KR20210031429A - Dna 데이터 저장을 위한 프린터 피니셔 시스템 - Google Patents
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Abstract
적어도 제 1 구성 요소 핵산 분자 및 제 2 구성 요소 핵산 분자로부터 식별자 핵산 분자를 조립함으로써 디지털 정보를 저장하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 시스템은 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자가 기질 상에 배치되도록 제 1 구성 요소 핵산 분자를 포함하는 제 1 용액의 제 1 액적을 기질상의 좌표에 분배하도록 구성된 제 1 프린트 헤드, 및 제 2 구성 요소 핵산을 포함하는 제 2 용액의 제 2 액적을 기질상의 좌표에 분배하도록 구성된 제 2 프린트 헤드를 포함할 수 있다. 시스템은 반응 혼합물을 기질상의 좌표 상에 분배하여 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자를 물리적으로 연결하고, 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자를 물리적으로 연결하는 데 필요한 조건을 제공하거나, 둘 다를 제공하는 피니셔를 포함할 수있다.
Description
본 출원은 2018년 5월 16일에 출원된 제목 "DNA 데이터 저장을 위한 프린터-피니셔 시스템"의 미국 잠정 출원 번호 제 62/672,500호; 2018년 5월 16일에 출원된 제목 "핵산 기반 데이터 저장을 위한 구성 및 방법"의 미국 잠정 출원 제 62/672,495호; 및 2019년 2월 25일에 출원된 제목 "DNA에 데이터 저장을 위한 시스템"의 미국 잠정 출원 제 62/809,870의 우선권 및 그 장점을 주장한다. 상기 출원들의 전체 내용은 여기에 참고로 포함된다.
핵산 디지털 데이터 저장장치는 자기 테이프 또는 하드 드라이브 스토리지 시스템보다 고밀도로 데이터를 저장하여 장기간 정보를 인코딩하고 저장하는 안정적인 접근 방식이다. 또한 차갑고 건조한 상태에서 보관된 핵산 분자에 저장된 디지털 데이터는 60,000년 또는 그 이상 오래 검색할 수 있다.
핵산 분자에 저장된 디지털 데이터에 액세스하기 위해 핵산 분자가 서열화될 수 있다. 따라서 핵산 디지털 데이터 저장은 자주 액세스하지 않지만 장기간 저장하거나 보관해야 하는 많은 양의 정보를 저장할 수 있는 데이터를 저장하는 이상적인 방법일 수 있다.
현재의 방법은 디지털 정보(예: 이진 코드)를 염기별 핵산 서열로 인코딩하는 데 의존하므로, 염기 서열과 염기 관계가 디지털 정보(예: 이진 코드)로 직접 변환된다. 새로운 염기 별 핵산 합성 비용이 비쌀 수 있기 때문에 비트 스트림 또는 디지털로 인코딩된 정보의 바이트로 읽을 수있는 기본 서열에 저장된 디지털 데이터의 서열화는 오류가 발생하기 쉽고 인코딩 비용이 많이들 수 있다. 핵산 디지털 데이터 저장을 수행하는 새로운 방법에 대한 기회는 저렴하고 상업적으로 구현하기 쉬운 데이터를 인코딩하고 검색하기 위한 접근 방식을 제공할 수 있다.
본 발명의 시스템, 조립 및 방법은 일반적으로 디지털 정보를 저장하는 DNA 분자의 생성에 관한 것이다. 예를 들어, 구성 요소 핵산 분자(예: 구성 요소)가 선택되어 웨빙과 같은 기질 재료에 개별적으로 분배된다. 구성 요소는 동일한 위치에 배치되도록 기질의 동일한 위치(예: 좌표)에서 인쇄 또는 분배된다. 구성 요소는 자체 조립하거나 미리 결정된 순서로 자체적으로 분류하여 식별자 핵산 분자(예: 식별자)를 형성하도록 구성된다. 각 식별자는 특정 심볼(예: 비트 또는 일련의 비트) 또는 심볼 스트링(예: 비트 스트림)에서 해당 심볼의 위치(예: 랭크 또는 어드레스)에 해당한다. 구성 요소를 조립하기 위해 시스템은 동일한 위치에 반응 혼합물을 인쇄하거나 분배하여 구성 요소가 자체적으로 정렬되어 식별자를 형성할 수 있다. 시스템은 구성 요소를 정렬 시키는 특정 온도와 같이 구성 요소를 물리적으로 연결하는 데 필요한 조건을 선택적으로 또는 추가로 제공할 수 있다. 일단 형성되면, 다수의 식별자가 식별자 풀(pool)로 결합될 수 있으며, 여기서 풀은 전체 심볼 스트링의 적어도 일부를 나타낸다.
여기에서 적어도 제 1 구성 요소 핵산 분자 및 제 2 구성 요소 핵산 분자로부터 식별자 핵산 분자를 조립함으로써 디지털 정보를 저장하기 위한 시스템 및 조립이 제공된다. 시스템은(a) 제 1 구성 요소 핵산 분자를 포함하는 제 1 용액의 제 1 액적을 기질상의 좌표 상에 분배하도록 구성된 제 1 프린트 헤드;(b) 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자가 기질 상에 배치되도록 제 2 구성 요소 핵산 분자를 포함하는 제 2 용액의 제 2 액적을 기질상의 좌표 상에 분배하도록 구성된 제 2 프린트 헤드; 및(c) 반응 혼합물을 기질상의 좌표 상에 분배하여 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자를 물리적으로 연결하고, 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자 또는 둘 모두를 물리적으로 연결하는 데 필요한 조건을 제공하는 피니셔를 포함할 수 있다. 일반적으로, 제 1 및 제 2 프린트 헤드는 다양한 구성 요소를 프린트하거나 분배하는 임의의 수의 프린트 헤드 및 대응하는 노즐의 열을 포함하는 시스템의 일부일 수 있다.
일부 구현예에서, 식별자 핵산 분자는 일련의 심볼에서 심볼의 위치와 값을 나타낸다. 예를 들어, 스트링의 각 심볼은 해당 심볼 위치를 나타내는 해당 식별자를 가질 수 있다. 특히, 해당 심볼의 값이 1이면 식별자가 생성될 수 있으며, 값이 0인 심볼을 나타내는 식별자는 생성되지 않을 수 있다. 스트링의 심볼에 대한 모든 식별자가 생성될 때 스트링에 대한 식별자 분자는 풀 내에서 결합될 수 있다. 따라서 풀 내에 특정 식별자가 있으면 해당 심볼 위치에 대해 1 값을 나타내지만 특정 식별자는 없다. 풀 내에서 해당 심볼 위치에 대한 0 값을 나타낸다. 0에 대응하는 심볼 값에 대해 식별자가 생성될 수 있는 반면, 값 1을 갖는 심볼을 나타내는 식별자는 생성되지 않을 수 있는 선택적인 접근법이 취해질 수 있다. 일부 구현예에서, 피니셔는 기질상의 좌표 상에 반응 혼합물을 분배하도록 구성된 제 3 프린트 헤드를 포함한다. 피니셔는 인큐베이터, 풀링 시스템 또는 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 인큐베이터는 식별자 핵산 분자를 형성하기 위해 구성 요소를 조립하기 위해 반응을 진행하는 데 필요한 특정 온도 조건 또는 조건 세트를 제공할 수 있다. 하기에 풀링 시스템이 논의된다.
몇몇 구현예에서, 피니셔는 제 1 프린트 헤드가 좌표에 제 1 액적을 분배하기 전, 제 2 프린트 헤드가 좌표에 두 번째 액적을 분배하기 전에 또는 둘 다에 반응 혼합물을 좌표에 분배한다. 일반적으로 피니셔는 액적이 분배되기 전, 제 1 액적이 분배된 후 마지막 액적이 분배되기 전 또는 모든 액적이 분배된 후 언제든지 좌표에 반응 혼합물을 분배할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 시스템은 제 1 프린트 헤드, 제 2 프린트 헤드 및 피니셔를 지나서 기질을 이동시키는 적어도 하나의 롤러를 포함한다. 일부 구현예에서, 롤러는 기질의 선형 이동을 제공한다. 일반적으로, 롤러는 기질의 2 차원 또는 3 차원 이동을 제공할 수 있으며, 이는 제 1 및 제 2 프린트 헤드 및 피니셔 각각을 단 한번 또는 여러번 통과할 수 있다. 일부 구현예에서, 롤러는 일정한 속도로 기질의 선형 이동을 달성하는 릴 대 릴 시스템의 일부이다.
일부 구현예에서, 기질은 재료의 연속 루프를 형성하고, 적어도 하나의 롤러는 기질상의 좌표가 제 1 프린트 헤드, 제 2 프린트 헤드 및 피니셔를 여러 번 통과하게 하는 롤러 세트의 일부이다. 일반적으로, 기질 상에 분배되는 재료의 마찰 또는 가능한 오염을 방지하기 위해, 적어도 하나의 롤러가 기질상의 좌표와 접촉하지 않도록 시스템을 구성하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 기질은 제 1 액적, 제 2 액적 및 반응 혼합물이 분배되는 제 1 표면, 및 제 1 표면 반대편의 제 2 표면을 가지며, 적어도 하나의 롤러는 제 2 표면과 접촉하고 제 1 표면과 접촉하지 않는다. 선택적으로, 롤러 중 적어도 하나가 제 1 표면과 접촉하더라도, 롤러는 재료가 분배되는 임의의 좌표와 접촉하는 것을 방지하는 방식으로 그루브가 파여질 수 있다.
몇몇 구현예에서, 시스템은 적어도 하나의 밸리를 포함하는 제 2 롤러를 포함하고, 여기서 제 2 롤러는 적어도 하나의 밸리가 좌표와 정렬되도록 제 1 표면과 접촉한다. 일부 구현예에서, 시스템은 제 2 롤러를 포함하며, 여기서 기질은 적어도 하나의 롤러와 제 2 롤러 사이에서 또는 나선형 경로로 180도 회전하여 제 2 롤러가 제 2 표면과 접촉하고 제 1 표면과는 접촉하지 않도록 한다.
몇몇 구현예에서, 좌표는 1 마이크로 미터에서 200 마이크로 미터 사이의 기질상의 다른 좌표로부터의 직경 또는 간격을 갖는다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 액적은 각각 1 pL 내지 50 pL의 부피를 갖는다.
몇몇 구현예에서, 일부 구현예에서, 시스템은 기질과 제 1 및 제 2 프린트 헤드의 좌표 사이의 정렬을 유지하기 위해 실시간으로 기질의 움직임을 추적하는 레지스터를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 용액은 염료를 포함하고, 시스템은 제 1 및/또는 제 2 액적의 적절한 분배를 확인하는 카메라를 포함하는 스팟 이미저를 포함한다.
일부 구현예에서, 시스템은 기질상의 제 1 및 제 2 액적을 건조시키는 스팟 건조기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 프린트 헤드는 기질의 상이한 좌표에서 제 1 용액의 액적을 분배하는 제 1 복수의 노즐을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 프린트 헤드는 기질의 상이한 좌표에서 제 3 용액의 액적을 분배하는 제 2 복수의 노즐을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 결합력이 낮은 플라스틱을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 또는 폴리프로필렌을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 제 1 및 제 2 프린트 헤드는 기질의 움직임에 대해 상대적인 각도로 시스템 내에 장착되며, 이 각도는 좌표상의 오버 프린팅을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 제 1 프린트 헤드는 MEMS 박막 피에조 잉크젯 헤드 또는 MEMS 열 잉크젯 헤드이다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 프린트 헤드는 좌표 상에 액적을 분배하기 위해 동일한 트랙을 따라 위치되며, 시스템은 대응하는 트랙의 다른 좌표 상에 액적을 분배하기 위해 적어도 하나의 추가 트랙을 따라 위치되는 추가 프린트 헤드를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 피니셔는 반응 인큐베이션에 최적인 고정 내부 온도를 가진다. 일부 구현예에서, 피니셔는 인큐베이션 동안 반응 혼합물의 증발을 제어하는 고정된 습도 레벨을 갖는다. 일부 구현예에서, 피니셔는 응축을 방지하기 위해 인큐베이션 전에 기질을 가열하는 히터를 포함한다. 일부 구현예에서, 피니셔는 기질상의 상이한 좌표로부터의 다중 반응을 용기로 통합하는 풀링 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 피니셔는 응고 전에 기질의 좌표에 반응 억제제를 분배한다.
몇몇 구현예에서, 용기에는 반응 억제제인 풀링 용액이 들어 있다. 일부 구현예에서, 반응 억제제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이다. 용기는 풀링 용액 반응 억제제를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 시스템은 유체에서 포착된 핵산을 기질 상에 서로 다른 좌표로부터 수집된 멤브레인을 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 기질로부터 핵산을 제거하는 스크레이퍼를 포함한다. 일부 구현예에서, 서로 다른 좌표의 여러 반응이 에멀젼으로 합쳐져 여러 반응이 풀링된 후에도 내용물을 유지할 수 있다.
일부 구현예에서, 기질은 비혼화성 액체 또는 오일로 코팅된다. 일부 구현예에서, 시스템은 좌표 상에 오일을 분배하는 오일 분배기를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자에 결합하는 비드로 코팅되거나 패턴화된다. 일부 구현예에서, 시스템은 좌표 상에 비드를 분배하는 비드 분배기를 포함한다.
[21] 몇몇 구현예에서, 반응 혼합물은 리가아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 용액, 제 2 용액 및 반응 혼합물은 첨가제를 포함한다.일부 구현예에서, 첨가제는 제 1 용액과 제 1 프린트 헤드, 제 2 용액과 제 2 프린트 헤드, 또는 반응 혼합물과 피니셔와의 호환성을 가능하게 하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 첨가제는 제 1 용액, 제 2 용액 또는 반응 혼합물의 증발을 완화한다. 일부 구현예에서, 첨가제는 보습제, 계면 활성제 및 바이오사이드 중 적어도 하나를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 시스템은 시스템을 동작 명령들을 실행하도록 구성되는 컴퓨터 프로세서를 포함한다. 명령은(1) 예를 들어 롤러 세트를 제어하는 것과 같이 프린트 헤드를 지나 기질을 이동하기 위한 일련의 명령 및(2) 용액을 분배하기 위해 각 프린트 헤드 또는 해당 노즐에 대한 시간을 특정하기 위한 또 다른 명령 세트가 포함될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 핵산 분자를 조립하기 위한 시스템을 제공하고,
상기 시스템은:
(a) 제 1 구성 요소 핵산 분자를 포함하는 제 1 용액의 제 1 액적을 기질상의 좌표 상에 분배하도록 구성된 제 1 프린트 헤드;
(b) 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자가 기질 상에 배치하기 위해 제 2 구성 요소 핵산 분자를 포함하는 제 2 용액의 제 2 액적을 기질상의 좌표 상에 분배하도록 구성된 제 2 프린트 헤드; 및
(c) 반응 혼합물을 기질상의 좌표 상에 분배하여 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자를 물리적으로 연결하고, 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자 또는 둘 모두를 물리적으로 연결하는 데 필요한 조건을 제공하는 피니셔를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 피니셔는 기질상의 좌표 상에 반응 혼합물을 분배하도록 구성된 제 3 프린트 헤드를 포함한다. 피니셔는 인큐베이터, 풀링 시스템 또는 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로 피니셔는 언제든지 반응 혼합물을 분배할 수 있다. 구체적으로, 반응 혼합물은 제 1 프린트 헤드가 좌표 상에 제 1 액적을 분배하기 전, 제 2 프린트 헤드가 좌표 상에 제 2 액적을 분배하기 전에, 또는 둘 모두에 좌표 상에 분배될 수 있다.
일부 구현예에서, 조립된 핵산 분자는 유전자, 펩티드 또는 RNA 코딩 DNA를 포함한다. 조립된 핵산 분자는 DNA 앱타머 라이브러리를 포함할 수 있다.
참조에 의한 통합
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 명세서에 포함된 개시 내용과 모순되는 정도까지, 본 명세서는 그러한 모순되는 자료를 대체 및/또는 우선하도록 의도되었다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구 범위에서 구체적으로 설명된다. 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 구현을 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면(또한 "도면" 및 "도")을 참조하면 본 발명의 특징 및 장점에 대한 더 나은 이해를 얻을 수 있다.
도 1은 잉크젯 프린팅을 사용하여 빠르고 높은 처리량 방식으로 구성 요소로부터 DNA 식별자를 조립하여 DNA에 디지털 정보를 저장하는 예시적인 시스템을 도시한다. 시스템 및 그 다른 실시 예는 이후 "프린터-피니셔 시스템" 또는 PFS로 지칭된다.
도 2는 프린터 서브 시스템의 예를 더 자세히 도시하며, 프린트 헤드는 설계 웹에서 동일한 좌표에 다른 구성 요소를 중복 인쇄할 수 있다.
도 3A-D는 프린터에 있는 프린트 헤드의 예.
도 4는 프린터 내의 프린트 헤드의 잠재적 배열.
도 5는 프린터 서브 시스템에서 스팟 이미저에 대한 설정예.
도 6은 피니셔 서브 시스템의 예를 보다 상세히 도시하며, 기질의 각 좌표에 반응 혼합물을 분배하는 부분에 추가하여, 피니셔는 또한 통합 전에 기질의 각 좌표에 반응 억제제를 분배하는 부분을 포함할 수 있다.
도 7은 인큐베이션 단계 동안 피니셔를 통해 웹을 통과시키기 위한 롤러 루프의 예.
도 8은 인큐베이션 동안 예상되는 평형 부피에 대한 반응 혼합물 글리세롤 조성물 및 마무리 제습도의 효과를 예시.
도 9는 웹으로부터의 모든 반응을 하나의 컨테이너로 통합하는 예시적인 풀링 시스템.
도 10은 PFS를 통한 데이터 전송 파이프 라인의 실시예의 개략도.
도 11은 섀시 모듈, 프린트 엔진 모듈, 인큐베이터 모듈 및 풀링 모듈의 4개의 모듈을 포함하는 PFS의 실시예.
도 12는 반응 액적을 에멀젼으로 모으는 PFS의 실시예.
도 13은 웨빙 상에 인쇄된 후 반응 액적이 오일(또는 다른 비혼화성 액체) 로 코팅되는 PFS의 실시예.
도 14는 반응 액적이 인쇄된 DNA 구성 요소를 결합하는 비드를 함유하는 PFS의 실시예.
도 15는 비드에 결합된 DNA 구성 요소가 에멀젼을 사용하여 식별자로 처리될 수 있는 방법의 예시.
도 2는 프린터 서브 시스템의 예를 더 자세히 도시하며, 프린트 헤드는 설계 웹에서 동일한 좌표에 다른 구성 요소를 중복 인쇄할 수 있다.
도 3A-D는 프린터에 있는 프린트 헤드의 예.
도 4는 프린터 내의 프린트 헤드의 잠재적 배열.
도 5는 프린터 서브 시스템에서 스팟 이미저에 대한 설정예.
도 6은 피니셔 서브 시스템의 예를 보다 상세히 도시하며, 기질의 각 좌표에 반응 혼합물을 분배하는 부분에 추가하여, 피니셔는 또한 통합 전에 기질의 각 좌표에 반응 억제제를 분배하는 부분을 포함할 수 있다.
도 7은 인큐베이션 단계 동안 피니셔를 통해 웹을 통과시키기 위한 롤러 루프의 예.
도 8은 인큐베이션 동안 예상되는 평형 부피에 대한 반응 혼합물 글리세롤 조성물 및 마무리 제습도의 효과를 예시.
도 9는 웹으로부터의 모든 반응을 하나의 컨테이너로 통합하는 예시적인 풀링 시스템.
도 10은 PFS를 통한 데이터 전송 파이프 라인의 실시예의 개략도.
도 11은 섀시 모듈, 프린트 엔진 모듈, 인큐베이터 모듈 및 풀링 모듈의 4개의 모듈을 포함하는 PFS의 실시예.
도 12는 반응 액적을 에멀젼으로 모으는 PFS의 실시예.
도 13은 웨빙 상에 인쇄된 후 반응 액적이 오일(또는 다른 비혼화성 액체) 로 코팅되는 PFS의 실시예.
도 14는 반응 액적이 인쇄된 DNA 구성 요소를 결합하는 비드를 함유하는 PFS의 실시예.
도 15는 비드에 결합된 DNA 구성 요소가 에멀젼을 사용하여 식별자로 처리될 수 있는 방법의 예시.
본 명세서에서 사용되는 용어 "구성 요소", 일반적으로 핵산 서열을 의미한다. 구성 요소는 별개의 핵산 서열일 수 있다. 구성 요소는 다른 핵산 서열 또는 분자를 생성하기 위해 하나 이상의 다른 구성 요소와 연결되거나 조립될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "층"은 일반적으로 구성 요소 그룹 또는 풀을 지칭한다. 각 계층은 한 계층의 구성 요소가 다른 계층의 구성 요소와 다르도록 별개의 구성 요소 세트를 포함할 수 있다. 하나 이상의 층으로부터의 구성 요소를 조립하여 하나 이상의 식별자를 생성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "식별자"는 일반적으로 핵산 분자 또는 큰 비트 스트링 내의 비트 스트링의 위치와 값을 나타내는 핵산 서열을 의미한다. 보다 일반적으로, 식별자는 심볼 스트링에서 심볼을 나타내거나 이에 대응하는 모든 객체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 식별자는 하나 또는 다수의 연결된 구성 요소를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "식별자 라이브러리"는 일반적으로 정보를 나타내는 심볼 스트링의 문자에 대응하는 식별자들의 집합을 의미한다. 일부 구현예에서, 식별자 라이브러리에 주어진 식별자의 부재는 특정 위치에 있는 심볼 값을 나타낼 수 있다. 하나 이상의 식별자 라이브러리가 풀, 그룹 또는 식별자 집합에 결합될 수 있다. 각 식별자 라이브러리에는 식별자 라이브러리를 식별하는 고유 바코드가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산"은 일반적으로 디옥시리보핵산(DNA), 리보 핵산(RNA) 또는 이의 변이체를 지칭한다. 핵산은 아데노신(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U) 또는 이의 변이체에서 선택된 하나 이상의 서브 유닛을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 A, C, G, T 또는 U 또는 그 변이체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 성장하는 핵산 가닥에 통합될 수 있는 임의의 서브 유닛을 포함할 수 있다. 이러한 서브 유닛은 A, C, G, T 또는 U, 또는 하나 이상의 상보적인 A, C, G, T 또는 U 중 하나에 특이적이거나 퓨린에 상보적인(즉, A 또는 G , 또는 그의 변이체) 또는 피리미딘(즉, C, T 또는 U, 또는 그의 변이체)일 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 일부 경우에 핵산은 원형이다.
본 명세서에 사용된 용어 "핵산 분자" 또는 "핵산 서열"은 일반적으로 디옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA) 중 다양한 길이를 가질 수 있는 폴리머 형태의 뉴클레오티드 또는 폴리 뉴클레오티드 또는 이의 유사체를 지칭한다. 용어 "핵산 서열"은 폴리 뉴클레오티드의 알파벳 표현을 지칭할 수 있으며; 선택적으로, 이 용어는 물리적 폴리 뉴클레오티드 자체에 적용될 수 있다. 이 알파벳 표현은 중앙 처리 장치가있는 컴퓨터의 데이터베이스에 입력될 수 있으며 핵산 서열 또는 핵산 분자를 심볼 또는 비트에 매핑하여 디지털 정보를 인코딩하는 데 사용할 수 있다. 핵산 서열 또는 올리고 뉴클레오티드는 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드(들), 뉴클레오티드 유사체(들) 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "올리고 뉴클레오티드"는 일반적으로 단일 가닥 핵산 서열을 지칭하며, 일반적으로 폴리 뉴클레오티드가 RNA인 경우 4 개의 뉴클레오티드 염기: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G), 티민(T) 또는 우라실(U)의 특정 서열로 구성된다.
변형된 뉴클레오티드의 예는 디아미노퓨린, 5-플루오로우라실, 5-브롬우라 실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드로실메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시 메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실케오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시 카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-D46-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신, 슈도우라실, 큐오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실,(acp3)w, 2,6-디아미노퓨린 및 이와 같은 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 핵산 분자는 또한 베이스 모이어티(예를 들어, 상보 적 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성하는 데 일반적으로 이용 가능한 하나 이상의 원자 및/또는 일반적으로 상보 적 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수없는 하나 이상의 원자에서), 슈가 모이어티 또는 인산염 백본에서 변형될 수 있다. 핵산 분자는 또한 아미노알릴-dUTP(aa-dUTP) 및 아미노헥시락릴아미드-dCTP(aha-dCTP)와 같은 아민 변형 그룹을 함유하여 N-하이드록시숙신이 미드에스테르(NHS)와 같은 아민 반응성 부분의 공유 부착을 허용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "프라이머"는 일반적으로 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 등의 핵산 합성을 위한 시작 포인트로서 작용하는 핵산의 가닥을 지칭한다. 예를 들어, DNA 샘플을 복제하는 동안 복제를 촉매하는 효소는 DNA 샘플에 부착된 프라이머의 3'-단부에서 복제를 시작하고 반대 가닥을 복사한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "중합" 또는 "중합 효소"는 일반적으로 중합 반응을 촉매할 수 있는 임의의 효소를 의미한다. 중합 효소의 예는 제한없이 핵산 중합 효소를 포함한다. 중합 효소는 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있다. 중합 효소의 예는 Φ29 중합 효소 또는 이의 유도체이다. 일부 경우에, 새로운 핵산 서열을 구축하기 위해 중합 효소와 함께 또는 중합 효소의 대안으로 전사 효소 또는 리가아제(즉, 결합 형성을 촉매하는 효소)가 사용된다. 중합 효소의 예로는 DNA 중합 효소, RNA 중합 효소, 열 안정 중합 효소, 야생형 중합 효소, 변형 중합 효소, E.coli DNA 중합 효소 I, T7 DNA 중합 효소, 박테리오파지 T4 DNA 중합 효소 Φ29(phi29) DNA 중합 효소, Taq 중합 효소, 제 Tth 중합 효소, Tli 중합 효소, Pfu중합 효소 Pwo 중합 효소, VENT 중합 효소, DEEPVENT 중합 효소, Ex-Taq 중합 효소, LA-TAW 중합 효소, Sso 중합 효소, PoC 중합 효소, Mth 중합 효소, ES4 중합 효소, Tru 중합 효소, Tac 중합 효소, Tne 중합 효소, Tma 중합 효소, Tca 중합 효소, Tih 중합 효소, Tfi 중합 효소, 백금 Taq 중합 효소, Tbr 중합 효소, Tfl 중합 효소, Pfutubo 중합 효소, Pyrobest 중합 효소, KOD 중합 효소, Bst 중합 효소, Sac 중합 효소, 3'~5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 Klenow 단편 중합 효소 및 이의 변이체, 변형된 산물 및 유도체를 포함한다.
이진 코드의 형태와 같은 컴퓨터 데이터와 같은 디지털 정보는, 심볼들의 서열 또는 스트링을 포함할 수 있다. 이진 코드는 예를 들어, 비트로 지칭되는 2개의 이진 심볼(일반적으로 0 및 1)을 갖는 이진 숫자 시스템을 사용하여 텍스트 또는 컴퓨터 프로세서 명령어를 인코딩하거나 나타낼 수 있다. 디지털 정보는 비이진 심볼의 서열을 포함할 수 있는 비이진 코드의 형태로 표현될 수 있다. 각 인코딩된 심볼은 고유한 비트 스트링(또는 "바이트")에 다시 할당될 수 있으며 고유한 비트 스트링 또는 바이트는 바이트 또는 바이트 스트림의 스트링로 배열될 수 있다. 주어진 비트에 대한 비트 값은 두 심볼(예: 0 또는 1) 중 하나일 수 있다. N 비트의 스트링을 구성할 수 있는 바이트는 총 2N개의 고유한 바이트 값을 가질 수 있다. 예를 들어, 8 비트로 구성된 바이트는 총 28개 또는 256개의 가능한 고유한 바이트 값을 생성할 수 있으며, 256 바이트 각각은 바이트로 인코딩될 수 있는 256개의 가능한 구별 심볼, 문자 또는 명령어 중 하나에 대응할 수 있다. 시 데이터(예: 텍스트 파일 및 컴퓨터 명령어)는 바이트 또는 바이트 스트림의 스트링으표현될 수 있다. Zip 파일 또는 원시 데이터를 포함하는 압축 데이터 파일도 바이트 스트림에 저장할 수 있다. 이러한 파일은 압축된 형식의 바이트 스트림으로 저장한 다음 컴퓨터에서 판독 전에 원시 데이터로 압축을 풀 수 있다.
개요
핵산으로 디지털 정보를 인코딩하기 위한 이전의 방법, 잉크젯 프린터를 사용하여 시스템은 비용과 시간이 많이 소모될 수 있는 핵산의 염기에 의해 계 합성에 의존해왔다. 예를 들어, 잉크젯 프린터 기반 기술은 이전에 마이크로 리액터 칩 에서 올리고 뉴클레오티드 합성에 사용되었다. 그러나 이러한 기술은 각 합성 라운드 동안 단일 올리고 뉴클레오티드를 추가하기 위해 4 단계(디프로텍션, 커플링, 캡핑 및 산화) 고체상 포스포르아미다이트 사이클 반응을 사용해야 하는 염기 별 합성을 활용한다. 여기에 설명된 새로운 방법은 구성 요소의 조합 배열을 사용하여 디지털 정보를 인코딩할 수 있으며, 여기서 각 구성 요소(예: 핵산 서열)는 기질에 분배(예: 인쇄)되고, 반응 혼합물 및/또는 조건은 각 구성 요소가 제공되도록 제공된다. 단일 반응으로 물리적으로 연결되어 있다.
정보는 핵산 서열에 저장될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 하나 이상의 구성 요소로부터 구축된 식별자로 디지털 정보를 인코딩하는 방법이 본원에 제공된다. 각 구성 요소는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 프린터-피니셔 시스템(Printer-Finisher System)(또는 PFS)으로 알려진 인쇄 기반 시스템을 사용하여 식별자 구성을 위한 구성 요소를 배치하고 조립할 수 있다. PFS는 두 개의 서브 시스템, 프린터 및 피니셔를 포함할 수 있다. PFS는 구성 요소와 반응 혼합물을 기질에 분배하는 프린터인 하나의 시스템으로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 서브 시스템은 개별 기능을 위해 서로 연결되고 종속될 수 있다. 다른 구현예에서, 두 서브 시스템은 분리되어 독립적으로 작동할 수 있다.
정보를 인코딩하고 핵산 서열에 기록하는 방법
일 양태에서, 본 발명은 핵산 서열에 정보를 인코딩하기 위한 방법을 제공한다. 정보를 핵산 서열로 인코딩하는 방법은(a) 정보를 심볼 스트링으로 변환하고,(b) 심볼 스트링을 복수의 식별자에 매핑하고,(c) 적어도 서브집합을 포함하는 식별자 라이브러리를 구성하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 식별자 중. 복수의 식별자의 개별 식별자는 하나 이상의 구성 요소를 포함할 수 있다. 하나 이상의 구성 요소의 개별 구성 요소는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 심볼 스트링의 각 위치에 있는 각 심볼은 별개의 식별자에 대응할 수 있다. 개별 식별자는 심볼 스트링의 개별 위치에 있는 개별 심볼에 대응할 수 있다. 더욱이, 심볼 스트링의 각 위치에 있는 하나의 심볼은 식별자의 부재에 대응할 수 있다. 예를 들어,'0'과'1'의 이진 심볼(예: 비트)의 스트링에서'0'이 나올 때마다 식별자가 없음에 해당할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 핵산-기반 컴퓨터 데이터 저장 장치에 대한 방법을 제공한다. 핵산 기반 컴퓨터 데이터 저장 방법은(a) 컴퓨터 데이터 수신하고,(b) 컴퓨터 데이터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 합성하고,(c) 핵산 서열을 갖는 핵산 분자를 저장하는 단계를 포함할 수 있다. 컴퓨터 데이터는 합성된 핵산 분자의 적어도 서브 세트에서 인코딩될 수 있으며 각 핵산 분자의 서열에서는 인코딩되지 않을 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 기록 및 핵산 서열의 정보를 저장하는 방법을 제공한다. 상기 방법은(a) 정보를 나타내는 가상 식별자 라이브러리를 수신하거나 인코딩하고,(b) 식별자 라이브러리를 물리적으로 구성하고,(c) 식별자 라이브러리의 하나 이상의 물리적 사본을 하나 이상의 개별 위치에 저장하는 단계를 포함할 수 있다. 식별자 라이브러리의 개별 식별자는 하나 이상의 구성 요소를 포함할 수 있다. 하나 이상의 구성 요소의 개별 구성 요소는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 핵산-기반 데이터 저장 장치에 대한 방법을 제공한다. 핵산 기반 컴퓨터 데이터 저장 방법은(a) 컴퓨터 데이터 수신 단계,(b) 컴퓨터 데이터를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 합성하는 단계, 및(c) 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 저장하는 단계를 포함할 수 있다.. 핵산 분자의 합성은 염기 별 핵산 합성이 없을 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 기록 및 핵산 서열의 정보를 저장하는 방법을 제공한다. 핵산 서열에 정보를 기록하고 저장하는 방법은(a) 정보를 나타내는 가상 식별자 라이브러리를 수신하거나 인코딩하고,(b) 식별자 라이브러리를 물리적으로 구성하고,(c) 하나 이상의 별도 위치에 식별자 라이브러리의 하나 이상의 물리적 사본을 저장하는 단계를 포함할 수 있다. 식별자 라이브러리의 개별 식별자는 하나 이상의 구성 요소를 포함할 수 있다. 하나 이상의 구성 요소의 개별 구성 요소는 핵산 서열을 구성할 수 있다.
핵산 서열에 저장된 정보를 판독하는 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 핵산 서열에 인코딩된 정보를 판독하기 위한 방법을 제공한다. 핵산 서열에 인코딩된 정보를 판독하는 방법은(a) 식별자 라이브러리 제공하고,(b) 식별자 라이브러리에 존재하는 식별자를 식별하고,(c) 식별자 라이브러리에 존재하는 식별자로부터 심볼 스트링 생성하고, 및(d) 심볼 스트링에서 정보 컴파일하는 단계를 포함한다. 식별자 라이브러리는 조합 공간으로부터의 복수의 식별자의 서브 세트를 포함할 수 있다. 식별자 서브 세트의 각각의 개별 식별자는 심볼 스트링의 개별 심볼에 대응할 수 있다. 식별자는 하나 이상의 구성 요소를 포함할 수 있다.구성 요소는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
정보는 본 명세서에서 다른 곳에 기술된 하나 이상의 식별자 라이브러리에 기록될 수 있다. 식별자는 여기 다른 곳에서 설명된 방법을 사용하여 구성될 수 있다. 저장된 데이터는 여기 다른 곳에서 설명된 방법을 사용하여 복사 및 액세스할 수 있다.
식별자는 인코딩 심벌의 위치, 인코딩 심볼의 값, 또는 위치 모두 인코딩된 심볼의 값에 관한 정보를 포함할 수 있다. 식별자는 인코딩된 심볼의 위치와 관련된 정보를 포함할 수 있으며 식별자 라이브러리에서 식별자의 존재 또는 부재는 심볼의 값을 나타낼 수 있다. 식별자 라이브러리에 식별자의 존재는 이진 스트링의 제 1 심볼 값(예: 제 1 비트 값)을 나타낼 수 있으며 식별자 라이브러리에 식별자의 부재는 이진 스트링의 제 2 심볼 값(예: 제 2 비트 값)을 나타낼 수 있다. 이진 시스템에서 식별자 라이브러리의 식별자 유무에 따라 비트 값을 지정하면 조합된 식별자 수를 줄일 수 있으므로 쓰기 시간을 줄일 수 있다. 일예에서, 식별자의 존재는 매핑된 위치에서 비트 값'1'을 나타낼 수 있고, 식별자의 부재는 매핑된 위치에서 비트 값'0'을 나타낼 수 있다.
정보의 조각에 대한 심볼(예를 들어, 비트 값)을 생성하는 것은 심볼(예를 들어, 비트)로 맵핑 또는 인코딩될 수 있는 식별자의 존재 여부를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 식별자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계는 현재 식별자를 서열화하거나 혼성화 어레이를 사용하여 식별자의 존재를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 예에서, 인코딩된 서열의 디코딩 및 판독은 서열화 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있다. 서열화 플랫폼의 예는 2014년 8월 21일에 출원된 미국 특허 출원 제 14/465,685, 2013년 5월 2일에 출원된 미국특허 출원 제13/886,234 및 2009년 3월 9일에 출원된 미국 특허 출원 제 12/400,593에 개시되며, 이들 각각은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
일 예시에서, 핵산 인코딩 데이터를 디코딩하는 것은 Illumina® Sequencing과 같은 핵산 가닥의 염기별 염기 서열 분석에 의해 또는 모세관 전기 영동에 의한 단편화 분석과 같은 특정 핵산 서열의 존재 또는 부재를 나타내는 염기 서열 분석 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 서열화는 가역적 종결자를 사용할 수 있다. 서열화는 천연 또는 비 천연(예를 들어, 조작된) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 사용을 사용할 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 핵산 서열을 디코딩하는 것은 광학적, 전기 화학적 또는 화학적 신호를 생성하는 임의의 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 분석 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 디지털 PCR, Sanger 서열화, 고 처리량 서열화, 합성별 서열화, 단일 분자 서열화, 결찰별 서열화, RNA-Seq(Illumina), 차세대 서열화, Digital Gene Expression(Helicos), Clonal Single MicroArray(Solexa), shotgun 서열화, Maxim-Gilbert 서열화 또는 대규모 병렬 서열화과 같은 다양한 서열화 접근 방식을 사용할 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
다양한 판독 방법을 사용하여 인코딩된 핵산에서 정보를 가져올 수 있다. 예를 들어, 마이크로 어레이(또는 모든 종류의 형광 혼성화), 디지털 PCR, 정량적 PCR(qPCR) 및 다양한 서열화 플랫폼을 추가로 사용하여 인코딩된 서열을 판독하고 확장하여 디지털 인코딩된 데이터를 판독할 수 있다.
식별자 라이브러리는 정보에 대한 메타 데이터를 제공하거나 정보를 인코딩 또는 마스킹하거나 메타 데이터를 제공하고 정보를 마스킹하는 보충 핵산 서열을 추가로 포함 할 수 있다. 보충 핵산은 식별자의 식별과 동시에 식별될 수 있다. 선택적으로, 보충 핵산은 식별자를 확인하기 전 또는 후에 확인될 수 있다. 상기 예에서, 보조 핵산은 인코딩된 정보를 판독하는 동안 식별되지 않는다. 보충 핵산 서열은 식별자와 구별할 수 없다. 식별자 색인 또는 키를 사용하여 보조 핵산 분자를 식별자와 구별할 수 있다.
데이터를 인코딩 및 디코딩하는 효율은 더 적은 수의 핵산 분자를 사용할 수 있도록 입력 비트 스트링을 다시 코딩함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 인코딩 방법을 사용하여 3개의 핵산 분자(예: 식별자)에 매핑될 수 있는'111' 서브스트링이 많이 발생하는 입력 스트링이 수신되면 매핑할 수 있는'000' 서브스트링로 다시 코딩될 수 있다. 핵산 분자의 널 세트에.'000'의 대체 입력 서브스트링도'111'로 다시 코딩될 수 있다. 상기 레코딩 방법은 데이터 세트의' l'수가 감소할 수 있기 때문에 데이터를 인코딩하는 데 사용되는 핵산 분자의 총량을 줄일 수 있다. 상기 예에서는 새 매핑 명령어를 지정하는 코드북을 수용하기 위해 데이터 세트의 총 크기를 늘릴 수 있다. 인코딩 및 디코딩 효율성을 높이는 다른 방법은 입력 스트링을 다시 코딩하여 가변 길이를 줄이는 것이다. 예를 들어'111'은'00'으로 다시 코딩되어 데이터 세트의 크기를 줄이고 데이터 세트의'1' 수를 줄일 수 있다.
핵산 인코딩된 데이터를 디코딩하는 속도 및 효율성은 검출의 용이성을 위해 식별자를 구체적으로 설계함으로써 제어(예를 들어, 증가)될 수 있다. 예를 들어, 검출의 용이성을 위해 설계된 핵산 서열(예를 들어, 식별자)은 광학적, 전기 화학적, 화학적 또는 물리적 특성에 기초하여 호출하고 검출하기 더 쉬운 대부분의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 조작된 핵산 서열은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 조작된 핵산 서열은 핵산 서열의 검출 가능한 특성을 개선하는 합성 또는 비 천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 조작된 핵산 서열은 모든 천연 뉴클레오티드, 모든 합성 또는 비 천연 뉴클레오티드, 또는 천연, 합성 및 비 천연 뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있다. 합성 뉴클레오티드는 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 글리콜 핵산 및 트레오스 핵산과 같은 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 비 천연 뉴클레오티드는 3-메톡시-2-나프 탈기를 함유하는 인공 뉴클레오 사이드 인 dNaM 및 6-메틸이소 퀴놀린-1-티온-2-일기를 함유하는 인공 뉴클레오 사이드 인 d5SICS를 포함할 수 있다. 조작된 핵산 서열은 강화된 광학 특성과 같은 단일 강화된 특성을 위해 설계될 수 있거나, 설계된 핵산 서열은 강화된 광학 및 전기 화학적 특성 또는 강화된 광학 및 화학적 특성과 같은 다중 강화된 특성으로 설계될 수 있다.
조작된 핵산 서열은 핵산 서열의 광학적, 전기 화학적, 화학적 또는 물리적 특성을 개선하지 않는 반응성 천연, 합성 및 비 천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.핵산 서열의 반응성 구성 요소는 핵산 서열에 개선된 특성을 부여하는 화학적 모이어티의 추가를 가능하게할 수 있다. 각각의 핵산 서열은 단일 화학 모이어티를 포함하거나 여러 화학 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적인 화학적 모이어티는 형광 모이어티, 화학 발광 모이어티, 산성 또는 염기성 모이어티, 소수성 또는 친수성 모이어티, 및 핵산 서열의 산화 상태 또는 반응성을 변경하는 모이어티를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
서열화 플랫폼은 핵산 서열로 인코딩된 정보를 디코딩하고 판독하기 위해 특별히 설계될 수 있다. 서열화 플랫폼은 단일 또는 이중 가닥 핵산 분자의 서열화 전용일 수 있다. 서열화 플랫폼은 개별 염기를 판독(예: 염기 별 염기 서열 분석)하거나 핵산 분자 내에 포함된 전체 핵산 서열(예 : 구성 요소)의 존재 또는 부재(예: 식별자)를 검출함으로써 핵산 인코딩 데이터를 디코딩 할 수 있다. 서열화 플랫폼은 무차별 시약의 사용, 증가된 판독 길이 및 검출 가능한 화학적 모이어티의 추가에 의한 특정 핵산 서열의 검출을 포함할 수 있다. 서열화 중에 더 난잡한 시약을 사용하면 염기 서열을 더 빠르게 호출할 수 있으므로 판독 효율성이 높아져 서열화 시간이 단축될 수 있다. 증가된 판독 길이의 사용은 더 긴 인코딩된 핵산 서열이 판독 당 디코딩되도록할 수 있다. 검출 가능한 화학적 모이어티 태그의 추가는 화학적 모이어티의 존재 또는 부재에 의해 핵산 서열의 존재 또는 부재의 검출을 가능하게할 수 있다. 예를 들어, 약간의 정보를 인코딩하는 각 핵산 서열은 고유한 광학적, 전기 화학적 또는 화학적 신호를 생성하는 화학적 모이어티로 태그될 수 있다. 고유한 광학, 전기 화학 또는 화학적 신호의 존재 여부는'0'또는'1'비트 값을 나타낼 수 있다. 핵산 서열은 단일 화학적 모이어티 또는 다중 화학적 모이어티를 포함할 수 있다.화학적 모이어티는 데이터를 인코딩하기 위해 핵산 서열을 사용하기 전에 핵산 서열에 추가될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 화학적 모이어티는 데이터를 인코딩한 후 데이터를 디코딩하기 전에 핵산 서열에 추가될 수 있다. 화학적 모이어티 태그는 핵산 서열에 직접 추가될 수 있거나 핵산 서열은 합성 또는 비 천연 뉴클레오티드 앵커를 포함할 수 있고 화학적 모이어티 태그는 그 앵커에 추가될 수 있다.
최다이제스트 또는 인코딩 및 디코딩 에러를 검출하기 위해 고유 코드가 적용될 수 있다. 인코딩 및 디코딩 오류는 위음성(예: 무작위 샘플링에 포함되지 않은 핵산 분자 또는 식별자)에서 발생할 수 있다. 오류 감지 코드의 예는 식별자 라이브러리에 포함된 연속 가능한 식별자 집합에서 식별자 수를 계산하는 체크섬 서열일 수 있다. 식별자 라이브러리를 판독하는 동안 체크섬은 해당 연속 식별자 집합에서 검색 할 것으로 예상되는 식별자 수를 나타낼 수 있으며, 예상 개수가 충족될 때까지 판독을 위해 식별자를 계속 샘플링할 수 있다. 일부 구현예에서, 체크섬 서열은 모든 연속적인 R 식별자 세트에 포함될 수 있으며, 여기서 R은 크기가 동일하거나 1, 2, 5, 10, 50, 100, 200, 500 또는 1000보다 크거나 1000보다 작을 수 있으며, 500, 200, 100, 50, 10, 5 또는 2.R 값이 작을수록 오류 감지가 더 좋다. 일부 구현예에서, 체크섬은 보충 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어, 7개의 핵산 서열(예를 들어, 구성 요소)을 포함하는 세트는 제품 체계(층 X의 구성 요소 X1-X3 및 층 Y의 Y1-Y3)로 식별자를 구성하기 위한 핵산 서열, 보충 체크섬에 대한 핵산 서열(X4-X7 및 Y4-Y7)과 같은 두 그룹으로 나눌 수 있다. 체크섬 서열 X4-X7은 레이어 X의 0, 1, 2 또는 3개의 서열이 레이어 Y의 각 멤버와 조립되는지 여부를 나타낼 수 있다.또는 체크섬 서열 Y4-Y7은 0, 1, 2 또는 3개의 서열을 나타낼 수 있다. 상기 예에서는 식별자 {X1Y1, X1Y3, X2Y1, X2Y2, X2Y3}가 있는 원래 식별자 라이브러리를 보완하여 {X1Y1, X1Y3, X2Y1, X2Y2, X2Y3, X1Y6, X2Y7, X3Y4, X6Y1, X5Y2, X6Y3}과 같은 풀이되는 체크섬을 포함할 수 있다. 체크섬 서열은 오류 수정 에도 사용할 수 있다. 예를 들어, 위 데이터 세트에서 X1Y1이 없고 X1Y6 및 X6Y1이 존재하면 X1Y1 핵산 분자가 데이터 세트에서 누락되었음을 추론할 수 있다. 체크섬 서열은 식별자 라이브러리의 샘플링 또는 식별자 라이브러리의 액세스된 부분에서 식별자가 누락되었는지 여부를 나타낼 수 있다. 체크섬 서열이 누락된 경우 PCR 또는 친화성 태그가 지정된 프로브 혼성화와 같은 액세스 방법이이를 증폭 및/또는 분리할 수 있다. 일부 구현예에서, 체크섬은 보충 핵산 서열이 아닐 수 있다. 체크섬은 식별자로 표시되도록 정보에 직접 코딩될 수 있다.
데이터 인코딩 및 디코딩의 노이즈는 예를 들어 제품 체계에서 단일 구성 요소가 아닌 구성 요소의 회귀 쌍(palindromic pairs)을 사용하여 회귀성으로 식별자를 구성함으로써 감소될 수 있다. 그 다음, 상이한 층으로부터의 구성 요소 쌍은 회귀 방식으로 서로 조립될 수 있다(예를 들어, 구성 요소 X 및 Y에 대해 XY 대신 YXY). 상기 회귀성 방법은 더 많은 수의 층(예를 들어, XYZ 대신 ZYXYZ)으로 확장될 수 있으며 식별자 간의 잘못된 교차 반응을 감지할 수 있다.
식별자에 과잉(예를 들어, 매우 과잉) 보충 핵산 서열을 추가하면 서열이 인코딩된 식별자를 복구하는 것을 방지할 수 있다. 정보를 해독하기 전에 식별자는 보충 핵산 서열에서 농축될 수 있다. 예를 들어, 식별자는 식별자 단부에 특이적인 프라이머를 사용하는 핵산 증폭 반응에 의해 농축될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 특정 프라이머를 사용하여 서열화(예를 들어, 합성에 의한 서열화)함으로써 샘플 풀을 농축되도록 하지 않고 정보를 디코딩할 수 있다. 두 디코딩 방법 모두에서 디코딩 키가 없거나 식별자의 구성에 대해 알지 못하는 상태에서 정보를 농축되게 하거나 디코딩하는 것이 어려울 수 있다. 친화성 태그 기반 프로브를 사용하는 것과 같은 선택적인 액세스 방법이 사용될 수도 있다.
이진 서열 데이터를 인코딩하는 시스템
디지털 정보를 핵산(예: DNA)으로 인코딩하는 시스템은 파일 및 데이터(예: 원시 데이터, 압축된 zip 파일, 정수 데이터 및 기타 형태의 데이터)를 바이트로 변환하고 이를 인코딩하기 위한 시스템, 방법 및 장치를 포함 할 수 있다. 바이트를 핵산의 세그먼트 또는 서열, 일반적으로 DNA 또는 이들의 조합으로 변환한다.
일 양태에서, 본 발명은 핵산 서열을 이용하여 이진 정보를 인코딩하기 위한 시스템을 제공한다. 핵산을 사용하여 이진 서열 데이터를 인코딩하기 위한 시스템은 장치 및 하나 이상의 컴퓨터 프로세서를 포함할 수 있다. 장치는 식별자 라이브러리를 구성하도록 구성될 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는(i) 정보를 심볼의 스팅으로 변환하고,(ii) 심볼의 스트링을 복수의 식별자에 매핑하고,(iii) 복수의 식별자의 서브 세트중 적어도 하나를 포함하는 식별자 라이브러리를 구성하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍될 수 있다. 복수의 식별자의 개별 식별자는 심볼 스트링의 개별 심볼에 대응할 수 있다. 복수의 식별자의 개별 식별자는 하나 이상의 구성 요소를 포함할 수 있다. 하나 이상의 구성 요소의 개별 구성 요소는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 핵산을 사용하여 이진 서열 데이터를 판독하기 위한 시스템을 제공한다. 핵산을 사용하여 이진 서열 데이터를 판독하기 위한 시스템은 데이터베이스 및 하나 이상의 컴퓨터 프로세서를 포함할 수 있다. 데이터베이스는 정보를 인코딩하는 식별자 라이브러리를 저장할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는(i) 식별자 라이브러리에서 식별자를 식별하고,(ii)(i)에서 식별된 식별자로부터 복수의 심볼을 생성하고,(iii) 복수 심볼로부터 정보를 컴파일하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍될 수 있다. 식별자 라이브러리는 복수의 식별자의 서브 세트를 포함할 수 있다. 복수의 식별자의 각각의 개별 식별자는 심볼 스트링의 개별 심볼에 대응할 수 있다. 식별자는 하나 이상의 구성 요소를 포함할 수 있다. 구성 요소는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
디지털 데이터를 인코딩하는 시스템을 사용하는 방법의 비제한적인 구현은 바이트 스트림의 형태로 디지털 정보를 수신하는 단계를 포함할 수 있다. 바이트 스트림을 개별 바이트로 구문 분석하고, 핵산 인덱스(또는 식별자 랭크)를 사용하여 바이트 내의 비트 위치를 매핑하고, 1의 비트 값 또는 0의 비트 값에 해당하는 서열을 식별자로 인코딩한다. 디지털 데이터를 검색하기 위한 단계는 하나 이상의 비트에 매핑되는 핵산(예: 식별자)의 서열을 포함하는 핵산 샘플 또는 핵산 풀을 서열화하고, 식별자가 핵산 풀에 존재하는지 확인하기 위해 식별자 순위를 참조하고, 및 각 시퀀스에 대한 위치 및 비트-값 정보를 디지털 정보의 시퀀스를 포함하는 바이트로 디코딩하는 단계를 포함할 수 있다.
핵산 분자로 인코딩되고 기록된 정보를 인코딩, 기록, 복사, 액세스, 읽기 및 디코딩하기 위한 시스템은 단일 통합 유닛일 수 있거나 전술한 작업 중 하나 이상을 실행하도록 구성된 다중 유닛일 수 있다. 정보를 인코딩하고 핵산 분자(예를 들어, 식별자)에 기록하는 시스템은 장치와 하나 이상의 컴퓨터 프로세서를 포함할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 정보를 심볼 스트링(예를 들어, 비트 스트링)으로 파싱하도록 프로그래밍될 수 있다. 컴퓨터 프로세서는 식별자 랭크를 생성할 수 있다. 컴퓨터 프로세서는 심볼을 둘 이상의 범주로 분류할 수 있다. 하나의 카테고리는 식별자 라이브러리에서 대응하는 식별자의 존재에 의해 표현되는 심볼을 포함할 수 있고, 다른 카테고리는 식별자 라이브러리에서 대응하는 식별자의 부재에 의해 표현될 심볼을 포함할 수 있다. 컴퓨터 프로세서는 식별자 라이브러리 내의 식별자의 존재에 대해 표현될 심볼에 대응하는 식별자를 조립하도록 장치에 지시할 수 있다.
상기 장치는 복수의 영역, 구역, 또는 파티션들을 포함할 수 있다. 식별자를 조립하기 위한 시약 및 구성 요소는 장치의 하나 이상의 영역, 섹션 또는 파티션에 저장될 수 있다. 층들은 장치 섹션의 별도 영역에 저장될 수 있다. 층은 하나 이상의 고유한 구성 요소를 포함할 수 있다. 한 레이어의 구성 요소는 다른 레이어의 구성 요소와 다른 고유한 구성요소일 수 있다. 영역 또는 섹션은 용기를 포함할 수 있고 구획은 웰을 포함할 수 있다. 각 층은 별도의 용기 또는 파티션에 저장될 수 있다. 각 시약 또는 핵산 서열은 별도의 용기 또는 파티션에 저장될 수 있다. 선택적으로 또는 추가로, 시약을 조합 하여 식별자 구성을 위한 마스터 믹스를 형성할 수 있다. 기기는 상기 기기의 한 섹션에서 시약, 구성 요소 및 템플릿을 전송하여 다른 섹션에서 결합할 수 있다. 장치는 조립 반응을 완료하기 위한 조건을 제공할 수 있다. 예를 들어, 장치는 가열, 교반 및 반응 진행 감지를 제공할 수 있다. 구성된 식별자는 바코드, 공통 서열, 가변 서열 또는 태그를 식별자의 하나 이상의 단부에 추가하기 위해 하나 이상의 후속 반응을 거치도록 지시될 수 있다. 식별자는 식별자 라이브러리를 생성하기 위해 영역 또는 파티션으로 보내질 수 있다. 하나 이상의 식별자 라이브러리가 장치의 각 영역, 섹션 또는 개별 파티션에 저장될 수 있다.장치는 압력, 진공 또는 흡입을 사용하여 유체(예: 시약, 구성 요소, 템플릿)를 전달할 수 있다.
식별자 라이브러리는 장치에 저장될 수 있거나 이동될 수 별도의 데이터베이스.데이터베이스는 하나 이상의 식별자 라이브러리를 포함할 수 있다. 데이터베이스는 식별자 라이브러리의 장기 저장을 위한 조건(예: 식별자 저하를 줄이기 위한 조건)을 제공할 수 있다. 식별자 라이브러리는 분말, 액체 또는 고체 형태로 저장될 수 있다. 보다 안정적인 저장을 위해 식별자의 수용액을 동결 건조할 수 있다. 선택적으로 산소가 없는 상태(예: 혐기성 저장 조건)에서 식별자를 저장할 수 있다. 데이터베이스는 자외선 차단, 온도 감소(예: 냉장 또는 냉동), 분해 화학 물질 및 효소로부터 보호를 제공할 수 있다. 데이터베이스로 전송되기 전에 식별자 라이브러리를 동결 건조하거나 동결할 수 있다. 식별자 라이브러리는 뉴클레아제를 비활성화하기 위한 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및/또는 핵산 분자의 안정성을 유지하기 위한 완충액을 포함할 수 있다.
데이터베이스는 정보를 식별자에 기록하거나, 정보를 복사하거나, 정보에 액세스하거나, 정보를 읽는 장치에 연결되거나 포함되거나 분리될 수 있다. 식별자 라이브러리의 일부는 복사, 액세스 또는 판독 전에 데이터베이스에서 제거될 수 있다. 데이터베이스에서 정보를 복사하는 장치는 정보를 쓰는 장치와 같거나 다를 수 있다. 정보를 복사하는 장치는 장치에서 식별자 라이브러리의 부분 표본을 추출하고 해당 부분 표본을 시약 및 구성 요소과 결합하여 식별자 라이브러리의 일부 또는 전체를 증폭할 수 있다. 장치는 증폭 반응의 온도, 압력 및 교반을 제어할 수 있다. 장치는 파티션을 포함할 수 있으며 식별자 라이브러리를 포함하는 파티션에서 하나 이상의 증폭 반응이 발생할 수 있다. 장치는 한 번에 둘 이상의 식별자 풀을 복사할 수 있다.
복사된 식별자는 복사 장치에서 액세스 장치로 전송될 수 있다. 액세스 장치는 복사 장치와 동일한 장치일 수 있다. 액세스 장치는 별도의 영역, 섹션 또는 파티션을 포함 할 수 있다. 액세스 장치는 친화성 태그에 결합된 식별자를 분리하기 위한 하나 이상의 컬럼, 비드 저장소 또는 자기 영역을 가질 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 액세스 디바이스는 하나 이상의 크기 선택 유닛을 가질 수 있다. 크기 선택 유닛은 아가로스 겔 전기 영동 또는 핵산 분자 크기 선택을 위한 다른 방법을 포함할 수 있다. 복사 및 추출은 장치의 동일한 영역 또는 장치의 다른 영역에서 수행될 수 있다.
액세스된 데이터는 동일한 장치에서 읽혀 지거나 액세스된 데이터가 다른 장치로 전송될 수 있다. 판독 장치는 식별자를 검출하고 식별하는 검출 유닛을 포함할 수 있다. 검출 유닛은 시퀀서, 혼성화 어레이 또는 식별자의 존재 또는 부재를 식별하기 위한 다른 유닛의 일부일 수 있다. 서열화 플랫폼은 핵산 서열로 인코딩된 정보를 디코딩하고 판독하기 위해 특별히 설계될 수 있다. 서열화 플랫폼은 단일 또는 이중 가닥 핵산 분자의 서열화 전용일 수 있다. 서열화 플랫폼은 개별 염기(예: 염기 별 서열화)를 읽음으로써 또는 핵산 분자(예를 들어, 식별자) 내에 통합된 전체 핵산 서열(예를 들어, 구성 요소)의 존재 또는 부재를 검출함으로써 핵산 인코딩 데이터를 디코딩 할 수 있다. 선택적으로, 서열화 플랫폼은 Illumina® 서열화 또는 모세관 전기 영동에 의한 단편화 분석과 같은 시스템일 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 핵산 서열을 디코딩하는 것은 광학적, 전기 화학적 또는 화학적 신호를 생성하는 임의의 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 장치에 의해 구현된 다양한 분석 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
핵산 분자의 정보 저장은 장기 정보 저장, 민감한 정보 저장 및 의료 정보 저장을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 응용 분야를 가질 수 있다. 예를 들어, 개인의 의료 정보(예: 병력 및 기록)는 핵산 분자에 저장되어 환자에게 전달될 수 있다. 정보는 신체 외부(예: 웨어러블 디바이스) 또는 신체 내부(예: 피하 캡슐)에 저장될 수 있다.환자가 진료실이나 병원에 들어 오면 기기나 캡슐에서 샘플을 채취할 수 있으며 핵산 시퀀서를 사용하여 정보를 해독할 수 있다. 핵산 분자에 있는 의료 기록의 개인 저장은 컴퓨터 및 클라우드 기반 저장 시스템에 대한 대안을 제공할 수 있다. 핵산 분자에 의료 기록을 개인적으로 저장하면 해킹되는 의료 기록의 사례 또는 유병률을 줄일 수 있다. 의료 기록의 캡슐 기반 저장에 사용되는 핵산 분자는 인간 게놈 서열에서 파생될 수 있다. 인간 게놈 서열의 사용은 캡슐 실패 및 누출시 핵산 서열의 면역 원성을 감소시킬 수 있다.
구성요소를 조립하는 화학적 방법
본 명세서에 제공된 반응 및 방법은 하나 이상의 구성 요소로부터 식별자를 조립하기 위해 본원에 설명된 시스템에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 여기에 제공된 다른 화학적 방법에 대한 다른 반응 혼합물은 다른 구성 요소를 조립하기 위해 시스템의 피니셔에 사용될 수 있다.
A.중첩 연장 PCR(OEPCR) 조립
OEPCR에서, 구성 요소는 중합 효소 및 dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP 또는 이의 변이체 또는 유사체를 포함하는 데옥시뉴클레오티드 트리 포스페이트)를 포함하는 반응에서 조립될 수 있다. 구성 요소는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산일 수 있다. 서로 인접하여 조립될 구성 요소는 상보적인 3'단부, 상보적인 5'단부, 또는한 구성 요소의 5'단부과 인접한 구성 요소의 3'단부 사이의 상동성을 가질 수 있다. "혼성화 영역"이라고 하는 이러한 단부 영역은 OEPCR 동안 구성 요소 간의 혼성 접합 형성을 용이하게 하도록 의도되며, 여기서 하나의 입력 구성 요소(또는 그 보체)의 3'단부는 의도된 인접한 인접 구성 요소(또는 그 보완물)의 3'단부에 혼성화된다. 조립된 이중 가닥 제품은 중합 효소 연장에 의해 형성된다. 이 제품은 후속 혼성화 및 확장을 통해 더 많은 구성 요소로 조립될 수 있다.
일부 구현에서 용융 온도, 어닐링 온도 및 신장 온도는 OEPCR 세 사이의 온도 사이클을 포함할 수 있다. 용융 온도는 이중 가닥 핵산을 단일 가닥 핵산으로 전환하고 구성 요소 내에서 또는 구성 요소 사이의 2 차 구조 또는 혼성화의 형성을 제거하기 위한 것이다. 일반적으로 용융 온도는 높은데, 예를 들어 섭씨 95도 이상이다. 일부 구현 에서 용융 온도는 적어도 섭씨 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 또는 적어도 105 도일 수 있다. 다른 구현에서, 용융 온도는 최대 95, 94, 93, 92, 91 또는 최대 섭씨 90도일 수 있다. 용융 온도가 높을수록 핵산과 이차 구조의 해리가 개선되지만 핵산이나 중합 효소의 분해와 같은 부작용이 발생할 수도 있다. 용융 온도는 30 초, 1 분, 2 분 또는 3 분과 같은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 적어도 5 초 동안 반응에 적용될 수 있다.
어닐링 온도는 의도된 인접 구성요소(또는 이들의 보완물)의 상보적인 3'단부 사이의 혼성화 형성을 촉진하기 위한 것이다. 일부 구현에서, 어닐링 온도는 의도된 혼성화 핵산 형성의 계산된 용융 온도와 일치 할 수 있다. 다른 구현에서, 어닐링 온도는 상기 용융 온도의 10℃ 이상일 수 있다. 일부 구현에서, 어닐링 온도는 적어도 섭씨 25, 30, 50, 55, 60, 65, 또는 적어도 70 도일 수 있다. 용융 온도는 구성 요소 사이의 의도된 혼성화 영역의 순서에 따라 달라질 수 있다. 더 긴 혼성화 영역은 더 높은 용융 온도를 가지며, 구아닌 또는 사이토 신 뉴클레오티드 함량이 더 높은 혼성화 영역은 더 높은 용융 온도를 가질 수 있다. 따라서 특정 어닐링 온도에서 최적으로 조립되도록 의도된 OEPCR 반응을 위한 구성 요소를 설계할 수 있다. 어닐링 온도는 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25 초 또는 적어도 30 초 이상 동안 반응에 적용될 수 있다.
신장 온도는 하나 이상의 중합 효소 효소에 의해 촉매되는 혼성화된 3'단부의 핵산 사슬 연장을 개시하고 촉진하기 위한 것이다. 일부 구현에서, 신장 온도는 중합 효소가 핵산 결합 강도, 신장 속도, 신장 안정성 또는 충실도 측면에서 최적으로 기능하는 온도로 설정될 수 있다. 일부 구현 에서, 신장 온도는 적어도 섭씨 30, 40, 50, 60, 또는 적어도 70도 이상일 수 있다. 어닐링 온도는 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 적어도 60 초 이상 동안 반응에 적용될 수 있다.권장 신장 시간은 예상 신장의 킬로베이스 당 약 15 ~ 45 초이다.
OEPCR의 일부 구현에서 어닐링 온도 및 신장 온도가 동일할 수 있다. 따라서 3 단계 온도 사이클 대신 2 단계 온도 사이클을 사용할 수 있다. 결합된 어닐링 및 확장 온도의 예는 섭씨 60, 65 또는 72도를 포함한다.
일부 구현에서, OEPCR은 하나의 온도 사이클로 수행될 수 있다. 그러한 구현은 단지 두개의 구성 요소의 의도된 조립을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, OEPCR은 다중 온도 사이클로 수행될 수 있다. OEPCR에서 주어진 핵산은 한사이클에서 최대 하나의 다른 핵산으로 만 조립될 수 있다. 이는 조립(또는 확장 또는 신장)이 핵산의 3'단부에서만 발생할 수 있고 각 핵산에는 3'단부가 하나만 있기 때문이다.따라서 여러 구성 요소를 조립하려면 여러 온도사이클이 필요할 수 있다. 예를 들어, 4개의 구성품을 조립하는 데 3회의 온도 사이클이 포함될 수 있다. 6개의 구성 요소를 조립하는 데 5개의 온도 사이클이 포함될 수 있다. 10개의 부품을 조립하는 데 9개의 온도 사이클 이 포함될 수 있다. 일부 구현 에서 필요한 최소 온도보다 더 많은 온도 사이클을 사용하면 조립 효율이 증가할 수 있다. 예를 들어 4개의 온도 사이클을 사용하여 두개의 구성품을 조립 하면 하나의 온도 사이클만 사용하는 것보다 더 많은 제품을 생산할 수 있다. 이는 구성 요소의 혼성화 및 신장이 각사이클의 전체 구성 요소 수의 일부에서 발생하는 통계 이벤트이기 때문이다. 따라서 조립된 구성품의 총 비율은 사이클이 증가함에 따라 증가할 수 있다.
온도 사이클링의 고려에 더하여 OEPCR의 핵산 서열의 디자인은 서로 그들의 조립의 효율에 영향을 미칠 수 있다. 긴 혼성화 영역을 가진 핵산은 짧은 혼성화 영역을 가진 핵산에 비해 주어진 어닐링 온도에서 더 효율적으로 혼성화할 수 있다. 이는 더 긴 혼성화 제품이 더 많은 수의 안정된 염기쌍을 포함하고 따라서 더 짧은 혼성화 제품보다 전체적으로 더 안정적인 혼성화 제품일 수 있기 때문이다. 혼성화 영역은 적어도 1, 2, 34, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 적어도 10 개 이상의 염기의 길이를 가질 수 있다.
높은 구아닌 또는 시토신 함량을 가진 혼성화 영역은 낮은 구아닌 또는 시토신 함량을 가진 혼성화 영역보다 소정 온도에서 더 효율적으로 혼성화할 수 있다. 이것은 구아닌이 티민과 아데닌보다 사이토 신과 더 안정적인 염기쌍을 형성하기 때문이다. 혼성화 영역은 0% 내지 100%의 구아닌 또는 시토신 함량(GC 함량이라고도 함)을 가질 수 있다. 예를 들어, 혼성화 영역은 0%에서 5%, 5%에서 10%, 10%에서 15%, 15%에서 20%, 20%에서 25%, 25% 에서 30%, 30%에서 35%, 35%에서 40%, 40%에서 45%, 45%에서 50%, 50%에서 55%, 55%에서 60%, 60%에서 65%, 65%에서 70%, 70%에서 75%, 75%에서 80%, 80%에서 85%, 85%에서 90%, 90%에서 95%, 또는 95%에서 100%의 구아닌 또는 시토신 함량을 가질 수 있다.
혼성화 영역 길이 및 GC 함량 이외에도 OEPCR의 효율에 영향을 미칠 수 있는 핵산 서열을 설계의 많은 측면들이 있다. 예를 들어, 구성 요소 내에서 원하지 않는 2 차 구조의 형성은 의도된 인접한 구성 요소와 혼성화 생성물을 형성하는 능력을 방해할 수 있다. 이러한 2 차 구조에는 헤어핀 루프가 포함될 수 있다.핵산에 대한 가능한 2 차 구조의 유형 및 안정성(예: 충족 온도)은 서열을 기반으로 예측할 수 있다. 디자인 공간 검색 알고리즘을 사용 하여 효율적인 OEPCR을 위한 적절한 길이 및 GC 함량 기준을 충족하는 핵산 서열을 결정하는 동시에 잠재적으로 억제할 수 있는 2 차 구조를 갖는 서열을 피할 수 있다. 설계 공간 검색 알고리즘에는 유전 알고리즘, 휴리스틱 검색 알고리즘, tabu 검색과 같은 메타 휴리스틱 검색 전략, 분기 및 바인딩 검색 알고리즘, 동적 프로그래밍 기반 알고리즘, 제한된 조합 최적화 알고리즘, 경사 하강법 기반 알고리즘, 무작위 검색 알고리즘 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
마찬가지로, 동종이량체(동일한 서열의 핵산 분자와 혼성화하는 핵산 분자) 및 원치 않는 이종이량체(그들의 의도된 조립 파트너를 제외한 다른 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 서열)의 형성은 OEPCR을 방해 할 수 있다. 핵산 내의 2 차 구조와 유사하게, 동종이량체 및 이종이량체의 형성은 계산 방법 및 설계 공간 검색 알고리즘을 사용하여 핵산 설계 중에 예측되고 설명될 수 있다.
더 긴 핵산 서열 또는 더 높은 GC 함량은 OEPCR을 사용하여 원치 않는 2차 구조, 동종이량체 및 이종이량체의 증가된 형성을 생성할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 더 짧은 핵산 서열 또는 더 낮은 GC 함량의 사용은 더 높은 조립 효율로 이어질 수 있다. 이러한 설계 원칙은 보다 효율적인 조립을 위해 긴 혼성화 영역 또는 높은 GC 함량을 사용하는 설계 전략을 방해할 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, OEPCR은 GC 함량이 높은 긴 혼성화 영역을 사용하지만 GC 함량이 낮은 짧은 비-혼성화 영역을 사용하여 최적화될 수 있다. 핵산의 전체 길이는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 적어도 100 개 염기 이상일 수 있다. 일부 구현에서는 조립 효율이 최적화된 핵산의 혼성화 영역에 대한 최적의 길이와 최적의 GC 함량이 있을 수 있다.
OEPCR 반응에서 더 많은 수의 구별 핵산은 예상 조립 효율을 방해할 수 있다. 이는 더 많은 수의 별개의 핵산 서열이 특히 이종 이량체 형태로 바람직하지 않은 분자 상호 작용에 대한 더 높은 확률을 생성할 수 있기 때문이다.따라서 많은 수의 구성 요소를 조립하는 OEPCR의 일부 구현에서, 핵산 서열 제약은 효율적인 조립을 위해 더욱 엄격해질 수 있다.
예상되는 최종 조립된 제품을 증폭하기 위한 프라이머는 OEPCR 반응에 포함될 수 있다. OEPCR 반응은 구성 구성 요소 사이에 더 많은 조립을 생성 할뿐만 아니라 기존 PCR 방식으로 전체 조립된 제품을 지수 적으로 증폭함으로써 조립된 제품의 수율을 개선하기 위해 더 많은 온도 사이클로 수행될 수 있다.
첨가제는 조립 효율을 향상시킬 OEPCR 반응에 포함될 수 있다. 예를 들어, 베타인, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 비이온성 세제, 포름아미드, 마그네슘, 소혈청 알부민(BSA) 또는 이들의 조합이 첨가될 수 있다. 첨가제 함량(부피당 중량)은 적어도 0%, 1%, 5%, 10% 또는 적어도 20% 이상일 수 있다.
각종 폴리머가 OEPCR에 사용될 수 있다. 중합 효소는 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있다. 중합 효소의 예는 Φ29 중합 효소 또는 이의 유도체이다. 일부 경우에, 전사 효소 또는 리가아제(즉, 결합 형성을 촉매하는 효소)가 중합 효소와 함께 사용되거나 중합 효소의 대안으로 사용되어 새로운 핵산 서열을 구성한다. 중합 효소의 예로는 DNA 중합 효소, RNA 중합 효소, 열 안정 중합 효소, 와일드형 중합 효소, 변형 중합 효소, E.coli DNA 중합 효소 I, T7 DNA 중합 효소, 박테리오파지 T4 DNA 중합 효소 Φ29(phi29) DNA 중합 효소, Taq 중합 효소, Tth 폴리머, TLI 중합 효소, Pfu 중합 효소, PWO 중합 효소, VENT 중합 효소, DEEPVENT 중합 효소, Ex-Taq 중합 효소, LA-TAW 중합 효소, SSO 중합 효소 PoC 중합 효소, Pab 중합 효소, Mth 중합 효소 ES4 중합 효소, Tru 중합 효소, Tac 중합 효소, Tne 중합 효소, Tma 중합 효소, Tca 중합 효소, Tih 중합 효소, Tfi 중합 효소, 백금 Taq 중합 효소, Tbr 중합 효소, Phusion 중합 효소, KAPA 중합 효소, Q5 중합 효소, Tfl 중합 효소, Pfutubo 중합 효소, Pyrobest 중합 효소, KOD 중합 효소, Bst 중합 효소, Sac 중합 효소, 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가진 클레나우 단편 중합 효소 및 그의 변이체, 변형된 산물 및 유도체가 포함된다. 다른 중합 효소는 안정적이고 다른 온도에서 최적으로 기능할 수 있다. 더욱이, 다른 중합 효소는 다른 특성을 가지고 있다. 예를 들어, Phusion 중합 효소 와 같은 일부 중합 효소는 3'에서 5'엑소 뉴 클레아제 활성을 나타낼 수 있으며, 이는 핵산 연장 동안 더 높은 충실도에 기여할 수 있다. 일부 중합 효소는 연신 중에 선행 서열을 대체할 수 있는 반면, 다른 중합 효소는 이들을 저하 시키거나 연신을 중단할 수 있다. Taq 와 같은 일부 중합 효소는 핵산 서열의 3'단부에 아데닌 염기를 포함한다. 이 과정을 A-테일링 이라고 하며, 아데닌 염기의 첨가가 의도된 인접한 구성 요소 사이의 설계된 3'상보성을 방해할 수 있으므로 OEPCR을 억제할 수 있다. OEPCR은 중합 효소 순환 조립(또는 PCA) 라고도한다.
B.결찰 조립
결찰 조립에서, 하나 이상의 리가아제 효소 및 추가 보조 인자를 포함하는 반응에서 별도의 핵산이 어셈블리된다. 보조 인자에는 ATP(Adenosine Tri-Phosphate), DTT(Dithiothreitol) 또는 마그네슘 이온(Mg2 +) 이 포함될 수 있다.결찰 동안, 한 핵산 가닥의 3'-단부는 다른 핵산 가닥의 5'단부에 공유 적으로 연결되어 조립된 핵산을 형성한다. 결찰 반응의 구성 요소는 블런트- 단부 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA) 또는 부분적으로 혼성화된 단일 가닥 DNA일 수 있다. 핵산의 단부를 모으는 전략은 리가아제 효소에 대한 생존 가능한 기질의 빈도를 증가 시키므로 리가아제 반응의 효율성을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 블런트-단부 dsDNA 분자는 리가아제 효소가 작용할 수 있는 소수성 스택을 형성하는 경향이 있으나 핵산을 모으기위한 보다 성공적인 전략은 조립하려는 구성 요소의 오버행에 대해 상보성을 갖는 5 '또는 3'단일 가닥 오버행와 함께 핵산 구성 요소를 사용하는 것이다. 후자의 경우, 염기-염기 혼성화로 인해보다 안정적인 핵산 이중 나선이 형성될 수 있다.
이중 가닥 핵산의 한쪽 단부에 오버행 가닥이있는 경우, 동일한 단부에 있는 다른 가닥을 "공동"이라고 할 수 있다. 공동과 오버행은 함께 "점착 단부"라고도하는 "접착제 단부"를 형성한다. 점착 단부는 3' 오버행 및 5' 공동 또는 5' 오버행 및 3' 공동일 수 있다. 2개의 의도된 인접한 구성 요소 사이의 접착 단부는 양 접착 단부의 오버행이 혼성화하여 각각의 오버행이 다른 구성 요소상의 공동의 시작 부분에 직접 인접하게 끝나도록 상보성을 갖도록 설계될 수 있다. 이것은 리가아제의 작용에 의해 "밀봉"(포스포디에스테르 결합을 통해 공유 결합)될 수 있는 "닉"(이중 가닥 DNA 파손)을 형성한다. 닉은 한 가닥 또는 다른 가닥 또는 둘 다 밀봉할 수 있다. 열역학적으로 점착성 단부를 형성하는 분자의 상단 및 하단 가닥은 관련 상태와 해리 상태 사이에서 이동할 수 있으므로 점착 단부는 일시적으로 형성될 수 있다. 그러나 일단 두 구성 요소 사이의 점착 단부 듀플렉스의 한 가닥을 따라 닉이 밀봉되면 반대 가닥의 부재가 해리되더라도 공유 결합이 유지된다. 연결된 가닥은 반대 가닥의 의도된 인접 멤버가 결합할 수 있는 템플릿이될 수 있고 다시 한번 밀봉될 수 있는 닉을 형성할 수 있다.
하나 이상의 엔도 뉴 클레아와 dsDNA를 절단함으로써 점착 단부가 생성될 수 있다. 엔도뉴클레아제(제한 효소로 지칭될 수 있음)는 dsDNA 분자의 한쪽 또는 양쪽 단부에 있는 특정 부위(제한 부위로 지칭될 수 있음)를 표적으로 삼아 엇갈린 절단(때로는 다이제스트가라고도 함)을 생성하여 점착 단부를 남긴다. 다이제스트는 회귀 오버행(자체의 역상 보완 서열을 가진 오버행)를 남길 수 있다. 만약 그렇다면, 동일한 엔도뉴클레아제로 분해된 두 구성 요소는 리가아제와 함께 조립될 수 있는 상보적인 점착 단부를 형성할 수 있다. 다이제스트와 결찰은 엔도뉴클레아제와 리가아제가 호환되는 경우 동일한 반응에서 함께 발생할 수 있다. 반응은 섭씨 4, 10, 16, 25 또는 37 도와 같은 균일한 온도에서 발생할 수 있다. 또는 섭씨 16도에서 37도 사이와 같이 여러 온도 사이에서 반응이 순환될 수 있다. 여러 온도 사이의 순환은 순환의 서로 다른 부분 동안 각각의 최적 온도에서 진행되는 다이제스트 및 결찰을 가능하게 할 수 있다.
개별 반응에서 다이제스트 및 결찰을 수행하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 원하는 경우 리가아제와 원하는 엔도뉴클레아제가 서로 다른 조건에서 최적으로 기능한다. 또는, 예를 들어, 결찰된 생성물이 엔도뉴클레아제에 대한 새로운 제한 부위를 형성하는 경우. 이러한 경우에는 제한 다이제스트를 수행한 다음 결찰을 개별적으로 수행하는 것이 더 좋을 수 있으며, 결찰 전에 제한 효소를 제거하는 것이 더 유리할 수 있다. 핵산은 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전, 자기 비드 포획 및/또는 실리카 멤브레인 흡착, 세척 및 용리를 통해 효소에서 분리될 수 있다. 여러 엔도뉴클레아제가 동일한 반응에 사용될 수 있지만, 엔도뉴클레아제가 서로 간섭하지 않고 유사한 반응 조건에서 기능하도록 주의해야 한다. 두 개의 엔도뉴클레아제를 사용하여 dsDNA 구성 요소의 양쪽 단부에 직교(비상 보) 점착 단부를 만들 수 있다.
엔도뉴클레아제 분해는 5' 단부가 인산화된 점착 단부를 남긴다. 리가아제는 인산화된 5' 단부에서만 기능할 수 있으며 인산화되지 않은 5' 단부에서는 작동하지 않는다. 따라서 디제스천과 결찰 사이에 중간 5'인산화 단계가 필요하지 않을 수 있다. 점착 단부에 회귀 오버행이있는 다이제스티드 dsDNA 구성 요소는 스스로 결찰될 수 있다. 자가 결찰을 방지하기 위해 결찰 전에 상기 dsDNA 구성 요소를 탈 인산화하는 것이 유익할 수 있다.
다중 엔도 뉴클레아제는 상이한 제한 부위를 타겟팅하지만 호환 오버행(서로 역방향 보완 오버행)을 남길 수 있다. 2개의 이러한 엔도뉴클레아제로 생성된 점착 단부의 결찰 생성물은 결찰 부위에 어느 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 포함하지 않는 조립된 생성물을 생성할 수 있다. 이러한 엔도뉴클레아제는 반복적인 다이제스트-결찰사이클을 수행하여 단 두 개의 엔도뉴클레아제를 사용하여 여러 구성 요소를 프로그래밍 가능하게 조립할 수 있는 바이오 브릭 조립과 같은 조립 방법의 기초를 형성한다. 도 도 20은 호환 가능한 오버행을 갖는 엔도뉴클레아제 BamHI 및 BglII를 사용하는 다이제스트-결찰사이클을 예시한다.
일부 구현에서 점착 단부를 만드는 데 사용되는 엔도뉴클레아제는 IIS 제한 효소 유형일 수 있다. 이러한 효소는 특정 방향으로 제한 부위에서 고정된 수의 염기를 절단 하므로 생성되는 오버행의 순서를 맞춤화할 수 있다. 오버행 서열은 회귀성일 필요가 없다. 동일한 유형의 IIS 제한 효소를 사용 하여 동일한 반응 또는 여러 반응에서 여러개의 서로 다른 점착 단부을 만들 수 있다. 또한, 하나 또는 여러 유형의 IIS 제한 효소를 사용 하여 동일한 반응 또는 여러 반응에서 호환 가능한 오버행을 가진 구성 요소를 만들 수 있다. 유형 IIS 제한 효소에 의해 생성된 두 점착 단부 사이의 결찰 부위는 새로운 제한 부위를 형성하지 않도록 설계될 수 있다. 또한, 유형 IIS 제한 효소 부위는 dsDNA에 위치하여 제한 효소가 점착 단부를 가진 구성 요소를 생성 할 때 자신의 제한 부위를 절단할 수 있다. 따라서 유형 IIS 제한 효소에서 생성된 여러 구성 요소 간의 결찰 제품에는 제한 부위가 포함되어 있지 않을 수 있다.
유형 IIS 제한 효소가 서로 함께 구성 요소 다이제스트 및 결찰을 수행하는 리가아제로 반응시 혼합될 수 있다. 반응 온도는 최적의 다이제스트 및 결찰을 촉진하기 위해 둘 이상의 값 사이에서 순환될 수 있다. 예를 들어, 다이제스트는 섭씨 37도에서 최적으로 수행될 수 있고 결찰은 섭씨 16도에서 최적으로 수행될 수 있다. 더 일반적으로, 반응은 섭씨 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 이상, 또는 65 ℃ 이상의 온도 값 사이를 순환할 수 있다. 결합된 분해 및 결찰 반응을 사용 하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개 이상의 구성 요소.유형 IIS 제한 효소를 활용하여 점착 단부을 만드는 조립 반응의 예로는 Golden Gate Assembly(Golden Gate Cloning이라고도 함) 또는 Modular Cloning(MoClo 라고도 함)이 있다.
결찰의 일부 구현에서 엑소뉴클레아제는 끈적한 단부가 있는 구성 요소를 만드는 데 사용할 수 있다. 3'엑소뉴클레아제는 dsDNA에서 3'단부를 다시 츄잉하여 5'오버행을 생성하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 5'엑소뉴클레아제는 dsDNA 로부터 5'단부를 츄잉하여 3'오버행을 생성하는 데 사용될 수 있다. 다른 엑소뉴클레아제는 다른 특성을 가질 수 있다. 예를 들어 엑소뉴클레아제들은 ssDNA에 작용하는지 여부, 인산화 또는 인산화되지 않은 5 '말단에 작용하는지 여부, 닉에서 시작할 수 있는지 여부 또는 5 '캐비티, 3'캐비티, 5 '오버행 또는 3'오버행에서 활동을 시작할 수 있는지 여부에 따라 뉴 클레아 제 활성 방향(5 '에서 3'또는 3 '에서 5')이 다를 수 있다. 다양한 유형의 엑소뉴클레아제에는 Lambda 엑소뉴클레아제, RecJf, 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 T, 엑소뉴클레아제 V, 엑소뉴클레아제 VIII, 엑소뉴클레아제 VII, 뉴 클레아 제 BAL_31, T5 엑소뉴클레아제 및 T7 엑소뉴클레아제가 포함된다.
엑소뉴클레아제는 여러 구성요소를 조립하기 위해 리가아제와 함께 반응에 사용될 수 있다. 반응은 고정된 온도 또는 여러 온도 사이의 사이클에서 발생할 수 있으며, 각각은 각각 리가아제 또는 엑소뉴클레아제에 이상적이다. 중합 효소는 리가아제 및 5'-to-3'엑소뉴클레아제와의 조립 반응에 포함될 수 있다. 이러한 반응의 구성 요소는 서로 인접하여 조립하도록 의도된 구성 요소가 가장자리에서 상동 서열을 공유하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 구성 요소 Y와 조립될 구성 요소 X는 5'-z-3 '형태의 3'가장자리 서열을 가질 수 있고, 구성 요소 Y는 5'-z-3 '형태의 5'가장자리 서열을 가질 수 있다. z는 임의의 핵산 서열이다. 깁슨 중첩'과 같은 형태의 상동 에지 서열을 참조한다. 5' 엑소뉴클레아제가 깁슨 중첩과 함께 dsDNA 구성 요소의 5'단부를 다시 츄잉하면 서로 혼성화하는 호환 가능한 3'오버행을 생성한다. 그 다음, 혼성화된 3'단부는 중합 효소의 작용에 의해 템플릿 구성 요소의 단부로, 또는 한 구성 요소의 연장된 3'오버행이 인접한 구성 요소의 5'공동과 만나는 지점까지 연장되어 리가아제에 의해 봉인될 수 있다. 중합 효소, 리가아제 및 엑소뉴클레아제가 함께 사용되는 이러한 조립 반응을 종종 "깁슨 조립"이라고한다. Gibson 조립은 T5 exonuclease, Phusion polymerase 및 Taq ligase를 사용하고 섭씨 50도에서 반응을 인큐베이션하여 수행할 수 있다. 상기 예에서, 고온 성 리가아제인 Taq를 사용하면 반응시 세 가지 유형의 효소 모두에 적합한 온도인 섭씨 50도에서 반응을 진행할 수 있다.
용어 "깁슨 조립"은 일반적으로 폴리머, 리가아제 및 엑소뉴클레아제를 포함한 임의 집합 반응을 지칭할 수 있다. 깁슨 조립은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 적어도 10 개 이상의 부품을 조립하는 데 사용될 수 있다. 깁슨 조립은 1 단계, 등온 반응 또는 하나 이상의 온도 인큐베이션을 통한 다단계 반응으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 깁슨 조립은 최소 30, 40, 50, 60 또는 최소 70도 이상의 온도에서 발생할 수 있다. 깁슨 조립의 인큐베이션 시간은 1, 5, 10, 20, 40 또는 80 분 이상일 수 있다.
깁슨 조립 반응은 의도된 인접 구성 요소 사이의 깁슨 중첩이 특정 길이이고 헤어핀, 동종이량체 또는 원치 않는 이종이량체와 같은 바람직하지 않은 혼성화 이벤트를 피하는 서열과 같은 서열 특징을 가질 때 최적으로 발생할 수 있다. 일반적으로 최소 20 개 염기의 깁슨 중첩이 권장된다. 그러나 깁슨 중첩은 길이가 적어도 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 적어도 100 개 이상의 염기일 수 있다.깁슨 오버랩의 GC 함량은 0%에서 100%까지이다. 예를 들어, 깁슨 오버랩의 GC 함량은 0%에서 5%, 5%에서 10%, 10%에서 15%, 15%에서 20%, 20%에서 25%, 25%3, 0%, 30%에서 35%, 35%에서 40%, 40%에서 45%, 45%에서 50%, 50%에서 55%, 55%에서 60%, 60%에서 65%, 65%에서 70%, 70%에서 75%, 75%에서 80%, 80%에서 85%, 85%에서 90%, 90%에서 95%, 또는 95%에서 100%일 수 있다.
깁슨 조립은 일반적으로 5' 엑소뉴클레아제로 설명되지만, 반응은 3' 엑소뉴 클레아제에서도 발생할 수 있다. 3' 엑소뉴클레아제가 dsDNA 구성 요소의 3'단부를 다시 츄잉하면 중합 효소는 3'단부를 확장하여 작용을 방해한다. 이 동적 과정은 두 구성 요소(깁슨 중첩을 공유하는)의 5'오버행(엑소뉴클레아제에 의해 생성됨)가 혼성화되고 중합 효소가 인접한 구성 요소의 5'단부를 충족할만큼 충분히 멀리한 구성 요소의 3'단부까지 확장될 때까지 계속될 수 있다. 따라서 리가아제로 봉인될 수 있는 닉이 남는다.
일부 구현예에서, 효소는 대조적으로 결찰 끈적 단부 구성 요소는 합성 생성될 수 함께 혼합하는 두개의 단일 가닥 핵산 또는 올리고 완전한 상보성을 공유하지 않는다.
점착 단부 결찰에서 올리고의 인덱스 영역 및 혼성화 영역(들)은 구성 요소의 적절한 조립을 용이하게 하도록 설계될 수 있다. 오버행이 긴 부품은 오버행이 짧은 부품에 비해 주어진 어닐링 온도에서 서로 더 효율적으로 혼성화할 수 있다.오버행은 적어도 1, 2, 34, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 적어도 30 개 이상의 염기 길이를 가질 수 있다.
높은 구아닌 또는 시토신 함량을 포함하는 오버행을 갖는 구성 요소는 낮은 구아닌 또는 시토신 함량을 포함하는 돌출부를 갖는 구성 요소보다 주어진 온도에서 이들의 상보적 구성 요소에 더 효율적으로 혼성화할 수 있다. 이것은 구아닌이 티민과 아데닌보다 사이토신과 더 안정적인 염기쌍을 형성하기 때문이다. 오버행은 0%에서 100% 사이의 구아닌 또는 시토신 함량(GC 함량이라고도 함)을 가질 수 있다.
오버행 서열을 가짐에 따라 올리고 인덱스 영역의 GC 함량 길이는 결찰 효율에 영향을 미칠 수 있다. 이는 각 구성 요소의 상단 및 하단 가닥이 안정적으로 결합되면 접착 단부 구성 요소가 보다 효율적으로 조립될 수 있기 때문이다. 따라서 인덱스 영역은 더 높은 GC 함량, 더 긴 서열 및 더 높은 용융 온도를 촉진하는 기타 기능으로 설계될 수 있다. 그러나, 결찰 조립의 효율성에 영향을 미칠 수 있는 인덱스 영역 및 오버행 서열 모두에 대해 올리고 디자인의 더 많은 측면이 있다. 예를 들어, 구성 요소 내에서 원하지 않는 이차 구조의 형성은 의도된 인접한 구성 요소와 함께 조립된 제품을 형성하는 능력을 방해할 수 있다. 이는 인덱스 영역, 오버행 서열 또는 둘 다의 2 차 구조로 인해 발생할 수 있다. 이러한 2 차 구조에는 헤어핀 루프가 포함될 수 있다. 올리고에 대한 가능한 2 차 구조의 유형과 안정성(예: 온도를 충족)은 서열을 기반으로 예측할 수 있다. 디자인 공간 검색 알고리즘을 사용 하여 효과적인 구성 요소의 형성을 위한 적절한 길이 및 GC 함량 기준을 충족하는 올리고 서열을 결정하는 동시에 잠재적으로 억제성 2차 구조를 갖는 서열을 피할 수 있다. 설계 공간 검색 알고리즘은 유전 알고리즘, 휴리스틱 검색 알고리즘, tabu 검색과 같은 메타 휴리스틱 검색 전략, 분기 및 바인딩 검색 알고리즘, 동적 프로그래밍 기반 알고리즘, 제한된 조합 최적화 알고리즘, 경사 하강 법 기반 알고리즘, 무작위 검색 알고리즘 또는 이들의 조합을 포함할 수 있습니다.
마찬가지로, 동종이량체(동일한 서열의 올리고와 혼성화하는 올리고) 및 원치 않는 이종이량체(의도된 조립 파트너를 제외하고 다른 올리고와 혼성화하는 올리고)의 형성은 결찰을 방해할 수 있다. 구성 요소 내의 2 차 구조와 유사하게, 동종이량체 및 이종 이량체의 형성은 계산 방법 및 설계 공간 검색 알고리즘을 사용하여 올리고 설계 중에 예측되고 설명될 수 있다.
더 긴 올리고 서열 또는 더 높은 GC 함량은 결찰 반응 내에서 원하지 않는 2 차 구조, 동종이량체 및 이종이량체의 형성을 증가시킬 수 있다. 따라서 일부 구현 에서 더 짧은 올리고 또는 더 낮은 GC 함량을 사용하면 조립 효율성이 높아질 수 있다. 이러한 설계 원칙은 보다 효율적인 조립을 위해 긴 올리고 또는 높은 GC 함량을 사용하는 설계 전략을 방해할 수 있다. 따라서 결찰 조립 효율이 최적화되도록 각 구성 요소를 구성하는 올리고에 대한 최적의 길이와 최적의 GC 함량이 있을 수 있다. 결찰에 사용되는 올리고의 전체 길이는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 적어도 100 염기 이상일 수 있다. 결찰에 사용되는 올리고의 전체 GC 함량은 0% ~ 100%이다. 예를 들어, 결찰에 사용되는 올리고의 전체 GC 함량은 0%에서 5%, 5%에서 10%, 10%에서 15%, 15%에서 20%, 20%에서 25%, 25%에서 30%, 30%에서 35%, 35%에서 40%, 40%에서 45%, 45%에서 50%, 50%에서 55%, 55%에서 60%, 60%에서 65%, 65%에서 70%, 70%에서 75%, 75%에서 80%, 80%에서 85%, 85%에서 90%, 90%에서 95%, 또는 95%에서 100% 까지일 수 있다.
점착 단부 결찰에 더하여, 결찰은 또한 스테이플(또는 템플릿 또는 브릿지) 가닥을 사용하여 단일 가닥 핵산 사이에서 발생할 수 있다. 상기 방법은 스테이플 가닥 결찰(SSL), 템플릿 지정 결찰(TDL) 또는 브리지 가닥 결찰 이라고할 수 있다. TDL에서 두개의 단일 가닥 핵산은 템플릿에 인접하게 혼성화 하여 리가아제에 의해 봉인될 수 있는 닉을 형성한다.끈적 점착 단부 결찰에 대한 동일한 핵산 설계 고려 사항이 TDL에도 적용된다. 템플릿과 의도된 상보적 핵산 서열 간의 더 강한 혼성화는 결찰 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서 템플릿의 각면에서 혼성화 안정성(또는 용융 온도)을 개선하는 서열 특징은 결찰 효율을 향상시킬 수 있다. 이러한 기능에는 더 긴 서열 길이와 더 높은 GC 콘텐츠가 포함될 수 있다. 템플릿을 포함하여 TDL에서 핵산의 길이는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 적어도 100 개 염기 이상일 수 있다. 템플릿을 포함한 핵산의 GC 함량은 0%에서 100%까지이다. 예를 들어, 템플릿을 포함한 핵산의 GC 함량은 0%에서 5%, 5%에서 10%, 10%에서 15%, 15%에서 20%, 20%에서 25%, 25%에서 30%, 30%에서 35%, 35%에서 40%, 40%에서 45%, 45%에서 50%, 50%에서 55%, 55%에서 60%, 60%에서 65%, 65%에서 70%, 70%에서 75%, 75%에서 80%, 80%에서 85%, 85%에서 90%, 90%에서 95% 또는 95% ~ 100%일 수 있다.
TDL에서, 점착성 단부 결찰과 같이, 서열 공간 검색 알고리즘과 함께 핵산 구조 예측 소프트웨어를 사용하여 원하지 않는 2차 구조를 피하는 구성 요소 및 템플릿 서열을 설계하는데 주의를 기울일 수 있다. TDL의 구성 요소가 이중 가닥 대신 단일 가닥일 수 있기 때문에 노출된 염기로 인해 원하지 않는 2 차 구조(점착 단부 결찰에 비해)가 더 많이 발생할 수 있다.
TDL은 또한 블런트 단부 dsDNA 구성 요소으로 수행될 수 있다. 이러한 반응에서 스테이플 가닥이 두 개의 단일 가닥 핵산을 적절하게 연결하기 위해 스테이플은 먼저 전체 단일 가닥 보체를 대체하거나 부분적으로 대체해야 할 수 있다. dsDNA 구성 요소과의 TDL 반응을 용이하게 하기 위해 dsDNA는 초기에 고온에서 인큐베이션하여 녹일 수 있다. 그 후 반응은 냉각되어 스테이플 가닥이 적절한 핵산 보체에 어닐링되도록 할 수 있다. 상기 프로세스는 dsDNA 구성 요소에 비해 상대적으로 높은 농도의 템플릿을 사용하여 훨씬 더 효율적 으로 만들 수 있으므로 템플릿이 결합을 위해 적절한 전장 ssDNA 보완 물을 능가할 수 있다. 두개의 ssDNA 가닥이 템플릿과 리가아제에 의해 조립되면, 그 조립된 핵산은 반대의 전장 ssDNA 보체에 대한 템플릿이될 수 있다. 따라서 TDL과 블런트 단부 dsDNA의 결찰은 여러 번의 용융(고온에서 배양) 및 어닐링(저온에서 배양)을 통해 개선될 수 있다. 이 과정을 Ligase Cyling Reaction(LCR)이라고 한다. 적절한 용융 및 어닐링 온도는 핵산 서열에 따라 다르다. 용융 및 어닐링 온도는 섭씨 4, 10, 20, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100도 이상일 수 있다. 온도 사이클의 수는 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 15, 30 또는 그 이상일 수 있다.
모든 결찰은 고정 온도 반응 또는 다중 온도 반응에서 수행될 수 있다. 결찰 온도는 섭씨 0, 4, 10, 20, 20, 30, 40, 50 또는 60도 이상일 수 있다. 리가아제 활성을 위한 최적 온도는 리가아제 유형에 따라 다를 수 있다. 더욱이, 구성 요소가 반응에서 인접하거나 혼성화하는 속도는 핵산 서열에 따라 다를 수 있다. 더 높은 인큐베이션 온도는 더 빠른 확산을 촉진하여 구성 요소가 일시적으로 인접하거나 혼성화하는 빈도를 증가시킬 수 있다. 그러나 증가된 온도는 염기쌍 결합을 방해할 수 있으므로 인접하거나 혼성화된 구성 요소 이중 나선의 안정성을 감소시킬 수 있다. 결찰을 위한 최적 온도는 조립할 핵산의 수, 해당 핵산의 서열, 리가아제 유형 및 반응 첨가제와 같은 기타 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 4베이스 보완 오버행이 있는 두개의 점착 단부 구성 요소는 T4 리가아제를 사용하는 25 ° C보다 T4 리가아제를 사용하여 섭씨 4도에서 더 빠르게 조립할 수 있다. 그러나 25베이스 상보적 오버행이 있는 두개의 접착 끝 부품은 T4 리가아제를 사용하는 4 °C에서보다 T4 리가아제를 사용하여 25 °C에서 더 빠르게 조립할 수 있으며, 어떤 온도에서든 4-베이스 오버행을 사용하는 연결보다 빠를 수 있다. 결찰의 일부 구현예에서, 결찰 첨가 전에 어닐링을 위해 구성 요소를 가열하고 서서히 냉각하는 것이 유리할 수 있다.
결찰은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상의 핵산을 조립하는 데 사용할 수 있다. 결찰 인큐베이션 시간은 최대 30 초, 1 분, 2 분, 5 분, 10 분, 20 분, 30 분, 1 시간 또는 그 이상일 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간은 결찰 효율을 향상시킬 수 있다.
[126] 결찰은 5' 인산화된 단부를 가진 핵산을 필요로할 수 있다. 5'인산화된 단부가 없는 핵산 구성 요소는 T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제(또는 T4 PNK)와 같은 폴리뉴클레오티드 키나아제와의 반응에서 인산화될 수 있다. ATP, 마그네슘 이온 또는 DTT와 같은 다른 보조 인자가 반응에 존재할 수 있다. 폴리 뉴클레오티드 키나아제 반응은 섭씨 37도에서 30 분 동안 발생할 수 있다. 폴리 뉴클레오티드 키나아제 반응 온도는 섭씨 4, 10, 20, 20, 30, 40, 50 또는 60도 이상일 수 있다.폴리 뉴클레오티드 키나아제 반응 인큐베이션 시간은 최대 1 분, 5 분, 10 분, 20 분, 30 분, 60 분 또는 그 이상일 수 있다. 선택적으로, 핵산 구성 요소는 변형된 5'인산화로 합성(효소에 반대되는) 설계 및 제조될 수 있다. 5'단부에 조립되는 핵산 만 인산화가 필요할 수 있다. 예를 들어, TDL의 템플릿은 조립할 수 없으므로 인산화되지 않을 수 있다.
첨가제가 결찰 효율을 향상시킬 수 있는 연결 반응에 포함될 수 있다. 예를 들면, 디메틸설폭 사이드(DMSO), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하나의 부가 2-Propanediol(1,2-PRD), 글리세롤, 이들의 트윈 20 또는 이들의 조합을 포함한다. PEG6000은 특히 효과적인 결찰 증강 제일 수 있다. PEG6000은 크라우딩 에이전트 역할을 하여 결찰 효율을 높일 수 있다. 예를 들어, PEG6000은 리가아제 반응 용액에서 공간을 차지하고 리가아제와 구성 요소를 더 가깝게 만드는 응집된 결절을 형성할 수 있다. 첨가제 함량(부피당 중량)은 적어도 0%, 1%, 5%, 10%, 20% 또는 그 이상일 수 있다.
다양한 리가아제가 결찰에 사용될 수 있다. 리가아제는 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있다. 리가아제의 예로는 T4 DNA 리가아제, T7 DNA 리가아제, T3 DNA 리가아제, Taq DNA 리가아제, 9oNTM DNA 리가아제, E.coli DNA 리가아제 및 SplintR DNA 리가아제가 있다. 다른 리가아제가 안정적이고 다른 온도에서 최적으로 기능할 수 있다. 예를 들어, Taq DNA Ligase는 내열성이며 T4 DNA Ligase는 그렇지 않다. 더욱이, 다른 ligases는 다른 속성을 가지고 있다. 예를 들어, T4 DNA 리가아제는 블런트-단부 dsDNA를 결찰할 수 있지만 T7 DNA 리가아제는 결찰하지 않을 수 있다.
결찰은 서열화 어댑터를 핵산 라이브러리에 부착하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 결찰은 핵산 라이브러리의 각 부재의 단부에서 공통의 점착 단부 또는 스테이플을 사용하여 수행할 수 있다. 핵산의 한쪽 단부에 있는 점착 단부 또는 스테이플이 다른 쪽 끝의 것과 구별되는 경우, 서열화 어댑터는 비대칭으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 순방향 서열화 어댑터는 핵산 라이브러리 부재의 한쪽 단부에 연결될 수 있고 역방향 서열화 어댑터는 핵산 라이브러리 부재의 다른 쪽 단부에 연결될 수 있다. 선택적으로, 블런트- 단부 결찰은 블런트- 단부 이중 가닥 핵산 라이브러리에 어댑터를 부착하는 데 사용될 수 있다. 포크 어댑터는 양쪽 단부(예: A-꼬리)에서 동일한 블런트- 단부 또는 점착 단부가 있는 핵산 라이브러리에 어댑터를 비대칭적으로 부착하는 데 사용할 수 있다.
결찰은 열 불활성화(예를 들어, 적어도 20 분 동안 섭씨 65도에서 배양), 변성제의 첨가, 또는 EDTA와 같은 킬레이터의 첨가에 의해 억제될 수 있다.
C.제한 다이제스트
제한 다이제스트는 제한 엔도뉴클레아제(또는 제한 효소)가 핵산상의 동족 제한 부위를 인식하고 이어서 상기 제한 부위를 포함하는 핵산을 절단(또는 분해)하는 반응이다. 유형 I, 유형 II, 유형 III 또는 유형 IV 제한 효소를 제한 다이제스트에 사용할 수 있다. 유형 II 제한 효소는 핵산 분해에 가장 효율적인 제한 효소일 수 있다. 유형 II 제한 효소는 회귀 제한 부위를 인식하고 인식 부위 내의 핵산을 절단할 수 있다. 상기 제한 효소(및 이들의 제한 부위)의 예는 AatII(GACGTC), AfeI(AGCGCT), ApaI(GGGCCC), DpnI(GATC), EcoRI(GAATTC), NgeI(GCTAGC) 등을 포함한다. DpnI 및 AfeI 와 같은 일부 제한 효소는 중앙의 제한 부위를 절단하여 블런트- 단부 dsDNA 제품을 남길 수 있다. EcoRI 및 AatII 와 같은 다른 제한 효소는 제한 부위를 중심에서 잘라내어 dsDNA 제품에 점착 단부(또는 엇갈린 끝)을 남긴다. 일부 제한 효소는 불연속 제한 부위를 표적으로 삼을 수 있다. 예를 들어, 제한 효소 AlwNI는 제한 부위 CAGNNNCTG를 인식하며, 여기서 N은 A, T, C 또는 G일 수 있다. 제한 부위는 적어도 2, 4, 6, 8, 10 또는 그 이상의 염기 길이일 수 있다.
일부 유형 II 제한 효소는 제한 부위 외부에서 핵산을 절단한다. 효소는 유형 IIS 또는 유형 IIG 제한 효소로 서브분류될 수 있다. 상기 효소는 회귀가 아닌 제한 부위를 인식할 수 있다. 상기 제한 효소의 예는 GAAAC를 인식하고 추가 하류에 지그재그 절단 2(동일 가닥) 및 6(반대 가닥) 염기를 생성하는 BbsI를 포함한다. 또 다른 예는 GGTCTC를 인식하고 엇갈린 절단 1(동일 가닥) 및 5(반대 가닥) 염기를 추가 하류로 생성하는 BsaI를 포함한다. 상기 제한 효소는 골든 게이트 조립 또는 모듈 클로닝(MoClo)에 사용될 수 있다. BcgI(IIG 형 제한 효소 와 같은 일부 제한 효소는 인식 부위의 양쪽 단부에 엇갈린 절단을 생성할 수 있다. 제한 효소는 인식 부위에서 적어도 1, 5, 10, 15, 20 개 또는 그 이상의 염기로부터 핵산을 절단할 수 있다. 상기 제한 효소는 인식 부위 외부에서 엇갈린 절단을 생성할 수 있기 때문에 생성된 핵산 오버행의 서열은 임의로 설계될 수 있다. 이는 인식 부위 내에서 엇갈린 절단을 생성하는 제한 효소와 반대이며, 생성된 핵산 오버행의 서열이 제한 부위의 서열에 결합된다. 제한 다이제스트에 의해 생성된 핵산 오버행은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 염기 길이일 수 있다. 제한 효소가 핵산을 절단할 때 생성된 5'단부에는 인산염이 포함된다.
하나 이상의 핵산 서열은 제한 다이제스트 반응을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 제한 다이제스트 반응에서 하나 이상의 제한 효소를 함께 사용할 수 있다. 제한 다이제스트물은 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 나트륨 이온, BSA, S-아데노 실-L-메티오닌(SAM) 또는 이들의 조합을 포함한 첨가제 및 보조 인자를 포함할 수 있다. 제한 다이제스트 반응은 섭씨 37도에서 1 시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 제한 다이제스트 반응은 섭씨 0, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60도 이상의 온도에서 인큐베이션될 수 있다. 최적의 다이제스트 온도는 효소에 따라 달라질 수 있다. 제한 다이제스트 반응은 최대 1, 10, 30, 60, 90, 120 분 또는 그 이상 동안 인큐베이션될 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간은 다이제스트를 증가시킬 수 있다.
D.핵산 증폭
핵산 증폭은 중합 효소 연쇄 반응, 또는 PCR로 실행될 수 있다. PCR에서 핵산의 시작 풀(템플릿 풀 또는 템플릿이라고 함)은 중합 효소, 프라이머(짧은 핵산 프로브), 뉴클레오티드 삼인산(예 : dATP, dTTP, dCTP, dGTP 및 이의 유사체 또는 변이체), 베타 인, DMSO 및 마그네슘 이온과 같은 추가 보조 인자 및 첨가제와 결합될 수 있다. 템플릿은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산일 수 있다. 프라이머는 템플릿 풀의 표적 서열을 보완하고 이에 혼성화하기 위해 합성적으로 구축된 짧은 핵산 서열일 수 있다. 일반적으로 PCR 반응에는 두 개의 프라이머가 있는데, 하나는 표적 템플릿의 상단 가닥에 있는 프라이머 결합 부위를 보완하기 위한 것이고 다른 하나는 제 1 결합 부위의 하류에 있는 표적 템플릿의 하단 가닥에 있는 프라이머 결합 부위를 보완하기 위한 것이다. 이들 프라이머가 표적에 결합하는 5'에서 3'방향은 이들 사이의 핵산 서열을 성공적으로 복제하고 지수적으로 증폭하기 위해 서로 마주해야한다. "PCR"은 전형적으로 상기 형태의 특이적인 반응을 지칭할 수 있지만, 임의의 핵산 증폭 반응을 지칭하기 위해 보다 일반적으로 사용될 수도 있다.
일부 구현에서 PCR은 세 온도: 용융 온도, 어닐링 온도 및 신장 온도: 사이의 온도 사이클을 포함할 수 있다. 용융 온도는 이중 가닥 핵산을 단일 가닥 핵산으로 전환하고 혼성화 산물과 이차 구조의 형성을 제거하기 위한 것이다. 일반적으로 용융 온도는 높은데, 예를 들어 섭씨 95도 이상이다. 일부 구현에서 용융 온도는 적어도 섭씨 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 또는 105 도일 수 있다. 다른 구현에서 용융 온도는 섭씨 95, 94, 93, 92, 91 또는 90도 이하일 수 있다. 용융 온도가 높을수록 핵산과 이차 구조의 해리가 개선되지만 핵산이나 중합 효소의 분해와 같은 부작용이 발생할 수도 있다. 용융 온도는 30 초, 1 분, 2 분 또는 3 분과 같은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 초 또는 그 이상 동안 반응에 적용될 수 있다. 복잡하거나 긴 템플릿을 사용하는 PCR 에는 더 긴 초기 용융 온도 단계가 권장될 수 있다.
어닐링 온도는 프라이머와 표적 템플릿 간의 혼성화 형성을 촉진하기 위한 것이다. 일부 구현에서, 어닐링 온도는 계산된 프라이머의 용융 온도와 일치할 수 있다. 다른 구현에서, 어닐링 온도는 상기 용융 온도의 10 ℃ 이상일 수 있다. 일부 구현에서, 어닐링 온도는 적어도 섭씨 25, 30, 50, 55, 60, 65 또는 70 도일 수 있다. 용융 온도는 프라이머의 순서에 따라 달라질 수 있다. 더 긴 프라이머는 더 높은 용융 온도를 가질 수 있으며, Guanine 또는 Cytosine 뉴클레오티드 함량이 더 높은 프라이머는 더 높은 용융 온도를 가질 수 있다. 따라서 특정 어닐링 온도에서 최적으로 조립하기 위한 프라이머를 설계할 수 있다. 어닐링 온도는 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 초 이상 동안 반응에 적용될 수 있다. 어닐링을 보장하기 위해 프라이머 농도가 높거나 포화 상태일 수 있다. 프라이머 농도는 500 나노 몰(nM)일 수 있다. 프라이머 농도는 최대 1nM, 10nM, 100nM, 1000nM 또는 그 이상일 수 있다.
신장 온도는 하나 이상의 중합 효소에 의해 촉매되는 프라이머의 3 '말단 핵산 사슬 연장을 시작하고 촉진하기 위한 것이다. 일부 구현에서, 신장 온도는 중합 효소가 핵산 결합 강도, 신장 속도, 신장 안정성 또는 충실도 측면에서 최적으로 기능하는 온도로 설정될 수 있다. 일부 구현에서, 신장 온도는 적어도 섭씨 30, 40, 50, 60, 또는 70도 이상일 수 있다. 어닐링 온도는 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 60 초 이상 동안 반응에 적용될 수 있다. 권장 연장 시간은 예상 신장의 킬로베이스 당 약 15 ~ 45 초이다.
PCR의 일부 구현에서 어닐링 온도 및 신장 온도가 동일할 수 있다. 따라서 3 단계 온도 사이클 대신 2 단계 온도 사이클을 사용할 수 있다. 결합된 어닐링 및 확장 온도의 예는 섭씨 60, 65 또는 72도를 포함한다.
일부 구현예서, PCR은 하나의 온도 사이클로 수행될 수 있다. 이러한 구현은 표적화된 단일 가닥 템플릿 핵산을 이중 가닥 핵산으로 전환하는 것을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, PCR은 다중 온도 사이클로 수행될 수 있다. PCR이 효율적이면 표적 핵산 분자의 수가 각사이클을 두 배로 늘려 원래의 템플릿 풀에서 표적 핵산 템플릿의 수가 기하 급수적으로 증가 할 것으로 예상된다. PCR의 효율성은 다를 수 있다. 따라서 각 라운드에서 복제되는 표적 핵산의 실제 백분율은 100%보다 많거나 적을 수 있다. 각 PCR사이클은 돌연변이 및 재조합 핵산과 같은 바람직하지 않은 인공물을 도입할 수 있다. 이러한 잠재적인 손상을 줄이기 위해 높은 충실도와 높은 처리성을 가진 중합 효소를 사용할 수 있다. 또한 제한된 수의 PCR사이클을 사용할 수 있다. PCR은 최대 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 그 이상의 사이클을 포함할 수 있다.
일부 구현에서 여러 별개의 표적 핵산 서열이 한 PCR에서 함께 증폭된다. 각 표적 서열에 공통 프라이머 결합 부위가있는 경우 모든 핵산 서열은 동일한 프라이머 세트로 증폭될 수 있다. 선택적으로, PCR은 각각의 별개의 핵산을 표적으로하는 다중 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 PCR은 다중 PCR로 지칭될 수 있다. PCR은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 또는 그 이상의 별개의 프라이머를 포함할 수 있다. 여러개의 고유한 핵산 표적이 있는 PCR에서 각 PCR사이클은 표적 핵산의 상대적 분포를 변경할 수 있다. 예를 들어, 균등 분포는 치우치거나 균일하지 않게 분포될 수 있다. 이러한 잠재적인 손상을 줄이기 위해 최적의 중합 효소(예: 고 충실도 및 서열 견고성) 및 최적의 PCR 조건을 사용할 수 있다. 어닐링 및 확장 온도 및 시간과 같은 요소를 최적화할 수 있다. 또한 제한된 수의 PCR 사이클을 사용할 수 있다.
PCR의 일부 구현에서 템플릿의 표적 프라이머 결합 부위와 염기 불일치가 있는 프라이머를 사용하여 표적 서열을 돌연변이 시킬 수 있다. PCR의 일부 구현에서, 5'단부(오버행으로 알려짐)에 여분의 서열을 가진 프라이머를 사용하여 서열을 표적 핵산에 부착할 수 있다. 예를 들어, 5'단부에 서열화 어댑터를 포함하는 프라이머를 사용하여 서열화를 위한 핵산 라이브러리를 준비 및/또는 증폭할 수 있다. 서열화 어댑터를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 특정 서열화 기술에 대한 충분한 농축으로 핵산 라이브러리를 증폭할 수 있다.
일부 구현에서, 선형 -PCR(또는 비대칭 -PCR)이 사용되며, 여기서 프라이머는 템플릿의 한 가닥(두 가닥 모두 아님)만을 표적으로 한다. 선형-PCR에서는 각주기에서 복제된 핵산이 프라이머에 보완되지 않으므로 프라이머가 결합하지 않는다. 따라서 프라이머는 각사이클마다 원래의 표적 템플릿 만 복제하므로 선형(지수적) 증폭이 발생한다. 선형 PCR의 증폭은 기존(지수) PCR만큼 빠르지 않을 수 있지만 최대 수율은 더 클 수 있다. 이론적으로, 선형-PCR의 프라이머 농도는 기존 PCR 에서처럼사이클이 증가하고 수율이 증가하는 제한 요인이되지 않을 수 있다. Linear-After-The-Exponential-PCR(또는 LATE-PCR)은 특히 높은 수율을 달성할 수 있는 선형 PCR의 수정된 버전이다.
핵산 증폭의 일부 구현에서, 융점, 어닐링 및 연장의 처리는 단일 온도에서 발생할 수 있다. 이러한 PCR은 등온 PCR 이라고할 수 있다. 등온 PCR은 프라이머 결합을 위해 서로 완전히 보완된 핵산 가닥을 해리하거나 대체하기 위한 온도 독립적인 방법을 활용할 수 있다. 전략에는 루프 매개 등온 증폭, 가닥 변위 증폭, 헬리 카제 의존 증폭 및 닉킹 효소 증폭 반응이 포함된다. 등온 핵산 증폭은 최대 섭씨 20, 30, 40, 50, 60 또는 70도 이상의 온도에서 발생할 수 있다.
일부 구현에서, PCR은 상기 형광 프로브 또는 시료 핵산의 양을 정량화하는 염료를 포함한다. 예를 들어, 염료는 이중 가닥 핵산으로 삽입될 수 있다. 상기 염료의 예는 SYBR Green이다. 형광 프로브는 또한 형광 유닛에 부착된 핵산 서열일 수 있다.형광 유닛은 표적 핵산에 대한 프로브의 혼성화 및 연장 중합 효소 유닛으로부터의 후속 변형시 방출될 수 있다. 상기 프로브의 예는 Taqman 프로브를 포함한다. 이러한 프로브는 PCR 및 광학 측정 도구(여기 및 검출 용)와 함께 사용하여 샘플의 핵산 농도를 정량화할 수 있다. 이 과정을 정량적 PCR(qPCR) 또는 실시간 PCR(rtPCR) 이라고 할 수 있다.
일부 구현에서 PCR은 다중 템플릿 분자의 풀보다는 단일 분자 템플릿(단일 분자 PCR이라고 할 수 있는 과정에서)에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 유제-PCR(ePCR)을 사용하여 오일 에멀젼 내의 물액적 내에 단일 핵산 분자를 캡슐화할 수 있다. 물액적은 또한 PCR 시약을 포함할 수 있으며, 물액적은 PCR에 필요한 온도 순환이 가능한 온도 제어 환경에 보관될 수 있다. 이러한 방식으로 다중 자체 포함 PCR 반응이 높은 처리량에서 동시에 발생할 수 있다. 오일 에멀젼의 안정성은 계면 활성제로 개선될 수 있다. 물액적의 움직임은 미세 유체 채널을 통한 압력 으로 제어될 수 있다. 미세 유체 장치는 액적 생성, 액적 분할, 액적 병합, 재료 주입 액적 주입 및 액적인큐베이션에 사용될 수 있다. 오일 에멀젼의 물액적 크기는 1 피코 리터(pL), 10pL, 100pL, 1 나노 리터(nL), 10nL, 100nL 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구현예서, 단일 분자 PCR은 고체상 기질에서 수행될 수 있다. 예로는 Illumina 고체상 증폭 방법 또는 그 변형이 있다. 템플릿 풀은 고체상 기질에 노출될 수 있으며, 여기서 고체상 기질은 특정 공간 해상도에서 템플릿을 고정할 수 있다. 브리지 증폭은 각 템플릿의 공간적 이웃 내에서 발생 하여 기질에서 높은 처리량 방식으로 단일 분자를 증폭할 수 있다.
처리량이 높은 단일 분자 PCR은 서로 간섭 할 수 있는 별개의 핵산 풀을 증폭하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 여러개의 별개의 핵산이 공통 서열 영역을 공유하는 경우, 이 공통 영역을 따라 핵산 사이의 재조합이 PCR 반응 중에 발생할 수 있으며, 결과적으로 새로운 재조합 핵산이 생성된다. 단일 분자 PCR은 서로 다른 핵산 서열을 구획화하여 상호 작용하지 않을 수 있으므로 잠재적인 증폭 오류를 방지한다. 단일 분자 PCR은 서열화를 위한 핵산을 준비하는 데 특히 유용할 수 있다. 단일 분자 PCR 매트는 템플릿 풀 내 여러 표적의 절대 정량화에도 유용하다. 예를 들어, 디지털 PCR(또는 dPCR)은 개별 단일 분자 PCR 증폭 신호의 빈도를 사용하여 샘플에서 시작 핵산 분자의 수를 추정한다.
PCR의 일부 구현에서, 핵산 그룹은 모든 핵산에 공통적인 프라이머 결합 부위에 대한 프라이머(예를 들어, 풀의 모든 핵산 옆에 있는 프라이머 결합 부위 용 프라이머)를 사용하여 비 차별적으로 증폭될 수 있다. 합성 핵산 라이브러리는 일반적인 증폭을 위해 이러한 공통 부위와 함께 생성되거나 조립될 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서, PCR은 풀로부터 핵산의 표적화된 서브 세트를 선택적으로 증폭하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 표적화된 핵산 서브 세트에만 나타나는 프라이머 결합 부위가있는 프라이머를 사용한다. 합성 핵산 라이브러리는 잠재적인 관심 서브라이브러리에 속하는 핵산이 모두 해당 에지(서브 라이브러리 내에서 일반적이지만 다른 서브라이브러리와 구별됨)에서 공통 프라이머 결합 부위를 공유하도록 생성 또는 조립될 수 있다. 일부 구현예에서, PCR은 부분적으로 조립되거나 잘못 조립된(또는 의도하지 않거나 바람직하지 않은) 이중 생성물 로부터 완전히 조립되거나 잠재적으로 완전히 조립된 핵산을 선택적으로 증폭하기 위해 핵산 조립 반응(예: 결찰 또는 OEPCR)과 조합될 수 있다. 예를 들어, 조립은 완전한 조립된 핵산 생성물 만이 증폭을 위해 필요한 2개의 프라이머 결합 부위를 포함하도록 각 에지 서열에 프라이머 결합 부위를 갖는 핵산을 조립하는 것을 포함할 수 있다. 상기 예에서, 부분적으로 조립된 제품은 프라이머 결합 부위가 있는 가장자리 서열 중 어느 것도 포함하지 않거나 하나만 포함할 수 있으므로 증폭해서는 안된다. 마찬가지로 잘못 조립된(또는 의도하지 않았거나 바람직하지 않은) 제품은 에지 시퀀스 중 하나만 포함하거나 둘 다 포함 할 수 없지만 잘못된 방향으로 있거나 잘못된 양의 염기로 분리될 수 있다. 따라서 잘못 조립된 제품은 잘못된 길이의 제품을 만들기 위해 증폭되거나 증폭되지 않아야 한다. 후자의 경우, 잘못된 길이의 증폭된 잘못 조립된 생성물은 아가로스 겔에서 DNA 전기 영동에 이어 겔 추출과 같은 핵산 크기 선택 방법에 의해 정확한 길이의 증폭된 완전 조립된 생성물로부터 분리될 수 있다.
첨가물(예를 들어, 베타 인, 디메틸설폭 사이드(DMSO), 비이 온성 세제, 포름 아미드, 마그네슘, 소 혈청 알부민(BSA) 또는 이들의 조합의 첨가)은 핵산 증폭의 효율을 향상시키기 위해 PCR에 포함될 수 있다. 첨가제 함량(부피당 중량)은 적어도 0%, 1%, 5%, 10%, 20% 또는 그 이상일 수 있다.
다양한 폴리머가 PCR에 사용될 수 있다. 중합 효소는 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있다.중합 효소의 예는 Φ29 중합 효소 또는 이의 유도체이다. 일부 경우에, 새로운 핵산 서열을 구축하기 위해 중합 효소와 함께 또는 중합 효소의 대안으로 전사 효소 또는 리가아제(즉, 결합 형성을 촉매하는 효소)가 사용된다. 중합 효소의 예로는 DNA 중합 효소, RNA 중합 효소, 열 안정 중합 효소, 야생형 중합 효소, 변형 중합 효소, E.coli DNA 중합 효소 I, T7 DNA 중합 효소, 박테리오파지 T4 DNA 중합 효소 Φ29(phi29) DNA 중합 효소, Taq 중합 효소, 제 Tth 중합 효소, Tli 중합 효소, Pfu중합 효소 Pwo 중합 효소, VENT 중합 효소, DEEPVENT 중합 효소, Ex-Taq 중합 효소, LA-TAW 중합 효소, Sso 중합 효소, PoC 중합 효소, Mth 중합 효소, ES4 중합 효소, Tru 중합 효소, Tac 중합 효소, Tne 중합 효소, Tma 중합 효소, Tca 중합 효소, Tih 중합 효소, Tfi 중합 효소, 백금 Taq 중합 효소, Tbr 중합 효소, Tfl 중합 효소, Pfutubo 중합 효소, Pyrobest 중합 효소, KOD 중합 효소, Bst 중합 효소, Sac 중합 효소, 3'~5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 Klenow 단편 중합 효소 및 이의 변이체, 변형된 산물 및 유도체를 포함한다. 다른 중합 효소는 안정적이고 다른 온도에서 최적으로 기능할 수 있다. 더욱이, 다른 중합 효소는 다른 특성을 가지고 있다. 예를 들어, Phusion 중합 효소 와 같은 일부 중합 효소는 3'에서 5'엑소뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있으며, 이는 핵산 연장 동안 더 높은 충실도에 기여할 수 있다. 일부 중합 효소는 연신 중에 선행 서열을 대체할 수 있는 반면, 다른 중합 효소는 이들을 저하 시키거나 연신을 중단할 수 있다. Taq와 같은 일부 중합 효소는 핵산 서열의 3'단부에 아데닌 염기를 포함한다. 추가적으로, 일부 중합 효소는 다른 것보다 더 높은 충실도와 처리성을 가질 수 있으며 시퀀싱 준비와 같은 PCR 응용에 더 적합 할 수 있고, 증폭된 핵산 수율이 최소한의 돌연변이를 갖는 것이 중요하며, 별개의 핵산의 분포는 증폭 내내 균일한 분포를 유지하는 것이 중요하다.
E. 크기 선택
특정 크기의 핵산은 크기 선택 기술을 이용하여 샘플에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 크기 선택은 겔 전기 영동 또는 크로마토 그래피를 사용하여 수행될 수 있다. 핵산의 액체 샘플은 고정상 또는 겔(또는 매트릭스)의한 단부에 로딩될 수 있다. 겔의 음의 단부가 핵산 샘플이 로딩되는 단부가되고 겔의 양의 단부가 반대편의 단부 이되도록 전압 차이가 겔에 걸쳐 배치될 수 있다. 핵산은 음으로 하전된 인산염 골격을 가지고 있기 때문에 겔을 가로 질러 양극 단부로 이동한다. 핵산의 크기는 겔을 통한 상대적인 이동 속도를 결정한다. 따라서 다양한 크기의 핵산이 이동함에 따라 겔에서 분해된다.전압 차이는 100V 또는 120V일 수 있다. 전압 차이는 최대 50V, 100V, 150V, 200V, 250V 이상일 수 있다. 전압 차이가 클수록 핵산 이동 속도와 크기 분해능이 증가할 수 있다. 그러나 더 큰 전압 차이는 핵산이나 겔을 손상시킬 수도 있다. 더 큰 크기의 핵산을 분석하려면 더 큰 전압 차이가 권장될 수 있다. 일반적인 마이그레이션 시간은 15 분에서 60 분 사이이다. 마이그레이션 시간은 최대 10 분, 30 분, 60 분, 90 분, 120 분 이상일 수 있다. 더 높은 전압과 유사하게 더 긴 이동 시간은 더 나은 핵산 분해능으로 이어질 수 있지만 핵산 손상을 증가시킬 수 있다. 더 큰 크기의 핵산을 분석하려면 더 긴 마이그레이션 시간이 권장될 수 있다. 예를 들어, 120V의 전압 차이와 30 분의 이동 시간은 250-base 핵산에서 200-base 핵산을 분리하는 데 충분할 수 있다.
겔 또는 매트릭스의 특성은 크기 선택 과정에 영향을 미칠 수 있다. 겔은 일반적으로 TAE(Tris-acetate-EDTA) 또는 TBE(Tris-borate-EDTA)와 같은 전도성 완충액에 분산된 아가로스 또는 폴리 아크릴 아미드와 같은 중합체 물질을 포함한다. 겔에서 물질(예: 아가로스 또는 아크릴 아미드)의 함량(부피당 중량)은 최대.5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 그 이상일 수 있다. 함량이 높을수록 마이그레이션 속도가 느려질 수 있다. 더 작은 핵산을 분해하려면 더 높은 함량이 바람직할 수 있다. 아가로스(Agarose) 겔은 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 해결하는 데 더 좋을 수 있다. 폴리 아크릴 아미드 겔은 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 분석하는 데 더 좋을 수 있다. 바람직한 겔 조성물은 핵산 유형 및 크기, 첨가제(예: 염료, 염색, 변성 용액 또는 로딩 버퍼)의 호환성 및 예상 다운 스트림 적용(예: 겔 추출 후 결찰, PCR 또는 서열화). 아가로스 겔은 폴리 아크릴 아미드 겔보다 겔 추출에 더 간단할 수 있다. TBE만큼 좋은 전도체는 아니지만 TAE는 추출 과정에서 붕산염(효소 억제제) 캐리 오버가 다운 스트림 효소 반응을 억제할 수 있기 때문에 겔 추출에 더 좋을 수 있다.
겔은 SDS(나트륨 도데실 설페이트) 또는 우레아와 같은 변성 용액을 추가로 포함 할 수있다. SDS는 예를 들어 단백질을 변성 시키거나 잠재적으로 결합된 단백질에서 핵산을 분리하는 데 사용될 수 있다. 우레아는 DNA의 2차 구조를 변성시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 우레아는 dsDNA를 ssDNA로 변환하거나, 요소는 접힌 ssDNA(예: 헤어핀)를 접히지 않은 ssDNA로 변환 할 수 있다. ssDNA를 정확하게 분석하기 위해 요소-폴리아크릴 아미드 겔(TBE를 추가로 포함)을 사용할 수 있다.
샘플은 다른 형식의 겔에 통합될 수 있다. 일부 구현에서 겔은 샘플을 수동으로 로드할 수 있는 웰을 포함할 수 있다. 하나의 겔에는 여러 핵산 샘플을 실행하기 위한 여러 웰이 있을 수 있다. 다른 구현에서, 겔은 핵산 샘플(들)을 자동으로로드하는 미세 유체 채널에 부착될 수 있다. 각 겔은 여러 미세 유체 채널의 하류에 있을 수 있거나 겔 자체가 각각 별도의 미세 유체 채널을 차지할 수 있다. 겔의 치수는 핵산 검출(또는 시각화)의 민감도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어 미세 유체 채널 내부의 얇은 겔 또는 겔(예: 바이오 분석기 또는 테이프 스테이션)은 핵산 검출의 민감도를 향상시킬 수 있다. 핵산 검출 단계는 정확한 크기의 핵산 단편을 선택하고 추출하는 데 중요할 수 있다.
핵산 크기 참조를 위해 래더를 겔에로드 할 수 있습니다. 래더에는 핵산 샘플을 비교할 수 있는 다양한 크기의 마커가 포함될 수 있다. 래더마다 크기 범위와 해상도가 다를 수 있다. 예를 들어 50베이스 래더에는 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 및 600베이스에 마커가 있을 수 있다. 상기 래더는 50 및 600 개 염기의 크기 범위 내에서 핵산을 검출하고 선택하는 데 유용할 수 있다. 래더는 샘플에서 다양한 크기의 핵산 농도를 추정하기 위한 표준으로도 사용할 수 있다.
핵산 샘플 및 래더는 겔 전기 영동(또는 크로마토 그래피) 공정을 용이하게하기 위해 로딩 버퍼와 혼합될 수 있다. 로딩 버퍼에는 핵산의 이동을 추적하는 데 도움이되는 염료와 마커가 포함될 수 있다. 로드 버퍼가 상기 런닝 버퍼(예 TAE 또는 TBE)보다 조밀(예: 글리세롤) 시약을 포함할 수 있다, 핵산 샘플을 런닝 버퍼에 빠져들 수 있다 샘플 로딩 웰의 저부(침몰 보장).로딩 버퍼는 SDS 또는 요소와 같은 변성제를 추가로 포함할 수 있다. 로딩 버퍼는 핵산의 안정성을 개선하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 로딩 버퍼는 뉴 클레아 제로부터 핵산을 보호하기 위해 EDTA를 포함할 수 있다.
일부 구현에서, 겔은 핵산에 결합하고 다양한 크기의 핵산을 광학적으로 검출하는 데 사용될 수 있는 얼룩을 포함할 수 있다. 얼룩은 dsDNA, ssDNA 또는 둘 다에 대해 특이적일 수 있다. 다른 얼룩은 다른 겔 물질과 호환될 수 있다. 일부 얼룩은 시각화하기 위해 광원(또는 전자기파)의 여기가 필요할 수 있다. 광원은 UV(자외선) 또는 청색광일 수 있다. 일부 구현에서는 전기 영동 전에 겔에 얼룩을 추가할 수 있다. 다른 구현에서는 전기 영동 후 겔에 얼룩을 추가할 수 있다. 얼룩의 예로는 EtBr(Ethidium Bromide), SYBR Safe, SYBR Gold, 은색 얼룩 또는 메틸렌 블루가 있다. 예를 들어 특정 크기의 dsDNA를 시각화하는 신뢰할 수 있는 방법은 SYBR Safe 또는 EtBr 염색과 함께 아가로스 TAE 겔을 사용하는 것이다. 예를 들어 특정 크기의 ssDNA를 시각화하는 신뢰할 수 있는 방법은 메틸렌 블루 또는 은색 얼룩이 있는 요소-폴리 아크릴 아미드 TBE 겔을 사용하는 것이다.
일부 구현에서 겔을 통한 핵산의 이동은 전기 영동 외에 다른 방법에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어 중력, 원심 분리, 진공 또는 압력을 사용하여 겔을 통해 핵산을 구동하여 크기에 따라 분해될 수 있다.
특정 크기의 핵산은 블레이드 또는 면도날을 사용하여 겔에서 추출하여 핵산을 포함하는 겔 밴드를 절제 할 수 있다. 적절한 광학 검출 기술과 DNA 래더를 사용 하여 절제가 특정 밴드에서 정확하게 발생하고 절제시 서로 다른 바람직하지 않은 크기 밴드에 속할 수 있는 핵산을 성공적으로 배제할 수 있다. 겔 밴드를 완충액과 함께 인큐베이션 하여 용해시켜 핵산을 완충액으로 방출할 수 있다. 열 또는 물리적 교반은 용해 속도를 높일 수 있다. 선택적으로, 겔 밴드는 겔 용해를 요구하지 않고 DNA가 완충 용액으로 확산될 수 있을만큼 충분히 긴 완충액에서 인큐베이션될 수 있다. 이어서 완충액은 예를 들어 흡인 또는 원심 분리에 의해 남아있는 고체상 겔로부터 분리될 수 있다. 그런 다음 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전, 자기 비드 포획 및/또는 실리카 멤브레인 흡착, 세척 및 용리와 같은 표준 정제 또는 완충액 교환 기술을 사용하여 핵산을 용액 으로부터 정제할 수 있다. 핵산은 또한 이 단계에서 농축될 수 있다.
겔 절제에 대한 대안으로, 특정 크기의 핵산이 겔에서 흘러 내리도록 함으로써 겔로부터 분리될 수 있다. 이동하는 핵산은 겔에 묻혀 있거나 겔 단부에 있는 분지(또는 웰)를 통과할 수 있다. 특정 크기의 핵산 그룹이 분지에 들어갈 때 샘플 이 분지에서 수집되도록 이동 과정을 시간을 정하거나 광학적으로 모니터링할 수 있다. 수집은 예를 들어 열망에 의해 발생할 수 있다. 그런 다음 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전, 자기 비드 포획 및/또는 실리카 멤브레인 흡착, 세척 및 용리와 같은 표준 정제 또는 완충제 교환 기술을 사용하여 수집된 용액으로부터 핵산을 정제할 수 있다. 핵산은 또한 이 단계에서 농축될 수 있다.
핵산 사이즈 선택을 위한 다른 방법은 질량 분광법 또는 멤브레인 기반의 여과를 포함할 수 있다. 멤브레인 기반 여과의 일부 구현에서, 핵산은 dsDNA, ssDNA 또는 둘 모두에 우선적으로 결합 할 수 있는 멤브레인(예: 실리카 멤브레인)을 통과한다. 멤브레인은 적어도 특정 크기의 핵산을 우선적으로 포획하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 멤브레인은 20, 30, 40, 50, 70, 90 또는 그 이상의 염기의 핵산을 걸러 내도록 설계될 수 있다. 상기 멤브레인 기반 크기 선택 기술은 겔 전기 영동 또는 크로마토 그래피만큼 엄격하지 않을 수 있다.
F.핵산 포획
친화성 태그가 있는 핵산은 핵산 포획을 위한 서열 특이적 프로브로 사용될 수 있다. 그 후, 프로브는 핵산 풀과 함께 인큐베이션되고 표적에 혼성화될 수 있다. 인큐베이션 온도는 혼성화를 촉진하기 위해 프로브의 용융 온도보다 낮을 수 있다. 인큐베이션 온도는 프로브의 용융 온도보다 최대 섭씨 5, 10, 15, 20, 25도 또는 그 이상 낮을 수 있다. 혼성화된 표적은 친화성 태그를 특이 적으로 결합하는 고체상 기질에 포착될 수 있다. 고체상 기질은 멤브레인, 웰, 컬럼 또는 비드일 수 있다. 여러 차례의 세척은 표적에서 모든 비-혼성화 핵산을 제거할 수 있다. 세척은 세척 중에 표적 서열의 안정적인 고정을 촉진하기 위해 프로브의 용융 온도 미만의 온도에서 발생할 수 있다. 세척 온도는 프로브의 용융 온도보다 섭씨 5, 10, 15, 20, 25도 이상 낮을 수 있다. 최종 용출 단계는 고상 기질뿐만 아니라 친화성 태그가 달린 프로브로부터 핵산 표적을 회수할 수 있다. 용출 단계는 핵산 표적의 용출 완충액으로의 방출을 촉진하기 위해 프로브의 용융 온도보다 높은 온도에서 발생할 수 있다. 용출 온도는 프로브의 용융 온도보다 최대 섭씨 5, 10, 15, 20, 25도 이상일 수 있다.
특정 구현에서, 고체상 기질에 결합된 올리고 뉴클레오티드는 예를 들어, 산, 염기, 산화, 환원, 열, 빛, 금속 이온 촉매 작용, 치환 또는 제거 캐미스트리와 같은 조건에 노출되거나 효소 절단에 의해 고체상 기질로부터 제거될 수 있다. 특정 실시예에서, 올리고 뉴클레오티드는 절단 가능한 연결 모이어티를 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 기능화되어 표적화된 올리고 뉴클레오티드에 공유 부착을 위한 절단 가능한 링커를 제공할 수 있다. 일부 실시예에서, 링커 모이어티는 길이가 6 개 이상의 원자일 수 있다. 일부 실시예에서, 절단 가능한 링커는 TOPS(합성 당 2개의 올리고 뉴클레오티드) 링커, 아미노 링커, 또는 광 절단 가능한 링커일 수 있다.
일부 구현에서, 비오틴은 고체상 기질에 스트렙 타비딘에 의해 고정되는 친 화성 태그로 사용될 수 있다. 올리고 뉴클레오티드는 5'또는 3'단부에서 비오틴화될 수 있다. 그들은 또한 티민 잔류 물에서 내부적으로 비오틴화될 수 있다. 올리고에서 증가된 비오틴은 스트렙 타비딘 기질에서 더 강력한 포획으로 이어질 수 있다. 올리고의 3'단부에 있는 비오틴은 PCR 동안 올리고가 확장되는 것을 차단할 수 있다. 비오틴 태그는 표준 비오틴의 변형일 수 있다. 예를 들어, 비오틴 변이체는 비오틴-TEG(트리 에틸렌 글리콜), 이중 비오틴, PC 비오틴, DesthioBiotin-TEG 및 비오틴 Azide일 수 있다. 이중 비오틴은 비오틴-스트렙 타비딘 친화성을 증가시킬 수 있다. 비오틴-TEG는 비오틴 그룹을 TEG 링커에 의해 분리된 핵산에 부착한다. 이것은 비오틴이 핵산 프로브의 기능, 예를 들어 표적에 대한 혼성화를 방해하는 것을 방지할 수 있다.핵산 비오틴 링커도 프로브에 부착될 수 있다. 핵산 링커는 표적에 혼성화하도록 의도되지 않은 핵산 서열을 포함할 수 있다.
비오틴화된 핵산 프로브는 표적에 얼마나 잘 혼성화 할 수 있는지를 고려하여 설계할 수 있다. 더 높은 설계 용융 온도를 가진 핵산 프로브는 표적에 더 강하게 혼성화할 수 있다. 더 긴 핵산 프로브와 더 높은 GC 함량을 가진 프로브는 용융 온도 증가로 인해 더 강하게 혼성화할 수 있다. 핵산 프로브는 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 100 염기 이상의 길이를 가질 수 있다. 핵산 프로브는 GC 함량이 0 ~ 100% 사이일 수 있다. 프로브의 용융 온도가 스트렙 타비딘 기질의 온도 허용 오차를 초과하지 않도록 주의해야 한다. 핵산 프로브는 비 표적 핵산이 있는 헤어핀, 동종이량체 및 이종이량체와 같은 억제 이차 구조를 방지하도록 설계될 수 있다. 프로브 용융 온도와 표적을 벗어난 바인딩 사이에는 절충안이 있을 수 있다. 용융 온도가 높고 표적을 벗어난 결합이 낮은 최적의 프로브 길이 및 GC 함량이 있을 수 있다. 합성 핵산 라이브러리는 핵산이 효율적인 프로브 결합 부위를 포함하도록 설계될 수 있다.
고상 스트렙 기질은 마그네틱 비드일 수 있다. 마그네틱 비드는 마그네틱 스트립 또는 플레이트를 사용하여 고정될 수 있다. 마그네틱 스트립 또는 플레이트는 마그네틱 비드를 컨테이너에 고정시키기 위해 컨테이너와 접촉할 수 있다. 반대로, 자기 스트립 또는 플레이트는 용기 벽으로부터 용액으로 자기 비드를 방출하기 위해 용기로부터 제거될 수 있다. 다른 비드 속성이 적용에 영향을 미칠 수 있다. 구슬은 다양한 크기를 가질 수 있다. 예를 들어 비드는 직경이 1 ~ 3 마이크로 미터(um) 사이일 수 있다. 비드는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 마이크로 미터 이상의 직경을 가질 수 있다. 비드 표면은 소수성이거나 친수성일 수 있다. 비드는 차단 단백질, 예를 들어 BSA 로 코팅될 수 있다. 사용하기 전에 비드가 비특이적으로 결합하는 핵산을 방지하기 위해 차단 용액과 같은 첨가제로 비드를 세척하거나 사전 처리할 수 있다.
비오틴화된 프로브는 핵산 샘플 풀과 함께 인큐베이션하기 전에 자기 스트렙 타비딘 비드에 커플링될 수 있다. 상기 프로세스는 직접 캡처라고 할 수 있다. 선택적으로, 비오틴화된 프로브는 자기 스트렙 타비딘 비드를 첨가하기 전에 핵산 샘플 풀과 함께 인큐베이션될 수 있다. 상기 프로세스는 간접 캡처라고 할 수 있다. 간접 캡처 방법은 목표 수율을 향상시킬 수 있다. 더 짧은 핵산 프로브는 마그네틱 비드에 결합하는 데 더 짧은 시간이 필요할 수 있다.
핵산 시료 핵산 프로브의 최적인큐베이션은 1 내지 10도 섭씨 이상인 프로브의 용융 온도 이하의 온도에서 일어날 수 있다. 인큐베이션 온도는 섭씨 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 이상일 수 있다. 권장 인큐베이션 시간은 1 시간이다.인큐베이션 시간은 최대 1, 5, 10, 20, 30, 60, 90, 120 분 또는 그 이상일 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간은 더 나은 포획 효율로 이어질 수 있다. 비오틴-스트렙 타비딘 커플링을 허용하기 위해 스트렙 타비딘 비드를 추가한 후 추가 10 분의 인큐베이션이 발생할 수 있다. 상기 추가 시간은 최대 1, 5, 10, 20, 30, 60, 90, 120 분 또는 그 이상일 수 있다. 인큐베이션은 나트륨 이온과 같은 첨가제와 함께 완충 용액에서 발생할 수 있다.
핵산 풀이 단일 가닥 핵산(이중 가닥과 반대)인 경우 프로브의 표적에 대한 혼성화가 개선될 수 있다. dsDNA 풀에서 ssDNA 풀을 준비하는 것은 풀에 있는 모든 핵산 서열의 가장자리에 일반적으로 결합하는 하나의 프라이머로 선형 PCR을 수행하는 것을 수반할 수 있다. 핵산 풀이 합성 적으로 생성되거나 조립된 경우이 공통 프라이머 결합 부위가 합성 디자인에 포함될 수 있다. 선형-PCR의 제품은 ssDNA 이다. 더 많은 사이클의 선형 PCR로 핵산 포획을 위한 더 많은 시작 ssDNA 템플릿이 생성될 수 있다.
핵산 프로브가 표적에 혼성화되고 자성 스트렙 타비 딘 비드에 결합된 후, 비드는 자석에 의해 고정될 수 있고 몇 차례의 세척이 발생할 수 있다. 비 표적 핵산을 제거하는 데 3 ~ 5 번의 세척으로 충분할 수 있지만, 더 많거나 적은 라운드의 세척이 사용될 수 있다. 각 증분 세척은 비 표적 핵산을 추가로 감소시킬 수 있지만 표적 핵산의 수율을 감소시킬 수도 있다. 세척 단계 동안 표적 핵산의 프로브에 대한 적절한 혼성화를 촉진하기 위해 낮은 인큐베이션 온도를 사용할 수 있다. 60, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5도 이하의 낮은 온도를 사용할 수 있다. 세척 완충액은 나트륨 이온을 포함하는 Tris 완충 용액을 포함할 수 있다.
자기 비드 결합 프로브로부터 혼성화된 표적의 최적 용출은 프로브의 용융 온도와 동일하거나 그 이상의 온도에서 발생할 수 있다. 온도가 높을수록 대상과 프로브의 해리가 촉진된다. 용출 온도는 최대 섭씨 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90도 이상일 수 있다. 용출 인큐베이션 시간은 최대 1, 2, 5, 10, 30, 60 분 또는 그 이상일 수 있다. 일반적인 인큐베이션 시간은 약 5 분이지만 더 긴 인큐베이션 시간은 수율을 향상시킬 수 있다. 용출 완충액은 물 또는 EDTA와 같은 첨가제가 포함된 트리스 완충 용액일 수 있다.
하나 이상의 별개의 부위 세트를 포함하는 표적 서열의 핵산 포획은 이들 부위 각각에 대해 다수의 별개의 프로브를 사용하여 하나의 반응에서 수행될 수 있다. 별개의 부위 세트의 모든 부재를 포함하는 표적 서열의 핵산 포획은 일련의 포획반응으로 수행될 수 있으며, 특정 부위에 대한 프로브를 사용하여 각 별개 부위에 대해 하나의 반응이 수행될 수 있다. 일련의 포획 반응 후 표적 수율은 낮을 수 있지만 포획된 표적은 이후 PCR 로 증폭될 수 있다. 핵산 라이브러리가 합성 적으로 설계된 경우 PCR을 위한 공통 프라이머 결합 부위를 사용하여 표적을 설계할 수 있다.
합성 핵산 라이브러리는 일반적인 핵산 포획을 위해 공통 프로브 결합 부위와 함께 생성되거나 조립될 수 있다. 이러한 공통 부위는 조립 반응에서 완전히 조립되거나 잠재적으로 완전히 조립된 핵산을 선택적으로 포착 하여 부분적으로 조립되거나 잘못 조립된(또는 의도하지 않거나 바람직하지 않은) 이중 생성물을 필터링하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 조립은 완전히 조립된 핵산 제품 만이 각 프로브를 사용하여 일련의 2개의 포획 반응을 통과하는 데 필요한 2개의 필수 프로브 결합 부위를 포함하도록 각 에지 서열에 프로브 결합 부위가 있는 핵산을 조립하는 것을 포함할 수 있다. 상기 예에서, 부분적으로 조립된 제품은 탐침 부위를 포함하지 않거나 하나만 포함할 수 있으므로 궁극적으로 캡처해서는 안된다. 마찬가지로 잘못 조립된(또는 의도하지 않았거나 바람직하지 않은) 제품은 에지 시퀀스 중 하나도 포함하지 않거나 하나만 포함 할 수 있다. 따라서 잘못 조립된 제품은 궁극적으로 포착되지 않을 수 있다. 엄격함을 높이기 위해 조립되는 각 구성 요소에 공통 프로브 결합 부위를 포함 할 수 있다. 각 구성 요소에 대한 프로브를 사용하는 후속 일련의 핵산 포획 반응은 조립 반응의 임의의 부산물로부터 완전히 조립된 제품(각 구성 요소 포함)만을 분리할 수 있다. 후속 PCR은 표적 농축을 개선할 수 있으며 후속 크기 선택은 표적 엄격 성을 개선할 수 있다.
일부 구현에서, 핵산 포획은 풀로부터 핵산의 표적화된 서브 세트를 선택적으로 포획하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 표적화된 핵산 서브 세트에만 나타나는 결합 부위가있는 프로브를 사용한다. 합성 핵산 라이브러리는 해당되는 잠재적인 하위 라이브러리에 속하는 핵산이 보다 일반적인 라이브러리에서 하위 라이브러리를 선택적으로 캡처하기 위해 공통 프로브 결합 부위(서브 라이브러리 내에서 공통적이지만 다른 하위 라이브러리와 구별됨)를 모두 공유하도록 만들거나 조립될 수 있다.
G.동결 건조
동결 건조는 탈수 공정이다. 핵산과 효소는 모두 동결 건조될 수 있다.동결 건조된 물질은 더 긴 수명을 가질 수 있다. 동결 건조 과정을 통해 기능성 제품(예: 활성 효소)을 유지하기 위해 화학적 안정제와 같은 첨가제를 사용할 수 있다.수크로스 및 트레할로스와 같은 이당류는 화학적 안정제로 사용될 수 있다.
H.DNA 설계
합성 라이브러리(예를 들어, 식별자 라이브러리)를 구축하기 위한 핵산(예를 들어, 구성 요소)의 서열은 합성, 시퀀싱 및 조립 합병증을 방지하도록 설계될 수 있다. 또한 합성 라이브러리를 구축하는 비용을 줄이고 합성 라이브러리가 저장될 수 있는 수명을 개선하도록 설계될 수 있다.
핵산은 합성하기 어려울 수 있는 긴 줄의 단일 중합체(또는 반복된 염기 서열)를 방지하도록 설계될 수 있다. 핵산은 길이가 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상인 단일 중합체를 피하기 위해 설계될 수 있다. 더욱이, 핵산은 합성 과정을 억제할 수 있는 헤어핀 루프와 같은 2 차 구조의 형성을 방지하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 예측 소프트웨어를 사용 하여 안정적인 2 차 구조를 형성 하지 않는 핵산 서열을 생성할 수 있다. 합성 라이브러리 구축을 위한 핵산은 짧게 설계할 수 있다. 더 긴 핵산은 합성하기가 더 어렵고 비용이 많이들 수 있다. 더 긴 핵산은 합성 중에 돌연변이 가능성이 더 높을 수 있다. 핵산(예를 들어, 구성 요소)은 최대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 또는 그 이상의 염기일 수 있다.
조립 반응에서 구성 요소가되는 핵산은 조립 반응을 용이하게 하도록 설계될 수 있다. 효율적인 조립 반응에는 일반적으로 인접한 구성 요소 간의 혼성화가 포함된다. 서열은 잠재적인 표적 외 혼성화를 피하면서 이러한 표적 상 혼성화 이벤트를 촉진하도록 설계될 수 있다. 잠긴 핵산(LNA)과 같은 핵산 염기 변형을 사용 하여 표적 혼성화를 강화할 수 있다. 이러한 변형된 핵산은 예를 들어 스테이플 가닥 결찰의 스테이플 또는 점착성 가닥 결찰의 점착 단부로 사용될 수 있다. 합성 핵산 라이브러리(또는 식별자 라이브러리)를 구축하는 데 사용할 수 있는 다른 변형된 염기에는 2,6-Diaminopurine, 5-Bromo dU, deoxyUridine, inverted dT, inverted diDeoxy-T, Dideoxy-C, 5-Methyl dC, deoxylnosine, Super T, Super G 또는 5-Nitroindole이 포함된다. 핵산은 하나 또는 여러 개의 동일하거나 다른 변형된 염기를 포함 할 수 있다. 상기 변형된 염기 중 일부는 더 높은 용융 온도를 갖는 천연 염기 유사체(예: 5- 메틸 dC 및 2,6- 디아 미노 퓨린)이므로 조립 반응에서 특정 혼성화 이벤트를 촉진하는 데 유용할 수 있다. 상기 변형된 염기 중 일부는 모든 천연 염기에 결합 할 수 있는 범용 염기(예: 5- 니트로 인돌)이며, 따라서 바람직한 결합 부위 내에 가변 서열을 가질 수 있는 핵산과의 혼성화를 촉진하는 데 유용할 수 있다. 조립 반응에서 유익한 역할 외에도 이들 변형된 염기는 프라이머(예를 들어, PCR 용) 및 프로브(예를 들어, 핵산 포획용)에서 유용할 수 있는데, 이는 핵산 풀 내에서 프라이머 및 프로브의 표적 핵산에 대한 특이적 결합을 촉진할 수 있기 때문이다.
염기 서열 분석을 용이하게 하기 위해 핵산을 설계할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 2 차 구조, 동종 중합체의 스트레치, 반복적인 서열 및 GC 함량이 너무 높거나 낮은 서열과 같은 전형적인 서열화 합병증을 방지하도록 설계될 수 있다. 특정 시퀀서 또는 서열화 방법은 오류가 발생할 수 있다. 합성 라이브러리(예: 식별자 라이브러리)를 구성하는 핵산 서열(또는 구성 요소)은 서로 특정 해밍 거리로 설계될 수 있다. 이러한 방식으로 염기 분해능 오류가 서열화에서 높은 비율로 발생하더라도 오류를 포함하는 서열의 스트레치는 여전히 가장 가능성이 높은 핵산(또는 구성 요소)에 다시 매핑될 수 있다. 핵산 서열은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 개 이상의 염기 돌연변이의 해밍 거리로 설계될 수 있다.해밍 거리로부터의 대체 거리 측정법을 사용 하여 설계된 핵산 사이의 최소 필수 거리를 정의할 수도 있다.
일부 서열화 방법 및 도구는 어댑터 서열 또는 프라이머 결합 부위로서 특정 서열을 포함하는 핵산의 입력을 요구할 수 있다. 이들 서열은 "방법 특정 서열"로 지칭될 수 있다. 상기 서열화 기기 및 방법에 대한 전형적인 준비 워크 플로우는 방법 특정 서열을 핵산 라이브러리에 조립하는 것을 포함할 수 있다. 그러나 합성 핵산 라이브러리(예: 식별자 라이브러리)가 특정 기기 또는 방법으로 시퀀싱될 것이라는 것이 미리 알려진 경우, 그런 다음 이러한 방법 특이적 서열은 라이브러리(예: 식별자 라이브러리)를 구성하는 핵산(예: 구성 요소)으로 설계될 수 있다. 예를 들어, 서열화 어댑터는 합성 핵산 라이브러리의 부재가 개별 핵산 구성 요소으로부터 자체적으로 조립될 때와 동일한 반응 단계에서 합성 핵산 라이브러리의 부재에 조립될 수 있다.
핵산은 DNA 손상을 촉진 할 수 있는 서열을 피하기 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 부위 특이 적 뉴 클레아 제에 대한 부위를 포함하는 서열은 피할 수 있다. 또 다른 예로서, UVB(자외선-B) 광은 인접한 티민 이 피리 미딘 이량 체를 형성하게 하여 서열화 및 PCR을 억제할 수 있다. 따라서 합성 핵산 라이브러리가 UVB에 노출된 환경에 저장되도록 의도된 경우, 인접한 티민(즉, TT)에 대한 핵산 서열을 설계하는 것이 유용할 수 있다.
식별자 라이브러리 구축 시스템
상술한 바와 같이, 프린터-피니셔 시스템(또는 PFS)으로 알려진 인쇄 기반 시스템을 사용하여 식별자 구성을 위한 구성 요소를 배치하고 조립할 수 있다.
다음을 포함하는 정보 저장을 위한 하나 이상의 구성 요소로부터의 식별자를 조립하기 위한 시스템이 제공된다:(a) 각각 하나이상의 구성 요소가 핵산 서열을 포함하는 하나이상의 구성 요소를 기질에 분배하기 위한 프린터; 및(b) 상기 기질 상에 상기 하나 이상의 구성 요소를 조립하기 위한 피니셔, 상기 피니셔는 하나 이상의 핵산 서열을 물리적으로 연결하는데 필요한 반응 혼합물 및/또는 조건을 제공한다.
일부 구현에서, 상기 프린터는 복수의 프린트 헤드를 더 포함하고, 상기 복수의 각 프린트 헤드는 하나 이상의 구성 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 프린터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상의 프린트 헤드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 각각의 프린트 헤드는 상이한 구성 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 프린트 헤드는 적어도 하나의 노즐을 포함한다. 일부 구현예에서, 각 프린트 헤드는 노즐 열을 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 프린트 헤드는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 노즐의 열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프린트 헤드는 각각 동일한 잉크를 분배하는 노즐 세트로 간주될 수 있다. 일부 실시예에서, 노즐 열은 동일한 잉크를 분배한다. 일부 구현예에서, 노즐 열의 특정 노즐 서브 세트는 상기 노즐 열의 다른 노즐과 다른 잉크를 분배한다. 일부 구현예에서, 노즐 열은 적어도 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 그 이상의 노즐을 포함한다. 일부 실시예에서, 노즐 열의 노즐 중 일부 또는 전부는 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 프린트 헤드는 상기 구성 요소를 포함하는 액적을 상기 기질 상에 분배한다. 일부 구현예에서, 상기 프린트 헤드는 상기 기질 상에 반응 혼합물을 포함하는 액적을 분배한다. 일부 구현예에서, 상기 액적은 부피가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 피코 리터이다. 일부 구현예에서, 상기 액적은 부피가 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 80 피코 리터이다. 일부 구현예에서, 상기 프린터는 프린터베이스를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 프린터는 레지스터, 스팟 이미저, 및/또는 스팟 건조기를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 구성 요소는 용액 내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 구성 요소는 건식 구성 요소이다. 일부 구현예에서, 상기 반응 혼합물은 리가아제를 포함한다 .리가아제는 핵산 서열을 포함하는 다른 구성 요소를 연결하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조건은 온도 조건이다. 일부 구현예에서, 상기 기질은 선형 이동으로 상기 프린터 및/또는 상기 피니셔를 통과한다. 일부 구현예에서, 상기 선형 운동은 릴 대 릴 시스템에 의해 제어된다. 일부 구현예에서, 상기 스팟 이미저는 카메라이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 구성 요소는 염료를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 반응 혼합물은 염료를 포함한다. 염료는 모든 핵산 염료일 수 있다. 염료는 가시적 염료일 수 있다.
일부 구현에서, 상기 기질은 중합체 물질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 프린트 헤드는 MEMS(마이크로 전자 기계 시스템) 박막 피에조 잉크젯 헤드 또는 MEMS 열 잉크젯 헤드이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 구성 요소는 첨가제를 포함한다. 일부 구현예에서, 첨가제는 상기 프린트 헤드 와 상기 하나 이상의 구성 요소의 호환성을 제공한다. 일부 구현예에서, 첨가제는 용질, 보습제 또는 계면 활성제이다. 일부 구현예에서, 상기 스팟 이미저는 라인 스캔 검사 원리를 사용한다. 일부 구현예에서, 상기 피니셔는 피니셔베이스를 더 포함한다.
일부 구현에서, 상기 피니셔는 스팟 가습기, 스팟 이미저 및/또는 풀링 서브 시스템을 더 포함한다. 일부 구현에서, 상기 피니셔는 프린트 헤드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 피니셔의 프린트 헤드는 적어도 1 pL, 5 pL, 10 pL, 50 pL, 100 pL 또는 200 pL을 갖는 부피를 분배한다. 일부 구현예에서, 상기 피니셔는 반응 인큐베이션에 최적인 고정된 내부 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 피니셔는 롤러 루프를 포함한다.
프린터 베이스 시스템
PFS는 각각 하나 이상의 핵산 분자를 기질 상에 프린팅할 수 있는 하나 이상의 프린트 헤드의 사용을 포함할 수 있다. 생성될 식별자 라이브러리가 주어지면, 주어진 비트 스트림을 인코딩하는 모든 식별자를 조립하는 작업은 각 서브작업이 식별자 라이브러리의 일부를 생성하는 것을 포함하는 서브작업으로 분할될 수 있다. 상기 부분은 식별자 라이브러리의 "섹터" 라고 할 수 있다. 섹터의 크기는 PFS에 의한 섹터 생성의 오류가 PFS에 의해 감지되거나 수정될 수 있도록 선택될 수있다. 오류는 오작동하는 프린트 헤드, 프린팅 중 또는 이후에 의도하지 않은 구성 요소 혼합, 프린트 헤드에 의해 분배되는 시약 또는 핵산의 양의 변화, 프린트 헤드와 기질의 대상 좌표(또는 스팟) 사이의 정렬 불량, 높은 온도로 인한 건조 또는 습윤 또는 낮은 습도를 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 원인으로 인해 발생할 수 있다. 이러한 원인 중 일부는 생성 할 하나 이상의 식별자가 생성되지 않는 오류로 이어질 수 있다. 이러한 유형의 오류를 식별자 누락 오류라고 할 수 있다.
원인에 따라 일부 누락된 식별자 오류가 PFS에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, PFS는 하나 이상의 카메라를 사용하여 인쇄된 섹터의 전체 또는 일부를 자동으로 검사할 수 있다. PFS는 연속적으로 또는 프로그램 가능한 간격으로 각 인쇄된 섹터의 하나 이상의 이미지를 캡처하고 지정된 각 반응이 기질에 인쇄되었는지 여부를 검출하기 위해 이러한 이미지를 계산 처리할 수 있다. 다른 실시예에서, PFS는 연속적으로 또는 프로그램 가능한 간격으로 하나 이상의 프린트 헤드상의 하나 이상의 노즐을 모니터링하고 기질에 대한 반응을 인쇄할 때 노즐의 이미지 또는 비디오를 캡처 할 수 있다. 모니터링 카메라는 가시 광선이나 다른 주파수 대역의 빛을 사용할 수 있다. 다른 실시예에서, PFS는 기질의 테스트 영역에 있는 모든 프린트 헤드상의 모든 노즐로부터 하나 이상의 테스트 패턴을 주기적으로 인쇄할 수 있다. PFS는 스팟 이미저, 카메라 또는 분석 가능한 출력이 있는 기타 장치를 사용하여 테스트 패턴 인쇄의 결과를 시각적으로 캡처하거나 분석할 수 있다. 다른 실시 예에서, PFS는 예를 들어 겔 전기 영동과 같은 하나 이상의 화학적 검증 방법을 사용하여 테스트 패턴을 인쇄하고 분석 할 수 있다.
시각적 분석 후, PFS가 모든 지정된 식별자를 조립하는 데 필요한 일부 또는 모든 구성 요소가 반응으로 인쇄되지 않았다고 결론을 내리면 PFS는 이 결론을 오류 로그에 보고 할 수 있다. PFS를 제어하는 제어 소프트웨어는 인쇄 중에 또는 나중에이 로그를 계속 분석하고 누락된 식별자 오류가 포함된 섹터를 다시 인쇄하도록 선택할 수 있다. 로그에서 제어 소프트웨어는 오작동하는 프린트 헤드 또는 노즐을 식별하고 예비 프린트 헤드 또는 노즐을 사용하여 나머지 섹터를 인쇄할 수 있다. 일실시예에서, 제어 소프트웨어는 또한 그러한 불완전한 섹터가 최종 식별자 라이브러리에 포함되지 않도록 다운 스트림 처리 단계에서 식별자 오류가 누락된 섹터를 제외할 수 있다.
조립될 식별자 라이브러리가 지정되고 사양 파일 세트를 통해 PFS로 전송된다. 생성될 식별자 라이브러리는 블록이라고하는 더 작은 유닛 세트로 지정될 수 있다. 사양 파일은 DNA 구성 요소에서 식별자 라이브러리를 어셈블하는 데 사용되는 스키마가 포함된 쓰기 사양 파일, 스키마 별 매개 변수 목록 및 블록 사양 파일 이름 목록으로 구성된다. 블록 사양은 블록 메타 데이터 파일과 블록 데이터 파일을 포함할 수 있다. 블록 메타 데이터 파일은 길이, 해시 및 기타 생성자 정의 매개 변수와 같은 블록에 대한 정보를 설명한다. 블록 데이터 파일은 PFS에서 생성 할 식별자 집합을 지정한다. 블록 데이터 파일은 데이터 압축 알고리즘을 사용하여 압축될 수 있다. 블록을 구성하는 식별자는 트리, 트라이, 목록 또는 비트 맵과 같은(이에 국한되지 않음) 직렬화된 데이터 구조의 형태로 지정될 수 있다.
예를 들어, 제품 스킴을 사용하여 생성할 식별자 라이브러리는 컴포넌트 라이브러리 파티션 스킴을 포함하는 블록 메타 데이터 파일과 각 레이어에서 사용 가능한 컴포넌트의 이름 목록으로 지정될 수 있다.
블록 데이터 파일에는 생성될 식별자가 루트에서 트리 리프까지의 각 경로는 식별자를 나타내고 경로를 따라 각 노드는 해당 식별자의 해당 계층에서 사용할 구성 요소 이름을 지정하는 직렬화된 트라이 데이터 구조로 구성될 수 있다. 블록 데이터 파일은 루트부터 시작하여 각 노드의 왼쪽 자식 노드를 방문한 다음 노드 자체를 방문한 다음 오른쪽 자식 노드를 방문하는 순서로 순회 하여이 트라이의 직렬화를 포함할 수 있다.
PFS는 수신 사양 파일에 대한 입력 큐를 모니터링할 수 있다. 새 사양을 감지하면 PFS는 쓰기 사양을 읽고 적절한 프린트 헤드 또는 노즐에 공급되는 필요한 구성 요소를 사용하여 자체적으로 프로그래밍할 수 있다. PFS는 블록 메타 데이터 및 데이터 파일을 읽고 이를 처리하여 프린트 헤드에 대한 인쇄 지침을 생성할 수 있다. PFS는 각 블록에 대한 이러한 명령을 프린트 헤드로 보내고 프린트 헤드에서 각 섹터에 대한 상태 정보를 얻을 수 있다. 올바르게 또는 완전하게 인쇄하지 못한 섹터는 로그에 보고되고 자동으로 다시 인쇄될 수 있다.
예시적인 PFS
도 1은 잉크젯 프린팅, 예를 들어 열 잉크젯 프린팅, 버블 잉크젯 프린팅 및 압전 잉크젯 프린팅을 사용하여 신속하고 높은 처리량 방식으로 구성 요소로부터 DNA 식별자를 조립하여 DNA에 디지털 정보를 저장하는 시스템을 설명한다. 일부 구현에서, 2개의 서브 시스템(120, 130)은 개별 기능을 위해 부착되고 서로 의존할 수 있다. 다른 구현에서, 2개의 서브 시스템(120, 130)은 분리될 수 있고 독립적으로 기능할 수 있다.
프린터(120)는 각각 용액에 DNA 구성 요소(또는 copts)를 포함하거나 일부 구현에서 건조된 DNA 구성 요소을 포함하는 프린트 헤드(122)의 열을 포함한다. 우리는 별개의 DNA 구성 요소의 각 수용액을 "잉크" 또는 "색상"이라고 부를 수 있다. 프린트 헤드(122)는(주문형 방식으로)프로그래밍 가능하게 pL- 스케일 액적을 기질(또는 웹 또는 웨빙)의 좌표에 분배할 수 있다. 좌표는 직경/간격 1 마이크로 미터(um), 직경/간격 10um, 직경/간격 50um, 직경/간격 100um, 직경/간격 150um, 직경/간격 200um 이상이다. 프린터 시스템(120)에 대한 입력은 수성 구성 요소/기질을 포함한다. 프린터 시스템(120)으로부터의 출력은 기질상의 건식 다층 스팟을 포함한다. 프린터(120)의 환경은 건조(증발성)할 수 있다.
피니셔(130)는 구성 요소를 식별자로 조립하기 위한 반응 혼합물(예를 들어, 리가 제 혼합물)을 분배하기 위한 기구 부품(예를 들어, 프린트 헤드)을 포함한다. 피니셔 시스템(130)에 대한 입력 피니셔(130)는 기질(또는 웹 또는 웨빙)의 각 좌표 상에 반응 혼합물을 분배할 수 있다. 피니셔(130)는 기질으로부터 조립된 식별자를 단일 풀(132)로 통합하기 전에 반응을 인큐베이션하여 조립을 가능하게 할 수 있다. 일부 구현에서, 반응 혼합물은 피니셔가 아닌 프린터의 일부로 분배될 수 있다. 다른 구현에서, 반응 혼합물은 DNA 구성 요소 이전에 각 좌표에 분배될 수 있다. 일부 실시예에서, 가시적인 염료가 반응 혼합물에 포함될 수 있다.
기질(또는 웹)(136)은 선형(1 차원) 이동으로 프린터 및 피니셔를 자동으로 통과할 수 있다. 일정한 속도의 선형 운동은 릴-릴 시스템(롤러 대 롤러)(134)에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현에서, 일정한 속도의 선형 운동은 재순환 또는 연속적인 웨빙으로 달성될 수 있다. 일부 실시예에서, 스네일 경로를 따라 웨빙을 사용하여 일정한 속도로 선형 운동을 수행할 수 있다. 예를 들어, 도 7을 참조하라. 일부 구현예에서, 일정한 속도의 선형 운동은 나선형 경로를 따르는 웨빙을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 구현에서, 일정한 속도의 선형 운동은 180˚ 비틀림 경로를 따르는 웨빙을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 웨빙은 시스템과 함께 각 롤러에서 180도 회전하며, 여기서 웨빙은 모든 롤러를 오른쪽 위로 통과한다. 다른 구현에서, 기질은 고정될 수 있고 프린트 헤드는(예를 들어 래스터 패턴으로) 2 차원으로 기질 위로 이동할 수 있다.
도 2는 프린터 서브 시스템(120)을 더 상세히 도시한다. 프린터베이스(121)는 인쇄 엔진(122), 스팟 이미저(126) 및 스팟 건조기(128)를 호스팅하는 웹 드라이브를 갖는 프린터베이스를 포함한다. 인쇄 엔진은 어드레싱 방식을 지원하기 위해 인쇄 및 오버 프린트한다. 프린트 엔진(122)은 프린트 헤드를 포함할 수 있다.프린트 헤드는 웹(136)상의 동일한 좌표에 서로 다른 구성 요소를 겹쳐 인쇄하거나 배치하거나 오버레이하도록 설계된다. 단일 노즐, 단일 프린트 헤드, 복수의 노즐, 복수의 프린트 헤드 또는 이들의 임의의 조합은 동일한 좌표에 구성 요소를 오버 프린트할 수 있다. 프린트 헤드에 추가하여, 프린터는 선택적으로 레지스터(124), 스팟 이미저(126) 및 스팟 건조기(128)를 포함할 수 있다.
등록은 스팟 정렬(다중 패스 시스템 인 경우)이 포함된다. 레지스터(124)는 기질과 프린트 헤드의 좌표 사이의 정렬을 유지하기 위한 것이다. 이는 레지스터가 실시간으로 기질의 움직임을 추적할 수 있도록하는 특수 마킹으로 기질에 라벨을 지정 함으로써 달성될 수 있다. 다른 구현에서, 등록은 롤러상의 인코더로부터 기질 위치를 데 드레 코닝 함으로써 달성될 수 있다. 웹을 따른 정렬 제어는 프린트 헤드에서 디스펜스 작업을 타이밍하여 수행할 수 있다. 웹을 가로 질러 정렬 하려면 액추에이터를 사용하여 기질 또는 프린트 헤드를 이동해야할 수 있다.
스팟 이미저(126)는 구성 요소 추가의 인증을 제공한다. 스팟 이미저(126)는 구성 요소 또는 반응 혼합물의 적절한 분배를 확인하기 위한 카메라일 수 있다. 스팟 이미저(126)의 기능을 용이하게 하기 위해, 가시 염료가 구성 요소 잉크 또는 반응 혼합물에 포함될 수 있다.
스팟 건조기(128)는 인쇄된 액적을 건조 시키도록 의도되어, 인쇄 헤드 사이에서 또는 프린터에서 나올 때(예를 들어, 기질이 프린터에서 나올 때 말려지도록 의도된 경우) 건조될 수 있다. 프린트 헤드 사이의 액적 건조는 오버 프린팅 프로세스 동안 특정 좌표에서 액체가 넘쳐나는 것을 방지하는 데 유용할 수 있다. 각 프린트 헤드는 적어도 1 pL, 5 pL, 10 pL, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pL 또는 그 이상의 액적을 분사할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 1, 5, 10, 20, 50, 100 개 또는 그 이상의 프린트 헤드가 동일한 좌표로 분배될 수 있다.
프린터 서브 시스템은 선택적으로 기질 및 코팅 모듈(129)을 포함할 수 있다. 기질 및 코팅 모듈(129)은 웹 재료와 코팅/패터닝을 포함한다. 기질은 재료를 포함하거나 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 또는 폴리프로필렌과 같은 저결합 플라스틱과 같은 재료로 코팅될 수 있다.
도 3A-D는 프린터(예를 들어, 도 1의 프린터(120)) 내의 프린트 헤드(300)의 예를 도시한다. 프린트 헤드에는 1, 2, 3, 4 개 이상의 잉크(다른 구성 요소 용액)가 포함될 수 있다. 상기 특정 예에서, 우리는 노즐의 각 열에 제공된 하나의 잉크 와 함께 최대 4개의 잉크를 포함할 수 있는 프린트 헤드(300)를 고려한다. 또한 프린트 헤드에는 잉크 당 여러개의 노즐(예: 300개의 노즐)이 포함될 수 있다. 특정 예에서, 노즐이 적절하게 정렬되지 않아 각 잉크가 프린트 헤드를 선형으로 통과하는 기질의 동일한 좌표에 오버 프린트될 수 있기 때문에 일부 또는 모든 노즐에 의해 어드레스 지정 가능한 웹 좌표 세트가 분리될 수 있다. 또는, 다른 잉크에 대한 노즐을 적절히 소정의 피치로 인쇄 이격되지 않을 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 프린트 헤드는 원하는 피치로 구성 요소 잉크를 중복 인쇄할 수 있도록(웹의 움직임에 따라) 비스듬히 장착할 수 있다. 도 3B-D에 도시된 바와 같이, ~ 9도 회전은 167 um 피치로 4개의 잉크를 중복 인쇄 할 수 있기에 충분하다. 구체적으로, 도 3C는 4 열의 프린터 헤드 노즐(302, 304, 306, 308)을 도시한다. 각각의 열(302, 304, 306, 208)은 상이한 구성 요소를 분배할 수 있다. 기질(312)(화살표(312)로 가리키는 선으로부터 대각선으로 위쪽으로 그리고 오른쪽으로 연장됨)은 프린트 헤드(300) 아래에서 선형으로 이동된다. 프린트 헤드의 8.7도 회전으로 인해, 기질(312)상의 좌표(314)는 라인(307)을 따라 열(302, 304, 306, 308)의 노즐 바로 아래를 통과하여 각 노즐이 좌표(314) 상에 구성 요소를 증착 할 수 있다. 도 3D에 도시된 바와 같이, 다수의 프린트 헤드(300, 310, 320)는 다수의 기질에 동시에 인쇄할 수 있도록 병렬로 배열될 수 있다. 예에서, 프린트 헤드는 오버 프린팅에 적합한 정렬로 가져오도록 작동될 수 있다. 프린트 헤드는 MEMS(미세 전자 기계 시스템) 박막, 피에조 잉크젯 헤드 또는 MEMS 열 잉크젯 헤드일 수 있다. 프린트 헤드 와의 호환성을 용이하게 하기 위해 구성 요소 잉크에 첨가제를 추가할 수 있다. 예를 들어, 트리스와 같은 용질을 첨가 하여 전도도를 높일 수 있다. 예를 들어, 습윤제 또는 계면 활성제(예: 글리세롤)를 추가하여 배출 품질 및 프린트 헤드 노즐 수명을 개선할 수 있다.
도 4는 프린터 내의 프린트 헤드의 잠재적 배열을 묘사한다. 기질이 세로 방향으로 통과하여 서로 다른 트랙(T1 ~ T4)의 프린트 헤드가 독립적인 좌표로 인쇄되지만 동일한 트랙을 따라있는 프린트 헤드는 기질의 동일한 좌표(오버 프린팅)에 인쇄될 수 있다. 기질은 좌표 당 더 많은 DNA 구성 요소를 받기 위해 매번 새 프린트 헤드(또는 새 잉크로 채워진 동일한 프린트 헤드)로 프린터를 여러번 통과할 수 있다. 그러나 각 트랙을 따라 충분한 수의 프린트 헤드가 배치되면 원하는 수의 식별자를 구축할 수 있도록 충분한 수의 구성 요소를 통합하는 데 필요한 모든 것이 단일 패스일 수 있다. 예를 들어, 식별자가 각각 8 개 구성 요소의 10 개 레이어로 구성된 제품 체계에서 구성되고(기가비트 데이터를 저장하기에 충분한 810 개의 식별자 사용) 각 프린트 헤드가 4 개의 구성 요소를 인쇄 할 수있는 경우, 그런 다음 트랙을 따라 20 개의 프린트 헤드를 장착하는 것만으로도 기질 위의 단일 패스에서 모든 구성 요소 세트 배열을 가능하게 할 수 있다. 다중 트랙을 사용하면 기질(웹)을보다 효율적으로 사용할 수 있으므로 더 짧아지고 더 높은 처리량 방식으로 식별자를 만들 수 있다. 기질에 트랙보다 더 많은 너비(위도)가 있는 경우, 각 패스 후에 기질(또는 프린트 헤드 섀시)을 위로 이동하여 길이 대신 기질 너비를 따라 빈 기질에 인쇄할 수 있다. 다른 실시예에서, 별도의 프린터베이스 시스템은 동일한 기질의 분리된 부분에 인쇄될 수 있다.
도 5는 프린터 하위 시스템에서 스팟 이미저에 대한 설정예를 도시한다. 스팟 이미저는 라인 스캔 검사 원리를 사용할 수 있다. 예를 들어, 스팟 이미저는 컴퓨터 시스템(520), 디스플레이(510), 라인 스캔 카메라(530), 회전 드럼(540) 및 인코더(550)를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템(520)은 라인 스캔 카메라(530)와 통신한다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템(520)은 제어 신호를 라인 스캔 카메라(520)로 보낼 수 있고 라인 스캔 카메라(530)는 이미지 데이터를 컴퓨터 시스템(520)으로 다시 보낼 수 있다. 컴퓨터 시스템(520) 및 라인 카메라 시스템(530)은 무선 또는 유선 연결을 통해 통신할 수 있다. 라인 스캔 카메라(530)를 통해 수집된 이미지 데이터는 디스플레이(510)에 표시된다. 도 5에서, 라인 스캔 카메라(530)는 디스플레이(510) 상에 디스플레이될 수 있는 드럼(540)의 이미지를 캡처할 수 있다.
도 6은 피니셔 서브 시스템(130)을 더 상세히 도시한다. 피니셔 서브 스티 템(130)은 웹 드라이브, 인큐베이션 버퍼 및 분배 호스팅, 스팟 가습기(144), 스팟 이미저(146) 및 풀링 서브 시스템(148)을 갖춘 피니셔베이스(140)를 포함한다. 기질의 각 좌표에 반응 혼합물을 분배하는 부품에 추가하여, 피니셔는 또한 통합 전에 기질(136)의 각 좌표 상에 반응 억제제를 분배하는 부분(142)을 포함할 수 있다. 이러한 분배 부품은 프린트 헤드일 수 있다. 주문형 프린트 헤드일 수 있지만 웹을 따라 각 좌표가 분배를 받을 것으로 예상될 수 있으므로 연속 인쇄로도 충분할 수 있다. 디스펜스 볼륨은 DNA 구성 요소가 이전에 분배된 각 좌표의 영역을 포함하기에 충분해야 한다. 분배 부피는 적어도 1 pL, 5 pL, 10 pL, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pL, 60 pL, 70 pL, 80 pL, 90 pL, 100 pL, 150 pL, 200 pL, 또는 그 이상일 수 있다. 프린트 헤드는 MEMS(미세 전자 기계 시스템) 박막, 피에조 잉크젯 헤드 또는 MEMS 열 잉크젯 헤드일 수 있다. 프린트 헤드 와의 호환성을 용이하게 하기 위해 첨가제가 분배된 액체(예: 마스터 믹스 또는 억제 믹스)에 추가될 수 있다. 예를 들어, 트리스 와 같은 용질을 첨가 하여 전도도를 높일 수 있다.또 다른 예로서, 습윤제 또는 계면 활성제를 첨가 하여 배출 품질 및 프린트 헤드 노즐 수명을 개선할 수 있다. 또한, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 보습제를 첨가 하여 노즐-공기 경계면 에서뿐만 아니라 액적이 분사된 후 증발을 제어할 수 있다. 이러한 습윤제는 반응 생성물 수율을 증가시킴으로써 반응 혼합물에 추가로 도움이될 수 있다.
프린터 서브 시스템과 유사하게, 피니셔는 또한 레지스터 및 스팟 이미저(146)를 포함하여 웹을 프린트 헤드와 정렬하고 각각 적절한 분배를 검증할 수 있다. 스팟 이미저의 기능을 용이하게 하기 위해, 가시 염료가 분배된 유체에 포함될 수 있다.
피니셔는 웹(기질)(136)상의 반응이 반응 통합 전에 더 긴 시간 동안 배양될 수 있도록 반응 믹스 분배 후 여러 개의 롤러 루프(웨빙을 루프하도록 의도된 롤러의 구성)(134)를 추가로 포함 할 수 있다. 피니셔는 반응 인큐베이션에 최적인 고정된 내부 온도를 포함할 수 있다. 예를 들어 섭씨 4, 12, 25, 37도 이상이다. 인큐베이션 단계 동안 분배된 반응 혼합물의 증발을 느리게 제어하기 위해 피니셔는 고정된 높은 습도 레벨을 포함할 수 있다. 피니셔 서브 시스템(130)의 습도 레벨은 인큐베이션 기간 동안(예를 들어, 기질이 롤러(134)를 통과하는 동안) 젖은 스팟의 유지를 제어하는 스팟 가습기(144)에 의한 제어기일 수 있다.
마지막으로, 피니셔는 인큐베이션 후 모든 식별자 어셈블리 반응을 하나의 용기로 통합하기위한 풀링 시스템(148)을 포함할 수 있다. 반응 억제는 상기 단계 이전에 발생할 수 있거나 상기 단계 중에 발생할 수 있다.
도 7은 인큐베이션 단계 동안 피니셔를 통해 웹을 통과시키기 위한 롤러 루프(710, 720)의 예를 도시한다. 웹의 루핑은 더 제한된 공간에서 더 긴 인큐베이션을 가능하게 한다. 예를 들어, 웹이 180mm/s로 시스템을 통과하는 경우 그런 다음 5 분의 인큐베이션 시간에 ~ 60m의 배양된 웹 길이가 필요하지만 여러 개의 루프를 통해이 길이가 ~ 60m의 선형 터널이 아닌 더 제한된 공간에서 인큐베이션할 수 있다. 더 짧은 인큐베이션 시간은 더 짧은 인큐베이션 웹 길이를 허용할 수 있다. 예를 들어, 45 초의 인큐베이션 시간은 ~ 9m의 인큐베이션된 웹 길이를 허용할 수 있고 10 초의 인큐베이션 시간은 ~ 2m의 인큐베이션된 웹 길이를 허용할 수 있다. 이러한 더 짧은 인큐베이션된 웹 길이에서, 작은 공간 내에 인큐베이션을 제한하기 위해 더 적은 웹 루프가 필요할 수 있다.
롤러 루프의 기하학적 구조로 인해, 웨빙(740)은 특정 롤러(720)를 오른쪽 위로 통과시키고 다른 롤러(710)를 뒤집을 수있다.
도면의 하단은 웹의 이동 경로를 따른 롤러(710)의 단면을 도시한다. 롤러는 기질(740)의 접촉점 사이에 골(또는 그루브, 포켓, 또는 임의의 다른 오목 부)(730)을 포함하도록 설계되어 반응(예를 들어, 구성 요소가 분배된 좌표)이 간섭없이 골을 통과할 수 있다. 선택적으로 웨브가 항상 설정까지 우측의 롤러를 통해 전달되도록 롤러 사이의 180도 회전(즉, 180˚ 비틀림 경로)될 수 있다. 선택적 으로 웨빙은 인큐베이터를 통해 나선형 경로를 이동하여 롤러 세트 주위의 웨빙의 원형 경로가 반응을 포함하는 웨빙의 측면이 롤러와 접촉하지 않도록 보장한다. 비유로 실린더 주위에 리본을 감거나 테니스 라켓에 그립 테이프를 붙이는 것을 고려하라.
일부 구현에서 웨빙은 재순환 또는 연속 웨빙이다. 일부 구현에서, 웨빙은 릴 대 릴 시스템(롤러 대 롤러)이다.. 일부 구현예에서 웨빙은 스네일 경로를 따른다. 예를 들어, 도 7을 참조하라. 일부 구현예에서, 웨빙은 나선형 경로를 따른다. 일부 구현예에서, 웨빙은 180˚ 비틀림 경로를 따른다. 예를 들어, 웨빙은 시스템과 함께 각 롤러에서 180도 회전하며, 여기서 웨빙은 모든 롤러를 오른쪽 위 구성으로 통과한다.
도 8은 인큐베이션 동안 예상되는 평형 부피에 대한 반응 혼합물 글리세롤 조성물 및 마무리 제습도의 효과를 예시한다. 입자는 액체 상과 기체 상 사이를 전환하는 물 분자를 나타낸다.액적(820)은 웹(810)에 분배된 반응을 나타낸다. 바깥 쪽 음영 영역은 물을, 중간 음영 영역은 글리세롤을, 내부 음영 영역은 용질(예: DNA, 효소/리가아제, 염/마그네슘, Tris)을 나타낸다.높은 습도와 높은 글리세롤 조건은 원래 조성과 가장 유사한 평형 반응 조성을 초래한다. 그러나 평형 상태에서 반응 조성의 변화는 유익할 수 있다. 예를 들어, DNA 구성 요소의 상대적인 양이 증가하면 식별자 생산 수율이 높아질 수 있다. 마찬가지로, 글리세롤 함량의 증가는 식별자 생성을 촉진하는 크라우딩 효과를 생성할 수 있다. 반응 효율은 특정 용질(예: 염) 농도의 증가에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있지만, 반응 혼합물에 존재하는 초기 용질은 의도적으로 저 농축될 수 있으며 반응 액적이 평형 조성 및 부피로 증발한 후 최적의 농도로 존재하도록 설계될 수 있다.
도 9는 웹으로부터의 모든 반응을 하나의 컨테이너로 통합하는 풀링 시스템을 예시한다. 일련의 롤러(902)는 웹(910)으로부터 반응 및 그 식별자 생성물을 포착하도록 설계된 스프레이 세척(914) 및 수집 저장소(942)를 통해 웹(910)을 탐색한다. 이 과정에서 부피가 과도하게 축적되는 것을 방지하기 위해 수집 유체는 핵산을 포획하도록 설계된 멤브레인을 통해 연속적으로 또는 반복적으로 흐를 수 있다. 예를 들어, 멤브레인은 실리카 멤브레인일 수 있고 수집 유체는 핵산의 멤브레인에 대한 결합을 용이하게 하는 DNA 결합 완충액(912)일 수 있다. 수집 유체는 반응을 억제하는 첨가제를 추가로 포함하여 응집된 부피에서 진행되지 않도록 할 수 있다. 예를 들어, 반응이 결찰 반응인 경우 수집 유체는 EDTA(예: 25mM)를 포함 하여 리가아제에서 마그네슘 이온을 킬레이트화하여 반응을 억제할 수 있다. 한 실시 양태에서 바인딩 버퍼는 상기 바인딩 버퍼의 부피를 최소화하기 위해 하나 이상의 결합 컬럼을 통해 재순환될 수 있다. 웹(910)은 웹(910)으로부터 DNA를 제거하기 위해 액체로 적셔질 수 있고, 이것은 수집 저장소 내의 액체에 웹(910)을 침지시키는 것과 결합될 수 있다. 스크레이퍼(918)는 웹(910)으로부터 DNA 제거를 돕기 위해 물리적 스크레이퍼, 액체 제트 또는 가스(예를 들어, 공기) 제트일 수 있다. 웹(910) 으로부터의 DNA 방출을 돕기 위해 하나 이상의 스프레이가 사용될 수 있다.
DNA가 멤브레인에 포획된 후, 용출 및 추가 평가를 위해 시스템(기계)에서 제거될 수 있다. 추가 평가는 겔에서 DNA를 실행하고 예상된 식별자 길이에 해당하는 밴드 크기를 선택하는 것을 포함할 수 있다(이에 따라 다른 잠재적인 오프 타겟 제품에서 식별자를 정제함). 상기 예에서 대상 식별자 길이는 300bp이다. DNA 출력은 선택적으로 겔 또는 기타 여과(940)를 통과하여 동결 건조될 수 있는 DNA 데이터(930)를 생성할 수 있다.
풀링 전 또는 풀링 중에 반응 혼합물을 첨가하고 억제하는 대신, 반응이 풀링 단계에서 발생하는 상기 시스템의 또 다른 실시예가 있다. 상기 실시예에서, 구성 요소는 어닐링되지만 인큐베이션 프로세스 동안 조립되지 않은 다음, 식별자로의 구성 요소 조립을 위한 반응 혼합물 및 적절한 환경 조건(예: 온도, pH, 염)을 포함하는 풀에서 함께 통합된다. 상기 실시예는 어닐링된 구성 요소가 풀링되면 나머지 반응이 시스템(기계) 외부에서 진행될 수 있기 때문에 웹(910)에서 더 짧은 인큐베이션 시간 및 피니셔에서 덜 엄격한 하드웨어 요구 사항을 가능하게 할 수 있다. 상기 실시예에서, 풀링된 반응에서 상이한 식별자의 구성 요소들 사이의 원치않는 교차 조립을 방지하기 위해, 풀링 전과 풀링 중에 구성 요소들이 서로 강하게 어닐링되도록 특별한 주의를 기울일 수 있다. 여기에는 강력한 어닐링을 위해 긴 점착 단부(및 혼성화 영역)을 가진 구성 요소를 사용하고 어닐링된 제품을 유지하고 어닐링되지 않은 제품의 확산을 제한하기 위해 풀링 단계에서 더 낮은 온도를 사용하는 것이 포함될 수 있다.
도 10은 PFS를 통한 데이터 전송 파이프 라인의 실시예의 개략도를 도시한다. 도 10은 1Tb의 데이터를 포함하는 소스 스트림(1002)에서 시작한다. 소스 스트림(1002)은 코덱(1004)으로 전송되고 작업 모듈(1006)로 공급된다. 작업 모듈(1006)은 각 소스 스트림 및/또는 코덱 파일에 대한 작업 파일, 블록 레코드 및 블록 데이터를 생성한다. 이 정보는 블록 모니터(1008)에 공급된다. 작업 모듈(1006)은 블록 모니터(1008)와 통신하는 작업 모니터(1016)에 의해 모니터링된다. 블록 모니터(1008)는 새로운 블록을 감시하고, 블록을 확인하고, 인쇄를 위해 파이프 라인에 추가한다. 작업 모듈(1006)로부터의 블록 데이터(1010)는 분리되어 블록 데이터를 인쇄하기 위해 필요한 잉크 및 프린트 헤드 구성을 처리하는 블록 판독기(1012)로 전송된다. 그 후, 블록 데이터는 데이터 전송의 정확성을 테스트하도록 구성된 블록 데이터(1010) 및 "칩"를 포함하는 인쇄 가능한 프레임(1014)으로 변환된다. 그 다음, 프레임(1014)은 프린터(1034)와 통신하는 문서 프린터 모듈(1018)로 전송된다. 예를 들어, 문서 프린터 모듈(1018)은 인쇄를 위해 프레임(1014)을 프린터(1034)로 전송하고 프린터(1034)는 문서 프린터(1018)로 피드백을 전송한다. 임의의 실패(1020)는 텍스트 파일 또는 다른 저장 방법(1024)에 기록되는 완료 제어기(1022)로 전달된다. 문서 프린터(1018)와 전자적으로 통신하는 것 외에, 프린터(1034)는 물리적 웹 섹터(1036)를 수신한다. 웹 섹터(1036)는 하나의 코너에서 마커에 의해 위치적으로 검증된다. 각 웹 섹터에는 고유한 ID 코드가 있다. 프린터(1032)는 웹에 구성 요소(1032)를 배치한다. 그 후 웹은 피니셔(1026)로 계속된다. 피니셔(1026)는 피니시 컨트롤러(1022)와 통신한다. 피니시 컨트롤러(1022)는 마무리할 프레임 또는 부분 프레임에 관한 정보를 피니셔(1026)로 보내고 피니셔(1026)는 피니시 컨트롤러(1022)에 피드백을 보낸다. 프린터 및 피니셔 시스템(1034, 1026) 모두로부터의 피드백은 섹터 할당에 대한 프레임 기록, 인쇄 및 품질 제어를 통한 웹 등록 조정 및 실패한 프레임 기록을 용이하게 한다. 피니셔(1026)를 떠난 후, 웹이 인쇄되고 마무리(1028)되어 DNA 스팟(1030)이 있는 기질이 생성되고, 그 결과 폴링 시스템 또는 임의의 다른 적절한 저장 방법으로 보낼 수 있다.
도 11은 섀시 모듈, 프린트 엔진 모듈, 인큐베이터 모듈 및 풀링 모듈의 4개의 모듈을 포함하는 PFS의 실시예를 예시한다. 섀시 모듈의 기능은 시스템의 모든 모듈을 통해 웨빙의 움직임을 구동, 안정화 및 제어하는 기본 시스템을 제공하는 것이다. 인쇄 엔진 모듈의 기능은 DNA 구성 요소와 기타 재료 및 시약을 웨빙의 반응 액적로 인쇄하는 것이다. 인큐베이터 모듈의 기능은 반응 액적에서 개선된 생성물(예를 들어, 조립된 DNA 또는 식별자) 수율을 위한 시간 및 환경 제어를 제공하는 것일 수 있다. 풀러 모듈의 기능은 웨빙에서 반응 액적을 제거하고 하나의 용기로 통합하는 것이다.
일부 실시예에서, 반응 액적은 효소 결찰을 통해 DNA 식별자를 조립할 수 있다. 일부 실시예에서, 반응 액적은 클릭 케미스트리를 통해 DNA 식별자를 조립할 수 있다.
일부 실시예에서, 인큐베이터 모듈은 100, 50, 25, 10, 5, 1, 또는 0.1 미터 이하의 웨빙을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, PFS는 인큐베이터 모듈을 갖지 않을 수 있다.
일부 실시예에서, 프린트 엔진 또는 인큐베이터는 웨빙상에서 증발할 때 반응 액적에 부피를 보충하기 위해 간헐적인 프린트 헤드 또는 분배 서브 모듈을 포함 할 수 있다.
일부 실시예에서, PFS를 통과하는 웨빙은 인쇄 엔진 이전에 롤에서 풀리고 풀러 후에 롤에서 다시 감길 수 있다. 일부 실시예에서, 웨빙은 풀러 후에 인쇄 엔진으로 다시 통과하는 연속 루프를 형성할 수 있다.
도 12는 반응 액적을 에멀젼(1260)으로 모으는 PFS의 실시예를 예시한다. 에멀젼(1260)은 오일 또는 반응 액적과 혼화되지 않는 임의의 액체를 포함할 수 있으며, 이에 의해 반응 액적(1250)이 풀링된 후에도 그 내용물을 유지할 수 있게 한다. PFS의 웨빙(1220)은 프린트 헤드(1210) 아래를 통과하기 전에(예를 들어, 롤러(1230 및 1240)를 통해) 오일로 코팅될 수 있다. 반응 액적(1250)은 에멀젼에서 크기 및 형태를 제어하기 위해 계면 활성제 및 기타 첨가제를 함유할 수 있다. 계면 활성제 및 첨가제는 또한 에멀젼 내의 안정성을 촉진하고 서로 다른 반응 액적 사이의 유착을 방지할 수 있다. 풀링된 유화 반응 액적은 미세 유체 장치를 통과할 수 있다. 모아진 유화된 반응 액적은 인큐베이션될 수 있다. 더욱이, 풀링된 유화 반응 액적은 응집되어 에멀젼에서 분리될 수 있다.
도 13은 웨빙(1320) 상에 인쇄된 후 반응 액적(1350) 이 오일(또는 다른 비혼 화성 액체)(1370)로 코팅되는 PFS의 실시예를 예시한다. 오일 코팅은 웨빙(1320)이 롤러(1330 및 1340)를 통해 프린트 헤드 클러스터(1310) 아래를 통과 할 때 반응 액적(1350) 상에 오일을 인쇄, 분배 또는 스프레이하는 오일 분배 서브 모듈(1380)에서 발생할 수 있다. 오일은 웨빙(1320) 상의 반응 액적의 증발을 줄이거나 방지할 수 있다. 반응 액적에는 계면 활성제 및 기타 첨가제가 포함될 수 있다. 오일로 덮인 반응 액적(1370)은 에멀젼(1390) 으로 모일 수 있다. 풀링된 유화 반응 액적은 미세 유체 장치를 통과할 수 있다. 모아진 유화된 반응 액적은 인큐베이션될 수 있다. 더욱이, 풀링된 유화 반응 액적은 응집되어 에멀젼에서 분리될 수 있다.
도 14는 반응 액적(1450)이 인쇄된 DNA 구성 요소를 결합하는 비드를 함유하는 PFS의 실시예를 예시한다. 비드는 DNA에 결합하는 실리카, 카르복실기 또는 아민 또는 이미 다졸 모이어티로 코팅될 수 있다. 선택적으로 또는 추가로, 비드는 비오틴 연결을 통해 DNA 구성 요소를 결합하는 스트렙 타비딘 으로 코팅될 수 있다. 비오틴은 광 또는 UV 절단 가능한 링커로 DNA 구성 요소에 연결될 수 있다.
웨빙(1420)은 프린트 헤드(1410) 아래를 통과하기 전에(예를 들어, 롤러(1430 및 1440)를 통해) 비드로 편재적으로 덮이거나 비드로 패턴화될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 비드는 각각의 반응 액적(1450)에 침착되거나 인쇄될 수 있다. 반응 액적은 비드에 대한 DNA 결합을 촉진하는 첨가제를 포함할 수 있다. 비드는 반응 액적당 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100 또는 그 이상의 양일 수 있다.
반응 액적(1450)은 비드에 대한 DNA의 추가 결합을 방지하는 용액(1460)에 모일 수 있다. 용액(1460)은 BSA와 같은 차단제를 포함할 수 있다. 풀링된 용액의 DNA 결합 비드는 용액 에서 분리되어 건조될 수 있다(1470). 원심 분리를 통해 분리가 발생할 수 있다. 다른 실시예에서, 비드는 자성을 가질 수 있고 그들은 자석 으로 분리될 수 있다.
풀링된 DNA- 결합 비드(건조된 1470 또는 용액 1460)는 유화된 반응 액적에 추가로 캡슐화될 수 있다. 한 실시예에서, DNA-결합된 비드는 각각 미세 유체를 사용하여 반응 액적에 캡슐화된다. 다른 구체예에서, DNA-결합된 비드는 액적이 자발적으로 형성되도록 반응 용액과 오일(또는 다른 비혼 화성 액체)을 혼합함으로써 반응 액적에 각각 캡슐화된다. 자발적으로 형성된 반응 액적 대 DNA 결합 비드의 비율은 반응 액적이 하나 이상의 DNA 결합 비드를 포함하지 않을 가능성이 있도록 조정될 수 있다. 반응 액적은 크기를 제어하거나 다른 반응 액적의 유착을 방지하기 위해 계면 활성제 또는 기타 첨가제를 포함할 수 있다.
반응 액적은 비드에서 DNA를 분리하는 시약을 포함할 수 있다. 반응 액적은 DNA 구성 요소를 함께 결찰하여 식별자를 형성하는 시약을 포함할 수 있다. 반응 액적은 ATP, DTT 또는 염과 같은 결찰 보조 인자뿐만 아니라 효소 리가아제를 포함할 수 있다.
DNA가 광 절단 가능 또는 UV 절단 가능 연결을 통해 비드에 결합되면, 상기 DNA는 적절한 파장의 전자파(예를 들면 광 또는 UV)에 노출시킴으로써 에멀젼을 비드로부터 방출할 수 있다.
도 15는 비드에 결합된 DNA 구성 요소가 에멀젼을 사용하여 식별자로 처리될 수있는 방법의 예를 예시한다. 단계 1510에서 DNA 결합 비드가 제공된다. DNA- 결합된 빈은 단계 1520에서 유화되어 반응 혼합물 액적에 캡슐화된 DNA- 결합된 비드가 오일에 잠기게된다. 그 후 DNA가 해리되어 혼합물(1530)이 생성된다. 해리된 DNA 혼합물이 인큐베이션되어 1540의 조립된 DNA가 생성된다.
본 명세서에서 예시적인 구현이 도시되고 설명되었지만, 이러한 구현은 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백 할 것이다. 당업자에게는 수많은 변형, 변경 및 대체가 발생할 수 있다. 여기에 설명된 구현에 대한 다양한 대안이 채택될 수 있음을 이해해야 한다.
PFS 크기를 줄이기 위한 변형예
도 11에서 상술한 바와 같이, PFS는 섀시, 인쇄 엔진, 인큐베이터 및 풀러의 네 가지 모듈로 구성될 수 있다. DNA에 1Tb의 정보를 인코딩하는 PFS의 경우 각 모듈의 대략적인 크기는 아래 표에 나열되어 있다.:
| 모듈 | L(mm) | W9mm) | H(mm) |
| 프린터 | 1850 | 1200 | 2000 |
| 인큐베이터 | 2300 | 1150 | 2000 |
| 섀시 | 800 | 1150 | 2000 |
| 풀러 | 600 | 1150 | 1600 |
PFS의 크기를 줄이기 위해 개별 모듈의 크기를 줄이거나 모듈을 제거할 수 있다. 크기를 줄이기 위한 수정의 예는 다음과 같다.:
(1) 프린트 엔진에서 프린트 헤드 용량 증가. 사용자 정의 프린트 헤드 또는 추가 프린트 헤드를 사용하여 노즐 열 수를 세 배로 늘릴 수 있다(또는 더 큰 요소로 증가). 이것은 인쇄된 반응의 수와 웨빙의 인쇄 너비를 세 배로 늘릴 수 있다.
(2) 재순환 웨빙 사용. 예를 들어 PFS는 21km의 폴리프로필렌 웨빙을 사용하여 1Tb의 정보를 인코딩하기에 충분한 반응을 인쇄할 수 있다. 웨빙 릴(또는 롤)의 사용을 없애기 위해 재순환 웨빙을 롤 투 롤 웨빙의 대안으로 사용할 수 있다. 회복 연구는 풀러의 웹에서 DNA를 쉽게 제거할 수 있음을 보여준다.
(3) 결찰 반응 시간 감소. 이것은 더 작은 인큐베이터를 사용하거나 아예 인큐베이터를 사용하지 않을 수 있다.수율을 희생하지 않고 결찰 반응 시간을 줄이려 면 더 높은 결찰 속도를 충족하도록 화학을 최적화할 수 있다.
(4) 실온 및 주변 조건에서 결찰을 수행한다. 이렇게 하면 인큐베이터 모듈이 필요하지 않을 수 있다.
(5) 오일 에멀젼을 사용하여 반응 액적 부피를 유지하거나 풀러 후에 결찰을 시작하거나 계속할 수 있다. 이렇게 하면 인큐베이터 모듈이 필요하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 예시적인 실시 예가 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게는 수많은 변형, 변경 및 대체가 발생할 수 있다. 여기에 설명된 실시예에 대한 다양한 대안이 채택될 수 있음을 이해해야 한다.
조합 DNA 조립 방법 및 시스템의 응용
구성 요소를 정의된 큰 세트의 식별자로 조합하여 조립하기 위해 여기에 설명된 방법 및 시스템은 정보 기술(예를 들어, 데이터 저장, 컴퓨팅 및 인코딩)과 관련하여 지금까지 설명되었다. 그러나 이러한 시스템 및 방법은 고 처리량 조합 DNA 조립의 모든 응용 분야에 보다 일반적으로 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 우리는 아미노산 사슬을 인코딩하는 조합 DNA 라이브러리를 만들 수 있다. 이러한 아미노산 사슬은 펩티드 또는 단백질을 나타낼 수 있다. 조립을 위한 DNA 단편은 코돈 서열을 포함할 수 있다. 단편이 조립되는 접합부는 조합 라이브러리의 모든 부재에 공통적인 기능적 또는 구조적으로 비활성 코돈일 수 있다.대안으로, 단편이 조립되는 접합부는 나중에 처리된 펩티드 사슬로 변환되는 메신저 RNA 에서 결국 제거되는 인트론일 수 있다. 특정 단편은 코돈이 아니라(다른 조립된 바코드와 결합하여) 코돈의 각 조합 스트링에 고유하게 태그를 지정하는 바코드 서열일 수 있다. 조립된 제품(바코드 + 코돈 스트링)은 함께 모아서 체외 발현 분석을 위해 액적에 캡슐화하거나, 함께 모아서 생체 내 발현 분석을 위해 세포로 변환할 수 있다. 분석은 형광 출력을 가질 수 있어서, 액적/세포가 형광 강도에 의해 빈으로 분류될 수 있고, 이어서 각각의 코돈 스트링을 특정 출력과 상관 시킬 목적으로 이들의 DNA 바코드가 서열화될 수 있다.
또 다른 실시예에서, RNA를 인코딩하는 조합 DNA 라이브러리를 만들 수 있다. 예를 들어, 조립된 DNA는 microRNA 또는 CRISPR gRNA의 조합을 나타낼 수 있다. 풀링된 시험 관내 또는 생체 내 RNA 발현 검정은 액적 또는 세포 및 바코드를 사용하여 상기 기질된 바와 같이 수행하여 어떤 액적 또는 세포가 어떤 RNA 서열을 함유하는지 추적 할 수 있다. 그러나 출력 자체가 RNA 서열화 데이터인 경우 일부 풀링된 분석은 액적 또는 세포 외부에서 수행될 수 있다. 이러한 풀링된 분석의 예에는 RNA 앱 타머 스크리닝 및 테스트(예: SELEX)가 포함된다.
또 다른 실시예에서, 우리는 대사 경로에서 유전자를 인코딩하는 조합 DNA 라이브러리를 만들 수 있다. 각 DNA 단편은 유전자 발현 구조를 포함할 수 있다. 단편이 조립되는 접합부는 유전자 사이의 불활성 DNA 서열을 나타낼 수 있다. 풀링된 시험 관내 또는 생체 내 유전자 경로 발현 분석은 액적 또는 세포 및 바코드를 사용하여 상기 기질된 바와 같이 수행하여 어떤 액적 또는 세포가 어떤 유전자 경로를 포함하는지 추적할 수 있다.
또 다른 실시예에서는, 유전자 조절 인자의 상이한 조합으로 조합 DNA 라이브러리를 생성할 수 있다. 유전자 조절 요소의 예에는 5' 비 변환 영역(UTR), 리보솜 결합 부위(RBS), 인트론, 엑손, 프로모터, 종결 자 및 전사 인자(TF) 결합 부위가 포함된다. 풀링된 시험 관내 또는 생체 내 유전자 발현 분석은 액적 또는 세포 및 바코드를 사용하여 상기 기질된 바와 같이 수행하여 어떤 액적 또는 세포가 어떤 유전자 조절 구조를 함유하는지 추적할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 조합 DNA 앱 타머의 라이브러리가 생성될 수 있다. 리간드에 결합하는 DNA 압타머의 능력을 테스트하기 위해 분석을 수행할 수 있다.
Claims (51)
- 적어도 제 1 구성 요소 핵산 분자 및 제 2 구성 요소 핵산 분자로부터 식별자 핵산 분자를 조립하여 디지털 정보를 저장하는 시스템에 있어서,
(a) 제 1 구성 요소 핵산 분자를 포함하는 제 1 용액의 제 1 액적을 기질상의 좌표 상에 분배하도록 구성된 제 1 프린트 헤드;
(b) 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자가 기질 상에 배치되도록 제 2 구성 요소 핵산 분자를 포함하는 제 2 용액의 제 2 액적을 기질상의 좌표 상에 분배하도록 구성된 제 2 프린트 헤드; 및
(c) 반응 혼합물을 기질상의 좌표 상에 분배 하여 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자를 물리적으로 연결하고, 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자 또는 둘 다를 물리적으로 연결하는 데 필요한 조건을 제공하는 피니셔를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템. - 제 1항에 있어서, 식별자 핵산 분자는 심볼 문자열에서 심볼의 위치와 값을 나타내도록 구성되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 피니셔는 기질상의 좌표 상에 반응 혼합물을 분배하도록 구성된 제 3 프린트 헤드를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 3항에 있어서, 피니셔가 인큐베이터, 풀링 시스템 또는 둘 다를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 피니셔는 제 1 프린트 헤드가 좌표 상에 제 1 액적을 분배하기 전에, 제 2 프린트 헤드가 좌표 상에 제 2 액적을 분배하기 전에, 또는 둘 모두에 반응 혼합물을 좌표 상에 분배하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 프린트 헤드, 제 2 프린트 헤드 및 피니셔를 지나서 기질을 이동시키는 적어도 하나의 롤러를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 6항에 있어서, 적어도 하나의 롤러는 기질의 선형 이동을 제공하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 7항에 있어서, 상기 적어도 하나의 롤러는 일정한 속도로 상기 기질의 선형 이동을 달성하는 릴 대 릴 시스템의 일부인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 6항에 있어서, 기질은 재료의 연속 루프를 형성하고, 적어도 하나의 롤러는 기질상의 좌표가 제 1 프린트 헤드, 제 2 프린트 헤드 및 피니셔를 여러 번 통과하게하는 롤러 세트의 일부인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 제 1 액적, 제 2 액적 및 반응 혼합물이 분배되는 제 1 표면, 및 제 1 표면 반대편의 제 2 표면을 가지며, 적어도 하나의 롤러가 제 2 액적과 접촉하고 제 1 표면과 접촉하지 않는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 밸리를 포함하는 제 2 롤러를 더 포함하고, 상기 제 2 롤러는 적어도 하나의 밸리가 좌표와 정렬되도록 제 1 표면과 접촉하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 10항에 있어서, 제 2 롤러를 더 포함하고, 상기 기질은 상기 적어도 하나의 롤러와 상기 제 2 롤러 사이에서 또는 나선형 경로로 180도 회전되어 상기 제 2 롤러가 상기 제 2 표면과 접촉하고 상기 제 1 표면과 접촉하지 않는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 좌표는 1 마이크로 미터 내지 200 마이크로 미터의 기질상의 다른 좌표로부터의 직경 또는 간격을 갖는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 액적 각각은 1 pL 내지 50 pL의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질과 제 1 및 제 2 프린트 헤드의 좌표 사이의 정렬을 유지하기 위해 실시간으로 기질의 움직임을 추적하는 레지스터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 용액은 염료를 포함하고, 상기 시스템은 상기 제 1 및 제 2 액적의 적절한 분배를 확인하는 카메라를 포함하는 스팟 이미저를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질상의 제 1 및 제 2 액적을 건조시키는 점 건조기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 프린트 헤드는 기질의 상이한 좌표에서 제 1 용액의 액적을 분배하는 제 1 복수의 노즐을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 18항에 있어서, 상기 제 1 프린트 헤드는 기질의 상이한 좌표에서 제 3 용액의 액적을 분배하는 제 2 복수의 노즐을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 20항에 있어서, 기질은 저 결합 플라스틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 21항에 있어서, 기질이 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 또는 폴리프로필렌을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 프린트 헤드는 기질의 움직임에 대한 각도로 시스템 내에 장착되고, 상기 각도는 좌표상의 오버 프린팅을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프린트 헤드는 MEMS 박막 피에조 잉크젯 헤드 또는 MEMS 열 잉크젯 헤드인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 프린트 헤드는 좌표 상에 액적을 분배하기 위해 동일한 트랙을 따라 위치되고, 상기 시스템은 해당 트랙에서 다른 좌표 상에 액적을 분배하기 위해 적어도 하나의 추가 트랙을 따라 위치되는 추가 프린트 헤드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 피니셔가 반응 인큐베이션에 최적인 고정된 내부 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 26항에 있어서, 피니셔가 인큐베이션 동안 반응 혼합물의 증발을 제어하는 고정된 습도 레벨을 갖는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 25 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 피니셔는 응축을 방지하기 위해 인큐베이션 전에 기질을 가열하는 히터를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 피니셔는 기질상의 상이한 좌표로부터의 다중 반응을 용기로 통합하는 풀링 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 29항에 있어서, 피니셔가 응고 전에 기질의 좌표 상에 반응 억제제를 분배하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 29항에 있어서, 용기가 반응 억제제를 포함하는 풀링 용액을 함유하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 30항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 억제제가 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질상의 상이한 좌표로부터 수집된 유체로부터 핵산을 포착하는 멤브레인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질로부터 핵산을 제거하는 스크레이퍼를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 29항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 서로 다른 좌표의 여러 반응이 에멀젼으로 합쳐져 여러 반응이 합쳐진 후에도 내용물을 유지할 수 있는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 35항에 있어서, 기질은 비혼화성 액체 또는 오일로 코팅되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 35항에 있어서, 좌표 상에 오일을 분배하는 오일 분배기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질이 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자에 결합하는 비드로 코팅되거나 패턴화되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 좌표 상에 비드를 분배하는 비드 분배기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물이 리가아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 용액, 제 2 용액 및 반응 혼합물 중 적어도 하나가 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 41항에 있어서, 첨가제는 제 1 용액과 제 1 프린트 헤드, 제 2 용액과 제 2 프린트 헤드, 또는 반응 혼합물과 피니셔와의 호환성을 가능하게 하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 41 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 첨가제가 제 1 용액, 제 2 용액 또는 반응 혼합물의 증발을 완화하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 첨가제가 보습제, 계면 활성제 및 바이오사이드 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항의 시스템을 동작시키기 위한 명령을 실행하도록 구성된 컴퓨터 프로세서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 핵산 분자를 조립하기 위한 시스템에 있어서,
상기 시스템이,
(a) 제 1 구성 요소 핵산 분자를 포함하는 제 1 용액의 제 1 액적을 기질상의 좌표 상에 분배하도록 구성된 제 1 프린트 헤드;
(b) 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자가 기질 상에 배치되도록 제 2 구성 요소 핵산 분자를 포함하는 제 2 용액의 제 2 액적을 기질상의 좌표 상에 분배하도록 구성된 제 2 프린트 헤드; 및
(c) 반응 혼합물을 기질상의 좌표 상에 분배 하여 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자를 물리적으로 연결하고, 제 1 및 제 2 구성 요소 핵산 분자 또는 둘 다를 물리적으로 연결하는 데 필요한 조건을 제공하는 피니셔를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템. - 제 46항에 있어서, 피니셔는 기질상의 좌표 상에 반응 혼합물을 분배하도록 구성된 제 3 프린트 헤드를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 47항에 있어서, 피니셔가 인큐베이터, 풀링 시스템 또는 둘 다를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 46항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 피니셔는 제 1 프린트 헤드가 좌표에 제 1 액적을 분배하기 전, 제 2 프린트 헤드가 좌표에 제 2 액적을 분배하기 전에 또는 둘 다에 반응 혼합물을 좌표에 분배하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 46항에 있어서, 조립된 핵산이 유전자-, 펩티드-또는 RNA-인코딩 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제 46항에 있어서, 조립된 핵산이 DNA 앱타머 라이브러리를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
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