딩 서열의 개시에서 "코돈 뱅크"의 생성이다. 이는 각 코돈의 3번째 뉴클레오타이드 위치를 변경함으로써 달성된다. 추가적으로, 일부 아미노산, 예를 들어, 류신, 세린, 및 아르기닌은 뱅크를 제조하는 데 복잡성을 추가할 수 있는 다수의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 이러한 돌연변이 유발 방법은 문헌[Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기술되어 있다.
일 구현예에서, 한 세트의 벡터는 그 안의 각 시스트론에 대한 소정 범위의 TIR 강도로 생성된다. 이러한 제한된 세트는 각 사슬의 발현 수준뿐만 아니라 다양한 TIR 강도 조합 하에서 요망되는 항체 산물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 강도는 문헌[Simmons et al. 미국특허 제5,840,523호]에 상세히 기술된 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 결정될 수 있다. 번역 강도 비교를 기초로 하여, 요망되는 개개 TIR은 본 발명의 발현 벡터 작제물에서 조합되도록 선택된다.
본 발명의 항체를 발현시키기 위해 적합한
원핵 숙주 세포는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 아르카에박테리아 및 유박테리아를 포함한다. 유용한 박테리아의 예는 에스케리키아(예를 들어, 대장균), 바실리(예를 들어, B. 서브틸리스), 엔테로박테리아, 슈도모나스 종(예를 들어, P. 에루기노사), 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세칸스, 클레브시엘라, 프로테우스, 시겔라, 리조비아, 비트레오실라, 또는 파라코쿠스를 포함한다. 일 구현예에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 일 구현예에서, 대장균 세포가 본 발명을 위한 숙주로서 사용된다. 대장균 균주의 예는 유전자형 W3110 인간을 갖는 균주 33D3을 포함하는(Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit NE. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli E. coliCC 31,446) 균주 W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) 및 이의 유도체를 포함하며, 엔도 대장균 RV308(ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이러한 예는 제한적이기 보다는 예시적인 것이다. 규정된 유전자형을 갖는 임의의 상술된 박테리아의 유도체를 작제화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Bass et al., Protein, 8:309-314 (1990)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 박테리아의 세포에서 레플리콘의 복제성을 고려하여 적절한 박테리아를 선택하는 것이 필요하다. 예를 들어, 대장균, 세라티아(Serratia), 또는 살모넬라 종은, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하기 위해 사용될 때 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 통상적으로, 숙주 세포는 소량의 단백질 분햐 효소를 분비해야 하며, 추가 프로테아제 억제제는 바람직하게는 세포 배양물에 도입될 수 있다.
항체 생성
숙주 세포는 상술된 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 요망되는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 적절한 경우 변형된 보편적인 영양 배지 중에서 배양된다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합제에 의해 복제 가능하도록 원색 숙주 내에 DNA를 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 대해 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 칼슘 클로라이드를 사용하는 칼슘 처리는 일반적으로 실질적인 세포벽 배리어를 함유하는 박테리아 세포에 대해 사용된다. 형질전환을 위한 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩타이드를 생성하기 위해 사용되는 원핵 세포는 당해 분야에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양을 위해 적합한 배지 중에서 성장된다. 적합한 배지의 예는 루리아 브로쓰(luria broth)(LB) 플러스 필수 영양 보충제를 포함한다. 특정 구현예에서, 배지는 또한, 발현 벡터를 함유한 원핵 세포의 성장을 선택적으로 가능하게 하기 위해 발현 벡터의 작제를 기초로 하여 선택되는 선택제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린이 암피실린 내성 유전자를 발현시키는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 포스페이트 소스 이외의 임의의 필요한 보충물이 또한 단독으로 또는 복합 질소 소스와 같은 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되는 적절한 농도로 포함될 수 있다. 선택적으로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리스리톨 및 디티로스레이톨로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. 대장균 성장을 위해, 예를 들어, 성장은 약 20℃ 내지 약 39℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 및 약 30℃를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 온도 범위에서 일어난다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라, 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 대장균에 대하여, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0일 수 있다.
본 발명의 발현 벡터에서 유도성 프로모터가 사용되는 경우에, 단백질 발현은 프로모터의 활성화를 위해 적합한 조건 하에서 유도된다. 본 발명의 일 양태에서, PhoA 프로모터는 폴르펩타이드의 전사를 제어하기 위해 사용된다. 이에 따라, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 포스페이트-제한 배지 중에서 배양된다. 일 구현예에서, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다[예를 들어, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147 참조]. 다양한 다른 유도제는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라, 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 발현된 폴리펩타이드는 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 일반적으로 삼투 충격, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 파괴하는 것을 통상적으로 포함한다. 세포가 파괴된 직후에, 세포 파편 또는 전체 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질은 예를 들어, 친화력 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지로 수송되고 그 안에서 단리될 수 있다. 세포는 배양물로부터 제거될 수 있으며, 배양 상청액은 추가 정제를 위해 여과되고 농축된다. 발현된 폴리펩타이드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 일반적으로 공지된 방법을 이용하여 추가로 단리되고 식별될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 공급-배치 발효 절차는 재조합 단백질의 생산을 위해 이용 가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터 용량, 예를 들어, 약 1,000 내지 100,000 리터 용량을 갖는다. 이러한 발효기는 산소 및 영양소, 특히, 글루코오스(일반 탄소/에너지원)를 분포시키기 위해 교반기 임펠러를 이용한다. 소규모 발효는 일반적으로, 부피 용량이 대략 100 리터 이하인 발효기에서의 발효를 지칭하고, 약 1 리터 내지 약 100 리터의 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 통상적으로, 세포가 적합한 조건 하에서 세포가 초기 정지기에 있는 단계에서 요망되는 밀도까지 성장한 후에 개시된다(예를 들어, 약 180 내지 220의 OD550). 다양한 유도제는 사용되는 벡터 작제물에 따라, 당해 분야에 알려져 있고 상술된 바와 같이 사용될 수 있다. 세포는 유도 전에 더 짧은 기간 동안 성장될 수 있다. 세포는 대개 약 12 내지 50시간 동안 유도되지만, 더 길거나 짧은 유도 시간이 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 생산 수율 및 품질을 개선시키기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩타이드의 적절한 어셈블리 및 폴딩을 개선하기 위해, 샤페론 단백질, 예를 들어, Dsb 단백질(DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA(샤페론 활성을 갖는 펩티딜프로필 시스,트랜스-이소머라아제)를 과발현시키는 추가 벡터는 숙주 원핵 세포로부터 공동-형질변환하기 위해 사용될 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생성된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 용해도를 촉진시키는 것으로 나타났다[Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., 미국특허 제6,083,715호; Georgiou et al., 미국특허 제6,027,888호; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210].
발현된 이종 단백질(특히, 단백질 분해에 민감한 것)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주가 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합과 같은 공지된 박테리아 프로테아제를 인코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이(들)를 달성하기 위해 변형될 수 있다. 일부 대장균 프로테아제-결핍 균주는 입수 가능하고, 예를 들어, 문헌[Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., 미국특허 제5,264,365호; Georgiou et al., 미국특허 제5,508,192호; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 단백질 분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현시키는 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주는 본 발명의 발현 시스테에서 숙즈 세포로서 사용된다.
항체 정제
일 구현예에서, 본원에서 생성된 항체 단백질은 추가 검정 및 사용을 위해 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 추가로 정제된다. 당해 분야에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 면역친화력 또는 이온-교환 컬럼 상에서의 분별화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 암모늄 설페이트 침전, 및 예를 들어, Sephadex G-75를 이용한 겔 여과.
일 양태에서, 고체상에 고정된 단백질 A는 본 발명의 항체 산물의 면역친화력 정제를 위해 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 높은 친화력으로 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다[Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]. 단백질 A가 고정되는 고체상은 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 컬럼, 또는 제어된 기공 유리 컬럼, 또는 규산 컬럼일 수 있다. 일부 적용에서, 컬럼은 오염물의 비특이적 부착을 가능한 한 방지하기 위해 글리세롤과 같은 시약으로 코팅된다.
정제의 제1 단계로서, 상술된 세포 배양물로부터 유도된 제제는 단백질 A에 대한 고려되는 항체의 특이적 결합을 가능하게 하기 위해 단백질 A 고정된 고체상 상에 적용될 수 있다. 고체상은 이후에 고체상에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거하기 위해 세척될 것이다. 마지막으로, 고려되는 항체는 용리에 의해 고체상으로부터 회수된다.
진핵 숙주 세포를 사용한 항체 생성
벡터 성분은 일반적으로, 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인헨서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에서 사용하기 위한 벡터는 또한 고려되는 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에서 특정 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 일반적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 가공되는(즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 헤르페스 gD 신호가 이용 가능하다.
이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 항체를 인코딩하는 DNA에 리딩 프레임에서 결찰된다.
(ii) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유류 발현 벡터에 대해 필요한 것은 아니다. 예를 들어, SV40 기점은 통상적으로, 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다.
(iii) 유전자 성분 선택
발현 및 클로닝 벡터는 선택 가능한 마커로도 불리워지는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 통상적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉사트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나 (b) 관련된 경우, 영양 요구성 결핍을 보완하거나 (c) 복합 배지로부터 입수 가능하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다.
선택 방식의 일 예는 숙주 세포의 성장을 저지하기 위해 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 그러한 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 이에 따라, 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유류 세포에 대한 적합한 선택 가능한 마커의 다른 예에는 DHFR, 티미딘 키나아제, 메탈로티오네인-I 또는 -II(예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나아제, 오르니틴 데카복실라아제, 등과 같은, 항체 핵산을 흡수하는 세포 성분을 식별할 수 있는 것이 있다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 메토트렉사트(Mtx), DHFR의 경쟁 길항제를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 식별될 수 있다. 야생형 DHFR이 사용될 때 적절한 숙주 세포는 예를 들어, DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주(예를 들어, ATCC CRL-9096)를 포함한다.
대안적으로, 항체를 인코딩하는 DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질, 및 다른 선택 가능한 마커, 예를 들어, 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라아제(APH)와 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유한 야생형 숙주)는 선택 가능한 마커, 예를 들어, 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418에 대한 선택 작용제를 함유한 배지 중에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다[미국특허 제4,965,199호 참조].
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 대개 숙주 유기체에 의해 인식되고 고려되는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 진핵 생물에 대해 알려져 있다. 사실상 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 업스트림에 대략 25 내지 30개의 염기에 위치된 AT-풍부 영역을 갖는다. 다수의 유전자의 전사의 개시로부터 업스트림에 70 내지 80개의 염기가 발견된 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 단부에는 코딩 서열의 3' 단부에 폴리 A 테일의 첨가에 대한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이러한 서열은 진핵 발현 벡터 내에 적합하게 삽입된다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 폴리펩타이드 전사는 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포 바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 유인원 바이러스 40(SV40)와와 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유류 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 열충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어될 수 있으며, 단, 이러한 프로모터는 숙주 세포계와 양립 가능하다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점도 함유한 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 거대세포 바이러스의 즉각적인 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템은 미국특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국특허 제4,601,978호에 기술되어 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스로부터 티미딘 키나아제 프로모터의 제어 하에서 마우스 세포에서 인간 β-인테페론 cDNA의 발현에 대해 문헌[Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]이 참조된다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부는 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인헨서 요소 성분
더 고차의 진핵 생물에 의한 본 발명의 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA의 전사는 종종 인헨서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 여러 인헨서 서열은 현재 포유류 유전자로부터 알려져 있다(글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-페토단백질, 및 인슐린). 그러나, 통상적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인헨서가 사용될 것이다. 예는 복제 기점의 후측 상의 SV40 인헨서(bp 100-270), 거대세포 바이러스 초기 프로모터 인헨서, 복제 기점의 후측에 있는 폴리오마 인헨서, 및 아데노바이러스 인헨서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 강화 요소에 대해서는 문헌[Yaniv, Nature 297:17-18(1982)]이 참조된다. 인헨서는 항체 폴리펩타이드-인코딩 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 분할될 수 있지만, 일반적으로, 프로모터로부터 부위 5'에 위치된다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 통상적으로 또한, 전사의 종결을 위해 및 mRNA를 안정화시키기 위해 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로, 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역된 영역으로부터 입수 가능하다. 이러한 영역은 항체를 인코딩하는 mRNA의 비번역된 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 세그먼트를 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다[WO94/11026호 및 여기에 개시된 발현 벡터 참조].
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 포함하는, 본원에 기술된 더 고차 진행 생물 세포를 포함한다. 배양물(조직 배양물)에서 척추동물 세포의 번식은 일상적인 절차가 된다. 유용한 포유류 숙주 세포의 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인(현탁 배지에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주(Hep G2)가 있다.
숙주 세포는 항체 생성을 위해 상술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 적절한 경우에 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 요망되는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 배지, 예를 들어, Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지(MEM)(Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)(Sigma)가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195호; 또는 미국특허 Re.30,985호]에 기술된 임의의 배지는 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 임의의 이러한 매질에는 필요한 경우에 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예를 들어, 나트륨 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제(예를 들어, HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소(대개 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 규정됨), 및 글루코오스 또는 균등한 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제는 또한, 당업자에게 공지되는 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, pH, 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용되는 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
(ix) 항체의 정제
재조합 기술을 이용할 때, 항체는 세포내에서 생성될 수 있거나, 배지로 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생성되는 경우에, 제1 단계로서, 미립자 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 일반적으로, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지에 분비되는 경우에, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로, 먼저 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 이용하여 농축된다. 프로테아제 억제제, 예를 들어, PMSF는 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 이전 단계에서 포함될 수 있으며, 항생제는 외래성 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화력 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있으며, 친화력 크로마토그래피는 일반적으로 허용되는 정제 기술이다. 친화력 리간드로서 단백질 A와 같은 친화력 시약의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다[Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 아이소형 및 인간 γ3 에 대해 제한된다[Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]. 친화력 리간드가 부착되는 기질은 가장 흔히 아가로오스이지만, 다른 기질이 이용 가능하다. 기계적으로 적합한 기질, 예를 들어, 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로오스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, Bakerbond ABX™ 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제를 위해 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어, 이온-교환 컬럼 상에서의 분별화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상에서의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피(예를 들어, 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전이 또한 회수되는 항체에 따라 이용 가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 고려되는 항체와 오염물을 포함하는 혼합물은 필요한 경우, 예를 들어, 낮은 염 농도(예를 들어, 약 0 내지 0.25 M 염)에서 일반적으로 수행되는, 약 2.5 내지 4.5의 pH에서 용리 완충제를 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가 정제 단계로 처리될 수 있다.
일반적으로, 연구, 시험 및 임상 용도로 사용하기 위한 항체를 제조하기 위한 기술 및 방법은 상기와 일치하고/거나 고려되는 특정 항체에 대한 당업자에 의해 적절하다고 간주되는 당해 분야에서 잘 확립되어 있다는 것이 주지되어어야 한다.
활성 검정
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 검정에 의해 이의 물리적/화학적 성질 및 생물학적 기능에 대해 특징화될 수 있다.
본 개시의 항체, 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 이의 유도체는 또한 항원에 대한 이의 결합 친화력에 대해 기술되거나 명시될 수 있다. 탄수화물 항원에 대한 항체의 친화력은 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다[예를 들어, Berzofsky et al, "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); 및 본원에 기술된 방법]. 특정 항체-탄수화물 항원 상호작용의 측정된 친화력은 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정하는 경우 달라질 수 있다. 이에 따라, 친화력 및 다른 항원-결합 파라미터(예를 들어, KD, Ka, Ka)의 측정이 바람직하게는, 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제와 함께 수행된다.
본 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 시험관내 및 생체내 치료, 예방, 및/또는 진단 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이러한 항체는 예를 들어, 암을 치료, 억제, 재발 예방, 및/또는 진단하기 위해 배양물에서 예를 들어, 시험관내 또는 생체와 또는 대상체에, 예를 들어, 생체내에서 세포에 투여될 수 있다.
정제된 항체는 N-말단 시퀀싱, 아미노산 분석, 비-변성 크기배제 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분광법, 이온교환 크로마토그래피, 및 파파인 소화를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 검정 시리즈에 의해 추가로 특징화될 수 있다.
필요한 경우, 항체는 이의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 이의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 당해 분야에 공지되고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 비제한적으로, 웨스턴 블롯, 방사면역검정, ELISA(효소 결합 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침강 검정, 형광 면역검정, 화학발광 면역검정, 나노입자 면역검정, 아프타머 면역검정, 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 이용한 임의의 직접 또는 경쟁적 결합 검정을 포함한다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특정 상황에서, 전체 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 더 작은 크기의 단편은 신속한 제거를 허용하고, 고형 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다.
항체 단편의 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이러한 단편은 온전한 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다[예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985) 참조]. 그러나, 이러한 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 대장균에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있고, 이에 따라, 대량의 이러한 단편을 용이하게 생성할 수 있다. 항체 단편은 상기에 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접적으로 회수되고 화학적으로 결합되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다[Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]. 다른 방법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국특허 제5,869,046호에 기술되어 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구현예에서, 선택되는 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다[WO 93/16185호; 미국특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호 참조]. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 온전한 결합 부위를 갖는 유일한 종이다. 이에 따라, 이러한 것은 생체내 사용 동안 비특이적 결합 감소를 위해 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합을 생성하도록 작제화될 수 있다. [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra]. 항체 단편은 또한, 예를 들어, 미국특허 제5,641,870호에 기술된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
인간화된 항체
본 발명은 인간화된 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 비-인간인 소스로부터 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로서 지칭되며, 이는 통상적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 본질적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써, 윈터(Winter) 및 공동-연구자의 방법에 따라 수행될 수 있다[Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536)]. 이에 따라, 이러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체(미국특허 제4,816,567호)이며, 여기서, 실질적으로 덜 온전한 인간 가변 도메인은 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 것이다. 실제적으로, 인간화된 항체는 통상적으로, 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게, 일부 FT 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간화된 항체를 제조하는 데 사용되는, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는 데 중요할 수 있다. 소위 "최적-적합(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류의 서열에서 가장 가까운 인간 서열은 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크로서 허용된다[Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901]. 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유도된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 수 개의 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다[Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623].
일반적으로, 항체가 항원에 대한 높은 친화력 및 다른 바람직한 생물학적 성질을 보유하면서 인간화되는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 하나의 방법에 따르면, 인간화된 항체는 부모 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용하여 부모 서열 및 다양한 개념적 인간화된 산물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 입수 가능하고, 당업자에게 익숙한 것이다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 이의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 서열 및 유입 서열로부터 선택되고 결합되어, 요망되는 항체 특징, 예를 들어, 타겟 항원(들)에 대한 친화력 증가가 달성될 수 있게 한다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는 데 관여한다.
본 발명의 인간 항-SSEA-4 항체는 상술된 바와 같이 인간-유도 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 결합시킴으로서 작제화될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 단일클론 항-SSEA-4 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어, 문헌[Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기술되어 있다.
현재, 면역화 시에, 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에서 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형 접합성 결실이 내인성 항체 생성의 완전 억제를 초래하는 것으로 기술되어 있다. 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 접종(challenge) 시에 인간 항체의 생성을 초래할 것이다[예를 들어, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993) 참조].
유전자 셔플링은 또한, 비-인간 항체, 예를 들어, 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서, 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화력 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅"으로도 불리워지는 이러한 방법에 따르면, 상술된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 비-인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라의 집단을 생성한다. 항원을 사용한 선택은 비-인간 사슬/인간 사슬 키메라 scFv 또는 Fab의 단리를 초래하며, 여기서, 인간 사슬은 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 사슬의 제거 시에 파괴된 항원 결합 부위를 복원하며, 즉, 에피토프는 인간 사슬 파트너의 선택을 지배한다. 잔류하는 비-인간 사슬을 대체하기 위해 공정이 반복될 때, 인간 항체가 수득된다[PCT WO 93/06213호(1993년 4월 1일에 공개됨) 참조]. CDR 그라프팅에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기를 가지지 않은, 완전 인간 항체를 제공한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 특정 라이신 연결을 포함하는 SSEA-4에 대한 것이며, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 상이한 2개의 라이신 연결을 갖는 2개의 상이한 SSEA-4에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 한 것으로서, 여기서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다[Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류로 인해, 이러한 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이들 중에 단지 하나는 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 대개 친화력 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는, 정확한 분자의 정제는 다소 번거로우며, 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차는 WO 93/08829호(1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한 구현예에 따르면, 요망되는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 이러한 융합은, 예를 들어, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 특정 구현예에서, 경쇄 결합을 위해 필수적인 부위를 함유한 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체를 인코딩하는 DNA, 및 요망되는 경우, 면역글로불린 경쇄는 별도의 발현 벡터 내에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내에 공동-트랜스펙션된다. 이는 구성에서 사용된 3개의 폴리펩타이드 사슬의 비균등 비율이 최적 수율을 제공할 때 구현예에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬의 발현이 높은 수율을 야기시킬 때 또는 이러한 비율이 중요하지 않을 때 하나의 발현 벡터에서 2개 또는 3개 모두의 폴리펩타이드 사슬에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
일 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에 제1 결합 특이성을 가지고 다른 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄로 이루어진다. 이중특이적 분자의 단지 절반에 면역글로불린 경쇄의 존재가 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조이 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 요망되는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진시킨다는 것이 확인되었다. 이러한 방법은 WO 94/04690호에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가 세부사항에 대해 예를 들어, 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]이 참조된다.
다른 방법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계는 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로다이머의 백분율을 최대화하기 위해 조작될 수 있다. 경계는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 경계로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예를 들어, 트립신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 보정 "공동"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 경계 상에 생성된다. 이는 호모다이머와 같은 다른 원치 않는 최종 산물에 비해 헤테로다이머의 수율을 증가시키기 위한 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로컨쥬게이트에서 항체 중 하나는 아비딘에 결합될 수 있으며, 다른 하나는 비오틴에 결합될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 원치 않는 세포에 대한 면역계 세포를 타겟화 하기 위해(미국특허 제4,676,980호) 및 HIV 감염증의 치료를 위해(WO 91/00360호, WO 92/00373호, 및 EP 03089호) 제안되었다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 미국특허 제4,676,980호에 여러 가교 기술과 함께, 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술이 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌[Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에는 F(ab')2 단편을 생성하기 위해 온전한 항체를 단백질 분해시키는 절차가 기술되어 있다. 이러한 단편은 인근 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제 나트륨 아르세나이트의 존재 하에서 환원된다. 생성된 Fab' 단편은 이후에 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 이후에 머캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 다시 전환되고, 이중특이적 항체를 형성하기 위해 동일한 몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합된다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
최근 진보는 이중특이적 항체를 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있는, 대장균으로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 촉진하였다. 문헌[Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에는 완전 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산이 기술되어 있다. 각 Fab' 단편은 대장균으로부터 별도로 분비되고 이중특이적 항체를 형성하기 위해 시험관내 유도 화학적 커플링으로 처리되었다. 이에 따라 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체 및 정상 인간 T 세포를 발현시키는 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 타겟에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리시키기 위한 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용하여 생성되었다[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 결합되었다. 항체 호모다이머는 힌지 영역에서 환원되어 모노머를 형성하고, 이후에 재-산화되어 항체 헤테로다이머를 형성하였다. 이러한 방법은 또한, 항체 호모다이머의 생산을 위해 이용될 수 있다. 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)]에 기술된 "이중체" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 대안적인 메커니즘을 제공한다. 단편은 동일한 사슬에서 2개의 도메인 간의 쌍을 형성하기에 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 이에 따라, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루어서, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv(sFv) 다이머를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 다른 전력이 또한 보고되어 있다[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368(1994) 참조].
2가 이상의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)].
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 세포 발현 항원에 의해 이가 항체보다 더 빠르게 내재화(및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는(IgM 부류 이외의 것인) 다가 항체(예를 들어, 사가 항체)일 수 있으며, 이는 항체의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 다가 항체는 다이머화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 다이머화 도메인은 예를 들어, Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다(또는 이로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역 및 Fc 영역에 대한 아미노-말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 일 구현예에서, 다가 항체는 예를 들어, 3 내지 약 8개, 또는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다(또는 이로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, 2개의 폴리펩타이드 사슬)을 포함하며, 여기서, 폴리펩타이드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 사슬(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있으며, 여기서, VD1은 제1 가변 도메인이며, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩타이드 사슬이며, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내며, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 사슬(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 사슬을 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 적어도 2개(예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어, 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 선택적으로, CL 도메인을 추가로 포함한다.
항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화력 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산에 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 항체의 아미노산 서열 내에서 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 도달하도록 이루어질 수 있으며, 단, 최종 작제물은 요망되는 특징을 지닌다. 아미노산 변경은 서열이 제조된 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발을 위한 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리워진다. 여기에서, 타겟 잔기의 잔기 또는 기는 확인되고(예를 들어, 하전된 잔기, 예를 들어, arg, asp, his, lys, and glu), 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 미치기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 그러한 아미노산 위치는 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정제된다. 이에 따라, 아미노산 서열 변형을 도입하기 위한 부위가 사전결정되었지만, 돌연변이의 특성 자체는 사전결정될 필요가 없다. 예를 들어, 제공된 부위에 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이 유발은 타겟 코돈 또는 영역에서 수행되며, 발현된 면역글로불린은 요망되는 활성에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유한 폴리펩타이드에 이르는 길의 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩타이드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소(예를 들어, ADEPT에 대해) 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
다른 타입의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체는 상이한 잔기에 의해 대체된 항체 분자에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이 유발을 위한 가장 고려되는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 변경이 또한 고려된다.
항체의 생물학적 성질의 실질적인 변형은 (a) 치환 구역에서 폴리펩타이드 골격의 구조, 예를 들어, 시트 또는 나선형 형태의 구조, (b) 타겟 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 이의 효과에 있어서 상당히 차이가 나는 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 이의 측쇄의 성질의 유사성에 따라 그룹핑될 수 있다[A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]:
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (O)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통 측쇄 성질을 기초로 한 그룹으로 나누어질 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향에 영향을 미치는 잔기:Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환된 잔기는 또한, 보존적 치환 부위 또는 나머지(비-보존된) 부위에 도입될 수 있다.
한 타입의 치환 변이체는 부모 항체(예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 얻어진 변이체(들)는 이러한 것이 생성된 부모 항체에 비해 변형된(예를 들어, 개선된) 생물학적 성질을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화력 성숙을 포함한다. 간단하게, 초가변 영역 부위(예를 들어, 6 내지 7개 부위)는 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성하기 위해 돌연변이된다. 이에 따라 생성된 항체는 융합으로서 사상 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키징된 파지 코트 단백질(M13의 유전자 III 산물)의 적어도 일부로 디스플레이된다. 파지-디스플레이된 변이체는 이후에 본원에 개시된 이의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화력)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 스캐닝 돌연변이 유발(예를 들어, 알라닌 스캐닝)은 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체와 항원 간의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합물의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 본원에서 설명되는 것을 포함하는, 당해 분야에 공지된 기술에 따른 치환을 위한 후보물이다. 이러한 변이체가 생성된 직후에, 변이체의 패널은 본원에 기술된 것을 포함하는, 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 스크리닝되며, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 성질을 갖는 항체는 추가 개발을 위해 선택될 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은 천연 소스로부터의 단리(자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 이전에 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 항체의 올리고뉴클레오타이드-매개(또는 부위-유도) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발에 의해 제조를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 자연 발생 서열을 배제할 것이다.
본 발명의 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여, Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 것을 포함하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
면역컨쥬게이트
다른 양태에서, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어, 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 컨쥬게이트)에 컨쥬게이션된 항체를 포함하는, 면역컨쥬게이트, 또는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 제공한다.
세포독성 또는 세포증식 억제제, 예를 들어, 암 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 컨쥬게이트의 사용(Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; 미국특허 제4,975,278호)은 약물 모이어티를 종양에 타겟화 전달하고 그 안에 세포내 축적을 허용하며, 여기서, 이러한 비컨쥬게이션된 약물 작용제의 전신 투여는 정상 세포뿐만 아니라 제거되어야 하는 종양 세포에 대한 허용되지 않는 수준의 독성을 초래할 수 있다[Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506]. 이에 의해 최소 독성을 가진 최대 효과가 추구된다. 다클론 항체 및 단일클론 항체 둘 모두는 이러한 전략에서 유용한 것으로서 보고되어 있다[Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87]. 이러한 방법에서 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉사트, 및 빈데신을 포함한다[Rowland et al., (1986) supra]. 항체-독소 컨쥬게이트에서 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예를 들어, 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어, 리신, 소분자 독소, 예를 들어, 겔다나마이신(Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드(EP 1391213호; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리케아마이신(Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)를 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라아제 억제를 포함하는 메커니즘에 의해 이의 세포독성 및 세포증식 억제 효과에 영향을 미칠 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 컨쥬게이션될 때 비활성적이거나 낮은 활성인 경향이 있다.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지되어 있고 용이하게 이용 가능한 추가 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 항체의 유도체화를 위해 적합한 모이어티는 수용성 폴리머이다. 수용성 폴리머의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 코폴리머, 폴리아미노산(호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 수중 이의 안정성으로 인해 제조하는 데 장점을 가질 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지되거나 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 폴리머의 수는 다양할 수 있으며, 하나 초과의 폴리머가 부착되는 경우에, 폴리머는 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화를 위해 사용되는 폴리머의 수 및/또는 타입은 개선되는 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에서 치료에 사용되는 지의 여부, 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 방사선에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 모이어티의 컨쥬게이트가 제공된다. 일 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)]. 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 일반 세포에 해를 끼지지 않지만 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 가열시키는 파장을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
약제학적 제형
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 부분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 약제 조성물은 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 생리학적으로 혼화 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 등장성 및 흡수 지연제를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 대상체에서 암 세포를 억제하는 데 효과적이다.
본 약제 조성물의 투여 경로는 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 경구, 국소, 피하, 피부내, 경피, 피하, 비경구, 직장, 척추, 또는 표피 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 약제 조성물은 주사제로서, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 또는 주사 전에 액체 비히클 중 용액 또는 현택액을 위해 적합한 고체 형태로서 제조될 수 있다. 약제 조성물은 또한, 고체 형태, 에멀젼화된 형태 또는 리포솜 비히클 또는 지속 전달을 위해 사용된 다른 미립자에 캡슐화된 활성 성분으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 약제 조성물은 오일 에멀젼, 유중수 에멀젼, 수중유중수 에멀젼, 부위-특이적 에멀젼, 긴-체류 에멀젼, 점착성 에멀젼, 마이크로에멀젼, 나노에멀젼, 리포솜, 마이크로입자, 마이크로스피어, 나노스피어, 나노입자 및 다양한 천연 또는 합성 폴리머, 예를 들어, 비흡수성 불투과성 폴리머, 예를 들어, 에틸렌비닐 아세테이트 코폴리머, 및 Hytrel® 코폴리머, 팽윤성 폴리머, 예를 들어, 하이드로겔, 또는 흡수성 폴리머, 예를 들어, 콜라겐 및 특정 다중산 또는 다중에스테르, 예를 들어, 약제 조성물의 지속 방출을 가능하게 하는 흡수 가능한 봉합사를 제조하기 위해 사용되는 것의 형태로 존재할 수 있다.
본 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 포유류 대상체에 전달하기 위한 약제 조성물로 제형화된다. 약제 조성물은 단독으로, 및/또는 약제학적으로 허용되는 비히클, 부형제 또는 담체와 혼합하여 투여된다. 적합한 비히클에는 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올, 등, 및 이들의 조합이 있다. 또한, 비히클은 소량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤화 또는 에멀젼화제, pH 완충제, 또는 애쥬번트를 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 본 발명의 약제 조성물의 흡수 또는 제거률을 안정화하거나 증가시키거나 감소시키도록 작용하는 생리학적으로 허용되는 화합물을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용되는 화합물ㅇ른 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 또는 덱스트란, 항산화제, 예를 들어, 아스코로브산 또는 글루타티온, 킬레이트제, 저분자량 단백질, 세제, 리포솜 담체, 또는 부형제 또는 다른 안정화제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 다른 생리학적으로 허용되는 화합물은 습윤제, 에멀젼화제, 분산제 또는 보존제를 포함한다[예를 들어, 문헌[the 21st edition of Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pa. ("Remington's")] 참조]. 본 발명의 약제 조성물은 또한, 보조 물질, 예를 들어, 약리학적 작용제, 시토카인, 또는 생물학적 반응 조절제를 포함할 수 있다.
또한, 약제 조성물은 중성 또는 염 형태의 약제 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염(활성 폴리펩타이드의 자유 아미노 기와 함께 형성됨)을 포함하며, 이는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산, 등과 같은 유기산과 함께 형성된다. 자유 카복실 기로부터 형성된 염은 또한 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 하이드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
이러한 투약 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되거나 당업자에게 명백할 것이다[예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 21st edition] 참조].
약제 조성물은 스케쥴에 따라 및 대상체의 연령, 체중 및 상태, 사용되는 특정 조성물, 및 투여 경로, 약제 조성물이 예방 또는 치료 목적을 위해 사용되는 것인 지의 여부, 등에 따라 적절한 시기에 단일 용량 치료 또는 다중 용량 치료로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서 본 발명에 따른 약제 조성물은 1개월에 1회, 1개월에 2회, 1개월에 3회, 격주(qow), 1주에 1회(qw), 1주에 2회(biw), 1주에 3회(tiw), 1주에 4회, 1주에 5회, 1주에 6회, 격일(qod), 매일(qd), 하루에 2회(qid), 또는 하루에 3회(tid) 투여된다.
본 발명에 따른 항체의 투여 기간, 즉, 약제 조성물이 투여되는 기간은 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 대상체 반응, 등에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 약제 조성물은 약 1초 이상 내지 1시간 이상, 1일 내지 약 1주, 약 2주 내지 약 4주, 약 1개월 내지 약 2개월, 약 2개월 내지 약 4개월, 약 4개월 내지 약 6개월, 약 6개월 내지 약 8개월, 약 8개월 내지 약 1년, 약 1년 내지 약 2년, 또는 약 2년 내지 약 4년, 또는 그 이상의 범위의 시기에 걸쳐 투여될 수 있다.
투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해, 투약 단위 형태의 경구 또는 비경구 약제 조성물이 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 투약 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 요망되는 약제학적 담체와 관련하여 요망되는 치료 효과를 형성하도록 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 소정 범위의 투여량을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 화합물 투여량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투약 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 다양할 수 있다. 다른 구현예에서, 치료학적 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 문헌[Cell culture. Sonderstrup, Springer, Sem. Immunopathol. 25: 35-45, 2003. Nikula et al., Inhal. Toxicol. 4(12): 123-53, 2000]에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 최대 절반 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 약 0.001 내지 약 60 mg/kg 체중, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg 체중, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg 체중, 약 0.5 내지 약 25 mg/kg 체중, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 10 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 0.75 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 1 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 2 내지 약 9 mg/kg 체중, 약 1 내지 약 2 mg/kg 체중, 약 3 내지 약 8 mg/kg 체중, 약 4 내지 약 7 mg/kg 체중, 약 5 내지 약 6 mg/kg 체중, 약 8 내지 약 13 mg/kg 체중, 약 8.3 내지 약 12.5 mg/kg 체중, 약 4 내지 약 6 mg/kg 체중, 약 4.2 내지 약 6.3 mg/kg 체중, 약 1.6 내지 약 2.5 mg/kg 체중, 약 2 내지 약 3 mg/kg 체중, 또는 약 10 mg/kg 체중이다.
약제 조성물은 유효량의 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 함유하도록 제형화되며, 여기서, 이러한 양은 치료되는 동물 및 치료되는 질환에 따라 달라진다. 일 구현예에서, 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 약 0.01 mg 내지 약 10 g, 약 0.1 mg 내지 약 9 g, 약 1 mg 내지 약 8 g, 약 2 mg 내지 약 7 g, 약 3 mg 내지 약 6 g, 약 10 mg 내지 약 5 g, 약 20 mg 내지 약 1 g, 약 50 mg 내지 약 800 mg, 약 100 mg 내지 약 500 mg, 약 0.05 ㎍ 내지 약 1.5 mg, 약 10 ㎍ 내지 약 1 mg 단백질, 약 30 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 40 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 0.1 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 0.1 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 25 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 1 mg, 약 1 mg 내지 약 2 mg 범위의 용량으로 투여된다. 임의의 대상체에 대한 특정 용량 수준은 특정 펩타이드의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배설률, 약물 조합 및 치료 중인 특정 질병의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라지고, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항체를 포함하는 치료 제형은 요망되는 정도의 순도를 갖는 항체를, 선택적 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 수용액, 동결건조된 또는 다른 건조된 제형의 형태로 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도로 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알칼 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
본원의 제형은 또한, 서로 악영향을 미치지 않는 보완저긴 활성을 갖는 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에서, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 무균이어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 면역글로불린을 함유한 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이러한 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태를 갖는다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국특허 제3,773,919호), L-글루탄산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머, 예를 들어, LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사 가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 폴리머, 예를 들어, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산이 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정의 하이드로겔은 더 짧은 시간 동안 단백질을 방출을 한다. 캡슐화된 면역글로불린 긴 시간 동안 신체에 존재할 때, 이러한 것은 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 응집하여, 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 가능한 변화를 초래한다. 관련된 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전력이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디설파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우에, 안정화는 설프히드릴 잔기의 개질, 산성 용액으로부터 동결건조, 적절한 첨가제를 사용한 수분 함량 조절, 및 특정 폴리머 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
용도
본 발명의 항체는 예를 들어, 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서 특정 항원 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하기 위한 길항제로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 적어도 일부는 다른 종으로부터의 항원 활성을 중화시킬 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 항체는 예를 들어, 항원을 함유한 세포 배양물에서, 인간 대상체에서 또는 본 발명의 항체와 교차반응하는 항원을 갖는 다른 포유류 대상체(예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 마모셋, 시노몰구스 및 레수스, 돼지 또는 마우스)에서 특정 항원 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 억제되도록 항체를 항원과 접촉시킴으로써 항원 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 인간 단백질 분자이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 대상체에서 항원 활성이 억제되도록 본 발명의 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 항원 활성이 유해한 장애로 고통받는 대상체에서 항원을 억제하는 방법에서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 인간 단백질 분자이며, 대상체는 인간 대상체이다. 대안적으로, 대상체는 본 발명의 항체와 결합하는 항원을 발현시키는 포유동물일 수 있다. 또한, 대상체는 (예를 들어, 항원의 투여에 의해 또는 항원 이식유전자의 발현에 의해) 항원이 도입된 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적을 위해 인간 대상체에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의학 목적을 위해 또는 인간 질병의 동물 모델로서 항원과 교차-반응하는 항원을 발현시키는 비-인간 포유동물(예를 들어, 영장류, 돼지 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 후자와 관련하여, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는 데(예를 들어, 투여량 및 투여의 시간 과정을 시험하는 데) 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는 암, 근육 장애, 유비퀴틴-경로-관련 유전 장애, 면역/염증 장애, 신경 장애, 및 다른 유비퀴틴 경로-관련 장애를 포함하지만 이로 제한되지 않는, SSEA-4 및 SSEA-4화된 단백질의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료, 억제, 이의 진행의 지연, 재발의 예방/지연, 개선, 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 차단 항체는 SSEA-4에 대해 특이적이다.
특정 구현예에서, 세포독성제와 컨쥬게이션된 본 발명의 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트는 환자에 투여된다. 특정 구현예에서, 면역컨쥬게이트 및/또는 여기에 결합된 항원은 SSEA-4와 관련된 이의 세포 표면 상에서 하나 이상의 단백질을 발현시키는 세포에 의해 내재화되어, 이와 관련된 타겟 세포를 사멸시키는 데 면역컨쥬게이트의 치료 효능을 증가시킨다. 일 구현예에서, 세포독성제는 타겟 세포에서 핵산을 타겟으로 하거나 이를 방해한다. 이러한 세포독성제의 예는 임의의 본원에 주지된 화학치료제(예를 들어, 메이탄시노이드 또는 칼리케아마이신), 방사성 동위원소, 또는 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본 발명의 항체(및 부속 치료제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내를 포함하는 이의의 적합한 수단에 의해, 및 요망되는 경우, 국소 치료, 병소내 투여를 위해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 특히 감소하는 용량의 항체와 함께 펼스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 투약은 예를 들어, 부분적으로 투여가 단기 또는 만성인 지에 따라 주사(예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사)에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체의 결합 타겟의 위치는 항체의 제조 및 투여를 고려할 수 있다. 결합 타겟이 세포내 분자일 때, 본 발명의 특정 구현예는 결합 타겟이 위치된 세포로 도입되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인트라바디로서 세포내에서 발현될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "인트라바디"는 문헌[Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); 미국특허 제6,004,940호 및 제6,329,173호; 미국특허출원 공개 제2003/0104402호, 및 PCT 공개 WO2003/077945호]에 기술된 바와 같이, 세포내에서 발현되고 타겟 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭한다. 인트라바디의 세포내 발현은 타겟 세포로 요망되는 항체 또는 이의 항원-결합 부분(일반적으로 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 유전자와 관련된 분비 신호 및 야생형 리더 서열이 결여됨)을 인코딩하는 핵산을 도입함으로써 달성된다. 미세주입, 탄도 주사, 전기천공, 칼슘 포스페이트 침전, 리포솜, 및 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 고려되는 핵산을 운반하는 백시나 백터를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 세포로 핵산을 도입하는 임의의 표준 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 항-SSEA-4 항체 모두 또는 부분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 타겟 세포로 전달될 수 있으며, 이에 따라, SSEA-4에 대한 세포내 결합 및 하나 이상의 SSEA-4-매개 세포 경로의 조절을 가능하게 하는 한 k이상의 인트라바디(intrabody)가 발현되게 한다.
다른 구현예에서, 내재화 항체가 제공된다. 항체는 세포로 항체의 전달을 향상시키는 특정 특징을 지닐 수 있거나, 이러한 특징을 지니도록 변형될 수 있다. 이를 달성하기 위한 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 양이온화는 세포로의 흡수를 촉진하는 것으로 알려져 있다[예를 들어, 미국특허 제6,703,019호 참조]. 리포펙션 또는 리포솜은 또한, 세포로 항체를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에, 타겟 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편은 일반적으로 유리하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 펩타이드 분자는 타겟 단백질 서열을 결합하는 능력을 보유하도록 설계될 수 있다. 이러한 펩타이드는 화학적으로 합성되고/거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다[예를 들어, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) 참조].
타겟 세포로의 조절인자 폴리펩타이드의 진입은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 향상될 수 있다. 예를 들어, 특정 서열, 예를 들어, HIV Tat Ehss 안텐나페디아 호메오도메인 단백질로부터 유도된 것은 세포막을 가로질러 이종 단백질의 효율적인 흡수를 지시할 수 있다[예를 들어, Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329 참조]..
결합 타겟이 뇌에 위치될 때, 본 발명의 특정 구현예는 혈액-뇌 장벽을 가로 지르는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 신경퇴행성 질병은 혈액-뇌 장벽의 투과성의 증가와 관련이 있으며, 이에 따라, 항체 또는 항원-결합 단편은 뇌에 용이하게 도입될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 손상되지 않은 상태로 유지될 때, 물리적 방법, 지질-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 이를 가로질러 분자를 수송하기 위한 수 개의 당해 분야에 공지된 방법이 존재한다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 물리적 방법은 혈액-뇌 장벽을 완전히 우회하거나 혈액-뇌 장벽에 개구를 생성시키는 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 우회 방법은 뇌로의 직접 주입(예를 들어, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002) 참조), 간질 주입/대류-향상 전달(예를 들어, Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994) 참조), 및 뇌에서 전달 디바이스의 이식(예를 들어, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); 및 Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical 참조)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 장벽에 개구를 생성시키는 방법은 초음파(예를 들어, 미국특허공개 제2002/0038086호), 삼투압(예를 들어, 고삼투압 만니톨의 투여에 의함(Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), 예를 들어, 브라디키닌 또는 투과제 A-7에 의한 투과화(예를 들어, 미국특허 제5,112,596호, 제5,268,164호, 제5,506,206호, 및 제5,686,416호 참조), 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 유전자를 함유한 벡터로 혈액-뇌 장벽을 걸쳐 있는 뉴런의 형질 감염(예를 들어, 미국특허공개 제2003/0083299호)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 지질-기반 방법은 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 결합된 리포솜에서 항체 또는 항원-결합 단편을 캡슐화하고(예를 들어, 미국특허출원 공개 제20020025313호 참조), 저밀도 리포단백질 입자(예를 들어, 미국특허출원 공개 제20040204354호 참조) 또는 아포리포단백질 E(예를 들어, 미국특허출원 공개 제20040131692호 참조)에서 항체 또는 항원-결합 단편을 코팅하는 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용(예를 들어, 미국특허출원공개 제2002/0065259호, 제2003/0162695호, 및 제2005/0124533호 참조); 칼륨 채널의 활성화(예를 들어, 미국특허출원 공개 제2005/0089473호 참조), ABC 약물 수송체의 억제(예를 들어, 미국특허출원 공개 제2003/0073713호 참조); 트렌스페린으로 항체를 코팅하고 하나 이상의 트렌스페린 수용체의 활성을 조절함(예를 들어, 미국특허출원 공개 제2003/0129186호 참조), 및 항체의 양이온화(예를 들어, 미국특허 제5,004,697호 참조)를 포함한다.
본 발명의 항체 조성물은 양호한 의학적 관행과 일치하는 방식으로 제형화, 투약, 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서의 고려할 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의료 종사자에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그러할 필요는 없지만, 선택적으로, 고려되는 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 장애 또는 치료의 타입, 및 상기에 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이러한 것은 일반적으로, 본원에 기술된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 임의의 투여량으로, 및 적절한 것으로 경험적으로/임상적으로 결정되는 임의의 경로에 의해 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 화학치료제와 같은 다른 작용제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 타입, 항체의 타입, 질병의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는 지의 여부, 이전 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질병의 타입 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체는 예를 들어, 하나 이상의 별도의 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에 대한 투여를 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 통상적인 일일 투여량은 질병의 예방 또는 치료를 위해 약 1 ㎍의 범위일 수 있으며, 본 발명의 항체의 적절한 투여량(질병에 따라 수 일 이상)으로, 이러한 치료가 일반적으로 질병 증상의 요망되는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 항체의 하나의 예시적 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 것이다. 이에 따라, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량은 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다(예를 들어, hks자가 약 2 내지 약 12회, 또는 예를 들어, 약 6회 용량의 항체를 수용하도록 함) 투여될 수 있다. 초기의 더 높은 로딩 용량, 이후 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투여 요법은 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량, 이후 약 2 mg/kg의 매주 유지 용량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
제조품
본 발명의 다른 양태에서, 상기에 기술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 유용한 물질을 함유한 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키징 인서트를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 또는 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 함께 조합될 때 조성물을 유지하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 니들에 의해 스토퍼를 갖는 바이알 또는 정맥내 용액 백일 수 있다). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 인서트는 조성물이 선택된 질환을 치료하기 위해 사용됨을 지시한다. 또한, 제조품은 (a) 그 안에 함유된 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 갖는 제1 용기; 및 (b) 그 안에 함유된 추가 세포독성 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 구현예에서 제조품은 조성물이 특정 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 인서트를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조품은 제조품은 약제학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제2(제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들, 및 시린지를 포함하는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질이 추가로 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 치료되는 대상체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 가축, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 돼지, 말, 양, 또는 염소이다. 특정 구현예에서, 대상체는 반려 동물, 예를 들어, 개 또는 고양이이다. 특정 구현예에서, 대상체는 가축, 예를 들어, 소, 돼지, 말, 양, 또는 양이다. 특정 구현예에서, 대상체는 동물원 동물이다. 다른 구현예에서, 대상체는 연구 동물, 예를 들어, 설치류, 개, 또는 비-인간 영장류이다. 특정 구현예에서, 대상체는 비-인간 형질전환 동물, 예를 들어, 유전자 도입 마우스 또는 유전자 도입 돼지이다.
약제 조성물 및 제형
본원에 기술된 항체의 제조 후에, "사전-동결건조된 제형"이 생성될 수 있다. 제형을 제조하기 위한 항체는 바람직하게는, 본질적으로 순수하고 요망되게 본질적으로 균질하다(즉, 오염 단백질, 등이 존재하지 않음). "본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로, 적어도 약 90 중량%의 단백질, 바람직하게는, 적어도 약 95 중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로, 적어도 약 99 중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 특정 구현예에서, 단백질은 항체이다.
사전-동결건조된 제형에서 항체의 양은 요망되는 용량 부피, 투여 모드(들), 등을 고려하여 결정된다. 선택되는 단백질이 온전한 항체(전장 항체)인 경우에, 약 2 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 바람직하게는, 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 및 가장 바람직하게는, 약 20 내지 30 mg/mL는 예시적인 출발 단백질 농도이다. 단백질은 일반적으로 용액 중에 존재한다. 예를 들어, 단백질은 약 pH 4 내지 8, 및 바람직하게는 약 5 내지 7로 pH-완충 용액에 존재할 수 있다. 예시적인 완충제는 히스티딘, 포스페이트, Tris, 시트레이트, 숙시네이트, 및 다른 유기산을 포함한다. 완충제 농도는 예를 들어, 제형(예를 들어, 재구성된 제형)의 요망되는 등장성 및 완충제에 따라, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 3 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 바람직한 완충제는 히스티딘이며, 이는 하기에서 설명되는 바와 같이, 동결보호 성질을 가질 수 있다. 숙시네이트는 다른 유용한 완충제인 것으로 보였다.
동결보호제는 사전-동결건조된 제형에 첨가된다. 바람직한 구현예에서, 동결보호제는 수크로오스 또는 트레할로오스와 같은 비-환원당이다. 사전-동결건조된 제형에서 동결보호제의 양은 일반적으로, 재구성 시에, 얻어진 제형이 등장성이게 하는 양이다. 그러나, 고장성 재구성된 제형이 또한 적합할 수 있다. 또한, 동결보호제의 양은 단백질의 허용되지 않는 양의 분해/응집이 동결건조 시에 일어나도록 너무 낮지 않아야 한다. 동결보호제가 당(예를 들어, 수크로오스 또는 트레할로오스)이고 단백질이 항체인 경우, 사전-동결건조된 제형에서 예시적인 동결보호제 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM, 및 바람직하게는, 약 30 mM 내지 약 300 mM, 및 가장 바람직하게는, 약 50 mM 내지 약 100 mM이다.
동결보호제에 대한 단백질의 비율은 각 단백질 및 동결보호제 조합을 위해 선택된다. 선택되는 단백질로서의 항체 및 높은 단백질 농도를 갖는 등장성 재구성화된 제형을 생성하기 위한 동결보호제로서 당(예를 들어, 수크로오스 또는 트레할로오스)의 경우에, 항체에 대한 동결보호제의 몰비율은 1 mole 항체에 대해 약 100 내지 약 1500 mole 동결보호제, 및 바람직하게는, 1 mole 항체에 대해 약 200 내지 약 1000 mole의 동결보호제, 예를 들어, 1 mole 항체 당 약 200 내지 약 00 mole의 동결보호제일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 사전-동결건조된 제형에 계면활성제를 첨가하는 것이 바람직하다는 것이 확인되었다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 계면활성제는 동결건조된 제형 및/또는 재구성된 제형에 첨가될 수 있다. 예시적 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤; 나트륨 도데실 설페이트(SDS); 나트륨 라우렐 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코사이드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도프로필-, 팔니도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-베타인(예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 똔느 이소스테아라미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 디나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUATTM 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 코폴리머(예를 들어, Pluronics, PF68 etc)를 포함한다. 첨가된 계면활성제의 양은 재구성된 단백질의 응집을 감소시키고 재구성 후에 미립자의 형성을 최소화하게 한다. 예를 들어, 표면활성제는 사전-동결건조된 제형에서 약 0.001 내지 0.5%, 및 바람직하게는, 약 0.005 내지 0.05%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 동결보호제(예를 들어, 수크로오스 또는 트레할로오스) 및 벌크화제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신)의 혼합물은 사전-동결건조 제형의 제조에서 사용된다. 벌크화제는 그 안에 과도한 포켓, 등 없이 균일한 동결건조된 케이크을 생산할 수 있다.
다른 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술된 것은 사전-동결건조된 제형(및/또는 동결건조된 제형 및/또는 재구성된 제형)에 포함되며, 단, 이러한 것은 제형의 요망되는 특징에 악영향을 미치지 않는다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 추가 완충제; 보존제; 보조 용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 생분해성 폴리머, 예를 들어, 폴리에스테르; 및/또는 염-형성 반대이온, 예를 들어, 나트륨을 포함한다.
본원에 기술된 약제 조성물 및 제형은 바람직하게는 안정적이다. "안정한" 제형/조성물은 그 안의 항체가 본질적으로 이의 저장 시 물리적 및 화학적 안정성 및 무결성을 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술은 당해 분야에서 입수 가능하고, 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에서 검토된다. 안정성은 선택된 시간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 무균이어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 대안적으로, 전체 혼합물의 무균성은 예를 들어, 약 120℃에서 약 30분 동안, 단백질을 제외한 구성성분들을 오토클레이빙함으로써 달성될 수 있다.
단백질, 동결보호제 및 다른 선택적 성분은 함께 혼합된 후에, 제형은 동결건조된다. 이러한 목적을 위해, 다수의 상이한 냉동-건조제기, 예를 들어, Hull50®(Hull, USA) 또는 GT20®(Leybold-Heraeus, Germany) 냉동-건조기가 이용 가능하다. 냉동-건조는 제형을 냉동시키고 후속하여 1차 건조를 위해 적합한 온도에서 냉동된 함유물로부터 얼음을 승화시킴으로써 달성된다. 이러한 조건 하에서, 제품 온도는 제형의 공융점 또는 붕괴 온도 미만이다. 통상적으로, 차 건조를 위한 저장 수명은 통상적으로, 약 50 내지 250 mTorr 범위인 적합한 압력에서 약 -30 내지 25℃(단, 제품은 1차 건조 동안 냉동된 채로 유지됨)의 범위일 것이다. 제형, 샘플을 유지하는 용기의 크기 및 타입(예를 들어, 유리 바이알) 및 액체 부피는 주로 건조를 위해 필요한 시간을 결정할 것이며, 이는 수 시간 내지 수 일(예를 들어, 40 내지 60시간)의 범위일 수 있다. 2차 건조 단계는 주로 용기의 타입 및 크기, 및 사용되는 단백질의 타입에 따라 약 0 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 그러나, 본원에는 2차 건조 단계가 필요하지 않을 수 있다는 것이 발견되었다. 예를 들어, 동결건조의 전체 물 제거 시기 전반에 걸쳐 저장 온도는 약 15 내지 30℃(예를 들어, 약 20℃)일 수 있다. 2차 건조를 위해 필요한 시간 및 압력은 예를 들어, 온도 및 다른 파라미터에 따라 적합한 동결건조된 케이크를 생산하는 것일 것이다. 2차 건조 시간은 제품의 요망되는 잔류 수분 수준에 따라 결정되고, 통상적으로, 적어도 약 5시간(예를 들어, 10 내지 15시간) 소요된다. 압력은 1차 건조 단계 동안 사용되는 것과 동일할 수 있다. 냉동-건조 조건은 제형 및 바이알 크기에 따라 달라질 수 있다.
일부 경우에, 단백질의 재구성이 전달 단계를 피하기 위해 수행되어야 하는 용기에서 단백질 제형을 동결건조하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우에 용기는 예를 들어, 3, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이알일 수 있다. 일반적인 명제로서, 동결 건조는 이의 수분 함량이 약 5% 미만, 및 바람직하게는, 약 3% 미만인 동결 건조된 제형을 초래할 것이다.
요망되는 단계에서, 통상적으로, 환자에 단백질을 투여할 때가 되면, 동결건조된 제형은, 재구성된 제형에서 단백질 농도가 적어도 50 mg/mL, 예를 들어, 약 50 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 더욱 바람직하게는, 약 80 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 및 가장 바람직하게는, 약 90 mg/mL 내지 약 150 mg/mL이도록 희석제로 재구성될 수 있다. 재구성된 제형에서 이러한 높은 단백질 농도는 재구성된 제형의 피하 전달이 의도되는 경우 특히 유용한 것으로 고려된다. 그러나, 다른 투여 경로, 예를 들어, 정맥내 투여를 위해, 재구성된 제형에서 단백질의 더 낮은 농도(예를 들어, 재구성된 제형에서 약 5 내지 50 mg/mL, 또는 약 10 내지 40 mg/mL 단백질)가 요망될 수 있다. 특정 구현예에서, 재구성된 제형에서 단백질 농도는 사전-동결건조된 제형에서의 단백질 농도보다 상당히 더 높다. 예를 들어, 재구성된 제형에서 단백질 농도는 사전-동결건조된 제형에서 단백질 농도보다 약 2 내지 40배, 바람직하게는, 3 내지 10배, 및 가장 바람직하게는, 3 내지 6배(예를 들어, 적어도 3배 또는 적어도 4배)이다.
재구성은 일반적으로, 완전한 수화를 보장하기 위해 약 25℃의 온도에서 일어나며, 요망되는 경우에 다른 온도가 이용될 수 있다. 재구성을 위해 필요한 시간은 예를 들어, 희석제의 타입, 부형제(들) 및 단백질의 양에 따라 달라질 것이다. 예시적 희석제는 멸균수, 주사용 정균수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로오스 용액을 포함한다. 희석제는 보존제를 선택적으로 함유한다. 예시적 보존제는 상기에 기술되었으며, 바람직한 보존제에는 방향족 알코올, 예를 들어, 벤질 또는 페놀 알코올이 있다. 사용되는 보존제의 양은 단백질과의 양립성 및 보존제 효능 시험을 위한 상이한 보존제 농도를 평가함으로써 결정된다. 예를 들어, 보존제가 방향족 알코올(예를 들어, 벤질 알코올)인 경우에, 이는 약 0.1 내지 2.0%, 및 바람직하게는, 약 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는, 약 1.0 내지 1.2%의 양으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 재구성된 제형은 10 ㎛ 초과의 크기인 바이알 당 6000개 미만의 입자를 갖는다.
치료 적용
본원에는 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에 치료학적 유효량의, 본원에 기술된 하나 이상의 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 기술된다.
특정 구현예에서, 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 환자)는 암으로 진단되거나, 암에 걸린 것으로 의심되거나, 암에 대한 위험을 갖는 것으로 진단된다. 암의 예는 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담도암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암 및 전립선암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 암은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암, 또는 췌장암이다. 일부 바람직한 구현예에서, 암은 뇌암 또는 다형성 교아세포종(GBM) 암이다.
바람직한 구현예에서, 항체는 SSEA-4-발현 암 세포를 타겟으로 할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 암 세포 상의 SSEA-4를 타겟으로 할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 암에서 SSEA-4를 타겟으로 할 수 있다.
치료는 종양 크기 감소, 악성 세포 제거, 전이 예방, 재발 예방, 파종성 암의 감소 또는 사멸, 생존 연장 및/또는 종양 암 진행까지의 시간 연장을 초래한다.
특정 구현예에서, 치료는 항체의 투여 전, 동안 또는 후에 상기 대상체에 추가 치료법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 치료법은 화학치료제로의 치료이다. 특정 구현예에서, 추가 치료법은 방사선 치료법이다.
본 발명의 방법은 초기 단계 종양을 치료 및 예방하는 데 특히 유리하고, 이에 의해 더욱 진행된 단계로의 진행을 방지하여 진행된 암과 관련된 이환률 및 사망률을 감소시킨다. 본 발명의 방법은 또한, 종양 재발 또는 종양, 예를 들어, 원발성 종양의 제거 후 지속되는 휴면 종양의 재성장을 예방하거나 종양의 발생을 감소시키거나 예방하는 데 유리하다.
본원에 기술된 방법에 의해 치료되는 대상체는 포유동물, 더욱 바람직하게는, 인간일 수 있다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협측암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종, 또는 뇌종양을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 암에 걸리거나 암에 대한 위험을 가지거나 암에 걸린 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. 암에 걸린 대상체는 일상적인 의학적 검사에 의해 확인될 수 있다.
본원에서 사용되는 "유효량"은 대상체에 치료 효과를 부여하는 데 필요한 각 활성제 단독 또는 하나 이상의 다른 활성제와 함께 조합한 양을 지칭한다. 유효량은 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 치료되는 특정 질환, 질환의 중증도, 연령, 신체적 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함하는 개별 환자 파라미터, 치료 기간, 동시 치료법의 특성, 임의의 경우에, 특정 투여 경로 및 건강한 실무자의 지식 및 전문성 내에서의 유사한 인자들에 따라 달라진다. 이러한 인자는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 일상적인 실험만으로 해결될 수 있다. 일반적으로, 개별 성분 또는 이들의 조합의 최대 용량, 즉, 건전한 의학적 판단에 따른 최고 안전 용량이 사용되는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자는 환자가 의학적 이유, 심리학적 이유로 또는 사실상 임의의 다른 이유로 더 낮은 용량 또는 허용 가능한 용량을 주장할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
반감기와 같은 경험적 고려사항은 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 양립 가능한 항체, 예를 들어, 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체는 숙주 면역계에 의해 공격받는 항체를 방지하도록 항체의 반감기를 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있고, 반드시 그러한 것은 아니지만, 일반적으로, 암의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연을 기초로 한다. 대안적으로, 본원에 기술된 항체의 지속된 연속 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 디바이스는 당해 분야에 공지되어 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 항체에 대한 투여량은 항체의 1회 이상의 투여(들)가 제공된 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체에는 증가 투여량의 항체가 제공된다. 항체의 효능을 평가하기 위해, 질병(예를 들어, 암)의 지시제가 일상적인 관행에 따라 이어질 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 임의의 항체의 투여를 위해, 초기 후보물 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 통상적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 임의의 0.1 ㎍/kg 내지 3 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg 내지 300 ㎍/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 질환에 따라, 치료는 요망되는 증상 억제가 일어날 때까지 암 또는 이의 증상을 개선시키기 위해 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 지속된다. 예시적인 투여 요법은 약 2 mg/kg의 초기 용량, 이후 약 1 mg/kg의 항체의 매주 유지 용량, 또는 이후 격주 약 1 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 의사가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴의 패턴에 따라 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 1주일에 1 내지 4회의 투약이 고려된다. 특정 구현예에서, 약 3 ㎍/mg 내지 약 2 mg/kg(예를 들어, 약 3 ㎍/mg, 약 10 ㎍/mg, 약 30 ㎍/mg, 약 100 ㎍/mg, 약 300 ㎍/mg, 약 1 mg/kg, 및 약 2 mg/kg) 범위의 투약이 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 투약 빈도는 매주, 2주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 또는 10주 마다 1회 또는 1개월, 2개월, 또는 3개월 또는 그 이상 마다 1회이다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 사용되는 항체를 포함하는 투약 요법은 시간에 따라 달라질 수 있다.
본 개시의 목적을 위해, 본원에 기술된 항체의 적절한 투여량은 사용되는 특정 항체(또는 이의 조성물), 암의 타입 및 중증도, 에방 또는 치료 목적을 위해 항체가 투여되는 지의 여부, 종래 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 본원에 기술된 항체의 투여는 사전선택된 시기에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 예를 들어, 암의 발병 전, 동안, 또는 후에 일련의 간격으로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는 것"은 암, 암의 증상, 또는 암에 대한 소인을 치료, 치유, 개선, 완화, 변화, 개량, 개선, 또는 영향을 미치는 목적으로, 암, 암의 증상, 또는 암에 대한 소인을 갖는 대상체에 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
암을 개선시키는 것은 암의 발달 또는 진행을 지연시키거나 암의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 암을 개선시키는 것은 반드시 치료 결과를 필요하는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 암의 발달을 "지연"한다는 것은 암의 진행을 지연, 방해, 느리게, 지연, 안정화 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 암의 병력 및/또는 치료되는 개체에 따라 다양한 시간 길이를 가질 수 있다. 암의 발달을 "지연"시키거나 개선시키거나, 암 발병의 지연시키는 방법은 본 방법을 이용하지 않은 것과 비교할 때, 제공된 시간 프레임에서 암의 하나 이상의 증상이 발달할 확률(위험)을 줄이고/거나 제공된 시간 프레임에서 증상의 정도를 줄이는 방법이다. 이러한 비교는 통상적으로, 통계적으로 유의미한 결과를 제공하기에 충분한 수의 대상체를 이용한 임상 연구를 기초로 한다.
암의 "발달" 또는 "진행"은 암의 초기 증상 및/또는 계속되는 암의 진행을 의미한다. 암의 발달은 당해 분야에 공지될 뿐만 아니라 표준 임상 기술을 이용하여 검출 가능하고 평가될 수 있다. 그러나, 발달은 또한 검출되지 않을 수 있는 진행을 지칭한다. 본 개시의 목적을 위해, 발달 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발달"은 발생, 재발 및 발병을 포함한다. 본원에서 사용되는 암의 "발병" 또는 발생"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.
의약 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법은 치료되는 질병의 타입 또는 질병의 부위에 따라, 대상체에 약제 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 또한, 다른 통상적인 경로를 통해 투여되고, 예를 들어, 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소로, 직장로, 비강으로, 협측으로, 질내로 또는 이식 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 피부내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 척수재, 병소내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 이는 주사 가능한 데폿 투여 경로를 통해, 예를 들어, 1-, 3- 또는 6-개월 데폿 주사 가능 또는 생분해성 물질 및 방법을 이용하여 대상체에 투여될 수 있다.
주사 가능한 조성물은 다양한 담체, 예를 들어, 식물성 오일, 디메틸락타미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사를 위해, 수용성 항체는 드립 방법에 의해 투여될 수 있으며, 이에 의해 항체 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 함유한 약제학적 제형이 주입된다. 생리학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어, 5% 덱스트로오스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 가용성 염 형태의 항체의 근육내 제제, 예를 들어, 멸균 제형은 약제학적 부형제, 예를 들어, 주사용수, 0.9% 염수, 또는 5% 글루코오스 용액 중에 용해되고 투여될 수 있다.
"화학치료제"는 암 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF), 메르탄신(DM1), 안트라사이클린, 피롤로벤조디아제핀, α-아마니틴, 투불리신, 벤조디아제핀, 에를로티닙, 보르테조밉, 풀베스트란트, 수니티닙, 레트로졸, 이마티닙 메실레이트, PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴, 류코보린, 라파마이신, 라파티닙, 로나파르닙(SARASAR®, SCH 66336), 소라페닙, 게피티닙, AG1478, AG1571, 알킬화제; 알킬 설포네이트; 아지리딘; 에틸렌이민; 메틸아멜라민, 아세토제닌; 캄프토테신; 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065; 크립토파이신; 돌라스타틴; 듀오카르마이신; 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 클로람부실; chlornaphazine; 콜로포스파미드; 에스트라무스틴; 아이포스파미드; 메클로레타민; 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드; 멜팔란; 노벰비킨; 페네스테린; 프레드니무스틴; 트로포스파미드; 우라실 머스타드; 카르무스틴; 클로로조토신; 포테무스틴; 로무스틴; 니무스틴; 라니무스틴; 칼리케아마이신; 다이네마이신; 클로드로네이트; 에스페라마이신; 네오카르지노스타틴 크로모포어; 아클라시노마이신; 악티노마이신; 오트라마이신; 아자세린; 블레오마이신; 칵티노마이신; 카라비신; 카미노마이신; 카르지노필린; 크로모마이시니스; 닥티노마이신; 다우노루비신; 데토루비신; 6-디아조-5-옥소-L-노르류신; 독소루비신; 에피루비신; 에소루비신; 이다루비신; 마르셀로마이신; 미토마이신; 미코페놀산; 노갈라마이신; 올리보마이신; 페플로마이신; 포트피로마이신; 퓨로마이신; 쿠엘라마이신; 로도루비신; 스트렙토니그린; 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉사트; 5-플루오로우라실(5-FU); 데놉테린; 프테로프테린; 트리메트렉세이트; 플루다라빈; 6-메르캅토퓨린; 티아미프린; 티오구아닌; 안시타빈; 아자시티딘; 6-아자우리딘; 카르모푸르; 시타라빈; 디데옥시우리딘; 독시플루리딘; 에노시타빈; 플록수리딘; 칼루스테론; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 에피티오스타놀; 메피티오스탄; 테스토락톤; 아미노글루테티미드; 미토탄; 트릴로스탄; 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신; 안사미톡신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드; 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드; 파클리탁셀; 도세탁셀; 클로란부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉사트; 시스플라틴; 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드; 아이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉사트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 토포이소머라아제 억제제; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드 또는 카페시타빈을 포함한다.
"생물학적 치료제"는 암 치료에서 유용한 생물학적 분자이다. 화학치료제의 예는 PD-1 길항제, PD-1 항체, CTLA 길항제, CTLA 항체, 인터류킨, 시토카인, GM-CSF, 수용체 트립신 키나아제를 방해하는 작용제(RTK), 라파마이신(mTOR) 억제제의 포유류 타겟, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 억제제, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제, 인테그린 차단제, CDK4/6 억제제, PI3K 억제제, mTOR 억제제, AKT 억제제, 또는 항-Globo 시리즈 항원 항체를 포함한다.
"항-Globo 시리즈 항원 항체"는 항-Globo H 항체, 항체 또는 항-SSEA-4 항체를 포함한다.
조합물을
적합한 OBI-868(
Globo
H 세라마이드 또는
SSEA
-4 세라마이드)의 예의 설명
특정 구현예에서, Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 구조는 PCT 특허출원(WO2017041027A1호), 특허 출원에 기술된 바와 같으며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 참고로 포함된다.
Globo H 및 SSEA-4(Globo 시리즈 of 탄수화물 글리칸) 및 시알릴 라이스 A(SLea), 루이스 A(Ley), 시알릴 루이스 X(SLex), 및 루이스 X(Lex)는 암 세포의 표면 상에서 발현되고 유방, 췌장, 위, 대장, 폐, 경구, 난소 및 전립선을 포함하는 광범위한 상이한 암 타입에 대해 특이적인 항원이다.
Globo H는 구조(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)를 갖는 육당류로서, 이는 다양한 타입의 암, 특히, 유방, 전립선 및 폐의 암 상에서 고도로 발현되는 항원성 탄수화물의 패밀리의 구성원이다[Kannagi R, et al. J Biol Chem 258:8934-8942, 1983; Zhang SL, et al. Int J Cancer 73:42-49, 1997; Hakomori S, et al. Chem Biol 4:97-104, 1997; Dube DH, et al. Nat Rev Drug Discov 4:477-488, 2005]. Globo H는 당지질로서 및 가능하게 당단백질로서 암 세포 표면 상에서 발현된다[Menard S, et al. Cancer Res 43:1295-1300, 1983; Livingston PO Cancer Biol 6:357-366, 1995). 유방암 환자의 혈청은 Globo H 에피토프에 대한 높은 수준의 항체를 함유한다[Menard S, et al. Cancer Res 43:1295-1300, 1983].
본 개시의 Globo H 세라마이드 및/또는 SSEA-4 세라마이드는 일 양태에서, 글리칸, 예를 들어, Globo시리즈 글리칸(Globo시리즈 글리코스핑고지질 항원) 및/또는 종양 관련 탄수화물 항원(TACA)의 효율적인 검출 및 결합을 촉진할 수 있는 링커 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
TACA는 2가지 부류, 즉, 당단백질 항원 및 당지질 항원으로 나누어질 수 있다. 당단백질 항원은 예를 들어 (1) 예를 들어, α-2,6-N-아세틸갈락토사미닐(Tn), 톰슨-프렌드리히(Thomsen-Friendreichl, TF), 및 시알릴-Tn(sTn)을 포함하거나 배제할 수 있는 뮤신, 및 (2) 폴리시알산(PSA)을 포함하거나 배제할 수 있다. 당지질 항원은 하기를 포함하거나 배제할 수 있다. (1) Globo 시리즈 항원은 예를 들어, Globo H, SSEA-3(또는 Gb5), SSEA-4, Gb3 및 Gb4를 포함하거나 배제할 수 있으며, (2) 혈액 그룹 결정인자는 예를 들어, 루이스 x(Lex), 루이스 y(Ley), 루이스 a(Lea), 시알릴 루이스 x(sLex), 및 시알릴 루이스 a(SLea)를 포함하거나 배제할 수 있으며, (3) 강글리오사이드는 예를 들어, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1, 및 Neu5GcGM3을 포함하거나 배제할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 다양한 적용에서 사용될 수 있는 링커를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 링커는 기질에 분자를 부착하기 위해 사용될 수 있으며, 이러한 기질은 표면, 고체 표면, 입자, 어레이 또는 비드를 포함하거나 배제할 수 있다. 링커는 일부 양태에서, 탄수화물과 상호작용하는 제1 모이어티 및 표면과 상호작용하는 제2 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 링커, 및 링커-Globo시리즈 글리칸 또는 다른 TACA, 링커-globo 시리즈 당단백질 컨쥬게이트를 포함하는 링커-TACA를 포함하거나 배제할 수 있는 링커와 글리칸의 컨쥬게이트, 및 이를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 예시적 Globo시리즈 글리칸은 SSEA-4, 및 Globo H를 포함하거나 배제할 수 있다. 예시적 Globo시리즈 당단백질은 SSEA-4, 및 펩타이드 또는 단백질에 부착된 Globo H를 포함하거나 배제할 수 있다. 추가 TACA 글리칸은 예를 들어, Ley, SLea, 및 SLex를 포함하거나 배제할 수 있다. TACA는 또한, 임의의 예시적인 글리칸의 n-펜틸아민-작용화된 변이체, 예를 들어, SSEA-4, Gb3, Gb4, Globo H, Ley, SLea, 및 SLex의 n-펜틸아민-작용화된 변이체를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 링커에 의한 것을 포함하는, 기질에 컨쥬게이션된 글리칸을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 유방암을 포함하는 암을 검출하는 방법으로서, (a) 시험 샘플을, Globo H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, 및 SLex를 포함하는 글리칸에 공유 결합된 링커와 접촉시키는 단계; (b) 시험 샘플에서의 항체가 Globo H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, 및 SLex와 관련된 분자/결정 인자에 결합하는 지의 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있는 방법이다.
여기서, 키랄 탄소 원자, 예를 들어, C1은 라세믹 또는 키랄이며; n은 n=7을 포함하는 5 내지 9 범위의 정수이며, TACA는 Globo H, SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex 중 하나로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 개시는 질병 진단, 재발 모니터링 및 약물 발견에서 사용하기 위한 복수의 비드에 관한 것이며, 여기서, 각 비드는 각 비드 상에 또는 내에 독특한 식별자를 가지며, 비드-n은 복수의 G1-A-Z 모이어티를 포함하며, 여기서, G1은 하나의 TACA이며, 비드-n은 복수의 Gn-A-Z를 포함하며, 여기서, Gn은 G1 TACA과 실질적으로 동일한 것인 제2 TACA이다.
일 양태에서, 본 개시는 하기 화학식의 화합물을 지칭한다: G-A-Z-X(화학식 1), 상기 식에서, G는 글리칸이며, A는 에스테르 또는 아미드를 포함하는 모이어티이며, X는 기질, 예를 들어, 표면, 고체 표면, 투명 고체, 불투명 고체, 가시광 또는 비가시광의 선택된 파장에 대해 투명한 고체, 입자, 어레이, 마이크로버블, 또는 비드, 코팅된 기질, 코팅된 표면, 폴리머 표면, 니트로셀룰로오스-코팅된 표면, 또는 비드 표면; 기질에 부착된 스페이서 기 또는 기질에 링커를 부착하기 위한 기를 갖는 스페이서 기이며; Z는 하나 또는 복수의 지질 사슬, 지질 사슬을 갖는 하나 또는 복수의 스페이서 기이다.
일 양태에서, 본 개시는 하기 화학식을 갖는 화합물을 특징으로 한다:
일 양태에서, 본 개시는 하기 화학식을 갖는 화합물을 특징으로 한다:
일 양태에서, 본 개시는 하기 화학식을 갖는 예시적인 G-A-Z 화합물을 특징으로 한다:
상기 식에서, Q는 
또는 수소일 수 있으며, C2는 키랄 또는 비-키랄일 수 있으며, C3은 도시된 키랄성을 가지며, [지질 사슬]은 임의의 C4-C16 선형 또는 분지된 알킬 또는 알콕시 사슬일 수 있으며, m은 1 내지 10 범위의 정수값을 가질 수 있으며, 여기서, TACA는 Globo H, SSEA-3(또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 이의 n-펩틸아민-작용화된 변이체 중 하나로부터 선택된다. 상기에 명시된 바와 같이, 이러한 화학식은 예시적인 G-A-Z이다.
일 양태에서, 예시적인 G-A-Z 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, C2는 키랄 또는 비-키랄일 수 있으며, C3은 도시된 키랄성을 가지며, [지질 사슬 1]은 임의의 C4-C16 선형 또는 분지된 알킬 또는 알콕시 사슬일 수 있으며, [지질 사슬 2]는 수소, 또는 적어도 하나의 하이드록시 모이어티를 포함하는 임의의 불포화된 C4-C16 알킬 사슬일 수 있으며, m은 1 내지 10 범위의 정수값을 가질 수 있으며, 여기서, TACA는 Globo H, SSEA-3(또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 이의 n-펜틸아민-작용화된 변이체 중 하나로부터 선택된다.
일 양태에서, m은 5일 수 있으며, [지질 사슬 1]은 하기 화학식일 수 있다:
상기 식에서, n은 7을 포함하는, 1 내지 10의 정수이며, 물결선은 [지질 사슬 1]에 연결된 카보닐 탄소에 대한 결합을 나타낸다.
일 양태에서, 하기 화학식에 따른 화합물이 제공된다:
상기 식에서, C2는 키랄 또는 비키랄일 수 있으며, C3은 도시된 바와 같은 키랄성을 가지며, m은 1을 포함하는, 1 내지 10 범위의 정수 값을 가질 수 있으며, 여기서, TACA는 Globo H, SSEA-3(또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 이의 n-펜틸아민-작용화된 변이체 중 하나로부터 선택된다.
일 양태에서, 하기 화학식에 따른 화합물이 제공된다:
상기 식에서, 본원에서 "지질"로도 지치되는 [지질 사슬]은 임의의 C4-C16 선형 또는 분지된 알킬 또는 알콕시 사슬일 수 있으며, m은 1 내지 10 범위의 정수 값을 가질 수 있으며; 여기서, TACA는 Globo H, SSEA-3(또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 이의 n-펜틸아민-작용화된 변이체 중 하나로부터 선택된다.
일 양태에서, 하기 화학식에 따른 화합물이 제공된다:
상기 식에서, 키랄 탄소 원자 C1은 라세믹 또는 키랄이며;
R1 및 R2는 알킬, 아릴, 할로, 헤테로아릴, 할로알킬, 벤질, 페닐일 수 있고, R1 및 R2가 사이클릭 결합을 형성할 수 있도록 서로 연결될 수 있으며;
n은 n = 7을 포함하는, 4 내지 9 범위의 정수이며;
TACA는 Globo H, SSEA-3, Gb3, Gb4, SSEA-4, Ley, SLea, 및 SLex, 및/또는 이의 n-펜틸아민-작용화된 변이체 중 하나로부터 선택된다.
일 양태에서, 하기 화학식 중 어느 하나에 따른 화합물이 제공된다:
상기 식에서, 키랄 탄소 원자 C1은 라세믹 또는 키랄이며;
n은 n = 7을 포함하는, 4 내지 9 범위의 정수이며;
TACA는 Globo H, SSEA-3(또는 Gb5), Gb3, Gb4, SSEA-4, Ley, SLea, 또는 SLex, 및/또는 이의 n-펜틸아민-작용화된 변이체 중 하나로부터 선택된다.
일 양태에서, 아미드 결합을 형성하기 위해 지질 사슬-1 또는 지질 사슬-2를 펜틸아민-작용화된 Globo H와 반응하는, 본원의 화합물을 제조하는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 하기 화학식에 따른 화합물이 제공된다:
상기 식에서, m은 1 내지 10 범위의 정수 값을 가질 수 있으며;
V는 산소 또는 탄소일 수 있으며;
q는 1 내지 3 범위의 정수 값을 가질 수 있으며;
TACA는 Globo H, SSEA-3(또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 이의 n-펜틸아민-작용화된 변이체 중 하나로부터 선택된다.
일 양태에서, 본원에 개시된 링커의 사용을 포함하는, 어레이에서 민감성을 개선시키는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 본 개시는 (a) 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체로부터 항체를 함유한 샘플을 제공하는 단계; (b) 샘플을, 하나 이상의 TACA를 포함하는 어레이와 접촉시키는 단계; (c) 하나 이상의 TACA에 결합된 샘플에서 항체의 복합물을 형성하는 단계; (d) 하나 이상의 TACA에 결합된 항체의 양을 검출하는 단계; 및 (e) 상기 하나 이상의 TACA에 결합된 항체의 정상 수준과 비교하여 상기 하나 이상의 TACA에 결합된 상기 항체의 양을 기준으로 하여 대상체의 질병 상태를 결정하는 단계를 포함하는, 암 진단 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 정상 수준은 예를 들어, 정상 환자 또는 정상 환자의 집단으로부터 샘플에서 TACA 결합된 항체의 수준 측정을 기초로 한 기준 값 또는 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 검출된 TACA 결합 항체는 순환 항체이다. 일 양태에서, 검출은 적어도 하나의 TACA에 대한 적어도 하나의 항체의 결정을 포함한다. 일부 양태에서, 어레이 상의 TACA는 Tn, TF, sTn, 폴리시알산, Globo H, SSEA-3, SSEA-4, Gb3, Gb4, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1 또는 Neu5GcGM3 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
일 양태에서, 샘플은 체액(혈청, 타액, 림프구 유체, 소변, 질 면봉 또는 협측 면봉)이다.
일 양태에서, 본 개시는 TACA 결합 파트너에 대한 글리칸 결합 파트너의 라이브러리를 스크리닝하는 것에 관한 것이다. 일부 양태에서, 분자 또는 라이브러리는 예를 들어, 나노체, 항체 단편, 아프타머, 렉틴, 펩타이드, 또는 조합 라이브러리 분자를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 TACA 결합 파트너를 식별하기 위한 상기 라이브러리의 스크리닝은 본원에 개시된 바와 같이, TACA 글리칸 어레이의 사용을 포함한다.
일부 양태에서, TACA 결합 파트너는 다양한 적용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 질병 상태를 결정하는 방법으로서, (a) 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 샘플을 하나 이상의 TACA 결합 파트너와 접촉시키는 단계; (c) TACA와 결합 파트너 간의 결합 특이성을 측정하는 단계, 및 (d) 발현된 종양 관련 탄수화물 항원(TACA)의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 질병 상태를 결정하는 방법에 관한 것이다.
TACA 결합 파트너는 이를 필요로 하는 환자, 예를 들어, TACA 발현 암, 종양, 신생물 또는 과형성을 갖는 환자를 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 검출은 TACA의 검출을 포함한다. 일 양태에서, 상기 TACA의 검출은 TACA 글리칸 어레이의 사용을 포함한다.
일부 양태에서, 본 방법은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교아세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담도암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 대장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협측암, 구인두암, 후두암 및/또는 전립선암 중 하나 이상으로부터 선택된 샘플을 검정하는 것을 포함한다. 일 양태에서, 본 방법은 유방, 난소, 폐, 췌장, 복부(위), 대장, 전립선, 간, 자궁경부, 식도, 뇌, 경구, 및/또는 신장암으로부터 선택된 샘플을 검정하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 본 방법은 유방, 난소, 폐, 췌장, 복부(위), 대장, 전립선, 간, 자궁경부, 방광, 식도, 뇌, 경구, 및/또는 신장암의 암, 신생물, 과형성 중 하나 이상을 검출하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 질병 상태 중 하나 이상은 B 세포 림프종, 흑색종, 신경모세포종, 육종, 비소세포 폐 암종(NSCLC)에 의해 특징된다.
일 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 치료에서 항신생물제의 치료 효능을 결정하기 위한 본 개시의 신규한 어레이를 사용하는 방법으로서, (a) 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 샘플을 TACA 어레이와 접촉시키는 단계; (c) TACA 또는 항체 중 하나 이상의 결합을 검정하는 단계; 및 (d) 글리칸 검출의 검정된 값을 기초로 한 신생물의 치료에서 항신생물제의 치료 효과를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체의 치료 동안 항신생물제의 치료 효능을 결정하기 위한 본 개시의 신규한 어레이를 사용하는 방법으로서, (a) 치료 전 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 샘플을 TACA 어레이와 접촉시키는 단계; (c) 치료 전에 TACA 결합 모이어티의 역가를 검정하는 단계; (d) 항신생물제의 투여 후 대상체로부터 하나 또는 복수의 샘플을 제공하는 단계; (e) 하나 또는 복수의 샘플을 TACA 어레이와 접촉시키는 단계; (f) 하나 또는 복수의 샘플에서 TACA 역가를 검정하는 단계; 및 (g) TACA 역가의 변화를 기초로 하여 신생물에 대한 치료에서 항신생물제의 치료 효과를 결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, TACA 결합 모이어티는 항체일 수 있다.
일 양태에서, 항신생물제는 백신을 포함한다. 백신은 담체 단백질에 컨쥬게이션된 탄수화물 항원 또는 탄수화물 면역원성 단편을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 탄수화물 항원 또는 탄수화물 면역원성 단편은 Globo H, 단계-특이적 배아 항원 3(SSEA-3), 단계-특이적 배아 항원 4(SSEA-4), Tn, TF, sTn, 폴리시알산, Globo H, SSEA-3, SSEA-4, Gb3, Gb4, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1 또는 Neu5GcGM3을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 담체 단백질은 KLH(키홀 림펫 헤모사이아닌), DT-CRM 197(디프테리아 독소 교차반응 물질 197), 디프테리아 톡소이드 또는 파상품 톡소이드를 포함한다. 일 양태에서, 백신은 약제 조성물로서 제공된다. 일 양태에서, 약제 조성물은 Globo H-KLH 및 추가 애쥬번트를 포함한다. 일 양태에서, 추가 애쥬번트는 사포닌, 프로인드 애쥬번트 또는 α-갈락토실-세라마이드(α-GalCer) 애쥬번트로부터 선택된다. 일 양태에서, 약제 조성물은 본원에 기술된 바와 같이, OBI-822/OBI-821을 포함한다. 일 양태에서, 항신생물제는 하나 이상의 탄수화물 항원을 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다.
일 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 암, 암종, 신생물 또는 과형성 중 하나 이상을 가지기 쉽다. 일 양태에서, 암은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교아세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담도암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 대장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협측암, 구인두암, 후두암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 어레이 상에서 사용되는 글리칸은 둘 이상의 당 단위를 포함할 수 있다. 본 발명의 글리칸은 직쇄 및 분지된 올리고사카라이드뿐만 아니라 자연 발생 및 합성 글리칸을 포함할 수 있다. 알로오스, 알트로오스, 아라비노오스, 글루코오스, 갈락토오스, 굴로오스, 푸코오스, 프룩토오스, 이도오스, 릭소오스, 만노오스, 리보오스, 탈로오스, 자일로오스, 뉴라민산 또는 다른 당 단위를 포함하는, 임의의 타입의 당 단위가 본 발명의 글리칸에 존재할 수 있다. 이러한 당 단위는 다양한 치환체를 가질 수 있다. 예를 들어, 당 단위 상에 통상적으로 존재하는 치환체 대산에 또는 이에 추가하여 존재할 수 있는 치환체는 아미노, 이온성 카복시 및 이의 염(예를 들어, 나트륨 카복실레이트)을 포함하는 카복시, 티올, 아지드, N-아세틸, N-아세틸뉴라민산, 옥시(=O), 시알산, 이온성 설페이트 및 이의 염을 포함하는 설페이트(-SO4-), 이온성 포스페이트 및 이의 염을 포함하는 포스페이트(-PO4-), 저급 알콕시, 저급 알카노일옥시, 저급 아실, 및/또는 저급 알카노일아미노알킬을 포함한다. 지방산, 지질, 아미노산, 펩타이드 및 단백질은 또한 본 발명의 글리칸에 부착될 수 있다. 일부 양태에서, 글리칸은 Globo H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, SLex, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 배제할 수 있다. 일부 양태에서, 글리칸은 Globo H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, SLex, 또는 작용화된 글리칸 변이체 및/또는 비-작용화된 글리칸의 임의의 조합물을 포함하거나 배제한다.
다른 양태에서, 본 발명은 고체 기질, 및 고체 지지체 상의 다수의 규정된 글리칸 위치를 포함하는 마이크로어레이로서, 각 글리칸 위치는 여기에 부착된 한 타입의 글리칸 분자의 다수의 카피를 포함하는 고체 지지체의 영역을 규정하며, 글리칸은 본원에 기술된 바와 같이 링커에 의해 마이크로어레이에 부착된, 마이크로어레이를 제공한다. 이러한 마이크로어레이는 예를 들어, 약 1 내지 약 100,000개의 상이한 글리칸 위치, 또는 약 1 내지 약 10,000개의 상이한 글리칸 위치, 또는 약 2 내지 약 100개의 상이한 글리칸 위치, 또는 약 2 내지 약 5개의 상이한 글리칸 위치를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 어레이에 부착된 글리칸은 글리칸 프로브로 지칭된다.
다른 양태에서, 본 발명은 시험 분자 또는 시험 물질이 본 발명의 어레이 또는 마이크로어레이 상에 존재하는 글리칸에 결합할 수 있는 지의 여부를 식별하는 방법을 제공한다. 본 방법은 어레이를 시험 분자 또는 시험 물질과 접촉시키고 시험 분자 또는 시험 물질이 글리칸 라이브러리에서 또는 어레이 상에서 글리칸에 결합하는 지의 여부를 관찰하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같이, 라이브러리에서 시험 분자 또는 시험 물질에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 글리칸에 시험 분자 또는 시험 물질이 결합할 수 있는 지를 식별하는 방법으로서, 글리칸이 본 발명의 어레이 상에 존재하는 방법을 제공한다. 본 방법은 어레이를 시험 분자 또는 시험 물질과 접촉시키고, 글리칸에 어레이 시험 분자 또는 시험 물질이 결합할 수 있는 지의 여부를 관찰하는 것을 포함한다.
각 글리칸 위치에서 글리칸의 밀도는 유도체화된 글리칸 위치에 적용된 글리칸 용액의 농도를 변화시킴으로써 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 링커 분자를 통해 어레이에 부착된 분자의 라이브러리를 포함할 수 있는 분자의 어레이에 관한 것으로서, 절단 가능한 링커가 하기 구조를 갖는 분자의 어레이에 관한 것이다:
G-A-Z-X 화학식 1
여기서, G는 글리칸이며; A는 에스테르 또는 아미드를 포함하는 모이어티이며; X는 기질, 예를 들어, 표면, 고체 표면, 투명 고체, 불투명 고체, 가시광 또는 비가시광의 선택된 파장에 대해 투명한 구체, 입자, 어레이, 마이크로버블, 또는 비드, 코팅된 기질, 코팅된 표면, 폴리머 표면, 니트로셀룰오스-코팅된 표면, 또는 비드 표면이며; 스페이서 기는 기질에 부착되거나 스페이서 기는 기질에 링커를 부착시키기 위한 기를 가지며; Z는 하나 또는 복수의 링커이며, 여기서, 상기 링커는 지질 사슬, 지질 사슬을 갖는 하나 이상의 스페이서 기를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 어레이는 기질 및 고체 지지체 상의 다수의 규정된 글리칸 프로브 위치를 포함하며, 각 글리칸 프로브 위치는 여기에 부착된 한 타입의 유사한 글리칸 분자의 다수의 카피를 갖는 고체 지지체의 영역을 규정한다.
A와 X 간의 상호작용은 일부 양태에서, 공유 결합, 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합 ,이온 결합, 또는 소수성 상호작용일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 분자의 어레이를 시험 샘플과 접촉시키고 어레이를 세척하고 절단 가능한 링커를 절단시켜 어레이에 부착된 분자의 분자 구조의 구조적 또는 기능적 분석을 허용하는 것을 포함할 수 있는 시험 샘플에서 생체분자에 분자 구조가 결합하는 지를 결정하는 방법이다. 예를 들어, 생체분자는 항체, 수용체 또는 단백질 복합물일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 (a) 샘플을, Globo H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, 및 SLex를 포함하는 글리칸에 공유 결합된 링커와 접촉시키는 단계; (b) 시험 샘플에서 항체가 Globo H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, 및 SLex와 관련된 분자/결정인자에 결합하는 지를 결정하는 단계를 포함할 수 있는 시험 샘플에서 유방암을 포함하는 암을 검출하는 방법이다.
일 양태에서, 본 개시는 하기 화학식을 갖는 화합물을 특징으로 한다:
본 발명의 일반적인 양태
이에 따라, 본 개시는 암 상에서의 Globo 시리즈 항원이 미세환경으로 배출되고 T 세포에 도입될 수 있다는 발견을 기초로 한 것이다. T 세포 활성화는 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 도입 후 억제되었다. T 세포에 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 도입을 억제하기 위한 항-Globo H 항체 또는 항-SSEA-4 항체의 첨가는 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드 유도된 면역억제를 억제할 수 있다. PD-1/PD-L1 참여는 TCR 신호전달 경로를 억제하였다. T 세포에 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 첨가는 TCR 신호전달을 추가로 억제한다. Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드의 도입은 TCR 신호전달의 배설 효과를 감소시켰으며, 이는 PD-1/PD-L1 참여에 의한 억제(즉, 면역 관문 효과)를 차단하기 위한 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 결과이다. 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 함께 항-Globo H 항체 또는 항-SSEA-4 항체의 첨가는 Globo H 세라마이드 또는 SSEA-4 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여에 의해 억제된 TCR 신호전달을 상승적으로 역전시킨다. Globo H 또는 SSEA-4 항원을 발현시키는 암은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교아세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담도암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 대장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협측암, 구인두암, 후두암 및 전립선암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
병용 요법에서 관문 억제제의
비제한적인
실시예의
설명
면역 관문 시스템을 억제/차단하는 분자인 면역 관문 억제제는 고급 신생물에 대한 효과적인 치료법으로서 나타나며, 이러한 것들 중에는 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(CTLA4)를 차단하는 치료 항체, 및 여러 종양에 대해 사용된 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)이 있다[Topalian SL et al., Nat Rev Cancer. 2016 May;16(5):275-87.]. PD-1(프로그래밍된 세포 사멸 단백질, CD279)(B7/CD28 패밀리의 수용체의 구성원)은 T, B, NK 및 골수 유래 억제 세포를 포함하는 활성화된 백혈구의 세포 표면 상에서 발현된 모노머 분자이며, 이의 발현은 유전적 및 후생적 메커니즘 간의 상호작용에 의해 미세하게 조절된다. PD-1의 공지된 리간드에는 PD-L1 및 PD-L2가 있다(Farkona S. et al., BMC Med. 2016 May 5;14:73).
PD-L1(프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1, B7H1, CD274)은 T, B, 골수 및 수지상 세포를 포함하는 조혈 세포, 및 비-조혈(예를 들어, 폐, 심장, 내피, 췌장 섬 세포, 각질 세포) 및 특히 암 세포 상에서 낮은 수준으로 발현되고, 세포 활성화 시에 상향 조절된다. PD-L2(프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 2, B7-DC, CD273)는 대식 세포, 수지상 세포(DC), 활성화된 CD4+ 및 CD8+ 림프구 및 일부 고체 종양(난소 암종, 소세포 폐암, 식도암) 상에서 발현된다. PD-L1 및 PD-L2 발현은 또한 정상 및 암-관련 섬유아세포 상에서 검출되었다. PD-L1 및 PD-L2 둘 모두는 추가 수용체와 상호작용하는 데, PD-L1은 CD28 리간드 CD80과 상호작용하며, PD-L2는 대식 세포 및 다른 세포 타입 상에서 발현되는 반발 유도 분자(RGM)b와 상호작용한다. PD-1의 세포질 테일은 면역수용체 트립신-기반 억제 모티프(ITIM) 및 면역수용체 트립신-기반 스위치 모티프(ITSM)를 함유한다. T 림프구에서, 이의 리간드와 PD-1의 상호작용은 PD-1의 세포내 테일에서 2개의 트립신의 포스포릴화를 초래하며, PD-1의 ITSM 세포질 영역으로의 SH2 도메인-함유 단백질 트립신 포스파타아제(SHP-1 및/또는 SHP-2)의 동원은 이후에 T-세포 수용체의 다운스트림 신호를 억제하여, T 세포 증식 및 시토카인 생산을 억제한다. PD-1은 또한 T 세포에 대한 다른 효과를 발휘한다. 예를 들어, Akt 및 Ras 경로를 억제함으로써, PD-1 촉발은 유비퀴틴 리가아제 성분 SKP2의 전사를 억제하며, 이는 사이클린-의존 키나아제의 억제제인, p27의 SKP2-매개 퇴화(kip1)를 소상시키고, 이에 의해 세포 주기 진행을 차단한다. 또한, PD-1은 하나 이상의 메커니즘에 의해 아폽토시스를 촉진시킬 수 있다. T 세포 활성화를 직접적으로 억제하는 것 이외에, PD-L1에 의한 촉발은 이펙터 T 세포를 능동적으로 억제하는 말초 내성의 주요 매개인자인, T 조절 세포(Treg)의 발달을 유도할 수 있다. PD-1 촉발에 의한 Treg 유도는 포스포-Akt와 같은 주요 신호 전달 분자의 조절에 의해 매개되며, 이의 수준은 PTEN의 PD-1 유도 활성에 의해 낮게 유지된다.
여러 타입의 암 세포는 PD-L1을 발현시킨다. 또한, 종양 미세환경에서 비-신생 세포(내피 세포, 백혈구, 섬유아세포)는 또한 PD-L1을 발현시킬 수 있다. 이는 종양-침윤 PD-1 + T 림프구(TIL)를 용인하고/거나 Treg 발달을 유전할 수 있음을 시사한다. 실제로, 늘어나고 있는 증거는 항-PD-1/PD-L1 단일클론 항체(mAb)로 일부 암 타입(흑색종, 신장 암종, 비소세포 폐암, 등)에 결린 환자의 치료가 종양 성장을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
현재, 100개 이상의 임상 시험에서는 다양한 암에서 PD-1 및 PD-L1 차단 임상 효능을 조사하고 있다. 그러나, 매우 고무적인 결과에도 불구하고, a) 모든 종양 타입이 항-PD-1 또는 항-PD-L1 mAb에 대해 유의미한 반응을 나타내지 않고, b) 반응하는 암의 서브세트에서, 모든 환자가 반응하지 않고 일부 반응이 매우 부분적이라는 것이 명백하다. 이러한 연구 단계에서 반응의 지속성에 대한 불확실성과 함께 이러한 증거 조각은 항-PD-1/PD-L1 mAb 간의 유효 치료 조합에 대한 필요성 및 다른 경로에서 작용하는 툴을 지시한다[Topalian SL et al. Cancer Cell. 201 5 Apr 13;27(4):450-61].
면역 관문 억제제는 인간에서 일부 항-종양 활성을 제공하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 부분 항-종양 활성은 치료된 대상체의 일부에서만 관찰된다. 관문 억제제는 아미노산 잔기 및 단일클론 또는 다클론 항체를 포함하는, 단백질, 폴리펩타이드를 포함하거나 배제할 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 하나 초과의 관문 억제제를 포함하거나 이와 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 관문 억제제는 CD28/CTLA-4를 포함하는, T 세포 조절제의 임의의 패밀리 상에서 발견된 리간드 또는 단백질에 결합한다. 관문 억제제의 타겟은 면역계 이펙터 또는 조절제 세포(예를 들어, T 세포) 상에서 발현된 수용체 또는 공동-수용체(예를 들어, CTLA-4; CD8); 항원-제시 세포의 표면 상에서 발현된(즉, PD-1, PD-2, PD-L1 및 PD-L2를 포함하거나 배제할 수 있는, 활성화된 T 세포의 표면 상에서 발현된) 단백질; 대사 효소 또는 종양 및 종양-침습 세포 둘 모두에 의해 발현된 대사 효소(예를 들어, IDO1 및 IDO2와 같은 아이소형을 포함하는 인돌라민(IDO)); 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 단백질(예를 들어, 림프구-활성화 유전자 3, LAG3으로도 알려짐); B7 패밀리에 속하는 단백질(예를 들어, B7-H3 또는 이의 동족체)을 포함하거나 배제할 수 있다. B7 단백질은 활성화된 항원 제시 세포 및 T 세포 둘 모두 상에서 발견될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 관문 억제제는 조합되거나 함께 쌍을 이룰 수 있다. 예를 들어, 항원 제시 세포 상에서 발견된 B7 패밀리 관문 억제제는 이러한 2가지 타입의 세포 간의 활성을 감소시키기 위한 공동-억제 신호를 생성하기 위해, T 세포의 표면 상에 발현된, CD28 또는 CTLA-4 억제제와 쌍을 이룰 수 있다. 공동-수용체는 외부 리간드에 결합한 후에 내부 세포 과정을 조절할 수 있는 동일한 세포 상에 위치된 2개의 상이한 수용체의 존재를 지칭한다. 공동-수용체는 자극성이거나 억제성일 수 있다. 공동-수용체는 때때로 보조 수용체 또는 동시-신호 수용체로 불리워진다. 본원에서 사용되는 용어 "공동-억제"는 하나 초과의 분자가 세포의 표면 상에 이의 개개 수용체에 결합하여, 세포내 과정이 일어나는 것을 늦추거나 방해하는 결과를 지칭한다.
특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-1 또는 CTLA-4를 억제하는 억제 수용체의 길항제, 예를 들어, 항-PD-1, 항-PD-L1 또는 항-CTLA-4 항체 또는 억제제를 포함할 수 있다. PD-1 또는 PD-L1 억제제의 예는 비제한적으로, 인간 PD-1을 차단하는 인간화된 항체, 예를 들어, 람브롤리주맙(항-PD-1 Ab, 상표명 키트루다) 또는 피딜리주맙(항-PD-1 Ab), 바벤시오(항-PD-L1 Ab, 아벨루맙), 임핀지(항-PD-L1 Ab, 두발루맙), 및 테센트리크(항-PD-L1 Ab, 아테졸리주맙)뿐만 아니라 완전 인간 항체, 예를 들어, 니볼루맙(항-PD-1 Ab, 상표명 옵디보)을 포함할 수 있다. 다른 PD-1 억제제는 비제한적으로, B7-DC-Ig 또는 AMP-244로도 알려진 PD-L2 Fc 융합 단백질 및 현재 조사 중이고/거나 치료에서 사용하기 위해 개발 중인 다른 PD-1 억제제를 포함하는 가용성 PD-1 리간드의 제제를 포함할 수 있다. 또한, 면역 관문 억제제는 비제한적으로, PD-L1을 차단하는 인간화된 또는 완전 인간 항체, 예를 들어, 두발루맙 및 MIH1 및 현재 조사 중인 다른 PD-L1 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4, PD-L1 또는 PD-1 항체이다. 일부 구현예에서, PD-1 또는 CTLA-4 억제제는 비제한적으로, 인간 PD-1을 차단하는 인간화된 항체, 예를 들어, 람브롤리주맙(항-PD-1 Ab, 상표명 키트루다) 또는 피딜리주맙(항-PD-1 Ab), 니볼루맙(항-PD-1 Ab, 상표명 옵디보), 티실리무맙(항-CTLA-4 Ab), 이필리무맙(항-CTLA-4 Ab), MPDL3280A, BMS-936559, AMP-224, IMP321(ImmuFact), MGA271, 인독시모드, 및 INCB024360을 포함한다.
병용 요법
이에 따라, 음성 면역 관문의 차단과 조합된 항-Globo H 항체에 의한 Globo H 세라마이드의 결핍은 면역억제를 극복하는 데 효과적일 수 있다. 본 발명자의 발견은 항-음성 면역 관문 차단으로 Globo 시리즈 항원(Globo H 또는 SSEA-4)을 타겟화하는 것이 T 세포 비활성화를 구제하는 것으로 공동으로, 부가적으로 및/또는 상승적으로 작용한다는 것을 지지한다.
이에 따라, 본 발명의 제1 구현예는 항-Globo H 및/또는 항-SSEA-4 항체 또는 이의 단편 및 면역 관문의 적어도 하나의 억제제를 포함하는 조합물에 관한 것이다. 특별한 특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-음성 면역 관문 항체이다.
본 개시는 항-종양 면역치료를 필요로 하는 대상체에 대한 병용 요법을 위한 방법으로서, 대상체가 관문 억제제의 향상된 또는 증가된 조절을 통해 증가된 효능 또는 개선된 종양 반응을 필요로 하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 병용 요법은 동시에 또는 순차적으로, 별도의 단일요법 제형 또는 조합된 공동제형으로서 투여된다. 투여의 순서는 최대 치료 효능을 달성하기 위해 교대되거나 중첩될 수 있다. 일 양태에서, 치료제는 백신이며, 관문 억제제는 PD-1 억제제이다.
일 양태에서, 치료 효능은 1) T 세포에 의한 항-종양 활성의 증가, 종양 회귀의 증가 또는 종양 용적 수축 또는 종양 괴사에 의해 향상된다. 특정 구현예에서, 상기 관문 억제제는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4 관문 억제제이다.
실시예
실시예 1. 다양한 암 세포에서 인간 CD3+ T 세포로의 Globo H 또는 SSEA-4의 배출의 입증
인간 암 세포주(HCC1428, MDA-MB-231, SKOV-3, ACHN, 또는 NCI-H526; 모두 ATCC(Manassas, VA)로부터 구매함)를 24-웰 플레이트에서 개별적으로 ATCC 제안된 완전 성장 배지 중에 시딩하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 3일의 인큐베이션 후에, 인간 말초혈 단핵 세포(hPBMC)를 첨가하고, 37℃ 5% CO2에서 2일 동안 암 세포와 함께 또는 암 세포 없이 배양하였다. 암 세포, 암 세포와 함께 배양된 PBMC 및 암 세포 없이 배양된 PBMC를 각각 Alexa Fluor 488-컨쥬게이션된 항-Globo H, Alexa Fluor 647-컨쥬게이션된 항-SSEA-4, 및 APC/Cy7-컨쥬게이션된 항-인간 CD3 단일클론 항체(BioLegend, Inc. Cat#344818,)로 다중 염색한 세포 표면에 수확하였다. 도 1의 결과에서는 Globo H 또는 SSEA-4가 종양 세포에서 인간 T 세포로 배출될 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 2. Globo 시리즈 글리코스핑고지질에 의한 T 세포 활성화의 억제의 입증
Jurkat/NFAT-Re Luc 세포(Promega, Inc., Cat# G7102)를 48-웰 배양 플레이트에서 18 내지 24시간 동안 다양한 농도의 화학적으로 합성된 Globo H 세라마이드(GHCer) 또는 SSEA-4 세라마이드(SSEA4Cer)와 함께 예비-인큐베이션하였다. 세포를 수집하고, 밤새 항-인간 CD3(100 ng/웰)(BioLegend, Inc. Cat#317326)으로 코팅된 및 6시간 활성화를 위해 37℃ 인큐베이터에서 항-인간 CD28(300 ng/웰)(BioLegend, Inc. Cat#302914)로 코팅된 백색, 평평한 바닥 96-웰 검정 플레이트(Greiner Bio-One GmbH, Cat#655073)로 옮겼다. 검정 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고, 15분 동안 실온(22 내지 25℃)로 평형 상태로 만들었다. 75 ㎕의 Bio-Glo™ 루스페라아제 검정 시약(Promega, Inc. Cat#G7940)을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 발광을 마이크로플레이트 판독기 SpectraMax L(Molecular Devices, LLC.)을 이용하여 측정하였다. 광전자 배증관 튜브(PMT) 감도를 자동 범위로 설정하고, 570 nm에서 보정하였다. 유도 배수를 RLU활성화됨/RLU비활성화됨에 의해 계산하였다. 도 2에서의 결과는 GHCer 또는 SSEA4Cer가 용량 의존 방식으로 항-CD3/28 자극에 대해 Jurkat T 세포 활성화를 억제함을 나타내었다.
실시예 3. 항-Globo H 항체에 의한 Globo H 세라마이드-유도 T 세포 비활성화의 역전의 입증
40, 20 및 5 μM GHCer를 37℃에서 3시간 동안 0.5 % super Low IgG 우태아혈청(Hyclone, Cat# SH30898.03)을 갖는 RPMI-1640 배지(Life Technologies, Cat#A1049101)를 함유한 검정 배지에서, 10 μM OBI-888, 항-Globo H 항체와 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 5분 동안 5000×g에서 원심분리하고, 상청액을 수확하고, 18 내지 24시간 동안 Jurkat/NFAT-Re Luc 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 수집하고, 6시간 활성화를 위해 37℃ 인큐베이터에서 항-인간 CD3(100 ng/웰), 및 항-인간 CD28(300 ng/웰)로 밤새 코팅된 백색, 평평한 바닥 96-웰 검정 플레이트로 옮겼다. 검정 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고, 15분 동안 실온(22 내지 25℃)로 평형 상태로 만들었다. 75 ㎕의 Bio-Glo™ 루시페라아제 검정 시약을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 발광을 마이크로플레이트 판독기 SpectraMax L을 이용하여 측정하였다. 광전자 배증관 튜브(PMT) 감도를 자동 범위로 설정하고, 570 nm에서 보정하였다. 유도 배수를 RLU활성화됨/RLU비활성화됨에 의해 계산하였다. 도 3에 도시된 결과는 OBI-888(예시적 항-Globo H 항체)이 항-CD3/28에 의해 활성화된 Jurkat T 세포에 대한 GHCer 유도된 면역억제를 역전시킬 수 있음을 나타내었다.
실시예 4. 항-SSEA-4 항체에 의한 SSEA-4 세라마이드-유도된 T 세포 비활성화의 역전의 입증
40, 20 및 10 μM SSEA4Cer를 37℃에서 5시간 동안 0.1% 초저 IgG 우태아혈청(Hyclone, Cat# SH30898.03)과 함께 RPMI-1640 배지(Life Technologies, Cat#11875093)를 함유한 검정 배지에서, 5 μM OBI-898, 항-SSEA-4 항체와 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 7000×g에서 5분 동안 2회 원심분리하고, 상청액을 수확하고, 18 내지 24시간 동안 Jurkat/NF-κB-Re Luc 세포(Signosis, Inc., Cat#SL-0050-NP)와 인큐베이션하였다. 세포를 모으고, 6시간 활성화 동안 37℃ 인큐베이터 안에 있는 항-인간 CD3(100 ng/웰), 및 항-인간 CD28(300 ng/웰)로 밤새 코팅된 백색의 평평한-바닥의 96-웰 검정 플레이로 옮겼다. 검정 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고, 15분 동안 실온(22 내지 25℃)로 평형 상태로 만들었다. 75 ㎕의 Bio-Glo™ 루시페라아제 검정 시약을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 발광을 마이크로플레이트 판독기 SpectraMax L을 이용하여 측정하였다. 광전자 배증관 튜브(PMT) 감도를 자동범위로 설정하고, 570 nm에서 보정하였다. 유도 배수를 RLU활성화됨/RLU비활성화됨에 의해 계산하였다. 도 4에 도시된 결과에서는 OBI-898(예시적 항-SSEA-4 항체)이 항-CD3/28에 의해 활성화된 Jurkat T 세포에 대한 SSEA4Cer 유도 면역억제를 역전시킬 수 있음을 나타내었다.
실시예 5. TCR 신호전달에 대한 억제 향상에서 PD-1/PD-L1 참여와 함께 Globo 시리즈 글리코스핑고지질의 상승적 반응의 입증
다양한 농도의 GHCer 또는 SSEA4Cer를 PD-1 이펙터 세포(PD-1/PD-L1 차단 바이오검정 키트, Promega, Cat# J3011)와 함께 인큐베이션하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. PD-L1+ 타겟 세포(PD-1/PD-L1 차단 바이오검정 키트, Promega, Cat# J3011)를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. PD-L1+ 세포가 코팅된 플레이트에서 성장 배지를 GHCer 또는 SSEA4Cer/이펙터 세포 Rxn에 의해 교체하고, 6시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 10분 동안 주변 온도로 꺼내었다. Bio-Glo™ 시약을 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하고, 이후에 광도계에 의해 판독하였다. 도 6의 결과에서는 GHCer 또는 SSEA4Cer이 TCR 활성화 신호전달 경로를 억제하는 데 PD-1/PD-L1 참여와 상승적으로 작용함을 나타낸다.
실시예 6. 감소된 키트루다 또는 테센트리크 방출된 PD-1/PD-L1 참여는 Globo H 세라마이드에 의한 TCR 신호전달을 억제함
40 μM GHCer를 PD-1 이펙터 세포(PD-1/PD-L1 차단 바이오검정 키트, Promega, Cat# J3011)와 함께 인큐베이션하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. PD-L1+ 타겟 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. PD-L1+ 세포가 코팅된 플레이트에서 성장 배지를 2 μM 키트루다, 항-PD-1 mAb, 또는 2 μM 테센트리크, 항-PD-L1 mAb를 갖는 GHCer/이펙터 세포 R투에 의해 교체하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 10분 동안 주변 온도로 꺼내었다. Bio-Glo™ 시약을 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하고, 이후에 광도계에 의해 판독하였다. 도 7의 결과에서는 이펙터 세포 감소된 키트루다 또는 테센트리크 방출된 PD-1/PD-L1 참여 상에 GHCer의 도입이 TCR 신호전달을 억제함을 나타낸다.
실시예 7. 감소된 키트루다 또는 테센트리크 방출된 PD-1/PD-L1 참여는 SSEA-4 세라마이드에 의한 TCR 신호전달을 억제함.
40 μM SSEA4Cer를 PD-1 이펙터 세포(PD-1/PD-L1 차단 바이오검정 키트, Promega, Cat# J3011)와 함께 인큐베이션하고, 이후에, 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. PD-L1+ 타겟 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. PD-L1+ 세포가 코팅된 플레이트에서 성장 배지를 μM 키트루다, 항-PD-1 mAb, 또는 2 μM 테센트리크, 항-PD-L1 mAb를 갖는 SSEA4Cer/이펙터 세포 Rxn에 의해 교체하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 10분 동안 주변 온도로 꺼내었다. Bio-Glo™ 시약을 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하고, 이후에 광도계로 판독하였다. 도 8의 결과에서는 이펙터 세포 상에 SSEA4Cer를 도입하여 감소된 키트루다 또는 테센트리크 방출된 PD-1/PD-L1 참여가 TCR 신호전달을 억제함을 나타내었다.
실시예 8. Globo H 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여의 역전은 키트루다 또는 테센트리크 항체아 조합된 항-Globo H 항체에 의해 TCR 신호전달을 억제함
GHCer을 37℃에서 4시간 동안 99% RPMI 1640/1% FBS(PD-1/PD-L1 차단 바이오검정 키트, Promega, Cat# J3011)를 함유한 검정 배지 중에서 10 μM OBI-888과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 8000×g에서 5분 동안 2회 원심분리하고, 상청액을 수확하고, 24시간 동안 PD-1 이펙터 세포와 함께 인큐베이션하였다. PD-L1+ 타겟 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. PD-L1 세포가 코팅된 플레이트로부터 성장 배지를 2 μM 키트루다 또는 2 μM 테센트리크를 갖는 GHCer/이펙터 세포 Rxn에 의해 교체하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 10분 동안 주변 온도로 꺼내었다. Bio-Glo™ 시약을 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하고, 이후에 광도계에 의해 판독하였다. 도 10의 결과에서는 OBI-898이 GHCer를 구제하는 데 키트루다 또는 테센트리크와 상승적으로 작용하고 D-1/PD-L1 결합이 TCR 신호전달을 억제하였음을 나타내었다.
실시예 9. SEA-4 세라마이드 및 PD-1/PD-L1 참여의 역전은 키트루다 또는 테센트리크 항체와 조합된 항-SSEA-4 항체에 의해 TCR 신호전달을 억제함
SSEA4Cer를 37℃에서 4시간 동안 검정 배지 중에서 5 μM OBI-898과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 8000×g에서 5분 동안 2회 원심분리하고, 상청액을 수확하고, 24시간 동안 PD-1 이펙터 세포와 인큐베이션하였다. PD-L1+ 타겟 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. PD-L1 세포가 코팅된 플레이트로부터의 성장 배지를 2 μM 키트루다 또는 2 μM 테센트리크와 함께 SSEA4Cer/이펙터 세포 R투에 의해 대체하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 10분 동안 주변 온도로 꺼내었다. Bio-Glo™ 시약을 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하고, 이후에 광도계로 판독하였다. 도 11의 결과에서는 OBI-898이 SSEA4Cer를 구제하는 데 키트루다 또는 테센트리크와 상승적으로 작용하고 D-1/PD-L1 결합이 TCR 신호전달을 억제하였음을 나타내었다.
달리 규정하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어 및 임의의 두문자어는 본 발명의 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 정보를 전달하기 위한 임의의 조성물, 방법, 키트, 및 수단이 본 발명을 실행하기 위해 사용될 수 있지만, 정보를 전달하기 위한 바람직한 조성물, 방법, 키트, 및 수단이 본원에 기술된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 법률에 의해 허용되는 전체 범위까지 본원에 참고로 포함된다. 이러한 참고문헌의 논의는 단지 이의 저자에 의해 이루어진 주장을 요약하기 위해 의도된다. 임의의 참조문헌(또는 임의의 참조문헌의 일부)이 관련 선행 기술이라는 것은 인정하지 않는다. 본 출원인은 임의의 인용문헌의 정확성 및 적절성에 대해 이의를 제기할 권리가 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> OBI PHARMA, INC.
<120> COMBINATION THERAPY BY USING ANTI-GLOBO H OR ANTI-SSEA-4
ANTIBODY WITH ANTI-NEGATIVE IMMUNE CHECK POINTS ANTIBODY
<130> G3004-01202
<140> PCT/US2019/035168
<141> 2019-06-03
<150> 62/679,510
<151> 2018-06-01
<160> 182
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 1
tctggccctg ggatattgca gccctcccag accctcagtc tgacttgttc tttctctgga 60
ttttcactgt acacttttga tatgggtgta ggctggattc gtcagccttc agggaagggt 120
ctggagtggc tggcacacat ttggtgggat gatgataagt actataaccc agccctgaag 180
agtcggctca cagtctccaa ggatacctcc aaaaaccagg tcttcctcaa gatccccaat 240
gtggacactg cagatagtgc cacatactac tgtgctcgag taaggggcct ccatgattat 300
tactactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctct 348
<210> 2
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 2
gcatctccag gggagaaggt cacaatgact tgcagggcca gttcaagtgt aagttacatg 60
cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc cccaaaccct ggatttatgc cacatccaac 120
ctggcgtctg gagtccctgc tcgcttcagt ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc 180
acaatcagca gagtggaggc tgaagatgct gccacttatt tctgccagca gtggagtcga 240
aacccattca cgttcggctc ggggacaaag ttggaaataa ga 282
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 3
Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys
1 5 10 15
Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe Asp Met Gly Val Gly Trp
20 25 30
Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp
35 40 45
Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
50 55 60
Val Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Pro Asn
65 70 75 80
Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Gly
85 90 95
Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser
115
<210> 4
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 4
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
1 5 10 15
Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
20 25 30
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
35 40 45
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg
50 55 60
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Arg
65 70 75 80
Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
85 90
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 5
Tyr Thr Phe Asp Met Gly Val Gly
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 6
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 7
Val Arg Gly Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 8
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 9
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 10
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 11
Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 12
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys
1 5 10 15
Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe Asp Met Gly Val Gly Trp
20 25 30
Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp
35 40 45
Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
50 55 60
Val Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Pro Asn
65 70 75 80
Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Gly
85 90 95
Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser
115
<210> 14
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 14
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
1 5 10 15
Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
20 25 30
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
35 40 45
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg
50 55 60
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Arg
65 70 75 80
Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
85 90
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 15
Tyr Thr Phe Asp Met Gly Val Gly
1 5
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 16
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 17
Val Arg Gly Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 18
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 19
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 20
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 21
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 21
Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys
1 5 10 15
Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe Asp Met Gly Val Gly Trp
20 25 30
Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Gln Ile Trp
35 40 45
Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Gly Leu Lys Ser Arg Leu Thr
50 55 60
Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Pro Asn
65 70 75 80
Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Leu Arg Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser
115
<210> 22
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 22
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
1 5 10 15
Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
20 25 30
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
35 40 45
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg
50 55 60
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Arg
65 70 75 80
Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
85 90
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 23
Tyr Thr Phe Asp Met Gly Val Gly
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 24
Gln Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Gly Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 25
Ile Arg Gly Leu Arg Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 26
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 27
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 28
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 29
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 29
Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys
1 5 10 15
Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe Gly Leu Gly Val Gly Trp
20 25 30
Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp
35 40 45
Trp Asp Asp Asp Lys Ser Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
50 55 60
Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Met Ile Ala Asn
65 70 75 80
Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Gly Pro
85 90 95
Lys Trp Ser Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Cys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser
115
<210> 30
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 30
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
1 5 10 15
Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
20 25 30
Pro Tyr Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg
35 40 45
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg
50 55 60
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser
65 70 75 80
Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
85 90
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 31
Ser Thr Phe Gly Leu Gly Val Gly
1 5
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 32
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Ser Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 33
Ile Gly Pro Lys Trp Ser Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Cys Asp Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 34
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 35
Ala Thr Ser Asn Leu Ser Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 36
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 37
Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys
1 5 10 15
Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe Gly Leu Gly Val Gly Trp
20 25 30
Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp
35 40 45
Trp Asp Asp Asp Lys Ser Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Gln Leu Thr
50 55 60
Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Leu Leu Lys Ile Ala Asn
65 70 75 80
Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Gly Pro
85 90 95
Lys Trp Ser Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Cys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser
115
<210> 38
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 38
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
1 5 10 15
Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
20 25 30
Pro Tyr Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg
35 40 45
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg
50 55 60
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser
65 70 75 80
Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
85 90
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 39
Ser Thr Phe Gly Leu Gly Val Gly
1 5
<210> 40
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Ser Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 41
Ile Gly Pro Lys Trp Ser Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Cys Asp Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 42
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 43
Ala Thr Ser Asn Leu Ser Ser
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 44
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 45
tacacttttg atatgggtgt aggc 24
<210> 46
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 46
cacatttggt gggatgatga taagtactat aacccagccc tgaagagt 48
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 47
gtaaggggcc tccatgatta ttactactgg ttttgcttac 40
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 48
agggccagtt caagtgtaag ttacatgcac 30
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 49
gccacatcca acctggcgtc t 21
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 50
cagcagtgga gtcgaaaccc attcacg 27
<210> 51
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 51
tctggccctg ggatattgca gccctcccag accctcagtc tgacttgttc tttctctgga 60
ttttcactgt acacttttga tatgggtgta ggctggattc gtcagccttc agggaagggt 120
ctggagtggc tggcacacat ttggtgggat gatgataagt actataaccc agccctgaag 180
agtcggctca cagtctccaa ggatacctcc aaaaaccagg tcttcctcaa gatccccaat 240
gtggacactg cagatagtgc cacatactac tgtgctcgag taaggggcct ccatgattat 300
tactactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctct 348
<210> 52
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 52
gcatctccag gggagaaggt cacaatgact tgcagggcca gttcaagtgt aagttacatg 60
cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc cccaaaccct ggatttatgc cacatccaac 120
ctggcgtctg gagtccctgc tcgcttcagt ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc 180
acaatcagca gagtggaggc tgaagatgct gccacttatt tctgccagca gtggagtcga 240
aacccattca cgttcggctc ggggacaaag ttggaaataa ga 282
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 53
tacacttttg atatgggtgt aggc 24
<210> 54
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 54
cacatttggt gggatgatga taagtactat aacccagccc tgaagagt 48
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 55
gtaaggggcc tccatgatta ttactactgg tttgcttac 39
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 56
agggccagtt caagtgtaag ttacatgcac 30
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 57
gccacatcca acctggcgtc t 21
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 58
cagcagtgga gtcgaaaccc attcacg 27
<210> 59
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 59
tctggccctg ggatattgca gccctcccag accctcagtc tgacttgttc tttctctgga 60
ttttcactgt acacttttga tatgggtgta ggctggattc gtcagccttc agggaagggt 120
ctggagtggc tggcacaaat ttggtgggat gatgataagt actataaccc aggcctgaag 180
agtcggctca caatctccaa ggatacctcc aaaaaccagg tattcctcaa gatccccaat 240
gtggacactg cagatagtgc cacatactac tgtgctcgaa taaggggcct ccgtgattat 300
tactactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctct 348
<210> 60
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 60
gcatctccag gggagaaggt cacaatgact tgcagggcca gctcaagtgt aagttacatg 60
cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc cccaaaccct ggatttatgc cacatccaac 120
ctggcttctg gagtccctgc tcgcttcagt ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc 180
acaatcagca gagtggaggc tgaagatgct gccacttatt tctgccagca gtggagtcga 240
aacccattca cgttcggctc ggggacaaag ttggaaataa ga 282
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 61
tacacttttg atatgggtgt aggc 24
<210> 62
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 62
caaatttggt gggatgatga taagtactat aacccaggcc tgaagagt 48
<210> 63
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 63
ataaggggcc tccgtgatta ttactactgg tttgcttac 39
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 64
agggccagct caagtgtaag ttacatgcac 30
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 65
gccacatcca acctggcttc t 21
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 66
cagcagtgga gtcgaaaccc attcacg 27
<210> 67
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 67
tctggccctg ggatattgca gccctcccag accctcagtc tgacttgttc tttctctggg 60
ttttcgctga gcacttttgg tttgggtgta ggctggattc gtcagccttc agggaagggt 120
ctggagtggc tggcacacat ttggtgggat gatgataagt cctataaccc agccctgaag 180
agtcggctca caatctccaa ggatacctcc aaaaaccagg tcttcctcat gatcgccaat 240
gtggacactg cagatactgc cacatactac tgtgctcgaa taggcccgaa atggagcaac 300
tactactact actgtgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc c 351
<210> 68
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 68
gcatctccag gggagaaggt cacaatgact tgcagggcca gctcaagtgt tagttacatg 60
cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc cccaaaccct acatttatgc cacatccaac 120
ctgtcttctg gagtccctgc tcgcttcagt ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc 180
acaatcagca gagtggaggc tgaagatgct gccacttatt actgccagca gtggagtagt 240
aaccccttca cgttcggctc ggggacaaag ttggaaataa aa 282
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 69
agcacttttg gtttgggtgt aggc 24
<210> 70
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 70
cacatttggt gggatgatga taagtcctat aacccagccc tgaagagt 48
<210> 71
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 71
ataggcccga aatggagcaa ctactactac tactgtgact ac 42
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 72
agggccagct caagtgttag ttacatgcac 30
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 73
gccacatcca acctgtcttc t 21
<210> 74
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 74
cagcagtgga gtagtaaccc cttcacg 27
<210> 75
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 75
tctggccctg ggatattgca gccctcccag accctcagtc tgacttgttc tttctctggg 60
ttttcgctga gcacttttgg tttgggtgta ggctggattc gtcagccttc agggaagggt 120
ctggagtggc tggcacacat ttggtgggat gatgataagt cctataaccc agccctgaag 180
agtcagctca caatctccaa ggatacctcc aaaaaccagg tactcctcaa gatcgccaat 240
gtggacactg cagatactgc cacatactac tgtgctcgaa taggcccgaa atggagcaac 300
tactactact actgtgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc c 351
<210> 76
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 76
gcatctccag gggagaaggt cacaatgact tgcagggcca gctcaagtgt tagttacatg 60
cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc cccaaaccct acatttatgc cacatccaac 120
ctgtcttctg gagtccctgc tcgcttcagt ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc 180
acaatcagca gagtggaggc tgaagatgct gccacttatt actgccagca gtggagtagt 240
aaccccttca cgttcggctc ggggacaaag ttggaaataa aa 282
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 77
agcacttttg gtttgggtgt aggc 24
<210> 78
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 78
cacatttggt gggatgatga taagtcctat aacccagccc tgaagagt 48
<210> 79
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 79
ataggcccga aatggagcaa ctactactac tactgtgact ac 42
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 80
agggccagct caagtgttag ttacatgcac 30
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 81
gccacatcca acctgtcttc t 21
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 82
cagcagtgga gtagtaaccc cttcacg 27
<210> 83
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 83
Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys
1 5 10 15
Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu
20
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 84
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
1 5 10
<210> 85
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 85
Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys
1 5 10 15
Ile Pro Asn Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 86
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 86
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 87
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 87
Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys
1 5 10 15
Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
20
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 88
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10
<210> 89
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 89
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 90
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 90
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 91
Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe Asp Met Gly Val Gly
1 5 10
<210> 92
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 92
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 93
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 93
Val Arg Gly Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 94
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 94
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 95
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 96
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 96
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 97
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 98
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 99
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 100
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 100
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 101
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 102
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 102
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 103
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 103
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe
20 25 30
Asp Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Arg Gly Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr
100 105 110
<210> 104
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 104
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr
85 90 95
<210> 105
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 105
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe
20 25 30
Asp Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Pro Asn Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Arg Gly Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr
100 105 110
<210> 106
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 106
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Thr Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr
85 90 95
<210> 107
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 107
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe
20 25 30
Asp Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Arg Gly Leu His Arg Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 108
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 108
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Lys Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Arg Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 109
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 109
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acttgcactg tctctgggtt ttcattaatc agctatggtg tagactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggtg gtggaaatac aaattataat 180
tcatctctca tgtccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccaa aactgggacc 300
ggatatgctt tggagtactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc c 351
<210> 110
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 110
gaaaatgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccaggtc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaacc 120
gcctccccca aactctggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt cccaggtcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg aaactcttac tctctcacga tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgttgcca cttattactg ttttcaggcg agtgggtacc cgctcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaacg g 321
<210> 111
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 111
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Gly Thr Gly Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 112
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 112
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Thr Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala Ser Gly Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 113
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 113
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
20
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 114
Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 115
Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Thr Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 116
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 117
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 117
Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 118
Phe Gln Ala Ser Gly Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 119
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 119
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
1 5 10
<210> 120
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 120
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 121
Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr Gly Val Asp
1 5 10
<210> 122
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 122
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 123
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 123
Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met Ser
1 5 10 15
<210> 124
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 124
Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 125
Thr Gly Thr Gly Tyr Ala Leu Glu Tyr
1 5
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 126
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 127
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 127
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acttgtactg tctctgggtt ttcattaagc agctatggtg tagactgggt tcgccaacct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggtg gtggaagcat aaattataat 180
tcagctctca tgtccagact gagcatcagc aaagacaatt ccaagagcca aattttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatact actgtaccac acatgaggat 300
tacggtcctt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 128
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 128
caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca aatcctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg ggtagttacc cgtggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aaatcaaacg g 321
<210> 129
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 129
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Thr His Glu Asp Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 130
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Gly Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 131
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 131
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
20
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 132
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 133
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 133
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 134
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 135
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 135
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 136
Gln Gln Trp Gly Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 137
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 138
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 138
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 139
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 139
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val Asp
1 5 10
<210> 140
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 140
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 141
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 141
Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser
1 5 10 15
<210> 142
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 142
Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu Lys
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Thr
20 25 30
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 143
His Glu Asp Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr
1 5
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 144
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 145
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 145
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcactg tctcagggtt ttcattaacc agttatggtg taagctgggc tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggtg acgggagcac aaattatcat 180
tcagctctca tatccagact gagcatcagc aaggataact ccaagagcca agttttctta 240
aaactgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccacgtact actgtgccaa accggaaaac 300
tgggacggct tcgatgtctg gggcccaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 146
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 146
caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccgaca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccgacctgg cttctggagt ccctactcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttacc cgtggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aaatcaaacg g 321
<210> 147
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 147
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ala Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Pro Glu Asn Trp Asp Gly Phe Asp Val Trp Gly Pro Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 148
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 148
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 149
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 149
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
20
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 150
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 151
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 151
Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 152
Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser
1 5
<210> 153
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 153
Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 154
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 155
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 156
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 156
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 157
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val Ser
1 5 10
<210> 158
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 158
Trp Ala Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 159
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 159
Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser
1 5 10 15
<210> 160
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 160
Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
1 5 10 15
Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 161
Pro Glu Asn Trp Asp Gly Phe Asp Val
1 5
<210> 162
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 162
Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 163
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 163
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Gly Thr Gly Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 164
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 164
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Gly Thr Gly Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 165
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 165
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Gly Thr Gly Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 166
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Gln Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Gly Thr Gly Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 167
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 168
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 169
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Gln Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met
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100 105 110
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 170
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Met
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Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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Val Thr Val Ser Ser
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 171
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
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Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met
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100 105 110
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<211> 117
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 172
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met
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Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 173
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
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Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 174
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 174
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
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Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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115
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 175
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val Asp Trp
1 5 10
<210> 176
<211> 17
<212> PRT
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 176
Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 177
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 177
Thr Gly Thr Gly Tyr Ala Leu Glu
1 5
<210> 178
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 178
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
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Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala Ser Gly Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 179
<211> 107
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 179
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala Ser Gly Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 180
Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 181
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 181
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 182
Phe Gln Ala Ser Gly Tyr Pro Leu Thr
1 5
Claims (30)
- 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 치료학적 유효량의 항-음성 면역 관문 항체와 조합하여 항-Globo 시리즈 항원 항체를 포함하는 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, Globo 시리즈 항원이 단계-특이적 배아 항원-4(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1) 또는 Globo H(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)인 방법.
- 제1항에 있어서, 면역 관문 항원 분자가 PD-1/PD-L1 항원, CTLA-4(세포독성 T-림프구-연관 단백질 4), LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIGIT(T-세포 면역글로불린 및 면역수용체 트립신-기반 억제 모티프 도메인), Ceacam 1(암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1), LAIR-1(백혈구-연관 면역글로불린-유사 수용체-1) 또는 TIM-3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-3)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항에 있어서, 항-Globo 시리즈 항원 항체가 OBI-888 또는 OBI-898인 방법.
- 제1항에 있어서, 항-음성 면역 관문 작용제가 PD-1/PD-L1 길항제인 방법.
- 제5항에 있어서, 항-PD-1/PD-L1 항체가 바벤시오(아벨루맙), 옵디보(니볼루맙), 키트루다(펨브롤리주맙), 임핀지(두발루맙) 및/또는 테센트리크(아테졸리주맙)인 방법.
- 제1항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협측암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종, 또는 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항에 있어서, 하나의 항-Globo 시리즈 항원 항체 또는 이의 단편 및 하나의 항-PD-1/PD-L1 항체 또는 이의 단편을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 항-Globo 시리즈 항체 및/또는 면역 관문의 적어도 하나의 억제제가 뮤린 항체, 재조합 항체, 인간화된 또는 완전 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 특히, 이중특이적 항체로부터 선택된 단일클론 항체 또는 이의 단편인 방법.
- 제9항에 있어서, 면역 관문의 적어도 하나의 억제제가 항체, 단백질, 소분자 및/또는 si-RNA인 방법.
- 제1항에 있어서, 항-Globo 시리즈 항체 또는 이의 단편이 표 1 및 표 2에 기술된 서열번호 1 내지 서열번호 108을 포함하는 인간화된 항체, 또는 표 6 내지 표 9에 기술된 서열번호 109 내지 서열번호 182를 포함하는 항-SSEA4 항체인 방법.
- 제9항에 있어서, 면역 관문의 억제제가 제3항의 항원(PD-1/PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIGIT, Ceacam 1, LAIR-1 또는 TIM-3)에 결합하는 항체 또는 이의 단편인 방법.
- 제1항에 있어서, 항-Globo 시리즈 항원 항체 또는 이의 단편 및 면역 관문의 적어도 하나의 억제제가 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여되는 방법.
- 제1항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
- 제1항에 있어서, 항-음성 면역 관문 차단과 조합한 Globo 시리즈 항원(항-Globo H 또는 항-SSEA-4를 가짐) 항체의 타겟화가 T 세포 비활성화를 구제하고 치료 효능을 개선하기 위해 공동으로, 부가적으로, 및/또는 상승적으로 작용하는 방법.
- 제1항에 있어서, 치료 효능이 T 세포 비활성화의 구제에 의해 향상되는 방법.
- 제1항에 있어서, 암의 성장 또는 진행이 억제되고/거나 감소되는 방법.
- 제1항에 있어서, 종양 용적이 감소되는 방법.
- T 세포 비활성화를 구제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 치료학적 유효량의, 항-음성 면역 관문 항체와 조합하여 항-Globo 시리즈 항원 항체를 포함하는 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 암 성장/진행을 감소시키고/거나 억제하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 치료학적 유효량의, 항-음성 면역 관문 항체와 조합하여 항-Globo 시리즈 항원 항체를 포함하는 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 항-음성 면역 관문 항체 억제제가 키트루다(펨브롤리주맙), 및/또는 옵디보(니볼루맙)로부터 선택된 항-PD-1 항체, 및 바벤시오(아벨루맙), 임핀지(두발루맙), 및/또는 테센트리크(아테졸리주맙)으로부터 선택된 상기 항-PD-L1 항체를 포함하는 방법.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 Globo 시리즈 항원이 단계-특이적 배아 항원-4(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1) 또는 Globo H(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)인 방법.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 항-Globo 시리즈 항원 항체가 OBI-888 또는 OBI-898인 방법.
- 항-Globo 시리즈 항원 항체 및 항-음성 면역 관문 항체의 조합물; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 이중 음성 면역 관문 분자를 타겟으로 하는 약제 조성물.
- 제24항에 있어서, 둘 이상의 면역 관문 분자를 추가로 결합시키는 조성물.
- 제25항에 있어서, 면역 관문 분자가 PD-1/PD-L1 항원, CTLA-4(세포독성 T-림프구-연관 단백질 4), LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIGIT(T-세포 면역글로불린 및 면역수용체 트립신-기반 억제 모티프 도메인), Ceacam 1(암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1), LAIR-1(백혈구-연관 면역글로불린-유사 수용체-1) 또는 TIM-3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
- 제24항에 있어서, Globo 시리즈 항원이 단계-특이적 배아 항원-4(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1) 또는 Globo H(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)인 조성물.
- 제24항에 있어서, 항-Globo 시리즈 항원 항체가 OBI-888 또는 OBI-898인 조성물.
- 제24항에 있어서, 항-Globo 시리즈 항원 항체 또는 이의 단편이 표 1 및 표 2에 기술된 바와 같은 서열번호 1 내지 108을 포함하는 항-Globo H 항체, 또는 표 6 내지 표 9에 기술된 바와 같은 서열번호 109 내지 182를 포함하는 항-SSEA4 항체인 방법.
- 제24항의 약제 조성물 및 이의 사용 설명서를 포함하는 키트.
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