KR20210025522A - 강력하고 선택적인 인터루킨 모방체의 드 노보 디자인 - Google Patents

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KR20210025522A
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만자노 다니엘 아드리아노 실바
숀 유
우뭇 얼지
데이비드 베이커
케난 크리스토퍼 가르시아
제이미 스팽글러
칼 워키
루비오 알프레도 퀴자노
케빈 주드
브라이언 와이츠너
엔리케 마르코스
자비에 카스텔라노스
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

IL-2 수용체 β
Figure pct00147
c 헤테로이량체(IL-2Rβ
Figure pct00148
c), IL-4 수용체 α
Figure pct00149
c 헤테로이량체(IL-4Rα
Figure pct00150
c), 또는 IL-13 수용체 α 하위단위(IL-13Rα)에 결합하는 드 노보 디자인된 폴리펩타이드가 개시되며, 상기 폴리펩타이드를 사용하고 디자인하는 방법 또한 개시된다.

Description

강력하고 선택적인 인터루킨 모방체의 드 노보 디자인
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 6월 25일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/689,769호 및 2018년 11월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/768,733호에 대해 우선권을 주장하며, 각각은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
암 치료를 위한 중심 면역 사이토카인 인터루킨, 예컨대 IL-2 및 IL-4의 상당한 잠재력은, 돌연변이 및/또는 화학적 변형에 의해 이들의 치료적 특성을 향상시키려는 무수한 노력을 촉구하였다. 그러나, 이들 접근법은 네이티브 IL-2 또는 IL-4에 밀접하게 관련이 있기 때문에, 이들은 바람직하지 못한 특성, 예컨대 낮은 안정성 및 IL-2 수용체 α 하위단위(IL-2Rα), IL-4 수용체 α
Figure pct00001
c 헤테로이량체(IL-4Rα
Figure pct00002
c), 또는 IL-13 수용체 α 하위단위(IL-13Rα)에의 결합을 해소할 수 없다.
일 양태에서, 방법이 제공된다. 컴퓨터 장치는, 복수의 잔기의 구조가 특정 수용체 결합 계면을 제공하는 단백질의 상기 복수의 잔기의 구조를 결정한다. 컴퓨터 장치는 상기 컴퓨터 장치에 의해 제공되는 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하며, 여기서, 상기 복수의 디자인된 잔기는 특정 수용체 결합 계면을 제공하고, 상기 복수의 디자인된 잔기는 복수의 잔기와 상이하다.
컴퓨터 장치는 복수의 디자인된 잔기를 연결하는 하나 이상의 연결형(connecting) 나선 구조를 결정한다. 컴퓨터 장치는 하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 결정한다. 컴퓨터 장치는 상기 제1 단백질 백본에 기초하여 유연성(flexibility) 및 저에너지 구조에 대한 단백질에 대해 제2 단백질 백본을 디자인한다. 컴퓨터 장치는 적어도 상기 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성한다.
또한, 본원에 기재된 방법에 의해 제조되는 비-자연 발생 단백질이 포함된다. 비-자연 발생 단백질은 사이토카인, 예를 들어, 비-자연 발생 IL-2 또는 IL-4(본원에서 IL-2, IL-2/15 모방체 또는 IL-4 모방체로도 지칭됨)일 수 있다.
또 다른 양태에서, 컴퓨터 장치가 제공된다. 컴퓨터 장치는 하나 이상의 프로세서; 및 하나 이상의 프로세서에 의해 실행 시, 컴퓨터 장치가 기능을 수행하도록 유발하는, 적어도 컴퓨터-판독 가능 명령을 저장하도록 구성된 데이터 저장을 포함한다. 상기 기능은, 특정 수용체 결합 계면을 제공하는 단백질의 복수의 잔기에 대한 구조를 결정하는 단계; 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하는 단계로서, 여기서, 상기 복수의 디자인된 잔기는 특정 수용체 결합 계면을 제공하고, 상기 복수의 디자인된 잔기는 복수의 잔기와 상이한 것인, 단계; 복수의 디자인된 잔기를 연결하는 하나 이상의 연결형 나선 구조를 결정하는 단계; 하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 결정하는 단계; 상기 제1 단백질 백본에 기초하여 유연성 및 저에너지 구조에 대한 단백질에 대해 제2 단백질 백본을 디자인하는 단계; 및 적어도 상기 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 비-일시적 컴퓨터-판독 가능 매체가 제공된다. 상기 비-일시적 컴퓨터-판독 가능 매체는 컴퓨터 장치의 하나 이상의 프로세서에 의해 실행 시, 컴퓨터 장치가 기능을 수행하도록 유발하는, 적어도 컴퓨터-판독 가능 명령을 저장하도록 구성된다. 상기 기능은, 특정 수용체 결합 계면을 제공하는 단백질의 복수의 잔기에 대한 구조를 결정하는 단계; 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하는 단계로서, 여기서, 상기 복수의 디자인된 잔기는 특정 수용체 결합 계면을 제공하고, 상기 복수의 디자인된 잔기는 복수의 잔기와 상이한 것인, 단계; 복수의 디자인된 잔기를 연결하는 하나 이상의 연결형 나선 구조를 결정하는 단계; 하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 결정하는 단계; 상기 제1 단백질 백본에 기초하여 유연성 및 저에너지 구조에 대한 단백질에 대해 제2 단백질 백본을 디자인하는 단계; 및 적어도 상기 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 장치가 제공된다. 상기 장치는, 특정 수용체 결합 계면을 제공하는 단백질의 복수의 잔기에 대한 구조를 결정하기 위한 수단; 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하기 위한 수단으로서, 여기서, 상기 복수의 디자인된 잔기는 특정 수용체 결합 계면을 제공하고, 상기 복수의 디자인된 잔기는 복수의 잔기와 상이한 것인, 수단; 복수의 디자인된 잔기를 연결하는 하나 이상의 연결형 나선 구조를 결정하기 위한 수단; 하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 결정하기 위한 수단; 상기 제1 단백질 백본에 기초하여 유연성 및 저에너지 구조에 대한 단백질에 대해 제2 단백질 백본을 디자인하기 위한 수단; 및 적어도 상기 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하기 위한 수단을 포함한다.
또 다른 양태에서, 도메인 X1, X2, X3 및 X4를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서:
(a) X1은 E HA LYD A L (서열번호1)과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
(b) X2는 적어도 8개 아미노산 길이의 나선형-펩타이드이며;
(c) X3은 Y AF N FE LI (서열번호2)와 적어도 25%%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
(d) X4는 I TIL Q S W IF (서열번호3) 와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
여기서, X1, X2, X3 및 X4는 폴리펩타이드에서 임의의 순서로 존재할 수 있으며;
아미노산 링커는 임의의 도메인 사이에 존재할 수 있고;
상기 폴리펩타이드는 IL-2 수용체 β
Figure pct00003
c 헤테로이량체(IL-2Rβ
Figure pct00004
c), IL-4 수용체 α
Figure pct00005
c 헤테로이량체(IL-4Rα
Figure pct00006
c), 또는 IL-13 수용체 α 하위단위(IL-13Rα)에 결합한다.
다른 양태에서, 본원에 개시된 하나 이상의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 본원에 개시된 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산, 본원에 개시된 재조합 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 본원에 개시된 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 추가의 양태에서, 암을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 개시된 하나 이상의 폴리펩타이드, 재조합 핵산, 상기 재조합 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및/또는 재조합 숙주 세포 또는 이의 약제학적 조성물을 종양을 치료하기에 효과적인 양으로, 암을 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
하기 도면은 예시적인 구현예에 따른 것이다:
도 1a 내지 도 1d. 드 노보 사이토카인 모방체의 컴퓨터 디자인. 도 1a)에서 디자인된 모방체는 4개의 나선을 가지며; 3개의 모방체 IL-2는 hIL-2Rβ
Figure pct00007
c와 상호작용하는 한편, 4번째 모방체는 처음 3개를 제자리에 고정시킨다. 상단: 제1 세대의 디자인에서, IL-2(나선 H1-H4)의 각각의 코어 요소는 독립적으로, 클러스터링된(clustered) 이상적 단편 데이터베이스(크기: 4 a.a.)로부터 단편-조립을 사용하여 이상화(idealize)되었으며; 하단: 제2 세대의 디자인에서, 코어 요소가 대신에, 각각의 분리된(disembodied) 나선의 모양을 개괄하는 매개 방정식을 사용하여 구축되어, 각각의 나선의 길이에서 +/- 8 a.a.만큼의 변화를 가능하게 하였으며; 도 1b) 나선의 쌍은 이상적인 루프 단편(크기: 각각 세대-1 및 세대-2에 대해 4 a.a. 또는 7 a.a., 방법 참조)을 사용하여 재연결되었으며, 대표적인 예는 각각의 나선 쌍을 연결하는 새로 구축된 요소와 함께 나타나 있고; 도 1c) 도 1b에서 생성된 나선 헤어핀은 모든 가능한 조합에서 조립되어, 완전히 연결된 단백질 백본을 생성시켰으며; 도 1d) 디자인 및 실험적으로 성숙된 버전은 효모 디스플레이에 의한 결합에 대해 시험되었고, 높은 친화도 결합을 나타내는 것들은 재조합적으로 발현되었으며(이. 콜라이), 표면 플라즈몬 공명 및 IL-2 유사 포스포-STAT5(pSTAT5) 신호화를 사용하여 결합에 대해 시험되었다. 제1 세대의 3개 디자인 및 제2 세대로부터의 10개 디자인에 대한 결과는 실선 부호에서 2D-플롯에 나타나 있다. 열린 별표(open star)는 네오루킨-2/15이며, 화살표는 이의 부모(비최적화된) 디자인에서 기원한다.
도 2a 내지 도 2c. 네오루킨-2/15의 특징화. 도 2a) 상단으로부터 하단까지: 표면 플라즈몬 공명 실험에서, 네오루킨-2/15는 인간 또는 뮤린 IL-2Rα에는 결합하지 않으나, 인간 및 뮤린 IL-2Rβ 둘 다와 유사한 친화도(인간 및 마우스 수용체 각각에 대해 Kd ~ 11.2 nM 및 16.1 nM)로 결합한다. 자연 IL-2와 마찬가지로, 네오루킨-2/15는
Figure pct00008
c 수용체에 불량하게 결합하고, 인간 및 뮤린 IL-2Rβ
Figure pct00009
c 둘 다에 대해 협동적인 결합을 나타낸다(인간 및 마우스 헤테로이량체성 수용체에 대해 Kd ~ 18.8 nM 및 38.4 nM인 한편, 네이티브 hIL-2 및 슈퍼-2의 Kd는 ~ 193.6 nM 및 300.9 nM이며, 표 E1 참조). 도 2b) 상단: 시험관내 pSTAT5 신호화 연구는, 네오루킨-2/15가 인간 세포(EC50)에서 IL-2-유사 신호화를 유도하고 IL-2Rα 발현(CD25)과 함께 또는 없이 대략 동일한 약효(CD25+ 및 CD25- 세포 각각에서 EC50 ~ 73.0 pM 및 49.2 pM)로 인간 YT-1 NK 세포를 활성화시킴을 실증하고; 하단: 유사하게는 뮤린 CD4+ 1차 세포에서 생체외 실험은, 네오루킨-2/15가 또한 뮤린 세포에서 강력한 IL-2 유사 신호화를 유도할 수 있고 IL-2Rα 발현(CD25+ 및 CD25- 세포 각각에서 EC50 ~ 24 pM 및 129 pM)과 독립적임을 실증하며; 도 2c) 하단: 결합 실험(OCTET)은, 네오루킨-2/15가 임의의 주지할 만한 결합 손실 없이 80℃에서 2시간 동안 인큐베이션될 수 있는 반면, 인간 및 뮤린 IL-2는 활성을 빠르게 손실시키며; 하단: 생존율을 위해 IL-2를 필요로 하는 배양된 뮤린 비장세포 상에서의 생체외 실험은, 95℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 네오루킨-2/15가 여전히 세포 생존율을 효과적으로(10 ng/ml에서 ~70% 상대 발광) 유도하는 한편, mIL2 및 슈퍼-2는 결국 불활성이다(10 ng/ml에서 각각 ~10% 및 0.1%).
도 3a 내지 도 3e. 네오루킨-2/15(Neo-2/15) 및 mIL-2Rβ
Figure pct00010
c 와의 이의 3원 복합체의 구조. 도 3a) 상단: 디자인 모델을 이용한 네오루킨-2/15(Neo-2/15) 사슬 A의 구조적 정렬(100 Cα 원자에 대한 r.m.s.d. 1.11 Å)이며; 하단: 계면 나선 H1, H3 및 H4(hIL-2에 따라 넘버링됨, 표 1 참조)의 세부사항이다. 계면 측쇄는 스틱으로 표시되어 있으며; 도 3b) Neo-2/15와 mIL-2Rβ 및 γc의 3원 복합체의 결정학적 구조(3원 복합체에서 Neo-2/15의 93개의 모델링된 Cα 원자에 대한 r.m.s.d 1.27 Å); 도 dc) 3원 복합체에서 단량체성 Neo-2/15(사슬 A)와 Neo-2/15의 구조적 정렬이다(3원 복합체에서 Neo-2/15의 93개의 모델링된 Cα 원자에 대한 r.m.s.d 1.71 Å). 나선 H4는 단량체성 결정 구조와 비교하여 3원-복합체 구조에서 나선 H4의 대략 4.0 + 시프트(shift)를 보여주며; 도 3d) hIL-2(만화적 도해)의 결정학적 구조이다. IL-2Rβ 및 γc 와 상호작용하는 영역이 표시되어 있다. IL-2Rα와 상호작용하는 hIL-2로부터의 루프-풍부 영역은 드 노보 모방체 Neo-2/15에 존재하지 않는다. 도 3e) : "b)"(만화적 도해)에서 3원 복합체로부터의 네오루킨-2/15의 결정학적 구조. IL-2Rβ 및 γc 와 상호작용하는 영역이 표시되어 있다. IL-2Rα와 상호작용하는 hIL-2로부터의 루프-풍부 영역은 드 노보 모방체 Neo-2/15에 존재하지 않는다.
도 4a 내지 도 4g. 네오루킨-2/15의 면역원성, 면역자극성 및 치료적 활성. 도 4a) 미접촉 마우스 T 세포에서 네오루킨-2/15(Neo-2/15)의 용량 상승 효과이다. 미접촉 C57BL/6 마우스는 지시된 농도에서 네오루킨-2/15 또는 mIL-2로 매일 치료받았다(그룹 당 n=2 내지 3 마리). 14일 후, 비장이 수합되고 지시된 마커를 사용하여 유세포분석에 의해 분석되었다. 막대 플롯은, mIL-2가 용량 의존적 방식으로 CD4+ Treg 증식(expansion)을 증강시킨 한편, Neo-2/15가 Treg 세포의 증식에 거의 효과가 없거나 전혀 효과가 없었음을 보여준다. 네오루킨-2/15는 mIL-2와 비교하여 더 높은 CD8+:Treg 비를 유도하였으며; 도 4b) 마우스의 기도 염증 모델(20 μg/일/마우스, 7일)에서 Neo-2/15의 효과이다. 미접촉 마우스와 유사하게, Neo-2/15는 림프 기관에서 항원-특이적 CD4+ Foxp3+ Treg의 빈도를 증가시키지 않고, 폐 체류(정맥내 표지화에 의해 Thy1.2-) CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는 데 있어서 mIL-2와 유사하게 효과적이고; 도 4c) 네오루킨-2/15는 검출 가능한 면역원성을 갖지 않는다. C57BL/6 마우스는 5x105 B16F10 세포를 피하 주사에 의해 접종받았다. 제1일에 출발하여, 마우스는 네오루킨-2/15(10 μg) 또는 등몰량의 mIL-2로 복강내(i.p.) 주사(각각의 그룹에 대해 n=10)에 의해 매일 치료받았다. 14일 후, 혈청(항혈청)이 수합되고, IgG는 소 태아 혈청(FBS 10%, 음성 대조군), 네오루킨-2/15, mIL-2, hIL-2, 또는 음성 대조군으로서 Ov알부민(OVA)(점선은 음성 대조군의 평균을 보여줌)으로 코팅된 플레이트에서 ELISA에 의해 검출되었다. 항-Neo-2/15 폴리클로날 항체는 양성 대조군(검정색, n=2)으로서 사용되었고, mIL-2 또는 h-IL2와 교차 반응하지 않았으며; 도 4d) C57BL/6 마우스는 완전 프로인트 아쥬반트 중 500 μg KO Neo-2/15로 면역화되었고, 제7일 및 제15일에 불안전 프로인트 아쥬반트 중 500 μg KO Neo-2/15로 부스팅되었다. KO Neo-2/15 및 네이티브 Neo-2/15에 대한 반응성, 뿐만 아니라 마우스 IL-2와의 교차-반응성은 혈청(PBS에서 1:1,000으로 희석됨)과 지시된 바와 같은 플레이트-결합 KO Neo-2/15, Neo-2/15 또는 마우스 IL-2의 인큐베이션에 의해 결정되었다. 혈청 결합은 HRP에 접합된 항-마우스 2차 항체를 사용하고, 뒤이어 TMB와의 인큐베이션에 의해 검출되었다. 데이터는 450 nm에서 광학 밀도로서 보고된다. 상단, 미접촉 마우스 혈청; 하단, 면역화된 마우스 혈청. 도 4e 내지 도 4g) 네오루킨-2/15의 치료 효능이고: 도 4e) BALB/C 마우스는 CT26 종양으로 접종되었다. 제6일에 출발하여, 마우스는 mIL-2 또는 네오루킨-2/15(10 μg)의 i.p. 주사로 매일 치료받았거나, 치료받지 않았다(그룹 당 n = 5). 종양 성장 곡선이다(상단, 생존한 마우스에 대한 데이터만 보여줌). 생존율 곡선이다(하단). 체중 손실이 초기 체중의 10%를 초과한 경우 또는 종양 크기가 1,300 mm3에 도달한 경우, 마우스는 안락사되었다. 도 4f) C57BL/6 마우스는 "a)"에서와 같이 B16 종양으로 접종되었다. 제1일에 출발하여, 마우스는 네오루킨-2/15(10 μg) 또는 등몰량의 mIL-2(그룹 당 n = 10)의 i.p. 주사로 매일 치료받았다. TA99에 의한 주 2회 치료는 제3일에 추가되었다. 체중 손실이 초기 체중의 10%를 초과한 경우 또는 종양 크기가 2,000 mm3에 도달한 경우, 마우스는 안락사되었다. 종양 성장 곡선이다(상단 및 하단 좌측). 생존율 곡선, 삽도는 평균 체중 변화를 보여준다(상단 우측). 사망 원인의 정량화이다(하단 우측). 도 4g) Neo-2/15는 마우스 IL-2보다 더 높은 CD8+:Treg 비를 유도한다. C57BL/6 마우스에 B16 종양을 접종하고, 지시된 바와 같이 매일 i.p. 주사로 치료하였다. TA99(하단 플롯)에 의한 치료는 제5일에 출발하고, 주 2회로 계속되었다. 종양은 이들 종양이 2,000 mm3에 도달한 경우 마우스로부터 수합된 다음, 유세포분석에 의해 분석되었다. CD8:Treg 세포 비는, CD8+인 CD45+ CD3+ 세포의 백분율을 CD4+ CD25+ FoxP3+인 백분율로 나누어서 계산되었다.
도 5a 내지 도 5d. 결장암에 미치는 네오루킨-2/15의 치료적 효과. 도 5a) BALB/C 마우스는 CT26 종양으로 접종되었다. 제9일에 출발하고 제14일에 종료하여, 마우스는 매일 명시된 농도에서 mIL-2 또는 네오루킨-2/15의 i.p. 주사로 치료받았거나, 치료받지 않았다(그룹 당 n = 5). 종양 성장 곡선이다(상단, 생존한 마우스에 대한 데이터만 보여줌). 생존율 곡선이다(하단). 체중 손실이 초기 체중의 10%를 초과한 경우 또는 종양 크기가 1,300 mm3에 도달한 경우, 마우스는 안락사되었다. 도 5a 내지 도 5b) 막대-플롯은 CT26 종양으로 접종되고 제6일에 출발하여 매일 10 μg 네오루킨-2/15 또는 10 μg mIL-2의 i.p. 주사로 치료받은 BALB/C 마우스(그룹 당 n = 3) 또는 비-처리(Tx 없음)에 대한 T 세포 집단을 비교한다. 제14일에 Treg 세포의 백분율(CD4+ CD45+ FoxP3+, 상단 그래프) 및 CD8:Treg 세포 비((CD45+ CD3+ CD8+ )/ Treg, 하단 그래프)이 도 5b) 종양, 도 5c) 이웃하는 서혜부 림프절(LN), 및 도 5d) 비장에서 평가되었다.
도 6a 내지 도 6d. 흑색종에 미치는 네오루킨-2/15의 치료적 효과. 도 6a 내지 도 6e) B16 종양으로 접종되고 저용량(1 μg/마우스/일, a 내지 b) 또는 고용량의 네오루킨-2/15(10 μg/마우스/일, c 내지 d)로 치료된 C57BL/6 마우스에 대한 종양 성장 곡선(하단) 및 생존율 곡선(상단)이다. 제1일에 출발하여, 마우스(그룹 당 n = 5)는 도 6a): 1 μg/마우스 또는 등몰량의 mIL-2(그룹 당 n = 5)에서 단일 작용제 네오루킨-2/15, 또는 도 6b): TA99(제5일에 출발됨)에 의한 주 2회 치료와 조합된 동일한 치료의 i.p. 주사로 매일 치료받았다. 종양 크기가 2,000 mm3에 도달한 경우 마우스는 안락사되었다. C57BL/6 마우스에 B16 종양을 접종하고, 지시된 바와 같이 매일 i.p. 주사로 치료하였다. 도 6c 내지 도 6d) "a 내지 b)"와 유사하나 제4일에 출발하여, 마우스는 10 μg/마우스의 네오루킨-2/15, 또는 등몰량의 mIL-2의 i.p. 주사로 단독으로 도 6c) 또는 제4일에 출발된 주 2회 TA99와 조합되어 도 6d) 매일 치료받았다. 종양 크기가 2,000 mm3에 도달한 경우 마우스는 안락사되었다. 네오루킨-2/15의 치료적 효과는 용량 의존적이고(더 높은 용량은 더 양호함), 항체 TA99의 존재 하에 강력해진다. 실험은 1회 수행되었다. 모든 성장 곡선에서, 데이터는 평균 ± s.e.m.이다. 결과는, 만텔-콕스 검정(95% 신뢰 구간)을 사용하여 평가된 생존율 곡선을 제외하고는 일원 ANOVA(95% 신뢰 구간)에 의해 분석되었다.
도 7a 내지 도 7c. 인간 인터루킨-4(hIL-4) 모방체(네오루킨-4)로의 네오루킨-2/15의 재조작. 도 7a) IL-4Rα 및
Figure pct00011
c(PDB 코드 3BPL로부터)와의 복합체에서 IL-4의 구조로 구조적으로 정렬된 Neo-2/15이다. IL-4Rα와 접촉하고 Neo-2/15 내로 이식된 14개의 IL-4 잔기가 표지된다. 도 7b) 네오루킨-4(Neo-4)는 Neo-2/15와 비교하여 16개의 아미노산 돌연변이를 갖는 새로운 단백질이다. 이들 돌연변이는 표지되며; 이들 중 13개는 IL-4Rα와의 접촉을 매개하는 패널 "a)"에 도시된 IL-4 잔기로부터 유래되었고, 이들 중 3개(도면에서 밑줄 표시된 H8M, K68I 및 I98F)는 무작위 돌연변이발생 및 높은 결합 친화도 변이체에 대한 스크리닝을 사용하여 직접 진화(directed evolution)에 의해 도입되었다. 도 7c) IL-4와 같은 Neo-4가 IL-4Rα 단독에 결합하며,
Figure pct00012
c에 대해 친화도가 없으나, IL-4Rα가 용액 내에 존재하는 경우
Figure pct00013
c에 결합함을 보여주는 생물층 간섭계(biolayer interferometry) 데이터이다.
도 8a 내지 도 8b. 인간 CAR-T 세포에 미치는 네오루킨-2/15의 자극 효과. 도 8a) 자극된 항-CD3/CD28 또는 도 8b) 비자극된 인간 1차 CD4(상단) 또는 CD8(하단) T 세포는 지시된 농도의 인간 IL2 또는 네오루킨-2/15에서 배양되었다. T 세포 증식은 IL2 보충 없이 배양된 T 세포를 능가하는 배수 변화(fold change)로서 측정된다. Neo-2/15는 자극된 CAR-T 세포의 증식을 유도하는 데 있어서 네이티브 IL-2만큼 효과적이고, 비자극된 CAR-T 세포, 특히 비자극된 CD8 CAR-T 세포의 증식을 유도하는 데 있어서 네이티브 IL-2보다 더 효과적이다.
도 9a 내지 도 9d. 4개의 공통 나선 각각에 대한 결합 잔기에서 전체 서열 보존, 3개의 상이한 드 노보-디자인된 IL-2 모방체로부터의 정보의 조합. 서열 로고는 G2_neo2_40_1F_seq27, G2_neo2_40_1F_seq29 및 G2_neo2_40_1F_seq36에 대한 3개의 독립적인 SSM 돌연변이발생 라이브러리로부터의 결합 실험(헤테로이량체성 마우스 IL-2Rβγc를 사용함)으로부터 조합된 데이터를 사용하여 생성되었다(도 11 내지 도 13). 모든 이들 단백질은 마우스 및 인간 IL-2의 기능적인 고-친화도 드 노보 모방체이며, 일부는 Neo-2/15와 상이한 독성학을 갖지만 모두는 4개의 나선 H1(도 9a; Neo-2/15 1-22는 서열번호248이며, IL-2 6-27은 서열번호249이고, IL-15 1-15는 서열번호250임), H3(도 9b; Neo-2/15 34-55는 서열번호251이며, IL-2 82-103은 서열번호252이고, IL-15 59-80은 서열번호253임), H2'(도 9c; Neo-2/15 58-76은 서열번호254이며, IL-2 50-68은 서열번호255이고, IL-15 34-52는 서열번호256임) 및 H4(도 9d; Neo-2/15 80-100은 서열번호257이며, IL-2 111-131은 서열번호258이고, IL-15 93-113은 서열번호259임)를 함유한다. 로고는 각각의 나선에 대한 조합된 정보를 독립적으로 보여준다. 각각의 로고 아래에, 선 그래프는 Neo-2/15 서열에서 각각의 아미노산에 대한 확률 점수(더 높은 확률 점수는 더 보존되어 있음을 의미함)를 보여준다. 수평의 실선은, Neo-2/15 아미노산이 30% 이상의 확률 점수를 갖는 위치를 강조한다(즉, 이들 아미노산은, 이들이 시험된 모든 드 노보 IL-2 모방체에 걸쳐 결합 집단에서 전반적으로 농화되어 있으므로, 수용체 결합에 더 일반적으로 기여함). Neo-2/15에서 각각의 나선의 위상기하학은 각각의 로고의 좌측에 나타나 있다. Neo-2/15 나선의 서열 및 인간 IL-2와 IL-15에서 상응하는 나선(구조적으로 정렬됨)의 서열은 그래프 아래에 나타나 있으며, Neo-2/15 나선 및 결합 계면의 특수성(distinctiveness)을 강조한다.
도 10a 내지 도 10d. G1_neo2_40의 실험적 최적화. 도 10a 내지 도 10c) 도 10a) 50 nM, 도 10b) 2 nM, 및 도 10c) 0.1 nM IL-2Rβ
Figure pct00014
c 헤테로이량체에 의한 선택을 증가시키는 연속적인 라운드(round) 후 특정 위치에서 농화를 보여주는 G1_neo2_40 단일-부위 돌연변이발생 라이브러리에 대한 히트맵이다. 이들 농화 데이터에 기반하여, 조합적 라이브러리는 뉴클레오타이드 다양성 1.5 Х 106으로 디자인되었다. 도 10d) 초기 조합적 라이브러리에서 이용 가능한 아미노산 잔기는 도시되어 있으며, 이는 유리한(원래 서열의 위에 나타나 있음) 것으로 그리고 불리한(원래 서열의 아래에 나타나 있음) 것으로 예측된 잔기를 나타내며; 원래 서열의 도시에서, 검정색은 조합적 라이브러리에서 표시된 잔기를 나타내고, 회색은 조합적 라이브러리에서 표시되지 않은 잔기를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11e. G2_neo2_40_1F_seq27의 실험적 최적화. 도 11a) 10 nM, 도 11b) 1 nM, 도 11c) 0.1 nM, 및 도 11d) 0.1 nM IL-2Rβ
Figure pct00015
c 헤테로이량체에 의한 선택을 증가시키는 연속적인 라운드 후 특정 위치에서 농화를 보여주는 G2_neo2_40_1F_seq27 단일-부위 돌연변이발생 라이브러리에 대한 히트맵이다. 이들 농화 데이터에 기반하여, 조합적 라이브러리는 뉴클레오타이드 다양성 5.3 Х 106으로 디자인되었다. 도 11e) 초기 조합적 라이브러리에서 이용 가능한 아미노산 잔기는 도시되어 있으며, 이는 유리한 것으로 예측된 잔기를 나타내며; 검정색은 조합적 라이브러리에서 표시된 출발 서열에서의 잔기를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12e. G2_neo2_40_1F_seq29의 실험적 최적화. 도 12a) 10 nM, 도 12b) 1 nM, 도 12c) 0.1 nM, 및 도 12d) 0.1 nM IL-2Rβ
Figure pct00016
c 헤테로이량체에 의한 선택을 증가시키는 연속적인 라운드 후 특정 위치에서 농화를 보여주는 G2_neo2_40_1F_seq29 단일-부위 돌연변이발생 라이브러리에 대한 히트맵이다. 이들 농화 데이터에 기반하여, 조합적 라이브러리는 뉴클레오타이드 다양성 2.9 Х 106으로 디자인되었다. 도 12e) 초기 조합적 라이브러리에서 이용 가능한 아미노산 잔기는 도시되어 있으며, 이는 유리한 것으로 예측된 잔기를 나타내며; 검정색은 조합적 라이브러리에서 표시된 출발 서열에서의 잔기를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13e. G2_neo2_40_1F_seq36의 실험적 최적화. 도 13a) 10 nM, 도 13b) 1 nM, 도 13c) 0.1 nM, 및 도 13d) 0.1 nM IL-2Rβ
Figure pct00017
c 헤테로이량체에 의한 선택을 증가시키는 연속적인 라운드 후 특정 위치에서 농화를 보여주는 G2_neo2_40_1F_seq36 단일-부위 돌연변이발생 라이브러리에 대한 히트맵이다. 이들 농화 데이터에 기반하여, 조합적 라이브러리는 뉴클레오타이드 다양성 2.7 Х 106으로 디자인되었다. 도 13e) 초기 조합적 라이브러리에서 이용 가능한 아미노산 잔기는 도시되어 있으며, 이는 유리한 것으로 예측된 잔기를 나타내며; 검정색은 조합적 라이브러리에서 표시된 출발 서열에서의 잔기를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14b. 다수의 IL-2/IL-15 드 노보 디자인된 모방체, 세대-1에 대한 원편광 이색성(CD) 열 변성 실험. 도 14a)는 열 변성 곡선이고 도 14b)는 파장 스캔이다.
도 15a 내지 도 15b. 다수의 IL-2/IL-15 드 노보 디자인된 모방체, 실험적으로 최적화된 세대-1에 대한 원편광 이색성(CD) 열 변성 실험. 도 15a)는 열 변성 곡선이고 도 15b)는 파장 스캔이다.
도 16a 내지 도 16d. IL-2/IL-15 모방체 디자인 세대-2에 대한 원편광 이색성(CD) 열 용융(thermal melt). 도 16a 및 도 16c)는 열 변성 곡선이고 도 16b 및 도 16d)는 파장 스캔이다.
도 17a 내지 도 17c. 네오루킨-2/15의 발현, 정제, 및 열 변성 특징화. 도 17a)는 친화도 컬럼에 걸쳐 발현 및 정제를 보여주는 SDS Tris-트리신 겔 전기영동이다. 도 17b)는 강건한 온도 안정성을 보여주는, 25℃로부터 95℃로의 열 용융 동안 222 nm에서의 원편광 이색성이다. 도 17c)는 네오루킨-2/15가 95℃에서 완전히 용융되지 않고 25℃로 다시 냉각된 후 완전히 접힘을 보여주는, 25℃, 95℃ 및 다시 25℃에서의 원편광 이색성 파장 스캔이다.
도 18a 내지 도 18d. 더 높은 열적 안정성을 갖는 네오루킨-2/15의 단일 이황화 스테이플화 변이체. 네오루킨-2/15의 이황화 안정화된 변이체의 구조적 모델은 표지된 돌연변이화 잔기 및 제시된 이황화 결합의 위치와 함께 제시된다. 2 가지 전략이 사용되어, 이황화 변이체를 생성하였다: 도 18a)는 잔기 38 및 75에서의 내부 배치 및 말단 연결이며; 말단 변이체에 대한 도 18b)에서, 이황화 결합을 형성하기 위해 필요할 출발 구조로 임의의 왜곡(distortion)을 제한하기 위해 각각의 말단에 3개의 잔기가 첨가되었다. 내부 및 말단 이황화 변이체에 대한 냉각 후 25℃, 95℃ 및 25℃에서의 CD 스펙트럼은 이들의 구조적 모델을 하기에 제시한다. 두 변이체 모두 95℃에서 매우 적은 신호 손실 및 냉각 시 완전한 재접힘을 보여주며; 도 18c)에서 온도 범위에 걸쳐 222.0 nm에서 CD 신호를 모니터링함으로써 각각의 변이체의 열 용융이 수행되었다. 각각의 이황화 변이체는 네이티브에 비해 향상된 안정성을 보여주고; 도 18d)에서 IL-2Rβγc에 대한 각각의 변이체의 결합 강도는 생물층 간섭계(biolayer interferometry)에 의해 측정되었다. 결합 상호작용을 교란시키는 것과 대조적으로, 이들 데이터는, 이황화 결합의 도입이 IL-2Rβγc에 대한 모방체의 결합을 향상시킴을 보여준다. 이황화-결합 변이체 둘 다, IL-2Rβγc(동일한 실험 조건 하에 Neo-2/15에 대한 6.9 ± 0.61 nM와 비교하여, 내부 및 외부 이황화-스테이플 각각에 대해 Kd ~ 1.3 ± 0.49 및 1.8 ± 0.26 nM) 결합에서의 향상을 나타내며, 이는 단백질의 결합 부위의 이황화-유도 안정화의 예상된 효과와 일관된다.
도 19a 내지 도 19b. 비-결합 계면 위치 상에서 단일-점 시스테인 돌연변이체에 대한 네오루킨-2/15의 강건성(robustness). 도 19a)는 단백질의 발현 또는 IL-2Rβγc에의 결합을 방해하지 않으면서, 시스테인으로 개별적으로 돌연변이화될 수 있는 네오루킨-2/15에서 점 돌연변이체 위치를 보여주는 도식이다. 수용체 결합에 대한 방해를 피하기 위한 위치가 선택되었다. 도 19b)는 생물층 간섭계를 사용하여 측정된, IL-2Rβγc와 네오루킨-2/15 시스테인 돌연변이체의 결합 동역학이다. 모든 변이체는 Neo-2/15와 대략 유사하게 수용체와 결합한다.
도 20a 내지 도 20c. 네오루킨-4의 발현, 정제, 및 열 변성 특징화. 도 20a)는 친화도 컬럼에 걸쳐 발현 및 정제를 보여주는 SDS Tris-트리신 겔 전기영동이다. 도 20b)는 강건한 온도 안정성을 보여주는, 25℃로부터 95℃로의 열 용융 동안 222 nm에서의 원편광 이색성이다. 도 20c)는 네오루킨-4가 95℃에서 완전히 용융되지 않고 25℃로 다시 냉각된 후 완전히 접힘을 보여주는, 25℃, 95℃ 및 다시 25℃에서의 원편광 이색성 파장 스캔이다.
도 21a 내지 도 21d. Neo-2/15 또는 Neo-2/15-PEG에 대한 비-인간 영장류 반응에서 사이토카인 수준. 그룹 당 2 마리의 비-인간 영장류(NHP), 그룹 당 1 마리의 수컷 및 1 마리의 암컷은 비히클, Neo-2/15 또는 Neo-2/15-PEG(PEG40K에 접합된 E62C의 단일 시스테인 돌연변이를 갖는 Neo-2/15를 포함함)에 의한 치료에 배정되었다. 동물에게 0(비히클), 0.1, 0.2 또는 0.3 mg/kg의 Neo-2/15, 또는 0.05, 0.10 또는 0.15 mg/kg의 Neo-2/15-PEG가 정맥내 볼루스에 의해 투여되었다. Neo-2/15 PEG로 치료받는 동물은 정맥내 볼루스에 의해 투여받았다. 사이토카인 시료는 투약 후 0, 4, 8 및 24시간째에 채취되었다. 사이토카인 혈청 시료를 제조하여 <-70℃에서 동결시키고, 시료가 Luminex 멀티플렉스 면역검정법 시스템을 통해 분석되는 곳으로 운송하였다. IL-10(도 21a 내지 도 21b) 및 IL-15(도 21c 내지 도 21d)를 포함하는 몇몇 사이토카인은, PEG화된 분자에 대한 더욱 지속된 약력학적(pharmacodynamic) 효과와 일관되게, 사이토카인 생성의 시간 경로에서 두드러진 차이를 실증하였다.
도 22: 예시적인 컴퓨터 네트워크의 블록 다이어그램이다.
도 23a: 예시적인 컴퓨터 장치의 블록 다이어그램이다.
도 23b: 클라우드-기반 서버 시스템으로서 배열된 컴퓨터 장치의 예시적인 네트워크의 블록 다이어그램이다.
도 24: 방법의 순서도이다.
본원에 사용된 바와 같이 그리고 다르게 지시되지 않는 한, 용어 단수형("a" 및 "an")은 "하나", "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 간주된다. 문맥상 다르게 필요하지 않는 한, 본원에 사용된 단수 용어는 복수형을 포함해야 하고, 복수 용어는 단수형을 포함해야 한다.
문맥상 명확하게 다르게 필요로 하지 않는 한, 상세한 설명 및 청구항 전체에 걸쳐, 단어 '포함하다', '포함하는' 등은 배제적인 또는 배타적인 의미와는 대조적으로 포함적인 의미로 간주되어야 하며; 즉, "비제한적으로 ~을 포함하는"의 의미로 간주되어야 한다. 단수형 또는 복수형 숫자를 사용하는 단어는 또한, 각각 복수형 또는 단수형 숫자를 포함한다. 부가적으로, 단어 "본원", "상기" 및 "하기" 및 유사한 의미의 단어는 본 출원에 사용되는 경우, 본 출원의 임의의 특정 일부가 아니라 본 출원을 전체로서 지칭해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 하기와 같이 약술된다: 알라닌(Ala; A), 아스파라긴(Asn; N), 아스파르트산(Asp; D), 아르기닌(Arg; R), 시스테인(Cys; C), 글루탐산(Glu; E), 글루타민(Gln; Q), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His; H), 이소류신(Ile; I), 류신(Leu; L), 라이신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y), 및 발린(Val; V).
본 발명의 임의의 양태의 모든 구현예는 문맥상 명확하게 다르게 나타내지 않는 한 조합되어 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 도메인 X1, X2, X3 및 X4를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서:
(a) X1은 E HA LYD A L (서열번호1)과 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
(b) X2는 적어도 8개 아미노산 길이의 나선형-펩타이드이며;
(c) X3은 Y AF N FE LI (서열번호2)와 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
(d) X4는 I TIL Q S W IF (서열번호3)와 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
여기서, X1, X2, X3 및 X4는 폴리펩타이드에서 임의의 순서로 존재할 수 있으며;
아미노산 링커는 임의의 도메인 사이에 존재할 수 있고;
상기 폴리펩타이드는 IL-2 수용체 β
Figure pct00018
c 헤테로이량체(IL-2Rβ
Figure pct00019
c), IL-4 수용체 α
Figure pct00020
c 헤테로이량체(IL-4Rα
Figure pct00021
c), 또는 IL-13 수용체 α 하위단위(IL-13Rα)에 결합한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩타이드는 200 nm 이하, 100 nm 이하, 50 nM 이하, 또는 25 nM 이하의 결합 친화도로 IL-2Rβ
Figure pct00022
c 또는 IL-4Rα
Figure pct00023
c에 결합한다.
일 양태에서, 본 발명은 도메인 X1, X2, X3 및 X4를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서:
(a) X1은 E HA LYD A L (서열번호1)과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
(b) X2는 적어도 8개 아미노산 길이의 나선형-펩타이드이며;
(c) X3 은 Y AF N FE LI (서열번호2)와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
(d) X4는 I TIL Q S W IF (서열번호3)와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
여기서, X1, X2, X3 및 X4는 폴리펩타이드에서 임의의 순서로 존재할 수 있으며;
아미노산 링커는 임의의 도메인 사이에 존재할 수 있고;
상기 폴리펩타이드는 IL-2 수용체 β
Figure pct00024
c 헤테로이량체(IL-2Rβ
Figure pct00025
c)에 결합한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩타이드는 200 nm 이하, 100 nm 이하, 50 nM 이하, 또는 25 nM 이하의 결합 친화도로 IL-2Rβ
Figure pct00026
c에 결합한다.
일 양태에서, 본 발명은 도메인 X1, X2, X3 및 X4를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서:
(a) X1은 아미노산 서열 E HA LYD A L (서열번호1)을 포함하는 펩타이드이며;
(b) X2는 적어도 8개 아미노산 길이의 나선형-펩타이드이며;
(c) X3은 아미노산 서열 Y AF N FE LI (서열번호2)를 포함하는 펩타이드이며;
(d) X4는 아미노산 서열 I TIL Q S W IF (서열번호3)를 포함하는 펩타이드이며;
여기서, X1, X2, X3 및 X4는 폴리펩타이드에서 임의의 순서로 존재할 수 있으며;
아미노산 링커는 임의의 도메인 사이에 존재할 수 있고;
상기 폴리펩타이드는 IL-2 수용체 β
Figure pct00027
c 헤테로이량체(IL-2Rβ
Figure pct00028
c)에 결합한다. 다양한 구현예에서, 폴리펩타이드는 200 nm 이하, 100 nm 이하, 50 nM 이하, 또는 25 nM 이하의 결합 친화도로 IL-2Rβ
Figure pct00029
c에 결합한다.
후속하는 실시예에 제시된 바와 같이, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 (a) IL-2 수용체 β
Figure pct00030
c 헤테로이량체(IL-2Rβ
Figure pct00031
c)에 결합하지만 IL-2Rα 또는 IL-15Rα에 대한 결합 부위를 갖지 않는 IL-2 및 인터루킨-15(IL-15)의 모방체, 또는 (b) IL-4 수용체 α
Figure pct00032
c 헤테로이량체(IL-4Rα
Figure pct00033
c) 또는 IL-13 수용체 α 하위단위(IL-13Rα)(본원에 기재된 자연 IL-4 및 IL-4 모방체는 IL-13 수용체와 교차-반응하여, IL-4Rα/IL13Rα 헤테로이량체를 형성함)에 결합하는 IL-4의 모방체이다. 디자인은 초안정하며(hyper-stable), 자연 사이토카인보다 더 높은 친화도로 인간 및 마우스 IL-2Rβ
Figure pct00034
c 또는 IL-4Rα
Figure pct00035
c에 결합하고, IL-2Rα 및 IL-15Rα와 독립적으로 또는 IL-13Rα와 독립적으로 다운스트림 세포 신호화를 유도한다. 폴리펩타이드는 예를 들어, 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 단백질 모방체는 또 다른 단백질의 기능의 소정의 양태를 모방하는 단백질을 지칭한다. 2개의 단백질은 전형적으로, 상이한 아미노산 서열 및/또는 상이한 구조를 가진다. 다른 것들 중에서도, IL-2 및 IL-15의 드 노보 모방체가 본원에 제공된다. 이들 모방체가 모방하는 IL-2 및 IL-15의 기능의 양태는 IL-2Rβ
Figure pct00036
c의 헤테로이량체화를 유도하여, STAT5의 인산화를 야기하는 것이다. IL-2와 IL-15 둘 다 IL-2Rβ
Figure pct00037
c의 헤테로이량체화를 통해 신호화하기 때문에, 이들 모방체는 IL-2와 IL-15 둘 다의 이러한 생물학적 기능을 모방한다. 이들 모방체는 본원에서, IL-2의 모방체, IL-15의 모방체, 또는 IL-2와 IL-15 둘 다의 모방체로 지칭될 수 있다.
IL-4의 드 노보 모방체가 또한, 제공된다. 이들 모방체는 IL-4의 소정의 기능을 모방할 수 있다. 이들 모방체가 모방하는 IL-4의 기능은 IL-4Rα
Figure pct00038
c의 헤테로이량체화(및/또는 IL-4Rα/IL-13Rα의 헤테로이량체화)의 유도이다.
네이티브 hIL-2는 길고 불규칙한 루프에 의해 연결된 4개의 나선을 포함한다. N-말단 나선(H1)은 베타 하위단위와 감마 하위단위 둘 다와 상호작용하며, 제3 나선(H3)은 베타 하위단위와 상호작용하고, C-말단 나선(H4)은 감마 하위단위와 상호작용하며; 알파 하위단위 상호작용 표면은 불규칙한 제2 나선(H2) 및 2개의 긴 루프에 의해 형성되고, 하나는 H1을 H2에 연결하고 다른 하나는 H3을 H4에 연결한다. H1, H3 및 H4에 의해 고무된(inspired) IL-2Rβ
Figure pct00039
c 또는 IL-4Rα
Figure pct00040
c 계면을 나타내는 비제한적으로 나선 및 베타 가닥을 포함하는 이상화된 구조 도메인(각각 도메인 X1, X3 및 X4로 지칭됨)에 의해 H1, H3 및 H4가 대체되고, 더 양호한 패킹(packing)을 제공하는 이상화된 나선(도메인 X2로 지칭됨)으로 H2가 대체된, 이상화된 단백질이 디자인되었고, 생성되었다. 실시예에 제시된 바와 같이, 광범위한 돌연변이 연구가 수행되었고, 각각의 펩타이드 도메인의 아미노산 서열이 각각, IL-2 또는 IL-4 수용체에의 결합 손실 없이 광범위하게 변형될 수 있고, 상기 도메인이 IL-2 또는 IL-4 수용체에의 결합을 보유하는 한편 임의의 순서로 배치될 수 있음을 실증한다. 폴리펩타이드는 L 아미노산 및 글리신, D- 아미노산 및 글리신, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
그러므로, X1, X2, X3 및 X4는 폴리펩타이드에서 임의의 순서로 존재할 수 있으며; 비제한적인 구현예에서, 순서화는 X1-X2-X3-X4; X1-X3-X2-X4; X1-X4-X2-X3; X3-X2-X1-X4; X4-X3-X2-X1; X2-X3-X4-X1; X2-X1-X4-X3일 수 있다; 등.
도메인은 임의의 길이의 아미노산 조성물의 아미노산 링커에 의해 분리될 수 있다. 링커에 대한 요건은 없으며; 일 구현예에서, 임의의 도메인 사이에 존재하는 링커는 없다. 다른 구현예에서, 아미노산 링커는 도메인 X1, X2, X3 및 X4 사이의 1, 2, 또는 모든 3개의 접합부 사이에 존재할 수 있다. 상기 링커는 의도된 용도에 적절한 것으로 여겨지는 임의의 길이일 수 있다.
다양한 구현예에서, X1은 서열번호1과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다. 다른 구현예에서, X3은 서열번호2와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다. 추가의 구현예에서, X4는 서열번호3과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-2/15 모방체이고, (i) X1은 하기: 잔기 2에서의 H 및 잔기 5에서의 Y 중 하나 또는 둘 다를 포함하며; 그리고/또는 (ii) X3은 하기: 잔기 1에서의 Y, 잔기 3에서의 F, 잔기 4에서의 N, 잔기 7에서의 L, 및 잔기 8에서의 I 중 1, 2, 3, 4, 또는 모든 5개를 포함한다. 추가의 구현예에서, (iii) X4는 잔기 8에서의 I를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-4 모방체이고, (i) X1은 잔기 2에서의 E 및 잔기 5에서의 K를 포함하고; (ii) X3은 잔기 1에서의 F, 잔기 3에서의 K, 잔기 4에서의 R, 잔기 7에서의 R, 및 잔기 8에서의 N을 포함한다. 추가의 구현예에서, (iii) X4는 잔기 8에서의 F를 포함한다.
이들 모든 구현예에서, X1, X3 및 X4는 임의의 적합한 길이일 수 있으며, 이는 각각의 도메인이 서열번호1, 2, 및 3 각각의 펩타이드 이외의 부가적인 아미노산을 임의의 적합한 수로 함유할 수 있음을 의미한다. 일 구현예에서, X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQLHA E HA LYD A L MILNI(서열번호 4)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며; X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 L ED Y AF N FE LI LEE I ARLFESG(서열번호5)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고; X4는 펩타이드 EDEQEEMANAI I TIL Q S W IFS(서열번호6)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.
일 구현예에서, X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQLHA E HA LYD A L MILNI(서열번호 4)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며; X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 L ED Y AF N FE LI LEE I ARLFESG(서열번호5)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고; X4는 이의 길이를 따라 펩타이드 EDEQEEMANAI I TIL Q S W IFS(서열번호6)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.
일 구현예에서, X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQLHA E HA LYD A L MILNI(서열번호 4)와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며; X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 L ED Y AF N FE LI LEE I ARLFESG(서열번호5)와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고; X4는 이의 길이를 따라 펩타이드 EDEQEEMANAI I TIL Q S W IFS(서열번호6)와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.
일 구현예에서, X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQLHA E HA LYD A L MILNI(서열번호 4)와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며; X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 L ED Y AF N FE LI LEE I ARLFESG(서열번호5)와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고; X4는 이의 길이를 따라 펩타이드 EDEQEEMANAI I TIL Q S W IFS(서열번호6)와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.
일 구현예에서, X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQLHA E HA LYD A L MILNI(서열번호 4)와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며; X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 L ED Y AF N FE LI LEE I ARLFESG(서열번호5)와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고; X4는 이의 길이를 따라 펩타이드 EDEQEEMANAI I TIL Q S W IFS(서열번호6)와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.
일 구현예에서, X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQLHA E HA LYD A L MILNI(서열번호 4)와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며; X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 L ED Y AF N FE LI LEE I ARLFESG(서열번호5)와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고; X4는 이의 길이를 따라 펩타이드 EDEQEEMANAI I TIL Q S W IFS(서열번호6)와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-2/15 모방체이고, (i) X1은 하기: 잔기 7에서의 L, 잔기 8에서의 H, 잔기 11에서의 H, 잔기 14에서의 Y; 잔기 18에서의 M 중 1, 2, 3, 4 또는 모든 5개를 포함하며; 그리고/또는 (ii) X3은 하기: 잔기 3에서의 D, 잔기 4에서의 Y, 잔기 6에서의 F, 잔기 7에서의 N, 잔기 10에서의 L, 잔기 11에서의 I, 잔기 13에서의 E, 또는 잔기 14에서의 E 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 모든 8개를 포함한다. 추가의 구현예에서, (iii) X4는 잔기 19에서의 I를 포함한다.
IL-2 모방체의 일 구현예에서, 기준 펩타이드 도메인(즉: 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)에 대한 아미노산 치환은 볼드 폰트로 표시된 AA 잔기에서는 발생하지 않는다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-4/IL-13 모방체이고,
X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQIMA EEALKDAL SILNI(서열번호 8)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 LER FAKRFERN LWGIARLFESG(서열번호 9)와 적어도 37% 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고;
X4는 이의 길이를 따라 펩타이드 EDEQEEMANA IITILQSWFF S(서열번호 10)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며,
여기서,
(i) X1은 잔기 7에서의 I, 잔기 8에서의 T 또는 M, 잔기 11에서의 E, 잔기 14에서의 K 및 잔기 18에서의 S를 포함하고;
(ii) X3은 잔기 3에서의 R, 잔기 4에서의 F, 잔기 6에서의 K, 잔기 7에서의 R, 잔기 10에서의 R, 잔기 11에서의 N, 잔기 13에서의 W, 및 잔기 14에서의 G를 포함한다.
추가의 구현예에서, (iii) X4는 잔기 19에서의 F를 포함한다.
일 구현예에서, 기준 펩타이드 도메인에 대한 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 본원에 사용된 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은, 주어진 아미노산이 유사한 물리화학적 특징을 갖는 잔기에 의해 대체될 수 있으며, 예를 들어, 하나의 지방족 잔기를 또 다른 지방족 잔기(예컨대 서로에 대해 Ile, Val, Leu, 또는 Ala)로 치환하거나, 하나의 극성 잔기를 또 다른 극성 잔기(예컨대 Lys과 Arg; Glu과 Asp; 또는 Gln과 Asn 사이에서)로 치환하는 것을 의미한다. 다른 이러한 보존적 치환, 예를 들어 유사한 소수성 특징을 갖는 전체 영역의 치환이 알려져 있다. 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드는 네이티브 또는 기준 폴리펩타이드의 요망되는 활성, 예를 들어 항원-결합 활성 및 특이성이 보유됨을 확인하기 위해 본원에 기재된 검정법 중 임의의 하나에서 시험될 수 있다. 아미노산은 이의 측쇄의 특성에서의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다(문헌[A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]): (1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H). 대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통의 측쇄 특성에 기초하여 그룹으로 분류될 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비-보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다. 특정 보존적 치환은 예를 들어, Ala으로부터 Gly으로 또는 Ser으로; Arg으로부터 Lys으로; Asn으로부터 Gln으로 또는 His으로; Asp으로부터 Glu으로; Cys으로부터 Ser으로; Gln으로부터 Asn으로; Glu으로부터 Asp으로; Gly으로부터 Ala으로 또는 Pro으로; His으로부터 Asn으로 또는 Gln으로; Ile으로부터 Leu으로 또는 Val으로; Leu으로부터 Ile으로 또는 Val으로; Lys으로부터 Arg으로, Gln으로 또는 Glu으로; Met으로부터 Leu으로, Tyr으로 또는 Ile으로; Phe으로부터 Met으로, Leu으로 또는 Tyr으로; Ser으로부터 Thr으로; Thr으로부터 Ser으로; Trp으로부터 Tyr으로; Tyr으로부터 Trp으로; 및/또는 Phe으로부터 Val으로, Ile으로 또는 Leu으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 서열번호4에 대한 X1에서의 아미노산 잔기는,
위치 01: A F I L M P Q R S W
위치 02: A D E G V K
위치 03: D E F W K
위치 04: D E K N P R W
위치 05: D E H I K L M S
위치 06: A D E G L P S W Q
위치 07: D E L Q Y I
위치 08: A F H W Y M T
위치 09: C F P A
위치 10: C D E F K P
위치 11: D F H E
위치 12: A D E P S T V
위치 13: H I L M P R V W
위치 14: F R W Y K
위치 15: D E N Y
위치 16: A C L M S
위치 17: F I L M P R
위치 18: G M Q Y S
위치 19: I L M P Q V
위치 20: A K L M Q R S
위치 21: G K N P R S W
위치 22: D E I K M N W Y
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-4 모방체이고, 위치 7은 I이며, 위치 8은 M 또는 T이며, 위치 11은 E이며, 위치 14는 K이고, 위치 18은 S이다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-2 모방체이고, 하기: 위치 7은 I이며, 위치 8은 M 또는 T이며, 위치 11은 E이며, 위치 14는 K이고, 위치 18은 S라는 것 중 1, 2, 3, 4, 또는 5개는 참(true)이 아니다.
또 다른 구현예에서, 서열번호5에 대한 X3에서의 아미노산 잔기는,
위치 01: A L
위치 02: D E G K M T
위치 03: D E N Y R
위치 04: C D G T Y F
위치 05: A F H S V W Y
위치 06: A F I M T V Y K
위치 07: D K N S T R
위치 08: A C G L M S V F
위치 09: C H K L R S T V E
위치 10: F I L M Y R
위치 11: I L N T Y
위치 12: F K L M S V
위치 13: A D F G I N P Q S T E W
위치 14: A E F G H S V
위치 15: C I L M V W
위치 16: A D G S T V
위치 17: H K L N R
위치 18: C D G I L Q R T W
위치 19: D F M N W
위치 20: A C E F G M S Y
위치 21: D E G H L M R S T V W
위치 22: A D G K N S Y
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-4/IL-13 모방체이고, 위치 3은 R이며, 위치 4는 F이며, 위치 6은 K이며, 위치 7은 R이며, 위치 10은 R이며, 위치 11은 N이며, 위치 13은 W이고, 위치 14는 G이다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-2 모방체이고, 하기: 위치 3은 R이며, 위치 4는 F이며, 위치 6은 K이며, 위치 7은 R이며, 위치 10은 R이며, 위치 11은 N이며, 위치 13은 W이고, 위치 14는 G라는 것 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 모든 8개는 참이 아니다.
임의의 이러한 구현예에서, 폴리펩타이드는 H, K, L, N 및 R의 아미노산 잔기 외에도 서열번호5에 대해 위치 17에서 시스테인을 추가로 허용한다. 이에, 서열번호5에 대한 X3에서의 아미노산 잔기는,
위치 01: A L
위치 02: D E G K M T
위치 03: D E N Y R
위치 04: C D G T Y F
위치 05: A F H S V W Y
위치 06: A F I M T V Y K
위치 07: D K N S T R
위치 08: A C G L M S V F
위치 09: C H K L R S T V E
위치 10: F I L M Y R
위치 11: I L N T Y
위치 12: F K L M S V
위치 13: A D F G I N P Q S T E W
위치 14: A E F G H S V
위치 15: C I L M V W
위치 16: A D G S T V
위치 17: H K L N R C
위치 18: C D G I L Q R T W
위치 19: D F M N W
위치 20: A C E F G M S Y
위치 21: D E G H L M R S T V W
위치 22: A D G K N S Y
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 6에 대한 X4 내의 아미노산 잔기는,
위치 01: D E G K V
위치 02: D I M S
위치 03: E G H K
위치 04: E G I K Q R S
위치 05: A D E G H S V
위치 06: C D E G I M Q R T V
위치 07: C E L M P R T
위치 08: A F L M W
위치 09: A G L N Q R T
위치 10: A C D E F H I W
위치 11: I M N S V W
위치 12: I K L S V
위치 13: C L M R S T
위치 14: I L P T Y
위치 15: F G I L M N V
위치 16: H K Q R
위치 17: C F K S W Y
위치 18: K Q T W
위치 19: C G N I
위치 20: C F G L Y
위치 21: A F G H S Y
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-4/IL-13 모방체이고, 위치 19는 I이다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-2 모방체이고, 위치 19는 I가 아니다.
임의의 이러한 구현예에서, 폴리펩타이드는 E, G, H 및 K의 아미노산 잔기 외에도 서열번호6에 대해 위치 3에서 시스테인을 추가로 허용한다. 이에, 서열번호6에 대한 X4 내의 아미노산 잔기는,
위치 01: D E G K V
위치 02: D I M S
위치 03: E G H K C
위치 04: E G I K Q R S
위치 05: A D E G H S V
위치 06: C D E G I M Q R T V
위치 07: C E L M P R T
위치 08: A F L M W
위치 09: A G L N Q R T
위치 10: A C D E F H I W
위치 11: I M N S V W
위치 12: I K L S V
위치 13: C L M R S T
위치 14: I L P T Y
위치 15: F G I L M N V
위치 16: H K Q R
위치 17: C F K S W Y
위치 18: K Q T W
위치 19: C G N I
위치 20: C F G L Y
위치 21: A F G H S Y
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 주지된 바와 같이, 도메인 X2는 구조 도메인이므로, 적절한 다른 도메인을 (도메인 순서에 따라) 연결하고 이들을 접을 수 있는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다. 필요한 길이는 만들어지는 단백질의 구조에 따라 다를 것이고, 8개 아미노산 길이 이상일 수 있다. 하나의 예시적이고 비제한적인 구현예에서, X2는 이의 길이를 따라 KDEAEKAKRMKE W MKRIKT(서열번호7)와 적어도 20%, 27%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다. 추가의 구현예에서, 서열번호7에 대한 X2에서의 아미노산 잔기는,
위치 01: A H L M R S V K
위치 02: A D E Q R S T V W Y
위치 03: C E G K L N Q R W
위치 04: A F G N S T V Y
위치 05: A E G I M R V
위치 06: C E K L N R V
위치 07: A C E I L S T V W
위치 08: H K L M S T W Y
위치 09: A I L M Q S R
위치 10: A I M S W Y
위치 11: C I K L S V
위치 12: C E K L P Q R T
위치 13: A D H N W
위치 14: A C G I L S T V M
위치 15: A E G I K L M R V
위치 16: G H L R S T V
위치 17: A I L V
위치 18: A C D E G H I K M S
위치 19: D E G L N V T
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-4/IL-13 모방체이고, 위치 11은 I이다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-2 모방체이고, 위치 11은 I가 아니다.
임의의 이러한 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호7에 대해 위치 5 또는 16에서 시스테인을 추가로 허용한다.
대안적으로, 임의의 이러한 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호7에 대해 위치s 1, 2, 5, 9 또는 16에서 시스테인을 추가로 허용한다.
이에, 서열번호7에 대한 X2에서의 아미노산 잔기는,
위치 01: A H L M R S V K C
위치 02: A D E Q R S T V W Y C
위치 03: C E G K L N Q R W
위치 04: A F G N S T V Y
위치 05: A E G I M R V C
위치 06: C E K L N R V
위치 07: A C E I L S T V W
위치 08: H K L M S T W Y
위치 09: A I L M Q S R C
위치 10: A I M S W Y
위치 11: C I K L S V
위치 12: C E K L P Q R T
위치 13: A D H N W
위치 14: A C G I L S T V M
위치 15: A E G I K L M R V
위치 16: G H L R S T V C
위치 17: A I L V
위치 18: A C D E G H I K M S
위치 19: D E G L N V T
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 하기 폴리펩타이드(즉: 서열번호11-94, 103-184, 190-243, 및 245-247)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 밑줄친 잔기는 링커이고 선택적이며, 링커의 각각의 잔기는 존재하는 경우 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. 하기 각각의 변형에서, 2개의 서열번호 링커 위치를 선택적이고 가변적인 것으로 포함하는 제1 서열번호, 및 하기 제시된 바와 같은 서열을 열거하는 제2 서열번호를 포함한다.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
각각의 하기 변이체에 대해, 2개의 서열번호 하기 제시된 바와 같은 서열을 열거하는 제1 서열번호, 및 선택적이고 가변적인 것으로서 링커 위치를 포함하는 제2 서열번호가 제공된다.
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호90, 181, 및 247로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호90, 181, 또는 247의 아미노산 서열과 동일한 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 (i) 인간 또는 뮤린 IL-2R알파에 결합하지 않으며, (ii) 인간 IL2RB에 약 11.2 nM의 친화도로 결합하며, (iii) 뮤린 IL2RB에 약 16.1 nm의 친화도로 결합하며, (IV) 인간 IL-2Rβ
Figure pct00065
c에 약 18.8 nM의 친화도로 결합하고, (V) 뮤린 IL-2Rβ
Figure pct00066
c에 약 3.4 nM의 친화도로 결합한다.
전장(full length) 폴리펩타이드의 임의의 이들 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-4/IL-13 모방체일 수 있으며, 위치 7은 I이며, 위치 8은 T 또는 M이며, 위치 11은 E이며, 위치 14는 K이며, 위치 18은 S이며, 위치 33은 Q이며, 위치 36은 R이며, 위치 37은 F이며, 위치 39는 K이며, 위치 40은 R이며, 위치 43은 R이며, 위치 44는 N이며, 위치 46은 W이고, 위치 47은 G이다. 추가의 구현예에서, 위치 68은 I이고, 위치 98은 F이다.
전장 폴리펩타이드의 임의의 이들 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-2 모방체일 수 있으며, 하기: 위치 7은 I이며, 위치 8은 T 또는 M이며, 위치 11은 E이며, 위치 14는 K이며, 위치 18은 S이며, 위치 33은 Q이며, 위치 36은 R이며, 위치 37은 F이며, 위치 39는 K이며, 위치 40은 R이며, 위치 43은 R이며, 위치 44는 N이며, 위치 46은 W이고, 위치 47은 G라는 것 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 모든 14개는 참이 아니다. 추가의 구현예에서, 하기: 위치 68은 I이고, 위치 98은 F라는 것 중 1 또는 2개 모두 참이 아니다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들이 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드는 네이티브 IL-2의 3차원 구조의 백본 원자 또는 알파 탄소 원자 상에 중첩된 경우, 공통 잔기 백본 원자 또는 알파 탄소 원자의 제곱평균제곱근 편차(root mean square deviation)를 2.5 옹스트롬 미만, 1.5 옹스트롬 미만, 또는 1 옹스트롬 미만으로 갖는 구조적 좌표와 함께 3차원 구조를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들이 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드는 표 E2의 구조적 좌표를 갖는 3차원 구조의 백본 원자 또는 알파 탄소 원자 상에 중첩된 경우, 공통 잔기 백본 원자 또는 알파 탄소 원자의 제곱평균제곱근 편차를 2.5 옹스트롬 미만, 1.5 옹스트롬 미만, 또는 1 옹스트롬 미만으로 갖는 구조적 좌표와 함께 3차원 구조를 갖는다.
추가의 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들이 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드는 마우스 IL-2 수용체 β
Figure pct00067
c와의 3원 복합체로 존재하는 경우, 상기 폴리펩타이드는 마우스 IL-2 수용체 β
Figure pct00068
c와의 3원 복합체로 존재하는 경우 네이티브 IL-2의 3차원 구조의 백본 원자 또는 알파 탄소 원자 상에 중첩된 경우, 공통 잔기 백본 원자 또는 알파 탄소 원자의 제곱평균제곱근 편차를 2.5 옹스트롬 미만, 1.5 옹스트롬 미만, 또는 1 옹스트롬 미만으로 갖는 구조적 좌표와 함께 3차원 구조를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들이 조합의 IL-4 모방체 폴리펩타이드는 네이티브 IL-4의 3차원 구조의 백본 원자 또는 알파 탄소 원자 상에 중첩된 경우, 공통 잔기 백본 원자 또는 알파 탄소 원자의 제곱평균제곱근 편차를 2.5 옹스트롬 미만, 1.5 옹스트롬 미만, 또는 1 옹스트롬 미만으로 갖는 구조적 좌표와 함께 3차원 구조를 갖는다.
각각의 이들 구현예에서, 폴리펩타이드의 3차원 구조는 컴퓨터 모델링을 사용하여 결정될 수 있거나, 대안적으로, 폴리펩타이드의 3차원 구조는 결정학적으로-결정되는 구조 데이터를 사용하여 결정된다.
본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 일 구현예에서, X1, X2, X3 및 X4는 알파-나선형 도메인이다. 또 다른 구현예에서, X1, X2, X3 및 X4 중 각각의 아미노산 길이는 독립적으로, 적어도 약 8, 10, 12, 14, 16, 19개 이상의 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, X1, X2, X3 및 X4 중 각각의 아미노산 길이는 독립적으로, 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 또는 50개 이하의 아미노산 길이이다. 다양한 추가의 구현예에서, X1, X2, X3 및 X4 중 각각의 아미노산 길이는 독립적으로, 약 8-1000, 8-500, 8-400, 8-300, 8-200, 8-100, 8-50, 10-1000, 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 10-50, 12-1000, 12-500, 12-400, 12-300, 12-200, 12-100, 12-50, 14-1000, 14-500, 14-400, 14-300, 14-200, 14-100, 14-50, 16-1000, 16-500, 16-400, 16-300, 16-200, 16-100, 16-50, 19-1000, 19-500, 19-400, 19-300, 19-200, 19-100, 또는 약 19-50개 아미노산 길이이다.
본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X1은 인간 IL-2 수용체의 베타 및 감마 하위단위에 결합한다. 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X2는 인간 IL-2 수용체에 결합하지 않는다. 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X3은 인간 IL-2 수용체의 베타 하위단위에 결합한다. 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드의 추가의 구현예에서, X4는 인간 IL-2 수용체의 감마 하위단위에 결합한다. 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 인간 또는 뮤린 IL-2 수용체의 알파 하위단위에 결합하지 않는다. 일 구현예에서, 상기 결합은 생물학적으로 적절한 농도에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같이 특이적인 결합이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드는 200 nm 이하, 100 nm 이하, 50 nM 이하, 또는 25 nM 이하의 결합 친화도로 IL-2 수용체 β
Figure pct00069
c 헤테로이량체(IL-2Rβ
Figure pct00070
c)에 결합한다. 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드의 추가의 구현예에서, 인간 및 마우스 IL-2 수용체에 대한 폴리펩타이드의 친화도는 네이티브 IL-2와 대략 동일하거나 그보다 크다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-4 모방체 폴리펩타이드는 200 nm 이하, 100 nm 이하, 50 nM 이하, 또는 25 nM 이하의 결합 친화도로 IL-4 수용체 α
Figure pct00071
c 헤테로이량체(IL-4Rα
Figure pct00072
c)에 결합한다. 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-4 모방체 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, 인간 및 마우스 IL-4 수용체에 대한 폴리펩타이드의 친화도는 네이티브 IL-4와 대략 동일하거나 그보다 크다.
본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드의 일 구현예에서, 폴리펩타이드는 네이티브 IL-2와 대략 동일하거나 그보다 큰 약효로 IL-2 수용체를 발현하는 세포에서 STAT5 인산화를 자극한다. 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-2 수용체 β
Figure pct00073
c 헤테로이량체를 발현하지만 IL-2 수용체 α가 결여된 세포에서 네이티브 IL-2와 대략 동일하거나 그보다 큰 약효로 IL-2 수용체를 발현하는 세포에서 STAT5 인산화를 자극한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 IL-2 모방체 폴리펩타이드는 네이티브 IL-2의 열적 안정성과 대략 동일하거나 그보다 큰 열적 안정성을 실증한다.
본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 폴리펩타이드의 추가의 구현예에서, 폴리펩타이드는 열적 안정성 시험 후 이의 접혀진 구조의 적어도 70%, 80%, 또는 90%를 유지하거나 회복하며, 그리고/또는 열적 안정성 시험 후 이의 타원율 스펙트럼의 적어도 80%를 유지하거나 회복하며, 그리고/또는 열적 안정성 시험 후 이의 활성의 적어도 70% 또는 80%를 유지하거나 회복한다. 일 구현예에서, 이러한 활성은 STAT5 인산화 검정법에 의해 결정된다. 또 다른 구현예에서, 열적 안정성은 222 nM에서 원편광 이색성(CD; circular dichroism) 분광법에 의해 측정된다. 추가의 구현예에서, 열적 안정성 시험은 상기 폴리펩타이드를 1시간의 시간 프레임(time frame)에서 25℃로부터 95℃까지 가열하는 단계, 상기 폴리펩타이드를 5분 시간 프레임 내에서 25℃까지 냉각시키는 단계, 및 222 nm에서 타원율을 모니터링하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 폴리펩타이드는 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 발현될 수 있다(폴리펩타이드가 유전적으로 인코딩 가능한 경우). 폴리펩타이드는 생체내에서 증가된 반감기를 촉진하기 위해 비제한적으로 알부민, PEG화(하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 사슬의 부착), HES화, PAS화, 글리코실화를 포함하여 다른 화합물, 예컨대 안정화 화합물에 연결될 수 있거나, Fc-융합으로서 생성되거나 탈면역화된 변이체로 생성될 수 있다. 이러한 연결은 공유적 또는 비-공유적일 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜("PEG")-함유 모이어티의 첨가는 폴리펩타이드의 시스테인 잔기에의 말레이미드기에 연결된 PEG 기(" PEG -MAL")의 부착을 포함할 수 있다. PEG -MAL의 적합한 예는 메톡시 PEG -MAL 5 kD; 메톡시 PEG -MAL 20 kD; 메톡시 ( PEG )2-MAL 40 kD; 메톡시 PEG (MAL)2 5 kD; 메톡시 PEG (MAL)2 20 kD; 메톡시 PEG (MAL)2 40 kD; 또는 이들의 조합이다. 미국 특허 제8,148,109호를 참조한다. 다른 구현예에서, PEG는 분지쇄 PEG 및/또는 다수의 PEG 사슬을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 비제한적으로 PEG-함유 모이어티를 포함하는 안정화 화합물은 폴리펩타이드에서 시스테인 잔기에 연결된다. 또 다른 구현예에서, 시스테인 잔기는 X2 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 시스테인 잔기는 예를 들어, X2 도메인에서 다수의 위치 중 임의의 하나에 존재한다. 일부 이러한 구현예에서, X2 도메인은 적어도 19개 아미노산 길이이고, 시스테인 잔기는 19개 아미노산에 대해 위치 1, 2, 5, 9 또는 16에 존재한다. 추가의 구현예에서, 비제한적으로 PEG-함유 모이어티를 포함하는 안정화 화합물은 비제한적으로 서열번호90에 대한 아미노산 잔기 62에 존재하는 시스테인 잔기에 연결되는 것을 포함하여, 말레이미드기를 통해 시스테인 잔기에 연결된다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드는 Neo-2/15 폴리펩타이드이고, Neo-2/15의 아미노산은 안정화 모이어티(예를 들어, PEG-함유 모이어티)의 부착을 위해 시스테인 잔기로 돌연변이화된다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 Neo-2/15 폴리펩타이드이고, 서열번호90, 181, 또는 247에 대한 위치 50, 53, 62, 69, 73, 82, 56, 58, 59, 66, 77, 또는 85 또는 이들의 조합에서의 아미노산은 안정화 모이어티(예를 들어, PEG-함유 모이어티)의 부착을 위해 시스테인 잔기로 돌연변이화된다. 이에, 추가의 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호90, 181, 또는 247[Neo-2/15]의 아미노산 서열의 전장과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서, 하기 돌연변이:
R50C;
E53C;
E62C;
E69C;
R73C; 및/또는
E82C 중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 모든 6개가 존재한다.
추가의 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호90, 181, 또는 247의 아미노산 서열의 전장과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서, 하기 돌연변이:
D56C;
K58C;
D59C;
R66C;
T77C;
E85C;
R50C;
E53C;
E62C;
E69C;
R73C; 및/또는
E82C 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모든 12개가 존재한다.
추가의 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호 190-243으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 전장과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호190 및 217로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호190의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호191 및 218로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호191의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호192 및 219로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호192의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호193 및 220으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호193의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호194 및 221으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호194의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호195 및 222로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호195의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호196 및 223으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호196의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호197 및 224로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호197의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호198 및 225로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호198의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호199 및 226으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호199의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호200 및 227으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호200의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호201 및 228으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 이의 길이를 따라 서열번호201의 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호195, 207, 214, 222, 234, 및 241로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 전장과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나; 폴리펩타이드는 서열번호195, 207, 및 214로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 전장과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함한다.
추가의 구현예에서, 폴리펩타이드는 표적화 도메인을 추가로 포함한다. 이 구현예에서, 폴리펩타이드는 관심 표적으로 지향(directed)될 수 있다. 상기 표적화 도메인은 상기 폴리펩타이드에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합될 수 있다. 표적화 도메인이 폴리펩타이드에 비-공유적으로 결합되는 구현예에서, 비제한적으로 스트렙타비딘-비오틴 링커를 포함하여, 이러한 비-공유 결합을 위한 임의의 적합한 수단이 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 존재하는 경우, 폴리펩타이드와의 번역적 융합이다. 이 구현예에서, 폴리펩타이드 및 표적화 도메인은 번역적 융합에서 서로에 대해 직접적일 수 있거나, 의도된 목적에 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있다. 예시적인 이러한 링커는 WO2016178905, WO2018153865(특히 13쪽에서), 및 WO 2018170179(특히 단락 [0316]-[0317]에서)에 개시된 것들을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌다. 다른 구현예에서, 적합한 링커는 펩타이드 링커, 예컨대 GGGGG(서열번호 95), GSGGG(서열번호 96), GGGGGG(서열번호 97), GGSGGG(서열번호 98), GGSGGSGGGSGGSGSG(서열번호 99), GSGGSGGGSGGSGSG(서열번호 100), GGSGGSGGGSGGSGGGGSGGSGGGSGGGGS(서열번호 101), 및 X가 Q, E 또는 S이고 n이 2 내지 5인 [GGGGX]n(서열번호 102)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
표적화 도메인은 관심 표적에 결합하는 폴리펩타이드 도메인 또는 저분자이다. 하나의 비제한적인 구현예에서, 표적화 도메인은 세포 표면 단백질에 결합하며; 이 구현예에서, 세포는 적합한 표적화 도메인에 의해 결합될 수 있는 표면 단백질을 포함하는 임의의 관심 유형의 세포일 수 있다. 일 구현예에서, 세포 표면 단백질은 종양 세포, 종양 혈관 구성요소 세포, 종양 미세환경 세포(예를 들어, 섬유아세포, 침윤성 면역 세포, 또는 기질 요소), 다른 암세포 및 면역 세포(비제한적으로 CD8+ T 세포, T-조절 세포, 수지상 세포, NK 세포, 또는 대식세포를 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에 존재한다. 세포 표면 단백질이 종양 세포, 혈관 구성요소 세포, 또는 종양 미세환경 세포(예를 들어, 섬유아세포, 침윤성 면역 세포, 또는 기질 요소), 임의의 적합한 종양 세포, 혈관 구성요소 세포, 또는 종양 미세환경 세포의 표면 상에 존재하는 경우, 비제한적으로 EGFR, EGFRvIII, Her2, HER3, EpCAM, MSLN, MUC16, PSMA, TROP2, ROR1, RON, PD-L1, CD47, CTLA-4, CD5, CD19, CD20, CD25, CD37, CD30, CD33, CD40, CD45, CAMPATH-1, BCMA, CS-1, PD-L1, B7-H3, B7-DC, HLD-DR, 암배아 항원(CEA), TAG-72, MUC1, 폴레이트-결합 단백질, A33, G250, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), 페리틴, GD2, GD3, GM2, Ley, CA-125, CA19-9, 표피 성장 인자, p185HER2, IL-2 수용체, EGFRvIII(de2-7 EGFR), 섬유아세포 활성화 단백질, 테나신(tenascin), 메탈로프로테이나제(metalloproteinase), 엔도시알린, 혈관 내피 성장 인자, avB3, WT1, LMP2, HPV E6, HPV E7, Her-2/neu, MAGE A3, p53 비돌연변이체, NY-ESO-1, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, gp100, p53 돌연변이체, PR1, bcr-abl, 티로시나제, 서바이빈(survivin), PSA, hTERT, 육종 전좌 절단점 단백질, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, ERG, NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B 1, 폴리시알산, MYCN, RhoC, TRP-2, 푸코실 GM1, 메소텔린 (MSLN), PSCA, MAGE Al, sLe(동물), CYP1B1, PLAV1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, 카르보닉 안하이드라제(carbonic anhydrase) IX, PAX5, OY-TESL 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, 레구마인, Tie 3, VEGFR2, MAD-CT-1, PDGFR-B, MAD-CT-2, ROR2, TRAIL1, MUC16, MAGE A4, MAGE C2, GAGE, EGFR, CMET, HER3, MUC15, CA6, NAPI2B, TROP2, CLDN6, CLDN16, CLDN18.2, CLorf186, RON, LY6E, FRA, DLL3, PTK7, STRA6, TMPRSS3, TMPRSS4, TMEM238, UPK1B, VTCN1, LIV1, ROR1, 및 Fos-관련 항원 1을 포함하는 표면 마커가 표적화될 수 있다.
다른 구현예에서, 세포 표면 단백질이 종양 세포, 혈관 구성요소 세포, 또는 종양 미세환경 세포(예를 들어, 섬유아세포, 침윤성 면역 세포, 또는 기질 요소), 임의의 적합한 종양 세포, 혈관 구성요소 세포, 또는 종양 미세환경 세포의 표면 상에 존재하는 경우, 비제한적으로 하기 목록:
(1) BMPR1B (골 형태발생 단백질 수용체-유형 IB, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--001203);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--003486);
(3) STEAP1 (전립선의 6 막관통 상피 항원, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--012449);
(4) 0772P (CA125, MUC16, Genbank 기탁 번호 AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 강화 인자, 메소텔린, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 계통 34 (소듐 포스페이트), 구성원 2, 유형 II 소듐-의존적 포스페이트 수송체 3b, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7 트롬보스폰딘 반복부 (유형 1 및 유형 1-유사), 막관통 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, Genbank 기탁 번호 AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, Genbank 기탁 번호 AY358628);
(9) ETBR (엔도텔린 유형 B 수용체, Genbank 기탁 번호 AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--017763);
(11) STEAP2 (HGNC.sub.--8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관 유전자 1, 전립선암 연관 단백질 1, 전립선의 6 막관통 상피 항원 2, 6 막관통 전립선 단백질, Genbank 기탁 번호 AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널, 하위계통 M, 구성원 4, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--003203 또는 NM.sub.--003212);
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR(C3d/엡스타인 바 바이러스 수용체) 또는 Hs. 73792, Genbank 기탁 번호 M26004);
(15) CD79b (IGb (면역글로불린-관련 베타), B29, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 앵커 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, Genbank 기탁 번호 NM_--030764);
(17) HER2 (Genbank 기탁 번호 M11730);
(18) NCA (Genbank 기탁 번호 M18728);
(19) MDP (Genbank 기탁 번호 BC017023);
(20) IL20R.알파. (Genbank 기탁 번호 AF184971);
(21) Brevican (Genbank 기탁 번호 AF229053);
(22) Ephb2R (Genbank 기탁 번호 NM_--004442);
(23) ASLG659 (Genbank 기탁 번호 AX092328);
(24) PSCA (Genbank 기탁 번호 AJ297436);
(25) GEDA (Genbank 기탁 번호 AY260763);
(26) BAFF-R (Genbank 기탁 번호 NP_--443177.1);
(27) CD22 (Genbank 기탁 번호 NP-001762.1);
(28) CD79a(CD79A, CD79.알파., 면역글로불린-관련 알파, Ig 베타(CD79B)와 공유적으로 상호작용하고 표면 상에서 IgM 분자와 복합체를 형성하고, B-세포 분화에 연관된 신호를 전달하는 B 세포-특이적 단백질, Genbank 기탁 번호 NP_--001774.1);
(29) CXCR5(버킷 림프종 수용체 1, CXCL13 케모카인에 의해 활성화되며, 림프구 이동 및 체액성 방어에서 작용하고, HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병의 발병에서 역할을 하는 G 단백질-커플링된 수용체, Genbank 기탁 번호 NP_--001707.1);
(30) HLA-DOB(펩타이드에 결합하고 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 클래스 II 분자(Ia 항원)의 베타 하위단위, Genbank 기탁 번호 NP_--002111.1);
(31) P2X5(푸린성(Purinergic) 수용체 P2X 리간드-개폐 이온 채널 5, 세포외 ATP에 의해 개폐되는 이온 채널은 시냅스 전달 및 신경발생에 관여할 수 있으며, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정(idiopathic detrusor instability)의 병리생리학에 기여할 수 있음, Genbank 기탁 번호 NP_--002552.2);
(32) CD72(B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2, Genbank 기탁 번호 NP_--001773.1);
(33) LY64(림프구 항원 64(RP105), 류신 풍부 반복부(LRR) 계통의 유형 I 막 단백질은 B-세포 활성화 및 세포자멸사를 조절하며, 기능 상실은 전신 홍반성 루푸스 환자에서 증가된 질환 활성과 연관되어 있음, Genbank 기탁 번호 NP_--005573.1);
(34) FCRH1(Fc 수용체-유사 단백질 1, C2 유형 Ig-유사 및 ITAM 도메인을 함유하는 면역글로불린 Fc 도메인에 대한 추정(putative) 수용체는 B-림프구 분화에서 역할을 할 수 있음, Genbank 기탁 번호 NP_--443170.1); 또는
(35) IRTA2(면역글로불린 슈퍼계통 수용체 전좌 연관 2, B 세포 발달 및 림프종발생(lymphomagenesis)에서 가능한 역할을 갖는 추정 면역수용체; 전좌에 의한 유전자의 탈조절(deregulation)은 일부 B 세포 악성물에서 발생함, Genbank 기탁 번호 NP_--112571.1)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드를 포함하는 표면 마커가 표적화될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 면역 세포 표면 마커에 결합한다. 이 구현예에서, 표적은 비제한적으로 CD8+ T 세포, T-조절 세포, 수지상 세포, NK 세포, 또는 대식세포를 포함한 임의의 적합한 면역 세포 상의 세포 표면 단백질에 결합한다. 표적화 도메인은 비제한적으로 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD40, CD68, CD123, CD254, PD-1, B7-H3, 및 CTLA-4를 포함한 임의의 적합한 면역 세포 표면 마커(비제한적으로 조작된 CAR-T 세포를 포함하여, 내인성 또는 조작된 면역 세포이든지 간에)를 표적화할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 PD-1, PDL-1, CTLA-4, TROP2, B7-H3, CD33, CD22, 카르보닉 안하이드라제 IX, CD123, 넥틴-4, 조직 인자 항원, CD154, B7-H3, B7-H4, FAP(섬유아세포 활성화 단백질) 또는 MUC16에 결합하며, 그리고/또는 표적화 도메인은 PD-1, PDL-1, CTLA-4, TROP2, B7-H3, CD33, CD22, 카르보닉 안하이드라제 IX, CD123, 넥틴-4, 조직 인자 항원, CD154, B7-H3, B7-H4, FAP(섬유아세포 활성화 단백질) 또는 MUC16에 결합한다.
모든 이들 구현예에서, 표적화 도메인은 관심 표적에 결합하고 본 개시내용의 폴리펩타이드 내로 혼입될 수 있는 임의의 적합한 폴리펩타이드일 수 있다. 비제한적인 구현예에서, 표적화 도메인은 scFv, F(ab), F(ab')2, B 세포 수용체(BCR), DARPin, 아피바디(affibody), 모노바디(monobody), 나노바디, 디아바디(diabody), 항체(단일특이적 또는 이중특이적 항체를 포함함); 비제한적으로 RGD 인테그린-결합 펩타이드를 포함하는 세포-표적화 올리고펩타이드, 드 노보 디자인된 결합제, 앱타머, 비사이클(bicycle) 펩타이드, 코노톡신(conotoxin), 저분자, 예컨대 엽산, 및 세포 표면에 결합하는 바이러스를 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 이황화 결합(즉: 1, 2, 3, 4개 이상의 이황화 결합)을 포함한다. 임의의 적합한 이황화 결합, 예컨대 2개의 상이한 나선을 연결하는 이황화 결합이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 이황화 결합은 나선 1(X1) 및 나선 4(X4)를 연결하는 이황화 결합을 포함한다. 이황화 결합은 예를 들어, 2개의 도메인을 함께 연결하는 이황화 결합이 없는 실질적으로 유사한 폴리펩타이드와 비교하여 폴리펩타이드의 열적 안정성을 향상시킨다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 펩타이드 도메인은, 본 개시내용의 폴리펩타이드 또는 펩타이드 도메인에 존재하지 않는 부가적인 잔기를 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에 포함할 수 있으며; 이들 부가적인 잔기는 기준 폴리펩타이드에 대해 본 개시내용의 폴리펩타이드 또는 펩타이드 도메인의 동일성 백분율을 결정하는 데에 포함되지 않는다. 비제한적으로 검출 태그(즉: 형광 단백질, 항체 에피토프 태그 등), 어댑터, 정제 목적에 적합한 리간드(His 태그 등), 폴리펩타이드에 기능성을 부가하는 다른 펩타이드 도메인 등을 포함한 이러한 잔기는 의도된 용도에 적합한 임의의 잔기일 수 있다. 이러한 기의 부착에 적합한 잔기는 시스테인, 라이신 또는 p-아세틸페닐알라닌 잔기를 포함할 수 있거나, 미국 특허 제9,676,871호 및 제9,777,070호에 개시된 바와 같은 트랜스글루타미나제와의 반응에 적합한 태그, 예컨대 아미노산 태그일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 유전적으로 인코딩될 수 있는 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함한 핵산을 제공한다. 단리된 핵산 서열은 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있다. 이러한 단리된 핵산 서열은, 비제한적으로 polyA 서열, 변형된 Kozak 서열, 및 에피토프 태그, 외수송 신호, 및 분비 신호, 핵 위치화 신호, 및 혈장막 위치화 신호를 인코딩하는 서열을 포함하여, 인코딩된 단백질의 발현 및/또는 정제를 촉진하는 데 유용한 부가적인 서열을 포함할 수 있다. 본원의 교시에 기초하여, 어떤 핵산 서열이 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩할 것인지 당업자에게 명백해질 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적합한 제어 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 임의의 양태의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. "재조합 발현 벡터"는 핵산 코딩 영역 또는 유전자를, 유전자 생성물의 발현에 영향을 줄 수 있는 임의의 제어 서열에 작동적으로 연결하는 벡터를 포함한다. 본 발명의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 "제어 서열"은 핵산 분자의 발현에 영향을 줄 수 있는 핵산 서열이다. 제어 서열은, 이들 제어 서열이 이의 발현을 지향시키도록 작용하는 한, 핵산 서열과 인접해 있을 필요는 없다. 그러므로, 예를 들어, 전사되었으나 아직 번역되지 않은 개입 서열은 프로모터 서열과 핵산 서열 사이에 존재할 수 있고, 상기 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동적으로 연결되어" 있는 것으로 여겨질 수 있다. 다른 이러한 제어 서열은 폴리아데닐화 신호, 종결 신호, 및 리보솜 결합 부위를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 발현 벡터는 플라스미드 및 바이러스-기초 발현 벡터를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 포유류 시스템에서 개시된 핵산 서열의 발현을 유도하는 데 사용되는 제어 서열은 구성적(비제한적으로 CMV, SV40, RSV, 액틴, EF를 포함하여 여러 가지 프로모터 중 임의의 프로모터에 의해 유도됨)일 수 있거나 유도적(비제한적으로 테트라사이클린, 엑디손, 스테로이드-반응성을 포함하여 많은 유도적 프로모터 중 임의의 프로모터에 의해 유도됨)일 수 있다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA 내로의 통합에 의해 숙주 유기체에서 복제 가능해야 한다. 다양한 구현예에서, 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스-기초 벡터(비제한적으로 레트로바이러스 벡터 또는 종양용해성(oncolytic) 바이러스를 포함함), 또는 임의의 다른 적합한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 치료적 이익을 위해 생체내에서 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 본 개시내용의 방법에서 투여될 수 있다. 비제한적인 구현예에서, 발현 벡터는 본원에 개시된 치료 방법을 수행하기 위해 세포 치료 표적(비제한적으로 CAR-T 세포 또는 종양 세포를 포함함)을 형질감염시키거나 형질도입하는 데 사용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서, 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 세포는 본 발명의 발현 벡터를 혼입시키기 위해 비제한적으로 박테리아 형질전환, 칼슘 포스페이트 공동-침전, 전기천공, 또는 리포솜 매개-, DEAE 덱스트란 매개-, 다중양이온성(polycationic) 매개-, 또는 바이러스 매개 형질감염을 포함하는 기법을 사용하여 일시적으로 또는 안정하게 조작될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, 등, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; 문헌[Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2 nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY)] 참조). 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 본 발명의 부가적인 파트이다. 상기 방법은 (a) 폴리펩타이드의 발현에 도움이 되는 조건 하에 본 발명의 이러한 양태에 따른 숙주를 배양하는 단계, 및 (b) 선택적으로, 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다. 발현된 폴리펩타이드는 세포-무함유 추출물로부터 회수될 수 있으나, 바람직하게는 이들 폴리펩타이드는 배양 배지로부터 회수된다.
추가의 양태에서, 본 개시내용은 상기 개시내용의 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 및 이의 단편일 수 있고, 당업자에 알려진 기법을 사용하여 만들어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "선택적으로 결합하다"는, 당업자에 의해 잘 이해되는 바와 같이, 하나 이상의 다른 생물학적 분자, 구조, 세포, 조직 등과 대조적으로, 본 개시내용의 폴리펩타이드에의 항체의 우선적인 결합을 의미한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 예를 들어, 하기 기재된 개시내용의 방법에 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 본 개시내용의 폴리펩타이드 이외에, (a) 동결건조보호제; (b) 계면활성제; (c) 벌킹제; (d) 장성 조정제(tonicity adjusting agent); (e) 안정화제; (f) 보존제 및/또는 (g) 완충제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내의 완충제는 Tris 완충제, 히스티딘 완충제, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제 또는 아세테이트 완충제이다. 약제학적 조성물은 또한, 동결건조보호제, 예를 들어, 수크로스, 소르비톨 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 약제학적 조성물은 보존제, 예를 들어, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메로살, 벤조산, 및 이들의 다양한 혼합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 글리신과 같은 벌킹제를 포함한다. 더욱 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트- 60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-85, 폴록사머-188, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 트리올레에이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 약제학적 조성물은 또한, 장성 조정제, 예를 들어, 제제를 인간 혈액과 실질적으로 등장성 또는 등삼투압성으로 되게 하는 화합물을 포함할 수 있다. 예시적인 장성 조정제는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 메티오닌, 만니톨, 덱스트로스, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 아르기닌 및 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 부가적으로, 안정화제, 예를 들어, 관심 단백질과 조합된 경우 동결건조된 형태 또는 액체 형태의 관심 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 실질적으로 방지하거나 감소시키는 분자를 포함한다. 예시적인 안정화제는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 아르기닌 및 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함한다.
폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포는 약제학적 조성물에서 단독 활성제일 수 있거나, 상기 조성물은 의도된 용도에 적합한 하나 이상의 다른 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 개시내용은 암을 치료하고/하거나 제한하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포, 이의 염, 이의 접합체, 또는 이의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 암을 치료하고/하거나 제한하는 단계를 포함한다. 상기 방법이 암을 치료하는 단계를 포함하는 경우, 하나 이상의 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포는 이미 암을 갖는 것으로 진단되었던 대상체에게 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, "치료하다" 또는 "치료하는"은 하기: (a) 대상체에서 종양 및/또는 전이의 크기 또는 부피를 감소시키는 것; (b) 대상체에서 종양 및/또는 전이의 크기 또는 부피의 임의의 증가를 제한하는 것; (c) 생존율을 증가시키는 것; (d) 암과 관련된 증상의 중증도를 감소시키는 것; (e) 암과 관련된 증상의 발달을 제한하거나 예방하는 것; 및 (f) 암과 관련된 증상의 악화를 저해하는 중 하나 이상을 달성하는 것을 의미한다.
상기 방법이 암의 발병을 제한하는 단계를 포함하는 경우, 하나 이상의 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포는 암을 갖고 있는 것으로 알려져 있지 않으나 암의 위험에 있을 수 있는 대상체에게 예방적으로 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, "제한하는"은 비제한적으로 암의 가족력이 있는 대상체, 유전적으로 암의 소인이 있는 대상체, 암에 대해 증상적인 대상체 등을 포함하여 암의 위험에 있는 대상체에서 암의 발병을 제한하는 것을 의미한다.
상기 방법은 비제한적으로 결장암, 흑색종, 신세포암, 두경부 편평세포암, 위암, 요로상피세포암종, 호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 간세포암종, 췌장암, 메르켈 세포 암종 결장직장암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암, 및 진단 검사, 예컨대 현미부수체 불안정성(microsatellite instability), 종양 돌연변이 부담(mutational burden), PD-L1 발현 수준, 또는 면역점수(immunoscore) 검정법(면역항암학회(the Society for Immunotherapy of Cancer)에 의해 개발된 바와 같음)에 의해 선택된 임의의 종양 유형을 포함하는 임의의 적합한 암을 치료하거나 이의 발병을 제한하는 데 사용될 수 있다.
상기 대상체는 암을 갖고 있거나 암이 발병할 위험에 있는 임의의 대상체일 수 있다. 일 구현예에서, 대상체는 비제한적으로 인간, 개, 고양이, 말, 소 등을 포함하는 포유류이다.
추가의 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용의 폴리펩타이드, 재조합 핵산, 발현 벡터, 재조합 숙주 세포, 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계에 의한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 조절될 "면역 반응"은 자극에 대한 면역계 세포, 예컨대 B 세포, T 세포(CD4 또는 CD8), 조절 T 세포, 항원-제시 세포, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, NKT 세포, NK 세포, 호염기구, 호산구, 또는 호중구에 의한 반응을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 반응은 특정 항원에 특이적이고("항원-특이적 반응"), CD4 T 세포, CD8 T 세포 또는 B 세포의 항원-특이적 수용체를 통한 이들 세포에 의한 반응을 지칭한다. 일부 구현예에서, 면역 반은 T 세포 반응, 예컨대 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응이다. 이들 세포에 의한 이러한 반응은 예를 들어, 세포독성, 증식, 사이토카인 또는 케모카인 생성, 트래피킹(trafficking), 또는 식세포작용을 포함할 수 있고, 반응을 겪는 면역 세포의 성질에 따라 다를 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 조절될 면역 반응은 T-세포 매개이다.
일부 양태에서, 면역 반응은 항암 면역 반응이다. 일부 이러한 양태에서, 본원에 기재된 IL-2 모방체는 암을 갖고 있는 대상체에게 투여되어 상기 대상체에서 항암 면역 반응을 조절한다.
일부 양태에서, 면역 반응은 조직 수복 면역 반응이다. 일부 이러한 양태에서, 본원에 기재된 IL-4 모방체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되어 상기 대상체에서 조직 수복 면역 반응을 조절한다.
일부 양태에서, 면역 반응은 상처 치유 면역 반응이다. 일부 이러한 양태에서, 본원에 기재된 IL-4 모방체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되어 상기 대상체에서 상처 치유 면역 반응을 조절한다.
일부 양태에서, 대상체에서 제2 치료제에 대한 면역 반응을 조절하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 양태에서, 상기 방법은 본 개시내용의 폴리펩타이드를 유효량의 제2 치료제와 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 제2 치료제는 예를 들어, 화학치료제 또는 항원-특이적 면역치료제일 수 있다. 일부 양태에서, 항원-특이적 면역치료제는 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)를 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 치료제에 대한 대상체의 면역 반응을 증강시킨다. 면역 반응은 예를 들어, T 세포 반응(CAR-T 세포 반응을 포함함)을 향상시키거나, 선천적 T 세포 면역 반응을 증대시키거나, 염증을 저하시키거나, T 세포 조절 활성을 저해하거나, 또는 이들의 조합에 의해 증강될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 사이토카인 모방체, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 IL-4 모방체는 생체물질과 함께 함침되거나 그렇지 않다면 생체물질과 결합될 것이고, 상기 생체물질은 대상체에게 도입될 것이다. 일부 양태에서, 생체물질은 이식 가능한 의료 장치의 구성요소일 것이고, 상기 장치는 예를 들어, 생체물질로 코팅될 것이다. 이러한 의료 장치는 예를 들어, 혈관 및 동맥 이식물(graft)을 포함한다. IL-4 및/또는 IL-4 관련 생체물질은 예를 들어, 상처 치유 및/또는 조직 수선 및 재생을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량"은 암을 치료하고/하거나 제한하는 데 효과적인 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포의 양을 지칭한다. 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포는 전형적으로, 약제학적 조성물, 예컨대 상기 개시된 것들로서 제제화되고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 및 비히클을 함유하는 투약 단위 제제에서 비제한적으로 경구로, 흡입 스프레이에 의해, 안내로(ocularly), 정맥내로, 피하로, 복강내로, 및 방광내로(intravesicular)를 포함하여 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포는 비제한적으로 안내, 흡입 또는 비내 투여를 포함하여 점막으로 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포는 경구 투여된다. 이러한 특정 구현예는 점적액, 네뷸라이저, 스프레이, 또는 다른 적합한 제제를 통해 투여될 수 있다.
임의의 적합한 투약 범위는 주치의에 의해 결정된 바와 같이 사용될 수 있다. 투약 요법은 최적의 요망되는 반응(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 폴리펩타이드에 적합한 투약 범위는 예를 들어, 0.1 ug/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중일 수 있으며; 대안적으로, 상기 투약 범위는 0.5 ug/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중; 1 ug/kg 체중 내지 25 mg/kg 체중, 또는 5 ug/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중일 수 있다. 일부 구현예에서, 권고 용량은 특히 국소 투여되는 경우, 0.1 mcg/kg 미만일 수 있을 것이다. 다른 구현예에서, 권고 용량은 체중/m2(즉, 체표면적)를 기반으로 할 수 있을 것이며, 및/또는 권고 용량은 고정된 용량(예를 들어, 0.05 내지 100 mg)으로 투여될 수 있을 것이다. 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포는 단일 볼루스로 전달될 수 있거나, 주치의에 의해 결정된 바와 같이 1회 초과(예를 들어, 2, 3, 4, 5 이상의 횟수)로 투여될 수 있다.
폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 및/또는 숙주 세포는 단독 예방제 또는 치료제로서 투여되도록 만들어질 수 있거나, 비제한적으로 종양 절개, 화학치료법, 방사선 치료법, 면역치료법 등을 포함하는 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제와 함께(즉, 조합되거나 별도로) 투여될 수 있다.
예시적인 컴퓨터 환경
도 22는 예시적인 컴퓨터 네트워크의 블록 다이어그램이다. 비제한적으로 소프트웨어, Rosetta 소프트웨어 묶음, RosettaScripts, PyRosetta, Rosetta 어플리케이션, 및/또는 다른 본원에 기재된 컴퓨터 소프트웨어 및 컴퓨터 하드웨어의 일부로서 개시되고/되거나 이에 의해 수행되는 기법과 같은 본원에 개시된 상기-언급된 기법 중 일부 또는 모두는 컴퓨터 장치의 일부이고/이거나 컴퓨터 장치에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, FIG X1은 네트워크(106)를 통해, 클라이언트 장치(104a, 104b, 및 104c) 및 단백질 데이터베이스(108)와 통신하도록(communicate) 구성된 단백질 디자인 시스템(102)을 보여준다. 일부 구현예에서, 단백질 디자인 시스템(102) 및/또는 단백질 데이터베이스(108)는 본원에 기재된 방법 및 기법, 예컨대 비제한적으로, 방법(300) 및 Rosetta의 일부이거나 이와 관련된 것으로 기재된 기능성 중 일부 또는 모두를 수행하도록 구성된 컴퓨터 장치일 수 있다. 단백질 데이터베이스(108)는 일부 구현예에서, Rosetta와 관련되고/되거나 이에 의해 사용되는 정보를 저장할 수 있다.
네트워크(106)는 네트워크화된 컴퓨터 장치 사이에 통신 경로를 제공하도록 구성된 LAN, 광역 네트워크(WAN), 기업 인트라넷, 공공 인터넷, 또는 임의의 다른 유형의 네트워크에 상응할 수 있다. 네트워크(106)는 또한, LAN, WAN, 기업 인트라넷, 및/또는 공공 인터넷 중 하나 이상의 조합에 상응할 수 있다.
도 22가 단지 3개의 클라이언트 장치(104a, 104b, 104c)만 보여주더라도, 분산형 어플리케이션 아키텍쳐는 수십개, 수백개 또는 수천개의 클라이언트 장치의 역할을 할 수 있다. 더욱이, 클라이언트 장치(104a, 104b, 104c)(또는 임의의 부가적인 클라이언트 장치)는 임의의 종류의 컴퓨터 장치, 예컨대 통상적인 랩탑 컴퓨터, 데스크탑 컴퓨터, 네트워크 터미널, 와이어리스 통신 장치(예를 들어, 핸드폰 또는 스마트폰) 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 클라이언트 장치(104a, 104b, 104c)로 Rosetta 소프트웨어 묶음을 해결하며/사용하는 문제에 전념할 수 있다. 다른 구현예에서, 클라이언트 장치(104a, 104b, 104c)는 많은 업무를 수행하도록 구성되고 Rosetta 소프트웨어 묶음을 해결하며/사용하는 문제에 전념할 필요가 없도록 구성된 범용 컴퓨터로서 사용될 수 있다. 더욱 다른 구현예에서, 단백질 디자인 시스템(102) 및/또는 단백질 데이터베이스(108)의 기능성 중 일부 또는 모두는 클라이언트 장치, 예컨대 클라이언트 장치(104a, 104b, 및/또는 104c)에 통합될 수 있다.
컴퓨터 환경 아키텍쳐
도 23a는 예시적인 컴퓨터 장치(예를 들어, 시스템)의 블록 다이어그램이다. 특히, 도 23a에 도시된 컴퓨터 장치(200)는, 본원에 기재된 방법 및 기법, 예컨대 비제한적으로, 방법(300) 및 Rosetta의 일부이거나 이와 관련된 것으로 기재된 기능성 중 일부 또는 모두의 구성요소를 포함하고/하거나 이의 하나 이상의 기능성을 수행하도록 구성될 수 있다. 컴퓨터 장치(200)는 사용자 인터페이스 모듈(201), 네트워크-통신 인터페이스 모듈(202), 하나 이상의 프로세서(203), 데이터 저장(204), 및 단백질 합성 장치(220)를 포함할 수 있으며, 이들은 모두 시스템 버스, 네트워크, 또는 다른 연결 메커니즘(205)을 통해 함께 연결될 수 있다.
사용자 인터페이스 모듈(201)은 외부 사용자 입력/결과물 장치로 데이터를 전송하고/하거나 상기 장치로부터 데이터를 수신하도록 작동 가능할 수 있다. 예를 들어, 사용자 인터페이스 모듈(201)은 사용자 입력 장치, 예컨대 키보드, 키패드, 터치 스크린, 컴퓨터 마우스, 트랙 볼, 조이스틱, 카메라, 음성 인식 모듈, 및/또는 다른 유사한 장치로 데이터를 전송하고/하거나 상기 장치로부터 데이터를 수신하도록 구성될 수 있다. 사용자 인터페이스 모듈(201)은 또한, 현재 알려져 있거나 이후에 개발되는 사용자 디스플레이 장치, 예컨대 하나 이상의 캐소드 레이 튜브(CRT), 액정 디스플레이(LCD), 발광 다이오드(LED), 디지탈 광 처리를 사용한 디스플레이(DLP) 기술, 프린터, 라이트 벌브(light bulb), 및/또는 다른 유사한 장치에 결과물을 제공하도록 구성될 수 있다. 사용자 인터페이스 모듈(201)은 또한, 들을 수 있는 결과물(들), 예컨대 스피커, 스피커 잭, 오디오 출력 포트, 오디오 출력 장치, 이어폰, 및/또는 다른 유사한 장치를 생성시키도록 구성될 수 있다.
네트워크-통신 인터페이스 모듈(202)은 네트워크, 예컨대 도 22에 도시된 네트워크(106)를 통해 통신하도록 구성될 수 있는 하나 이상의 와이어리스 인터페이스(207) 및/또는 하나 이상의 와이어라인 인터페이스(208)를 포함할 수 있다. 와이어리스 인터페이스(207)는 하나 이상의 와이어리스 전달기, 수신기, 및/또는 트랜시버(transceiver), 예컨대 블루투스 트랜시버, Zigbee 트랜시버, Wi-Fi 트랜시버, WiMAX 트랜시버, 및/또는 와이어리스 네트워크를 통해 통신하도록 구성될 수 있는 다른 유사한 유형의 와이어리스 트랜시버를 포함할 수 있다. 와이어라인 인터페이스(208)는 하나 이상의 와이어라인 전달기, 수신기, 및/또는 트랜시버, 예컨대 이더넷 트랜시버, 범용 직렬 버스(USB; Universal Serial Bus) 트랜시버, 또는 트위스티드 페어(twisted pair), 하나 이상의 와이어, 동축 케이블, 섬유-광학 링크, 와이어라인 네트워크에의 유사한 물리적 연결을 통해 통신하도록 구성될 수 있는 유사한 트랜시버를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 네트워크 통신 인터페이스 모듈(202)은 신뢰할 만한, 보안된(secured), 및/또는 인증된(authenticated) 통신을 제공하도록 구성될 수 있다. 본원에 기재된 각각의 통신에 대해, 신뢰할 만한 통신(즉, 보장된 메세지 전달)을 보장하기 위한 정보가 아마도 메세지 헤더(header) 및/또는 푸터(footer)(예를 들어, 패킷/메세지 시퀀싱 정보, 캡슐화 헤더(들) 및/또는 푸터(들), 크기/시간 정보, 및 전달 확증 정보, 예컨대 CRC 및/또는 패리티 체크 값(parity check value))의 일부로서 제공될 수 있다. 통신은 하나 이상의 암호 프로토콜 및/또는 알고리즘, 예컨대, 비제한적으로, DES, AES, RSA, Diffie-Hellman, 및/또는 DSA를 사용하여 보안되며(예를 들어, 인코딩되거나 암호화됨) 및/또는 해독/디코드될 수 있다. 다른 암호 프로토콜 및/또는 알고리즘이 마찬가지로 사용될 수 있거나 통신을 보안화하기 위해(그리고 그 후에 해독/디코드하기 위해) 본원에 열거된 것들에 더하여 사용될 수 있다.
프로세서(203)는 하나 이상의 범용 프로세서 및/또는 하나 이상의 특수 목적 프로세서(예를 들어, 디지털 신호 프로세서, 적용 주문형 접적 회로(application specific integrated circuit) 등)를 포함할 수 있다. 프로세서(203)는 데이터 저장(204)에 함유된 컴퓨터-판독 가능 프로그램 명령(206) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 명령을 실행하도록 구성될 수 있다. 데이터 저장(204)은 적어도 하나의 프로세서(203)에 의해 판독되고/되거나 접근될 수 있는 하나 이상의 컴퓨터-판독 가능 저장 매체를 포함할 수 있다. 하나 이상의 컴퓨터-판독 가능 저장 매체는 휘발성 및/또는 비-휘발성 저장 구성요소, 예컨대 광학적, 자기, 유기 또는 다른 메모리 또는 디스크 저장을 포함할 수 있으며, 이들은 적어도 하나의 프로세서(203)와 전체적으로 또는 부분적으로 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 데이터 저장(204)은 단일 물리적 장치(예를 들어, 하나의 광학, 자기, 유기 또는 다른 메모리 또는 디스크 저장 유닛)를 사용하여 실시될 수 있는 한편, 다른 구현예에서, 데이터 저장(204)은 2개 이상의 물리적 장치를 사용하여 실시될 수 있다.
데이터 저장(204)은 컴퓨터-판독 가능 프로그램 명령(206) 및 아마도 부가적인 데이터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데이터 저장(204)은 단백질 디자인 시스템 및/또는 단백질 데이터베이스; 예를 들어, 단백질 디자인 시스템(102), 단백질 데이터베이스(108)에 의해 이용되는 데이터 중 일부 또는 모두를 저장할 수 있다. 일부 구현예에서, 데이터 저장(204)은 부가적으로, 본원에 기재된 방법 및 교시 중 적어도 일부 및/또는 본원에 기재된 장치 및 네트워크의 기능성 중 적어도 일부를 수행하는 데 필요한 저장을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 컴퓨터 장치(200)는 단백질 합성 장치(220)를 포함한다. 단백질 합성 장치는 명령어를 사용하여 단백질 합성 장치(220)에 제공되는 입력 데이터 및/또는 프로세서(203) 및/또는 데이터 저장(204)에 제공되는 데이터에 기초하여 폴리펩타이드를 합성하거나 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질 합성 장치(220)의 기능성 중 일부 또는 모두는 반자동화된 또는 자동화된 펩타이드 합성기에 의해 수행될 수 있다.
도 23b는 예시적인 구현예에 따라 클라우드-기반 서버 시스템으로서 배열되는 컴퓨터 클러스터(209a, 209b, 209c)의 네트워크(106)를 도시한다. 단백질 디자인 시스템(102)용 데이터 및/또는 소프트웨어는 클라우드-기반 어플리케이션 및/또는 서비스의 프로그램 로직 및/또는 데이터를 저장하는 하나 이상의 클라우드-기반 장치 상에 저장될 수 있다. 일부 예에서, 단백질 디자인 시스템(102)은 단일 컴퓨터 센터에서 체류하는 단일 컴퓨터 장치일 수 있다. 다른 예에서, 단백질 디자인 시스템(102)은 단일 컴퓨터 센터에 다수의 컴퓨터 장치를 포함하거나, 심지어 다양한 지리학적 장소에 위치한 다수의 컴퓨터 센터에 위치한 다수의 컴퓨터 장치를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 단백질 디자인 시스템(102)에 대한 데이터 및/또는 소프트웨어는 탠저블 컴퓨터 판독 가능 매체(또는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체)에 저장되고 클라이언트 장치(104a, 104b, 및 104c), 및/또는 다른 컴퓨터 장치에 의해 접근 가능한 컴퓨터 판독 가능 정보로서 인코딩될 수 있다. 일부 예에서, 단백질 디자인 시스템(102)에 대한 데이터 및/또는 소프트웨어는 단일 디스크 드라이브 또는 다른 탠저블 저장 매체 상에 저장될 수 있거나, 하나 이상의 다양한 지리학적 장소에 위치한 다수의 디스크 드라이브 또는 다른 탠저블 저장 매체 상에서 실행될 수 있다.
도 23b는 예시적인 구현예에 따른 클라우드-기반 서버 시스템을 도시한다. 도 23b에서, 단백질 디자인 시스템(102)의 기능은 3개의 컴퓨터 클러스터(209a, 209b, 및 209c) 중에서 분산될 수 있다. 컴퓨터 클러스터(209a)는 하나 이상의 컴퓨터 장치(200a), 클러스터 저장 어레이(210a), 및 지역 클러스터 네트워크(212a)에 의해 연결된 클러스터 공유기(211a)를 포함할 수 있다. 유사하게는, 컴퓨터 클러스터(209b)는 하나 이상의 컴퓨터 장치(200b), 클러스터 저장 어레이(210b), 및 지역 클러스터 네트워크(212b)에 의해 연결된 클러스터 공유기(211b)를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 컴퓨터 클러스터(209c)는 하나 이상의 컴퓨터 장치(200c), 클러스터 저장 어레이(210c), 및 지역 클러스터 네트워크(212c)에 의해 연결된 클러스터 공유기(211c)를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 각각의 컴퓨터 클러스터(209a, 209b, 및 209c)는 동일한 수의 컴퓨터 장치, 동일한 수의 클러스터 저장 어레이, 및 동일한 수의 클러스터 공유기를 가질 수 있다. 그러나, 다른 예에서, 각각의 컴퓨터 클러스터는 상이한 수의 컴퓨터 장치, 상이한 수의 클러스터 저장 어레이, 및 상이한 수의 클러스터 공유기를 가질 수 있다. 각각의 컴퓨터 클러스터에서 컴퓨터 장치, 클러스터 저장 어레이, 및 클러스터 공유기의 수는 각각의 컴퓨터 클러스터에 배정된 컴퓨터 업무 또는 업무들에 따라 다를 수 있다.
컴퓨터 클러스터(209a)에서, 예를 들어, 컴퓨터 장치(200a)는 단백질 디자인 시스템(102)의 다양한 컴퓨터 업무를 수행하도록 구성될 수 있다. 일례에서, 단백질 디자인 시스템(102)의 다양한 기능성은 하나 이상의 컴퓨터 장치(200a, 200b, 및 200c) 중에서 분산될 수 있다. 컴퓨터 클러스터(209b 및 209c)에서 컴퓨터 장치(200b 및 200c)는 컴퓨터 클러스터(209a)에서 컴퓨터 장치(200a)와 유사하게 구성될 수 있다. 한편, 일부 예에서, 컴퓨터 장치(200a, 200b, 및 200c)는 상이한 기능을 수행하도록 구성될 수 있다.
일부 예에서, 단백질 디자인 시스템(102)과 관련된 컴퓨터 업무 및 저장된 데이터는 적어도 부분적으로, 단백질 디자인 시스템(102)의 처리 요건, 컴퓨터 장치(200a, 200b, 및 200c)의 처리 능력, 각각의 컴퓨터 클러스터에서 컴퓨터 장치 사이에 그리고 컴퓨터 클러스터 자체 사이에서 네트워크 연결의 잠재성, 및/또는 전체 시스템 아키텍쳐의 비용, 속도, 내고장성(fault-tolerance), 탄력성(resiliency), 효율. 및/또는 다른 디자인 목표에 기여할 수 있는 다른 인자에 기초하여 컴퓨터 장치(200a, 200b, 및 200c)에 걸쳐 분산될 수 있다.
컴퓨터 클러스터(209a, 209b, 및 209c)의 클러스터 저장 어레이(210a, 210b, 및 210c)는 하드 디스크 드라이브 그룹에 판독 및 작성 접근을 관리하도록 구성된 디스크 어레이 제어기를 포함하는 데이터 저장 어레이를 포함할 수 있다. 디스크 어레이 제어기는 단독으로 또는 이의 각각의 컴퓨터 장치와 조합되어, 디스크 드라이브에 대해 보호하거나 하나 이상의 컴퓨터 장치가 하나 이상의 클러스터 저장 어레이에 접근하는 것을 방지하는 다른 클러스터 저장 어레이 실패 및/또는 네트워크 실패에 대해 보호하기 위해 클러스터 저장 어레이에 저장된 데이터의 백업 또는 여유분의 카피를 관리하도록 구성될 수 있다.
단백질 디자인 시스템(102)이 컴퓨터 클러스터(209a, 209b, 및 209c)의 컴퓨터 장치(200a, 200b, 및 200c)에 걸쳐 분산될 수 있는 방식과 유사하게, 이들 구성요소의 다양한 활성 부분 및/또는 백업 부분은 클러스터 저장 어레이(210a, 210b, 및 210c)에 걸쳐 분산될 수 있다. 예를 들어, 일부 클러스터 저장 어레이는 단백질 디자인 시스템(102)의 데이터 및/또는 소프트웨어의 일부를 저장하도록 배치될 수 있는 한편, 다른 클러스터 저장 어레이는 단백질 디자인 시스템(102)의 데이터 및/또는 소프트웨어의 별개의 일부를 저장할 수 있다. 부가적으로, 일부 클러스터 저장 어레이는 다른 클러스터 저장 어레이에 저장된 데이터의 백업 버전을 저장하도록 구성될 수 있다.
컴퓨터 클러스터(209a, 209b, 및 209c)에서 클러스터 공유기(211a, 211b, 및 211c)는 컴퓨터 클러스터에 대해 내부 및 외부 통신을 제공하도록 구성된 네트워크화 장비를 포함할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 클러스터(209a)에서 클러스터 공유기(211a)는 (i) 컴퓨터 장치(200a)와 클러스터 저장 어레이(201a) 사이에서 지역 클러스터 네트워크(212a)를 통한 근거리 네트워크 통신, 및 (ii) 네트워크(106)에의 광역 네트워크 연결(213a)을 통해 컴퓨터 클러스터(209a)와 컴퓨터 클러스터(209b 및 209c) 사이에서 광역 네트워크 통신을 제공하도록 구성된 하나 이상의 인터넷 스위칭 및 공유 장치를 포함할 수 있다. 클러스터 공유기(211b 및 211c)는 클러스터 공유기(211a)와 유사한 네트워크 장비를 포함할 수 있고, 클러스터 공유기(211b 및 211c)는, 클러스터 공유기(211a)가 컴퓨터 클러스터(209a)에 대해 수행하는 컴퓨터 클러스터(209b 및 209b)에 대한 유사한 네트워크화 기능을 수행할 수 있다.
일부 예에서, 클러스터 공유기(211a, 211b, 및 211c)의 구성은 적어도 부분적으로, 컴퓨터 장치 및 클러스터 저장 어레이의 데이터 통신 요건, 클러스터 공유기(211a, 211b, 및 211c)에서 네트워크 장비의 데이터 통신 능력, 근거리 네트워크(212a, 212b, 212c)의 잠재성 및 처리량, 광역 네트워크 연결(213a, 213b, 및 213c)의 잠재성, 처리량 및 비용, 및/또는 모더레이션(moderation) 시스템 아키텍쳐의 비용, 속도, 내고장성, 탄력성, 효율 및/또는 다른 디자인 목표에 기여할 수 있는 다른 인자에 기초할 수 있다.
예시적인 작동 방법
도 24는 예시적인 방법(300)의 순서도이다. 방법(300)은 컴퓨터 장치, 예컨대 적어도 도 2a의 맥락에서 기재된 컴퓨터 장치(200)에 의해 수행될 수 있다. 적어도 하기 언급된 방법(300)의 예는 상기 논의되어 있다.
방법(300)은, 컴퓨터 장치가 단백질의 복수의 잔기에 대한 구조를 상기 컴퓨터 장치를 사용하여 결정할 수 있는 블록(310)에서 시작할 수 있으며, 이때, 복수의 잔기의 구조는 특정 수용체 결합 계면을 제공한다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 복수의 잔기의 구조가 특정 수용체 결합 계면을 제공하는 단백질의 복수의 잔기에 대한 구조의 결정은 전형적으로, 특정 수용체 결합 계면에 결합하는 네이티브 단백질의 원래의 잔기의 식별인 반면, 복수의 디자인된 잔기는 동일한 수용체 결합 계면에 결합할 수 있는 잔기로서 식별된다.
블록(320)에서, 컴퓨터 장치는 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정할 수 있으며, 여기서, 상기 복수의 디자인된 잔기는 특정 수용체 결합 계면을 제공하고, 상기 복수의 디자인된 잔기는 복수의 잔기와 상이하다.
일부 예에서, 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하는 단계는 이상화된 잔기의 데이터베이스를 사용하여, 이상화된 잔기를 결정하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 이상화된 잔기는 복수의 디자인된 잔기의 디자인된 잔기와 관련이 있다. 이들 예 중 일부에서, 이상화된 잔기의 데이터베이스를 사용하여, 이상화된 잔기를 결정하는 단계는, 이상화된 잔기의 데이터베이스로부터 상기 이상화된 잔기와 관련된 하나 이상의 이상화된 단편을 검색하는 단계; 및 관련된 디자인된 잔기를 상기 하나 이상의 이상화된 단편을 사용하여 재작제함으로써 이상화된 잔기를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 예 중 일부에서, 관련된 디자인된 잔기를 하나 이상의 이상화된 단편을 사용하여 재작제하는 단계는, 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍을, 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍의 조합적 단편 조립의 사용에 의해 재연결하는 단계; 및 데카르트-제약(Cartesian-constrained) 백본 최소화를 사용하여, 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍이 2개 이상의 복수의 디자인된 잔기를 연결하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 예 중 일부에서, 관련된 디자인된 잔기를 하나 이상의 이상화된 단편을 사용하여 재작제하는 단계는, 이상화된 잔기의 중복 단편이 이상화된 잔기의 데이터베이스를 사용하여 이상화된 단편인지 확증하는 단계; 이상화된 잔기가 특정 수용체 결합 계면과 연관된 표적 수용체와 충돌하지 않는지 여부를 확증하는 단계; 및 이상화된 잔기가 특정 수용체 결합 계면과 연관된 표적 수용체와 충돌하지 않는지의 여부를 확증한 후, 이상화된 잔기의 각각의 위치에서 최확(most probable) 아미노산을 상기 이상화된 잔기의 데이터베이스를 사용하여 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 예 중 일부에서, 하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 결정하는 단계는, 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍을 조합적으로 재조합함으로써 상기 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍을 재조합하는 단계; 및 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 하나 이상의 이상화된 단편의 재조합된 쌍을 사용하여 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 예 중 일부에서, 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍을 조합적으로 재조합하는 단계는 상기 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍의 이상화된 단편 사이의 상호연결 길이에 기초하여 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍의 순위를 매기는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 복수의 디자인된 잔기를 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 결정하는 단계는, 복수의 디자인된 잔기의 디자인된 잔기의 모양을 나타내는 하나 이상의 매개 방정식(parametric equation)을 사용하여, 이상화된 잔기를 결정하는 단계; 및 상기 이상화된 잔기를 복수의 디자인된 잔기의 적어도 하나의 디자인된 잔기와 근접시키는 단일 단편을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 예 중 일부에서, 디자인된 잔기는 나선형 구조를 포함할 수 있고, 상기 하나 이상의 매개 방정식은 상기 나선형 구조의 파이(phi) 및 프사이(psi) 각도의 원주각 피치(angular pitch)와 관련된 방정식을 포함할 수 있다. 이들 예 중 일부에서, 상기 나선형 구조의 파이 및 프사이 각도와 관련된 방정식은 나선형 구조의 파이 및 프사이 각도의 원주각 피치와 관련된 하나 이상의 텀을 포함할 수 있다.
블록(330)에서, 컴퓨터 장치는 복수의 디자인된 잔기를 연결하는 하나 이상의 연결형 나선 구조를 결정할 수 있다.
블록(340)에서, 컴퓨터 장치는 하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 결정할 수 있다.
블록(350)에서, 컴퓨터 장치는 상기 제1 단백질 백본에 기초하여 유연성 및 저에너지 구조에 대한 단백질에 대해 제2 단백질 백본을 디자인할 수 있다.
블록(360)에서, 컴퓨터 장치는 적어도 상기 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성할 수 있다. 일부 예에서, 단백질에 대한 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계는 단백질에 대한 제2 단백질 백본에 기초하여 하나 이상의 분자를 디자인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 단백질에 대한 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계는, 상기 단백질에 대한 제2 단백질 백본에 기초한 단백질에 대한 합성 유전자를 생성하는 단계; 상기 합성 유전자를 사용하여 특정 단백질을 생체내에서 발현시키는 단계; 및 상기 특정 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 예 중 일부에서, 합성 유전자를 사용하여 특정 단백질을 생체내에서 발현시키는 단계는, 합성 유전자를 포함하는 하나 이상의 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 특정 단백질 서열을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 단백질에 대한 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계는 상기 단백질에 대한 제2 단백질 백본 중 적어도 일부를 포함하는 하나 이상의 이미지를 생성시키는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 컴퓨터 장치는 단백질 합성 장치를 포함할 수 있고, 그 후에, 단백질에 대한 제2 단백질 백본과 적어도 관련된 결과물을 생성하는 단계는 단백질에 대한 적어도 제2 단백질 백본을 상기 단백질 장치를 사용하여 합성하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 예시된 바와 같은 단백질 모방체를 디자인하는 방법이 존재한다.
또한, 본원에 기재된 컴퓨터 방법에 의해 제조된 비-자연 발생 단백질이 포함된다. 비-자연 발생 단백질은 사이토카인, 예를 들어, 비-자연 발생 IL-2 또는 IL-4 모방체일 수 있다.
본원에 제시된 특정 사항은 예에 의한 것이고, 본 발명의 구현예의 예시적인 논의의 목적을 위해 본 발명의 다양한 구현예의 원리 및 개념적인 양태의 가장 유용하고 쉽게 이해되는 설명인 것으로 여겨지는 것을 제공하는 원인으로 제시된다. 이러한 측면에서, 몇몇 형태의 본 발명이 실제로 어떻게 구현될 수 있는지를 당업자에게 명백하게 하는 도면 및/또는 실시예와 함께 취해진 설명과 본 발명의 근본적인 이해에 필요한 것보다 더 상세하게 본 발명의 구조적인 세부사항을 보여주는 시도는 없다.
상기 정의 및 설명은, 하기 실시예에서 명백하게 그리고 분명하게 변형되지 않는 한 또는 의미의 적용이 임의의 작제를 무의미하게 하거나 본질적으로 무의미하게 하는 경우 임의의 향후 작제에서 제어적인 것으로 의미되고 의도된다. 용어의 작제가 이를 무의미하게 또는 본질적으로 무의미하게 할 경우, 정의는 웹스터 사전, 제3판 또는 당업자에게 알려진 사전, 예컨대 옥스포드 생화학 및 분자생물학 사전(Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)으로부터 취해져야 한다.
상기 설명은 본 개시내용의 구현예의 철저한 이해, 및 이에 대한 설명을 가능하게 하는 구체적인 세부사항을 제공한다. 그러나, 당업자는, 본 개시내용은 이들 세부사항 없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 다른 경우에, 잘 알려진 구조 및 기능은, 본 개시내용의 구현예의 설명을 불필요하게 모호하게 하지 않기 위해 상세하게 제시되거나 기재되지 않았다. 본 개시내용의 구현예의 설명은 철저한 것으로 의도되거나 상기 개시내용을 개시된 정확한 형태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용의 구체적인 구현예 및 이에 대한 실시예가 예시적인 목적을 위해 본원에 기재되긴 하지만, 다양한 동등한 변형은 당업자가 인식할 바와 같이 본 개시내용의 범위 내에서 가능하다.
본원에서 인용된 모든 참조문헌은 참조에 의해 포함된다. 본 개시내용의 양태는 필요하다면, 본 개시내용의 더욱 추가의 구현예를 제공하기 위해 상기 참조문헌의 시스템, 기능 및 개념을 적용하도록 변형될 수 있다. 이들 및 다른 변화는 상세한 설명의 측면에서 본 개시내용에 이루어질 수 있다.
임의의 전술한 구현예의 구체적인 요소는 다른 구현예에서의 요소와 조합되거나 치환될 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 소정의 구현예와 관련된 이점이 이들 구현예의 맥락에서 기재되긴 하였지만, 다른 구현예가 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있고, 모든 구현예가 이러한 이점을 본 개시내용의 범위 내에 속하도록 나타낼 필요는 없다.
상기 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조로 하여 개시된 시스템, 장치 및 방법의 다양한 특질 및 기능을 기재한다. 도면에서, 유사한 부호는 전형적으로, 문맥상 다르게 나타내지 않는 한, 유사한 구성요소를 식별한다. 상세한 설명, 도면 및 청구항에서 기재된 예시적인 구현예는 기재된 예시적인 구현예는 제한적인 것으로 의미되지 않는다. 다른 구현예는 이용될 수 있고, 다른 변화는 본원에 제시된 주제의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다. 본원에서 일반적으로 기재된 바와 같고 도면에 예시된 바와 같이, 본 개시내용의 양태는 광범위하게 다양한 상이한 구성에서 배열, 치환, 조합, 분리 및 디자인될 수 있으며, 이들은 모두 본원에서 명백하게 고려되는 것이 쉽게 이해될 것이다.
도면 및 본원에 논의된 바와 같이 임의의 또는 모든 사다리 다이어그램, 시나리오, 및 순서도에 관하여, 각각의 블록 및/또는 통신은 예시적인 구현예에 따라 정보의 처리 및/또는 정보의 전달을 나타낼 수 있다. 대안적인 구현예는 이들 예시적인 구현예의 범위 내에 포함된다. 이들 대안적인 구현예에서, 예를 들어, 블록, 전달, 통신, 요청, 반응, 및/또는 메세지로서 기재된 기능은 관여된 기능성에 따라, 실질적으로 동시적인(concurrent) 또는 역 순서를 포함하여 제시되거나 논의된 것으로부터 순서로 실행될 수 있다. 나아가, 더 많거나 더 적은 블록 및/또는 기능은 본원에 논의된 임의의 사다리 다이어그램, 시나리오 및 순서도와 함께 사용될 수 있고, 이들 사다리 다이어그램, 시나리오 및 순서도는 부분적으로 또는 전체적으로 서로 조합될 수 있다.
정보의 처리를 나타내는 블록은 본원에 기재된 방법 또는 기법의 특정 논리적 기능을 수행하도록 구성될 수 있는 회로에 상응할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 정보의 처리를 나타내는 블록은 프로그램 코드(관련된 데이터를 포함함)의 모듈, 분절 또는 일부에 상응할 수 있다. 프로그램 코드는 방법 또는 기법에서 특정 논리적 기능 또는 작용을 실시하기 위한 프로세서에 의해 실행 가능한 하나 이상의 명령을 포함할 수 있다. 프로그램 코드 및/또는 관련 데이터는 임의의 유형의 컴퓨터 판독 가능 매체, 예컨대 디스크 또는 하드 드라이브 또는 다른 저장 매체를 포함하는 저장 장치에 저장될 수 있다.
컴퓨터 판독 가능 매체는 또한, 비-일시적(non-transitory) 컴퓨터 판독 가능 매체, 예컨대 단기간의 시간 유사 레지스터 메모리를 위한 데이터를 저장하는 컴퓨터-판독 가능, 프로세서 캐시, 및 랜덤 접근 메모리(RAM)을 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 또한, 프로그램 코드 및/또는 데이터를 더 장기간 동안 저장하는, 예컨대 2차 또는 지속적인 장기간 저장을 위한 비-일시적 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어 2차 또는 지속적인 장기간 저장, 예컨대 판독 전용 메모리(ROM; read only memory), 광학 또는 자기 디스크, 컴팩트-디스크 판독 전용 메모리(CD-ROM)를 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 또한, 임의의 다른 휘발성 또는 비-휘발성 저장 시스템일 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 예를 들어, 컴퓨터 판독 가능 저장 매체, 또는 탠저블 저장 장치(tangible storage device)로서 간주될 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 정보 전달을 나타내는 블록은 동일한 물리적 장치에서 소프트웨어 및/또는 하드웨어 모듈 사이의 정보 전달에 상응할 수 있다. 그러나, 상이한 물리적 장치에서 소프트웨어 모듈 및/또는 하드웨어 모듈 사이에 다른 정보 전달이 있을 수 있다.
본 개시내용의 많은 변형 및 변화는 상기 교시의 측면에서 가능하다.
실시예
디자인하기 위한 컴퓨터 접근법은 자연 사이토카인의 기능적 부위를 개괄하지만 위상기하학 또는 아미노산 서열과 관련이 없는 드 노보 사이토카인 모방체가 기재된다. 이 전략을 사용하여, IL-2 수용체 β
Figure pct00074
c 헤테로이량체(IL-2Rβ
Figure pct00075
c)16,17에 결합하지만, IL-2Rα 또는 IL-15Rα에 대한 결합 부위를 갖지 않는 IL-2 및 인터루킨-15의 드 노보 모방체(IL-15)15를 디자인하였다. 디자인은 초안정하며, 자연 사이토카인보다 더 높은 친화도로 인간 및 마우스 IL-2Rβ
Figure pct00076
c에 결합하고, IL-2Rα 및 IL-15Rα와 독립적으로 다운스트림 세포 신호화를 유도한다. 실험적으로 최적화된 모방체, 네오루킨-2/15의 결정 구조는 디자인 모델과 매우 근접하고, 뮤린 IL-2Rβ
Figure pct00077
c 복합체에 제1 구조적 정보를 제공한다. 네오루킨-2/15는 흑색종 및 결장암의 뮤린 모델에서 IL-2와 비교하여 고도로 효과적인 치료 활성을 가지며, 이때, 독성은 감소되어 있고 면역원성의 어떠한 징후도 없다. 초안정한 드 노보 모방체를 구축하기 위한 이러한 전략은 다수의 천연 사이토카인 및 다른 신호화 단백질에 쉽게 적용될 수 있어서, 증강된 임상 프로파일을 갖는 우수한 치료 후보의 생성을 가능하게 한다.
천연 단백질 호르몬 및 사이토카인의 강력한 생물학적 활성때문에, 단백질 조작을 통해 이들의 잠재적인 치료 효능을 향상시키려는 광범위한 노력이 있어 왔다. 이러한 노력은 제조를 단순화시키며, 반감기를 연장하고, 수용체 상호작용을 조절하기 위해 모색되었다18-20. 그러나, 자연 발생 생물활성 단백질로 출발하는 경우, 새로운 치료제의 개발을 위한 고유한 도전과제가 있다. 우선, 대부분의 자연 단백질은 단지 변연부로 안정하므로21-25, 효능을 증가시키는 것을 목표로 하는 아미노산 치환은 발현을 저하시키거나 응집을 유발하여, 제조 및 저장을 어렵게 만들 수 있다. 기능적 또는 표적화 도메인의 더욱 실질적인 변화, 예컨대 결실 또는 융합은 종종 작업 불가능하고, 약물동력학적 특성 및 조직 투과를 급격하게 변경시킬 수 있다19. 둘째, 조작된 변이체에 대한 임의의 면역 반응은 내인성 분자26-35와 교차-반응할 수 있으며, 이때 잠재적으로 격변적인 결과가 있다. 이들 도전을 우회하는 향상된 치료적 특성을 갖는 자연 단백질의 유사체를 생성시키도록 컴퓨터 디자인 접근법을 개발하여, 질환을 치료하는 데 최적인 수용체 결합 계면의 특정 하위세트를 나타내는 드 노보 사이토카인 모방체를 조작하는 데 노력을 맞추었다.
많은 사이토카인은 다수의 상이한 수용체 하위단위15,16,36-39와 상호작용하고, 대부분의 자연 발생 단백질과 마찬가지로, 안정성을 손상시키지만 기능에 중요한 비-이상적인 구조적 특질을 함유한다. 요망되는 수용체 하위단위(들)와 상호작용하는 구조적 요소가 공간 내에 고정되는 컴퓨터 프로토콜을 개발하였으며, 이상화된 전체 단백질 구조는 이들 요소를 지지하도록 구축된다. 이전의 노력은 조합적 단편 조립체를 사용하여 연장되어, 지식-기초 루프 클로저와 커플링된 해체된 나선의 매개 작제(parametric construction)를 갖는 짧은 선형 에피토프를 지지하였다(도 1a 내지 도 1b). 인간 IL-2Rβ
Figure pct00078
c(hIL-2Rβ
Figure pct00079
c)에 대해 인간 IL-2(hIL-2) 및 인간 IL-15(hIL-15)를 모방하지만 IL-2 수용체 알파 (IL-2Rα) 상호작용 표면이 완전히 결여된 상호작용 표면을 갖는 안정한 이상화된 단백질을 드 노보 디자인하기 위해 접근법을 시험하였다. 돌연변이9,44,45(예를 들어, 슈퍼-2의 F42A 돌연변이, H9로도 알려져 있음9) 또는 PEG화(예를 들어, NKTR-2149,13)에 의해 hIL-2 내 알파 상호작용 영역을 제거하는 이전의 노력은, 알파 상호작용을 완전히 없애는 데 실패하는 한편 hIL-2Rβ
Figure pct00080
c 수용체 상에서 사이토카인의 두드러지게 감소된 안정성, 결합 및/또는 약효를 초래하였다.
IL-2Rβ
Figure pct00081
c 에 결합하고 활성화시키는 IL-2/IL-15 모방체의 컴퓨터 디자인: 네이티브 hIL-2는 길고 불규칙한 루프에 의해 연결된 4개의 나선을 포함한다. N-말단 나선(H1)은 IL-2 수용체의 베타 하위단위와 감마 하위단위 둘 다와 상호작용하며, 제3 나선(H3)은 베타 하위단위와 상호작용하고, C-말단 나선(H4)은 감마 하위단위와 상호작용하며; 알파 하위단위 상호작용 표면은 불규칙한 제2 나선(H2) 및 2개의 긴 루프에 의해 형성되고, 하나는 H1을 H2에 연결하고 다른 하나는 H3을 H4에 연결한다. H1, H3 및 H4에 의해 형성된 계면을 베타 및 감마와 함께 나타내고 H2를 더 양호한 패킹을 제공하는 규칙적인 나선으로 대체하는, 이상화된 단백질을 디자인하였다. 나선 H1, H3 및 H4(도 1a 참조)를 결합 부위에 대한 주형으로서 사용한 한편, 데이터베이스 오프 고도-표시 클러스터링-단편을 사용하여(방법 참조) 나선 H2를 재작제하였다(H2'). 나선 쌍을 동일한 데이터베이스(도 1b 참조)로부터 추출된 루프와 연결하였으며, 생성된 나선형 헤어핀을 완전히 연결된 백본(도 1c 참조)으로 조립하고, Rosetta 46-48 조합적 유연성 백본 서열 디자인 계산을 hIL-2Rβ
Figure pct00082
c(방법 참조)의 존재 하에 수행하였다. 상단의 4개 컴퓨터 디자인 및 8개의 단일-이황화 스테이플화 변이(표 S1 참조)를 효모 디스플레이(방법 참조)에 의한 실험적 특징화에 선택하였다. 8개의 디자인은 저-나노몰 농도에서 형광적-태그 베타-감마 키메라 IL-2 수용체에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 최상의 비-이황화 디자인(G1_neo2_40)을 부위 포화 돌연변이발생을 받게 하고, 뒤이어 뮤린 IL-2Rβ
Figure pct00083
c(mIL-2Rβ
Figure pct00084
c, 도 10 참조)에 대한 친화도-증가 치환의 선택 및 조합을 받게 하였다. 최적화된 디자인은 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현되었고, 저-나노몰 또는 심지어 피코몰 농도(표 E1 참조)에서 IL-2-반응성 뮤린 세포 상에서 시험관내에서 pSTAT5 신호화를 유도하는 것으로 밝혀졌으나, 상대적으로 낮은 열적 안정성(Tm ~<45℃, 도 14 및 도 15 참조)을 가졌다. 안정성을 향상시키기 위해, 최고 친화도 제1 라운드 디자인의 백본(G1_neo2_40_1F, 위상기하학: H1->H4->H2'->H3)으로부터 출발하고 루프 구축 과정을 나선 길이 (+/- 8개 아미노산, 도 1a 하단 패널 참조)에서 매개 변동과 연관지어 컴퓨터 디자인 프로토콜을 반복하였다. 이러한 제2 접근법은 각각의 나선 쌍을 연결하는 루프의 실질적으로 더 많은 조합의 외삽을 가능하게 함으로써 모델의 품질을 향상시켰다. G1_neo2_40_1F(표 S3 참조)의 27개의 Rosetta 서열 재디자인과 함께 제2 세대의 14개의 최상의 디자인을 실험적으로 특징화하고, 1개를 제외한 모두는 저-나노몰 농도에서 IL-2 수용체에 결합하는 것으로 밝혀졌다(도 1d, 표 E1, 및 도 16). 3개의 최고 친화도 및 안정성 디자인(1개의 서열 재디자인 및 2개의 새로운 모방체)은 mIL-2Rβ
Figure pct00085
c 결합(도 11 내지 도 13)에 대한 부위 포화 돌연변이발생을 받게 하고, 뒤이어 인간 및 마우스 IL-2Rβ
Figure pct00086
c 둘 다에 대한 친화도-증가 치환의 선택 및 조합을 받게 하였다. 성숙된 디자인(표 S4 참조)은 초안정성을 보유하는 한편(표 E1 참조) 증강된 결합을 보여주었다. 상단 디자인, 네오루킨-2/15(본원에서 Neo-2/15로도 지칭됨)는 새로운 위상기하학을 갖고 인간 또는 뮤린 IL-2와 꽤 상이한 서열을 갖는 100개 잔기 단백질이다(구조적 위상기하학-애그노스틱(agnostic) 기반 정렬에서, 89개의 잔기에 걸쳐 hIL-2에 대한 29% 서열 동일성, 및 76개의 정렬된 잔기에 걸쳐 mIL-2에 대한 16% 서열 동일성, 표 E1 참조).
네오루킨-2/15의 기능적 특징화: 네오루킨-2/15는 인간 및 마우스 IL-2Rβ
Figure pct00087
c(각각 Kd ~38 nM 및 ~19 nM)에 높은 친화도로 결합하지만, IL-2Rα와 상호작용하지 않는다(도 2a). 인간 및 마우스 IL-2 수용체(IL-2Rβ 및 IL-2Rβ
Figure pct00088
c)에 대한 네오루킨-2/15의 친화도는 상응하는 네이티브 IL-2 사이토카인보다 유의하게 더 높다. 네이티브 IL-2와는 대조적으로, 네오루킨-2/15는 인간 및 뮤린 IL-2-반응성 세포 둘 다(도 2b, 상단)에서 그리고 뮤린 1차 T 세포(도 2b, 하단)에서 IL-2Rα-독립적 신호화를 유도한다. 네오루킨-2/15는 이의 더 높은 결합 친화도에 따라 네이티브 인간 또는 뮤린 IL-2보다 더 강력하게 IL-2Rα- 세포를 활성화시킨다. 1차 세포에서, 네오루킨-2/15는 슈퍼-2와 비교하여 IL-2Rα- 세포 상에서는 더욱 활성적이고, IL-2Rα+ 세포 상에서는 덜 활성적이며, 이는 추정컨대 IL-2Rα 결합의 이의 완전한 결여로 인한 것이다. 네오루킨-2/15는 초안정하고(도 17 참조), 80℃에서 2시간 동안 인큐베이션 후 hIL-2Rβ
Figure pct00089
c에 대한 결합 친화도를 상실하지 않는 한편, hIL-2 및 슈퍼-2는 10분 후 완전히 불활성화된다(절반-불활성화 시간(half-inactivation time) = 각각 ~4.2분 및 ~2.6분, 도 2c). 유사하게는, 생체외 1차 세포 배양물에서, 네오루킨-2/15는 95℃에서 60분 동안 가열된 후 T 세포 생존율을 효과적으로 유도한 한편, 이들 조건은 IL-2와 슈퍼-2 둘 다 불활성화시켰다(도 2c, 하단). 열 변성 연구를 디자인된 모방체 중 많은 다른 것들 상에서 수행하였으며, 이들의 열적 안정성을 마찬가지로 실증하였다(도 14 내지 도 16 참조). 콜드 체인 저장의 요건을 해소하는 것을 능가하는, 사이토카인-유사 분자에 대한 이러한 전례 없는 안정성은 네이티브 IL-2를 크게 초과하는, 돌연변이에 대한 강건성(도 13 및 도 18 내지 도 19 참조), 유전적 융합 및 화학적 변형을 시사하며, 이는 향상된 또는 새로운 치료적 특성의 개발에 기여할 수 있을 것이다(도 7 참조).
단량체성 네오루킨-2/15 및 mIL-2Rβ
Figure pct00090
c 와의 3원 복합체의 구조: 네오루킨-2/15의 X-선 결정 구조가 결정되었으며, 이는 컴퓨터 디자인 모델에 매우 근접한 것으로 밝혀졌다(비대칭 단위에서 6개 카피에 대한 r.m.s.d.Cα = 1.1 Å 내지 1.3 Å, 도 3a). 뮤린 IL-2Rβ
Figure pct00091
c(도 3b, 표 E2)와의 3원 복합체에서 네오루킨-2/15의 결정 구조가 해결되었으며; 이는, 드 노보 디자인된 단백질이 이전의 해결되지 않은 자연 수용체 복합체의 구조적 결정을 가능하게 한 최초의 실시예일 수 있다. 네오루킨-2/15 디자인 모델 및 결정 구조는 마우스 3원 복합체 구조와 각각 1.27 Å 및 1.29 Å의 r.m.s.d.Cα로 정렬된다(도 3c). 네오루킨-2/15에서 나선의 순서(IL-2 넘버링에서)는 H1->H3->H2'->H4이다(도 1a 및 도 3a, 도 3d 참조). H1-H3 루프는 3원 복합체에서 탈정돈되어 있으나, 나선 H3은 예측된 구조와 근접하게 일치하며; 단량체성 구조와 비교하여 나선 H4 및 H2'-H4 루프의 외향 이동이 또한 존재한다(도 3c). 네오루킨-2/15는 나선 H1 및 H3을 통해 mIL-2Rβ와 상호작용하며, H1 및 H4 나선(도 3c)을 통해
Figure pct00092
c와 상호작용하고, 이들 영역은 컴퓨터 디자인 모델(도 3a) 및 단량체성 결정 구조(도 3c) 둘 다와 근접하게 정렬된다. hIL-2 수용체 복합체49의 이전에 보고된 결정 구조와의 구조적 정렬은, 결합 부위에서 네오루킨-2/15 및 hIL-2의 나선형 백본 사이의 밀접한 배열을, 2개 단백질의 상이한 위상기하학에도 불구하고 드러낸다(도 3d 내지 도 3e). 네오루킨-2/15와 mIL-2Rβ
Figure pct00093
c 사이의 일부 측쇄 상호작용은 hIL-2 - hIL-2Rβ
Figure pct00094
복합체에 존재하는 한편, 다른 것들, 예컨대 L19Y는 컴퓨터 디자인 과정 동안 발생하였다.
네오루킨-2/15의 치료적 적용: IL-2의 임상적 용도는 주로 독성에 의해 제한되었다50-52. 인간에서 IL-2 독성에 관여하는 상호작용이 불완전하게 이해되기는 하지만, 뮤린 모델에서 독성은 T 세포 독립적이고, IL-2Rα 사슬이 부족한 동물에서 개선된다(CD25+). 그러므로, IL-2Rα와의 상호작용을 약화시키기 위해 IL-2를 재조작하는 데 많은 노력을 기울여 왔으나, CD25 결합 부위에서 돌연변이는 고도로 탈안정화일 수 있다6. IL-2의 고유한 낮은 안정성 및 CD25에 대한 이의 밀접하게 관련된 의존도는 재조작된 IL-2 화합물의 번역에 대한 장벽이 되어 왔다. IL-15가 IL-2Rβ
Figure pct00095
c를 이량체화함으로써 IL-2에 대해 유사한 신호화를 유동하지만 CD25에 대한 친화도가 없기 때문에, 다른 노력은 IL-1553,54에 초점을 맞춘다. 그러나, IL-15는, 주로 항원-제시 세포 및 자연 살해 세포 상에서 표시되는 IL-15α(CD215) 수용체에 의한 trans 표시에 따라 달라진다. 네이티브 IL-15의 낮은 안정성, 및 trans 제시에 따른 이의 의존도는 또한, 재조작 노력에 대한 실질적인 장벽이 되어 왔다53-55.
*미접촉 마우스에서의 용량 상승 연구는, mIL-2가 조절 T 세포를 우선적으로 증식시키며, 이는 CD25+ 세포 41,56,57에의 우선적인 결합과 일관되는 한편, 네오루킨-2/15는 주로 CD8+ T 세포(도 4a)의 증식을 유도하고 조절 T 세포의 증식을 유도하지 않거나 시험된 최고 용량에서만 미미하게 유도함을 보여준다. 유사하게는, 통상 조직 체류 CD8+ T 세포를 작은 백분율로 유도하는 기도 염증의 뮤린 모델에서, 네오루킨-2/15는 림프 기관에서 CD4+ Foxp3+ 항원-특이적 Treg를 증가시키지 않으면서 Thy1.2- CD44+ CD8+ T 세포에서 증가를 생성한다(도 4b).
드 노보 단백질 디자인은 네이티브 사이토카인의 구조적 한계를 피할 수 있게 하지만, 항-약물 항체를 유도하는 확률이 존재한다. 네오루킨-2/15가 항-약물 반응을 유도하는지의 여부를 시험하기 위해, 종양-소유 마우스를 2주의 기간에 걸쳐 매일 네오루킨-2/15로 치료하였고, 임의의 치료된 동물에서 항-약물 항체의 증거는 관찰되지 않았다(도 4c, 좌측 패널; 면역 반응의 유사한 결여는 다른 드 노보 디자인 치료 후보41에 대해 관찰되었음). 마우스를 완전 프로인트 아쥬반트 중 불활성 네오루킨-2/15 돌연변이체(K.O. 네오루킨)로 백신화함으로써 네오루킨-2/15에 대한 폴리클로날 항체를 생성하였다. 이들 폴리클로날 항-네오루킨-2/15 항체는 인간 또는 마우스 IL-2와 교차 반응하지 않았다(도 4c). 네이티브 IL-2에의 결합의 부재는, 네오루킨-2/15에 대한 면역 반응이 존재하는 경우에도 이러한 반응이 내인성 IL-2와 교차-반응하지 않는 경향이 있음을 시사한다. 더욱이, 네오루킨-2/15와 hIL-2 사이의 서열 동일성이 낮기 때문에(<30%, 표 E1 참조), 숙주 IL-2에 대한 자가면역 반응은, 내인성 IL-2와 단지 소수의 돌연변이만큼 상이한 이전에 조작된 hIL-2 변이체(예를 들어, 슈퍼-2, 표 E1 참조)인 경향이 훨씬 더 있다.
네오루킨-2/15의 치료 효능을 불량하게 면역원성인 B16F10 흑색종 및 더 면역원성인 CT26 결장암 마우스 모델에서 시험하였다. 네오루킨-2/15에 의한 단일 작용제 치료는 암 모델 둘 다에서 종양 성장에서 용량-의존적 지연을 유발하였다. CT26 결장암에서, 단일 작용제 치료는 재조합 mIL-2에 대해 관찰된 것보다 향상된 효능을 보여주었다(도 4d 및 도 5). B16F10 흑색종에서, 항-흑색종 항체 TA99(항-TRP1)에 의한 공동-치료는 유의한 종양 성장 지연을 유발한 한편, TA99 치료 단독은 거의 효과가 없었다(도 4e 및 도 6). 장기간 생존율 시험(8주)에서, TA99와 조합된 네오루킨-2/15는 mIL-2(도 4e)와 비교하여 실질적으로 감소된 독성 및 전반적으로 우수한 치료적 효과를 보여주었다. 조합 mIL-2와 TA99로 치료받은 마우스는 꾸준하게 체중을 손실하였고 이들 마우스의 전반적인 건강은 안락사를 필요로 하는 지점까지 하락한 반면, 네오루킨-2/15와 TA99의 조합에서는 이러한 하락이 거의 관찰되지 않았다(도 4e). 치료적 이익과 일관되게, 네오루킨-2/15 치료는 종양내 CD8:Treg 비(도 4f 및 도 5 참조)에서 유의한 증가를 유발하였으며, 이는 효과적인 항종양 면역 반응58과 이전에 상관관계가 있었다. 네오루킨-2/15에 의한 CD8:Treg 비의 증가는 용량 및 항원 의존적이고(도 4f); 최적의 치료적 효과는 더 높은 용량에서 그리고 다른 면역치료제와 조합되어 수득되었다(도 6 참조). 더불어, 이들 데이터는, 네오루킨-2/15가 이의 IL-2로부터 유래된 예측된 항상성 이익, 예컨대 면역강화제 활성을 나타내지만, CD25+ 우선 결합과 관련된 유해 사건은 없음을 보여준다. 이들 증강된 특성 및 저-독성은, 재조합 IL-2가 광범위하게 사용되지 않는 다른 면역치료법에 대해 네오루킨-2/15의 일상적인 사용을 가능하게 할 수 있다. 이러한 사용의 일례로서, CAR-T 세포 치료법(도 8 참조)을 증강시키기 위한 네오루킨-2/15의 잠재적인 적용을 조사하였다. 종양 접종 후 제8일 내지 제14일째에, 0.5 Х 106개 RAJI 종양 세포가 접종된 NSG 마우스를 치료하지 않은 채 두거나, 0.8 Х 106개 항-CD19 CAR-T 세포(종양 세포의 접종 후 7일째에 주입됨)로 치료하거나, 유사하게는 항-CD19 CAR-T 세포 + 20 μg/일의 인간 IL-2 또는 네오루킨-2/15로 치료하였다. 예상된 바와 같이, 네오루킨-2/15는 이 모델에서 CAR-T 세포 치료법의 항-종양 효과를 유의하게 증강시켜, 종양의 성장을 늦추고 마우스의 생존율을 연장시켰다(데이터는 제시되지 않음).
단백질 모방체의 드 노보 디자인은 단백질-기초 치료제 분야를 변환시키는 잠재성을 가져서, 사이토카인에 대해서가 아니라 기지의 또는 정확하게 예측 가능한 구조를 갖는 사실상 임의의 생물학적 활성 분자에 대해 증강된 치료적 특성 및 감소된 부작용을 갖는 생물우수(biosuperior) 분자의 개발을 가능하게 한다. 현재의 전형적인 조작 접근법(예를 들어, 단일 부위에서의 1 내지 3개 아미노산 치환, 화학적 변형)의 증분 성질(incremental nature)때문에, 부모 분자의 결점 대부분은 생성된 조작 변이체에서 불가피하게 거쳐가며 종종 악화된 형태로 거쳐간다. 모방체 드 노보로 구축함으로써, 이들 결점은 완전히 피해질 수 있으며: 재조합 IL-2 및 hIL-2의 조작된 변이체와는 달리, 네오루킨-2/15는 이. 콜라이에서 가용성으로 발현될 수 있으며(도 17 참조), 고온에서 활성을 보유하고, IL-2Rα와 상호작용하지 않고, 새로운 기능의 조작을 가능하게 하는 실질적인 서열 변화에 강건성이다(도 7). 드 노보 디자인된 단백질의 작은 크기 및 높은 안정성때문에, 면역원성은 낮은 것으로 보이고, hIL-2의 증분 변이체와는 대조적으로, 모방체에 대한 임의의 항체 반응은 자연 부모 사이토카인과 교차 반응하는 경향이 거의 없다. 디자인된 모방체는 이의 높은 안정성과 강건성, 및 이의 맞춤형 상호작용 표면때문에, 상이한 단백질 기능성, 예를 들어 네오루킨-2/15의 표적화된 버전을 조합하는 차세대 치료제에서 특히 강력한 경향이 있다.
네오루킨-2/15의 강건한 모듈성. 이황화-스테이플화 및 IL-4 모방체로의 재조작: 네오루킨-2/15는 고도로 모듈성이어서, 이의 특성을 쉽게 조정할 수 있고, 예컨대 이의 안정성을 증가시키거나 이의 결합 선호도를 변형시킨다. 이러한 모듈성 및 강건성은, 컴퓨터 디자인에 의해 네오루킨-2/15 59의 기능을 보존하는 단일-이황화 스테이플을 증강시키는 안정성에 의해 도입함으로써 이용되었다. 이를 위해, 2 가지 오르토고날(orthogonal) 전략을 사용하였다. 우선, 선호할 만한 지리학적 배열, 뒤이어 유연성 백본 최소화로 위치의 쌍을 검색함으로써 이황화 브릿지를 도입하였다. 최종 디자인은 잔기 38과 75 사이에 단일 이황화를 도입하였으며, 이는 나선 H3 및 H2를 안정화시킨다. 제2 접근법에서, 네오루킨-2/15의 N-말단 및 C-말단을 리모델링하여, 전체 단백질(말단 P 및 S 잔기를 제거한 후 각각 N-말단 및 C-말단에 대해 첨가된 서열 CNSN(서열번호260) 및 NFQC(서열번호261), 도 18 참조)을 포괄하는 단일-이황화 스테이플의 도입을 가능하게 하였다. 이황화 스테이플화 전략 둘 다, 네오루킨-2/15의 안정성을 증가시킨 한편(Tm > 95℃), 이의 서열 및 기능은 대체로 영향을 받지 않았다(도 18 참조). 네오루킨-2/15의 모듈성 특성을 사용하여, 이의 결합 선호도를 변형시켰다. 인터루킨-2 계통의 모든 사이토카인은
Figure pct00096
c와 상호작용하고, 공통 구조를 공유한다. 따라서, 네오루킨-2/15가, IL-2Rβ(나선 H1 및 H3)와 상호작용하는 결합-부위 중 절반에서만 아미노산을 변화시킴으로써 IL-2 계통의 또 다른 사이토카인 모방체로 변환될 수 있는 것으로 가정되었다. 개념의 증명으로서, 인간 인터루킨-4(hIL-4)는, 이것이 IL-2와 광범위한 구조적 상동성을 공유하고 재생 의학60,61에서 잠재적인 적용을 갖고 있기 때문에 표적으로서 선택되었다. Neo-2/15는, Neo-2/15 모델을 이의 IL-4 수용체에 결합된 인간 IL-4의 구조로 정렬시키고, Neo-2/15 내의 14개 잔기를 IL-4와 IL4r 사이에서 상호작용을 매개하는 구조적 위치에서 IL-4의 아미노산과 매칭하도록 돌연변이화시킴으로써, 인간 IL-2 수용체(IL-2Rβ 및
Figure pct00097
c를 포함함)가 아니라 인간 IL-4 수용체(IL-4Rα 및
Figure pct00098
c를 포함함)에 결합하도록 변형되었다(도 7). 결합은, 무작위 돌연변이발생을 사용하고 높은 결합 친화도 변이체에 대해 스크리닝하는 직접 진화에 의해 추가로 최적화되었으며, 이는 2개의 부가적인 아미노산 치환을 도입하고 IL-4 단백질로부터 이식된 14개의 원래 잔기 중 하나를 변형시켰고, 이로써 네오루킨-2/15로부터 총 16개의 돌연변이를 갖는 새로운 단백질 네오루킨-4를 생성하였다. 생성된 최적화된 디자인, 네오루킨-4(표 S5 참조)는 이. 콜라이로부터 재조합적으로 발현되고 정제되었으며, 결합에 대해 시험되었다. 네오루킨-4는 IL-4Rα 수용체에 높은 친화도로 결합하며, IL-4Rα
Figure pct00099
c(도 7 참조)에 협동적으로 결합하고, IL-2 수용체(데이터는 제시되지 않음)에 임의의 친화도로 결합하지 않으며, 네오루킨-4는 네오루킨-2/15(도 20b,c 참조)의 우수한 열안정성 특성을 보유하고, IL-13 수용체(데이터는 제시되지 않음)에 대한 IL-4의 주어진 자연 교차-반응성에서 예상된 바와 같이 IL-13 수용체에 결합한다. 종합하면, 이는, 네오루킨-2/15가 모듈형 스캐폴드로서 작용하기에 충분히 강건하며, 이때 유의한 합리적인 서열 변화가 도입되어 이의 기능 또는 물리적 특성을 고도로 예측 가능한 방식으로 변형시킬 수 있음을 보여준다.
방법
드 노보 사이토카인 모방체의 컴퓨터 디자인: 드 노보 사이토카인 모방체의 디자인은, 디자인을 위한 주형으로서 IL-2Rβ
Figure pct00100
c 수용체와 함께 4원 복합체에서 hIL-2의 구조를 정의함으로써 시작하였다. 조사 후, 결합-부위를 구성하는 잔기는 Rosetta's 메타데이터(PDBInfoLabels)를 사용하여 핫스팟으로서 정의되었다. 구조를, PyRosetta에서 프로그래밍된 새로운 모방체 디자인 프로토콜 내로 공급하였으며, 이는 표적-주형을 구성하는 코어-2차 구조 요소를 자동적으로 검출하고 디자인에 대한 전체 RosettaScripts 상용성 정보를 갖는 생성된 드 노보 모방체 백본을 생성할 수 있다. 간략하게는, 모방체 구축 알고리즘은 하기와 같이 작동한다. 1세대 디자인에 대해, 각각의 코어-요소는 고도로-이상적인 단편(단편-크기 4개 아미노산)의 클러스터링된 데이터베이스로부터 루프를 사용하여 재작제에 의해 이상화되었다. 이상화 후, 모방체 구축 프로토콜은 모든 가능한 조합의 쌍에 의해 이상화된 요소를 재연결하는 것을 목표로 한다. 이를 위해, 이는 데이터베이스로부터 서열-애그노스틱 단편의 조합적 단편 조립을 사용하고, 뒤이어 잠재적인 솔루션을 위해 데카르트-제약 백본 최소화를 사용한다(즉, 구축된 단편의 N-말단 및 C-말단이 2개의 2차 구조를 연결하기에 충분히 근접한 경우). 최소화 후, 상기 솔루션은 고도로 이상적인 단편을 함유하고(즉, 2개의 연결된 요소로 구성된 모든 중복 단편이 데이터베이스 내에도 함유됨) 백본이 표적(맥락) 수용체와 충돌하지 않는 것으로 입증된다. 그 후에, 통과 백본 솔루션은 단편의 동일한 데이터베이스를 사용하여 프로파일링되어, 각각의 위치에서 최확 아미노산을 결정하였다(이 정보는 디자인 상의 메타데이터에서 인코딩되었음). 다음, 연결된 2차 구조의 쌍에 대한 솔루션은 조합적으로 재조합되어, 구성요소를 연결한 그래프 이론을 사용함으로써 완전히 연결된 백본을 생성한다. 솔루션의 수가 요소의 각각의 쌍에 따라 지수적으로 성장하기 때문에, 각각의 단편 조합 단계에서, 본 발명자들은 코어 요소의 쌍 사이에 더 짧은 상호연결을 갖는 것을 선호하도록 디자인을 순위 매기고, 다음 단계로 진행하기 위해 상위 솔루션만 유지시켰다. 그 후에, 완전히 연결된 솔루션을 층(계면, 코어, 비-코어-표면, 표면)에 의해 프로파일링하여, 가능한 아미노산의 동일성을 층-상용성인 것으로 제약하였다. 마지막으로, 핫스팟 상의 모든 정보, 상용성 구축-단편 아미노산 및 층을 조합하였다(핫스팟은 아미노산 확률에게 우선권을 갖고, 아미노산 확률은 층에 대해 우선권을 가졌음). 이들 완전히 프로파일링된 백본을 유연성 백본 디자인 및 여과를 위해 RosettaScripts로 통과시켰다(부록 A의 rosetta-스크립트 참조). 2세대 디자인의 경우, 2 가지 접근법이 이어졌다. 제1 접근법에서, 최상의 1세대 최적화된 디자인의 서열 재디자인을 실행하였다(G1_neo2_40_1F, 부록 B 참조). 제2 접근법에서, G1_neo2_40_1F를 표적 주형으로서 사용하여 새로운 모방체를 조작하였다. 이 2세대에서 모방체 디자인 프로토콜은 2 가지 주요 차이를 제외하고는 1세대에 대해 기재된 것과 유사하였다. 우선, 코어-단편은 단편으로부터 더 이상 구축되지 않았으나, 대신에 각각의 표적 나선을 가능한 한 근접하게 나타낸 반복 2차 구조를 초래하는 반복 파이 및 프사이 각도(180°로 고정된 오메가)의 매개 방정식으로 발견함으로써 구축되었고, 파이 및 프사이 각도의 "피치"는 나선이 곡률(최종 매개변수: H1:, H2:, H3, H4)을 갖는 확률을 허용하기 위해 모든 X-아미노산을 가능하게 하였고, 이들 매개 방정식의 슈(sue)는 표적 구조 내 코어-요소 각각의 크기를 마음대로 변화시킬 수 있게 하였으며(크기를 증가시키거나 감소시킴), 이는 루프 구축 과정과 커플링되었고(최대/최소 8.a.a.), 코어 요소의 크기 감소는 결합 부위로부터 핫스팟을 제거하는 것이 허용되지 않았다. 2세대 디자인에서 제2 차이는, 2차 구조 코어-요소를 재연결하는 대신 본 발명자들은 7개 아미노산의 단편-크기를 사용하였고, 1개 초과의 단편의 조합적 조립은 가능하지 않았다는 점이다(즉, 단일 단편은 2차 구조의 쌍과 근접할 수 있어야 함). 디자인 알고리즘의 나머지는 본질적으로, 1세대와 유사하였다(부록 C 참조). 사용된 Rosetta 에너지 함수는 1세대 및 2세대 디자인 각각에 대해 "talaris2013" 및 "talaris2014"였다.
드 노보 모방체에 대한 백본의 디자인에 사용된 고도로 이상적인 단편의 데이터베이스는 RCSB 단백질 데이터 뱅크로부터의 비-잉여 공개적으로 입수 가능한 단백질 구조의 광범위한 데이터베이스를 사용하여 새로운 Rosetta 적용 "kcenters_clustering_of_단편"으로 작제되었으며, 이는 1세대 디자인에 사용된 4량체 데이터베이스에 대해 16767 PDB, 및 2세대 디자인에 사용된 7량체 데이터베이스에 대해 7062 PDB로 이루어졌다.
효모 디스플레이: 효모를, 선형화된 pETcon3 벡터와 함께 표시될 단백질을 인코딩하는 유전자로 형질전환시켰다. 벡터를 NdeI 및 XhoI(New England Biolabs)에 의한 100배 과다분해에 의해 선형화시킨 다음, 겔 추출(Qiagen)에 의해 정제하였다. 유전자는 5' 말단과 3' 말단 둘 다에서 벡터와 50개 염기의 중복을 포함하여, 상동성 재조합은 유전자를 벡터 상에서 AGA2 유전자와 myc 태그 사이의 프레임에 배치할 것이다. 효모는 이전에 기재된 바와 같이 SGCAA 배지에서 유도 전에 C-Trp-Ura 배지에서 성장되었다. 유도 후 12시간 내지 18시간째에, 세포를 냉각 디스플레이 완충제(50 mM NaPO4 pH 8, 20 mM NaCl, 0.5% BSA)에서 세척하고, 다양한 농도의 비오틴화된 수용체(인간 또는 뮤린 IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ, 또는 인간 IL-4Rα)와 함께 인큐베이션하였으며, 이때 4℃에서 교반하였다. 대략 30분 후, 세포를 냉각 완충제에서 다시 세척한 다음, 얼음 상에서 FITC-접합 항-c-Myc 항체(3x106개 세포 당 1 uL) 및 스트렙타비딘-피코에리트린(100 uL 부피의 효모 당 1 uL)과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 효모를 세척하고, 유세포분석(Accuri C6)의해 카운트하거나 FACS(Sony SH800)에 의해 소팅하였다. 초기 수용체 인큐베이션이 비오틴화 IL-2R 및 비-비오틴화 IL-4Rα의 조합과 함께 수행되는 실험의 경우, 비-비오틴화된 수용체는 몰 과량으로 제공되었다.
돌연변이발생 및 친화도 성숙: 오류-유발 PCR 기초 돌연변이발생의 경우, 돌연변이화되는 디자인을 pETcon3 벡터 내로 클로닝하고, MutaGene II 돌연변이발생 키트(Invitrogen)를 제조업체의 설명에 따라 사용하여 증폭시켜, 뉴클레오타이드 당 대략 1%의 돌연변이 빈도를 산출하였다. 1 μg의 이러한 돌연변이화된 유전자를 1 μg의 선형화된 pETcon3 벡터와 함께 EBY100 효모 내로 전기천공시키고, 이때 형진전환 효율은 약 108이었다. 집단이 수렴할 때까지 효모를 유도하고, 점진적으로 저하되는 농도의 수용체와 함께 연속하여 여러 번 소팅하였다. 효모를 각각의 소트 사이에서 C-Trp-Ura 배지에서 재성장시켰다.
부위-포화 돌연변이발생(SSM) 라이브러리를 Genscript로부터의 합성 DNA로부터 작제하였다. 각각의 디자인 주형 상의 각각의 아미노산에 대해, PCR 증폭이 축퇴성 NNK 코돈을 갖는 5' PCR 생성물 및 3' PCR 생성물 각각을 초래하도록 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 디자인하였다. COF 및 COR 프라이머에 의한 "좌측" 및 "우측" 생성물의 증폭은, 각각이 상이한 잔기 위치에서 축퇴성 NNK 코돈으로 구성된 일련의 주형 생성물을 산출하였다. 각각의 디자인에 대해, 이들 생성물을 풀링하여 SSM 라이브러리를 산출하였다. SSM 라이브러리를, Benatuil 등에 의해 이미 기재된 프로토콜을 사용하여, 선형화된 pETCON3 벡터와 더불어 전기천공에 의해 조건화된 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 EBY100 세포로 형질전환시켰다.
조합적 라이브러리를 모호한 뉴클레오타이드를 함유하는 Genscript로부터의 합성 DNA로부터 작제하고, 선형화된 pETCON3 벡터로 유사하게 형질전환시켰다.
단백질 발현: 디자인된 단백질 서열을 인코딩하는 유전자를 합성하고, pET-28b(+) 이. 콜라이 플라스미드 발현 벡터(GenScript, N-말단 6xHis 태그 및 트롬빈 절단 부위) 내로 클로닝하였다. 그 후에, 플라스미드를 화학적으로 적격인(competent) 이. 콜라이 Lemo21 세포(NEB)로 형질전환시켰다. 단백질 발현을 Terrific 브로쓰 및 M 염을 사용하여 수행하고, OD600이 대략 0.8에 도달할 때까지 배양물을 37℃에서 성장시킨 다음, 1 mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 이용하여 발현을 유도하고, 온도를 18℃까지 낮추었다. 대략 18시간 동안 발현시킨 후, 세포를 수합하고, 18,000 psi에서 Microfluidics M110P 미세유동화기로 용해시킨 다음, 24,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 가용성 분획을 정화시켰다. 가용성 분획을 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(Qiagen), 뒤이어 FPLC 크기-배제 크로마토그래피(superdex 75 10/300 GL, GE Healthcare)에 의해 정제하였다. 정제된 네오루킨-2/15를, 용액(Thermo Scientific) 중 화학종의 분자량의 질량 스펙트럼(MS) 확인, 단량체성 상태 및 분자량(Agilent, Wyatt)을 확증하기 위한 크기 배제 - 다각도 레이저 광 산란(SEC-MALLS), SDS-PAGE, 및 내독소 수준(Charles River)에 의해 특징화하였다.
hIL-2(a.a. 1-133), hIL-2Rα(a.a. 1-217), hIL-2Rβ(a.a. 1-214) hIL-2Rγ(a.a. 1-232), mIL-2(a.a. 1-149), mIL-2Rα 엑토도메인(a.a. 1-213), mIL-2Rβ 엑토도메인(a.a. 1-215), 및 mγc 엑토도메인(a.a. 1-233)를 포함하는 인간 및 마우스 IL-2 복합체 구성요소가 분비되었고, 이전에 기재된 바와 같이17,49 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 정제되었다. 모든 단백질을 HBS에서 평형화된 Superdex 200 사이징 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 98% 초과의 균질성까지 정제하였다. 순도를 SDS-PAGE 분석에 의해 확증하였다. 비오틴화 인간 IL-2 및 마우스 IL-2 수용체 하위단위의 발현을 위해, C-말단 비오틴 수용기 펩타이드(BAP)-LNDIFEAQKIEWHE(서열번호262)를 함유하는 단백질을 발현시키고, 기재된 바와 같이 Ni-NTA 친화도 크로마토그래피에 의해 정제한 다음, 0.5 mM 비신(Bicine) pH 8.3, 100 mM ATP, 100 mM 마그네슘 아세테이트, 및 500 mM 비오틴(Sigma) 중 가용성 BirA 리가제 효소로 비오틴화시켰다. 과량의 비오틴을, HBS에서 평형화된 Superdex 200 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다.
네오루킨-2 결정 및 공동-결정 구조: C-말단 6xHis-태그 엔도글리코시다제 H(endoH) 및 뮤린 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 이전에 기재된 바와 같이 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 Hi-five 세포에서 별도로 발현시켰다. IL-2Rγ를 5 μM 키푸넨신(kifunensin)의 존재 하에 성장시켰다. 대략 72시간 후, 분비된 단백질을 Ni-NTA 아가로스 컬럼에 걸쳐 통과시켜 배지로부터 정제하고, HBS 완충제(150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.3) 중 200 mM 이미다졸로 용출시켰다. EndoH를 희석여과에 의해 HBS 완충제로 교환하였다. 1:75 (w/w) endoH와 밤새 인큐베이션함으로써 mIL-2Rγ를 탈글리코실화시켰다. mIL-2Rβ 및 mIL-2Rγ를 추가로 정제하고, S200 컬럼(GE Life Sciences)을 사용하여 FPLC에 의해 완충제를 교환하였다.
단량체성 네오루킨-2/15를 12 mg/ml까지 농축시키고, 2.4 M 소듐 말로네이트 pH 7.0으로부터 증기 확산에 의해 결정화하고, 결정을 수합하고 추가의 동결보호 없이 순간(flash) 냉동시켰다. 결정을 Stanford Synchrotron Radiation Laboratory 빔라인 12-2에서 2.0 Å 분해능(resolution)까지 회절시키고, 인덱스(index)하고, XDS(Kabsch, 2010)를 사용하여 통합하였다. 스페이스 기를 Pointless(Evans, 2006)를 이용하여 배정하고, 등급화(scaling)를 CCP4 묶음(Winn 등, 2013)으로부터 에임리스(Aimless)(Evans 및 Murshudov, 2013)로 수행하였다. 본 발명자들의 예측된 모델을 검색 앙상블로서 사용하여, 페이서(Phaser)(McCoy 등, 2007)에서 분자 재배치에 의해 구조를 해결하였으며, 이때 6개의 프로모터는 비대칭 단위로 배치되었다. 오토빌드(Autobuild)(Terwilliger 등, 2008)를 이용한 초기 재구축 후, 수동 재구축 및 정화의 반복 사이클(iterative cycle)을 쿠트(Coot)(Emsley 등, 2010) 및 피닉스(Phenix)(Adams 등, 2010)를 사용하여 수행하였다.
3원 네오루킨:mIL-2Rβ:mIL-2Rγ 복합체를 결정화하기 위해, 3개 단백질을 등몰비로 조합하고, 1:100 (w/w) 카르복시펩티다제 A 및 B로 밤새 분해시켜 정제 태그를 제거하고, S200 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 정제하였으며; 모든 3 가지 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 20 mg/ml까지 농축시켰다. 0.1 M 이미다졸 pH 8.0, 1 M 소듐 시트레이트로부터의 증기 확산에 의해 초기 니들유사(needlelike) 미세결정을 형성시키고, 이를 사용하여 마이크로시드 매트릭스 스크리닝(MMS, (D'Arcy 등, 2014))에서 후속 사용하기 위한 마이크로시드 스탁을 제조하였다. MMS의 단일 반복 후, 동일한 침전물에서 성장된 결정을 30% 에틸렌 글리콜로 동결보호하고, 수합하고, Advanced Photon Source 빔라인 23ID-B에서 3.4 Å x 3.8 Å x 4.1 Å 분해능까지 이방성적으로(anisotropically) 회절시켰다. 구조를, 검색 앙상블로서 인간 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ 구조(pdb ID 2B5I)를 사용하여 페이서에서 분자 재배치에 의해 해결하였다. 이는 전자 밀도 맵을 생성하였고, 이 맵 내로 2개의 폴리-알라닌 알파 나선이 수동적으로 구축될 수 있었다. 피닉스에서 강성체 정화 후, BC 루프 및 일부 방향족 측쇄와 함께 2개의 비모델링된 알파 나선에 대한 전자 밀도는 가시적으로 되어, 단량체성 네오루킨의 도킹을 가능하게 하였다. MMS의 2개의 추가 반복 및 첨가제 스크린(Hampton Research)의 사용은 150 nl의 단백질, 0.1 M Tris pH 7.5, 5% 덱스트란 설페이트, 2.1 M 암모늄 설페이트를 함유하는 125 nl의 웰 용액 및 1.3 M 암모늄 설페이트, 50 mM Tris pH 7.5, 50 mM 이미다졸 pH 8.0, 300 mM 소듐 시트레이트를 함유하는 25 nl의 마이크로시드 스탁을 사용한 증기 확산에 의해 성장된 결정을 생성하였다. 3 M 소듐 말로네이트로 동결보호된 결정을 순간 동결시키고, Advanced Light Source 빔라인 5.0.1에서 2.5 Å x 3.7 Å x 3.8 Å로 이방성적으로 회절시켰다. 데이터를 XDS로 처리한 후, 타원형 분해능 한계를 STARANISO 서버(Bruhn 등, 2017)를 사용하여 적용하였다. 부스터(Buster)(Smart 등, 2012; Bricogne 등, 2016)에서 더 높은 분해능의 인간 수용체(PDB id 2B5I) 및 네오루킨-2/15 구조로의 TLS 및 표적 제약을 사용한 이들 반영에 대한 정화에 의해 모델의 신속한 수렴을 수득하였고, 이때 쿠트에서의 수동적인 재구축, 뒤이어 표적 제약이 없이 피닉스에서 최종 라운드의 정화가 수행되었다. 구조 도면은 PyMol(Schrodinger, LLC. 2010. The PyMOL Molecular Graphics System, 버전 2.1.0)울 이용하여 제조되었다. 이 프로젝트에 사용된 소프트웨어를 설치하고 SBGrid(Morin 등, 2013)에 의해 구성하였다.
세포주: 비변형된 YT-164 및 IL-2Rα+ YT-1 인간 자연 살해 세포65를 RPMI 완전 배지(10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민, 최소 비필수 아미노산, 소듐 피루베이트, 25 mM HEPES, 및 페니실린-스트렙토마이신 [Gibco]이 보충된 RPMI 1640 배지)에서 배양하였다. ATCC로부터 구매한 CTLL-2 세포를 ConA (Corning)가 보충된 10% T-STIM 배양물 RPMI 완전 배지에서 배양하였다. 모든 세포를 5% CO2를 함유한 습도조절 분위기에서 37℃에서 유지시켰다. IL-2Rα를 발현하는 YT-1 세포의 하위집단을 이전에 기재된 바와 같이17 자기적 선별을 통해 정제하였다. IL-2Rα 발현의 농화 및 지속성을, Accuri C6 유세포분석기(BD Biosciences) 상에서 PE-접합 항-인간 IL-2Rα(Biolegend) 항체 결합의 분석에 의해 모니터링하였다.
원편광 이색성(CD): 원자외선 CD 측정을 1 mm 통로-길이 큐벳에서 PBS 완충제(pH 7.4) 중 AVIV 분광광도계 모델 420을 이용하여 ~0.20 mg/ml(문헌에서 다르게 언급되지 않는 한)의 단백질 농도로 수행하였다. 온도 용융은 25℃로부터 95℃까지이고, 222 nm에서의 흡광 신호를 모니터링하였다(2℃/분의 단계, 단계에 의해 30초의 평형화). 파장 스캔(195 nm 내지 260 nm)을 25℃ 및 95℃에서 수집하고, 신속한 재접힘(~5분) 후 25℃에서 다시 수집하였다.
결합 연구: 표면 플라즈몬 공명(SPR): IL-2 수용체 친화도 적정 연구를 위해, 비오틴화된 인간 또는 마우스 IL-2Rα, IL-2Rβ, 및 IL-2Rγ 수용체를 Biacore T100 기기(GE Healthcare) 상에서의 분석을 위해 스트렙타비딘-코팅 칩에 고정시켰다. 무관한 비오틴화된 단백질을 기준 채널에 고정시켜, 비-특이적 결합을 배제하였다. 100 반응 단위(RU) 미만의 각각의 리간드를 고정시켜, 질량 이전 효과를 최소화하였다. hIL-2, mIL-2, 슈퍼-2, 또는 조작된 IL-2 모방체의 3-배 일련 희석물을 고정된 리간드에 걸쳐 60초 동안 유동시키고, 해리를 240초 동안 측정하였다. IL-2Rβγc 결합 연구를 위해, 포화 농도의 hIL-2Rβ(3 uM) 또는 mIL-2Rββ(5 uM)를 각각 지시된 농도의 hIL-2 또는 mIL-2에 첨가하였다. 10 mM 소듐 아세테이트 pH 5.5 중 1 M MgCl2에 15초 동안 노출시켜, 모든 상호작용에 대한 표면 재생을 수행하였다. 0.2% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 HBS-P+ 완충제(GE Healthcare)에서 25℃에서 SPR 실험을 수행하고, 모든 결합 연구를 50 L/분의 유속으로 수행하여, 분석물 재결합을 방지하였다. Biacore T100 평가 소프트웨어 버전 2.0(GE Healthcare)을 사용하여 데이터를 시작화하고, 처리하였다. 모든 결합 상호작용을 우선으로 가정하는 GraphPad Prism을 사용하여 평형 적정 곡선 적합 및 평형 결합 해리(KD) 값 결정을 실시하였다. 생물층 간섭계: 결합 데이터를 Octet RED96(ForteBio, Menlo Park, CA)에서 수집하고, 1:1 결합 모델을 사용하는 기기의 통합 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 비오틴화된 표적 수용체, 인간 또는 뮤린 IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ, 또는 인간 IL-4Rα를 결합 완충제(10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, 0.5% 무지분유) 중 1 μg/ml에서 300초 동안 스트렙타비딘 코팅된 바이오센서(SA ForteBio)로 작용화시켰다. 분석물 단백질을 농축된 스탁으로부터 결합 완충제로 희석시켰다. 결합 완충제 단독에서의 기준선 측정 후, 100 nM의 디자인된 단백질(결합)을 함유하는 웰에 바이오센서를 침지시킨 다음, 상기 센서를 다시 기준선 웰(해리)에 침지시킴으로써 결합 동역학을 모니터링하였다. IL-2Rβ 또는 IL-4Rα가 솔루션에 보충되는 한편 IL-2R이 센서에 결합되는 결합 실험에 대해, 보충 단백질은 2.5배 몰 과량으로 제공되었다.
STAT5 인산화 연구: 시험관내 연구: 대략 2x105 YT-1, IL-2Rα+ YT-1, 또는 CTLL-2 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 평판배양하고, hIL-2, mIL-2, 슈퍼-2, 또는 조작된 IL-2 모방체의 일련의 희석물을 함유하는 RPMI 완전 배지에 재현탁시켰다. 세포를 37℃에서 15분 동안 자극시키고, 포름알데하이드를 1.5%까지 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 즉시 고정시켰다. 세포의 투과도는 4℃에서 30분 동안 빙냉 100% 메탄올에 재현탁시킴으로써 달성되었다. 고정된 세포 및 투과된 세포를 FACS 완충제(0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 포스페이트-완충 식염수 [PBS] pH 7.2)로 2회 세척하고, FACS 완충제에서 희석된 Alexa Fluor® 647-접합 항-STAT5 pY694(BD Biosciences)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 FACS 완충제에서 2회 세척하고, MFI를 CytoFLEX 유세포분석기(Beckman-Coulter) 상에서 결정하였다. 용량-반응 곡선을 로지스틱 모델로 적합화시키고, 비자극된 세포의 평균 형광 강도(MFI)의 차감 및 최대 신호 강도로의 정규화 후 GraphPad Prism 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 절반-최대 유효(half-maximal effective) 농도(EC50 값)을 계산하였다. 실험을 3중으로 수행하고, 유사한 결과로 3회 수행하였다. 생체외 연구: The Jackson Laboratory로부터 구매한 야생형 C57BL/6J 또는 B6;129S4-Il2ratm1Dw(CD25KO) 마우스로부터 비장 및 림프절을 수합하고, 소트(sort) 완충제(pH 7.2 포스페이트-완충 식염수 중 2% 소 태아 혈청) 중 단일 세포 현탁액으로 만들었다. 세포 현탁액을 비오틴-접합 항-B220, CD8, NK1.1, CD11b, CD11c, Ter119, 및 CD19 항체로 1:100에서 얼음 상에서 30분 동안 염색함으로써 CD4+ T 세포를 음성 선별을 통해 농화시켰다. 소트 완충제에 의한 세척 후, 항-비오틴 MicroBeads(Miltenyi Biotec)를 세포 현탁액에 총 107개 세포 당 20 μL로 첨가하고 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하며, 재현탁시키고, 음성 선별을 EasySep Magnets(STEMCELL Technologies)을 사용하여 수행하였다. 대략 1 x105개의 농화된 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰 내의 mIL-2, 슈퍼-2, 또는 네오루킨-2/15의 10-배 일련의 희석물과 함께 5% FCS가 있는 RPMI 완전 배지에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 자극시키고, 4% PFA로 고정시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 고정 후, 세포를 수합하고, 소트 완충제로 2회 세척하며 투과를 위해 dH2O 중 500 μL 90% 빙냉 메탄올에서 30분 동안 다시 고정하였다. 세포를 Perm/Wash 완충제(BD Biosciences)로 2회 세척하고, 펌/세척(Perm/Wash) 완충제 중 항-CD4-PerCP(1:300), 항-CD44-Alexa Fluor 700(1:200), 항-CD25-PE-Cy7(1:200), 및 시료 당 5 μL의 항-pSTAT5-PE pY694로 실온, 암실에서 45분 동안 염색하였다. 세포를 펌/세척제로 세척하고, BD LSR II 유세포분석기(BD Biosciences)에서의 분석을 위해 소트 완충제에 재현탁시켰다.
생체내 뮤린 기도 염증 실험: C57BL/6J를 The Jackson Laboratory로부터 구매하였다. 마우스에게, 마우스 당 총 23 μg Derp1까지 PBS에서 재현탁된 20 μL의 집먼지좀 진드기(whole house dust mite) 항원(Greer)을 비내로 접종하였다. 제1일 내지 제7일, 마우스에게 멸균 PBS(pH 7.2) 중 20 μg mIL-2, 멸균 PBS 중 몰 당량의 네오루킨-2/15의 복강내 주사를 제공하거나, 주사를 제공하지 않았다. 제8일에, 순환형 T 세포를 혈관내 표지하고, 사량체 양성 세포를 이전에 기재된 바와 같이(Hondowicz, Immunity, 2016) 림프절 및 비장 또는 폐로부터 농화시켰다. 컬럼 플로우-스루(flow-through) 및 결합된 분획 둘 다 유세포분석을 위해 비축하였다. 세포를 항체로 표면 염색시키고, BD LSR II 유세포분석기(BD Biosciences)에서 분석하였다. 동물 모델: C57BL/6 마우스를 The Jackson Laboratory로부터 구매하거나 인하우스에서 사육하였고, BALB/c 마우스를 Charles River로부터 구매하였다. 동물을 Dana-Farber Cancer Institute(DFCI) Institutional 동물 관리 및 사용 위원회, Direcao Geral de Veterinaria 및 iMM Lisboa 윤리 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 유지시켰다.
결장직장 암종 생체내 마우스 실험: CT26 세포를 포르투갈, IGC(Instituto Gulbenkian de Ciencia)의 Jocelyne Demengeot의 연구 그룹으로부터 공급받았다. 제0일에, 5 x 10^5개 세포를 Matrigel(Corning)과 함께 Dulbecco's Modified Eagle 배지(Gibco)의 1:1 혼합물 50 μL와 함께 BALB/c 마우스의 옆구리에 피하(s.c.) 주사하였다. 제6일에 출발하여, 종양 부피가 대략 100 mm3에 도달한 경우, 네오루킨-2/15 및 mIL-2(Peprotech)를 50 μL의 PBS(Gibco) 중 복강내(i.p.) 주사에 의해 매일 투여하였다. 항-PD-1 항체(Bio X Cell)에 의한 치료를 마우스 당 PBS 중 200 μg의 i.p. 주사에 의해 매주 2회 수행하였다. 종양 부피가 1,300 mm3에 도달한 경우, 마우스를 희생시켰다.
흑색종 생체내 실험: B16F10 세포를 ATCC로부터 구매하였다. 제0일에, 5Х105개 세포를 500 μL의 Hank's Balanced 염 용액(Gibco)에서 s.c. 주사에 의해 접종하였다. 제1일에서 출발하여, 네오루킨-2/15 및 mIL-2(Peprotech)를 200 μL의 LPS-무함유 PBS(Teknova) 중 복강내(i.p.) 주사에 의해 매일 투여하였다. 150 μg/마우스에서 TA99(Noor Momin 및 Dane Wittrup로부터의 선물, Massachusetts Institute of Technology)의 처리를 지시된 바와 같이 수일 후에 추가하였다. 종양 부피가 2,000 mm3에 도달한 경우, 마우스를 희생시켰다.
유세포분석: 절개된 종양을 분쇄하며, 효소적으로 분해하고(Miltenyi Biotec), 40-μm 필터에 통과시켰다. 비장 및 종양-드레이닝(draining) 림프절로부터의 세포를, 1-mL 주사기 플런저의 뒷면을 사용하여 40-μm 세포 스트레이너(strainer)를 통해 PBS 내로 분산시켰다. 모든 세포 현탁액을 PBS로 1회 세척하고, 세포 펠렛을 형광단-접합 항체를 함유하는 2% 불활성화된 소 태아 혈청에 재현탁시켰다. 세포를 4℃에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 고정하며, 투과시키고, BioLegend FoxP3 염색 키트를 사용하여 염색하였다. 시료를 BD Fortessa 유세포분석기에서 분석하였다. 흑색종 실험에 사용된 항체(BioLegend)는, CD45-BV711(클론 30-F11), CD8-BV650(53-6.7), CD4-BV421(GK1.5), TCRβ-BV510(H57-597), CD25-AF488(PC61), FoxP3-PE(MF-14)였다. 결장 암종 실험에 사용된 항체(eBioscience)는, CD45-BV510(30-F11), CD3-BV711(17A2), CD49b-FITC(DX5), CD4-BV605(GK1.5), CD8-PECy7(53-6.7), Foxp3-APC(FJK-16s)였다. 고정형 생존력 염료 eFluor 780(eBioscience)을 사용하여 사멸된 세포를 배제하였다.
항-네오루킨-2/15 폴리클로날 항체의 생성: 마우스에게 PBS와 완전 프로인트 아쥬반트의 1:1 에멀젼 200 μL 중 500 μg의 K.O. 네오루킨을 i.p. 주사하였다. 마우스를 제7일 및 제15일에 PBS와 불완전 프로인트 아쥬반트의 1:1 에멀젼 200 μL 중 500 μg의 K.O. 네오루킨으로 부스팅하였다. 제20일에, 혈청을 수합하고, 네오루킨-2/15의 인식을 ELISA에 의해 확인하였다.
효소-연결 면역흡착 검정법(ELISA): 고-결합 96-웰 플레이트(Corning)를 4℃에서 밤새 카르보네이트 완충제 중 100 ng/mL의 네오루킨-2/15, mIL-2(Peprotech), hIL-2(Peprotech), 또는 오브알부민(Sigma-Aldrich)로 코팅시켰다. 표적 단백질에의 항체 결합을, 75 ng/mL에서 HRP-접합 양 항-마우스 IgG(GE Healthcare)를 사용하여 검출하였다. 플레이트를 테트라메틸벤지딘 및 HCl로 발색시켰다. 흡광도를 EnVision Multimode 플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm에서 측정하였다.
T 세포 증식 검정법: 세포를 EasySep T 세포 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 마우스 비장으로부터 단리하였다. 이들 세포를 96-웰 배양 플레이트 내의 RPMI에 10,000개 세포/웰의 밀도로 평판배양하였다. 배지에 정기적인 또는 열처리된 네오루킨-2/15, rmIL-2, 또는 슈퍼-2를 보충하였다. 37℃에서 5일간의 인큐베이션 후, 세포 생존율 및 증식을 CellTiter-Glo Luminescent 세포 생존력 검정법(Promega)에 의해 측정하였다.
통계학적 및 검출력 분석: 생체내 뮤린 기도 염증 실험: MIKEL. 생체내 뮤린 결장암 실험: CARLOS. 생체내 뮤린 흑색종 실험: 종양-소유 마우스의 생존율의 비교를 로그-순위(만텔-콕스) 검정을 사용하여 수행하였다. 종양-소유 마우스에서 체중 손실의 비교를 양측 t 검정(two-tailed t test)을 사용하여 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다. 최소 그룹 크기는 예상된 큰 효과 크기(Cohen's d = 1.75)에 대해 G*파워를 사용하여 결정하였다.
네오루킨-2/15에의 마우스 혈청 알부민(MSA) 융합의 생물층 간섭계 분석. 연장된 반감기를 위한 MSA에의 네오루킨-2/15의 유전적 융합은 뮤린 IL-2R베타 및 IL-2R감마(33.5 ± 0.2 nM)(데이터는 제시되지 않음)에 대한 사이토카인 모방체의 온전한 결합 친화도를 보존한다. 이 연구에 이용된 작제물은 하기와 같았다:
선택적:(괄호 안은 hIsTag TEV 절단 부위임)
마우스 혈청 알부민 (이탤릭체)
링커
Neo2/15 (볼드 폰트)
Figure pct00101
비오틴-mIL2감마를 스트렙타비딘 바이오센서 상에 고정하고, MSA-Neo2 농도를 포화 농도의 mIL2베타의 존재 하에 729 nM로부터 1 nM까지 적정하였다. 생물층 간섭계를 상기와 같이 수행하였다: 결합 데이터를 Octet RED96(ForteBio, Menlo Park, CA)에서 수집하고, 1:1 결합 모델을 사용하는 기기의 통합 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 비오틴화된 표적 수용체, 인간 또는 뮤린 IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ, 또는 인간 IL-4Rα를 결합 완충제(10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, 0.5% 무지분유) 중 1 μg/ml에서 300초 동안 스트렙타비딘 코팅된 바이오센서(SA ForteBio)로 작용화시켰다. 분석물 단백질을 농축된 스탁으로부터 결합 완충제로 희석시켰다. 결합 완충제 단독에서의 기준선 측정 후, 100 nM의 디자인된 단백질(결합)을 함유하는 웰에 바이오센서를 침지시킨 다음, 상기 센서를 다시 기준선 웰(해리)에 침지시킴으로써 결합 동역학을 모니터링하였다.
CAR-T 세포 생체내 실험: 시험관내 T 세포 증식 검정법이다. 1차 인간 T 세포를 건강한 공여자로부터 수득하였다. Ficoll-Hypaque(Sigma)에 걸친 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 단리하였다. EasySepTM CD8 또는 CD4 음성 단리 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여 T 세포를 단리하였다. T 세포를 자극시키기 위해, T 세포를 해동시키고, 50 IU/ml(3.1 ng/ml)의 IL2가 보충된 배지에서 1:1 비의 항-CD3/CD28 Dynabeads(Gibco)와 함께 인큐베이션하였다. 4일의 인큐베이션 후 비드를 제거하였다. 자극된 또는 새로 해동되고 비자극된 T 세포를 96 웰 포맷에서 각각 30000개 세포/웰 또는 50000개 세포/웰로 평판배양하고, 지시된 농도의 IL2 또는 네오루킨-2/15에서 3중으로 배양하였다. 3일 후, CellTiter-Glo 2.0.(Promega)을 사용하여 증식을 측정하였다.
생체내 RAJI 실험: 6주령 내지 8주령의 NSG 마우스를 Jackson Laboratory로부터 입수하였다. ffluc/eGFP가 형질도입된 0.5*10^6개 RAJI 종양 세포를 꼬리 정맥을 통해 NSG 마우스 내로 주사하였다. 종양 주사 후 7일째에, (Liu et al, 2016)에 기재된 바와 같이 제조된 렌티바이러스 형질도입된 항-CD19 CAR T 세포(0.4*10^6 CD4, 0.4*10^6 CD8)를 마우스 내로 i.v. 주입하였다. 20 μg/마우스에서 hIL2 또는 네오루킨-2/15를 종양 주사 후 제8일 및 제16일로부터 i.p. 제공하였다.
PEG화된 폴리펩타이드의 제조: 단일 또는 이중 시스테인 돌연변이를 갖는 Neo-2/15 스탁(stock)을 포스페이트 완충제, pH 7.0로 투석시키고, 1.0 mg/ml 내지 2.0 mg/ml로 조정하였다. TCEP를 단백질에 대해 10:1 몰비로 첨가하고, RT에서 10분 동안 인큐베이션하여 이황화를 환원시켰다. 말레이미드-변형된 PEG40k(PEG40k-MA) 또는 PEG30k(PEG30k-MA) 분말을 10:1 PEG:시스테인의 몰비로 환원된 단백질 용액에 직접적으로 첨가하고, 2시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. SDS-PAGE를 위한 분취물을 반응 혼합물로부터 직접적으로 채취하였다. 이들 데이터는, 예상된 화학양론에서 PEG40k-MA 또는 PEG30k-MA와 Neo-2/15 시스테인 돌연변이체 사이의 공유 연결의 신속하며 자발적이고 근-정량적(near-quantitative) 형성을 실증한다.
Neo-2/15 및 PEG화 Neo-2/15-E62C(Neo-2/15-PEG)에 의한 치료는 다수의 염증 마커의 수준에서 변화를 실증한다: 2 마리의 비-인간 영장류(NHP), 그룹 당 1 마리의 수컷 및 1 마리의 암컷은 비히클(그룹 1), Neo-2/15(w/o PEG)(그룹 2 내지 4) 또는 Neo-2/15 PEG(그룹 5 내지 7; E62C 및 PEG40K의 단일 시스테인 돌연변이)에 의한 치료에 배정되었다. 비히클 또는 Neo-2/15(w/o PEG)로 치료받는 동물은 연구일 제1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7(1주일 동인 매일 1회)에 0의 용량 수준(비히클) 또는 0.07, 0.21 또는 0.14 mg/kg/일 Neo 2/15(w/o PEG)의 용량 조정된 값(각각 그룹 2, 3 및 4)에서 정맥내(IV) 볼루스에 의해 투약되었다. Neo-2/15 PEG에 의해 치료받는 동물은 연구일 제1일 및 제7일에 0.05, 0.15 또는 0.10 mg/kg/일 Neo-2/15PEG(각각 그룹 5, 6 및 7)의 용량 수준에서 IV 볼루스에 의해 투약받았다. 투약 후 제1일 및 제7일에 0, 4, 8 및 24시간의 시점에서 사이토카인 시료를 채취하였다. 사이토카인 혈청 시료를 제조하여 <-70℃에서 동결시키고, 시료가 Luminex 멀티플렉스 면역검정법 시스템을 통해 분석되는 곳으로 운송하였다. IL-15 및 IL-10을 포함하는 몇몇 사이토카인은, PEG화된 분자에 대한 더욱 지속된 약력학적 효과와 일관되게, 사이토카인 생성의 시간 경로에서 두드러진 차이를 실증하였다.
표적화된 Neo-2/15 융합은 이의 IL-2R 결합 친화도를 보유하였고, 항-종양 효과를 실증하였다. 선택된 표적화 도메인을 펩타이드 링커를 통해 Neo-2/15의 N-말단 또는 C-말단에 융합시키고, 인간 및 마우스 IL-2R에 대한 이의 결합 친화도를 생물층 간섭계에 의해 특징화하였다. 결과는, N 또는 C 말단에서 Neo-2/15에의 융합이 IL-2R을 결합하는 능력을 방해하지 않았음을 확인하였다. 후속적인 시험관내 유세포분석 연구는, 융합 단백질이 세포 표면에의 표적 수용체의 결합을 할 수 있음을 확인하였다. 표적화된 작제물의 효능을 생체내 마우스 실험에서 평가하였으며, 이 실험에서 종양 세포 또는 면역 세포로의 표적화된 Neo-2/15 모이어티는 비-표적화된 대조군을 능가하여 유익한 항-종양 효과를 갖는 것으로 실증되었다(데이터는 제시되지 않음).
시험된 융합은, (i) 서열번호100의 링커를 통한 Neo 2/15의 C 말단에의 항-CD47 나노바디의 융합; (b) 서열번호100의 링커를 통한 Neo 2/15의 N 말단에의 항-CD47 나노바디의 융합; (c) 서열번호100의 링커를 통한 Neo 2/15의 C 말단에의 항-CTLA4 나노바디의 융합; (d) 서열번호100의 링커를 통한 Neo 2/15의 N 말단에의 항-CTLA4 나노바디의 융합; (e) 서열번호100의 링커를 통한 Neo 2/15의 C 말단에의 항-PDL-1 나노바디의 융합; 및 (f) 서열번호100의 링커를 통한 Neo 2/15의 N 말단에의 항-PDL-1 나노바디의 융합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
Neo -2/15에의 알부민의 융합은 IL-2R 결합 친화도를 유지시켰다. 마우스 혈청 알부민(MSA)을 펩타이드 링커를 통해 Neo 2/15의 N 말단에 융합시키고, 시험관내에서 시험하여, 마우스 IL-2R에의 이의 결합 친화도를 생물층 간섭계에 의해 특징화하였다. 비오틴-mIL2감마를 스트렙타비딘 바이오센서 상에 고정하고, MSA-Neo2 농도를 포화 농도의 mIL2베타의 존재 하에 729 nM로부터 1 nM까지 적정하였다. 융합은 IL-2R 결합 역량을 유지시켰다(데이터는 제시되지 않음).
PEG화 및 비-PEG화 Neo-2/15는 비-인간 영장류(NHP)에서 유의미한 항-약물 항체(ADA) 반응을 유도하지 않는다. ADA를 유도하는 PEG화 및 비-PEG화 Neo-2/15(PEG화 Neo-2/15: E62C 및 PEG40K의 단일 시스테인 돌연변이)의 잠재력을 비-인간 영장류에서 시험하였다. 동물에게 1주 동안 화합물을 정맥내 투여하였다: 제1일 및 제7일에 PEG화 Neo-2/15; 제1일 내지 제7일에 야생형 Neo-2/15. 이후 다양한 시점에서 혈액을 채혈하고, 투여된 화합물에 특이적인 항체의 존재에 대해 분석하였다. 각각의 용량 그룹은 1 마리의 수컷 마카크(macaque) 및 1 마리의 암컷 마카크로 구성되었다. 비-PEG화 Neo-2/15를 7일 연속일 동안 0.1 m/kg, 0.2 mg/kg, 또는 0.3 mg/kg에서 매일 iv 볼루스 주사를 통해 투여하였다. PEG화 Neo-2/15를 제1일 및 제7일에 0.015 mg/kg, 0.050 mg/kg, 및 0.10 mg/kg에서 iv 볼루스 주사를 통해 투여하였다. 동등한 부피의 식염수를 7일 연속일 동안 비히클 대조군에게 매일 투여하였다. 대략 750 ul의 혈액을 요골측 피부 정맥(cephalic vein) 또는 복재 정맥(saphenous vein)을 통해 연구일 제1일(투약-전), 제22일, 제29일 및 제43일에서 ADA 분석을 위해 각각의 동물로부터 채혈하였다. 습식 얼음 상에서 혈청 분리기 튜브를 사용하여 혈액으로부터 혈청을 추출하고, 후속적으로 분석 시까지 -80℃에 저장하였다. 비히클 또는 PEG화 Neo-2/15를 받은 모든 시노몰구스 마카크는 제22일, 제29일 및 제43일에 ADA에 대해 음성으로 시험되었고, 이는 PEG화 Neo-2/15가 심지어 반복 투약 후에도, 마카크 면역계에 대해 전적으로 외래인 컴퓨터-디자인 단백질임에도 불구하고, 검출 가능한 면역 반응을 유도하지 않았다. 비히클 대조군을 받는 2 마리(1 마리의 수컷; 1 마리의 암컷) 마카크 둘 다, 제1일, 제15일, 제22일 및 제28일에 야생형 Neo-2/15에 대해 ADA에 대해 음성으로 시험되었다. 비-PEG화 Neo-2/15가 시험되는 그룹에서 모든 동물(3 마리의 수컷; 2 마리의 암컷)은 제1일에 ADA(투약-전)에 대해 음석으로 시험되었다. 이들 중에서, 5 마리 중 3 마리(60%)는 제22일, 제29일 및 제43일에 ANDA에 대해 음성으로 남아 있었다. 후속적으로, 잔여 2 마리의 동물을 제22일, 제29일 및 제43일에 ANDA에 대해 양성으로 남아 있었다. 1 마리의 대상체는 제22일 및 제29일에 양성으로 시험되었으나, 제43일만큼 음성으로 되돌아갔다. 해당 대상체에 대해, ADA 반응은 낮고 일시적이었으며, 이는 미미한 임상적 유의성을 시사한다. 또 다른 대상체는 제22일, 제29일 및 제43일 상에서 양성으로 시험되었다. 해당 대상체에 대해, 측정된 ADA 농도는 100 ng/ml 이하이므로 불분명한 임상적 관련성을 가졌다.
데이터 표
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Figure pct00103
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네오루킨-2/15-H8Y-K33E: H1->H3->H2'->H4
PKKKIQLYAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEELEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS (서열번호 94)
IL2 수용체에 대한 네오루킨-2/15-H8Y-K33E의 결합을 생물층 간섭계에 의해 측정하였으며, IL2-R베타에 대해 네오루킨-2보다 더 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌고, 둘 다 IL2R베타 단독에 대해 시험된 경우 및 IL2R베타-감마 복합체에 대해 시험된 경우였다. 이러한 증가된 친화도는 대체로, IL2-R베타로부터의 향상된 오프율(off-rate)에 기인하였다.
Figure pct00113
부록 A. 모방체 세대-1의 서열 디자인을 위한 RosettaScripts XML 프로토콜.
Figure pct00114
Figure pct00115
부록 B. G1_Neo2_40_1F (즉, 세대-2)의 서열 재디자인을 위한 RosettaScripts XML 프로토콜.
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
부록 C. 새로운 모방체 세대-2 (즉, 주형으로서 G1_Neo2_40_1F를 기초한 모방체)의 서열 디자인을 위한 RosettaScripts XML 프로토콜.
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
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Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
SEQUENCE LISTING <110> University of Washington Silva Manzano, Daniel A. Yu, Shawn Ulge, Umut Baker, David Garcia, Kenan C. Spangler, Jamie Walkey, Carl Jude, Kevin Rubio, Alfredo Q. <120> DE NOVO DESIGN OF POTENT AND SELECTIVE INTERLEUKIN MIMETICS <130> IPA201495-US <150> US 62/689,769 <151> 2018-06-25 <150> US 62/768,733 <151> 2018-11-16 <160> 262 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala Leu 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Ile Thr Ile Leu Gln Ser Trp Ile Phe 1 5 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile Ala 1 5 10 15 Arg Leu Phe Glu Ser Gly 20 <210> 6 <211> 21 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<223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 11 Ser Thr Lys Lys Trp Gln Leu Gln Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Trp 1 5 10 15 Gln Met Ala Leu Asn Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asn Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Ala Ala Gln Ser Trp Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Asp Ile Arg Arg Asn Ser Asp Gln Ala Arg Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ala Gln 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Ala Arg 85 <210> 12 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 12 Ser Thr Lys Lys Trp Gln Leu Gln Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Trp 1 5 10 15 Gln Met Ala Leu Asn Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asn Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Ala Ala Gln Ser Cys Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Asp Ile Arg Arg Asn Ser Asp Gln Ala Arg Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ala Gln 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Ala Arg 85 <210> 13 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 13 Ser Thr Lys Lys Trp Gln Leu Gln Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Trp 1 5 10 15 Gln Met Ala Leu Asn Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asn Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Ala Ala Gln Ser Trp Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Asp Ile Arg Arg Asn Ser Asp Gln Ala Arg Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ala Gln 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Ala Cys 85 <210> 14 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 14 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu His Phe Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ile Leu Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Asp Ala Gln Ser Trp Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Glu Leu Ala Arg Asn Leu Glu Lys Val Arg Asp Glu 50 55 60 Ala Leu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Val Ser Asn Ala Lys 65 70 75 80 Val Ile Ala Leu Glu Leu Lys 85 <210> 15 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 15 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu His Phe Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ile Leu Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Leu Asn Arg 20 25 30 Cys Ile Thr Asp Ala Gln Ser Trp Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Glu Cys Ala Arg Asn Leu Glu Lys Val Arg Asp Glu 50 55 60 Ala Leu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Val Ser Asn Ala Lys 65 70 75 80 Val Ile Ala Leu Glu Leu Lys 85 <210> 16 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 16 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu His Phe Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ile Leu Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Asp Ala Gln Ser Cys Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Glu Leu Ala Arg Asn Leu Glu Lys Val Arg Asp Glu 50 55 60 Ala Leu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Val Ser Asn Ala Lys 65 70 75 80 Val Ile Ala Leu Glu Leu Lys 85 <210> 17 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 17 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu His Phe Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ile Leu Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Asp Ala Gln Ser Trp Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Glu Leu Cys Arg Asn Leu Glu Lys Val Arg Asp Glu 50 55 60 Ala Leu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 19 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Gln Met Met Leu Asn Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Cys Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Gly Ala Lys Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Arg Gln Glu 50 55 60 Ala Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 20 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 20 Ser Thr Lys Lys Ile Gln Leu Gln Leu Glu His Ala Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ala Leu Asn Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Leu Asn Arg 20 25 30 Met Ile Thr Trp Leu Gln Ser Trp Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Asn Ala Gln Glu Met Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Arg Lys Glu 50 55 60 Met Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Ile 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ser 85 <210> 21 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 21 Ser Thr Lys Lys Ile Gln Leu Gln Leu Glu His Ala Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ala Leu Asn Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Leu Asn Arg 20 25 30 Met Ile Thr Trp Leu Gln Ser Cys Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Asn Ala Gln Glu Met Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Arg Lys Glu 50 55 60 Met Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Ile 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ser 85 <210> 22 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 22 Ser Thr Lys Lys Ile Gln Leu Gln Leu Glu His Ala Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ala Leu Asn Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Leu Asn Arg 20 25 30 Met Ile Thr Trp Leu Gln Ser Trp Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Asp Asn Ala Gln Glu Met Cys Lys Glu Ala Glu Lys Ile Arg Lys Glu 50 55 60 Met Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Cys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ser 85 <210> 23 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 23 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Phe Met Met Leu Asn Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 35 40 45 Asp Gly Ala Lys Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Tyr Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Asp Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 24 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 24 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 His Met Met Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Tyr Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Glu Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 25 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(37) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absentt <400> 25 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Phe Met Met Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Lys Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Phe Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Glu Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 26 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 26 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Leu Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 27 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 27 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 His Met Met Leu Asn Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Leu Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Asp Asp Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 28 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 28 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 His Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 29 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 29 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Tyr Met Met Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Leu Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Asp Asp Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 30 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 30 Ser Thr Lys Lys Thr His Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Tyr Met Met Leu Asn Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Lys Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Phe Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Asp Asp Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 31 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 31 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Tyr Met Met Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Ile Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Tyr Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 32 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 32 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Met Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Phe Met Met Leu Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Asp Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Leu Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Asp Asp Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 33 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 33 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ile Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Asp Met Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Ser Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Gln Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 His Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Glu Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 34 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 34 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Leu Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu His Met Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Ser Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 His Glu Lys Arg Gly Arg Asp Val Glu Asp Asp Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 35 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 35 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ile Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Asn Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Ser Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Asp Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Gln Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 His Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 36 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 36 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Leu Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu His Met Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Asp Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Asp Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 His Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 37 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 37 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ile Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu His Met Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Ser Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln His Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 His Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Glu Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 38 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 38 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Leu Ile Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu His Met Lys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Asn Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Asp Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 His Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Leu Ala 85 <210> 39 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 39 Ser Thr Glu Lys Thr Gln Leu Ala Ala Glu His Ala Leu Arg Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Lys His Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Ala Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Gln Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Gln Gln Glu 50 55 60 His Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu His Leu Ala 85 <210> 40 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 40 Ser Thr Lys Asn Thr Gln Leu Ala Ala Glu Asp Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Arg Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Ala Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Gln Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Gln Gln Glu 50 55 60 His Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Gln Leu Ala 85 <210> 41 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 41 Ser Thr Glu Lys Thr Gln His Ala Ala Glu Asp Ala Leu Arg Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Arg Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Leu Ala Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Gln Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Asp Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Glu Leu Gln Gln Glu 50 55 60 His Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Gln Leu Ala 85 <210> 42 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(30) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(49) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(72) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 42 Thr Gln Lys Lys Gln Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Arg 20 25 30 Met Ile Thr Ile Ala Gln Ser Trp Ile Phe Thr Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Glu Ala Lys Glu Met Ile Lys Met Ala Glu Gln Ala Glu Glu Glu 50 55 60 Ala Arg Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Tyr Val Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Lys Glu Ile Ala 85 <210> 43 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 43 Thr Thr Lys Lys Tyr Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Met Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Glu Glu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Phe Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Lys Glu Leu Ser 85 <210> 44 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 44 Thr Thr Lys Lys Ile Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Leu Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Arg Ala Arg Glu Leu Ala Lys Leu Leu Glu Glu Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Met Ile 65 70 75 80 Val Ile Ile Arg Glu Leu Ala 85 <210> 45 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 45 Thr Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Ala Glu His Val Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Met Asn Arg 20 25 30 Leu Ile Thr Ile Val Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Glu Glu Met Ala Lys Trp Val Glu Glu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Phe Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ala Ser Asn Val Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Lys Glu Leu Ser 85 <210> 46 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 46 Thr Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Leu Ile Glu His Leu Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Val Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Leu Ala Glu Glu Met Glu Lys Leu Met Gln Glu Ile Glu Glu Glu 50 55 60 Leu Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Met Ser Asn Met Arg 65 70 75 80 Val Ile Ile Lys Glu Leu Ser 85 <210> 47 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 47 Thr Lys Lys Lys Leu Gln Leu Leu Val Glu His Leu Leu Leu Asp Met 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Leu Ile Thr Glu Leu Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Glu Met Trp Lys Ile Met Glu Glu Ile Glu Lys Glu 50 55 60 Leu Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Met Ser Asn Ala Lys 65 70 75 80 Val Ile Ile Lys Glu Leu Ser 85 <210> 48 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 48 Thr Ser Lys Lys Gln Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Val Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Trp Leu Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Glu Glu Met Arg Lys Leu Ala Glu Gln Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Val Ile Ala Lys Glu Leu Ser 85 <210> 49 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 49 Thr Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Leu Ile Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Val Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Ile Asn Arg 20 25 30 Leu Ile Thr Trp Leu Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Leu Ala Glu Glu Met Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Met Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Met Ser Asn Met Arg 65 70 75 80 Val Ile Val Lys Glu Leu Ser 85 <210> 50 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 50 Thr Lys Lys Lys Trp Gln Leu Leu Ile Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Leu Ile Thr Trp Leu Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Leu Ala Glu Glu Met Lys Lys Met Met Asp Glu Ile Glu Asp Glu 50 55 60 Leu Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Met Ser Asn Ala Lys 65 70 75 80 Val Ile Ile Lys Glu Leu Ser 85 <210> 51 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 51 Thr Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Glu Glu Leu Ser Lys Leu Val Glu Glu Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Asp Glu Leu Ser 85 <210> 52 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 52 Thr Glu Lys Lys Leu Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Leu Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Glu Glu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Ala Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Lys Glu Leu Ser 85 <210> 53 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 53 Thr Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Leu Met Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Val Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Leu Ile Thr Ile Ile Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Glu Met Ala Lys Met Leu Lys Glu Ile Glu Asp Glu 50 55 60 Leu Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Met Ser Asn Met Ile 65 70 75 80 Val Ile Met Lys Glu Leu Ser 85 <210> 54 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 54 Thr Thr Lys Lys Ile Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Met Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Gln Glu Leu Ala Lys Leu Val Glu Glu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Phe Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Glu Glu Leu Ser 85 <210> 55 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 55 Thr Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Arg Glu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Phe Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Val Ile Leu Arg Glu Leu Ser 85 <210> 56 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 56 Thr Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Arg Ala Arg Glu Leu Ala Lys Leu Val Glu Glu Ile Arg Asp Glu 50 55 60 Met Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Glu Glu Leu Ala 85 <210> 57 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 57 Thr Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Leu Ile Glu His Val Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Met Asn Arg 20 25 30 Leu Ile Thr Ile Leu Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Glu Met Ala Lys Leu Leu Lys Glu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Phe Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ile Ser Asn Ala Ile 65 70 75 80 Val Ile Leu Lys Glu Leu Ser 85 <210> 58 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 58 Thr Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Glu Glu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Phe Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Lys Glu Leu Ser 85 <210> 59 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 59 Thr Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Arg Glu Leu Ala Lys Leu Val Glu Glu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Phe Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Glu Glu Leu Ala 85 <210> 60 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> vnt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 60 Thr Lys Lys Lys Leu Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Glu Glu Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Leu Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Lys Glu Leu Ser 85 <210> 61 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 61 Thr Thr Lys Lys Tyr Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Arg Glu Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Val Ile Leu Arg Glu Leu Ser 85 <210> 62 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 62 Thr Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Arg Glu Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Val Ile Leu Arg Glu Leu Ser 85 <210> 63 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 63 Thr Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Leu Ile Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Leu Ile Thr Trp Leu Gln Ser Trp Ile Phe Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Glu Trp Ala Lys Ile Leu Lys Glu Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Leu Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Met Ser Asn Ala Ile 65 70 75 80 Val Ile Met Lys Glu Leu Ser 85 <210> 64 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 64 Thr Asp Lys Lys Leu Gln Leu Leu Val Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Met Asn Arg 20 25 30 Leu Ile Thr Ile Ala Gln Ser Trp Ile Phe Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Leu Ala Arg Glu Met Ile Lys Leu Leu Glu Glu Thr Glu Asp Glu 50 55 60 Asn Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Ala Arg 65 70 75 80 Val Ile Ala Lys Glu Leu Glu 85 <210> 65 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 65 Thr Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Val Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Met Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Gln Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Glu Glu Leu Lys Glu Glu 50 55 60 Phe Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Lys 65 70 75 80 Val Ile Leu Lys Glu Leu Ser 85 <210> 66 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 66 Thr Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Leu Ile Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Thr Met Gln Ser Trp Ile Phe Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Glu Leu Glu Lys Leu Ala Lys Glu Ile Glu Asp Glu 50 55 60 Ala Arg Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Met Ser Asn Leu Arg 65 70 75 80 Val Ile Leu Lys Glu Leu Ser 85 <210> 67 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 67 Thr Lys Lys Lys Ala Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Trp Leu Gln Ser Ile Ile Phe Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Met Val Lys Glu Ala Val Lys Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asp Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Arg 65 70 75 80 Val Ile Leu Gln Glu Leu Ala 85 <210> 68 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 68 Thr Gln Lys Lys Asn Gln Leu Leu Ala Glu His Leu Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Val Leu Asn Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ala Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Trp Ala Gln Ser Trp Ile Phe Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asn Lys Ala Glu Glu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Glu Glu Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ile Ser Asn Met Lys 65 70 75 80 Val Ile Ala Glu Glu Met Ser 85 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(29) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(50) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(80) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 69 Glu Asp Tyr Tyr Ser Asn Leu Lys Val Ile Leu Glu Glu Leu Ala Arg 1 5 10 15 Glu Met Glu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Arg Gln 20 25 30 Trp Lys Lys Ile Val Glu Arg Ile Arg Gln Ile Arg Ser Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Asn Glu Ala Lys Glu Leu Leu Asn Arg Leu Ile Thr Tyr Ile 50 55 60 Gln Ser Gln Ile Phe Glu Ile Ser Glu Arg Ile Arg Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Glu Lys Lys Glu Glu Ser Trp Lys Lys Trp Gln Leu Leu Leu Glu His 85 90 95 Ala Leu Leu Asp Val Leu Met Leu Leu Asn Asp 100 105 <210> 70 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(56) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(82) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 70 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Leu Glu His Ile Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Thr Glu Ser 20 25 30 Lys Phe Glu Asp Tyr Ile Ser Asn Ala Glu Val Ile Ala Glu Glu Leu 35 40 45 Ala Lys Leu Met Glu Ser Xaa Xaa Leu Ser Asp Glu Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Lys Ile Lys Gln Trp Leu Arg Glu Val Trp Arg Ile Trp Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Trp Ser Thr Leu Glu Asp Lys Ala Arg Glu Leu Leu Asn Arg 85 90 95 Ile Ile Thr Thr Ile Gln Ser Gln Ile Phe Tyr 100 105 <210> 71 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(31) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(83) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 71 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Leu Glu His Ile Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Met Ile Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 20 25 30 Glu Met Glu Asp Tyr Trp Ser Asn Val Arg Val Ile Leu Arg Glu Leu 35 40 45 Ala Arg Leu Met Glu Glu Xaa Xaa Xaa Lys Glu Leu Ser Glu Leu Met 50 55 60 Glu Arg Met Arg Lys Ile Val Glu Lys Ile Arg Gln Ile Val Thr Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Leu Asp Thr Ala Arg Glu Trp Leu Asn Arg Leu Ile Thr 85 90 95 Trp Ile Gln Ser Leu Ile Phe Arg 100 <210> 72 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(83) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 72 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Leu Glu His Ile Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Thr Glu Ser 20 25 30 Glu Met Glu Asp Tyr Trp Ser Asn Val Arg Val Ile Leu Arg Glu Leu 35 40 45 Ala Arg Leu Met Glu Glu Xaa Xaa Xaa Lys Glu Leu Ser Glu Leu Met 50 55 60 Glu Arg Met Arg Lys Ile Val Glu Lys Ile Arg Gln Ile Val Thr Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Leu Asp Thr Ala Arg Glu Trp Leu Asn Arg Leu Ile Thr 85 90 95 Trp Ile Gln Ser Leu Ile Phe Arg 100 <210> 73 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(50) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(75) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 73 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Ala Glu His Leu Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ala Ser Asn 20 25 30 Ala Gln Val Ile Ala Asp Glu Phe Arg Glu Leu Ala Arg Glu Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Asp Glu Ala Lys Lys Ala Glu Lys Ile Ile Glu Ala Leu Glu 50 55 60 Arg Ala Arg Glu Trp Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Glu Lys Ala Lys 65 70 75 80 Glu Ala Leu Asn Arg Ala Ile Thr Ile Ala Gln Ser Trp Ile Phe Asn 85 90 95 <210> 74 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(83) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 74 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Asn Ile Glu Ser 20 25 30 Asp Trp Glu Asp Tyr Met Ser Asn Ile Glu Val Ile Ile Glu Glu Leu 35 40 45 Arg Lys Ile Met Glu Ser Xaa Xaa Xaa Ser Glu Lys Ala Lys Glu Trp 50 55 60 Lys Arg Met Lys Gln Trp Val Arg Arg Ile Leu Glu Ile Val Lys Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Leu Glu Glu Ala Lys Glu Trp Leu Asn Arg Leu Ile Thr 85 90 95 Ile Val Gln Ser Glu Ile Phe Glu 100 <210> 75 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(83) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 75 Trp Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asn Thr Glu Ser 20 25 30 Leu Met Glu Asp Tyr Met Ser Asn Ala Lys Val Ile Val Glu Glu Leu 35 40 45 Ala Arg Met Met Arg Ser Xaa Xaa Xaa Glu Asp Lys Ala Arg Glu Trp 50 55 60 Glu Glu Met Lys Lys Arg Ile Glu Glu Ile Arg Gln Ile Ile Gln Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Lys Glu Arg Ala Lys Glu Glu Leu Asn Arg Leu Ile Thr 85 90 95 Tyr Val Gln Ser Glu Ile Phe Arg 100 <210> 76 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 76 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asn Ala Glu Glu 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Val Glu Val Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Met Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Arg Ile Ile Thr Leu Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 77 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 77 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asn Ala Glu Glu 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Tyr Met Ser Asn Val Glu Val Ile Met Glu Glu Phe 35 40 45 Ala Arg Met Met Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Glu Glu Ala Glu Asn Ala 50 55 60 Glu Arg Ile Lys Lys Trp Val Arg Lys Ala Ser Ser Xaa Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Glu Glu Gln Arg Glu Met Met Asn Arg Ala Ile Thr Leu Met Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Glu 100 <210> 78 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(58) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(78) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 78 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Ala Glu His Leu Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Val Leu Asn Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Thr Glu Glu 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Tyr Ile Ser Asn Met Lys Val Ile Ile Lys Glu Met 35 40 45 Ile Glu Leu Met Arg Ser Leu Xaa Xaa Xaa Glu Glu Ala Glu Lys Trp 50 55 60 Lys Glu Ala Leu Lys Ala Val Glu Lys Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ser 65 70 75 80 Glu Thr Ala Arg Glu Leu Ala Asn Arg Ile Ile Thr Leu Ala Gln Ser 85 90 95 Ala Ile Phe Tyr 100 <210> 79 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(58) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(78) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 79 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Phe Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Ala Glu Glu 20 25 30 Lys Ile Glu Asp Tyr Ala Ser Asn Leu Arg Val Ile Ala Glu Glu Leu 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Asp Glu Ala Gln Lys Ala 50 55 60 Lys Asp Ile Lys Glu Leu Ala Glu Arg Ala Arg Ser Xaa Xaa Ser Ser 65 70 75 80 Glu Lys Arg Lys Glu Ala Met Asn Arg Ala Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Met Ile Phe Arg 100 <210> 80 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(58) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absentt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(78) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 80 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Asn Thr Glu Ser 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Tyr Ile Ser Asn Leu Lys Val Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Met Glu Ser Leu Xaa Xaa Xaa Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Glu Ala Met Arg Leu Ala Asp Lys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Glu 65 70 75 80 Glu Glu Lys Lys Glu Ala Met Asn Arg Val Ile Thr Trp Ala Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Asn 100 <210> 81 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(29) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(58) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 81 Pro Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Met Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Glu Glu 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Tyr Trp Ser Asn Leu Ile Val Ile Leu Arg Glu Ile 35 40 45 Ala Lys Leu Met Glu Ser Leu Xaa Xaa Xaa Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Glu Ala Ala Arg Trp Ala Glu Glu Ala Arg Thr Xaa Xaa Xaa Lys 65 70 75 80 Asp Gln Arg Arg Glu Leu Ala Asn Arg Ile Ile Thr Leu Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 82 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(78) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 82 Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Ala Glu His Leu Leu Leu Asp Ala Leu 1 5 10 15 Met Ile Leu Asn Ile Ile Glu Thr Asn Glu Gln Asn Ala Glu Ser Lys 20 25 30 Leu Glu Asp Tyr Ile Ser Asn Ala Lys Val Ile Leu Asp Glu Phe Arg 35 40 45 Glu Met Ala Arg Asp Leu Xaa Xaa Xaa Asp Glu Ala Lys Lys Ala Glu 50 55 60 Lys Met Lys Arg Trp Leu Glu Lys Met Arg Ser Xaa Xaa Xaa Ser Asp 65 70 75 80 Glu Arg Arg Glu Trp Ala Asn Arg Met Ile Thr Thr Ala Gln Ser Trp 85 90 95 Ile Phe Asn <210> 83 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 83 Thr Asn Lys Lys Ala Gln Leu His Ala Glu Phe Ala Leu His Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Trp Leu Gln Ser Ile Ile Phe Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Met Val Lys Glu Ala Val Lys Asp Ala Asp Glu Ile Glu Asp Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Arg 65 70 75 80 Leu Ile Leu Gln Glu Leu Ala 85 <210> 84 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 84 Thr Asn Lys Glu Ala Gln Leu His Ala Glu Phe Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Trp Leu Gln Ser Ile Ile Phe Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Met Val Lys Glu Ala Val Lys Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asp Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Val Asn Leu Arg 65 70 75 80 Leu Ile Leu Gln Glu Leu Ala 85 <210> 85 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 85 Thr Lys Lys Asp Ala Glu Leu Leu Ala Glu Phe Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu Asn Glu 20 25 30 Ile Ile Thr Trp Leu Gln Ser Ile Ile Phe Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Met Val Lys Glu Ala Val Lys Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asp Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Ser Asn Leu Arg 65 70 75 80 Leu Ile Leu Gln Glu Leu Ala 85 <210> 86 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(28) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(48) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(73) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 86 Thr Asn Lys Lys Ala Gln Leu His Ala Glu Phe Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu Asn Asp 20 25 30 Ile Ile Thr Trp Leu Gln Ser Ile Ile Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Met Val Lys Glu Ala Val Lys Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asp Glu 50 55 60 Met Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Val Val Asn Leu Arg 65 70 75 80 Tyr Ile Leu Gln Glu Leu Ala 85 <210> 87 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(24) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(50) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(80) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 87 Glu Asp Tyr Tyr Ser Asn Leu Lys Leu Ile Leu Glu Glu Leu Ala Arg 1 5 10 15 Glu Met Glu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Lys Ala Glu Glu Trp Arg Gln 20 25 30 Trp Lys Lys Ile Val Glu Arg Ile Arg Gln Ile Arg Ser Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Asn Glu Ala Lys Glu Leu Leu Asn Arg Leu Ile Thr Tyr Ile 50 55 60 Gln Ser Gln Ile Phe Glu Val Leu His Gly Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Glu Lys Lys Glu Glu Ser Trp Lys Lys Trp Asp Leu Leu Leu Glu His 85 90 95 Ala Leu Leu Asp Val Leu Met Leu Leu Asn Asp 100 105 <210> 88 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(24) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(50) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(80) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 88 Glu Asp Tyr Tyr Ser Asn Leu Lys Val Ile Leu Glu Glu Leu Ala Arg 1 5 10 15 Glu Met Glu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Lys Ala Glu Glu Trp Arg Gln 20 25 30 Trp Lys Lys Ile Val Glu Arg Ile Arg Gln Ile Arg Ser Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Asn Glu Ala Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Ile Thr Tyr Ile 50 55 60 Gln Ser Gln Ile Phe Glu Val Ile Glu Arg Glu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Glu Lys Lys Glu Glu Ser Trp Lys Lys Trp Glu Leu His Leu Glu His 85 90 95 Ala Leu Leu Asp Val Leu Met Leu Leu Asn Asp 100 105 <210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(24) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(50) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(80) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 89 Glu Asp Tyr Tyr Ser Asn Leu Lys Leu Ile Leu Glu Glu Leu Ala Arg 1 5 10 15 Glu Met Glu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Lys Ala Glu Glu Trp Arg Gln 20 25 30 Trp Lys Lys Ile Val Glu Arg Ile Arg Gln Ile Arg Ser Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Asn Glu Ala Lys Glu Leu Leu Asn Arg Leu Ile Thr Tyr Ile 50 55 60 Gln Ser Gln Ile Phe Glu Val Leu Glu Gly Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Glu Lys Lys Glu Glu Ser Trp Lys Lys Trp Glu Leu His Leu Glu His 85 90 95 Ala Leu Leu Asp Val Leu Met Leu Leu Asn Asp 100 105 <210> 90 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(32) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 90 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 91 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(32) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 91 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu Leu Ala Glu His Ala Leu Phe Asp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Tyr Ala Tyr Asn Ala Gly Val Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Asp Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Glu Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Asn Phe Ser 100 <210> 92 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(32) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 92 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Ile Thr Ala Glu Glu Ala Leu Lys Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ser Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Gln Leu Glu Arg Phe Ala Lys Arg Phe Glu Arg Asn Leu Trp Gly Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 93 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(32) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 93 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Ile Met Ala Glu Glu Ala Leu Lys Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ser Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Gln Leu Glu Arg Phe Ala Lys Arg Phe Glu Arg Asn Leu Trp Gly Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Ile Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Phe Phe Ser 100 <210> 94 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(32) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(56) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 94 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu Tyr Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Glu Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Xaa Xaa Gln Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 95 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 96 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 96 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 97 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 97 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 98 Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 99 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 99 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 100 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 101 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 101 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 102 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is Q, E, or S <400> 102 Gly Gly Gly Gly Xaa 1 5 <210> 103 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 103 Ser Thr Lys Lys Trp Gln Leu Gln Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Trp 1 5 10 15 Gln Met Ala Leu Asn Lys Ser Pro Glu Pro Asn Glu Asn Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Ala Ala Gln Ser Trp Ile Ser Thr Gly Lys Ile Asp Leu 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Asp Ile Arg Arg Asn Ser Asp Gln Ala Arg Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Lys Arg Gly Ile Asp Val Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ala Gln 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Ala Arg 85 <210> 104 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 104 Ser Thr Lys Lys Trp Gln Leu Gln Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Trp 1 5 10 15 Gln Met Ala Leu Asn Lys Ser Pro Glu Pro Asn Glu Asn Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Ala Ala Gln Ser Cys Ile Ser Thr Gly Lys Cys Asp Leu 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Asp Ile Arg Arg Asn Ser Asp Gln Ala Arg Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Lys Arg Gly Ile Asp Val Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ala Gln 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Ala Arg 85 <210> 105 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 105 Ser Thr Lys Lys Trp Gln Leu Gln Ala Glu His Ala Leu Leu Asp Trp 1 5 10 15 Gln Met Ala Leu Asn Lys Ser Pro Glu Pro Asn Glu Asn Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Ala Ala Gln Ser Trp Ile Ser Thr Gly Lys Ile Asp Cys 35 40 45 Asp Lys Ala Glu Asp Ile Arg Arg Asn Ser Asp Gln Ala Arg Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Lys Arg Gly Ile Asp Val Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ala Gln 65 70 75 80 Val Ile Leu Leu Glu Ala Cys 85 <210> 106 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 106 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu His Phe Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ile Leu Asn Glu Ser Pro Glu Pro Asn Glu Glu Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Asp Ala Gln Ser Trp Ile Ser Thr Gly Lys Ile Asp Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Glu Leu Ala Arg Asn Leu Glu Lys Val Arg Asp Glu 50 55 60 Ala Leu Lys Arg Gly Ile Asp Val Arg Asp Leu Val Ser Asn Ala Lys 65 70 75 80 Val Ile Ala Leu Glu Leu Lys 85 <210> 107 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 107 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu His Phe Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ile Leu Asn Glu Ser Pro Glu Pro Asn Glu Glu Leu Asn Arg 20 25 30 Cys Ile Thr Asp Ala Gln Ser Trp Ile Ser Thr Gly Lys Ile Asp Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Glu Cys Ala Arg Asn Leu Glu Lys Val Arg Asp Glu 50 55 60 Ala Leu Lys Arg Gly Ile Asp Val Arg Asp Leu Val Ser Asn Ala Lys 65 70 75 80 Val Ile Ala Leu Glu Leu Lys 85 <210> 108 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 108 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu His Phe Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ile Leu Asn Glu Ser Pro Glu Pro Asn Glu Glu Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Asp Ala Gln Ser Cys Ile Ser Thr Gly Lys Cys Asp Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Glu Leu Ala Arg Asn Leu Glu Lys Val Arg Asp Glu 50 55 60 Ala Leu Lys Arg Gly Ile Asp Val Arg Asp Leu Val Ser Asn Ala Lys 65 70 75 80 Val Ile Ala Leu Glu Leu Lys 85 <210> 109 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 109 Ser Thr Lys Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu His Phe Leu Leu Asp Val 1 5 10 15 Gln Met Ile Leu Asn Glu Ser Pro Glu Pro Asn Glu Glu Leu Asn Arg 20 25 30 Ala Ile Thr Asp Ala Gln Ser Trp Ile Ser Thr Gly Lys Ile Asp Leu 35 40 45 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absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 217 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Cys Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 218 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 218 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Cys Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 219 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 219 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Cys Gln Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 220 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 220 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Cys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 221 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 221 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Cys Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 222 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 222 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Cys Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 223 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 223 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Cys Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 224 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 224 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Cys Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 225 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 225 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Cys Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 226 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 226 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Cys Ala Ser Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 227 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 227 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Cys Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 228 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 228 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Cys Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 229 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 229 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Cys Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Cys Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 230 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 230 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Cys Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Cys Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 231 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 231 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Cys Gln Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Cys Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 232 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 232 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Cys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Cys Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 233 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 233 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Cys Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Cys Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 234 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 234 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Cys Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Cys Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 235 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 235 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Cys Met Lys Glu Trp Met Lys Cys Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 236 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 236 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Cys Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Cys Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 237 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 237 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Cys Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Cys Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 238 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 238 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Cys Gln Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Cys Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 239 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 239 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Cys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Cys Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 240 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 240 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Cys Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Cys Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 241 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 241 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Cys Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Cys Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 242 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 242 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Cys Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Cys Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 243 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 243 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Cys Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Cys Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 244 <211> 726 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(25) <223> Optional His tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(609) <223> Mouse serum albumin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (610)..(626) <223> Linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (627)..(726) <223> Neo2/15 <400> 244 Gly Ser Asp Gly Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Glu Ala His Lys Ser Glu Ile 20 25 30 Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val 35 40 45 Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His 50 55 60 Ala Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala 65 70 75 80 Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly 85 90 95 Asp Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu 100 105 110 Ala Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu 115 120 125 Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu 130 135 140 Ala Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met 145 150 155 160 Gly His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala 165 170 175 Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln 180 185 190 Cys Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp 195 200 205 Gly Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys 210 215 220 Cys Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala 225 230 235 240 Val Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile 245 250 255 Thr Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His 260 265 270 Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr 275 280 285 Met Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys 290 295 300 Asp Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His 305 310 315 320 Asp Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu 325 330 335 Asp Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu 340 345 350 Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val 355 360 365 Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys 370 375 380 Cys Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala 385 390 395 400 Glu Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn 405 410 415 Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile 420 425 430 Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu 435 440 445 Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr 450 455 460 Leu Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala 465 470 475 480 Ile Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu 485 490 495 His Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys 500 505 510 Phe Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys 515 520 525 Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys 530 535 540 Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His 545 550 555 560 Lys Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe 565 570 575 Ala Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys 580 585 590 Phe Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu 595 600 605 Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 610 615 620 Ser Gly Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr 625 630 635 640 Asp Ala Leu Met Ile Leu Asn Ile Val Lys Thr Asn Ser Pro Pro Ala 645 650 655 Glu Glu Lys Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu 660 665 670 Glu Ile Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Asp Gln Lys Asp Glu Ala Glu 675 680 685 Lys Ala Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Thr Ala 690 695 700 Ser Glu Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu 705 710 715 720 Gln Ser Trp Ile Phe Ser 725 <210> 245 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 245 Thr Asn Lys Lys Ala Gln Leu His Ala Glu Phe Ala Leu His Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Leu Leu Asn Leu Ser Ser Glu Ser Asn Glu Arg Leu Asn Arg 20 25 30 Ile Ile Thr Trp Leu Gln Ser Ile Ile Phe Tyr Gly Thr Tyr Asp Pro 35 40 45 Asp Met Val Lys Glu Ala Val Lys Asp Ala Asp Glu Ile Glu Asp Glu 50 55 60 Met Arg Lys Arg Gly Ile Asp Thr Glu Asp Tyr Val Ser Asn Leu Arg 65 70 75 80 Leu Ile Leu Gln Glu Leu Ala 85 <210> 246 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 246 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu Tyr Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Val Lys Thr Asn Ser Pro Pro Ala Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Asp Gln Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Thr Ala Ser Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 247 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(57) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(79) <223> Xaa, when present, can be any naturally occurring amino acid or is optionally absent <400> 247 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Arg Leu Phe Glu Ser Gly Xaa Xaa Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala 50 55 60 Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser 85 90 95 Trp Ile Phe Ser 100 <210> 248 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 248 Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Leu Met Ile Leu Asn Ile 20 <210> 249 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 249 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Gln Met Ile Leu Asn Gly 20 <210> 250 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 250 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 <210> 251 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 251 Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile Ala 1 5 10 15 Arg Leu Phe Glu Ser Gly 20 <210> 252 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 252 Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 1 5 10 15 Gly Ser Glu Thr Thr Phe 20 <210> 253 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 253 Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ser Asn Gly Asn Val 20 <210> 254 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 254 Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala Lys Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg 1 5 10 15 Ile Lys Thr <210> 255 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 255 Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 1 5 10 15 Leu Glu Glu <210> 256 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 256 Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val 1 5 10 15 Ile Ser Leu <210> 257 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 257 Glu Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln 1 5 10 15 Ser Trp Ile Phe Ser 20 <210> 258 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 258 Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln 1 5 10 15 Ser Ile Ile Ser Thr 20 <210> 259 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 259 Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln 1 5 10 15 Met Phe Ile Asn Thr 20 <210> 260 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 260 Cys Asn Ser Asn 1 <210> 261 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 261 Asn Phe Gln Cys 1 <210> 262 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> biotin acceptor peptide <400> 262 Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10

Claims (138)

  1. 도메인 X1, X2, X3 및 X4를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩타이드로서,
    (a) X1은 E HA LYD A L (서열번호1)과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
    (b) X2는 적어도 8개 아미노산 길이의 나선형-펩타이드이며;
    (c) X3은 Y AF N FE LI (서열번호2)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
    (d) X4는 I TIL Q S W IF(서열번호3)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
    여기서, X1, X2, X3 및 X4는 폴리펩타이드에서 임의의 순서로 존재할 수 있으며;
    아미노산 링커는 임의의 도메인 사이에 존재할 수 있고;
    상기 폴리펩타이드는 IL-2 수용체 β
    Figure pct00130
    c 헤테로이량체(IL-2Rβ
    Figure pct00131
    c), IL-4 수용체 α
    Figure pct00132
    c 헤테로이량체(IL-4Rα
    Figure pct00133
    c), 또는 IL-13 수용체 α 하위단위(IL-13Rα)에 결합하는, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) X1은 하기: 잔기 2에서의 H 및 잔기 5에서의 Y 중 하나 또는 둘 다를 포함하며; 그리고/또는
    (ii) X3은 하기: 잔기 1에서의 Y, 잔기 3에서의 F, 잔기 4에서의 N, 잔기 7에서의 L, 및 잔기 8에서의 I 중 1, 2, 3, 4, 또는 모든 5개를 포함하는, 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (iii) X4는 잔기 8에서의 I를 포함하는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    (i) X1은 잔기 2에서의 E 및 잔기 5에서의 K를 포함하고;
    (ii) X3은 잔기 1에서의 F, 잔기 3에서의 K, 잔기 4에서의 R, 잔기 7에서의 R, 및 잔기 8에서의 N을 포함하는, 폴리펩타이드.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    (iii) X4는 잔기 8에서의 F를 포함하는, 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQLHA E HA LYD A L MILNI(서열번호 4)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
    X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 L ED Y AF N FE LI LEE I ARLFESG(서열번호5)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고;
    X4는 펩타이드 EDEQEEMANAI I TIL Q S W IFS(서열번호6)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인, 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    (i) X1은 하기: 잔기 7에서의 L, 잔기 8에서의 H, 잔기 11에서의 H, 잔기 14에서의 Y; 잔기 18에서의 M 중 1, 2, 3, 4, 또는 모든 5개를 포함하며; 및/또는
    (ii) X3은 하기: 잔기 3에서의 D, 잔기 4에서의 Y, 잔기 6에서의 F, 잔기 7에서의 N, 잔기 10에서의 L, 잔기 11에서의 I, 잔기 13에서의 E, 또는 잔기 14에서의 E 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 모든 8개를 포함하는, 폴리펩타이드.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    (iii) X4는 잔기 19에서의 I인, 폴리펩타이드.
  9. 제6항에 있어서,
    X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQIMAEEALKDALSILNI(서열번호 8)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
    X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 LERFAKRFERNLWGIARLFESG(서열번호 9)와 적어도 37% 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고;
    X4는 이의 길이를 따라 펩타이드 EDEQEEMANAIITILQSWFFS(서열번호 10)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며.
    여기서,
    (i) X1은 잔기 7에서의 I, 잔기 8에서의 T 또는 M, 잔기 11에서의 E, 잔기 14에서의 K 및 잔기 18에서의 S를 포함하고;
    (ii) X3은 잔기 3에서의 R, 잔기 4에서의 F, 잔기 6에서의 K, 잔기 7에서의 R, 잔기 10에서의 R, 잔기 11에서의 N, 잔기 13에서의 W, 및 잔기 14에서의 G를 포함하는, 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서,
    (iii) X4는 잔기 19에서의 F를 포함하는, 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 펩타이드 도메인에 대한 아미노산 치환은 볼드 폰트로 표시된 AA 잔기에서는 발생하지 않는, 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 펩타이드 도메인에 대한 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환인, 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인은 X1-X2-X3-X4; X1-X3-X2-X4; X1-X4-X2-X3; X3-X2-X1-X4; X4-X3-X2-X1; X2-X3-X4-X1; 및 X2-X1-X4-X3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배열에서 N-말단으로부터 C-말단으로 배열되는, 폴리펩타이드.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호4에 대한 아미노산 잔기는,
    위치 01: A F I L M P Q R S W
    위치 02: A D E G V K
    위치 03: D E F W K
    위치 04: D E K N P R W
    위치 05: D E H I K L M S
    위치 06: A D E G L P S W Q
    위치 07: D E L Q Y I
    위치 08: A F H W Y M T
    위치 09: C F P A
    위치 10: C D E F K P
    위치 11: D F H E
    위치 12: A D E P S T V
    위치 13: H I L M P R V W
    위치 14: F R W Y K
    위치 15: D E N Y
    위치 16: A C L M S
    위치 17: F I L M P R
    위치 18: G M Q Y S
    위치 19: I L M P Q V
    위치 20: A K L M Q R S
    위치 21: G K N P R S W
    위치 22: D E I K M N W Y
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  15. 제14항에 있어서, 위치 7은 I이며, 위치 8은 M 또는 T이며, 위치 11은 E이며, 위치 14는 K이고, 위치 18은 S인, 폴리펩타이드.
  16. 제14항에 있어서, 하기: 위치 7은 I이며, 위치 8은 M 또는 T이며, 위치 11은 E이며, 위치 14는 K이고, 위치 18은 S라는 것 중 1, 2, 3, 4, 또는 5개는 참(true)이 아닌, 폴리펩타이드.
  17. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호5에 대한 아미노산 잔기는,
    위치 01: A L
    위치 02: D E G K M T
    위치 03: D E N Y R
    위치 04: C D G T Y F
    위치 05: A F H S V W Y
    위치 06: A F I M T V Y K
    위치 07: D K N S T R
    위치 08: A C G L M S V F
    위치 09: C H K L R S T V E
    위치 10: F I L M Y R
    위치 11: I L N T Y
    위치 12: F K L M S V
    위치 13: A D F G I N P Q S T E W
    위치 14: A E F G H S V
    위치 15: C I L M V W
    위치 16: A D G S T V
    위치 17: H K L N R
    위치 18: C D G I L Q R T W
    위치 19: D F M N W
    위치 20: A C E F G M S Y
    위치 21: D E G H L M R S T V W
    위치 22: A D G K N S Y
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  18. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호5에 대해 위치 17 또는 20에서 시스테인 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 위치 3은 R이며, 위치 4는 F이며, 위치 6은 K이며, 위치 7은 R이며, 위치 10은 R이며, 위치 11은 N이며, 위치 13은 W이고, 위치 14는 G인, 폴리펩타이드.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 하기: 위치 3은 R이며, 위치 4는 F이며, 위치 6은 K이며, 위치 7은 R이며, 위치 10은 R이며, 위치 11은 N이며, 위치 13은 W이고, 위치 14는 G라는 것 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 모든 8개는 참이 아닌, 폴리펩타이드.
  21. 제6항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호6에 대한 아미노산 잔기는,
    위치 01: D E G K V
    위치 02: D I M S
    위치 03: E G H K
    위치 04: E G I K Q R S
    위치 05: A D E G H S V
    위치 06: C D E G I M Q R T V
    위치 07: C E L M P R T
    위치 08: A F L M W
    위치 09: A G L N Q R T
    위치 10: A C D E F H I W
    위치 11: I M N S V W
    위치 12: I K L S V
    위치 13: C L M R S T
    위치 14: I L P T Y
    위치 15: F G I L M N V
    위치 16: H K Q R
    위치 17: C F K S W Y
    위치 18: K Q T W
    위치 19: C G N I
    위치 20: C F G L Y
    위치 21: A F G H S Y
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  22. 제6항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호6에 대해 위치 3에서 시스테인 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 위치 19는 I인, 폴리펩타이드.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 위치 19는 I가 아닌, 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, X2는 이의 길이를 따라 KDEAEKAKRMKE W MKRIKT(서열번호7)와 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인, 폴리펩타이드.
  26. 제25항에 있어서, 서열번호7에 대한 아미노산 잔기는,
    위치 01: A H L M R S V K
    위치 02: A D E Q R S T V W Y
    위치 03: C E G K L N Q R W
    위치 04: A F G N S T V Y
    위치 05: A E G I M R V C
    위치 06: C E K L N R V
    위치 07: A C E I L S T V W
    위치 08: H K L M S T W Y
    위치 09: A I L M Q S R
    위치 10: A I M S W Y
    위치 11: C I K L S V
    위치 12: C E K L P Q R T
    위치 13: A D H N W
    위치 14: A C G I L S T V M
    위치 15: A E G I K L M R V
    위치 16: G H L R S T V C
    위치 17: A I L V
    위치 18: A C D E G H I K M S
    위치 19: D E G L N V T
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 서열번호7에 대해 위치 1, 2, 5, 9, 12, 또는 16에서 시스테인 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 위치 11은 I인, 폴리펩타이드.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 위치 11은 I가 아닌, 폴리펩타이드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호11-94, 103-184, 190-243, 및 245-247로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호90 및 181로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호90의 아미노산 서열의 전장(full length)과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고, 하기 돌연변이:
    R50C;
    E53C;
    E62C;
    E69C;
    R73C; 및/또는
    E82C 중 1, 2개 이상이 존재하는, 폴리펩타이드.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호181의 전장과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고, 하기 돌연변이:
    D56C;
    K58C;
    D59C;
    R66C;
    T77C;
    E85C;
    R50C;
    E53C;
    E62C;
    E69C;
    R73C; 및/또는
    E82C 중 1, 2개 이상이 존재하는, 폴리펩타이드.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 190-243으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 전장과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나; 상기 폴리펩타이드는 서열번호195 및 222로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나; 상기 폴리펩타이드는 서열번호195의 아미노산 서열의 전장과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜("PEG")-함유 모이어티를 포함하는 안정화 화합물에 연결되는, 폴리펩타이드.
  36. 제35항에 있어서, 상기 비제한적으로 PEG-함유 모이어티를 포함하는 안정화 화합물은 상기 폴리펩타이드 내 시스테인 잔기에 연결되는, 폴리펩타이드.
  37. 제36항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 X2에 존재하는, 폴리펩타이드.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비제한적으로 PEG-함유 모이어티를 포함하는 안정화 화합물은 비제한적으로 서열번호90에 대해 아미노산 잔기 62에 존재하는 시스테인 잔기를 포함하여, 말레이미드기를 통해 시스테인 잔기에 연결되는, 폴리펩타이드.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호92, 93, 183, 및 184로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 25%, 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
  40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 7은 I이며, 위치 8은 T 또는 M이며, 위치 11은 E이며, 위치 14는 K이며, 위치 18은 S이며, 위치 33은 Q이며, 위치 36은 R이며, 위치 37은 F이며, 위치 39는 K이며, 위치 40은 R이며, 위치 43은 R이며, 위치 44는 N이며, 위치 46은 W이고, 위치 47은 G인, 폴리펩타이드.
  41. 제40항에 있어서, 위치 68은 I이고, 위치 98은 F인, 폴리펩타이드.
  42. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 하기: 위치 7은 I이며, 위치 8은 T 또는 M이며, 위치 11은 E이며, 위치 14는 K이며, 위치 18은 S이며, 위치 33은 Q이며, 위치 36은 R이며, 위치 37은 F이며, 위치 39는 K이며, 위치 40은 R이며, 위치 43은 R이며, 위치 44는 N이며, 위치 46은 W이고, 위치 47은 G라는 것 중 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 모든 14개가 참이 아닌, 폴리펩타이드.
  43. 제42항에 있어서, 하기: 위치 68은 I이고, 위치 98은 F라는 것 중 1 또는 2개 모두 참이 아닌, 폴리펩타이드.
  44. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호11-94, 103-184, 190-243, 및 245-247로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
  45. 제44항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호11-94, 103-184, 190-243, 및 245-247로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 IL-2 수용체 β
    Figure pct00134
    c 헤테로이량체(IL-2Rβ
    Figure pct00135
    c)에 결합하는, 폴리펩타이드.
  47. 제1항에 있어서,
    (a) X1은 E HA LYD A L (서열번호1)과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
    (b) X2는 적어도 8개 아미노산 길이의 나선형-펩타이드이며;
    (c) X3은 Y AF N FE LI (서열번호2)와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고;
    (d) X4는 I TIL Q S W IF(서열번호3)와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
    여기서, X1, X2, X3 및 X4는 폴리펩타이드에서 임의의 순서로 존재할 수 있으며;
    아미노산 링커는 임의의 도메인 사이에 존재할 수 있고;
    상기 폴리펩타이드는 IL-2 수용체 β
    Figure pct00136
    c 헤테로이량체(IL-2Rβ
    Figure pct00137
    c)에 결합하는, 폴리펩타이드.
  48. 제1항에 있어서,
    X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQLHA E HA LYD A L MILNI(서열번호 4)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며;
    X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 L ED Y AF N FE LI LEE I ARLFESG(서열번호5)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고;
    X4는 이의 길이를 따라 펩타이드 EDEQEEMANAI I TIL Q S W IFS(서열번호6)와 적어도 80% 동일한 아미노산을 포함하는 펩타이드인, 폴리펩타이드.
  49. 제48항에 있어서,
    X1은 이의 길이를 따라 펩타이드 PKKKIQLHA E HA LYD A L MILNI(서열번호 4)와 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함하는 펩타이드이며;
    X3은 이의 길이를 따라 펩타이드 L ED Y AF N FE LI LEE I ARLFESG(서열번호5)와 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함하는 펩타이드이고;
    X4는 이의 길이를 따라 펩타이드 EDEQEEMANAI I TIL Q S W IFS(서열번호6)와 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함하는 펩타이드인, 폴리펩타이드.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, X2는 이의 길이를 따라 KDEAEKAKRMKE W MKRIKT(서열번호7)와 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함하는 펩타이드인, 폴리펩타이드.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 X2 내의 시스테인 잔기에서 폴리에틸렌 글리콜("PEG")-함유 모이어티에 연결되는, 폴리펩타이드.
  52. 제51항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호195 및 222로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 PEG-함유 모이어티는 서열번호195에 대해 아미노산 잔기 62에서 시스테인 잔기에 연결되는, 폴리펩타이드.
  53. 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인은 X1-X3-X2-X4로 이루어진 군으로부터 선택되는 배열에서 N-말단으로부터 C-말단으로 배열되는, 폴리펩타이드.
  54. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제17항, 제20항 내지 제21항, 제24항 내지 제26항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제43항, 및 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 네이티브 IL-2의 3차원 구조의 백본 원자 또는 알파 탄소 원자 상에 중첩된 경우, 공통 잔기 백본 원자 또는 알파 탄소 원자의 제곱평균제곱근 편차(root mean square deviation)를 2.5 미만으로 갖는 구조적 좌표와 함께 3차원 구조를 갖는, 폴리펩타이드.
  55. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제17항, 제20항 내지 제21항, 제24항 내지 제26항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제44항, 및 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 표 E2의 구조적 좌표를 갖는 3차원 구조의 백본 원자 또는 알파 탄소 원자 상에 중첩된 경우, 공통 잔기 백본 원자 또는 알파 탄소 원자의 제곱평균제곱근 편차를 2.5 미만으로 갖는 구조적 좌표와 함께 3차원 구조를 갖는, 폴리펩타이드.
  56. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제17항, 제20항 내지 제21항, 제24항 내지 제26항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제45항, 및 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 IL-2 수용체 β
    Figure pct00138
    c와의 3원 복합체로 존재하는 경우, 상기 폴리펩타이드는 마우스 IL-2 수용체 β
    Figure pct00139
    c와의 3원 복합체로 존재하는 경우 네이티브 IL-2의 3차원 구조의 백본 원자 또는 알파 탄소 원자 상에 중첩된 경우, 공통 잔기 백본 원자 또는 알파 탄소 원자의 제곱평균제곱근 편차를 2.5 미만으로 갖는 구조적 좌표와 함께 3차원 구조를 갖는, 폴리펩타이드.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제곱평균제곱근 편차는 1.5 옹스트롬 미만인, 폴리펩타이드.
  58. 제57항에 있어서, 상기 제곱평균제곱근 편차는 1 옹스트롬 미만인, 폴리펩타이드.
  59. 제4항 내지 제6항, 제9항 내지 제15항, 제17항 내지 제19항, 제21항 내지 제23항, 제25항 내지 제28항, 제30항, 및 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 네이티브 IL-4의 3차원 구조의 백본 원자 또는 알파 탄소 원자 상에 중첩된 경우, 공통 잔기 백본 원자 또는 알파 탄소 원자의 제곱평균제곱근 편차를 2.5 미만으로 갖는 구조적 좌표와 함께 3차원 구조를 갖는, 폴리펩타이드.
  60. 제59항에 있어서, 상기 제곱평균제곱근 편차는 1.5 옹스트롬 미만인, 폴리펩타이드.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 제곱평균제곱근 편차는 1 옹스트롬 미만인, 폴리펩타이드.
  62. 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 3차원 구조는 컴퓨터 모델링을 사용하여 결정되는, 폴리펩타이드.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, X3 및 X4는 알파-나선형 도메인인, 폴리펩타이드.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 X1, X2, X3 및 X4의 아미노산 길이는 적어도 약 8개 아미노산 길이인, 폴리펩타이드.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 X1, X2, X3 및 X4의 아미노산 길이는 적어도 약 19개 아미노산 길이인, 폴리펩타이드.
  66. 1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 X1, X2, X3 및 X4의 아미노산 길이는 1000개 이하의 아미노산 길이, 500개 이하의 아미노산 길이, 400개 이하의 아미노산 길이, 300개 이하의 아미노산 길이, 200개 이하의 아미노산 길이, 100개 이하의 아미노산 길이, 또는 50개의 아미노산 길이인, 폴리펩타이드.
  67. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제55항, 및 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, X1은 인간 IL-2 수용체의 베타 및 감마 하위단위에 결합하는, 폴리펩타이드.
  68. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제555항, 및 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, X2는 인간 IL-2 수용체에 결합하지 않는, 폴리펩타이드.
  69. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제55항, 및 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, X3은 인간 IL-2 수용체의 베타 하위단위에 결합하는, 폴리펩타이드.
  70. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제55항, 및 제62항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, X4는 인간 IL-2 수용체의 감마 하위단위에 결합하는, 폴리펩타이드.
  71. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제55항, 및 제62항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 뮤린 IL-2 수용체의 알파 하위단위에 결합하지 않는, 폴리펩타이드.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합은 생물학적으로 적절한 농도에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같이 특이적인 결합인, 폴리펩타이드.
  73. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제55항, 및 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 200 nm 이하, 100 nm 이하, 50 nM 이하, 또는 25 nM 이하의 결합 친화도로 IL-2 수용체 β
    Figure pct00140
    c 헤테로이량체(IL-2Rβ
    Figure pct00141
    c)에 결합하는, 폴리펩타이드.
  74. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제55항, 및 제62항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 및 마우스 IL-2 수용체에 대한 폴리펩타이드의 친화도가 네이티브 IL-2와 대략 동일하거나 그보다 큰, 폴리펩타이드.
  75. 제4항 내지 제6항, 제9항 내지 제15항, 제17항 내지 제19항, 제21항 내지 제23항, 제25항 내지 제28항, 제30항, 제35항 내지 제37항, 제39항 내지 제41항, 및 제59항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 200 nm 이하, 100 nm 이하, 50 nM 이하, 또는 25 nM 이하의 결합 친화도로 IL-4 수용체 α
    Figure pct00142
    c 헤테로이량체(IL-4Rα
    Figure pct00143
    c)에 결합하는, 폴리펩타이드.
  76. 제4항 내지 제6항, 제9항 내지 제15항, 제17항 내지 제19항, 제21항 내지 제23항, 제25항 내지 제28항, 제30항, 제35항 내지 제37항, 제39항 내지 제41항, 제59항 내지 제66항, 및 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 및 마우스 IL-4 수용체에 대한 폴리펩타이드의 친화도가 네이티브 IL-4와 대략 동일하거나 그보다 큰, 폴리펩타이드.
  77. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제55항, 및 제62항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 네이티브 IL-2와 대략 동일하거나 그보다 큰 약효로 IL-2 수용체를 발현하는 세포에서 STAT5 인산화를 자극하는, 폴리펩타이드.
  78. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제55항, 제62항 내지 제74항, 및 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 IL-2 수용체 β
    Figure pct00144
    c 헤테로이량체를 발현하지만 IL-2 수용체 α가 결여된 세포에서 네이티브 IL-2와 대략 동일하거나 그보다 큰 약효로 IL-2 수용체를 발현하는 세포에서 STAT5 인산화를 자극하는, 폴리펩타이드.
  79. 제2항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제11항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항, 제20항 내지 제22항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제38항, 제42항 내지 제55항, 제62항 내지 제74항, 및 제77항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 네이티브 IL-2의 열적 안정성과 대략 동일하거나 그보다 큰 열적 안정성을 실증하는, 폴리펩타이드.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 열적 안정성 시험 후 이의 접혀진 구조의 적어도 70%를 유지하거나 회복하는, 폴리펩타이드.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 열적 안정성 시험 후 이의 접혀진 구조의 적어도 80%를 유지하거나 회복하는, 폴리펩타이드.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 열적 안정성 시험 후 이의 접혀진 구조의 적어도 90%를 유지하거나 회복하는, 폴리펩타이드.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 열적 안정성 시험 후 이의 타원율 스펙트럼의 적어도 80%를 유지하거나 회복하는, 폴리펩타이드.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 열적 안정성 시험 후 적어도 70% 활성을 유지하거나 회복하는, 폴리펩타이드.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 열적 안정성 시험 후 적어도 80% 활성을 유지하거나 회복하는, 폴리펩타이드.
  86. 84항 또는 제85항에 있어서, 상기 활성은 STAT5 인산화 검정법에 의해 결정되는, 폴리펩타이드.
  87. 제79항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열적 안정성은 222 nM에서 원편광 이색성(CD; circular dichroism) 분광법에 의해 측정되는, 폴리펩타이드.
  88. 제87항에 있어서, 상기 열적 안정성 시험은 상기 폴리펩타이드를 1시간의 시간 프레임(time frame)에서 25℃로부터 95℃까지 가열하는 단계, 상기 폴리펩타이드를 5분 시간 프레임 내에서 25℃까지 냉각시키는 단계, 및 222 nm에서 타원율을 모니터링하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드.
  89. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호90, 181, 또는 247의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 (i) 인간 또는 뮤린 IL-2R알파에 결합하지 않으며, (ii) 인간 IL2RB에 약 11.2 nM의 친화도로 결합하며, (iii) 뮤린 IL2RB에 약 16.1 nm의 친화도로 결합하며, (IV) 인간 IL-2Rβ
    Figure pct00145
    c에 약 18.8 nM의 친화도로 결합하고, (V) 뮤린 IL-2Rβ
    Figure pct00146
    c에 약 3.4 nM의 친화도로 결합하는, 폴리펩타이드.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 하나의 이황화 결합을 포함하는, 폴리펩타이드.
  91. 제90항에 있어서, 상기 이황화 결합은 X1, X2, X3 및 X4 도메인 중 2개를 함께 연결하는, 폴리펩타이드.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 이황화 결합은 X1 도메인을 X4 도메인에 연결하는, 폴리펩타이드.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이황화 결합은, 2개의 도메인을 함께 연결하는 이황화 결합이 없는 실질적으로 유사한 폴리펩타이드와 비교하여 폴리펩타이드의 열적 안정성을 향상시키는, 폴리펩타이드.
  94. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 표적화 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  95. 제94항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 상기 폴리펩타이드와의 번역적 융합인, 폴리펩타이드.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 세포 표면 단백질에 결합하는, 폴리펩타이드.
  97. 제96항에 있어서, 상기 세포 표면 단백질은 종양 세포, 혈관 구성요소, 종양 미세환경(예를 들어, 섬유아세포, 침윤성 면역 세포, 또는 기질 요소(stromal element)), 다른 암세포 및 면역 세포(비제한적으로 CD8+ T 세포, T-조절 세포, 수지상 세포, NK 세포, 또는 대식세포를 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에 존재하며, 이러한 면역 세포 표면 마커는 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD40, CD68, CD123, CD254, PD-1, B7-H3, 및 CTLA-4를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 폴리펩타이드.
  98. 제96항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 종양 세포, 종양 혈관 구성요소 세포, 또는 종양 미세환경 세포 표면 마커에 결합하는, 폴리펩타이드.
  99. 제98항에 있어서, 상기 세포 표면 마커는 비제한적으로 EGFR, EGFRvIII, Her2, HER3, EpCAM, MSLN, MUC16, PSMA, TROP2, ROR1, RON, PD-L1, CD47, CTLA-4, CD5, CD19, CD20, CD25, CD37, CD30, CD33, CD40, CD45, CAMPATH-1, BCMA, CS-1, PD-L1, B7-H3, B7-DC, HLD-DR, 암배아 항원(CEA; carcinoembryonic antigen), TAG-72, EpCAM, MUC1, 폴레이트-결합 단백질, A33, G250, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 페리틴, GD2, GD3, GM2, Ley, CA-125, CA19-9, 표피 성장 인자, p185HER2, IL-2 수용체, EGFRvIII (de2-7 EGFR), 섬유아세포 활성화 단백질, 테나신(tenascin), 메탈로프로테이나제(metalloproteinase), 엔도시알린(endosialin), 혈관 내피 성장 인자, avB3, WT1, LMP2, HPV E6, HPV E7, Her-2/neu, MAGE A3, p53 비돌연변이체(nonmutant), NY-ESO-1, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, gp100, p53 돌연변이체, PR1, bcr-abl, 티로시나제, 서바이빈(survivin), PSA, hTERT, 육종 전좌 절단점 단백질, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, ERG, NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B 1, 폴리시알산, MYCN, RhoC, TRP-2, 푸코실 GM1, 메소텔린(MSLN), PSCA, MAGE Al, sLe(동물), CYP1B1, PLAV1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, 카르보닉 안하이드라제(carbonic anhydrase) IX, PAX5, OY-TESL 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, 레구마(Legumain), Tie 3, VEGFR2, MAD-CT-1, PDGFR-B, MAD-CT-2, ROR2, TRAIL1, MUC16, MAGE A4, MAGE C2, GAGE, EGFR, CMET, HER3, MUC15, CA6, NAPI2B, TROP2, CLDN6, CLDN16, CLDN18.2, CLorf186, RON, LY6E, FRA, DLL3, PTK7, STRA6, TMPRSS3, TMPRSS4, TMEM238, UPK1B, VTCN1, LIV1, ROR1, Fos-관련 항원 1, 및 하기 열거된 마커:
    (1) BMPR1B (골 형태발생 단백질 수용체-유형 IB, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--001203);
    (2) E16 (LAT1, SLC7A5, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--003486);
    (3) STEAP1 (전립선의 6 막관통 상피 항원, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--012449);
    (4) 0772P (CA125, MUC16, Genbank 기탁 번호 AF361486);
    (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 강화 인자, 메소텔린, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--005823);
    (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 계통 34 (소듐 포스페이트), 구성원 2, 유형 II 소듐-의존적 포스페이트 수송체 3b, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--006424);
    (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7 트롬보스폰딘 반복부 (유형 1 및 유형 1-유사), 막관통 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, Genbank 기탁 번호 AB040878);
    (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, Genbank 기탁 번호 AY358628);
    (9) ETBR (엔도텔린 유형 B 수용체, Genbank 기탁 번호 AY275463);
    (10) MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--017763);
    (11) STEAP2 (HGNC.sub.--8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관 유전자 1, 전립선암 연관 단백질 1, 전립선의 6 막관통 상피 항원 2, 6 막관통 전립선 단백질, Genbank 기탁 번호 AF455138);
    (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널, 하위계통 M, 구성원 4, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--017636);
    (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--003203 또는 NM.sub.--003212);
    (14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR(C3d/엡스타인 바 바이러스 수용체) 또는 Hs. 73792, Genbank 기탁 번호 M26004);
    (15) CD79b (IGb (면역글로불린-관련 베타), B29, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--000626);
    (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 앵커 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, Genbank 기탁 번호 NM.sub.--030764);
    (17) HER2 (Genbank 기탁 번호 M11730);
    (18) NCA (Genbank 기탁 번호 M18728);
    (19) MDP (Genbank 기탁 번호 BC017023);
    (20) IL20R.알파. (Genbank 기탁 번호 AF184971);
    (21) Brevican (Genbank 기탁 번호 AF229053);
    (22) Ephb2R (Genbank 기탁 번호 NM.sub.--004442);
    (23) ASLG659 (Genbank 기탁 번호 AX092328);
    (24) PSCA (Genbank 기탁 번호 AJ297436);
    (25) GEDA (Genbank 기탁 번호 AY260763);
    (26) BAFF-R (Genbank 기탁 번호 NP.sub.--443177.1);
    (27) CD22 (Genbank 기탁 번호 NP-001762.1);
    (28) CD79a(CD79A, CD79.알파., 면역글로불린-관련 알파, Ig 베타(CD79B)와 공유적으로 상호작용하고 표면 상에서 IgM 분자와 복합체를 형성하고, B-세포 분화에 연관된 신호를 전달하는 B 세포-특이적 단백질, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--001774.1);
    (29) CXCR5(버킷 림프종 수용체 1, CXCL13 케모카인에 의해 활성화되며, 림프구 이동 및 체액성 방어에서 작용하고, HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병의 발병에서 역할을 하는 G 단백질-커플링된 수용체, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--001707.1);
    (30) HLA-DOB(펩타이드에 결합하고 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 클래스 II 분자(Ia 항원)의 베타 하위단위, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--002111.1);
    (31) P2X5(푸린성(Purinergic) 수용체 P2X 리간드-개폐 이온 채널 5, 세포외 ATP에 의해 개폐되는 이온 채널은 시냅스 전달 및 신경발생에 관여할 수 있으며, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정(idiopathic detrusor instability)의 병리생리학에 기여할 수 있음, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--002552.2);
    (32) CD72(B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--001773.1);
    (33) LY64(림프구 항원 64(RP105), 류신 풍부 반복부(LRR) 계통의 유형 I 막 단백질은 B-세포 활성화 및 세포자멸사를 조절하며, 기능 상실은 전신 홍반성 루푸스 환자에서 증가된 질환 활성과 연관되어 있음, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--005573.1);
    (34) FCRH1(Fc 수용체-유사 단백질 1, C2 유형 Ig-유사 및 ITAM 도메인을 함유하는 면역글로불린 Fc 도메인에 대한 추정(putative) 수용체는 B-림프구 분화에서 역할을 할 수 있음, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--443170.1); 및
    (35) IRTA2(면역글로불린 슈퍼계통 수용체 전좌 연관 2, B 세포 발달 및 림프종발생(lymphomagenesis)에서 가능한 역할을 갖는 추정 면역수용체; 전좌에 의한 유전자의 탈조절(deregulation)은 일부 B 세포 악성물에서 발생함, Genbank 기탁 번호 NP.sub.--112571.1)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  100. 제96항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 면역 세포 표면 마커(비제한적으로 CD8+ T 세포, T-조절 세포, 수지상 세포, NK 세포, 또는 대식세포를 포함함)에 결합하며, 상기 면역 세포 표면 마커는 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD40, CD68, CD123, CD254, PD-1, B7-H3, 및 CTLA-4를 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않으며, 및/또는 상기 표적화 도메인은 PD-1, PDL-1, CTLA-4, TROP2, B7-H3, CD33, CD22, 카르보닉 안하이드라제(carbonic anhydrase) IX, CD123, 넥틴-4, 조직 인자 항원, CD154, B7-H3, B7-H4, FAP(섬유아세포 활성화 단백질) 또는 MUC16에 결합하는, 폴리펩타이드.
  101. 제94항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 scFv, F(ab), F(ab')2, B 세포 수용체(BCR), DARPin, 아피바디(affibody), 모노바디(monobody), 나노바디, 디아바디(diabody), 항체(단일특이적 또는 이중특이적 항체를 포함함); 비제한적으로 RGD 인테그린-결합 펩타이드를 포함하는 세포-표적화 올리고펩타이드, 드 노보 디자인된 결합제, 앱타머, 비사이클(bicycle) 펩타이드, 코노톡신(conotoxin), 저분자, 예컨대 엽산, 및 세포 표면에 결합하는 바이러스를 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는, 폴리펩타이드.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산.
  103. 프로모터에 작동적으로 연결된 제102항의 재조합 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  104. 제102항의 핵산 및/또는 제103항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  105. 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제102항의 재조합 핵산, 제103항의 발현 벡터, 또는 제104항의 재조합 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  106. 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제102항의 재조합 핵산, 제103항의 발현 벡터, 제104항의 재조합 숙주 세포, 또는 제105항의 약제학적 조성물을 종양을 치료하기에 효과적인 양으로, 암을 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 암은 결장암, 흑색종, 신세포암, 두경부 편평세포암, 위암, 요로상피세포암종, 호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 간세포암종, 췌장암, 메르켈 세포 암종, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암, 및 진단 검사, 예컨대 현미부수체 불안정성(microsatellite instability), 종양 돌연변이 부담(mutational burden), PD-L1 발현 수준, 또는 면역점수(immunoscore) 검정법(면역항암학회(the Society for Immunotherapy of Cancer)에 의해 개발된 바와 같음)에 의해 선택된 임의의 종양 유형으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  108. 대상체에서 암을 치료하기 위한 및/또는 면역 반응을 조절하기 위한 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드, 제102항의 재조합 핵산, 제103항의 발현 벡터, 제104항의 재조합 숙주 세포, 또는 제105항의 약제학적 조성물.
  109. 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제102항의 재조합 핵산, 제103항의 발현 벡터, 제014항의 재조합 숙주 세포, 또는 제105항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 면역 반응은 항암 면역 반응, 조직 수복 면역 반응 또는 상처 치유 면역 반응인, 방법.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 상기 폴리펩타이드, 재조합 핵산, 발현 벡터, 재조합 숙주 세포, 또는 약제학적 조성물은 생체물질의 구성요소로서 투여되는, 방법.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 제2 치료제에 대한 상기 대상체의 면역 반응을 증강시키는, 방법.
  114. 제112항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 치료제는 화학치료제, 또는 비제한적으로 키메라 항원 수용체 T 세포를 포함하는 항원-특이적 면역치료제를 포함하는, 방법.
  115. 방법으로서,
    단백질의 복수의 잔기에 대한 구조를 컴퓨터 장치를 사용하여 결정하는 단계로서, 여기서, 상기 복수의 잔기의 구조는 특정 수용체 결합 계면(interface)을 제공하는, 단계;
    상기 컴퓨터 장치에 의해 제공되는 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하는 단계로서, 여기서, 상기 복수의 디자인된 잔기는 특정 수용체 결합 계면을 제공하고, 상기 복수의 디자인된 잔기는 복수의 잔기와 상이한 것인, 단계;
    복수의 디자인된 잔기를 연결하는 하나 이상의 연결형(connecting) 나선 구조를 상기 컴퓨터 장치를 사용하여 결정하는 단계;
    하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 상기 컴퓨터 장치를 사용하여 결정하는 단계;
    상기 제1 단백질 백본에 기초하여 유연성(flexibility) 및 저에너지 구조에 대한 단백질에 대해 제2 단백질 백본을 상기 컴퓨터 장치를 사용하여 디자인하는 단계; 및
    적어도 상기 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  116. 제115항에 있어서, 상기 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하는 단계는 이상화(idealize)된 잔기의 데이터베이스를 사용하여, 이상화된 잔기를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 이상화된 잔기는 복수의 디자인된 잔기의 디자인된 잔기와 관련이 있는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 이상화된 잔기의 데이터베이스를 사용하여, 이상화된 잔기를 결정하는 단계는,
    이상화된 잔기의 데이터베이스로부터 상기 이상화된 잔기와 관련된 하나 이상의 이상화된 단편을 검색하는 단계; 및
    관련된 디자인된 잔기를 상기 하나 이상의 이상화된 단편을 사용하여 재작제(reconstruct)함으로써 이상화된 잔기를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 관련된 디자인된 잔기를 하나 이상의 이상화된 단편을 사용하여 재작제하는 단계는,
    하나 이상의 이상화된 단편의 쌍(pair)을, 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍의 조합적 단편 조립의 사용에 의해 재연결하는 단계; 및
    데카르트-제약(Cartesian-constrained) 백본 최소화를 사용하여, 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍이 2개 이상의 복수의 디자인된 잔기를 연결하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 관련된 디자인된 잔기를 하나 이상의 이상화된 단편을 사용하여 재작제하는 단계는,
    이상화된 잔기의 중복 단편이 상기 이상화된 잔기의 데이터베이스를 사용하여 이상화된 단편인지 확증하는 단계;
    이상화된 잔기가 특정 수용체 결합 계면과 연관된 표적 수용체와 충돌(clash)하지 않는지 여부를 확증하는 단계; 및
    이상화된 잔기가 특정 수용체 결합 계면과 연관된 표적 수용체와 충돌하지 않는지 여부를 확증한 후, 이상화된 잔기의 각각의 위치에서 최확(most probable) 아미노산을 상기 이상화된 잔기의 데이터베이스를 사용하여 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  120. 제118항에 있어서, 하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 결정하는 단계는,
    하나 이상의 이상화된 단편의 쌍을 조합적으로 재조합함으로써 상기 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍을 재조합하는 단계; 및
    단백질에 대한 제1 단백질 백본을 하나 이상의 이상화된 단편의 재조합된 쌍을 사용하여 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍을 조합적으로 재조합하는 단계는 상기 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍의 이상화된 단편 사이의 상호연결 길이에 기초하여 하나 이상의 이상화된 단편의 쌍의 순위를 매기는 단계를 포함하는, 방법.
  122. 제115항에 있어서, 상기 복수의 디자인된 잔기를 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 결정하는 단계는,
    복수의 디자인된 잔기의 디자인된 잔기의 모양을 나타내는 하나 이상의 매개 방정식(parametric equation)을 사용하여, 이상화된 잔기를 결정하는 단계; 및
    상기 이상화된 잔기를 복수의 디자인된 잔기의 적어도 하나의 디자인된 잔기와 근접시키는 단일 단편을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 디자인된 잔기는 나선형 구조를 포함하고, 상기 하나 이상의 매개 방정식은 상기 나선형 구조의 파이(phi) 및 프사이(psi) 각도의 원주각 피치(angular pitch)와 관련된 방정식을 포함하는, 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 나선형 구조의 파이 및 프사이 각도와 관련된 방정식은 나선형 구조의 파이 및 프사이 각도의 원주각 피치와 관련된 하나 이상의 텀(term)을 포함하는, 방법.
  125. 제115항에 있어서, 단백질에 대한 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계는, 상기 단백질에 대한 제2 단백질 백본에 기초하여 하나 이상의 분자를 디자인하는 단계를 포함하는, 방법.
  126. 제115항에 있어서, 단백질에 대한 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계는,
    상기 단백질에 대한 제2 단백질 백본에 기초한 단백질에 대한 합성 유전자를 생성하는 단계;
    상기 합성 유전자를 사용하여 특정 단백질을 생체내에서 발현시키는 단계; 및
    상기 특정 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 합성 유전자를 사용하여 특정 단백질을 생체내에서 발현시키는 단계는, 합성 유전자를 포함하는 하나 이상의 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 특정 단백질 서열을 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
  128. 제115항에 있어서, 단백질에 대한 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계는 상기 단백질에 대한 제2 단백질 백본 중 적어도 일부를 포함하는 하나 이상의 이미지를 생성시키는 단계를 포함하는, 방법.
  129. 제115항에 있어서, 상기 컴퓨터 장치는 단백질 합성 장치를 포함하고, 단백질에 대한 제2 단백질 백본과 적어도 관련된 결과물을 생성하는 단계는 단백질에 대한 적어도 제2 단백질 백본을 상기 단백질 장치를 사용하여 합성하는 단계를 포함하는, 방법.
  130. 제115항 또는 제129항에 있어서, 상기 방법은 단백질 모방체를 디자인하기 위한 것인, 방법.
  131. 제130항의 방법에 의해 식별되는 비-자연 발생 단백질 모방체.
  132. 제131항에 있어서, 사이토카인 모방체인 비-자연 발생 단백질.
  133. 제122항에 있어서, IL-2 모방체 또는 IL-4 모방체인, 비-자연 발생 단백질.
  134. 컴퓨터 장치로서,
    하나 이상의 프로세서; 및
    실행 시, 컴퓨터 장치가 하기 단계:
    특정 수용체 결합 계면을 제공하는 단백질의 복수의 잔기에 대한 구조를 결정하는 단계;
    모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하는 단계로서, 여기서, 상기 복수의 디자인된 잔기는 특정 수용체 결합 계면을 제공하고, 상기 복수의 디자인된 잔기는 복수의 잔기와 상이한 것인, 단계;
    복수의 디자인된 잔기를 연결하는 하나 이상의 연결형 나선 구조를 결정하는 단계;
    하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 결정하는 단계;
    상기 제1 단백질 백본에 기초하여 유연성 및 저에너지 구조에 대한 단백질에 대해 제2 단백질 백본을 디자인하는 단계; 및
    적어도 상기 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계를 포함하는 기능을 수행하도록 유발하는, 적어도 컴퓨터-판독 가능 명령을 저장하도록 구성된 데이터 저장을 포함하는, 컴퓨터 장치.
  135. 제134항에 있어서, 상기 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하는 단계는 이상화된 잔기의 데이터베이스를 사용하여, 이상화된 잔기를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 이상화된 잔기는 복수의 디자인된 잔기의 디자인된 잔기와 관련이 있는, 컴퓨터 장치.
  136. 제134항에 있어서, 상기 모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하는 단계는,
    복수의 디자인된 잔기의 디자인된 잔기의 모양을 나타내는 하나 이상의 매개 방정식을 사용하여, 이상화된 잔기를 결정하는 단계; 및
    상기 이상화된 잔기를 복수의 디자인된 잔기의 적어도 하나의 디자인된 잔기와 근접시키는 단일 단편을 결정하는 단계를 포함하는, 컴퓨터 장치.
  137. 제135항에 있어서, 상기 컴퓨터 장치는 단백질 합성 장치를 추가로 포함하고, 단백질에 대한 제2 단백질 백본과 적어도 관련된 결과물을 생성하는 단계는 단백질에 대한 적어도 제2 단백질 백본을 상기 단백질 장치를 사용하여 합성하는 단계를 포함하는, 컴퓨터 장치.
  138. 비-일시적(non-transitory) 컴퓨터-판독 가능 매체로서, 컴퓨터 장치의 하나 이상의 프로세서에 의해 실행 시, 상기 컴퓨터 장치가 하기 단계:
    특정 수용체 결합 계면을 제공하는 단백질의 복수의 잔기에 대한 구조를 결정하는 단계;
    모방체 디자인 프로토콜을 사용하여 복수의 디자인된 잔기를 결정하는 단계로서, 여기서, 상기 복수의 디자인된 잔기는 특정 수용체 결합 계면을 제공하고, 상기 복수의 디자인된 잔기는 복수의 잔기와 상이한 것인, 단계;
    복수의 디자인된 잔기를 연결하는 하나 이상의 연결형 나선 구조를 결정하는 단계;
    하나 이상의 연결형 나선 구조 및 복수의 디자인된 잔기를 복수의 조합에 걸쳐 조립함으로써 단백질에 대한 제1 단백질 백본을 결정하는 단계;
    상기 제1 단백질 백본에 기초하여 유연성 및 저에너지 구조에 대한 단백질에 대해 제2 단백질 백본을 디자인하는 단계; 및
    단백질에 대한 적어도 제2 단백질 백본과 관련된 결과물을 생성하는 단계를 포함하는 기능을 수행하도록 유발하는, 적어도 컴퓨터-판독 가능 명령을 저장하도록 구성된 비-일시적 컴퓨터-판독 가능 매체.
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