KR20210027352A - 감소된 효과기 기능을 갖는 항-vla-4 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항-VLA-4 항체 및 이의 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 상기 항체 및 이의 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 항체 및 이의 결합 단편의 제조 방법을 추가로 포함한다. 본 발명은 상기 항체 및 이의 결합 단편의 투여에 의해서 다발성 경화증 및/또는 뇌전증을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 추가로 포함한다. 본 발명은 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 결합 단편의 스크램블링에 대한 민감성을 감소시키는 방법을 추가로 포함한다.
Description
본 발명은 알파-4 결합 항체 및 이의 단편에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해서 제출되고, 전체가 참고로 본 명세서에 포함된 서열 목록을 포함한다. 2019년 4월 12일자로 작성된 상기 서열 목록은, 파일명이 Anti_VLASequence PatentIN_ST25이고, 크기가 208킬로바이트이다.
인테그린(Integrin)은 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 매개하는 세포 표면 수용체의 큰 패밀리의 구성원이다. 이것은 α쇄와 β쇄의 상이한 조합의 비-공유 αβ 이종이량체로서 존재하고, 상당한 구조적 상동성을 공유한다. 인테그린은 광범위한 생리학적 과정을 매개하고, 광범위한 병리학적 병태에 관련된다. α4 쇄는 대체로 백혈구 제한적이며, 2개의 쇄, 즉 β1 및 β7과 연관될 수 있다.
VLA-4(α4β1라고도 지칭됨) 및 α4β7은 염증성 질환의 병태생리학에서 중심적인 역할을 한다. VLA-4는 세포 표면 수용체의 β1 인테그린 패밀리의 구성원이다. VLA-4는 α4 쇄 및 β1 쇄를 함유하고, 세포-세포 상호작용에 관여된다. 이의 발현은 주로 T 림프구를 포함한 림프 세포와 및 미세아교 세포 및 대식세포를 포함한 골수 세포에 제한된다. VLA-4는 내피 세포 리간드 VCAM-1(혈관 세포 접착 분자(Vascular Cell Adhesion Molecule)-1)에 결합하고, 인간 혈장 피브로넥틴의 헤파린 II 결합 단편에 대한 T 및 B 림프구 부착을 매개할 수 있다. VLA-4는 정상 백혈구 트래피킹(trafficking)을 조절하고(Lobb and Hemler, J. Clin. Invest. 94(5): 1722-1728, 1994), 세포 활성화를 지원하는 주요 공-자극 신호를 제공한다(Clark and Brugge, Science 268(5208):233-9, 1995). 염증 반응 동안, VLA-4는 손상된 조직으로의 백혈구 이동을 조절하고, 따라서 매력적인 치료 표적으로 인식되어 왔다. 차단 단클론성 항체를 사용한 생체내 연구(Lobb and Hemler, supra; Enders et al., Brain 121 (Pt 7):1257-66, 1998; Ramos-Barbon et al., Am J Respir Crit Care Med. 163(1):101-8. 2001), 저해 펩타이드(Molossi et al., J Clin Invest. 95(6):2601-10,1995; Abraham, 1997; van der Laan et al., J Neurosci Res. 2002 Jan 15;67(2):191-9, 2002) 및 소분자 길항제(Kudlacz et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 301(2):747-52, 2002)는 백혈구-매개된 염증에서 α4β1 인테그린의 중요한 역할을 검증하였다.
α4β1은 2개의 단백질 리간드, VCAM-1 또는 피브로넥틴(예를 들어, 대안적으로 스플라이싱된 연결 분절 1(spliced connecting segment 1: CS1)-함유 피브로넥틴 변이체) 중 하나에 결합함으로써 세포 접착을 매개한다(Osborn et al., Cell 59(6):1203-11, 1989; Wayner et al., J. Cell Biol. 109(3):1321-30, 1989). 다른 잠재적인 리간드가 식별되어 있지만(Bayless et al., J. Cell Sci. 111 (Pt 9):1165-74, 1998); 이러한 상호작용의 생물학적 중요성은 명확하지 않다. α4β1과 이의 리간드 간의 상호작용은 친화도가 낮고, 결합은 아마도 다가 상호작용을 통해 조절된다. α4β1의 발현은 구성적이지만, 리간드와의 상호작용은 항원, 항 -T-세포 수용체 mAb, 포르볼 에스터, 2가 양이온 Mn2+ 및 특정 β1-특이적 항체를 포함한 다양한 자극에 의해 유도될 수 있는 활성화 상태에서 강하게 향상된다. 이러한 친화도 및/또는 결합활성의 이러한 변화는 궁극적으로 상호작용이 생산적이고, 리간드/인테그린 복합체를 안정화시키는지의 여부를 결정한다 (Humphries, Curr Opin Cell Biol. 8(5):632-40, 1996). α4β7은 더 제한된 백혈구 세트에 의해 발현되고, 점막 어드레신(mucosal addressin) MadCAM에 결합함으로써 림프구를 점막 림프 조직으로 귀소시키는 역할을 부분적으로 담당하지만, 그것은 VCAM-1 및 피브로넥틴에도 결합한다. α4에 대한 특정 단클론성 항체(mAb)는 VLA4 및 α4β7의 접착 기능을 차단할 수 있다.
인간화된 항체는 HAMA(Human Anti-Mouse Antibody(인간 항-마우스 항체)) 반응으로 명명된, 인간에서 바람직하지 않은 면역 반응을 피하기 위해서 뮤린 항체 대신에 치료제로서 사용될 수 있다. 인간화된 항체는 일반적으로 인간 항체의 상보성 결정 영역(complementary determining regions: CDRs)을 또 다른 종, 전형적으로 마우스 항체의 CDRs로 대체함으로써 작제된다.
항체는 가변 영역을 통해서 항원에 결합하는 능력을 갖는다. 항원이 항체에 의해서 결합되면 항원은 파괴를 위한 표적이 되는데, 이것은 종종 항체의 불변 영역 또는 Fc 영역에 의해서, 적어도 부분적으로 매개된다. 항체의 Fc 영역에 의해 매개되는 여러 효과기 기능 또는 활성이 존재한다. 하나의 효과기 기능은 보체-의존적 세포독성(CDC)이라고 명명된 과정에서 표적 항원, 예를 들어, 세포 병원체를 용해시키는데 도움이 될 수 있는 보체 단백질에 결합하는 능력이다. Fc 영역의 또 다른 효과기 활성은 다른 면역 효과를 촉발하는 능력을 갖는, 면역 세포 또는 소위 효과기 세포의 표면 상의 Fc 수용체(예를 들어, FcγR)에 결합하는 것이다. 이러한 면역 효과(예를 들어, 항체-의존적 세포 독성(ADCC) 및 항체-의존적 세포 식균작용(ADCP))은, 예를 들어, 면역 활성화제를 방출하고, 항체 생산, 세포내이입, 식세포 작용 및 세포 살해를 조절함으로써 병원체/항원을 제거하는데 작용한다. 일부 임상 응용에서 이러한 반응은 항체의 효능에 중요하지만, 다른 경우에는 이것은 원치 않는 부작용을 유발한다. 효과기-매개 부작용의 하나의 예는 급성 열 반응을 일으키는 염증성 사이토카인의 방출이다. 또 다른 예는 항원-보유 세포의 장기적 결실이다.
항체의 효과기 기능은 Fc 영역이 결여된 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 단일 쇄 Fv(scFv))을 사용함으로써 회피될 수 있다. 그러나, 이러한 단편은 신장을 통한 신속한 제거로 인해 감소된 반감기를 갖는다. Fab 및 scFv 단편은 2개가 아닌 단지 하나의 항원-결합 부위를 가지고 있는데, 이는 결합활성으로 인해 잠재적으로 임의의 이점을 손상시키고, 제조 시 잠재적인 문제를 제시한다. 대안적인 접근법은 Fc 영역의 다른 가치있는 속성(예를 들어, 연장된 반감기 및 이종이량체화)을 유지하면서, 전장 항체의 효과기 기능을 감소시키는 것을 목표로 한다. 효과기 기능을 감소시키는 한 가지 접근법은 Fc 영역의 특정 잔기에 연결된 당을 제거함으로써 소위 비글리코실화된(aglycosylated) 항체를 생성시키는 것이다. 비글리코실화된 항체는 예를 들어, 당이 부착된 잔기를 결실 또는 변경시키거나, 당을 효소에 의해서 제거하거나, 당화 저해제의 존재 하에 배양된 세포에서 항체를 생산하거나 또는 단백질을 글리코실화시킬 수 없는 세포(예를 들어, 박테리아 숙주 세포)에서 항체를 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 또 다른 접근법은 IgG1 대신 IgG4 항체로부터의 Fc 영역을 사용하는 것이다. IgG4 항체는 IgG1보다 더 낮은 수준의 보체 활성화 및 항체-의존적 세포 독성을 갖는 것을 특징으로 한다는 것이 널리 공지되어 있다.
인간 α4에 대한 단클론성 항체는 3개의 기능적으로 구별되는 지형적 에피토프, A, B 및 C에 결합한다(Pulido et al., J. Biol. Chem. 266:10241-10245, 1991; Schiffer et al., J. Biol. Chem. 270: 14270-14273, 1995). 에피토프 B는 지형적으로 구별 가능하지 않지만, 세포 응집을 유도하는 mAb의 능력에 의해서 정의되는 B1 에피토프 및 B2 에피토프로 세분된다. 에피토프 A 및 B2에 지향되는 항-α4 mAb는 동형성(homotypic) 세포 응집을 유도할 수 있지만, 에피토프 B1 및 C에 대해서 지향되는 것은 그렇지 않다.
본 발명은 CDR-그래프팅된 알파-4 결합 항체, 예컨대, 항-VLA-4 항체를 최적화할 수 있는 생식계열 가변 영역 프레임워크를 포함하는 항-VLA-4 항체 및 이의 결합 단편에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 항-VLA-4 가변 중(VH)쇄 및 가변 경(VL)쇄 및 이러한 프레임워크를 포함하는 항체 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, VLA-4는 인간 VLA-4이다. 일부 실시형태에서, VLA-4는 α4 쇄(예를 들어, 인간 α4 쇄)를 포함한다.
항체는 또한 변형된 Fc 영역을 함유할 수 있는데, 이것은 효과기 기능을 변경시키거나 감소시키고, 안정성을 개선시킨다. 변형된 Fc 영역을 갖는 항체는 올리고당류가 결여된 항체에서 발견되는 상당히 부정적인 효과, 특히 입체배좌 및 안정성에 대한 부정적인 효과를 개선시킬 수 있다. 변형된 Fc 영역을 갖는 항체는 또한 변경된 또는 감소된 효과기 기능 및 개선된 안정성을 가질 수 있다. 본 발명은 추가로 본 명세서에 기재된 분자의 제조 방법에 관한 것이다.
이러한 항체는 Fc 영역의 안정성을 향상시키는 개선된 방법을 제공함으로써 선행 기술 "효과기-적은(effector-less)" 항체의 문제점을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 폴리펩타이드의 Fc 영역 내에 안정화 아미노산을 포함하는, 안정성-조작된 Fc 폴리펩타이드, 예를 들어, 안정화된 IgG 항체 또는 다른 Fc-함유 결합 분자를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 Fc 영역의 향상된 안정성을 야기하는 모체 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역 내의 특정 아미노산 잔기 위치에 돌연변이를 도입하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 (안정화 아미노산(들)을 포함하지 않는 폴리펩타이드와 비교할 때) 변경된 또는 감소된 효과기 기능을 갖고, 모체 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 향상된 안정성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 인간 IgG1(예를 들어, 서열번호 83의 서열을 가짐)이다. 일부 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 인간 IgG4(예를 들어, 서열번호 84의 서열을 가짐)이다.
따라서, 본 명세서에 개시된 항체는 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 몇몇 이점을 제공할 수 있다:
- 감소된 효과기 기능으로 인해서 치료체로 적합한, 안정화된 비글리코실화된 Fc 영역을 포함하는 안정화된 비글리코실화된 Fc 폴리펩타이드, 예를 들어, 안정화된 융합 단백질 또는 비글리코실화된 IgG 항체를 제공함;
- 감소된 효과기 기능으로 인해서 치료제로 적합한, IgG4 항체, 예를 들어, 안정화된 글리코실화된 또는 비글리코실화된 융합 단백질 또는 IgG4 항체로부터 유래된 Fc 영역을 포함하는 안정화된 Fc 폴리펩타이드를 제공함;
- (예를 들어, 비안정화된 모 폴리펩타이드에 변화를 도입함으로써 또는 안정화된 Fc 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 발현함으로써) 폴리펩타이드에 대한 최소한의 변경으로 안정화된 Fc 폴리펩타이드를 생산하는 효율적인 방법;
- 면역원성 및/또는 효과기 기능에서의 임의의 증가를 회피하면서 Fc 폴리펩타이드의 안정성을 향상시키는 방법;
- Fc 폴리펩타이드의 확장성, 제조 및/또는 장기간 안정성을 향상시키는 방법; 및
- 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드를 사용하여 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
일 실시형태에서, 본 발명은 공여자 항-α4 항체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-α4 항체로부터의 CDR을 갖는 항-α4 항체 VH 쇄 및 VH 쇄에 대한 생식계열 가변 영역 서열의 서열로부터의 영역 1, 2, 3 및 4을 갖거나 또는 이것과 5, 10 또는 15개 이하의 차이를 갖는 VH 프레임워크를 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 가변 프레임워크 영역 4(FR4)는 인간 공통 서열이다. 일 실시형태에서, 완전한 VH 쇄 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 쇄는 VH 영역의 항원-결합 단편이다.
일 실시형태에서, 생식계열 서열은 도 1에 도시된 인간 IGHV1-f(서열번호 2)이다. 특정 실시형태에서, VH 프레임워크 서열은 생식계열 서열, 예를 들어, 서열번호 2와 적어도 하나이지만 2, 3, 4, 5, 10 또는 15개 이하의 아미노산 잔기가 상이할 수 있다. 일 실시형태에서, VH 프레임워크는 상응하는 인간 잔기 이외의 잔기를 추가로 포함한다. 예를 들어, VH 쇄는 서열번호 2의 24, 67, 76, 80 및 94번(카밧 넘버링) 프레임워크 위치 중 하나 이상에서 비-표준(non-canonical) 잔기를 포함한다.
일 실시형태에서, 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDRs) 중 적어도 하나 이상은 공여자 비-인간 α4-결합 항체(즉, α4에 특이적으로 결합하는 비-인간 항체)로부터 유래된다. 일 실시형태에서, CDR-그래프팅된 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 영역은 26 내지 34번 위치(CDR1), 50 내지 65번 위치(CDR2) 및 95 내지 102번 위치(CDR3)(카밧 넘버링)에 상응하는 CDRs을 포함한다.
따라서, 일 실시형태에서, 가변 중쇄(VH) 프레임워크는 인간 항체 생식계열 서열 IGHV1-f로부터 유래된 억셉터 서열을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, VH의 FR1 영역에서 적어도 하나의 아미노산 및 2, 3, 4, 5 또는 10개 미만의 아미노산 잔기는 상응하는 인간 생식계열 잔기 이외의 것이다. 이러한 잔기 중 하나 이상은 예를 들어, CDR 서열이 유래된 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일할 수 있다. 일 실시형태에서, 24번 카밧 위치에서의 아미노산 잔기는 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일하도록 돌연변이된다.
또 다른 실시형태에서, VH의 FR2 영역에서 적어도 하나의 아미노산 및 2, 3, 4, 5 또는 10개 미만의 아미노산 잔기는 상응하는 인간 생식계열 잔기 이외의 것이다. 이러한 잔기 중 하나 이상은 예를 들어, CDR 서열이 유래된 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일할 수 있다.
추가의 또 다른 실시형태에서, VH 쇄의 FR3에서 적어도 하나의 아미노산 및 2, 3, 4, 5 또는 10개 미만의 아미노산 잔기는 상응하는 인간 생식계열 잔기 이외의 것이다. 이러한 잔기 중 하나 이상은 예를 들어, CDR 서열이 유래된 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일할 수 있다. 일 실시형태에서, 94번 카밧 위치에서의 아미노산 잔기는 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일하다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 67, 76, 80 및 94번 카밧 위치에서 아미노산 잔기는 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일하다.
특정 실시형태에서, 항체의 VH 쇄는 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 서열을 갖는다.
일 양상에서, 본 발명은 공여자 항-VLA-4 항체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-VLA-4 항체로부터의 CDR을 갖는 항-VLA-4 VL 쇄 및VL 쇄에 대한 생식계열 가변 영역 서열의 서열로부터의 영역 1, 2, 3 및 4을 갖거나 또는 이것과 5, 10 또는 15개 이하의 차이(영역당 또는 총)를 갖는 VL 프레임워크를 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 가변 프레임워크 영역 4(FR4)는 인간 공통 서열이다. 일 실시형태에서, 완전한 VL 쇄 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 쇄는 VL 영역의 항원-결합 단편이다.
또 다른 실시형태에서, 생식계열 서열은 도 2에 도시된 IGKV4-1(서열번호 7)이다. 추가의 다른 실시형태에서, VL 프레임워크 서열은 생식계열 프레임워크 서열, 예를 들어, 서열번호 7과 적어도 하나이지만 2, 3, 4, 5, 10 또는 15개 이하의 아미노산 잔기가 상이할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, VL은 상응하는 인간 아미노산 잔기 이외의 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, VL 쇄는 서열번호 7의 1, 73 및 87번(카밧 넘버링) 프레임워크 위치 중 하나 이상에서 비-인간 잔기를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 서열은 도 2에 도시된 AAH7035.1(서열번호 12) 또는 이의 생식계열 조작된 버전(서열번호 13)이다. 일부 실시형태에서, VL 프레임워크 서열은 생식계열 조작된 프레임워크 서열, 예를 들어, 서열번호 13과 적어도 하나이지만 5, 10, 15, 20 또는 25개 이하의 아미노산 잔기가 상이할 수 있다. 일 실시형태에서, VL 쇄는 상응하는 인간 잔기 이외의 것을 포함한다. 예를 들어, VL 쇄는 서열번호 12의 1 및 87번(카밧 넘버링) 프레임워크 위치 중 하나 이상에서 비-인간 잔기를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, VL은 예컨대, 생식계열 서열 IGKV4-1과 상이한 인간 생식계열 프레임워크 서열과 유사하도록 프레임워크 영역 내에 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, VL 프레임워크 서열은 서열번호 12의 1 내지 3, 5 내지 23, 35 내지 37, 39 내지 42, 45 내지 49, 57, 59 내지 61, 63 내지 64, 70 내지 72, 74 내지 84, 86 내지 88, 99 내지 106번 위치(카밧 넘버링)에서 IGKV4-1 생식계열 서열과 동일하도록 변경된다.
일 실시형태에서, 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDRs) 중 적어도 하나 이상은 공여자 비-인간 α4-결합 항체로부터 유래된다. 또 다른 실시형태에서, CDR-그래프팅된 중쇄 가변 도메인의 항원 결합 영역은 24 내지 31번 위치(CDR1), 50 내지 56번 위치(CDR2) 및 89 내지 97번 위치(CDR3)(카밧 넘버링)에 상응하는 CDRs을 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, VL 프레임워크는 IGKV4-1 생식계열 서열, 항체 AAH70335.1 또는 생식계열 조작된 항체 AAH70335.1로부터 작제된 억셉터 서열을 갖는다.
추가의 또 다른 실시형태에서, VL 쇄의 FR1에서 적어도 하나의 아미노산 및 2, 3, 4, 5, 10 또는 15개 미만의 잔기는 상응하는 인간 잔기 이외의 것이다. 이러한 잔기 중 하나 이상은 예를 들어, CDR 서열이 유래된 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일할 수 있다. 일 실시형태에서, FR1의 N-말단 위치에서의 아미노산 잔기는 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일하도록 돌연변이된다.
또 다른 실시형태에서, VL 쇄의 FR2에서 적어도 하나의 아미노산 및 2, 3, 4, 5, 10 또는 15개 미만의 잔기는 상응하는 인간 잔기 이외의 것이다. 이러한 잔기 중 하나 이상은 예를 들어, CDR 서열이 유래된 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일할 수 있다.
추가의 또 다른 실시형태에서, VL의 FR3에서 적어도 하나의 아미노산 및 2, 3, 4, 5, 10 또는 15개 미만의 잔기는 상응하는 인간 잔기 이외의 것이다. 이러한 잔기 중 하나 이상은 예를 들어, CDR 서열이 유래된 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 87번 카밧 위치에서의 아미노산 잔기는 비인간 항체 프레임워크 영역과 동일하도록 돌연변이된다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 67 및 87번 카밧 위치에서의 아미노산 잔기는 비인간 항체 프레임워크 서열과 동일하도록 돌연변이된다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 서열번호 7의 67, 73 및 87번 카밧 위치에서의 아미노산 잔기는 비인간 항체 프레임워크 서열과 동일하도록 돌연변이된다.
다른 실시형태에서, 항체의 VL 쇄는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 또는 서열번호 11의 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, 항체의 VH 쇄는 서열번호 4의 서열을 갖고, 항체의 VL 쇄는 서열번호 11의 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, VH 및 VL 억셉터 프레임워크 서열의 CDRs은 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체 서열의 CDR 서열과 유사하도록 선택되고, 여기서 비인간 항체는 인테그린 알파-4 또는 이의 단편에 결합한다. 또 다른 실시형태에서, CDRs의 서열은 VLA-4 α4 쇄의 B1 에피토프에 결합하는 비-인간 항체의 CDRs의 서열과 유사하도록 선택된다. 일 실시형태에서, CDRs은 뮤린 단클론성 항체, 예를 들어, HP1/2, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2 또는 21.6과 유사하도록 선택된다(Pulido et al., J. Biol. Chem. 266:10241-10245, 1991; 미국 특허 제6,033,665호). 변형은 예를 들어, 직접 돌연변이유발(directed 돌연변이유발)에 의한 제거와 및 삽입 또는 변경을 의미할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 하기를 비롯한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다:
- 본 명세서에 기재된 항-VLA-4 VL 쇄, 예를 들어, 공여자 항-VLA-4 항체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-VLA-4 항체로부터의 CDR을 갖는 항-VLA-4 VL 쇄 및 VL 쇄에 대한 생식계열 가변 영역 서열의 서열로부터의 LC 프레임워크 영역 1, 2 및 3을 갖거나 또는 이것과 5, 10 또는 15개 이하의 차이를 갖는 VL 프레임워크. 일 실시형태에서, 가변 영역 4는 인간 공통 서열; 및
- 본 명세서에 기재된 항-VLA-4 VH 쇄, 예를 들어, 공여자 항-VLA-4 항체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-VLA-4 항체로부터의 CDR을 갖는 항-VLA-4 VL 쇄 및 VL 쇄에 대한 생식계열 가변 영역 서열의 서열로부터의 LC 프레임워크 영역 1, 2 및 3을 갖거나 또는 이것과 5, 10 또는 15개 이하의 차이를 갖는 VL 프레임워크이다. 일 실시형태에서, 가변 영역 4는 인간 공통 서열이다.
일 실시형태에서, 항체는 α4β1 및 α4β7 중 하나 또는 둘 다에 결합한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 VL 또는 VH 쇄 또는 항체, 또는 이의 단편은 검출 가능하게 표지된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 또는 K478의 결실부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편을 제공한다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 또는 K478의 결실로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이를 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 또는 K478의 결실로부터 선택된 적어도 3개의 돌연변이를 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 또는 K478의 결실로부터 선택된 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개의 돌연변이를 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 다음 돌연변이 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실을 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편을 제공하며, 이것은 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG4의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이를 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG4의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9 돌연변이를 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG4의 불변 중쇄 카밧 넘버링 체계에 따라서 다음 돌연변이 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실 중 하나 이상을 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다.
(카밧 넘버링 체계에 따라서 478번 위치에서) C'말단 라이신 잔기는 전형적으로 번역 후에 또는 아티피스(artifice)에 의해서 결실된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체(또는 이의 도메인의 Fc 부분)의 중쇄는 C 말단에서 라이신이 결여되어 있다. 다시 말해서, 일부 실시형태에서, 478번 위치(카밧 넘버링)에서 라이신은 본 명세서에 기재된 항체 (또는 이의 도메인의 Fc 부분)의 중쇄에서 결실되어 있다.
일부 실시형태에서, 돌연변이 또는 치환을 갖지 않는 인간 IgG1의 불변 중쇄는 서열번호 83의 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 돌연변이 또는 치환을 갖지 않는 인간 IgG4의 불변 중쇄는 서열번호 84의 서열을 갖는다.
추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 중쇄 또는 α4 이의 결합 단편을 암호화하는 DNA를 함유하는 벡터를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 벡터의 DNA는 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 서열을 갖는 VH를 암호화한다.
추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 경쇄 또는 α4 이의 결합 단편을 암호화하는 DNA를 함유하는 벡터를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 벡터의 DNA는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열을 갖는 VL 쇄를 암호화한다.
추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 중쇄 또는 α4 이의 결합 단편 및 본 명세서에 기재된 항체 경쇄 또는 α4 이의 결합 단편을 암호화하는 DNA를 함유하는 벡터를 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 벡터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 중쇄 및/또는 경쇄 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 것을 함유하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
일 양상에서, 본 발명은 (a) 본 명세서에 기재된 항체 중쇄 또는 이의 α4-결합 단편을 암호화하는 DNA 서열, 및 (b) 항체 경쇄 또는 이의 α4-결합 단편을 암호화하는 DNA 서열이 형질주입된 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 형질주입된 세포를 배양하여 재조합 항-α4 항체 분자 또는 α4 이의 결합 단편을 생산하는 단계에 의해서, 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 (a) 항체 중쇄 또는 이의 α4-결합 단편을 암호화하는 DNA 서열(예를 들어, 여기서 DNA 서열은 서열번호 4의 서열을 가짐), 및 (b) 항체 경쇄 또는 이의 α4-결합 단편을 암호화하는 DNA 서열(예를 들어, 여기서 DNA 서열은 서열번호 11의 서열을 가짐)이 형질주입된 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 형질주입된 세포주를 배양하여 재조합 항-α4 항체 분자 또는 α4 이의 결합 단편을 생산하는 단계에 의해서, 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 α4 인테그린, 예를 들어, α4β1(VLA-4) 또는 α4β7 인테그린에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 본 명세서에 기재된 α4 항체 또는 항체 단편 또는 이러한 항체 또는 단편을 함유하는 약제학적 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 대상체는 예를 들어, 염증, 면역 또는 자가면역 장애(예를 들어, 중추신경계의 염증, 예컨대, 다발성 경화증, 수막염, 시신경척수염, 신경유육종증, CNS 맥관염, 뇌염 및 횡단척수염), 조직 또는 장기 이식편 거부반응 또는 이식편-대-숙주병, 급성 CNS 손상, 예컨대, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury: TBI) 또는 척수 손상(SCI); 만성 신장 질환; 알레르기, 예를 들어, 알레르기성 천식; 1형 진성 당뇨병; 염증성 장 장애, 예컨대, 크론병, 궤양성 대장염; 중증근무력증; 섬유근육통; 관절염 장애, 예컨대, 류머티스 관절염, 건선성 관절염; 염증/면역 피부 장애, 예컨대, 건선, 백반증, 피부염, 편평태선; 전신성 홍반성 루푸스; 쇼그렌 증후군; 혈액암, 예컨대, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종; 고형암, 예컨대, 폐, 유방, 전립선, 뇌의 육종 또는 암종; 및 섬유증 장애, 예컨대, 폐 섬유증, 골수섬유증, 간 경변, 사구체간질 증식성 사구체신염, 반월형 사구체신염, 당뇨병성 신증 및 콩팥 사이질 섬유증을 가질 수 있거나 발달할 위험이 있을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 다발성 경화증을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법 또는 다발성 경화증, 예컨대, 임상 단독 증후군(clinically isolated syndrome), 재발 경감 다발성 경화증(relapsing remitting multiple sclerosis) 또는 활성 2차 진행성 다발성 경화증(active secondary progressive multiple sclerosis)을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 다발성 경화증은 다발성 경화증의 재발 형태이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 약물-내성 뇌전증(epilepsy)을 비롯한 뇌전증을 갖거나 이의 발달 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 대상체 또는 환자는 인간이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 환자에게 α4-결합 항체 또는 항체 단편을 투여함으로써 환자를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 환자는 암, 예컨대, 고형 종양 또는 혈액 악성종양을 갖는다. 예를 들어, α4-결합 항체 또는 항체 단편으로 치료된 환자는 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 다발성 골수종(MM)을 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 환자는 염증성 장애, 예컨대, 다발성 경화증, 천식(예를 들어, 중등도 내지 중증 천식), 류마티스 관절염, 당뇨병 또는 크론병을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 요법으로서 투여된다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 방법은 조성물로의 치료에 적합한 환자를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 치료에 적합한 환자는 예를 들어, 질환 발병을 나타내는 징후 또는 증상, 예를 들어, MS를 나타내는 징후 또는 증상을 나타내었다. 바람직한 실시형태에서, 환자는 뇌전증을 갖는다.
특정 실시형태에서, 환자는 치료적 유효량의 α4-결합 항체 또는 항체 단편이 투여된다. 특정 실시형태에서, 환자는 약 0.0003㎎/㎏, 0.0004㎎/㎏, 0.0005㎎/㎏, 0.0006㎎/㎏, 0.0007㎎/㎏, 0.0008㎎/㎏, 0.0009㎎/㎏, 0.0010㎎/㎏, 0.0015㎎/㎏ 또는 0.0020㎎/㎏ 내지 약 0.0025㎎/㎏, 0.003㎎/㎏, 0.005㎎/㎏, 0.010㎎/㎏, 0.0125㎎/㎏, 0.025㎎/㎏, 0.050㎎/㎏, 0.0625㎎/㎏, 0.080㎎/㎏, 0.100㎎/㎏, 0.200㎎/㎏, 0.300㎎/㎏, 0.3125㎎/㎏, 0.40㎎/㎏, 0.50㎎/㎏, 0.6㎎/㎏, 0.7㎎/㎏, 0.8㎎/㎏, 0.9㎎/㎏, 1㎎/㎏, 1.5㎎/㎏, 2㎎/㎏, 3㎎/㎏, 4㎎/㎏, 5㎎/㎏, 6㎎/㎏, 7㎎/㎏, 8㎎/㎏, 9㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏의 범위의 양으로 α4-결합 항체 또는 항체 단편이 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 0.025㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 양의 α4-결합 항체 또는 항체 단편이 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 0.0625㎎/㎏ 내지 약 8.0㎎/㎏의 양의 α4-결합 항체 또는 항체 단편이 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 0.3㎎/㎏ 내지 약 6.0㎎/㎏의 양의 α4-결합 항체 또는 항체 단편이 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 5.0㎎/㎏의 양의 α4-결합 항체 또는 항체 단편이 투여된다.
추가의 또 다른 실시형태에서, 방법은 환자에게 제2 작용제, 예컨대, 화학치료제, 혈전용해제, 신경보호제, 소염제, 스테로이드, 사이토카인 또는 성장 인자를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 환자는 본 명세서에 기재된 인간화된 항-VLA-4 항체, 또는 이의 단편, 예컨대, HuHP1/2, H1L1, H1L2 또는 H1L3이 투여된다.
일 실시형태에서, α4-결합 항체를 함유하는 조성물은 예컨대, 규칙적인 간격으로서 요법으로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 1일 1회, 주 1회 또는 월 1회; 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회 또는 그 이상; 또는 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회 또는 그 초과로 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 투여는 항-α4 항체의 이전 투여의 환자 청소율(rate of clearance)에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 환자는 환자의 신체 내에서 항-α4 항체의 수준이 미리 결정된 수준 미만으로 떨어지기 이전에, 제2 또는 후속 용량이 투여되지 않을 것이다. 일 실시형태에서, 환자로부터 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 혈액 또는 소변 샘플)을 항-α4 항체의 존재에 대해서 검정하고, 항-α4 항체의 수준이 미리 결정된 수준을 초과하면, 환자는 제2 또는 후속 용량이 투여되지 않을 것이다. 환자의 신체 내에서 항-α4 항체의 수준이 미리 결정된 수준 미만이면, 환자는 제2 또는 후속 용량이 투여된다.
일 실시형태에서, 조성물은 예를 들어, 30분 이상, 그러나 1, 2, 4, 또는 12시간 미만의 기간에 걸쳐 연속적으로 투여된다. 이러한 항체 및 제2 작용제를 함유하는 조성물은 임의의 적절한 방법에 의해, 예컨대, 피하, 근육내, 또는 정맥내 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이러한 항체 및 제2 작용제 각각은 각각이 단일 요법 (monotherapy)을 위해 처방될 때와 동일한 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 항체는 단독으로 투여될 때 효능을 위해 요구되는 양과 동등하거나 이보다 적은 투여량(dosage)으로 투여된다. 유사하게, 제2 작용제는 단독으로 투여될 때 효능을 위해 요구되는 양과 동등하거나 이보다 적은 용량으로 투여될 수 있다.
본 개시내용에서 특징으로 하는 또 양상은 환자가 미리 선택된 기준을 충족하는 지, 그리고 환자가 본 명세서에 기재된 VLA-4 결합 항체 제형을 승인하거나, 제공하거나, 처방하거나, 또는 이를 환자에 투여하기 위한 미리 선택된 기준을 충족하는지를 결정함으로써 환자를 평가하는 방법이다. 일 실시형태에서, 미리 선택된 기준은 환자가 예를 들어, MS의 치료를 위한 이전의 대안적 치료적 치료 또는 요법에 적절하게 반응하지 못하는 것이다. 또 다른 실시형태에서, 미리 선택된 기준은 진행성 다초점백질뇌증(progressive multifocal leukoencephalopathy: PML)의 임의의 징후 또는 증상의 부재, 또는 PML의 진단의 부재이다. 일부 사례에서, 선택은 PML에 대한 위험 인자의 부재에 기초하고, 예를 들어, 대상체는 JC 바이러스 DNA에 대해 양성인 것으로 시험되지 않거나, 또는 JC 바이러스 항체에 대해 양성인 것으로 시험되지 않는다. 또 다른 실시형태예에서, 기준은 본 발명에 참조에 의해 포함된 PCT/US07/75577(WO2008/021954로서 공개됨)에서 기재된 바와 같은데, 이는 약물 유통 및 환자에게 약물을 제공하기 위한 방법 및 시스템을 기재한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 조성물을 유통시키는 방법이 제공된다. 이러한 조성물은 알파-4 결합 항체를 함유한다. 이러한 방법은 수용자(예를 들어, 최종 사용자, 환자, 의사, 소매 또는 도매 약국, 유통업자, 또는 병원내 약국, 요양 클리닉 또는 HMO)에게 적어도 6, 12, 24, 36, 또는 48개월 동안 환자를 치료할 수 있는 충분한 단위 투여량(unit dosage)의 약물을 함유하는 패키지를 제공하는 것을 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 (예를 들어, 이의 유통 기한이 만료되었는지를 결정하기 위해) 알파-4 결합 항체를 힘유하는 본 명세서에 기재된 조성물의 패키지 또는 패키지 로트의 품질을 평가하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 패키지의 유통 기한이 만료되었는지를 평가하는 것을 포함한다. 만료 일자는 미리 선택된 사건, 예컨대, 제조, 검정, 또는 포장으로부터 적어도 6, 12, 24, 36, 또는 48개월, 예컨대, 24 또는 36개월 초과이다. 일부 실시형태에서, 분석의 결과로서 결정 또는 조치가 행해진다. 예를 들어, 정확한 분석에 따라서, 패키지 내의 항체는 사용되거나 폐기되고, 분류되거나, 선별되거나, 방출되거나, 보류되거나, 선적되거나, 새로운 장소로 이동되거나, 판매용으로 방출되거나, 판매되거나 또는 제품의 유통 기한이 만료되었는지에 따라 판매용으로 제공되거나, 회수되거나, 또는 판매용으로 더 이상 제공되지 않는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 α4 결합 항체를 함유하는 수성 조성물의 적어도 2회 단위 용량을 함유하는 패키지를 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 모든 단위 용량은 동일한 양의 항체를 함유하고, 다른 실시형태에서 2가지 이상의 농도의 단위 투여량 또는 예를 들어, 상이한 농도 또는 방출 특성을 갖는 2개 이상의 상이한 제형이 존재한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 수용자에게 α4 결합 항체를 함유하는 제형의 투여에 대해서 지시하는 방법을 포함한다. 이 방법은 수용자(예를 들어, 최종 사용자, 환자, 의사, 소매 또는 도매 약국, 유통업자, 또는 병원내 약국, 요양 클리닉 또는 HMO)에게 항체가 본 명세서에 기재된 요법에 따라 환자에게 투여되어야 한다는 것을 지시하는 것을 포함한다. 이 방법은 또한 수용자에게 항체가 만료 일자 이전에 투여되어야 한다는 것을 지시하는 것을 포함한다. 만료 일자는 미리 선택된 사건, 예컨대, 제조, 검정, 또는 포장으로부터 적어도 6, 12, 24, 36, 또는 48개월, 예컨대, 24 또는 36개월 초과이다. 일 실시형태에서, 수용자는 또한, 항체, 예를 들어, 항체의 단위 투여량이 공급된다.
일 실시형태에서, 안정화된 폴리펩타이드는 키메라 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 안정화된 폴리펩타이드는 인간 IgG4 항체로부터 유래된 적어도 하나의 불변 도메인 및 인간 IgG1 항체로부터 유래된 적어도 하나의 불변 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, Fc 영역은 글리코실화된 Fc 영역이다.
일 실시형태에서, Fc 영역은 비글리코실화된 Fc 영역이다.
일 실시형태에서, Fc 영역은 Fc 영역의 297번 위치(EU 넘버링), 314번 위치(카밧 넘버링)에 글루타민(Q)을 포함하는 비글리코실화된 Fc 영역이다.
일 실시형태에서, 키메라 Fc 영역은 IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역은 자연 발생 아르기닌(N) 잔기 대신에 Fc 영역의 297번 위치(EU 넘버링), 314번 위치(카밧 넘버링)에 글루타민(Q) 잔기를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 키메라 Fc 영역은 IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 힌지, CH1 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 항체는 228번 아미노산 위치(EU 넘버링), 241번 위치(카밧 넘버링)에 프롤린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 Fc 영역은 IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 힌지, CH1 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 항체는 228번 아미노산 위치(EU 넘버링), 241번 위치(카밧 넘버링)에 프롤린을 포함하고, 자연 발생 아르기닌(N) 잔기 대신에 Fc 영역의 297번 위치(EU 넘버링), 314번 위치(카밧 넘버링)에 글루타민(Q) 잔기를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, IgG 항체는 인간 항체이다.
일 실시형태에서, 비글리코실화된 Fc 영역은 키메라 힌지 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 키메라 힌지 도메인은 228번 아미노산 위치(EU 넘버링), 241번 위치(카밧 넘버링)에서 프롤린 잔기로의 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, 항체는 서열번호 4의 서열을 갖는 VH 쇄, 서열번호 11의 서열을 갖는 VL 쇄, 힌지, IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH1 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역을 포함하며, 여기서 항체는 CH2 영역 내의 297번 위치(EU 넘버링), 314번 위치(카밧 넘버링)에서 글루타민 잔기(Q)로의 치환; 힌지 영역 내의 228번 아미노산 위치(EU 넘버링), 241번 위치(카밧 넘버링)에서 프롤린 잔기(P)로의 치환; 및 CH3 영역 내의 447번 EU 넘버링 위치(478번 카밧 넘버링 위치)에서 라이신(K)의 결실을 포함한다.
일 실시형태에서, 항체는 서열번호 80의 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 81의 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
일 실시형태에서, 항체는 IgG4(야생형; 글리코실화된)에 대한 HP1/2 H1 중쇄인 서열번호 86의 중쇄를 포함한다.
일 실시형태에서, 항체는 IgG4 S228P(EU 넘버링)(IgG4P라고도 알려짐; 글리코실화된)에 대한 HP1/2 중쇄인 서열번호 87의 중쇄를 포함한다.
일 실시형태에서, 항체는 IgG4 S228P L235E(EU 넘버링)(IgG4PE라고도 알려짐; 글리코실화된)에 대한 HP1/2 H1 중쇄인 서열번호 88의 중쇄를 포함한다.
일 실시형태에서, 항체는 IgG4 S228P T299A(EU 넘버링)(비글리코실)에 대한 HP1/2 H1 중쇄인 서열번호 89의 중쇄를 포함한다.
일 실시형태에서, 항체는 IgG1 N297Q(EU 넘버링)(비글리코실)에 대한 HP1/2 H1 중쇄인 서열번호 90의 중쇄를 포함한다.
특정 치료용 항체, 예를 들어, IgG4 불변 영역을 갖는 것에서, 스크램블링(scrambling)은 치료용 항체의 표적(예를 들어, VLA4)에 대해서 1가이고, 또 다른 항원에 대해서 1가인 이중특이적 단클론성 항체를 초래할 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 스크램블링을 제거하거나 스크램블링에 대한 항체의 민감성을 감소시킴으로써 PK/PD 가변성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 2가 단클론성 항체와 함께 효력을 증가시킬 수 있고, 스크램블링으로 인해서 이중특이성을 제거할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 이의 비-돌연변이된 반대부분보다 더 높은 결합 친화도를 나타내고/내거나 더 높은 지속적인 수용체 점유율을 나타낼 수 잇다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명할 것이다.
VLA-4에 대한 항체는 질환을 치료하는데 유용한 것으로 입증되어 있다. 예를 들어, 항-VLA-4 항체인 나탈리주맙(TYSABRI®)은 재발성 다발성 경화증 및 크론병을 치료하는데 사용된다. 그러나, 특정 질환, 예를 들어, 급성 질환, 예컨대, 척수 손상(spinal cord injury: SCI) 또는 외상성 뇌 손상(TBI)의 치료 또는 한정된 횟수로 투여되는 치료, 예컨대, 암의 치료를 위해, 나탈리주맙과 상이한 친화도, 예컨대, 더 높은 친화도 및/또는 상이한 약리학 프로파일(예를 들어, 생체내에서 낮은 약동학/약력학적 가변성을 가짐)로 결합하는 항-VLA-4 항체로 치료하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 항체는 또한 더 적은 빈도의 치료가 요구되거나, 또는 주입 (infusion) 이외의 수단에 의한 투여가 더욱 효율적일 수 있다는 점에서, 다발성 경화증과 같은 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 더 적은 용량으로 치료를 가능하게 하는 것은 또한, PML과 같은 부작용의 위험을 낮출 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 목적하는 특성을 갖는 항체를 제공한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 특정 항체는 항-α4 항체 나탈리주맙보다 10-배 더 높은 α4에 대한 결합 친화도를 갖는 새로 설계된 인간화된 α4-결합 항체의 예상치 못한 특성에 적어도 부분적으로 기초한다.
이러한 항체는 또한 예를 들어, Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역에 하나 이상의 안정화 아미노산을 포함시킴으로써, 감소된 효과기 기능을 갖는 안정화된 Fc 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, 안정화 아미노산은 폴리펩타이드의 글리코실화 및/또는 효과기 기능에 영향을 주지 않으면서 폴리펩타이드의 Fc 영역을 안정화시키고, 폴리펩타이드의 다른 목적하는 기능(예를 들어, 항원 결합 친화도 또는 반감기)을 상당히 변경시키지 않는다.
본 명세서 및 청구범위의 명확한 이해를 제공하기 위해서, 하기 정의를 하기에 편리하게 제공한다.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효과기 기능"은 면역계의 단백질 및/또는 세포에 결합하고, 다양한 생물학적 효과를 매개하는 Fc 영역 또는 이의 부분의 기능적 능력을 지칭한다. 효과기 기능은 항원-의존적이거나, 항원-독립적일 수 있다. 효과기 기능의 감소는 항체(또는 이의 단편)의 가변 영역의 항원 결합 활성을 유지시키면서 하나 이상의 효과기 기능이 감소하는 것을 지칭한다. 효과기 기능, 예컨대, Fc 수용체 또는 보체 단백질에 대한 Fc 결합의 증가 또는 감소는 배수 변화(예를 들어, 1배, 2배 등으로 변화됨)로 표현될 수 있으며, 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 검정을 사용하여 결정된 결합 활성에 있어서의 변화 백분율에 기초하여 계산될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-의존적 효과기 기능"은 상응하는 항원에 대한 항체의 결합 이후에 일반적으로 유도되는 효과기 기능을 지칭한다. 전형적인 항원-의존적 효과기 기능은 보체 단백질(예를 들어, C1q)에 결합하는 능력을 포함한다. 예를 들어, Fc 영역에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체-의존적 세포독성(CDCC)이라 칭하는 과정인 세포 병원체의 옵소닌작용 (opsonisation) 및 용해로 이어지는 고전적 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다. 보체의 활성화는 또한, 염증 반응을 자극하며, 자가면역 과민성에 연관될 수도 있다.
다른 항원-의존적 효과기 기능은 이의 Fc 영역을 통한 세포상의 특정한 Fc 수용체("FcR")에 대한 항체의 결합에 의해서 매개된다. IgG(감마 수용체, 또는 IgγR), IgE(엡실론 수용체 또는 IgεR), IgA(알파 수용체, 또는 IgαR) 및 IgM(뮤 수용체, 또는 IgμR)을 포함한 상이한 클래스의 항체에 대해 특이적인 다수의 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 면역 복합체의 엔도사이토시스, 항체-코팅된 입자 또는 미생물의 포획 및 파괴(또한, 항체-의존적 식작용, 또는 ADCP라 칭함), 면역 복합체의 청소, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해(항체-의존적 세포 세포독성, 또는 ADCC라 칭 함), 염증 매개체의 방출, 면역계 세포 활성화의 조절, 태반 전이 및 면역글로불린 생산의 조절을 포함한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 유발한다. 특정 Fc 수용체인 Fc 감마 수용체(FcγR)는 면역 동원을 저지하거나 증진시키는데 중요한 역할을 한다. FcγR은 백혈구 상에서 발현되며, 3개의 구별되는 클래스인 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII으로 구성된다(Gessner et al., Ann. Hematol., (1998), 76: 231-48). 구조적으로, FcγR은 2개 또는 3개의 Ig-유사 도메인으로 구성된 세포외 부분과 함께 IgG-결합 α-쇄를 갖는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 모든 구성원이다. 인간 FcγRI(CD64)은 인간 단핵구 상에서 발현되며, 단량체 IgG1, IgG3, 및 IgG4에 대해서 높은 친화도 결합(Ka=108 내지 109M-1)을 나타낸다. 인간 FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)은 IgG1 및 IgG3에 대해서 낮은 친화도를 가지며(Ka <107M-1), 단지 이들 IgG 아이소타입의 복합체 또는 중합체 형태에만 결합할 수 있다. 더욱이, FcγRII 및 FcγRIII 클래스는 "A" 및 "B" 형태 둘 다를 포함한다. FcγRIIa(CD32a) 및 FcγRIIIa(CD16a)는 막관통 도메인에 의해서 대식세포, NK 세포 및 일부 T 세포의 표면에 결합되는 반면, FcγRIIb(CD32b) 및 FcγRIIIb (CD16b)는 포스파티딜 이노시톨 글리칸(GPI) 고정자(anchor)를 통해서 과립구(예컨대, 호중구)의 세포 표면에 선택적으로 결합된다. 인간 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII의 각각의 뮤린 동족체는 FcγRIIa, FcγRIIb/1 및 FcγR1o이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-독립적 효과기 기능"은 항체가 이의 상응하는 항원에 결합하였는지 여부와 무관하게, 항체에 의해서 유도될 수 있는 효과기 기능을 지칭한다. 전형적인 항원-의존적 효과기 기능은 세포 수송, 면역글로불린의 순환 반감기 및 청소율 및 정제의 촉진을 포함한다. 구제(salvage) 수용체로도 또한 공지된 구조적으로 고유한 Fc 수용체인 "신생아(neonatal) Fc 수용체" 또는 "FcRn"은 반감기 및 세포 수송에 중요한 역할을 한다. 미생물 세포로부터 정제된 다른 Fc 수용체(예를 들어, 스타필로코쿠스 단백질((Staphylococcal Protein) A 또는 G)는 높은 친화도로 Fc 영역에 결합할 수 있으며, Fc-함유 폴리펩타이드의 정제를 촉진시키기 위해서 사용될 수 있다.
면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 FcγR과는 달리, 인간 FcRn은 주요 조직부적합 복합체(Major Histoincompatibility Complex; MHC) 클래스 I의 폴리펩타이드와 구조적으로 유사하다(Ghetie and Ward, Immunology Today, (1997), 18(12): 592-8). FcRn은 일반적으로, 가용성 β 또는 경쇄(β2 마이크로글로불린)과의 복합체 내의 막관통 α 또는 중쇄로 이루어진 이종이량체로 발현된다. FcRn은 클래스 I MHC 분자와 22 내지 29% 서열 동일성을 공유하며, MHC 펩타이드 결합 홈(groove)의 비-기능성 버전을 갖는다(Simister and Mostov, Nature, (1989), 337: 184-7). MHC와 마찬가지로, FcRn의 α 쇄는 3개의 세포외 도메인(α1, α2, α3)으로 구성되며, 짧은 세포질 꼬리는 단백질을 세포 표면에 고정시킨다. α1 도메인 및 α2 도메인은 항체의 Fc 부분 내의 FcR 결합 부위와 상호작용한다(Raghavan et al, Immunity, (1994), 1: 303-15). FcRn은 포유동물의 모체측 태반 또는 난황낭에서 발현되며, 이것은 모체로부터 태아에게로 IgG를 전이시키는데 연루된다. FcRn은 또한 설치류 신생아의 소장에서 발현되며, 여기에서 이것은 섭취된 초유 또는 모유로부터 모체 IgG를 솔 가장자리 상피를 가로질러서 전이시키는데 관여된다. FcRn은 또한 다수의 종에 걸쳐서 다수의 다른 조직뿐만 아니라 다양한 내피 세포주에서도 발현된다. 이것은 또한 인간 성인 혈관 내피세포 근육 맥관구조 및 간 동양혈관 (sinusoid)에서도 발현된다. FcRn은 IgG에 결합하고, 이것을 혈청에 재순환시킴으로써 IgG의 순환 반감기 또는 혈청 수준을 유지시키는데 추가의 역할을 하는 것으로 생각된다. IgG 분자에 대한 FcRn의 결합은 엄밀히 pH 의존적인데, 최상의 결합은 7.0 미만의 pH에서 일어난다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "반감기"는 생체내에서 특정 결합 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 지칭한다. 반감기는 대상체에게 투여된 양의 절반이 순환 및/또는 동물 내의 다른 조직으로부터 청소되도록 하 는데 필요한 시간으로 나타낼 수 있다. 주어진 결합 폴리펩타이드의 청소 곡선이 시간의 함수로서 구축되는 경우에, 곡선은 통상적으로 급속한 α-상 및 더 긴 β-상을 갖는 이상 (biphasic)이다. α-상은 전형적으로 혈관내 공간과 혈관외 공간 사이에 투여된 Fc 폴리펩타이드의 평형을 나타내며, 부분적으로 폴리펩타이드의 크기에 의해서 결정된다. β-상은 전형적으로 혈관내 공간에서의 결합 폴리펩타이드의 이화작용을 나타낸다. 따라서, 비제한적인 실시형태에서, 본 명세서에서 사용된 용어 반감기는 β-상에서의 결합 폴리펩타이드의 반감기를 지칭한다. 인간에게서 인간 항체의 전형적인 β상 반감기는 21일이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 자연 아미노산 또는 비-자연 아미노산 중 2개 이상의 중합체를 지칭한다. 용어 "Fc 폴리펩타이드"는 Fc 영역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 모이어티)를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 본 발명의 방법에 따라서 안정화된다. 선택적인 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역(또는 이의 부분)에 작동 가능하게 연결되거나 융합된 결합 부위를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 폴리펩타이드(예를 들어, Fc 폴리펩타이드) 또는 하나 초과의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 지칭한다. 따라서, 단백질은 단량체(예를 들어, 단일 Fc 폴리펩타이드) 또는 다량체일 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 이량체이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 이량체는 2개의 동일한 단량체 소단위 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 2개의 동일한 Fc 폴리펩타이드)를 포함하는 동종이량체이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 이량체는 2개의 동일하지 않은 단량체 소단위 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 2개의 동일하지 않은 Fc 폴리펩타이드 또는 Fc 폴리펩타이드 및 Fc 폴리펩타이드 이외의 제2 폴리펩타이드)를 포함하는 이종이량체이다. 이량체의 소단위는 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드 쇄 중 적어도 하나는 Fc 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 이량체는 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄(예를 들어, 적어도 2개의 Fc 폴리펩타이드 쇄)를 포함한다. 일 실시형태에서, 이량체는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 여기서 쇄 중 하나 또는 둘 다는 Fc 폴리펩타이드 쇄이다. 또 다른 실시형태에서, 이량체는 3개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 여기서 폴리펩타이드 쇄 중 1개, 2개 또는 모두는 Fc 폴리펩타이드 쇄이다. 또 다른 실시형태에서, 이량체는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 여기서 폴리펩타이드 쇄 중 1개, 2개, 3개 또는 모두는 Fc 폴리펩타이드 쇄이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 수단에 의해 2개 초과의 요소 또는 성분을 함께 모으는 것을 지칭한다. 화학 접합 방법(예를 들어, 이종이기능성 가교결합제 사용)이 당업계에 공지되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 융합된" 또는 "유전자 융합"은 단백질, 폴리펩타이드 또는 단편을 암호화하는 단일 폴리뉴클레오타이드 분자의 유전자 발현을 통해서, 이의 개별 펩타이드의 골격을 통한 2종 이상의 단백질, 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 공동 선형, 공유 연결부 또는 부착을 지칭한다. 이러한 유전자 융합은 단일 인접 유전자 서열의 발현을 야기한다. 일부 실시형태에서, 유전자 융합은 인 프레임(in frame)이며, 즉, 2개 이상의 오픈 리딩 프레임(open reading frames: ORFs)본래 ORFs의 올바른 리딩 프레임을 유지하는 방식으로, 연속적인 더 긴 ORF를 형성하도록 융합된다. 따라서 재조합 융합 단백질은 본래 ORFs에 의해 암호화되는 폴리펩타이드에 상응하는 둘 이상의 단백질 분절을 함유하는 단일 단백질이다 (이 단편은 보통 자연에서는 이렇게 연결되지 않음). 따라서 리딩 프레임은 융합된 유전자 분절 전체에서 연속적으로 제조되지만, 단백질 단편은 예를 들어, 인-프레임 폴리펩타이드 링커에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 항체 중쇄의 2개 이상의 Fc 모이어티에 의해서 형성된 면역글로불린의 부분으로서 정의되어야 한다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 이량체 Fc 영역이다. "이량체 Fc 영역" 또는 "dcFc"는 2개의 별개의 면역글로불린 중쇄의 Fc 모이어티에 의해서 형성된 이량체를 지칭한다. 이량체 Fc 영역은 2개의 동일한 Fc 모이어티(예를 들어, 자연 발생 면역글로불린의 Fc 영역)의 동종이량체 또는 2개의 동일하지 않은 Fc 모이어티의 이종이량체일 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 영역은 단량체 또는 "단일-쇄" Fc 영역(즉, scFc 영역)이다. 단일 쇄 Fc 영역은 단일 폴리펩타이드 쇄(즉, 단일 인접한 유전자 서열에 암호화됨) 내에 유전자에 의해서 연결된 Fc 모이어티로 구성된다. 예시적인 scFc 영역은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 PCT 출원 제PCT/US2008/006260호(출원일 2008년 5월 14일)에 개시되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 모이어티"는 파파인 절단 부위 바로 상류의 힌지 영역(즉, 잔기 226, 카밧 넘버링/잔기 216, IgG에서의 EU 넘버링, 중쇄 불변 영역의 제1 잔기를 114라고 간주함)에서 시작하고 면역글로불린 중쇄의 C-말단에서 끝나는 면역글로불린 중쇄의 부분으로부터 유래된 서열을 지칭한다. 따라서, Fc 모이어티는 완전한 Fc 모이어티 또는 이의 부분(예를 들어, 도메인)일 수 있다. 완전한 Fc 모이어티는 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인(즉, 카밧 아미노산 위치 226 내지 477; EU 아미노산 위치 216 내지 446)을 포함한다. 추가적인 라이신 잔기(K)가 때때로 Fc 모이어티의 최외곽 C-말단에 존재하지만, 종종 성숙 항체로부터 절단된다. Fc 영역 내의 아미노산 위치 각각은 달리 명시되지 않는 한 당업계에서 인식되는 EU 넘버링 시스템에 따라서 넘버링되었다. 특정 실시형태에서, Fc 모이어티는 힌지(예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 변이체, 부분 또는 이의 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 적어도 CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 모이어티는 완전한 Fc 모이어티이다. 다른 실시형태에서, Fc 모이어티는 자연 발생 Fc 모이어티에 비해서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 예를 들어, 힌지 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인(또는 이의 부분) 중 적어도 하나는 결실될 수 있다. 예를 들어, Fc 모이어티는 (i) CH2 도메인(또는 이의 부분)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 부분), (ii) CH3 도메인(또는 이의 부분)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 부분), (iii) CH3 도메인(또는 이의 부분)에 융합된 CH2 도메인(또는 이의 부분), (iv) CH2 도메인(또는 이의 부분), 및 (v) CH3 도메인 또는 이의 부분을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
항체에서 아미노산 잔기는 그 자신의 넘버링 체계를 갖는다는 것은 주목해야 한다. 간행물[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., vol. 4, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA]은 때로는 카밧 등의 문헌에서와 같은 EU 인덱스 넘버링이라고도 지칭되는 넘버링 체계를 언급한다. 그러나, 시간이 지남에 따라서, 카밧 넘버링이라고 지칭되는 새로운 넘버링 체계가 출현하였다.
비제한적인 예에서, 하기 표는 인간 IgG1의 중쇄 CH1, CH2 및 CH3 도메인의 EU 넘버링과 카밧 넘버링의 비교를 제시한다. 인간 IgG1의 불변 영역의 서열을 서열번호 83에 제공한다는 것을 주목해야 한다.
상기 표의 아미노산 잔기는 자연 발생하거나 인간 IgG1에서 표준인 것을 주목해야 한다. 따라서, 297번 위치(EU 넘버링)(이것은 카밧 넘버링에서 314번 위치임)에서의 표준 잔기는 아스파라긴(N)이다. 표준 잔기로부터의 아미노산 잔기의 임의의 변화를 치환 또는 돌연변이라고 지칭한다.
인간 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 유사성으로 인해서, 모든 IgG 분자의 불변 영역은 118번 EU 넘버링 위치(114번 카밧 넘버링 위치)에서의 알라닌 잔기에서 시작하여 447번 EU 넘버링 위치(478번 카밧 넘버링 위치)에서 C 말단에서의 라이신 잔기로 끝난다는 것을 주목해야 한다.
하기 표는 EU 넘버링에서 216번 위치(카밧 넘버링에서 226번 위치)에서 글루탐산 잔기에서 시작하는, 인간 IgG1의 힌지에서의 EU 넘버링과 카밧 넘버링의 상관관계를 나타낸다.
하기 표는 EU 넘버링에서 216번 위치(카밧 넘버링에서 226번 위치)에서 글루탐산 잔기에서 시작하는, 인간 IgG4의 힌지에서의 EU 넘버링과 카밧 넘버링의 상관관계를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 언급된 치환이 자연 발생 IgG1 또는 IgG4에 존재하는 경우, 치환을 나타내는 EU 또는 카밧 넘버링은 자연 발생 모 분자(또는 이의 도메인)의 넘버링을 지칭할 것이다. 예를 들어, IgG4의 힌지 내의 228번 위치에서의 세린이 예를 들어, 프롤린으로 돌연변이되는 경우, 돌연변이는 EU 넘버링으로 S228P 및 카밧 넘버링으로 S241P를 나타낼 것이다.
인간 IgG1의 자연 발생 중쇄의 전장 서열을 114번 위치(카밧 넘버링)인 118번 위치(EU 넘버링)에서 표준 알라닌 잔기에서 시작하는 서열번호 83으로 본 명세서에서 제공된다.
인간 IgG1의 자연 발생 중쇄의 전장 서열을 114번 위치(카밧 넘버링)인 118번 위치(EU 넘버링)에서 표준 알라닌 잔기에서 시작하는 서열번호 84로 본 명세서에서 제공된다.
본 명세서에서 언급된 바와 같이, 당업자는 자연-발생 Fc 모이어티에 의해서 부여되는 적어도 하나의 목적하는 기능을 유지하면서, Fc 모이어티가 자연 발생 면역글로불린 분자의 완전한 Fc 모이어티와 아미노산 서열이 달라지도록 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, Fc 모이어티는 FcRn 결합 또는 연장된 반감기에 필요하다고 당업계에 공지된 Fc 모이어티의 부분을 적어도 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, Fc 모이어티는 FcγR 결합에 필요하다고 당업계에 공지된 부분을 적어도 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 Fc 영역은 단백질 A 결합에 필요하다고 당업계에 공지된 부분을 적어도 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 Fc 모이어티는 단백질 G 결합에 필요하다고 당업계에 공지된 Fc 분자의 부분을 적어도 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 영역의 Fc 모이어티는 동일한 아이소타입을 갖는다.
예를 들어, Fc 모이어티는 IgG1 또는 IgG4 아이소타입의 면역글로불린(예를 들어, 인간 면역글로불린)으로부터 유래될 수 있다. 그러나, Fc 영역(또는 Fc 영역의 하나 이상의 Fc 모이어티)은 또한 키메라일 수 있다. 키메라 Fc 영역은 상이한 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래된 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이량체 또는 단일 -쇄 Fc 영역의 Fc 모이어티 중 적어도 2개는 상이한 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. 추가의 또는 대안적인 실시형태에서, 키메라 Fc 영역은 하나 이상의 키메라 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 Fc 영역 또는 모이어티는 제1 아이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG3 아이소타입)의 면역글로불린으로부터 유래된 하나 이상의 부분을 포함할 수 있고, Fc 영역 또는 모이어티의 나머지는 상이한 아이소타입을 갖는다. 예를 들어, Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역 또는 모이어티는 제1 아이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG4 아이소타입)의 면역글로불린으로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 제2 아이소타입(예를 들어, IgG3 아이소타입)의 면역글로불린으로부터의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, Fc 영역 또는 모이어티는 제2 아이소타입(예를 들어, IgG4 아이소타입)의 면역글로불린으로부터 유래된 힌지 및/또는 CH2 도메인 및 제2 아이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG3 아이소타입)의 면역글로불린으로부터의 CH3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 Fc 영역은 제1 아이소타입(예를 들어, IgG4 아이소타입)에 대한 면역글로불린으로부터의 Fc 모이어티(예를 들어, 완전한 Fc 모이어티) 및 제2 아이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG3 아이소타입)의 면역글로불린으로부터의 Fc 모이어티를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 면역글로불린으로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 면역글로불린으로부터의 CH3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 분자로부터의 CH1 도메인 및 CH2 도메인 및 IgG1 분자로부터의 CH3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, Fc 영역 또는 모이어티는 항체의 특정 아이소타입으로부터의 CH2 도메인의 일부, 예를 들어, CH2 도메인의 309 내지 360번 카밧 위치, 292 내지 340번 EU 위치를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 모이어티로부터 유래된 CH2의 292 내지 340번 위치(EU 넘버링), 309 내지 360번 위치(카밧 넘버링)에 아미노산을 포함하며, CH2의 나머지는 IgG1 모이어티로부터 유래된다(대안적으로, CH2의 292 내지 340(EU 넘버링) 309 내지 360(카밧 넘버링)은 IgG1 모이어티로부터 유래될 수 있고, CH2의 나머지는 IgG4 모이어티로부터 유래된다).
다른 실시형태에서, Fc 영역 또는 모이어티는 키메라 힌지 영역을 포함할 수 있다. 키메라 힌지는 부분적으로, IgG1, IgG2 또는 IgG4 분자(예를 들어, 상부 및 하부 중간 힌지 서열) 및 부분적으로 IgG3 분자(예를 들어, 중간 힌지 서열)로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예로서, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG1 분자로부터 부분적으로 그리고 IgG4 분자로부터 부분적으로 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 키메라 힌지는 IgG4 분자로부터의 상부 힌지 도메인 및 하부 힌지 도메인 및 IgG1 분자로부터의 중간 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 키메라 힌지는 IgG4 힌지 영역의 중간 힌지 도메인 내의 228번 EU 위치, 241번 카밧 위치에 프롤린 치환(Ser228Pro(EU 넘버링); Ser241Pro(카밧 넘버링))을 도입함으로써 제조될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 힌지는 IgG2 항체로부터 유래된 246 내지 249번 카밧 위치에 아미노산 및/또는 Ser228Pro(EU 넘버링) Ser241Pro(카밧 넘버링) 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서 힌지의 나머지 아미노산은 IgG4 항체(예를 들어, 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVAGP의 키메라 힌지)로부터 유래된다. 추가 키메라 힌지는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 출원 제10/880,320호에 기재되어 있다.
구체적으로 "Fc 영역"의 정의 내에는 "비글리코실화된 Fc 영역"이 포함된다. 명세서에서 사용되는 바와 같은 "비글리코실화된 Fc 영역"은 예를 들어, 이의 Fc 모이어티 중 하나 이상에서, 297번 EU 위치, 314번 카밧 위치에 N-글리코실화된 부위에서 공유 연결된 올리고당 또는 글리칸이 결여된 Fc 영역이다. 특정 실시형태에서 비글리코실화된 Fc 영역은 완전히 비글리코실화되어 있고, 즉, 이의 Fc 모이어티 모두는 탄수화물이 결여되어 있다. 다른 실시형태에서, 비글리코실화는 부분적으로 비글리코실화되어 있다(즉, 반(hemi)-글리코실화됨). 비글리코실화된 Fc 영역은 Fc 탄수화물이 예를 들어, 화학적으로 또는 효소에 의해서 제거된 Fc 영역인 탈글리코실화된 Fc 영역일 수 있다. 대안적으로, 비글리코실화된 Fc 영역은 단백질에 탄수화물을 자연적으로 부착하지 않는 유기체(예를 들어, 박테리아)에서의 발현에 의해서 또는 글리코실화된 머시너리가 유전자 조작에 의해서 결핍된 숙주 세포 또는 유기체에서의 발현에 의해서 또는 글리코실화된 저해제(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제 저해제)에 의해서, 예를 들어, 297 또는 299번 EU 위치, 314 또는 318번 카밧 위치에서의 N-글리코실화된 부위(예를 들어, Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr)에서 예를 들어, 글리코실화 패턴을 암호화하는 하나 또는 잔기들의 돌연변이에 의해서, Fc 탄수화물이 없이 발현되는 항체인, 비글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 대안적인 실시형태에서, Fc 영역은 "글리코실화된 Fc 영역"이고, 즉, 이것은 모든 사용 가능한 글리코실화 부위에서 완전히 글리코실화된다.
용어 "모체 Fc 폴리펩타이드"는 안정화가 바람직한 Fc 영역(예를 들어, IgG 항체)을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 효과기-적은 Fc 폴리펩타이드이다. 감소된 효과기 기능을 갖는 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 기재되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된 PCT 공개 제WO2010/085682호 참고). 따라서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 본 발명의 방법이 수행될 수 있는 본래 Fc 폴리펩타이드를 나타내고, 이것은 안정성 비교를 위해서 참조 지점으로 사용될 수 있다. 모체 폴리펩타이드는 자연 발생 서열의 기존의 아미노산 서열 변형(예컨대, 삽입, 결실 및/또는 다른 변경)을 갖지만 하나 이상의 안정화 아미노산이 결여된 네이티브(즉, 자연 발생) Fc 영역 또는 모이어티(예를 들어, 인간 IgG4 Fc 영역 또는 모이어티) 또는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
용어 "돌연변이" 또는 "돌연변이시키는"은 (예를 들어, 하나의 아미노산을 암호화하는 핵산의 코돈을, 예를 들어, 부위-지향된 돌연변이유발에 의해서, 변경시켜 상이한 아미노산을 암호화하는 코돈을 야기함으로써) 모체 Fc 폴리펩타이드에 돌연변이를 물리적으로 만드는 것 또는 (예를 들어, 모체 Fc 영역을 암호화하는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 공지함으로써 그리고 본 발명의 안정화된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 돌연변이시킬 필요 없이 모체 Fc 영역의 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자의 합성을 설계함으로써) 모체 Fc 영역에서 발견되지 않는 아미노산을 갖는 변이체 Fc 영역을 합성하는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
일 예시적인 실시형태에서, 모 Fc 폴리펩타이드는 효과기-적은 Fc 폴리펩타이드로부터의 Fc 영역을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "효과기-적은 Fc 폴리펩타이드"는 IgG1 아이소타입의 야생형의, 비글리코실화된 항체와 비교할 때 변경된 또는 감소된 효과기 기능을 갖는 Fc 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 감소된 또는 변경된 효과기 기능은 항체-의존적 효과기 기능, 예를 들어, ADCC 및/또는 ADCP이다. 일 실시형태에서, 효과기-적은 Fc 폴리펩타이드는 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역에서, 예를 들어, 비글리코실화된 Fc 영역에서 변형된 또는 감소된 글리코실화의 결과로 감소된 효과기 기능을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 효과기-적은 Fc 폴리펩타이드는 IgG4 Fc 영역 또는 이의 부분(예를 들어, IgG4 항체의 CH2 및/또는 CH3 도메인)의 혼입으로 인해서 감소된 효과기 기능을 갖는다.
용어 "변이체 Fc 폴리펩타이드" 또는 "Fc 변이체"는 모체 Fc 폴리펩타이드로부터 유래된 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. Fc 변이체는, 이것이 예를 들어, 적어도 하나의 Fc 안정화 돌연변이의 도입으로 인해서, 하나 이상의 안정화 아미노산 잔기를 포함한다는 점에서, 모체 Fc 폴리펩타이드와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 모체 폴리펩타이드의 서열과 서열이 동일하지만 하나 이상의 안정화 Fc 아미노산이 존재하는 Fc 영역(또는 Fc 모이어티)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 변이체는 모체 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 향상된 안정성을 가질 것이고, 선택적으로 모체 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 동등하거나 감소된 효과기 기능을 가질 것이다.
설계된 폴리펩타이드 또는 단백질"로부터 유래된" 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 기원을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 특정 서열로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 서열 또는 이의 일부와 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 여기서 이 일부는 적어도 10 내지 20개의 아미노산 또는 적어도 20 내지 30개의 아미노산 또는 적어도 30 내지 50개의 아미노산으로 이루어지거나 또는 이것은 서열에서 이의 기원을 갖는 것으로 당업자에게 달리 식별 가능하다. 폴리펩타이드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열에서 서로 이웃하는 잔기가 폴리펩타이드의 1차 구조에서 인접하는 아미노에서 카복실 말단 방향으로의 폴리펩타이드에서 아미노산의 순서이다. 또 다른 폴리펩타이드(예를 들어, 모체 Fc 폴리펩타이드)로부터 유래된 폴리펩타이드(예를 들어, 변이체 Fc 폴리펩타이드)는 출발 또는 모 폴리펩타이드에 비해서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 또 다른 아미노산 잔기로 대체되거나 또는 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 또는 결실을 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 자연 발생하지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변이체는 출발 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 필수적으로 갖는다. 비제한적인 실시형태에서, 변이체는 예를 들어, 변이체 분자 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 영역 또는 Fc 모이어티)의 전체 길이에 걸쳐서, 출발 폴리펩타이드의 아미노산과 약 75% 내지 100% 미만 또는 80% 내지 100% 미만, 또는 약 85% 내지 100% 미만, 또는 약 90% 내지 100% 미만(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 또는 약 95% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 일 실시형태에서, 출발 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 모체 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역)과 이로부터 유래된 서열(예를 들어, 변이체 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역) 사이에 하나의 아미노산 차이가 존재한다. 다른 실시형태에서, 출발 폴리펩타이드 서열과 변이체 폴리펩타이드 사이에 2개 내지 10개의 아미노산 차이(예를 들어, 약 2 내지 20개, 약 2 내지 15개, 약 2 내지 10개, 약 5 내지 20개, 약 5 내지 15개, 약 5 내지 10개 아미노산 차이)가 존재한다. 예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 차이(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 차이)가 존재할 수 있다. 이러한 서열과 관련된 동일성 또는 유사성은, 서열을 정렬하고, 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일성 백분율을 달성한 후, 출발 아미노산 잔기와 동일한(즉, 동일한 잔기) 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 인간 면역글로불린 서열(예를 들어, 인간 IgG 분자로부터의 Fc 영역 또는 Fc 모이어티)로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 적어도 하나의 Fc 영역 또는 Fc 모이어티)을 포함할 수 있다. 그러나, 폴리펩타이드는 또 다른 포유동물 종으로부터의 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 영장류 Fc 모이어티 또는 영장류 결합 부위는 대상 폴리펩타이드에 포함될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 뮤린 아미노산이 Fc 폴리펩타이드에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 면역원성이 아니다.
당업자는 본 발명의 Fc 폴리펩타이드가 모체 폴리펩타이드의 하나 이상의 목적하는 활성(예를 들어, 감소된 효과기 기능)을 유지하면서, 이들이 유래된 모체 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 달라지도록 변경될 수 있다는 것을 또한 이해할 것이다. 특정 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드를 안정화시키는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 치환을 생성시킨다. 일 실시형태에서, Fc 변이체를 암호화하는 단리된 핵산 분자는, 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 삽입 또는 결실을 모체 Fc 폴리펩타이드의 뉴클레오타이드 서열에 도입하여 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이 암호화된 단백질에 도입됨으로써 생성될 수 있다. 돌연변이(예를 들어, 안정화 돌연변이)는 표준 기술, 예컨대, 부위-지향된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이생성에 의해서 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 안정성"은 환경적 조건(예를 들어, 상승하거나 하강된 온도)에 대한 반응으로 단백질의 하나 이상의 물성이 유지되는 것에 대한 당업계에서 인지되는 척도이다. 일 실시형태, 물성은 단백질의 공유적 구조의 유지이다(예를 들어, 단백질분해 절단, 원치 않은 산화 또는 탈아마이드화의 부재). 또 다른 실시형태예에서, 물성은 적절하게 폴딩된 상태로 단백질이 존재하는 것이다(예를 들어, 가용성 또는 불용성 응집체 또는 침전물의 부재). 일 실시형태에서, 단백질의 안정성은 단백질의 생물물리학적 특성, 예를 들어, 열 안정성, pH 언폴딩 프로파일, 글리코실화의 안정적인 제거, 안정성, 생화학적 기능 (예를 들어, 단백질(예를 들어, 리간드, 수용체, 항원 등) 또는 화학 모이어티 등에 결합하는 능력) 및/또는 이들의 조합을 검정함으로써 측정된다. 또 다른 실시형태에서, 생화학적 기능은 상호작용의 결합 친화도에 의해서 입증된다. 일 실시형태에서, 단백질 안정성의 척도는 열 안정성, 즉, 열 자극에 대한 저항성이다. 안정성은 당업계에 공지되거나 그리고/또는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, "전이 온도"라고도 지칭되는 "Tm"이 측정될 수 있다. Tm은 거대 분자, 예를 들어, 결합 분자의 50%가 변성되는 온도이며, 단백질의 열 안정성을 설명하기 위한 표준 매개변수로 간주된다.
용어 "아미노산"은 알라닌(Ala 또는 A); 아르기닌(Arg 또는 R); 아스파라긴 (Asn 또는 N); 아스파트산(Asp 또는 D); 시스테인(Cys 또는 C); 글루타민(Gln 또는 Q); 글루탐산(Glu 또는 E); 글리신(Gly 또는 G); 히스티딘(His 또는 H); 아이소소류신(Ile 또는 I); 류신(Leu 또는 L); 라이신(Lys 또는 K); 메티오닌(Met 또는 M); 페닐알라닌(Phe 또는 F); 프롤린(Pro 또는 P); 세린(Ser 또는 S); 트레오닌(Thr 또는 T); 트립토판(Trp 또는 W); 타이로신(Tyr 또는 Y); 및 발린 (Val 또는 V)을 포함한다. 비-전통적인 아미노산이 또한 본 발명의 범주 내에 속하며, 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 문헌[Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기재된 것과 같은 다른 아미노산 잔기 유사체를 포함한다. 이러한 비-자연 발생 아미노산 잔기를 생성시키기 위해서, 문헌[Noren et al. Science 244:182 (1989)] 및 상기 Ellman 등의 문헌의 절차를 사용될 수 있다. 간략하면, 이러한 절차는 억제인자 tRNA를 비-자연 발생 아미노산 잔기로 화학적으로 활성화시키고, 그 다음 RNA의 시험관내 전사 및 번역을 포함한다. 비-전통적인 아미노산의 도입은 또한 당업계에 공지된 펩타이드 화학을 사용하여 달성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "극성 아미노산"은 순 제로 전하(net zero charge)를 갖지만, 이의 측쇄의 상이한 부분에 비-제로 부분 전하를 갖는 아미노산(예를 들어, M, F, W, S, Y, N, Q, C)을 포함한다. 이들 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용에 참여할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "하전된 아미노산"은 이의 측쇄에 비-제로 순 전하를 가질 수 있는 아미노산(예를 들어, R, K, H, E, D)을 포함한다. 이들 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용에 참여할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "충분한 입체 장애(steric bulk)를 갖는 아미노산"은 더 큰 3차원 공간을 점유하는 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 충분한 입체 장애의 측쇄 화학을 갖는 예시적인 아미노산은 타이로신, 트립토판, 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 글루탐산, 글루타민 및 메티오닌 또는 이의 유사체 또는 모방체를 포함한다.
"아미노산 치환"은 미리 결정된 아미노산 서열(출발 폴리펩타이드의 아미노산 서열)에서 적어도 하나의 기존의 아미노산 잔기를 제2의 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. "아미노산 삽입"은 미리 결정된 아미노산 서열 내에 적어도 하나의 추가의 아미노산을 혼입하는 것을 지칭한다. 삽입은 통상적으로 1 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어질 수 있지만, 본 발명의 더 큰 "펩타이드 삽입", 예를 들어, 약 3 내지 5개 또는 심지어는 약 10, 15 또는 20개까지의 아미노산 잔기의 삽입을 제조할 수 있다. 삽입된 잔기(들)는 상기에 개시된 바와 같은 자연 발생 또는 비자연 발생적일 수 있다. "아미노산 결실"은 미리 결정된 아미노산 서열로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기를 제거하는 것을 지칭한다. 상기에 제시된 바와 같이, 이러한 용어는 기존의 물리적 핵산 분자에 대한 실제 변화 또는 기존 핵산 서열에 대한 디자인 공정(예를 들어, 종이 또는 컴퓨터) 중에 제조된 변경을 포함한다. 특정 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 결합 폴리펩타이드이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합 폴리펩타이드"는 표적 분자(예컨대, 항원 또는 결합 파트너)에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 표적 결합 부위 또는 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, Fc 폴리펩타이드)를 지칭한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 면역글로불린 항원 결합 부위 또는 리간드 결합의 책임이 있는 수용체 분자의 부분 또는 수용체 결합의 책임이 있는 리간드 분자의 부분을 포함한다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 2개의 결합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 결합 폴리펩타이드는 2개의 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 결합 폴리펩타이드는 3개의 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 결합 폴리펩타이드는 4개의 결합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 결합 부위는 탠덤 (tandem)으로 서로에 연결된다. 다른 실시형태에서, 결합 부위는 결합 폴리펩타이드의 상이한 위치, 예를 들어, Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역의 N- 또는 C-말단 단부 중 하나 이상에 위치된다. 예를 들어, Fc 영역이 scFc 영역인 경우, 결합 부위는 N-말단 단부, C-말단 단부 또는 scFc 영역의 양 단부에 연결될 수 있다. Fc 영역이 이량체 Fc 영역인 경우, 결합 부위는 하나 또는 두 N-말단 단부 및/또는 하나 또는 두 C-말단 단부에 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합 부위" 또는 "결합 모이어티"는 예를 들어, 표적 분자(예를 들어, 항원, 리간드, 수용체, 기질 또는 저해제)와의 특이적 결합을 매개하는, (Fc-매개된 생물학적 활성 이외의) 생물학적 활성을 갖는 결합 폴리펩타이드의 부분, 영역 또는 부위를 지칭한다. 예시적인 결합 도메인은 생물학적 활성 단백질 또는 모이어티, 항원 결합 부위, 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체의 리간드 결합 도메인 또는 효소 도메인을 포함한다. 또 다른 예에서, 용어 "결합 모이어티"는 생물학적 시스템의 성분(예를 들어, 혈청 중의 또는 세포의 표면 상의 또는 세포 기질 중의 단백질)에 결합하는 생물학적 활성 분자 또는 이의 부분을 지칭하고, 이 결합은 생물학적 효과(예를 들어, 활성 모이어티 및/또는 이것이 결합하는 성분(예를 들어, 활성 모이어티의 절단 및/또는 이것이 결합하는 성분, 세포 또는 대상체에서의 생물학적 반응의 증강 또는 저해))를 초래한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "리간드 결합 도메인"은 적어도 정성적 리간드 결합 능력 및/또는 상응하는 네이티브 수용체의 생물학적 활성 중 적어도 일부(또는 대부분)를 보유하는 네이티브 수용체(예를 들어, 세포 표면 수용체) 또는 이의 영역 또는 유도체를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "수용체 결합 도메인"은 적어도 정성적 수용체 결합 능력 및/또는 상응하는 네이티브 리간드의 생물학적 활성 중 적어도 일부를 보유하는 네이티브 리간드 또는 이의 영역 또는 유도체를 지칭한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 감소 또는 제거에 대해서 표적화된 분자, 예를 들어, 세포 표면 항원 또는 가용성 항원에 대해서 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 결합 도메인은 (예를 들어, 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열 또는 대안적인 프레임워크 영역(예를 들어, 선택적으로 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 프레임워크 영역) 내에 위치하는 항체로부터의 6개의 CDR을 포함하는) 항원 결합 부위를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "결합 친화도"는 결합 상호작용의 강도를 포함하며, 따라서 실제 결합 친화도뿐만 아니라 겉보기 결합 친화도 둘 다를 포함한다. 실제 결합 친화도는 해리 속도에 대한 회합 속도의 비이다. 따라서, 결합 친화도를 부여하거나 최적화하는 것에는 이들 성분 중의 어느 하나 또는 둘 다를 바람직한 결합 친화도의 수준에 도달하도록 변화시키는 것이 포함된다. 겉보기 친화도는 예를 들어, 상호작용의 결합활성을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "결합 자유 에너지" 또는 "결합의 자유 에너지"는 당업계에서 인식되는 의미 및 특히 용매 중에서의 결합 부위-리간드 또는 Fc-FcR 상호작용에 대해 적용되는 것으로서 의미를 포함한다. 결합 자유 에너지의 감소는 친화도를 향상시키는 반면에, 결합 자유 에너지의 증가는 친화도를 감소시킨다.
용어 "특이성"은 주어진 표적에 특이적으로 결합하는(예를 들어, 표적과 면역작용하는) 잠재적 결합 부위의 수를 포함한다. 결합 폴리펩타이드는 단일 특이적일 수 있고, 동일한 표적(예를 들어, 동일한 에피토프)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 함유할 수 있거나, 결합 폴리펩타이드는 다중특이적이고, 동일한 표적(예를 들어, 상이한 에피토프) 또는 상이한 표적의 상이한 부분에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 하나 초과의 표적 분자(예를 들어, 하나 초과의 항원 또는 동일한 항원 상의 하나 초과의 에피토프)에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이적 결합 폴리펩타이드(예를 들어, 이중특이적 폴리펩타이드)가 제조될 수 잇다. 또 다른 실시형태에서, 다중특이적 결합 폴리펩타이드는 감소 또는 제거에 대해서 표적화된 분자에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인 및 세포 상의 표적 분자에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 다중특이적 결합 폴리펩타이드는 감소 또는 제거에 대해서 표적화된 분자에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인 및 약물에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인을 갖는다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 다중특이적 결합 폴리펩타이드는 감소 또는 제거에 대해서 표적화된 분자에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인 및 전구약물에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 다중특이성 결합 폴리펩타이드는 하나의 표적 분자에 대해 특이적인 2개의 결합 영 역 및 제2 표적 분자에 대해 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 4가 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합가(valency)"는 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 잠재적 결합 도메인의 수를 지칭한다. 각각의 결합 도메인은 하나의 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 결합 폴리펩타이드가 하나 초과의 결합 도메인을 포함하는 경우, 각각의 결합 도메인은 동일하거나 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있다(예를 들어, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다). 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 1가이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다가이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 2가이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 3가이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 4가이다. 특정 양상에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 링커를 사용한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드 링커"는 폴리펩타이드 쇄의 선형 아미노산 서열 내에서 2개의 도메인을 연결하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열)을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커는 결합 부위를 본 발명의 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역(또는 Fc 모이어티)에 연결시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드 링커는 폴리펩타이드 분자에 대해 유연성을 제공한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, VH 도메인 또는 VL 도메인은 폴리펩타이드 링커에 융합되거나 연결되고, 폴리펩타이드 링커의 N- 또는 C-말단은 Fc 영역(또는 Fc 모이어티)의 C- 또는 N-말단에 부착되고, 폴리펩타이드 링커의 N-말단이 VH 또는 VL 도메인의 N- 또는 C-말단에 부착된다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 링커는 scFc 폴리펩타이드의 2개의 Fc 모이이티 또는 도메인을 연결하는데(예를 들어, 유전자 융합시키는데) 사용된다. 이러한 폴리펩타이드 링커는 또한 본 명세서에서 Fc 연결 폴리펩타이드라고 지칭된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 연결 폴리펩타이드"는 구체적으로 2개의 Fc 모이어티 또는 도메인을 연결하는(예를 들어, 유전자 융합시키는) 연결 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 발명의 결합 분자는 하나 초과의 펩타이드 링커를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "적절하게 폴딩된 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드를 포함하는 모든 기능적 도메인이 명백하게 활성인 폴리펩타이드(예를 들어, 본 발명의 결합 폴리펩타이드)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부적절하게 폴딩된 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드의 기능적 영역 중의 적어도 하나가 활성이 아닌 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "적절하게 폴딩된 Fc 폴리펩타이드" 또는 "적절하게 폴딩된 Fc 부분"은 적어도 2개의 성분 Fc 모이어티가 적절하게 폴딩되어 생성된 Fc 영역이 적어도 하나의 효과기 기능을 포함하는 Fc 영역(예를 들어, scFc 영역)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 이것이 어떤 적절한 특이적 면역반응성을 갖든지 갖지 않든지 간에 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 조합을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 관심대상 항원(예를 들어, 종양 연관된 항원)에 대해서 상당한 공지된 특이적 면역반응 활성을 갖는 이러한 조립체(예를 들어, 무손상 항체 분자, 항체 단편 또는 이의 변이체)를 지칭한다. 항체 및 면역글로불린은 경쇄 및 중쇄를, 이들 사이의 쇄간 공유적 연결이 있거나 없이 포함한다. 척추동물계에서 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 널리 이해되어 있다.
하기에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 일반 용어 "항체"는 생화학적으로 구별될 수 있는 항체의 5개의 구별되는 클래스를 포함한다. 항체의 각각의 클래스로부터의 Fc 모이어티는 명확하게 본 발명의 범주 내에 포함되며, 하기의 설명은 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 관한 것이다. IgG와 관련하여, 면역글로불린은 분자량 약 23,000달톤의 2개의 동일한 폴리펩타이드 경쇄 및 분자량 53,000 내지 70,000의 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 4개의 쇄는 "Y" 구성으로 다이설파이드 결합에 의해서 결합되는데, 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 출발하여 가변 영역을 통해서 계속되는 중쇄를 함께 모은다.
면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다(κ,λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로에 대해서 공유 결합되며, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해서 생성되는 경우 2개의 중쇄의 "꼬리(tail)" 부분은 공유 다이설파이드에 의해서 서로에 연결 또는 비-공유 연결에 의해서 서로에 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 구성의 분기된 단부에서의 N-말단으로부터 각각의 쇄의 하부에서의 C-말단에 걸쳐있다. 당업자는, 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며, 이들 중에는 일부의 서브클래스(예를 들어, γ1 내지 γ4)가 있음을 이해할 것이다. 이것은 항체의 "클래스"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG 또는 IgE로 결정하는 이 쇄의 본질이다. 면역글로불린 서브클래스(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 널리 특징규명되어 있고, 기능적 전문화를 부여하는 것으로 공지되어 있다. 이들 클래스 및 아이소타입 각각의 변형된 버전은 본 개시내용에 비추어서 당업자에게 쉽게 인식될 수 있으며, 따라서 본 발명의 범주 내에 포함된다.
경쇄 및 중쇄는 둘 다 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 구분된다. 용어 "영역"은 단일 면역글로불린(용어 "Fc 영역"에서와 같음) 또는 단일 항체 쇄의 일부 또는 부분을 지칭하며, 불변 영역 또는 가변 영역뿐만 아니라 상기 도메인의 더 구별되는 일부 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 경쇄 가변 도메인은 본 명세서에 정의된 바와 같은 "프레임워크 영역" 또는 "FR" 사이에 산재된 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"을 포함한다. 면역글로불린의 특정한 영역은 "불변 영역"의 경우에는 다양한 클래스 구성원의 영역 내에서 서열 변이의 상대적 결여, 또는 "가변 영역"의 경우에는 다양한 클래스 구성원의 영역 내에서의 상당한 변이를 기초로 하여 "불변"(C) 영역 또는 "가변"(V) 영역으로 정의될 수 있다. 용어 "불변 영역" 및 "가변 영역"은 또한 기능적으로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 면역글로불린 또는 항체의 가변 영역은 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것으로 이해될 수 있다. 이에 반해서, 면역글로불린 또는 항체의 불변 영역은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 효과기 기능을 부여한다. 다양한 면역글로불린의 불변 영역의 소단위 구조 및 3차원 구성은 널리 공지되어 있다.
면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 영역 및 가변 영역은 영역 내로 폴딩된다. 용어 "도메인"은 예를 들어, β-주름진(pleated) 시트 및/또는 쇄내 다이설파이드 결합에 의해서 안정화된 펩타이드 루프(loop)를 포함하는(예를 들어, 3 내지 4개의 펩타이드 루프를 포함하는) 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드의 독립적으로 폴딩된 구형 영역을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 상의 불변 영역 도메인은 "경쇄 불변 영역 도메인", "CL 영역" 또는 "CL 도메인"으로 상호 교환 가능하게 지칭된다. 중쇄 상의 불변 도메인(예를 들어, 힌지, CH1, CH2 또는 CH3 도메인)은 "중쇄 불변 영역 도메인", "CH" 영역 도메인 또는 "CH 도메인"으로 상호 교환 가능하게 지칭된다. 경쇄 상의 가변 도메인은 "경쇄 가변 영역 도메인", "VL 영역 도메인" 또는 "VL 도메인"으로 상호 교환 가능하게 지칭된다. 중쇄 상의 가변 도메인은 "중쇄 가변 영역 도메인", "VH 영역 도메인" 또는 "VH 도메인"으로 상호 교환 가능하게 지칭된다.
협약에 의해서, 가변 영역 도메인 및 불변 영역 도메인의 넘버링은 이들이 면역글로불린 또는 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 멀어지게 됨에 따라서 증가한다. 각각의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 N-말단은 가변 영역이고, C-말단은 불변 영역이며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각, 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단을 포함한다. 따라서, 경쇄 면역글로불린의 도메인은 VL-CL 배향으로 정렬되는 반면에, 중쇄의 도메인은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3 배향으로 정렬된다. CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인 내에서의 아미노산 위치를 포함한 중쇄 불변 영역 내에서의 아미노산 위치는 달리 언급되지 않는 한 본 명세서에서 EU 인덱스 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 대조적으로, 경쇄 불변 영역(예를 들어, CL 도메인) 내에서의 아미노산 위치는 카밧 인덱스 넘버링 시스템에 따라서 번호 본 명세서에서 넘버링된다(상기 카밧 등의 문헌 참고).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하며, 용어 "VL 도메인"은 카밧 인덱스 넘버링 시스템에 따라 면역글로불린 경쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CH1 도메인"은 예를 들어, 대략 118 내지 215번 EU 위치로부터 연장되는 면역글로불린 중쇄의 제1(가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대한 VH 도메인에 그리고 아미노 말단에 인접하고, 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 일부를 형성하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄 분자(예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4 분자)로부터 유래된 CH1 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합시키는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하며, 유연성이 있고, 따라서 2개의 N-단 항원 결합 영역이 독립적으로 이동하는 것을 허용한다. 힌지 영역은 3개의 구별되는 도메인, 즉 상부, 중간 및 하부 힌지 도메인으로 세분될 수 있다(Roux et al. J. Immunol. 1998, 161:4083).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CH2 도메인"은 대략 231 내지 340번 EU 위치로부터 연장되는 중쇄 면역글로불린 분자의 부분을 포함한다. CH2 도메인은 이것이 또 다른 도메인과 근접하여 쌍을 이루지 않는다는 점에서 고유하다. 그 보다는, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 네이티브 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 IgG1 분자(예를 들어, 인간 IgG1 분자)로부터 유래된 CH2 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 IgG4 분자(예를 들어, 인간 IgG4 분자)로부터 유래된 CH2 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 CH2 도메인(231 내지 340번 EU 위치), 또는 그의 부분을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CH3 도메인"은 CH2 도메인의 N-말단으로부터 대략 110개의 잔기, 예를 들어, 대략 341 내지 446b번 위치(EU 넘버링 시스템)로 연장되는 중쇄 면역글로불린 분자의 부분을 포함한다. 추가적인 라이신 잔기(K)가 때때로 CH3 도메인의 최외곽 C-말단에 존재하지만, 종종 성숙 항체로부터 절단된다. CH3 도메인은 전형적으로 항체의 C-말단 부분을 형성한다. 그러나, 일부의 면역글로불린에서, 추가적인 도메인이 CH3 도메인으로부터 연장되어 분자의 C-말단 부분(예를 들어, IgM의 μ 쇄 및 IgE의 ε 쇄 내의 CH4 도메인)을 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 IgG1 분자(예를 들어, 인간 IgG1 분자)로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 IgG4 분자(예를 들어, 인간 IgG4 분자)로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CL 도메인"은 예를 들어, 대략 107A 내지 216번 카밧 위치로부터 연장되는 면역글로불린 중쇄의 제1(가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CL 도메인은 VL 도메인에 인접한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 카파 경쇄(예를 들어, 인간 카파 경쇄)로부터 유래된 CL 도메인을 포함한다.
상기에 제시된 바와 같이, 항체의 가변 영역은 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하게 하고, 따라서 이에 특이적으로 결합한다. 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 표적 결합 항체라고도 지칭될 수 있다(예를 들어, α4 결합 항체는 α4에 특이적으로 결합하는 항체이다). "특이적으로 결합한다"는 항체(또는 이의 가변 영역)가 약 5×10-5(즉, 50uM) 미만 또는 약 1×10-5(즉, 10uM) 미만 또는 약 5×10-6 (즉, 5uM) 미만 또는 약 1×10-6(즉, 1uM) 미만 또는 약 5×10-7(즉, 500nM) 미만 또는 약 1×10-7(즉, 100nM) 미만 또는 약 5×10-8(즉, 50nM) 미만 또는 약 1×10-8(즉, 10nM) 미만 또는 약 5×10-9(즉, 5nM) 미만 또는 약 1×10-9(즉, 1nM) 미만 또는 약 5×10-10(즉, 500pM) 미만 또는 약 1×10-10(즉, 100pM) 미만 또는 약 5×10-11(50pM) 미만 또는 약 1×10-11(10pM) 미만 또는 약 5×10-12(5pM) 미만 또는 약 1×10-12(1pm) 미만 또는 약 5×10-13(500fM) 미만 또는 약 1×10-13(100fM) 미만 또는 약 5×10-14 (50fM) 미만 또는 약 1×10-14(10fM) 미만 또는 약 5×10-15(5fM) 미만 또는 약 1×10-15(1fM) 미만의 평형 해리 상수(KD)로 표적(예를 들어, α4 인테그린 상의 에피토프)에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인은 조합하여 3차원 항원 결합 부위를 정의하는 가변 영역(Fv)을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각각의 아암의 단부에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 더욱 구체적으로, 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각 상의 3개의 상보성 결정 영역(CDRs)에 의해서 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 부위"는 세포 표면 또는 가용성 항원과 같은 항원에 특이적으로 결합하는(항원과 면역반응하는) 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 결합 부위는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이들 가변 영역에 의해서 형성된 결합 부위는 항체의 특이성을 결정한다. 항원 결합 부위는 폴리펩타이드 마다 서로 달라지는 가변 영역에 의해서 형성된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 항체 분자(예를 들어, 서열이 당업계에 공지되어 있거나, 본 명세서에 기재된 것)의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 2개의 CDRs을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 3개의 CDRs을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 4개의 CDRs을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 5개의 CDRs을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 항체 분자로부터의 6개의 CDRs을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 예시적인 항체 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 예시적인 분자는 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비인접성 항원 조합 부위를 의미한다. 이들 특정 영역은 문헌[Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) 및 Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991) 및 Chothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987) 및 MacCallum et al., J. MoI. Biol. 262:732-745 (1996)](여기서, 정의는 서로에 대해 비교하는 경우에 아미노산의 중첩 또는 서브세트를 포함함)]에 기재되어 있다. 상기 인용된 문헌 각각에 의해서 정의된 CDRs을 포함하는 아미노산 잔기는 비교를 위해서 설명된다. 일부 실시형태에서, 용어 "CDR"은 서열 비교를 기초로 하여 카밧에 의해서 정의된 바와 같은 CDR이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR 영역"은 가변 영역의 일부이지만, CDRs의 일부는 아닌(예컨대, CDRs의 카밧 정의를 사용하여) 아미노산 잔기를 포함한다. 따라서, 가변 영역 프레임워크는 길이가 약 100 내지 120개의 아미노산이지만, 단지 CDRs 외부의 아미노산을 포함한다. 중쇄 가변 영역의 구체적인 예 및 카밧 등에 의해서 정의된 바와 같은 CDRs에 대해서, 프레임워크 영역 1은 아미노산 1 내지 30을 포함하는 가변 영역의 도메인에 해당하며; 프레임워크 영역 2는 아미노산 36 내지 49를 포함하는 가변 영역의 도메인에 해당하고; 프레임워크 영역 3은 아미노산 66 내지 94를 포함하는 가변 영역의 도메인에 해당하며; 프레임워크 영역 4는 아미노산 103에서 가변 영역의 단부까지의 가변 영역의 도메인에 해당한다. 경쇄를 위한 프레임워크 영역은 경쇄 가변 영역 CDRs 각각에 의해서 유사하게 분리된다. 유사하게, 코티아 등 또는 맥칼럼 등에 의한 CDRs의 정의를 사용하여, 프레임워크 영역 경계는 상술한 바와 같은 각각의 CDR 말단에 의해서 분리된다. 일부 실시형태에서, CDRs은 카밧에 의해서 정의된 바와 같다.
자연 발생 항체에서, 항체는 수성 환경에서 그의 3차원 구성을 취하기 때문에, 각각의 단량체 항체 상에 존재하는 6개의 CDRs이 항체 결합 부위를 형성하도록 특별하게 위치하는 아미노산의 짧고 비-인접성인 서열이다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 나머지는 아미노산 서열에서 더 적은 분자간 가변성을 나타내며, 프레임워크 영역이라 칭한다. 프레임워크 영역은 대부분 β-시트 입체배좌를 채택하며, CDRs은 β-시트 구조를 연결하고, 일부의 경우에는 이의 일부분을 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 이들 프레임워크 영역은 분자-간 비-공유 상호작용에 의해서 정확한 배향으로 6개의 CDRs의 배치를 제공하는 스캐폴드(scaffold)를 형성하도록 작용한다. 배치된 CDRs에 의해서 형성된 항원 결합 부위는 면역반응성 항원 상의 에피토프에 대한 표면 상보성을 정의한다. 이러한 상보성 표면은 면역반응성 항원 에피토프에 대한 항체의 비-공유 결합을 촉진시킨다. CDRs의 위치는 당업자에 의해서 쉽게 식별될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 결합 폴리펩타이드와 선택된 항원과의 회합을 제공하는(예를 들어, 동일한 결합 폴리펩타이드 내의(예를 들어, 단일 폴리펩타이드의 N- 및 C-말단 둘 다에서) 또는 본 발명의 다량체 결합 단백질의 각각의 성분 결합 폴리펩타이드에 연결된) 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인은 동일한 면역글로불린 분자로부터 유래될 필요가 없다. 이와 관련하여, 가변 영역은 체액성 반응을 개시하고, 목적하는 항원에 대한 면역글로불린을 생성하도록 유도될 수 있는 모든 유형의 동물로부터 유래될 수 있거나 유래되지 않을 수 있다. 이와 같이, 가변 영역은 예를 들어, 포유동물 기원의 것일 수 있으며, 예를 들어, 인간, 뮤린, 비-인간 영장류(예컨대, 시노몰거스 원숭이, 마카크(macaques) 등), 이리(lupine), 낙타과(camelid)(예를 들어, 낙타, 라마 및 관련된 종) 기원의 것일 수 있다.
용어 "항체 변이체" 또는 "변형된 항체"는 자연에서 발생하지 않고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 아미노산 또는 아미노산 변형에 의해서 자연-유래된 항체와는 상이한 아미노산 서열 또는 아미노산 측쇄 화학을 갖는 항체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 변이체"는 이들이 자연 발생하지 않도록 변경된 항체의 합성 형태, 예를 들어, 적어도 2개의 중쇄 부분을 포함하지만 2개의 완전한 중쇄를 포함하지는 않는 항체(예컨대, 도메인 결실된 항체 또는 미니바디); 2개 이상의 상이한 항원에 또는 단일 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하도록 변경된 항체의 다중특이적 형태(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 등); scFv 분자에 결합된 중쇄 분자; 단일-쇄 항체; 다이아바디; 트라이아바디; 및 변경된 효과기 기능을 갖는 항체 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "scFv 분자"는 하나의 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 이의 부분 및 하나의 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 이의 부분으로 이루어진 결합 분자를 포함하며, 여기서 각각의 가변 도메인(또는 이의 부분)은 동일하거나 상이한 항체로부터 유래된다. scFv 분자는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 개재된 scFv 링커를 포함한다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호; 문헌[Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "scFv 링커"는 scFv의 VL 및 VH 도메인 사이에 개재된 모이어티를 지칭한다. 일 실시형태에서, scFv 링커는 scFv 링커 펩타이드를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 특정 실시형태에서, scFv 링커 펩타이드는 gly-ser 폴리펩타이드 링커를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, scFv 링커는 다이설파이드 결합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "gly-ser 폴리펩타이드 링커"는 글리신 및 세린 잔기로 이루어진 펩타이드를 지칭한다. 예시적인 gly/ser 폴리펩타이드 링커는 아미노산 서열(Gly4Ser)n을 포함한다. 일 실시형태에서, n=1이다. 일 실시형태에서, n=2이다. 또 다른 실시형태에서, n=3이고, 즉, (Gly4 Ser)3이다. 또 다른 실시형태에서, n=4이고, 즉, (Gly4 Ser)4이다. 또 다른 실시형태에서, n=5이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n=6이다. 또 다른 실시형태에서, n=7이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n=8이다. 또 다른 실시형태에서, n=9이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n=10이다. 또 다른 예시적인 gly/ser 폴리펩타이드 링커는 아미노산 서열 Ser(Gly4Ser)n을 포함한다. 일 실시형태에서, n=1이다. 일 실시형태에서, n=2이다. 일부 실시형태에서, n=3이다. 또 다른 실시형태에서, n=4이다. 또 다른 실시형태에서, n=5이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n=6이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "네이티브 시스테인"은 폴리펩타이드의 특정 아미노산 위치에서 자연 발생하고, 인간의 수작업에 의해서 변형되거나, 도입되거나 변경되지 않은 시스테인 아미노산을 의미한다. 용어 "조작된 시스테인 잔기 또는 이의 유사체" 또는 "조작된 시스테인 또는 이의 유사체"는 합성 수단에 의해서 (예를 들어, 재조합 기술, 시험관내 펩타이드 합성, 펩타이드의 효소적 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술의 일부의 조합에 의해서), 그 위치에 시스테인 잔기 또는 이의 유사체를 자연적으로 함유하지 않는 폴리펩타이드의 아미노산 위치에 도입된 비-네이티브 시스테인 잔기 또는 시스테인 유사체(예를 들어, 티올-함유 유사체, 예컨대, 티아졸린-4-카복실산 및 티아졸리딘-4-카복실산(티오프롤린, Th))를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "다이설파이드 결합"은 2개의 황 원자 사이에서 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올기와 다이설파이드 결합 또는 브리지를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 네이티브 다이설파이드 결합에 의해서 연결되며, 2개의 중쇄는 카밧 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242에 상응하는 위치 (226 또는 229번 위치, EU 넘버링 시스템)에서 2개의 네이티브 다이설파이드 결합에 의해서 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합된 시스테인"은 동일하거나 상이한 폴리펩타이드 내에 존재하는 제2 네이티브 또는 조작된 시스테인 또는 다른 잔기와의 다이설파이드 결합 또는 다른 공유 결합을 형성하는 폴리펩타이드 내의 네이티브 또는 조작된 시스테인 잔기를 지칭해야 한다. "분자내 결합된 시스테인"은 동일한 폴리펩타이드 내에 존재하는 제2 시스테인에 공유 결합된(즉, 분자내 다이설파이드 결합), 결합된 시스테인을 지칭한다. "분자간 결합된 시스테인"은 상이한 폴리펩타이드 내에 존재하는 제2의 시스테인에 공유적으로 결합된(즉, 분자간 디설파이드 결합), 결합된 시스테인을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유리 시스테인"은 실질적으로 환원된 형태로 존재하는 폴리펩타이드 서열 내의 네이티브 또는 조작된 시스테인 아미노산 잔기(및 이의 유사체 또는 모방체, 예를 들어, 티아졸린-4-카복실산 및 티아졸리딘-4-카복실산(티오프롤린, Th))를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유리 시스테인은 바람직하게는 본 발명의 효과기 기능에 의해서 변형될 수 있다.
용어 "티올 변형 시약"은 결합 폴리펩타이드 내의(예컨대, 결합 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 링커 내에서) 조작된 시스테인 잔기 또는 이의 유사체와 선택적으로 반응할 수 있고, 따라서 결합 폴리펩타이드에 대한 효과기 모이어티의 부위-특이적 화학적 첨가 또는 가교결합을 위한 수단을 제공함으로써 변형된 결합 폴리펩타이드를 형성할 수 있는 화학제를 지칭해야 한다. 일부 실시형태에서, 티올 변형 시약은 유리 시스테인 잔기 내에 존재하는 티올 또는 설프하이드릴 작용기를 사용한다. 예시적인 티올 변형 시약은 말레이미드, 알킬 및 아릴 할라이드, α-할로아실 및 피리딜 다이설파이드를 포함한다.
용어 "기능성 모이어티"는 일부 실시형태에서 결합 폴리펩타이드에 바람직한 기능을 부가하는 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능은 폴리펩타이드의 고유한 바람직한 활성, 예를 들어, 분자의 항원-결합 활성을 상당히 변화시키지 않고 부가된다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 기능성 모이어티를 포함할 수 있다. 유용한 기능성 모이어티의 예는 효과기 모이어티, 친화성 모이어티,및 차단 모이어티를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 차단 모이어티는 예를 들어, 폴리펩타이드를 글리코실화시키는 글리코시다제의 능력을 차단함으로써, 환원된 글리코실화가 일어나도록 하는 충분한 입체 장애 및/또는 전하의 모이어티를 포함한다. 차단 모이어티는 추가로 또는 대안적으로 예를 들어, 수용체 또는 보체 단백질에 결합하는 Fc 영역의 능력을 저해함으로써 효과기 기능을 감소시킬 수 있다. 비제한적인 차단 모이어티는 시스테인 부가물, 시스틴, 혼합된 다이설파이드 부가물 및 PEG 모이어티를 포함한다. 예시적인 검출 가능한 모이어티는 형광 모이어티, 방사성 동위원소 모이어티, 방사선 불투과성 모이어티 등을 포함한다. 화학적 모이어티의 접합과 관련하여, 용어 "연결 모이어티"는 기능성 모이어티를 결합 폴리펩타이드의 나머지에 연결시킬 수 있는 모이어티를 포함한다. 연결 모이어티는 이것이 절단 가능하거나 절단 가능하지 않도록 선택될 수 있다. 절단 가능하지 않은 연결 모이어티는 일반적으로 높은 전신 안정성을 갖지만, 바람직하지 않은 약동학을 가질 수도 있다.
용어 "스페이서(spacer) 모이어티"는 분자에 공간을 도입시키도록 설계된 비단백질 모이어티이다. 일 실시형태에서, 스페이서 모이어티는 탄소, 산소, 질소, 황 등으로부터 선택된 0 내지 100개의 원자의 선택적으로 치환된 쇄일 수 있다. 일 실시형태에서, 스페이서 모이어티는 이것이 수용성이 되도록 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 스페이서 모이어티는 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜이다.
용어 "페길화 모이어티" 또는 "PEG 모이어티"는 커플링제, 또는 커플링 또는 활성화 모이어티에 의한(예를 들어, 티올, 트라이플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란 또는 말레이미드 모이어티, 예를 들어, PEG-말레이미드를 사용한) 유도체화의 존재 또는 부재 하의 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 이의 유도체를 포함한다. 다른 적절한 폴리알킬렌 글리콜 화합물은 말레이미도 모노메톡시 PEG, 활성화된 PEG, 폴리프로필렌 글리콜을 포함하며, 또한 다음 유형의 하전되거나 중성인 중합체를 포함한다: 덱스트란, 콜로민산 또는 다른 탄수화물 기반 중합체, 아미노산의 중합체 및 바이오틴 유도체. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효과기 모이어티"(E)는 생물학적 또는 다른 기능성 활성을 갖는 진단 및 치료제(예를 들어, 단백질, 핵산, 지질, 약물 모이어티 및 이의 단편)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드에 접합된 효과기 모이어티를 포함하는 결합 폴리펩타이드는 비접합된 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 하나의 추가의 기능 또는 특성을 갖는다. 예를 들어, (예를 들어, 이의 폴리펩타이드 링커를 통한) 결합 폴리펩타이드에 대한 세포독성 약물 모이어티(예를 들어, 효과기 모이어티)의 접합은 제2 기능으로서(즉, 항원 결합에 더하여) 약물 세포독성을 갖는 변형된 폴리펩타이드의 형성을 야기한다. 또 다른 예로, 제1 결합 폴리펩타이드에 대한 제2 결합 폴리펩타이드의 접합은 추가의 결합 특성을 부여할 수 있다. 효과기 모이어티가 유전적으로 암호화된 치료 또는 진단 단백질 또는 핵산인 하나의 양상에서, 효과기 모이어티는 당업계에 널리 공지된 펩타이드 합성 또는 재조합 DNA 방법에 의해서 합성되거나 발현될 수 있다. 효과기가 비-유전자 암호화된 펩타이드 또는 약물 모이어티인 또 다른 양상에서, 효과기 모이어티는 인공적으로 합성되거나 자연 공급원으로부터 정제될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약물 모이어티"는 소염제, 항암제, 항감염제(예를 들어, 항진균제, 항박테리아제, 항기생충제, 항바이러스제 등), 및 마취성 치료제를 포함한다. 추가 실시형태에서, 약물 모이어티는 항암제 또는 세포독성제이다. 상용성 약물 모이어티는 또한, 전구약물을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전구약물"은 모 약물에 비해서 덜 활성이고, 덜 반응성이며, 부작용의 경향이 적으며, 생체내에서 더 활성인 형태로 효소에 의해서 활성화되거나 또는 달리 전환될 수 있는 약제학적 활성제의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 본 발명과 상용성인 전구약물은 포스페이트 함유 전구약물, 아미노산-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트 함유 전구약물, 펩타이드 함유 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 선택적으로 치환된 페녹시아세트아마이드-함유 전구약물 또는 선택적으로 치환된 페닐아세트아마이드-함유 전구약물, 5-플루오로사이토신 및 더 활성인 무-세포독성 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로유리딘 전구약물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 당업자는 화합물의 반응을 본 발명의 변형된 결합 단백질을 제조할 목적으로 더욱 편리하게 되도록 하기 위해서 바람직한 약물 모이어티 또는 이의 전구약물에 대한 화학적 변형을 수행할 수 있다. 약물 모이어티는 또한 본 명세서에 기재된 약물 모이어티의 유도체, 약제학적으로 허용 가능한 염, 에스터, 아마이드 및 에터를 포함한다.
"친화성 수지"는 반응 혼합물의 다른 성분으로부터 친화성 도메인에 결합된 단백질의 분리를 용이하게 하기 위해서 높은 친화도로 친화성 도메인에 결합할 수 있는 화학적 표면이다. 친화성 수지는 고체 지지체의 표면 또는 이의 일부 상에 코팅될 수 있다. 대안적으로, 친화성 수지는 고체 지지체를 포함할 수 있다. 이러한 고체 지지체는 적합하게 변형된 크로마토그래피 칼럼, 마이크로타이터 플레이트, 비드(bead) 또는 바이오칩(biochip)(예를 들어, 유리 웨이퍼(glass wafer))을 포함할 수 있다. 예시적인 친화성 수지는 니켈, 키틴, 아밀라제 등으로 구성된다. 용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본 명세서에서 바람직한 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입시키고, 이를 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하도록 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 상용성인 벡터는 선택 마커, 바람직한 유전자의 클로닝을 용이하게 하기 위한 적절한 제한 부위 및 진핵 또는 원핵 세포에 유입되고/되거나 그 세포 내에서 복제하는 능력을 포함할 수 있다.
당업자는 본 명세서에 기재된 항체(또는 이의 단편 또는 쇄)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 서열)가 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 인핸서 및/또는 폴리 A 테일을 또한 포함하는 발현 벡터 내에 함유되는 경우, 폴리뉴클레오타이드가 벡터가 도입된 숙주 세포에서 단백질로서 발현될 것이라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 발현 벡터에 삽입된 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내에서 그리고 따라서 벡터가 도입된 숙주 세포 내에서의 "발현을 위해서 배치된" 것으로 지칭될 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 서열)는 숙주 세포에서의 발현을 위해서 배치되도록 발현 벡터에 삽입될 필요가 없다. 폴리뉴클레오타이드가 세포에서의 발현을 위해서 배치된 널리 공지된 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, DNA 서열은 예를 들어, 상동성 재조합을 사용하여 숙주 세포의 게놈에 삽입되어, 삽입된 DNA 서열의 발현이 숙주 세포의 내인성 프로모터 및 다른 조절 요소에 의해서 조절될 수 있다. 상동성 재조합을 위한 이러한 기술은 널리 공지되어 있다.
본 발명의 목적에 따라, 다수의 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터의 하나의 클래스는 소 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus), 폴리오마(polyoma) 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아(vaccinia) 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 사용한다. 다른 것은 내부 리보좀 결합 부위를 갖는 다시스트론성(polycistronic) 시스템의 사용을 수반한다. 예시적인 벡터는 미국 특허 제6,159,730호 및 제6,413,777호 및 미국 특허 출원 제2003 0157641 A1호에 기재된 것을 포함한다. 추가로, DNA를 염색체 내에 통합한 세포는 형질주입된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입시킴으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 프로토트로피(prototrophy), 살생물제 저항성(예컨대, 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 저항성을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결될 수 있거나, 공동형질전환에 의해서 동일한 세포 내에 도입될 수 있다. 일 실시형태에서, 유도성 발현 시스템이 사용될 수 있다. mRNA의 최적 합성을 위해서 추가의 요소가 필요할 수도 있다. 이들 요소는 신호 서열, 스플라이스(splice) 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서는, 분비 신호, 예를 들어, 몇몇 널리 특징규명된 박테리아 리더(leader) 펩타이드(예컨대, pelB, phoA 또는 ompA) 중의 어느 하나를 프레임 내에서 본 발명의 폴리펩타이드의 N 말단에 융합시켜 폴리펩타이드의 최적 분비를 수득할 수 있다(Lei et al. (1988), Nature, 331:543; Better et al. (1988) Science, 240:1041; Mullinax et al, (1990). PNAS, 87:8095).
용어 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제되고, 적어도 하나의 이형 유전자를 암호화한 벡터에 의해서 형질전환된 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 단백질을 단리시키기 위한 방법의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 단백질의 공급원을 나타내기 위해서 상호 교환 가능하게 사용된다. 다시 말해서, "세포"로부터 단백질의 회수는 스핀 다운된 전체 세포로부터 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다. 단백질 발현을 위해서 사용된 숙주 세포주는 가장 바람직하게는 포유동물 기원의 것이다. 당업자는 그 안에서 발현될 원하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정의 숙주 세포주를 선택적으로 결정하는 능력을 갖는 것으로 여겨진다. 예시적인 숙주 세포주는 DG44 및 DUXBII(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA(인간 자궁경부 암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-IcIBPT(소 내피세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. CHO 세포(및 또한 DHFR 활성-결여 CHO-K1 세포를 비롯한 이의 변이체)가 유용한 숙주 세포이다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업 서비스, 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 입수 가능하다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 비-포유동물 세포, 예컨대, 박테리아 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수도 있다. 이와 관련하여, 박테리아와 같은 다양한 단세포 비-포유동물 미생물, 즉 배양 또는 발효 시에 성장할 수 있는 것이 또한, 형질전환될 수 있는 있다고 인식될 것이다. 형질전환이 가능한 박테리아는 엔테로박테리아세(enterobacteriaceae), 예컨대, 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella)의 균주; 바실라세 (Bacillaceae), 예컨대, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코커스 (Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)의 구성원을 포함한다. 추가로 박테리아 내에서 발현되는 경우 폴리펩타이드는 일반적으로 봉입체 (inclusion body)의 일부가 되는 것으로 인식될 것이다. 폴리펩타이드는 단리되고, 정제되고, 그 다음 기능성 분자로 조립되어야 한다.
원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물이 사용될 수도 있다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 빵 효모(baker's yeast)가 진핵성 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용되지만, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함하는 다른 균주의 구성원들이 또한 통상적으로 사용될 수 있다. 사카로마이세스 내에서의 발현을 위해서, 예를 들어, 플라스미드 YRp7(Stinchcomb et al, (1979), Nature, 282:39; Kingsman et al, (1979), Gene, 7:141; Tschemper et al, (1980), Gene, 10:157)이 통상적으로 사용된다. 이 플라스미드는 이미 트립토판 중에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선택 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 함유하며, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1이다 (Jones, (1977), Genetics, 85: 12). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
시험관내 생산은 본 발명의 바람직한 변경된 결합 폴리펩타이드를 대량으로 제공하도록 규모 확대시키는 것을 허용한다. 조직 배양 조건 하에서 포유동물 세포를 배양하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 공기리프트 (airlift) 반응기 또는 연속 교반 반응기 내에서의 균질 현탁 배양 또는 예를 들어, 중공 섬유, 마이크로캡슐 내에서, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지에서의 고정화 또는 포획 세포 배양을 포함한다. 필요하고/하거나 목적하는 경우, 폴리펩타이드의 용액은 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), DEAE-셀룰로스 상에서의 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 구 "결합 폴리펩타이드의 투여가 이익이 될 대상체"는 예를 들어, (예를 들어, 진단 절차를 위해서) 본 발명의 결합 펩타이드에 의해서 인식되고, 이것에 의해서 특이적으로 결합되는 항원의 검출을 위해서 사용되는 결합 폴리펩타이드의 투여가 이익이 되고/되거나 결합 폴리펩타이드로 치료하여 결합 폴리펩타이드에 의해서 인식되고, 이것에 의해서 특이적으로 결합되는 표적을 감소시키거나 제거하는 것이 이익이 될 대상체, 예컨대, 포유동물 대상체를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 순환 또는 혈청으로부터의 가용성 또는 특정 분자(예를 들어, 독소 또는 병원체)의 감소 또는 제거 또는 표적을 발현하는 세포 집단(예를 들어, 종양 세포)의 감소 또는 제거가 이익이 될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 결합 폴리펩타이드는 비접합된 형태로 사용될 수 있거나 또는 예를 들어, 약물, 전구약물 또는 아이소토프와 접합되어 상기 대상체에게 투여하기 위한 변형된 결합 폴리펩타이드를 형성할 수 있다.
용어 "페길화", "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 커플링제, 또는 커플링 또는 활성화 모이어티에 의한(예를 들어, 티올, 트라이플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란 또는 말레이미드 모이어티, 예를 들어, PEG-말레이미드를 사용한) 유도체화의 존재 또는 부재 하의 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 이의 유도체를 포함한다. 다른 적절한 폴리알킬렌 글리콜 화합물은 말레이미도 모노메톡시 PEG, 활성화된 PEG, 폴리프로필렌 글리콜을 포함하며, 또한 다음 유형의 하전되거나 중성인 중합체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 덱스트란, 콜로민산 또는 다른 탄수화물 기반 중합체, 아미노산의 중합체 및 바이오틴 유도체.
I. 가변 영역
본 발명은 알파-4 결합 항체 및 이의 단편을 제공하며, 여기서 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 프레임워크는 생식계열 또는 생식계열 조작된 항체 서열, 예컨대, IGKV4-1 또는 geAAH70335.1 또는 IGHV1-f 항체로부터 작제된 억셉터 서열을 갖는다. CDR 서열은 비인간 항-α4 결합 항체, 예컨대, 항-VLA-4 항체 HP1/2로부터 유래된다(본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된 PCT 공개 제WO2011/130603호 참고). 본 명세서에 기재된 항체는 예를 들어, 적어도 1.5, 2.0, 2.5, 3.0배의 친화도 증가를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 친화도 증가는 적어도 1.5, 2.0, 2.5, 3.0배이지만, 각각 25, 20 또는 15배 미만이다.
뮤린 단클론성 항체(mAb) HP1/2는 α4 mAb의 B1 하위군의 구성원이며, 시험관내에서 약 0.1nM의 효력으로 VCAM1 및 피브로넥틴 둘 다에 대한 세포 접착을 저해한다. HP1/2 Fab의 cryo-EM 구조는 α4β1 엑토도메인과 복합체로 해석되었다. HP1/2는 리간드 결합 홈 외부에서 α4 β-프로펠러 도메인에 결합하고, 리간드 결합을 비-경쟁적으로 길항작용한다. HP1/2에 의해서 인식되고, 이에 의해서 특이적으로 결합되는 α4 인테그린의 에피토프 및 입체배좌는 나탈리주맙 α4 인테그린 결정 구조에서 관찰되는 것과 유사하다.
mAb 대 α4 인테그린은 림프구, 호산구 및 단핵구가 조직으로 이동하는 것의 효과인 차단제이며, 생체내에서 질환 변형 효과를 나타낸다. 특히, mAb HP1/2는 양의 과반응성(Lobb et al., Ann. N.Y. Acad. Sci 796: 113-123, 1996), 기니피그에서 기관지 기도 과민 반응(Pretolani et al., J. Ex. Med. 180(3):795-805, 1994; Kraneveld et al., J. Allergy Clin. Immunol. 100(2):242-50, 1997), 영장류에서 궤양성 대장염(Podolsky et al., J. Clin Invest. 92(1):372-380,1993), NHP에서 엔다터엑토마이즈드 캐로티드 동맥 내막 과증식(endarterectomized carotid artery intimal hyperplasia)(Lumsden et al., J. Vasc. Surg. 26(1):87-93, 1997)의 동물 모델에서 효능이 있다고 밝혀져 있고, 네오외막 형성(neoadventitial formation) 및 후속 풍선 손상 후 내강 좁아짐(luminal narrowing following balloon injury) (Labinaz et al., Can J. Cardiol.16(2):187-96, 2000), 토끼에서 스텐트 삽입에 대한 염증 반응(Ma et al., 2004)을 감소시키고, 토끼에서 심장 이식편 거부반응 (Sadahiro et al., Am. J. Pathol. 142(3):675-683, 1993)을 예방한다. 또한, HP1/2는 개코원숭이에서 골수 기질로부터 조혈 전구세포의 말초화 (peripheralization)를 자극한다(Papayannopoulou and Nakamoto, Proc. Natl. Acad. Sci 90(20): 9374-9378, 1993).
HP1/2 항체는 JM (미성숙 T-세포 백혈병) 세포주가 주사된 Balb/c 마우스에서 상승되었다(Sanchez-Madrid et al., Eur. J. Immunol. 16: 1343-1349, 1986). 2마리 마우스로부터의 비장 세포에 SP2 또는 P3-X63Ag8.653 마우스 골수종 세포를 융합시켰다. 항체는 1993년에 인간화되었지만, 이어서 2010년에 재인간화되어 인간화 디자인에서 개발에 사용하였다.
알파-4 결합 항체 또는 이의 단편은 서열번호 8, 9, 10 또는 11의 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함할 수 있다. 알파-4 결합 항체 또는 이의 단편은 서열번호 3, 4 또는 5의 가변 중쇄를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 알파-4 결합 항체는 서열번호 11의 서열을 갖는 가변 경쇄 및 서열번호 4의 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다.
알파-4 결합 항체는 본 명세서에 추가로 상세하게 논의된 바와 같은 변이체 Fc 영역을 추가로 포함할 수 있다.
II. 모체 Fc 폴리펩타이드
변이체 Fc 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 모체 또는 출발 Fc 폴리펩타이드로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 IgG의 모든 아형 및 이들의 조합물을 포함하는 항체, 예컨대, IgG 면역글로불린이다. 일부 실시형태에서, IgG 항체의 모체 Fc 폴리펩타이드는 IgG 아형 또는 둘 이상의 IgG 아형의 Fc 영역의 상이한 부분의 조합을 갖는다. 인간에서, IgG 아형은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 모체 Fc 폴리펩타이드는 면역글로불린으로부터 유래된 Fc 영역을 포함하지만, Fc 영역에 작동 가능하게 연결되거나 융합된 결합 부위를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 항원, 예컨대, 리간드, 사이토카인, 수용체, 세포 표면 항원 또는 세포 항원에 결합한다. 본 명세서에서 실시예는 IgG 항체를 사용하지만, 이 방법은 임의의 Fc 폴리펩타이드 내의 Fc 영역에 동등하게 적용될 수 있다는 것이 이해된다. Fc 폴리펩타이드가 항체인 경우, 항체는 합성이거나, 자연-유래(예를 들어, 혈청으로부터)되거나, 세포주(예를 들어, 하이브리도마)에 의해서 생산되거나 트랜스제닉 유기체에서 생산될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 Fc 영역의 단일 Fc 모이어티를 포함한다. 다른 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 dcFc 폴리펩타이드이다. dcFc 폴리펩타이드는 이량체 Fc(또는 dcFc) 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 scFc 폴리펩타이드이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 scFc 폴리펩타이드는 단일-쇄 Fc(scFc) 영역을 포함하는 폴리펩타이드, 예를 들어, 적어도 2개의 Fc 모이어티 사이에 개재된 가요성 폴리펩타이드 링커를 통해서, 유전자 융합된 적어도 2개의 Fc 모이어티를 포함하는 scFc 폴리펩타이드를 지칭한다. 예시적인 scFc 영역은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 PCT 출원 제PCT/US2008/006260호(출원일 2008년 5월 14일)에 개시되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 동일하거나, 실질적으로 동일한 서열 조성의 Fc 모이어티를 포함하는 Fc 영역(본 명세서에서 "동형(homomeric) Fc 영역"이라고 지칭)을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 상이한 서열 조성의 적어도 2개의 Fc 모이어티를 포함하는 Fc 영역(본 명세서에서 "이형(heteromeric) Fc 영역"이라고 지칭)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 결합 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 하나의 삽입 또는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 이형 Fc 영역은 제1 Fc 모이어티 내에 아미노산 치환을 포함하지만, 제2 Fc 모이어티 내에는 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 Fc 모이어티로부터 독립적으로 선택된 이의 구성요소 Fc 모이어티 중 2개 이상을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, Fc 모이어티는 동일하다. 또 다른 실시형태에서, Fc 모이어티 중 적어도 2개는 상이하다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드의 Fc 모이어티는 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함하거나, 이것은 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 약 5개 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 잔기), 약 10개 잔기, 약 15개 잔기, 약 20개 잔기, 약 30개 잔기, 약 40개 잔기 또는 약 50개 잔기)만큼 길이가 상이할 수 있다. 추가의 다른 실시형태에서, Fc 모이어티는 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열이 상이할 수 있다. 예를 들어, Fc 모이어티 중 적어도 2개는 약 5개 아미노산 위치(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 위치), 약 10개 위치, 약 15개 위치, 약 20개 위치, 약 30개 위치, 약 40개 위치 또는 약 50개 위치)에서 상이할 수 있다.
모체 Fc 폴리펩타이드는 서로 또는 다른 폴리펩타이드와 조립되어 다량체 Fc 폴리펩타이드 또는 단백질(또한 본 명세서에서 "다량체"라고 지칭됨)을 형성할 수 있다. 본 발명의 다량체 Fc 폴리펩타이드 또는 단백질은 본 발명의 적어도 하나의 모체 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 모체 폴리펩타이드는 비제한적으로 단량체분만 아니라 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체 및 육량체) Fc 폴리펩타이드 또는 단백질 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 다량체의 구성요소 Fc 폴리펩타이드는 동일하다(즉, 동형 다량체, 예를 들어, 동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체). 다른 실시형태에서, 본 발명의 다량체 단백질의 적어도 2개의 구성요소 Fc 폴리펩타이드는 상이하다(즉, 이형 다량체, 예를 들어, 이종이량체, 이종삼량체, 이종사량체). 특정 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드 중 적어도 2개는 이량체를 형성할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 이량체 Fc 영역(이량체를 형성하는 단일 쇄 폴리펩타이드 또는 이량체를 형성하는 2개의 쇄 폴리펩타이드)을 포함하고, 분자에 존재하는 생물학적 활성 모이어티와 관련하여 단량체이다. 예를 들어, 이러한 Fc 작제물은 하나의 생물학적 활성 모이어티를 포함할 수 있다. 1개 또는 2개의 쇄 안정화된 Fc 단량체 작제물은, 예를 들어, 표적 분자의 가교 결합이 바람직하지 않은 경우에(예를 들어, 특정 항체, 예를 들어, 항-CD40 항체의 경우), 바람직하다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 Fc 작제물은 2개의 상이한 생물학적 활성 모이어티를 포함할 수 있다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 이러한 Fc 작제물은 2개의 동일한 생물학적 활성 모이어티를 포함할 수 있다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 이러한 Fc 작제물은 2개 초과의 동일한 생물학적 활성 모이어티를 포함할 수 있다.
A. Fc 모이어티
본 발명의 모체 Fc 폴리펩타이드를 생성시키는데 유용한 Fc 모이어티는 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 결합 폴리펩타이드의 Fc 모이어티는 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 그러나, Fc 모이어티는 예컨대, 설치류(예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그) 또는 비-인간 영장류(예컨대, 침팬지, 마카크) 종을 비롯한 또 다른 포유동물 종의 면역글로불린으로부터 유래될 수도 있는 것으로 이해된다. 더욱이, Fc는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함한 임의의 면역글로불린 클래스 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한 모든 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Fc는 IgG1로부터 유래될 수 있지만, 서열 내에 특정 돌연변이를 갖는다. 일 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG1 또는 IgG4가 사용된다. 일부 실시형태에서, Fc는 Ig 면역글로불린의 하나의 유형으로부터 취한 부분(예를 들어, IgG1로부터의 CH3 도메인) 및 또 다른 유형의 Ig 면역글로불린으로부터의 다른 부분(예를 들어, IgG4로부터의 CH1 도메인)을 함유하는 키메라일 수 있다.
다양한 Fc 모이어티 유전자 서열(예를 들어, 인간 불변 영역 유전자 서열)은 공적으로 입수할 수 있는 기탁물의 형태로 사용할 수 있다. Fc 모이어티 서열을 포함하는 불변 영역 도메인은 특정한 효과기 기능을 갖거나(또는 특정 효과기 기능이 결여되거나), 면역원성을 감소시키기 위해서 특정 변형이 있도록 선택될 수 있다. 항체 및 항체-암호화 유전자의 다수의 서열은 공개되어 있으며, 적합한 Fc 모이어티 서열(예를 들어, 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열 또는 이의 부분)은 당업계에 인식되는 기술을 사용하여 이들 서열로부터 유래될 수 있다. 그 후, 전술한 방법 중의 임의의 것을 사용하여 얻어진 유전자 물질을 변경시키거나 합성하여 본 발명의 폴리펩타이드를 얻을 수 있다. 추가로 본 발명의 범주는 불변 영역 DNA 서열의 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포함하는 것으로 이해될 수 있을 것이다.
Fc 모이어티 서열은 예를 들어, 폴리머라제 연쇄반응 및 관심대상 도메인을 증폭시키기 위해서 선택된 프라이머를 사용하여 클로닝될 수 있다. 항체로부터 Fc 모이어티 서열을 클로닝하기 위해서, mRNA를 하이브리도마, 비장 또는 림프 세포로부터 단리시키고, DNA로 역전사시키고, 항체 유전자를 PCR에 의해서 증폭시킬 수 있다. PCR 증폭 방법은 미국 특허 제4,683,195호; 4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호; 및 예를 들어, 문헌["PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270)]에 상세히 기술되어 있다. PCR은 공통 불변 영역 프라이머에 의해서 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초한 더 특이적인 프라이머에 의해서 개시될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 클론을 단리시키기 위해서 사용될 수 있다. 이 경우에, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 마우스 불변 부분 프로브와 같은 더 큰 상동성 프로브에 의해서 스크리닝될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 다수의 프라이머 세트는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 정제된 항체의 N-말단 서열에 기초한 5' 프라이머(Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); cDNA 말단의 신속한 증폭(Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); 항체 리더 서열(Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250)). 항체 서열의 클로닝은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 Newman 등의 미국 특허 제5,658,570호(출원일: 1995년 1월 25일)에 추가로 기재되어 있다.
본 발명의 모체 Fc 폴리펩타이드는 단일 Fc 모이어티 또는 다수의 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 2개 이상의 Fc 모이어티(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 Fc 모이어티)가 존재하는 경우, Fc 모이어티 중 적어도 2개는 적절하게 폴딩된 Fc 영역(예를 들어, 이량체 Fc 영역 또는 단일 쇄 Fc 영역 (scFc))을 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, Fc 모이어티는 상이한 유형의 것일 수 있다. 일 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드 내에 존재하는 적어도 하나의 Fc 모이어티는 힌지 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 적어도 하나의 CH3 도메인 또는 이의 부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 적어도 하나의 CH4 도메인 또는 이의 부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 (예를 들어, 힌지-CH2 배향으로) 적어도 하나의 힌지 도메인 또는 이의 부분 및 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 (예를 들어, CH2-CH3 배향으로) 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 부분 및 적어도 하나의 CH3 도메인 또는 이의 부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 적어도 하나의 힌지 도메인 또는 이의 부분, 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 부분 및 적어도 하나의 CH3 도메인 또는 이의 부분을, 예를 들어, 힌지-CH2-CH3, 힌지-CH3-CH2 또는 CH2-CH3-힌지의 배향으로 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다.
특정 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄(예를 들어, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 모이어티, 그러나 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없음)로부터 유래된 적어도 하나의 완전한 Fc 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 적어도 2개의 완전한 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 완전한 Fc 모이어티는 인간 IgG 면역글로불린 중쇄(예를 들어, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4)로부터 유래된다.
또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 완전한 CH3 도메인(EU 넘버링에 따라서 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 341 내지 438)을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 완전한 CH2 도메인(EU 넘버링에 따라서 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 231 내지 340)을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 적어도 CH3 도메인, 및 적어도 하나의 힌지 영역(EU 넘버링에 따라서 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 216 내지 230), 및 CH2 도메인을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 일 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 힌지 및 CH3 도메인을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 인간 IgG 면역글로불린 중쇄로부터 유래된다.
Fc 모이어티를 구성하는 불변 영역 도메인 또는 이의 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 모체 Fc 폴리펩타이드는 IgG4 분자로부터 유래된 힌지 및/또는 CH2 도메인 또는 이의 부분 및 IgG1 분자로부터 유래된 CH3 영역 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 키메라 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 힌지는 부분적으로 IgG1 분자로부터 그리고 부분적으로 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 힌지는 IgG1 분자로부터의 중간 힌지 도메인 및 IgG4 분자로부터의 상부 및 하부 힌지 도메인을 포함한다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 당업자는 모체 Fc 모이어티가 자연 발생 면역글로불린의 상응하는 Fc 모이어티와 동일할 수 있거나 또는 그것이 아미노산 서열이 달라지도록 변경될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특정 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 예를 들어, 아미노산 돌연변이(예를 들어, 추가, 결실 또는 치환)에 의해서 변경된다. 예를 들어, 모체 Fc 폴리펩타이드는 Fc 모이어티가 유래된 야생형 Fc와 비교할 때 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 Fc 모이어티일 수 있다. 예를 들어, Fc 모이어티가 인간 IgG1 항체로부터 유래되는 경우, 변이체는 인간 IgG1 Fc 영역의 상응하는 위치에서의 야생형 아미노산과 비교할 때 적어도 하나의 아미노산 돌연변이(예를 들어, 치환)를 포함한다.
아미노산 치환(들)은 잔기가 항체 내의 Fc 영역에 제공될 위치 번호(EU 넘버링 협약을 사용하여 언급된 바와 같음)에 "상응하는" 이라고도 지칭되는 Fc 모이어티 내의 위치에 배치될 수 있다. 당업자는 Fc 모이어티 내의 위치에 "상응하는" EU 번호가 무엇인지를 결정하기 위해서 정렬을 쉽게 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, 치환은 힌지 도메인 또는 이의 부분 내에 위치된 아미노산 위치에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 치환은 CH2 도메인 또는 이의 부분 내에 위치된 아미노산 위치에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 치환은 CH3 도메인 또는 이의 부분 내에 위치된 아미노산 위치에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 치환은 CH4 도메인 또는 이의 부분 내에 위치된 아미노산 위치에 존재한다.
특정 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 하나 초과의 아미노산 치환을 포함한다. 모체 Fc 폴리펩타이드는 야생형 Fc 영역에 비해서 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 적어도 1개의 아미노산 위치 또는 그 초과, 예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 아미노산 위치 또는 그 초과의 간격을 두고 서로 공간적으로 배치된다. 일부 실시형태에서, 조작된 아미노산은 적어도 5, 10, 15, 20 또는 25개의 아미노산 위치 또는 그 초과의 간격을 두고 서로 떨어져서 공간적으로 배치된다.
특정 실시형태에서, 치환은 야생형 Fc 모이어티를 포함하는 Fc 영역에 의해서 부여된 적어도 하나의 효과기 기능의 변경(예를 들어, Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질(예를 들어, C1q)에 결합하거나, 항체-의존적 세포독성(ADCC) 식균작용 또는 보체-의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC)을 유발하는 Fc 영역의 감소)을 제공한다.
모체 Fc 폴리펩타이드는 효과기 기능의 변경을 부여하는 것으로 공지된 당업계에 인식된 치환을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 모체 Fc 폴리펩타이드는 예를 들어, 각각의 부분이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 PCT 공개 WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, 및 WO06/085967A2; 미국 특허 공개 US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; 또는 미국 특허 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 및 7,317,091에 기재된 아미노산 위치 중의 하나 이상에서의 변화(예를 들어, 치환)를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 특정 변화(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특정 치환)는 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 개시된 아미노산 위치 중의 하나 이상에서의 상이한 변화(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치에서의 상이한 치환)가 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 Fc 모이어티의 "15 옹스트롬 접촉 구역(15 Angstrom Contact Zone)" 내에 있는, EU 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 위치를 포함하는 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 15 옹스트롬 구역은 전장 야생형 Fc 모이어티의 243 내지 261, 275 내지 280, 282 내지 293, 302 내지 319, 336 내지 348, 367, 369, 372 내지 389, 391, 393, 408 및 424 내지 440번 EU 위치에 배치된 잔기를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 그럼에도 불구하고 하나 이상의 기능을 Fc 영역에 부여하기에 충분하지 않은 하나 이상의 절두된 Fc 모이어티를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, FcRn(즉, FcRn 결합 부분)에 결합하는 Fc 모이어티의 부분은 대략 아미노산 282 내지 438(EU 넘버링)을 포함한다. 따라서, 모체 Fc 폴리펩타이드의 Fc 모이어티는 FcRn 결합 부분을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한, 임의의 아이소타입의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG1의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG4의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다. 특정 실시형태에서, FcRn 결합 부분은 비글리코실화된다. 다른 실시형태에서, FcRn 결합 부분은 글리코실화된다.
특정의 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 항체의 항원-독립적인 효과기 기능, 특히 항체의 순환 반감기를 변화시키는, Fc 모이어티에 대한 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 이들 치환이 없는 폴리펩타이드에 비해서 FcRn에 대한 증가되거나 감소된 결합을 나타내며, 따라서 혈청 내에서 각각 증가되거나 감소된 반감기를 갖는다. FcRn에 대한 개선된 친화도를 갖는 모체 Fc 폴리펩타이드는 더 긴 혈청 반감기를 갖는 것으로 예상되며, 이러한 분자는 투여된 폴리펩타이드의 긴 반감기가 예를 들어, 만성 질환 또는 장애를 치료하기 위해서 바람직한 경우에 포유동물을 치료하는 방법에서 유용한 응용을 갖는다. 이에 반해서, 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 모체 Fc 폴리펩타이드는 더 짧은 반감기를 갖는 것으로 예상되며, 이러한 분자는 또한 예를 들어, 단축된 순환 시간이 유리할 수 있는 경우에, 예를 들어, 생체내 진단 영상화를 위해서 또는 출발 폴리펩타이드가 장기간 동안 순환계 중에 존재할 때에 독성 부작용을 갖는 경우에 포유동물에게 투여하기에 유용하다. 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 모체 Fc 폴리펩타이드는 아마도 태반을 덜 관통할 것이며, 따라서 임신한 여성에게서 질환 또는 장애를 치료하는데 유용하다. 또한, 감소된 FcRn 결합 친화도가 바람직할 수 있는 다른 응용은 뇌, 신장 및/또는 간에서의 국지화가 바람직한 응용을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 맥관구조로부터 신장 사구체의 상피를 가로질러서 감소된 수송을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 혈액 뇌장벽(blood brain barrier; BBB)을 가로지르는 뇌로부터 혈관 공간 내로의 감소된 수송을 나타낸다. 일 실시형태에서, 변경된 FcRn 결합을 갖는 모체 Fc 폴리펩타이드는 Fc 모이어티의 "FcRn 결합 루프" 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 모이어티(예를 들어, 1 또는 2개의 Fc 모이어티)를 포함한다. FcRn 결합 루프는 야생형, 전장 Fc 모이어티의 아미노산 잔기 280 내지 299(EU 넘버링에 따름)로 구성된다. 다른 실시형태에서, 변경된 FcRn 결합 친화도를 갖는 모체 Fc 모체 폴리펩타이드는 15 A FcRn "접촉 구역" 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 모이어티(예를 들어, 1 또는 2개의 Fc 모이어티)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 15 A FcRn "접촉 구역"은 야생형 전장 Fc 모이어티의 다음 위치에서의 잔기를 포함한다: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440(EU 넘버링). 일부 실시형태에서, 변경된 FcRn 결합 친화도를 갖는 모체 Fc 폴리펩타이드는 다음의 EU 위치 중 적어도 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 모이어티(예를 들어, 1 또는 2개의 Fc 모이어티)를 포함한다: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434(예를 들어, N434A 또는 N434K) 및 438. FcRn 결합 활성을 변경시키는 예시적인 아미노산 치환은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 PCT 공개 제WO05/047327호에 개시되어 있다. 다른 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 용매-노출된 표면에 위치되는 조작된 시스테인 잔기 또는 이의 유사체를 갖는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 시스테인 잔기 또는 이의 유사체는 Fc 영역에 의해서 부여되는 효과기 기능을 방해하지 않는다. 일부 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 제2 시스테인 잔기와의 다이설파이드 결합이 실질적으로 존재하지 않는 적어도 하나의 조작된 유리 시스테인 잔기 또는 이의 유사체를 포함하는 Fc 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 CH3 도메인 내의 하기 위치 중 하나 이상에서 조작된 시스테인 잔기 또는 이의 유사체를 갖는 Fc 모이어티를 포함할 수 있다: 349-371, 390, 392, 394-423, 441-446 및 446b(EU 넘버링). 보다 일부의 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 하기 위치 중 임의의 하나에서 조작된 시스테인 잔기 또는 이의 유사체를 갖는 Fc 변이체를 포함한다: 350, 355, 359, 360, 361, 389, 413, 415, 418, 422, 441, 443 및 EU 위치 446b(EU 넘버링). 그 후, 상기 조작된 시스테인 잔기 또는 이의 유사체 중 임의의 것은 당업계에 인식된 기술(예컨대, 티올-반응성 이종이기능성 링커로 접합됨)을 사용하여 기능성 모이어티에 접합될 수 있다.
B. 효과기-적은 Fc 폴리펩타이드
특정 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 변경된 또는 감소된 효과기 기능을 갖는 "효과기-적은" Fc 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 감소된 또는 변경된 효과기 기능은 항원-의존적 효과기 기능이다. 예를 들어, 모체 Fc 폴리펩타이드는 예를 들어, 야생형 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때, 특정 ADCC 또는 보체 활성화에서, 폴리펩타이드의 항원-의존적 효과기 기능을 감소시키는 서열 변이체(예를 들어, 아미노산 치환)를 포함할 수 있다. 불행하게도, 이러한 모체 Fc 폴리펩타이드는 종종 이것을 본 발명의 방법에 따른 안정화를 위한 이상적인 후보자로 만드는 감소된 안정성을 갖는다.
감소된 FcγR 결합 친화도를 갖는 Fc 폴리펩타이드는 효과기 기능을 감소시킨다고 예측되고, 이러한 분자는 또한 예를 들어, 정상 세포가 표적 분자를 발현할 수 있는 경우 또는 폴리펩타이드의 만성 투여가 원치 않는 면역계 활성화를 초래할 수 있는 경우, 예를 들어, 표적 세포 파괴가 바람직하지 않은 병태의 치료에 유용하다. 일 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 야생형 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 옵소닌작용, 식균작용, 보체 의존적 세포독성, 항원-의존적 세포성 세포독성(ADCC) 또는 효과기 세포 조절로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원-의존적 효과기 기능을 나타낸다. 일 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 활성화 FcγR(예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, 또는 FcγRIIIa)에 대해서 변경된 결합을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 저해성 FcγR(예를 들어, FcγRIIb)에 대해서 변경된 결합 친화도를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 감소된 FcγR 결합 친화도(예를 들어, 감소된 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIIIa 결합 친화도)를 갖는 Fc 폴리펩타이드는 다음의 위치 중 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 모이어티(예를 들어, 1 또는 2개의 Fc 모이어티)를 포함한다: 234, 236, 239, 241, 251, 252, 261, 265, 268, 293, 294, 296, 298, 299, 301, 326, 328, 332, 334, 338, 376, 378 및 435(EU 넘버링). 다른 실시형태에서, 감소된 보체 결합 친화도(예를 들어, 감소된 C1q 결합 친화도)를 갖는 Fc 폴리펩타이드는 다음의 위치 중 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 모이어티(예를 들어, 1 또는 2개의 Fc 모이어티)를 포함한다: 239, 294, 296, 301, 328, 333 및 376(EU 넘버링).
FcγR 또는 보체 결합 활성을 변경시킨 예시적인 아미노산 치환은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 PCT 공개 제WO05/063815호에 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다음의 특정 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: S239D, S239E, M252T, H268D, H268E, I332D, I332E, N434A 및 N434K (즉, 항체 Fc 영역에서 이들 EU 넘버링된 위치 중의 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서의 이들 치환 중의 하나 이상).
특정 예시적인 실시형태에서, 모체 '효과기-적은' 폴리펩타이드의 효과기 기능은 모체 Fc 폴리펩타이드 내의 비글리코실화된 Fc 영역으로 인해서 변경되거나 감소될 수 있다. 특정 실시형태에서, 비글리코실화된 Fc 영역은 Fc 영역의 글리코실화를 변경시키는 아미노산 치환에 의해서 생성된다. 예를 들어, Fc 영역 내의 297번 EU 위치에서의 아스파라긴은 (예를 들어, 치환, 삽입, 결실에 의해서, 또는 화학적 변형에 의해서) 변경되어 이의 글리코실화를 저해할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 299번 EU 위치(예를 들어, 트레오닌(T))에서 아미노산 잔기는 (예를 들어, 알라닌(A))로 치환되어 인접한 잔기 297에서 글리코실화를 감소시킨다. 글리코실화를 감소시키거나 변경시키는 예시적인 아미노산 치환은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 PCT 공개 제WO05/018572호 및 미국 특허 공보 제2007/0111281호에 개시되어 있다. 다른 실시형태에서, 비글리코실화된 Fc 영역은 Fc 영역을 글리코실화시킬 수 없는 숙주 세포(예를 들어, 손상된 글리코실화 머시너리를 갖는 박테리아 숙주 세포 또는 포유동물 숙주 세포)에서 Fc 폴리펩타이드의 발현 또는 올리고당의 효소적 또는 화학적 제거에 의해서 생성된다.
특정 실시형태에서, 비글리코실화된 Fc 영역은 부분적으로 비글리코실화되거나 또는 반-글리코실화된다. 예를 들어, Fc 영역은 제1의 글리코실화된 Fc 모이어티(예를 들어, 글리코실화된 CH2 영역) 및 제2의 비글리코실화된 Fc 모이어티(예를 들어, 비글리코실화된 CH2 영역)를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 영역은 완전히 비글리코실화될 수 있고, 즉, 이의 Fc 모이어티 중 어느 것도 글리코실화되지 않는다.
"효과기-적은" 폴리펩타이드의 비글리코실화된 Fc 영역은 임의의 IgG 아이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)을 가질 수 있다. 일 예시적인 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 IgG4 항체의 비글리코실화된 Fc 영역, 예컨대, "agly IgG4.P"를 포함할 수 있다. Agly IgG4.P는 비글리코실화된 Fc 영역(EU 넘버링)을 생성하기 위해서 힌지 영역 내의 프롤린 치환(Ser228Pro) 및 CH2 도메인 내의 Thr299Ala 돌연변이를 포함하는 IgG4 항체의 조작된 형태이다. Agly IgG4.P는 시험관내에서 측정 가능한 면역 효과기 기능을 갖지 않는 것으로 나타났다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 모체 Fc 폴리펩타이드는 IgG1 항체의 비글리코실화된 Fc 영역, 예컨대, "agly IgG1"을 포함한다. Agly IgG1은 낮은 효과기 기능 프로파일을 부여하는 Thr299Ala 돌연변이(EU 넘버링)를 갖는 IgG 면역글로불린 IgG1의 비글리코실화된이다. agly IgG4.P 및 agly IgG1 항체 둘 다는 면역 효과기 기능이 바람직하지 않은 치료 시약의 중요한 클래스를 나타낸다.
특정 예시적인 실시형태에서, "효과기-적은" 모체 Fc 폴리펩타이드는 IgG4 항체로부터 유래된 Fc 영역을 포함한다. IgG4 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 동일할 수 있거나 또는 이것은 야생형 IgG4 서열에 대해서 하나 이상의 변형을 가질 수 있다. 이러한 IgG4-유사 Fc 폴리펩타이드는 보체 및/또는 Fc 수용체에 결합하는 IgG4 항체의 고유하게 감소된 능력의 결과로서 감소된 효과기 기능을 갖는다. IgG4 아이소타입의 모체 Fc 폴리펩타이드는 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다. 추가로, IgG4-유사 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역은 IgG4 항체의 완전한 Fc 모이어티를 포함할 수 있거나 그것은 키메라 Fc 모이어티를 포함할 수 있으며, 여기서 Fc 모이어티의 부분은 IgG4 항체로부터 유래되며, 나머지는 또 다른 아이소타입의 항체로부터 유래된다. 일 예시적인 실시형태에서, 키메라 Fc 모이어티는 IgG1 항체로부터의 CH3 도메인 및 IgG4 항체로부터의 CH2 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, IgG4 항체는 키메라 힌지를 포함하며, 여기서 상부 힌지 도메인 및 하부 힌지 도메인은 IgG4 항체로부터 유래되고, 중간 힌지 도메인은 힌지 영역 내의 프롤린 치환 (Ser228Pro)의 결과로 IgG1 항체로부터 유래된다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 모체 키메라 IgG4 항체는 키메라 힌지(여기서 상부 힌지 도메인 및 하부 힌지 도메인은 IgG4 항체로부터 유래되고, 중간 힌지 도메인은 힌지 영역 내의 프롤린 치환 (Ser228Pro)의 결과로 IgG1 항체로부터 유래됨), IgG1 또는 IgG4 항체로부터의 CH1 도메인, IgG4 항체로부터의 CH2 도메인(또는 292 내지 340번 위치, EU 넘버링) 및 IgG1 항체로부터의 CH1 및/또는 CH3 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, "효과기-적은" Fc 폴리펩타이드의 감소된 효과기 기능은 Fc 수용체(FcR), 예컨대, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIIIb 수용체 또는 보체 단백질, 예를 들어, 보체 단백질 C1q에 대한 결합이 감소된다. 결합에서의 이러한 변화는 약 1배 또는 그 초과, 예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 50 또는 100배 초과 또는 이의 임의의 간격 또 범위 정도일 수 있다. 효과기 기능, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체 단백질에 대한 Fc 결합에서의 이러한 감소는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 검정 또는 당업계에 공지된 검정을 사용하여 결정된 결합 활성의 백분율 감소에 기초하여 쉽게 계산된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 단일 쇄 Fc 영역을 포함한다. 이러한 단일 쇄 Fc 영역은 당업계에 공지되어 있고(예를 들어, WO200801243, WO2008131242; WO2008153954), 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 본 명세서에 교시된 바와 같은 안정화 아미노산은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 이러한 작제물의 하나 이상의 Fc 모이어티에 혼입될 수 있다. 이러한 단일 쇄 Fc 영역 또는 유전자-융합된 Fc 영역은 단일 폴리펩타이드 쇄(즉, 단일 인접한 유전자 서열에 암호화됨) 내에 유전자에 의해서 연결된 Fc 도메인(또는 Fc 모이어티)으로 구성된 합성 Fc 영역이다. 따라서, 유전자-융합된 Fc 영역(즉, scFc 영역)은, 이것이 하나의 폴리펩타이드 쇄를 포함하지만, 분자의 적절한 부분이 이량체화되어 n Fc 영역을 형성한다는 점에서 단량체이다. Fc 모이어티와 관련된 본 명세서에서의 교시는 2개의 쇄 Fc 이량체 및 단일 쇄 Fc 이량체 둘 다에 적용 가능하다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, Fc 영역 작제물 중 어느 하나의 유형은 예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체로부터 유래될 수 있거나 또는 이것은 키메라(예를 들어, 키메라 힌지를 포함함 그리고/또는 IgG4 항체로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 항체로부터의 CH3 도메인을 포함함)일 수 있다.
III. 안정화된 Fc 영역을 갖는 변이체 Fc 폴리펩타이드
특정 양상에서, 본 발명은 상기에 기재된 모체 Fc 폴리펩타이드 중 임의의 하나의 변이체인 아미노산 서열을 포함하는 변이체 Fc 폴리펩타이드를 제공한다. 특히, 본 발명의 변이체 Fc 폴리펩타이드는 모체 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역(또는 Fc 모이어티)으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 Fc 영역(또는 Fc 모이어티)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 Fc 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 안정화 Fc 돌연변이 중 적어도 하나의 존재가 모체 Fc 폴리펩타이드와 상이하다. 특정 실시형태에서, Fc 변이체는 추가적인 아미노산 서열 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 변이체는 모 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 향상된 안정성을 가질 것이고, 선택적으로 모체 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 변경된 효과기 기능을 가질 것이다. 예를 들어, 변이체 Fc 폴리펩타이드는 모체 Fc 폴리펩타이드의 항원-의존적 효과기 기능(예를 들어, ADCC 및/또는 CDC)과 동등하거나 또는 이보다 더 낮은 항원-의존적 효과기 기능을 가질 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 변이체 Fc 폴리펩타이드는 모체 Fc 폴리펩타이드에 비해서 항원-독립적인 효과기 기능(예를 들어, 연장된 반감기)을 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 변이체 Fc 폴리펩타이드는 출발 또는 모 폴리펩타이드에 비해서 대략 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 약 2 내지 약 20, 약 2 내지 약 15, 약 2 내지 약 10, 약 5 내지 약 20 또는 약 5 내지 약 10개의 돌연변이), 예를 들어, 또 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 또는 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 또는 결실을 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기를 제외하고, 모체 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역(Fc 모이어티)과 본질적으로 동일한 Fc 영역(또는 Fc 모이어티)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 변이체 Fc 폴리펩타이드는 출발 폴리펩타이드에 비해서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩타이드는 자연 발생하지 않는 아미노산 서열을 포함한다.
이러한 변이체는 출발 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 필수적으로 갖는다. 비제한적인 실시형태에서, 변이체는 예를 들어, 변이체 분자 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 영역 또는 Fc 모이어티)의 전체 길이에 걸쳐서, 출발 폴리펩타이드의 아미노산과 약 75% 내지 100% 미만 또는 80% 내지 100% 미만, 예를 들어, 약 85% 내지 100% 미만, 또는 약 90% 내지 100% 미만(예를 들어, 91 내지 99%, 92 내지 99%, 93 내지 99%, 94 내지 99%, 95 내지 99%, 96 내지 99%, 97 내지 99%, 98 내지 99% 또는 99%) 또는 약 95% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 일 실시형태에서, 출발 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 모체 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역)과 이로부터 유래된 서열(예를 들어, 변이체 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역) 사이에 하나의 아미노산 차이가 존재한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 변이체 Fc 폴리펩타이드는 안정화된 Fc 폴리펩타이드이다. 즉, 안정화된 폴리펩타이드는 안정화 Fc 돌연변이인 적어도 하나의 서열 변이 또는 돌연변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정화 Fc 돌연변이"는 그것이 유래된 모체 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 변이체 Fc 폴리펩타이드에 향상된 단백질 안정성(예를 들어, 열 안정성)을 부여하는 변이체 Fc 폴리펩타이드의 Fc 영역 내에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안정화 돌연변이는 Fc 영역 내의 탈안정화 아미노산을 Fc 영역에 향상된 단백질 안정성(본 명세서에서 "안정화 아미노산")을 부여하는 대체 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 안정화 Fc 돌연변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 안정화 돌연변이)를 포함한다. 안정화 Fc 돌연변이는 Fc 영역의 예를 들어, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2와 CH3 도메인 둘 다에 도입될 수 있다.
특정 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 변이체 Fc 폴리펩타이드는 상기에 기재된 "효과기-적은" 모체 Fc 폴리펩타이드의 안정화된 변이체이다. 즉, 안정화된 변이체는 "효과기-적은 모 Fc 폴리펩타이드"에 비해서 향상된 안정성을 갖는다. 일 예시적인 실시형태에서, 변이체 Fc 폴리펩타이드는 IgG1 항체의 비글리코실화된 Fc 영역, 예를 들어, T299A 돌연변이(EU 넘버링)를 포함하는 비글리코실화된 IgG1 Fc 영역을 포함하는 모체 Fc 폴리펩타이드의 안정화된 변이체이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 변이체 Fc 폴리펩타이드는 글리코실화된 또는 비글리코실화된 IgG4 항체의 Fc 영역을 포함하는 모체 Fc 폴리펩타이드의 안정화된 변이체이다. 예를 들어, 변이체 Fc 폴리펩타이드는 "agly IgG4.P" 항체로부터 유래된 Fc 영역 내에 안정화 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 동일한 측정 조건 하에서 변이체 Fc 폴리펩타이드와 비교하는 경우 향상된 안정성을 나타낸다. 그러나, Fc 변이체 폴리펩타이드의 안정성이 이의 모 Fc 폴리펩타이드에 비해서 향상되는 정도는 선택된 측정 조건 하에서 달라질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 안정성의 향상은 특정 pH, 예를 들어, 산성, 중성 또는 염기성 pH에서 관찰될 수 있다. 일 실시형태에서, 향상된 안정성은 약 6.0(예를 들어, 약 6.0, 약 5.5, 약 5.0, 약 4.5 또는 약 4.0) 미만의 산성 pH에서 관찰된다. 또 다른 실시형태에서, 향상된 안정성은 약 6.0 내지 약 8.0(예를 들어, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0)의 중성 pH에서 관찰된다. 또 다른 실시형태에서, 향상된 안정성은 약 8.0 내지 약 10.0(예를 들어, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 약 10.0)의 염기성 pH에서 관찰된다.
변이체 Fc 폴리펩타이드의 향상된 열 안정성은 예를 들어, 하기에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 평가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 그것이 유래된 모체 폴리펩타이드의 것보다 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 25, 약 30, 약 40 또는 50℃더 높은 열 안정성(예를 들어, 용융 온도 또는 Tm)을 갖는 Fc 영역(또는 Fc 모이어티)을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드 변이체는 이량체, 사량체 또는 다른 응집된 형태가 25% 이하(예를 들어, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10% 또는 약 5% 미만)인 단량체 가용성 단백질로서 발현된다.
또 다른 실시형태에서, 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 열 자극 검정에서 40℃ 초과(예를 들어, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49℃ 또는 그 초과)의 T50을 갖는다(본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 출원 제11/725,970호뿐만 아니라 하기 실시예 4 참고). 일부 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 분자는 50℃ 초과(예를 들어, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58℃ 또는 그 초과)의 T50을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 분자는 60℃ 초과(예를 들어, 60, 61, 62, 63, 64, 65℃ 또는 그 초과)의 T50을 갖는다. 더 추가의 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 분자는 65℃ 초과(예를 들어, 65, 66, 67, 68, 69, 70℃ 또는 그 초과)의 T50을 갖는다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 분자는 70℃ 초과(예를 들어, 70, 71, 73, 74, 75℃ 또는 그 초과)의 T50을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 분자는 약 60℃ 초과(예를 들어, 약 61, 62, 63, 64, 65℃ 또는 그 초과), 65℃ 초과(예를 들어, 65, 66, 67, 68, 69℃ 또는 그 초과) 또는 약 70℃ 초과(예를 들어, 71, 72, 73, 74, 75℃ 또는 그 초과)인 Tm 값을 갖는 CH2 도메인을 갖는다 다른 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 분자는 약 70℃ 초과(예를 들어, 71, 72, 73, 74, 75℃ 또는 그 초과), 약 75℃ 초과(예를 들어, 76, 77, 78, 79, 80℃ 또는 그 초과) 또는 80℃ 초과(예를 들어, 81, 82, 83, 84, 85 ℃ 또는 그 초과)인 Tm 값을 갖는 CH3 도메인을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 IgG4 항체(예를 들어, agly IgG4.P)의 비글리코실화된 또는 글리코실화 Fc 영역을 포함하는 모체 Fc 폴리펩타이드의 변이체이다. 다른 실시형태에서, 상기 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 IgG1 항체(예를 들어, agly IgG1)의 비글리코실화된 Fc 영역을 포함하는 모체 Fc 폴리펩타이드의 변이체이다. 추가의 다른 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 분자는 글리코실화된 IgG1 항체와 실질적으로 동일하거나 이것보다 더 큰 열 안정성을 갖는 Fc 영역 또는 Fc 모이어티(예를 들어, CH2 및/또는 CH3 도메인)를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 변이체 Fc 폴리펩타이드는 이것이 유래된 모체 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 감소된 응집을 유발한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해서 생산된 안정화된 Fc 분자는 모체 Fc 분자에 비해서 응집이 적어도 1% 감소된다. 다른 실시형태에서, 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 모체 분자에 비해서 응집이 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 75% 또는 적어도 100% 감소된다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 이것이 유래된 모체 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 증가된 장기간 안정성 또는 저장 수명을 야기한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해서 생산된 안정화된 Fc 분자는 비안정화된 결합 분자에 비해서 저장 수명이 적어도 1일 증가된다. 이것은, 안정화된 Fc 폴리펩타이드의 제제가 전날에 존재하는 양과 실질적으로 동일한 양의 생물학적 활성 변이체 Fc 폴리펩타이드를 갖고, 제제가 인지 가능할 정도로 변이체 폴리펩타이드의 응집 또는 분해를 겪지 않는다는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 안정화된 Fc 분자는 비안정화된 Fc 분자에 비해서 저장 수명이 적어도 2일, 적어도 5일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년 증가된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 이의 모체 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때 증가된 수율로 발현된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 모 Fc 분자에 비해서 수율이 적어도 1% 증가된다. 다른 실시형태에서, 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 모체 Fc 분자에 비해서 수율이 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 100% 증가된다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 숙주 세포, 예를 들어, 박테리아 또는 진핵(예를 들어, 효모 또는 포유동물) 숙주 세포에서 (모체 Fc 폴리펩타이드와 비교할 때) 증가된 수율로 발현된다. 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 발현시키는데 사용될 수 있는 예시적인 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HELA(인간 자궁경부 암종) 세포, CVI(원숭이 신장 세포주) 세포, COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체) 세포, R1610(중국 햄스터 섬유아세포) 세포, BALBC/3T3(마우스 섬유아세포) 세포, HAK(햄스터 신장 세포주) 세포, SP2/O(마우스 골수종) 세포, BFA-1c1BPT 세포(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 세포, PER.C6®(인간 망막-유래 세포주, 크루셀사 (Crucell), 네덜란드 소재) 및 293 세포(인간 신장)를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 대규모(예를 들어, 상업 규모) 조건 하에서 숙주 세포에서 (이의 모체 Fc 폴리펩타이드에 비해서) 증가된 수율로 발현된다. 예시적인 실시형태에서, 안정화된 Fc 분자는 적어도 10리터의 배양 배지에서 발현되는 경우 수율이 증가된다. 다른 실시형태에서, 안정화된 Fc 결합 분자는 적어도 20리터, 적어도 50리터, 적어도 75리터, 적어도 100리터, 적어도 200리터, 적어도 500리터, 적어도 1000리터, 적어도 2000리터, 적어도 5,000리터 또는 적어도 10,000리터의 배양 배지에서 숙주 세포로부터 발현되는 경우 수율이 증가된다. 예시적인 실시형태에서, 적어도 10㎎(예를 들어, 10㎎, 20㎎, 50㎎ 또는 100㎎)의 안정화된 Fc 분자가 1리터의 배양 배지에 대해서 생산된다.
(i) 안정화 Fc 아미노산
특정 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 IgG4 분자의 CH2 도메인(또는 이의 아미노산 292 내지 340) 및 297번 위치에 Gln(Q) 잔기를 갖는, IgG1 분자로부터의 CH3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 IgG1 분자의 CH2와 CH3 도메인 그리고 299번 위치의 Lys(K) 잔기를 단독으로 또는 297번 위치에서의 Asp(D) 잔기와 조합으로 포함한다.
(ii) 예시적인 안정화된 Fc 모이어티
본 발명의 예시적인 안정화된 Fc 모이어티는 본 출원, 실시예 및 서열 목록 전체에서 찾아볼 수 있다.
특정 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 하기 표 1.1에 제시된 Fc 아미노산 서열 중 1개, 2개 또는 그 초과를 포함하는 안정화된 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 안정화 Fc 돌연변이를 볼드체로 밑줄로 나타낸다.
[표 1.1]
특정 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 하기 표 1.2에 제시된 키메라 Fc 모이어티 아미노산 서열 중 1개, 2개 또는 그 초과를 갖는 안정화된 키메라 Fc 영역을 포함한다.
[표 1.2]
다른 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 하기 표 1.3에 제시된 IgG1 Fc 모이어티 아미노산 서열 중 1개, 2개 또는 그 초과를 갖는 안정화된 비글리코실화된 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
[표 1.3]
IV. 변이체 Fc 폴리펩타이드를 안정화시키는 방법
특정 양상에서, 본 발명은 Fc 영역(예를 들어, 비글리코실화된 Fc 영역)을 포함하는 폴리펩타이드를 안정화시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (a) 돌연변이를 위해서 출발 Fc 영역의 적어도 하나의 Fc 모이어티 내에 하나 이상의 아미노산 위치를 선택하는 단계; 및 (b) 돌연변이를 위해서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치를 돌연변이시켜, 폴리펩타이드를 안정화시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 출발 Fc 영역은 IgG1 Fc 영역이다. 또 다른 실시형태에서, 출발 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이다. 또 다른 실시형태에서, 출발 Fc 영역은 키메라 Fc 영역이다. 일 실시형태에서, 출발 Fc 영역은 비글리코실화된 IgG1 Fc 영역이다. 또 다른 실시형태에서, 출발 Fc 영역은 비글리코실화된 IgG4 Fc 영역이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체(또는 이의 단편)의 Fc 영역은 서열번호 85에 제시된 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, 돌연변이를 위해서 선택된 아미노산 위치는 출발 IgG 분자 (예를 들어, IgG4 분자)의 Fc 영역 내의 연장된 루프에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이를 위해서 선택된 아미노산 위치는 CH3 도메인 사이의 계면에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이를 위해서 선택된 아미노산 위치는 1hzh 결정 구조에서 탄수화물의 접촉 부위 근처에 존재한다(예를 들어, V264, R292 또는 V303). 다른 실시형태에서, 아미노산 위치는 CH3/CH2 계면 근처 또는 CH3/CH2 계면 근처에 존재할 수 있다(예를 들어, H310). 또 다른 실시형태에서, 예를 들어, 표면 노출된 글루타민 잔기(Q268, Q274 또는 Q355)의 세트 중 하나 이상에서 Fc 영역의 전체 표면 전하를 변경시키는 하나 이상의 돌연변이가 만들어질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 위치는 CH2 및 CH3의 "발린 코어"에서 발견되는 발린 잔기이다. CH2 내의 "발린 코어"는 모두 CH2 도메인의 동일한 가까운 내부 코어로 배향된 동일한 5개의 발린 잔기(V240, V255, V263, V302 및 V323)이다. 유사한 "발린 코어"가 CH3(V348, V369, V379, V397, V412 및 V427)에 대해서 관찰된다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이를 위해서 선택된 아미노산 위치는 아미노산 297에서 N-연결된 탄수화물과 상호작용하거나 접촉하는 것으로 예상되는 위치에 존재한다. 이러한 아미노산 위치는 동족 Fc 수용체(예를 들어, FcγRIIIa)에 결합된 Fc 영역의 결정 구조를 조사함으로써 식별될 수 있다. N297과 상호작용을 형성하는 예시적인 아미노산은 잔기 262 내지 270에 의해서 형성된 루프를 포함한다.
예시적인 아미노산 위치는 EU 넘버링 협약에 따라서 240, 255, 262 내지 266, 267 내지 271, 292 내지 299, 302 내지 309, 379, 397 내지 399, 409, 412 및 427번 아미노산 위치를 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌연변이를 위해서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 240, 255, 262, 263, 264, 266, 268, 274, 292, 299, 302, 303, 307, 309, 323, 348, 355, 369, 379, 397, 399, 409, 412 및 427로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 위치이다. 특정 실시형태에서, 돌연변이를 위해서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 399, 409 및 427로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 위치이다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 위치는 297, 299, 307, 309, 409 및 427로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 위치이다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 위치는 아미노산 잔기 240, 262, 264 및 266로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 위치 중 적어도 하나는 297번 EU 위치에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 위치 중 적어도 하나는 299번 EU 위치에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 위치 중 적어도 하나는 307번 EU 위치에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 위치 중 적어도 하나는 309번 EU 위치에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 위치 중 적어도 하나는 399번 EU 위치에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 위치 중 적어도 하나는 409번 EU 위치에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 위치 중 적어도 하나는 427번 EU 위치에 존재한다.
특정 실시형태에서, Fc 영역은 IgG1 Fc 영역이다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 IgG1 Fc 영역인 경우, 하나 이상의 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따라서 아미노산 잔기 240, 262, 264, 299, 297 및 266으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 경우, 하나 이상의 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따라서 아미노산 잔기 297, 299, 307, 309, 399, 409 및 427로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 돌연변이는 아미노산 위치(예를 들어, 알라닌(A), 세린(S) 또는 트레오닌(T)로의 치환)에서 아미노산 측쇄의 크기를 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산으로의 치환(예를 들어, 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M), 프롤린(P), 페닐알라닌(F) 및 트립토판(W)으로의 치환)이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 CH3 계면에 소수성을 부가하여, 예를 들어, 두 상호작용 도메인(예를 들어, Y349F, T350V 및 T394V) 간의 회합을 증가시키거나 또는 계면의 측쇄(예를 들어, F405Y)에서 벌크(bulk)를 증가시킨다. 또 다른 실시형태에서, "발린 코어"의 하나 이상의 아미노산은 안정성을 증가시키기 위해서 아이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산(예를 들어, L351 및/또는 L368)은 더 많이 분지화된 소수성 측쇄로 돌연변이된다.
일 실시형태에서, 돌연변이는 알라닌(A)으로의 치환이다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 류신(L)으로의 치환이다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 트레오닌(T)으로의 치환이다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 라이신(K)으로의 치환이다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 프롤린(P)으로의 치환이다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 페닐알라닌 (F)으로의 치환이다.
일 실시형태에서, 돌연변이는 하기 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3 및/또는 표 5.4에 제시된 돌연변이 또는 치환 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시형태에서, 돌연변이는 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 297S, 297D, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S, 409M 및 427F(EU 넘버링 협약)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 299 A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399E, 399S, 409K, 409M 및 427F로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 위치는 아미노산 잔기 240F, 262L, 264T 및 266F로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 299A이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 299K이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 307P이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 309K이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 309M이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 309P이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 323F이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 399S이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 399E이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 409K이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 409M이다. 또 다른 실시형태에서, 치환 중 적어도 하나는 427F이다.
또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 2개 이상의 치환(예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 3개 이상의 치환(예를 들어, 3, 4, 5 또는 6개)을 포함한다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 안정화된 Fc 영역은 4개 이상의 치환(예를 들어, 4, 5, 6 또는 7개)을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 안정화된 Fc 영역을 포함하는 안정화된 결합 분자의 제조 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 발명의 안정화된 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 결합 모이어티의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 유전자 접합시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 안정화된 Fc 영역은 본 발명의 방법에 따라서 안정화된다.
또 다른 실시형태에서, 치료용 항체는 스크램블링을 제거할 수 있거나 스크램블링에 대한 항체의 민감성을 감소시킬 수 있다. 특정 항체, 예를 들어, 야생형 IgG4 불변 영역을 갖는 것(예를 들어, 힌지 영역을 포함하는 것)은 내인성 IgG4 항체와의 스크램블링에 민감하여 기능적 1가 생성물의 2개의 카피를 생성시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Aalberse and Schuurman, Immunology 105: 9-19, 2002] 참고). 스크램블링 속도는 IgG4의 내인성 수준에 의존적일 수 있고, 이것은 가변적이다. 그 결과, 야생형 인간 IgG4 불변 영역을 갖는 치료용 항체는 가변적인 약동학/약력학(PK/PD) 프로파일을 갖는다. 야생형 IgG4 불변 영역을 갖는 항체의 스크램블링은 VLA4에 대해서 1가이고, 또 다른 항원에 대해서 1가인 이중특이적 항체를 생성시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료용 항체는 동일한 특이성(예를 들어, α4에 대한 특이적 결합)을 갖지만, 야생형 IgG4 불변 영역을 갖는 항체보다 더 일관된 PK 프로파일을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료용 항체의 보다 일관된 PK 프로파일은, 동일한 특이성(예를 들어, α4에 대한 특이적 결합)을 갖지만, 야생형 IgG4 불변 영역을 갖는 항체와 비교할 때 본 명세서에 기재된 항체의 안전성을 증가시키고/시키거나 순도를 증가시키고/시키거나 효력을 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG1과 인간 IgG4 항체 간의 키메라 또는 혼성체인 중쇄 힌지 및 Fc 영역을 갖는 치료용 항체는 인간 IgG4 분자로부터의 힌지 및 Fc 영역을 포함하는 항체에서 일어나는 스크램블링을 감소시키거나 제거할 수 있다. 일 실시형태에서, 키메라 또는 혼성체 중쇄 불변 영역을 갖는 본 명세서에 기재된 항체는 스크램블링을 제거하거나 스크램블링에 대한 항체의 민감성을 감소시킴으로써 PK/PD 가변성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료용 항체는 동일한 특이성(예를 들어, α4에 대한 특이적 결합)을 갖지만, 야생형 IgG4 불변 영역을 갖는 항체보다 더 낮은 PK/PD 가변성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 2가 단클론성 항체와 함께 효력을 증가시킬 수 있고/있거나, 스크램블링으로 인해서 이중특이성을 제거할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 돌연변이되지 않은 대응항체보다 또는 동일한 특이성(예를 들어, α4에 대한 특이적 결합)을 갖지만, 야생형 IgG4 불변 영역을 갖는 항체보다 더 높은 결합 친화도를 나타낼 수 있고/있거나 더 높은 지속적인 수용체 점유를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 더 낮은 PK/PK 가변성 및/또는 더 높은 결합 친화도 및/또는 감소된 또는 제거된 스크램블링을 갖는 본 명세서에 기재된 치료용 항체는 동일한 특이성(예를 들어, α4에 대한 특이적 결합)을 갖지만, 야생형 IgG4 불변 영역을 갖는 항체와 비교할 때 본 명세서에 기재된 항체의 안전성을 증가시키고/시키거나 순도를 증가시키고/시키거나 효력을 증가시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 스크램블링을 제거하거나 스크램블링에 대한 항체의 민감성을 감소시킨 항체는 (a) 서열번호 80의 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 중쇄; 및 (b) 서열번호 81의 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 경쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체이다.
V. 단백질 안정성의 평가 방법
본 발명의 조성물의 안정성 특성은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 당업자에게 허용 가능한 안정성 매개변수를 사용할 수 있다. 예시적인 매개변수는 하기에 보다 상세하게 기술되어 있다. 예시적인 실시형태에서, 열 안정성이 평가된다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 발현 수준(예를 들어, 수율 %로 측정되는 바와 같음)이 평가된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 응집 수준이 평가된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 안정성 특성은 적합한 대조군의 것과 비교된다. 예시적인 대조군은 모체 Fc 폴리펩타이드 예컨대, 야생형 Fc 폴리펩타이드, 야생형(글리코실화된) IgG1 또는 IgG4 항체를 포함한다 또 다른 예시적인 대조군은 비글리코실화된 Fc 폴리펩타이드, 비글리코실화된 IgG1 또는 IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 하기에 기재되는 하나 이상의 매개변수가 측정된다.
일 실시형태에서, 이 매개변수들 중 하나 이상이 포유동물 세포에서의 발현 후에 측정된다. 일 실시형태에서, 하기에 기재되는 하나 이상의 매개변수는 대규모 제조 조건(예를 들어, 생물반응기에서 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 폴리펩타이드 또는 분자의 발현) 하에서 측정된다.
A. 열 안정성
본 발명의 조성물의 열 안정성은 당업계에 공지된 다수의 비제한적 생물물리학적 또는 생물화학적 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 특정 실시형태에서, 열 안정성은 분석 분광법에 의해 평가된다. 예시적인 분석 분광법은 시차 주사 열량계 (DSC)이다. DSC는 대부분의 단백질 또는 단백질 도메인의 언폴딩을 동반하는 열 흡광도에 민감한 열량계를 사용한다(예를 들어, 문헌[Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988] 참고). 단백질의 열 안정성을 결정하기 위해, 단백질의 샘플을 열량계에 삽입하고, Fc 폴리펩타이드(또는 이의 CH2 또는 CH3 도메인)가 언폴딩될 때까지 온도를 상승시킨다. 단백질이 언폴딩하는 온도는 전체적인 단백질 안정성을 나타낸다.
또 다른 예시적인 분석 분광 방법은 원편광 이색성(Circular Dichroism: CD) 분광법이다. CD 분광법은 증가하는 온도의 함수로서 조성물의 광학 활성을 측정한다. 원편광 이색성(CD) 분광법은 구조적 비대칭으로 인해 발생하는 좌측 편광 대 측 편광의 흡수 차이를 측정한다. 정렬되지 않은 구조 또는 언폴딩된 구조는 정렬된 구조 또는 폴딩된 구조의 CD 스펙트럼과 매우 상이한 CD 스펙트럼을 초래한다. CD 스펙트럼은 증가하는 온도의 변성 영향에 대한 단백질의 민감도를 반영하고, 이에 따라 이는 단백질의 열 안정성을 나타낸다(문헌[van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol, 79(3):281-98, 2000] 참고).
열 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석 분광 방법은 형광 발광 분광법이다(상기 문헌[van Mierlo and Steemsma] 참고). 열 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석 분광 방법은 핵 자기 공명(Nuclear Magnetic Resonance: NMR) 분광법이다(예를 들어, 상기 문헌[van Mierlo and Steemsma] 참고).
다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 열 안정성은 생물화학적으로 측정된다. 열 안정성을 평가하기 위한 예시적인 생물화학적 방법은 열 자극 검정이다. "열 자극 검정"에서, 본 발명의 조성물은 일정 시간 동안 상승된 온도 범위에 적용된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 시험 Fc 영역을 포함하는 시험 Fc 폴리펩타이드는 증가된 온도 범위에, 예를 들어, 1 내지 1.5시간 동안 적용된다. 이어서, Fc 수용체(예를 들어, FcγR, 단백질 A 또는 단백질 G)에 결합하는 Fc 영역의 능력을 관련 생물화학적 검정(예를 들어, ELISA 또는 DELFIA)에 의해서 검정한다. 예시적인 열 자극 검정을 하기 실시예 4에 기재한다.
일 실시형태에서, 이러한 검정은 고효율 포맷으로 진행질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, Fc 변이체의 라이브러리를 당업계에 공지된 방법에 의해 생성시킬 수 있다. Fc 발현이 유도될 수 있고, Fc는 열 자극에 적용될 수 있다. 자극된 시험 샘플을 결합에 대해 검정할 수 있고, 안정적인 Fc 폴리펩타이드를 규모 확대시켜 추가로 특징규명할 수 있다.
특정 실시형태에서, 열 안정성은 상기 기술 중 임의의 것(예를 들어, 분석 분광 기술)을 사용하여 본 발명의 조성물의 융점(Tm)을 측정함으로써 평가된다. 융점은 조성물의 분자 중 50%가 폴딩된 상태로 있는 열적 전이 곡선의 중간점에 있는 온도이다.
다른 실시형태에서, 열 안정성은 분석 열량측정 기술(예를 들어, DSC)을 사용하여 본 발명의 조성물의 비열 또는 열용량(Cp)을 측정함으로써 평가된다. 조성물의 비열은 물 1몰의 온도를 1℃ 상승시키는 데 필요한 에너지(예를 들어, kcal/㏖ 단위)이다. 큰 Cp는 변성되거나 불활성인 단백질 조성물의 표시이다. 특정 실시형태에서, 조성물의 열용량의 변화량(ΔCp)은 열적 전이의 전 및 후의 조성물의 비열을 결정함으로써 측정된다. 다른 실시형태에서, 열 안정성은 언폴딩의 깁스 자유 에너지(ΔG), 언폴딩의 엔탈피(ΔH), 또는 언폴딩의 엔트로피(ΔS)를 포함한 열동력 안정성의 다른 매개변수를 측정하거나 결정함으로써 평가될 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 생물화학적 검정 중 하나 이상(예를 들어, 열 자극 검정)을 사용하여, 조성물의 50%가 이의 활성(예를 들어, 결합활성)을 보유하는 온도(즉, Tc 값)를 결정한다.
B. 응집률 %
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 그것의 응집 성향을 측정함으로써 결정된다. 응집은 다수의 비제한적 생물화학적 또는 생물물리학적 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 응집은 크로마토그래피, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 평가될 수 있다. SEC는 크기에 기초하여 분자를 분리한다. 칼럼을, 이온 및 작은 분자가 안으로 들어가도록 허용하지만 큰 것은 들어가지 못하도록 하는 고분자 겔의 반고체 비드로 충전한다. 단백질 조성물을 칼럼의 상단에 적용할 때, 컴팩트하게 폴딩된 단백질(즉, 비응집 단백질)이 큰 단백질 응집체에 사용 가능한 보다 큰 부피의 용매를 통해 분배된다. 결과적으로, 큰 응집체는 칼럼을 통해 보다 빨리 이동하고, 이러한 식으로, 혼합물은 분리되거나 그 성분 안으로 분별될 수 있다. 각각의 분획이 겔로부터 용리됨에 따라서, 이것이 (예를 들어, 광 산란에 의해) 분리되어 정량될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물의 응집률 %는 분획의 농도를 겔에 적용된 단백질의 총 농도와 비교함으로써 결정될 수 있다. 안정적인 조성물은 본질적으로 단일 분획으로서 칼럼으로부터 용리되어, 용리 프로파일 또는 크로마토그램에서 본질적으로 단일 피크로서 나타난다.
일부 실시형태에서, SEC는 인-라인 광 산란(예를 들어, 정통적 또는 동적 광 산란)과 함께 사용되어, 조성물의 응집률 %을 결정한다. 특정 실시형태에서, 정적 광 산란을 사용하여, 분자 형상 또는 용리 위치와 무관한 각 분획 또는 피크의 질량을 측정한다. 일부 실시형태에서, 동적 광 산란을 사용하여, 조성물의 수력학적 크기를 측정한다. 단백질 안정성을 평가하기 위한 다른 예시적인 방법은 고속 SEC를 포함한다(예를 들어, 문헌[Corbett et al., Biochemistry. 23(8):1888-94, 1984] 참고).
비제한적인 실시형태에서, 응집률 %은 단백질 샘플 내의 단백질 응집체의 분율을 측정함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 조성물의 응집률 %는 단백질 샘플 내의 폴딩된 단백질의 분율을 결정함으로써 측정된다.
C. 수율 %
다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 단백질의 발현(예를 들어, 재조합 발현) 후에 회수된 단백질의 양(여기서, "수율 %")을 측정함으로써 평가된다. 예를 들어, 수율 %는 숙주 배양 배지의㎖ 마다에 대해서 회수된 단백질의 밀리그램(즉, ㎎/㎖의 단백질)을 결정함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수율 %는 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포) 내에서의 발현 후에 평가된다.
D. 손실률 %
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 정의된 시간 동안 저장한 후 일정 범위의 온도(예를 들어, -80 내지 25℃)에서 단백질의 손실을 모니터링함으로써 평가된다. 회수된 단백질의 양 또는 농도는 당업계에 공지된 임의의 단백질 정량 방법을 사용하여 결정되어, 단백질의 초기 농도와 비교될 수 있다. 예시적인 단백질 정량 방법은 SDS-PAGE 분석 또는 브래드포드(Bradford) 검정이 포함된다 (Bradford, et al., Anal. Biochem. 72, 248, (1976)). 손실률 %를 평가하기 위한 비제한적인 방법은 상기 기재된 분석 SEC 방법 중 임의의 것을 사용한다. 손실률 % 측정은 임의의 바람직한 저장 조건 또는 예를 들어, 동결건조 단백질 제제를 비롯한 저장 제형 하에서 결정될 수 있다.
E. 단백질분해율 %
다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 표준 조건 하에서 저장된 후 단백질분해되는 단백질의 양을 결정함으로써 평가된다. 예시적인 일 실시형태에서, 단백질분해는 단백질의 SDS-PAGE에 의해 결정되고, 여기서 무손상 단백질의 양을 SDS-PAGE 겔 상에 나타나는 저분자량 단편의 양과 비교한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 단백질분해는 질량 분광법(MS)에 의해 결정되고, 여기서 예상 분자량의 단백질의 양을 샘플 내 저분자량 단백질 단편의 양과 비교한다.
F. 결합 친화도
다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 표적 결합 친화도를 결정함으로써 평가될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 매우 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 예시적인 방법은 표면 플라스몬 공명을 사용한다. 표면 플라스몬 공명은, 예를 들어, BIAcore 시스템(파마시아 바이오센서 에이비사(Pharmacia Biosensor AB), 스웨덴 업살라 및 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)을 사용하여 바이오센서 기질 내 단백질 농도의 변경을 검출함으로써 실시간 생물특이적 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상이다. 추가 설명에 대해, 문헌[U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) /. MoI. Recognit. 8:125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참고하기 바란다.
G. 다른 결합 연구
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 표지 화합물의 결합 분자의 변성되거나 언폴딩된 부분에 대한 결합을 정량함으로써 평가될 수 있다. 이러한 분자는 소수성일 수 있는데, 이는 그것이 네이티브 단백질의 내부에 일반적으로 매립되어 있지만, 변성되거나 언폴딩된 결합 분자에 노출된 아미노산의 큰 소수성 패치와 결합하거나 상호작용할 것이기 때문이다. 예시적인 표지 화합물은 소수성 형광 염료, 1-아닐리노-8-나프탈린 설포네이트(ANS)이다.
VI. 안정화된 Fc 영역을 포함하는 안정화된 결합 폴리펩타이드
일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 IgG4 항체로부터의 CH1 도메인, IgG4 항체로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 항체로부터의 CH3 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 Ser228Pro 치환을 추가로 포함한다. 폴리펩타이드는 아미노산 297 및/또는 299, 예를 들어, 297Q 및/또는 299K 또는 297S 및/또는 299K에서 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 IgG1 또는 IgG4 항체로부터의 CH1 도메인, IgG4 항체로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 항체로부터의 CH3 도메인을 포함할 수 있고; 여기서 폴리펩타이드는 Ser228Pro, 297Q 또는 299K 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다. IgG4 분자로부터의 CH1 도메인(Ser228Pro 치환을 가짐), IgG4 항체로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 항체로부터의 CH3 도메인으로 이루어진 Fc 영역의 아미노산 서열이 서열번호 43에 제공된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 서열번호 74에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 서열번호 75에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 서열번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 안정화된 Fc 폴리펩타이드는 서열번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 Fc 영역은 단일 쇄(scFc)이다. 일 실시형태에서, 본 단락에 기재된 Fc 영역을 포함하는 분자는 1가이다. 일 실시형태에서, 본 단락에 기재된 Fc 영역을 포함하는 분자는 1가 이고, Fc 영역은 scFc이다. 본 명세서에 기재된 Fc 영역을 포함하는 분자는 또한 scFv를 포함할 수 있다.
VII. 기능성 모이어티를 포함하는 안정화된 Fc-함유 폴리펩타이드
본 발명의 변이체 Fc-함유 폴리펩타이드는 목적하는 효과를 갖도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 변이체 Fc-폴리펩타이드의 Fc 영역은 추가 모이어티, 즉, 기능성 모이어티, 예컨대, 예를 들어, 차단 모이어티, 검출 가능한 모이어티, 진단용 모이어티 및/또는 치료용 모이어티에 연결, 예를 들어, 공유 연결될 수 있다. 예시적인 기능성 모이어티는 먼저 하기에 기재되어 있고, 그 다음 상이한 아미노산 측쇄 화학에 이러한 기능성 모이어티를 연결하기 위한 유용한 화학이 기재된다.
유용한 기능성 모이어티의 예는 차단 모이어티, 검출 가능한 모이어티, 진단용 모이어티 및 치료용 모이어티를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 차단 모이어티는, 효과기 기능이 예를 들어, 수용체 또는 보체 단백질에 결합하는 Fc 영역의 능력을 저해함으로써 감소되도록, 충분한 입체 장애 및/또는 전하의 모이어티를 포함한다. 비제한적인 차단 모이어티는 폴리알킬렌 글리콜 모이어티, 예를 들어, PEG 모이어티 또는 PEG-말레이미드 모이어티를 포함한다. 비제한적인 페길화 모이어티(또는 관련 중합체)는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜("PEG"), 폴리프로필렌 글리콜("PPG"), 폴리옥시에틸화 글리세롤("POG") 및 다른 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리바이닐 알코올("PVA) 및 다른 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리옥시에틸화 솔비톨 또는 폴리옥시에틸화 글루코스일 수 있다. 중합체는, 그것이 적어도 하나의 활성 설폰 모이어티를 갖는 한, 직쇄형 또는 분지형의 치환된 또는 비치환된 상기에 언급된 단량체에 기초한 단독중합체, 랜덤 또는 블록 공중합체 사원공중합체일 수 있다. 중합체 부분은 임의의 길이 또는 분자량을 가질 수 있지만, 이러한 특징을 생물학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 약제학적 응용에서 청소율을 감소시키기에 특히 유용한 중합체 평균 분자량은 2,000 내지 35,000달톤의 범위이다. 또한, 2개의 기가 각각의 단부에 하나씩 중합체에 연결되는 경우, 중합체의 길이는 두 기 사이에서 효과적인 거리 및 다른 공간적 관계에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 당업자는 중합체의 길이를 변경하여 목적하는 생물학적 활성을 최적화하거나 부여할 수 있다. PEG는 몇몇 이유로 인해서 생물학적 응용에 유용하다. PEG는 전형적으로 투명하고, 무색, 무취이고, 수용성이고, 열 안정적이고, 다수의 화학 물질에 불활성이고, 가수분해되지 않고, 무독성이다. 페길화는 분자의 겉보기 분자량을 증가시킴으로써 분자의 약동학적 성능을 개선시킬 수 있다. 겉보기 분자량의 증가는 피하 또는 전신 투여 후 신체로부터의 청소율을 감소시킨다. 다수의 경우, 페길화는 항원성 및 면역원성을 감소시킬 수 있다. 또한, 페길화는 생물학적 활성 분자의 용해도를 증가시킬 수 있다.
페길화된 항체 및 항체 단편은 일반적으로 본 명세서에 기재된 항체 및 항체 단편의 투여에 의해서 완화되거나 조절될 수 있는 병태를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 일반적으로 페길화된 비글리코실화된 항체 및 항체 단편은 비페길화된 비글리코실화된 항체 및 항체 단편과 비교할 때 증가된 반감기를 갖는다. 페길화된 비글리코실화된 항체 및 항체 단편은 단독으로, 함께 또는 다른 약제학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 폴리펩타이드에 유용한 검출 가능한 모이어티의 예는 형광 모이어티, 방사성 동위원소 모이어티, 방사성불투과성 (radioisotopic) 모이어티 등, 예를 들어, 검출 가능한 표지, 예컨대, 바이오틴, 형광단, 발색단, 스핀 공명 프로브 또는 방사성표지를 포함한다. 예시적인 형광단은 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인, 로다민 등) 및 다른 발광 분자(예를 들어, 루미날(luminal))를 포함한다. 형광단은, 기질(예를 들어, 단실 프로브)에 결합할 때 구조적 변화를 겪는 변형된 단백질에서 하나 이상의 잔기에 가깝도록 위치하면 형광이 변화하도록 환경 민감성일 수 있다. 예시적인 방사성표지는 하나 이상의 저 민감성 핵(13C, 15N, 2H, 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, 111In 등)을 갖는 원자를 함유하는 소분자를 포함한다. 다른 유용한 모이어티는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 방법 및 폴리펩타이드에 유용한 진단용 모이어티의 예는 질환 또는 장애의 존재를 드러내기에 적합한 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 전형적으로 진단용 모이어티는 분자, 예를 들어, 질환 또는 장애와 연관된 표적 펩타이드, 단백질 또는 단백질들의 존재, 부재 또는 수준을 결정하도록 한다. 이러한 진단제는 또한 질환 또는 장애 및 이의 진행을 예후 및/또는 진단하기에 적합하다.
본 발명의 방법 및 폴리펩타이드에 유용한 치료용 모이어티의 예는 예를 들어, 소염제, 항암제, 항-신경변성제 및 항-감염제를 포함한다. 기능성 모이어티는 또한 상기에 언급된 기능 중 하나 이상을 가질 수 있다.
예시적인 치료제는 핵 DNA에서 다중 가닥 브레이크를 유발할 수 있는 고-에너지 이온화 방사선을 가져서, (예를 들어, 암의) 세포 사멸을 유도하기에 적합한 방사성 핵종을 포함한다. 예시적인 고-에너지 방사성 핵종은 하기를 포함한다: 90Y, 125I, 1311, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re. 이러한 동위원소는 전형적으로 짧은 경로 길이를 갖는 고 에너지 OC- 또는 β-입자를 생성시킨다. 이러한 방사성 핵종은 이것이 가까이 있는 세포, 예를 들어 접합체가 부착되거나 유입된 신생물 세포를 사멸시킨다. 이것은 국소화되지 않은 세포에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않으며, 본질적으로 면역원성이 아니다.
예시적인 치료제는 또한 세포독성제, 예컨대, 세포증식정지제(예를 들어, 알킬화제, DNA 합성 저해제, DNA-인터칼레이터 또는 가교제, 또는 DNA-RNA 전사 조절제), 효소 저해제, 유전자 조절제, 세포 독성 뉴클레오사이드, 튜불린 결합제, 호르몬 및 호르몬 길항제, 항-혈관신생제 등을 포함한다.
예시적인 치료제는 또한 알킬화제, 예컨대, 안트라사이클린 패밀리 약물(예를 들어, 아드리아마이신, 카미노마이신, 사이클로스포린-A, 클로로퀸, 메톱테린, 미트라마이신, 포피로마이신, 스트렙토니그린, 포피로마이신, 안트라센다이온 및 아지리딘)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 화학치료 모이어티는 세포증식정지제, 예컨대, DNA 합성 저해제이다. DNA 합성 저해제의 예는 메토트렉세이트 및 다이클로로메토트렉세이트, 3-아미노-1,2,4-벤조트라이아진 1,4-다이옥사이드, 아미놉테린, 사이토신 β-D-아라비노퓨라노사이드, 5-플루오로-5'-데옥시유리딘, 5-플루오로유라실, 간시클로비어, 하이드록시유레아, 악티노마이신-D 및 미토마이신 C를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 DNA-인터칼레이터 또는 가교결합제는 블레오마이신, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 시스-다이아민플라티늄(II) 다이클로라이드(시스플라틴), 멜팔란, 미톡산트론 및 옥살리플라틴을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 치료제는 또한 전사 조절제, 예컨대, 악티노마이신 D, 다우노루비신, 독소루비신, 호모하링토인 및 이다루비신을 포함한다. 본 발명과 상용성인 다른 예시적인 세포증식정지제는 안사마이신 벤조퀴논, 퀴노노이드 유도체(예를 들어, 퀴놀론, 게니스테인, 박타사이클린), 부설판, 이포스파마이드, 메클로에타민, 트라이아지쿠온, 다이아지쿠온, 카바질퀴논, 인돌로퀴논 EO9, 다이아지리딘일-벤조퀴논 메틸 DZQ, 트라이에틸렌포스포아마이드 및 나이트로소유레아 화합물(예를 들어, 카무스틴, 로무스틴, 세무스틴)을 포함한다.
예시적인 치료제는 또한 세포독성 뉴클레오사이드, 예를 들어, 아데노신 아라비노사이드, 사이타라빈, 사이토신 아라비노사이드, 5-플루오로유라실, 플루다라빈, 플록스유리딘, 프토라퍼 및 6-머캅토퓨린; 튜불린 결합제, 예컨대, 탁소이드(예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 탁산), 노코다졸, 리족신, 돌라스타틴(예를 들어, 돌라스타틴-10, -11 또는 -15), 콜히친 및 콜히치노이드(예를 들어, ZD6126), 콤브레타스타틴(예를 들어, 콤브레타스타틴 A-4, AVE-6032) 및 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈(나벨빈)); 항-신생혈관생성 화합물, 예컨대, 안지오스타틴 Kl-3, DL-α-다이플루오로메틸-오르니틴, 엔도스타틴, 푸마길린, 게니스테인, 미노사이클린, 스타우로스포린 및 (±)-탈리도마이드 등을 포함한다. 예시적인 치료제는 또한 호르몬 및 호르몬 길항제, 예컨대, 코티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손), 프로게스틴(예를 들어, 하이드록시프로게스테론 또는 메드로프로게스테론), 에스트로겐(예를 들어, 다이에틸스틸베스트롤), 항에스트로겐(예를 들어, 타목시펜), 안드로겐(예를 들어, 테스토스테론), 아로마타제 저해제(예를 들어, 아미노글루테티마이드), 17-(알릴아미노)- 17-데메톡시겔다나마이신, 4-아미노-1,8-나프탈리마이드, 아피게닌, 브레펠딘 A, 시메티딘, 다이클로로메틸렌-다이포스폰산, 류프롤라이드(류프로렐린), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(luteinizing hormone-releasing hormone), 피피트린-α, 라파마이신, 성 호르몬-결합 글로불린 및 탑시가르긴을 포함한다.
예시적인 치료제는 또한 효소 저해제, 예컨대, S(+)-캄프토테신, 커큐민, (-)-데구엘린, 5,6-다이클로로벤즈-이미다졸 1-β-D-리보퓨라노사이드, 에토포사이드, 포르메스탄, 포스트라이에신, 히스피딘, 2-이미노-1-이미다졸리딘아세트산(사이클로크레아틴), 메비놀린, 트라이코스타틴 A, 티르포스틴 AG 34 및 티르포스틴 AG 879를 포함한다. 예시적인 치료제는 또한 유전자 조절제, 예컨대, 5-아자-2'- 데옥시사이티딘, 5-아자사이티딘, 콜레칼시페롤(비타민 D3), 4-하이드록시타목시펜, 멜라토닌, 미페프리스톤, 랄록시펜, 트랜스-레티날(비타민 A 알데하이드), 레티노산, 비타민 A 산, 9-시스-레티노산, 13-시스-레티노산, 레티놀(비타민 A), 타목시펜 및 트로클리타존을 포함한다.
예시적인 치료제는 또한 세포독성제, 예를 들어, 프테리딘 패밀리의 약물, 다이이넨 및 포도필로톡신 등을 포함한다. 이러한 클래스의 특히 유용한 구성원은 예를 들어, 메톱테린, 포도필로톡신 또는 포도필로톡신 유도체, 예컨대, 에토포사이드 또는 에토포사이드 포스페이트, 류로시딘, 빈데신, 류로신 등을 포함한다.
본 명세서의 교시와 상용성인 추가의 다른 사이토톡신은 아우리스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 E 및 모노메틸아우리스탄 E), 칼헤아미신, 그라미시딘 D, 메이탄사노이드(예를 들어, 메이탄신), 네오카지노스타틴, 토포테칸, 탁산, 사이토칼라신 B, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 테노포사이드, 콜히친, 다이하이드록시 안트라신다이온, 미톡산트론, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 다른 유형의 기능성 모이어티가 당업계에 공지되어 있고, 본 명세서에 포함된 교시에 기초하여 본 발명의 방법 및 조성물에서 쉽게 사용될 수 있다.
소분자, 핵산, 중합체, 펩타이드, 단백질, 화학치료제 또는 다른 유형의 분자를 특정 아미노산 측쇄에 연결하기 위한 상기 기능성 모이어티를 연결하기 위한 화학은 당업계에 공지되어 있다(특정 링커의 상세한 검토에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)] 참고).
VIII. 약제학적 조성물
안정화된 Fc 영역을 갖는 α4 결합제, 예컨대, VLA-4 결합 항체는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 양립성인 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
"약제학적으로 허용 가능한 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 유지하고 임의의 목적하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참고). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가 염은 무독성 무기산, 예컨대, 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산 등 그리고 무독성 유기산, 예컨대, 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등 그리고 무독성 유기 아민, 예컨대, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 항체 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 약제학적 제형은 널리 확립된 기술이고, 문헌[Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); 및 Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X)]에 추가로 기재되어 있다.
일 실시형태에서, α4 항체는 부형제 물질, 예컨대, 염화나트륨, 나트륨 이염기성 인산염 7수화물, 나트륨 일염기성 인산염 및 폴리솔베이트 80으로 제형화될 수 있다. 다른 실시형태에서, α4 항체는 예를 들어, pH 5, 5.5, 6, 6.5, 7 또는 7.5에서 스트르산염 완충액에서 제형화될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, α4 항체는 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14 또는 15% 수크로스를 포함하는 용액에서 제형화될 수 있다. 이것은 예를 들어, 약 20㎎/㎖ 농도에서 완충된 용액 중에 제공될 수 있고, 2 내지 8℃에서 저장될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 다양한 다른 형태로 존재할 수 있다. 이것은 예를 들어, 액체, 반-고체 및 고체 투여 형태, 예컨대, 액체 용액(예를 들어, 주사 가능 용액 및 주입 가능 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포좀 및 좌약을 포함한다. 형태는 의도된 투여 양식 및 치료 응용에 좌우될 수 있다. 전형적으로, 본 명세서에 기재된 작용제를 위한 조성물은 주사 가능 또는 주입 가능 용액의 형태일 수 있다.
이러한 조성물은 비경구 모드(예를 들어, 정맥내, 피하, 복막내, 또는 근육내 주사)에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 일반적으로 주사에 의한, 장관 및 국소 투여 이외의 투여 모드를 의미하고, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추관내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
약제학적 조성물은 전형적으로 제조와 저장 조건 하에 멸균되어야 하고, 정적이어야 한다. 약제학적 조성물은 또한 투여를 위한 정부 및 업계 기준을 충족하는 것을 보장하기 위해서 시험되어야 한다.
조성물은 용액, 마이크로에멀션, 분산액, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사 가능 용액은 적절한 용매 중에서, 필요한 양의 본 명세서에 기재된 작용제를 필요에 따라 상기에 열거된 하나 또는 성분의 조합물과 함께 혼입하고, 그 다음 멸균 여과(filtered sterilization)시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기에 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 본 명세서에 기재된 작용제를 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 전형적인 제조 방법은 미리 멸균-여과된 용액으로부터 본 명세서에 기재된 작용제 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조(vacuum drying) 및 동결건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사 가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대, 모노스테아르산염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
IX. 투여
α4 결합 항체는 다양한 방법에 의해 대상체, 예컨대, 인간 대상체에 투여될 수 있다. 많은 적용의 경우에, 투여 경로는 정맥내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 근육내 주사 중 하나이다. α4 결합 항체는 고정된 용량 또는㎎/㎏ 단위의 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 항체는 정맥내(IV) 또는 피하(SC) 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 예를 들어, 4주마다 약 50 내지 600㎎ IV 또는 예를 들어, 적어도 주 1회(예를 들어, 주 2회) 약 50 내지 100㎎ SC(예를 들어, 75㎎)의 고정된 단위 용량으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 50㎎, 60㎎, 80㎎, 100㎎, 120㎎, 130㎎, 140㎎, 150㎎, 160㎎, 180㎎, 200㎎, 300㎎, 400㎎, 500㎎ 또는 600㎎ 또는 그 이상의 고정된 단위 용량으로 IV로 투여된다. IV 용량의 투여는 주 1회 또는 2회 또는 3회 또는 그 초과 또는 2주, 3주, 4주 또는 5주마다 1회 또는 더욱 적은 빈도로 실시될 수 있다.
일 실시형태에서, 이러한 항체는 50㎎, 60㎎, 70㎎, 75㎎, 80㎎, 100㎎, 또는 120㎎ 또는 그 초과의 고정된 단위 용량으로 SC로 투여된다. SC 용량의 투여는 주 1회 또는 2회 또는 3회 또는 그 초과 또는 2주, 3주, 4주 또는 5주마다 1회 또는 더욱 적은 빈도로 실시될 수 있다.
항-α4 항체는 또한, 약 1 내지 10㎎/㎏, 예를 들어, 약 6.0㎎/㎏, 4.0㎎/㎏, 3.0㎎/㎏, 2.0㎎/㎏, 1.0㎎/㎏의 용량으로 볼러스로 투여될 수 있다. 변형된 용량 범위는 전형적으로 4주마다 또는 월 1회 투여를 위한 약 600㎎/대상체, 약 400㎎/대상체, 약 300㎎/대상체, 약 250㎎/대상체, 약 200㎎/대상체 또는 약 150㎎/대상체 미만인 용량을 포함한다. α4 결합 항체는 예를 들어, 3주 내지 5주마다, 예컨대, 4주마다, 또는 월 1회 투여될 수 있다.
투여는 항-α4 항체의 이전 투여의 환자 청소율에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 환자는 환자의 신체 내에서 항-α4 항체의 수준이 미리 결정된 수준 미만으로 떨어지기 이전에, 제2 또는 후속 용량이 투여되지 않을 것이다. 일 실시형태에서, 환자로부터 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 혈액, 소변 또는 뇌척수액(CSF) 샘플)을 항-α4 항체의 존재에 대해서 검정하고, 항-α4 항체의 수준이 미리 결정된 수준을 초과하면, 환자는 제2 또는 후속 용량이 투여되지 않을 것이다. 환자의 신체 내에서 항-α4 항체의 수준이 미리 결정된 수준 미만이면, 환자는 제2 또는 후속 용량이 투여된다. 항-α4 수준이 너무 높은 것(미리 결정된 수준 초과)으로 결정된 환자는 1일 또는 2일 또는 3일, 또는 1주 후 다시 시험될 수 있고, 환자 샘플에서 항-α4-항체의 수준이 미리 결정된 수준 미만으로 떨어지면, 환자는 항체의 제2 또는 후속 용량이 투여될 수 있다.
용량은 또한 α4 결합 항체에 대한 항체의 생산을 감소시키거나 피하도록, α4 소단위의 40, 50, 70, 75, 또는 80% 초과의 포화도 (saturation)가 달성되도록, α4 소단위의 80, 70, 60, 50, 또는 40% 미만의 포화도가 달성되도록 또는 순환 백혈구 세포의 수준에서 증가가 예방되도록 선택될 수 있다.
특정 실시형태에서, 활성제는 신속한 방출로부터 화합물을 보호하는 담체, 예컨대, 이식물을 비롯한 제어 방출 제형(controlled release formulation) 및 미세캡슐화된 전달 시스템(microencapsulated delivery system)으로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 바이닐 아세테이트(에틸렌 바이닐 아세테이트), 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조를 위한 많은 방법이 특허되거나, 또는 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Controlled Drug Delivery (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Second Edition, J. Robinson and V. H. L. Lee, eds., Marcel Dekker, Inc., New York, 1987]을 참고하기 바란다.
약제학적 조성물은 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 바늘 없는 피하 주사 장치, 예컨대, 미국 특허 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 예를 들어, 미국 특허 제4,487,603호(이것은 의약을 제어된 속도로 분배하기 위한 이식 가능한 마이크로-주입 펌프를 개시함); 미국 특허 제4,486,194호(이것은 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치를 개시함); 미국 특허 제4,447,233호(이것은 의약을 정확한 주입 속도로 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시함); 미국 특허 제4,447,224호(이것은 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식 가능 주입 기기를 개시함); 미국 특허 제4,439,196호(이것은 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시함); 및 미국 특허 제4,475,196호(이것은 삼투성 약물 전달 시스템을 개시함)에서 논의된다. 물론, 다수의 다른 이와 같은 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 역시 공지되어 있다.
본 발명은 또한, 제1 작용제 및 제2 작용제를 투여하기 위한 장치를 특징으로 한다. 이러한 장치는 예를 들어, 약제학적 제제를 저장하기 위한 하나 이상의 하우징(housing)을 포함할 수 있고, 제1 작용제 및 제2 작용제의 단위 용량을 전달하도록 구성될 수 있다. 제1 작용제 및 제2 작용제는 동일한 또는 별개의 구획 내에 저장될 수 있다. 예를 들어, 이러한 장치는 투여에 이전에 이들 작용제를 조합할 수 있다. 또한, 제1 작용제 및 제2 작용제를 투여하기 위해 상이한 장치를 사용하는 것이 가능하다.
투여 요법은 목적하는 반응, 예컨대, 치료 반응 또는 병용 치료 효과를 제공하기 위해 조정된다. 일반적으로, VLA4 결합제와 제2 작용제의 용량(별개의 또는 공동-제형화됨)의 임의의 조합물이 대상체에게 두 작용제 모두를 생체 사용 가능한 양으로 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태 또는 "고정된 용량"은 치료되는 대상체에 대한 단위 용량(unitary dosage)으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체 및 선택적으로 다른 작용제와 공동으로 원하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 작용제의 "치료적 유효량"을 포함할 수 있다. 이러한 유효량은 투여된 제1 작용제와 제2 작용제의 조합 효과 (combinatorial effect)에 기초하여 결정될 수 있다. 작용제의 치료적 유효량은 또한 대상체의 질환 상태, 연령, 성별과 체중, 그리고 대상체에서 목적하는 반응, 예컨대, 적어도 하나의 장애 매개변수, 예를 들어, 다발성 경화증 매개변수의 개선 또는 장애의 적어도 하나의 증상, 예컨대, 다발성 경화증의 증상, 예컨대, 근육 위축, 기능장애(ataxia) 및 진전 (tremor)의 개선을 유도하는 화합물의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수도 있다. 치료적 유효량은 또한 조성물의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 유익한 효과에 의해 압도되는 양이다.
IX. 장치 및 키트
본 명세서에 기재된 항체를 함유하는 제형은 의료 장치로 투여될 수 있다. 이러한 장치는 긴급 상황에서 예를 들어, 현장의 훈련되지 않은 대상체 또는 응급 요원에 의해 사용되고, 의료 시설 및 기타 의료 장비로 이동될 수 있도록 휴대가능성(portability), 실온 보관 및 사용의 편이성과 같은 특징을 갖도록 설계될 수 있다. 이러한 장치는 예를 들어, α4-결합 항체를 포함하는 약제학적 제제를 저장하기 위한 하나 이상의 하우징을 포함할 수 있고, 작용제의 하나 이상의 단위 용량을 전달하도록 구성될 수 있다.
예를 들어, 약제학적 조성물은 경피 전달 장치, 예컨대, 피하 또는 다중챔버 주사기를 비롯한 주사기로 투여될 수 있다. 다른 적합한 전달 장치는 스텐트 (stent), 카테터(catheter), 마이크로니들(microneedle) 및 이식 가능한 제어 방출 장치를 포함한다. 조성물은 예를 들어, 인-라인 필터가 있거나 없는 IV 튜빙을 비롯한 표준 IV 장비로 정맥내 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 장치는 SC 또는 IM 투여에서의 사용을 위한 주사기일 것이다.
약제학적 조성물은 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 바늘 없는 피하 주사 장치, 예컨대, 미국 특허 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 예를 들어, 미국 특허 제4,487,603호(이것은 의약을 제어된 속도로 분배하기 위한 이식 가능한 마이크로-주입 펌프를 개시함); 미국 특허 제4,486,194호(이것은 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치를 개시함); 미국 특허 제4,447,233호(이것은 의약을 정확한 주입 속도로 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시함); 미국 특허 제4,447,224호(이것은 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식 가능 주입 기기를 개시함); 미국 특허 제4,439,196호(이것은 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시함); 및 미국 특허 제4,475,196호(이것은 삼투성 약물 전달 시스템을 개시함)에서 논의된다. 치료용 조성물은 또한 피하 또는 근육내 투여를 위한 생분해성 또는 비-생분해성 지속 방출 제형의 형태일 수 있다. 이러한 조성물에 대한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 연속 투여는 또한, 이식 가능 펌프 또는 외부 펌프를 사용하여 달성될 수 있다. 투여는 또한 예를 들어, 1일 단일 주사에 의해 간헐적으로 또는 예를 들어, 지속 방출 제형으로 적은 용량으로 연속적으로 수행될 수 있다. 전달 장치는 α4-결합 항체의 투여에 최적으로 적합하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 주사기는 항체의 저장 및 전달을 위한 최적의 정도까지 실리콘 처리될 수 있다. 물론, 다수의 다른 이와 같은 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 역시 공지되어 있다.
본 발명은 또한 제1 작용제 및 제2 작용제(예를 들어, 항체 및 제2 작용제)를 투여하기 위한 장치를 특징으로 한다. 이러한 장치는 예를 들어, 약제학적 제제를 저장하기 위한 하나 이상의 하우징(housing)을 포함할 수 있고, 제1 작용제 및 제2 작용제의 단위 용량을 전달하도록 구성될 수 있다. 제1 작용제 및 제2 작용제는 동일한 또는 별개의 구획 내에 저장될 수 있다. 일 실시형태에서, 장치는 투여 전에 작용제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 제1 작용제 및 제2 작용제가 상이한 장치에 의해서 투여된다.
α4-결합 항체는 키트에 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 키트는 (a) 높은 농도의 VLA-4-결합 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 용기, 선택적으로 (b) 제2 작용제를 포함하는 조성물을 함유하는 용기, 그리고 선택적으로 (c) 정보 자료를 포함한다. 정보 자료는 본 명세서에 기재된 방법 및/또는 치료적 이익을 위한 이들 작용제의 사용에 관계하는 설명 자료, 지시 자료, 마케팅 자료 또는 기타 자료일 수 있다. 일 실시형태에서, 키트는 또한 제2 작용제를 포함한다. 예를 들어, 키트는 α4-결합 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기, 그리고 제2 작용제를 포함하는 제2 용기를 포함한다.
이들 키트의 정보 자료는 형태에서 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 정보 자료는 항체 생산, 농도, 만료 일자, 배취 또는 생산 장소 등에 관한 정보를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 정보 자료는 급성 장애, 예컨대, 척수 손상 또는 외상성 뇌 손상 또는 염증 질환(예를 들어, MS)을 갖는 대상체 또는 염증 질환과 연관된 에피소드를 겪을 위험이 있는 대상체를 치료하기 위해, α4-결합 항체를 예를 들어, 적합한 용량, 투여 형태 또는 투여 모드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 용량, 투여 형태 또는 투여 모드)로 투여하는 방법에 관한 것이다. 정보는 인쇄된 문서, 컴퓨터 판독 가능한 자료, 비디오 기록물, 또는 오디오 기록물, 또는 실제 자료에 링크 또는 주소를 제공하는 정보를 비롯한 다양한 형식으로 제공될 수 있다.
작용제 이외에, 키트 내에 조성물은 다른 성분, 예컨대, 용매 또는 완충제, 안정화제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 작용제는 임의의 형태, 예를 들어, 액체 형태, 건조 형태 또는 동결건조된 형태로 제공되고, 그리고 실질적으로 순수하고/하거나 멸균일 수 있다. 작용제가 액체 용액으로 제공될 때, 액체 용액은 전형적으로 수성 용액이다. 작용제가 건조된 형태로 제공되는 경우, 재구성은 일반적으로 적합한 용매의 첨가에 의해 달성된다. 용매, 예를 들어, 멸균수 또는 완충액이 선택적으로 키트 내에 제공될 수 있다.
키트는 작용제를 함유하는 조성물 또는 조성물들을 위한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 조성물 및 정보 자료를 위한 별개의 용기, 분배기 또는 구획을 함유한다. 예를 들어, 조성물은 병, 바이알 또는 주사기 내에 함유될 수 있고, 정보 자료는 플라스틱 슬리브 또는 패킷 내에 포함될 수 있다. 다른 실시형태에서, 키트의 별개의 요소는 분할되지 않은 단일 용기 내에 함유된다. 예를 들어, 조성물은 라벨의 형태로 정보 자료가 부착된 병, 바이알 또는 주사기 내에 함유된다. 일부 실시형태에서, 키트는 복수의(예를 들어, 팩)의 개별 용기를 포함하고, 이들 각각은 작용제의 하나 이상의 단위 형태(예를 들어, 본 명세서에 기재된 투여 형태)을 함유한다. 이러한 용기는 조합 단위 용량, 예를 들어, α4 결합 항체 및 제2 작용제를, 예컨대, 목적하는 비율로 포함하는 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 복수의 주사기, 앰플, 포일 패킷(foil packet), 블리스터 팩(blister pack) 또는 의료 장치를 포함할 수 있고, 이들 각각은 예를 들어, 단일 조합 단위 용량을 함유한다. 키트의 용기는 밀폐되고, 방수되고(예를 들어, 수분 또는 증기의 변화에 불침투성) 및/또는 광-밀폐(light-tight)될 수 있다.
키트는 조성물을 투여하는데 적합한 장치, 예를 들어, 주사기 또는 다른 적합한 전달 장치를 선택적으로 포함한다. 이러한 장치는 작용제 중 하나 또는 둘 다가 미리-로딩된 상태로 제공되거나, 또는 비어있지만 로딩에 적합할 수 있다.
XI. 종양학
본 명세서에 기재된 α4-결합 항체 및 방법은 고형암 및 혈액 악성 종양 (hematological malignancy)을 비롯한 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 예시적인 고형암은 예를 들어, 폐, 유방, 췌장, 결장, 전립선, 방광 및 뇌의 육종 및 암종을 포함한다. 혈액 악성종양은 다발성 골수종, 백혈병 및 림프종과 같은 암을 포함한다.
α4-결합 항체, 예컨대, 본 명세서에 기재된 항-VLA-4 항체를 함유하는 조성물로 혈액 악성종양을 갖는 환자를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 혈액 악성종양은 신체의 혈액-형성계(blood-forming system) 및 면역계의 암이다. 이러한 유형의 암은 혈액, 골수 및/또는 림프절에 영향을 준다. 혈액 악성종양은 백혈병, 예컨대, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 전골수구성 백혈병, 급성 적백혈병 및 털세포 백혈병(hairy cell leukemia: HCL); 림프종, 예컨대, 호지킨병 및 비-호지킨 림프종; 및 다발성 골수종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroblobulinemia); 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome: MDS)(이것은 AML에서 절정에 이를 수 있음); 골수증식성 질환, 예컨대, 진성다혈구증(PV, PCV 또는 진성 적혈구 과다증(polycythemia rubra vera: PRV)이라고 불림), 본태성 혈소판증가증(Essential thrombocytosis: ET), 골수섬유증, 중쇄병; 및 경쇄병으로 인한 아밀로이드(amyloid due to light-chain disease)를 포함한다.
혈액 악성종양을 갖는 환자는 예를 들어, 광 현미경(light microscopy)에 의한 혈액 수치 및 혈액 도말의 분석에 의해 식별될 수 있는데, 이것은 악성 세포를 식별하는데 유용하다. 예를 들어, 골수로부터의 생검이 또한 악성 세포를 식별하는데 사용될 수 있고, 림프절로부터 생검은 림프절장애(lymphadenopathy)를 식별하는데 유용할 수 있다.
α4-결합 항체(예를 들어, 인간화된 항-VLA-4 항체, 예컨대, HuHP1/2, H1L0, H1L1, H1L2 또는 H1L3)는 백혈병, 예컨대, AML의 치료에 유용하다. 백혈병은 골수에서 기원하는 암인데, 여기서 악성 세포는 백혈구 세포이다. AML(급성 골수성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 그리고 급성 비-림프구성 백혈병이라고도 함)은 과립구 또는 단핵구에서 발생하는 악성종양이다. AML은 정상적인 혈액 세포로서 기능하지 못하는 백혈아세포(leukemic blast)라고 불리는 세포의 제어되지 않고, 과대한 성장 및 축적, 그리고 혈액 중에서 적혈구(빈혈) 및 혈소판(혈소판 감소증) 및 정상적인 백혈구(특히, 호중구, 즉, 호중 구 감소증)의 결핍을 유발하는 정상적인 골수 세포의 생산 차단을 특징으로 한다.
AML의 모든 아형은 VLA-4 결합 항체로의 치료에 적합하다. AML의 아형은 진단의 시점에 골수아세포(myeloblast)가 도달된 발달의 단계에 기초하여 분류된다. 이러한 카테고리 및 하위세트는 의사가 세포 유형에 대해 어떤 치료가 가장 효과적인지 그리고 질환이 얼마나 빨리 발달할 수 있는지를 결정할 수 있도록 한다. 이들 하위세트는 하기와 같다: M0, 특별한 분석에서 골수아구성; M1, 성숙 없이 골수아구성; M2, 성숙과 함께 골 수아구성; M3, 전골수구성; M4, 골수단구성; M5, 단구성; M6, 적백혈병; 그리고 M7, 거핵구성. VLA-4 항체는 AML의 아형에 특히 적합한 2차 작용제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 급성 전골수구성 백혈병(APL) 및 급성 단구성 백혈병은 AML의 다른 아형과 상이한 치료를 필요로 하는 AML의 아형이다. APL의 치료를 위한 제2 작용제는 올-트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid: ATRA) 또는 대사길항물질(antimetabolite) 예를 들어, 시타라빈을 포함할 수 있다. 급성 단구성 백혈병의 치료를 위한 제2 작용제는 데옥시아데노신 유사체, 예컨대, 2-클로로-2'-데옥시아데노신(2-CDA)을 포함할 수 있다.
AML의 위험 인자는 특정 유전적 장애, 예컨대, 다운 증후군(Down syndrome), 판코니 빈혈(Fanconi anemia), 슈바치만 다이아몬드 증후군(Shwachman-Diamond syndrome) 등의 존재를 포함한다. AML 및 유전적 장애를 갖는 환자는 유전적 장애의 증상을 치료하기 위해서 VLA-4 결합 항체 및 제2 작용제가 투여될 수 있다. 예를 들어, AML 및 판코니 빈혈을 갖는 환자는 VLA-4 결합 항체 및 항생제가 투여될 수 있다.
AML에 대한 다른 위험 인자는 상이한 암의 치료를 위한 화학요법 또는 방사선요법, 흡연 및 다량의 벤젠에 대한 노출을 포함한다.
α4-결합 항체로 치료에 적합한 다른 암은 고형 종양, 예컨대, 육종 및 암종 (예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 난소암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭종암, 속질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 태생성 암종, 빌름스 종양 (Wilm's tumor), 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 소세포 폐 암종, 상피 암종, 신경 교종, 성상세포종, 속질모세포종, 머리인두종, 뇌질피복 세포증, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 신경초종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막아종)을 포함한다.
XII. 다른 장애
본 명세서에 기재된 제형 및 방법은 또한, 다른 염증 질환, 면역 질환 또는 자가면역 질환, 예를 들어, 중추 신경계의 염증(예를 들어, 다발성 경화증, 수막염, 시신경척수염, 신경유육종증, CNS 맥관염, 뇌염 및 횡단 척수염); 조직 또는 장기 이식편 거부반응 또는 이식편대숙주병; 급성 CNS 손상, 예를 들어, 뇌졸중 또는 척수 손상(spinal cord injury: SCI); 만성 신장 질환; 알레르기, 예를 들어, 알레르기성 천식, 중등도 내지 중증 알레르기성 비염, 눈 알레르기; 1형 진성 당뇨병; 염증성 장 질환, 예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염(예를 들어, 치료 또는 완화의 유지를 위해); 호산구성 위장염; 중증근무력증; 섬유근육통; 류머티스학/면역학과 연관된 질환, 예컨대, 관절염 질환, 예컨대, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염; 피부 질환, 예를 들어, 염증성/면역성 피부 질환, 예컨대, 건선, 백반증, 피부염(예를 들어, 아토피성 피부염), 편평태선, 중등도 내지 중증 만성 두드러기; 전신성 홍반성 루푸스(SLE; 예를 들어, 홍반성 신염); 경피증(예를 들어, 진행성 전신성 경화증(Progressive Systemic Sclerosis: PSS), 예컨대, 폐의 PSS); 급성 또는 만성 일차성 호산구성 폐렴; 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome); 급성 관동맥 증후군(acute coronary syndrome: ACS); 급성 심근 경색; 죽상 경화증; 및 섬유증 질환, 예를 들어, 폐 섬유증(예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 폐 섬유증(예를 들어, 유도된 XRT), 골수섬유증, 간경변, 사구체간질 증식성 사구체신염, 반월형 사구체신염, 당뇨병성 신증 및 콩팥 사이질 섬유증을 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 제형은 뇌전증을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 제형 및 방법은 또한 신경 장애, 예컨대, 일과성 허혈성 발작 및/또는 동맥 협착증을 갖는 환자에서의 예방을 비롯한 대뇌 허혈을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 예시적인 신경 질환은 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy: CIDP); 길랭-바레 증후군(Guillian-Barre Syndrome: GBS); 눈 질환, 예컨대, 황반 퇴화(예를 들어, 습성 황반 퇴화) 및 전방허혈성시신경증; 신경병적 통증(예를 들어, 증후성 신경병적 통증); 알츠하이머병; 근위축성 축삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS) (예를 들어, 질환 변형 ALS) 및 파킨슨병을 포함한다.
본 명세서에 기재된 제형 및 방법은 또한 이식, 예컨대, 신장, 심장 또는 골수 이식을 받은 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
XIII. 다발성 경화증
본 명세서에 기재된 알파-4 결합 항체를 함유하는 제형은 염증 질환, 예컨대, 다발성 경화증(MS)의 치료에 유용하다. 다발성 경화증은 미엘린초(myelin sheath)의 염증 및 상실을 특징으로 하는 중추신경계 질환이다.
MS를 갖는 환자는 MS의 진단에 관한 워크숍에 의해 정의된 바와 같이 임상적으로 명확한 MS의 진단을 확립하는 척도에 의해 식별될 수 있다(Poser et al., Ann. Neurol. 13:227, 1983). 예를 들어, 임상적으로 명확한 MS를 갖는 개체는 2회의 발작 및 2개 병변의 임상적 증거 또는 1개 병변의 임상적 증거 및 또 다른 개별적인 병변의 준임상 증거를 나타낸다. 명확한 MS는 또한 2회의 발작 및 뇌척수액에서 IgG의 올리고클론성 밴드(oligoclonal band)의 증거에 의해 또는 1회의 발작, 2개 병변의 임상적 증거 및 뇌척수액에서 IgG의 올리고클론성 밴드의 조합에 의해 진단될 수 있다. 또한 MS를 진단하기 위해 맥도널드(McDonald) 기준이 사용될 수 있다(McDonald et al., 2001, "Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis," Ann. Neurol. 50:121-127). McDonald 척도는 복합적인 임상적 발작의 부재에서, MS의 진단에 사용될, 시간의 흐름에서 CNS 손상의 MRI 증거를 사용하는 것을 포함한다. 다발성 경화증의 효과적인 치료는 여러 상이한 방법으로 평가될 수 있다. 치료의 유효성을 판단하기 위해 하기 매개변수가 사용될 수 있다. 2개의 예시적인 척도는 EDSS(확대 기능부전 상태 스케일(extended disability status scale)) 및 MRI(자기 공명 영상화(magnetic resonance imaging))에서 악화의 징조를 포함한다. EDSS는 MS로 인한 임상적 손상을 등급화하는 방법이다 (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983). 8개의 기능적 시스템(functional system)이 신경 손상(neurologic impairment)의 유형 및 중증도에 대해 평가된다. 간략하면, 치료 전에, 환자는 하기 시스템에서 손상에 대해 평가된다: 추체로(pyramidal), 소뇌, 뇌간, 감각, 장과 방광, 시각, 대뇌 등. 추적 조사는 규정된 간격에서 실행된다. 스케일은 0(정상) 내지 10(MS로 인한 사망)의 범위이다. 하나의 완전 단계의 하락은 효과적인 치료를 나타낸다(Kurtzke, Ann. Neurol. 36:573-79, 1994). 환자는 또한 당업자에 의해 사용되는 다른 기준을 사용하여 진단될 수 있다.
악화는 MS에 기인하고 적절한 새로운 신경 비정상(neurologic abnormality)을 동반하는 새로운 증상의 출현으로 정의된다(상기 IFNB MS 연구군). 이에 더하여, 악화는 적어도 24시간 동안 지속되고, 적어도 30일 동안 안정성 또는 향상이 선행되어야 한다. 간략하면, 환자는 임상의에 의한 기준 신경 검사가 제공된다. 악화는 신경 척도(Neurological Rating Scale)(Sipe et al., Neurology 34:1368, 1984)에서 변화에 따라 경증, 중등도 또는 중증도이다. 연간 악화 속도 및 악화-없는 환자의 비율이 결정된다.
요법은 이들 측정 중에서 어느 하나에서 치료군과 위약군 사이에 악화-없는 또는 재발-없는 환자의 비율 또는 비에서 통계학적으로 유의한 차이가 있으면, 효과적인 것으로 간주될 수 있다. 이에 더하여, 첫 번째 악화까지의 시간 및 악화 지속 기간과 심각도가 또한 측정될 수 있다. 이와 관련하여 요법으로서 효과 척도는 대조군에 비하여 치료군에서 첫 번째 악화까지의 시간 및 악화 지속 기간과 중증도에서 통계학적으로 유의한 차이이다. 1년, 18개월, 또는 20개월 이상의 악화-없는 또는 재발-없는 기간이 특히 주목할 만하다. 효능은 또한 예를 들어, 단독으로 또는 다른 척도와 공동으로 사용되는 보행 검사(timed walk test)를 사용한 운동성 향상(mobility improvement)을 비롯하여, MS의 증상을 평가하기 위해 당업계에서 사용되는 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
제1 작용제 및 선택적으로 제2 작용제를 투여하는 효능은 또한 하기 기준 중 하나 이상에 기초하여 평가될 수 있다: 제한 희석(limiting dilution)에 의해 결정된 MBP 반응성 T 세포의 빈도, MBP 반응성 T 세포주와 클론의 증식 반응, 환자로부터 확립된 MBP에 대한 T 세포주와 클론의 사이토카인 프로파일. 효능은 반응성 세포의 빈도의 감소, 고유 펩타이드와 비교하여 변형된 펩타이드로의 티미딘 혼입의 감소 및 TNF와 IFN-α의 감소에 의해 나타난다.
임상적 측정치는 1년과 2년 간격에서 재발률 및 6개월 동안 지속되는 EDSS에서 1.0 단위의 기준선으로부터 진행까지의 시간을 비롯한 EDSS에서 변화를 포함한다. 카플란 마이어(Kaplan-Meier) 곡선에서, 신체장애(disability)의 지속된 진행에서 지연은 효능을 나타낸다. 다른 기준은 MRI 상에서 T2 영상의 면적과 부피, 그리고 가돌리늄 조영증강 영상(gadolinium enhanced image)에 의해 결정된 병변의 숫자와 부피에서 변화를 포함한다.
MRI는 가돌리늄-DTPA-조영증강 영상화(McDonald et al. Ann. Neurol. 36:14, 1994) 또는 T2-가중 기술을 사용한 병변의 위치 및 정도를 사용하여 활성 병변을 측정하는데 사용될 수 있다. 간략하면, 기준선 MRI를 얻는다. 동일한 영상 절단면 (imaging plane) 및 환자 위치를 각각의 차후 연구에 사용한다. 배치 및 영상화 순서는 병변 검출을 극대화시키고 병변 추적을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 동일한 배치 및 영상화 순서가 차후 연구에 사용될 수 있다. MS 병변의 존재, 위치와 정도는 방사선 학자에 의해 결정될 수 있다. 병변의 면적을 윤곽으로 표시하고, 총 병변 면적에 대한 조각에 의해서 조각을 합할 수 있다. 3개의 분석, 즉, 새로운 병변의 증거, 활성 병변의 출현 속도, 병변 면적에서 변화 백분율이 수행될 수 있다 (Paty et al., Neurology 43:665, 1993). 요법으로 인한 개선은 기준선에 비해서 개별 환자에서 또는 위약군에 비해서 치료군에서 통계학적으로 유의한 향상으로 확립될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법으로 치료될 수 있는 다발성 경화증과 연관된 예시적인 증상은 시신경염, 복시, 안구 진탕증, 눈 겨냥이상, 핵간성안근마비, 운동 및 소리 안내섬광, 들신경동공결손, 부전마비, 단부전마비, 대부전마비, 반부전마비, 사지마비(quadriparesis), 마비, 대마비, 편마비, 팔다리마비(tetraplegia), 사지마비(quadriplegia), 근긴장, 구음 장애, 근위축, 쥐, 경련, 긴장 감퇴, 간대성 경련, 간대성 근경련, 근육잔떨림, 하지불안증후군, 발처짐, 반사 기능장애, 감각 이상, 마취, 신경통, 신경병적 통증과 신경성 통증, 레르미트 징후, 고유 감각 이상, 삼차 신경통, 운동 실조, 기도 진전, 측정 장애, 전정성 운동실조, 현기, 언어 장애, 긴장 이상, 되풀이운동장애, 빈번한 배뇨, 경련성 방광, 이완성 방광, 배뇨근-괄약근 실조, 발기 부전, 무극치감, 불감증, 변비, 긴급 배변, 배변 실금, 우울증, 인식 장애, 치매, 기분의 두드러진 변화, 정서적 불안정, 도취증, 양극성 증후군, 불안, 실어(aphasia), 실어증(dysphasia), 피로, 우토프 징후, 식도 역류, 그리고 수면 장애를 포함된다.
MS의 각 사례는 표현 및 차후 경과의 여러 패턴 중에서 한 가지를 나타낸다. 가장 일반적으로, MS는 먼저, 일련의 발작으로서 자신을 드러내고, 그 이후에 완전한 또는 부분적인 완화를 나타내는데, 그 이유는 증상이 불가사의하게 줄어들고 안정성 기간 이후에 재발하기 때문이다. 이것은 재발-완화(relapsing-remitting: RR) MS로 불린다. 임상 단독 증후군(Clinically isolated syndrome: CIS)은 MS의 또 다른 재발 형태이다. CIS는 적어도 24시간 지속되고, 중추신경계(CNS)에서 염증 또는 탈수초(신경 세포를 피복하는 수초의 손실)에 의해서 유발되는 신경 증상의 제1 에피소드를 지칭한다. 1차 진행성(Primary-progressive: PP) MS는 비록 일시적인 안정 상태 또는 증상으로부터 경미한 완화가 나타날 수도 있지만, 명백한 완화 없이 점진적인 임상적 감퇴를 특징으로 한다. 활성 1차 진행성 MS는, 환자가 비정기적인 재발을 경험하거나 MRI 상에서 새로운 병변의 증거가 존재하는 경우 발생한다. "활성이 아닌" 또는 "진행과 함께"는 증상이 재발하거나 재발하지 않으면서 또는 MRI 상에서 새로운 병변이 나타나거나 나타나지 않으면서 시간에 따라 악화되는 증가가 있음을 의미한다. 2차 진행성(Secondary-progressive: SP) MS는 재발-완화 과정으로 시작되고, 후기 1차 진행성 과정으로 이어진다. 활성 2차 진행성 MS는 MS의 재발 형태 중 하나인 것으로 간주된다. 드물게는, 환자는 질환이 급성 발작으로 구분되는 진행 경로를 취하는 진행성 재발(progressive-relapsing: PR) 과정을 가질 수 있다. PP, SP 및 PR은 때때로 함께 묶여, 만성 진행성 MS라고 불린다.
따라서, 다발성 경화증의 재발 형태(또는 단순히 재발 다발성 경화증)는 비제한적으로 임상 단독 증후군(CIS), 재발 경감 다발성 경화증(RRMS) 및 활성 2차 진행성 다발성 경화증(활성 SPMS)을 포함한다.
소수의 환자는 질환 발명 직후에 유의미한 장애 또는 심지어 사망을 유발하는 빠르고 혹독한 감퇴로서 정의되는 악성 MS를 경험한다. 이러한 감퇴는 본 명세서에 기재된 요법의 투여에 의해 정지되거나 감소될 수 있다.
본 발명의 특징적인 항-α4 항체의 투여는 MS의 하나 이상의 증상, 예컨대, 상기에 기재된 증상 중 하나 이상을 완화시키는데 효과적일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-α4 항체의 투여는 1차 또는 2차 진행성 다발성 경화증(각각, PPMS 또는 SPMS)을 치료하는데 사용될 수 있고, 항-α4 항체의 치료는 재발을 예방하는데 효과적일 수 있다.
인간 연구에 더하여 또는 인간 연구에 이전에, 동물 모델을 사용하여 2종의 작용제를 사용하는 효능을 평가할 수 있다. 다발성 경화증에 대한 예시적인 동물 모델은 예를 들어, 문헌[Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401), 및 Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129]에 기재된 바와 같은 실험 자가면역 뇌염(experimental autoimmune encephalitis: EAE) 마우스 모델이다. 마우스는 EAE 유도 이전에 본 명세서에 기재된 제1 작용제 및 제2 작용제가 투여될 수 있다. 이어서, 이들 마우스를 이러한 모델에서 2종의 작용제를 사용하는 효능을 결정하기 위해 특징적인 기준에 대해 평가한다.
XIV. 뇌전증
본 명세서에 기재된 알파-4 결합 항체를 함유하는 제형은 뇌전증의 치료에 유용하다.
뇌전증 발작은, 영향을 받은 뇌의 특정 부위가 임상 발현에 영향을 미치면서, 뇌파 검사 또는 임상 수단을 통해 검출될 수 있는 비정상적으로 배출되는 뉴런으로 인한 발작성 에피소드이다. 뇌전증 발작은 근본적으로 신경막 또는 흥분성 및 저해 과정과 관련될 수 있는 뉴런의 기본 흥분성의 불균형에서 발생한다(또한 문헌 [Holmes et al., Epilepsia 45(12): 1568-1579, 2004] 참고). 뇌전증은 뇌전증 발작을 유발하는 지속적인 소인 및 이러한 병태의 신경생물학적, 인지적, 심리적, 사회적 결과를 특징으로 하는 뇌의 장애로 개념적으로 정의된다(Fisher R.S., Curr Opin Neurol. 28(2):130-5, 2015). 뇌전증의 유병률 및 발생률에 대한 최근 검토에 따르면 평생 유병률은 1000명당 7.6명이고 연간 누적 발생률은 100,000명당 67.77명이다(Fiest et al., Neurology 88(3):296-303, 2017).
본 발명 이전에, 뇌전증 환자를 위한 일반적인 치료법은 항뇌전증 약물 (antiepileptic drug: AED)이었으며, 환자 중 대략 70%의 환자가 AED 요법으로 양호한 발작 조절을 달성하는 것으로 추정된다. 2개(또는 그 초과의) 내약성이 있고, 적절하게 선택되어 사용된 AED의 적절한 시험에 실패한 환자는 약물-내성 뇌전증이 있는 것으로 정의된다(문헌[Kwan et al., Epilepsia. 51(6):1069-77, 2010; 및 erratum in Epilepsia. 51(9):1922, 2010] 참고). 이러한 환자의 경우, 뇌전증 수술, 신경자극 장치, 전문 식이, 행동 요법 및 기타 실험적 치료를 포함한 다른 치료법이 고려된다. AED는 전형적으로 전압-의존적 또는 리간드-게이팅형 이온 채널의 조절을 통해 또는 저해성 또는 흥분성 신경전달물질 시스템에 대한 효과를 통해 작동한다. 현재, 상업적으로 입수 가능한 AED는 20종을 초과한다. 최근 몇 년 동안 다수의 더 새로운 AED가 출시되었음에도 불구하고, 신형 약물 및 구형 약물 모두 뇌전증 관리에 일반적으로 동등하게 효과적이며, 이전의 약물-내성 뇌전증 환자가 새로운 치료법으로 발작이 없어지게 되는 경우는 여전히 드물다.
약물-내성 뇌전증에서 발작 조절을 개선시키거나 발작을 제거하는 요법을 개발해야 하는 충족되지 않은 높은 요구가 여전히 존재한다. 뇌전증 발병기전에서 면역계 및 염증의 잠재적인 역할을 표적으로 하는 것은 AED 개발 및 임상 연구에서 미개척 영역을 나타낸다. 뇌전증의 실험 모델 및 뇌전증을 갖는 인간 환자로부터의 증거는 염증의 역할을 시사한다.
본 명세서에 개시된 제형은 뇌전증을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, (a) 서열번호 80의 서열을 포함하는 중쇄; 및 (b) 서열번호 81의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편을 포함하는 제형을 뇌전증을 앓고 있는 환자에게 투여할 수 있다. α4 인테그린을 차단하면 백혈구-혈관 상호작용이 감소하고, BBB 온전성을 안정화시킨다는 가설이 세워졌다. 또한 발작에 의해 유도된 뇌전증-감소 백혈구-혈관 상호작용이 발작의 빈도 및 중증도를 감소시킬 것이라는 가설이 세워졌다.
XV. 항체 생성
알파-4에 결합하는 재조합 항체는 생체내 또는 시험관내 방법, 예컨대, 파지 디스플레이(phage display)에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 CDR 그래프팅된 항체에서의 사용을 위한 항-α4 CDR을 공급하는데 사용될 수 있다. 이에 더하여, 파지 디스플레이와 같은 방법은 예를 들어, 프레임워크가 생식계열 프레임워크인 라이브러리를 사용함으로써, 본 발명에서 개시된 생식계열 프레임워크의 맥락에서 이러한 CDR을 선별하는데 사용될 수 있다.
특허 제EP 239 400호(Winter 등)에는 하나의 종에 대한 상보성 결정 영역 (CDRs)의 또 다른 종으로부터의 것으로의 치환(주어진 가변 영역 내에서)에 의한 항체의 변형이 기재되어 있다. CDR-치환된 항체는 진(true) 키메라 항체에 비해서 인간에서 면역 반응을 도출할 가능성이 더 낮을 수 있는데, 그 이유는 CDR-치환된 항체가 훨씬 더 적은 비-인간 성분을 함유하기 때문이다(Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536). 전형적으로, 뮤린 항체의 CDRs은 재조합 핵산 기술을 사용하여 목적하는 치환된 항체를 암호화하는 서열을 생산함으로써 인간 항체에서 상응하는 영역으로 치환된다. 목적하는 아이소타입(일반적으로, CH의 경우 감마 I 및 CL의 경우 카파)의 인간 불변 영역 유전자 분절이 부가될 수 있고, 중쇄 및 경쇄 유전자는 포유동물 세포에서 공동-발현되어 가용성 항체를 생산할 수 있다. 대형 비면역화된 파지 디스플레이 라이브러리는 또한 표준 파지 기술을 사용하여 인간 치료제로서 개발될 수 있는 고 친화도 항체를 단리시키는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; 및 Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; U.S. 2003-0232333] 참고).
본 명세서에 기재된 항-α4 항체 또는 항체 단편은 동족 리간드, 예를 들어, VCAM-1 또는 피브로넥틴에 대한 결합에 관여하는 α4 소단위의 에피토프를 인식하여, 이에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-α4 항체 또는 항체 이의 단편은 α4 인테그린의 B 에피토프를 인식하여, 이에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에 기재된 항체의 결합은 동족 리간드(예를 들어, VCAM-1 및 피브로넥틴) 중 하나 이상에 대한 α4 인테그린의 결합을 저해할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 특징적인 항체는 세포, 예를 들어, 림프구 상에서 VLA4와 상호작용할 수 있지만, 세포 응집을 유발하지 않는다.
예시적인 α4 결합 항체는 하나 이상의 CDRs, 예를 들어, 본 발명에 개시된 특정 항체의 3개의 중쇄(HC) CDRs 모두 및/또는 3개의 경쇄(LC) CDRs 모두, 또는 이러한 항체와 총합에서 적어도 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 동일한 CDRs을 갖는다. 일 실시형태에서, H1 및 H2 초가변 루프는 본 명세서에 기재된 항체의 것과 동일한 표준 구조를 갖는다. 일 실시형태에서, L1 및 L2 초가변 루프는 본 명세서에 기재된 항체의 것과 동일한 표준 구조를 갖는다.
일 실시형태에서, HC 및/또는 LC 가변 도메인 서열의 아미노산 서열은 본 명세서에 기재된 항체의 HC 및/또는 LC 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일하다. HC 및/또는 LC 가변 도메인 서열의 아미노산 서열은 적어도 1개의 아미노산, 그러나 10개, 8개, 6개, 5개, 4개, 3개 이하의 아미노산이, 또는 본 명세서에 기재된 항체의 상응하는 서열로부터 2개의 아미노산이 상이할 수 있다. 예를 들어, 이들 차이는 프레임워크 영역 내에 주로 또는 완전히 존재할 수 있다.
HC 및 LC 가변 도메인 서열의 아미노산 서열은 높은 엄격성(stringency) 조건 하에서, 본 명세서에 기재된 핵산 서열 또는 본 명세서에 기재된 가변 도메인 또는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 일 실시형태에서, HC 및/또는 LC 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)의 아미노산 서열은 본 명세서에 기재된 항체의 HC와 LC 가변 도메인의 상응하는 프레임워크 영역과 적어도 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일하다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역(예를 들어, HC FR1, FR2 및 FR3)은 인간 생식계열 항체로부터 상응하는 프레임워크 영역의 서열과 적어도 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 100% 동일하다.
두 서열 간에 "상동성" 또는 "서열 동일성"(이들 용어는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 이들 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭(gap)이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 최적 정렬은 12의 갭 페널티(gap penalty), 4의 갭 연장 페널티(gap extend penalty) 및 5의 프레임시프트 갭 페널티 (frameshift gap penalty)를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스 (scoring matrix)를 사용한 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 사용한 최고 스코어로서 결정된다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열에서 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우, 이들 분자는 이 위치에서 동일하다(본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등하다). 두 서열 간에 동일성 백분율은 이러한 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "높은 엄격성 조건 하에서 혼성화된다"는 혼성화 및 세척을 위한 조건을 기재한다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 안내는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있는데, 이는 참조에 의해서 포함된다. 수성 및 비-수성 방법은 상기 참고문헌에 기재되고, 어느 하나가 사용될 수 있다. 고 엄격성 혼성화 조건은 약 45℃에서 6X SSC, 그 다음에 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상의 세척 또는 실질적으로 유사한 조건에서의 혼성화를 포함한다.
XVI. 항체 생산
항체는 원핵 및 진핵 세포에서 생산될 수 있다. 일 실시형태에서, 항체(예를 들어, scFv)는 효모 세포, 예컨대, 피치아(Pichia)(예를 들어, 문헌[Powers et al. (2001) J. Immunol. Methods 251:123-35]를 참고), 한세눌라(Hansenula) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces)에서 발현된다.
일 실시형태에서, 항체, 특히 전장 항체, 예를 들어, IgG는 포유동물 세포에서 생산된다. 재조합 발현을 위한 예시적인 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(dhfr-CHO 세포 포함, 문헌[Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재됨, 예를 들어, 문헌[Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선별 가능 마커와 함께 사용됨), 림프구성 세포주, 예를 들어, NS0 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포, K562 및 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 트랜스제닉 포유류로부터 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 유선 상피 세포(mammary epithelial cell)이다.
면역글로불린 도메인을 암호화하는 핵산 서열에 더하여, 재조합 발현 벡터는 추가의 핵산 서열, 예를 들어, 숙주 세포 내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기원) 및 선별 가능 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별 가능 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참고). 예시적인 선별 가능 마커 유전자는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr-숙주 세포에서 사용을 위해) 및 neo 유전자 (G418 선별을 위해)를 포함한다.
항체(예를 들어, 전장 항체 또는 이의 항원-결합 부분)의 재조합 발현을 위한 예시적인 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 인산칼슘-매개된 형질주입에 의해 dhfr-CHO 세포 내로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 이들 유전자의 높은 수준의 전사를 유도하기 위해서, 인핸서/프로모터 조절 요소(예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된 조절 요소, 예컨대, CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소)에 작동 가능하게 연결된다. 재조합 발현 벡터는 또한 메토트렉세이트 선별/증폭을 사용한 벡터로 형질주입된 CHO 세포의 선별을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 보유한다. 선별된 형질전환체 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현이 가능하도록 배양되고, 온전한 항체는 배양 배지로부터 회수된다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질주입시키고, 형질전환체를 선별하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 예를 들어, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용한 친화도 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 정제된 α4-결합 항체는 당업계에 공지된 단백질 농축 기술을 사용하여 약 100㎎/㎖ 내지 약 200㎎/㎖로 농축될 수 있다.
항체는 또한, 예를 들어, Fc 수용체 또는 C1q, 또는 둘 다와의 상호작용을 감소시키거나 제거하기 위한 변형, 예를 들어, Fc 기능을 변경시키는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG4 불변 영역은 힌지 영역을 고정시키기 위해 잔기 228에서 Ser 대 Pro 돌연변이를 가질 수 있다. IgG4 Fc(힌지 + CH2 + CH3 도메인)의 아미노산 서열은 도 5에 제공된다.
다른 예에서, 인간 IgG1 불변 영역은 예를 들어, 미국 특허 제5,648,260호의 넘버링에 따라, 하나 이상의 잔기, 예를 들어, 잔기 234 및 237 중 하나 이상에서 돌연변이될 수 있다. 다른 예시적인 변형은 미국 특허 제5,648,260호에서 기재된 것을 포함한다.
Fc 도메인을 포함하는 일부 항체의 경우에, 항체 생산 시스템은 Fc 영역이 글리코실화되는 항체를 합성하도록 설계될 수 있다. 다른 예에서, IgG 분자의 Fc 도메인은 CH2 도메인 내의 아스파라긴 297에서 글리코실화된다(도 5 참고). 이러한 아스파라긴은 이안테나(biantennary)-유형 올리고당류로의 변형을 위한 모이어티이다. 이러한 글리코실화는 Fcγ 수용체 및 보체 C1q에 의해 매개된 효과기 기능에 참여한다(Burton and Woof (1992) Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev. 163:59-76). Fc 도메인은 아스파라긴 297에 상응하는 잔기를 적절하게 글리코실화시키는 포유동물 발현 시스템에서 생산될 수 있다. Fc 도메인은 또한 다른 진핵 번역후 변형을 포함할 수 있다.
다른 적합한 Fc 도메인 변형은 국제 특허 제WO2004/029207호에 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 XmAb® Fc(젠코어사(Xencor), 미국 캘리포니아주 몬로비아 소재)일 수 있다. Fc 도메인 또는 이의 단편은 Fcγ 수용체(FcγR) 결합 영역, 예컨대, 국제 특허 제WO05/063815호에서 기재된 도메인 및 단편에서 치환을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인 또는 이의 단편은 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 영역, 예컨대, 국제 특허 제WO05047327호에 기재된 도메인 및 단편에서 치환을 갖는다. 다른 실시형태에서, Fc 도메인은 단일 쇄, 또는 이의 단편 또는 이의 변형된 버전, 예컨대, 국제 특허 제WO2008143954호에 기재된 것이다. 다른 적합한 Fc 변형은 당업계에서 공지되고 기재되어 있다.
항체는 또한 트랜스제닉 동물에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,849,992호에는 트랜스제닉 포유동물의 유선에서 항체를 발현시키는 방법이 기재되어 있다. 관심대상 항체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항체 및 분비를 위한 신호 서열을 암호화하는 모유-특이적 프로모터 및 핵산 서열을 포함하는 트랜스젠이 작제된다. 이러한 트랜스제닉 포유동물의 암컷에 의해 생산된 모유는 그 내부에 분비되는 관심대상 항체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다. 항체는 모유로부터 정제되거나 또는 일부 적용의 경우에 직접 사용될 수 있다.
항체는 예를 들어, 혈액, 혈청, 림프, 기관지폐포 세척액 또는 기타 조직에서 순환 동안 이의 안정화 및/또는 체류를 예를 들어, 적어도 1.5, 2, 5, 10, 또는 50배 개선시키는 모이어티로 변형될 수 있다.
예를 들어, VLA4 결합 항체는 중합체, 예를 들어, 실질적으로 비-항원성 중합체, 예컨대, 폴리알킬렌 옥사이드 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 회합될 수 있다. 적합한 중합체는 중량이 실질적으로 달라질 것이다. 약 200 내지 약 35,000달톤(또는 약 1,000 내지 약 15,000, 및 2,000 내지 약 12,500) 범위의 수평균 분자량을 갖는 중합체가 사용될 수 있다.
예를 들어, VLA-4 결합 항체는 수용성 중합체, 예를 들어, 친수성 폴리바이닐 중합체, 예를 들어, 폴리바이닐알코올 또는 폴리바이닐피롤리돈에 접합될 수 있다. 이러한 중합체의 비제한적 목록은 폴리알킬렌 옥사이드 단독중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화된 폴리올, 이의 공중합체 및 이의 블록 공중합체를 포함하되, 단, 블록 공중합체의 수용성이 유지되어야 한다. 추가의 유용한 중합체에는 폴리옥시알킬렌, 예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 및 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시프로필렌의 블록 공중합체(Pluronics); 폴리메타크릴레이트; 카보머; 당류 단량체 D-만노스, D- 및 L-갈락토스, 푸코오스, 프럭토스, D-자일로스, L-아라비노스, D-글루쿠론산, 시알산, D-갈락투론산, D-만누론산(예를 들어, 폴리만누론산 또는 알긴산), D-글루코사민, D-갈락토사민, D-글루코오스 및 동종다당류 및 이종다당류, 예컨대, 락토스, 아밀로펙틴, 전분, 히드록시에틸 전분, 아밀로오스, 덱스트란 황산염, 덱스트란, 덱스트린, 글리코겐, 또는 산성점액다당류의 다당류 소단위, 예컨대, 히알루론산을 비롯한 뉴라민산을 포함하는 분지형 또는 비분지형 다당류; 당알코올의 중합체, 예컨대, 폴리솔비톨 및 폴리만니톨; 헤파린 또는 헤파론(heparon)을 포함한다.
XVIII. 예시적인 제2 작용제
일부 경우에, 본 명세서에 기재된 제형, 예를 드렁, 알파-4 결합 항체를 함유하는 제형은 제2 작용제를 포함하거나 또는 제2 작용제를 함유하는 제형과 병용 투여된다.
일 구현예에서, α4 결합 항체 및 제2 작용제는 공동-제형으로서 제공되고, 이러한 공동-제형이 대상체에게 투여된다. 더욱이, 예를 들어, 공동-제형의 투여 전후에 적어도 24시간에, α4 결합 항체 제형의 1회 용량 및 제2 작용제를 함유하는 제형의 1회 용량을 별개로 투여하는 것이 가능하다. 다른 구현예에서, 항체와 제2 작용제는 별개의 제형으로서 제공되고, 투여 단계는 항체 및 제2 작용제를 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 순차적인 투여는 동일한 일자에(예를 들어, 서로 1시간 이내에 또는 적어도 3, 6 또는 12시간 간격으로) 또는 상이한 일자에 제공될 수 있다.
일반적으로, 항체 및 제2 작용제는 각각 시간이 분리된 복수의 용량으로서 투여된다. 일반적으로, 항체와 제2 작용제는 각각, 요법에 따라 투여된다. 하나 또는 둘 다에 대한 요법은 규칙적인 주기성(regular periodicity)을 가질 수 있다. 항체에 대한 요법은 제2 작용제에 대한 요법과 상이한 주기성을 가질 수 있고, 예를 들어, 하나의 요법은 다른 요법보다 더욱 빈번하게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 항체 및 제2 작용제 중 하나는 주 1회 투여되고, 다른 하나는 월 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 항체 및 제2 작용제 중 하나는 예를 들어, 30분 이상, 하지만 1, 2, 4, 또는 12시간 이하의 기간에 걸쳐 연속적으로 투여되고, 다른 하나는 볼러스로서 투여된다. 이러한 항체 및 제2 작용제는 임의의 적절한 방법에 의해, 예컨대, 피하, 근육내, 또는 정맥내 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이러한 항체 및 제2 작용제 각각은 각각이 단일 요법 (monotherapy)을 위해 처방될 때와 동일한 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 항체는 단독으로 투여될 때 효능을 위해 요구되는 양과 동등하거나 이보다 적은 투여량(dosage)으로 투여된다. 유사하게, 제2 작용제는 단독으로 투여될 때 효능을 위해 요구되는 양과 동등하거나 이보다 적은 용량으로 투여될 수 있다.
α4 결합 항체와 조합하여 다발성 경화증을 치료하기 위한 제2 작용제의 비제한적인 예를 하기를 포함한다:
인터페론, 예를 들어, 인간 인터페론 베타-1a(예를 들어, AVONEX® 또는 REBIF®)) 및 인터페론 베타-1b(BETASERONTM; 17번 위에서 치환된 인간 인터페론 베타; Berlex/Chiron);
화학치료제, 예를 들어, 클라드리빈(LEUSTATIN®), 아자티오프린(IMURAN®), 사이클로포스파마이드(CYTOXAN®), 사이클로스포린-A, 메토트렉세이트, 4-아미노피리딘 및 티자니딘;
글라티라머 아세테이트는 아미노산-글루탐산, 라이신, 알라닌 및 타이로신의 무작위 쇄로부터 형성된 단백질(따라서, GLATiramer)이다. 글라티라머 아세테이트는 용액 중에서 N-카복시아미노산 무수물을 사용하여 대략 5부의 알라닌 대 3부의 리신, 1.5부의 글루탐산 및 1부의 타이로신의 비로 이들 아미노산으로부터 합성될 수 있다.
추가의 제2 작용제는 다른 인간 사이토카인 또는 성장 인자, 예를 들어, TTNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF 및 PDGF의 항체 또는 길항제를 포함된다. 또 다른 예시적인 제2 작용제는 세포 표면 분자, 예컨대, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 또는 이의 리간드에 대한 항체를 포함한다. 예를 들어, 다클리주맙은 다발성 경화증을 완화시킬 수 있는 항-CD25 항체이다.
또 다른 예시적인 항체는 본 명세서에 기재된 작용제의 활성을 제공하는 항체, 예컨대, 인터페론 베타 수용체와 같은 인터페론 수용체와 맞물리는 항체를 포함한다. 전형적으로, 제2 작용제가 항체를 포함하는 구현예에서, 이것은 VLA-4 이외의 또는 α4 인테그린 이외의 표적 단백질에 결합하거나 또는 VLA-4 상에서 제1 작용제에 의해 인식되고, 이에 의해서 특이적으로 결합되는 에피토프 이외의 적어도 하나의 에피토프에 결합한다.
또 다른 추가의 예시적인 제2 작용제는 FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레프루노마이드, 비-스테로이드성 소염제(NSAID), 예를 들어, 포스포다이에스터라제 저해제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 저해제, 아드레날린제, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전염증성 사이토카인에 의한 신호전달을 간섭하는 작용제, IL-1β 전환 효소 저해제(예를 들어, Vx740), 항-P7, PSGL, TACE 저해제, T-세포 신호전달 저해제, 예컨대, 키나제 저해제, 금속단백분해효소 저해제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 앤지오텐신 전환 효소 저해제, 본 명세서에 기재된 바와 같은 가용성 사이토카인 수용체 및 이들의 유도체, 소염성 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGF)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 작용제는 MS의 하나 이상의 증상 또는 부작용을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 작용제는 예를 들어, 아만타딘, 바클로펜, 파파베린, 메클리진, 하이드록시진, 설파메톡사졸, 시프로플록사신, 도큐세이트, 페몰린, 단트롤렌, 데스모프레신, 덱사메타손, 톨테로딘, 페니토인, 옥시부티닌, 비사코딜, 벤라팍신, 아미트립틸린, 메테나민, 클로나제팜, 이소니아지드, 바데나필, 나이트로푸란토인, 사일륨 친수성 무실로이드, 알프로스타딜, 가바펜틴, 노르트립틸린, 파록세틴, 프로판텔린 브롬화물, 모다피닐, 플루옥 세틴, 페나조피리딘, 메틸프레드니솔론, 카르바마제핀, 이미프라민, 디아제팜, 실데나필, 부프로피온, 그리고 설트랄린을 포함한다. 소형 분자인 다수의 제2 작용제는 150 내지 5000 달톤의 분자량을 갖는다.
TNF 길항제의 예는 TNF(예를 들어, 인간 TNF α)에 대한 키메라, 인간화된, 인간 또는 시험관내 생성된 항체(또는 이의 항원-결합 단편), 예컨대, D2E7, (인간 TNFα 항체, 미국 특허 제6,258,562호; 바스프사(BASF)), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(인간화된 항-TNFα 항체; 셀테크사(Celltech)/파마시아사(Pharmacia)), cA2 (키메라 항-TNFα 항체; REMICADETM, 센토코어사(Centocor)); 항-TNF 항체 단편(예를 들어, CPD870); TNF 수용체의 가용성 단편, 예를 들어, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 이의 유도체, 예를 들어, 75 kdTNFR-IgG(75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, ENBRELTM; 이뮤넥스사(Immunex); 예를 들어, 문헌[Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A] 참고), p55 kdTNFR-IgG(55kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질(LENERCEPTTM)); 효소 길항제, 예를 들어, TNFα 전환 효소(TACE) 저해제(예를 들어, 알파-설포닐 하이드록삼산 유도체, 국제 특허 제WO 01/55112호, 및 N-하이드록시폼아마이드 TACE 저해제 GW 3333, -005, 또는 -022); 및 TNF-bp/s-TNFR(가용성 TNF 결합 단백질; 예를 들어, 문헌 [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42] 참고)을 포함한다.
제2 작용제에 더하여, 대상체에 다른 작용제를 전달하는 것도 가능하다. 그러나, 일부 실시형태에서, α4 결합 항체 및 제2 작용제 이외에 어떤 단백질 또는 생물학적제제도 약제학적 조성물로서 대상체에게 투여되지 않는다. α4 결합 항체 및 제2 작용제는 주사에 의해 전달되는 유일한 작용제일 수 있다. 제2 작용제가 재조합 단백질인 실시형태에서, α4 결합 항체 및 제2 작용제는 대상체에 투여되는 유일한 재조합 작용제, 또는 면역 반응 또는 염증 반응을 조절하는 적어도 유일한 재조합 작용제일 수 있다. 추가의 다른 실시형태에서, α4 결합 항체 단독은 대상체에 투여되는 유일한 재조합 작용제 또는 유일한 생물학적제제이다.
본 특허 또는 출원 문헌은 색상으로 구현된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 색상 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 복사본은 요청 시에 그리고 필요한 비용을 지불하면 특허청에서 제공될 것이다.
도 1은 인간 중쇄 생식계열 IGHV1-f(서열번호 2)에 대한 HP1/2 중쇄(서열번호 1)의 3개의 서열 변이체를 도시한 도면. 서열 위의 소문자는 카밧 넘버링 체계에 따른 삽입을 나타낸다.
도 2는 생식계열 IGKV4-1 항체 서열(서열번호 7)(디자인 L0 - 서열번호 8, L1 - 서열번호 9 및 L2 - 서열번호 10) 또는 인간 카파 생식계열 조작된 AAH7033.1 항체 서열(서열번호 12)(디자인 L3 - 서열번호 11)에 대한 HP1/2 경쇄(서열번호 6)의 4개의 서열 변이체를 도시한 도면. 서열 위의 소문자는 카밧 넘버링 체계에 따른 삽입을 나타낸다.
도 3은 ELISA 검정의 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 ELISA 검정의 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 IgG4 Fc의 아미노산 서열(힌지 + CH2 + CH3 도메인)(서열번호14)을 도시한 도면. 힌지 영역을 볼드체로, CH3 도메인을 밑줄로 도시한다. 박스 안의 "S"는 Ser228(EU 넘버링, 이것은 Ser241, 카밧 넘버링임). 원 안의 "N"은 카밧 넘버링으로 Asn314(이것은 Asn297, EU 넘버링임).
도 6은 다양한 종양 세포주에 대한 HuHP1/2의 결합으로부터의 유세포 분석법 데이터를 도시한 그래프. "HP1/2"는 인간화된 HP1/2를 지칭한다.
도 7A 내지 도 7C는 HuHP1/2에 의한 피브로넥틴 또는 VCAM1-Ig 코팅된 웰에 대한 AML 세포주의 결합의 저해를 도시한 일련의 그래프. 도 7A는 FN-코팅된 웰에 대한 HL60 및 KG1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 7B는 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 KG1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 7C는 20㎍/㎖의 HuHP1/2와 함께 인큐베이션된 경우 FN- 및 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 HL60 세포의 결합의 저해를 도시한 도면(채워진 막대). 투명한 막대는 아이소타입 대조군의 존재 하에서 세포 접착력의 백분율을 나타낸다. "HP1/2"는 인간화된 HP1/2를 지칭한다.
도 8A 내지 도 8C는 HuHP1/2에 의한 피브로넥틴 또는 VCAM1-Ig 코팅된 웰에 대한 MM 세포주의 결합의 저해를 도시한 일련의 그래프를 구성한다. 도 8A는 FN-코팅된 웰에 대한 U266 및 H929 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 8B는 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 U266 및 H929 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 8C는 20㎍/㎖의 HuHP1/2와 함께 인큐베이션된 경우 FN- 및 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 U266 세포의 결합의 저해를 도시한 도면(채워진 막대). 투명한 막대는 아이소타입 대조군의 존재 하에서 세포 접착력의 백분율을 나타낸다. "HP1/2"는 인간화된 HP1/2를 지칭한다.
도 9A 내지 도 9C는 HuHP1/2에 의한 피브로넥틴 또는 VCAM1-Ig 코팅된 웰에 대한 CLL 세포주의 결합의 저해를 도시한 일련의 그래프를 구성한다. 도 9A는 FN-코팅된 웰에 대한 Mec1 및 JM1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 9B는 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 Mec1 및 JM1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 9C는 20㎍/㎖의 HuHP1/2와 함께 인큐베이션된 경우 FN- 및 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 Mec1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면(채워진 막대). 투명한 막대는 아이소타입 대조군의 존재 하에서 세포 접착력의 백분율을 나타낸다. "HP1/2"는 인간화된 HP1/2를 지칭한다.
도 10은 전형적인 항원 결합 폴리펩타이드(IgG 항체)의 구조 및 항체의 항원 결합의 기능성 특성 및 효과기 기능(예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합)을 도시한 도면. 항체의 CH2 도메인 내의 당(글리코실화)의 존재가 어떻게 효과기 기능(FcR 결합)을 변경시키지만 항원 결합에 영향을 미치지 않는지가 또한 도시되어 있다.
도 11은 IgG1 X선 결정 구조(pdb 코드 1hzh)로부터의 2개의 상호작용 CH3 도메인(패널 A)을 도시한 도면. IgG1 잔기 K409/K440(EU 넘버링/카밧 넘버링) 및 D399/D427(EU 넘버링/카밧 넘버링)을 강조한다. 패널 2B는 구조-기반 HMM을 사용하여 인간 IgG1/카파 불변 도메인 서열의 정렬을 도시한다(Wang et al, 2009, Proteins 76: 99, 2009). 도메인간 상호작용에 관여되는 CL, CH1 및 CH3의 잔기 위치 및 탄수화물과 직접 접촉한 아미노산과 강하게 결합하는 아미노산 위치를 회색으로 강조한다. 카밧 및 EU 번호를 정렬 아래에 제공한다. 패널 2C는 IgG1-CH2 도메인의 구조의 리본 다이어그램을 도시한다(Sondermann et al, 406(6793):267-73, 2000). N-연결된 탄수화물에 묻힌 발린 잔기 및 CH2 도메인 내의 고유한 6개 아미노산 루프를 표지한다. 패널 2D는 네이티브 IgG1-CH2 서열 및 완전 변형된 IgG1-CH2 서열의 정렬을 도시한다. 변형된 잔기 위치를 흑색으로 표시한다. 변형된 위치의 EU 번호를 정렬 위에 나타낸다.
도 12는 교반 이후에 본 발명의 예시적인 IgG Fc 작제물의 탁도(패널 A) 및 단량체 함량 %(패널 B)을 도시한다.
도 13은 낮은 pH 유지(pH 3.1)에서 IgG Fc 작제물의 시간에 따른 상대적인 피크 높이를 도시한다.
도 14는 용액 친화도 표면 플라스몬 공명에 의해서 측정되는 바와 같은 Fcγ 수용체에 대한 본 발명의 예시적인 IgG1 및 IgG4 Fc 작제물의 초기 결합 속도를 도시한다.
도 15는 CD64(FcγRI)(도 6A) 및 CD16(FcγRIIIa V158)(도 6B)에 대한 본 발명의 예시적인 IgG1 및 IgG4 Fc 작제물의 결합에 대한 IC50을 계산하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한다.
도 16은 CD64(FcγRI)(도 7A)에 대한 IgG1 T318A(카밧 넘버링)(T299A, EU 넘버링) 및 IgG1 야생형과 비교한 IgG1 T318K(카밧 넘버링)(T299K, EU 넘버링)의 결합, 및 CD64(FcγRI)(도 7B)에 대한 T318A(카밧 넘버링)(T299A, EU 넘버링) 돌연변이를 혼입한 다른 예시적인 IgG4 Fc 작제물 및 IgG1 야생형과 비교한 T318K(카밧 넘버링)(T299K, EU 넘버링) 돌연변이를 혼입한 예시적인 IgG4 Fc 작제물의 결합 감소를 강조한 적정 곡선을 도시한다.
도 17은 CD16(FcγRIIIa V158)에 대한 T299A 돌연변이 및 IgG1 야생형을 혼입한 다른 예시적인 IgG4 Fc 작제물과 비교한 T299K 돌연변이를 혼입한 예시적인 IgG4 Fc 작제물의 결합을 도시한다.
도 18은 보체 인자 C1q에 대한 본 발명의 예시적인 IgG1 및 IgG4 Fc 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한다.
도 19 패널 A 및 B는 각각 CD64 및 CD 16에 대한 다양한 Fc 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한다. 패널 C는 N314Q(카밧 넘버링)(N297Q, EU 넘버링) IgG4-CH2/IgG1-CH3이 T318A(카밧 넘버링) (T299A, EU 넘버링) 항체(이것은 비글리코실화된 IgG1보다 약간 더 짧음)와 동일한 반감기를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 20 패널 A는 CD64에 대한 T318X(카밧 넘버링)(T299X, EU 넘버링) 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시하고, 양으로 하전된 측쇄 T318R(카밧 넘버링)(T299R, EU 넘버링) 및 T318KA(카밧 넘버링)(T299K, EU 넘버링)가 CD64에 대해서 낮은 친화도를 부여한다는 것을 나타낸다. 패널 B는 다양한 대안적인 작제물에 대한 CD64의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한 도면. 패널 C 및 D는 CD32aR에 대한 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시하고, 패널 E 및 F는 CD16에 대한 작제물의 결합을 도시한 도면. 패널 G 및 H는 C1q ELISA의 결과를 도시한다.
도 21 패널 A는 CD64에 대한 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시하고, 패널 B는 CD16에 대한 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한다.
도 22A는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1, 카파 경쇄(H1L3)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열(DNA는 서열번호 91에 상응하게 나타냄) 및 경쇄 서열(서열번호 92)의 아미노산 1 내지 233을 제시한다. 볼드 이탤릭체로 제시된 아미노산 1 내지 19(그리고 DNA 서열을 암호화함)은 합성 LC 신호 펩타이드를 함유한다. 성숙 N-말단은 20번 위치(S)에서 아미노산으로 시작된다.
도 22B는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1, 중쇄(H1L3)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열(DNA를 제시하고, 서열번호 93에 상응함) 및 중쇄(서열번호 94)의 아미노산 1 내지 469를 제시한다. 아미노산 1 내지 22(DNA 서열은 이탤릭체로 제시함)은 기록된 합성 신호 펩타이드를 함유한다. 성숙 N-말단은 23번 위치(E)에서 아미노산으로 시작된다.
도 23A는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1의 신호 서열(밑줄), 카파 경쇄(H1L3)를 비롯한 아미노산 서열을 포함한다.
도 23B는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1의 아미노산 서열, 서열번호 81의 성숙 경쇄 및 서열번호 80의 성숙 중쇄를 갖는 카파 경쇄(H1L3)를 포함한다.
도 24는 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 UV 스펙트럼을 제공한다.
도 25는 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 비-환원 조건을 좌측 2개의 레인(줄 1 및 2)에 도시하고, 환원 조건을 우측 2개의 레인(줄 3 및 4)에 제시한다. 레인 1은 비-환원 조건 하의 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001)이고; 레인 2는 비-환원 조건 하의 분자량 마커이고; 레인 3은 환원 조건 하의 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001)이고, 레인 4는 환원 조건 하의 분자량 마커이다.
도 26은 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 IEF의 결과를 도시한다.
도 27은 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 분석용 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 도시한다.
도 28 내지 도 30은 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 DSC의 결과를 도시한다. HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 무손상 항체, Fc 및 Fab2 단편에 대한 용융 곡선을 각각 도 28, 도 29 및 도 30에 도시한다.
도 31은 비-환원 조건 하에서 HP1/2 샘플의 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시한다. 각각의 샘플을 6 및 3㎍/레인으로 로딩하였다. 분자량 마커를 패널의 좌측에 나타낸다. SDS-PAGE를 인비트로젠사(Invitrogen)로부터의 4 내지 20% 폴리아크릴아마이드 구배 겔 상에서 전개시키고, 겔을 Simply Blue 염색제(인비트로젠사)로 염색하고, 증류수로 탈염색하였다. 레인 1은 6ug/레인의 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3이고; 레인 2는 6ug/레인의 HP1/2 hG4P agly(T299A)이고; 레인 3은 6ug/레인의 나탈리주맙 G4P agly이고; 레인 4는 6ug/레인의 나탈리주맙 G4P이고; 레인 5는 3ug/레인의 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3이고; 레인 6은 3ug/레인의 HP1/2 hG4P agly(T299A)이고; 레인 7은 3ug/레인의 나탈리주맙 G4P agly이고; 레인 8은 3ug/레인의 나탈리주맙 G4P이다.
도 32A는 HP1/2 샘플의 SEC 분석의 결과를 도시한다. 샘플을 PBS(10mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH 7.5) 중에서 0.2㎖/분의 유량으로 Superdex Increase 5/150 GL 칼럼(GE 28-9909-45) 상에서 전개시켰다.
도 32B는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3, HP1/2 hG4P agly(T299A), 나탈리주맙 G4P agly 및 나탈리주맙 G4P의 SEC 분석의 결과를 도시한다. 샘플을 PBS(10mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH 7.5) 중에서 0.2㎖/분의 유량으로 Superdex 200 Increase 5/150 GL 칼럼(GE 28-9909-45) 상에서 전개시켰다.
도 33a 및 33b는 각각 인간화된 HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q, EU 넘버링)/IgG1 키메라(GP1/2 GrP agly/G1) 및 인간화된 HP1/2 G1/L3 huIgG4P agly(T299A, EU 넘버링)(HP1/2 hG4P)의 DSC의 결과를 도시한다.
도 34는 3㎎/㎏ HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q, EU 넘버링)/IgG1 키메라(GP1/2 GrP agly/G1)(도에서 HP12라고도 지칭됨; 빈 원), 30㎎/㎏ HP12(채워진 원) 및 3㎎/㎏ 나탈리주맙(Tysabri, 채워진 삼각형)의 단일 IV 볼러스(bolus) 투여 후 시노몰거스 원숭이에서 약동학 시간-경과를 도시한 선 그래프이다.
도 35는 3㎎/㎏ HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q, EU 넘버링)/IgG1 키메라(GP1/2 GrP agly/G1)(도에서 HP12라고도 지칭됨; 빈 원), 30㎎/㎏ HP12(채워진 원) 및 3㎎/㎏ 나탈리주맙(Tysabri, 채워진 삼각형)의 단일 IV 볼러스(bolus) 투여 후 시노몰거스 원숭이에서 유리 수용체 시간 경과를 도시한 선 그래프이다.
도 36은 인간(인간 1 및 인간 2) 및 시노몰거스 원숭이(시노 1 및 시노 2)에서 CD49 (알파-4 인테그린) 발현 수준을 도시한 막대 그래프이다.
도 37A 내지 도 37D는 제시된 투여량의 나탈리주맙(적색 선) 및 HP1/2(흑색 선)의 단일 IV 투여 후 예측된 수용체 점유 시간-경과를 도시한 선 그래프이다.
도 38은 HP1/2(도에서 HP12라고도 지칭됨, 빈 원) 및 나탈리주맙(채워진 삼각형)의 특정 용량의 투여 후 Cmax에서 예측된 수용체 점유율을 도시한 그래프를 제공한다.
도 1은 인간 중쇄 생식계열 IGHV1-f(서열번호 2)에 대한 HP1/2 중쇄(서열번호 1)의 3개의 서열 변이체를 도시한 도면. 서열 위의 소문자는 카밧 넘버링 체계에 따른 삽입을 나타낸다.
도 2는 생식계열 IGKV4-1 항체 서열(서열번호 7)(디자인 L0 - 서열번호 8, L1 - 서열번호 9 및 L2 - 서열번호 10) 또는 인간 카파 생식계열 조작된 AAH7033.1 항체 서열(서열번호 12)(디자인 L3 - 서열번호 11)에 대한 HP1/2 경쇄(서열번호 6)의 4개의 서열 변이체를 도시한 도면. 서열 위의 소문자는 카밧 넘버링 체계에 따른 삽입을 나타낸다.
도 3은 ELISA 검정의 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 ELISA 검정의 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 IgG4 Fc의 아미노산 서열(힌지 + CH2 + CH3 도메인)(서열번호14)을 도시한 도면. 힌지 영역을 볼드체로, CH3 도메인을 밑줄로 도시한다. 박스 안의 "S"는 Ser228(EU 넘버링, 이것은 Ser241, 카밧 넘버링임). 원 안의 "N"은 카밧 넘버링으로 Asn314(이것은 Asn297, EU 넘버링임).
도 6은 다양한 종양 세포주에 대한 HuHP1/2의 결합으로부터의 유세포 분석법 데이터를 도시한 그래프. "HP1/2"는 인간화된 HP1/2를 지칭한다.
도 7A 내지 도 7C는 HuHP1/2에 의한 피브로넥틴 또는 VCAM1-Ig 코팅된 웰에 대한 AML 세포주의 결합의 저해를 도시한 일련의 그래프. 도 7A는 FN-코팅된 웰에 대한 HL60 및 KG1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 7B는 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 KG1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 7C는 20㎍/㎖의 HuHP1/2와 함께 인큐베이션된 경우 FN- 및 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 HL60 세포의 결합의 저해를 도시한 도면(채워진 막대). 투명한 막대는 아이소타입 대조군의 존재 하에서 세포 접착력의 백분율을 나타낸다. "HP1/2"는 인간화된 HP1/2를 지칭한다.
도 8A 내지 도 8C는 HuHP1/2에 의한 피브로넥틴 또는 VCAM1-Ig 코팅된 웰에 대한 MM 세포주의 결합의 저해를 도시한 일련의 그래프를 구성한다. 도 8A는 FN-코팅된 웰에 대한 U266 및 H929 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 8B는 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 U266 및 H929 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 8C는 20㎍/㎖의 HuHP1/2와 함께 인큐베이션된 경우 FN- 및 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 U266 세포의 결합의 저해를 도시한 도면(채워진 막대). 투명한 막대는 아이소타입 대조군의 존재 하에서 세포 접착력의 백분율을 나타낸다. "HP1/2"는 인간화된 HP1/2를 지칭한다.
도 9A 내지 도 9C는 HuHP1/2에 의한 피브로넥틴 또는 VCAM1-Ig 코팅된 웰에 대한 CLL 세포주의 결합의 저해를 도시한 일련의 그래프를 구성한다. 도 9A는 FN-코팅된 웰에 대한 Mec1 및 JM1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 9B는 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 Mec1 및 JM1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면. 도 9C는 20㎍/㎖의 HuHP1/2와 함께 인큐베이션된 경우 FN- 및 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 Mec1 세포의 결합의 저해를 도시한 도면(채워진 막대). 투명한 막대는 아이소타입 대조군의 존재 하에서 세포 접착력의 백분율을 나타낸다. "HP1/2"는 인간화된 HP1/2를 지칭한다.
도 10은 전형적인 항원 결합 폴리펩타이드(IgG 항체)의 구조 및 항체의 항원 결합의 기능성 특성 및 효과기 기능(예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합)을 도시한 도면. 항체의 CH2 도메인 내의 당(글리코실화)의 존재가 어떻게 효과기 기능(FcR 결합)을 변경시키지만 항원 결합에 영향을 미치지 않는지가 또한 도시되어 있다.
도 11은 IgG1 X선 결정 구조(pdb 코드 1hzh)로부터의 2개의 상호작용 CH3 도메인(패널 A)을 도시한 도면. IgG1 잔기 K409/K440(EU 넘버링/카밧 넘버링) 및 D399/D427(EU 넘버링/카밧 넘버링)을 강조한다. 패널 2B는 구조-기반 HMM을 사용하여 인간 IgG1/카파 불변 도메인 서열의 정렬을 도시한다(Wang et al, 2009, Proteins 76: 99, 2009). 도메인간 상호작용에 관여되는 CL, CH1 및 CH3의 잔기 위치 및 탄수화물과 직접 접촉한 아미노산과 강하게 결합하는 아미노산 위치를 회색으로 강조한다. 카밧 및 EU 번호를 정렬 아래에 제공한다. 패널 2C는 IgG1-CH2 도메인의 구조의 리본 다이어그램을 도시한다(Sondermann et al, 406(6793):267-73, 2000). N-연결된 탄수화물에 묻힌 발린 잔기 및 CH2 도메인 내의 고유한 6개 아미노산 루프를 표지한다. 패널 2D는 네이티브 IgG1-CH2 서열 및 완전 변형된 IgG1-CH2 서열의 정렬을 도시한다. 변형된 잔기 위치를 흑색으로 표시한다. 변형된 위치의 EU 번호를 정렬 위에 나타낸다.
도 12는 교반 이후에 본 발명의 예시적인 IgG Fc 작제물의 탁도(패널 A) 및 단량체 함량 %(패널 B)을 도시한다.
도 13은 낮은 pH 유지(pH 3.1)에서 IgG Fc 작제물의 시간에 따른 상대적인 피크 높이를 도시한다.
도 14는 용액 친화도 표면 플라스몬 공명에 의해서 측정되는 바와 같은 Fcγ 수용체에 대한 본 발명의 예시적인 IgG1 및 IgG4 Fc 작제물의 초기 결합 속도를 도시한다.
도 15는 CD64(FcγRI)(도 6A) 및 CD16(FcγRIIIa V158)(도 6B)에 대한 본 발명의 예시적인 IgG1 및 IgG4 Fc 작제물의 결합에 대한 IC50을 계산하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한다.
도 16은 CD64(FcγRI)(도 7A)에 대한 IgG1 T318A(카밧 넘버링)(T299A, EU 넘버링) 및 IgG1 야생형과 비교한 IgG1 T318K(카밧 넘버링)(T299K, EU 넘버링)의 결합, 및 CD64(FcγRI)(도 7B)에 대한 T318A(카밧 넘버링)(T299A, EU 넘버링) 돌연변이를 혼입한 다른 예시적인 IgG4 Fc 작제물 및 IgG1 야생형과 비교한 T318K(카밧 넘버링)(T299K, EU 넘버링) 돌연변이를 혼입한 예시적인 IgG4 Fc 작제물의 결합 감소를 강조한 적정 곡선을 도시한다.
도 17은 CD16(FcγRIIIa V158)에 대한 T299A 돌연변이 및 IgG1 야생형을 혼입한 다른 예시적인 IgG4 Fc 작제물과 비교한 T299K 돌연변이를 혼입한 예시적인 IgG4 Fc 작제물의 결합을 도시한다.
도 18은 보체 인자 C1q에 대한 본 발명의 예시적인 IgG1 및 IgG4 Fc 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한다.
도 19 패널 A 및 B는 각각 CD64 및 CD 16에 대한 다양한 Fc 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한다. 패널 C는 N314Q(카밧 넘버링)(N297Q, EU 넘버링) IgG4-CH2/IgG1-CH3이 T318A(카밧 넘버링) (T299A, EU 넘버링) 항체(이것은 비글리코실화된 IgG1보다 약간 더 짧음)와 동일한 반감기를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 20 패널 A는 CD64에 대한 T318X(카밧 넘버링)(T299X, EU 넘버링) 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시하고, 양으로 하전된 측쇄 T318R(카밧 넘버링)(T299R, EU 넘버링) 및 T318KA(카밧 넘버링)(T299K, EU 넘버링)가 CD64에 대해서 낮은 친화도를 부여한다는 것을 나타낸다. 패널 B는 다양한 대안적인 작제물에 대한 CD64의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한 도면. 패널 C 및 D는 CD32aR에 대한 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시하고, 패널 E 및 F는 CD16에 대한 작제물의 결합을 도시한 도면. 패널 G 및 H는 C1q ELISA의 결과를 도시한다.
도 21 패널 A는 CD64에 대한 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시하고, 패널 B는 CD16에 대한 작제물의 결합을 평가하는데 사용되는 적정 곡선을 도시한다.
도 22A는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1, 카파 경쇄(H1L3)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열(DNA는 서열번호 91에 상응하게 나타냄) 및 경쇄 서열(서열번호 92)의 아미노산 1 내지 233을 제시한다. 볼드 이탤릭체로 제시된 아미노산 1 내지 19(그리고 DNA 서열을 암호화함)은 합성 LC 신호 펩타이드를 함유한다. 성숙 N-말단은 20번 위치(S)에서 아미노산으로 시작된다.
도 22B는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1, 중쇄(H1L3)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열(DNA를 제시하고, 서열번호 93에 상응함) 및 중쇄(서열번호 94)의 아미노산 1 내지 469를 제시한다. 아미노산 1 내지 22(DNA 서열은 이탤릭체로 제시함)은 기록된 합성 신호 펩타이드를 함유한다. 성숙 N-말단은 23번 위치(E)에서 아미노산으로 시작된다.
도 23A는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1의 신호 서열(밑줄), 카파 경쇄(H1L3)를 비롯한 아미노산 서열을 포함한다.
도 23B는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1의 아미노산 서열, 서열번호 81의 성숙 경쇄 및 서열번호 80의 성숙 중쇄를 갖는 카파 경쇄(H1L3)를 포함한다.
도 24는 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 UV 스펙트럼을 제공한다.
도 25는 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 비-환원 조건을 좌측 2개의 레인(줄 1 및 2)에 도시하고, 환원 조건을 우측 2개의 레인(줄 3 및 4)에 제시한다. 레인 1은 비-환원 조건 하의 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001)이고; 레인 2는 비-환원 조건 하의 분자량 마커이고; 레인 3은 환원 조건 하의 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001)이고, 레인 4는 환원 조건 하의 분자량 마커이다.
도 26은 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 IEF의 결과를 도시한다.
도 27은 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 분석용 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 도시한다.
도 28 내지 도 30은 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 DSC의 결과를 도시한다. HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 무손상 항체, Fc 및 Fab2 단편에 대한 용융 곡선을 각각 도 28, 도 29 및 도 30에 도시한다.
도 31은 비-환원 조건 하에서 HP1/2 샘플의 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시한다. 각각의 샘플을 6 및 3㎍/레인으로 로딩하였다. 분자량 마커를 패널의 좌측에 나타낸다. SDS-PAGE를 인비트로젠사(Invitrogen)로부터의 4 내지 20% 폴리아크릴아마이드 구배 겔 상에서 전개시키고, 겔을 Simply Blue 염색제(인비트로젠사)로 염색하고, 증류수로 탈염색하였다. 레인 1은 6ug/레인의 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3이고; 레인 2는 6ug/레인의 HP1/2 hG4P agly(T299A)이고; 레인 3은 6ug/레인의 나탈리주맙 G4P agly이고; 레인 4는 6ug/레인의 나탈리주맙 G4P이고; 레인 5는 3ug/레인의 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3이고; 레인 6은 3ug/레인의 HP1/2 hG4P agly(T299A)이고; 레인 7은 3ug/레인의 나탈리주맙 G4P agly이고; 레인 8은 3ug/레인의 나탈리주맙 G4P이다.
도 32A는 HP1/2 샘플의 SEC 분석의 결과를 도시한다. 샘플을 PBS(10mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH 7.5) 중에서 0.2㎖/분의 유량으로 Superdex Increase 5/150 GL 칼럼(GE 28-9909-45) 상에서 전개시켰다.
도 32B는 HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3, HP1/2 hG4P agly(T299A), 나탈리주맙 G4P agly 및 나탈리주맙 G4P의 SEC 분석의 결과를 도시한다. 샘플을 PBS(10mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH 7.5) 중에서 0.2㎖/분의 유량으로 Superdex 200 Increase 5/150 GL 칼럼(GE 28-9909-45) 상에서 전개시켰다.
도 33a 및 33b는 각각 인간화된 HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q, EU 넘버링)/IgG1 키메라(GP1/2 GrP agly/G1) 및 인간화된 HP1/2 G1/L3 huIgG4P agly(T299A, EU 넘버링)(HP1/2 hG4P)의 DSC의 결과를 도시한다.
도 34는 3㎎/㎏ HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q, EU 넘버링)/IgG1 키메라(GP1/2 GrP agly/G1)(도에서 HP12라고도 지칭됨; 빈 원), 30㎎/㎏ HP12(채워진 원) 및 3㎎/㎏ 나탈리주맙(Tysabri, 채워진 삼각형)의 단일 IV 볼러스(bolus) 투여 후 시노몰거스 원숭이에서 약동학 시간-경과를 도시한 선 그래프이다.
도 35는 3㎎/㎏ HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q, EU 넘버링)/IgG1 키메라(GP1/2 GrP agly/G1)(도에서 HP12라고도 지칭됨; 빈 원), 30㎎/㎏ HP12(채워진 원) 및 3㎎/㎏ 나탈리주맙(Tysabri, 채워진 삼각형)의 단일 IV 볼러스(bolus) 투여 후 시노몰거스 원숭이에서 유리 수용체 시간 경과를 도시한 선 그래프이다.
도 36은 인간(인간 1 및 인간 2) 및 시노몰거스 원숭이(시노 1 및 시노 2)에서 CD49 (알파-4 인테그린) 발현 수준을 도시한 막대 그래프이다.
도 37A 내지 도 37D는 제시된 투여량의 나탈리주맙(적색 선) 및 HP1/2(흑색 선)의 단일 IV 투여 후 예측된 수용체 점유 시간-경과를 도시한 선 그래프이다.
도 38은 HP1/2(도에서 HP12라고도 지칭됨, 빈 원) 및 나탈리주맙(채워진 삼각형)의 특정 용량의 투여 후 Cmax에서 예측된 수용체 점유율을 도시한 그래프를 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고 문헌은 이의 전문이 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우선시될 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시이며, 제한으로 의도되지 않는다.
실시예
달리 제시되지 않는 한, 본 실시예에서 모든 아미노산 넘버링은 EU 넘버링을 사용한다.
실시예 1. 변이체 항-VLA-4 항체는 인간화된 HP1/2보다 더 강력하다.
VL 쇄의 경우에 생식계열 프레임워크 IGKV4-1(또는 디자인 L1과 L2) 또는 생식계열-조작된 AAH7033.1(디자인 L3의 경우), 그리고 VH의 경우 생식계열 프레임워크 IGHV1-f를 사용하여 항-VLA-4 항체를 작제하였다. 이들 항체는 미국 특허 제6,602,503호에서 기재된 인간화된 HP1/2 항체보다 더 적은 역돌연변이를 가졌다.
중쇄 변형
중쇄의 3가지 변형의 서열을 도 1에서 디자인 H0, 디자인 H1 및 디자인 H2로서 도시한다. 각각의 디자인은 IGHV1-f 프레임워크에 그래프팅된 뮤린 HP1/2의 CDR을 갖는다. 디자인 H0은 프레임워크 영역의 역돌연변이를 포함하지 않는 반면, 디자인 H1 과 H2는 인간화된 항체의 친화성을 최적화하기 위해 프레임워크 영역 서열 내에 다양한 정도의 역돌연변이를 갖는다.
경쇄 변형
경쇄의 4가지 변형의 서열을 도 2에서 디자인 L0, 디자인 L1, 디자인 L2 및 디자인 L3(소위 L0, L1, L2, L3이라고 부름)으로서 도시한다. 각각의 디자인은 생식계열 프레임워크에 그래프팅된 뮤린 HP1/2의 CDR을 갖는다. IGKV4-1 생식계열 프레임워크를 디자인 L0, L1 및 L2에 대해서 사용하였고, AAH70335 생식계열 조작된 프레임워크를 디자인 L3에 대해서 사용하였다. 디자인 L0은 프레임워크 영역의 역돌연변이를 포함하지 않는 반면, 디자인 L1, L2 및 L3은 인간화된 항체의 친화성을 최적화하기 위해 프레임워크 영역 내에 다양한 정도의 역돌연변이를 갖는다.
경쟁 ELISA 검정의 결과를 표 2 및 도 3에 도시한다. 본 실험에서, α4β1을 시험 mAb와 함께 사전 인큐베이션시키고, 이어서 뮤린 HP1/2를 경쟁 시약 (competing reagent)으로서 사용하였다. 본 실험의 결과는, 경쇄 L2 또는 L3을 갖는 항체가 미국 특허 제6,602,503호에 기재된 항체보다 더 강력하다는 것을 나타내었다. 이들 결과를 하기 표 2 및 도 3에 도시한다. 이러한 검정에 대한 항체에서 중쇄(H1)는 도 1에서 도시된 "디자인 H1" 서열을 가졌는데, 여기서 L1은 도 2에서 디자인 L1을 지칭한다.
표 2에서, 키메라 mAb는 키메라화된 HP1/2 항체이고, 여기서 뮤린 가변 중쇄 및 경쇄는 인간 IgG1 불변 영역에 유전자 융합된다. 이러한 항체는 결합 친화도에서 본래 뮤린 HP1/2 항체와 본질적으로 동일하다(Sanchez-Madrid et al., Eur. J. Immunol. 16:1343-1349, 1996). 본 실험의 결과는 생식계열-조작된 억셉터 프레임워크 상에서의 인간화를 통해 뮤린 모체 서열에 비해서 단클론성 항체의 친화도를 향상시키는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
또 다른 경쟁 검정은 새로운 항체의 결합 친화도를 미국 특허 제5,840,299호에서 기재된 인간화된 21.6 항-α4 항체(TYSABRI®(나탈리주맙))와 비교한다. 본 실험에서, 마우스 HP1/2와 시험 mAb의 혼합물의 α4β1에 대한 결합을 평가하였다. 본 실험의 결과를 하기 도 4 및 표 3에서 제시하는데, 이는 새로 설계된 항체가 나탈리주맙보다 약 10배 더 강력하다는 것을 나타낸다.
실시예 2. 인간화된 HP1/2(HuHP1/2)는 종양 세포주 상의 VLA-4에 결합한다.
다양한 세포주에 대한 항-VLA-4 항체 HuHP1/2의 결합을 유세포 분석법으로 시험하였다. 결합을 CLL(만성 림프구성 백혈병) 세포주 Mec1 및 JM1; MM(다발성 골수종) 세포주 U266과 H929; 그리고 AML(급성 골수성 백혈병) 세포주 HL60 및 KG1에서 시험하였다. HuHP1/2는 시험된 모든 종양 세포주에 결합하였다(도 6). 유세포 분석법 데이터를 사용하여 각각의 상이한 세포주에 대한 항체 결합의 EC50 값을 계산하였다. 이러한 정보를 하기 표 4에 제시한다.
HuHP1/2는 또한 피브로넥틴(FN) 및 VCAM1-Ig 융합 단백질에 대한 AML 세포주의 접착을 차단하는 것을 발견하였다. 항체가 부착을 차단할 수 있는지를 시험하기 위해서, AML 세포주 HL60 또는 KG1를 증가하는 농도의 HP1/2 또는 아이소타입 대조군 항체의 존재 하에서, FN-코팅된 웰(도 7A) 또는 VCAM1-Ig-코팅된 웰(도 7B)에 접착시켰다. HuHP1/2는 FN-코팅된 웰 및 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 두 세포 유형의 접착을 차단하였다. 두 리간드에 대한 HL60 세포 결합의 최대 저해는 20ug/㎖ HuHP1/2로 달성되었다(도 7C).
HuHP1/2는 또한 FN 및 VCAM1-Ig 융합 단백질에 대한 MM 세포주의 접착을 차단하는 것을 발견하였다. MM 세포주 U266 및 H929를 증가하는 농도의 HP1/2 또는 아이소타입 대조군 항체의 존재 하에서, FN-코팅된 웰(도 8A) 또는 VCAM1-Ig-코팅된 웰(도 8B)에 접착시켰다. HuHP1/2는 FN- 및 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 두 유형의 세포주의 접착을 차단하였다. 두 리간드에 대한 U266 세포 결합의 최대 저해는 20㎍/㎖ HuHP1/2로 달성되었다(도 8C).
HuHP1/2는 또한 FN 및 VCAM1-Ig 융합 단백질에 대한 CLL 세포주의 접착을 차단하는 것을 발견하였다. CLL 세포주 Mec1과 및 JM1을 증가하는 농도의 HP1/2 또는 아이소타입 대조군 항체의 존재 하에서, FN-코팅된 웰(도 9A) 또는 VCAM1-Ig-코팅된 웰(도 9B)에 접착시켰다. HuHP1/2는 FN- 및 VCAM1-Ig-코팅된 웰에 대한 두 유형의 세포주의 접착을 차단하였다. 두 리간드에 대한 Mec1 세포 결합의 최대 저해는 20㎍/㎖ HuHP1/2로 달성되었다(도 9C).
종양 세포주에 대한 HuHP1/2 결합에 대한 IC50 값을 도 7 내지 도 9에 제시된 데이터로부터 계산하였다. 이러한 데이터를 표 4에 제시한다.
실시예 3 내지 13에 대한 물질 및 방법
실시예 3 내지 13 전체에서, 달리 언급하지 않는 한 하기 물질 및 방법을 사용하였다.
일반적으로, 달리 언급하지 않는 한 본 발명의 실시는 화학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학(특히, 예를 들어, 항체 기술) 및 전기영동에서의 표준 기술의 종래의 기술을 사용한다(예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., IrI Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)] 참고).
모체 항체
본 명세서에 개시된 안정화된 항체를 생산하기 위해서, 모델 인간 항체(예를 들어, hu5c8), 이의 변이체 항체 또는 상응하는 Fc 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 표준 발현 벡터에 도입하였다. 인간 항체 hu5c8 및 이의 변이체는 예를 들어, 미국 특허 제5,474,771호 및 제6,331,615호에 기재되어 있다. hu5c8 IgG4 중쇄(서열번호 52), hu5c8 경쇄(서열번호 53), hu5c8 Fab(서열번호 54), 모체 IgG4 항체로부터의 완전한 Fc 모이어티(서열번호 55), S228P 돌연변이를 갖는 모체 IgG4 Fc 모이어티(서열번호 56) 및 S228P/T299A 돌연변이를 갖는 모체 비글리코실화된 IgG4 Fc 모이어티(서열번호 57)에 대해서 아미노산 서열이 하기에 제공되어 있다. 중쇄에 대한 리더 서열은 MDWTWRVFCLLAVAPGAHS였다. 또한 모체 IgG1 비글리코실화된 hu5c8 항체의 중쇄(서열번호 58) 및 Fc 모이어티(서열번호 59) 서열이 제공되어 있다.
실시예 3. 안정성 이득(Gain-in-Stability) IgG Fc 돌연변이의 합리적인 디자인
비글리코실화된 항체는 면역 효과기 기능이 바람직하지 않은 치료 시약의 중요한 클래스를 나타낸다. 그러나, IgG1 및 IgG4에서 CH2 연관된 올리고당류의 제거가 항체 입체배좌 및 안정성에 영향을 미친다는 것은 널리 확립되었다. 항체 안정성의 손실은 프로그램 타임라인 및 공급원에 부정적으로 영향을 미치는 공정 개발 도전을 제공할 수 있다. 여기서 본 발명자들은 IgG Fc에 대한 증가된 안정성을 생성시키기 위해서 CH2 및 CH3 내의 아미노산 위치의 라이브러리를 설계하는데 사용되는 다수의 방법을 상세히 기재한다. 본 실시예에 제시된 넘버링 모두는 EU 넘버링이다.
A. 효과기-적은 IgG에 대한 공변량 및 잔기 빈도 디자인: IgG4 CH2 도메인
다양한 Cl-클래스 Ig-폴드 서열 데이터베이스를 사용한 공변량 분석을 이미 기재된 바와 같이 수행하였다(예를 들어, PCT 공개 제WO2007109254호; 및 문헌 [Wang et al, 2009, Proteins 76: 99, 2009] 참고). Cl-클래스 Ig-폴드 서열의 컴파일(compilation) 및 구조/HMM-기반 정렬을 또한 이미 기재된 바와 같이 수행하였다(전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 PCT 공개 제WO2007109254호). 공변량 분석은 한 쌍의 아미노산이 특정 단백질 서열 내에서 어떻게 공동-보존되는지 여부와 관련된 상관 계수, φ-값의 데이터세트로 이루어지며, φ-값의 범위는 -1.0 내지 1.0이다. 1.0의 φ-값은 아미노산이 서열 하위세트 내의 한 위치에서 발견될 때 다른 잔기 위치에 있는 또 다른 아미노산도 항상 그 하위세트에 존재하는 것으로 발견된다는 것을 나타낸다. -1.0의 φ-값은 아미노산이 서열 하위세트 내의 한 위치에서 발견될 때 다른 잔기 위치에 있는 또 다른 아미노산은 그 서열 하위세트에 절대로 존재하는 것으로 발견된다는 것을 나타낸다. 0.2 초과의 절대 φ-값이 분석된 데이터세트에 대해 통계학적으로 유의한 것으로 밝혀져 있다(PCT 공개 제WO2007109254호; 상기 문헌[Wang et al., 2009]). 데이터세트에 대한 경험에 기초하여, 0.25 초과의 φ-값이 의미가 있는 것으로 간주되었고(즉, 아미노산 쌍의 공존에 대한 물리적 이유가 존재할 가능성이 있음), 0.5 초과의 φ-값이 중요한 기능적 또는 구조적 이유에 대해서 매우 강하고 가능성 있게 공동 보존된다고 간주되었다.
본 연구를 위해, IgG4로부터의 CH2 서열을 쿼리(query) 서열로 사용하였고, 0.3 초과의 φ-값을 공변량에 의해 돌연변이를 식별하기 위한 컷-오프로 사용하였다. 공변량 분석으로부터 식별된 잔기를 표 5.1에 열거한다(실시예 3의 나머지에 걸쳐 상세히 설명된 모든 후속 잔기를 표 5.1에 열거함). 표 5.1에서, 각각의 잔기는 EU 넘버링 시스템에 따라 그 위치에서 목적하는 아미노산 치환에 대한 언급을 제공한다. "근거(rationale)"는 사용된 설계 방법을 지칭한다. 공변량 및 잔기 빈도는 미국 특허 출원 제11/725,970호에 자세히 설명되어 있다. 추가 공변량 링크의 수는 주어진 위치에서 열거된 아미노산 유형에 대한 돌연변이에 의해 형성된 추가 공변량 관계에서 이 치환을 수행함으로써 손실된 공변량 관계의 수를 뺀 값을 지칭한다. 추가 공변량 링크의 수는 제안된 공변량 돌연변이의 품질에 대한 추가 척도를 의미한다. 다수의 아미노산 치환이 우세한 연관된 추가 공변량 링크의 수 없이 제안되는 경우, 라이브러리 접근법이 이 위치에서 사용되었으며, 여기서 모든 20개의 아미노산이 델피아(Delphia) 열 자극 검정을 사용하여 스크리닝되었다(실시예 4에서 자세히 설명됨). 이 방법론을 사용하여, 6개의 아미노산 위치가 제안된 특정 공변량 돌연변이로 식별되었다: L242P(P로 변화된 위치 242에서의 L을 의미함), Q268D, N286T, T307P, Y319F 및 S330A. 또한, 5개의 잔기 위치가 다중 바람직한(양성 추가 공변량 링크) 치환을 갖는 것으로 식별되었으며, 라이브러리 접근법을 사용하였다. 이러한 위치는 D270, P271, E294, A299 및 N315이다.
단백질 폴드 내의 개별 위치에서 잔기 빈도 분석에 기초한 안정성을 개선시키는 방법이 성공적으로 사용되었으며(Steipe, 2004; Demarest et al, 2006), 항-LTβR 항체 BHA10 VH 및 VL-도메인 내의 라이브러리 위치의 식별에 대해서는 특허 출원 BGNA242-1 "STABILIZED POLYPEPTIDES AND METHODS FOR EVALUATING AND INCREASING THE STABILITY OF SAME"에 이미 기재되어 있다. 잔기 빈도 분석을 사용하여 안정성 이득 돌연변이에 대한 5개의 잔기 위치를 식별하였다 N276S, K288R, V308I, S324N 및 G327A. 또한, 공변량 및 잔기 빈도 돌연변이의 생성에서 PCR 오류에 의해 2개의 잔기가 생성되었다: L309 및 N325.
[표 5.1]
B. 효과기-적은 IgG에 대한 구조 분석 디자인
공변량 및 잔기 빈도 분석에 의한 돌연변이체 디자인에 더하여, 무손상 인간 IgG b.12 항체의 공개된 결정 구조의 구조 분석(pdb 코드 1hzh; 문헌[Saphire, E.O., et al. (2001) Crystal structure of a neutralizing human IGG against HIV-I: a template for vaccine design. Science 293:1155-1159] 참고). 구조 분석은 IgG 분자의 안정성을 개선시키도록 변형될 수 있는 특정 구조적 품질을 식별하였다. IgG4 분자의 안정성을 IgG1의 안정성에 더 가깝게 이동시키기 위해서, IgG1과 IgG4 분자 간의 구조적 차이를 보상하기 위해 다수의 돌연변이를 만들었다. 그러한 돌연변이 중 하나는 IgG4, E269의 연장된 루프에 존재한다. 이 루프의 추가 길이를 보상할 수 있는 잔기를 스크리닝하기 위해 라이브러리 접근법을 사용하였다. 이 루프는 또한 본 실시예의 파트 C에 자세히 설명된 바와 같이 추가 변경의 대상이었다.
CH3 도메인 사이의 계면은 IgG 분자의 Fc 도메인에서 가장 큰 단백질-단백질 접촉 면적을 구성한다. IgG1과 IgG4 사이의 이 계면에서의 단일 치환 차이는 잔기 409에 존재한다. IgG1에서, 라이신은 409번 위치에 배치되고, IgG4 분자에는 아르기닌이 409번 위치에 배치된다. IgG4에서 R409를 IgG1 K409로 치환시키는 설계를 진행하여 IgG1 CH3에 대해 관찰된 우수한 안정성 품질을 도입하였다. R409M 및 R409I이 또한 설계하여 이 이론을 시험하였다. IgG4 CH3 계면에서 아르기닌의 추가된 벌크를 더 잘 수용하기 위해서, 반대 CH3 도메인으로부터의 접촉 잔기 D399에서 다수의 돌연변이를 만들었다: D399E 및 D399S(도 11a). 이 위치에서 더 작은 측쇄를 치환시킴으로써, 반대 CH3 도메인은 아르기닌의 추가된 벌크를 더 잘 수용하고, CH3 도메인의 전체 안정성을 증가시킬 수 있다. 2개의 상호작용 도메인(Y349F, T350V 및 T394V) 간의 회합을 증가시키고, 계면의 측쇄(F405Y)에서 벌크를 증가시키기 위해서 CH3 인터페이스에 소수성을 부가하는 돌연변이를 설계하는 또 다른 접근법을 사용하였다. 돌연변이를 또한 설계하여 1hzh 결정 구조(V264, R292, V303)뿐만 아니라 CH3/CH2 계면 근처의 H310에서 탄수화물과 근처 접촉 부위에 배치된 잔기에서 안정화를 시험하였다. 표면 노출된 글루타민 잔기 세트(Q268, Q274 및 Q355)는 또한 전체 표면 전하를 변경시키기 위한 다수의 돌연변이의 초점이었다. E419에 대해서 동일한 접근 방식을 사용하였다.
마지막으로, 고온성(thermophilic) 단백질의 증가된 열 안정성을 설명하는데 사용되는 가장 일반적인 기전 중 하나는 단백질의 내부 코어의 더 단단한 패킹을 포함한다(문헌[Jaenicke, R. and Zavodszky, P. 1990. Proteins under extreme physical conditions. FEBS Lett. 268: 344-349] 참고). 이 현상을 설명하기 위해서, CH2 및 CH3의 "발린 코어"에서 발견된 발린 잔기를 아이소류신 또는 페닐알라닌으로 대체하였다. 추가적인 분지형 측쇄 및 더 큰 연관된 벌크로부터 안정성의 증가가 예측되었다. CH2 내의 "발린 코어"는 모두 CH2 도메인의 동일한 가까운 내부 코어로 배향된 동일한 5개의 발린 잔기(V240, V255, V263, V302 및 V323)이다. 유사한 "발린 코어"가 CH3(V348, V369, V379, V397, V412 및 V427)에 대해서 관찰된다. 또한, L351 및 L368을 더 높은 분지형 소수성 측쇄로 돌연변이시켰다.
C. 효과기-적은 IgG를 위한 공변량 디자인: 다른 C-클래스 Ig-도메인에서 관찰된 공변량 패턴에 기초한 CH2 글리코실화된 부위 근처의 합쳐진 돌연변이.
IgG CH2 도메인은 EU 위치 N297에서 N-연결된 탄수화물과의 상호작용 및 CD16, CD32 및 CD64의 다양한 FcγR 형태와의 상호작용 둘 다를 유지하기 위해 많은 잔기를 공동 보존한다. 탄수화물의 제거는 IgG-Fcs에 의한 FcγR 결합의 극적인 감소로 이어진다(Taylor and Garber, 2005). 본 명세서에 기재된 디자인의 경우, 다른 C-클래스 Ig-폴드 도메인에서 공동 보존되는 것으로 밝혀진 아미노산으로 대체하여 IgG-Fc 내의 N-연결된 탄수화물 근처의 잔기의 공동-변이성을 조사하였다. 이러한 공동-돌연변이가 FcγR-결합에 미칠 수 있는 영향 및 N-연결된 탄수화물의 존재 및 부재 하에서 CH2 도메인의 안정성에 미칠 수 있는 영향을 조사하였는데, 그 이유는 이러한 변형이 비글리코실-Fc 내서 특히 양호하게 용인될 수 있고, 그리고 비글리코실 및 글리코실화된 Fc 모이어티 둘 다에서 FcγR과의 상호 작용을 감소시킬 수 있기 때문이다.
N-연결 탄수화물과 잠재적으로 상호작용하는데 중요한 잔기가 본 연구의 초점이었다. N297에서 탄수화물과 직접 접촉하는 IgG1-C^ 잔기를 FcγRIIIa에 결합된 IgG1-Fc의 공개된 결정 구조 및 MOLMOL 프로그램을 사용하여 식별하였다 (Sondermann, P., Huber, R., Oosthuizen, V., Jacob, U. (2000) The 3.2 Å crystal structure of the human IgG1 Fc fragment-FcgRIII complex. Nature, 406: 267-273; Koradi, R., Billeter, M. & Wuthrich, K. (1996) MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J. Mol. Graph. 14: 51-55). 공변량 분석 및 디자인의 초점은 이러한 아미노산이었다.
Cl-클래스 Ig-폴드 서열의 컴파일 및 구조/HMM-기반 정렬을 이미 기재된 바와 같이 수행하였다(PCT 공개 제WO2007109254호). 다양한 Cl-클래스 Ig-폴드 서열 데이터베이스를 사용한 공변량 분석을 또한 이미 기재된 바와 같이 수행하였다(PCT 공개 제WO2007109254호; 및 상기 문헌[Wang et al, 2009] 참고). 공변량 분석은 한 쌍의 아미노산이 특정 단백질 서열 내에서 어떻게 공동-보존되는지 여부와 관련된 상관 계수, φ-값의 데이터세트로 이루어지며, φ-값의 범위는 -1.0 내지 1.0이다. 1.0의 φ-값은 아미노산이 서열 하위세트 내의 한 위치에서 발견될 때 다른 잔기 위치에 있는 또 다른 아미노산도 항상 그 하위세트에 존재하는 것으로 발견된다는 것을 나타낸다. -1.0의 φ-값은 아미노산이 서열 하위세트 내의 한 위치에서 발견될 때 다른 잔기 위치에 있는 또 다른 아미노산은 그 서열 하위세트에 절대로 존재하는 것으로 발견된다는 것을 나타낸다. 0.2 초과의 절대 φ-값이 분석된 데이터세트에 대해 통계학적으로 유의한 것으로 밝혀져 있다(PCT 공개 제WO2007109254호; 상기 문헌[Wang et al., 2009]). 데이터세트에 대한 경험에 기초하여, 0.25 초과의 φ-값이 의미가 있는 것으로 간주되었고(즉, 아미노산 쌍의 공존에 대한 물리적 이유가 존재할 가능성이 있음), 0.5 초과의 φ-값이 중요한 기능적 또는 구조적 이유에 대해서 매우 강하고 가능성 있게 공동 보존된다고 간주되었다.
구조 분석에 기초하여, 소수성 잔기 V262 및 V264가 N-연결된 탄수화물에 의해 용매로부터 격리된 CH2 도메인의 표면에 소수성 패치를 형성하는 것을 발견하였다. 또한 V266은 V262 및 V264에 근접한 잔기이며, CH2 도메인에 고유하지만, 그것은 루프에 존재하고 도메인 내부에 묻혀있다. V262, V264 및 V266은 IgG-C^ 도메인 내에서 서로 매우 중요한 상관관계로 고도로 공동-보존되는 것을 발견하였다(φ 값: V262-V264= 0.44; V262-V26=0.40; V264- V266=0.54). 이러한 잔기를 IgG 불변 도메인의 구조-기반 서열 정렬에서 강조한다(도 11b).
3개의 발린 잔기(262, 264 및 266)는 또한 CR2 도메인(잔기 267 내지 271)에서 고유한 루프 구조를 형성하는 잔기와 강한 상관관계 계수를 갖는다. 이 루프는 다른 IgG 불변 도메인 CL, CHI 및 CH3에 의해 형성된 공통 루프보다 2개의 아미노산이 더 길다. 특정 상관관계는 V262 및 E269 및 D270 사이(φ-값 = 각각 0.38 및 0.31), V264 및 S267, D268 및 E269 사이(φ-값 = 각각 0.27, 0.44 및 0.52), 및 V266 및 S267 사이(φ-값 = 0.30)에 존재한다 이러한 상관 관계에 기초하여, 본 발명자들은 이 루프가 N297 및 이의 탄수화물을 함유하는 루프의 배치뿐만 아니라 FcγR과의 상호작용에 중요한 것으로 공지된 잔기 325 내지 330을 함유하는 루프의 배치에 중요할 수 있다고 추측하였다(Sondermann et al, 2000; Shields et al, 2001).
이러한 관찰에 기초하여, 본 발명자들은 특히 비글리코실-IgG에서의 이들 위치에서 다른 아미노산 유형의 용인성(tolerability)(즉, CH2 도메인의 폴딩 및 안정성에 대한 영향)을 조사하기 위한 디자인을 생성하였다. 본 발명자들이 관찰하고자 하는 또 다른 양상은 이러한 부위에서의 변형이 IgG의 FcγR-결합 특성에 대해서 미칠 수 있는 영향이다. 이러한 관찰에 기초하여 CH2 도메인 내에서 이루어진 아미노산 변화를 표 5.2에 열거하며, 도 11c의 IgG-Fc 구조에 도시한다 (Sondermann, P., Huber, R., Oosthuizen, V., Jacob, U. (2000) The 3.2 A crystal structure of the human IgG1 Fc fragment-FcgRIII complex. Nature, 406: 267-273). 모든 돌연변이를 함유하는 서열(SDE9)에 대한 네이티브 서열의 정렬을 도 11d에 도시한다.
[표 5.2]
D. 돌연변이 지원
주어진 잔기 위치에서 특정 유형의 돌연변이의 특이성을 시험하기 위해서, 일련의 추가 돌연변이를 설계하였다. 이것은 안정성을 증가시키는 것으로 나타난 잔기 위치에서 다양한 아미노산 유형(극성, 소수성 및 전하)을 시험하는 것을 포함한다. 본 발명자들은 또한 다양한 IgG 아이소타입 및 글리코실화 상태에 대한 모든 안정성 이득 돌연변이의 적용을 시험할 것이다. 이러한 돌연변이를 표 5.3에 열거한다.
[표 5.3]
E. 추가 다중 돌연변이 작제물
안정성 돌연변이 T299K를 갖는 펩타이드로부터 생성된 잠재적 T-세포 에피토프를 감소시키고, T307P 및 D399S 안정성 돌연변이를 비글리코실화된 IgG1 및 IgG4를 초래하는 다른 돌연변이와 조합하여 사용하기 위해서, 본 발명자들은 또한 다음 작제물을 생성시킬 것이다(표 5.4).
[표 5.4]
실시예 4. 이.콜라이에서 생산된 IgG Fc 항체 도메인의 열 안정성 스크리닝
미국 특허 출원 제11/725,970호에 기재된 변형된 열 자극 검정을 안정성 스크리닝으로 사용하여 pH 4.5에서 열 자극 이벤트 후에 유지되는 40℃에서 가용성 IgG Fc 단백질의 양을 결정하였다.
이. 콜라이 균주 W3110(ATCC, 미국 버지니아주 매나서스 소재, 카탈로그 번호 27325)을 유도성 ara C 프로모터의 제어 하에서 pBRM012(IgG1) 및 pBRM013 (S228P, T299A 돌연변이를 갖는 IgG4) Fc와 C-말단 히스티딘 태그를 암호화하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 형질전환체를 30℃에서 0.6% 글리신, 0.6% Triton X100, 0.02% 아라비노스 및 50㎍/㎖ 카베니실린이 보충된 SB(테크노바사(Teknova), 미국 캘리포니아주 하프 문 베이 소재, 카탈로그 번호 S0140)로 이루어진 발현 배지에서 밤새 성장시켰다. 박테리아를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 추가 처리를 위해 상청액을 수거하였다.
열 자극 후, 응집된 물질을 원심분리에 의해 제거하고, 처리되고 정화된 상청액에 남아있는 가용성 Fc 샘플을 DELFIA 검정에 의해 단백질 A(시그마 P7837)에 대한 결합에 대해 검정하였다. 2개의 96웰 플레이트(MaxiSorp, 날제 눈크사(Nalge Nunc), 미국 뉴욕주 로체스터 소재, 카탈로그 번호 437111)를 37℃에서 PBS 중에서 0.5㎍/㎖의 단백질 A로 1시간 동안 코팅한 다음, 실온에서 진탕하면서, DELFIA 검정 완충액(DAB, 10mM Tris HCl, 150mM NaCl, 20μM EDTA, 0.5% BSA, 0.02% Tween 20, 0.01% NaN3, pH 7.4)로 1시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 BSA가 없는 DAB(세척 완충액)로 3회 세척하고, 상청액 10㎕를 DAB 90㎕에 첨가하여 최종 부피 100㎕(기준 플레이트)를 달성하였다. 다음으로 10㎕의 10% HOAc를 폴리프로필렌 플레이트의 각각의 상청액에 첨가하여 4.5의 샘플 pH를 달성하였다. 플레이트를 40℃에서 90분 동안 인큐베이션시키고, 1400×g에서 원심분리시킴으로써 변성된 단백질을 제거하였다. 10㎕의 산 및 열 처리된 상청액을 100mM Tris, pH 8.0(챌린지 플레이트)이 보충된 90㎕의 DAB를 함유하는 또 다른 DELFIA 플레이트에 첨가하였다. DELFIA 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션시키고, 이전과 같이 3회 세척하였다. 250ng/㎖의 Eu-표지된 항-His6 항체(퍼킨 엘머사(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 보스톤 소재, 카탈로그 번호 AD0109)를 함유하는 DAB의 웰당 100㎕를 첨가함으로써 결합된 Fc를 검출하고, 1시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 웰당 100㎕의 DELFIA 향상 용액(enhancement solution)(퍼킨 엘머사(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 보스톤 소재, 카탈로그 번호 4001-0010)을 첨가하였다. 15분 동안 인큐베이션시킨 한 후, Victor 2(퍼킨 엘머사, 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)에서 유로퓸 방법을 사용하여 플레이트를 판독하였다. 40℃에서 다양한 작제물에 대한 기준 플레이트와 챌린지 플레이트 사이의 Eu-형광 비율의 순위를 매겨 데이터를 분석하였다. pBRM013에 대한 값보다 큰 형광 값은 표적 작제물(IgG4.P agly)에 비해서 안정성이 증가된 것으로 해석되었다. 데이터를 표 6.1에 제시한다.
[표 6.1]
실시예 5. 안정화된 IgG Fc 항체의 생산
A. 돌연변이유발, 이.콜라이에서의 안정화된 IgG Fc 모이어티의 일시적인 발현 및 정제
Stratagene Quik-Change Lightning 돌연변이유발 키트를 사용하는 부위-지향 돌연변이유발에 의해서, 실시예 4에서 이미 상세히 설명된 BRM 13 작제물에 안정성 돌연변이를 혼입하였다. 프라이머는 길이가 36 내지 40개 염기로 설계되었고, 중간에 돌연변이가 있고, 양쪽에 올바른 서열의 10 내지 15개의 염기가 있고, 적어도 40% GC 함량이며, 하나 이상의 C/G 염기에서 시작 및 종결된다. 모든 돌연변이체 작제물을 하기 표 7.1에 열거한다.
[표 7.1]
돌연변이를 도입할 프라이머를 사용한 PCR 이후, 모체 플라스미드를 완전히 소화하기 위해서 각각의 돌연변이유발을 Dpn I 제한 효소로 37℃에서 5분 동안 소화시켰다. 이어서 돌연변이유발 반응은 XL1-Blue 이.콜라이 울트라컴피턴트 (ultracompetent) 세포로 형질전환되었다. 암피실린 내성 집락을 스크리닝하고, DNA 서열결정을 사용하여 돌연변이유발 반응에서 올바른 서열을 확인하였다.
서열 확인된 DNA를 EC3 프로그램을 사용하여 전기천공에 의해 3110 세포로 형질전환시켰다. 고유한 집락을 골라내고, 10㎖ LB-amp의 출발 배양물에서 밤새 성장시켰다. 이러한 사전배양물을 1ℓ 발현 배지[SB + 0.02% 아라비노스 + amp/carb 50㎎/ℓ]로 옮기고, 32℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 원심분리기에서 회전시키고, 100㎖의 스페로플라스트 완충액(20% 수크로스, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl pH 8.0 및 리소자임(0.01% w/v))에 완전히 재현탁시켰다. 세포를 회전시키고, 생성된 단백질을 상청액에 넣었다.
IgG-Fc 작제물을 단백질 A 세파로스 FF(지이 헬쓰케어사(GE Healthcare))를 사용한 배취-정제에 의해 정제시켰다. Fc 분자를 pH 3.0에서 0.1M 글리신을 사용하여 단백질 A 세파로스로부터 용리시키고, Tris 염기로 중화시키고, 마지막으로 Pierce 10㎖ 투석 카세트(10,000 MWCO 컷오프)를 사용하여 PBS로 투석시켰다.
B. 돌연변이유발, CHO 세포에서 안정화된 항체의 일시적인 발현, 항체 정제 및 특징규명
Stratagene Quik-Change Lightning 돌연변이유발 키트를 사용하여 부위-지향 돌연변이유발에 의해서, 안정성 돌연변이를 IgG4.P 항체(아미노산 228에서 이미 프롤린 힌지 돌연변이를 함유하는 VH 작제물)에 혼입하였다. Fab를 인식하는 항원은 항-CD40 항체 5c8에서 유래되었다. 프라이머는 길이가 36 내지 40개 염기로 설계되었고, 중간에 돌연변이가 있고, 양쪽에 올바른 서열의 10 내지 15개의 염기가 있고, 적어도 40% GC 함량이며, 하나 이상의 C/G 염기에서 시작 및 종결된다. 모든 글리코실화된 돌연변이 작제물 및 비글리코실화된 돌연변이 작제물을 표 7.2에 열거한다.
[표 7.2]
돌연변이를 도입할 프라이머를 사용한 PCR 이후, 모체 플라스미드를 완전히 소화하기 위해서 각각의 돌연변이유발을 Dpn I 제한 효소로 37℃에서 5분 동안 소화시켰다. 이어서 돌연변이유발 반응은 XL10-Gold 이.콜라이 울트라컴피턴트 세포로 형질전환되었다. 암피실린 내성 집락을 스크리닝하고, DNA 서열결정을 사용하여 돌연변이유발 반응에서 올바른 서열을 확인하였다.
확인된 서열로부터의 DNA를 규모 확대시키고, TOP10 이.콜라이 컴피턴트 세포(인비트로젠사 Corporation, Carlsbad, CA)에서 형질전환시켰다. 암피실린 약물 내성으로 형질전환된 이.콜라이 집락을 삽입물의 존재에 대해서 스크리닝하였다. 이어서 집락을 250㎖의 대규모로 배양물로 배양하였다. Qiagen HiSpeed Maxiprep 키트를 사용하여 일시적인 형질주입을 위한 박테리아 배양물로부터 DNA를 추출하고, 정제시켰다. DNA를 ε280를 사용하여 정량하여 형질주입을 위해서 사용될 DNA 농도를 측정하였다.
이어서, 동일한 양의 5c8 VL 플라스미드와 함께 돌연변이체 플라스미드를 사용하여 항체 단백질의 일시적인 발현을 위해 CHO-S 세포를 공동-형질주입시켰다. 형질주입에 사용될 DNA의 양은 0.5㎎/ℓ의 VH 및 0.5㎎/ℓ의 VL이었다. 형질주입 배지(SAFC로부터의 LONG R4IGF-1을 사용하는 인비트로젠사의 CHO-S-SFMII)를 PEI 3㎎ 대 DNA 1㎎의 비율로 1㎎/㎖의 PEI(폴리사이언시스사(Polysciences) 카탈로그 번호 23966)를 사용하여 형질주입 부피의 5%로 제조하였다. DNA를 형질주입 배지/PEI 용액에 첨가하고, 흔들고, 이어서 실온에서 5분 동안 정치시켰다. 이어서 혼합물을 Ie6 세포/㎖로 500㎖의 CHO-S 세포에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 4시간 후, 1× 부피의 확장 배지(CHOM37 + 20g/ℓ PDSF + 펜스트렙트/암포테리신)를 최종 배양 부피 1ℓ로 첨가하였다. 제1일에, 코튼(cotton) 가수분해물 10㎖를 200g/ℓ로 첨가하고, 온도를 28℃로 하강시켰다. 생존율이 70%(8 내지 12일) 아래로 떨어질 때까지 배양 생존률을 모니터링하였다. 단백질 발현에 대한 역가를 또한 항-IgG 팁에 대한 결합을 측정할 때 Octet(포르테바이오사(ForteBio))을 사용하여 이 시점에서 확인하였다. 배양물을 2400rpm으로 10분 동안 회전시켜 세포를 수거하고, 이어서 상청액을 0.2um 한외여과기를 통해 여과하였다.
5C8 항체를 AKTA(아머샴 바이오사이언시스사(Amersham Biosciences)) 상의 단백질 A 세파로스 FF(지이 헬쓰케어사)를 사용하여 상청액으로부터 포획하였다. 항체 분자를 pH 3.0에서 0.1M 글리신을 사용하여 단백질 A로부터 용리시키고, Tris 염기로 중화시키고, Pierce 10㎖ 투석 카세트(10,000 MWCO 컷오프)를 사용하여 PBS로 투석시키고, 1㎖ 최종 부피로 농축시키고, 정제용 크기 배제 크로마토그래피 (TOSOHASS, 토소 바이오사이언시스사(TOSHOH Biosciences))를 사용하여 추가로 정제시켰다. 5C8 분자를 pH 6.0에서 20m㏖ 시트레이트, 150m㏖ NaCl 용액으로 투석시켰다. 단량체 항체 생성물의 순도 및 백분율을 각각 4 내지 20% Tris-글리신 SDS-PAGE 및 분석 크기-배제 HPLC로 평가하였다.
C. 질량 스펙트럼 분석법을 사용한 안정성 조작 항체의 단백질 서열 및 번역후 변형의 확인
샘플을 환원 조건 하에서 분석하였다. 37℃에서 1시간 동안 4M 구아니딘 HCl의 존재 하에서 100mM DTT에서 환원을 수행하였다. 주입 전에, 샘플을 PBS로 1:1로 희석시켰다. 빙초산을 혼합물에 최종 농도 2%(v/v)로 첨가하였다. 각각의 샘플 5㎍을 페닐 칼럼에 주입하고, ESI-TOF로 분석하였다. 결합 및 용리 방법을 사용하였다. 완충액 A는 물 중에 0.03% TFA를 함유하고, 완충액 B는 아세토나이트릴 중에 0.025% TFA를 함유한다. 유량을 분당 100㎕로 일정하게 유지시켰다. Analyst 소프트웨어로부터 스펙트럼을 얻고, MaxEntl을 사용하여 디컨볼루팅(deconvoluting)하였다. 환원 분석 후, 샘플 중 3개가 글리코폼으로 검출되었기 때문에, EC323, EC326 및 EAG2300의 3개 샘플에서 탈글리코실화가 수행되었다. 탈글리코실화를 환원 조건 하에서 수행하였다: 20mM DTT, 10mM Tris pH 7.0의 존재 하에서 N-글리카나제 1mU/단백질 2㎍. 샘플을 37℃에서 탈글리코실화시켰다. 2시간 후, 추가 30mM의 DTT를 2.7M 구아니딘 HCl의 존재 하에서 샘플에 첨가하고, 추가 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 각각의 환원되고 탈글리코실화된 샘플 5㎍을 페닐 칼럼에 주입하고, 상기에 설명된 바와 같이 분석하였다.
결과는 중쇄의 N-말단 글루타민(Q)을 피로글루탐산(PE)으로 전환한 13개 샘플 모두의 아이덴티티를 확인하였다. 표 7.3은 글리코실화 및 탈글리코실화된 모든 샘플에 대해 얻은 질량을 열거한다. 모든 경쇄 및 중쇄는 1% 이하의 낮은 수준의 당화(glycation)를 포함하였다. 비변형된 N-말단 글루타민에 해당하는 질량은 -20 내지 40%의 상대 강도로 각각의 샘플에서 관찰되었다. 모든 경쇄 디컨볼루팅된 스펙트럼은 예상대로 동일하였다.
[표 7.3]
번역 후 변형은 본 명세서에 기재된 항체에서 광범위하게 변할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 예를 들어, 당화(단백질 상의 아미노기와 글루코스의 반응에 의해 유발되는 비-효소적 변형)는 단백질에서 일상적으로 검출되며, 수준은 세포 배양 조건에 따라 크게 달라진다. 확실히, 당화 수준은 중쇄 및 경쇄 각각에서 상기에 기재된 1%보다 훨씬 높을 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 당화 수준은 10%, 20%, 30%, 40% 또는 40% 초과일 수 있다. 마찬가지로, 탈아민화 및 글리코실화와 같은 다른 번역후 변형은 본 명세서에 기재된 항체의 생성 및 정제 방법에 따라 달라질 수 있다.
샘플 EC323, EC326 및 EAG2300은 GOF가 가장 풍부한 종으로서 GOF를 갖는 일반적인 GOF, GIF, G2F 이안테나 글리칸을 함유하였고, 그 다음으로 GIF, 그 다음 G2F를 함유하였다. 샘플 EC323 및 EC326은 코어 푸코스(GO)가 누락된 GOF 글리칸에 상응하는 GOF 피크에서 -146Da의 피크를 함유하였다. EC323의 경우, GO의 상대적 백분율 강도(마이너스 푸코스)는 2%였고 EC326 샘플의 강도는 23%였다. 모든 3개의 글리코실화된 샘플은 G2F 글리칸 상에 낮은 수준(<1%)의 시알산을 함유하였다.
모든 샘플 쇄는 ESI-TOF의 상승된 기체 온도와 관련된 기기 아티팩트인 것으로 밝혀진 -18Da 피크를 함유하였다. 350℃의 온도를 사용하여 TFA 부가물을 제거하였다.
실시예 6. 비글리코실화된 IgG Fc 항체의 열 안정성
단백질 안정성은 단백질 치료제의 개발 및 규모 확대를 위한 중요한 문제이다. 불충분한 안정성은 생물반응기의 규모 확대 생산에 적합하지 않음, 단백질 정제의 어려움, 약제 제조 및 사용에 대한 부적합성에 이르는 다양한 개발 문제로 이어질 수 있다. 효과기-기능이 결핍된 Fc 골격을 생성시키기 위해서, 돌연변이를 agly IgG4.P(S228P)에 도입하여 CH2 및 CH3 도메인의 전반적인 안정성을 증가시켰다. 본 연구의 목표는 설계된 돌연변이가 열 안정성을 증가시키는지를 조사하는 것이었다. 따라서 각각의 작제물의 열안정성을 시차 주사 열량 측정법(DSC)을 사용하여 평가하였다. 이.콜라이 생산된 Fc-메인 작제물 및 전장 항체 작제물 둘 다를 DSC에 의해 평가하였다. 이.콜라이 생산된 Fc-도메인 작제물 및 전장 항체 작제물의 발현 및 정제 방법은 실시예 5에 상세히 설명되어 있다.
항체를 pH 6.0에서 25mM 시트르산나트륨, 150mM NaCl 완충액에 대해 투석시켰다. 항체를 1㎎/㎖로 농축시키고, UV 흡광도로 측정하였다. 자동 모세관 DSC(마이크로칼사(MicroCal, LLC), 미국 매사추세츠주 노샘프톤 소재)를 사용하여 스캔을 수행하였다. 기준선 감산을 위해 2개의 완충액 스캔을 수행하였다. 스캔은 중간 피드백 모드를 사용하여 20 내지 105℃에서 1℃/분으로 실행하였다. 이어서 소프트웨어 Origin(마이크로칼사, 미국 매사추세츠주 노샘프톤 소재)을 사용하여 스캔을 분석하였다. 0이 아닌 기준선은 3차 다항식을 사용하여 수정하였고, 각각의 항체의 언폴딩 전이를 비-2-상태 언폴딩 모델을 사용하여 피팅하였다. 이들 작제물의 안정성을 추가로 평가하기 위해서, 전장 항체를 pH 4.5에서 25mM 인산나트륨, 25mM 시트르산나트륨, 150nM NaCl 완충액에 대해 투석시켰다. 상기에 설명한 것과 동일한 DSC 프로토콜을 사용하였다. Fab 도메인이 결여된 이.콜라이 발현된 Fc-도메인 작제물을 사용하여 실시예 2에 상세히 설명된 바와 같은 Delphia 열 자극 검정에서 식별된 돌연변이의 안정성 향상을 시험하였다. 작제물 BRM023, BRM030 및 CR103-119를 용융점과 함께 표 8.1에 열거한다.
[표 8.1]
표 8.1에 나타낸 바와 같이, agly IgG1 및 IgG4.P(S228P, T299A) Fc 모이어티 대조군은 각각 CH2에 대해 65.9℃ 및 62.3℃, CH3에 대해 각각 82.6℃ 및 71.2℃의 용융 온도를 가졌다. 단일 부위 돌연변이 중에서, BRM023(T307P) 및 BRM030(T299K)은 agly IgG4.P(S228P, T299A) 대조군에 비해 CH2 용융 온도에서 3.4 내지 3.9℃ 증가를 나타냈다. R409번 위치에서 라이신 또는 메티오닌으로의 치환은, CH3 용융 온도가 12℃ 및 6.6℃ 증가하였다. 더 작은 소수성 측쇄(Leu 및 He)로의 치환은 CH3에 대한 증가된 안정성을 부여하지 않았다. 이 위치는 IgG1과 IgG4 간의 CH3 계면의 단일 차이를 나타낸다. D399번 위치에서의 돌연변이는 IgG4 CH3 계면의 409번 위치에서 아르기닌 측쇄의 부가된 벌크를 보상하기 위해 만들어졌다(실시예 3에 상세히 설명됨). 더 작은 측쇄(Ser)의 치환은 약 4℃의 용융 온도의 증가를 촉진시켰다. 동일한 크기이지만 전하가 결핍된 측쇄(Asp) 또는 전하가 동일한 더 큰 측쇄(Glu)로의 치환은 모두 안정성의 증가를 나타내지 않았다. 실시예 3에 상세히 설명된 바와 같은 소수성 발린 코어에서의 치환은 약 4℃의 CH3 용융 온도의 증가를 나타내는 V427F를 제외하고는, 용융 온도의 효과가 없거나 감소하였다.
단일 및 다중 돌연변이의 조합을 평가하기 위해서, 전장 IgG 분자를 사용하였다. 실시예 5에 상세히 설명된 바와 같이 돌연변이를 전장 5c8 항체에 혼입하였다. pH 6.0 및 pH 4.5에서 DSC에 의해 측정된 CH2 및 CH3 도메인의 용융 온도에 대한 돌연변이의 효과를 하기 표 8.2에 요약한다.
[표 8.2]
표 8.2에 나타낸 바와 같이, D399S 돌연변이는 agly IgG4.P에서 CH3 도메인의 열 안정성을 pH 6.0에서 평균 2℃, pH 4.5에서 10℃ 증가시켰다. 돌연변이체 T299K는 사용하여 비글리코실화된 CH2를 생성시킨다. 299번 위치에서의 라이신 치환은 이 위치에서 알라닌의 치환보다 IgG4.P 분자에서 pH 6.0에서 5℃, pH 4.5에서 11℃만큼 용융 온도를 증가시킨다. T299K 돌연변이는 또한 pH 6.0에서 IgG1 CH2의 경우 Tm을 6℃만큼 증가시킨다. T307P 돌연변이는 D399S와 조합하여 사용되는 경우 글리코실화된 IgG4.P CH2 도메인에 대해 4℃의 증가를 나타내었다. 그 자체로, T307P는 글리코실화된 IgG4.P 형태에서 용융 온도를 증가시키지 않았다. 비글리코실화된 형태에서, T307P 돌연변이는 CH2 Tm을 6℃만큼 증가시켰다. T299K 돌연변이와 조합되는 경우, CH2에 대한 Tm은 8℃ 증가하였다. L309K 돌연변이는 T307P 및 T299A와 조합하여 사용되는 경우 비글리코실화된 IgG4.P에 대한 안정성에서 1℃ 증가를 제공하였다. 그러나 T307P 및 T299K의 조합에서, L309K 돌연변이는 3℃의 증가를 부여하였다. IgG4.P의 글리코실화된 형태에서, L309K 돌연변이는 CH2의 경우 Tm을 2℃만큼 증가시킨다. L309K 돌연변이는 T307P 및 T299A와 조합하여 사용되는 경우 비글리코실화된 IgG4.P의 안정성에서 1℃ 증가를 부여하였다. 그러나, T307P 및 T299K의 조합에서, L309K 돌연변이는 pH 4.5에서 3℃의 증가를 부여하였다. CH2에서의 V323F 돌연변이는 CH2 도메인의 용융 온도에 영향을 미치지 않았지만, V240F 돌연변이는 용융 온도를 13℃ 감소시켰다. 또한 V427F 돌연변이는 CH2에 대한 Tm을 13℃ 감소시켰다.
용융 온도의 가장 극적인 증가는 IgG4.P에서 T299K, T307P, L309K 및 D399S의 조합에서 관찰된다. 이러한 작제물은 T299A IgG4.P와 비교할 때 CH2에 대한 Tm에서 11℃(pH 6.0) 및 12℃(pH 4.5)의 증가를 나타낸다. 실제로 T299K 돌연변이는 T299A 돌연변이에 비해 T307P, L309K 및 D399S와 조합하여 사용되는 경우 Tm을 2 내지 3℃ 증가시킨다. 또한, IgG4.P 아이소타입의 CH3을 IgG1로부터의 CH3으로 전환하는 것과 조합하여 T299K를 IgG4.P CH2에 도입하면 CH2 및 CH3 도메인에 대해 각각 agly IgG4.P에 비해서 6℃ 및 15℃가 증가하였다.
CH2 글리코실화의 공변량 연구에서 식별된 돌연변이는 IgG1 CH2에 대한 Tm에 전혀 효과가 없거나 거의 효과가 없음을 나타내거나(V262L, 및 V262L과 조합된 V264T, 루프 대체), 또는 7℃의 감소된 효과를 나타낸다(V266F, V264T 및 V266F, 루프 및 V264T 및 V266F). V262L, V264T 및 V266F의 조합에 대해 10 내지 12℃의 용융 Tm의 큰 감소가 관찰되었다.
요약하면, T299K, T307P, L309K는 단일 돌연변이로서 또는 서로 조합하여 CH2 도메인의 열 안정성을 증가시키는 능력을 나타냈다. D399S는 IgG4.P의 CH3 도메인에 안정성을 부여하였다.
실시예 7: IgG Fc 항체의 교반 및 pH 유지 단계 연구
단백질 치료제가 제조 생산 및 저장 동안 단백질의 물리적 또는 화학적 특성을 최소한으로 변화시키면서, 긴 저장 수명을 갖는 것이 매우 바람직하다. 관련 스트레스를 평가하는 것은 제형 개발의 중요한 부분이며, IgG Fc 돌연변이체에 대해 2가지 유형의 관련 스트레스를 평가하였다.
A. 교반 스트레스
교반은 제조 및 가공 중에 발생하는 스트레스를 모방할 뿐만 아니라 실제 선적(즉, 시험 장소로 약물 제품 바이알을 선적) 중에 스트레스를 모의실험한다. 따라서, 48시간 동안 교반 안정성을 분석하고, 분석 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 단백질 응집 또는 침전을 모니터링하고, 320nM에서 흡광도를 모니터링함으로써 탁도를 측정하였다. 탁도는 응집 및 침전물 형성으로 인한 광 산란의 척도이며, 이는 극단적인 경우 단백질/완충액 용액을 흐리거나 심지어 불투명하게 만든다. 하기 방법을 각각의 실험 세트에서 일관되게 사용하였다: 0.5㎎/㎖의 각각의 샘플 1㎖를 3㎖ 제형 튜브에서 650rpm으로 진탕하고, 고무 마개로 밀봉하고, 다시 파라필름으로 밀봉하였다. 100㎕의 샘플을 필요한 시점(0, 6, 24 및 48시간)에 추출하고, 14,000rpm에서 5분 동안 회전시켜 응집체 또는 형성된 침전물을 회전시켰다. 이어서, 샘플을 분석 SEC 칼럼 상에서 전개시키고, 분석하였다. 응집된 단백질은 더 짧은 체류 시간에 용리되고, 단백질 분해 산물은 SEC 용리 프로필에서 더 긴 체류 시간에 용리된다. 따라서 단량체 종의 백분율을 사용하여 주어진 시점에서 단백질의 전반적인 안정성을 모니터링하였다.
가장 높은 열적 안정화를 갖는 작제물(실시예 6 참조)을 교반 연구를 위해 선택하였다. 비글리코실화된 IgG4 분자의 경우, YC401 내지 YC403(모든 비글리코실화된 IgG4.P T299A 및 D399S[플러스 각각 T307P, L309K 및 T307P/L309K], YC404 내지 YC406(모든 비글리코실화된 IgG4.P T299K 및 D399S[각각 플러스 T307P, L309K 및 T307P/L309K], 야생형 IgG4.P 비글리코실화된(T299A) 대조군으로서 YC407, CN578(비글리코실화된 IgG1 A299K), EC331(이것은 비글리코실화된 IgG4.P T299K 및 T307P임, IgG1 CH3 도메인을 가짐), 비글리코실화된 IgG1(T299A), 비글리코실화된 IgG4.P(T299A) 및 비글리코실화된 IgG1(T299A)을 연구를 위해서 선별하였다. 글리코실화된 분자의 경우, EC304(글리코실화된 IgG4.P T307P, D399S), EC323(글리코실화된 IgG4.P D399S, L309K), EC326(글리코실화된 IgG4.P T307P, D399S, L309K), 글리코실화된 IgG4.P T299A 및 글리코실화된 IgG1을 연구를 위해서 선별하였다.
탁도와 관련하여 비글리코실화된 돌연변이체를 비교하면(하기 표 9.1 및 도 12A 참고), YC403(비글리코실화된 IgG4.P T299A, T307P, L309K 및 D399S) 및 YC406 (비글리코실화된 IgG4.P T299K, T307P, L309K 및 D399S)은 야생형 YC407(비글리코실화된 IgG4.P T299A)에 비해서 가장 낮은 양의 탁도를 나타내었다. 두 작제물 모두는 각각의 시점에 야생형에 비해서 탁도의 1/3을 일관되게 나타낸다. 두 작제물의 유일한 차이는 T299A(YC403) 및 T299K(YC406)이다.
[표 9.1]
단량체 %(하기 표 9.2 및 도 12B 참고)를 비교하면, 돌연변이체 작제물 모두는 시간에 따라서 감소된 응집을 나타내었다. 24시간 시점에, 돌연변이체 작제물 모두는 야생형보다 더 양호하였고, 48시간 시점에, 대부분의 작제물은 적어도 2배 더 양호하였다. 그러나, 최고 단량체 %를 보유한 작제물은 YC403, 그 다음 YC402 (비글리코실화된 IgG4.P T299A, L309K 및 D399S) 및 그 다음 YC406(비글리코실화된 IgG4.P T299K, T307P, L309K 및 D399S)이었다. 이들 작제물은, 시간에 따라서 단량체 %의 가정 적은 점진적인 손실을 나타내었다. 최상의 순위의 작제물에서 관찰되는 공통적인 돌연변이는 L309K 돌연변이이다. 이러한 데이터는, 선택된 돌연변이가 기계적 스트레스 맥락에서 전체 안정성을 개선시킨다는 것을 입증한다. 비글리코실화된 IgG4.P 작제물에 대한 두 교반 측정치를 비교하면, YC403(비글리코실화된 IgG4.P T299A, T307P, L309K 및 D399S) 및 YC406(비글리코실화된 IgG4.P T299K, T307P, L309K 및 D399S) 작제물은 시간에 따라서 기계적 스트레스를 가장 잘 견딘다. 두 분자 모두는 열 안정성 및 구조적 안정성을 개선시킬 수 있는 부가 돌연변이(T307P/L309K)를 나타낸다.
[표 9.2]
IgG1 비글리코실화된 분자의 경우, CN578(비글리코실화된 IgG1 A299K)이 최소한의 탁도를 나타내었고, 그것은 또한 전체 실험에 걸쳐서 응집을 본질적으로 나타내지 않았다. CN578은 IgG1 T299A 및 또한 야생형 IgG1 299T 분자보다 더 양호하게 거동하기 때문에, A299K 돌연변이는 비글리코실화된 IgG1 분자에 대해서 교반에 대해 최소한의 효과를 갖는다. CN578은 IgG1 T299A보다 탁도 연구에서 5-배 더 양호하다. CN578 분자는 또한 48시간 동안 응집을 나타내지 않으며, 이는 비글리코실화된 IgG1 T299A 및 글리코실화된 IgG1 299T 모두와 동일한 결과이다. EC331(이것은 IgG1 CH3 도메인을 갖는 비글리코실화된 IgG4.P T299K 및 T307P임)은 교반 연구 전체에서 100단량체%를 유지하였기 때문에, 다른 작제물에 비해 매우 잘 기능하였다. 이것은 IgG4.P agly 작제물(YC 시리즈)에 비해 탁도가 2-배 개선되었다. 이 데이터는, IgG1 CH3 부분이 분자의 열 안정성 및 구조적 안정성 둘 다에 크게 도움이 됨을 시사한다.
글리코실화된 분자, 글리코실화된 분자s, EC304(글리코실화된 IgG4.P T307P,
D399S), EC323(글리코실화된 IgG4.P D399S, L309K), EC326(글리코실화된 IgG4.P T307P, D399S, L309K) 중에서, 야생형 글리코실화된 IgG4 분자에 비해서 응집 연구 과정에서 단량체 %의 개선이 존재한다(표 9.2 및 도 12B 참고). 그러나 탁도는 매시점에서 최대 75-배까지 크게 증가한다. 일관되게, 각각의 분자는 D399S를 함유하여, 이 돌연변이는 데이터가 나타내는 바와 같이 구조적 안정성을 불안정화시킬 가능성이 존재할 수 있다.
B. 낮은 pH 유지 단계 연구
단백질 치료제는 제조성 및 확대성을 갖는 것이 매우 바람직하다. pH 유지 단계 연구를 수행하는 것은 공정 개발에 필수적이다. pH 유지 연구는 단백질의 생산 및 정제 단계에서 공정 개발을 모방한다. 생산 단계의 경우, 단백질의 재현성과 일관성은 품질 보증에 필수적이다. 이 방법을 사용하여 높은 pH 또는 낮은 pH에서 단백질의 안정성을 측정할 수 있다. 연구를 위해, AKTA(파마 바이오테크사 (Pharmacia Biotech), 현재 지이 헬쓰케어사)를 사용하여 단백질 A 칼럼에 1㎎의 단백질을 로딩하고, pH 3.1에서 아세테이트 완충액으로 용리시켰다. 단백질은 6시간까지 2시간 간격으로 낮은 pH에서 유지시켰다. 100㎕ 분취물을 취하고, 이어서 분석 SEC 상에서 전개시켜 분해 및 응집으로 인한 단백질 손실을 측정하였다. 결과를 표 9.3(하기 참고) 및 도 13에 요약한다.
[표 9.3]
본 연구를 위해서, EC304(글리코실화된 IgG4.P T307P, D399S), EC323(글리코실화된 IgG4.P D399S, L309K), EC326(글리코실화된 IgG4.P T307P, D399S, L309K), 글리코실화된 IgG4.P T299A, EC331(이것은 IgG1 CH3 도메인을 갖는 비글리코실화된 IgG4.P T299K 및 T307P임), 비글리코실화된 IgG1(T299A), 비글리코실화된 IgG4.P(T299A) 및 글리코실화된 IgG1를 연구를 위해서 선별하였다. 이 데이터로부터, EC331은 많은 수율을 잃지 않으면서 최소 6시간 동안 낮은 pH 유지를 견딜 수 있는 것으로 나타났다. 이것은 실행된 비글리코실화된 IgG4 야생형 대조군에 비해 개선된 것이다. 나머지 비글리코실화된 작제물은 분해로 인해 어떠한 단백질도 잃지 않을 것으로 예상되는데, 그 이유는 이 작제물이 낮은 pH 유지를 견딜 수 있었기 때문이다. 둘 다 글리코실화되기 때문에, EC304 및 EC326은 또한 수율을 유지하는데, 이는 또한 글리코실화된 IgG1 야생형과 대등하다. 또한 글리코실화된 EC323은 시간이 지남에 따라 잘 기능하지 않는다. L309K 돌연변이 단독이 T307P 돌연변이와 함께 안정화될 필요가 있다는 가설이 세워지며, 이는 보다 안정화된 EC326 작제물에서 인지된다.
실시예 8. 안정성 조작된 IgG Fc 항체의 Fc 수용체 결합
본 발명의 비글리코실화된 변이체 항체의 효과기 기능을 Fc 수용체 또는 보체 분자, 예컨대, C1q에 결합하는 능력으로 특징규명하였다.
A. 용액 상 경쟁 Biacore 실험
Fcγ 수용체에 대한 결합을 용액 친화도 표면 플라스몬 공명을 사용하여 분석하였다(문헌[Day ES, Cachero TG, Qian F, Sun Y, Wen D, Pelletier M, Hsu YM, Whitty A. Selectivity of BAFF/BLyS and APRIL for binding to the TNF family receptors BAFFR/BR3 and BCMA. Biochemistry. 2005 Feb 15;44(6):1919-31] 참고). 이 방법은 소위 "대량-수송-제한(mass-transport-limited)" 결합 조건을 사용하는데, 여기서 리간드 결합(센서 칩에 대한 단백질 결합)의 초기 속도는 용액 중의 리간드의 농도에 비례한다(문헌[BIApplications Handbook (1994) Chapter 6: Concentration measurement, pp 6-1-6-10, Pharmacia Biosensor AB] 참고). 이러한 조건 하에서, 칩 상의 고정된 단백질에 대한 가용성 분석물(칩 표면 위를 유동하는 단백질)의 결합은 칩 표면 상의 덱스트란 매트릭스로의 분석물의 확산에 비해서 빠르다. 따라서, 분석물의 확산 특성 및 칩 표면 위를 유동하는 용액 중의 분석물의 농도가 분석물이 칩에 결합하는 속도를 결정한다. 이러한 실험에서, 용액 중의 유리 Fc 수용체의 농도는 고정된 IgG1 MAb를 함유하는 CM5 Biacore 칩에 대한 초기 결합 속도에 의해 결정된다. 이러한 Fc 수용체 용액에서 안정성 조작된 작제물을 적정하였다(하기 표 10.1 참고). 이들 작제물의 최대 절반(50%) 저해 농도(IC50)는 센서 칩 표면 상에 고정된, 고정된 IgG1 항체에 대한 결합으로부터 Fc 수용체를 저해하는 능력을 입증하였다. 초기 결합 속도는 원시 센서그램 데이터에서 얻었다(도 14). IC50을 계산하는데 사용된 적정 곡선은 CD64(FcγRI)의 경우 도 15A 및 CD16 (FcγRIIIa V158)의 경우 도 15B에 도시한다. 결과를 표 10.1에 제시하고, 두 적정의 평균으로 보고된다.
[표 10.1]
CD64 결합 검정에서, IgG1 대조군 항체는 IC50이 9.6μM인 반면, IgG1 T299A(agly) 및 IgG4.P T299A(agly)는 IC50이 각각 205 및 739μM이었다. 예상된 바와 같이, IgG1 분자는 IgG4 분자보다 CD64에 대해서 더 큰 친화도를 가지며, 비글리코실화된 IgG1은 글리코실화된 IgG1에 비해 감소된 친화도를 나타냈다. 안정성 조작된 글리코실화된 IgG4.P 분자(EC300 및 EC326)는 약 8μM의 IC50 값을 가졌으며, 이에 비해서 안정성 조작된 비글리코실화된 IgG4.P 분자(EC331 및 YC400 시리즈)는 440 내지 5000μM 초과의 범위였다. 안정성 조작된 IgG4.P 글리코실화된 분자(EC300, EC326)에 대한 IC50은 글리코실화된 IgG1 대조군과 동등하였고, T299A를 갖는 안정성 조작된 비글리코실화된 IgG4.P(YC401, YC403)는 비글리코실화된 IgG4.P T299A와 동등한 로그 IC50을 가졌다. 그러나, T299K를 갖는 안정성 조작된 비글리코실화된 IgG4.P는 T299A 치환을 갖는 동등한 분자에 비해 친화도에서 1 내지 2 로그 더 큰 감소를 나타냈다(도 7A). 이 결과는 또한 비글리코실화된 IgG1 T299A 대조군과 비교하여 친화도의 로그 감소를 나타내는 안정성 조작된 비글리코실화된 IgG1 T299K(CN578)에 대해 관찰되었다(도 16B). 실제로, T299K 치환은, 비글리코실화된 IgG1(T299A) 분자를 비글리코실화된 IgG4.P T299A 대조군보다 CD64에 대해 더 큰 친화도를 갖는 것에서부터, 비글리코실화된 IgG4.P 대조군에 비해서 비글리코실화된 IgG1(T299K)에 대해서 감소된 친화도를 갖는 것으로 이동시킨다(도 16B). 요약하면, T299K 돌연변이는 IgG1 및 IgG4 분자 둘 다에서 CD64에 대한 친화도를 감소시킨다.
CD16 검정의 경우, IgG1 대조군은 105μM의 IC50을 가졌고, 비글리코실화된 IgG4.P T299A 및 IgG1 T299A는 둘 다 1000μM 초과의 IC50을 가졌다. 글리코실화된 안정성 조작된 IgG4.P 분자는 IgG1 대조군과 동등한 log의 IC50 값을 가졌고, 안정성 조작된 비글리코실화된 분자 모두(IgG4.P 및 IgG1 둘 다)는 1000μM 초과의 IC50을 가졌다. T299K가 CD16에 대한 친화도를 추가로 감소시키는지의 여부를 조사하기 위해서, 유일한 차이로서 T299K 치환을 갖는 두 세트의 작제물(YC401, YC404 및 YC403, YC406)을 고농도의 항체(5μM)에서 시험하였다. 결합 곡선은 고농도에서 T299K 돌연변이로 인한 CD16에 대한 친화도의 감소를 나타낸다(도 17). 요약하면, T299K 돌연변이는 IgG 분자에서 CD16에 대한 친화도를 감소시킨다.
B. C1q 결합 ELISA
96웰 Maxisorb ELISA 플레이트(날제-눈크사, 미국 뉴욕주 로체스터 소재)를 PBS중에서 4℃에서 밤새 10ug/㎖로 50㎕의 재조합 가용성 인간 CD40 리간드로 코팅함으로써 C1q 결합 검정을 수행하였다. 웰을 흡인시키고, 세척 완충액(PBS, 0.05% Tween 20)으로 3회 세척하고, 200㎕/웰의 차단/희석 완충액(0.1M Na2HP04, pH 7.0, 1M NaCl, 0.05% Tween 20, 1% 젤라틴)으로 1시간 동안 차단시켰다. 항체를 3-배 희석액으로 차단/희석 완충액 중에서 희석하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
상기와 같이 흡인 및 세척한 후, 차단/희석 완충액에 희석된 시그마 인간 C1q(C0660)의 2 J. 겔의 50 J. 웰을 첨가하고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다.
상기와 같이 흡인 및 세척한 후, 차단/희석 완충액에 3, 560배로 희석된 양 항 C1q(세로테크사(Serotec) AHP033) 50 pll/웰을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 웰을 상기와 같이 흡인 및 세척하였다. 이어서, 차단/희석액 중에 1:10,000으로 희석된 당나귀 항-양 IgG HRP 접합체(잭슨 이뮤노리서치사 (Jackson ImmunoResearch) 713-035-147) 50pll/웰을 첨가하고, 웰을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
상기와 같이 흡입 및 세척한 후, 100개의 모든 TMB 기질(420plM TMB, 0.1M 아세트산나트륨/시트르산 완충액 중의 0.004% H2O2, pH 4.9)을 첨가하고, 2분 동안 인큐베이션시킨 후, 100ul 2N 황산으로 반응을 중단시켰다. 흡광도를 Softmax PRO 기기를 사용하여 450nm에서 판독하고, Softmax 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 피트로 상대 결합 친화도(C 값)를 결정하였다.
실험 결과는 CN578(IgG1 T299K) 및 YC406(비글리코실화된 IgG4.P T299K, T307P, L309K 및 D399S) 모두 C1q(도 17)의 측정 가능한 결합이 없는 반면, IgG1 T299A는 약간의 잔기 결합을 가짐을 나타낸다.
실시예 9. IgG1 CH3은 효과기 기능이 없는 비글리코실화된 IgG4 CH2를 안정화시킨다.
본 섹션에 기재된 단백질은 5c8 항체로부터 유래되고, 달리 제시되지 않는 한, IgG4로부터의 CH1 영역, IgG4로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 또는 IgG4 항체로부터의 CH3 도메인을 포함한다(제시된 바와 같음). 단백질을 실시예 3에 기재된 바와 같이 생산 및 정제시켰다. 변형된 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 열안정성을 pH 6.0 및 pH 4.5에서 DSC에 의해 측정하였다(실시예 6에 자세히 설명됨). 교반 스트레스의 효과를 분석 SEC 및 A320nm에서의 탁도 측정에 의해 측정하였다(실시예 7). 본 발명의 비글리코실화된 변이체 항체의 효과기 기능을 Fc 수용체 또는 보체 분자, 예컨대, C1q에 결합하는 능력으로 특징규명하였다. Fcγ 수용체에 대한 결합을 용액 친화도 표면 플라스몬 공명을 사용하여 분석하고, 보체 인자 C1q에 대한 결합을 ELISA로 분석하였다(실시예 6). 마지막으로, 혈청 반감기를 스프라그-돌리 래트(Sprague-Dawley rat)에서 수행된 약동학 연구에 의해 결정하였다(실시예 9).
IgG4-CH2/IgG1-CH3 비글리코실화된 작제물을 실시예 5에 상세히 설명된 바와 같이 CHO에서 발현시켰고, 수율은 1리터당 7 내지 14㎎ 범위였다. IgG1-CH3의 도입은 IgG4로부터의 CH3을 사용한 동일한 작제물에 비해 더 높은 수율(-1.5X)을 부여하는 것으로 보인다(표 8.1). 또한, IgG1 비글리코실 IgG4-CH2/IgG1-CH3은 야생형 비글리코실 IgG4의 CH3 도메인의 안정성(Tm = 74℃, 표 12.2 및 8.2)에 비해서 CH3 도메인에서 증가된 열 안정성(Tm = 85℃)을 가졌다. 흥미로운 관찰은, IgG1 CH3이 교반 안정성에서 결정적인 특징이라는 것인데(표 12.3), 그 이유는 이전에는 CH2 도메인에서 글리칸의 손실이 안정성의 지배적인 요인이 될 것이라고 생각했기 때문이다.
EAG2412 작제물(N297Q IgG4-CH2/IgG1-, 즉, 5c8 가변 영역(IgG1 프레임워크), IgG4 CH1, IgG4 CH2, IgG1 CH3(N297Q 및 Ser228Pro 치환 가짐))이 더 양호한 효과기 기능 프로파일을 나타내는 것으로 관찰되며, T299A 및 T299K IgG4-CH2/IgG1-CH3에 비해서, CD64 및 CD32에 대한 결합이 가장 낮다. IgG1-CH3는 Fcγ 수용체에 대한 결합에 영향을 미치지 않는 것을 발견하였다. 비글리코실 IgG4-CH2 도메인-함유 작제물 모두는 C1q에 결합하지 않는다.
안정성 조작된 IgG4/IgG1 분자의 안정성 및 혈청-반감기를 다루기 위해 스프라그-돌리 래트에서 약동학 연구를 수행하였다. 래트를 바이오젠 이데크 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Biogen Idec Institutional Animal Care and Use Committee) 및 실험 동물의 인도적 치료 및 관리에 대한 시, 주 및 연방 지침에 따라 유지시켰다. 인산염-완충 식염수(PBS) 중에 희석된 항체 1㎎/㎏(1㎎/㎖)의 단일 볼러스 주사를 수컷 스프라그-돌리 래트에게 IV로 투여하였다. 래트를 주사 후 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 6, 24, 48, 96, 168, 216, 264 및 336시간에 희생시켰다. 항체의 수준을 정량하기 위한 분석을 위해 혈청 샘플을 준비하였다. 샘플을 5% 정상 마우스 혈청(잭슨 이뮤노리서치사 015-000-120)이 보충된 DAB에 희석시켰고, 검출 시약은 250ng/㎖의 최종 농도에서 사용된 Eu-표지된 마우스 항-인간 Fc 항체(퍼킨 엘머사 1244-330)였다. 정제된 항체의 표준 곡선과 비교하여 Excel의 TREND 기능을 사용함으로써 정량을 수행하였다.
N297Q IgG4-CH2/IgG1-CH3은 T299A IgG4 항체와 동일한 반감기를 가졌는데, 이것은 예상된 바와 같이, 비글리콜실화된 IgG1보다 약간 더 짧았다(표 12.5). 데이터를 도 19C에 플로팅한다.
[표 12.1]
[표 12.2]
[표 12.3]
[표 12.4]
[표 12.5]
실시예 10. T299는 안정성 및 효과기 기능의 결정인자이다.
본 섹션에 기재된 단백질은 모두 5c8 항체로부터 유래되고, 달리 제시되지 않는 한 IgG1 항체의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 단백질을 실시예 5에 기재된 바와 같이 생산 및 정제시켰다. CH2 및 CH3 도메인의 용융 온도에 대한 돌연변이의 효과를 pH 6.0 및 pH 4.5에서 DSC에 의해 측정하였다(실시예 6에서 자세히 설명됨). 본 발명의 비글리코실화된 변이체 항체의 효과기 기능을 Fc 수용체 또는 보체 분자, 예컨대, C1q에 결합하는 능력으로 특징규명하였다. Fcγ 수용체에 대한 결합을 용액 친화도 표면 플라스몬 공명을 사용하여 분석하고, 보체 인자 C1q에 대한 결합을 ELISA로 분석하였다(실시예 8).
IgG1 T299X 및 N297X/T299K 비글리코실화된 작제물을 실시예 5에 상세히 설명된 바와 같이 CHO에서 발현시켰고, 수율은 1리터당 7 내지 30㎎ 범위였다(표 13.1). T299K와 조합하여 N297번 위치에서 2차 돌연변이를 추가하면 CH2 도메인의 열 안정성이 1.5 내지 4.4℃ 감소하였다(표 13.2). 또한, T299X 돌연변이는 Arg (T299R)와 Lys(T299K)의 양으로 하전된 측쇄로부터 안정성에서 가장 큰 이득을 나타내었다(표 13.2). 두 극성 측쇄 Asn(T299N) 및 Gln(T299Q)는 둘 다 T299A에 비해서 더 큰 안정성을 나타내었지만, 양으로 하전된 측쇄만큼 크지는 않았다. 프롤린 (T299P)은 T299A에 비해서 안정성이 약간 감소하였으며, 더 큰 소수성 측쇄 Phe (T299F)는 CH2 도메인의 열 안정성을 2.4℃만큼 감소시켰다. 마지막으로, 음으로 하전된 측쇄 Glu(T299E)는 CH2 열 안정성에 거의 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는, CH2 도메인에서 열 안정성을 증가시키기 위해서 T299번 위치에서 양으로 하전된 측쇄를 치환시키는 새로운 특성을 입증한다.
N297X, T299K 돌연변이(CN645, CN646 및 CN647)는 모두 CD32a 및 CD16에 대한 매우 낮은 친화도를 유지하면서 CD64에 대한 친화도를 약간 증가시키는 것으로 관찰되었다(도 20B, 도 20D 및 도 20F). T299X 돌연변이는 CD 16에 대해 일관되게 낮은 친화도를 나타내었지만, T299E의 경우 CD32a에 대한 낮은 친화도가 증가되었다(표 13.3 및 도 20C, 도 18E). 또한, 양으로 하전된 측쇄 T299R 및 T299K 만 CD64에 대해 낮은 친화도를 부여한다는 점에 주목하는 것이 흥미롭다(표 13.3 및 도 20A). 마지막으로, T299K, T299P 및 T299Q를 제거하여 C1q 결합을 추적하고; T299N, T299E, T299F가 약간 상승했지만, C1q에 대한 결합은 여전히 매우 낮다(도 20G 및 도 20H). N297P/T299K, N297D/T299K 및 N297S/T299K는 C1q에 대한 결합을 나타내지 않는다(도 20H).
[표 13.1]
[표 13.2]
[표 13.3]
실시예 11. 안정화된 Fc 작제물은 안정성 돌연변이체의 적용이 Fab에 독립적이라는 것을 나타낸다.
본 섹션에 기재된 단백질은 5c8 항체로부터 유래된 결합 부위를 포함한다. EAG2476 작제물은 IgG4 면역글로불린 분자로부터의 Fc 모이어티를 포함하고, EAG2478은 IgG1 분자로부터의 Fc 모이어 티를 포함한다(EAG2476 및 EAG2478은 각각 YC406 및 CN578 작제물의 Fc 버전(Fab 없음)임).
단백질을 실시예 5에 기재된 바와 같이 생산 및 정제시켰다. CH2 및 CH3 도메인의 용융 온도에 대한 돌연변이의 효과를 pH 6.0에서 DSC에 의해 측정하였다(실시예 6에서 자세히 설명됨). 본 발명의 비글리코실화된 변이체 항체의 효과기 기능을 도 21에 제시한다. 항체를 Fc 수용체에 결합하는 능력으로 특징규명하였다. Fcγ 수용체에 대한 결합을 용액 친화도 표면 플라스몬 공명을 사용하여 분석하였다(실시예 8).
안정화된 Fc 비글리코실화된 작제물을 실시예 5에 상세히 설명된 바와 같이 CHO에서 발현시켰고, 수율을 (표 14.1)에 상세히 설명한다. CH2 도메인(T299K, T307P 및 L309K) 내의 돌연변이는 동일한 Fc γ 수용체 결합 친화도(표 14.3)를 가질 뿐만 아니라 Fab의 존재 또는 부재 하에서 동일한 열 안정성을 나타냈다(표 14.2). 종합하면, 본 발명에 설명된 안정화 돌연변이는 예상된 바와 같이 Fab 독립적이며, Fab 기여에 관계없이 Fc 도메인을 안정화시키는데 적용 가능하다.
[표 10.1]
[표 10.2]
[표 10.3]
실시예 12
열 안정성, 정제 시 침전 감소, 항체-분비 세포로부터의 항체 생산 역가 개선의 바람직한 특성을 갖는 본 발명의 항체를 생산하기 위해서, 인간 카파 경쇄 불변 영역에 부착된 서열번호 11의 가변 경쇄 서열을 포함한 경쇄 및 다양한 중쇄 불변 영역에 부착된 서열번호 4의 가변 중쇄 서열을 포함하는 중쇄 가변 경쇄 서열을 포함하는 경쇄를 사용하여 다수의 항체 작제물을 생성시켰다. 시험된 다양한 중쇄 불변 영역 중에서, 서열 변화는 놀랍게도 큰 결과를 초래하였다.
예를 들어, 서열번호 4의 가변 중쇄를 CH1, S228P 돌연변이(EU 넘버링)를 갖는 힌지, 인간 IgG4(여기서 IgG4는 N-연결된 글리코실화 모티프 NXS/T를 제거함으로써 비글리코실화됨)의 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역(아스파라긴 잔기 297 또는 트레오닌 잔기 299(EU 넘버링)에서 아미노산 변화를 가짐)에 커플링시키는 것은 열 안정성이 불량하고, 단백질 A 용리 동안 낮은 pH에 노출될 때 침전되는 경향이 있는 항체를 생성시켰다. 놀랍게도, CH1, S228P 돌연변이(EU 넘버링)를 갖는 힌지 및 인간 IgG4의 CH2 및 인간 IgG1의 CH3 영역에 커플링된 CH2 도메인 내의 N297Q 돌연변이(EU 넘버링)를 포함하는 키메라 Fc 영역을 사용하여 서열번호 4의 가변 중쇄 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 인간 카파 경쇄 불변 영역에 부착된 서열번호 11의 가변 경쇄 서열을 포함하는 경쇄를 제조하는 경우, 생성된 항체는 정제 시 침전이 적고, 항체-생산 세포로부터의 항체 생산이 증가하는 것과 상관관계가 있는 증가된 열 안정성을 가졌다. 다시 말해서, 인간 카파 경쇄 불변 영역에 부착된 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄, 및 CH1, S228P 돌연변이(EU 넘버링)를 갖는 힌지 및 인간 IgG1의 CH3 영역에 커플링된 인간 IgG4의 N297Q 돌연변이(EU 넘버링)를 갖는 CH2를 포함하는 키메라 Fc 영역에 부착된 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체는 놀랍게도, 특히 S228P(EU 인덱스 넘버링)을 갖는 비글리코실화된 인간 IgG4와 비교할 때, 더 높은 열 안정성, 항체의 정제 시 더 낮은 침전 및 항체-생산 세포로부터의 더 높은 항체 수율을 가졌다.
실시예 13. 수소/중수소 교환 질량 분광법 및 X-선 결정학에 의해서 결정된 바와 같은 안정화된 효과기-적은 항체의 단백질 입체배좌, 역학 및 구조
구조 및 역학은 단백질의 기능에 크게 기여한다. 근본적인 구조적 메커니즘을 이해하는 것은 관찰된 기능성 효과를 설명하는데 중요하다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 수소/중수소 교환 질량 분광법(HfDX MS) 및 x-선 결정학에 의해 단백질 구조 및 역학에 대한 이미 상세하게 설명된 안정성 이득 돌연변이의 효과를 조사하였다.
A. 수소/중수소 교환 질량 분광법
질량 분광법에 의해서 수소/중수소 교환을 검출하는 것은 단백질 역학 및 형태를 특징규명하기 위한 접근법이다. 단백질 역학/입체배좌는 단백질에서 수소에 대한 중수소의 교환 속도에 영향을 미치므로, 시간 경과에 따른 단백질의 중수소화를 측정하면 단백질 구조가 (예를 들어, 돌연변이로) 변형될 때 입체배좌에 대한 변화를 설명할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명자들의 비글리코실화된 항체 Fc 골격의 수소/중수소 교환에 대한 안정화 돌연변이의 효과를 조사하였다.
(50mM 인산나트륨, 100mM 염화나트륨 H2O, pH 6.0 중의) 항체를 50mM 인산나트륨, 100mM 염화나트륨, D2O, pD 6.0으로 20배 희석시키고, 실온에서 다양한 시간 동안(10초, 1, 10, 60 및 240분) 인큐베이션시켰다. 200mM 인산나트륨, 0.5M TCEP 및 4M 구아니딘 HCl, H2O, pH 2.4로 1:1로 희석시켜 pH를 2.6으로 감소시킴으로써 교환 반응을 켄칭시켰다. 켄칭된 샘플을 nanoACQUITY 플랫폼에 기반한 Waters UPLC 시스템을 사용하여 온라인으로 분해, 탈염 및 분리시켰다. 대략 20p㏖의 교환 및 켄칭된 항체를 고정화된 펩신 칼럼에 주입하였다. 온라인 분해는 0.1nL/분의 유량으로 15℃에서 0.05% 폼산을 함유한 물에서 2분에 걸쳐 수행하였다. 생성된 소화 펩타이드를 0℃에서 유지되는 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7㎛ 펩타이드 트랩(워터스사 (Waters), 미국 매사추세츠주 밀리포드 소재)에 포획하고, 물, 0.05% 폼산으로 탈염시켰다. 유동을 스위칭 밸브에 의해 전환시키고, 포획된 펩타이드를 40㎕/분의 속도로 트랩으로부터 0℃로 유지된 Waters ACQUITY UPLC BEH Cl 8 1.7㎛, 1㎜×100㎜ 칼럼으로 용리시켰다(평균 배압은 대략 9000 psi). 0.05% 폼산을 함유한 6분 선형 아세토나이트릴 구배(8-40%)를 사용하여 펩타이드를 분리시켰다. 용리물을 전기분무 이온화 및 잠금 질량 보정(lock-mass correction)(Glu-피브리노겐 펩타이드 사용)을 사용하여 Waters Synapt 질량분석기로 보냈다. 질량 스펙트럼을 m/z 범위 260 내지 1800에서 획득하였다. Waters IdentityE 소프트웨어의 도움으로 정확한 질량 및 MS/MS의 조합을 사용하여 펩신 단편을 식별하였다. 펩타이드 중수소 수준은 Weis 등이 기재된 바와 같이 Excel 기반 프로그램 HX-Express를 사용하여 결정하였다.
무손상 IgG4.P 대 N297Q IgG4.P, N297Q IgG4.P 대 N297Q IgG4.P-CH2/IgG1-CH3 및 T299A IgG4.P 대 YC406(T299K, T207P, L309K, D399S)에 대한 H/DX-MS 데이터를 상기에 기재된 바와 같이 수집하였다. 무손상(글리코실화된) IgG4와 비글리코실화된 N297Q IgG4의 비교는 비글리코실화된 형태가 더 큰 교환을 나타내는 서열 영역을 나타낸다. 더 많은 H/D 교환이 펩타이드 L235-F241, F241-D249, 1253-V262, V263-F275 및 H310-E318에서 관찰된다. N297Q IgG4.P-CH2/IgG1-CH3 작제물 내의 동일한 펩타이드에 비해 IgG4 펩타이드 M358-L365, T411-V422 및 A431-S442의 더 높은 교환은 N297Q IgG4-CH2와 조합하여 IgG1-CH3으로부터 생성된 안정성 이득을 나타낸다. 이 경우, IgG4로부터의 CH3 도메인은 IgG1-CH3에 비해서 CH3의 3개의 구별되는 영역에서 더 큰 교환을 나타낸다. 마지막으로, 펩타이드 L235-F241, F241-M252, V263-F275, V266-F275 및 V282-F296은, 탈글리코실화로 인해서 특별하게 교환이 더 쉬운 서열 영역에서의 비글리코실화된 IgG4(T299A)에 비해서 돌연변이체 작제물 YC406에 의한 안정성의 이득을 나타낸다. 흥미롭게도, CH3 도메인 내의 D399S 돌연변이는 열 안정성을 약간 증가시키면서, 야생형 서열보다 더 큰 교환을 부여한다. 전반적으로, H/D 교환 MS는 탈글리코실화의 결과로서 입체배좌의 변화가 안정성 돌연변이에 의해 부분적으로 또는 완전히 회복되었음을 나타내었다.
B. 안정성 향상된 Fc 작제물의 X-선 결정학
EAG2476 작제물(agly IgG4-Fc T299K, T307P, L309K, D399S)을 결정화시키고, 데이터를 2.8A 해상도로 수집하였다(데이터 완전성 전체 92%; 고해상도 쉘 66%). 구조를 전자 밀도로 구축하였고, 각각 27.7/33.9%의 R/Rfree로 개선시켰다. 구조는 두 쇄 사이의 편차가 거의 없이 중첩 가능한 비대칭 단위(ASU)의 두 Fc 쇄를 나타낸다. 루프 V266-E272 및 특히 P291-V302는 야생형 IgG4 결정 구조(pdb IADQ)에서 관찰된 것과 상당히 상이하다. 이것은 돌연변이 T299K의 직접적인 결과일 수 있다.
EAG2478 작제물(agly IgG1 Fc T299K)의 결정 구조는 2.5Å 분해능(데이터 완전성 전체 92%; 고해상도 쉘 66%)으로 해석하였다. 구조를 구축하였고, 각각 27.4/35.8%의 R/Rfree로 개선시켰다. EAG2476의 구조와 달리, ASU 내의 두 Fc 쇄는 EAG2478 구조에서 동일하지 않다. 쇄 A는 효소에 의해서 탈글리코실화된 IgG1 Fc (pdb 3DNK)의 구조와 더 유사한 것으로 관찰된다. EAG2478 구조 내의 CH2 도메인은 효소에 의해서 탈글리코실화된 IgG1 Fc(pdb 3DNK) 및 뮤린 비글리코실화된 IgG1 Fc (pdb 3HKF)에서 관찰된 것보다 서로 더 가깝다. CH2 도메인은 EAG2478 구조에서 관찰된 것보다 EAG2476 구조에서 더 개방적이다. 구조는, 두 경우 모두에서 T299K 돌연변이가 도킹된 Fc 감마 III 수용체의 Y129 측쇄를 향하고 있음을 나타내는데, 이는 이 돌연변이에 대해 관찰된 수용체에 대한 감소된 친화도를 설명할 것이다.
실시예 14. 단백질 정제.
서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 안정적으로 발현시키고, 정제시켰다. 생성된 분자를 HP1/2 H1L3 비글리코실 IgG4P/IgG1 키메라 S228P N297Q(카밧 넘버링) 또는 HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3이라고 칭한다.
도 22A는 신호 펩타이드 서열을 포함하여, HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1의 경쇄, 카파 경쇄(H1L3)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 91) 및 아미노산 서열(서열 번호 92)을 나타낸다(신호 펩타이드 서열 및 암호화 DNA은 도 22A에서 굵은 이탤릭체로 나타냄).
도 22B는 신호 펩타이드 서열을 포함하여, HP1/2 hG4P agly(N297Q, EU 넘버링) G1의 경쇄, 중쇄(H1L3)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 93) 및 아미노산 서열(서열 번호 94)을 나타낸다(신호 펩타이드 서열 및 암호화 DNA은 도 22B에서 굵은 이탤릭체로 나타냄).
도 23A는 경쇄(상단) 및 중쇄(하단) 둘 다에 대한 신호 서열(밑줄 그은 텍스트)을 포함하여, HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1, 카파 경쇄(H1L3)의 아미노산 서열을 포함한다.
도 23B는 HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1의 아미노산 서열, 서열번호 81의 성숙 경쇄 및 서열번호 80의 성숙 중쇄를 갖는 카파 경쇄(H1L3)를 포함한 도면. 도 23B에서, 경쇄 내의 상보성 결정 영역(CDR) 서열(아미노산 잔기 24-34, 50-56 및 89-97) 및 중쇄 내의 상보성 결정 영역(CDR) 서열(잔기 28-35, 50-66 및 99-110)을 밑줄로 나타낸다.
발열원이 없는 용기 및 용액을 정제 공정 전반에 걸쳐 사용하였다. 정제 공정을 실온에서 수행하였다.
HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3을 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 안정적으로 발현시키고, 정제시켰다.
정제를 위해, 약 10g의 HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3(Octet에 의해 추정된 역가: 1310㎎/ℓ)을 함유하는 7.5L의 CHO 배지를 400㎖ rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE 17-1279-04, id 50㎜)에 25mM 인산나트륨, pH 7.0, 0.1M NaCl에서 40 내지 120㎖/h로 로딩하였다. 칼럼을 4 x 400㎖의 동일한 완충액으로 세척한 다음 3 x 400㎖의 25mM Na2HPO4, pH 5.5, 0.1M NaCl로 세척하였다. HP1/2 hG4P agly (N297Q) G1 H1L3을 1000㎖의 25mM 인산나트륨(pH 2.8, 0.1M NaCl)으로 용리시키고, pH를 25mM 인산나트륨(pH 8.6)으로 중화시켰다. 샘플을 Thermo Scientific Nalgene 필터로 0.2μ 여과시키고, 4℃에 저장하였다. 용리된 샘플의 단백질 함량(1㎎/㎖ HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3에 대해 계산된 흡광 계수 = 1.49)을 280nm에서 값을 보고하는 NonoDrop 2000 분광광도계를 사용하여 흡광도 스펙트럼으로부터 추정하였다.
rProtein A 용리된 풀을 10mM 인산나트륨, pH 7.0, 0.1M NaCl 중의 150㎖ TMAE 칼럼(EMD 1.16881.0500, i.d. 50㎜)에 로딩하였다. 관통액을 수집하고, SDS-PAGE로 확인하였다. 샘플을 농축시키고, Millipore Pellicon-2 한외여과 장치를 사용하여 25mM 인산나트륨(pH 7.0, 25mM NaCl)으로 완충액을 교환시키고, 25mM 인산나트륨(pH 7.0, 25mM NaCl)에서 동일한 TMAE 칼럼에 재로딩하였다. 관통액을 수집하고, 514㎖ 샘플에 15.24㎖의 4M NaCl을 첨가하여 140mM NaCl로 조정한 다음, Thermo Scientific Nalgene 필터로 0.2μ 여과시키고, 분취하여 -80℃에 저장하였다. 이론 수율의 96%를 나타내는 9,384㎎의 HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3이 생성되었다.
실시예 15. 단백질 특징규명.
실시예 14에 기재된 단백질을 하기에 논의된 바와 같은 몇몇 상이한 방법을 통해 특징규명하였다.
A. UV 스펙트럼
도 24는 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 UV 스펙트럼을 제공한다. HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3(RS)의 UV 스펙트럼을 NonoDrop 2000 분광광도계에서 25mM 인산나트륨(140mM NaCl, pH 7.0) 중에서 희석되지 않은 샘플에서 직접 측정하였다. 17.74㎎/㎖의 단백질 농도는 계산된 흡광 계수 ε280 0.1% = 1.49/㎝를 사용하여 결정되었다.
B. 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
도 25는 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3의 분취물은 환원된 샘플의 경우 DTT를 함유한 샘플 완충액 또는 비-환원된 샘플의 경우 DTT를 함유하지 않는 샘플 완충액에서 준비하였다. SDS-PAGE를 인비트로젠사(Invitrogen)로부터의 4 내지 20% 폴리아크릴아마이드 구배 겔 상에서 전개시키고, 겔을 Simply Blue 염색제(인비트로젠사)로 염색하고, 증류수로 탈염색하였다. 도 25는 HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3(RS)의 분석 결과를 나타낸다. 환원 조건 하에서, 겔은 각각 HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3의 중쇄 및 경쇄의 예상 분자량, 50 및 25kDa을 나타내는 두 개의 밴드를 나타낸다. 비-환원 조건에서, 주요 밴드는 항체의 HC2LC2 사량체 구조에 대해 150kDa의 예상 분자량을 갖는다. 샘플은 0.5% 미만의 고분자량 형태를 함유한다.
C. 등전점 포커싱(Isoelectric Focusing: IEF)
도 26은 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 IEF의 결과를 도시한다. 샘플을 IEF 샘플 완충액 3 내지 10에서 준비하고, Novex pH 3-10 IEF Gel(써모 피셔사 EC66552BOX)을 130V 전류에서 92분 동안 전개시켰다. 겔을 12% TCA로 10분 동안 고정시키고, 겔을 Simply Blue 염색제(인비트로젠사)로 염색하고, 증류수로 탈염색하였다. HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 RS는 단일 주요 밴드 및 몇몇 사소한 아세트산 변이체로서 전개된다. 계산된 pI는 HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3의 경우 6.22이다. 도 26은 또한 CHO DG44i 세포에서 발현된 동일한 작제물, 야생형 IgG4P Fc 및 IgG4PE Fc에 융합된 2개의 다른 HP1/2 H1L3 작제물을 도시한다. 분자의 겔 이동성은 분자의 다른 pI 값과 일관된다. 레인 명칭에 모든 샘플에 대해 계산된 pI가 존재함을 주목하기 바란다.
D. 분석 크기 배제 크로마토그래피
도 27은 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 분석 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 도시한다. 20㎍의 연구 표준품을 20xPBS(써모 사이언티픽사 28348)로부터 희석된 PBS(10mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.5)에서 0.2㎖/분의 유량으로 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 Superdex 200 Increase 5/150 GL 칼럼(GE 28-9909-45)에서 전개시켰다. 용리물의 흡광도를 280nm에서 모니터링하였고, 도 27에 도시한다. HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3은 7.8분에 단일 피크로 용리되었고, 어떠한 검출 가능한 응집물 또는 저분자량 성분도 존재하지 않았다.
E. 내독소
제조사의 지침에 따라 Charles River Endosafe PTS20 카트리지(0.05 내지 5EU/㎖)를 사용하여 내독소를 결정하였다. 연구 표준품에서 발견된 내독소 수준은 NHP 주입에 적합한 0.06EU/㎎ 미만이었다.
F. 시차 주사 열량측정법(DSC)
도 28 내지 도 30은 서열번호 81의 성숙 경쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND001의 성숙 경쇄) 및 서열번호 80의 성숙 중쇄(HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 ND004/ND006의 성숙 중쇄)를 갖는 단백질의 DSC의 결과를 도시한다. HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 연구 표준품을 PBS 중에서 약 1 ㎎/㎖로 희석시키고, 이어서 약 20시간 동안 4℃에서 PBS에 대해 투석시켰다. 샘플당 대략 400㎍(400㎕)을 96웰 플레이트에 첨가하였다. 향상된 피크 분해능을 위해 중간 피드백 모드를 사용하여 2℃/분으로 20 내지 120℃에서 스캔을 수행하였다. MicroCal DSC 기기를 사용하여 각각의 도메인에 대해 Tm 값(단백질 분자의 50%가 동적 비-가역적 2-상태 평형 상태에서 언폴딩되는 상전이 온도)을 측정하였다. 차감에 대한 기준선을 정의하기 위해 2회의 완충액 스캔을 수행하고, Origin 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 비교를 위해 HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 Fc 단편(배취 BJG2018-1-3-0088-E2)의 샘플을 또한 분석하였다. Fab 도메인에 대한 배정의 검증으로서, 연구 표준품의 Fab2 단편을 생성시키고, 분석하였다. HP1/2 hG4P agly(N297Q) G1 H1L3 무손상 항체, Fc 및 Fab2 단편에 대한 용융 곡선을 도 28, 도 29 및 도 30에 각각 도시하고, 도메인 용융 온도(Tm)를 표 11에 요약한다. Tm 값에 기초하여, 무손상 항체에서 항체의 G4P CH2 도메인은 59.6℃의 상전이 온도에서 가장 덜 안정적이었고, Fab 도메인은 69.1℃에서 그리고 G1 CH3 도메인은 85.9℃에서 덜 안정적이었다. 항체의 G4P CH2 도메인에 대한 Tm 값은 단리된 Fc 단편에서 57.4℃이고, G1 CH3 도메인은 84.5℃였다. Fab2 단편의 경우 Fab 도메인의 Tm은 69.4℃였다.
실시예 16. 단백질의 추가 실험 분석.
2개의 상이한 HP1/2 단백질의 생성물 속성을 탐색하였다. 제1 작제물인 인간화된 HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q EU 넘버링)/IgG1 키메라 또는 HP1/2 G4P agly/G1은 서열번호 81의 성숙 경쇄 및 서열 번호 80의 성숙 중쇄를 포함한다. 제2 작제물인 인간화된 HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly (T299A EU 넘버링) 또는 HP1/2 G4P agly는 서열번호 81의 성숙 경쇄 및 서열 번호 89의 성숙 중쇄를 포함한다. HP1/2의 2개의 조작된 버전을 설계하고, 발현시키고, 정제시키고, 특징규명하였다. 작제물을 CHO 세포에서 일시적으로 발현시켰다.
상기 표(Octet에 의해 추정된 역가)에 언급된 바와 같이, 72 내지 122㎎/ℓ의 작제물을 함유하는 900㎖의 CHO 배지를 9㎖ rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE 17-1279-04) 상에서 중력으로 로딩하였다. 칼럼을 6×5㎖의 25mM 인산나트륨 (pH 7.0, 0.1M NaCl)으로 세척한 다음, 6×4㎖의 25mM 인산나트륨(pH 5.5, 0.1M NaCl)으로 세척하였다. mAb를 7×5㎖의 25mM 인산나트륨(pH 2.8, 0.1 M NaCl)로 용리시켰다. pH를 인산나트륨(pH 8.6)을 첨가하여 최종 농도가 20mM이 되도록 중화시켰다. 다양한 양의 침전물이 관찰되었다. 샘플을 3000rpm에서 5분 동안 원심분리시키고, 상청액을 여과하고, 분취하고, -70℃에서 저장하였다. 중화 전 그리고 중화-원심분리-여과 단계 후에 280nm에서 값을 보고하는 NonoDrop 2000 분광광도계를 사용하여 흡광도 스펙트럼으로부터 용리된 샘플의 단백질 함량을 추정하였다.
ProA 단계 후 4개의 항체 제제를 중화시켰을 때, 침전으로 인해 손실된 단백질의 양에 큰 차이가 있었다(하기 표 13 참고). HP1/2 G4P agly G1 버전은 침전으로 인해 생성물의 3% 만 손실되면서, 작제물의 더 양호한 거동을 나타내었다.
상기 표 13에 나타낸 바와 같이, 가장 유의한 것은 나탈리주맙 G4P agly 샘플을 중화시켰을 때 나타나는 생성물의 39% 손실이었다. 대조적으로, 상응하는 HP1/2 작제물(HP 1/2 G4P agly)의 1/3(13%)만 침전으로 인해 손실되었다. HP1/2 G4P agly G1 버전은 침전으로 인해 생성물의 3%만 손실되면서, 작제물의 가장 양호한 거동을 나타내었다.
원심분리 및 여과 후 4개의 작제물 샘플의 가용성 분획을 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 특징규명하였다. SDS-PAGE(도 31)는 IgG 항체의 사량체 2-중쇄, 2-경쇄 복합체 특징의 존재와 일관된, 4개의 샘플 모두에 대해 약 150kDa의 단일의 우세한 분자량 밴드를 나타냈다. HP1/2 샘플과 나탈리주맙 샘플 간의 분명한 차이는, 두드러진 밴드에서부터 겔의 상단까지 전개된 나탈리주맙 샘플에서 고분자량 부가물의 확산 도말이 존재한다는 것인데, 이는 가용성 응집물의 존재를 나타낸다.
도 32A는 HP1/2 샘플의 SEC 분석의 결과를 도시한다. 도 32B는 4개의 모든 작제물의 SEC 분석의 결과를 도시한다. 샘플을 PBS(10mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH 7.5) 중에서 0.2㎖/분의 유량으로 Superdex Increase 5/150 GL 칼럼(GE 28-9909-45) 상에서 전개시켰다. 4개의 샘플의 SEC 분석은 겉보기 분자량이 약 150kDa인 모든 샘플에서 단일 주요 피크를 나타냈다(도 32A 및 도 32B).
따라서, SDS-PAGE 데이터와 일관되게, SEC 분석은 HP1/2 샘플에서 검출되지 않았거나 또는 크게 감소되지 않은 주요 피크 이전에 용리되는 나탈리주맙 샘플에서 고분자량 가용성 응집물을 나타내었다. 이러한 분석과 함께, 나탈리주맙 샘플은 가용성 및 불용성 응집물을 함유하였는데, 이는 HP1/2 샘플에서 인지되는 것보다 불량한 수율 및 낮은 순도로 이어졌다.
2개의 HP1/2 샘플을 또한 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 안정성에 대해 특징규명하였다. 도 33a 및 도 33b는 인간화된 HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q) /IgG1 키메라(HP1/2 G4P agly G1, 좌측) 및 인간화된 HP1/2 G1/L3 huIgG4P agly(T299A)(HP1/2 G4Pagly, 우측)의 DSC 결과를 도시한다. 2개의 HP1/2 샘플을 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 안정성에 대해 특징규명하였다. Tm 값을 MicroCal DSC 기기를 사용하여 각각의 도메인에 대해 결정하였다. 스캔을 2℃/분으로 20 내지 120℃에서 수행하였다. 각각의 도메인에 대해 Tm 값(단백질 분자의 50%가 동적 비-가역적 2-상태 평형 상태에서 언폴딩되는 상전이 온도)을 측정하였다. 예상된 바와 같이, 두 작제물이 동일한 Fab 영역(69℃) 및 비글리코실 CH2 도메인(약 60℃)을 함유하기 때문에 열전이 다수가 동일하다.
HP1/2 G4P agly G1 버전의 CH3 도메인은 약 85℃의 Tm으로부터 명백한 바와 같이 매우 안정적인 반면, HP1/2 G4Pagly 버전의 CH3 도메인은 단지 약 69℃의 Tm을 가졌다.
다시 말해서, HP1/2 G4P agly G1(즉, 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 포함)은 HP1/2 G4Pagly 항체에 비해 우수한 안정성을 가졌다.
실시예 17: HP1/2의 임상 약동학 및 제1 인간 용량 예측
임상 입력의 역번역 통합을 사용하여 임상 약동학 및 약력학에 관한 예측의 신뢰도를 높일 수 있다. 본 실시예에서, 이러한 기술은 사용하여 나탈리주맙(NTZ)과 동일한 알파 4 에피토프 서브클레스인, 재조합, 인간화된 항-알파-4 인테그린 항체, HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q, EU 넘버링)/IgG1 키메라(본 실시예에서 "HP1/2" 또는 "BIIB107"이라고 지칭됨)의 임상 약동학 및 약력학을 조사하였다. 전체론적 데이터 통합을 사용하여 HP1/2 인간 약동학(PK) 및 효능이 있는 용량 예측에 대한 예측성 및 신뢰도를 증가시켰다.
HP1/2(3 및 30㎎/㎏) 및 NTZ(3㎎/㎏)의 단일 IV 용량을 시노몰거스 원숭이(n = 18)에게 투여하였다. PKPD 분석을 위해서 18마리의 시노몰거스 원숭이로부터 총 180개의 혈청 농도(60 NTZ, 120 HP1/2) 및 252 PD(RO) 측정치(84 NTZ, 168 HP1/2)가 사용 가능하였다. 시노몰거스 원숭이에서 3 내지 30㎎/㎏의 HP1/2 및 3㎎/㎏의 나탈리주맙(Tysabri)의 단일 IV 볼러스 투여 후 관찰된 PK 평균 시간 경과를 도 34에 나타낸다. 항-VLA의 투여 후, 유리 수용체는 시노몰거스 원숭이에서 Tysabri와 BIIB107 둘 다에 의해 90% 초과의 수용체 점유율을 나타내는 기준선의 10% 미만으로 감소되었다(도 35 참고). 유리 VLA 수용체는 약 500시간(21일)에 서서히 투여전 수준으로 복귀되었다. HP1/2는 동일한 용량(3㎎/㎏)에서 나탈리주맙(100 시간)과 비교할 때 더 긴 기간(최대 300시간) 동안 VLA 수용체를 포화(> = 90%)시키는 것으로 보이며, 이는 HP1/2의 더 높은 효력을 나타낸다. 특히, HP 1/2 용량(30㎎/㎏)이 높을수록 수용체 결속이 약 2배 더 길어졌고, 그 수준은 800시간 후에 기준선으로 복귀되었다.
약물-결합된 VLA의 형성에 대한 EC50(표 14 참고)은 Tysabri(6.40ug/㎖)과 비교할 때 HP1/2(4.73ug/㎖)에 대해 비교적 더 낮았는데, 이는 HP1/2의 더 큰 효력을 나타낸다.
이들 데이터는 HP1/2가 인간 수용체에 대한 결합보다 대략 5배(무손상 HP1/2) 및 대략 6배(Fab 단편) 더 약한 친화도로 시노몰거스 원숭이 알파-4 인테그린에 결합한다는 것을 나타낸다. 나탈리주맙은 그대로 인간 알파-4 인테그린보다 시노몰거스 알파-4 인테그린에 약 2배 더 약하게 결합하는 반면, Fab 결합은 두 종 간에 동일하다. 이러한 데이터는 또한 HP1/2가 나탈리주맙보다 더 높은 친화도로 인간 알파-4 인테그린에 결합한다는 것을 나타낸다. 다시 말해서, 그대로 비교하면 대략 5배 정도 차이가 있고, Fab 단편을 비교하면 대략 6배 차이가 존재하고; 그리고 HP1/2와 나탈리주맙 Fab 단편 간에는 19배 초과의 차이가 존재한다. 이러한 마지막 비교는 나탈리주맙이 생체내에서 Fab 아암 교환(스크램블링)을 겪고, 그것이 기능적으로 1가가 되는 것으로 공지된 야생형 IgG4이기 때문에 중요하다. 이에 반해서, HP1/2는 힌지를 안정화시키고, 스크램블링을 방지하는 점 돌연변이(S228P, EU 넘버링)를 함유하기 때문에 생체내에서 2가로 유지된다. PD 반응을 모델링하려는 목적을 위해서, 따라서 하기 식에서 나탈리주맙 Fab 단편의 Kd 및 HP1/2 그대로의 Kd를 사용하는 것이 적절하다.
도 36에 도시된 바와 같이, 인간 및 시노몰거스 원숭이 림프구에서의 알파-4 인테그린의 발현은 2배 차이인 것을 발견하였고, 인간 HP1/2 예측에 대해 조정이 필요하지 않았다.
선형 및 마이클리스-멘텐 제거(Michaelis-Menten elimination) 둘 다를 사용한 2-구획 모델 및 직접 Emax 모델을 사용하여 원숭이에서 NTZ 및 HP1/2 혈청 농도와 알파-4 인테그린 포화도(수용체 점유율(RO)) 간의 PKPD 관계를 특징규명하였다. 원숭이 PK 매개변수(k10, k12, k21 및 V1)에 대한 동종 스케일링(allometric scaling)을 통해 HP1/2 인간 PK를 예측하였다(문헌[Singh, A. P et al. The AAPS Journal, 17(2), 389-399] 참고). 접근법의 적절성을 보장하기 위해서, 원숭이 및 인간에서 얻어진 NTZ PK 매개변수를 사용하여 각각의 체중에 대한 인간 매개변수와 원숭이 매개변수 간의 비율의 로그를 취하여 감도 분석을 수행하였다. 고유한 원숭이 매개변수는 Km, Vmax 및 PD 매개변수(Emax, EC50, E0 및 V1)를 포함하여 인간에게 직접 적용되었다. 인간에서 HP1/2의 EC50은 인간에서 시험관내 결합 친화도(Kd) 및 NTZ EC50을 사용하여, 원숭이에서의 비교 PKPD 연구에서 수집된 데이터에 기초하여 예측되었다(문헌[uralidharan, K. K. et al. Journal of Clinical Pharmacology, 57(8), 1017-1030]). 데이터를 종 간 효력(Kd) 차이를 조정한 후, 원숭이(m)와 인간(h)에서 얻어진 EC50 매개변수 값을 조합한 경험적 스케일링 접근법을 사용하여 통합하였다:
최종 "인간화된"모델로부터의 PKPD 매개변수 값은 PKPD 모델로부터의 추정치의 공분산 매트릭스 및 모집단 매개변수 추정치로 설정된 평균 벡터를 갖는 다변량 정규 분포로부터 생성된 분포로서 전파되었다. Cmax에서 10% 이하의 평균 RO 생성시키는 용량을 선택하여 HP1/2의 최소 예상 생물학적 유효 수준(minimal anticipated biological effective level: MABEL) 용량을 한정하였다.
HP1/2 및 나탈리주맙의 수용체 점유 대 시간 프로파일을 단일 IV 투여 후 모의실험하였다(도 37A 내지 도 37D). 4주마다 투여된 0.5㎎/㎏의 단일 용량이 효능이 있을 것으로 예상되며, 대략 투여 후 약 1개월 후 기준선으로 복귀하기 시작하는 준치료 점유 수준(<70%)이 존재한다. HP1/2와 NTZ 둘 다는 표적-매개 약물 배치와 함께 PK 프로파일을 나타내었고, 원숭이에서 용량-의존적 RO를 나타내었다. 약물-결합된 알파-4 형성에 대한 EC50 값은 NTZ(2.51ug/㎖)와 비교할 때 HP1/2(0.62ug/㎖)에 대해 더 낮을 것으로 예상된다(문헌[Muralidharan, K. K. et al. Journal of Clinical Pharmacology, 57(8), 1017-1030] 참고). 예측된 NTZ 인간 PK 프로파일과 관찰된 NTZ 인간 PK 프로파일 간에 전반적으로 양호한 일치가 존재하는데, 이는 HP1/2 임상 PK를 계획하는 동종 스케일링 접근법의 적절성을 뒷받침한다. 인간에서 HP1/2의 MABEL은 0.0004㎎/㎏인 것으로 예측된다(NTZ의 경우 약 0.003㎎/㎏과 비교하여, 도 38 참고).
이 실시예 17의 관점에서, 2개의 인간화된 항-알파-4 인테그린 항체에 걸친 이용 가능한 PKPD 데이터의 통합은 최소 예상 생물학적 유효 수준 용량을 식별하기 위해서 수용체 점유율 및 인간 약동학을 추정하기 위한 역번역 모델링 접근법의 사용을 가능하게 하였다.
상기에 기재된 본 발명의 실시형태는 단지 예시이도록 의도되며; 다수의 변화 및 변경이 당업자에게 자명할 것이다. 모든 이러한 변화 및 변형은 임의의 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범주에 포함되도록 의도된다.
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Trp
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus spretus
<400> 6
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro
100
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 8
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20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 9
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 10
Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
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100 105
<210> 11
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 11
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Lys Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Thr Ser Leu Arg Pro
65 70 75 80
Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Lys Val Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Lys Val Gly Phe Asn Arg
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Lys Val Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 14
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 15
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Asp Ala Ser Gly Phe Gln Pro Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr
85 90 95
Ile Thr Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Tyr Glu Lys Val Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Lys Val Gly Phe Asn
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 16
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 17
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Phe Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 18
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly
225
<210> 19
<211> 306
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Phe
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
245 250 255
Ser Cys Ser Phe Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
260 265 270
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Phe Met
275 280 285
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290 295 300
Leu Gly
305
<210> 20
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly
225
<210> 21
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Phe
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly
225
<210> 22
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly
225
<210> 23
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Phe Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
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<213> Homo sapiens
<400> 40
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Pro Gly
225
<210> 41
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ala Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Pro Gly
225
<210> 42
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Pro Gly
225
<210> 43
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly
225
<210> 44
<211> 230
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
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210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 45
<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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165 170 175
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
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50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 47
<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
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1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Leu Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Asn Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
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180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
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210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 48
<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Thr Asp Phe Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
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210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 49
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Pro Asp Pro Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
65 70 75 80
Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
130 135 140
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145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Gly
225
<210> 50
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Leu Val
35 40 45
Thr Asp Val Ser Pro Asp Pro Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Gly
225
<210> 51
<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Leu Val
35 40 45
Thr Asp Phe Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 52
<211> 444
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 53
<211> 218
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 54
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
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165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
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195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215
<210> 55
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 56
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Leu Ser Leu Gly
225
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<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ala Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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225
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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195 200 205
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Leu Ser Pro
225
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<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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195 200 205
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<211> 447
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
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420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<213> Homo sapiens
<400> 64
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Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
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Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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<210> 65
<211> 228
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<211> 231
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<400> 76
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195 200 205
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 77
<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
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<210> 78
<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
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275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Ala Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 90
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 91
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized DNA sequence
<400> 91
atggacttcg gcctgtccct ggtgttcctg gtgctgatcc tgaagggcgt gcagtgcagc 60
atcgtgatga cccagagccc cgacagcctg gccgtgagcc tgggcgagcg cgccaccatc 120
aactgcaagg ccagccagag cgtgaccaac gacgtggcct ggtatcagca gaagcccggc 180
cagcccccca agctgctgat ctactacgcc agcaaccgct acaccggcgt gcccgaccgc 240
ttcagcggca gcggctacgg caccgacttc accttcacca tcagcagcct ccaggccgag 300
gacgtggcca cctacttctg ccagcaagac tacagcagcc cctacacctt cggccagggc 360
accaaggtgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggcaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagctccac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
tcctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aa 702
<210> 92
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 92
Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val
20 25 30
Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val
35 40 45
Thr Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser
100 105 110
Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 93
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA sequence
<400> 93
atggatatgc gcgtgcctgc ccaacttctc ggacttctcc tcctttggct gcctggagcc 60
cgatgtgagg tgcagctggt gcagagcggc gccgaggtga agaagcccgg cgccaccgtg 120
aagatcagct gcaaggccag cggcttcaac atcaaggaca cctacatgca ctgggtgcag 180
caggcccccg gcaagggcct ggagtggatg ggccgcatcg accccgccag cggcgacacc 240
aaatacgacc ccaagttcca agtccgggtg accatcaccg ccgacaccag caccgacacc 300
gcctacatgg agctgagcag cctgcgcagc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccgac 360
ggcatgtggg tcagcaccgg ctacgccctg gacttctggg gccagggcac cctggtgacc 420
gtctcgagcg ctagtaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctcccggagc 480
acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaacctgtg 540
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600
caatcctcag gactctactc cctctcttcc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660
acgaagacct acacctgtaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 720
gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca ccttgcccag cacctgagtt cctgggggga 780
ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcactt gcgtggtggt ggatgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gtttaactgg 900
tacgtggatg gcgtggaagt ccacaatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttccaa 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aagactggct gaacggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc gcgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtctc gctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc ctccgacatt 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ttggactccg acggctcctt ctttctctac tccaaactca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
caaaaaagcc tctccctcag cccgggctga 1410
<210> 94
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 94
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr
65 70 75 80
Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr
85 90 95
Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr
115 120 125
Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
145 150 155 160
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
210 215 220
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
340 345 350
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly
465
Claims (65)
- 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편으로서,
(a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄;
(b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄;
(c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및
(d) 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계(Kabat numbering scheme)에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄
를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편. - 제1항에 있어서, 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편으로서,
(a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄;
(b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄;
(c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및
(d) IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 힌지, CH1 도메인 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역으로서, 상기 키메라 Fc 영역은 상기 CH2 영역 내의 297번 EU 넘버링 위치(314번 카밧 넘버링 위치)에서 글루타민(Q)으로의 치환; 상기 힌지 영역 내의 228번 EU 넘버링 아미노산 위치(241번 카밧 넘버링 위치)에서 프롤린(P)으로의 치환; 및 상기 CH3 영역 내의 447번 EU 넘버링 위치(478번 카밧 넘버링 위치)에서 라이신(K)의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 키메라 Fc 영역
을 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편. - 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 단편은 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 상기 IgG4 아이소타입의 IgG 항체의 힌지, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역으로서, 상기 Fc 영역은 297번 EU 넘버링 위치(314번 카밧 넘버링 위치)에서 비-아스파라긴 잔기로의 치환을 포함하거나 이것으로 이루어지는, 상기 Fc 영역을 포함하는 항체와 비교할 때 증가된 열 안정성을 갖는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편으로서, (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편.
- 제7항에 있어서, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편.
- 제7항에 있어서, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개의 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 제7항에 있어서, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 다음 돌연변이 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실을 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편.
- 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편으로서,
(a) 서열번호 80의 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b) 서열번호 81의 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편. - 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 단백질은,
(a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄;
(b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄;
(c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및
(d) 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄
를 포함하는, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. - 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 단백질은,
(a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄;
(b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄;
(c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및
(d) 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄
를 포함하는, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. - 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 단백질은,
(a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄;
(b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄;
(c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및
(d) IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 힌지, CH1 도메인 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역으로서, 상기 키메라 Fc 영역은 상기 CH2 영역 내의 297번 EU 넘버링 위치(314번 카밧 넘버링 위치)에서 글루타민(Q)으로의 치환; 상기 힌지 영역 내의 228번 EU 넘버링 아미노산 위치(241번 카밧 넘버링 위치)에서 프롤린(P)으로의 치환; 및 상기 CH3 영역 내의 447번 EU 넘버링 위치(478번 카밧 넘버링 위치)에서 라이신(K)의 결실을 포함하는, 상기 키메라 Fc 영역
을 포함하는, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. - 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 단백질은, (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 단백질은, (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 단백질은,
(a) 서열번호 80의 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b) 서열번호 81의 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드. - 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법. - 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법. - 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 힌지, CH1 도메인 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역으로서, 상기 키메라 Fc 영역은 상기 CH2 영역 내의 297번 EU 넘버링 위치(314번 카밧 넘버링 위치)에서 글루타민(Q)으로의 치환; 상기 힌지 영역 내의 228번 EU 넘버링 아미노산 위치(241번 카밧 넘버링 위치)에서 프롤린(P)으로의 치환; 상기 CH3 영역 내의 447번 EU 넘버링 위치(478번 카밧 넘버링 위치)에서 라이신(K)의 결실을 포함하는, 상기 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법. - 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법. - 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법. - 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 80의 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 중쇄; 및 (b) 서열번호 81의 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 경쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법. - 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다발성 경화증은 다발성 경화증의 재발 형태인, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법.
- 제24항에 있어서, 다발성 경화증의 상기 재발 형태는 임상 단독 증후군(clinically isolated syndrome), 재발 경감 다발성 경화증(relapsing remitting multiple sclerosis) 또는 활성 2차 진행성 다발성 경화증(active secondary progressive multiple sclerosis)인, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법.
- 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다발성 경화증은 1차 진행성 다발성 경화증(primary progressive multiple sclerosis) 또는 진행성 재발 다발성 경화증인, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법.
- 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다발성 경화증은 다발성 경화증의 활성 재발 형태를 포함하는, 다발성 경화증의 활성 형태인, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법.
- 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 인간인, 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 증상을 완화시키는 방법.
- (a) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이드; 및
(b) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포. - (a) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 상기 폴리뉴클레타이드; 및
(b) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포. - (a) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 힌지, CH1 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역으로서, 상기 키메라 Fc 영역은 상기 CH2 영역 내의 297번 EU 넘버링 위치(314번 카밧 넘버링 위치)에서 글루타민(Q)으로의 치환; 상기 힌지 영역 내의 228번 EU 넘버링 아미노산 위치(241번 카밧 넘버링 위치)에서 프롤린(P)으로의 치환; 및 상기 CH3 영역 내의 447번 EU 넘버링 위치(478번 카밧 넘버링 위치)에서 라이신(K)의 결실을 포함하는, 상기 키메라 Fc 영역을 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
(b) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포. - (a) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
(b) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포. - (a) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
(b) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포. - (a) 서열번호 80의 서열을 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 서열번호 81의 서열을 포함하는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포.
- 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포인, 숙주 세포.
- 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편을 제조하는 방법으로서, (a) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이되, 상기 폴리뉴클레오타이드는 세포에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드, 및 (b) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이되, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포를 제공함으로써 수행되는, 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편을 제조하는 방법.
- 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법으로서, (a) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이되, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 뉴클레오타이드 및 (b) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포를 제공함으로써 수행되는, 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법.
- 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법으로서, (a) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 힌지, CH1 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역으로서, 상기 CH2 영역 내의 297번 EU 넘버링 위치(314번 카밧 넘버링 위치)에서 글루타민(Q)으로의 치환; 상기 힌지 영역 내의 228번 EU 넘버링 아미노산 위치(241번 카밧 넘버링 위치)에서 프롤린(P)으로의 치환; 및 상기 CH3 영역 내의 447번 EU 넘버링 위치(478번 카밧 넘버링 위치)에서 라이신(K)의 결실을 포함하는 상기 키메라 Fc 영역을 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이되, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드; 및
(b) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드를 제공함으로써 수행되는, 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법. - 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법으로서, (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이되, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포를 제공함으로써 수행되는, 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법.
- 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법으로서, (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이되, 상기 뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포를 제공함으로써 수행되는, 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법.
- 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법으로서,
(a) 서열번호 80의 서열을 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드; 및
(b) 서열번호 81의 서열을 포함하는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
상기 형질주입된 숙주 세포를 배양하여 상기 재조합 항-α4 항체 분자 또는 이의 α4 결합 단편를 생산하는 단계에 의해서 수행되는, 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편의 제조 방법. - 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포인, 재조합 항-α4 항체 또는 이의 α4-결합 단편을 제조하는 방법.
- 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편으로서,
(a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄;
(b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄;
(c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82);
(d) 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄
를 포함하되;
(e) 상기 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편은 야생형 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체 또는 결합 단편에 비해서 스크램블링(scrambling)에 대해서 감소된 민감성을 갖는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편. - 제43항에 있어서, 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 제43항에 있어서, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 제43항에 있어서, 인간 IgG1의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편으로서,
(a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄;
(b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄;
(c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82);
(d) IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 힌지, CH1 도메인 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역으로서, 상기 키메라 Fc 영역은 상기 CH2 영역 내의 297번 EU 넘버링 위치(314번 카밧 넘버링 위치)에서 글루타민(Q)으로의 치환; 상기 힌지 영역 내의 228번 EU 넘버링 아미노산 위치(241번 카밧 넘버링 위치)에서 프롤린(P)으로의 치환; 상기 CH3 영역 내의 447번 EU 넘버링 위치(478번 카밧 넘버링 위치)에서 라이신(K)의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 키메라 Fc 영역
을 포함하되;
(e) 상기 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편은 야생형 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체 또는 결합 단편에 비해서 스크램블링에 대해서 감소된 민감성을 갖는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편. - 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 단편은 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 상기 IgG4 아이소타입의 IgG 항체의 힌지, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역으로서, 상기 Fc 영역은 297번 EU 넘버링 위치(314번 카밧 넘버링 위치)에서 비-아스파라긴 잔기로의 치환을 포함하거나 이것으로 이루어지는, 상기 Fc 영역을 포함하는 항체와 비교할 때 증가된 열 안정성을 갖는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편으로서, (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하되; (e) 상기 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편은 야생형 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체 또는 결합 단편에 비해서 스크램블링에 대해서 감소된 민감성을 갖는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편.
- 제49항에 있어서, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편.
- 제49항에 있어서, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개의 돌연변이를 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 알파 4-결합 단편.
- 제49항에 있어서, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄는 카밧 넘버링 체계에 따라서 다음 돌연변이 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실을 포함하는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편.
- 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편으로서,
(a) 서열번호 80의 서열을 포함하는 중쇄;
(b) 서열번호 81의 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하되;
(c) 상기 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편은 야생형 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체 또는 결합 단편에 비해서 스크램블링에 대해서 감소된 민감성을 갖는, 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파 4-결합 단편. - 야생형 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체 또는 결합 단편에 비해서 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파-4 결합 단편의 스크램블링에 대한 민감성을 감소시키는 방법으로서,
(a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
상기 인간 IgG4의 불변 중쇄에 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P, 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 도입하는 단계
를 포함하는, 방법. - 야생형 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체 또는 결합 단편에 비해서 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파-4 결합 단편의 스크램블링에 대한 민감성을 감소시키는 방법으로서,
(a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄 및 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82)를 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
상기 인간 IgG4의 불변 중쇄에 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개의 돌연변이를 도입하는 단계
를 포함하는, 방법. - 야생형 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체 또는 결합 단편에 비해서 스크램블링에 대해서 감소된 민감성을 갖는 재조합 항-알파 4 항체 또는 이의 알파-4 결합 단편을 생산하는 방법으로서,
(a) 서열번호 80의 서열을 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 서열번호 81의 서열을 포함하는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에서의 발현을 위해서 배치된, 상기 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
상기 형질주입된 숙주 세포를 배양하여 상기 재조합 항-α4 항체 분자 또는 이의 α4 결합 단편를 생산하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포인, 방법.
- 뇌전증(epilepsy)을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법. - 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG1의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S127C, K129R, G135E, G136S, Q203K, I207T, N211D, K222R, P227S, S232Y, C233G, D234의 결실, K235의 결실, T236의 결실, H237P, T238P, L247F, H281Q, K287Q, Y313F, N314Q, A346G, A349S, P350S 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개 또는 적어도 12개 또는 적어도 13개 또는 적어도 14개 또는 적어도 15개 또는 적어도 16개 또는 적어도 17개 또는 적어도 18개 또는 적어도 19개 또는 적어도 20개 또는 적어도 21개 또는 적어도 22개 또는 적어도 23개 또는 적어도 24개 또는 적어도 25개 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG1의 불변 중쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법. - 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) IgG4 아이소타입의 IgG 항체로부터의 힌지, CH1 도메인 및 CH2 도메인 및 IgG1 아이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역으로서, 상기 키메라 Fc 영역은 상기 CH2 영역 내의 297번 EU 넘버링 위치(314번 카밧 넘버링 위치)에서 글루타민(Q)으로의 치환; 상기 힌지 영역 내의 228번 EU 넘버링 아미노산 위치(241번 카밧 넘버링 위치)에서 프롤린(P)으로의 치환; 상기 CH3 영역 내의 447번 EU 넘버링 위치(478번 카밧 넘버링 위치)에서 라이신(K)의 결실을 포함하는, 상기 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법. - 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 상기 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법. - 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 11의 서열을 포함하는 가변 경쇄; (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 가변 중쇄; (c) 인간 카파 경쇄의 불변 경쇄(서열번호 82); 및 (d) 인간 IgG4의 불변 중쇄로서, 상기 불변 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라서 S241P, N314Q, Q376R, E377D, M381L, R440K, E450Q, L476P 및 K478의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개의 돌연변이를 포함하는, 상기 인간 IgG4의 불변 중쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법. - 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서,
상기 환자에게 (a) 서열번호 80의 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 중쇄; 및 (b) 서열번호 81의 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 경쇄를 포함하는 재조합 항-알파 4 항체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법. - 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌전증은 약물-내성 뇌전증인, 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법.
- 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 인간인, 뇌전증을 앓고 있는 환자의 치료 방법.
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